UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, PÓS-GRADUAÇÃO, EXTENSÃO E CULTURA -

ProPPEC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

ROSILENE APARECIDA DA SILVEIRA

PROPOSIÇÃO DE UMA METODOLOGIA PARA MENSURAÇÃO DO POTENCIAL

DE BIODEGRADAÇÃO INTRÍNSECA DE AMOSTRAS LÍQUIDAS

INDUSTRIAIS/AMBIENTAIS

Itajaí (SC), 2010.

ROSILENE APARECIDA DA SILVEIRA

PROPOSIÇÃO DE UMA METODOLOGIA PARA MENSURAÇÃO DO POTENCIAL

DE BIODEGRADAÇÃO INTRÍNSECA DE AMOSTRAS LÍQUIDAS

INDUSTRIAIS/AMBIENTAIS

Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia Ambiental. Orientador: Prof. Dr. Claudemir Marcos

Radetski.

Itajaí (SC), 2010.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Dedico esta obra a minha filha Ana Flavia

e ao meu esposo Renato pelo apoio e

estímulo nos momentos difíceis.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus;

Ao meu Orientador, Prof. Dr. Claudemir Marcos Radetski, pela paciência,

compreensão, dedicação, amizade e pelo exemplo de pessoa. Meus sinceros

agradecimentos.

À UNIVALI, na pessoa da secretária Cristiane de Sousa Bilobran, pelo apoio

administrativo, pelo carinho, apoio e amizade. Meu muito obrigado.

À todos meus colegas de mestrado, em especial ao Fabiano Villatore, Aline

Meurer, Marla e Luis Augusto pela força e pela amizade.

À equipe do laboratório de Remedição Ambiental, Profª. Albertina, Fernanda

e Renan.

À minha família, meus pais pela colaboração; ao meu marido, pela

paciência, apoio e compreensão, e em especial, a minha filha, Ana Flavia, pela

compreensão na minha ausência e principalmente pelo seu amor.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi o de testar a viabilidade técnica do método de hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a atividade microbiológica em 6 diferentes amostras ambientais/industriais: esgoto doméstico, efluentes têxtil, agro-industrial e hospitalar, águas cinzas e águas de um rio fracamente poluído. Esta atividade microbiológica das bactérias autóctones pode servir como indicador da biodegradabilidade intrínseca da matéria orgânica. Para tanto, comparou-se a linearidade dos valores obtidos com a hidrólise da FDA com os valores de DQO, Oxigênio Consumido e DBO5. Os resultados demonstraram que a linearidade das respostas da hidrólise da FDA são comparáveis às da DQO e melhores do que a linearidade das respostas dos métodos do Oxigênio Consumido e DBO5, com exceção do efluente têxtil com corantes e das águas cinzas ricas em materiais graxos. A metodologia proposta não apresenta inconvenientes como é o caso da metodologia da DBO5, pois o método da hidrólise da FDA é simples, rápido, de baixo custo, sem necessidade de adequação da amostra para a realização do teste, sem necessidade de inóculo bacteriano, além de apresentar uma variabilidade pequena dos resultados. Estes resultados permitem concluir que a hidrólise da FDA pode ser usada como método para avaliação do potencial intrínseco da biodegradabilidade de uma amostra, o que pode ser de interesse nos sistemas de biorremediação de amostras ambientais/industriais.

PALAVRAS-CHAVE: Matéria orgânica. Biodegradabilidade. Fluoresceína. DBO. DQO.

ABSTRACT

The goal of this study was to evaluate the feasibility of FDA (fluorescein diacetate) hydrolysis method for the determination of enzymatic activity in 6 different wastewaters: domestic wastewater, textile, agro-industrial and hospital effluents, grey water, and water from a slight polluted stream water. This hydrolytic method using autochthonous microorganisms can indicates the intrinsic biodegradability of organic matter present in the samples. To achieve this information, the linearity of the response obtained with this new methodology was compared to the linearity response of different methodologies for organic matter determination in aqueous samples (e.g., COD, BOD, and Oxygen Demand methods). The results showed that linearity responses of the hydrolytic method are comparable to the COD linearity responses and are more precise than linearity responses of other tested methods, with exception of responses for textile effluents with dyes and grey waters with fatty materials. The hydrolytic methodology used to evaluate intrinsic biodegradable organic matter of samples presented in this study do not show some inherent problems found in other classical methodology used for this purpose (e.g., BOD). Furthermore, the hydrolytic methodology is rapid to carry out and present low cost for execution, and reflect real environment in terms of sample conditions. These results and characteristics allow us to conclude that FDA hydrolysis can be used for the determination of intrinsic biodegradability of samples with organic constituents, which can be of interest in the bioremediation process and in the monitoring of wastewater treatment plants.

KEYWORDS: Organic matter. Biodegradability. Fluorescein. BOD. QOD.

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1: Coordenadas geográficas das áreas de onde foram coletadas as

amostras ambientais..............................................................................37�

Tabela 1: Diluições feitas nas amostras analisadas no presente trabalho. ...............39�

Tabela 2: Influencia da concentração da fluoresceína na variação temporal da

absorbância de duplicatas das amostras de um efluente agroindustrial

bruto. ......................................................................................................43�

Tabela 3: Influencia da autoclavagem nas absorbâncias medidas após 2 e 24 h das

amostras após autoclavagem com e sem a adição prévia de 200µµµµL de

fluoresceína no meio reacional...............................................................44�

Tabela 4: Variação da absorbância em diferentes tempos para diferentes inóculos

bacterianos, com adição de 200 µL de FDA...........................................46�

Tabela 5: Influência do meio nutritivo na atividade hidrolítica das bactérias B.

polymixa, C. violacea e de uma Bactéria Liofilizada sem identificação em

diferentes intervalos de tempo................................................................47�

Tabela 6: Variabilidade dos pHs das amostras estudadas nos ensaios hidrolíticos..48�

Tabela 7: Médias dos valores de FDA, DQO e MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................50�

Tabela 8: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de FDA

e DQO em função dos valores de MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................52�

Tabela 9: Médias dos valores de FDA, OC e MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................54�

Tabela 10: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de

FDA e OC em função dos valores de MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................55�

Tabela 11: Médias dos valores de FDA, DBO e MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.................................57�

Tabela 12: Equação da reta e coeficiente de correlação linear (R2) para os valores

de FDA e DBO em função dos valores de MOO medidos nas diluições

das diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas. .........................58�

Tabela 13: Valores de FDA, DBO, DQO e MOO medidos nas diluições das diferentes

amostras industriais analisadas no estudo paralelo. ..............................60�

Tabela 14: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de

FDA, DQO e DBO em função dos valores de MOO medidos nas

diluições das diferentes amostras industriais usadas no estudo paralelo.

...............................................................................................................60�

Tabela 15: Relações entre os valores de FDA, DBO e MOO das diferentes amostras

analisadas neste estudo. ........................................................................65�

LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS

Gráfico 1: Variações das absorbâncias médias de triplicatas em função do tempo de

hidrólise de FDA para cada tipo de amostra e suas respectivas diluições

testadas (AC = Água Cinza; RP = Rio Poluído; AI = Agro-Industrial). ......45�

Figura 1: Reação 1....................................................................................................31�

Figura 2: Fórmula estrutural do Diacetato de Fluoresceína. .....................................32�

Figura 3: Reação de hidrólise do FDA. .....................................................................33�

Figura 4: Pontos das coletas das amostras...............................................................38�

LISTA DE ABREVIATURAS

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

APHA American Public Health Association

COT Carbono Orgânico Total

CO2 Dióxido de Carbono

C.V. Coeficiente de Variação

DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio

DBOu Demanda Última de Oxigênio

DBO 5 Demanda Bioquímica de Oxigênio padrão de 5 dias

DQO Demanda Química de Oxigênio

ETE Estação de Tratamento de esgoto

FDA Hidrólise de Diacetato de Fluoresceína

FD Fator de Diluição

M Molar

MOO Matéria Orgânica Oxidável

OD Oxigênio Dissolvido

OC Oxigênio Consumido

pH Potencial Hidrogeniônico

PCP Pentachlorophenol

Ppm Partícula por Milhão

STE Sistema Transportador de Elétrons

SUMÁRIO

1� INTRODUÇÃO....................................................................................................13�

1.1� Contextualização ............................................................................................13�

2� OBJETIVOS........................................................................................................17�

2.1� Objetivo Geral .................................................................................................17�2.2� Objetivos Específicos......................................................................................17�

3� JUSTIFICATIVA .................................................................................................18�

4� REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................19�

4.1� Matéria orgânica em amostras industriais/ambientais ....................................19�4.2� Microrganismos envolvidos no tratamento aeróbio da matéria orgânica ........21�4.3� Métodos de Mensuração da Matéria Orgânica em Meio Líquido....................27�4.3.1� Demanda Química do Oxigênio (DQO) ........................................................28�4.3.2� Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO) ....................................................29�4.3.3� Oxigênio Consumido (OC)............................................................................29�4.3.4� Carbono Orgânico Total (COT).....................................................................30�4.4� Aplicações da Hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) ........................31�

5� MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................37�

5.1� Descrição das áreas de estudo.......................................................................37�5.2� Coleta e Preparação das Amostras ................................................................38�5.3� Metodologia de quantificação da matéria orgânica.........................................39�5.3.1� Procedimento para a determinação da DBO5...............................................39�5.3.2� Procedimento para determinação da DQO...................................................40�5.3.3� Procedimento para determinação da Matéria Orgânica Oxidável (MOO) por

Calcinação ....................................................................................................41�5.3.4� Determinação do Oxigênio Consumido. .......................................................41�5.3.5� Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA......................42�

6� RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................43�

6.1� Otimização da metodologia de quantificação da matéria orgânica intrinsecamente biodegradável pela hidrólise da FDA....................................43�

6.2� Comparações dos resultados da Demanda Química do Oxigênio (DQO), Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO), Matéria Orgânica Oxidável (MOO), Oxigênio Consumido (OC) e hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) na estimação da matéria orgânica das amostras ................................................49�

6.2.1� Comparação da eficiência da DQO e da hidrólise da FDA na determinação da matéria orgânica de amostras industriais/ambientais mensurada pela calcinação (MOO).........................................................................................50�

6.2.2� Comparação da eficiência da Oxigênio Consumido e da hidrólise da FDA na determinação da matéria orgânica de amostras industriais/ambientais mensurada pela calcinação (Matéria Orgânica Oxidável - MOO).................53�

6.2.3� Comparação da eficiência da DBO e da hidrólise da FDA na determinação da matéria orgânica biodegradável de amostras industriais/ambientais líquidas mensurada pela calcinação (MOO) ..............................................................56�

6.3� Estudo paralelo (FDA x DQO x DBO) .............................................................59�6.4� Discussão geral ..............................................................................................61�

7� CONCLUSÃO .....................................................................................................68�

REFERÊNCIAS.......................................................................................................70�

ANEXO ...................................................................................................................77�

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 Contextualização

Para se ter um ambiente mais sustentável é preciso investir, entre outras

coisas, no tratamento de efluentes, buscando alternativas e soluções inovadoras nas

análises e nas técnicas de tratamento dos mesmos. O lançamento de efluentes sem

o devido tratamento na natureza pode resultar impactos bastante significativos para

os recursos hídricos, desencadeando vários problemas sócio-ambientais. Para que o

efluente tenha um destino adequado é necessário que seja coletado, analisado e

tratado. A matéria orgânica presente nos corpos d’água e nos esgotos é uma

característica de primordial importância, sendo a causadora do principal problema de

poluição das águas: o consumo do oxigênio dissolvido pelos microrganismos nos

seus processos metabólicos de utilização e estabilização da matéria orgânica (VON

SPERLING, 1996). Geralmente, utilizam-se métodos diretos e indiretos para

determinação do potencial poluidor ou quantificação da matéria orgânica de um

efluente. Entre os métodos indiretos, pode-se medir o consumo do oxigênio pela

DBO (Demanda Bioquímica de Oxigênio); DBOu (Demanda Última de Oxigênio) e

DQO (Demanda Química de Oxigênio). Com relação aos métodos diretos, pode-se

medir o COT (Carbono Orgânico Total).

O parâmetro mais usual de medição de poluição orgânica aplicado às águas

é a DBO cinco dias (DBO5), sendo que esta determinação envolve a medida do

oxigênio dissolvido utilizada pelos microrganismos na oxidação bioquímica da

matéria orgânica (BRAILE; CAVALCANTI, 1993). Esta técnica consiste em medir em

laboratório o consumo de oxigênio que um volume padronizado de esgoto ou outro

líquido exerce em um período de tempo pré-fixado, retratando a quantidade de

oxigênio requerido para estabilizar, através de processos bioquímicos, a matéria

orgânica carbonácea, uma indicação indireta, portanto, do carbono orgânico

biodegradável (VON SPERLING, 1996). A DBO é então uma determinação da

quantidade aproximada de oxigênio que será necessária para oxidar biologicamente

a matéria orgânica presente na amostra analisada. O período de incubação é de

cinco dias a 20° C, podendo-se utilizar outros períodos e temperaturas. Após a

14

incubação, o oxigênio dissolvido da amostra é medido, repetindo-se a medida no

final do período-teste, sendo então calculada a DBO. A oxidação bioquímica é um

processo vagaroso, dentro de um período de vinte dias a oxidação é de 95 a 99% do

total e de 60 a 70% num período de cinco dias (BRAILE; CAVALCANTI, 1993).

Segundo Von Sperling (1996), as principais vantagens do teste da DBO5, e

ainda não igualadas por nenhum outro teste de determinação de matéria orgânica,

são relacionadas ao fato de que o teste da DBO permite: a) indicação aproximada

da fração biodegradável do despejo; b) indicação da taxa de degradação do

despejo; c) indicação da taxa de consumo de oxigênio em função do tempo; d)

determinação aproximada da quantidade de oxigênio requerido para a estabilização

biológica da matéria orgânica presente; e) pode-se encontrar baixos valores de

DBO5 caso os microrganismos responsáveis pela decomposição não estejam

adaptados ao despejo. Como inconvenientes podem ser citados: a) os metais

pesados e outras substâncias tóxicas podem matar ou inibir os microrganismos; b)

há a necessidade de inibição dos organismos responsáveis pela oxidação da

amônia, para evitar que o consumo de oxigênio para a nitrificação (demanda

nitrogenada) interfira com a demanda carbonácea; c) relação DBOu / DBO5 varia,

para um mesmo despejo, ao longo da linha de tratamento da ETE (estação de

tratamento de esgoto); d) o teste demora 5 dias, não sendo útil para efeito de

controle operacional de uma estação de tratamento; e) os critérios de

dimensionamento das unidades, assim como, legislação para lançamento de

efluentes, são baseadas na DBO e não levam em consideração os inconvenientes

acima citados.

O teste de DBOu é muito similar à DBO5 padrão de 5 dias variando apenas

ao tempo de determinação do oxigênio dissolvido, que é determinado aos 20 dias,

pois no final de 5 dias de teste da DBO5, a estabilização da matéria orgânica não

está completa, continuando por dias ou semanas. Então, a DBOu está relacionada

ao consumo de oxigênio até este tempo onde presume-se que houve a

biodegradação completa.

O teste da DQO consiste na oxidação enérgica de uma amostra de esgoto

pelo dicromato de potássio, em meio ácido, sob elevada temperatura (DACACH,

1991). A diferença do teste de DBO e DQO é que a DBO está relacionada com a

oxidação bioquímica da matéria orgânica que é realizada por microrganismos,

15

enquanto, a DQO corresponde à oxidação química da matéria orgânica, realizada

por um oxidante (e.g., dicromato de potássio) em meio ácido.

