ROTAVÍRUS GRUPO A COMO MARCADOR BIOLÓGICO DE …livros01.livrosgratis.com.br/cp134450.pdf · Gentil Arthur, Alexandre Santos e Vanessa Neves, pelo ótimo astral e por sempre

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ANA CAROLINA GANIME ALVES TEIXEIRA

“ROTAVÍRUS GRUPO A COMO MARCADOR BIOLÓGICO DE CONTAMINAÇÃO DE SUPERFÍCIES HOSPITALARES”

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz

como parte dos requisitos para obtenção do título de

Mestre em CIÊNCIAS

Orientador: Prof. Dr. José Paulo Gagliardi Leite

RIO DE JANEIRO

2010

Livros Grátis

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ii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ANA CAROLINA GANIME ALVES TEIXEIRA

“ROTAVÍRUS GRUPO A COMO MARCADOR BIOLÓGICO DE CONTAMINAÇÃO DE SUPERFÍCIES HOSPITALARES”

ORIENTADOR: Prof. Dr. José Paulo Gagliardi Leite

Aprovada em: _____/_____/_____

EXAMINADORES:

Prof. Dra. Caroline Cordeiro Soares

Prof. Dr. Filipe Aníbal Carvalho Costa

Prof. Dra. Joana D’ Árc Pereira Mascarenhas

Prof. Dra. Cristiane Lamas

Prof. Dra. Rita Cubel-Garcia

Rio de Janeiro, 26 de março de 2010

iii

Trabalho desenvolvido no Laboratório de

Virologia Comparada e Ambiental, IOC,

FIOCRUZ, sob a orientação do Dr. José

Paulo Gagliardi Leite.

iv

Dedicatória

Aos meus pais, José Antonio Alves Teixeira (in

memorian) e Marisa Cardoso Ganime pelo

incentivo e apoio. Aos meus irmãos Paulo

Gustavo, Maria Claudia, Ana Cristina e Carlos

Eduardo pela compreensão e amizade. E ao meu

marido Vinícius de Morais pela amizade e

companheirismo. Aos meus sobrinhos, Letícia,

Enzo e Lucas, que eu tanto amo.

v

Agradecimentos

Ao Dr. José Paulo Gagliardi Leite e a Dra. Marize Pereira Miagostovich pela

confiança e pelas oportunidades que vêm me proporcionado;

À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária do Instituto

Oswaldo Cruz, FIOCRUZ;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e

FIOCRUZ pelo suporte financeiro deste trabalho;

À toda equipe do Laboratório de Virologia Comparada e ambiental, Alexandre Fialho,

Alexandre Pina, Joeler Vargas, Marilda Almeida, Francisca dos Santos, Tulio

Fumian, Carmen Baur, Matias Victoria, Flávia Guimarães, Tatiana Prado, Mônica

Ferreira, Maria da Penha Xavier, Rosane Maria Assis, Silvana, Irene Araújo, Juliana

Andrade, Suellen, Tatiana Rose, Maria Eugenia, Pamela, Ana Carolina Tinga,

Nilson, Elioneide, Hugo, Marcelle Figueira, Fernando, com especiais agradecimentos

ao Dr. Eduardo Volotão e Dr. Marcos Cézar Lima de Mendonça, diretamente

envolvidos na realização deste trabalho;

Às ―meninas‖ da B201, Ludmila Rocha, Juliana Bragazzi Cunha, Julia Fioretti,

Thaís Ramos, Mariela Martinez e Ana Maria Pinto, pelo apoio, divertimento e

ótimo clima de convivência;

À todos os funcionários e alunos do Pavilhão Helio e Peggy Pereira;

A equipe médica do Centro de Tratamento Intensivo do Hospital em que este

trabalho foi realizado.

vi

Aos colegas da turma de Biologia Parasitária Ludmila Rocha, Nathália Motta,

Gentil Arthur, Alexandre Santos e Vanessa Neves, pelo ótimo astral e por sempre

estarem ao meu lado nas horas boas e difíceis;

Aos meus amigos e familiares que sempre entenderam meus estresses e ausência

durante este tempo e me deram um enorme e importante apoio.

A todos que, colocando seus conhecimentos científicos a disposição de quem

precise, vêm me servindo de estímulo.

Pouco importa o julgamento dos outros.

Os seres são tão diversos e tão

contraditórios que é impossível atender

as suas demandas, satisfazê-los. Tenha

em mente simplesmente ser autê

vii

“Pouco importa o julgamento dos outros. Os

seres são tão diversos e tão contraditórios que é

impossível atender as suas demandas, satisfazê-

los. Tenha em mente simplesmente ser autêntico

e verdadeiro.”

Dalai Lama

viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

µM – Micromolar

A – Adenina

aa – Aminoácido

AcM – Anticorpos monoclonais

AdV - Adenovírus

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AstV – Astrovírus

BD - Botão de descarga (banheiro)

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool

C – Citosina

CA - Cadeira para acompanhante

Ca++ – Íon cálcio

CaCl2 – Cloreto de cálcio

CC - Controle da cama (apoio lateral)

CCIHs - Centros de controle de infecçõe hospitalares

CDC – Centers for Disease Control and Prevention

cDNA - Complementary DNA - DNA complementar

CEP – Comitê de Ética em Pesquisa

cg/mL – cópias genômicas por mililitro

CR - Controle remoto (TV)

CTI – Centro de terapia intensiva

dATP – Desoxiadenosna trifosfato

dCTP – Desoxicitidina trifosfato

ix

DDA – Doenças Diarréicas Agudas

dGTP – Desoxiguanosina trifosfato

DLP – Double Layer Particles – Partículas virais de camada dupla

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium

DMSO – Dimetil sulfóxido

DNA – Ácido desoxirribonucleico

D.P. – Desvio padrão

dTTP – Desoxitimidina trifosfato

dXTP – Desoxiribonucleotídeos

EDTA – Ácido etilenodiamino tetracético

EGPA – Eletroforese em gel de poliacrilamida

EGTA – Ácido etilenglicol tetracético

EIARA – Ensaio imunoenzimático para Adenovírus e Rotavírus-A

EIE – Ensaio imunoenzimático

EPI - Equipamento de proteção individual

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

g – Grama

G – Guanina

GA – Gastroenterite Aguda

GE – Gastroenterite

H2O – Água

HAstV – Astrovírus humanos

HCl – Ácido clorídrico

ICTV – International Committee on Taxonomy of Viruses - Comitê Internacional de

Taxonomia de Vírus

x

IF – Imunofluorescência

IFN-γ – Interferon gama

Ig – Imunoglobulina

IH - Infecção hospitalar

IME - Imunomicroscopia eletrônica

INF- α – Interferon alfa

IOC – Instituto Oswaldo Cruz

IUB - International Union of Biochemistry

IrAS - Infecção relacionada à assistência de saúde

IRF – Interferon regulatory factors - Fatores reguladores do Interferon

kb – kilobase - Quilobases

KCl - Cloreto de Potássio

kDa – kiloDalton - QuiloDalton

LVCA – Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental

M – Molar

MA - Mesa Apoio

MDDA – Monitorização das doenças diarréicas agudas

ME – Microscopia eletrônica

MEB - Maçaneta externa banheiro

mg – Miligrama

MgCl2 – Cloreto de magnésio

MIL - Maçanetas interna da porta do leito

mL – Mililitro

mM – Milimolar

xi

MS – Ministério da Saúde

N – Normal

NaHCO3 - Bicarbonato de Sódio

NaOH – Hidróxido de sódio

NCBI – National Center for Biotechnology Information - Centro Nacional de

Informação em Biotecnologia

ng – Nanograma

nm – Nanômetros

NSP – Non-structural protein - proteína não estrutural

nt – Nucleotídeos

NTPase - Proteína nucleosídeo trifosfatase

NV – Norovírus

oC – Graus centígrados

OMS – Organização Mundial de Saúde

ORF – Open reading frame - fase aberta de leitura

p – Probabilidade

P.A. – Pura análise

pb – Pares de bases

PBS – Phosphate buffered saline - tampão salina fosfato

PCIH – Programa de controle de infecções hospitalares

PCR - Reação em cadeia pela polimerase

PDC - Partículas com duplo capsídeo

pH – Concentração hidrogeniônico

pmoles - Picomoles

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

xii

PNI - Programa Nacional de Imunizações

PTC- Partículas com Triplo Capsídeo

q.s.p. – Quantidade suficiente para

qPCR - Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction - Amplificação genômica

quantitativa em tempo real

RE – Retículo endoplasmático

RER – Retículo endoplasmático rugoso

RJ – Rio de Janeiro

RNA – Ribonucleic acid - Ácido ribonucléico

RNA (+) – RNA de polaridade positiva

RNAfd – RNA fita dupla

RNAfs - RNA fita simples

RNAm – RNA mensageiro

RNAmv – RNA mensageiro viral

RpRd – RNA polimerase RNA dependente

RT –Reverse transcriptase - Transcriptase reversa

RT-PCR - Reação em cadeia pela polimerase precedida pela transcrição reversa

RV – Rotavírus

RV-A – Rotavírus do grupo A

RV-B – Rotavírus do grupo B

RV-C – Rotavírus do grupo C

SA - Suporte de álcool gel para higienização das mãos

SC - Suporte de clorexidina para higienização das mãos

SG – Subgrupo

SNE – Sistema nervoso entérico

xiii

T – Timina

TBE – Tris-Borato-EDTA

TBI - Teclado da bomba de infusão

TE – Telefone

TL - Tampa da lixeira de resíduo comum

Tris – Hidroximetil-tris-aminometano

U/μL – Unidades por microlitro

UTI – Unidade de terapia intensiva

UTR – Região não traduzida

UV – Ultravioleta

VLS – Viroplasm-like structures - Partículas similares a viroplasmas

VP – Viral protein - proteína estrutural

VP5* – Subunidade peptídica VP5 gerado por proteólise de VP4

VP8* – Subunidade peptídica VP8 gerada por proteólise de VP4

x g – Vezes maior que a força gravitacional

μg/mL – Microgramas por mililitro

μL – Microlitro

- Média

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1-1: Eletroforese em gel de poliacrilamida do genoma de rotavírus ................ 4

Figura 1-2: Esquema representativo dos eletroferotipos dos diferentes grupos de

rotavírus analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida ................................... 6

Figura 1-3: Esquema da estrutura do gene de rotavirus do grupo A ........................... 7

Figura 1-4: - Modelo esquemático do ciclo de replicação dos rotavírus.. .................. 13

Figura 1-5 - Veículo de disseminação direta e indireta de infecção viral nosocomial

.................................................................................................................................. 22

Figura 4-1 - Coleta de amostras de superfície pelo uso de swabs umedecidos em

PBS pH7,2................................................................................................................. 26

Figura 4-2 : Representação dos pontos de coleta. .................................................... 28

Figura 5-1: Distribuição mensal do percentual de positividade de Rotavirus A (RV-A)

detectados em 84 amostras/mês de superfícies de fômites hospitalares ................. 45

Figura 5-2 - Detecção de rotavirus A (RV-A) em diferentes superfícies/fômites

hospitalares.. ............................................................................................................. 46

Figura 5-3 - Detecção de rotavirus-A (RV-A) em amostras de superficies de fômites

distribuídas por leito hospitalar (n=72/leito). .............................................................. 48

Figura 5-4 - Distribuição mensal do número de fômites contaminados por leito

hospitalar do Centro de Tratamento Intensivo.......................................................... 49

Figura 5-5 - Detecção de rotavirus A (RV-A) em amostras de superfície hospitalar, de

acordo com a ocupação dos leitos. .......................................................................... 49

Figura 5-6 – Média da quantificação genômica de rotavírus-A (RV-A) por

fômites/superfícies. ................................................................................................... 50

Figura 5-7 - Agrupamento das amostras baseado na seqüência parcial do gene que

codifica para VP6 das amostras obtidas no presente estudo e diferentes protótipos

representantes dos diferentes genótipos I. ............................................................... 51

xv

LISTA DE QUADROS

Quadro 1-1 - Funções atribuídas às proteínas codificadas pelos segmentos

genômicos de rotavirus-A ............................................................................................ 5

Quadro 1-2– Valores de cut-off de percentagem de identidade nucleotídica que

definem os diferentes genótipos de rotavirus A considerando-se os 11 genes virais.

.................................................................................................................................. 10

Quadro 1-3 - Método de desenvolvimento das vacinas e suas características. ........ 19

Quadro 4-1 – Mistura de reagentes (Mix) utilizados na reação de transcrição reversa

do RNA viral. ............................................................................................................. 30

Quadro 4-2: Seqüência de iniciadores de cadeia utilizados nas PCRs para detecção,

quantificação e caracterização de Rotavirus-A. ....................................................... 31

Quadro 4-3 – Reagentes utilizados (Mix) na RT-PCR para amplificação parcial do

gene que codifica para a proteína VP6 de rotavirus A. ............................................. 32

Quadro 4-4: Reagentes utilizados (Mix) na nested-RT-PCR para a amplificação

parcial do gene que codifica para a proteína VP6 de rotavirus A. ............................. 33

Quadro 4-5 – Identificação, espécie de origem, número de acesso das seqüências,

classificação binária e genótipo do gene VP6 de rotavirus A .................................... 37

Quadro 5-1: Detecção de RV-A por Nested-RT-PCR em amostras obtidas através

de swabs de superfícies do CTI I de Hospital da rede particular situado na cidade do

Rio de Janeiro, no período de janeiro a junho de 2009. ............................................ 47

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 5-1- Detecção de rotavirus-A (RV-A) pela amplificação do gene que codifica

para a proteína VP6 (nested RT-PCR) em amostras de superfícies/fômites. .......... 43

Tabela 5-2: Avaliação de volume do eluato de swab a ser utilizado no método de

extração de RNA por sílica/isotiocianato de guanidina. ............................................ 44

xvii

ÍNDICE

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................................................ viii

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................... xiv

LISTA DE QUADROS ........................................................................................................................ xv

LISTA DE TABELAS ......................................................................................................................... xvi

Resumo ................................................................................................................................................ xx

Abstract............................................................................................................................................... xxi

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 1

1.1 Os Rotavírus ......................................................................................................................... 2

1.1.1 Histórico ......................................................................................................................... 2

1.1.2 Morfologia e organização do genoma viral ............................................................... 3

1.1.3 Propriedades físico-químicas ..................................................................................... 7

1.1.4 Classificação dos rotavirus-A ..................................................................................... 8

1.1.5 Replicação viral ........................................................................................................... 11

1.1.6 Patogênese.................................................................................................................. 13

1.1.7 Epidemiologia .............................................................................................................. 14

1.1.8 Diagnóstico laboratorial ............................................................................................. 16

1.1.9 Prevenção e controle ................................................................................................. 18

1.1.10 Disseminação ambiental de vírus - Contaminação de Superfícies ................... 20

1.1.11 Infecção Hospitalar (IH) ............................................................................................. 23

2 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................................... 23

3 OBJETIVOS ................................................................................................................................ 25

3.1 Objetivo Geral ..................................................................................................................... 25

3.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 25

4 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 25

4.1 Estudo Piloto ....................................................................................................................... 25

4.2 Período e Área de estudo ................................................................................................. 27

xviii

4.3 Extração dos ácidos nucleicos pelo método de sílica (Boom et al., 1990) ............... 28

4.4 Reação de transcrição reversa (RT) para a obtenção de DNA complementar

(cDNA) .............................................................................................................................................. 29

4.5 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) .................................................................... 30

