RUBENS GALDINO FEIJÓ - UFC · Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal do Rio Grande (FURG) ... enfermidades no camarão L. vannamei, sendo duas sequências (882-A1R2

FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus... 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR - LABOMAR MESTRADO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS

PROSPECÇÃO DE GENES RELACIONADOS À OCORRÊNCIA DE

ENFERMIDADES NO CAMARÃO Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931) SOB

CONDIÇÕES DE CULTIVO

RUBENS GALDINO FEIJÓ

FORTALEZA-CE

MARÇO, 2009

FEIJÓ, R. G. Prospecção de Genes Relacionados à Ocorrência de Enfermidades no Camarão Litopenaeus ...

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ORIENTADOR: Prof. Rodrigo Maggioni, Ph.D

FORTALEZA-CE MARÇO, 2009

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Marinhas Tropicais do

Instituto de Ciências do Mar (LABOMAR) da

Universidade Federal do Ceará (UFC), como

parte dos requisitos necessários para a obtenção

do título de Mestre em Ciências Marinhas

Tropicais, área de concentração Ciências

Biológicas.


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Aprovada em: 27/ 04/ 2009.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________ Prof. Rodrigo Maggioni, Ph.D (Orientador) Instituto de Ciências do Mar, LABOMAR

Universidade Federal do Ceará (UFC)

____________________________________ Profa. Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira, Ph.D (Examinadora interna)

Instituto de Ciências do Mar, LABOMAR Universidade Federal do Ceará (UFC)

____________________________________ Prof. Luis Fernando Fernandes Marins, Dr. (Examinador externo)

Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal do Rio Grande (FURG)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Marinhas Tropicais do Instituto de Ciências do Mar

(LABOMAR) da Universidade Federal do Ceará (UFC), como

parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de

Mestre em Ciências Marinhas Tropicais, área de concentração

Ciências Biológicas.


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DEDICO

Aos meus pais, Alberto e Conceição,

meus irmãos Rafael e Robson, e ao meu

avô Edvaldo Alves Feijó (in memorium)


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AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Alberto Magno e Maria Conceição, e irmãos Rafael Feijó e Robson Feijó,

que constituem toda a base de minha educação.

À Profa. Dra. Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira pela amizade, confiança e

conhecimentos repassados durante todos estes anos de convivência, pessoa que respeito e

admiro por ser uma cientista de excelência e de caráter inquestionável. Obrigado por tudo!!!

Ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Maggioni pela oportunidade, confiança e orientação

no desenvolvimento desta pesquisa. Um profissional genial e de visão inestimável pertinente

ao trabalho científico, com quem tenho aprendido deste a minha iniciação acadêmica.

Aos amigos João Mafaldo e Cândida Vila-Nova do Laboratório de Biologia Molecular do

Centro de Diagnóstico de Enfermidades de Organismos Aquáticos (CEDECAM-

LABOMAR/UFC), pela amizade e expressiva contribuição no desenvolvimento do trabalho.

Ao amigo Prof. Régis Vasconcelos pela amizade e contribuição nos procedimentos

laboratoriais.

Aos amigos Diego Apolinário, Cecília Gomes, Graça Coêlho, e a todos do Laboratório de

Histopatologia do CEDECAM-LABOMAR/UFC, pela contribuição no processamento

histológico das amostras.

Aos professores e funcionários do Instituto de Ciências do Mar (LABOMAR/UFC), que

contribuíram direta ou indiretamente no desenvolvimento deste projeto.

À equipe do Laboratório de Genética Molecular (UFC), em especial à Tuana Correia,

pela disponibilidade e tempo dedicado.

Aos amigos do NUGEN, em especial Michel Kamimura pela amizade, contribuição

cientifica e conhecimentos repassados no âmbito da Biologia Molecular.

Aos meus amigos Fernando Guardinha, Marney BB e Kaká Anjo pelos momentos de total


6

descontração vividos.

Aos meus familiares, tios, tias, primos e primas, e em especial à minha avó Raimunda

Rodrigues, pelo afeto e orações dedicadas a mim e a todos de nossa família.

Enfim, a todos que contribuíram de alguma forma para a realização desta minha

conquista.

MUITO OBRIGADO!!!


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“Deus não escolhe os capacitados

capacita os escolhidos

Fazer ou não fazer algo

só depende de nossa vontade

e perseverança”.

Albert Einstein


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RESUMO

Palavras-Chave: Litopenaeus vannamei, Enfermidades, Genes, DDRT-PCR.

A carcinicultura marinha vem assumindo um papel de grande relevância na economia

mundial, não somente pela geração de empregos e rendimentos, mas especialmente por

representar uma alternativa viável para o atendimento da crescente demanda mundial por

alimentos. No entanto, a ocorrência de enfermidades nos cultivos de camarões,

principalmente as de etiologia viral, vem comprometendo significativamente a atividade, por

provocarem elevados índices de mortalidade e conseqüente perda econômica. A identificação

e caracterização de genes relacionados a enfermidades de camarões têm auxiliado

significativamente na compreensão das respostas imunes desencadeadas nos processos

infecciosos, assim como dos mecanismos relacionados à interação patógeno-hospedeiro, ainda

de pouco conhecimento científico. O presente trabalho teve como objetivo principal a

prospecção e caracterização de genes relacionados a enfermidades de camarões da espécie

Litopenaeus vannamei sob condições de cultivo. A investigação sanitária de 40 camarões por

métodos histopatológicos e moleculares de diagnóstico resultou na detecção da IMN, IHHN,

WSS, NHP, vibrioses e gregarinas, o que permitiu o agrupamento destes camarões em classes

diferenciais destinadas ao estudo de prospecção gênica através da técnica de Differential

display RT-PCR (DDRT-PCR). A análise da expressão diferencial de genes nos perfis de

expressão dos camarões agrupados de acordo com o status sanitário resultou na identificação

de três sequências genéticas inéditas e potencialmente relacionadas à ocorrência de

enfermidades no camarão L. vannamei, sendo duas sequências (882-A1R2 e 730-A4R10) de

homologias indeterminada e uma (842-A2R6) com 99% de similaridade nucleotídica com o

gene mut-7 que codifica um tipo de RNAse envolvida no mecanismo de silenciamento pós-

transcricional de genes do nematóide Caenorhabditis elegans. Este resultado sugere que o

gene 842-A2R6 pode estar relacionado ao mecanismo de silenciamento de dsRNA associadas

ao IMNV.


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ABSTRACT

Keywords: Litopenaeus vannamei, Diseases, Gene, DDRT-PCR

The marine shrimp culture has achieved great importance in the global economy as an

agriculture business, not only for jobs and income generation, but especially because it

represents a viable alternative source of animal protein for the growing global food demand.

However, the occurrence of diseases in shrimp culture, especially those of viral aetiology, has

significantly compromised the activity, causing high mortality rates and consequent economic

loss. The identification and characterization of genes related to shrimp diseases has helped

understanding the immune responses triggered in the infectious processes, and mechanisms

related to host-pathogen interaction, about which very little is known at the moment. The

main objective of the present work was the prospection and characterization of genes related

to diseases of the shrimp species Litopenaeus vannamei under typical rearing conditions. The

health status investigation of 40 shrimps by histopathological and molecular methods of

diagnosis resulted in the detection of IMN, IHHN, WSS, NHP, vibriosis and gregarines in

various degrees and combinations. Shrimps have been grouped in classes for gene prospecting

through the technique of Differential Display RT-CR (DDRT-PCR). The analysis of

differential gene expression in the profiles produced resulted in the identification of three

previously undescribed gene sequences potentially related to the occurrence of diseases in

shrimp L. Vannamei. Two of these sequences (882-A1R2 and 730-A4R10) have not had

homologies to any annotated invertebrate sequences. Fragment 842-A2R6 however, showed

99% nucleotide similarity with the mut-7 gene, which encodes a type of RNAse involved in

the mechanism of post-transcriptional gene silencing through RNAi in the nematode

Caenorhabditis elegans. It is suggested hare that this kind of mechanism may be involved in

the silencing of double stranded RNA from viruses like the IMNV.


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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Litopenaeus vannamei.

FIGURA 2 - Eletromicrografia do IMNV.

FIGURA 3 - Eletromicrografia do IHHNV.

FIGURA 4 - Eletromicrografia do WSSV.

FIGURA 5 - Fotomicrografia de Víbrio sp.

FIGURA 6 - Eletromicrografia da NHP mostrando o formato helicoidal e

cocobacilo da bactéria.

FIGURA 7 - Combinações de primers utilizados na DDRT-PCR.

FIGURA 8 - Infiltração hemocítica focal no tecido muscular do camarão L.

vannamei (Grau 1)

FIGURA 9 - Necrose muscular de coagulação acompanhada de infiltração

hemocítica (Grau 2).

FIGURA 10 - Necrose muscular de liquefação e fibroses (Grau 3).

FIGURA 11 - Corte histológico mostrando a presença de esferóides no órgão

linfóide de um camarão com IMN (setas).

FIGURA 12 - Fotomicrografia de um camarão acometido com IMN mostrando a

presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide no tecido

muscular (setas).

FIGURA 13 - Glândula antenal de um camarão acometido com IMN. A seta

indica a presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide.

FIGURA 14 - Corpo de inclusão do tipo Cowdry A nas brânquias do camarão L.

vannamei (seta).

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FIGURA 15 - Corpos de inclusão do tipo Cowdry A no estômago do camarão L.

vannamei (setas).

FIGURA 16 - Microfotografia mostrando corpo de inclusão do tipo Cowdry A no

epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei (seta).

FIGURA 17 - Microfotografia mostrando corpos de inclusão do tipo Cowdry A

no epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei

(setas). FIGURA 18 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão mostrando

deformação moderada dos túbulos.

FIGURA 19 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão mostrando uma

proeminente deformação tubular e ausência de células B e R. FIGURA 20 - Necrose focal em uma lamela branquial do camarão L. vannamei FIGURA 21 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão L. vannamei

mostrando uma infiltração hemocítica entre os túbulos do órgão.

FIGURA 22 - Gregarinas Nematopsis sp. em diferentes estágios de seu ciclo de

vida (trofozoítos e gametocistos) no estômago do camarão L.

vannamei.

FIGURA 23 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da RT-PCR de detecção do

IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo: 328 pb;

(C+) Controle Positivo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus

(INVITROGEN®).

FIGURA 24 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da RT-PCR de detecção do

IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+)

Controle Positivo: 328 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus

(INVITROGEN®).

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FIGURA 25 - Gel de agarose 1% referente à PCR de detecção do IHHNV. Poços:

(1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo:

389 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).

FIGURA 26 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da Nested PCR de detecção

do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+)


(INVITROGEN®). FIGURA 27 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da Nested PCR de detecção

do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+)


(INVITROGEN®).

FIGURA 28 - Géis de agarose 2% referentes às combinações A1R1, A1R2,

A1R3, A2R4, A2R5 e A2R6 da DDRT-PCR. Poços: (1-40)

Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus

(INVITROGEN®).

FIGURA 29 - Géis de agarose 2% referentes às DDRT-PCR para as combinações

A3R7, A3R8, A3R9, A4R10, A4R11 e A4R12. Poços: (1-40)

Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus

(INVITROGEN®).

FIGURA 30 - Dendograma das similaridades genéticas dos 40 camarões

L.vannamei investigados, definido pelo método de agrupamento

UPGMA baseado no cálculo do índice de Jacard a partir dos perfis

de expressão gênica produzido pela DDRT-PCR.

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LISTA DE TABELAS

TABELA I - Composição e concentrações empregadas nas reações de

investigação molecular do IMNV, IHHNV, TSV, WSSV e MBV.

TABELA II - Primers e condições de termociclagem utilizados na investigação

molecular dos vírus IMN, IHHN, TS, WSS e MB.

TABELA III - Seqüências dos primers utilizados na DDRT-PCR.

TABELA IV - Classificação dos camarões identificados como positivos para a

IMN de acordo com o grau de severidade da infecção, com base

no método descrito por PEREIRA et al (2008).

TABELA V - Classificação dos camarões identificados como positivos para a

WSS de acordo com o grau de severidade da infecção, segundo

sistema de gradeamento proposto por LIGHTNER (1996a).

TABELA VI - Diagnóstico conclusivo por técnicas histopatológicas e

moleculares de detecção da ocorrência de enfermidades nos

camarões destinados ao estudo de prospecção gênica.

TABELA VII - Detecção e quantificação da expressão diferencial de genes nos

perfis genéticos produzidos pela DDRT-PCR através do

programa KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®).

TABELA VIII - Agrupamentos dos camarões em classes diferenciais de acordo

com a ocorrência de enfermidades.

TABELA IX - Percentual de camarões das classes diferenciais com expressão

detectada para os genes selecionados.

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SUMÁRIO

RESUMO ......................................................................................................................

ABSTRACT ..................................................................................................................

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................

LISTA DE TABELAS .................................................................................................

1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................

2.1. O camarão branco Litopenaeus vannamei...........................................................

2.2. Principais Enfermidades que acometem o camarão cultivado no Brasil..........

2.2.1. Mionecrose Infecciosa (IMN).........................................................................

2.2.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)..............................

2.2.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)..............................................................

2.2.4. Vibrioses.........................................................................................................

2.2.5. Hepatopancreatite Necrosante (NHP).............................................................

2.3. O Sistema Imune de Invertebrados......................................................................

2.4. Análise da Expressão Gênica em Organismos Aquáticos..................................

3. OBJETIVOS..............................................................................................................

3.1. Geral........................................................................................................................

3.2. Específicos...............................................................................................................

4. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................

4.1. Obtenção do Material Biológico...........................................................................

4.2 Extração de Ácidos Nucléicos e Síntese de cDNA................................................

4.2.1. Extração de DNA total....................................................................................

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viii

ix


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4.2.2. Extração de RNA total....................................................................................

4.2.3. Síntese de cDNA.............................................................................................

4.3. Investigação da Ocorrência de Enfermidades.....................................................

4.3.1. Procedimentos para o Diagnóstico Histopatológico........................................

4.3.2. Procedimentos para o Diagnóstico Molecular.................................................

4.4. Prospecção Gênica..................................................................................................

4.4.1. Produção de Perfis de Expressão Genética por DDRT-PCR...........................

4.4.2. Análise dos Perfis de Expressão Gênica..........................................................

4.4.3. Seleção de Genes Candidatos...........................................................................

4.4.4. Clonagem dos Genes Selecionados.................................................................

4.4.5. Seqüenciamento dos Clones Transformados...................................................

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................

5.1. Investigação da Ocorrência de Enfermidades.....................................................

5.1.1. Diagnóstico Histopatológico...........................................................................

5.1.1.1. Mionecrose Infecciosa (IMN)..............................................................

5.1.1.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)...................

5.1.1.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)...................................................

5.1.1.4. Hepatopancreatite Necrosante (NHP).................................................

5.1.1.5. Vibrioses..............................................................................................

5.1.1.6. Gregarinas...........................................................................................

5.1.2. Diagnóstico Molecular.....................................................................................

5.1.2.1. Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV).............................................

5.1.2.2. Vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV).

5.1.2.3. Vírus da Mancha Branca (WSSV)........................................................

5.1.3. Diagnóstico Conclusivo...................................................................................

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5.2. Produção e Análise dos Perfis de Expressão Gênica...........................................

5.2.1. Perfis de Expressão Gênica por DDRT-PCR....................................................

5.2.2. Estimativa de Similaridades Genéticas.............................................................

5.2.3. Identificação e Quantificação da Expressão Gênica Diferencial......................

5.3. Prospecção de Genes Relacionados às Enfermidades Detectadas.....................

5.3.1. Seleção de Genes Candidatos...........................................................................

5.3.2. Caracterização dos Genes Selecionados...........................................................

6. CONCLUSÕES........................................................................................................

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................

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1. INTRODUÇÃO

A carcinicultura marinha vem assumindo um papel de grande relevância na

economia mundial, não apenas pela geração de empregos e rendimentos, mas especialmente

por representar uma alternativa viável para o atendimento da crescente demanda mundial por

alimentos (BRASIL, 2001). O aperfeiçoamento das técnicas de cultivo tem contribuído

sobremaneira com o aumento da produção mundial de camarões, que vem crescendo cerca de

20% ao ano, chegando ao número de 2 milhões de toneladas no ano de 2006. O camarão da

espécie Litopenaeus vannamei é o responsável pela maior parcela da produção mundial, que

cresceu de 10% para 75% da produção total de camarões cultivados no período de 1998 a

2006 (WIBAN, 2007).

No Brasil, a região Nordeste é a principal produtora de camarões marinhos

cultivados, com 93,1% da produção nacional, sendo os Estados do Rio Grande do Norte e

Ceará os maiores responsáveis por este índice. Durante algum tempo, a atividade

carcinicultora brasileira não enfrentou grandes obstáculos, tendo como conseqüência um dos

maiores índices de produtividade mundial. Todavia, nos anos de 2004 e 2005 houve uma

queda de produção (-15,84%) e produtividade (-24,84%) ocasionada por diversos fatores,

destacando-se a ação antidumping imposta pelos Estados Unidos, diminuição dos preços

internacionais, variação da taxa cambial, bem como da ocorrência de enfermidades,

principalmente as de etiologia viral, com destaque para a Mionecrose Infecciosa (MADRID,

2005; RODRIGUES, 2005). A partir de 2005, houve uma estabilização da produção e

produtividade num patamar de 65.000 t e 4.063 kg/ha, respectivamente. Contudo, a crise do

setor produtivo ainda persistia até o final de 2007, principalmente em decorrência da

incidência de doenças que foi considerada a principal responsável pelas perdas econômicas e

conseqüente descapitalização setorial (ROCHA, 2007).

Segundo MARTINS (2006), o surgimento de enfermidades na carcinicultura está

diretamente relacionado com o equilíbrio entre as condições ambientais do viveiro, o estado

de saúde do camarão e os agentes potencialmente patogênicos. As doenças podem ser

classificadas em infecciosas e não-infecciosas. As infecciosas são causadas por patógenos

transmissíveis como vírus, bactérias, protozoários e fungos, enquanto que as não-infecciosas

são resultantes de agentes abióticos relacionados a fatores nutricionais, genéticos, ambientais

e físicos (NUNES & MARTINS, 2002).

Dentre as enfermidades que acometem os camarões cultivados, as de etiologia viral

são, invariavelmente, as que causam maior impacto e por isso maiores prejuízos econômicos a


18

atividade carcinicultora. Estas viroses têm se difundindo bastante tanto em camarões

cultivados como também em silvestres. No início de 1988, eram identificados apenas seis

vírus patogênicos para estes camarões (LIGHTNER, 1996b). Atualmente, são conhecidas

mais de 22 agentes virais capazes de infectar camarões peneídeos, sendo quatro deles,

responsáveis pelos maiores índices de mortalidade em sistemas de cultivo no mundo: vírus da

síndrome da mancha branca (White Spot Syndrome Virus, WSSV); vírus da síndrome da

Taura (Taura Syndrome Virus, TSV); vírus da cabeça amarela (Yellow Head Virus, YHV); e o

vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética (Infectious Hypodermal and

Hematopietic Necrosis Virus, IHHNV) (HASSON et al., 2005).

Na carcinicultura brasileira, já foi detectada a ocorrência de sete dos agentes

etiológicos virais mais comuns, sendo eles: baculovírus penaei (Baculovirus penaei, BP)

(BUENO et al., 1989, 1990); baculovirus de Penaeus monodon (Penaeus monodon-type

baculovirus, MBV) (BUENO 1991), vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética

(IHHNV) (BUENO, 1991; GESTEIRA & ANDRADE, 2002; MARTINS, 2003), vírus da

hepatopancreatite (Hepatopancreatic parvovirus, HPV) (BUENO, 1991; GESTEIRA &

ANDRADE, 2002), vírus da síndrome da Taura (TSV) (GESTEIRA & ANDRADE, 2002;

HASSON et al., 1995), vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) (ANDRADE et al., 2007;

LIGHTNER et al., 2004; NUNES et al., 2004; TANG et al., 2005), e recentemente, o vírus da

síndrome da mancha branca (WSSV) que praticamente extinguiu a atividade carcinicultora na

região Sul do país (SEIFFERT et al., 2005). Técnicas desenvolvidas para o diagnóstico de

enfermidades humanas têm sido adaptadas para a detecção de enfermidades em crustáceos e

outros organismos aquáticos, incluindo desde a simples análise clínica e histopatológica até os

métodos moleculares mais sofisticados (ANDRADE et al., 2007; COWLEY et al., 2004;

KHADIJAH et al., 2003; LIGHTNER et al., 2006; MACKAY et al., 2002).

As doenças de origem bacteriana também são consideradas como uma ameaça aos

sistemas de larvicultura e engorda de camarões marinhos, tendo como principais agentes

etiológicos, bactérias pertencentes ao gênero Vibrio, que podem em alguns casos ocasionar

mortalidades de até 100% dos camarões cultivados (BROCK & LEAMASTER, 1992). A

ocorrência de uma alfa-proteobactéria determinante da hepatopancreatite necrosante

(necrositing hepatopancreatitis, NHP) também é bastante comum em cultivos de camarões,

especificamente no continente americano, podendo provocar até 90% de mortalidade (LOY et

al., 1996). Alguns antibióticos podem ser empregados no controle de enfermidades

bacterianas em camarões, sendo utilizados preferencialmente em caráter emergencial, e de


19

acordo com dosagens pré-estabelecidas para o combate de determinado agente patogênico

(BROWN, 1999; SANGRUNGRUANG et al., 2004).

Embora tenhamos os vírus como os principais agentes causadores de mortalidade e

conseqüente perda econômica para a carcinicultura, existem poucas informações tanto em

nível celular como molecular a respeito da resposta imune viral dos invertebrados.

Paradoxalmente, mais se sabe a respeito do mecanismo de defesa de invertebrados no

contexto antibacteriano e antifúngico do que mesmo na resposta imunológica direcionada à

ação dos vírus (BACHERE et al., 2000; ROBALINO et al., 2004).

Outras enfermidades ocasionadas pela proliferação de protozoários, bactérias

filamentosas e algas, que geralmente aparecem aderidas às brânquias, cefalotórax, apêndices e

a órgãos internos, podem, dependendo do grau de severidade, gerar efeitos deletérios à saúde

do camarão. Estes agentes podem provocar letargia, redução do crescimento e o aumento da

susceptibilidade do camarão às doenças oportunistas (GUZMÁN & VALLE, 2000; NUNES

& MARTINS, 2002).

Neste contexto, a prevenção e o controle das enfermidades se tornaram

imprescindíveis ao setor, principalmente porque, como conseqüência do rápido crescimento

da indústria de cultivo de camarões, patógenos foram disseminados de uma região para outra,

de um país para outro e entre continentes, muitas vezes antes de terem sua etiologia conhecida

ou mesmo terem sido desenvolvidas ferramentas de diagnóstico (LIGHTNER, 1999).

Entretanto, para que se consiga prevenir e controlar estas doenças é necessário que haja uma

integração entre pesquisas que envolvam conhecimentos inerentes à fisiologia, imunologia,

patologia e genética do camarão cultivado (BACHÈRE, 2000).

Em virtude da inexistência de métodos curativos para as doenças virais que

acometem crustáceos, o controle das enfermidades e as medidas de biosegurança dentro dos

sistemas de cultivo de camarões têm sido considerados como os principais fatores críticos

para a manutenção da sustentabilidade do setor (LIGHTNER et al., 2006). Soluções com o

intuito de amenizar o problema gerado pelos surtos de doenças na carcicultura têm sido

sugeridas e incluem dentre outras, a mudança dos sistemas de cultivo intensivo para semi-

intensivo ou extensivo (DOS SANTOS & VALENTI, 2002), adoção de sistemas baseados no

policultivo (TIAN et al., 2001), criação de estoques de reprodutores resistentes a doenças

(COCK et al., 2009), e a utilização de imunoestimulantes, probióticos e alguns antibióticos

(BROWN, 1999; CHIU et al., 2007; GATESOUPE, 1999).