Segundo Von Sperling (1996), as principais vantagens do teste DQO são: a)

gasta apenas 2 a 3 horas para ser realizado; b) o resultado do teste dá uma

indicação do oxigênio requerido para a estabilização da matéria orgânica; c) o teste

não é afetado pela nitrificação. O grande inconveniente deste tipo de medida é que

ela não tem nenhuma relevância ambiental, pois o que foi medido pela DQO, não

necessariamente ocorrerá na natureza.

A DQO ocorre em condições mais energéticas, temperaturas acima de

150°C e meio muito ácido, sendo que os seus resultados são normalmente maiores

que do Oxigênio Consumido com permanganato que ocorre em temperaturas

inferiores a 100°C e condições menos ácidas (VALENTE; PADILHA; SILVA, 1997).

Normalmente, o valor da DQO supera o da DBO pelo fato de que a reação com o

dicromato oxida tanto a matéria orgânica putrescível como a não biodegradável

(DACACH, 1991).

No método direto de teste de carbono orgânico (COT) o carbono orgânico é

medido de forma direta, o que é diferente dos outros métodos que indiretamente

determinava o oxigênio consumido na oxidação. O teste do COT mede todo o

carbono liberado na forma de CO2. Para garantir que o carbono medido seja

realmente o carbono orgânico, as formas inorgânicas de carbono (CO2, HCO3-

entre outros) devem ser removidas antes da análise ou corrigidas quando do cálculo

(VON SPERLING, 1996).

Considerando os inconvenientes dos métodos da DBO e da DQO, o

propósito desta pesquisa é de estudar, de forma preliminar, a viabilidade do método

de hidrólise de FDA (Diacetato de Fluoresceína) para determinar matéria orgânica

biodegradável de amostras ambientais. A hidrólise de FDA é um método que avalia

a atividade hidrolítica indiscriminada das bactérias e dos fungos. A hidrólise de FDA

tem sido correlacionada positivamente com a respiração do solo (SCHNÜRER;

ROSSWALL, 1982). Em particular, a atividade enzimática no solo proporciona

catálise de diversas reações que são necessárias ao ciclo de vida dos

microrganismos, na decomposição de resíduos orgânicos durante o ciclo de

nutrientes e na formação da matéria orgânica e na estrutura do solo (BURNS, 1978).

Diversas pesquisas utilizando FDA para determinar a atividade enzimática do solo já

foram evidenciadas. As atividades enzimáticas (FDA, urease e � – glicosidase)

16

serviram como indicadoras do potencial da funcionalidade dos ecossistemas e,

aliadas aos demais atributos biológicos, tornam-se boas indicadoras da qualidade do

solo (CARVALHO, 2005).

Desta forma, pretende-se através deste trabalho analisar a viabilidade e a

eficiência do método da hidrólise de FDA na determinação da matéria orgânica de

amostras industriais/ambientais, assim como, comparar esta nova metodologia com

outros métodos de análises como DBO e DQO, no sentido de verificar se a hidrólise

do FDA pode ser mais uma opção de análise para determinação da atividade

microbiana em efluentes líquidos, o que está relacionada com a presença de matéria

orgânica nestas amostras. Em suma, o método da hidrólise do FDA pode nos

fornecer uma indicação da biodegradabilidade intrínseca da amostra, a qual já pode

conter os microrganismos adaptados para oxidar a matéria orgânica específica de

cada tipo de amostra ambiental/industrial.

17

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a aplicabilidade de um método baseado na hidrólise do Diacetato de

Fluoresceína (FDA) na determinação de matéria orgânica biodegradável em

amostras líquidas industriais/ambientais.

2.2 Objetivos Específicos

- Propor uma metodologia de quantificação da matéria orgânica biodegradável em

amostras industriais/ambientais usando o Diacetato de Fluoresceína (FDA) como

molécula base.

- Verificar a biodegradabilidade intrínseca das amostras industriais/ambientais no

sentido de prever quais amostras tem maior potencial intrínseco de

biodegradação e quais amostras necessitam de uma biodegradação assistida.

- Estabelecer valores de linearidade das respostas da Demanda Química de

Oxigênio, Demanda Bioquímica de Oxigênio, Oxigênio Consumido e Hidrólise da

FDA em função da diluição das amostras ambientais/industriais.

18

3 JUSTIFICATIVA

Esta pesquisa tem por finalidade avaliar a aplicabilidade de um método de

hidrólise de FDA (Diacetato de Fluoresceína) para determinação da matéria orgânica

biodegradável em amostras líquidas industriais/ambientais, subsidiando com dados

técnicos inéditos um melhor entendimento da biodegradação ou mesmo propondo a

substituição dos métodos convencionais utilizados para medição do potencial de

biodegradação das amostras líquidas estudadas. Estudos com FDA na

determinação de matéria orgânica biodegradável de efluentes em amostras

industriais/ambientais ainda não foram realizados.

A investigação do método de hidrólise de FDA vem sendo empregada como

importante técnica para análise da qualidade microbiológica dos solos. Assim, o

método do Diacetato de Fluoresceína, mostrou-se eficiente como bioindicador da

qualidade microbiológica de solos submetidos a reflorestamento (SILVA; SIQUEIRA;

COSTA, 2004). Outros autores também utilizaram o método em suas pesquisas com

solos, como OLIVEIRA et al (2007) que utilizou o método no monitoramento

ambiental de agroecossistemas do semi-árido, constatando que as concentrações

de Diacetato de Fluoresceína utilizadas foram positivamente correlacionado com a

quantidade microrganismos no solo.

O conhecimento gerado no presente estudo sobre a hidrólise do FDA em

amostras líquidas industriais/ambientais é estratégico para comparação dos

resultados obtidos com outros métodos já existentes na determinação de matéria

orgânica biodegradável para diferentes tipos de amostras. Assim, este será o

primeiro trabalho que estudará a viabilidade de se determinar a matéria orgânica

intrinsecamente biodegradável em efluentes utilizando o método da hidrólise de

FDA, tentando levantar os aspectos positivos e negativos desta nova metodologia,

permitindo o uso da mesma de forma mais segura e chamando para novos estudos

que permitam aperfeiçoar esta nova metodologia.

19

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 Matéria orgânica em amostras industriais/ambientais

A matéria orgânica nas águas é uma característica de primordial importância

nas questões ambientais, sendo a causadora do principal problema de poluição das

águas (VON SPERLING, 1996). Os principais compostos orgânicos presentes nas

amostras industriais/ambientais são as proteínas, carboidratos, gorduras, óleos,

uréia, fenóis, pesticidas entre outros, porém dificilmente se caracteriza a matéria

orgânica em termos de componentes individuais. Em termos práticos, a matéria

carbonácea pode ser dividida em biodegradável e não biodegradável, ambas em

suspensão e dissolvida, utilizando-se métodos indiretos para quantificar a matéria

orgânica total, como por exemplo, a DBO, DQO e COT, os quais são os parâmetros

mais utilizados para caracterizar a matéria orgânica das águas residuárias, das

águas industriais (brutas e tratadas) e dos corpos d’água. A matéria orgânica é

responsável pelo consumo do oxigênio dissolvido na água pelos microrganismos

decompositores, mas todos os efeitos da matéria orgânica só acontecem se a

mesma está biodisponível e bioacessível para os (micro)organismos aquáticos.

Contudo, estes termos (biodisponibilidade e bioacessibilidade) devem ser

bem entendidos, pois não só a taxa de biodegradação é dependente desta

disponibilidade/acessibilidade da matéria orgânica, bem como os métodos de

quantificação dessa matéria também são dependentes da

disponibilidade/acessibilidade da matéria orgânica para com os reagentes químicos

ou biológicos usados na quantificação da mesma.

Em geral, o termo biodisponibilidade é empregado em muitas áreas

científicas onde se necessita considerar as interações entre os seres vivos e as

substâncias químicas. Como resultado, cada área científica define este termo em

função da conveniência específica da área, levando à certa confusão quando se

comparam as definições de diferentes áreas. Algumas das definições gerais mais

aceitas sobre o termo biodisponibilidade são mostradas a seguir, começando por

Spacie e Hamelink (1995), os quais sugeriram a seguinte definição: “Biodisponível é

uma porção de uma totalidade de uma substância química no meio ambiente, ou

20

porção do total que está potencialmente disponível para a ação biológica”. A

biotransformação é controlada pela atividade bioquímica dos microrganismos e pela

transferência de massa da substância química para os microrganismos. Levando em

consideração estes 2 fatores, Bosma et al (1997) definiram o Número da

Biodisponibilidade (Bn), o qual é a relação entre a transferência de massa de uma

substância para a célula e a atividade intrínseca da célula usando esta substância

como substrato principal.

Na área da Ecotoxicologia terrestre, o termo Biodisponibilidade é de suma

importância, pois a parte biodisponível de uma substância é que tem o potencial de

causar danos tóxicos. Assim, Warrington e Skogley (1997) propuseram que este

termo fosse definido como “a quantidade da substância no solo que está presente

em uma forma química que o organismo pode absorver durante sua vida”. Já Ehlers

e Luthy (2003), em um relatório para o National Research Council, evitaram usar o

termo “Biodisponibilidade” de forma isolada, preferindo relatar um “Processo de

Biodisponibilidade” por falta de uma definição consistente e aplicável para o termo.

Mais recentemente, o termo Biodisponibilidade foi descrito como sendo “o

grau pelo qual substâncias químicas presentes no meio pode ser absorvido ou

metabolizado por humanos ou receptores ecológicos, ou que estão disponíveis para

interações com sistemas biológicos” (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR

STANDARDIZATION, 2006). Reichenberg e Mayer (2006) sugerem que

Biodisponibilidade “é composto pelo que é acessível (i.e., o que é extraído por um

extrator suave), juntamente com sua atividade química no meio (i.e., sujeição a um

processo físico-químico espontâneo, tais como difusão, sorção e partição)”.

Semple et al (2004) publicaram que a Biodisponibilidade representa a

“quantidade máxima de um contaminante disponível para absorção por um

organismo em um dado intervalo de tempo” e que este conceito pode ser

desdobrado em dois sentidos: Biodisponibilidade e Bioacessibilidade. O primeiro

sentido foi definido mais precisamente como “aquela fração que está disponível

livremente para atravessar a membrana de um organismo a partir do meio onde o

organismo vive em um determinado tempo”, enquanto o segundo sentido foi definido

como

aquela fração que está disponível para atravessar a membrana de um organismo a partir do meio onde o organismo vive, caso o organismo tenha acesso à substância; entretanto, esta fração pode

21

ser fisicamente removida do organismo ou somente estará disponível depois de um certo tempo. (SEMPLE et al, 2004).

Para mostrar que a distinção entre estes termos não é só semântica, para o

presente tema de dissertação pode-se dizer que a Biodisponibilidade de uma

substância (no sentido de poder ser degradada por um organismo) é um bom

descritor da taxa de biodegradação potencial, enquanto que a Bioacessibilidade de

uma substância (no sentido de que vai ser degradada por um organismo) é um bom

descritor da taxa de biodegradação real da substância. Em outras palavras, quando

toda a substância Biodisponível estiver Bioacessível, os valores quantitativos das

mesmas serão iguais.

Estas definições básicas para a biodegradação são válidas também para os

processos de extração química da matéria orgânica de uma amostra, bem como

para quantificação da matéria orgânica de uma amostra, pois para ambos os casos,

a “disponibilidade” e a “acessibilidade” podem não resultar, em termos quantitativos,

nos mesmos valores, sendo que isto será retomado na discussão dos resultados

obtidos nesta dissertação.

4.2 Microrganismos envolvidos no tratamento aeróbio da matéria orgânica

Para melhor compreensão do processo de biodegradação aeróbia de

amostras contendo matéria orgânica é importante conhecermos o funcionamento e

reações que ocorrem nos mesmos. As bactérias, os protozoários e os fungos são os

principais microrganismos envolvidos. Porém a massa microbiana é constituída

principalmente por bactérias e protozoários, sendo que os fungos e rotíferos são

raramente encontrados (ALEXANDER, 1994). Estes últimos suportam pHs baixos

com pouco nitrogênio, fazendo com que os mesmos sejam importantes no

tratamento de despejos industriais, porém alguns fungos podem prejudicar na

decantabilidade dos lodos. Assim como os fungos, os rotíferos são eficientes no

consumo de bactérias dispersas e de pequenas partículas de matéria orgânica e a

presença dos mesmos nos efluentes indica um eficiente processo de purificação

biológica (METCALF; EDDY, 1991). Contudo, os microrganismos aeróbios, quando

22

muito numerosos, podem reduzir o OD (Oxigênio dissolvido) até o nível zero, o que

pode causar transtornos nos meios ricos em organismos deste tipo.

Especificamente, cada tipo de amostra líquida contendo matéria orgânica

gera uma comunidade específica de bactérias. Uma destas bactérias geralmente é a

Zoogloeae ramigera, a qual sintetiza e secreta um gel polissacarídico onde outros

micróbios se aglomeram em flocos de grande atividade metabólica para

decomposição da matéria orgânica, originando o que se chama de lodo ativado, o

qual é o principal meio onde ocorre a biodegradação. O processo bioquímico da

biodegradação aeróbia é complexo e se processa em várias reações seqüenciais,

sendo a principal a Hidrólise onde o material orgânico é convertido em compostos de

menor peso molecular: proteínas se transformam em aminoácidos, carboidratos em

açúcares solúveis e lipídeos em ácidos graxos poliméricos e glicerina. Do ponto de

vista cinético, a biodegradação pode ocorrer em diferentes temperaturas e nesse

sentido, as bactérias podem ser classificadas de acordo com a faixa ótima de

temperatura para seu desenvolvimento. Assim, as que sobrevivem em temperaturas

entre 12 e 18°C são denominadas Psicrofílicas, entre 25 e 40°C são Mesofílicas e

entre 55 e 65°C são as Termofílicas (ALEXANDER, 1994). As Mesofílicas são as

bactérias que degradam matéria orgânica de forma mais rápida.

Do ponto de vista mais taxonômico, os microrganismos presentes nos

sistemas de biodegradação aeróbia por lodos ativados são, segundo Von Sperling

(1996):

- Bactérias: as bactérias são organismos unicelulares que se apresentam isolados

ou em cadeias e cuja forma varia de esférica a bastonetes ou espiradas. Seu

tamanho normalmente não excede 1,5 �m de comprimento. Quando se agrupam

formando filamentos, estes podem atingir centenas de micrômetros. No processo

de lodos ativados elas se dividem em bactérias não filamentosas e filamentosas.

Os principais gêneros de bactérias não filamentosas são: Bacillus, Aerobacter,

Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter,

Citromonas e Zooglea. Já as bactérias filamentosas estão presentes no processo

de lodos ativados no interior dos flocos formando a macroestrutura. Sua presença

contribui para uma boa eficiência do processo, já que possuem alta capacidade

de consumir matéria orgânica e, consequentemente, produzir um efluente final de

boa qualidade. Os microrganismos filamentosos mais freqüentes em lodos

23

ativados são: Sphaerotilus natans, Thiothrix, Beggiatoa, Microthrix parvicella,

Nocardia, etc.

- Fungos: os fungos não são habitantes freqüentes em lodos ativados. Seu

desenvolvimento pode ser estimulado quando prevalecem determinadas

condições nos reatores biológicos, tais como: pH baixo (ao redor de 5), presença

de grande quantidade de carboidratos e deficiência de nutrientes. Os fungos são

tão eficazes quanto as bactérias na estabilização da matéria orgânica. Dentre os

gêneros que podem aparecer em lodos ativados podemos citar: Geotrichum,

Fusarium, Penicillum e Cladosporium.