4.6 PCR para amplificação parcial do gene que codifica para a proteína VP6 de RV-A ..

............................................................................................................................................... 31

4.7 Análise dos amplicons por eletroforese em gel de agarose a 1,5% .......................... 33

4.8 Amplificação genômica quantitativa em tempo real (qPCR) ....................................... 34

4.9 Purificação e sequenciamento dos amplicons obtidos pela nested-RT-PCR do gene

que codifica para a proteína VP6 de RV-A. ............................................................................... 35

4.10 Análise dos cromatogramas das amostras .................................................................... 35

4.11 Análise Estatística .............................................................................................................. 38

4.12 Soluções .............................................................................................................................. 38

4.12.1 Sílica (pH = 2,0) .......................................................................................................... 38

4.12.2 EDTA 0,2M, pH=8,0 ................................................................................................... 38

4.12.3 Tampão TRIS-HCl 0,1M pH 6,4 ............................................................................... 39

4.12.4 Tampão L6 ................................................................................................................... 39

4.12.5 Tampão L2 ................................................................................................................... 40

4.12.6 Tampão Tris-Boro-EDTA 10X pH 8,4 (TBE) .......................................................... 40

4.12.7 Gel de agarose a 1,5% .............................................................................................. 41

4.12.8 Solução de brometo de etídio 0,5µg/mL ................................................................. 41

4.12.9 Etanol a 70% ............................................................................................................... 41

4.12.10 Meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium) pH 7,2 ............................... 42

5 RESULTADOS ........................................................................................................................... 42

5.1 Estudo Piloto ....................................................................................................................... 42

5.2 Detecção de RV-A pela RT-PCR e nested-RT-PCR em amostras de superfície

hospitalar. ........................................................................................................................................ 44

5.3 Amplificação genômica quantitativa em tempo real (qPCR) ....................................... 50

5.4 Caracterização molecular.................................................................................................. 50

6 DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 52

xix

7 CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 57

8 PERSPECTIVAS ........................................................................................................................ 58

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 59

xx

Resumo

Os Rotavirus A (RV-A) são os principais causadores de gastroenterites em crianças

menores de cinco anos de idade. Estes vírus estão diretamente associados à

diarréia e vômito e são transmitidos pela propagação de pessoa a pessoa por via

fecal-oral; entretanto, a transmissão ambiental de RV-A pelo contato com superfícies

contaminadas tem sido descrita em hospitais. O objetivo deste estudo foi

estabelecer um protocolo para detecção de RV-A em superfícies e fômites, a fim de

avaliar o RV-A como marcador biológico de contaminação de superfícies

hospitalares. Um estudo piloto foi realizado para avaliação e determinação da

metodologia de recuperação viral a ser utilizada em estudo no Centro de Tratamento

Intensivo de um hospital da rede particular situado na cidade do Rio de Janeiro,

Brasil. Neste local, no período de janeiro a junho de 2009, foram realizadas coletas

mensais de 12 superfícies e fômites de 7 leitos do CTI, totalizando 504 amostras

provenientes de: suporte para álcool gel, botão de descarga, cadeira do

acompanhante, suporte de clorexidina, tampa da lixeira de resíduos comuns,

maçaneta interna da porta do leito, controle da cama, maçaneta externa do

banheiro, teclado da bomba de infusão, controle remoto, mesa de apoio e telefone.

As amostras foram obtidas por fricção de ―swabs” embebidos em meio de cultura

(DMEM) e a extração do ácido nucléico viral realizada pelo método de isotiocianato

de guanidina/sílica, seguida da síntese do cDNA utilizando iniciador randômico

(pdN6). Protocolos de reação em cadeia da polimerase (PCR) qualitativa e

quantitativa foram utilizados para detecção e quantificação do RV-A pela

amplificação parcial dos genes que codificam para a proteína estrutural VP6 e a não

estrutural NSP3, respectivamente. Das 504 amostras analisadas, 25 (5%) foram

positivas para RV-A pela RT-PCR, ao passo que pela Nested-PCR este número

aumentou para 73 (14,5%). Destas 45 (61,6%) foram quantificadas pela qPCR com

carga viral variando de 3,4 x 100cg/mL a 2,9 x 103cg/mL. O sequenciamento

nucleotidico dos produtos obtidos pela nested-RT-PCR confirmaram a contaminação

por RV-A. A detecção de RV-A em superfícies hospitalares aponta para a

necessidade de um maior controle de higienização que reduza a contaminação por

vírus, e sugere a utilização do RV-A como marcador biológico de contaminação de

superfícies hospitalares.

xxi

Abstract

Rotavirus A (RV-A) is the main cause of acute gastroenteritis in children under five

years of age. This virus is directly associated with diarrhea and vomiting and is

transmitted by spread from person to person by the fecal-oral route, however,

environmental transmission of RV-A by contact with contaminated surfaces has been

described in hospitals. The aim of this study was to establish a protocol for detection

of RV-A on surfaces and fomites in order to assess RV-A as a contamination

biomarker of hospital surfaces. A pilot study was performed for evaluation and

determination of viral recovery methods to be used in a study in the intensive care

unit (ICU) of a private hospital located in the city of Rio de Janeiro, Brazil. From

January to June/2009, samples were collected monthly from 12 surfaces and fomites

of 7-bed of the ICU. There was a total of 504 samples collected from the following

sites: alcohol gel and chlorhexidine dispensers, toilet flush button, chair from the

accompanying person, ordinary waste bin lid, door handle from outside the bathroom

door and the patient’s room, bed control, infusion pump keyboard, TV remote control,

desk and telephone. Samples were obtained by rubbing swabs embedded in culture

medium (DMEM). Viral nucleic acid extraction was performed by the method of

guanidine isothiocyanate / silica, followed by cDNA synthesis using random primer

(pdN6). Qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR) were used for

detection and quantification of RV-A by partial amplification of genes coding for the

structural protein VP6 and nonstructural protein NSP3, respectively. Of the 504

analyzed samples, 25 (5%) were positive for RV-A by RT-PCR; when nested-PCR

was used, the number increased to 73 (14.5%). Of these, 45 (61.6%) were quantified

by quantitative PCR with viral load ranging from 3.4 x 100cg/mL to 2.9 x 103cg/mL.

Nucleotide sequences of the products obtained by nested-RT-PCR confirmed RV-A

contamination. Detection of RV-A in hospital surfaces indicates the need of greater

control on cleaning procedures to reduce contamination by viruses and suggests

using RV-A as a possible biomarker for contamination of hospital surfaces.

1

1 INTRODUÇÃO

As infecções entéricas agudas, incluindo gastroenterites agudas (GA), estão

entre as causas mais comuns de mortalidade em lactentes e crianças de até cinco

anos em países em desenvolvimento (Thapar & Sanderson., 2004).

No Brasil, em 2004, o sistema de vigilância da Monitorização das Doenças

Diarréicas Agudas (MDDA), do Ministério da Saúde (MS) notificou 2.395.485 casos

de diarréia. A magnitude das DDA em crianças menores de cinco anos pode ser

demonstrada pela quantidade de recursos destinados ao pagamento de internações

hospitalares, que no período de 1995 a 2004 somaram R$173.245.567,85, estando

os maiores valores concentrados nas regiões nordeste e sudeste do país. Da

mesma forma, as regiões nordeste e sudeste também apresentaram o maior número

de óbitos em crianças menores de cinco anos relacionadas às DDAs.

A etiologia da GA é bastante complexa, podendo envolver diferentes

patógenos, entre os quais vírus, bactérias, parasitas e também toxinas. Do ponto de

vista clínico, as GA causadas por vírus não podem ser distinguidas daquelas

causadas por bactérias, sendo geralmente um processo auto-limitado de diarréia e

vômito, com duração entre 1 e 7 dias (Wilhelmi et al., 2003).

A importância relativa dos agentes etiológicos é variável e o predomínio de

um agente ou sua distribuição sazonal está diretamente relacionado com a

freqüência e intensidades com que medidas higiênico-sanitárias são adotadas.

Estudos indicam que, tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento,

um grande número de casos de diarréia pode ser atribuído à etiologia viral (Glass et

al., 1994).

Aproximadamente 40% dos casos de GA em crianças de até cinco anos são

causadas por Rotavírus-A (RV-A) (Van Damme et al., 2007), ocasionando a morte

de aproximadamente 611.000 crianças por ano em todo mundo (Parashar et al.,

2006).

No Brasil, pelo menos dois terços (2/3) dos casos de DDA, têm os RV-A

como agentes etiológicos, com a infecção predominando na faixa etária entre 6 e 24

meses, acarretando 90.000 hospitalizações somente no primeiro ano de vida

2

(Ministério da Saúde, 2006). Anualmente, ocorrem 832.762 casos de GA causadas

por RV-A, ocasionando 2.475 mortes (Constenla et al., 2008).

1.1 Os Rotavírus

1.1.1 Histórico

Nos anos 1940, teve início a busca pela identificação de agentes virais

como etiologia de DDA. Na época, já era reconhecida a existência de diarréias em

que as coproculturas eram negativas para bactérias e protozoários causadores de

gastroenterites.

Um experimento pioneiro foi descrito por Light & Hodes (1943) em que

suspensões fecais previamente filtradas em filtro de Seitz, obtidas de lactentes com

DDA, foram inoculadas em bezerros por via intranasal, produzindo diarréia nestes

animais. As culturas das suspensões filtradas foram negativas para bactérias e a

existência de ―agentes filtráveis‖ como etiologia de DDA foi então sugerida pela

primeira vez.

Após vinte anos, em estudos realizados pela microscopia eletrônica (ME),

Adams & Kraft (1963) identificaram na mucosa intestinal de camundongos com

diarréia, estruturas intracelulares esféricas medindo entre 65 e 75nm de diâmetro,

com morfologia complexa, que sugeriram tratar de partículas virais, fato que seria

comprovado posteriormente.

A primeira descrição de um vírus como agente etiológico de DDA em

humanos foi feita no início dos anos 1970, quando foram conduzidos diversos

estudos pela ME em fezes diarréicas. Estas foram obtidas de voluntários infectados

com suspensões fecais (originárias do surto de gastroenterite ocorrido na cidade

norte-americana de Norwalk, em 1968). Em um dos estudos, foram visualizadas

partículas virais medindo 27nm (Kapikian et al., 1972), atualmente denominadas

norovírus.

Bishop e colaboradores (1973) fizeram a primeira identificação de partículas

virais medindo entre 67 e 87nm de diâmetro, em células da mucosa intestinal

obtidas por biópsia de duodeno de crianças com DDA. Este agente seria

3

posteriormente denominado rotavírus por Flewett et al (1974), por possuir, em ME o

aspecto de uma ―roda‖, sendo posteriormente conhecido como uma das principais

causas de DDA na população infantil.

No Brasil, a primeira descrição de RV em humanos ocorreu em 1976, a partir

de material fecal proveniente de crianças admitidas com GA em um hospital público

de Belém, PA e identificadas por ME (Linhares et al., 1977). Desde então, foram

realizadas inúmeras investigações em crianças no país, demonstrando a ocorrência

desses agentes associados com GA (Racz et al., 1988; Pereira et al., 1993;

Mascarenhas et al., 1999; Cardoso et al., 2003).

Wyatt e colaboradores (1980) descreveram, de maneira pioneira, técnicas

para cultivo in vitro de RV-A, utilizando células de rim de macaco, sendo este um

passo importante para a pesquisa dos RV-A.

1.1.2 Morfologia e organização do genoma viral

A partícula viral completa é não-envelopada, com simetria icosaédrica, e

mede aproximadamente 100nm de diâmetro (Hyser & Estes, 2009). Apresenta triplo

capsídeo formado por três camadas proteicas concêntricas, que foram designadas

como capsídeo externo, intermediário e interno (core) que circunda o genoma viral

(Kapikian et al., 2001).

O material genético dos RV é constituído por ácido ribonucléico de fita dupla

(RNAfd), com 11 segmentos distintos, que podem ser visualizados por eletroforese

em gel de poliacrilamida (EGPA). Cada um dos segmentos codifica uma proteína

específica, com exceção do segmento 11, que codifica para duas proteínas (Estes &

Kapikian, 2007) (Figura 1-1).

4

Figura 1-1: Eletroforese em gel de poliacrilamida do genoma de rotavírus, RNA fita dupla, segmentado (A) e as proteínas codificadas por cada segmento genômico (B). Partícula de rotavírus representada esquematicamente (C); partícula de rotavírus e sua estrutura determinada por eletromicroscopia associada ao processamento de imagem por computador (D).

As proteínas estruturais são designadas VP (Viral Protein) seguidas por

número seqüencial na ordem decrescente da massa molecular. No core estão

presentes as proteínas VP1, VP2 e VP3, codificadas pelos segmentos 1, 2 e 3,

respectivamente. Essas proteínas representam, em conjunto, aproximadamente

18% das proteínas virais. No capsídeo intermediário está a VP6 codificada pelo

segmento 6, sendo esta a mais abundante (51%) e uma das mais importantes

proteínas estruturais em termos de antigenicidade, responsável por uma das

classificações dos RV em grupos de A - G. No capsídeo externo estão as proteínas

VP4, codificada pelo segmento 4 e VP7, codificada pelos segmentos 7 (Rhesus sp.),

8 (rotavírus bovino, isolado UK, Bos taurus) ou 9 (rotavirus símio, isolado SA-11,

Chlorocebus pygerythrus) (Estes & Kapikian, 2007) (Quadro 1-1).

As proteínas não-estruturais, encontradas nas partículas virais maduras,

recebem a denominação NSP (Non-Structural Protein): NSP1, NSP2, NSP3, NSP4 e

NSP5/NSP6 que são codificadas pelos segmentos genômicos 5, 8, 7, 10 e 11,

respectivamente (Estes & Kapikian, 2007) (Quadro 1-1).

(C)

(B)

(A)

(D)

5

Quadro 1-1 - Funções atribuídas às proteínas codificadas pelos segmentos genômicos de rotavirus-A

Gene(1)

Proteína Massa

Molecular

(kDa)

Tamanho

Molecular

(pb)

Localização

nas

partículas

N° de

cópias

Funções

1 VP1 125 3302 Nucleocapsídeo

12 RNA polimerase RNA dependente


120 União do RNA/ formação do nucleocapsídeo


12 Guanililtransferase/Metiltransferase/Proteína básica

4 VP4

VP5(2)

VP8(2)

86,7

60

28

2362 Capsídeo externo

120 Proteína de união à célula/ interage com VP6

Infecciosidade viral aumenta após clivagem pela tripsina

formando VP5 e VP8

5 NSP1 58,6 1611 Proteína não estrutural

0 Associa-se com citoesqueleto/ interage com fator 3 regulatório de IFN

6 VP6 44,8 1356 Capsídeo intermediário

780 Proteína estrutural de capsídeo intermediário/ Antígeno de subgrupo


0 Envolvida na regulação da tradução


0 Acumula-se em viroplasmas/atividade

NTPase/ liga NSP5 e VP1

9 VP7 37,4 1062 Capsídeo externo

780 Glicoproteína estrutural do capsídeo externo/ antígenos

neutralizante G-tipo


0 Enterotoxina/receptor para partícula com duplo capsídeo

no RE


0 Possível cinase autocatalítica/Interage com

VP2, NSP2 e NSP6

NSP6 12 Proteína não estrutural

0 Produto de ORF2 do gene 11/ interage com

NSP5/localizada em viroplasmas

FONTE: Estes, 2001 (adaptação). NOTA: Outras espécies dentro do gênero podem ter proteínas com

diferenças significativas de tamanho. (1)

Segmentos numerados baseados na migração do genoma da

estirpe SA11 em gel de poliacrilamida. (2)

Produtos da clivagem de VP4.