Ainda que se tenham alguns resultados positivos, especialmente na utilização de

determinados métodos terapêuticos na prevenção de enfermidades, pouco se conhece a


20

respeito de seus efeitos a nível molecular. Contudo, alguns genes relacionados ao sistema

imune de crustáceos têm sido clonados e utilizados como marcadores genéticos em estudos de

investigação do mecanismo da ação de imunoestimulantes e identificação de camarões

resistentes ou tolerantes a enfermidades (PAN et al., 2005; WANG et al., 2008b). O estudo

envolvendo a identificação de genes em crustáceos tem contribuído de forma bastante

significativa no conhecimento da fisiologia, imunologia e patologia do camarão L. vannamei

(GROSS et al., 2001; RAVIV et al., 2006; REYES et al., 2007).


21

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. O camarão branco Litopenaeus vannamei

O camarão Litopenaeus vannamei (Fig. 1) é nativo do oceano Pacífico oriental

distribuindo-se desde a província de Sonora (norte do México) até o Estado de Tumbes, no

Peru, normalmente em águas com temperatura superiores a 20 ºC (BENZIE, 2000). A espécie

tem preferência por habitats de fundo lamoso, podendo ser encontrada no ambiente natural

desde a região do infralitoral, até profundidades de 72 m. Durante os estágios iniciais de seu

desenvolvimento o camarão L. vannamei habita regiões com águas de características

oceânicas, refugiando-se para águas litorâneas na medida em que se desenvolve. Nas regiões

estuarinas ou costeiras estes animais vivem até o estágio de juvenil quando retornam ao alto

mar para se reproduzirem. No período reprodutivo, as fêmeas eliminam cerca de 100.000 a

500.000 ovócitos, que são fecundados externamente pelos espermatozóides no momento da

desova (BARBIERI & OSTRESKY, 2002). Após um período de 14 a 20 horas da desova, as

larvas eclodem como naúplios, que possuem 5 subestágios (NI a NV), e passam posteriormente

para os estágios de protozoéia (PI a PIII) e misis (MI a MIII). A metamorfose se completa na

passagem do subestágio misis III para pós-larva I, estágio em que os animais já possuem

todas as características básicas de um camarão adulto (VINATEIA, 2004).

O rostro da espécie L. vannamei é caracterizado por possuir de 8 a 9 dentes dorsais e

de 1 a 2 dentes ventrais. Possui carapaça com espinhos hepáticos e antenais pronunciados,

sem espinho orbital e pterogostomiano. Abdômen com carena dorsal no quarto, quinto e sexto

segmentos, sendo que no último a carena é terminada em espinho; quarto segmento com uma

Figura 1 - Litopenaeus vannamei Fonte: CEDECAM, 2004.


22

cicatriz e sexto com três cicatrizes. Télson terminando em espinho. O petasma é simétrico,

semi-aberto, descoberto e sem projeção distomedianas, borda ventral curta com a parte distal

do lobo lateral livre, longa e subelíptica estendendo-se além do lobo mediano. O télico é o

tipo aberto com um par de carenas pontiagudas curvas na parte anterior do esternito XIV;

esternito XIII torna-se grande, protuberância mediana semicircular a sub-retangular (PÉREZ-

FARFANTE, 1988; PÉREZ-FARFANTE & KESLEY, 1997).

De acordo com PEREZ-FARFANTE & KESLEY (1997), a classificação taxonômica

do camarão L. vannamei obedece ao seguinte formato:

Reino Animalia

Filo Arthropoda

Subfilo Crustacea: Pennant, 1777

Classe Malacostraca: Latreille, 1806

Subclasse Eumalacostraca: Grobben, 1892

Superordem Eucarida: Calman, 1904

Ordem Decapoda: Latreille, 1803

Subordem Dendrobranchiata: Bate, 1888

Superfamília Penaeoidea: Rafinesque, 1815

Família Penaeidae: Rafinesque, 1815

Subfamília Penaeinae: Dana, 1852

Gênero Litopenaeus: Pérez-Farfante & Kensley, 1997

Espécie Litopenaeus vannamei: Boone, 1931

Características como rusticidade, rápido crescimento, fácil adaptação a rações

comerciais e boa tolerância a variações ambientais, fizeram do L. vannamei a espécie de

camarão mais cultivada no mundo. Os principais países produtores de camarões são China e

Tailândia, na Ásia, e Equador, México e Brasil, nas Américas (FAO, 2006). No Brasil, a

espécie foi introduzida ainda na década de 80, tendo sido dominados os processos de

reprodução e larvicultura na primeira metade dos anos 90, quando teve início a distribuição

comercial de pós-larvas no país (BRASIL, 2001).

A genética molecular de L. vannamei tem sido abordada de diversos ângulos,

objetivando desde a descrição da variabilidade de plantéis até a caracterização do genoma da

espécie. Estes esforços visam de maneira geral fornecer ferramentas para o desenvolvimento


23

de programas de melhoramento de genético da espécie (DE FRANCISCO & GALETTI JR,

2005; SHEN et al., 2007).

2.2. Principais Enfermidades que Acometem o Camarão Cultivado no Brasil

Na carcinicultura brasileira, destaca-se a ocorrência da mionecrose infecciosa (IMN),

infecção hipodermal e necrose hematopoiética (IHHN), síndrome da mancha branca (WSS),

hepatopancreatite necrosante (NHP) e de Vibrioses (GESTEIRA, 2006).

2.2.1. Mionecrose Infecciosa (IMN)

A IMN não era conhecida antes de 2002, quando foi identificada pela primeira vez

em uma fazenda de cultivo do camarão L. vannamei no Estado do Piauí, alastrando-se

posteriormente para outros da região Nordeste, incluindo os Estados do Ceará, Rio Grande do

Norte, Pernambuco, Paraíba e Maranhão (ANDRADE et al., 2007). A virose levou a uma

queda acentuada na produção de 2003 e 2004, afetando diretamente o volume de exportações

de camarões brasileiros no biênio (RODRIGUES, 2005). Esta enfermidade, que até então

tinha sua área de ocorrência limitada a Região Nordeste do Brasil, foi recentemente

diagnostica na Indonésia (SENAPIN et al., 2007).

O Vírus da Mionecrose Infecciosa apresenta simetria icosaédrica, não é envelopado,

possui 40 nm de diâmetro e tem densidade de 1,366 g/mL em CsCl. O seu genoma é

composto de uma única molécula de dsRNA com 7560 pb e provavelmente possui um

capsídeo com quatro polipeptídios de peso molecular 24, 42, 106 e 149 kDa (Fig. 2).

Figura 2 - Eletromicrografia do IMNV. Fonte: (POULOS et al., 2006).


24

O sequenciamento do genoma viral indicou a presença de dois ORF’s (open reading

frame). O ORF da extremidade 5’ (ORF 1, nt 136-4953) codifica as proteínas do capsídeo e a

RNA-binding, enquanto que o ORF da extremidade 3’ (ORF 2, nt 5241-7451) contém genes

para a codificação da RNA polimerase RNA-dependente (RdRp). Análises filogenéticas

mostraram similaridades significativas entre a RdRp do IMNV com a de um vírus (Giardia

lamblia vírus - GLV) pertencente a família Totiviridae, indicando que o IMNV pode ser o

único membro desta família capaz de infectar invertebrados (POULOS et al., 2006).

Entretanto, a distância evolutiva entre hospedeiros (Crustáceos x Protozoários flagelados)

somada a novas descobertas referentes à região do ORF 1 do IMNV quando comparados a

membros da família Totiviridae, sugerem estudos futuros para uma classificação definitiva do

IMNV, que pode levar a criação de uma nova família de vírus de dsRNA que infecta

invertebrados (NIBERT, 2007).

Dentre as espécies de camarões identificadas como susceptíveis ao IMNV estão o L.

vannamei, L. stylirostris, Penaeus monodon e o Farfantepenaeus subtilis (GOUVEIA &

FREITAS, 2007; LIGHTNER et al., 2004; TANG et al., 2005). A sintomatologia típica da

doença causada pelo IMNV em L. vannamei é caracterizada por necrose dos músculos

estriados do abdômen, apêndices e cefalotórax. Macroscopicamente, esta lesão se manifesta

através de uma opacidade muscular, principalmente no abdômen distal e na cauda, com áreas

de aspecto leitoso durante a fase inicial da doença. Em estágios mais avançados, pode ocorrer

uma decomposição tecidual da região afetada devido a liquefação da musculatura, que

provoca uma coloração avermelhada, dando uma aparência de camarão cozido (NUNES et

al., 2004). Além de afetar a musculatura estriada, o IMNV pode também lesionar as brânquias

e o órgão linfóide dos camarões infectados (LIGHTNER et al., 2004).

Para o diagnóstico da Mionecrose Infecciosa são utilizadas técnicas histopatológicas

(LIGHTNER et al., 2004) e ferramentas moleculares de detecção. Os métodos moleculares

que utilizam marcadores genéticos específicos para a detecção do IMNV são: hibridização in

situ, transcrição reversa do RNA total seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e

RT-PCR em tempo-real (qRT-PCR) (ANDRADE et al., 2007; ANDRADE et al., 2008;

PINHEIRO et al., 2007).

2.2.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)

O agente etiológico da enfermidade é um vírus cosmopolita que infecta grande parte

das espécies de camarões peneídeos selvagens e cultivados, porém não exclusivo ao gênero,


25

tendo sido detectado também em pós-larvas e juvenis do camarão de água doce

Macrobrachium rosenbergii (LIGHTNER, 1996b; HSIEH et al., 2006). O Vírus da Infecção

Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV) já foi detectado na costa do Pacífico desde o

Peru até o México, no Havaí, Brasil, Filipinas, Japão, Tailândia, Taiwan, Singapura,

Indonésia, Oriente Médio, Nova Caledônia, Guam, Madagascar, Tanzânia e Austrália (BING

et al., 2006; LIGHTNER, 1996b; OLIVEIRA-NETO, 2006; OWENS et al., 1992; PANTOJA

et al., 1999; TANG & LIGHTNER, 2002a, 2006).

O IHHNV é o menor dos vírus que ataca camarões peneídeos, apresenta simetria

icosaédrica, não envelopado, tamanho aproximado de 22 nm, com densidade de 1,40 g/mL em

CsCl. O patógeno contém DNA de fita simples com um tamanho de 4,1 kbp e possui um

capsídeo com quatro polipeptídios de 74, 47, 39 e 37,5 kDa (Fig. 3). Com base nestas

características, o vírus foi classificado como um membro da família Parvoviridae (BONAMI

et al., 1990; BONAMI & LIGHTNER, 1991; MARI et al., 1993).

Uma análise comparativa entre o genoma do IHHNV e de um vírus pertencente ao

gênero Brevidensovirus que ataca mosquitos mostrou alta similaridade genética, o que levou a

classificação do IHHNV como membro do gênero (SHIKE et al., 2000). Além desta

semelhança genética, estes vírus ainda têm em comum o fato de serem transmitidos

principalmente pelas fêmeas de seus hospedeiros e eventualmente através dos machos, no que

infere ao modo de transmissão vertical (EMMERI et al., 2002).

Em camarões, a detecção do IHHNV pode ser feita por métodos histológicos e

moleculares. Os métodos moleculares que utilizam marcadores genéticos específicos para o

diagnóstico do IHHNV são: Dot-blot, a hibridização in situ, a reação em cadeia da polimerase

(PCR) e a PCR em tempo-real (qPCR) (BELL & LIGHTNER, 1988b; LIGHTNER et al.,

Figura 3 - Eletromicrografia do IHHNV Fonte: (LIGHTNER & PANTOJA, 2005).


26

1992; LIGHTNER, 1996a; NUNAN et al., 2000; TANG & LIGHTNER, 2001).

A primeira ocorrência da IHHN em camarões foi observada em espécimes de L.

stylirostris no Havaí (LIGHTNER, 1983), e foi caracterizada por causar doença aguda com

alta taxa de mortalidade (superior a 90%) nas fases de juvenil e de sub-adulto. A infecção

provocada pelo IHHNV no camarão L. vannamei é considerada de baixo impacto, levando a

uma enfermidade crônica denominada “síndrome do nanismo deformativo” (runt deformity

syndrome, RDS), que ocasiona deformidades no rostro e na cutícula, antenas enrugadas,

aspereza da carapaça e índices reduzidos de crescimento (KALAGAYAN et al., 1991).

2.2.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)

A Síndrome da Mancha Branca foi primeiramente detectada em camarões cultivados

no Norte de Taiwan no ano de 1992 (NAKANO et al., 1994), e desde o seu descobrimento

tem se tornado uma das enfermidades mais ameaçadoras para a atividade carcinicultora no

mundo (ESCOBEDO-BONILLA et al., 2008). O vírus causador da doença foi pioneiramente

isolado de uma epidemia ocorrida no Japão (INOUYE et al., 1994) e dentro de poucos anos se

alastrou por vários países (FLEGEL, 1997). Em virtude da variação e simultaneidade da

ocorrência da enfermidade em várias regiões do mundo, a WSS recebeu, pelo menos, 13

denominações distintas (SANGAMAHESWARAN & JEYASEELAN, 2001).

O vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV) é baciliforme, envelopado e possui

um nucleocapsídeo em forma de bastão (WANG et al., 1995). Este vírus foi recentemente

classificado como pertencente ao gênero Whispovirus, família Nimaviridae (LEU et al.,

2009). O virião possui entre 210-380 nm de comprimento, 70-167 nm de largura máxima e

contém DNA de dupla fita circular com tamanho aproximado de 300 kbp, que varia de acordo

com a localidade onde o vírus é encontrado (CHEN et al., 2002) (Fig. 4).

Figura 4 - Eletromicrografia do WSSV Fonte: (LIGHTNER, 2000).


27

Análises genéticas demonstraram que o genoma do WSSV contém de 581 a 684

ORF’s com os nucleotídeos “ATG” como códon de inicialização. Dentre estes ORF’s,

aproximadamente 184 são responsáveis pela codificação de proteínas com tamanhos variando

entre 51 e 6077 aminoácidos, que representam aproximadamente 92% da informação genética

contida no genoma do vírus (VAN HULTEN et al., 2001; YANG et al., 2001).

A enfermidade causada pelo WSSV é caracterizada por provocar mortalidades

massivas em camarões peneídeos cultivados. O vírus possui um amplo número de

hospedeiros, incluindo uma grande variedade de espécies de camarões, lagostas, caranguejos,

poliquetas, membros do filo Chaetognata e Rotifera, além de algumas espécies de insetos

aquáticos (ESCOBEDO-BONILLA et al., 2008). A doença é considerada como letal em

camarões cultivados quando mortalidades de 90-100% ocorrem dentre 3 a 10 dias, antes

mesmo dos primeiros sintomas surgirem. Os sinais clínicos observados em camarões

infectados se baseiam principalmente na presença de deposição de cálcio (0,5 a 2 mm de

diâmetro) na cutícula do cefalotórax, podendo também apresentar redução no consumo

alimentar, anorexia, letargia e uma coloração avermelhada nos apêndices ou mesmo em todo

corpo do animal (LIGHTNER 1996a; SÁNCHEZ-MARTÍNEZ et al., 2007).

Vários procedimentos de diagnóstico têm sido desenvolvidos para a detecção do

WSSV, e incluem, dentre outras, técnicas de histopatologia (LIGHTNER, 1996a;

RODRÍGUEZ et al., 2003), hibridização in situ (LO et al., 1999), amplificação isotérmica do

DNA (KONO et al., 2004), detecção por anticorpos monoclonais (MAKESH et al., 2006),

PCR (SRITUNYALUCKSANA et al., 2005) e métodos que utilizam sondas de DNA-

Microarray (KHADIJAH et al., 2003).

Em meados de 2005, a WSS foi detectada pela primeira vez na carcinicultura

brasileira, ficando sua ocorrência restrita ao Estado de Santa Catarina, o que acasionou a

proibição da comercialização de camarões para outros Estados e a interdição dos

empreendimentos envolvidos, gerando sérios danos a atividade carcinicultora da região

(SEIFFERT, 2005). Posteriormente, o WSSV foi encontrado também em fazendas do

Nordeste brasileiro tendo sido relatado no Estado do Ceará no ano de 2005. Entretanto, o

vírus encontrado no Nordeste brasileiro não demonstrou o mesmo grau de patogenicidade do

WSSV encontrado nas fazendas do Sul do país (OIE, 2005).

2.2.4. Vibrioses


28

A enfermidade é provocada por algumas bactérias de bacilos curvos pertencentes ao

gênero Vibrio (Fig. 5). As principais espécies que infectam Peneídeos são: Vibrio

parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. dansela, V. harveyi, V. penaeicida V.

anguillarum, V. nereis, V. tubiashi e V. fluvialis (LIGHTNER, 1996c).

Apesar de ocorrerem naturalmente na água e sedimentos marinhos, assim como na

microbiota gastrointestinal do camarão, algumas espécies de víbrios têm sido associadas com

massivas mortalidades em vários países produtores (TAKAHASHI et al., 1985; ANDERSON

et al., 1988; SONG et al., 1993; COSTA et al., 1998). Vários métodos têm sido

desenvolvidos para a detecção de víbrios em amostras de camarões, sedimentos e água de

cultivo, e incluem ferramentas de identificação bioquímica (O’HARA et al., 2003), técnicas

moleculares (GONZALEZ et al., 2004; HERNÁNDEZ & OLMOS, 2003) e análises

imunológicas (LONGYANT et al., 2008).

Contudo, em camarões, as vibrioses têm sido consideradas como enfermidades

secundárias e oportunistas, assumindo uma maior patogenicidade especialmente quando o

animal se encontra sob condições de estresse (SAULNIER et al., 2000; LIU & CHEN, 2004).

Segundo PHUOC et al. (2008), a ocorrência de vibrioses além de provocar lesões e

mortalidades em camarões, contribui fortemente para o aumento da susceptibilidade destes

animais a outras enfermidades.

Na maioria dos casos, as vibrioses em camarões podem ser caracterizadas pela

expansão dos cromatóforos dos pleópodos, pereiópodos e urópodos, opacidade muscular,

assim como pela presença de listras negras nas regiões laterais do cefalotórax. Uma coloração

amarelada das brânquias e do cefalotórax pode também ser um indicativo da ocorrência desta

enfermidade (SUDHEESH & XU, 2001; LONGYANT et al., 2008). As vibrioses podem ser

diagnosticadas por análise a fresco, bacteriológica ou histopatológica, podendo ainda utilizar-

Figura 5 - Fotomicrografia de Víbrio sp. Fonte: FICA, 2007.


29

se de métodos bioquímicos, moleculares ou imunológicos para a identificação do agente

patogênico em amostras de tecido ou hemolinfa do camarão (LIGHTNER, 1996a).

2.2.5. Hepatopancreatite Necrosante (NHP)

A Hepatopancreatite Necrosante é causada por uma alfa-proteobactéria gram-

negativa, pleomórfica, obrigatoriamente intracelular e pertencente ao gênero Rickettsia

(FRELIER et al., 1992). O tipo desta Rickettsia de maior patogenicidade e predominância em

camarões é um pequeno cocobacilo com 0,36 µm de diâmetro e que se multiplica no interior

das células epiteliais dos túbulos do hepatopâncreas (LOY et al., 1996) (Fig. 6).

Esta doença foi inicialmente detectada em cultivos de L. vannamei dos Estados

Unidos, mais especificamente no Estado do Texas (KROL et al., 1991), e posteriormente em

países como Peru, Costa Rica, Panamá, Brasil, Venezuela, Equador e México. A ocorrência

da NHP ainda se limita às Américas, sendo capaz de infectar camarões das espécies L.

vannamei, L. setiferus, L. stylirostris, F. aztecus e F. californiensis (PANTOJA &

LIGHTNER, 2003).

Segundo NUNES & MARTINS (2002), camarões L. vannamei afetados com a NHP

podem inicialmente apresentar um quadro clínico assintomático da enfermidade.

Posteriormente, estes animais cessam a alimentação e o crescimento, o que pode ser

facilmente identificado através da observação do trato digestório, que aparece sempre vazio, e

da perda de rigidez da carapaça. Em estágios mais avançados, pode ainda ser observada uma

descoloração das brânquias, bem como evidentes alterações no hepatopâncreas como atrofia e

Figura 6 - Eletromicrografia da NHP mostrando o formato helicoidal e cocobacilo da bactéria. Fonte: (LIGHTNER, 1996a).


30

esbranquiçamento. Conforme os autores, as mortalidades acumuladas em decorrência da

infecção por NHP podem alcançar até 50% dos camarões em cultivo. Análises a fresco podem

ser utilizadas na identificação da NHP em camarões durante a fase de intermuda. Nestes

exames são observadas deformidades do hepatopâncreas, que apesar de não sofrer alterações

externas no inicio da infecção, apresentam atrofia e estrangulamento dos túbulos durante a

fase crônica da doença. Pouca reserva de lipídeos e indícios de massas bacterianas podem

também ser observados em camarões infectados com a NHP (MORALES-COVARRUBIAS,

2008).

Métodos histopatológicos e moleculares podem também ser utilizados no diagnóstico

da enfermidade determinada pela bactéria da Hepatopancreatite necrosante (NHP) (RÍO-

RODRÍGUEZ et al., 2006; VINCENT & LOTZ, 2005; NUNAN et al., 2008).

2.3. O Sistema Imune de Invertebrados

O sistema imune é constituído por mecanismos de defesa altamente complexos

utilizados pelos organismos multicelulares no combate a uma ampla variedade de corpos

estranhos ou patogênicos. Dada sua complexidade, este sistema pode ser subdividido em inato

e adaptativo (BOWDEN, 2008). A resposta imune inata ou natural compreende todos os

mecanismos presentes naturalmente nos organismos pluricelulares, constituindo-se na

primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos através do reconhecimento de

moléculas padrões associadas ao agente invasor. Por outro lado, o sistema imune adaptativo é

típico de vertebrados, sendo filogeneticamente mais recente. É caracterizado pela presença de

vários receptores e anticorpos linfocíticos das células B e T, e ainda por células de memória,

que garantem uma resposta de defesa altamente específica, especialmente na ocorrência de

uma segunda infecção pelo mesmo patógeno (LEE & SÖDERHÄLL, 2002).

Diferentemente dos vertebrados, os invertebrados contam apenas com a resposta

imune inata. Segundo BARRACO (2004), a ausência da resposta adaptativa nos

invertebrados, e conseqüentemente de memória imunológica, inviabiliza qualquer tentativa de

desenvolvimento de vacinas, o que diminui expressivamente a possibilidade de prevenção e

controle das enfermidades em camarões cultivados. Porém, estudos recentes evidenciam a

presença de memória imune na resposta inata de invertebrados, através da descoberta de

células de adesão com características análogas aos anticorpos de vertebrados (KURTZ &

ARMITAGE, 2006).