- Algas: embora não seja o ambiente propício para o crescimento devido a

ausência de luz provocada pela turbidez do meio, algumas algas podem estar

presentes em sistemas de lodos ativados. Apesar de desempenharem um papel

significante em lagoas de estabilização, pouco se sabe da sua contribuição em

processos de lodos ativados. As algas presentes em esgotos são as mesmas que

comumente habitam águas poluídas. Os principais grupos encontrados em

sistemas de tratamento são: algas azuis, algas verdes e diatomáceas.

- Protozoários: são microrganismos unicelulares, microscópicos. Algumas

espécies formam colônias, sendo suas células fundamentalmente independentes

e similares na estrutura e função e com formas variadas: esférica, oval, alongada

ou achatada. São tipicamente translúcidos (transparentes), mas algumas

espécies podem apresentar coloração devido à ingestão de alimento, material de

reserva ou pigmento (clorofila). Alimentam-se de bactérias, outros protozoários e

de matéria orgânica dissolvida e particulada. Os protozoários podem ser

subdivididos em grupos de acordo com o tipo de organela utilizada para a

locomoção e captura de alimentos:

a) Ciliados: possuem cílios que são organelas curtas e numerosas em forma de

fio, que se projetam da parede da célula. Os cílios encontram-se arranjados

em sentido longitudinal, diagonal e oblíquos, apresentando movimentos

ondulatórios e coordenados ao longo da célula. Podem ser agrupados em

Livre Nadantes (são os ciliados que possuem cílios distribuídos regularmente

por toda a célula e nadam livremente entre os flocos presentes), Predadores

de Flocos (são microrganismos cuja célula é achatada dorso-ventralmente e

seus cílios são modificados e agrupados na parte que fica em contato com o

substrato para retirar alimento dos flocos pelo batimento dos cílios ventrais

24

sobre o sedimento), Fixos ou Pedunculados (podem ser isolados ou coloniais

e estão ligados ao substrato por um pedúnculo e seus cílios encontram-se

concentrados na região anterior, próximo à boca).

b) Flagelados: são os protozoários que se locomovem através do flagelo, que

são organelas em forma de filamento alongado, pouco numerosos, que se

projetam de pontos específicos da célula (geralmente na parte anterior).

Executam movimento ondulatório na água, propelindo a célula para o próprio

lado ou para o lado oposto da inserção do flagelo. Sob condições adversas, o

flagelo pode se perder, mas sua regeneração ocorre prontamente. São

subdivididos em dois grupos: Fitoflagelados e Zooflagelados.

c) Amebas: locomovem-se através de organelas transitórias, os pseudópodes,

que são simplesmente prolongamentos do protoplasma, formados em

qualquer ponto da célula. Geralmente são transparentes e não possuem

forma bem definida. Nas espécies que apresentam carapaça, a forma varia de

arredondada a globosa e podem apresentar coloração parda quando ocorre

impregnação por sais de ferro. A carapaça pode ser secretada pela própria

ameba ou ser formada de partículas retiradas do meio. Podem ser de

natureza calcária, silicosa ou orgânica. São microrganismos lentos e sua

visualização muitas vezes fica comprometida, pois podem ser confundidas

com os flocos aos quais se ligam. A forma estrelada adotada por muitas

espécies está relacionada com o stress sofrido quando da manipulação da

amostra em que se encontra.

d) Micrometazoários: são microrganismos formados por várias células que,

agrupadas, formam verdadeiros tecidos. Células diferentes possuem funções

diferentes. No processo de lodos ativados são representados pelos anelídeos,

rotíferos, nematóides e tardígrados.

Todo este conjunto de (micro) organismos sintetiza e secreta enzimas, as

quais contribuem, algumas mais e outras menos, na hidrólise de compostos

químicos, incluindo-se aí o FDA, pois esta molécula é hidrolisada indistintamente por

lípases, esterases e proteases (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982).

Com relação às características microbianas importantes para a

bioacessibilidade e biodisponibilidade aos/dos compostos orgânicos de uma

amostra, devemos nos lembrar que são muitos os fatores que influenciam estes

25

processos, bem como são muitos os fatores microbiológicos para se chegar a uma

biodegradação completa de uma substância intrinsecamente biodegradável. Assim,

entre as características microbiológicas relevantes estão a morfologia, fisiologia e

comportamento adaptativo das células e populações e, mesmo a dinâmica e a

ecologia da comunidade natural onde se encontra a substância a degradar. O modo

como os microrganismos mobilizam as substâncias orgânicas é muito similar ao que

acontece com uma extração química e estes dois aspectos são importantes na

metabolização como também na metodologia para quantificação da matéria

orgânica, sendo portanto de interesse aprofundar um pouco estas questões.

Interações morfológicas entre substância orgânica e microrganismos dizem

respeito ao tamanho e forma, como também da abundância e distribuição espacial

de ambos (JOHNSEN; WICK; HARMS, 2005). Subentende-se uma boa mobilização

do substrato como um rápido acesso do microrganismo à substância a ser

degradada e caso não houver barreiras entre eles, podemos falar então de fácil

acessibilidade desta substância ao microrganismo. Em termos morfológicos, um

aumento da área superficial associado a uma maior quantidade de “dobras” na

arquitetura das paredes celulares, assim como uma melhor adequação do espaço

tridimensional ajudam nesta mobilidade-acessibilidade interfacial da substância

orgânica com o microrganismo (WICK et al, 2002). Caso houver a fixação da

substância orgânica em algum tipo de material (e.g., formação de biofilme em

geomaterial), a acessibilidade do microrganismo à substância poderá aumentar

grandemente a eficiência da biodegradação pelo aumento da transferência de

massa, fenômeno este conhecido como sorção (SPÄTH; FLEMMING; WUERTZ,

1998).

Com relação aos aspectos fisiológicos dos microrganismos que influenciam

na metabolização da matéria orgânica, o primeiro aspecto que deve ser considerado

é a aquisição evolucionária do sistema de alta absorção das susbtâncias que pode

se dar por difusão rápida de um composto (BUTTON, 1991). Nesse sentido, há uma

relação direta entre a afinidade específica e a taxa de difusão onde a disponibilidade

do substrato é limitada (HARMS; ZEHNDER, 1994). Produtos químicos presentes no

meio-ambiente em baixas concentrações ou que se transferem por com baixas taxas

de difusão não abrem novos caminhos metabólicos nos microrganismos. Nesse

sentido, o crescimento da biomassa dos organismos via uma nova rota metabólica

também é afetada por uma baixa acessibilidade aos compostos orgânicos (BOSMA

26

et al, 1997), o que pode ser remediado quando os microrganismos usam misturas de

substratos para a metabolização, o que se percebe claramente com os fungos e

também com algumas bactérias em condições oligotróficas (KOVAROVA-KOVAR;

EGLI, 1998). Uma outra possibilidade fisiológica para aumentar a biocessibilidade é

a síntese e excreção de moléculas ativas na superfície celular, similares à

detergentes, mas com modo de ação bem distinto destes, pois estes biosurfactantes

e bioemulsificadores agem em micro-escala dentro de microporos (RON;

ROSENBERG, 2001). Os mecanismos que aumentam a bioacessibilidade incluem

aumento da dissolução da matéria orgânica, dispersão de aglomerados de matéria

orgânica e dispersão da fase líquida não-aquosa (NEU, 1996; VOLKERING;

BREURE; RULKENS, 1997). Uma outra adaptação fisiológica negligenciada até o

presente momento em termos de biocessibilidade diz respeito à capacidade

intrínseca do organismo para degradar a matéria orgânica natural pela desorção

(EKSCHMITT et al, 2005), o que seria equivalente a uma oxidação suave por

persulfato.

A Quimiotaxia é uma adaptação do comportamento que permite ao

microrganismo localizar fontes de substâncias e aumentar a biodisponibilidade das

mesmas (desde que as substâncias estejam bioacessíveis) por movimentação a

favor do gradiente (quimiotaxia positiva) (PANDEY; JAIN, 2002). Para substâncias

poliméricas naturais foi relatado que o comportamento quimiostático em combinação

com o uso de enzimas extracelulares representa o meio mais rápido para o

microrganismo encontrar alimento particulado (VETTER et al, 1998), ou por outro

lado, fugir de substâncias com poder tóxico para os microrganismos (quimiotaxia

negativa), levando ao termo de equilíbrio entre a necessidade de alimento e fuga do

tóxico. Embora a quimiotaxia requeira uma solubilidade mínima da substância,

teoricamente é possível que a vizinhança composta pela parte insolúvel dê origem a

quimiotaxia via agentes solubilizantes e/ou ação de exoenzimas (VETTER et al.,

1998).

Com relação à importância da dinâmica da comunidade microbiana e das

interações ecológicas na biodegradação, estas podem influenciar via os

mecanismos supra-citados, contudo, deve ser salientado que a comunidade possui

uma maior flexibilidade e uma maior variabilidade do que os microrganismos que

agem isoladamente. Assim, mudanças dentro da comunidade influencia no balanço

destes mecanismos, o que pôde ser notado pela sucessão que ocorreu na

27

comunidade quando da biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos polinucleares

de diferentes tamanhos moleculares (UYTTEBROEK et al, 2006). A observação

freqüente de mudança de dominância na comunidade de esfingomonas para

micobactérias parece refletir a adaptação da comunidade aos diferentes níveis de

biodisponibilidade de substratos (LEYS et al, 2005; UYTTEBROEK et al, 2006). Isto

pode ser demonstrado para o caso das interações ecológicas que ocorrem quando

organismos bioturbadores remexem, por exemplo, os solos, aumentando a

bioacessibilidade das substâncias no meio (HARMS; WICK, 2006).

Em suma, a biodegradação de substâncias orgânicas em um meio é

dependente da bioacessibilidade e da biodisponibilidade desta substância para os

microrganismos. Contudo, vários fatores abióticos e bióticos influenciam neste

processo e o que se mede nos testes de biodegradação é o saldo de todas estas

interações.

4.3 Métodos de Mensuração da Matéria Orgânica em Meio Líquido

Para poder quantificar a biodegradação, geralmente faz-se medidas (diretas

ou indiretas) da quantidade de matéria orgânica presente no meio em determinados

tempos. Para tanto, existem inúmeras técnicas analíticas que possibilitam também

identificar o tipo de substância orgânica presente no meio, podendo identificar por

exemplo se é um metabólito oriundo da biodegradação. Outras técnicas fazem uso

de mensurações de outros parâmetros relacionados com as reações de

biodegradação (e.g., liberação de CO2 ou consumo de O2), porém não se conhece

nenhuma técnica que faça uso de atividade enzimática para mensurar a

biodegradabilidade da matéria orgânica de uma amostra tanto sólida como líquida.

A estimativa (direta ou indireta) da matéria orgânica por atividade enzimática

é de grande interesse, pois englobaria tanto o aspecto da bioacessibilidade, quanto

da biodisponibilidade das substâncias para os microrganismos, o que é de muito

interesse para o conhecimento da biodegradabilidade real (ou intrínseca) da

amostra. Em termos de biodegradação nos solos, isto pode ser considerado a

melhor medida do potencial de remediação de um solo contaminado, fato este que

nenhuma análise química pode ajudar a prever, pois esta se serve de métodos de

28

extração da matéria orgânica que pode ser limitado pela questão da acessibilidade

do solvente para extrair a matéria orgânica que será analisada (SEMPLE; MORRIS;

PATON, 2003). Nesse sentido, idealmente a extração deveria não ter problemas de

acessibilidade aos compostos químicos, mas isto não é o caso real, pois toda

extração deve ser acompanhada pelos valores de percentagem de recuperação dos

compostos extraídos da amostra. Também não devemos nos esquecer que a

extração química e a mobilização microbiológica de compostos químicos acontecem

em diferentes condições, tanto espaciais, quanto temporais. O aspecto espacial é o

mais importante, pois a extração química acaba por destruir a amostra, enquanto

que a mobilização microbiológica não altera as propriedades da amostra analisada.

Se ainda for levado em consideração o aspecto custo, então a medida/estimação

microbiológica da matéria orgânica em uma amostra passa a ser mais vantajosa

ainda do que a análise química. Uma diferença que deve ser enaltecida quanto à

natureza da molécula que está sendo extraída/analisada é que a parede celular

geralmente não absorve moléculas cuja massa molar é superior a 600 g mol-1 por

causa do tamanho dos poros onde acontece a difusão (WEISS et al, 1991).

Para efeitos de discussão posterior, haja visto as implicações deste trabalho

sobre a quantificação da matéria orgânica, as principais técnicas de mensuração da

matéria orgânica são descritas a seguir.

4.3.1 Demanda Química do Oxigênio (DQO)

Pode ser conceituada como a quantidade de oxigênio necessária para

oxidação da matéria orgânica realizada por um agente químico (dicromato de

potássio). Os valores da DQO normalmente são maiores que os da DBO5,20, sendo o

teste realizado num prazo menor (cerca de 3 horas). O aumento da concentração de

DQO num corpo d'água se deve principalmente a despejos de origem industrial,

sendo indispensável nos estudos para caracterizar esgotos sanitários e de efluentes

industriais. A DQO é muito útil quando utilizada conjuntamente com a DBO5,20 para

observar a biodegradabilidade de despejos. A oxidação do dicromato de potássio é

maior do que resulta da ação de microrganismos na DBO, exceto raríssimos casos

como hidrocarbonetos aromáticos e piridina. Por isso os resultados da DQO de uma

29

amostra são superiores aos de DBO5,20. Como na DBO5,20 mede-se apenas a fração

biodegradável, quanto mais este valor se aproximar da DQO significa que mais

facilmente biodegradável será o efluente. É comum aplicar-se tratamentos biológicos

para efluentes com relações DBO5,20 /DQO > 2,0 (METCALF; EDDY, 1991).

Conforme já salientado, apesar de ser um método de determinação da matéria

orgânica de uma amostra que possui muitas vantagens, a DQO sofre a crítica que

não é um método natural e que, portanto, só é válido para estudos de ETES, mas

não para estudos ambientais.

4.3.2 Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO)

A DBO é a quantidade de oxigênio necessária para oxidar a matéria

orgânica por decomposição microbiana aeróbia para uma forma inorgânica estável.

A DBO5,20 é normalmente considerada como a quantidade de oxigênio consumido

durante um determinado período de tempo, numa temperatura de incubação

específica. Um período de tempo de 5 dias numa temperatura de incubação de 20°C

é freqüentemente usado e referido como DBO5,20. Pelo fato de a DBO5,20 somente

medir a quantidade de oxigênio consumido num teste padronizado, não indica a

presença de matéria não biodegradável, nem leva em consideração o efeito tóxico

ou inibidor de materiais sobre a atividade microbiana, o que pode limitar seriamente

a aplicação desta metodologia (VON SPERLING, 1996).

4.3.3 Oxigênio Consumido (OC)

O método do Oxigênio Consumido é quimicamente similar ao teste de DQO,

mudando o oxidante, o qual é o permanganato de potássio. Em termos de definição,

o OC é a quantidade de oxigênio necessária para oxidar a matéria orgânica

carbonada da amostra. Assim o oxigênio consumido é um indicador da concentração

de matéria orgânica que pode ser oxidada em condições menos energéticas. A

30

oxidação com permanganato é mais utilizada para águas limpas, com baixa

concentração de matéria orgânica, sendo a reação principal descrita a seguir:

MnO42- (aq) + 8 H+

(aq) + 5 e- → Mn2+ (aq) + 4 H2O Eo = + 1,55 V

Como a oxidação é mais suave do que no caso da DQO, os resultados do

teste DQO são normalmente maiores que do Oxigênio Consumido usando

permanganato, pois neste caso a oxidação ocorre em temperaturas inferiores a

100°C e em condições menos ácidas.