6

Os RV representam os únicos virus conhecidos por possuir 11 segmentos de

RNAfd, infectando tanto mamíferos como aves. O genoma segmentado completo

dos RV apresenta 18.550 pares de base (pb), com os segmentos variando entre

667pb (segmento 11) e 3.302pb (segmento 1), caracaterística que permitiu

determinar um padrão eletroforético (eletroferotipos) dos Rotavirus (A-G) (Figura 1-

2) (Estes, 2001).

Figura 1-2 - Esquema representativo dos eletroferotipos dos diferentes grupos de rotavírus analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida (Adaptada de Estes, 2001).

Os RV-A podem ser caracterizados pela análise da mobilidade dos

segmentos 10 e 11 do seu RNAfd pela EGPA. Assim, os RV-A possuem três

distintos perfis: "perfil eletroforético longo", por diferenças de mobilidade do

segmento 11 e "perfil eletroforético curto" e "super curto", quando as diferenças de

mobilidade ocorrem no segmento 10 (Figura 1-2) (Taniguchi & Urasawa, 1995).

Cada segmento de RNAfd, no sentido 5´, inicia com uma guanidina (G),

seguido de um conjunto de seqüências conservadas que são parte da região não-

codificadora 5´. Possui uma fase aberta de leitura (ORF, do inglês: Open Reading

Frame), que codifica para uma proteína, que termina com o códon de terminação,

seguida por um conjunto de seqüências não-codificadoras contendo um subconjunto

de seqüências conservadas terminadas com duas cistidinas (C) na extremidade 3´

longo curto

7

(Estes. 2001). A maioria dos RNAs terminam com uma seqüência consenso 5´-

UGUGACC-3´, sendo que estas seqüências contêm sinais importantes para a

expressão gênica e replicação (Wentz et al. 1996).

Os tamanhos das regiões não-codificadoras, nas extremidades 5´ e 3´, são

variáveis para os diferentes genes e todos os genes seqüenciados possuem pelo

menos uma ORF longa depois do primeiro códon de iniciação (Estes, 2001). A

grande conservação das seqüências terminais nos segmentos genômicos sugere

que elas contêm importantes sinais para a transcrição, transporte de RNA,

replicação, montagem ou empacotamento dos segmentos genômicos (Patton &

Spencer, 2000).

O RNA mensageiro viral (RNAmv), também denominado RNA de polaridade

positiva (RNA(+)), transcrito a partir da ORF de cada segmento genômico apresenta

características estruturais comuns entre os diferentes protótipos de RV-A. Os

RNAmv apresentam um CAP (ou ―capacete‖) na guanidina (G) do seu extremo 5´,

não apresentando seqüências poliadeniladas no extremo 3´ (Estes & Kapikian,

2007) (Figura 1-3).

Figura 1-3 - Esquema da estrutura do gene de rotavirus do grupo A (adaptada de Estes, 2001). Regiões não codificadoras (conservadas); Fase aberta de leitura (ORF);

AUG − Códon de iniciação para síntese protéica; 5’ − seqüência intensificadora, extremidade guanidina; 3’ − seqüência intensificadora, extremidade citosina

1.1.3 Propriedades físico-químicas

Os RV-A podem se manter infecciosos no ambiente por dias ou meses. O

ambiente ideal para manutenção de sua viabilidade consiste em temperaturas

baixas (4°C a 20°C), pH em torno de 3,0, baixa umidade e proteção contra raios

8

ultravioleta (D’Souza et al., 2007). As partículas virais mantêm sua infecciosidade e

integridade após exposição ao éter, clorofórmio e deoxicolato, refletindo a ausência

de envelope em partículas maduras (Estes, 2001). A partícula se mantém em

superfícies porosas (papel e tecido de algodão) e não porosas (alumínio e látex)

(Abad et al., 1994).

1.1.4 Classificação dos rotavirus-A

1.1.4.1 Grupos e Subgrupos

Os rotavírus (RV) pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus. Estão

classificados sorologicamente em sete grupos distintos (A-G) dependendo dos

diferentes epítopos presentes na proteína estrutural VP6. Também são classificados

em diferentes subgrupos (SG) e sorotipos/genótipos segundo as características

sorológicas e moleculares da proteína VP6.

A especificidade de subgrupos (SG) também é mediada pela proteína de

capsídeo interno VP6, pela presença ou ausência de epítopos imunoreativos frente a

determinados anticorpos monoclonais (AcM). Foram descritos os seguintes SG: I; II;

I e II; não I e não II (Greenberg et al., 1983). Os RV-A pertencem a todos os SG

(Hoshino & Kapikian, 2000). Porém, o SGII é o mais prevalente entre os humanos,

enquanto o SGI é mais detectado entre as amostras de origem animal (Estes &

Kapikian, 2007).

Os RV grupos A, B e C foram descritos tanto em humanos quanto em

animais, enquanto que os grupos D-G só foram descritos, até o momento, em

animais. Os RV-A são epidemiologicamente os mais importantes, sendo os

principais responsáveis pelos episódios de DDA em crianças em todo o mundo

(Estes & Kapikian, 2007).

Os RV-B estão associados às epidemias primeiramente descritas na China

(Hung et al., 1984) e, mais recentemente, em casos de diarréia em adultos na Índia

(Krishnan et al., 1999; Barman et al., 2004). Os RV-C foram descritos em casos

esporádicos e surtos em adultos e crianças em diversos países (Penaranda et al.,

1989; Oishi et al.,1993; Jiang et al., 1995, Rahman et al., 2005, Gabbay, 2008).

9

1.1.4.2 Classificação binária

Um sistema de classificação binária para os RV-A foi estabelecido e o

mesmo baseia-se nas especificidades inerentes às propriedades imunológicas e

moleculares dos genes que codificam para as proteínas VP4 e VP7, representados

pelas letras P (sensibilidade à protease) e G (glicoproteína) (Estes & Kapikian,

2007).

A designação de sorotipos G (VP7) coincide com a designação de

genótipos G, sendo respeitada a letra ―G‖ acompanhada do numero do

genótipo/sorotipo correspondente. O mesmo não ocorre para os sorotipos/genótipos

P (VP4). Assim sendo, uma nomenclatura dual foi adotada para a classificação

genética e antigênica com base na proteína VP4. Os sorotipos são descritos com a

letra ―P‖ acompanhada do número do sorotipo e/ou número do genótipo

correspondente entre colchetes (P1A[8]G1). Foram descritos até o momento 31

genótipos P e 23 genótipos G (Matthijnssen et al. 2008a; 2008b; Abe et al. 2009;

Solberg et al. 2009; Ursu et al. 2009).

1.1.4.3 Nova proposta de classificação

Recentemente, foi proposto por Matthijnssens e colaboradores (2008b) um

novo sistema de classificação para os RV-A, tendo como base as propriedades

moleculares dos 11 segmentos genômicos do RNA fita dupla (RNAfd) (Quadro 1-2).

Este novo sistema foi proposto baseado na caracterização molecular e análise

filogenética do genoma completo de 53 protótipos. Os diferentes genótipos descritos

para cada um dos segmentos são divididos segundo valores de cut-off específicos

de identidade nucleotídica para cada um destes genes.

No estudo feito por Matthijnssens e colaboradores (2008b), mediante a

análise filogenética dos genes que codificam para as proteínas estruturais internas

(VP1- VP3) e não-estruturais (NSP1-NSP5), foi evidenciado um consistente padrão

evolutivo entre certos vírus de origem humana e animal. Com base nestes

10

resultados, os autores propõem que esta nova classificação seja baseada em todos

os genes de RV-A. Esta permitirá definir a função de cada gene na transmissão

interespécie, evidenciando com maior facilidade os eventos de reestruturações

genéticas (reassortment) entre amostras humanas, e entre amostras humanas e

animais, que podem levar ao surgimento de novos genótipos de RV-A. Estas

análises permitirão ainda, um melhor entendimento da origem e o padrão evolutivo

dos RV-A.

Quadro 1-2– Valores de cut-off de percentagem de identidade nucleotídica que definem os diferentes genótipos de rotavirus A considerando-se os 11 genes virais (Adaptada de Matthijnssens e colaboradores, 2008b).

Gene

Valores cut-off

de identidade

nucleotídica

(%)

Genótipos

caracterizados

Designação dos nomes

dos genótipos

Pro

teín

as

es

tru

tura

is

VP1 83 4R RNA polimerase-RNA

dependente

VP2 84 5C Proteína do Core

VP3 81 6M Metiltransferase

VP4 80 31P Sensível à Protease

VP6 85 11I Capsídeo Interno

VP7 80 23G Glicoproteína

Pro

teín

as

nã

o

es

tru

tura

is

NSP1 79 14A Antagonista do Interferon

NSP2 85 5N NTPase

NSP3 85 7T Intensificador da Tradução

NSP4 85 11E Enterotoxina

NSP5 91 6H Fospoproteína

(pHosphoprotein)

11

1.1.5 Replicação viral

Os RV possuem um tropismo celular (in vivo) pelos enterócitos maduros das

vilosidades intestinais. A replicação viral ocorre no citoplasma das células absortivas

diferenciadas, localizadas no terço apical das vilosidades do intestino delgado. As

partículas infecciosas são liberadas no lúmen intestinal e o processo replicativo tem

continuidade na área distal do intestino delgado e somente partículas com triplo

capsídeo conseguem aderir-se às células. (Estes, 2001).

A proteína VP4 tem função essencial no ciclo de replicação do vírus,

incluindo a ligação ao receptor e a penetração celular. A infecciosidade dos RV in

vitro é aumentada pela presença da enzima proteolítica tripsina. A ação proteolítica

desta enzima resulta na clivagem da proteína VP4, em dois polipeptídios: VP5* e

VP8*. Esta clivagem é associada à internalização das partículas de RV nas células.

Presume-se que esta clivagem ocorra durante a infecção viral, no lúmen intestinal do

hospedeiro, uma vez que os RV estão expostos às secreções pancreáticas (Zarate

et al. 2000).

A entrada dos RV na célula se dá por meio de interações com receptores

celulares contendo ácido siálico e integrinas no início do processo de adsorção, com

o domínio VP8* interagindo com o ácido siálico e VP5* com as integrinas. Diferentes

estudos têm demonstrado recentemente que concentrações apropriadas de íons

Ca++ são necessárias para se manter a estabilidade da partícula viral,

aparentemente pela estabilidade de VP7. A remoção dos íons Ca++ dissocia os

trímeros de VP7 em monômeros, liberando a VP7 do virion e iniciando a penetração

induzida por mudanças conformacionais que ocorrem na proteína VP4 (Aoki et al.

2009).

Após a adsorção à célula hospedeira, ocorre a penetração do vírus no

citoplasma celular (Figura 1-4). O mecanismo de penetração viral ainda não foi

totalmente esclarecido. Ambos os mecanismos de penetração viral, endocitose

mediada por receptor ou penetração direta através da membrana celular, tem sido

sugeridos para RV-A. Possivelmente, mais de um mecanismo de penetração viral

esteja atuando nos RV-A, como já foi descrito para os poliovírus e os reovírus (Estes

& Kapikian, 2007).

12

No citoplasma ocorre a perda do capsídeo externo (desnudamento)

liberando as double layer particles (DLPs) no citoplasma celular. Os RNAs são

transcritos pela RNA-polimerase RNA-dependente (VP1). Ocorre a síntese de RNA(+)

a partir da fita negativa do RNA viral. As fitas de RNA(+) servirão de RNAm para a

tradução das proteínas virais (estruturais e não-estruturais) e de molde para a

produção de novas fitas de RNA (-). As proteínas recém sintetizadas (VP1, VP2,

VP3 e VP6; NSP2, NSP5 e NSP6, esta última quando presente) e o RNA fita

simples (RNAfs) viral são reunidos no citoplasma da célula infectada, constituindo

um material amorfo denominado viroplasma (Kapikian et al. 2001; Estes & Kapikian,

2007).

O capsídeo intermediário (VP6) envolve o cerne (RNAfd, VP1-VP3)

formando a partícula viral incompleta, com aproximadamente 50 nm de diâmetro

(partículas de duplo capsídeo - DLPs). Esta deixa o viroplasma e passa para o

interior do RE Rugoso (RER), onde adquire o capsídeo externo juntamente com um

envoltório transitório. As proteínas do capsídeo externo são sintetizadas nos

polirribossomas do RER. As proteínas glicosiladas VP7 e NSP4 são sintetizadas em

associação com o RE. A VP7 forma o capsídeo externo e a NSP4 possui domínio

citoplasmático que funciona como receptor das DLPs, interagindo diretamente com

VP6 e VP4 e viabilizando o brotamento das DLPs para o interior do RE. Durante o

brotamento, as partículas adquirem um envoltório lipídico transitório que se perde

durante a passagem no RE. Em seguida, ocorre a montagem das partículas com

capsídeo externo, o que resulta na formação de partículas virais maduras com

diâmetro aproximado de 100 nm (Patton & Gallegos, 1990). Finalmente, o ciclo

infeccioso termina quando a progênie viral é liberada da célula hospedeira.

13

Figura 1-4 - Modelo esquemático do ciclo de replicação dos rotavírus. As etapas de replicação estão indicadas nos números abaixo (Adaptada de Arias et al. 2004). 1)

Adsorção do vírus à superfície celular, 2) Penetração e liberação da partícula viral produzindo DLPs (Partículas de duplo capsídeo), 3) Transcrição primária do RNAfd genômico, 4) Síntese das proteínas virais, 5) Síntese primária de fitas negativas de RNA, 6) Montagem da partícula viral, 7) Síntese secundária de fitas negativas de RNA, 8) Montagem das DLPs, 9) Aquisição das proteínas VP7 e VP4 no RE, 10) Perda do envoltório transitório e geração de vírions maduros com triplo capsídeo.

1.1.6 Patogênese

A principal via de transmissão dos rotavírus é a feca-oral. Ainda especula-se

que o contato pessoa a pessoa, contato com secreções respiratórias e o contato

com superfícies contaminadas possam ser fontes de transmissão, já que os altos

índices de diarréia por esses vírus nos três primeiros anos de vida, em todo mundo,

são independentes das condições higiênicas e sanitárias. A transmissão por via

respiratória não implica, porém, a multiplicação do vírus no trato respiratório

(Parashar et al., 1998; Gray et al., 2008).

O período de incubação varia de dois a quatro dias. A sintomatologia clínica

das infecções por rotavírus traduz-se por uma diarréia aguda (mais de 8 evacuações

ao dia) acompanhada de vômito e ocasionalmente febre. Caracteriza-se por ser uma

doença autolimitada, com duração média de 5 dias. A perda de fluidos e eletrólitos

14

devido ao vômito e diarréia pode levar a uma desidratação grave, hospitalização e

morte, especialmente em bebês e crianças subnutridas (Wickelgren, 2000).

Os rotavírus tem tropismo pelas células apicais das vilosidades do intestino

delgado (enterócitos), onde é propagado, provocando descamação dessas células.

O vírus não é replicado nas células das criptas. Aparentemente, a infecção viral

induz a destruição e a descamação dos enterócitose e, em consequencia, acelera a

migração de células secretórias das criptas para as vilosidades, provocando assim

uma perda temporária da capacidade absortiva do intestino, o que leva ao quadro de

diarréia (Widdowson et al., 2005).