31

A resposta inata dos invertebrados inclui uma série de reações imunes celulares e

humorais que atuam de forma integrada e estão intimamente associadas à hemolinfa do

animal. Os hemócitos, células circulantes da hemolinfa, são os principais responsáveis pelas

reações imunes celulares, atuando na fagocitose de patógenos e na formação de nódulos e

cápsulas hemocíticas em torno dos organismos invasores, destruindo-os através da liberação

e/ou produção de moléculas tóxicas e microbicidas, que incluem as enzimas lisossomais,

peptídeos antimicrobianos (Antimicrobial peptides, AMPs) e as espécies intermediárias

reativas de oxigênio (Reative Oxygen Intermediates, ROIs) e nitrogênio (Reative Nitrogen

Intermediates, RNIs) (BARRACO et al., 2008). Três populações de hemócitos podem ser

identificadas de acordo com a presença de grânulos citoplasmáticos, sendo assim,

classificados em hialinos, semi-granulares e granulares (JOHANSSON et al., 2000). Segundo

VAN DE BRAAK et al. (2002a), os hemócitos hialinos estariam envolvidos apenas no

processo de coagulação, enquanto os semi-granulares e granulares na fagocitose, formação de

nódulos e encapsulação dos organismos patogênicos. Contudo, o papel de cada população de

hemócitos na defesa imune de invertebrados ainda é um tema bastante discutido, não

existindo, portanto, uma definição universal e totalmente aceita para o mecanismo de ação

destas células (GARGIONI & BARRACO, 1998; JOHANSSON et al., 2000; VAN DE

BRAAK et al., 2002b).

As reações imunes humorais dos invertebrados envolvem a ação de moléculas de

reconhecimento como as lectinas, o sistema de coagulação e o sistema profenoloxidase. As

lectinas são proteínas ou glicoproteínas bivalentes capazes de aglutinar a superfície de

diferentes bactérias e outros patógenos invasores que possuam determinados açúcares. No

processo de aglutinação, as lectinas podem ainda melhorar a eficiência da fagocitose do corpo

invasor pelos hemócitos, funcionando como opsoninas, semelhante ao papel dos anticorpos

nos vertebrados. Entretanto, a ação das lectinas se limita a resíduos de açúcares presentes na

superfície das células do organismo patogênico (MARQUES & BARRACO, 2000).

Dois diferentes tipos de mecanismos de coagulação têm sido caracterizados para os

invertebrados, especialmente para os artrópodes (THEOPOLD et al., 2004). No limulídeo

Tachypleus tridentatus, o sistema de coagulação envolve uma cascata proteolítica que é

acionada pelo processo de degranulação dos hemócitos. Esta atividade hemocítica é induzida

pela presença de pequenas quantidades de lipopolissacarídeos de bactérias e β-1,3-glucanos

de fungos e culmina na ativação de uma pró-enzima, responsável pela catalisação e conversão

de uma proteína solúvel do plasma, o coagulogênio, em um agregado insolúvel, a coagulina,

cujo principal objetivo é o de limitar a infecção (IWANAGA, 2002). Já no lagostim


32

Pacifastacus leniusculus, o sistema de coagulação não envolve cascatas proteolíticas. Neste

crustáceo, a polimerização das proteínas de coagulação (Clotting protein, CP) é catalizada por

enzimas transglutaminases (Transglutaminase, TGase) dependentes de cálcio. As TGase estão

usualmente compartimentalizadas dentro dos hemócitos e são capazes de formar ligações

covalentes (λ-glutamil-ε-lisina) entre certas proteínas, como a proteína de coagulação presente

no plasma, resultando na formação de um gel insolúvel (MANINGAS et al., 2008).

O sistema profenoloxidase consiste em um conjunto de reações iniciada pela

oxidação de compostos fenólicos em quinonas por ação da enzima fenoloxidase

(Phenoloxidase, PO), que é sintetizada pelos hemócitos na sua forma inativa

(profenoloxidades) e convertida para sua forma ativa (PO) através de uma cascata de serina-

protease. Por meio de vias não enzimáticas, as quinonas são transformadas em vários

compostos citotóxicos e na melanina. A encapsulação dos patógenos por estes compostos

confere uma coloração escura às áreas de infecção, comumente denominada de melanização.

A ativação do sistema profenoloxidase se dá através do reconhecimento não-próprio de

moléculas padrões associadas à patógenos (Pathogen-associated molecular patterns,

PAMP’s) como lipopolissacarídeos ou peptidoglicanos de bactérias e β-1,3- glucanos de

fungos (CERENIUS et al., 2008).

Os invertebrados possivelmente contam ainda com dois mecanismos próprios da

resposta inata antiviral, que incluem os sistemas interferon (Interferon, IFN) e de RNA de

interferência (RNA interference, RNAi). Até pouco tempo atrás o sistema interferon era

considerado exclusivo de vertebrados, até que uma proteína homóloga a IFN-α de mamíferos

foi identificada em hemócitos do peneídeo P. japonicus (HE et al., 2005). Em vertebrados,

esta proteína juntamente com a IFN-β são induzidas por infecções virais e possuem a

capacidade de estimular a expressão de uma série de genes participantes de respostas

antivirais inespecíficas (PESTKA, 2007). ROBALINO et al. (2004), já haviam comprovado a

existência da resposta antiviral inespecífica em camarões L. vannamei através de injeções de

seqüências inespecíficas de dsRNA. A presença destas seqüências induziu a resposta antiviral

nos camarões, conferindo, conseqüentemente, um aumento expressivo da resistência a

infecções provocadas por dois vírus não relacionados, TSV e WSSV.

O mecanismo de silenciamento pós-transcricional de genes, também conhecido como

RNA de interferência, envolve o processamento ou maturação de precursores longos de

dsRNA em pequenos RNAs de 20-50 pb (short interfering RNAs, siRNA; repeat-associated

short interfering RNAs, rasiRNAs; e microRNAs, miRNAs) a partir de reações catalizadas por

endonucleases do tipo RNAse III dsRNA-específico, como as enzimas Drosha e Dicer. Estes


33

pequenos RNAs (RNAi) podem conduzir a clivagem de moléculas complementares de RNA

a partir de um complexo de silenciamento multiprotéico (RNA-induced silencing complex,

RISC), promovendo uma degradação específica ou a repressão da tradução do mRNA do

organismo patogênico (MEISTER & TUSCHL, 2004). Em camarões L. vannamei, este

mecanismo foi ativado a partir da injeção de longas moléculas de dsRNA referentes a

fragmentos da subunidade ribonucleotídeo redutase (Ribonucleotide reductase small subunit,

RR2), DNA polimerase (DNA polymerase, DP) ou do ORF-WSV252 (Open reading frame,

ORF-WSV252) provenientes do WSSV (ROBALINO et al., 2005).

Estudos recentes no campo da imunologia de camarões identificaram a presença de

receptores do tipo “Toll” em células dos peneídeos L. vannamei (IToll) e P. monodon

(PmToll). O alto índice de similaridades destes “Tolls” de camarões com os encontrados em

insetos levantam a hipótese da associação destas proteínas com o sistema imune inato do

camarão, inclusive na resposta antiviral. Na mosca Drosophila melanogaster, estes tipos de

receptores induzem a transcrição do AMP drosomicina. A análise das seqüências dos “Tolls”

dos peneídeos mostra um alto grau de conservação dos domínios LRR e TIR, semelhante ao

encontrado em “Tolls” de vertebrados. Por outro lado, não foi constatado nenhum sítio de

união para PAMP’s no domínio LRR, o que coloca em questão a atividade funcional destas

proteínas na resposta imune de camarões (YANG et al., 2007; ARTS et al., 2007). Em

vertebrados, o reconhecimento de PAMP’s através de sítios de união localizados no domínio

LRR permite a indução da expressão de importantes citocinas do sistema interferon (IFNs),

bem como de moléculas ativas da resposta imune adaptativa (AKIRA & TAKEDA, 2004).

2.4. Análise da Expressão Gênica em Organismos Aquáticos

A análise da expressão gênica permite o estudo de caracterização gênica na tentativa

de se compreender a relação entre os genes e seus fenótipos correspondentes em diferentes

estágios do desenvolvimento de um organismo e sob diferentes condições fisiológicas e

ambientais (BREYNE & ZABEAU, 2001).

A primeira ferramenta desenvolvida com o intuito de se determinar de modo global os

níveis de expressão gênica se baseou no sequenciamento massivo de transcritos (Expressed

Sequence Tag, EST’s), particularmente útil para a descoberta de novos genes, porém

extremamente trabalhosa e dispendiosa (ADAMS et al., 1995). Posteriormente, foram

desenvolvidas várias técnicas alternativas para a detecção e/ou quantificação da expressão

gênica. As principais ferramentas empregadas se baseiam em três distintos princípios


34

metodológicos: 1º) Hibridização de sondas (Ex: cDNA-microarray; Oligo-microarray e

Suppression subtractive hybridisation, SSH); 2º) Sequenciamento de regiões especificas de

fragmentos de cDNA (Ex: Serial Analysis of Gene Expression, SAGE; Massive Parallel

Signature Sequencing, MPSS); e 3º) Análises de fragmentos de cDNA amplificados pela

reação em cadeia da polimerase (Ex: Differential display reverse transcription-polymerase

chain reaction, DDRT-PCR; Real Time quantitative Reverse Transcription-PCR, qRT-PCR e

cDNA-amplified fragment length polymorphism, cDNA-AFLP) (BREYNE & ZABEAU,

2001). A utilização dessas técnicas tem contribuído substancialmente para estudos envolvendo

a expressão gênica diferencial, análise de transcritos e caracterização da transcrição em

determinadas células ou tecidos sob condições fisiológicas diversas (ONEAL et al., 2008;

BREYNE et al., 2002; TORRES et al., 2006; WHETTEN et al., 2001).

A literatura traz diversos exemplos dos avanços tecnológicos que têm permitido ao

homem a identificação e caracterização de genes em organismos aquáticos de relevante

interesse para a aqüicultura e pesca. O estudo de mecanismos moleculares na diferenciação

sexual em peixes, por exemplo, tem demonstrado claramente o papel dos esteróides e

especialmente dos estrógenos. No entanto, este estudo tem sido focado em um pequeno

número de espécies, basicamente espécies de significativos valores comerciais (DEVLIN &

NAGAHAMA, 2002). Pesquisas recentes com tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus)

envolvendo a técnica de cDNA-microarray identificaram a presença de genes expressos

diferentemente em machos e fêmeas antes da diferenciação gonadal, permitindo, deste modo, a

sexagem prévia de espécies que não possuem dimorfismo sexual através da utilização dos

genes descobertos como marcadores genéticos (SHIGEHO et al., 2008).

A técnica da transcrição reversa do RNA total seguido da reação em cadeia da

polimerase em tempo real (qRT-PCR) foi utilizada para a caracterização da expressão dos

genes 3 RMF, 2 MEF e 2 miostatina no músculo de trutas arco-íris (Oncorhynchus mykiss)

durante 9 estágios de seu desenvolvimento. O nível de expressão e o conhecimento das

funções de cada gene testado foram utilizados para inferir o grau de hiperplasia, hipertrofia e

limitação do crescimento muscular durante cada estágio de desenvolvimento estudado

(JOHANSEN & OVERTURF, 2005). A qRT-PCR também foi utilizada na perfilagem da

expressão de 22 genes relacionados com processos controlados por andrógeno e estrógeno

como a reprodução, crescimento e desenvolvimento de fêmeas e machos do peixe pateta

(Pimephales promelas). Para esta análise, tecidos de gônadas e fígado foram expostos ao anti-

andrógeno flutamida e ao estrógeno sintético 17α-etilestradiol (EE2). Nas duas formas de

tratamento foram produzidos fenótipos como a indução do plasma vitelogênico, redução


35

gonadossomático e redução secundária dos caracteres sexuais dos peixes. No entanto,

observou-se uma expressão diferencial dos genes analisados para os diferentes tratamentos,

sugerindo que estes operam basicamente por vias de mecanismos moleculares distintos

(FILBY et al., 2007).

BOUTET et al. (2005) investigaram a expressão do mRNA referente ao gene AST

(Aspartate aminotransferase) em diferentes tecidos da ostra Crassostrea gigas quando

exposta à hidrocarbonetos, pesticidas, condições de hipoxia e ao estresse causado por uma

hipo-salinidade. Os resultados desta pesquisa demonstraram que a expressão do gene AST

respondeu a exposição à hidrocarbonetos, condições de hipoxia e ao estresse salino, mas não

quando os animais eram expostos a pesticidas durante um determinado período de contato.

Entretanto, os autores afirmam que a utilização do gene AST como um emergente

biomarcador genético para o monitoramento de distúrbios ambientais ainda necessita de

estudos complementares.

Um recente trabalho de prospecção gênica utilizando metodologia modificada da

técnica de Differential Display RT-PCR detectou genes do camarão-rosa Farfantepenaeus

paulensis relacionados com o seu crescimento e tolerância à salinidade. O estudo resultou na

identificação dos genes da ciclofilina e hemocianina, que até então não tinham sido descritos

para a espécie estudada (KAMIMURA et al., 2008).

Dentre as pesquisas inerentes à prospecção e caracterização gênica em organismos

aquáticos, várias são as abordagens que tratam do acometimento de enfermidades em

camarões. Segundo BARRACCO et al. (2008), a identificação e quantificação da expressão

gênica de diferentes moléculas imunológicas em crustáceos têm auxiliado significativamente

na compreensão das respostas imunes desencadeadas nos processos infecciosos, assim como

dos mecanismos relacionados à interação patógeno-hospedeiro, ainda de pouco conhecimento

científico. DHAR et al. (2003), verificaram que genes codificadores de proteínas

imunológicas, estruturais, bem como aquelas de funções não conhecidas, tiveram sua

expressão maximizada em camarões L. vannamei infectados com o vírus da mancha branca

(WSSV). Neste estudo, a expressão do mRNA foi identificada e quantificada por cDNA-

microarray que se constituiu na primeira análise quantitativa da expressão gênica em

organismos aquáticos.

MONTAÑO-PÉREZ et al. (2005), utilizando a técnica de Differential Display RT-

PCR identificaram a expressão diferencial de genes em hemócitos do camarões L. vannamei

infectados experimentalmente com o Vibrio alginolyticus ou inoculados com partículas

abióticas (DEAE-Sephadex). A identificação dos genes detectados demonstrou que as células


36

de hemócitos são capazes de reconhecer e distinguir diferentes corpos estranhos, além de

responderem de forma bastante especifica a cada tipo, o que sugere alguma especificidade na

resposta imune do camarão.

A pesquisa voltada a descoberta de genes relacionados à resistência de camarões a

doenças têm despertado significativo interesse, especialmente na identificação daqueles

envolvidos na resistência viral. LUO et al. (2003) foram pioneiros na prospecção gênica

associada a resistência viral de camarões através da identificação do gene PmAV em camarões

Penaeus monodon resistentes ao WSSV. Outros estudos vêm explorando este campo de

pesquisa, porém, a ausência de linhagens celulares permanentes em crustáceos tem dificultado

a caracterização de genes através de ensaios in vitro de infecção ou de atividade antiviral (LIU

et al., 2001; LIGHTNER et al., 2006).


37

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

• O presente trabalho teve como objetivo geral prospectar e caracterizar genes

relacionados a enfermidades de camarões da espécie Litopenaeus vannamei sob

condições de cultivo.

3.2. Específicos

• Investigar a ocorrência de enfermidades em camarões L. vannamei, sob condições de

cultivo, através de métodos histopatológicos e moleculares de detecção.

• Produzir perfis de expressão gênica de camarões L. vannamei através da perfilagem do

RNA total seguido da transcrição reversa da polimerase utilizando-se a técnica

Differential Display RT-PCR (DD-RTPCR).

• Identificar, pela análise dos padrões de expressão de camarões infectados e saudáveis,

genes potencialmente relacionados às enfermidades detectadas nos camarões

investigados.

• Caracterizar os genes candidatos através de clonagem, sequenciamento e homologia a

sequências conhecidas.


38

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Obtenção do material biológico

Nesta pesquisa foram utilizados 40 camarões com aproximadamente 10g (±2)

pertencentes à espécie Litopenaeus vannamei. Os animais foram coletados em um viveiro

localizado no município de Paraípaba (CE) com 140 dias de cultivo durante a época de estio

do ano de 2007. A análise prévia do histórico de cultivo deste viveiro indicou características

inerentes à ação de patógenos como alta taxa de conversão alimentar, elevado índice de

mortalidade e a presença de camarões moribundos no sistema de cultivo.

No momento da amostragem, os camarões estavam sendo mantidos sob as seguintes

condições: densidade de 30 camarões/m2; pH 8,98; temperatura de 27,6 °C; salinidade 5‰;

4,7 mg/L de oxigênio dissolvido; e 27 cm de transparência da água. A captura dos animais foi

realizada com o auxílio de uma tarrafa, sendo a coleta efetivada em apenas um ponto do

viveiro.

Para a investigação molecular de enfermidades e prospecção gênica nos camarões

coletados foram retirados os pleópodos de cada camarão e conservados em álcool etílico 96%

(MERCK) até o processo de extração de ácidos nucléicos. Após a retirada dos pleópodos, os

camarões foram fixados com aproximadamente 30 mL de solução de Davidson AFA’s (BELL

& LIGHTNER, 1998a) e imersos na mesma solução até o seu processamento histológico.

Todo o material biológico coletado foi devidamente etiquetado em ordem numérica e

encaminhado ao Centro de Diagnósticos de Enfermidades de Organismos Aquáticos

(CEDECAM/LABOMAR-UFC) para as análises genéticas e histopatológicas. As amostras

destinadas a estudos moleculares foram transportadas em caixas isotérmicas contendo gelo e

armazenadas à -70 °C.

4.2. Extração de Ácidos Nucléicos e Síntese de cDNA

4.2.1. Extração de DNA total

O DNA genômico total foi extraído de acordo com o protocolo descrito por

SAMBROOK et al. (1989) e utilizado no diagnóstico molecular de vírus de DNA. Este

material genético foi extraído de aproximadamente 20 mg de tecido muscular de pleópodo

conservado em álcool 96% (MERCK®). Para a extração, o material biológico foi lavado com


39

uma solução de Tris-HCl (10 mM, pH 7,0) e colocado em microtubos do tipo Eppendorf de

1,5 ml contendo 500 µL de tampão de extração (Tris-HCl 100 mM, SDS 1%). Em seguida,

adicionou-se 30 µL de proteinase K (10 mg/ml) e misturou-se bem por inversão.

As amostras foram incubadas a 65 °C por 3 horas até o tecido está completamente

digerido, misturando-se ocasionalmente por inversão. Após a digestão do tecido, foi

adicionado 500 µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) (INVITROGEN®)

misturando-se por inversão durante 5 min. Para a separação das fases, as amostras foram

centrifugadas a 17.760 g/5 min. Uma alíquota de 450 µL da fase aquosa superior foi

transferida para outro microtubo tomando-se o cuidado essencial para não perturbar a

interface. Numa segunda etapa de purificação, 500 µL de clorofórmio:álcool isoamílico

(24:1) foram novamente adicionados à amostra e misturou-se por inversão durante 5 min. As

amostras foram novamente centrifugadas a 17.760 g/5 min e 450 µL da fase aquosa superior

foi transferido para outro microtubo de 1,5 mL. Para precipitação do DNA, foi adicionado 1,0

mL de etanol absoluto e 50 µL de acetato de sódio às amostras, incubando-as a 20 °C/30 min.

Após este passo, as amostras foram centrifugadas a 17.760 g/15 min a 4 °C. O sobrenadante

foi removido cuidadosamente por inversão. As amostras foram então lavadas com 500 µL de

etanol 70%, invertendo-se algumas vezes para posteriormente serem centrifugadas a 17.760

g/5 min. O etanol foi descartado cuidadosamente e os microtubos invertidos sobre um papel

toalha a fim de maximizar o processo de secagem a temperatura ambiente (15 a 25 °C) por 10

minutos.

O DNA das amostras foi ressuspendido em 50 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1

mM) e tratado com 2,0 µL de RNase (10 mg/mL). Para a ativação da RNase, as amostras

foram incubadas a 37 °C/30 min. Antes da utilização do DNA total extraído, sua integridade

foi avaliada por corrida eletroforética em gel de agarose a 1%, preparado em 150 mL de TAE

(1X) (0,04 M Tris Base; 0,04 M acetato e 0,001 M EDTA) contendo 0,1 µg/mL de Brometo

de Etídio. O gel foi preparado em uma cuba Electophoresis Systems FB-SB-1316

(FISHERBIOTECH®) contendo o tampão TAE (1X). 1,0 µL de cada amostra de DNA foi

misturada a 1,0 µL do corante Blue juiceTM 10X (INVITROGEN®) e aplicada no gel. A

corrida eletroforética foi realizada com a potência de 0,58 volts/cm2 de corrente contínua

durante 60 minutos. O gel foi visualizado em um transiluminador ultravioleta SelectTMSeries

(ESPECTROLINE®) e fotodocumentado através do sistema de análise e fotodocumentação de

eletroforese (Electrophoresis Documentation and Analysis System 290, EDAS 290)


40

(KODAK®) que utiliza o programa de computador KODAK 1D Image Analysis Software

(PIZZONIA, 2001).

O DNA total de cada amostra foi ainda quantificado em um aparelho

espectrofotômetro BIOMATE 3 (THERMO®, Electron Corporation), utilizando-se a

absorbância na faixa de 260 nm. A relação de absorbância (260A/280A) também foi analisada

para a certificação do grau de pureza do DNA total extraído.

4.2.2. Extração de RNA total

O RNA total foi extraído a partir de aproximadamente 50 mg de tecido muscular de

pleópodos, com a utilização do reagente Trizol (INVITROGEN®), seguindo metodologia

recomendada pelo fabricante, e usado para as sínteses dos cDNAs destinados a produção dos

perfis genéticos ou diagnóstico molecular de vírus de RNA. Inicialmente, o material biológico

foi lavado com uma solução de Tris-HCl (10 mM, pH 7,0) e colocado em microtubos de 1,5

mL contendo 500 µL de Trizol. Os pleópodos foram macerados e depois incubados durante 5

minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, adicionou-se 200 µL de clorofórmio às

amostras, agitando-as vigorosamente durante 15 segundos. Em seguida, as amostras foram

incubadas a temperatura ambiente por 10 min. Para a separação das fases, as amostras foram

centrifugadas a 17.760 g/15 min a 4 °C. Transferiu-se cuidadosamente 450 µL da fase

superior (RNA total) para um tubo de 2,0 mL, onde foi agregado 500 µL de álcool

isopropílico. As amostras foram incubadas durante 15 minutos a 30 °C, e centrifugadas a

17.760 g/10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi removido por inversão, tomando-se os

devidos cuidados para não se perder o pellet. As amostras foram lavadas com 1,0 mL de

etanol 75%, mescladas no vortex e centrifugadas a 8.600 rpm/5 min a 4 °C. O etanol foi

descartado cuidadosamente e os tubos invertidos sobre um papel toalha para secagem sob

temperatura ambiente durante 10 minutos. O RNA total foi dissolvido em 50 µL de água

tratada com dietil-pirocarbonato (DEPC). A certificação da integridade do material extraído

foi checada por eletroforese em gel de agarose obedecendo às mesmas condições descritas

para a análise do DNA total extraído. Para a quantificação espectrofotométrica do RNA

extraído utilizou-se a absorbância na faixa de 260 nm para análise de RNA. A relação entre as

medidas de absorbância (260A/280A) também foi utilizada para a verificação do grau de

pureza do RNA total obtido.