4.3.4 Carbono Orgânico Total (COT)

Nesta técnica, a análise direta do teor de matéria orgânica é avaliada por

meio da medida da concentração de carbono orgânico total (COT). A técnica é

baseada na oxidação da matéria orgânica pela introdução da amostra numa câmara

de reação aquecida a uma temperatura de aproximadamente 670°C empregando-se

um catalisador de platina adsorvido sobre óxido de alumínio. Desta forma, a água é

vaporizada e o carbono do analito transformado em CO2, sendo posteriormente

quantificado em um analisador de infravermelho não dispersivo. O carbono

inorgânico é medido utilizando-se uma câmara de reação que contém ácido

fosfórico, que permite a sua transformação em CO2, que é quantificado da mesma

forma descrita anteriormente. O carbono orgânico total é então deduzido pela

diferença entre o carbono total e o inorgânico (REEVE, 1994). A análise de COT

emergiu como uma alternativa rápida e segura às clássicas mas lentas análises da

demanda bioquímica de oxigênio (DBO) e da demanda química de oxigênio (DQO),

tradicionalmente reservados para avaliar a contaminação potencial das águas

residuais (REEVE, 1994).

31

4.4 Aplicações da Hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA)

As informações que seguem sobre a Fluoresceína foram extraídas da

Wapedia (WAPEDIA, 2010).

A fluoresceína é um xanteno, uma classe de compostos largamente utilizados

como corantes. Foi sintetizada pela primeira vez pelo químico alemão Johann

Friedrich Adolf von Bayer. Ela recebeu este nome em função da coloração

fluorescente amarelo-esverdeada que apresenta em solução alcalina, também

conhecida como uranina. Seu ponto de fusão é de 314-316°C. Apresenta-se como

sólido alaranjado escuro. Mesmo na forma sódica é apenas levemente solúvel em

água. Solúvel em álcool. A fluorescência desta molécula é muito alta, sua excitação

ocorre a 494 nm e a emissão a 521 nm.

A fluoresceína tem uma pKa de 6,4 e seu equilíbrio de ionização conduz a

absorção e emissão dependente do pH na faixa de 5 a 9. Assim, os tempos de vida

das formas protonadas e deprotonadas fluorescentes são aproximadamente 3 e 4

ns, as quais permitem a determinação do pH de medidas não intensamente básicas.

Os tempos de vida podem ser recuperados usando contagem de fótons isolados ou

por fluorometria de modulação de fases. A fluoresceína é sintetizada pela reação

entre anidrido ftálico e resorcinol, em presença de cloreto de zinco ou ácido sulfúrico

concentrado, que atuam como agentes desidratantes, via a reação de Friedel-Crafts

ou ainda pelo ácido metanossulfônico como ácido de Lewis e catalisador (Figura 1).

Figura 1: Reação 1. Fonte: Wapedia, 2010.

Esta síntese pode ser usada numa identificação qualitativa entre fenol e

resorcinol. Após a condensação do fenol em teste com o anidrido ftálico, a posterior

32

reação com solução hidróxido de sódio dará cor rosa para fenolftaleína (portanto

fenol) e forte fluorescência verde, para fluoresceína (portanto resorcina).

A fluoresceína, especialmente na forma de seu sal sódico, a uranina, é

comumente usada como corante de desinfetantes, assim como para traceamento de

tubulações e tanques, tanto de água tratada, quanto de esgoto, para detecção de

vazamentos, pela forte fluorescência que apresenta, mesmo em soluções muito

diluídas. A fluoresceína é largamente utilizada na determinação de bromo e iodo,

formando os compostos: eosina (coloração rosa) e eritrosina (coloração rosa-

arroxeado), respectivamente. A eosina é utilizada para tingir lã e seda, cosméticos,

tintas e papéis, além de ser um "corante microscópico", colorindo um grupo de

leucócitos existentes no sangue, os eosinófilos. A eritrosina, tem amplo uso na

coloração de alimentos e em dentifrícios indicadores de placa bacteriana. Em

oftalmologia, fluoresceína é aplicada topicamente na forma de uma gota no olho,

dada oralmente, ou injetada intravenosamente para produzir um angiograma de

fluoresceína.

A hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) é um método que avalia a

atividade hidrolítica indiscriminada de microrganismos sobre a molécula de FDA, a

qual é hidrolisada por várias enzimas (lípases, proteases e esterases) presentes nos

microrganismos do meio onde se encontra a molécula do FDA (Figura 1). Assim, a

medida do grau da hidrólise serve como uma medida da atividade microbiana total

do solo (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982), o que pode estar relacionado com a

quantidade de matéria orgânica presente na amostra.

Figura 2: Fórmula estrutural do Diacetato de Fluoresceína. Fonte: Sigma-Aldrich (200?).

Atualmente a hidrólise de FDA é usada em pesquisas para determinar a

atividade enzimática do solo e tem apresentado resultados confiantes. A

33

mensuração da atividade enzimática do solo usando a hidrólise de Diacetato de

Fluoresceína (FDA) tem como princípio a determinação colorimétrica da

Fluoresceína hidrolisada que é o resultado da ação de uma série de enzimas

hidrolíticas encontradas no solo (MAIA, 2004 (Figura 2). O método de hidrólise de

Diacetato de Fluoresceína pode medir a taxa de desenvolvimento da biomassa

microbiana através da coloração desenvolvida pela Fluoresceína, o que pode ser

quantificada espectofotometricamente. O método FDA tem sido utilizado para medir

a atividade microbiana total do solo, lixo doméstico e o crescimento filamentoso de

fungos (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982), sendo que este estudo é considerado

como ponto de partida para toda uma série de estudos que o sucederam, visto que

ele introduziu a aplicação mais abrangente desta técnica nas questões ambientais.

Como não se encontrou estudos da FDA na determinação da atividade enzimática

em amostras industriais/ambientais e nem se encontrou estudos de mensuração da

biodegradabilidade intrínseca de amostras contendo matéria orgânica em meio

líquido, a revisão bibliográfica focou-se nos estudos mais recentes com a matriz solo

para a qual existe uma literatura substancial desde 1970.

Figura 3: Reação de hidrólise do FDA. Fonte: Green, Stott e Diack (2006).

Fontvieille, Outaguerouine e Thevenot (1992) propuseram um protocolo para

aplicar a hidrólise da FDA como método para medir a atividade enzimática e/ou para

a contagem bacteriana em lodos ativados de estações de tratamento de esgotos .

Estes autores compararam os resultados obtidos com os resultados de outros

métodos baseados na atividade do sistema transportador de elétrons (STE) e

consumo de oxigênio (CO). Os autores concluíram que a hidrólise da FDA não foi

proporcional ao consumo de oxigênio, enquanto o STE o foi, mas salientaram que a

hidrólise da FDA permite avaliar a atividade microbiológica em situações de

34

monitoramento onde o tempo e o espaço dificultam o uso de outras metodologias

para este objetivo.

Já no trabalho de Lestan et al (1996), foi utilizado o método da hidrólise da

FDA para determinar o potencial biológico de um fungo para degradar o

Pentaclorofenol (PCP), assim como avaliar o potencial de proliferação da biomassa

fúngica produzida no substrato. Os autores concluíram que este método foi útil para

estimar a biomassa, assim como para avaliar o potencial biológico e de proliferação

de fungos em solos contaminados por este fenol, indicando que a composição do

substrato, temperatura e estrutura do solo são importantes fatores que contribuem

para a alta atividade metabólica e de proliferação do fungo P. chrysosporium.

Leszczy�ska e Oleszkiewic (1996) estudaram a presença de substâncias

químicas tóxicas nos lodos ativados que prejudicavam os microrganismos usando a

hidrólise da FDA como critério de efeito. Os resultados mostraram uma relação

dose-dependente inversa na atividade enzimática, ou seja, maior a concentração do

tóxico, menor a atividade enzimática. Os valores tóxicos encontrados foram

comparáveis com os dados da literatura para os tóxicos 2-Monoclorofenol; 2,4-

Diclorofenol e 3,5-Diclorofenol, mas não para o 4-Monoclorofenol. Os autores

concluíram que o método da inhibição da atividade esterásica da FDA mostrou ser

exato e preciso (reprodutível) para determinação da toxicidade química em lodos

ativados.

Em um estudo conduzido por Silva, Siqueira e Costa (2004), testou-se o

método de hidrólise de diacetato de fluoresceína (FDA) para determinar a atividade

microbiológica de um solo submetido a quatro tratamentos: reflorestamento com

espécies nativas da mata atlântica, reflorestamento com espécies exóticas,

reflorestamento com nim, sucupira e pau-pombo, solo não submetido a

reflorestamento, além de solo sob mata atlântica nativa que foi utilizada como

padrão de comparação. Os tratamentos que apresentaram maior atividade

microbiológica foram os solos reflorestados com espécies nativas e exóticas. Os

autores concluíram que a hidrólise de FDA foi eficaz como indicador da atividade

microbiológica nos solos submetidos a reflorestamentos.

Em um estudo realizado no nordeste do Brasil, Oliveira et al (2007) usaram o

método da hidrólise de Diacetato de Fluoresceína (FDA) para diferenciar

microbiologicamente os solos de cinco agroecossistemas quanto à atividade

microbiana na região do Semi-Árido do Brasil, sendo que a hidrólise ocorreu em

35

todos os tipos de solos. Assim, a atividade microbiológica foi notadamente alta em

solos sob cultivo de Gliricidia sepium, com 0,605 �g FDA hidrolisada min-1 g-1 de

solo, e foi baixa em solos nativos sob a caatinga, que atingiu o valor de 0,355 �g

FDA hidrolisada min-1 g-1 de solo, que por sua vez, foi semelhante ao solo sob palma

forrageira Opuntia fícus indica, obtendo-se um valor de 0,387 �g FDA hidrolisada

min-1 g-1 de solo. Os níveis de atividade microbiológica dos agroecossistemas

constituídos pelos solos sob pastagem cultivados com Urocloa mosambicensis e

áreas reflorestadas com leguminosas arbóreas (Mimosa caesalpiniaefolia) também

foram similares entre si apresentando valores de 0,544 e 0,519 �g FDA hidrolisada

min-1 g-1 de solo, respectivamente.

Silveira (2007) determinou as atividades enzimáticas em solos agrícolas

representativos de 11 localidades do Rio Grande do Sul e relacionou-as com

atributos químicos, físicos e químicos dos diferentes tipos de solos. Em cada local

foram avaliadas áreas sob vegetação nativa de mata e campo (utilizadas como

referência) e áreas cultivadas sob sistema de manejo conservacionista e

convencional, sendo determinadas as atividades das enzimas �-glucosidase,

fosfatase ácida, urease e hidrólise de FDA, o carbono da biomassa microbiana e a

respiração microbiana nas amostras de solo superficial. De maneira geral, os solos

com maiores teores de carbono orgânico apresentaram os maiores valores para as

atividades de �-glucosidase, fosfatase ácida e urease, com alta correlação positiva.

Entretanto, esta relação com o teor de carbono orgânico não foi observada com

carbono da biomassa, nem com a respiração microbiana. Os solos sob vegetação

nativa em geral apresentaram maior atividade enzimática, seguidos daqueles sob

sistemas mais conservacionistas, como o plantio direto. Os menores valores

geralmente ocorreram em solos sob sistema de plantio convencional. Os valores de

atividades enzimáticas tenderam a ser maiores nos períodos mais quentes. A �-

glucosidase, urease e fosfatase ácida mostraram-se sensíveis em detectar

mudanças, não só entre os sistemas de manejo de solo, mas também entre os

locais avaliados. Segundo esta autora, a hidrólise de FDA não se mostrou adequada

para indicar a qualidade do solo por apresentar valores similares nos diferentes

locais e sistemas de manejo.

Um estudo mostrou que o método da hidrólise da FDA pode ter

interferências por substâncias químicas na medida em que a atividade microbiana é

medida na camada superficial do solo (serrapilheira) (ALARCÓN-GUTIÉRREZ et al,

36

2007). Para entender a origem destas interferências, algumas amostras de

serrapilheira foram esterilizadas por radiação � e por autoclavagem e algumas

amostras foram contaminadas com diferentes substâncias (aminoácidos, glicose,

sorbitol e ácidos húmicos). As amostras irradiadas não mostraram diferença

significativa comparativamente às amostras-controle não-irradiadas na hidrólise da

FDA, permitindo concluir que a radiação � não interfere com as enzimas.

Contrariamente, o aquecimento no autoclave diminuiu consideravelmente a hidrólise

da FDA nas amostras contaminadas, indicando interferências non-enzimáticas nesta

hidrólise. Como a humificação aumenta com a profundidade da serrapilheira e a

interferferência na hidrólise da FDA diminuiu em função da profundidade da

serrapilheira, os autores concluíram que a degradação das substâncias interferentes

e/ou quelação das mesmas pelos ácidos húmicos deveria estar ocorrendo, o que

permitiu aventar a hipótese de que alguns aminoácidos (lisina, arginina, histidina e

cisteina) foram os principais interferentes. Diante disso, os autores sugeriram que o

uso da tampão fosfato (50 mM, pH 7.0) com tempo de incubação < 30 minutos, em

temperaturas entre 30 e 40°C, interferem minimamente na hidrólise da FDA nas

amostras de serrapilheira.

37

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Descrição das áreas de estudo

Os pontos amostrais foram escolhidos de acordo com a disponibilidade

logística, autorização para coletas e categoria de efluente, para poder testar

amostras com diferentes condições de pH original, diferentes composições químicas

e diferentes bactérias que “contaminam” estes tipos de efluentes. Os pontos de

estudo foram selecionados aleatoriamente, tendo em vista, facilidade de acesso aos

diferentes pontos de coletas dos efluentes. A seguir são apresentadas as

coordenadas geográficas das áreas de onde foram coletadas as diferentes amostras

ambientais, sendo utilizado GPS modelo G520 slim, 2009, Orange Coll, para melhor

precisão dos resultados.

Amostras Ambientais Coordenadas Efluente Doméstico (ED) [S 26°14’19.83” x O 49°21’14.32”] Efluente Hospitalar (EH) [S 26° 53’41.35” x O 48°40’36.26”] Rio Poluído (RP) [S 27°33’35.03’’ x O 48°29’37.13”] Água Cinza (AC) [S 27°33’35.05” x O 48°29’48.35”] Agro-Industrial (AI) [S 28°44’36.49” x O 49°28’48.51”] Indústria Têxtil (IT) [S 27°4’25.76” x O 48°53’51.98”]

Quadro 1: Coordenadas geográficas das áreas de onde foram coletadas as

amostras ambientais. Fonte: Elaborado pela autora.

38

Figura 4: Ponto das coletas das amostras Fonte: Google, 2010.