Estudos demonstram que a diarréia causada por rotavírus possui

componentes com características malabsortivas e secretórias e pode ter outros

componentes possivelmente relacionados a isquemia das vilosidades e motilidade

intestinal. A malabsoçãao resulta da não-digestão de mono e dissacarídeos,

carboidratos, gorduras e proteínas no cólon, onde estes são osmoticamente ativos,

impedindo a absorção normal de água, sugerindo um quadro de diarréia osmótica

(Estes & Kapikian, 2007; Santos & Soares, 2008). Havendo, em geral, a

necessidade de tratamento que consiste primariamente da reposição de fluido e

eletrólitos tanto pela via oral quanto endovenosa (Pérez-Vargas et al., 2006).

O componente secretório parece ser secundário às alterações funcionais

induzidas pelo vírus no epitélio das vilosidades. Os componentes centrais da

secreção parecem ser a NSP4 e o sistema nervoso entérico (SNE). O papel exato

da NSP4 ainda não está claro; talvez ela apenas amplifique os efeitos das infecções

nos enterócitos. Contudo, a NSP4 pode também atuar nas células das criptas,

induzindo o aumento da concentração de Ca++ intracelular ocasiona o acréscimo de

secreção de íons Cl-, provocando assim uma diarréia de natureza secretória.

(Greenberg et al., 1983; Clark et al., 1987, Santos & Soares, 2008).

1.1.7 Epidemiologia

Estudos estimam que em todo o mundo ocorram anualmente 138 milhões de

casos de gastroenterites por RV-A, principalmente em crianças menores de cinco

anos, com uma média de dois milhões de hospitalizações e mais de 500 mil óbitos

15

(Parashar et al., 2003; WHO, 2007), onde os países em desenvolvimento somam

mais de 80% dos casos fatais (Glass et al, 2005). Nos países industrializados

estima-se o total de 223 mil hospitalizações anuais, decorrentes da infecção pelos

RV. Nos países em desenvolvimento, cerca de 1,9 milhão de hospitalizações/ano

são requeridas devido às diarréias pelo RV (Parashar et al., 2003).

Em um recente relatório dos hospitais sentinelas baseado na vigilância do

rotavírus em 35 países, representando cada uma das seis regiões da OMS, entre

2001 e 2008, uma média de 40% das internações hospitalares por diarréia em

crianças menores de 5 anos foram atribuídas à infecção por RV (Centers for Disease

Control and Prevention, 2008).

Crianças menores de 5 anos de idade com diarréia por Rotavírus necessitam

geralmente permanecer no hospital por causa do curso grave: febre acima de 38 C,

vômitos, diarréia levando à desidratação e distúrbios eletrolíticos e do equilíbrio

acido-alcalino (Korycka, 2004). As infecções em adultos geralmente são subclínicas,

podendo, ocasionalmente, causar doença em pessoas próximas a crianças com

rotavirose, em pacientes imunocomprometidos, idosos e em viajantes (Parashar et

al., 1998).

A distribuição sazonal das gastroenterites por RV-A no Brasil assume duas

configurações bem distintas, em consonância com os padrões registrados no

mundo. Regiões de clima temperado apresentam um padrão de distribuição sazonal

bem marcante e, em regiões tropicais esta sazonalidade não é tão expressiva (Cook

et al., 1990; Pereira et al., 1993; Linhares, 1997). Assim, as regiões Centro-Oeste,

Sudeste e Sul do Brasil, exibem marcante perfil sazonal, observando-se maior

prevalência nos meses com menores índices pluviométricos no ano (maio a

setembro) (Gomes et al., 1991; Teixeira et al., 1991; Stewien et al., 1993). Nos

estados das regiões Norte e Nordeste tal sazonalidade parece não se revelar tão

evidente (Linhares et al., 1983; Stewien et al., 1991, Linhares, 2000).

A vigilância intensiva dos episódios diarréicos a que se procedeu no curso

de recente investigação em Belém, Pará, ofereceu nítidos indicadores quanto à

sazonalidade das infecções por rotavírus, ainda que sem o caráter marcante

assinalado naquelas regiões de clima temperado do país. Com efeito, na região

16

norte, o período de julho a setembro exibe mais expressiva incidência das diarréias

infantis por rotavírus, correspondendo aos meses em que se registra menor

precipitação pluviométrica (Linhares, 2000).

Os RV-A são amplamente reconhecidos como os maiores causadores de

gastroenterite viral em crianças em todo o mundo (Parashar et al., 2006). Para os

seres humanos, os genotipos G (G1, G2, G3, G4, G9) e os P (P[4] e P[8]) são os

mais comumente encontrados em todo o mundo (Santos & Hoshino, 2005). Na Índia,

a associação do genotipo P[6] com G1, G2, G3, G4 ou G9 também é muito comum

(Ramachandran et al., 1996).

A prevalência e a significância das infecções causadas pelos RV não-grupo

A permanecem incógnitas devido à falta de procedimentos de rotina para

diagnóstico. Contudo, os grupos B e C de RV têm sido associados com diarréia

humana em diferentes partes do mundo (Teixeira et al., 1998, Castello et al., 2002;

Mwenda et al., 2003; Schnagl et al., 2004; Phan et al., 2005; Rahman et al., 2005;

Yee et al., 2006). No Brasil, os primeiros relatos de detecção de RV-C são de

Pereira e colaboradores (1983b).

1.1.8 Diagnóstico laboratorial

A confiabilidade dos dados de vigilância epidemiológica de RV-A dependem

do uso de métodos adequados para odiagnóstico laboratorial. Uma rápida definição

etiológica do quadro diarréico poderia orientar uma conduta terapêutica adequada,

pois as manifestações clínicas são semelhantes às de outros enteropatógenos,

como bactérias, minimizando assim o uso desnecessário de antibióticos (Kapikian et

al., 2001).

Os RV-A são excretados em elevadas concentrações durante a fase aguda

da doença, podendo chegar a 1012 partículas por grama de fezes. Por isso, é

necessário que a coleta do espécime clínico ocorra nos primeiros 2 a 4 dias do início

dos sintomas, facilitando sobremaneira sua detecção. O método de escolha mais

utilizado para detecção do antígeno viral é o ensaio imunoenzimático (EIE), que

detecta antígenos virais nas fezes. É disponível comercialmente para o diagnóstico

17

de RV-A, com a utilização de anticorpos policlonais ou monoclonais dirigidos ao

antígeno comum de grupo (VP6) (Flewett et al., 1989).

A aglutinação em látex, outra técnica, importante no diagnóstico dos RV-A,

envolve microesferas sensibilizadas com anticorpos. Este método também detecta

antígenos virais nas fezes, possui sensibilidade comparável à EIE, com resultados

rápidos (cerca de 20 minutos). Os testes de imunocromatografía também estão

sendo utilizados por apresentarem sensibilidades e especificidades satisfatórias

(Flewett et al, 1989).

Além das técnicas citadas anteriormente, a ME e a imunomicroscopia

eletrônica (IME), são utilizadas como método de diagnóstico de RV-A,

principalmente diante de resultados conflitantes de outros procedimentos

laboratoriais (Penaranda et al., 1989).

A partir do advento das técnicas de biologia molecular nos anos de 1980,

estas metodologias vêm sendo cada vez mais empregadas tanto na investigação

científica quanto no diagnóstico laboratorial de diversas doenças infecciosas.

Particularmente, aquelas metodologias que partem da extração do ácido nucléico

genômico para a análise do mesmo, como por exemplo, a sua amplificação (parcial

ou completa) pela técnica da PCR (―Polimerase chain reaction” – reação em cadeia

pela polimerase), técnica descrita por Mullis et al. (1986), e que provocou uma

revolução em diferentes áreas da investigação em biologia e no diagnóstico de

doenças infecciosas.

Duas técnicas moleculares são amplamente utilizadas para a detecção do

genoma viral, como a reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição

reversa (RT-PCR) e a hibridação (―dot-blot‖) a partir de sondas moleculares. A RT-

PCR tem sua aplicação na detecção e genotipagem dos RV-A em amostras fecais.

Esta técnica também representa um método de alta sensibilidade e especificidade.

Através de iniciadores de cadeia consensuais e específicos é feita uma amplificação

enzimática dos genes de VP4 (genótipo P) (Gentsch et al., 1992) e VP7 (genótipo G)

(Das et al., 1994; Gouvea et al., 1994). Uma variação desta técnica, a RT-PCR em

tempo real (qPCR), permite quantificar a carga viral durante um episódio de infecção

e investigar sua relevância quanto aos sintomas clínicos da doença.

18

O seqüenciamento genômico permite a obtenção de informações sobre os

mecanismos pelos quais os RV-A evoluem e se diversificam, além da genotipagem,

determinação de linhagem e variantes. A análise filogenética permite a reconstrução

da história evolutiva dos vírus a partir de árvores filogenéticas representativas,

construídas a partir das informações contidas nas seqüências de nucleotídeos do

genoma, genes completos ou sequencias parciais dos genes. Este método pode ser

empregado para caracterizar amostras onde a genotipagem pela RT-PCR foi

ineficiente (Fischer & Gentsch, 2004).

1.1.9 Prevenção e controle

Os RV-A acometem crianças de todas as classes sociais, demonstrando

que, ao contrário de outros enteropatógenos de transmissão fecal-oral, somente as

melhorias na infra-estrutura sanitária das populações não são suficientes para

controlar a infecção de RV-A . Deste modo, acredita-se que o único recurso de

prevenção possível seja uma vacina eficaz contra os RV-A (Glass et al. 2006).

Devido ao impacto mundial causado pelas infecções por rotavírus em

crianças, várias vacinas foram desenvolvidas ou estão em desenvolvimento. Os

métodos de desenvolvimento de vacinas empreendidos com a utilização de vírus de

origem animal foram denominados Jennerianos (Quadro 1-3), baseados na

estratégia pioneira do cientista inglês Edward Jenner. Outros métodos também vêm

sendo empregados como as estratégias de vacinas construídas de amostras

geneticamente reestruturadas envolvendo segmentos genômicos de origem humana

e animal. Em geral, nesse tipo de vacina, preserva-se o gene associado à proteína

viral VP7 e/ou VP4, de origem humana (Quadro 1-3). Os 10 ou 9 genes adicionais

provem de RV-A bovinos ou símios, garantindo-se o potencial de replicação da

amostra em cultura de células.

O Brasil, devido à importância epidemiológica que os RV-A apresentam, foi o

primeiro país no mundo a introduzir a vacina monovalente RotarixTM no Programa

Nacional de Imunizações (PNI). Esta vacina, implantada no Brasil a partir de março

de 2006, é dirigida à população de menores de seis meses de idade para proteger

19

antecipadamente as crianças da faixa etária de 6 a 24 meses, nas quais se observa

a maior carga de complicações decorrentes da infecção pelo rotavírus.

Quadro 1-3 - Método de desenvolvimento das vacinas e suas características.

Método de desenvolvimento Vacinas: Características:

Estratégia Jenneriana Monovalente RIT 4237 Derivada do isolamento de rotavírus bovino NCDV de

genotipo P[1]G6.

WC3 Isolada de fezes diarréicas de bezerro recém-nascido,

genotipo P[2]G6.

RRV ou MMU18006 De origem símia, foi isolada de fezes de macaco Rhesus

sp com diarréia aguda, pertencente ao sorotipo G3.

Estratégia Jenneriana Modificada RRV-TV

(RotashieldTM

)

Derivada de co-infecção em culturas celulares de

amostras de rotavírus símio (MMU18006, sorotipo G3) e

de rotavírus humano (D, sorotipo G1; DS-1, sorotipo

G2 e ST-3, sorotipo G4).

RotateqTM

Construída a partir do protótipo viral WC3, de

origem bovina. A WC3 é uma preparação pentavalente

reunindo amostras virais com especificidades antigênicas

para G1, G2, G3, G4 e P1A[8]. Utilizada nos EUA

desde 2006.

Vacina de origem Humana RotarixTM

(RIX4414) É uma vacina atenuada para manter a capacidade

imunogênica, porém não patogênica. Foi elaborada com rotavírus isolados de fezes de um bebê de 15

meses em Cincinnati (Ohio, EUA). A vacina é

monovalente, ou seja, a cepa utilizada possui apenas um

sorotipo em sua composição que é o G1[P8] da cepa

RIX4414 (Glass et al., 2004). Atualmente utilizada no PNI

do Brasil.

20

Nos surtos de gastroenterites, a interrupção da transmissão é a principal

estratégia para o controle, especialmente em hospitais e creches. A eliminação de

fontes comuns de infecção, assim como a interrupção da transmissão pelo contato

pessoa a pessoa são medidas efetivas para o controle das infecções (Ansari et al.,

1988).

As mãos podem doar ou receber vírus durante o contato ocasional com

superfícies animadas e inanimadas, e portanto, a descontaminação adequada e

regular das mãos por parte dos profissionais da saúde é essencial para prevenir e

controlar a propagação de vírus e outros tipos de patógenos (Ansari et al., 1988). É

fundamental a atenção na higiene das mãos, que devem ser lavadas com água e

sabão antes e após o contato com o paciente ou com objetos que podem estar

contaminados, assim como a desinfecção de superfícies contaminadas (Wilhelmi et

al, 2003).

1.1.10 Disseminação ambiental de vírus - Contaminação de Superfícies

Muitos microorganismos já foram isolados de diferentes locais do ambiente

hospitalar, porém poucos foram associados à propagação da infecção pelo

ambiente. A limpeza e higiene são importantes para minimizar a contaminação do

ambiente, entretanto não são suficientes, porquanto há relatos de surtos

prolongados e dificuldade com medidas de controle (Creamer & Humphreys, 2008).

Ao contrário de certos tipos de patógenos nosocomiais como bactérias e

fungos, os vírus humanos patogênicos não fazem parte da microbiota normal do

corpo humano. Além de freqüentes causadores de infecções na população, muitos

tipos de vírus são também importantes patógenos nosocomiais, entretanto a

proporção de infecções hospitalares virais é subestimada. Acredita-se que os vírus

sejam responsáveis por mais de 30% dos casos de infecções hospitalares (Sattar,

2004).

Evidências experimentais, bem como estudos epidemiológicos indicam que

superfícies ambientais podem também desempenhar um papel na disseminação

hospitalar de patógenos virais respiratórios e entéricos (Sattar & Springthorpe,

1996). A capacidade de um determinado vírus de se disseminar de hospedeiro para

21

hospedeiro é determinada por, entre outras coisas, sua capacidade de permanecer

viável durante o trânsito para o hospedeiro susceptível. A disseminação dos vírus

geralmente começa antes do aparecimento dos sintomas clínicos e permanece

durante vários dias após a recuperação. A quantidade real de eliminação do vírus

varia consideravelmente dependendo do tipo de agente infectante e do estágio da

infecção (Sattar, 2004).

Muitos tipos de vírus podem permanecer viáveis por várias horas nas mãos

e, geralmente, muito mais tempo em superfícies ambientais (Sattar & Springthorpe ,

1996). Partículas de vírus infecciosos têm sido isoladas de mãos naturalmente

contaminadas dos profissionais da saúde e de fômites (Piednoir et al., 2002;

Gallimore et al., 2006).

A estabilidade das partículas virais no ambiente em geral é inversamente

proporcional à temperatura do ar. A umidade relativa do ar também tem um efeito

pronunciado sobre a sobrevivência do vírus e seu efeito é modulado pela

temperatura do ar: vírus envelopados geralmente sobrevivem melhor em condições

mais secas e de baixa umidade relativa que vírus não envelopados (Sattar &

Springthorpe, 1996; Ansari et al., 1988).