41

4.2.3. Síntese de cDNA

Para a obtenção dos cDNAs utilizados no diagnóstico molecular de vírus de RNA ou

na produção dos perfis genéticos, um volume equivalente a 2,5 µg de RNA total foi

empregado no processo de transcrição reversa através da utilização do kit SuperScriptTM First-

Strand Synthesis Systems for RT-PCR (INVITROGEN®) conforme recomendações do

fabricante. Em microtubos de 0,2 mL foram adicionados 2,5 µg do RNA total extraído; 10

mM de dNTP’s; 150 ng de primers randômicos hexâmeros ou 0,5 µg de primers Oligo(dT)12-

18; e água tratada com DEPC em quantidades suficientes para completar o volume final de 10

µL. As amostras foram incubadas a 65 °C/5 min e posteriormente resfriadas em gelo por 1

min. Em seguida, 9,0 µL de uma mistura contendo 2,0 µL de tampão RT (10X); 4,0 µL de

MgCl2 (25 mM); 2,0 µL de DTT (ditiotreitol) (0,1 M) e 1,0 µL de RNaseOUTTMRecombinant

RNase Inhibitor foi adicionada a cada amostra, que foram em seguida vortexadas, brevemente

centrifugadas e incubadas a 42 °C/2 min. Para a efetivação da reação de transcrição reversa,

1,0 µL da enzima SuperScriptTM II RT (50 unidades) foi adicionado em cada tubo,

misturando-se bem, e seguindo o processo com uma incubação a 42 °C/50 min. A reação de

transcrição foi terminada com a incubação das amostras a 70 °C/15 min. Após uma breve

centrifugação, adicionou-se ainda às amostras, 1µL de RNase H, terminando o processo com

uma incubação a 37 °C/20 min. As amostras foram armazenadas em congelador a -20 °C até o

processamento.

O cDNA obtido foi quantificado por espectrofotometria utilizando a absorbância na

faixa de 260 nm para DNA de dupla fita. A eficiência da síntese foi certificada através da

amplificação do gene da ß-actina por RT-PCR a partir dos primers ß-AC Forward (5’-

ACHAACTGGGAYGAYATGG-3’) e ß-AC Reverse (5’-TAGATGGGBACDGTGTGGG-

3’) (SANDRINI et al., 2006).

4.3. Investigação da Ocorrência de Enfermidades

Os camarões amostrados foram submetidos a procedimentos de diagnósticos

histopatológicos e/ou moleculares para a investigação da ocorrência de enfermidades

infecciosas. Nestes animais, foram investigadas evidências das principais enfermidades

detectadas nos sistemas de cultivo de camarões no Brasil como a IMN (Mionecrose

Infecciosa), IHHN (Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética), WSS (Síndrome da

Mancha Branca), NHP (Hepatopancreatite necrosante) e Vibrioses, bem como de doenças de


42

ocorrência já detectada no país, por exemplo, a TS (Síndrome da Taura), a MB (Doença do

Monodon Baculovírus) e a HPV (Hepatopancreatite Parvovírus).

4.3.1. Procedimentos para o Diagnóstico Histopatológico

Após 24 horas de imersão na solução de Davidson (AFA’s), os camarões foram

lavados em água corrente e seccionados nas regiões do cefalotórax e abdômen através de

cortes transversais e longitudinais. Os fragmentos foram transferidos para histocassetes e

submersos em álcool 70%, dando início ao seu processamento histológico, segundo a técnica

de histologia clássica de desidratação em série crescente de álcool, diafanização em xilol,

impregnação em parafina a 60 °C e emblocamento (BELL & LIGHTNER, 1988a). Cortes

histológicos de 4µm foram obtidos em micrótomo manual e os tecidos corados através do

método de Hematoxilina & Eosina (JUNQUEIRA & JUNQUEIRA, 1983). As lâminas

histológicas foram analisadas em microscópio de luz e microfotodocumentadas por uma

câmera Canon através do software (ZoomBrowser EX®CANON). Alterações citológicas

resultantes da ação de patógenos como IMNV, IHHNV, WSSV, TSV, MBV, HPV, NHP e

Vibrioses, bem como de outros agentes patogênicos, foram investigadas de acordo com

literatura clássica de patologia de crustáceos (LIGHTNER, 1996a; PEREIRA et al., 2008).

4.3.2. Procedimentos para o Diagnóstico molecular

Ferramentas moleculares de diagnóstico baseadas no princípio da Reação em Cadeia

da Polimerase (PCR) foram utilizadas na investigação da ocorrência do IMNV, IHHNV, TSV,

WSSV e MBV nos camarões estudados, e incluíram técnicas como a reação em cadeia da

polimerase (PCR), Transcrição Reversa do RNA total seguida da PCR (RT-PCR), Nested

PCR e RT-PCR em dois passos, que foram empregadas de acordo com modificações de

metodologias descritas para a detecção das enfermidades investigadas (VILA-NOVA et al.,

2008; OIE, 2003; NUNAN et al., 1998; LO et al., 1996; SURACHETPONG et al., 2005)

(Tab. I e II).

As amostras de cDNA utilizadas nas reações de RT-PCR foram as sintetizadas a

partir de primers randômicos hexâmeros. Os controles positivos das reações de detecção do

IMNV e IHHNV foram obtidos a partir de camarões infectados com os respectivos agentes.

Para os vírus da TS, WSS e MB foram utilizados controles positivos adquiridos de kits


43

comerciais (DIAGXOTICS® INC.). Como controle negativo utilizou-se água ultrapura em

substituição às amostras investigadas.

Tabela I - Composição e concentrações empregadas nas reações de investigação molecular do IMNV, IHHNV, TSV, WSSV e MBV.

Reagentes da

Reação1

RT-PCR em duas

etapas PCR RT-PCR Nested PCR

IMNV

(1° etapa)

IMNV

(2° etapa) IHHNV MBV TSV

WSSV

(1º passo)

WSSV

(2º passo)

dNTP’s

(100 mM) 200 µM 200 µM 200 µM 200 µM 300 µM 200 µM 200 µM

Primer Foward

(10 mM) 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,3 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM

Primer Reverse

(10 mM) 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,3 µM 0,4 µM 0,4 µM 0,4 µM

MgCl2 (50 mM) 1,5 mM 1,5 mM 2,0 mM 1,5 mM 2,0 mM 1,5 mM 1,5 mM

Taq polimerase

(500 U) 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U 1 U

Amostra 300 ng 1,0 µL2 100 ng 100 ng 300 ng 100 ng 2,0 µL2

Vol. da reação 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL

1 Cada reação conteve ainda água e tampão (1X) em QSP o volume final da reação. 2 Alíquota do produto do 1° passo da PCR ou RT-PCR.

Tabela II - Primers e condições de termociclagem utilizados na investigação molecular dos vírus IMN, IHHN, TS, WSS e MB.

Técnica Primers (5’- 3’) Condições de

Termociclagem*

Amplicons

(pb)

IMNV

RT-PCR

em duas

etapas

IMNV4586-F

(CGACGCTGCTAACCATACAA);

IMNV4914-R

(ACTCGGCTGTTCGATCAAGT)

94 ºC/2 min;

30 ciclos (94 ºC/20 s,

62º C/20 s, 72º C/30

s); 72º C/30 s

328

IHHNV PCR 389-F (CGGAACACAACCCGACTTTA);

389-R (GGCCAAGACCAAAATACGAA)

95 ºC/5 min;


55º C/30 s, 72º C/1

min); 72º C/7 min

389

TSV RT-PCR TSV9195-F (TCAATGAGAGCTTGGTCC);

TSV9992-R (AAGTAGACAGCCGCGCTT)

94 ºC/2 min;


60 ºC/45 s); 60 ºC/7

min

231

WSSV Nested F1 (ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG); 94 ºC/4 min; 1447


44

PCR R1 (TAATGCGGGTGTAATGTTCCTTACG)

e

F2 (GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA);

R2 (TACGGCAGCTGCCTGCACCTTTA)

39 ciclos (94 ºC/1

min, 55º C/1 min, 72

ºC/2 min); 72 ºC/5

min

e

941

MBV PCR 261-F (AATCCTAGGCGATCTTACCA);

261-R (CGTTCGTTGATGAACATCTC)

94 ºC/4 min;


60º C/30 s, 72º C/30

s); 72º C/7 min

261

*As reações foram efetivadas em um termociclador Flexygene®TECHNE

Para a eletroforese, 8,0 µL de cada produto da PCR ou RT-PCR foram

homogeneizado a 1 µL do corante Blue juiceTM (10X) (INVITROGEN®) e aplicado em gel de

agarose 1%, preparado em 150 mL de TAE (1X) e corado com 0,1 µg/mL de brometo de

etídio. A corrida eletroforética foi realizada em uma cuba (FISCHER SCIENTIFIC®) a uma

potência de 0,58 volts/cm2 de corrente contínua durante 60 minutos. A visualização das

bandas no gel foi feita em um transiluminador ultravioleta (SPECTROLINE®) e a

fotodocumentação através do sistema EDAS 290 (KODAK®).

4.4. Prospecção Gênica

4.4.1. Produção de Perfis de Expressão Genética por DDRT-PCR

A metodologia utilizada para a obtenção dos perfis de expressão gênica dos 40

camarões estudados baseou-se em um protocolo modificado da técnica de Differential Display

RT-PCR (DDRT-PCR) (LIANG & PARDEE, 1992). As reações de DD foram efetivadas com

a utilização de 4 primers âncoras (A1...4) em combinação com 12 primers randômicos (R1...12)

(OPERON TECHNOLOGIES®) (Tab. III). Dentre as 48 combinações possíveis entre estes

primers, 12 foram utilizadas de acordo com o formato descrito na figura 7.


45

Tabela III - Seqüências dos primers utilizados na DDRT-PCR.

Primers Seqüências (5’- 3’)

A1 TTTTTTTTTTTVA

A2 TTTTTTTTTTTVG

A3 TTTTTTTTTTTVC

A4 TTTTTTTTTTTVT

R1 TGATCCCTGG

R2 GGACTGGAGT

R3 TGCTCTGCCC

R4 GTCCACACGG

R5 CTGCTGGGAC

R6 CCTTGACGCA

R7 TCCGCTCTGG

R8 TTTGCCCGGA

R9 CCACAGCAGT

R10 GGACCCTTAC

R11 GGAGGGTGTT

R12 AGGGAACGAG

Cada DDRT-PCR conteve 1X do tampão proprietário (INVITROGEN®); 200 µM de

dNTP’s; 1,5 mM de MgCl2; 1,2 µM do primer âncora; 0,4 µM do primer randômico; 1 U da

enzima Taq Platinum (INVITROGEN®); 100 ng de cDNA sintetizados a partir de primers

Oligo(dT)12-18; e água ultrapura ajustada para o volume final de 10 µL. A reação foi efetivada

em um termociclador Primus 96 Plus (MWG-BIOTECH®) iniciando-se com um ciclo de

desnaturação a 94 ºC/5 min, seguido de 40 ciclos a 94 °C/30 s, 42 °C/2 min e 72 °C/30 s,

Figura 7 - Combinações de primers utilizados na DDRT-PCR.


46

equivalentes às etapas de desnaturação, anelamento dos primers e extensão do DNA,

respectivamente. A reação foi concluída com uma extensão final do DNA a 72 °C/7 min.

Um volume de 8,0 µL do produto da DDRT-PCR, homogeneizado a 1,0 µL do

corante Blue juiceTM (10X) (INVITROGEN®), foi aplicado em gel de agarose 2% contendo 0,1

µg/mL de brometo de etídio em tampão TAE (1X). A eletroforese foi realizada sob uma

corrente contínua de 0,63 volts/cm2 durante 75 minutos. Os perfis genéticos foram

visualizados em um transiluminador ultravioleta (SPECTROLINE®) e fotodocumentados

através do sistema EDAS 290 (KODAK®).

4.4.2. Análise dos Perfis de Expressão Gênica

Os perfis genéticos produzidos foram analisados através do programa de computador

KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®) (PIZZONIA, 2001), utilizado na detecção

e quantificação da expressão diferencial dos genes amplificados pela DDRT-PCR. Na

quantificação da expressão gênica pelo software empregado, considerou-se a intensidade das

bandas emitidas nos perfis genéticos para o cálculo da massa molecular de cada banda

expressa de acordo com a massa conhecida de cada banda obtida com a utilização do

marcador 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).

Padrões de bandas foram identificados em cada perfil produzido e convertidos em

uma matriz de dados binários, atribuindo-se o valor 1 para a presença de bandas e 0 para sua

ausência. Esta matriz foi utilizada para a estimativa de similaridades genética entre os 40

camarões estudados, utilizando-se o coeficiente de Jacard (MAGURRAN, 1988) e o

agrupamento pelo método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean),

através do módulo Neighbor do pacote PHYLIP versão 3.5 (FELSENSTEIN, 1993).

.

4.4.3. Seleção de Genes Candidatos

A escolha dos genes candidatos foi realizada a partir da análise da expressão gênica

em classes de camarões formadas de acordo com a ocorrência das enfermidades detectadas,

considerando-se os perfis de expressão produzidos em animais infectados e livres das

enfermidades investigadas.

4.4.4. Clonagem dos Genes Selecionados


47

Os fragmentos referentes aos genes selecionados foram excirsados e recuperados do

gel de agarose segundo protocolo modificado de MCKAY (2006). A clonagem destes

fragmentos foi realizada de acordo com recomendações do fabricante do kit pGEM®-T Easy

Vector Systems (PROMEGA®). A ligação dos fragmentos ao plasmídeo pGEM-T (razão

molar 3:1) procedeu a 4 ºC/18 horas. Os produtos ligados foram eletroporados a 2.500 V

(Eletroporador 2510 - EPPENDORF®) em células eletrocompetentes de E. coli TOP10F’.

Após o choque foi adicionado 1 mL de meio SOC (triptona 2%; extrato de levedura 0,5%;

NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM; MgCl2 10 mM; Glucose 20 mM; pH 7,0) pré-aquecido a 37 ºC ao

eletroporado. Com o auxílio de uma alça de Drigalsky plaqueou-se 100 µL da solução

contendo as células eletroporadas com os produtos de ligação em meio contendo LB Ágar

(ampicilina 100 µg/mL, estreptomicina 30 µg/mL, IPTG 0,5 mM e Xgal 80µg/mL). Após

uma incubação a 37 ºC/16 h observou-se o crescimento de colônias brancas e azuis. Para a

extração dos plasmídeos apenas as colônias brancas foram selecionadas.

A partir da colônia selecionada foi feito, com o auxilio de uma ponteira, um inóculo

em 1,5 mL de meio LB caldo (ampicilina 100 µg/mL; estreptomicina 30 µg/mL). Os inóculos

foram incubados a 37 ºC/16 horas. Os plasmídeos foram extraídos de acordo com o método

da lise alcalina (SAMBROOK et al., 1989). Para esta etapa, as células foram ressuspendidas

em 200 µL de tampão GET (glucose 50 mM; EDTA 10 mM; Tris-HCl 25 mM; pH 8,0).

Adicionou-se 200 µL de uma solução NaOH/SDS (NaOH 4 M; SDS 10%) às amostras,

invertendo os tubos suavemente para a homogeneização da mistura. As amostras foram, em

seguida, incubadas a 4 ºC/5 min. Após este período, foram adicionados 200 µL de acetato de

potássio 3M, invertendo novamente os tubos, que foram posteriormente centrifugados a

13.000 g/25 ºC/20 min. O sobrenadante foi coletado e transferido para novos microtubos de

1,5 mL. Aos volumes transferidos foram adicionados 2/3 de isopropanol 100% e

centrifugados a 13000 g/25 ºC/30 min. Descartou-se o sobrenadante, lavou-se o precipitado

com etanol 70% e centrifugaram-se novamente as amostras a 13.000 g/25 ºC/30 min. O etanol

foi descartado e os tubos invertidos sobre um papel toalha para secagem sob temperatura

ambiente durante 10 minutos. Os plasmídeos foram recuperados em 50 µL de água ultrapura

estéril.

A confirmação da transformação dos clones se deu a partir da amplificação por PCR

de fragmentos de tamanhos correspondentes a cada gene selecionado. Nesta reação foram

utilizados primers específicos para a região M13 presente no plasmídio pGEM-T easy vector

(PROMEGA®, USA): M13 Forward (5’-GTAAAACGACGGCCA-3’) e M13 Reverse (5’-


48

AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’). Em adicional, foram utilizadas as enzimas de

restrição Nde I e Nco I para a digestão de sítios plasmídiais específicos.

4.4.5. Seqüenciamento dos clones transformados

O sequenciamento dos plasmídeos transformados com os genes candidatos foi

realizado no Laboratório de Genética Molecular da Universidade Federal do Ceará (UFC). O

seqüenciamento foi realizado de forma bidirecional, e obedeceu-se especificações do

fabricante do kit DYEnamic ET Dye Terminator (AMERSHAM BIOSCIENCES®) para o

sequenciador MegaBACETM 1000. A reação conteve 4,0 µL do pré-mix proprietário do kit;

1,0 µL do primer M13-F ou M13-R (0,5 µM); e 300-400 ng de DNA plasmidial, completando

o volume final de 10 µL. As amostras foram distribuídas em uma placa de sequenciamento

(Seq. Mix 2) e termocicladas no Primus 96 Plus (MWG-BIOTECH®) em 35 ciclos a 95 ºC/20

s; 54 °C/15 s e 60 °C/90 s. Após este processo, as amostras foram precipitadas pelo método

do isopropanol (SAMBROOK et al., 1989) e ressuspendidas em 10 µL de MegaBACETM

loading solution. As amostras foram homogeneizadas a 10 µL de agarose (0,12%) e

encaminhadas ao seqüenciador automático modelo MegaBACETM 1000 (AMERSHAM

BIOSCIENCES®).


49

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Investigação da Ocorrência de Enfermidades

5.1.1. Diagnóstico Histopatológico

Alterações citológicas características de infecções provocadas pelos vírus da IMN,

IHHN e WSS, assim como por bactérias determinantes da Hepatopancreatite Necrosante

(NHP) e vibrioses, foram observadas nos exames histopatológicos. Através deste estudo foi

possível também a constatação da ocorrência de gregarinas (Nematopsis sp.) no estômago de

alguns camarões investigados. Contudo, nenhuma evidência histopatológica foi encontrada

para os vírus da TS, MB e HP. A histologia tem sido empregada com bastante êxito tanto na

investigação anatomopatológica de camarões como também na avaliação de seus processos

fisiológicos. Este método tem se tornado uma ferramenta de diagnóstico de rotina

imprescindível para a investigação de infecções causadas por vírus, bactérias e parasitas em

organismos aquáticos (REDDINGTON & LIGHTNER, 1994; GUZMÁN & VALLE, 2000).

5.1.1.1. Mionecrose Infecciosa (IMN)

A Mionecrose Infecciosa foi detectada nos camarões 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 19,

21, 22, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 34 e 39 através da observação de danos na musculatura

estriada do abdômen e cefalotórax. Os 22 camarões identificados como positivos para a IMN

foram agrupados de acordo com classificação descrita por PEREIRA et al. (2008) que se

baseiam no grau de severidade da infecção (Fig. 8, 9 e 10) (Tab. IV). A fase inicial da doença

(Grau 1) foi identificada através da detecção de infiltrações hemocíticas focais na musculatura

dos camarões 28, 29, 30, 31 e 32. Já a fase aguda (Grau 2), foi identificada nos camarões 3, 5,

6, 7, 10, 19, 21, 22, 25, 26 e 34 através da observação de necroses coagulativas e edemas nas

fibras musculares, que ocasionalmente eram substituídas pelo tecido conjuntivo. Nestes

animais ainda foram observadas infiltrações hemocíticas musculares e corpos de inclusão

intranucleares com halo de coloração pálida a basofílico em células do tecido muscular. Nos

camarões 1, 2, 4, 8, 9 e 39 foram observadas necroses musculares de liquefação que

eventualmente vinham acompanhadas de infiltrações hemocíticas e fibrose, características da

fase crônica da doença (Grau 3).

Segundo ANDRADE et al. (2007), a presença de um grande número de hemócitos na

musculatura do camarão, especialmente durante as fases pré-aguda e aguda da IMN, sugere


50

que estas células imunológicas poderiam ser as primeiras precursoras no processo de

regeneração das fibras musculares. Esta hipótese corrobora com a pesquisa realizada por

UHRIK et al. (1989), que investigaram o papel dos hemócitos no tecido muscular do lagostim

Astacus fluviatilis.

Tabela IV - Classificação dos camarões identificados como positivos para a IMN de acordo com o grau de severidade da infecção, com base no método descrito por PEREIRA et al.(2008).

Grau de Severidade da Mionecrose Infecciosa

Classificação Grau 1 Grau 2 Grau 3

Camarões 28, 29, 30, 31 e 32. 3, 5, 6, 7, 10, 19, 21, 22,

25, 26 e 34. 1, 2, 4, 8, 9 e 39.

Hipertrofia do órgão linfóide foi observada nos camarões 1, 3, 6, 7, 8, 19, 30, 32 e

34. Entretanto, nenhuma relação direta foi constatada entre este achado e o grau de severidade

da infecção. De acordo com HASSON et al. (1995), a hipertrofia do órgão linfóide em

Figura 8 - Infiltração hemocítica focal no tecido muscular do camarão L. vannamei (Grau 1).

Figura 9 - Necrose muscular de coagulação acompanhada de infiltração hemocítica (Grau 2).

Figura 10 - Necrose muscular de liquefação e fibroses (Grau 3).

50 µm

50 µm 50 µm


51

camarões L. vannamei contaminados com o TSV está diretamente associada a rápida

proliferação e sucessiva morfogênese dos chamados esferóides do órgão linfóide (Lymphoid

Organ Spheroids - LOS), que aparentemente é resultante de uma resposta não específica do

sistema imune do camarão contra uma variedade de agentes patogênicos. No presente estudo,

a ocorrência dos LOS nos animais acometidos pela IMN se limitou aos camarões que

apresentavam o órgão linfóide hipertrofiado, porém estudos posteriores devem ser

implementados para a confirmação desta relação em camarões infectados pelo IMNV. A

figura 11 mostra a presença destes esferóides em um camarão acometidos com a IMN.

Além das enfermidades provocadas pelo TSV e IMNV, a presença de esferóides no

órgão linfóide está também associada a outras seis doenças de etiologia viral que acometem

peneídeos: (1) vírus da vacuolização do órgão linfóide (lymphoid organ vacuolization vírus,

LOW) (BONAMI et al., 1992); (2) parvo-like vírus linfoidal (lymphoidal parvo-like virus,

LPV) (OWENS et al., 1991); (3) vírus do órgão linfóide (lymphoid organ vírus, LOV)

(SPANN et al., 1995); (4) rabdovírus de camarões peneídeos (rhabdovirus of penaeid shrimp,

RPS) (NADALA et al., 1992); (5) vírus da cabeça amarela (yellow head virus, YHV)

(FLEGEL et al., 1992); e (6) nodavírus de Penaeus vannamei (Penaeus vannamei nodavirus,

PvNV) (TANG et al., 2007). Curiosamente, todos os vírus relacionados com a presença de

LOS em camarões infectados contêm o RNA como material genético, o que sugere que a

ocorrência deste achado anatomopatológico possa estar atribuída a esta condição.

Em alguns camarões analisados foi constatada a presença de esferóides ectópicos do

órgão linfóide, especialmente nas proximidades da glândula antenal e na musculatura estriada

de camarões com sintomas evidentes da IMN (Fig. 12 e 13). De acordo com LIGHTNER et

Figura 11 - Corte histológico mostrando a presença de esferóides no órgão linfóide de um camarão com a IMN (setas).

50 µm


52

al. (2004), estes esferóides ocorrem geralmente em camarões que se encontram em estágios

mais avançados da IMN, sendo comumente detectados no hemocelo e no tecido conjuntivo

frouxo, especialmente no lúmen do coração e próximo a glândula antenal.