5.2 Coleta e Preparação das Amostras

Para a realização dos ensaios foram coletados esgotos domésticos da fossa

séptica e caixa de gordura, efluentes de um hospital, rio poluído, efluentes industriais

têxtil e agro-industrial. Foram coletados volumes necessários para os diferentes

tipos de análises, em diferentes condições, sendo que os experimentos foram

repetidos em 3 datas diferentes, a fim de contemplar a variabilidade na composição

dos efluentes. Todas as três coletas realizadas foram do tipo simples, ou seja, as

coletas ocorreram em um único período do dia. Foram coletados 5 L de cada

efluente, acondicionados em frascos de âmbar, sendo que as coletas ocorreram em

diferentes condições ambientais. Os frascos foram identificados e encaminhados ao

laboratório de Remediação Ambiental da UNIVALI para serem processadas,

primeiramente separado o volume suficiente para cada análise (DBO, DQO, MOO,

OC e FDA), seguido pela medida do pH, filtradas com filtro de papel grosso e

acondicionadas em erlenmeyers para a realização dos experimentos. Antes de

colocar nos erlenmeyers definitivos foram feitas diluições de acordo com a coloração

39

das amostras numa proporção de: 1/1; 1/4; 1/8; 1/16 e 1/32 (em amostras com

coloração como o têxtil) como mostra a Tabela 1. Para o controle foram feitas

triplicatas estéreis, esterilizadas com autoclave (sem fluoresceína) ou choque de pH.

Para cada diluição também foram feitas triplicatas, medido e controlado o pH. Um

estudo paralelo foi desenvolvido em laboratórios particulares para avaliação da

metodologia proposta neste trabalho, onde foram testadas 4 amostras industriais

denominadas de A, B, C e D, segundo as mesmas metodologias descritas neste

capítulo.

Tabela 1: Diluições feitas nas amostras analisadas no presente trabalho.

Origem da Amostra Diluições Doméstico 1/1 1/4 1/8 Têxtil 1/1 1/4 1/8 1/16 1/32 Hospitalar 1/1 1/4 1/8 Rio 1/1 1/4 1/8 Água Cinza 1/1 1/4 1/8 Agroindústria 1/1 1/4 1/8

5.3 Metodologia de quantificação da matéria orgânica

Para determinação da matéria orgânica das amostras foram utilizados 3

metodologias diferentes: DBO5, DQO, Oxigênio Consumido, Calcinação e hidrólise

da FDA, as quais são descritas sucintamente a seguir.

5.3.1 Procedimento para a determinação da DBO5

A metodologia para determinação da Demanda Bioquímica de Oxigênio

(DBO5) foi baseada no protocolo de (APHA; AWWA; WEF, 1998). A amostra foi

diluída entre as concentrações de 100 e 1,6% em frascos de DBO. Foi feita a

quantificação imediata da concentração de OD (Oxigênio Dissolvido) e após

intervalos de 24 h, durante 5 dias. A incubação foi feita à 20°C e na obscuridade.

40

Foram feitas diluições das amostras conforme previsto pela metodologia

para cada tipo de amostra. Os valores de DBO foram corrigidos pelo fator de diluição

(FD).

O cálculo da demanda bioquímica de oxigênio após cinco dias de incubação

(DBO5) foi calculado como segue:

DBO5 = OD inicial – OD final

FD

Onde:

DBO5 = demanda bioquímica de oxigênio após cinco dias de incubação;

OD inicial = medida de oxigênio dissolvido no início do experimento;

OD final = medida de oxigênio dissolvido após cinco dias de incubação da

amostra;

FD = fator de diluição utilizado para o ensaio.

5.3.2 Procedimento para determinação da DQO

As determinações de DQO foram realizadas de acordo com a metodologia

padrão (APHA et al., 1998) que consiste em digestão em tubo fechado, seguida de

determinação espectrofotométrica (espectrofotômetro Instrutherm) em 490 nm.

Como reagentes usou-se as amostras além de peróxido de hidrogênio e sulfato

ferroso heptaidratado de grau analítico (marca Vetec). Em todos os experimentos,

desde a adição dos reagentes até a introdução da amostra nos tubos de DQO,

gastou-se o tempo máximo de 20 s. Foram feitas duplicatas de todos os

experimentos do estudo de interferência inorgânica na DQO. O cálculo para

determinação da DQO foi determinado a partir da informação da NBR 10357 que diz

que o biftalato de potássio tem um valor teórico de DQO de 1176 mg O2 /mg.

DQO em mg/L = (Concentração de biftalato de potássio X 1,176 X 1000) mL de amostra

41

Onde:

ml de amostra = 5 mL

5.3.3 Procedimento para determinação da Matéria Orgânica Oxidável (MOO) por

Calcinação

Para o procedimento da determinação da matéria orgânica oxidável das

amostras usou-se o processo de calcinação de um volume conhecido da amostra,

no caso 1 L. Este procedimento de calcinação da amostra foi realizado na

temperatura de 400°C, segundo a metodologia proposta por Adad (1982).

Assim, as amostras foram filtradas e 1 Kg de cada amostra foi

acondicionada em becker de 2 L. Após a evaporação da água em caixa de areia e

na estufa a 110°C, o material restante foi pesado e levado para estufa durante 2 h a

400°C. Após resfriamento, o conjunto foi pesado novamente e o material volatilizado

foi considerado como sendo matéria orgânica oxidável, a qual foi relacionada com o

volume de 1 L da amostra. Na determinação da MOO não foram feitas diluições,

pois este método não está sujeito a nenhuma interferência na determinação da

matéria orgânica.

5.3.4 Determinação do Oxigênio Consumido.

A metodologia para determinação da matéria orgânica pelo método do

Oxigênio Consumido foi baseada na metodologia publicada por Adad (1982).

Os reagentes utilizados foram: Permanganato de potássio 0,0125N; oxalato

de sódio 0,0125N; solução de ácido sulfúrico 1:3. Após a adição dos reagentes,

deixous-se ocorrer a oxidação por 30 min e calculou-se o Oxigênio Consumido na

amostra (em p.p.m.), usando-se a expressão:

O.C = ( (K – N) – (k – n) ) . 10 Vol. da amostra (mL)

42

Onde:

K = volume total em mililitros de KMnO4, gasto na amostra, incluindo o

adicionado antes da digestão;

N = volume em mililitros de oxalato usado na amostra;

k = volume em mililitros de KMnO4 usado em branco;

n = volume em mililitros de oxalato usado no branco.

5.3.5 Determinação da atividade enzimática pela hidrólise da FDA

Este método consiste em quantificar a hidrólise do Diacetato de

Fluoresceína [3’,6’-diacetilfluoresceina (FDA)] em amostras que contém matéria

orgânica com bactérias. Basicamente, o teste foi iniciado com a preparação de uma

solução tampão de fosfato de sódio 60 mM, pH 7,6 (8,7g de K2HPO4 + 1,3g KH2PO4

para 1 L de água), sendo que o pH foi ajustado com o HCl 0,01M. As amostras

coletadas em campo foram filtradas em papel-filtro semi-quantitativo e em seguida

foram distribuídas em tubos de ensaios (5 mL de amostra) em três repetições para

cada diluição de cada amostra. Concluída esta fase, acrescentaram-se 0,2 mL da

solução de diacetato de fluoresceína (concentração final 2 mg.mL-1). No caso das

diluições sucessivas, as amostras (2,5 mL) foram diluídas pela adição de 2,5 mL de

tampão fosfato. A preparação da solução de FDA foi feita pela dissolução de 40 mg

de Diacetato de Fluoresceína (FLUKA 31545) em 5 mL acetona p.a. e 15 mL água

destilada. Posteriormente a esta etapa os frascos foram fechados com folhas de

alumínio, a mistura foi incubada na temperatura de 27°C por até 36 h. A cada

intervalo de tempo desejado foram tomadas as alíquotas para análise no

espectrofotômetro à 490 nm (Espectrofotômetro INSTRUTHERM, Modelo UV 1100).

Os resultados foram expressos de forma bruta, em valores de variação das unidades

de absorbância.

43

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Otimização da metodologia de quantificação da matéria orgânica

intrinsecamente biodegradável pela hidrólise da FDA

O primeiro passo consistiu na determinação da quantidade de reagente

hidrolítico que deveria ser adicionado à amostra. Esta quantidade não poderia ser

muito grande devido a presença da acetona como diluente e nem muito pequena,

para não comprometer a hidrólise por falta de reagente hidrolítico. Como veremos

posteriormente, estas concentrações podem ter afetado alguns resultados. Assim, a

Tabela 2 nos mostra como variou a absorbância em função da quantidade de FDA

adicionado aos 5 mL de amostra no tubo de ensaio.

Tabela 2: Influencia da concentração da fluoresceína na variação temporal da

absorbância de duplicatas das amostras de um efluente agroindustrial

bruto.

Absorbância (490 nm) Amostra/tempo 0 h 1h 2h 3h 4h 5h

0,188 0,173 0,126 0,136 0,143 0,147 Efluente + FDA 80 µL/mL 0,185 0,169 0,123 0,133 0,137 0,145

0,200 0,192 0,130 0,120 0,172 0,167 Efluente + FDA 60 µL/mL 0,197 0,142 0,086 0,052 0,127 0,130

0,451 0,437 0,483 0,549 0,656 1,399 Efluente + FDA 40 µL/mL 0,441 0,438 0,419 0,440 0,456 0,950

A Tabela 2 nos mostra que os resultados da absorbância variaram

consideravelmente em função da quantidade de FDA adicionada. Quando estas

quantidades acrescentadas aos tubos foram de 300 ou 400 µL de FDA não houve

uma evolução da absorbância, indicando alguma interferência físico-química no

processo hidrolítico, muito provavelmente ligado à presença de acetona usada na

solubilização da FDA que pode ter inibido a atividade enzimática, o que não se

percebeu quando foram adicionados 200 µL de FDA. Deve ser ressaltado que a

44

acetona presente nos 200 µL de FDA pode ter afetado o valor da absorbância, mas

mesmo assim, os resultados mostram que é possível se obter respostas decorrentes

das atividades hidrolíticas ao se usar esta concentração.

Para testar se a autoclavagem poderia ou não influenciar na hidrólise da

fluoresceína foi feita uma experiência com amostras autoclavadas dos 5 tipos de

amostras estudadas neste trabalho de dissertação (Tabela 3), com e sem adição

prévia de FDA.

Tabela 3: Influencia da autoclavagem nas absorbâncias medidas após 2 e 24 h das

amostras após autoclavagem com e sem a adição prévia de 200µL de

fluoresceína no meio reacional.

Com adição prévia de FDA Sem adição prévia FDA Amostra 2 h 24 h 2 h 24 h

0,270 0,245 0 0 0,316 0,296 0 0

H2O destilada

0,261 0,216 0 0 2,278 2,286 0,053 0,041 2,282 2,284 0,055 0,043

Rio Poluído

2,295 2,297 0,056 0,059 2,294 2,304 0,160 0,149 2,311 2,314 0,154 0,144

Efluente Hospitalar

2,321 2,319 0,153 0,141 2,258 2,273 0,062 0,047 2,254 2,258 0,051 0,058

Efluente Agro-Industrial

2,262 2,260 0,055 0,047 2,542 2,558 0,364 0,326 2,548 2,569 0,356 0,356

Efluente Têxtil

2,538 2,567 0,355 0,345 2,274 2,279 0,031 0,022 1,299 0,956 0,027 0,026

Esgoto Doméstico

2,279 2,290 0,023 0,022 Obs. Não foi medida a absorbância no t = 0 h.

A Tabela 3 nos mostra que a adição prévia à autoclavagem, resultou em

valores elevados de absorbância, o que significa que a fluoresceína sofre hidrólise

total ao ser autoclavada, isso para todos os tipos de amostras testadas, enquanto

45

que a adição da fluoresceína após a autoclavagem demonstra que a hidrólise não

avançou por causa da esterilidade da amostra. Este resultado é congruente com o

dado publicado por Alarcón-Gutiérrez et al (2007), os quais também constataram

uma influência da autoclavagem sobre a hidrólise da FDA. Desta experiência

também pode-se concluir que nenhum componente físico-químico das amostras

interfere com a hidrólise da FDA, ao menos depois de ter sofrido a autoclavagem.

Contudo, há de se salientar que a autoclavagem usada pode não ter sido

suficientemente para degradar quimicamente as moléculas que poderiam interferir

com a hidrólise da FDA.

Outro tipo de resposta testado com o método FDA foi o tempo de resposta

conforme a atividade hidrolítica para 3 dos 6 tipos de efluentes usados no trabalho

de dissertação (Gráfico 1) (Anexo A).

Gráfico 1: Variações das absorbâncias médias de triplicatas em função do tempo de hidrólise de FDA para cada tipo de amostra e suas respectivas diluições testadas (AC = Água Cinza; RP = Rio Poluído; AI = Agro-Industrial).

Nota-se no Gráfico 1 que o tempo de resposta hidrolítica foi variável para

cada tipo de amostra. Assim, para amostra da Água Cinza, a resposta passou a ser

útil depois de 21 h de hidrólise, enquanto para amostras do Rio Poluído e do

efluente Agro-Industrial a resposta já é útil a partir de 3 – 6 h de hidrólise, segundo a

diluição. Esta questão da resposta analítica já pode ser pensada em termos de

quantidade de bactérias hidrolíticas presentes em cada amostra, como também em

termos de bioacessibilidade e biodisponibilidade de matéria orgânica para as

46

bactérias, o que resultou nos diferentes tempos hidrolíticos. Outra conclusão deste

experimento diz respeito ao fato de que o crescimento bacteriano que pode haver na

amostra, ou mesmo a geração de metabólitos não perturbam de forma contundente

a evolução da hidrólise, conforme já demonstrado por Frankenberger e Tabatabai

(1980) quando trabalharam com a enzima L-glutaminase. Nesse sentido, as reações

catalisadas por enzimas mostram uma relação linear entre a quantidade de produto

formado e o tempo de incubação (DENG; TABATABAI, 1994), tendo um decaimento

à medida que o substrato é consumido (SKUJINS, 1967). Com relação à

temperatura dos experimentos (27°C), Adam e Duncan (2001) determinaram que a

temperatura ótima para a hidrólise da FDA foi de 30°C, muito próxima daquela

usada no presente trabalho.

Uma outra bateria de teste foi realizada para determinação do poder

hidrolítico de diferentes bactérias sobre o FDA e para tanto, foram escolhidas três

tipos de bactérias bem distintas: Bacilus polymixa; Cromobactéria violácea e uma

Bactéria liofilizada (não identificada), as quais foram inoculadas em meio aquoso

sem aporte nutricional. Nestes experimentos foram usados 100 µL de cada inóculo

bacteriano e ajustou-se o pH para 7. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela

4.

Tabela 4: Variação da absorbância em diferentes tempos para diferentes inóculos

bacterianos, com adição de 200 µL de FDA.

Bactéria Abs. inicial 2h 4h 6h 24h 26h 30h 48h

0,022 0,030 0,035 0,031 0,086 0,120 0,160 0,450 0,021 0,024 0,038 0,032 0,081 0,122 0,169 0,559

Bacilus polymixa

0,023 0,025 0,035 0,031 0,085 0,129 0,163 0,439 0,114 0,163 0,164 0,170 0,199 0,209 0,217 0,272 0,101 0,160 0,165 0,169 0,195 0,204 0,212 0,259

Cromobacteria violácea

0,139 0,160 0,172 0,172 0,235 0,254 0,268 0,328 0,012 0,020 0,027 0,013 0,036 0,037 0,054 0,106 0,007 0,020 0,031 0,019 0,038 0,044 0,055 0,109

Bactéria liofilizada

0,012 0,045 0,033 0,023 0,059 0,046 0,060 0,137

Percebe-se na Tabela 4 que as atividades hidrolíticas destas bactérias foram

fracas, muito provavelmente devido à pobreza do meio reacional, o que impediu o

47

crescimento bacteriano em função da falta de nutrientes. Mesmo assim, percebe-se

que houve atividade hidrolítica independentemente do tipo da cepa bacteriana. A fim

de verificar se haveria um aumento da atividade hidrolítica destas bactérias caso o

meio nutritivo fosse rico, realizou-se uma segunda série de ensaios, cujos resultados

são mostrados na Tabela 5. Neste novo ensaio o meio de cultura composto por

peptona de gelatina (5 mL), extrato de carne (3 mL), pH = 6,9 e 100 µL de inóculo

bacteriano de Bacilus polymixa ou Cromobacteria violacea, ou Bactéria Liofilizada

foram usados. Também testaram-se as seguintes diluições: 1/1; 1/4; 1/8; 1/16 e

1/32. Os tubos foram deixados na estufa por 24 h a 27°C e depois acrescentado 200

µL de FDA.