Além da contaminação direta, superfícies animadas e inanimadas podem ser

contaminadas indiretamente através da transferência de vírus por outros veículos

(Figura 1-5). Destes, a deposição por decantação de aerossóis ou contato com

fluidos contaminados por vírus são óbvias. Menos óbvias são as transferências, que

podem ocorrer entre os diferentes tipos de superfícies.

22

Figura 1-5 - Veículo de disseminação direta e indireta de infecção viral nosocomial (Sattar, 2004).

Os RV freqüentemente causam surtos em hospitais, creches, escolas e lares

de idosos. Esses vírus são eliminados em altas concentrações pelas fezes, que

variam de 105 a 1011 partículas virais por grama de amostra fecal (Farthing, 1989).

Devido a estabilidade do rotavirus no ambiente, sua ubiquidade e sua dose mínima

infecciosa (1 a 10 partículas), esses vírus têm sua transmissão facilitada, podendo

permanecer durante vários meses em superfícies, resistindo às intempéries durante

longo tempo (Payne et al., 2008).

Partículas infecciosas de RV foram recuperadas de mãos e de várias

superfícies e fômites. O contato ocasional pode levar à transferência desses vírus de

superfícies contaminadas para superfícies limpas. Assim, superfícies animadas e

inanimadas podem desempenhar um papel complementar na propagação desses

vírus (Sattar et al, 1994).

Dispositivos

médicos

Ar

Mãos

Água Alimento

Insetos

Fonte de vírus

Hospedeiro susceptível

Superfície/

fômites

23

1.1.11 Infecção Hospitalar (IH)

Infecção hospitalar é a infecção adquirida durante a hospitalização, que não

estava presente ou em período de incubação na ocasião da admissão do paciente.

São diagnosticadas, em geral, a partir de 72 horas após a internação, respeitando o

período de incubação das doenças. Atualmente, tem sido sugerida a mudança do

termo IH por Infecção relacionada à assistência de saúde (IrAS), que reflete melhor

o risco de aquisição dessas infecções (ANVISA, 2004).

Apesar de muitos esforços, o Brasil ainda enfrenta uma realidade adversa

daquilo que se pode julgar satisfatório para evitar a infecção hospitalar: carência de

recursos humanos e materiais nas instituições de saúde (principalmente nas

públicas); ausência de comissões de controle de infecções hospitalares (CCIHs)

atuantes em grande parte dos hospitais; ou ainda, profissionais exercendo a função

sem conhecimento adequado da atividade. Estes fatores resultam em elevadas

taxas de IH, ocorrência de surtos não detectados em berçários e unidades de terapia

intensiva, emergência de bactérias resistentes a diversos antibióticos e elevado risco

ocupacional (ANVISA, 2004).

O Programa de Controle de Infecção Hospitalar começou a ser

regulamentado em 1983, com a Portaria MS nº 196/83. Atualmente, está em vigor a

Portaria nº 2616, de 12 de maio de 1998. Em 1997, foi publicada, no Diário Oficial da

União, a Lei nº 9.431/97, que em seu artigo 1º fala da obrigatoriedade dos hospitais

manterem um Programa de Infecções Hospitalares (PCIH) e no artigo 2º preconiza a

criação de Comissão de Controle de Infecções Hospitalares (CCIH) para execução

deste controle (ANVISA, 2004).

2 JUSTIFICATIVA

Relatórios sobre a investigação de contaminação microbiológica em

ambientes hospitalares têm sido focados principalmente no controle de surtos de

Staphylococcus aureus meticilina-resistentes (MRSA), enterococos resistente à

vancomicina (VRE), Acinetobacter spp., Clostridium difficile e Pseudomonas spp.

http://e-legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=482

http://e-legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=587

24

(Ayliffe et al., 2000; AWMF, 2005; Creamer & Humphreys, 2008), de modo que a

verdadeira proporção de infecções hospitalares devido a vírus permanece

desconhecida. A carência de recursos destinados à vigilância adequada e ao

diagnóstico laboratorial diferencial de infecções adquiridas em hospitais é uma

realidade mesmo em hospitais de países desenvolvidos (Sattar et al, 1994).

As conseqüências de surtos nosocomiais podem afetar pacientes

individualmente, departamentos médicos e até diferentes enfermarias. Medidas de

prevenção, como o fechamento de alas hospitalares, são eficientes, apesar de

gerarem um elevado custo e causarem inúmeros transtornos. A fim de se evitar

despesas desnecessárias durante um surto, é preciso estabelecer medidas de

controle que sejam recomendadas e baseadas em evidências, como a identificação

do agente etiológico (Hansen et al., 2007).

Recentemente, Gallimore e colaboradores (2006) determinaram que a

ocorrência de um surto de gastroenterite nosocomial em uma unidade de tratamento

intensiva pediátrica foi causada pela contaminação de superfícies e equipamentos

por RV-A, norovirus (NV) e astrovírus (HAstV), sugerindo estes agentes como

potenciais marcadores de infecção hospitalar.

A estabilidade dos vírus gastroentéricos no ambiente, em particular dos RV-

A, sugere sua utilização como marcador biológico de contaminação de superfícies

hospitalares. Desta forma, o estabelecimento de metodologias que permitam

recuperar e quantificar estes vírus em superfícies é fundamental para evidenciar sua

disseminação no ambiente. Este tipo de ferramenta poderá contribuir de modo mais

eficiente na avaliação da qualidade microbiológica de ambientes hospitalares, na

elucidação de surtos nosocomiais e, principalmente, na tomada de medidas eficazes

de prevenção, manejo de pacientes e melhoria do aspecto humano das

hospitalizações.

25

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Estabelecer protocolo de detecção de rotavírus grupo A em superfícies de

fômites, a fim de avaliar o papel desses vírus como marcador biológico de

contaminação de superfícies hospitalares.

3.2 Objetivos Específicos

Avaliar protocolos de detecção de RV-A a partir de esfregaços de

swabs em superfícies pela realização de um estudo piloto em laboratórios de

pesquisa

Detectar e quantificar RV-A em superfícies de fômites hospitalares por

métodos qualitativos (RT-PCR e nested-RT-PCR) e quantitativo (qRT-PCR)

de amplificação genomica.

Caracterizar molecularmente os vírus obtidos pelo seqüenciamento

direto dos amplicons para a confirmação dos resultados obtidos pela nested-

RT-PCR.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Estudo Piloto

Inicialmente, um estudo piloto foi realizado para avaliação de protocolo de

recuperação de RV-A obtidos a partir de esfregaços de swabs em superfícies

associado a método molecular de detecção.

Este projeto foi realizado em duas etapas. Na primeira, foram realizadas

coletas em 26 amostras superfícies/fômites de dois laboratórios: bancada (2), alça

da maleta de transporte (1), botão do elevador (1), caixa de equipamento de

proteção individual (EPI) (1), caixa de primeiros socorros (1), descarga do banheiro

(1) maçaneta (7) punho do jaleco (1), puxador da gaveta de EPI (3), puxador da

26

geladeira da copa (1), teclado do computador (2), telefone do escritório (1) e

torneira da pia (4).

As amostras foram obtidas pela frição de swab umedecido em PBS pH 7,2,

conforme descrito por Gallimore e colaboradores (2005), e armazenadas em tubos

para cultura de células (Corning) sem adição de qualquer eluente (Figura 4-1). O

transporte das amostras foi realizado em maleta térmica com gelo e a extração do

RNA viral no mesmo dia da amostragem.

Figura 4-1 - Coleta de amostras de superfície pelo uso de swabs umedecidos em PBS pH7,2.

O método de sílica/isotiocianato de guanidina descrito por Boom et al. (1990)

foi utilizado para extração do RNA. Para a realização deste estudo, o swab foi

transferido para um tubo Eppendorf® (1,5mL) contendo 1,0mL de tampão L6 e

mantido neste por 1 hora (Gallimore et al., 2005).

Na segunda etapa, 10 novos esfregaços de superfícies foram obtidos pela

frição de swab umedecidos em meio de cultura DMEM enriquecido, pH 7,2. Para

esta etapa os swabs foram armazenados em tubos de cultura de células (Corning)

contendo 1mL de meio DMEM acrescido de antibiótico. Esta metodologia de

recuperação/extração foi modificada possibilitando a utilização da amostra em outras

metodologias, como por exemplo, o isolamento viral em cultura de células, uma vez

que a introdução do swab diretamente no meio de extração inviabiliza a utilização

destas amostras. Deste modo, para determinação do volume a ser utilizado no

método de extração sílica/isotiocianato de guanidina foram realizados testes com as

27

seguintes variações: a) 400µl do meio DMEM eluato e b) 50µl do meio DMEM+swab.

O volume b inclui o swab mais 50µL, pois, quando somados os 50µL ao volume

absorvido pelo swab, obteve-se um volume final de 400µL, podendo assim comparar

a recuperação viral entre os dois volumes.

Após definição do volume a ser utilizado no método de extração viral foi

estabelecido o protocolo para realização do monitoramento mensal de superfícies e

fômites hospitalares, cujo projeto foi aprovado pelo comitê de ética do hospital da

rede particular sob o número 275.

4.2 Período e Área de estudo

No período de janeiro a junho de 2009 foram realizadas coletas mensais de

amostras de superfície e fômites de um Centro de Tratamento Intensivo (CTI) adulto

de um hospital da rede particular situado na cidade do Rio de Janeiro. Foram obtidas

amostras de 12 superfícies de todos os sete leitos (ocupados ou não) deste CTI,

totalizando 42 amostras por fômite, 72 amostras por leito, 84 amostras mensais e

504 amostras no final dos seis meses de estudo. A determinação dos fômites foi

realizada de acordo com o risco de contaminação, ou seja, foram selecionados os

locais onde o contato com as mãos mostrou-se mais evidente. Deste modo em cada

leito realizou-se a amostragem dos seguintes fômites/superfíces (Figura 4-2):

suporte para álcool gel (SA), botão de descarga (BD), cadeira do acompanhante

(CA), suporte de clorexidina (SC), tampa da lixeira de resíduos comuns (TL),

maçaneta interna da porta do leito (MIL), controle da cama (CC), maçaneta externa

do banheiro (MEB), teclado da bomba de infusão (TBI), controle remoto (CR), mesa

de apoio (MA) e telefone (TE).

Após os dois primeiros meses do estudo hospitalar, foi realizada uma

reunião técnica com os responsáveis pelo CTI do hospital, afim de que estes

ficassem cientes dos resultados obtidos.

O procedimento de coleta e armazeamento das amostras seguiram o

protocolo descrito para o estudo piloto (etapa II, volume b). Em todas as coletas a

extração do RNA viral foi realizada no mesmo dia de obtenção das amostras.

28

Figura 4-2 : Representação dos pontos de coleta. A) botão de descarga, B) controle

remoto da TV, C) telefone, D) cadeira do acompanhante, E) suporte para álcool gel e

clorexidina, F) maçaneta interna da porta do leito e maçaneta externa do banheiro,

G) tampa da lixeira de resíduos comuns, H) controle da cama, I) teclado da bomba

de infusão, J) mesa de apoio.

4.3 Extração dos ácidos nucleicos pelo método de sílica (Boom et al., 1990)

A extração do ácido nucléico viral foi feita segundo a descrição de Boom et

al.(1990) , incluindo modificações.

Em tubos plásticos tipo Eppendorf® de 1,5mL contendo 1,0 mL de tampão

L6, foram adicionados: a) swab, b) swab + 50μL de eluato ou c) 400ul de eluato.

Depois de homogeneizadas em vortex as amostras foram mantidas 60 minutos à

temperatura ambiente. Em seguida o swab foi retirado e foram adicionados 20μL de

sílica. Os tubos foram homogeneizados e submetidos à agitação constante em

agitador orbital por 20 minutos. Posteriormente, foram centrifugados a 14.000 x g

durante 60 segundos, descartando-se o sobrenadante em solução de NaOH 10N.

Em cada tubo foi adicionado 1,0mL de tampão L2 para ressuspender o sedimento

formado. Após nova precipitação por centrifugação a 14.000 x g durante 60

segundos, o sobrenadante foi desprezado em solução de NaOH 10N. Foram

realizadas mais duas etapas de lavagens. A primeira, adicionando-se 1,0 mL de

29

etanol 70% gelado e a segunda com 1,0 mL de acetona P.A. (Merck®) gelada,

utilizando o mesmo procedimento de homogeneização e precipitação utilizado para

o tampão L2, desprezando o sobrenadante em solução de hipoclorito de sódio a 5%.

Após a última lavagem, os tubos foram incubados a 56ºC por 15 minutos em

banho-maria com as tampas do aparelho e dos tubos Eppendorf® abertas para

permitir a completa evaporação da acetona. Após esse período, foram adicionados

50μL de água livre de endo e exonucleases (Invitrogen®) em cada tubo. Os tubos

foram novamente homogeneizados em vórtex por 10 segundos, incubados a 56ºC

por 15 minutos com as tampas do aparelho e tubos Eppendorf® fechadas. Após a

centrifugação a 14.000 x g durante 3 minutos, 40μL do sobrenadante contendo

ácidos nucléicos foram coletados cuidadosamente e transferidos para outro tubo.

Em seguida este material foi encaminhado para a etapa 4.4.

4.4 Reação de transcrição reversa (RT) para a obtenção de DNA

complementar (cDNA)

Cada amostra extraída foi submetida à transcrição reversa (RT) do RNA

para um DNA complementar (cDNA), utilizando-se o iniciador randômico pd(N)6®

(Amersham Biosciences, USA) como previamente descrito por Ferreira et al. (2008).

A reação de transcrição foi feita utilizando a mistura de reagentes descrita no

Quadro 4-1.

30

Quadro 4-1 – Mistura de reagentes (Mix) utilizados na reação de transcrição reversa do RNA viral.

Em tubo plástico tipo Eppendorf® de 200μL foram adicionados 2μL de

dimetil sulfóxido (DMSO) e 10μL do RNA extraído. Após a incubação a 97ºC por 7

minutos para desnaturação e rompimento de estruturas secundárias do RNAfd, o

tubo foi mantido em banho de gelo por 2 minutos. A seguir, foram adicionados 38μL

da mistura de reagentes (Quadro 4-1), totalizando um volume final de reação de

50μL. O tubo foi incubado em termociclador programado com o seguinte ciclo de

temperaturas de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen®, CA, EUA):

42oC por 1 hora e 95oC por 10 minutos. O produto (cDNA) foi estocado a -20oC até o

momento da realização das reações de amplificação genômica (PCR).

4.5 Reação em cadeia pela polimerase (PCR)

O quadro 4-2 apresenta a seqüência dos iniciadores de cadeia utilizados

para detectar RV-A pelas técnicas de PCR utilizadas neste estudo. Os iniciadores de

cadeia foram sintetizados pela Invitrogen® (CA, EUA).

Reagente Concentração Volume/Reação

H2O livre de DNAase / RNAase (GIBCOBRL®) 23,5µL

Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®) 10X 5µL

dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Invitrogen®) 2,5mM 4µL

MgCl2 (Invitrogen®) 50mM 2,5µL

RT Superscript IITM (Invitrogen®) 200U/µL 1µL

pd(N)6® (Amersham Biosciences®) 50nM 2µL

31

Quadro 4-2: Seqüência de iniciadores de cadeia utilizados nas PCRs para detecção, quantificação e caracterização de Rotavirus-A.

Código IUB:w= a/t; r = a/g; v = g/ a/ c; n = a/ c/ g/ t.