Em virtude da ocorrência de esferóides no órgão linfóide ou ectópicos ser

relacionada a uma variedade de infecções virais, a detecção destas alterações fisiológicas em

camarões por histopatologia não pode ser considerada como conclusiva para o diagnóstico de

uma enfermidade específica, sendo, portanto necessário a implementação de métodos

complementares de detecção da doença investigada (HASSON et al., 1999).

5.1.1.2. Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHN)

A enfermidade causada pelo vírus da infecção hipodermal e necrose hematopoiética

(IHHNV) foi detectada nos camarões 1, 11 e 19 através da observação de corpos de inclusão

intranucleares do tipo Cowdry A (CAI’s), identificados especialmente nas células das

brânquias e/ou estômago dos animais investigados (Fig. 14 e 15). Segundo LIGHTNER

(1996a), o diagnóstico por histopatologia da IHHN pode ser realizado através da detecção de

corpos de inclusão intranucleares do tipo Cowdry A, bastante proeminentes e com cromatina

marginal. Quando o processamento histológico aplicado inclui a fixação do camarão com

solução de Davidson e coloração de seus tecidos por H&E, estes corpos de inclusão

apresentam uma coloração eosinofílica e podem ser encontrados tanto em tecidos de origem

ectodérmica quanto mesodérmica.

Figura 12 - Fotomicrografia de um camarão acometido com a IMN mostrando a presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide no tecido muscular (setas).

Figura 13 - Glândula antenal de um camarão acometido com a IMN. A seta indica a presença de esferóides ectópicos do órgão linfóide.

50 µm50 µm


53

Contudo, poucos CAI’s característicos da IHHN foram observados nos camarões

diagnosticados na atual pesquisa, o que pode sugerir, segundo sistema de gradeamento

proposto por LIGHTNER (1996a), a inclusão destes camarões na classificação Grau 1 de

infecção, que considera a quantidade de corpos de inclusão detectados por campo analisado

em microscópio de luz. Apesar do IHHNV não causar letalidade a espécie L. vannamei, que

demonstra certa resistência ao vírus, a infecção provocada por este agente pode causar a

síndrome do nanismo deformativo (RSD) (CHAYABURAKUL et al., 2005).

Segundo (ALVAREZ-BORREGO & CHÁVEZ-SÁNCHEZ, 2001), a identificação

por histopatologia de corpos de inclusão característicos da IHHN pode ser dificultada pela

multiplicidade de órgãos passiveis de infecção. Os autores ressaltam ainda que variações no

tamanho e na coloração dos CAI’s em decorrência do ciclo viral e de peculiaridades do órgão

afetado podem também ser consideradas como fatores críticos de sua identificação. No

entanto, métodos alternativos podem ser utilizados na identificação de corpos de inclusão do

IHHNV. Estes métodos incluem a análise de imagens digitais de tecidos e órgão processados

por histologia (digital color correlation) ou a detecção in situ de seqüências genéticas

específicas (Hibridização in situ) (ALVAREZ-BORREGO & CHÁVEZ-SÁNCHEZ, 2001;

HSIEH et al., 2006a).

5.1.1.3. Síndrome da Mancha Branca (WSS)

Corpos de inclusão do tipo Cowdry A típicos da síndrome da mancha branca (WSS)

foram identificados nos camarões 6, 8, 18, 21, 27, 30, 34 e 35, nos quais foram detectados

predominantemente em células do estômago, exceto para a amostra 35, onde foram

observados também nas brânquias. Segundo RODRÍGUEZ et al. (2003), a histopatologia de

Figura 14 - Corpo de inclusão do tipo Cowdry A nas brânquias do camarão L. vannamei (seta).

Figura 15 - Corpos de inclusão do tipo Cowdry A no estômago do camarão L. vannamei (setas).

20 µm 20 µm


54

camarões infectados com o WSSV revela a presença de corpos de inclusão intranucleares do

tipo Cowdry A, comumente encontrados em células do epitélio cuticular e do tecido

conjuntivo, e menos freqüentemente, nas células do epitélio da glândula antenal, membrana

do órgão linfóide, tecido hematopoiético e do coração.

Os CAI’s detectados nos camarões 18, 21, 27, 30 e 34 se mostraram semelhantes aos

encontrados para a enfermidade causada pelo IHHNV (Fig. 16), enquanto que nos camarões

6, 8 e 35, estes se apresentaram bem desenvolvidos e sem cromatina marginalizada (Fig. 17).

Segundo LIGHTNER (1996a), durante a fase inicial do desenvolvimento da WSS, os CAI’s

são eosinofílicos e com cromatina marginalizada, podendo muitas vezes ser confundidos com

os CAI’s característicos da IHHN. Por outro lado, em estágios mais avançados, os CAI’s são

maiores, mais desenvolvidos, e não possuem halo marginal, sendo, portanto, mais facilmente

relacionados ao WSSV. Os CAI’s detectados nesta pesquisa tiveram sua etiologia

comprovada a partir da detecção por PCR convencional e Nested PCR de fragmentos

genéticos específicos dos vírus da IHHN ou WSS, respectivamente (ver 5.1.2).

Os camarões acometidos com a WSS foram agrupados de acordo com sistema de

gradeamento sugerido por LIGHTNER (1996a) para a estimativa do grau de severidade da

infecção pelo WSSV (Tab. V), análogo ao proposto para a IHHN.

Tabela V - Classificação dos camarões identificados como positivos para a WSS de acordo com o grau de severidade da infecção, segundo sistema de gradeamento proposto por LIGHTNER (1996a).

Grau de Severidade da Síndrome da Mancha Branca

Classificação Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4

Camarões 18, 21, 27, 30 e 34 6, 8 e 35 - -

Figura 16 - Microfotografia mostrando corpo de inclusão do tipo Cowdry A no epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei (seta).

Figura 17 - Microfotografia mostrando corpos de inclusão do tipo Cowdry A no epitélio subcuticular do estômago do camarão L. vannamei (setas).

20 µm20 µm


55

5.1.1.4. Hepatopancreatite Necrosante (NHP)

A análise histopatológica do hepatopâncreas dos camarões 5 e 8 indicou alterações

citológicas características da ação da bactéria da Hepatopancreatite Necrosante (NHP), que

incluiu a observação de deformação e ausência de células epiteliais nos túbulos do

hepatopâncreas dos referidos animais (Fig. 18 e 19).

A NHP em camarões pode ser detectada em exames histopatológicos pela

observação de atrofia do hepatopâncreas e lesões granulomatosas multifocais envolvendo um

ou mais túbulos do órgão, decorrentes da multiplicação bacteriana no citoplasma das células

epiteliais tubulares (LIGHTNER, 1996a). Estas lesões podem ser representadas por necroses,

melanizações e pela deformação dos túbulos do hepatopâncreas, resultante do desprendimento

das células B e R. A infecção por NHP pode, eventualmente, vir acompanhadas de infiltrações

hemocíticas (JIMENEZ et al., 1997).

5.1.1.5. Vibrioses

Características sugestivas de vibrioses como necroses focais nas brânquias e/ou

infiltrações hemocíticas no hepatopâncreas foram observadas nos camarões 1, 2, 4, 8, 24 e 34

(Fig. 20 e 21). Contudo, apenas infecções brandas foram detectadas para a referida

enfermidade. Segundo QUINTANA et al. (2004), a histopatologia que se utiliza do método

de coloração por H&E em tecidos de camarões com vibrioses, pode revelar a presença de

Figura 19 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão mostrando uma proeminente deformação tubular e ausência de células B e R.

Figura 18 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão demonstrando deformação moderada dos túbulos.

200 µm 200 µm


56

infiltrações hemocíticas, necroses focais e formação de nódulos no órgão linfóide, coração,

brânquias, hepatopâncreas, epitélio cuticular ou tecido conjuntivo.

LOTZ & DAVIDSON (2001), afirmam que as enfermidades bacterianas são mais

nocivas aos camarões durante os estágios iniciais da vida quando comparados a juvenis e

adultos. Entretanto, nestes últimos estágios, a infecção bacteriana pode ser agravada em

decorrência de fatores condicionantes de estresse como altas densidades de cultivo, má

qualidade da água, erros de manejo ou variações bruscas de temperatura e salinidade, que

contribuem também para o aumento da susceptibilidade do camarão a outros patógenos

presentes no sistema de cultivo.

5.1.1.6. Gregarinas

Gregarinas da espécie Nematopsis sp. foram observadas no trato digestório de 12

animais, camarões 6, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 24, 27, 36 e 39 (Fig. 22). No entanto,

nenhuma alteração citológica foi detectada no estômago ou intestino destes animais. A

infecção provocada por gregarinas pode causar sérios danos ao epitélio intestinal, o que pode

prejudicar sensivelmente a absorção de nutrientes, e conseqüentemente, interferir no

crescimento e sanidade do animal (JIMÉNEZ-SANTISTEVAN, 1991). Segundo

SAAVEDRA-BUCHELI et al. (2008), a ocorrência deste endoparasita em camarões

independe da condição de sanidade do animal, estando, portando, mais relacionada a fatores

do ambiente, especialmente a sazonalidade. Os autores ressaltam que as maiores incidências

Figura 20 - Necrose focal em uma lamela branquial do camarão L. vannamei (seta).

Figura 21 - Corte histológico do hepatopâncreas do camarão L. vannamei mostrando uma infiltração hemocítica entre os túbulos do órgão.

20 µm 20 µm


57

de gregarinas em viveiros de cultivo de camarões na Colômbia ocorrem, principalmente,

durante a época seca (estio), em decorrência da baixa variação de salinidade neste período.

Uma expressiva relação foi observada entre a ocorrência de gregarinas e do WSSV

nos camarões em estudo, onde dentre os 12 camarões infectados com gregarinas, 8 estavam

também infectados com o WSSV. Uma relação também significativa entre a ocorrência destes

dois agentes foi referida durante o surto da WSS ocorrido no Estado de Santa Catarina no ano

de 2004 (SEIFFERT, 2005). Estes achados sugerem maiores investigações a cerca do papel

das gregarinas sobre a incidência do WSSV em camarões ou mesmo da possibilidade destes

endoparasitas funcionarem como vetores potenciais da doença.

Dada a dificuldade de se identificar certas alterações citológicas inerentes à ação de

alguns patógenos em camarões por exames histopatológicos, métodos adicionais devem ser

utilizados na obtenção de um diagnóstico conclusivo (PANTOJA & LIGHTNER, 2008).

Segundo FLEGEL et al. (2004), presença de camarões assintomáticos para determinadas

enfermidades também sugere a utilização de métodos de diagnósticos alternativos a

histopatologia de camarões, como os que utilizam princípios moleculares de detecção.

5.1.2. Diagnóstico Molecular

Dentre as enfermidades investigadas por métodos moleculares foram detectados

fragmentos genéticos correspondentes aos vírus da IMN, IHHN e WSS. Porém, nenhuma

positividade foi constatada para os vírus da TS e do MB também investigados. Atualmente,

metodologias que se utilizam de sondas genéticas estão cada vez mais difundidas, não

Figura 22 - Gregarinas Nematopsis sp. em diferentes estágios de seu ciclo de vida (trofozoítos e gametocistos) no estômago do camarão L. vannamei.

200 µm


58

somente no diagnóstico de enfermidades, mas também em pesquisas relacionadas a

mecanismos de infecção, patogenicidade e da defesa imune do hospedeiro (MARQUES et al.,

2006).

5.1.2.1. Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV)

Fragmentos de 328 pb referente ao gene codificante das proteínas do capsídeo e

RNA-binding do IMNV foram detectados através de sua amplificação por RT-PCR em duas

etapas nos camarões 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 19, 21, 25, 26, 30 e 34 (Fig. 23 e 24). A

metodologia da RT-PCR tem sido amplamente desenvolvida para o diagnóstico do IMNV,

tendo demonstrado maior sensibilidade de detecção quando comparada a utilização de kits

comerciais de diagnóstico (PINHEIRO et al., 2007; SENAPIN et al., 2007).

Figura 23 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da RT-PCR de detecção do IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 328 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).

Figura 24 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da RT-PCR de detecção do IMNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 328 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).


59

5.1.2.2. Vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV)

O IHHNV foi detectado nos camarões 1, 11, 15, 16 e 19 a partir da amplificação por

PCR convencional de um fragmento de 389 pb referente ao gene da proteína não-estrutural 1

(NS1) do vírus investigado (Fig. 25). TANG & LIGHTNER (2002b) estudando a

variabilidade do IHHNV nas Américas, encontraram uma taxa de substituição de nucleotídeos

de apenas 0,6% na região referente ao gene da proteína NS1, o que evidencia o alto nível de

conservação da região estudada.

FEIJÓ et al. (2008) investigando a variabilidade genética do IHHNV em camarões

da espécie Farfantepenaeus subtilis, certificaram que o vírus presente nos sistemas de cultivo

do Nordeste brasileiro apresenta elevado índice de similaridade com as cepas isoladas no

Havaí, mostrando uma grande consistência em termos geográficos com similaridades

diminuindo claramente a partir das Américas em direção ao Oceano Índico. Com estes

resultados, os autores comprovaram que não há uma variação significante do IHHNV

encontrado em fazendas do Nordeste brasileiro ao ponto de comprometer a detecção da

enfermidade por métodos moleculares que se utilizam de sondas específicas para o vírus

encontrado no Havaí. Contudo, é necessário que haja um monitoramento periódico a fim de

Figura 25 - Gel de agarose 1% referente à PCR de detecção do IHHNV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 389 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).


60

verificar possíveis variações genéticas do IHHNV e de outros vírus presentes nos cultivos

brasileiros.

5.1.2.3. Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV)

Na detecção molecular do vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) por Nested

PCR foram amplificados fragmentos referentes ao gene WSBV Sal1 1461 bp em amostras dos

camarões 6, 8, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 24, 25, 27, 28, 30, 31, 34, 35 e 36 (Fig. 26 e 27). A

técnica de Nested PCR permite a detecção de vírus de DNA em duas etapas de amplificações

de fragmentos genéticos específicos, sendo considerada até dez vezes mais sensível do que o

método de detecção que se utiliza apenas de uma etapa de amplificação (PCR convencional)

(AYUB et al., 2008). Estas duas ferramentas de diagnóstico foram recentemente validadas

para a detecção do WSSV em cultivos de camarões na Tailândia, onde demonstraram índices

de 100% de especificidade e 97,3% de sensibilidade, quando respeitados os números de

cópias virais detectáveis por ambas as técnicas, ou seja, no mínimo 1000 cópias virais para a

detecção por PCR convencional e de 100 cópias por Nested PCR (SRITUNYALUCKSANA

et al., 2005).

Figura 26 - Gel de agarose 1% referente à 1º etapa da Nested PCR de detecção do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 1447 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).

Figura 27 - Gel de agarose 1% referente à 2º etapa da Nested PCR de detecção do WSSV. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (C+) Controle Positivo: 941 pb; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).


61

Interessantemente, a amplificação de fragmentos genéticos virais nas referidas

amostras só pôde ser visualizada na segunda etapa da Nested PCR. A detecção por Nested

PCR do WSSV em camarões da espécie Penaeus monodon antes e depois do processo de

desova, mostrou, através da detecção do vírus na primeira ou segunda etapa da técnica, que o

estresse gerado por esta condição fisiológica pode funcionar como um gatilho da replicação

viral (HSU et al., 1999). Segundo OTTA et al. (2003), a Nested PCR pode ser utilizada como

um método semi-quantitativo da carga viral em camarões infectados pela diferença de

sensibilidade de detecção entre as duas etapas de amplificação do método. Deste modo, a não

detecção do WSSV na primeira etapa da Nested PCR empregada na atual pesquisa pode

implicar na presença de baixa carga viral nos camarões investigados.

5.1.3. Diagnóstico Conclusivo

A utilização simultânea de métodos de detecção de enfermidades em camarões tem

sido amplamente empregada em seus diagnósticos e envolve a combinação de metodologias

baseadas em princípios moleculares, histopatológicos, químicos e imunológicos (DHAR et

al., 2001; HOSSAIN et al., 2004; KASORNCHANDRA et al., 1998; PHALITAKUL et al.,

2006). A sensibilidade e especificidade dos métodos de diagnósticos utilizados na

investigação de enfermidades em camarões são requisitos de fundamental importância,

particularmente na detecção de enfermidades virais (QUÉRÉ et al., 2002).

Através dos métodos histopatológicos e/ou moleculares empregados no diagnóstico

dos 40 camarões investigados, identificaram-se evidências da ocorrência do IMNV (55%),

WSSV (42,5%), gregarinas (30%), vibrioses (15%), IHHNV (12,5%) e NHP (5%). Por outro

lado, nenhuma evidência foi encontrada para os vírus da TS, MB e HP. As evidências

detectadas corresponderam a amplificação de fragmentos genéticos específicos do agente

patogênico, alterações citológicas característica da ação de determinados patógenos ou da

observação do agente etiológico da doença através da histopatologia. A presença de pelo

menos uma destas evidências foi considerada como determinante para o diagnóstico de

enfermidades no presente estudo.

Dentre os 40 camarões investigados, 34 foram diagnosticados como portadores de

pelo menos uma enfermidade, sendo também verificada a presença de duas, três e até quatro

enfermidades em um mesmo camarão. A ausência de evidências de enfermidades nos

camarões 12, 23, 33, 37, 38 e 40 nos permitiu classificá-los como saudáveis ou livres das

enfermidades investigadas. A ocorrência de dupla infecção viral foi detectada nos camarões 1,


62

6, 8, 15, 16, 19, 21, 25, 28, 30, 31 e 34, sendo na maioria dos casos observadas a presença

simultânea do IMNV e WSSV (66,66%) (Tab. VI). A ocorrência de múltiplas infecções em

camarões já foi anteriormente observada através de alterações citopatológicas inerentes a

quatro enfermidades provocadas pelos vírus WSS, IHHN, YH e MB em um único animal,

porém não houve confirmação do diagnostico por ferramentas moleculares (MADHAVI et

al., 2002). Embora a presença de vários agentes patológicos de etiologia viral em um mesmo

hospedeiro seja pouco relatada para crustáceos, a identificação histopatológica e/ou molecular

de duplas infecções virais é bastante comum em camarões cultivados (MOHAN et al., 1998;

NATIVIDAD et al., 2006; OTTA et al., 2003; QUÉRÉ et al., 2002). Tabela VI - Diagnóstico conclusivo por técnicas histopatológicas e moleculares de detecção da ocorrência de enfermidades nos camarões destinados ao estudo de prospecção gênica.

Enfermidades /

Amostras IMNV WSSV IHHNV TSV MBV HPV NHP Vibrioses Gregarina

1 +a/+b - +a/+b - - - - +b - 2 +b - - - - - - +b - 3 +a/+b - - - - - - - - 4 +a/+b - - - - - - +b - 5 +a/+b - - - - - +b - - 6 +b +a/+b - - - - - - +c

7 +a/+b - - - - - - - - 8 +a/+b +a/+b - - - - +b +b - 9 +a/+b - - - - - - - -

10 +a/+b - - - - - - - - 11 - - +a/+b - - - - - +c 12 - - - - - - - - - 13 - +a - - - - - - +c 14 - - - - - - - - +c 15 - +a +a - - - - - +c 16 - +a +a - - - - - - 17 - +a - - - - - - +c 18 - +a/+b - - - - - - +c 19 +a/+b - +a/+b - - - - - - 20 - - - - - - - - +c 21 +a/+b +a/+b - - - - - - - 22 +b - - - - - - - - 23 - - - - - - - - - 24 - +a - - - - - +b +c 25 +a/+b +a - - - - - - - 26 +a/+b - - - - - - - - 27 - +a/+b - - - - - - +c 28 +b +a - - - - - - - 29 +b - - - - - - - - 30 +a/+b +a/+b - - - - - - - 31 +b +a - - - - - - - 32 +b - - - - - - - - 33 - - - - - - - - - 34 +a/+b +a/+b - - - - - +b - 35 - +a/+b - - - - - - - 36 - +a - - - - - - +c


63

37 - - - - - - - - - 38 - - - - - - - - - 39 +b - - - - - - - +c 40 - - - - - - - - -

Percentual de Infectados 55% 42,5% 12,5% 0% 0% 0% 5% 15% 30%

+a - Detecção de fragmentos genéticos específicos do agente patogênico.

+b - Detecção de alterações citológicas característica da ação do patógeno.

+c - Identificação do agente etiológico por histopatologia.

Um quadro clínico assintomático para as enfermidades da IHHN e da WSS foi

observado para os camarões 15 e 16 (IHHN); e 13, 15, 16, 17, 24, 25, 28, 31 e 36 (WSS). A

presença de camarões assintomáticos para algumas enfermidades em sistemas de cultivo do L.

vannamei pode implicar na tolerância ou resistência das populações cultivadas ao agente

determinante da doença (BOADA et al., 2008; FLEGEL, 2001).

A tolerância viral em crustáceos é definida como sendo uma adaptação a novos vírus

através do desenvolvimento de uma espécie de memória específica utilizada na inibição do

mecanismo de apoptose induzida pelo agente patogênico. Esta condição de tolerância

contrasta com a de resistência viral, na qual corresponde a eliminação definitiva do agente

etiológico pelos sobreviventes, que apesar de não se infectarem, esboçam sinais evidentes de

defesa relacionada à resposta imune (FLEGEL et al., 2007). Contudo, a distinção entre

camarões tolerantes e resistentes a infecções virais somente é possível sob condições

experimentais específicas de bioensaios, especialmente devido, dentre outros fatores, à

necessidade da certeza de exposição de todos os animais analisados ao agente patogênico

investigado (FLEGEL, 2001). É importante ressaltar a ocorrência de integrações genômicas

virais em camarões, especialmente por vírus de DNA, em virtude da possibilidade de

diagnósticos falsos positivos para a presença de camarões assintomáticos nos sistemas de

cultivos (TANG & LIGHTNER, 2006). Segundo VAN BLERKOM (2003), o genoma de

quase todos os vírus de DNA é constituído por DNA de fita dupla, semelhante ao genoma das

células que infectam. Essa similaridade em estrutura e replicação propicia a esses vírus de

DNA uma relação molecular muito íntima com o genoma de seus hospedeiros, ao qual são

capazes de se integrar, sendo transmitidos para a próxima geração como se fosse uma

característica mendeliana.

De forma interessante, o exame histopatológico dos camarões 2, 6, 22, 28, 29, 31, 32

e 39 indicou a presença de sintomas anatomopatológicos característicos da enfermidade

provocada pelo IMNV, sem, no entanto, haver a confirmação da presença deste agente por

método molecular de detecção. TANG et al. (2007) investigando camarões L. vannamei


64

cultivados em Belize, detectaram sinais clínicos e alterações citológicas características da

IMN. Porém, nenhuma positividade para o IMNV foi detectada através do emprego de

técnicas moleculares como RT-PCR e Hibridização in situ, o que sugeriu que a enfermidade

fosse causada por outro agente patogênico. O seqüenciamento de 928 pb de um inserto

genômico obtido a partir do RNA total de camarões infectados indicou 69% de similaridade

quando comparado a seqüências do MrNv (Macrobrachium rosenbergii nodavirus), revelando

a descoberta de um novo vírus denominado de PvNv (Penaeus vannamei nodavírus). Além da

possibilidade de ocorrência deste novo agente viral nos camarões investigados na atual

pesquisa, outros fatores como a ocorrência de variantes genéticas virais, variação da carga

viral ou a eficiência do sistema de defesa do hospedeiro podem ter influenciado a não

identificação do IMNV em algumas amostras por método molecular.