Tabela 5: Influência do meio nutritivo na atividade hidrolítica das bactérias B.

polymixa, C. violacea e de uma Bactéria Liofilizada sem identificação em

diferentes intervalos de tempo.

Bactéria Abs. Inicial da amostra

Abs. Inicial amostra + FDA 1h 3h 5h 22h

B. polymixa bruto

0,063 1,455 1,394 1,672 1,330 0,955

1/1 0,033 1,188 1,247 1,388 1,145 0,614

1/4 0,018 0,676 0,685 0,861 0,663 0,548 1/8 0,018 0,455 0,479 0,615 0,469 0,680

1/16 0,014 0,376 0,372 0,506 0,381 0,447

1/32 0,013 0,295 0,285 0,398 0,295 0,354 C. violacea

bruto 0,161 1,529 1,476 1,849 1,455 1,277

1/1 0,039 1,064 1,017 1,317 1,005 0,650

¼ 0,034 0,606 0,594 0,815 0,611 0,543

1/8 0,027 0,383 0,361 0,518 0,375 0,437 1/16 0,024 0,283 0,265 0,387 0,274 0,383

1/32 0,013 0,385 0,350 0,506 0,358 0,390 B. liofilizada.

Bruto 0,058 1,731 1,670 1,850 1,569 1,222

1/1 0,032 0,956 0,920 1,124 0,864 0,607 ¼ 0,028 0,729 0,739 0,978 0,739 0,802

1/8 0,022 0,691 0,698 1,050 0,721 0,938

1/16 0,013 0,326 0,326 0,467 0,317 0,345 1/32 0,005 0,365 0,357 0,512 0,351 0,351

48

Como pode ser visto na Tabela 5, o experimento da atividade hidrolítica das

bactérias com adição do caldo nutriente fez a absorbância aumentar rapidamente,

para depois diminuir, o que pode ser explicado provavelmente pela presença no

caldo de moléculas que provocam a degradação do FDA, conforme já relatado na

literatura (ALARCÓN-GUTIÉRREZ et al, 2007)

Outro parâmetro relatado na literatura que influencia grandemente na

hidrólise da FDA é o pH (BRUNIUS, 1980; ALARCÓN-GUTIÉRREZ et al, 2007). A

taxa de biodegradação é muito dependente do pH do meio e isto é válido tanto para

os sistemas aeróbios como para os sistemas anaeróbios, sendo que o melhor valor

para este parâmetro é próximo à neutralidade, isto é, em torno de 7 unidades

(FERREIRA-FILHO; CHUI, 2006). Assim, uma das condições para escolha dos

diferentes tipos de amostras testadas neste trabalho foi a possibilidade de testar a

metodologia com amostras de diferentes pH, subentendendo por aí, diferentes

condições hidrolíticas que representam o espectro de condições ambientais. Os pHs

das amostras brutas estudadas nesta dissertação são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6: Variabilidade dos pHs das amostras estudadas nos ensaios hidrolíticos.

pH pH Amostra

1ª Campanha 2ª Campanha Indústria Têxtil 11,96 13,01 Efluente Hospital 9,36 6,65 Agro-Indústria 9,63 6,18 Efluente Doméstico 9,43 7,58 Água Cinza 4,38 5,56 Rio Poluído 9,55 7,45

Em função dos valores do pH, que poderiam influenciar nos valores

hidrolíticos, optou-se por fazer todas as reações tamponadas com o tampão fosfato,

onde as diluições levaram o pH para cerca de 7,5 unidades, anulando qualquer

interferência na atividade hidrolítica que este parâmetro poderia exercer. Isto se

justifica porque o FDA se degrada espontaneamente em pH superior a 8,0 ou inferior

a 5,0 unidades (BRUNIUS, 1980; SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982). O efeito tampão

é crítico na hidrólise do FDA porque a ionização das proteínas/enzimas e o estado

de ionização dos substratos podem alterar significativamente a conformação

49

(estrutura espacial) de ambos, impedindo que o sítio ativo da enzima promova seu

efeito catalisador.

6.2 Comparações dos resultados da Demanda Química do Oxigênio (DQO),

Demanda Bioquímica do Oxigênio (DBO), Matéria Orgânica Oxidável

(MOO), Oxigênio Consumido (OC) e hidrólise de Diacetato de

Fluoresceína (FDA) na estimação da matéria orgânica das amostras

Os diferentes parâmetros usados para quantificar a matéria orgânica de uma

amostra sempre irão divergir entre si com relação aos valores encontrados, pois

cada parâmetro mede um processo diferente.

De todas as mensurações realizadas neste trabalho, aquela da Matéria

Orgânica Oxidável (MOO) é a única que mede diretamente a quantidade de

carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre na forma orgânica, ou em outras palavras,

mensura a calcinação da matéria orgânica que se transforma em gases voláteis.

Apesar de ser um método sujeito a pequenas interferências, estas podem ser

desprezíveis com relação à quantidade de matéria orgânica presente nas amostras.

Conforme já descrito anteriormente, a DQO mede a quantidade de O2

consumido para oxidar quimicamente a matéria orgânica, enquanto o OC mede o

mesmo parâmetro, mas consumido em uma oxidação mais suave com

permanganato. A DBO mede a quantidade de O2 consumido pelas bactérias na

biodegradação da matéria orgânica. Já a hidrólise da FDA é a medida da atividade

enzimática competente para hidrolisar a FDA, sendo objeto desta dissertação.

Assim, nas próximas seções estes tipos de mensurações serão comparados sempre

com a MOO e com a hidrólise da FDA para ver qual metodologia pode melhor

representar a quantidade de matéria orgânica de uma amostra, focando

principalmente no aspecto da quantificação da biodegradação intrínseca das

amostras, pois esta é a informação mais relevante para o entendimento do aspecto

ambiental envolvendo o despejo de amostras ricas em matéria orgânica nas águas

receptoras dos nossos rios.

50

6.2.1 Comparação da eficiência da DQO e da hidrólise da FDA na determinação da

matéria orgânica de amostras industriais/ambientais mensurada pela

calcinação (MOO)

A Tabela 7 mostra os valores mensurados pela DQO, hidrólise do FDA e

MOO nas diferentes diluições das diferentes amostras utilizadas neste estudo para

avaliar qual das metodologias é mais eficiente na determinação da matéria orgânica

presente nestas amostras, o que pode ser visto na tabela 9.

Tabela 7: Médias dos valores de FDA, DQO e MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.

Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)

DQO (mgO2/L)

MOO (mg/L)

1/1 1029 1290 490 1/4 790 698 245

1

1/8 609 244 122 1/1 621 814 350 1/4 578 500 175

Efluente Têxtil

2

1/8 474 208 87,5 1/1 563 512 220 1/4 407 314 110

1

1/8 278 131 55 1/1 524 558 201 1/4 297 210 100

Efluente Hospitalar

2

1/8 98 138 50 1/1 252 288 127 1/4 202 191 63

1

1/8 163 98 32 1/1 335 291 125 1/4 242 177 62

Agro-Indústria

2

1/8 169 80 31 1/1 125 577 231 1/4 50 267 115

1

1/8 19 166 58 1/1 63 711 256 1/4 52 298 128

Água Cinza

2

1/8 25 183 64 1/1 940 1368 520 1/4 490 843 260

1

1/8 80 209 130 1/1 1217 1067 480

Efluente Doméstico

2 1/4 832 333 240

51

Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)

DQO (mgO2/L)

MOO (mg/L)

1/8 524 180 120 1/1 165 353 155 1/4 122 217 77

1

1/8 86 78 38 1/1 238 367 136 1/4 66 200 68

Rio Poluído

2

1/8 10 77 34

A análise de DQO é bastante utilizada para avaliar o teor de matéria

orgânica presente em efluentes, pois o método apresenta muitas vantagens, como

por exemplo, rapidez (apenas 3 horas de teste), realizável mesmo com materiais

tóxicos (desde que não afetem o oxidante) e também permite avaliar a relação

DBO/DQO para prever a porcentagem de matéria orgânica biodegradável presente

na amostra estudada. Porém existem alguns problemas relativos a execução do

teste DQO, pois a presença de haletos interferem nos resultados podendo levar à

subestimação dos resultados pela inibição do catalisador (precipitação da prata) ou

superestimação dos valores de DQO devido a oxidação do cloreto a gás cloro

(VAIDYA et al, 1997). Assim, os métodos oficiais recomendam a adição de sulfato

de mercúrio para minimizar esta interferência pela precipitação dos haletos (APHA,

1998) A adição do mercúrio encarece a análise, apresenta risco de toxicidade ao

laboratorista e ao meio-ambiente. Também alguns íons inorgânicos como: Fe2+, S2-,

SO32-, entre outros, são oxidados pelo dicromato usado no teste, favorecendo uma

DQO inorgânica, superestimando os valores encontrados no teste da DQO.

Independentemente disto, a relação MOO/DQO para as amostras estudadas (Tabela

7) são similares com a relação de aproximadamente 0,4 encontrada na literatura

para a relação Carbono Total/DQO (SCHMIDELL et al, 2007).

Com relação aos objetivos deste trabalho, a linearidade das metodologias

estudadas, isto é, a proporcionalidade da resposta mensurada em função da

quantidade de MOO pode ser avaliada pelo coeficiente de correlação linear (R2) da

equação da reta obtida com os dados gerados, os quais são mostrados de forma

comparativa na Tabela 8 entre os valores mensurados da hidrólise da FDA e do

teste de DQO para as duas campanhas analíticas envolvendo os 6 tipos de

amostras ambientais/industriais. Obviamente que um método de hidrólise de um

composto adicionado ao meio reacional não nos permitirá a estimação da

quantidade de matéria orgânica presente na amostra, mas o objetivo de tal

52

comparação é compreender a linearidade da resposta fornecida pela metodologia,

comparativamente a um teste clássico bem estabelecido na literatura, como é o caso

do teste da DQO.

Tabela 8: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de FDA

e DQO em função dos valores de MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.

Equação da reta (R2) Amostra Campanha

FDA DQO Y = 0,8839.X – 429,73 y= 0,3549.X + 21,63 1 R² = 0,9540 R² = 0,9936 y = 1,610.X - 694,2 y = 0,434.X – 16,38

Efluente Têxtil

2

R² = 0,9109 R² = 0,9857 y = 0,5832.X - 114,3 y = 0,435.X – 10,34 1 R² = 0,9908 R² = 0,9860 y = 0,356.X + 7,771 y = 0,337.X + 15,06

Efluente Hospitalar

2

R² = 0,9880 R² = 0,9855 y = 1,077.X – 147,5 y = 0,501.X – 22,39 1

R² = 0,9919 R² = 0,9828 y = 0,571.X – 69,38 y = 0,448.X – 9,278

Agro-Indústria

2 R² = 0,9922 R² = 0,9891 y = 1,616.X + 30,15 y = 0,410.X – 3,341 1

R² = 0,8992 R² = 0,9958 y = 4,547.X – 62,88 y = 0,349.X + 10,53

Água Cinza

2

R² = 0,9095 R² = 0,9922 y = 0,455.X + 74,06 y = 0,332X + 35,52 1 R² = 0,9867 R² = 0,9703 y = 0,524.X – 169,2 y = 0,381.X + 79,38

Efluente Doméstico

2

R² = 0,9921 R² = 0,9853 y = 1,492.X – 95,47 y = 0,425X - 1,783 1

R² = 0,9903 R² = 0,9808 y = 0,435.X + 33,79 y = 0,355.X + 3,142

Rio Poluído

2 R² = 0,9954 R² = 0,9947

A análise da Tabela 8 nos mostra que das 6 amostras estudadas, quatro

apresentaram linearidades comparáveis entre a hidrólise da FDA e o teste da DQO,

enquanto 2 amostras (Efluente Têxtil e Águas Cinzas) mostraram uma linearidade

53

inferior para o caso da hidrólise da FDA. Para o caso específico do Efluente Têxtil, a

falta de linearidade da metodologia baseada na hidrólise da FDA pode ser explicada

pela interferência da coloração do efluente na leitura da absorbância na faixa do

visível onde a fluoresceína absorve (490 nm). No caso de se perceber interferência

da amostra neste comprimento de onda (490 nm), deve-se então ler as

absorbâncias na região do ultra-violeta no comprimento de onda de 320 nm ou usar

um espectrofluorímetro onde a excitação ocorre a 494 nm e a emissão a 521 nm. .

Esta interferência pode ser tanto pela absorção do raio no comprimento de

onda específico, como também pela reação dos componentes do efluente com o

diacetato ou mesmo com a própria fluoresceína. Já no caso da falta de boa

linearidade da amostra de Água Cinza, esta continha material graxo, o que dificultou

o acesso das bactérias ao material gorduroso e ao diacetato de fluoresceína. Assim,

apesar de haver matéria orgânica e o composto hidrolisável nesta amostra, estes

compostos poderiam não estar bioacessíveis ou mesmo indisponíveis para a

microbiologia presente neste tipo de amostra. Conforme já frisado por diversos

autores, o diacetato de fluoresceína pode ser degradado por lípases (geralmente

presente em resíduos gordurosos), mas o composto tem que estar bioacessível aos

microrganismos para que a hidrólise seja feita (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982;

SEMPLE et al, 2004).

Em função dos resultados mostrados na Tabela 8, podemos concluir que,

com exceção do Efluente Têxtil e da amostra de Águas Cinzas, a linearidade do

método da hidrólise da FDA é similar à linearidade apresentada pelo teste da DQO,

demonstrando haver uma proporcionalidade entre a resposta da hidrólise enzimática

com a matéria orgânica oxidável da amostra.

6.2.2 Comparação da eficiência da Oxigênio Consumido e da hidrólise da FDA na

determinação da matéria orgânica de amostras industriais/ambientais

mensurada pela calcinação (Matéria Orgânica Oxidável - MOO)

Os valores de matéria orgânica mensurados pelo método OC, hidrólise do

FDA e MOO nas diferentes diluições das diferentes amostras utilizadas neste estudo

para avaliar qual das metodologias apresenta uma linearidade de resposta com

54

relação à quantidade de matéria orgânica presente nestas amostras aparecem na

Tabela 9.

Tabela 9: Médias dos valores de FDA, OC e MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.

Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)

OC (mgO2/L)

MOO (mg/L)

1/1 1029 533 490 1/4 790 315 245 1 1/8 609 72 122 1/1 621 408 350 1/4 578 170 175

Efluente Têxtil

2 1/8 474 110 87,5 1/1 563 210 220 1/4 407 135 110 1 1/8 278 59 55 1/1 524 205 201 1/4 297 133 100

Efluente Hospitalar

2 1/8 98 57 50 1/1 252 12 127 1/4 202 10 63 1 1/8 163 7 32 1/1 335 27 125 1/4 242 19 62

Agro-Indústria

2 1/8 169 11 31 1/1 125 70 231 1/4 50 45 115 1 1/8 19 10 58 1/1 63 30 256 1/4 52 22 128

Água Cinza

2 1/8 25 12 64 1/1 940 306 520 1/4 490 190 260 1 1/8 80 64 130 1/1 1217 95 480 1/4 832 69 240

Efluente Doméstico

2 1/8 524 35 120 1/1 165 17 155 Rio Poluído 1

1/4 122 13 77

55

Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)

OC (mgO2/L)

MOO (mg/L)

1/8 86 9 38 1/1 238 12 136 1/4 66 9 68

2 1/8 10 6 34

Conforme se observa na Tabela 9, os valores de OC são nitidamente

inferiores aos valores da DQO mostrados na Tabela 7, o que se explica pela

oxidação da matéria orgânica em condições mais suaves do que no caso da DQO.