4.6 PCR para amplificação parcial do gene que codifica para a proteína VP6

de RV-A

Para a amplificação parcial do gene que codifica para a proteína VP6 (nt 747

– 1126) dos RV-A, foi utilizada a técnica descrita por Iturriza-Gómara e

colaboradores (2002), seguida pela Nested-RT-PCR, onde o protocolo de Gallimore

e colaboradores (2006) foi utilizado, obtendo-se, um produto final de 155pb.

A PCR foi realizada utilizando a mistura de reagentes descrita no Quadro 4-

3 e os iniciadores descritos no Quadro 4-2.

Reação: Iniciador: Região: Sequencia: Amplicon:

RT

-PC

R

VP6 - F (+)

VP6 - R (-)

747 – 766

1126 – 1106

gac ggv gcr act aca tgg t

gtc caa ttc atn cct ggt tgg 379pb

Neste

d-

RT

-PC

R

VP6 – NF

VP6 – NR

gcw aga aattt gat aca

gat tca caa act gca ga

155pb

qP

CR

NSP3 – F

NSP3 - R

TaqMan probe

963 -988

1028 -1049

995 – 1017

acc atc twc acr tra ccc tct atg ag

ggt cac ata acg ccc cta tag c

FAM_agt taa aag cta aca ctg tca aa_NONE

86pb

32

Quadro 4-3 – Reagentes utilizados (Mix) na RT-PCR para amplificação parcial do gene que codifica para a proteína VP6 de rotavirus A.

Reagentes Concentração Volume

H2O livre de DNAase/RNAase (GIBCO-

BRL®)

- 30,25µL

Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®) 10X 5,0 µL

dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (

Invitrogen®)

2,5mM/cada 4,0 µL

MgCl2 (Invitrogen®) 50mM 2,5 µL

Taq DNA polimerase Platinum II (Invitrogen®) 5U/µL 0,25µL

Conjunto de iniciadores de cadeia (VP6 – F

+ VP6 – R)

20µM (cada) 2,0 µL

Total - 44 µL

Para cada reação de PCR, foram adicionados 44μL da mistura dos

reagentes (Quadro 4-3) e 6,0μL de cDNA da amostra em tubo plástico tipo

Eppendorf® de 200μL. O tubo foi colocado em um termociclador programado com o

seguinte ciclo de temperaturas: etapa de desnaturação inicial a 94°C por 2 minutos,

seguida de 40 ciclos de amplificação a 94ºC por 30 segundos para a desnaturação,

58ºC por 30 segundos para o anelamento dos iniciadores e 72ºC por 1 minuto para a

fase de extensão das fitas de DNA. Após os 40 ciclos, a última etapa foi a de

alongamento final da fita de DNA, a 72ºC por 10 minutos. As amostras foram

mantidas a 10ºC e, posteriormente, entre 2 e 8ºC até o momento da análise.

A Nested-RT-PCR foi realizada utilizando a mistura de reagentes descrita no

Quadro 4-4 e os iniciadores descritos no Quadro 4-2.

33

Quadro 4-4: Reagentes utilizados (Mix) na nested-RT-PCR para a amplificação parcial do gene que codifica para a proteína VP6 de rotavirus A.

Reagentes Concentração Volume

H2O livre de DNAase/RNAase (GIBCO-

BRL®)

- 35,8µL

Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®) 10X 5,0 µL

dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (

Invitrogen®)

2,5mM/cada 4,0 µL

MgCl2 (Invitrogen®) 50mM 2,0 µL

Taq DNA polimerase Platinum II (Invitrogen®) 5U/µL 0,2µL

Conjunto de iniciadores de cadeia (VP6 –NF

+ VP6 – NR)

20µM (cada) 2,0 µL

Total - 49 µL

Para cada reação de Nested-RT-PCR, foram adicionados 49μL da mistura

dos reagentes (Quadro 4-4) e 1,0μL do produto da PCR em tubo plástico tipo

Eppendorf® de 200μL. O tubo foi colocado em um termociclador programado com o

seguinte ciclo de temperaturas: etapa de desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos,

seguida de 35 ciclos de amplificação a 94ºC por 30 segundos para a desnaturação,

42ºC por 30 segundos para o anelamento dos iniciadores e 72ºC por 30 segundos

para a fase de extensão das fitas de DNA. Após os 35 ciclos, a última etapa foi a de

alongamento final da fita de DNA, a 72ºC por 5 minutos. As amostras foram

mantidas a 10ºC e, posteriormente, entre 2 e 8ºC até o momento da análise.

4.7 Análise dos amplicons por eletroforese em gel de agarose a 1,5%

Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese (100 volts por 1

hora) em gel de agarose (GIBCO-BRL®, CA, EUA) a 1,5% em tampão TBE 1X

34

(GIBCO-BRL®). Dois microlitros do corante azul de bromofenol 10X (0,3% azul de

bromofenol, 65% sacarose, 10mM EDTA, 10mM Tris-HCl pH 7,5 - Invitrogen® CA,

EUA) foram adicionados a 10μL do produto da PCR (amplicon), seguido de

eletroforese.

Para identificar os amplicons foi utilizado um marcador de tamanho

molecular de 100 pb (GIBCO-BRL®). Após a impregnação de 20 minutos com

brometo de etídeo (0,5μg/mL), os amplicons foram visualizados em transiluminador

de luz ultravioleta (Labnet®, NJ, USA). As imagens foram registradas em sistema de

captura de imagem (BioImaging Systems®) utilizando o programa Labworks 4.0.

Foram consideradas amostras positivas aquelas que apresentaram

amplicons com os seguintes números de pares de bases: 379 na RT-PCR ou 155 na

nested-RT-PCR, ambas para VP6. Controles positivos (1) e negativos (3) foram

introduzidos durante todos os procedimentos. Todos os cuidados e precauções para

o trabalho com metodologia de amplificação genômica foram estritamente seguidos,

sendo cada etapa realizada em áreas distintas.

4.8 Amplificação genômica quantitativa em tempo real (qPCR)

As amostras positivas pela nested-RT-PCR foram submetidas ao PCR

quantitativo em tempo real (qPCR), com a finalidade de comparar o resultado àquele

obtido pelo PCR qualitativo, além da quantificação de RV-A. Para isto, foi utilizado o

protocolo de qPCR descrito por Zeng et al. (2008), no qual são utilizados iniciadores

de cadeia (quadro 4-2) para a amplificação parcial do segmento que codifica a

proteína não estrutural NSP3.

Os cálculos utilizados para a obtenção do número de cópias genômicas por

mililitro (cg/mL) foram feitos utilizando a seguinte fórmula:

(X.Z/Y) . (K/W) . (1000/V)

Onde,

X = número de cópias por reação;

35

Y = volume de cDNA utilizado;

Z = volume total de cDNA obtido na extração;

W = volume de RNA utilizado na RT;

V = Volume de eluente utilizado na extração;

K = Volume total de RNA.

4.9 Purificação e sequenciamento dos amplicons obtidos pela nested-RT-

PCR do gene que codifica para a proteína VP6 de RV-A.

Os amplicons obtidos pela nested-RT-PCR foram purificados utilizando o kit

comercial QIAquick Gel Extraction kit (QIAGENTM, Valencia, CA, EUA), para a

purificação do produto diretamente do gel de agarose. Após a purificação, o DNA foi

quantificado em gel de agarose a 1,5% utilizando o marcador de tamanho e massa

molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen™, Califórnia, EUA) ou em

espectrofotômetro NanoDrop™ (Thermo Scientific, USA).

O seqüenciamento foi realizado pela Plataforma de Seqüenciamento de

DNA PDTIS/Fiocruz (Otto et al. 2008). Segundo orientação da plataforma de

seqüenciamento, 6,5µL de DNA purificado e 3,2 pmoles (1,6 µL) de iniciadores

utilizados na PCR foram adicionados em tubo tipo Eppendorf® de 1,5mL. A reação

foi realizada utilizando o Kit Big Dye Terminator® v 3.1 Cycle Sequencing Kit‖

(Applied Biosystems®, CA, USA), conforme recomendado pelo fabricante. Os

produtos da reação de seqüência foram purificados com as colunas CENTRI-SEP®

(Princeton Separations®, CA, USA) conforme orientação do fabricante. A

quantificação do DNA amplificado foi determinada em espectrofotômetro

NanoDrop™ (Thermo Scientific, USA).

4.10 Análise dos cromatogramas das amostras

Os cromatogramas das seqüências enviadas pela ―Plataforma de

Seqüenciamento de DNA PDTIS/FIOCRUZ‖, foram analisados com o programa

Bioedit. As seqüências nucleotídicas foram alinhadas utilizando o programa

36

CLUSTAL W. As seqüências protótipos representantes dos diferentes genótipos de

RVA de origem humana e animal, descritas em diferentes países, foram resgatadas

no site do NCBI (National Center for Biotechnology Information -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov) através dos seus números de acesso ou mediante a

utilização da ferramenta BLAST (Basic Local Aligment Search Tool), disponível no

Genbank database. Os números de acesso das diferentes seqüências dos protótipos

utilizados nas análises filogenéticas encontram-se descritos no Quadro 4-5.

As relações filogenéticas entre as diferentes seqüências foram determinadas

mediante a utilização do programa MEGA v. 4.0 software package (Tamura et al.,

2007) através do método de reconstrução filogenética Neighbor-joining. As

distâncias genéticas entre as diferentes amostras foram calculadas mediante o

modelo Kimura dois-parametros como modelo de substituição nucleotídica. A

significância estatística das diferentes filogenias obtidas foi estimada através de

2.000 réplicas de bootstrap.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

37

Quadro 4-5 – Identificação, espécie de origem, número de acesso das seqüências, classificação binária e genótipo do gene VP6 de rotavirus A, representantes de diferentes genótipos humanos e animais, resgatadas do ―Entrez Pubmed – GenBank‖.

Nome (origem) N° de acesso GenBank Classificação

binária Genótipo I

B3458 (human) DQ870504 G9P[8] I1

B4633-03 (human) DQ146642 G12P[8] I1

D (human) EF583024 G1P[8] I1

Dhaka12-03 (human) DQ146664 G12P[6] I1



IAL28 (human) EF583032 G5P[8] I1

KU (human) AB022768 G1P1A[8] I1

Matlab13-03 (human) DQ146675 G12P[6] I1

P (human) EF583040 G3P[8] I1

ST3 (human) EF583048 G4P2A[6] I1

Wa (human) K02086 G1P1A[8] I1

WI61 (human) EF583052 G9P1A[8] I1

B4106 (human) AY740737 G3P11[14] I2

DRC88 (human) DQ005110 G8P[8] I2

DS-1 (human) DQ870507 G2P1B[4] I2

L26 (human) DQ146695 G12P1B[4] I2

N26-02 (human) DQ146686 G12P[6] I2

RV161-00 (human) DQ490549 G12P[6] I2

RV176-00 (human) DQ490555 G12P[6] I2

TB-Chen (human) AY787645 G2P[4] I2

AU-1 (human) DQ490538 G3P[9] I3

T152 (human) DQ146702 G12P[9] I3

PO-13 (avian) D16329 G18P[17] I4

A131 (porcine) AF317124 G3P[7] I5

RMC321 (human) AF531913 G9P[19] I5

38

4.11 Análise Estatística

Para avaliar a correlação entre a detecção viral pela RT-PCR e a nested-RT-

PCR foi realizado o teste qui-quadrado (2), cuja hipótese foi: as duas metodologias

apresentam a mesma sensibilidade. O mesmo teste foi utilizado para comparar a

positividade em dois períodos, antes da reunião técnica (janeiro e fevereiro) e após a

reunião técnica (março, abril, maio, junho).

4.12 Soluções

4.12.1 Sílica (pH = 2,0)

Dióxido de silício (SIGMA®) _____________ 60g

Água destilada q.s.p. ___________________500mL

Para o preparo da solução, foram adicionadas água (q.s.p. 500mL) e 60g de

dióxido de silício em uma proveta de 500mL. A solução foi homogeneizada vertendo-

se a proveta e posteriormente sedimentada, deixando-a parada por 24 horas.

Decorrido o tempo necessário, foram desprezados 430mL do sobrenadante e o

volume foi completado para 500mL com água destilada. Após nova sedimentação

por 5 horas, foram desprezados 440mL do sobrenadante. O pH foi ajustado

adicionando-se 600µL de HCl 37% (Merck®). A solução foi acondicionada em

alíquotas de 10mL em frascos de cor âmbar, autoclavada a 121°C por 20 minutos e

estocada à temperatura ambiente (entre 22°e 25°C).

4.12.2 EDTA 0,2M, pH=8,0

EDTA-ácido etilenodiamino tetracético-(SIGMA®)___________37,22mg

Água destilada q.s.p._________________________________ 500mL

39

Em um becker de 1000mL foram adicionados EDTA e 300mL de água

destilada, que foram homogeneizados com agitador magnético e tiveram o pH

ajustado com NaOH. A solução foi transferida para um balão volumétrico de 500mL

e o volume final ajustado. Em seguida, a solução foi transferida para um frasco com

tampa e conservada à temperatura ambiente.

4.12.3 Tampão TRIS-HCl 0,1M pH 6,4

Hidroximetil-tris-aminometano (SIGMA®)____________________12,114g

Água destilada q.s.p.____________________________________1000mL

Em um becker de 1000mL foram adicionados os reagentes,

homogeneizados com agitador magnético, ajustado o pH (6,4) com HCl PA (Merck®)

ea solução foi transferida para balão volumétrico de 1000mL. O volume final foi

completado e a solução foi transferida para um frasco com vedação e conservada

entre 2 e 8ºC.

4.12.4 Tampão L6

Isotiocianato de guanidina (Invitrogen®)_______________________120g

Triton X-100 (SIGMA®)____________________________________2,6g

EDTA 0,2M pH 8,0 (SIGMA®)_______________________________22mL

Tris-HCl 0,1M pH 6,4 (SIGMA®) q.s.p_________________________100mL

Em um becker de 250mL foram adicionados os reagentes e

homogeneizados com agitador magnético até completa dissolução. A solução foi

transferida para um balão volumétrico e o volume final ajustado para 100mL com

40

Tris-HCl e transferido para frasco âmbar, que foi conservado à temperatura

ambiente.

4.12.5 Tampão L2

Isotiocianato de guanidina (Invitrogen®)______________________ 120g

Tris-HCl 0,1M pH 6,4 (SIGMA®) q.s.p._______________________ 100mL

Os reagentes foram homogeneizados com agitador magnético em um

becker de 250mL. O conteúdo foi transferido para um balão volumétrico de 100mL e

o volume final completado. A solução foi transferida para um frasco âmbar e

conservada à temperatura ambiente.

4.12.6 Tampão Tris-Boro-EDTA 10X pH 8,4 (TBE)

Tris-base (Invitrogen®)_________________________________108g

Ácido bórico (Reagen®)________________________________55g

EDTA 0,5M pH 8, 8 (Sigma®)____________________________40mL

Água Milli-Q q.s.p._____________________________________1000mL

Em um becker de 2000mL foram adicionados os reagentes e

homogeneizados com agitador magnético. O conteúdo foi transferido para um balão

volumétrico de 1000mL, completado o volume final e transferido para um frasco com

vedação. A solução final foi conservada entre 2 e 8ºC.

41

4.12.7 Gel de agarose a 1,5%

Agarose (Gibco-BRL®)_________________________________ 1,20 g

Tampão TBE 0,5X (Gibco-BRL®)_____________________________ 80,00 mL

Depois de adicionados 80mL de tampão TBE à agarose em um erlenmeyer,

este foi levado ao forno de microondas (em potência alta) até que a agarose fosse

dissolvida. Deixando resfriar até +/- 50°C, a agarose foi colocada na cuba de

eletroforese, tendo sido evitada a formação de bolhas.