Recentemente, a detecção do WSSV por PCR no México foi dificultada pela

presença de três variantes genéticas do vírus neste país, o que impossibilitou a amplificação

da região alvo do genoma do WSSV a partir de primers desenvolvidos para a detecção de

apenas uma variante conhecida do vírus. Vários camarões diagnosticados como positivo para

a enfermidade através de exames histopatológicos não tiveram o diagnóstico confirmado por

PCR (GALAVÍZ-SILVA et al., 2004). A ocorrência de variantes genéticas virais em cultivos

de camarões já foi relatada também para os vírus IHHN, MB, HP, TS e YH (CÔTÉ et al.,

2008; DOUBROVSKY et al., 1988; KRABSETSVE et al., 2004; PHROMJAI et al., 2001;

WIJEGOONAWARDANEA et al., 2008). De acordo com LAKE et al. (1999), o processo de

replicação dos vírus de RNA, como no caso dos TSV, YHV e IMNV, é mais propenso a erros,

com elevadas taxas de substituição de nucleotídeos (de 10 a 100 mil vezes maior que as de

vírus de DNA) pelas enzimas virais, que tipicamente não possuem sistema de reparo.

Segundo HSU et al. (1999), existe a possibilidade de variação do número de

partículas virais em diferentes pleópodos provenientes do mesmo espécime de camarão, o que

geralmente implica na obtenção de resultados falsos negativos por métodos que se utilizam de

sondas genéticas. Deste modo, a detecção do IMNV pela técnica de RT-PCR utilizada no

atual estudo poderia ter sido inibida em decorrência da quantidade de partículas virais

presente nos pleópodos dos animais investigados. Todavia, outros autores validam a utilização

de pleópodos de camarões como uma forma não destrutiva de investigação de enfermidades

por ferramentas moleculares, incluindo a PCR (BELL & LIGHTNER, 1990). Um estudo

comparativo entre a sensibilidade das técnicas de Dot Blot e PCR para a detecção do WSSV

em diferentes tipos de tecidos do camarão Penaeus monodon como cutícula, pleópodos,

pereiópodos, urópodos, telson, brânquias e pendúculo ocular, indicou que apesar da eficiência


65

da detecção deste vírus por ambas as metodologias em amostras de pleópodos, pereiópodos,

urópodos e pendúculo ocular, os métodos se mostraram mais sensíveis quando da utilização

de tecidos da cutícula, telson e brânquias, respectivamente (SHEKHAR et al., 2006).

A presença de esferóides no órgão linfóide ou ectópicos nos camarões acometidos

pelo IMNV pode ter resultado na diminuição ou eliminação da carga viral nos camarões

investigados. BELL & LIGHTNER (1988a) consideram o órgão linfóide como um

componente integrante do sistema circulatório do camarão, tendo como função básica a

filtragem da hemolinfa do animal. Segundo VAN DE BRAAK et al. (2002b), o órgão linfóide

parece participar dos processos de eliminação e depuração dos agentes patogênicos por meio

de fagocitose, resultando em muitos casos, na formação de corpos esferoidais durante as

infecções. Contudo, ainda não está claro se o processo de fagocitose ocorre no órgão linfóide

ou se os hemócitos contendo os microorganismos já fagocitados migram para este órgão no

intuito de se realizar a depuração.

5.2. Produção e Análise dos Perfis de Expressão Genética

5.2.1. Perfis de Expressão Gênica por DDRT-PCR

A técnica de Differential Display utilizada na produção dos perfis genéticos envolveu

a reação em cadeia da polimerase a partir da transcrição reversa do ácido ribonucléico total,

sendo por isso comumente denominada de DDRT-PCR (Differential Display Reverse

Transcription - polimerase chain reaction). Esta metodologia foi descrita originalmente por

LIANG & PARDEE (1992), com o intuito de prover uma ferramenta efetiva para a detecção e

identificação de espécies de mRNA expressos diferencialmente em distintos processos

celulares de eucariotos.

Na presente pesquisa, dentre as combinações de primers utilizadas na DDRT-PCR,

apenas a combinação A1R1 não obteve êxito na amplificação dos perfis de expressão. No

entanto, para as combinações A1R2, A1R3, A2R4, A2R5, A2R6, A3R7, A3R8, A3R9,

A4R10, A4R11 e A4R12 foram produzidos excelentes perfis genéticos (Fig. 28 e 29). De

acordo com STURTEVANT (2000), a DDRT-PCR pode ser utilizada de forma rápida e

eficiente na identificação de qualquer gene expresso diferencialmente, permitindo a

determinação de perfis de transcrição com base qualitativa ou semi-quantitativa.


66

A1R2 A1R3A1R1

A2R4 A2R5 A2R6

Figura 28 - Géis de agarose 2% referentes às DDRT-PCR para as combinações A1R1, A1R2, A1R3, A2R4, A2R5 e A2R6. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).


67

5.2.2. Estimativa de Similaridades Genéticas

A estimativa das similaridades genéticas entre os camarões estudados foi

determinada pela expressão ou supressão de 73 genes detectados nos padrões de bandas de

cada perfil de expressão gênica produzido.

O dendograma abaixo, construído pelo método de UPGMA, mostra a distribuição dos

camarões investigados em dois grupos segundo as similaridades genéticas estimadas pelo

cálculo do índice de Jacard (Fig. 30).

A3R7 A3R8 A3R9

A4R10 A4R11

Figura 29 - Géis de agarose 2% referentes às DDRT-PCR para as combinações A3R7, A3R8, A3R9, A4R10, A4R11 e A4R12. Poços: (1-40) Amostras; (C-) Controle Negativo; (Kb) Marcador: 1 Kb DNA Plus (INVITROGEN®).

A4R12


68

5.2.3. Identificação e Quantificação da Expressão Gênica Diferencial

A expressão diferencial de 24 genes foi detectada e quantificada através do programa

de computador KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®) nos perfis de expressão

gênica dos 40 camarões submetidos a DDRT-PCR (Tab. VII). VENKATESH et al. (2005)

investigando o efeito de metabólitos secundários da canola Brassica napus sobre o

transcriptoma do fungo Leptosphaeria maculan validaram método para o estudo semi-

quantitativo da expressão gênica através da análise de imagens digitalizadas referentes à

perfis genéticos produzidos pela DDRT-PCR.

Grupo 1

Grupo 2

Figura 30 - Dendograma das similaridades genéticas dos 40 camarões L.vannamei investigados, definido pelo método de agrupamento UPGMA, baseado no cálculo do índice de Jacard a partir dos perfis de expressão gênica produzido pela DDRT-PCR.


69

Tabela VII - Detecção e quantificação da expressão diferencial de genes nos perfis genéticos produzidos pela DDRT-PCR através do programa KODAK 1D Image Analysis Software (KODAK®).

- * Expressão identificada, porém não quantificada em virtude da sensibilidade do software empregado.

- Unidade: ng

5.3. Prospecção de Genes Relacionados às Enfermidades Detectadas

5.3.1. Seleção de Genes Candidatos

O status sanitário dos camarões diagnosticados na presente pesquisa permitiu o

agrupamento de classes diferenciais destinadas a prospecção gênica relacionada ao

acometimento de doenças provocadas pelo IMNV, WSSV, IHHNV, Víbrios e Gregarinas

(Tab. VIII). Para o estudo de prospecção gênica foram consideradas como representativas


70

apenas as classes diferenciais que continham no mínimo 10% do total dos camarões

investigados.

Vários genes codificadores de proteínas como peptídeos antimicrobianos,

profenoloxidase (proPO), lectinas do tipo-C e like-interferon têm sido identificados e

associados as respostas imunes antivirais ou antibacterianas de camarões peneídeos (DE

LORGERIL et al., 2008; HE et al., 2005; LUO et al., 2003; LUO et al., 2006;

SRITUNYALUCKSANA et al., 1999; ZHANG et al., 2004). A investigação da expressão de

genes codificadores de enzimas relacionadas à atividade imune de camarões tem sido

direcionada principalmente para prospecção gênica em células de hemócitos ou tecidos

passiveis de serem infiltrados por estas células como brânquias, coração, hepatopâncreas,

tecido hematopoiético e muscular (HSIEH et al., 2006; WANG et al., 2006).

WANG et al. (2008a), demonstrou existir alguma especificidade no padrão de

expressão gênica produzido por camarões Fenneropenaeus chinensis infectados com o WSSV

ou Víbrios. No entanto, a ocorrência de duplas ou múltiplas infecções em camarões parece ter

influência significativa sobre a expressão de alguns genes expressos diferencialmente.

Recentemente, YEH et al. (2008) identificaram um decréscimo na expressão dos genes da

LGBP, proPO e PE em hemócitos de camarões L. vannamei co-infectados com os vírus da

IHHN e WSS quando comparados com camarões infectados apenas com o WSSV. Estudos

anteriores já evidenciavam esta interação viral ao demonstrar a influência do IHHNV na

redução da patogenicidade do WSSV em camarões peneídeos pré-infectados com o WSSV

(BONNICHON et al., 2006; TANG et al., 2003).

Tabela VIII - Agrupamentos dos camarões em classes diferenciais de acordo com a ocorrência de enfermidades.

AGRUPAMENTO I

Classes diferenciais (1) Camarões

Infectados com o IMNV

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 19, 21,

22, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 34 e

39

Infectados com o IMNV (Grau 1) 28, 29, 30, 31 e 32

Infectados com o IMNV (Grau 2) 3, 5, 6, 7, 10, 19, 21, 22, 25, 26 e

34

Infectados com o IMNV (Grau 3) 1, 2, 4, 8, 9 e 39

Infectados somente com o IMNV 3, 7, 9, 10, 22, 26, 29 e 32

Livres do IMNV 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20,

23, 24, 27, 33, 35, 36, 37, 38 e 40


71

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO II


Infectados com o IMNV+WSSV 6, 8, 21, 25, 28, 30, 31 e 34

Infectados somente com o IMNV+WSSV 21, 25, 28, 30 e 31

Livres do IMNV+WSSV

1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24,

26, 27, 29, 32, 33, 35, 36, 37, 38,

39 e 40

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO III


Infectados com o IMNV+Vibrios 1, 2, 4, 8 e 34

Livres do IMNV+Vibrios

3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,

35, 36, 37, 38, 39 e 40

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO IV


Infectados com Vibrios 1, 2, 4, 8, 24 e 34

Livres de Víbrios

3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25,

26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35,

36, 37, 38, 39 e 40

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO V


Infectados com o WSSV 6, 8, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 24, 25,

27, 28, 30, 31, 34, 35 e 36

Livres do WSSV

1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 19,

20, 22, 23, 26, 29, 32, 33, 37, 38,

39 e 40

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO VI


Infectados com o WSSV+Gregarinas 6, 13, 15, 17, 18, 24, 27 e 36

Livres de WSSV+Gregarinas 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14,

16, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 28,


72

29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 38,

39 e 40

Infectados somente com o WSSV+Gregarinas 13, 17, 18 e 36

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO VII


Infectados com Gregarinas 6, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 24, 27,

36 e 39

Livres de Gregarinas

1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 19,

21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 37, 38 e 40

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO VIII


Infectados com o IHHNV 1, 11, 15, 16 e 19

Livres de IHHNV

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14,

17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,

36, 37, 38, 39 e 40

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

AGRUPAMENTO IX


Infectados com 1 agente etiológico 3, 7, 9, 10, 14, 20, 22, 26, 29, 32 e

35

Infectados com 2 agente etiológico 2, 4, 5, 11, 13, 16, 17, 18, 19, 21,

25, 27, 28, 30, 31, 36 e 39

Infectados com 3 agente etiológico 1, 6, 15, 24 e 34

Saudáveis 12, 23, 33, 37, 38 e 40

A análise de similaridade genética (ver figura 29) entre os camarões estudados indica

não haver proximidade entre os animais agrupados com base na ocorrência de enfermidades,

o que pode sugerir baixa especificidade da expressão gênica relacionada ao status de sanidade

de cada camarão em estudo. Esta suposição pôde ser confirmada pela identificação e

quantificação da expressão gênica diferencial nos perfis genéticos dos referidos animais. A

quantificação dos níveis de expressão dos genes prospectados no presente estudo não indicou

nenhuma relação com a ocorrência das enfermidades detectadas. Porém, alguns fatores

associados às condições de cultivo dos camarões como o acesso ao alimento ofertado, ciclo de


73

muda, variação genética intraespecífica, variações ambientais, bem como as interações entre

patógenos, podem estar contribuindo na regulação dos genes prospectados.

Contudo, dentre os 24 genes de expressão diferencial detectada na presente pesquisa,

os genes 882-A1R2, 376-A2R6, 842-A2R6, 644-A3R8, 730-A4R10, 930-A4R11 e 500-

A4R12 foram selecionados como candidatos, clonados e seqüenciados, por indicarem

tendências na expressão ou supressão relacionada à ocorrência das enfermidades provocadas

pelo IMNV (842-A2R6 e 644-A3R8); WSSV+IMNV (842-A2R6, 644-A3R8 e 930-A4R11);

WSSV+Gregarinas (730-A4R10 e 930-A4R11); Gregarinas (376-A2R6) e IHHNV (500-

A4R12); bem como por estarem relacionados a quantidade de agentes etiológicos detectados

nos camarões investigados (882-A1R2 e 376-A2R6) (Tab. IX). A análise da expressão

diferencial destes genes indicou potencial relação com a resistência, infecção ou

patogenicidade inerente às enfermidades relacionadas.

Tabela IX - Percentual de camarões de cada classe diferencial com expressão detectada para os genes selecionados.

STATUS DE SANIDADE

PERCENTUAL DE CAMARÕES COM EXPRESSÃO

PARA OS GENES SELECIONADOS

Gen

e 88

2-A

1R2

Gen

e 37

6-A

2R6

Gen

e 84

2- A

2R6

Gen

e 64

4- A

3R8

Gen

e 73

0- A

4R10

Gen

e 93

0- A

4R11

Gen

e 50

0- A

4R12

Cla

sses

di

fere

ncia

is (1

)

Infectados com o IMNV 0,42 0,05 0,52 0,48 0,19 0,23 0,14

Infectados com o IMNV (Grau 1)

0,40 0 1,0 1,0 0,20 0,20 0,20


0,55 0,09 0,36 0,73 0,09 0,09 0,09


0,50 0 0,33 0,17 0,50 0,50 0,17

Infectados somente com o IMNV

0,48 0 0,51 0,25 0,12 0,38 0,38

Livres do IMNV 0,44 0,05 0,44 0,33 0,33 0,05 0,05

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0

Cla

sses

di

fere

ncia

is (2

)

Infectados com o IMNV+ WSSV

0,75 0,13 0,63 0,75 0,12 0 0

Infectados somente com o IMNV+WSSV

0,60 0 0,80 1,00 0,40 0 0,20

Livres do IMNV+WSSV 0,40 0,03 0,43 0,28 0,33 0,19 0,12

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0


74

Cla

sses

di

fere

ncia

is (3

) Infectados com o IMNV+Vibrioses

0,60 0 0,40 0,20 0,20 0,40 0

Livres do IMNV+Vibriose 0,46 0,05 0,48 0,62 0,28 0,11 0,11

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0

Cla

sses

di

fere

ncia

is (4

) Infectados com Vibrios 0,67 0 0,50 0,33 0,33 0,33 0

Livres de Víbrios 0,44 0,05 0,47 0,61 0,26 0,11 0,11

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0

Cla

sses

di

fere

ncia

is (5

) Infectados com o WSSV 0,59 0,12 0,65 0,53 0,17 0 0,05

Livres do WSSV 0,39 0 0,35 0,30 0,35 0,26 0,13

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0

Cla

sses

di

fere

ncia

is (6

)

Infectados com WSSV+Gregarinas

0,50 0,25 0,50 0,25 0,25 0 0,13

Infectados somente com WSSV+Gregarinas

0,50 0 0,75 0 0,25 0 0

Livres de WSSV+Gregarinas

0,47 0 0,47 0,41 0,25 0,19 0,09

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0

Cla

sses

di

fere

ncia

is (7

) Infectados com Gregarinas 0,58 0,17 0,42 0,25 0,25 0 0,08

Livres de Gregarinas 0,43 0 0,50 0,42 0,29 0,22 0,10

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0

Cla

sses

di

fere

ncia

is (8

) Infectados com o IHHNV 0,40 0 0,80 0,60 0,40 0,20 0,20

Livres de IHHNV 0,48 0,05 0,42 0,57 0,28 0,14 0,08

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0

Cla

sses

di

fere

ncia

is (9

)

Infectados com 1 agente etiológico

0,22 0 0,44 0,67 0 0,33 0,22

Infectados com 2 agentes etiológicos

0,26 0 0,35 0,26 0,09 0 0,06

Infectados com 3 agentes etiológicos

0,63 0,25 0,25 0,50 0,50 0,13 0,13

Saudáveis 0,33 0 0,16 0,33 0,67 0,17 0


75

5.3.1. Caracterização dos Genes Selecionados

Dentre os 7 genes candidatos, sequências de nucleotídeos referentes aos genes 882-

A1R2, 730-A4R10 e 842-A2R6 (Anexo 1) foram obtidas e submetidas a uma avaliação de

qualidade através do programa de computador Phred (índice de confiabilidade ≥ 20) (EWING

et al., 1998). As seqüências produzidas foram agrupadas em consenso (clusters) através do

programa CAP3 (Sequence Assembly Program) (HUANG & MADAN, 1999) e analisadas

quanto a homologia às sequências depositadas no banco de dados do GenBank através das

ferramentas BLASTn e BLASTx (disponíveis em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

(ALTSCHUL et al., 1997). Nenhuma homologia foi encontrada para as seqüências referentes

aos genes 882-A1R2 e 730-A4R10. No entanto, a seqüência 842-A2R6 demonstrou 99% de

similaridade nucleotídica com o gene mut-7 que codifica um tipo de RNAse (RNAse D)

envolvida no mecanismo de silenciamento pós-transcricional de genes (RNAi) do nematóide

Caenorhabditis elegans (Nº de acesso: NM_066704.5).

O mecanismo de silenciamento pós-transcricional gênico foi inicialmente descoberto

em plantas e posteriormente em uma variedade de organismos eucarióticos estando

intimamente relacionado ao reconhecimento de moléculas de dsRNA específicas.

Naturalmente, estas moléculas podem ser produzidas a partir da RNA polimerase RNA-

dependente, proveniente de patógenos virais, ou então pela hibridização de transcritos

sobrepostos resultantes da transposição gênica (MEISTER & TUSCHL, 2004). Em

invertebrados, o mecanismo de RNAi já foi descrito para o nematóide C. elegans (FIRE et al.,

1998) e para a mosca Drosophila melanogaster (GOTO et al., 2003), sendo recentemente,

identificado nos camarões P. monodon e L. vannamei através de injeções de moléculas de

dsRNA específicas dos vírus da WSS, TS e YH (ROBALINO et al., 2005; YODMUANG et

al., 2006; TIRASOPHON et al., 2005). Segundo ROBALINO et al. (2007), a identificação do

mecanismo de RNAi por indução experimental em camarões peneídeos, anteriormente citada,

não consiste em prova concreta da utilização natural deste tipo de resposta imune antiviral

específica por estes animais.

Contudo, a expressão da seqüência 842-A2R6 em camarões L. vannamei apresentada

no atual estudo somada a detecção da IMN em 55% dos animais investigados, sugere a

indução natural do mecanismo de silenciamento pós-transcricional (RNAi) no camarão L.

vannamei, evidenciando ainda a capacidade de suas células de reconhecer e acumular dsRNA

viral em ambiente de cultivo.


76

Com base nos resultados obtidos na presente pesquisa, recomenda-se que estudos

futuros sejam implementados no intuito de se confirmar a real potencialidade da utilização

dos marcadores genéticos aqui identificados, em investigações relacionadas à infecção,

resistência ou patogenicidade das enfermidades que acometem o camarão L. vannamei. De

acordo com WANG et al. (2007), a prospecção e caracterização de genes relacionados às

enfermidades de camarões têm sido amplamente empregadas, contribuindo, desta forma, para

um melhor entendimento da imunologia do camarão, ainda de pouco conhecimento científico.

A detecção destes genes têm ainda proporcionado o emprego de biomarcadores genéticos

utilizados na identificação de camarões resistentes ou até mesmo como um método

quantitativo da resposta imune antiviral.


77

6. CONCLUSÕES

Nos 40 camarões L. vannamei investigados foram detectadas por métodos histopatológicos

e/ou moleculares de diagnóstico a ocorrência da IMN (55%), WSS (42,5%) e IHHN

(12,5%), NHP (5%) e vibrioses (15%). Também foi observada a presença de gregarinas

Nematopsis sp. no estômago de 12 camarões (30%).

Foi verificada a ocorrência de até quatro enfermidades por espécime do L. vannamei, com

predominância para as duplas infecções que foram detectadas em 42,5% dos animais

investigados.

A infecção simultânea por IMNV e WSSV, de ocorrência ainda não descrita, foi

pioneiramente detectada em 20% dos camarões L. vannamei investigados no presente

estudo.

A expressiva relação entre a ocorrência de gregarinas e do WSSV nos camarões em estudo

sugere maiores investigações a cerca do papel das gregarinas sobre a incidência do WSSV

em camarões L. vannamei ou mesmo da possibilidade destes endoparasitas funcionarem

como vetores potenciais da doença.

A técnica de Differential Display RT-PCR apresentou eficiência satisfatória na produção

de perfis genéticos do camarão L. vannamei, mostrando também boa relação custo-

benefício.

Através da DDRT-PCR foi possível selecionar 7 genes de expressão diferencial

relacionados à ocorrência de enfermidades provocadas pelo IMNV (842-A2R6 e 644-

A3R8); WSSV+IMNV (842-A2R6, 644-A3R8 e 930-A4R11); WSSV+Gregarinas (730-

A4R10 e 930-A4R11); Gregarinas (376-A2R6) e IHHNV (500-A4R12); e/ou relacionados

a quantidade de agentes etiológicos detectados nos camarões investigados (882-A1R2 e

376-A2R6).


78

Três sequências genéticas inéditas relacionadas à ocorrência de enfermidades do camarão

L. vannamei foram produzidas, sendo duas sequências (882-A1R2 e 730-A4R10) de

homologias indeterminadas e uma (842-A2R6) com 99% de similaridade nucleotídica com

o gene mut-7 que codifica um tipo de RNAse envolvida no mecanismo de silenciamento

pós-transcricional de genes do nematóide C. elegans.

A expressão da seqüência 842-A2R6 em camarões L. vannamei apresentada no atual

estudo somada a detecção da IMN em 55% dos animais investigados, sugere a indução

natural do mecanismo de silenciamento pós-transcricional (RNAi) no camarão L.

vannamei.


79

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADAMS, M. D.; KERLAVAGE, A. R.; FLEISCHMANN, R. D.; FULDNER, R. A, BULT,

C. J.; LEE, N. H.; KIRKNESS, E. F.; WEINSTOCK, K. G.; GOCAYNE, J. D.; WHITE, O.

Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million

nucleotides of cDNA sequence. Nature. v. 377, p. 163-174, 1995.

AKIRA, S. & TAKEDA, K. Toll-Like Receptor signaling. Immunology. v. 4, p. 499-511,

2004.

ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHAFFER, A. A.; ZHANG, Z.; MILLER, W.;

LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database

search programs. Nucleic Acids Research. v. 25, p. 3389-3402, 1997.

ALVAREZ-BORREGO, J. & CHÁVEZ-SÁNCHEZ, M. C. Detection of IHHN vírus in

shrimp tissue by digital color correlation. Aquaculture. v. 194, p. 1-9, 2001.