Com relação à comparação da linearidade entre os métodos FDA e OC, os

resultados obtidos são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de

FDA e OC em função dos valores de MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.

Equação da reta (R2) Amostra Campanha

FDA OC Y = 0,884.X – 429,73 y= 0,793.X + 42,57 1 R² = 0,9540 R² = 0,9758 y = 1,610.X - 694,2 y = 0,839.X + 11,64

Efluente Têxtil

2

R² = 0,9109 R² = 0,9899 y = 0,583.X - 114,3 y = 1,092.X – 18,71 1

R² = 0,9908 R² = 0,9812 y = 0,356.X + 7,771 y = 1,017.X – 16,89

Efluente Hospitalar

2 R² = 0,9880 R² = 0,9784 y = 1,063.X – 147,1 y = 18,31.X – 103,0 1

R² = 0,9764 R² = 0,9514 y = 0,571.X – 69,38 y = 5,875.X – 38,96

Agro-Indústria

2

R² = 0,9922 R² = 0,9812 y = 1,616.X + 30,15 y = 2,803.X + 17,88 1 R² = 0,8992 R² = 0,9581 y = 4,547.X – 62,88 y = 10,49.X – 74,49

Água Cinza

2 R² = 0,9095 R² = 0,9679 y = 0,455.X + 74,06 y = 1,603.X + 4,058 1

R² = 0,9867 R² = 0,9772

Efluente Doméstico

2 y = 0,524.X – 169,2 y = 5,876.X – 109,8

56

Equação da reta (R2) Amostra Campanha

FDA OC R² = 0,9921 R² = 0,9645

y = 1,492.X – 95,47 y = 14,62.X – 100,1 1 R² = 0,9903 R² = 0,9820 y = 0,435.X + 33,79 y = 17,00.X – 73,67

Rio Poluído

2

R² = 0,9954 R² = 0,9819

A Tabela 10 mostra uma melhor linearidade do método de hidrólise da FDA

comparativamente à linearidade do método OC para 4 tipos de amostras (EH, AI, ED

e RP). Isto pode ser explicado pelo fato de que a oxidação via permanganato no

método OC não consegue degradar de forma homogênea os compostos orgânicos

presentes nestas amostras devido às condições suaves de oxidação. Já para os

Efluentes Têxteis e para a Água Cinza, a mesma explicação dada quando da análise

da DQO é válida, ou seja, a interferência de corantes e a presença de material graxo

dificultam a mensuração óptica ou o acesso à matéria orgânica.

6.2.3 Comparação da eficiência da DBO e da hidrólise da FDA na determinação da

matéria orgânica biodegradável de amostras industriais/ambientais líquidas

mensurada pela calcinação (MOO)

A metodologia da DBO é a mais usada para determinação da quantidade de

matéria orgânica via decomposição bacteriana. A digestão completa da matéria

orgânica se faz no organismo da bactéria, através de uma reação bioquímica que

necessita de oxigênio para ser realizada. Assim, quando é fornecido como alimento

à uma bactéria uma quantidade de matéria orgânica, ela precisará de uma

determinada quantidade de oxigênio para que seu organismo transforme a matéria

orgânica em outra substância (no caso, mineralize a matéria orgânica). Apesar de

poder se medir vários parâmetros neste teste de DBO, não se mede diretamente a

quantidade de bactérias e sim o consumo de O2 pelas bactérias. Uma alternativa

para se mensurar a quantidade de matéria orgânica biodegradável é a quantificação

da atividade enzimática na amostra, o que pode ser feito pela adição de um

57

composto facilmente hidrolisável (neste caso, o diacetato de fluoresceína). Para uma

avaliação mais criteriosa desse tipo de resposta, na Tabela 11 são mostrados os

valores mensurados pela DBO, hidrólise do FDA e MOO nas diferentes diluições das

diferentes amostras utilizadas neste estudo. A comparação da linearidade das

respostas mensuradas em função das diluições usadas permite avaliar qual das

metodologias é mais eficiente na determinação da matéria orgânica biodegradável

presente nas amostras estudadas.

Tabela 11: Médias dos valores de FDA, DBO e MOO medidos nas diluições das

diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.

Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)

DBO (mgO2/L)

MOO (mg/L)

1/1 1029 207 490 1/4 790 143 245

1

1/8 609 30 122 1/1 621 196 350 1/4 578 75 175

Efluente Têxtil

2

1/8 474 61 87,5 1/1 563 230 220 1/4 407 80 110

1

1/8 278 51 55 1/1 524 110 201 1/4 297 82 100

Efluente Hospitalar

2

1/8 98 35 50 1/1 252 20 127 1/4 202 13 63

1

1/8 163 4 32 1/1 335 16 125 1/4 242 10 62

Agro-Indústria

2

1/8 169 4 31 1/1 125 30 231 1/4 50 28 115

1

1/8 19 10 58 1/1 63 36 256 1/4 52 29 128

Água Cinza

2

1/8 25 4 64 Efluente Doméstico

1 1/1 940 110 520

58

Amostra Campanha Diluição FDA (� Abs x 10-3)

DBO (mgO2/L)

MOO (mg/L)

1/4 490 78 260

1/8 80 40 130 1/1 1217 400 480 1/4 832 250 240

2

1/8 524 70 120 1/1 165 68 155 1/4 122 30 77

1

1/8 86 22 38 1/1 238 20 136 1/4 66 14 68

Rio Poluído

2

1/8 10 8 34

Os valores mensurados pelo método da DBO (Tabela 11) são inferiores aos

valores mensurados pela DQO (Tabela 7), o que é congruente, pois enquanto esta

mede toda a matéria orgânica oxidável, a DBO só mede a parte da matéria orgânica

biodegradada pelas bactérias. A questão de qual das metodologias apresenta uma

melhor linearidade na quantificação da matéria orgânica pode ser avaliada

consultando-se a Tabela 12, a seguir.

Tabela 12: Equação da reta e coeficiente de correlação linear (R2) para os valores

de FDA e DBO em função dos valores de MOO medidos nas diluições

das diferentes amostras analisadas nas 2 campanhas.

Equação da reta (y = B.X + A) (R2) Amostra Campanha

FDA DBO Y = 0,884.X - 429,73 y= 1,965.X + 36,73 1 R² = 0,9540 R² = 0,9401 y = 1,610.X - 694,2 y = 1,749.X + 10,57

Efluente Têxtil

2 R² = 0,9109 R² = 0,9716 y = 0,583.X - 114,3 y = 0,860.X + 24,84 1

R² = 0,9908 R² = 0,9835 y = 0,356.X + 7,771 y = 1,915.X - 27,90

Efluente Hospitalar

2

R² = 0,9880 R² = 0,9434 y = 1,063.X - 147,1 y = 5,821.X + 2,205 1 R² = 0,9764 R² = 0,9638

Agro-Indústria

2 y = 0,571.X - 69,38 y = 7,833.X - 5,667

59

Equação da reta (y = B.X + A) (R2) Amostra Campanha

FDA DBO R² = 0,9922 R² = 0,9812

y = 1,616.X + 30,15 y = 6,481.X - 12,23 1

R² = 0,8992 R² = 0,8097 y = 4,547.X - 62,88 y = 5,088.X + 32,30

Água Cinza

2

R² = 0,9095 R² = 0,8755 y = 0,455.X + 74,06 y = 5,505.X - 115,0 1 R² = 0,9867 R² = 0,9714 y = 0,524.X - 169,2 y = 1,077.X + 21,54

Efluente Doméstico

2

R² = 0,9921 R² = 0,9707 y = 1,492.X - 95,47 y = 2,389.X - 5,563 1

R² = 0,9903 R² = 0,9856 y = 0,435.X + 33,79 y = 8,500.X - 39,67

Rio Poluído

2 R² = 0,9954 R² = 0,9820

A Tabela 12 mostra uma melhor linearidade do método de hidrólise da FDA

comparativamente à linearidade do método DBO para os 6 tipos de amostras, com

exceção da segunda campanha com o Efluente Têxtil. As amostras que

apresentaram as piores linearidades para a hidrólise da FDA foram os Efluentes

Têxteis e as Águas Cinzas, pois há a interferência de corantes na hidrólise do

diacetato ou na mensuração óptica e a presença de material graxo nas Águas

Cinzas dificulta a acessibilidade à matéria orgânica, o que pode tornar os compostos

biodegradáveis não-biodisponíveis, o que se percebe pelos baixos valores de

correlação linear para ambos os métodos testados.

6.3 Estudo paralelo (FDA x DQO x DBO)

Paralelamente ao estudo desenvolvido na UNIVALI, foram realizadas

análises de DQO, FDA, DBO e MOO em laboratórios particulares, utilizado a mesma

metodologia do FDA proposta neste trabalho. Os ensaios foram realizados com

quatro diferentes amostras líquidas industriais (A, B, C e D).

60

Tabela 13: Valores de FDA, DBO, DQO e MOO medidos nas diluições das diferentes

amostras industriais analisadas no estudo paralelo.

Amostra Diluições DQO

(mgO2/L)

DBO

(mgO2/L)

FDA

(� Abs x 10-3)

MOO

(mg/L)

1/1 825 522 154 350

1/4 367 50 86 175

A

1/8 36 22 51 87,5

1/1 181 30 183 680

1/4 83 20 153 340

B

1/8 49 3 140 170

1/1 218 80 303 920

1/4 95 47 245 460

C

1/8 26 14 210 230

1/1 640 305 614 2420

1/4 302 192 320 1210

D

1/8 175 110 148 605

Com estes dados da Tabela 13, pôde-se calcular a equação da reta para as

respostas obtidas com as diferentes diluições das amostras e assim estabelecer o

coeficiente de correlação linear que permite calcular a variabilidade das respostas

dos diferentes métodos (Tabela 14).

Tabela 14: Equação da reta e coeficiente de correlação linear para os valores de

FDA, DQO e DBO em função dos valores de MOO medidos nas

diluições das diferentes amostras industriais usadas no estudo paralelo.

Equação da reta (R2) Amostra

FDA DBO DQO Y= 2,552.X - 43,37 Y= 0,457.X + 113,7 Y= 0,336.X + 66,73 A R2= 0,9999 R2= 0,9600 R2= 0,9952 Y= 1,177.X – 147,0 Y= 1,794.X + 7,968 Y= 0,377.X + 0,271 B

R2= 0,9994 R2= 0,9432 R2= 0,9966 C Y= 0,747.X – 135,1 Y= 1,045.X + 4,530 Y= 0,361.X + 12,86

61

R2= 0,9988 R2= 0,9819 R2= 0,9996 Y= 0,002.X + 0,001 Y= 1,054.X + 53,50 Y= 2,595.X + 6,00 D

R2= 0,9992 R2= 0,9951 R2= 0,9978

Os resultados da Tabela 14 confirmam os resultados obtidos no

laboratório da UNIVALI, demonstrando que para as amostras testadas em paralelo,

a linearidade das respostas obtidas pela hidrólise da FDA (3 respostas na casa do

0,999) são melhores (mas, similares) do que as respostas obtidas com a

metodologia da DQO e bem melhores do que as linearidades apresentadas pelo

método da DBO (nenhuma resposta na casa do 0,999).

6.4 Discussão geral

Antes de iniciar uma discussão mais detalhada sobre os resultados obtidos,

devemos nos lembrar que os métodos usados no presente trabalho, apesar de

procurarem quantificar a matéria orgânica, sempre acabam quantificando materiais

distintos. Assim, de um lado temos os métodos de oxidação como MOO, DQO e OC

e de outro lado, métodos que medem a atividade microbiológica, como a DBO e a

Hidrólise da FDA. Contudo, as eficiências das duas vertentes estão condicionadas à

acessibilidade e a disponibilidade (especiação química/estrutura química) das

substâncias a serem oxidadas.

Os primeiros métodos citados acima na realidade oxidam tudo o que for

oxidável em função dos seus poderes de oxidação. Assim, na metodologia da MOO

o aquecimento a 500°C oxida a matéria orgânica carbonácea (e.g., glicídios) e

nitrogenada (e.g., proteínas), assim como a matéria mineral oxidável a esta

temperatura (e.g., carbonatos). Já no caso da DQO, a oxidação medida pelo

consumo do agente oxidante forte (i.e., dicromato em meio ácido) diz respeito

principalmente à oxidação da matéria orgânica carbonácea e nitrogenada, mas que

pode sofrer interferências de certos minerais (e.g., haletos). No caso do OC, o poder

oxidante do ânion permanganato em condições de oxidação mais suaves é mais

fraco, ocasionando uma oxidação da matéria mais limitada e são por estas razões

que se pode explicar a hierarquia de linearidade observada para estas três

62

metodologias analíticas: a MOO apresenta a menor variabilidade devido as

condições fortemente oxidantes, com a menor intensidade de interferência e por isto

mesmo, escolhido como método de referência; a DQO apresentou, com relação à

MOO, os melhores coeficientes de correlação entre os valores mensurados em

função das diluições das amostras usadas e por último, o fraco poder oxidante da

metodologia OC levou aos piores valores de correlação entre os valores

mensurados em função das diluições das amostras. Naturalmente pode-se pensar

que um menor poder de oxidação significa que a reação química de oxidação está

mais sujeita às variações da acessibilidade/disponibilidade da matéria a ser oxidada.

Assim, espera-se que matéria orgânica insolúvel ou parcialmente solúvel (e.g.,

matéria orgânica em suspensão) seja oxidada em menor extensão/intensidade do

que uma matéria orgânica dissolvida, a qual tem uma área de contato muito maior,

facilitando o contato dos reagentes, ou em outras palavras, a matéria a ser oxidada

está acessível/disponível para as moléculas oxidantes.

No caso das metodologias que mensuram a atividade dos microrganismos, a

questão da maior ou menor taxa de biodegradação depende quase que

exclusivamente de 3 fatores: da bioacessibilidade, da biodisponibilidade (incluindo aí

a estrutura molecular, a qual pode ou não ser degradada pelos organismos

presentes no meio onde ocorre a biodegradação).

Do ponto de vista físico-químico, várias explicações foram dadas para se

entender a acessibilidade ou disponibilidade de uma molécula para reagir com outra

molécula ou ser absorvida por um microrganismo, sendo que todas estas

explicações passam pelo fenômeno de adsorção/desorção das moléculas oxidáveis

(PIGNATELLO; XING, 1996; XING; PIGNATELLO, 1997). De forma simplificada, a

desorção rápida e completa de uma molécula que está adsorvida está associada às

fracas interações químicas presentes neste fenômeno (e.g., forças de van der

Waals, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, pontes de Hidrogênio), fazendo com

que a acessibilidade a esta molécula fracamente adsorvida seja facilitada. As

desorções lentas e parciais estão associadas às fortes interações entre as

moléculas adsorvidas e os adsorventes (e.g., ligações químicas parcialmente

covalentes e em alguns casos, iônicas). Existem também os casos onde as

moléculas não serão oxidadas por falta de acessibilidade e/ou disponibilidade destas

moléculas, geralmente por estarem fortemente adsorvidas por ligações covalentes a

um adsorvente ou por estarem protegidas no interior de uma molécula maior

63

(CALDERBANK, 1989). Ainda, no caso da disponibilidade, o estado de oxidação da

estrutura química a ser decomposta é o principal parâmetro que determinará se

haverá ou não a oxidação, seja química, seja microbiológica.