4.12.8 Solução de brometo de etídio 0,5µg/mL

Brometo de etídio 10mg/mL (Invitrogen®)____________________15µL

Água destilada_________________________________________300mL

O brometo de etídio foi dissolvido em água em recipiente plástico com

tampa, homogeneizado suavemente em agitador magnético e conservado sob

proteção da luz à temperatura ambiente.

4.12.9 Etanol a 70%

Etanol P.A. (Merck®)_____________________________________70mL

Água destilada__________________________________________30mL

Em uma proveta de 100mL foram adicionados 70mL de etanol e o volume

final completado com a água destilada para 100mL. O conteúdo foi homogeneizado

por inversão, transferido para frasco com vedação e conservado entre 2 e 8ºC.

42

4.12.10 Meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium) pH 7,2

DMEM com alta concentração de glicose (Gibco BRL)_________13,4g

Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)___________________________ 3,7g

Água destilada (q.s.p.)__________________________________1000mL

Em um becker contendo 950mL de água destilada, foram adicionados o

meio DMEM e o NaHCO3 . Estes foram homogeneizados até total dissolução. A

solução teve o pH ajustado, foi filtrada por pressão positiva e armazenada entre

entre 2 e 8ºC.

Os seguintes itens foram adicionados a 500mL de DMEM:

NaHCO3 7,5% - 5mL

L-Glutamina 2% - 7,5mL

Garamicina 50mg/mL - 0,5mL

Fungizona 0,5mg/mL - 2,5mL

Triptose Fosfato 29,5g/L - 5mL

5 RESULTADOS

5.1 Estudo Piloto

A tabela 5-1 apresenta os resultados obtidos na primeira etapa do estudo

piloto em que foi realizada a amostragem de diferentes superfícies de laboratórios

de pesquisa. Das 26 amostras testadas, quatro foram positivas pela RT-PCR. A

utilização de uma segunda etapa de amplificação utilizando iniciadores internos

(nested-PCR) elevou para 10 (38,5%) o número de amostras positivas para RV-A.

43

Tabela 5-1- Detecção de rotavirus-A (RV-A) pela amplificação do gene que codifica para a proteína VP6 (nested RT-PCR) em amostras de superfícies/fômites de dois laboratórios.

FÔMITES Amostras positivas / amostras

coletadas (%)

Bancada 0 /2

Alça maleta de transporte 1 /1

Botão do elevador 1 /1

Caixa de equipamento de proteção individual (EPI) 0 /1

Caixa primeiros socorros 1 /1

Descarga banheiro 0 /1

Maçaneta 2 /7

Punho jaleco 1 /1

Puxador gaveta EPI 2 /3

Puxador geladeira copa 0 /1

Teclado computador 1 /2

Telefone escritório 0 /1

Torneira da pia 1 /4

TOTAL: 10/26 (38,5%)

44

A tabela 5-2 apresenta os resultados obtidos na segunda etapa do estudo

piloto, com a modificação do método de extração a partir da eluição de swab em

meio de cultura. O critério de seleção do protocolo a ser utilizado nas amostras

hospitalares foi o aumento no número de amostras positivas e a maior intensidade

dos amplicons observados em gel de agarose 1,5%. Deste modo, determinou-se

que a extração de RNA viral a partir do swab seria mantida. É importante salientar

que o eluato também apresentou positividade, podendo assim ser utilizado no

isolamento viral em cultura celular.

Tabela 5-2: Avaliação do protocolo de extração de RNA por sílica/isotiocianato de guanidina a partir de swab ou eluato de swab.

N° da amostra Swab + 50µL 400 µL

1 (++) (++)

2 (+++) (+)

3 (++) (+)

4 (+++) (++)

5 (+++) (-)

6 (+++) (++)

7 (+++) (-)

8 (-) (-)

9 (-) (-)

10 (-) (-)

(-) negativo, (+) positivo – baixa intensidade, (++) positivo - media intensidade, (+++) positivo -

alta intensidade.

5.2 Detecção de RV-A pela RT-PCR e nested-RT-PCR em amostras de

superfície hospitalar.

Das 504 amostras analisadas, 25/504 (5%) foram positivas para RV-A pela

RT-PCR. A realização de uma segunda etapa utilizando iniciadores internos

(Nested-PCR) elevou para 73/504 (14,5%) o número de amostras positivas. A menor

positividade obtida pela RT-PCR foi estatisticamente significativa quando comparada

com a nested-RT-PCR (p < 0.001).

45

A Figura 5-1 apresenta a distribuição mensal do percentual de amostras

positivas para RV-A registrando uma diminuição estatisticamente significativa (p <

0.001) do número de fômites contaminados a partir de março. Em pelo menos dois

swabs por mês foram detectados RV-A.

Figura 5-1: Distribuição mensal do número de positividade de Rotavirus A (RV-A) detectados por nested-RT-PCR em amostras de superfícies de fômites hospitalares (n=84).

Os resultados de detecção de RV-A demonstraram que todos as

superfícies/fômites em algum momento do estudo apresentaram resultado positivo

para a pesquisa de RV-A, sendo o suporte para álcool gel o fômite que apresentou

maior número de amostras positivas (11/73; 15,1%), seguido pelo botão de descarga

com 9/73 (12,3%). Cadeira do acompanhante, suporte de clorexidina e tampa da

lixeira de resíduos comuns, apresentando 8/73 (11,0%) amostras positivas cada

uma; maçaneta interna da porta do leito com 6/73 (8,2%) amostras positivas;

controle da cama e maçaneta externa do banheiro 5/73 (6,8%); teclado da bomba de

0

20

40

60

80

100

Jan Fev Mar Abr Mai JunMeses do estudo

nú

mero

de a

mo

str

as

RV-A

Total

46

infusão 4/73 (5,5%); e controle remoto, mesa de apoio e telefone com 3/73 (4,1%)

amostras positivas (Quadro 5-1, figura 5-2).

0

2

4

6

8

10

12

Nº

de

am

ost

ras

po

siti

vas

Pontos de coleta

Figura 5-2 – Distribuição das amostras positivas (n=73) para rotavirus A (RV-A) por

superfícies/ fomites hospitalares testados.

47

Quadro 5-1: Detecção de rotavirus A (RV-A) por Nested-RT-PCR em amostras obtidas através de swabs de superfícies do CTI de

hospital da rede particular situado na cidade do Rio de Janeiro, no período de janeiro a junho de 2009. As coletas foram realizadas em

12 fômites de todos os sete leitos, totalizando 504 amostras.

FÔMITES MESES

JANEIRO

FEVEREIRO

MARÇO

ABRIL

MAIO

JUNHO

TOTAL

BOMBA INFUSÃO 2 (L1, L2)* 1 (L7) 1 (L5) 0 0 0 4/42 (9,5%)

MAÇANETA INTERNA PORTA LEITO 3 (L1, L5, L7) 2 (L4, L5) 1 (L7) 0 0 0 6/42(14,3%)

TELEFONE 1 (L7) 1 (L2) 1 (L7) 0 0 0 3/42 (7,1%)

MESA DE APOIO 2 (L2, L4) 0 0 0 1 (L5) 0 3/42 (7,1%)

MAÇANETA EXTERNA BANHEIRO 2(L1, L7) 3 (L2, L3, L7) 0 0 0 0 5/42 (11,9%)

SUPORTE de ÁLCOOL GEL 6 (L1, L2, L3, L4, L6, L7) 4 (L2, L3, L5, L7) 0 0 0 1 (L2) 11/42 (26,2%)

SUPORTE de CLOREXIDINA 3 (L1, L4, L7) 5 (L2, L3, L5, L6, L7) 0 0 0 0 8/42 (19,0%)

TAMPA LIXEIRA RESÍDUOS

COMUNS

2 (L3, L7) 5 (L1, L2, L3, L5, L7) 0 0 0 1(L2) 8/42 (19,0%)

CONTROLE REMOTO 0 1 (L2) 0 0 2 (L1, L6) 0 3/42 (7,1%)

CONTROLE DA CAMA 1 (L3) 0 0 1 (L7) 3 (L5, L6, L7) 0 5/42 (11,9)

BOTÃO DE DESCARGA 2 (L3, L7) 1 (L5) 1 (L1) 2 (L1, L2) 3 (L5, L6, L7) 0 9/42 (21,4%)

CADEIRA ACOMPANHANTE 2 (L1, L3) 1 (L1) 0 4 (L2, L3, L6, L7) 1 (L3) 0 8/42(19%)

Total de pontos positivos por mês 26/84 (31,0%) 24/84 (28,6%) 4 /84 (4,8%) 7 /84 (8,3%) 10/84 (11,9%) 2/84 (2,4%) 73/504 (14,5%)

* N0 de amostras Positivas / leitos (L). No de L = 7

48

A análise dos fômites de acordo com os leitos demonstrou que RV-A foram

detectados em todos os leitos do CTI. O leito sete foi o que obteve maior número de

amostras positivas, com 25% de positividade (18/73) nas amostras coletadas e o

leito de número quatro o que apresentou menor percentual de positividade com

5,6% (4/73) de amotras positivas (Figura 5-3).

Figura 5-3 - Detecção de rotavirus-A (RV-A) em amostras de superficies de fômites distribuídas por leito hospitalar (n=72/leito).

A queda mensal no número de fômites contaminados observadas no mês de

março foi observada em todos os leitos. A partir de abril, com exceção do leito de

número 4, onde não foram mais detectadas amostras de superfícies contaminadas

e do leito 5, onde o percentual de positivdiade continuou decrescente, todos os

demais leitos mantiveram ou aumentaram o percentual de fômites positivos para RV-

A (Figura 5-4).

49

0

1

2

3

4

5

6

7

8

JANEIRO FEVEREIRO MARÇO ABRIL MAIO JUNHO

Nú

me

ro d

e fô

mit

es

con

tam

inad

os

Meses de estudo

LEITO 01

LEITO 02

LEITO 03

LEITO 04

LEITO 05

LEITO 06

LEITO 07

Figura 5-4 - Distribuição mensal do número de fômites contaminados por leito hospitalar do Centro de Tratamento Intensivo.

Dentre as amostras positivas (n=73), 23,3% foram detectadas em leitos sem

pacientes, porém com processo de desinfecção efetuado, enquanto 76,7% em leitos

com pacientes (Figura 5-5).

Figura 5-5 - Detecção de rotavirus A (RV-A) em amostras de superfície hospitalar, de acordo com a ocupação dos leitos.

50

5.3 Amplificação genômica quantitativa em tempo real (qPCR)

Das 73 amostras detectadas pela nested-RT-PCR, 45 (61,6%) foram

detectadas pela qPCR, tendo a quantificação variado de 3,43 x 100cg/mL a 2,94 x

103cg/mL (cg/mL - cópias genômicas por mililitro). Quando analisadas as médias de

quantificação por fômites, pode-se observar que o telefone, apesar de ser o fômite

com menor número de amostras positivas, apresentou o maior número de cópias

genômicas (Figura 5-6). Não foi possível a detecção de RV-A pela qPCR em swabs

provenientes de CR.

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

TBI MIL TE MA MEB SA SC TL CC BD CA

Fômites

cg

/mL

Média - D.P.

Média

Média + D.P.

Figura 5-6 – Média da quantificação genômica de rotavírus-A (RV-A) por fômites/superfícies.

5.4 Caracterização molecular

A análise das sequencias parciais do gene que codifica para a proteína VP6

obtidas mostram que as amostras formaram dois grandes clusters, o primeiro

agrupou amostras com o protótipos do genótipo I1, o segundo com protótipos do

genótipo I2 (Figura 5-7), de acordo com a nova classificação proposta por

Matthijnssens e colaboradores (2008b).

51

Figura 5-7 - Agrupamento das amostras baseado na seqüência parcial do gene que codifica para

VP6 das amostras obtidas no presente estudo e diferentes protótipos representantes dos diferentes genótipos I.

SWAB423_CR_20/05/09_L01

SWAB440_CC_20/05/09_L05

D/Hu/G1P8/I1

SWAB443_CR_20/05/09_L06

SWAB360_CA_28/04/09_L07

SWAB335_BD_28/04/09_L01

SWAB356_CA_28/04/09_L06

Wa/Hu/G1P8/I1

SWAB434_CA_20/05/09_L03

SWAB441_BD_20/05/09_L05

SWAB374_MA_06/05/09_L05

SWAB153_CR_10/02/09_L02

SWAB344_CA_28/04/09_L03

SWAB95_TE_03/02/09_L02

SWAB339_BD_03/02/09_L02

SWAB340_CA_03/02/09_L02

SWAB358_CA_28/04/09_L07

SWAB245_BD_17/03/09_L01

SWAB128_SA_10/02/09_L05

SWAB142_TL_10/02/09_L03

SWAB141_SC_10/02/09_L03

SWAB138_TL_10/02/09_L07

RIX4414

SWAB139_MEB_10/02/09_L03

SWAB140_SA_10/02/09_L03

SWAB133_SC_10/02/09_L06

SWAB135_MEB_10/02/09_L07

SWAB137_SC_10/02/09_L07

KU/Hu/G1P8/I1

IAL28/Hu/G5P8/I1

B4633-03/Hu/G12P8/I1

Dhaka12-03/Hu/G12P6/I1

Matlab13-03/Hu/G12P6/I1



P/Hu/G3P8/I1

B3458/Hu/G9P8/I1

WI61/Hu/G9P8/I1

ST3/Hu/G4P6/I1

SWAB102_MIL_03/02/09_L05

SWAB129_SC_10/02/09_L05

SWAB26_MA_06/01/09_L04

SWAB89_BD_27/01/09_L07

SWAB54_SA_13/01/01_L01

SWAB124_SA_10/02/09_L02

SWAB12_MIL_06/01/09_L05

SWAB21_TE_06/01/09_L07

SWAB201_TE_03/03/09_L07

SWAB109_TBI_03/02/09_L07

SWAB03_TBI_06/01/09_L02

SWAB28_MIL_06/01/09_L01

SWAB20_MIL_06/01/09_L07

SWAB123_MEB_10/02/09_L02

rj 15221/08

I1

A131/Po/G3P7/I5

RMC321/Hu/G9P19/I5I5

DS-1/Hu/G2P4/I2

L26/Hu/G12P4/I2

TB-Chen/Hu/G2P4/I2

B4106/Hu/G3P14/I2

N26-02/Hu/G12P6/I2

DRC88/Hu/G8P8/I2

SWAB72_CC_27/01/09_L03

SWAB42_SA_13/01/09_L06

SWAB52_TL_13/01/09_L03

SWAB47_SC_13/01/09_L07

SWAB58_SA_13/01/09_L04

SWAB59_SC_13/01/09_L04

SWAB130_TL_10/02/09_L05

SWAB159_BD_10/02/09_L05

RV161-00/Hu/G12P6/I2

RV176-00/Hu/G12P6/I2

SWAB34_SA_13/01/09_L02

SWAB48_TL_13/01/09_L07

SWAB55_SC_13/01/09_L01

SWAB45_MEB_13/01/09_L07

SWAB50_SA_13/01/09_L03

SWAB46_SA_13/01/09_L07

SWAB126_TL_10/02/09_L02

I2

I4 PO-13/Av/G18P17/I4

AU-1/Hu/G3P9/I3

T152/Hu/G12P9/I3I3

69

99

80

64

64

88

82

78

75

57

70

61

63

79

60

96

58

96

88

59

97

59

0.05

Os valores de Bootstrap (2000 replicas) estão indicados nos nodos da árvore. Os valores de Bootstrap menores que 50%

não estão representados na árvore. A barra na parte inferior da figura é proporcional à distancia genética. Legenda: SWAB

N°_local de coleta_data_leito

52

6 DISCUSSÃO

A determinação da qualidade microbiológica dos hospitais ainda é restrita a

poucos grupos de bactérias resistentes a antibióticos e, mais recentemente, ao

Clostridium difficile. Entretanto, as avaliações são raras e se restringem à ocorrência

de surtos nosocomiais. Neste contexto, a verdadeira importância dos vírus nestes

surtos ainda permanece desconhecida, uma vez que muitos hospitais, mesmo em

países desenvolvidos, não têm procedimentos adequados para o monitoramento e

diagnóstico das infecções adquiridas pós-internação (Sattar, 2004).