ANDERSON, I. G.; SHAMSUDIN, M. N.; SHARIFF, M.; NASH, G. Bacterial septicemia in

juvenile tiger shrimp, Penaeus monodon, cultured in Malaysian brackish water ponds. Asian

Fish. Sci. v. 1, p. 93-108, 1988.

ANDRADE, T. P. D.; SRISUVAN, T.; TANG, K. F. J.; LIGHTNER, D. V. Real-time reverse

transcriptase polymerase chain reaction assay using TaqMan probe for detection and

quantification of Infectious myonecrosis virus (IMNV). Aquaculture. v. 264, p. 9-15, 2007.

ANDRADE, T. P. D.; REDMAN, R. M.; LIGHTNER, D. V. Evaluation of the preservation

of shrimp samples with Davidson’s AFA fixative for infectious myonecrosis virus (IMNV) in

situ hybridization. Aquaculture. v. 278, p. 179-183, 2008.

ARTS, J. A. A.; CORNELISSEN, F. H. J.; CIJOUW, T.; HERMSEN, T.; SAVELKOUL, H.

F. J.; STET, R. J. M. Molecular cloning and expression of a Toll receptor in the giant tiger

shrimp, Penaeus monodon. Fish and Shellfish Immunology. v. 23, p. 504-513, 2007.

BACHÈRE, E. Shrimp immunity and disease control. Aquaculture. v. 191, p. 3-11, 2000.


80

BACHÈRE, E.; DESTOUMIEUX, D.; BULET, P. Penaeidins, antimicrobial peptides of

shrimp: a comparison with other effectors of innate immunity. Aquaculture. v. 191, p. 71-88,

2000.

BARBIERI, J. R. C. & OSTRESKY, N. A. Camarões marinhos: Engorda, Aprenda fácil.

157 p., Viçosa, 2002.

BARRACCO, M. A. Mecanismos de resistência a doenças em crustáceos. Sanidade de

organismos aquáticos, Ed. Varela, p. 51-74, 2004.

BARRACCO, M. A.; PERAZZOLO, L. M.; ROSA, R. D. Inmunología del Camarón. In:

MORALES, V. Q &. CUÉLLAR-ANJEL. Patología e Inmumología de Camarones

Penaeidos. Panamá: CYTED-RED II-D: Red Vannamei, p. 171-224, 2008.

BELL, T. A. & LIGHTNER, D. V. A handbook of normal penaeid shrimp histology.

World Aquaculture Society, Boton Rouge, Luisiana, 114 p., 1988a.

BELL, T. A. & LIGHTNER, D. V. IHHNV disease of Penaeus stylirostris: effects of shrimp

size on disease expression. J. Fish Dis. v. 10, p. 165-170, 1988b.

BELL, T. A. &. LIGHTNER, D. V. A biopsy procedure for the non-destructive determination

of IHHN virus infection in Penaeus vannamei. J. Aquatic Animal Health. v. 2, p. 151-153,

1990.

BENZIE, J. A. H. Population genetic structure in penaeid praws. Aquaculture Research. v.

31, p. 95-119, 2000.

BING, Y.; SONG, X.; HUANG, J, SHI, X. Y.; LIU, L. Evidence of existence of infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp cultured in China.

Veterinary Microbiology. v. 34, p. 8-15, 2006.

BOADA, M.; DE DONATO, M.; RODULFO, H. Detección del virus de la necrosis

infecciosa hipodérmica y hematopoyética (IHHNV) en camarones blancos cultivados

asintomáticos, Litopenaeus vannamei (BOONE), in Venezuela. FCV-LUZ . v. 23, n. 1, p. 7-

11, 2008.


81

BONAMI, J. R.; BREHELIN, M.; MARI, J.; TRUMPER, B.; LIGHTNER, D. V. Purification

and characterization of IHHN virus of penaeid shrimps. J. Gen. Virol. v. 71, p. 2657-2664,

1990.

BONAMI, J. R. & LIGHTNER, D. V. Unclassified Viruses of Crustacea. In: Atlas of

Invertebrate Viruses CRC Press. Boca Raton, Florida, USA: Adams, 1991. Cap. 24, p.

597-622.

BONAMI, J. R.; LIGHTNER, D. V.; REDMAN, R. M.; POULOS, B. T. Partial

characterization of a togavirus (LOVC') associate with histopathological changes of the

lymphoid organ of penaeid shrimps. Dis. Aquat. Org. v. 14, p. 145-152, 1992.

BONNICHON, V.; LIGHTNER, D. V, BONAMI, J. R. Viral interference between infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus and white spot syndrome virus in Litopenaeus

vannamei. Dis. Aquat. Org. v. 23, p. 179-184, 2006.

BOUTET, I.; MEISTERTZHEIM, A. L.; TANGUY, A.; THÉBAULT, M. T.; MORAGA, D.

Molecular characterization and expression of the gene encoding aspartate aminotransferase

from the pacific oyster Crassostrea gigas exposed to environmental stressors. Comparative

Biochemistry and Physiology. v. 40, p. 69-78, 2005.

BOWDEN, T. J. Modulation of the immune system of fish by their environment. Fish &

Shellfish Immunology. v. 25, p. 373-383, 2008.

BRASIL. Plataforma Tecnológica do Camarão Marinho Cultivado. Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Departamento de Pesca e Aqüicultura, 276 p.,

Brasília, 2001.

BREYNE, P & ZABEAU, M. Genome-wide expression analysis of plant cell cycle modulated

genes. Curr. Opin. Plant. Biol. v. 4, p. 136-142, 2001.

BREYNE, P.; DREESEN, R.; VANDEPOELE,K.; VEYLDER, D. L.; BREUSEGEM, F. V.;

CALLEWAERT, L.; ROMBAUTS, S.; RAES, J.; CANNOOT, B.; ENGLER, G.; INZE, D.;

ZABEAU, M. Transcriptome analysis during cell division in plants. Cell Biology. v. 99, n.

23, p. 14825-14830, 2002.


82

BROCK, J. A. & LEAMASTER. A look at the principal bacterial, fungal and parasitic disease

of farmed shrimp. In: Proceedings of the Social Session on Shrimp Farming. Baton Rouge:

Wyban, 1992, Cap. 3, p. 212-226, 1992.

BROWN, J. H. Antibiotics: their use and abuse in aquaculture. World Aquaculture Society.

v. 20, p. 34-43, 1999.

BUENO, S. L. S.; NASCIMENTO, R. M.; NASCIMENTO, I. Registros de Infecções

causadas por Baculovirus penaei em espécies nativas de camarões marinhos no Brasil. Uma

revisão sobre o tema. In: SIMPÓSIO BRASILEIRO SOBRE CULTIVO DE CAMARÕES,

3., João Pessoa. Anais... João Pessoa, v. 1, p. 357-372, 1989.

BUENO, S. L. S.; NASCIMENTO, R. M.; NASCIMENTO, I. Baculovirus Penaei infection

in Penaeus subtilis. A new host and a new geographic range of the disease. World

Aquaculture Society. v. 21, p. 235-237, 1990.

BUENO, S. L. S. Doenças em camarões marinhos no Brasil. Panorama da Aqüicultura. v.

1, n. 8. nov/dez. 1991.

CERENIUS, L.; LEE, B. L.; SÖDERHÄLL, K. The proPO-system: pros and cons for its role

in invertebrate immunity. Trends in Immunology. v. 29, p. 263-271, 2008.

CHAYABURAKUL, K.; LIGHTNER, D. V.; SRIURAIRATTANA, S.; KATHY TANG

NELSON, K. N.; WITHYACHUMNARNKUL, B. Different responses to infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in Penaeus monodon and P.

vannamei. Diseases of Aquatic Organisms. v. 67, n. 3, p. 191-200, 2005.

CHEN, L. L.; WANG, H. C.; HUANG, C. J.; PENG, S. E.; CHEN, Y. G.; LINS, J.; CHEN,

W. Y.; DAI, C. F.; YU, H. T.; WANG, C. H. Transcriptional analysis of the DNA polymerase

gene of shrimp white spot syndrome virus. Virology. v. 30, p. 136-147, 2002.

CHIU, C. H.; GUU, Y. K.; LIU, C. H.; PAN, T. M.; CHENG, W. Immune responses and

gene expression in white shrimp, Litopenaeus vannamei, induced by Lactobacillus plantarum.

Fish & Shellfish Immunology. v. 23, p. 364-377, 2007.


83

COCK, J.; GITTERLE, T.; SALAZAR, M.; RYE, M. Breeding for disease resistance of

Penaeid shrimps. Aquaculture. v. 286, p. 1-11, 2009.

COSTA, R.; MERMOUD, I.; KOBLAVI, S.; MORLET, B.; HAFFNER, P.; BERTHE, F.;

LEGROUMELLEC, M.; GRIMONT, P. Isolation and characterization of bacteria associated

with a Penaeus stylirostris disease (Syndrome 93) in New Caledonia. Aquaculture. v. 164, p.

297-309, 1998.

CÔTÉ, I.; NAVARRO, S.; TANG, K. F. J.; NOBLE, B.; LIGHTNER, D. V. Taura syndrome

virus from Venezuela is a new genetic variant. Aquaculture. Vol. 284: 62-67, 2008.

COWLEY, J. A.; CADOGANA, L. C.; WONGTEERASUPAYA, C.; HODGSONA, R. A.

J.; BOONSAENG, V.; WALKER, P. J. Multiplex RT-nested PCR differentiation of gill-

associated virus (Australia) from yellow head virus (Thailand) of Penaeus monodon. Journal

of Virological Methods. v. 117, p. 49-59, 2004.

DE FRANCISCO, A. K. & GALETTI JR, P. M. Genetic distance between broodstocks of the

marine shrimp Litopenaeus vannamei (Decapoda, Penaeidae) by mtDNA analyses. Genetics

and Molecular Biology. v. 28, n. 2, p. 258-261, 2005.

DE LORGERIL, JULIEN.; GUEGUEN, Y.; GOARANT, C.; GOYARD, E.; MUGNIER, C.;

FIEVET, J.; PIQUEMAL, D.; BACHÈRE, E. A relationship between antimicrobial peptide

gene expression and capacity of a selected shrimp line to survive a Vibrio infection.

Molecular Immunology. v. 45, p. 3438-3445, 2008.

DEVLIN, R. H. & NAGAHAMA, Y. Sex determination and sex differentiation in fish: an

overview of genetic, physiological, and environmental influences. Aquaculture. v. 208, p.

191-364, 2002.

DHAR, A. K.; DETTORI, A.; ROUX, M. M.; KLIMPEL, K. R.; READ, B. Identification of

differentially expressed genes in shrimp (Penaeus stylirostris) infected with White spot

syndrome virus by cDNA microarrays. Archives of Virology. v. 148, p. 2381-2396, 2003.


84

DHAR, A. K.; ROUX, M. M.; KLIMPEL, K. R. Detection and quantification of infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus and white spot virus in shrimp using real-time

quantitative PCR and SYBR Green Chemistry. Journal of Clinical Microbiology. v. 39, n. 8,

p. 2835-2845, 2001.

DOS SANTOS, M. J. M. & VALENTI, W. C. Production of Nile tilapia Oreochromis

niloticus and freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii stocked at different densities in

polyculture systems in Brazil. Journal World Aquaculture Society. v. 33, p. 369-76, 2002.

DOUBROVSKY, A.; PAYNTER, J. L.; SAMBHI, S. K.; ATHERTON, J. G.; LESTER, R. J.

G. Observations on the ultrastructure of baculovirus in Australian Penaeus monodon and

Penaeus merguiensis. Aust. J. Mar. Freshw. Res. v. 39, p. 743-749, 1988.

EMMERI. M.; YUGCHA. E.; LUZARDO. J.; CASTRO. F.; LECLERCQ. G.;

RODRÝ´GUEZA. J.; MIRANDAA. P.; BORJAA. O.; SERRANOA. J.; TERREROSA. M.;

MONTALVOA. K.; NARVA´EZA. A.; TENORIOA. N.; HSIEH, C .Y.; CHUANG, P. C.;

CHEN, L. C.; TU, C.; CHIEN, M. S.; HUANG, K. C.; KAO, H. F.; TUNG, M. C.; TSAI, S.

S. Prevention of IHHNV vertical transmission in the white shrimp Litopenaeus vannamei.

Aquaculture. v. 219, p. 57-70, 2002.

ESCOBEDO-BONILLA, C. M.; ALDAY-SANZ, V.; WILLE, M.; SORGELOOS, P.;

PENSAERT, M. B.; NAUWYNCK, H. J. A review on the morphology, molecular

characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus. Journal of

Fish Diseases. v. 31, p. 1-18, 2008.

EWING, B.; HILLIER, L.; WENDL, M. C.; GREEN, P. Based-calling of automated

sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. v. 8, p. 175-185,

1998.

AYUB, F.; SARKER, M. Y.; ALAM, M. S. Prevalence of white spot syndrome virus

infection detected by one-step and nested PCR in selected tiger shrimp (Penaeus monodon)

hatcheries. Aquacult. Int. v. 16, p. 405-415, 2008.


85

FAO, 2006. Cultured Aquatic Species Information Programme Penaeus vannamei (BOONE,

1931). Disponível em: http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Penaeus_vannamei. Acesso

em: 02/02/2009.

FEIJÓ, R. G.; KAMIMURA, M. T.; OLIVEIRA, D. M.; COSTA, R. B.; FURTADO-NETO,

M. A. A.; COÊLHO, M. G. L.; MAGGIONI, R. Avaliação da Variabilidade Genética do

Vírus da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV) no Camarão Rosa,

Farfantepenaeus subtilis, infectado experimentalmente. Arquivos de Ciências do Mar. v. 41,

n. 1, p. 113-117, 2008.

FELSENSTEIN, J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Department of

Genetics, University of Washington, Seattle., M.A, 1993.

FILBY, A. L.; THORPE, K. L.; MAACK, G.; TYLER, C. R. Gene expression profiles

revealing the mechanisms of anti-androgen and estrogen-induced feminization in fish.

Aquatic Toxicology. v. 81, p. 219-231, 2007.

FIRE, A.; XU, S.; MONTGOMERY, M. K.; KOSTAS, S. A.; DRIVER, S. E.; MELLO, C. C.

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.

Nature. v. 391, p. 806-811, 1998.

FLEGEL, T. W.; FEGAN, D. F.; KONGSOM, S.; VUTHIKORNUDOMKIT, S.;

SRIURAIRATANA, S.; BOONYARATPALIN, S.; CHANTANACHOOKIN, C.; VICKERS,

J. E.; MACDONALD, O. D. Occurrence, diagnosis and treatment of shrimp diseases in

Thailand. In: Diseases of cultured penaeid shrimp in Asia and the United States. The

Oceanic Institute, LA USA: Fulks, 1992, p. 57-112.

FLEGEL, T. W. Special topic review: major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus

monodon) in Thailand. World Journal of Microbiology & Biotechnology. v. 13, p. 433-442,

1997.

FLEGEL, T. W. The shrimp Response to Viral Pathogens. In: The New Wave, Proceedings

of the Special Session on Sustainable Shrimp Culture. The World Aquaculture Society.

Baton Rouge, LA USA: Craig, 2001, p. 254-278.


86

FLEGEL, T. W.; NIELSEN, L.; THAMAVIT, V.; KONGTIM, S.; PASHARAWIPASC, T.

Presence of multiple viruses in non-diseased, cultivated shrimp at harvest. Aquaculture. v.

240, p. 55-68, 2004.

FLEGEL, T. W. Update on viral accommodation, a model for host-viral interaction in shrimp

and other arthropods. Developmental and Comparative Immunology. v. 31, n. 3, p. 217-

231, 2007.

FRELIER, P. F.; SIS, R. F.; BELL, T. A.; LEWIS, D. H. Microscopic and ultrastructural

features of necrotizing hepatopancreatitis in Texas cultured shrimp (Penaeus vannamei). Vet.

Pathol. v. 29, p. 269-277, 1992.

GARGIONI, R. & BARRACO, M. A. Hemocytes of the palaemonids Macrobrachium

rosenbergii and M. acanthurus, and of the penaeid Penaeus paulensis. Journal of

Morphology. v. 236, p. 209-221, 1998.

GATESOUPE, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. v. 180, p. 147-65,

1999.

GESTEIRA, T. C. V. & ANDRADE, T. P. Registros da ocorrência de algumas enfermidades

em um cultivo do camarão Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) no Estado do Ceará. In:

CONGRESSO BRASILEIRO SOBRE CRUSTÁCEOS (Resumos), Sociedade Brasileira de

Carcinologia, São Pedro, p.51, 2002.

GESTEIRA, T. C. V. Enfermidades infecciosas registradas na carcinicultura brasileira. In:

Sanidade de organismos aquáticos no Brasil. ABRAPOA. Maringá: Silva-Souza, 2006, p.

137-158.

GONZALEZ, S. F.; KRUG, M. J.; NIELSEN, M. E.; SANTOS, Y.; CALL, D. R.

Simultaneous detection of marine fish pathogens by using multiplex PCR and a DNA

microarray. J. Clin. Microbiol. v. 42, p. 1414-1419, 2004.

GOTO, A.; BLANDIN, S.; ROYET, J.; REICHHART, J. M.; LEVASHINA, E. A. Silencing

of Toll pathway components by direct injection of double-stranded RNA into Drosophila

melanogaster adult flies. Nucleic Acids Res. v. 31, p. 6619–6623, 2003.


87

GOUVEIA, R. P. & FREITAS, M. L. Southern brown shrimp found susceptibile to IMNV.

Global Aquaculture Advocate. p. 86. jul/aug. 2007.

GROSS, P. S.; BARTLETT, T. C.; BROWDY. C. L.; CHAPMAN, R. W.; WARR, G. W.

Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas

in the Pacific White Shrimp, Litopenaeus vannamei, and the Atlantic White Shrimp, L.

setiferus. Developmental and Comparative Immunology. v. 25, p. 565-577, 2001.

GUZMÁN, G. A. & VALLE, F. A. Infectious disease in shrimp species with aquaculture

potential. Resent Res. Devl. Microbiology. v. 4, p. 333-348, 2000.

HASSON, K. W.; LIGHTNER, D. V.; MARI, J.; POULOS, B. T.; REDMAN, R. M.;

WHITE, B. L.; MOHNEY, L. L.; BONAMI, J. R. Taura syndrome of marine penaeid shrimp:

demonstration of a viral etiology. Dis. Aquat. Org. v. 23, p. 115-126, 1995.

HASSON, K. W.; LIGHTNER, D. V.; MOHNEY, L. L.; REDMAN, R. M.; WHITE, B. L.

Role of lymphoid organ spheroids in chronic Taura syndrome virus (TSV) infections in

Penaeus vannamei. Dis. Aquat. Org. v. 38, p. 93-105, 1999.

HASSON, K. W.; FAN, Y; VARNER, P. W. Current infections marine shrimp diseases of

concern in the United States. In: Korea-us seminar and workshop on the sustainable

marine shrimp culture: challenges and opportunities for the future of marine shrimp

farming. West Sea Fisheries Research Institute/NOAA: Incheon, 2005, p. 24-26..

HE, N.; QIN, Q.; XUN, X. Differential profile of genes expressed in hemocytes of White Spot

Syndrome Virus-resistant shrimp (Penaeus japonicus) by combining suppression subtractive

hybridization and differential hybridization. Antiviral Research. v. 66, p. 39-45, 2005.

HERNÁNDEZ, G. &. OLMOS, J. Molecular identification of pathogenic and nonpathogenic

strains of Vibrio harveyi using PCR and RAPD. Appl Microbiol Biotechnol. v. 63, p. 722-

727, 2003. HOSSAIN, M. S.; OTTA, S. K.; CHAKRABORTY, A.; KUMAR, H. S.; KARUNASAGAR,

S.; KARUNASAGAR, I. Detection of WSSV in cultured shrimps, captured brooders, shrimp


88

postlarvae and water samples in Bangladesh by PCR using different primers. Aquaculture. v.

237, p. 59-71, 2004.

HSIEH, C. Y.; CHUANG, P. C.; CHEN, L. C.; CHIEN, T.; CHIEN, M. S.; HUANG, K. C.;

KAO, H. F.; TUNG, M. C.; TSAI, S. S. Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis

virus (IHHNV) infections in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii.

Aquaculture. v. 258, p. 73-79, 2006a.

HSIEH, S. L.; CHIU, Y. C.; KUO, C. M. Molecular cloning and tissue distribution of ferritin

in Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). Fish & Shellfish Immunology. v. 21, p.

279-283, 2006b.

HSU, H. C.; LO, C. F.; LIN, S. C.; LIU, K. F.; PENG, S. E.; CHANG, Y. S.; CHEN, L. L.;

LIU, W. J.; KOU, G. H. Studies on effective PCR screening strategies for white spot

syndrome virus (WSSV) detection in Penaeus monodon brooders. Dis. Aquat. Org. v. 39, p.

13-19, 1999.

HUANG, X. & MADAN, A. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome

Research. v. 9, p. 868-877, 1999.

INOUYE, K.; MIWA, S.; OSEKO, N.; NAKANO, H.; KIMURA, T.; MOMOYAMA, K.;

HIRAOKA, M. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Penaeus japonicus, in Japan in

1993: electron microscopic evidence of the causative virus. Fish Pathology. v. 29, p. 149-

158, 1994.

IWANAGA, S. The molecular basis of innate immunity in the horseshoe crab. Current

Opinion in Immunology. v. 14, p. 87-95, 2002.

JIMENEZ, R.; BARNIOL, R.; MACHUCA, M. An epizootic of an intracellular bacterium in

cultured penaeid shrimp (Crustacea: Decapoda) in the Gulf of Guayaquil, Ecuador. In:

Disease in Asian Aquaculture III. Fish Health Section-Asian Fisheries Society, Manila:

Flegel, 1997, p. 305-311.


89

JIMÉNEZ-SANTIESTEVAM, R. Análisis de gregarinas asociadas al detenimiento de

crecimiento en camarones Litopenaeus vannamei. Acuacultura del Ecuador. p. 17-25,

1991.

JOHANSEN, K. A. & OVERTURF, K. Quantitative expression analysis of genes affecting

muscle growth during development of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Marine

Biotechnology. v. 7, p. 576-587, 2005.

JOHANSSON, M. W.; KEYSER, P.; SRITUNYALUCKSANA, K.; SÖDERHÄLL, K.

Crustacean haemocytes and haematopoiesis. Aquaculture. v. 191, p. 45-52, 2000.

JUNQUEIRA, L. C. U. & JUNQUEIRA, L. M. S. Técnicas básicas de citologia e histologia.

Editora Santos, 123 p., São Paulo, 1983.

KALAGAYAN, G.; GODIN, D.; KANNA, R. ; HAGINO, G. ; SWEENEY, J.; WYBAN, J.

& BROCK, J. IHHN virus as an etiological factor in runt-deformity syndrome of juvenile

Penaeus vannamei cultured in Hawaii. J. World Aquaculture Soc. v. 22, p. 235-243, 1991.

KAMIMURA, M. T.; MEIER, K. M.; CAVALLI, R. O.; LAURINO, J.; MAGGIONI, R.;

MARINS, L. F. Characterization of growth-related genes in the south-western Atlantic Pink

shrimp Farfantepenaeus paulensis (Pérez-Farfante, 1967) throung a modifield DDRT-PCR

protocol. Aquaculture Research. v. 39, p. 200-204, 2008.

KASORNCHANDRA, J.; BOONYARATPALIN, S.; ITAMI, T. Detection of white spot

syndrome in cultured penaeid shrimp in Asia : microscopic observation and polymerase chain

reaction. Aquaculture. v. 164, p. 243-251, 1998.