Com relação à otimização da metodologia proposta para avaliar a

quantidade de matéria orgânica intrinsicamente biodegradável nas amostras, este

estudo demonstrou que o volume de FDA na preparação do reagente é importante,

pois uma quantidade maior de acetona para dissolver mais FDA pode causar uma

toxicidade importante nas bactérias responsáveis pela biodegradação. Testes

alternativos poderiam ser feitos utilizando outro tipo de solvente, como por exemplo

o DMSO a 5%. Deve-se observar também o pH e a possível presença de

substâncias na amostra que possam hidrolisar o FDA, o que pode ser visto

imediatamente, pois em poucos minutos a absorbância aumenta bastante e se torna

estável. Nesse sentido, um ensaio preliminar ao começar o trabalho com uma

amostra é altamente recomendável, pois também se conhecerá o tempo necessário

para que o produto da hidrólise possa ser quantificado de forma segura e como

consequência, se os microrganismos presentes na amostra tem a capacidade de

hidrolisar o FDA. Todas as amostras testadas possuíam microrganismos

competentes para hidrolisar o FDA e nos ensaios realizados, também uma espécie

de bactéria liofilizada foi competente para realizar a hidrólise nas condições do teste.

Como o FDA é uma substância fluorescente, pode-se aumentar consideravelmente

o limite de detecção da metodologia ao se trabalhar com um espectrofluorímetro na

detecção do produto da hidrólise.

Como os métodos de DQO e OC possuem objetivos distintos da

metodologia do FDA, não cabem discussões comparativas entre estas

metodologias, porém, no caso da DBO, uma comparação mais criteriosa é de

importância para clarificar os aspectos positivos e negativos de cada metodologia.

Os dados mostrados na Tabela 12 deixaram claro que das 12 amostras

testadas, somente uma apresentou uma melhor linearidade para a DBO,

comparativamente aos valores da Hidrólise da FDA. Esta melhor linearidade da FDA

significa que a metodologia responde de forma mais precisa quando se usam

diferentes diluições para se avaliar a quantidade de matéria orgânica. Uma crítica

que pode ser feita para as condições usadas nos testes é a de que não foi feita a

diluição adequada da amostra para a realização do teste da DBO. Apesar disto ser

verdadeiro, isto na realidade demonstra a grande versatilidade do método da

64

hidrólise da FDA que não requer obrigatoriamente uma diluição para fornecer uma

resposta confiável.

Deve-se salientar que o teste da DBO é amplamente aceito como indicador

da biodegradabilidade da matéria orgânica presente em uma amostra, sendo de

grande importância quantitativa a relação DQO/DBO (BRAILE; CAVALCANTI, 1993).

Contudo, apesar da grande importância da informação gerada pelo teste de DBO,

algumas críticas metodológicas sempre persistiram quanto à aplicabilidade desta

metodologia. As principais críticas ao teste DBO são (DART, 1977; LOGAN;

WANGENSELLER, 1993; ADAMS; BEALING, 1994):

− tempo de resposta relativamente longo: o teste padrão de DBO demora 5 dias,

mas a biodegradação natural pode não ser completa em 5 dias ou pode ser em

um tempo menor do que este período;

− reprodutibilidade pobre: os resultados para a mesma amostra apresentam valor

do coeficiente de variação em torno de 20%, o que é relativamente alto;

− inconsistência de resultados quando substâncias tóxicas estão presentes nas

amostras estudadas;

− inóculo: quando se acrescenta um inóculo de microrganismos, estes podem ser

diferentes daqueles que estarão em contato com a amostra no meio-ambiente;

− diluições: quando se faz diluições, estas também geralmente não correspondem

com a realidade ambiental, onde geralmente se tem um gradiente bem maior de

diluição na área de despejo;

− laboriosidade: o procedimento clássico do teste de DBO é laborioso, inclusive

com necessidade de se realizar um pré-teste;

− co-metabolismo: os organismos mortos durante o teste contribuem para aumentar

o valor da DBO, mas estes não fazem parte da matéria orgânica das amostras;

− falta de representatividade ecológica: os microrganismos usados no inóculo para

ocorrer a biodegradação podem não existir no meio-ambiente, sendo que o

mesmo pode ser dito com relação às condições de realização do ensaio

laboratorial.

Assim, com os valores obtidos pelo método da Hidrólise da FDA pode-se

fazer a proposição de outra relação para se avaliar a especificamente a quantidade

de matéria orgânica intrinsecamente biodegradável de uma amostra, a qual seria a

relação entre o valor da matéria orgânica oxidável pelo processo térmico de

65

calcinação e a variação da absorbância do teste da FDA (MOO/FDA). Os valores

desta relação, assim como a relação entre MOO e DBO para as diferentes amostras

e suas diluições são mostrados na Tabela 15.

Tabela 15: Relações entre os valores de FDA, DBO e MOO das diferentes amostras

analisadas neste estudo.

Amostra Campanha Dados MOO/DBO MOO/FDA X ± � 6,41 ± 1,63 2,49 ± 0,44 1 C.V. 25,5 17,7 X ± � 4,74 ± 1,71 2,52 ± 0,29

Efluente Têxtil

2

C.V. 36,0 11,7 X ± � 2,91 ± 0,89 2,52 ± 0,29 1

C.V. 30,7 11,4 X ± � 3,86 ± 1,26 2,55 ± 0,39

Efluente Hospitalar

2 C.V. 32,6 15,2 X ± � 17,86 ± 5,75 2,79 ± 0,45 1

C.V. 32,2 16,1 X ± � 18,63 ± 1,21 2,59 ± 0,26

Agro-Indústria

2

C.V. 6,5 10,0 X ± � 15,12 ± 5,02 2,56 ± 0,27 1 C.V. 33,2 10,7 X ± � 25,26 ± 18,37 2,66 ± 0,29

Água Cinza

2

C.V. 72,7 10,7 X ± � 9,49 ± 3,79 2,49 ± 0,82 1

C.V. 39,9 33,0 X ± � 2,19 ± 0,75 1,70 ± 0,45

Efluente Doméstico

2 C.V. 34,1 26,5 X ± � 5,32 ± 1,85 2,38 ± 0,39 1

C.V. 34,7 16,6 X ± � 14,08 ± 4,37 2,63 ± 0,34

Rio Poluído

2

C.V. 31,0 13,1 X ± � 2,72 ± 1,79 2,00 ± 0,28 A 1 C.V. 65,8 14,0 X ± � 32,11 ± 21,4 2,38 ± 1,26 B 1

C.V. 66,8 52,8 X ± � 12,57 ± 3,45 2,00 ± 0,98 C 1

C.V. 27,4 49,0 D 1 X ± � 6,58 ± 1,24 3,94 ± 0,15

66

Amostra Campanha Dados MOO/DBO MOO/FDA C.V. 18,8 3,9

Nota-se claramente na Tabela 15 que a relação MOO/FDA para uma mesma

amostra é muito mais regular do que a relação MOO/DBO. Observa-se ainda na

Tabela 15 que das 16 amostras testadas, somente em 2 amostras (uma amostra

Agro-industrial e outra amostra industrial C) o coeficiente de variação (C.V.) para as

diluições da mesma amostra foram maiores na relação MOO/FDA do que na relação

MOO/DBO, mostrando que o método de Hidrólise da FDA apresenta uma menor

variabilidade quando se usa uma diluição para estabelecer a relação de

biodegradabilidade da matéria orgânica presente na amostra estudada. Mais

importante ainda é o fato de que os valores dos coeficientes de variação das

relações são muito mais aceitáveis para o caso da relação MOO/FDA (4 casos

depassando um C.V. de 20%) do que no caso da relação MOO/DBO que apresentou

12 casos em 16 com C.V. maior do que 30%.

Contrariamente a tendências tecnológicas sofisticadas, a aplicação da

metodologia da Hidrólise da FDA é simples, sem necessidade de muitos reagentes,

sem necessidade de equipamento adicional, sendo que o espectrofotômetro pode

ser substituído por uma escala colorimétrica impressa em papel. Além do mais, caso

se queira expandir a qualidade da informação obtida, isto é, além de poder se

conhecer a biodegradabilidade intrínseca da amostra, pode-se conhecer o potencial

de biodegradação da amostra ao se adicionar um inóculo específico (ou mistura) de

microrganismos, facilitando assim a escolha do tipo de microrganismo mais

competente para a degradação da matéria orgânica de uma amostra específica, o

que pode ser de muito interesse para os operadores de estações de tratamento de

águas residuárias ou de efluentes industriais. Nesse sentido, as leituras em

intervalos de tempo podem fornecer dados para se conhecer a cinética da

biodegradação, permitindo otimizar rapidamente as condições de operação do

sistema de tratamento em uso.

A literatura registra também outras metodologias para a avaliação da

quantidade e qualidade da material orgânica em amostras líquidas, tanto naturais

quanto industriais. Assim, a necessidade de métodos rápidos, portáteis,

economicamente acessíveis e, principalmente aplicáveis de forma on-line, tem

estimulado a produção e desenvolvimento de biosensores (RASTOGI et al, 2003).

67

Como exemplo, podemos citar o trabalho de Wang et al (2010), os quais

desenvolveram um biosensor do tipo bio-reator, usando mistura de células de

microrganismos imobilizados em esferas colocadas em uma câmera ao invés da

imobilzação clássica feita em membranas. Estas células imobilizadas nas esferas

dentro de câmaras foram colocadas em suspensão para o máximo contato com a

matéria orgânica e oxigênio presentes no meio líquido, podendo-se ajustar o número

de microrganismos nas esferas em função das condições do meio onde os

microrganismos serão expostos. Esta proposição metodológica de Wang et al (2010)

significativamente aumentaram o limite de detecção, a exatidão e a precisão na

determinação da matéria orgânica biodegradável. Para uma freqüência de 8 análises

diárias de DBO, as esferas tiveram uma vida útil de 70 dias, mas o aparato analítico

inclui equipamento informático, o que encarece sensivelmente a aplicação desta

metodologia.

68

7 CONCLUSÃO

Este trabalho de dissertação apresenta uma nova metodologia para avaliar a

biodegradabilidade intrínseca da matéria orgânica de uma amostra líquida de origem

industrial/ambiental, a qual tem larga aplicabilidade em termos de diferentes classes

de efluentes industriais (têxtil, hospitalar, agro-industrial) ou amostras ambientais

que possuem matéria orgânica (águas residuárias cinzas, esgotos domésticos e

águas de rio poluído). Esta metodologia é baseada na hidrólise do diacetato de

fluoresceína, hidrólise esta que pode ser feita por uma ampla variedade de

microrganismos que possuem em seu metabolismo lipases, esterases e proteases.

A otimização parcial da metodologia permitiu estabelecer um conjunto de condições

mínimas para a aplicação desta metodologia. Assim, quantidade do reagente FDA

(200 µl.mL-1), pH (entre 7,0 – 8,0), sistema tamponante (fosfato de sódio 60 mM, pH

7,6), volume de amostra e diluição (5 mL e diluições de 1/1; 1/4 e 1/8), tempo de

biodegradação (24 h) foram estabelecidos para que todas as amostras testadas

pudessem ser analisadas pela nova metodologia. Já foi determinado que amostras

contendo corantes que interferem na leitura do FDA hidrolisado (�max= 490 nm) e

amostras ricas em material graxo podem interferir significativamente na

eficiência/precisão da metodologia proposta.

A comparação das respostas de amostras diluídas e analisadas por

diferentes metodologias de avaliação da matéria orgânica permitiram estabelecer

que a hidrólise da FDA apresenta uma precisão melhor (mas próxima) daquela da

metodologia da DQO e muito melhor do que a precisão apresentada pelo método do

Oxigênio Consumido (OC). Em termos de mensuração da biodegradabilidade

intrínseca da matéria orgânica de uma amostra líquida, a comparação entre as

relações da hidrólise da FDA e DBO com a Matéria Orgânica Oxidável termicamente

(MOO) mostraram que a hidrólise da FDA fornece valores bem mais precisos do que

a DBO quando se trabalha com uma série de diluição para cada amostra. Nesse

sentido, os valores dos coeficientes de variação das relações são muito mais

aceitáveis para o caso da relação MOO/FDA (4 casos depassando um C.V. de 20%)

do que no caso da relação MOO/DBO que apresentou 12 casos em 16 com C.V.

maior do que 30%. A explicação para isto repousa no fato de que a matéria orgânica

(incluído o diacetato de fluoresceína) está mais acessível (em termos de contato) e

69

disponível (em termos de especiação química e absorção) para os microrganismos

nas condições em que o ensaio é realizado. Desta forma, é razoável concluir que,

independentemente da perspectiva de uso (monitoramento de uma estação de

tratamento em indústria ou monitoramento de um sistema de biorremediação in

locus), a hidrólise do FDA conjuga a avaliação da bioacessibilidade e da

biodisponibilidade, as quais estão sujeitas a uma série de influências por fatores

físico-químicos do meio onde ocorre a oxidação.

De forma resumida, o ensaio com a FDA é mais ambientalmente realístico

do que o teste de DBO, além de ser rápido, de baixo custo, de fácil execução técnica

e com necessidade mínima de equipamento.

Além do fato de ser mais conveniente em termos de aplicação

industrial/ambiental, o desenvolvimento da coloração pela hidrólise permite medidas

mais precisas e mais reais (em termos de condições ambientais) para se conhecer a

cinética da biodegradação de uma amostra específica. A eficiência da

biodegradação pelo uso de diferentes microrganismos ou misturas de

microrganismos poderá ser feita de forma rápida e precisa, ajustando-se assim

rapidamente as condições ótimas para promover a biodegradação.

Certamente outros fatores deverão ser estudados para melhor compreender

as limitações técnicas desta nova metodologia, porém, os dados levantados

permitem afirmar que a metodologia é viável tecnicamente e de fácil execução

laboratorial. Por outro lado, além das possíveis deficiências, os estudos

complementares poderão ajudar no aperfeiçoamento desta nova metodologia que

poderá ser incorporada no cotidiano dos técnicos que trabalham na área da

biodegradação.

70

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ANEXO

Anexo A – Variações das absorbâncias médias de triplicatas em função do tempo de hidrólise de FDA para cada tipo de amostra e suas respectivas diluições testadas (AC = Água Cinza; RP = Rio Poluído; AI = Agro-Industrial).

Amostra Abs. inicial

3h 6h 9h 21h 24h 27h 30h AC 1/1 0,095 0,085 0,092 0,096 0,183 0,220 0,236 0,275 AC 1/4 0,053 0,040 0,049 0,046 0,090 0,104 0,119 0,134 AC 1/8 0,023 0,023 0,029 0,022 0,034 0,042 0,060 0,075 RP 1/1 0,134 0,184 0,226 0,243 0,293 0,299 0,320 0,348 RP 1/4 0,081 0,104 0,132 0,144 0,192 0,202 0,227 0,259 RP 1/8 0,042 0,049 0,061 0,067 0,099 0,109 0,115 0,140 AI 1/1 0,164 0,166 0,213 0,228 0,322 0,345 0,366 0,379 AI 1/4 0,054 0,086 0,125 0,140 0,248 0,265 0,279 0,292 AI 1/8 0,031 0,046 0,071 0,082 0,173 0,184 0,203 0,214