O estabelecimento de metodologias capazes de recuperar e quantificar vírus

a partir de amostras de superfícies ambientais é fundamental para se demonstrar a

disseminação de vírus no ambiente hospitalar. Neste estudo foi testada a

metodologia descrita por Gallimore e colaboradores (2005) que se mostrou eficiente

para recuperação de RV-A a partir destas amostras. Entretanto, o protocolo de

extração descrito por Gallimore, inviabiliza a utilização das amostras por outras

metodologias de detecção, como o isolamento viral, uma vez que o esfregaço de

swab é imerso no tampão de extração de RNA. Com o objetivo de se estabelecer

uma metodologia de recuperação de RV-A em superfície, que forneça amostra

suficiente para ser utilizada em metodologias moleculares de detecção viral e para

isolamento em cultivo celular realizou-se a eluição do swab em meio de cultura. A

metodologia avaliada neste estudo com eluição do swab em meio de cultura se

mostrou adequada, demonstrando a presença de vírus no eluato, que

posteriormente poderá ser utilizado para estudos de infecciosidade viral, importantes

para se evidenciar a presença de partículas virais infecciosas e avaliar o risco de

infecção por vírus presentes em superfícies. Entretanto, o isolamento viral em

amostras ambientais não é uma tarefa fácil; a maioria dos vírus entéricos, não é

propagada rapidamente em culturas de células (Fong & Lipp, 2005). Contaminações

bacterianas no ambiente também podem dificultar a propagação do vírus em

culturas de células. Tratar as amostras com grandes quantidades de antibióticos

pode ser eficaz, mas os efeitos tóxicos não podem ser excluídos, portanto, técnicas

moleculares oferecem a melhor alternativa para desenvolver métodos sensíveis e

53

específicos para a detecção de vírus entéricos em amostras ambientais (Tsai et al.

1994).

Embora a PCR seja atualmente a técnica mais utilizada para a detecção de

vírus em amostras ambientais, por sua sensibilidade e especificidade, não é capaz

de distinguir entre partículas virais infecciosas ou não (Fong e Lipp, 2005). Os

rotavirus são agentes infecciosos particularmente resistentes, capazes de se manter

por um longo tempo em superfícies, entretanto o genoma de RNA fita dupla, não

permanece intacto sem a proteção do capsídeo em um ambiente rico em RNase.

Portanto, a detecção de RNA genômico por técnicas moleculares sugere a presença

de partículas virais intactas (Haramoto et al., 2007).

O aumento do percentual de positividade pela utilização da nested-PCR

tornou evidente que enquanto a RT-PCR é suficientemente sensível para o

diagnóstico humano de RV-A, para amostras ambientais, pode ser necessária uma

segunda PCR (nested-RT-PCR). Estes dados corroboram os descritos por Gentsch

et al., 1992 que demonstram a maior sensibilidade da nested-RT-PCR, capaz de

detectar de 10 a 100 partículas. Ramani e colaboradores (2008) na Índia, estudando

indivíduos com infecção assintomática por RV demonstraram que a realização da

nested-RT-PCR detectou RV em 70% das amostras negativas pela RT-PCR,

enfatizando a necessidade de se realizar esta metodologia em indivíduos

assintomáticos assim como em amostras de superfícies também avaliadas neste

estudo.

Com o objetivo de se caracterizar os genótipos de RV-A detectados realizou-

se protocolos para amplificação dos genes que codificam as proteínas VP4 e VP7.

Entretanto, não houve positividade detectada por estas metodologias (dados não

demonstrados). Isto corrobora os dados obtidos por Ramani e colaboradores (2008)

que também não obtiveram resultados positivos por esta metodologia em amostras

de superfícies. A utilização da região de VP6 em protocolo convencional de RT-PCR

demonstrou ser esta a região do genoma mais indicada para detecção de RV-A em

amostras ambientais (Ferreira et al., 2009). Em adição, neste estudo a realização

de uma segunda etapa (nested-PCR) foi fundamental para um aumento na

positividade por esta metodologia.

54

A utilização do qPCR para detecção/quantificação de vírus demonstrou que

nem todas as amostras detectadas na nested-RT-PCR foram quantificadas por esta

metodologia. Este fato pode ser explicado pela presença de possíveis inibidores

para esta técnica (qPCR) presentes no meio de cultura DMEM (enriquecido) onde

foram armazenadas as amostras, ou mesmo pela utilização de outra região alvo

para amplificação do genoma (NSP3), embora esta seja descrita como mais

conservada que a região de VP6 (Matthijnssens et al.,2008b). Outros estudos

devem ser realizados para avaliar a interferência do meio de cultura utilizado como

eluente do swab na reação de qPCR. A quantificação de RV-A nas superfícies é

importante para determinar a carga de contaminação fornecendo dados para

estudos de avaliação de risco.

A caracterização molecular dos RV-A pelo sequenciamento parcial do

genoma demonstrou que as amostras agruparam em dois genótipos distintos, porém

esta classificação não pode ser afirmada, uma vez que a nova proposta de

Matthijnssens e colaboradores (2008b) recomenda que a classificação seja

conclusiva após sequenciamento de pelo menos 50% do gene que codifica para a

proteína viral correspondente ao genótipo. Entretanto, os dados obtidos pelo

sequenciamento nucleotidico confirmaram o RV-A como o vírus presente nas

superfícies estudadas.

No presente estudo o percentual de amostras positivas para RV-A, assim

como a variedade de superfícies contaminadas, demonstrou a contaminação do

ambiente hospitalar, identificando-se superfícies que podem estar associadas com a

transmissão destes vírus, como por exemplo, maçanetas, botão de descarga,

controle remoto da televisão, entre outros itens que estão frequentemente

associados ao contato das mãos. Gallimore e colaboradores (2006) também

demonstraram uma variedade de superfícies e equipamentos contaminados, em

uma unidade pediátrica de pacientes imunodeficientes, por vírus entéricos com

percentuais de detecção variando entre 4% e 18%, dentre estes o RV-A. Neste

mesmo estudo, em adição ao bom procedimento de controle de infecção, os

profissionais de saúde e parentes foram educados e informados sobre os

procedimentos corretos a serem realizados durante o trabalho ou visita. Apesar

dessas medidas houve contaminação de superfícies nesta unidade. No entanto, não

55

foi possível afirmar que as infecções adquiridas ocorreram pelo resultado da

transmissão pelo contato pessoa a pessoa, ou pela contaminação ambiental.

Estudos sobre a transferência de RV entre superfícies animadas-

inanimadas, animadas – animadas; animadas e inanimadas, mostraram que a

transferência do vírus: (a) ocorre prontamente independentemente da natureza da

superfície do doador e do receptor, (b) é reduzida com o aumento da ―idade‖ do

inóculo, provavelmente devido à maior perda de umidade, (c) é diretamente

proporcional à quantidade de pressão aplicada durante o contato e (d) aumentam

substancialmente quando o atrito é aplicado durante o contato (Ansari et al., 1988).

Os resultados obtidos neste estudo revelaram que o local em que a

contaminação ambiental se mostrou mais evidente foi onde a desinfecção das mãos

por álcool gel foi realizada, evidenciando e corroborando dados que indicam que a

lavagem das mãos tem uma baixa complacência (Kramer et al., 2006). Este dado

também evidencia que a desinfecção das mãos por álcool é mais aceita e utilizada

por profissionais da saúde, pelo acesso mais fácil, e por apresentar irritabilidade

menor para a pele como descrito por Bisset (2002). O segundo local de maior

contaminação, botão de descarga, foi o local onde as mãos têm contato pós-

defecação. Em estudo realizado por Gallimore e colaboradores (2006), superfícies

próximas ao vaso sanitário foram as que apresentaram maior positividade para RV-

A. O controle remoto foi o fômite onde se observou o menor percentual de

positividade para RV-A. Vale lembrar que dos fomites investigados este é o que tem

maior contato com o paciente.

A positividade de todos os fômites em pelo menos um momento deste estudo

indica que profissionais do hospital e/ou parentes e visitantes podem ser as

principais fontes de contaminação e disseminação de RV-A no ambiente hospitalar.

Esta disseminação no ambiente aumenta a chance de contaminação do paciente

pelo eventual contato deste com estas superfícies. O alto índice de contaminação

do botão de descarga poderia resultar em infecção direta do paciente ou

indiretamente pela manipulação de um profissional ou visitante que tenha entrado

em contato com esta superfície.

No atual estudo evidenciou-se que a cadeira dos acompanhantes

apresentou contaminação por RV-A, reforçando que parentes e visitantes do

56

paciente são fontes de contaminação e indicando que a lavagem das mãos não

estava sendo corretamente realizada. Estes resultados estão em concordância com

trabalhos realizados anteriormente por Gallimore e colaboradores (2005, 2008), que

demonstraram que a contaminação por NV em um hospital, estava sempre

associada com o tráfego de parentes pela unidade, sugerindo que a lavagem das

mãos não estava sendo adequada. A adoção de medidas corretivas e preventivas

pelo treinamento de técnicas de higienização das mãos, tanto para os profissionais

da saúde, como para parentes e visitantes poderiam minimizar tanto a transmissão

direta como indireta desses vírus (Soule et al., 1999).

Os resultados obtidos neste estudo evidenciaram o papel das mãos como

fonte de contaminação de diferentes superfícies, visto que os pontos selecionados

para a coleta são todos suscetíveis de manipulação. Dados estes que corroboram

estudos onde a contaminação e persistência de RV-A nas mãos e superficies foi

demonstrada. Em estudo efetuado por Ansari e colaboradores (1988) foi evidenciado

que os RV-A podem ser transferidos de mãos contaminadas para limpas, persistindo

nas mãos por até 260 minutos. Em outro, realizado por Akhter e colaboradores

(1995), os RV-A foram detectados nas mãos de 78,6% dos indivíduos amostrados e

também sobre superfícies em contato frequente com as mãos.

Neste estudo a diminuição significativa do percentual de positividade das

superfícies no mês de março até o final do estudo é explicada pela mudança de

equipe de limpeza efetuada pela administração do hospital, após conhecimento dos

resultados obtidos nos meses anteriores. A redução de 30% para 7% no percentual

de positividade enfatiza o grande impacto que medidas de limpeza podem causar

quando aplicadas com maior rigor. Esses dados podem indicar que o

monitoramento da contaminação ambiental dos hospitais por RV-A pode ser uma

forma de controlar a higienização efetiva do ambiente hospitalar, podendo evitar

surtos tanto por RV-A como por outros vírus e até mesmo outros microorganismos.

A detecção de RV-A em superfícies de leitos sem pacientes salienta o não

cumprimento efetivo dos protocolos de limpeza, além de fortalecer os dados

evidenciados por Sattar e colaboradores (1986) em que os RV-A podem persistir

em superfícies por mais de 60 dias, dado que pode variar com a temperatura

ambiente, umidade do ar e tipo de superfície. Vale lembrar que todos os protocolos

57

de limpeza do hospital são efetuados diariamente enfatizando que após a alta do

paciente o leito sofre um processo mais rigoroso de desinfecção.

Uma vez que o presente estudo foi realizado em CTI não pediátrico de

hospital da rede particular, ou seja, apenas indivíduos adultos circularam por este

local, pode-se explicar a presença de contaminação por RV-A no ambiente pelo fato

de indivíduos adultos assintomáticos terem sido um provável veículo de

disseminação do vírus, como demonstrado em outros trabalhos (Horst & Kohlhase,

1986; Barnes et al., 2003). Uma baixa concentração de infecção ou presença de

imunidade preexistente, poderiam ser as possíveis causas de infecção assintomática

(Gallimore et al., 2006).

O monitoramento ambiental de vírus gastroentéricos em superfíceis e

equipamentos hospitalares pode diminuir o risco de pacientes adquirirem estes vírus

(Gallimore et al., 2005) sendo recomendado em situações em que a infecção viral

seja de grande risco ao paciente, como por exemplo, em pacientes transplantados

(medula óssea) ou imunodeficientes. Este tipo de monitoramento seria relevante

quando aplicado à UTI pediátrica, uma vez que o RV-A possui uma grande

importância epidemiológica em crianças menores de cinco anos, principalmente

imunocomprometidos (Parashar et al., 1998, 2003).

Os resultados obtidos neste estudo aliados às propriedades físico-químicas

do vírus abrem perspectivas para a utilização do RV-A como marcador de

contaminação de superfícies hospitalares.

7 CONCLUSÕES

Os protocolos de recuperação de RV-A utilizando esfregaço de swabs em

superfícies diluidos ou não foram eficientes para detecção de RV-A nestas

superfícies.

O percentual de 14,5% amostras positivas para RV-A e a contaminação

evidenciada em algum momento do estudo de todos os fômites investigados

demonstram a disseminação de RV-A no CTI.

58

A metodologia nested-PCR deve ser utilizada em amostras de superfícies

uma vez que aumentou em 9,5 % o percentual de positivade quando comparada

com a PCR convencional.

O sequenciamento nucleotídico dos produtos obtidos pela nested-PCR

confirmaram o RV-A como o vírus presente nas superfícies estudadas.

O qPCR demonstrou uma variabilidade na carga de contaminação por RV-A

nos fômites estudados com variação entre 3,43 x 100cg/mL e 2,94 x 103cg/mL.

O fômite que obteve o maior número de amostras positivas foi o suporte

para álcool gel, com 15,1%. O telefone, juntamente com o controle remoto e a mesa

de apoio, foi o fômite que obteve menor número de amostras positivas (4,1%),

porém maior média da concentração viral ( = 1000,83cg/mL).

Uma queda significativa no percentual de detecção de RV-A após

fiscalização da limpeza demonstrou que as medidas de descontaminação hospitalar

utilizadas rotineiramente, quando corretamente aplicadas, foram capazes de diminuir

o percentual de detecção de RV-A

A detecção de 23,3% de fômites positivos para RV-A em leitos hospitalares

não ocupados revela a persistência destes vírus nas superfícies e/ou neglicência na

limpeza dos leitos, uma vez que neste estudo evidenciou-se que uma

descontaminação adequada pode reduzir o nível de contaminação viral. A presença

de RV-A em superfícies do CTI do hospital onde existe um PCIH evidencia a

importância do controle do mesmo nos hospitais e sugere a utilização do RV-A como

marcador de contaminação de superfícies hospitalares.

8 PERSPECTIVAS

Este estudo é pioneiro no Brasil e aponta a necessidade de investigações

complementares de infecciosidade, análise de risco e desinfecção de superfícies

contaminadas por RV-A. Estudos futuros devem ser realizados para a verificação e

introdução de protocolos de limpeza e higienização mais rigorosos em ambientes

hospitalares, para que haja a eliminação ou redução dos níveis de contaminação

viral, em especial de vírus gastroentéricos, em superfícies e equipamentos.

59

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