KHADIJAH, S.; NEO, S. Y.; HOSSAIN, M. S.; MILLER, L. D.; MATHAVAN, S.;

KWANG, J. Identification of White Spot Syndrome Virus Latency-Related Genes in Specific-

Pathogen-Free Shrimps by Use of a Microarray. Journal of Virology. v. 77, p. 10162-10167,

2003.

KONO, T.; SAVAN, R.; SAKAI, M.; ITAMI, T. Detection of white spot syndrome virus in

shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. v. 115,

p. 59-65, 2004.


90

KRABSETSVE, K.; CULLEN, B. R.; OWENS, L. Rediscovery of the Australian strain of

infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus. Dis. Aquat. Org. v. 61, p. 153-158,

2004.

KROL, R.; HAWKINS, W. E.; OVERSTREET, R. M. Ricketsial and mollicule infections in

Texas. Vet. Pathol. v. 29, p. 269-277, 1991.

KURTZ, J. & ARMITAGE, S. A. O. Alternative adaptative immunity in invertebrates.

TRENDS in Immunology. v. 27, n. 11, p. 493-496, 2006.

LAKE, J. A.; JAIN, R.; RIVERA, M. C. Mix and match in the tree of life. Science. v. 283, p.

2027-2028, 1999.

LEE, S. Y. & SÖDERHÄLL, K. Early events in crustacean innate immunity. Fish &

Shellfish immunology. v. 12, p. 421-437, 2002.

LEU, J. H.; YANG, F.; ZHANG, X.; XU, X.; KOU, G. H.; LO, C. F. Whispovirus. Current

Topics in Microbiology and Immunology. v. 328, p. 197-227, 2009.

LIANG, P. & PARDEE, A. B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of

the polymerase chain reaction. Science. v. 257, p. 967-971, 1992.

LIGHTNER, D. V.; REDMAN, R. M.; BELL, T. A. Infectious hypodermal and

hematopoietic necrosis a newly recognized virus disease of penaeid shrimp. J. Invertebr.

Pathol. v. 42, p. 62-70, 1983.

LIGHTNER, D. V.; POULOS, B. T.; BRUCE, L.; REDMAN, R. M.; MARI, J.; BONAMI,

J.R. New developments in penaeid virology: application of biotechnology in research and

disease diagnosis for shrimp viruses of concern in the Americas. In: Diseases of Cultured

Penaeid Shrimp in Asia and the United States. The Oceanic Institute, Makapuu Point,

Honolulu, Hawaii, USA: Fulks, 1992, p. 233-253.

LIGHTNER, D. V. A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases

of Cultured Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Balton Rouge, Louisiana, 1996a.


91

LIGHTNER, D. V. The penaeid shrimp viruses IHHNV and TSV: Epizootiology, distribution

and the impact on international trade of two penaeid shrimp viruses in the Americas. Rev. sci.

tech. Off. int. Epiz. v. 15, p. 579-601, 1996b.

LIGHTNER, D. V. Disease of culture penaeid shrimp. In: Handbook of Mariculture.

Crustacean Aquaculture. 2a Ed. CRC. Press. Boca Raton: McVey, 1996c, p. 393-486.

LIGHTNER, D. V. The penaeid shrimp virus TSV, IHHNV, WSSV AND YHV: Status in

the Americas, available diagnostic methods and management strategies. J. Applied

Aquaculture. v. 9, p. 27-52, 1999.

LIGHTNER, D. V.; PANTOJA, C. R.; POULOS, B. T.;TANG, K. F. J.; REDMAN, R. M.;

ANDRADE, T. P. D.; BONAMI, J. R. Infectious Myonecrosis: New Disease in Pacific White

Shrimp. The advocate Global Aquaculture Alliance, p. 17-22. out/nov. 2004.

LIGHTNER, D. V.; POULOS, B. T.; TANG, K. F.; PANTOJA, C. R.; NUNAN, L. M.;

NAVARRO, S. A. Application of molecular diagnostic methods to penaeid shrimp diseases:

advances of the past 10 years for control of viral diseases in famed shrimp. Dev. Biol (Basel).

v. 126, p. 117-122, 2006.

LIU, C. H. & CHEN, J. C. Effect of ammonia on the immune response of white shrimp

Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus. Fish Shellfish immunol.

v. 16, p. 321-334, 2004.

LIU, W. J.; YU, H. T.; PENG, S. E.; CHANG, Y. S.; PIEN, H. W.; LIN, C. J.; HUANG, C.

J.; TSAI, M. F.; HUANG, C. J.; WANG, C. H.; LIN, J. Y.; LO, C. F.; KOU, G. H. Cloning,

characterization, and phylogenetic analysis of a shrimp White spot syndrome virus gene that

encodes a protein kinase. Virology. v. 289, p. 362-377, 2001.

LO, C. F.; HO, C. H.; PENG, S, E.; CHEN, C. H.; HSU, H. C.; CHIU, Y. L.; CHANG, H. F.;

LIU, K. F.; SU, M. F.; WANG, H. H.; KOU, G. H. White spot syndrome baculovirus

(WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Dis. Aquat.

Org. v. 27, p. 215-225, 1996.


92

LO, C. F.; HSU, H. C.; TSAI, M. F.; HO, C. H.; PENG, S. E.; KOU, G. H.; LIGHTNER,

D.V. Specific genomic DNA fragment analysis of different geographical clinical samples of

shrimp white spot syndrome virus. Dis. Aquat. Org. v. 35, p. 175-185, 1999.

LONGYANT, S.; RUKPRATANPORN, S.; CHAIVISUTHANGKURA, P, SUKSAWAD,

P.; SRISUK, C.; SITHIGORNGUL, W.; PIYATIRATITIVORAKUL, S.; SITHIGORNGUL,

P. Identification of Vibrio spp. in vibriosis Penaeus vannamei using developed monoclonal

antibodies. Journal of Invertebrate Pathology. v. 98, p. 63-68, 2008.

LOTZ, J. & DAVIDSON J. Two approaches to epidemiology in shrimp aquaculture disease

control. In: Proceedings of the Special Session on Sustainable Shrimp Culture, A. The

World Aquaculture Society. Baton Rouge, LA USA: Craig, 2001, p. 219-225.

LOY, J. K.; FRELIER, P. F.; VARNER, P.; TEMPLETON, J. W. Detection of the etiologic

agent of necrotizing hepatopancreatitis in cultured Penaeus vannamei from Texas and Peru by

polymerase chain reaction. Dis. Aqua. Org. v. 5, p. 117-120, 1996.

LUO, T.; ZHANG, X.; SHAB, Z.; XU, X. PmAV, a novel gene involved in virus resistance of

shrimp Penaeus monodon. FEBS Letters. v. 551, p. 53-57, 2003.

LUO, T.; YANG, H. J.; LI, F.; ZHANG, X. B.; XU, X. Purification, characterization and

cDNA cloning of a novel lipopolysaccharide-binding lectin from the shrimp Penaeus

monodon. Dev. Comp. Immunol. v. 30, p. 607-617, 2006.

MACKAY, I. M.; ARDEN, K. E.; NITSCHE, A. A Real-Time PCR in Virology. Nucleic

Acids Research. v. 30, p. 1292-1305, 2002.

MADHAVI, R.; JANAKIRAM, P.; JAYASREE, L.; MURTHY, P. S. N. Occurrence of

concurrent infections with multiple viruses in Penaeus monodon from culture ponds of north

coastal Andhra Pradesh. Current Science. v. 82, n. 11/10, p. 1397-1400, 2002.

MADRID, R. M. Análises das exportações da Carcinicultura brasileira de 1999 a 2003: Cinco

anos de sucesso e, 2004, o início de uma nova fase. Revista da ABCC. Recife, ano 7, n.1,

2005.


93

MAGURRAN, A. E. Ecological diversity and its measurement. New Jersey: Princenton

University Press, 1988.

MAKESH, M.; KOTEESWARAN, A.; CHANDRAN, N. D. J.; MANOHAR, B. M.;

RAMASAMY, V. Development of monoclonal antibodies against VP28 of WSSV and its

application to detect WSSV using immunocomb. Aquaculture. v. 261, p. 64-71, 2006.

MANINGAS, M. B. B.; KONDO, H.; HIRONO, I.; SAITO-TAKI, T.; AOKI, T. Essential

function of transglutaminase and clotting protein in shrimp immunity. Molecular

Immunology. v. 45, p. 1269-1275, 2008.

MARI, J.; BONAMI, J. R.; LIGHTNER, D. V. Partial cloning of the genome of infectious

hypodermal and haematopoietic necrosis virus, an unusual parvovirus pathogenic for penaeid

shrimps: Diagnosis of the disease using a specific probe. J. Gen. Virol. v. 74, p. 2637-2643,

1993.

MARQUES, M. R. F. & BARRACO, M. A. Lectins, as non-self recognition factors, in

crustaceans. Aquaculture. v. 191, p. 23-44, 2000.

MARQUES, M. R. F.; MOSER, J. R.; MÜLER, C. In: SILVA-SOUZA, A. T. (Org.).

Virologia de crustáceos e métodos moleculares de diagnóstico. Sanidade de Organismos

Aquáticos. ABRAPOA, Maringá, p. 159-184, 2006.

MARTINS, P. C. C. Influência das condições ambientais e das técnicas de manejo de

produção sobre a ocorrência de enfermidades na criação de camarão marinho Litopenaeus

vannamei, no Estado do Ceará. Tese (Doutorado em Ciências), Universidade Federal de São

Carlos, São Carlos, 117 p., 2003.

MARTINS, P. C. C. Cultivo de camarão marinho. In: Sanidade de organismos aquáticos no

Brasil. ABRAPOA, Maringá: Silva-Souza, 2006, p. 121-135.

MCKAY, C. L. Freeze Squeeze PCR Product Purification from Agarose Gel. Protocol

Online-Your lab’s reference book, 2006. Disponível em: http://www.protocol-online.org/

Acesso: 08/01/2009.


94

MEISTER, G. & TUSCHL, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA.

Nature. v. 431, p. 343-349, 2004.

MOHAN, C. V.; SHANKAR, K. M.; KULKARNI, S.; SUDHA, P. M. Histopathology of

cultured shrimp showing gross signs of yellow head syndrome and white spot syndrome

during 1994 Indian epizootics. Dis. Aquat.Org. v. 34, p. 9-12, 1998.

MONTAÑO-PÉREZ, K.; GÓMEZ-GÁMEZ, A. I.; VARGAS-ALBORES, F. Different

expression of Litopenaeus vannamei (Boone) haemocyte to Vibrio and particle inoculation.

Aquaculture Research. v. 36, p. 912-919, 2005.

MORALES-COVARRUBIAS, M. S. Enfermedades Bacterianas. In: Patología e

Inmumología de Camarones Penaeidos. CYTED-RED II-D: Red Vannamei ,Panamá:

Morales &. Cuéllar-Anjel, 2008, p. 119-134.

NADALA, E. C. B.; LU, Y.; LOH, P. C.; BROCK, J. A. Infection of Penaeus stylirostris

(BOONE) with a rhabdovirus isolated from Penaeus sp. Gyobyo Kenkyu. v. 27, p. 143-147,

1992.

NAKANO, H.; KOUBI, H.; UMEZAWA, S. Mass mortalities of cultured karuma shrimp,

Penaeus japonicus, in Japan in 1993: Epizootiological survey and infection trails. Fish

Pathol. v. 29, p. 135-139, 1994.

NATIVIDAD, K. D. T.; MIGO, M. V. P.; ALBALADEJO, J. D.; MAGBANUA, J. P. V.;

NOMURA, N.; MATSUMURA, M. Simultaneous PCR detection of two shrimp viruses

(WSSV and MBV) in postlarvae of Penaeus monodon in the Philippines. Aquaculture. v.

257, p. 142-149, 2006.

NIBERT, M. L. ‘2A-like’ and ‘shifty heptamer’ motifs in penaeid shrimp infectious

myonecrosis virus, a monosegmented double-stranded RNA virus. Journal of General

Virology. v. 88, p. 1315-1318, 2007.

NUNAN, L. M.; POULOS, B. T.; LIGHTNER, D .V. Reverse transcription polymerase chain

reaction (RT-PCR) used for the detection of Taura Syndrome Virus (TSV) in experimentally

infected shrimp. Dis. Aquat. Org. v. 34, p. 87-91, 1998.


95

NUNAN, L. M.; POULOS, B. T.; LIGHTNER, D. V. Use of polymerase chain reaction for

detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp.

Marine Biology Technology. v. 2, p. 319-328, 2000.

NUNAN, L. M.; PANTOJA, C.; LIGHTNER, D .V. Improvement of a PCR method for the

detection of necrotizing hepatopancreatitis in shrimp. Diseases of Aquatic Organisms. v. 80,

n. 1, p. 69-73, 2008.

NUNES, A. J. P. & MARTINS, P. C. Avaliando o estado de saúde de camarões marinhos na

engorda. Panorama da Aqüicultura. Rio de Janeiro. v. 12, p. 23-33. jul/ago. 2002.

NUNES, A. J. P.; MARTINS, P. C.; GESTEIRA, T. C. Carcinicultura Ameaçada. Panorama

da Aqüicultura. Rio de Janeiro. v. 14, p. 37-57. maio/jun. 2004.

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE), 2003. Manual of Diagnostic Tests

for Aquatic Animals. Part 4. Section 4.1.. Chapter 4.1.6.. Summary. Index. CHAPTER 4.1.6.

INFECTIOUS HYPODERMAL AND HAEMATOPOIETIC NECROSIS. Disponível em:

http://www.oie.int/eng/normes/fmanual/manual2003/a_00052.htm. Acesso em: 03.08.2008.

OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE), 2005. Disease Information: White

Spot Disease in Brazil. Disponível em:

http://www.oie.int/eng/info/hebdo/AIS_58.HTM#Sec0. Acesso em: 30.03.2009.

O’HARA, C. M.; SOWERS, E. G.; BOPP, C. A.; DUDA, S. B.; STOCKBINE, N. A.

Accuracy of six commercially available systems for identification of members of the family

Vibrionaceae. J. Clin. Microbiol. v. 41, p. 5654-5659, 2003.

OLIVEIRA-NETO, J. M. Investigação da ocorrência dos Vírus da Síndrome da Mancha

Branca (WSSV) e da Infecção Hipodermal e Necrose Hematopoiética (IHHNV) em camarões

coletados em área sob influência de efluentes da carcinicultura. Dissertação de Mestrado

(Ciências Marinhas Tropicais). LABOMAR-UFC, Fortaleza, 2006.


96

ONEAL, M. J.; SCHAFER, E. R.; MADSEN, M. L.; MINION, F. C. Global transcriptional

analysis of Mycoplasma hyopneumoniae following exposure to norepinephrine.

Microbiology. v. 154, p. 2581-2588, 2008.

OWENS, L.; ANDERSON, I. G.; KENWAY, M.; TROTT, L.; BENZIE J. A. H Infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in a hybrid penaeid prawn from

tropical Australia. Dis. Aquat. Org. v. 23, p. 219-228, 1992.

OWENS, L.; DE BEER, S.; SMITH, J. Lymphoidal parvoviruslike particles in Australian

penaeid prawns. Dis Aquat Org. v. 11, p. 129-134, 1991.

OTTA, S. K.; KARUNASAGAR, I.; KARUNASAGAR, I. Detection of monodon

baculovirus and white spot syndrome virus in apparently healthy Penaeus monodon

postlarvae from India by polymerase chain reaction. Aquaculture. v. 220, p. 59-67, 2003.

PAN, D.; HE, N.; YANG, Z.; LIU, H.; XU, X. Differential gene expression profile in

hepatopancreas of WSSV-resistant shrimp (Penaeus japonicus) by suppression subtractive

hybridization. Developmental and Comparative Immunology. v. 29, p. 103-112, 2005.

PANTOJA, C. R.; LIGHTNER, D. V.; HOLTSCHMIT, K. H. Prevalence and geographic

distribution of IHHN parvovirus in wild penaeid shrimp (Crustacea: Decapoda) from the Gulf

of California, Mexico. J. Aquat. Anim. Health. v. 11, p. 23-34, 1999.

PANTOJA, C. R. & LIGHTNER, D. V. Necrotizing hepatopancreatitis: diagnosis,

distribuition in shrimp. Global Aquaculture Advocate. v. 4, p. 18, 2003.

PANTOJA, C. R. & LIGHTNER, D. V. Enfermedades Virales. In: Patología e Inmumología

de Camarones Penaeidos. CYTED-RED II-D: Red Vannamei, Panamá: Morales &. Cuéllar-

Anjel, 2008, p. 57-95.

PEREIRA, A. M. L.; MENDES, E. S.; GESTEIRA, T. C. V. Mionecrosis infecciosa viral

(IMNV) y sus implicaciones em los cultivos de camarones brasileños. In: Patología e

Inmumología de Camarones Penaeidos. CYTED-RED II-D: Red Vannamei, Panamá:

Morales &. Cuéllar-Anjel, 2008, p. 96-106.


97

PÉREZ-FARFANTE, I. Illustrated Key to Penaeoid Shrimps of Commerce in the

Americas. NOAA Techinical Rerpots, NMFS 64, 1988.

PÉREZ-FARFANTE, I. & KENSLEY, B. Penaeoid and Sergestoid Shrimps and Spraw of

the world: Key and Diagnoses for the Families and Genera. Edition du Muséum national

d’Histoire naturelle, Paris, 1997.

PESTKA, S. The Interferons: 50 Years after Their Discovery, There Is Much More to Learn.

Journal of Biological Chemistry. v. 282, n. 28, p. 20047-20051, 2007.

PHALITAKUL, S.; WONGTAWATCHAI, J.; SARIKAPUTI, M.; VISESHAKUL, N. The

molecular detection of Taura syndrome virus emerging with White spot syndrome virus in

penaeid shrimps of Thailand. Aquaculture. v. 260, p. 77-85, 2006.

PHROMJAI, J.; SUKHUMSIRICHART, W.; PANTOJA, C.; LIGHTNER, D. V.; FLEGEL,

T. W. Different reactions obtained using the same DNA detection reagents for Thai and

Korean hepatopancreatic parvovirus of penaeid shrimp. Dis. Aquat. Org. v. 46, p. 153-158,

2001.

PHUOC, L. H.; CORTEEL. M.; NAUWYNCK, H. J.; PENSAERT, M. B.; ALDAY-SANZ,

V.;VAN DEN BROECK, W.; SORGELOOS, P.; BOSSIER, P. Increased susceptibility of

white spot syndrome virus-infected Litopenaeus vannamei to Vibrio campbellii.

Environmental Microbiology. v. 10, p. 2718-2727, 2008.

PINHEIRO, A. C. A. S.; LIMA, A. P. S.; SOUZA, M. E.; NETO, E. C. L.; ADRIÃO, M.;

GONÇALVES, V. S. P.; COIMBRA, M. R. M. Epidemiological status of Taura syndrome

and Infectious myonecrosis viruses in Penaeus vannamei reared in Pernambuco (Brazil).

Aquaculture. v. 262, p. 17-22, 2007.

PIZZONIA, J. Electrophoresis gel image processing and analysis using the KODAK 1D

software. Biotechniques. v. 30, n. 6, p. 1316-1320, 2001.

POULOS, B. T.; TANG, K. F. J.; PANTOJA, C. R.; BONAMI, J. R., LIGHTNER, D. V.

Purification and Characterization of Infectious Myonecrosis Virus of Penaeid Shrimp.

Journal of General Virology. v. 87, p. 987-996, 2006.


98

QUÉRÉ, R.; THÉRÈSE, C.; MARTI, J.; BONAMI, J. R. White spot syndrome virus and

infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus simultaneous diagnosis by miniarray

system with colorimetry detection. Journal of Virological Methods. v. 5, p. 189-196, 2002.

RAVIV, S.; PARNES, S.; SEGALL, C.; DAVIS, C.; SAGI, A. Complete sequence of

Litopenaeus vannamei (Crustacea: Decapoda) vitellogenin cDNA and its expression in

endocrinologically induced sub-adult females. General and Comparative Endocrinology. v.

145, p. 39-50, 2006.

REDDINGTON, J. & LIGHTNER, D. V. Diagnostics and their application to aquaculture. J.

World Aquaculture Society. v. 25, p. 41-48, 1994.

REYES, A.; SALAZAR, M.; GRANJA, C. Temperature modifies gene expression in

subcuticular epithelial cells of white spot syndrome virus-infected Litopenaeus vannamei.

Developmental and Comparative Immunology. v. 31, p. 23-29, 2007.

RÍO-RODRÍGUEZ, R. E.; SOTO-RODRÍGUEZ, S.; LARA-FLORES, M.; CU

ESCAMILLA, A. D.; GOMEZ-SOLANO, M. I. A necrotizing hepatopancreatitis (NHP)

outbreak in a shrimp farm in Campeche, Mexico: A first case report. Aquaculture. v. 255, p.

606-609, 2006.

ROBALINO, J.; BROWDY, C. L.; PRIOR, S.; METZ, A.; PARNELL, P.; GROSS, P. S.;

WARR, G. Induction of Antiviral Immunity by Double-Stranded RNA in a Marine

Invertebrate. Journal of Virology. v. 78 , p. 10442-10448, 2004.

ROBALINO, J.; BARTLETT, T. C.; SHEPARD, E.; PRIOR, S.; JARAMILLO, G.; SCURA,

E.; CHAPMAN, R. W.; GROSS, P. S.; BROWDY, C. L.; WARR, G. W. Double-Stranded

RNA Induces Sequence-Specific Antiviral Silencing in Addition to Nonspecific Immunity in

a Marine Shrimp: Convergence of RNA Interference and Innate Immunity in the Invertebrate

Antiviral Response? Journal of Virology. v. 79, n. 21, p. 13561-13571, 2005.

ROBALINO, J.; BARTLETT, T. C.; ROBERT, W.; CHAPMAN, R. W.; GROSS, P. S.;

BROWDY, C. L.; WARR, G. W. Double-stranded RNA and antiviral immunity in marine


99

shrimp: Inducible host mechanisms and evidence for the evolution of viral counter-responses.


ROCHA, I. P. Desempenho da carcinicultura brasileira em 2007: desafios e oportunidades

para 2008. Revista da ABCC, Ano 10, n. 1, p. 20-23, 2007.

RODRIGUES, J. Carcinicultura marinha: Desempenho em 2004. Revista da ABCC, Ano 7,

n. 2, p. 38-44, 2005.

RODRÍGUEZ, J.; BAYOT, B.; AMANO, Y.; PANCHANA, F.; DE BLAS, I.; ALDAY, V.;

CALDERÓN, J. White spot syndrome virus infection in cultured Penaeus vannamei (Boone)

in Ecuador with emphasis on histopathology and ultrastructure. Journal of Fish Disease. v.

26, p. 439-450, 2003.

SAAVEDRA-BUCHELI, M.; ÁLVARES-LEÓN, R.; REY-CARRASCO, I. Análisis de La

Incidencia de Gregarinas em cultivos comerciales de Litopenaeus vannamei y L. stylirostris

en el Sur Del Caribe Colombiano. Arquivos de Ciências do Mar. v. 41, n. 1, p. 9-23, 2008.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A laboratory

manual. 2a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

SÁNCHEZ-MARTÍNEZ, J. G.; AGUIRRE-GUZMÁN, G.; MEJÍA-RUÍZ, H. White Spot

Syndrome Virus in cultured shrimp: A review. Aquaculture Research, v. 38, p. 1339-1354,

2007.

SANDRINI, J. Z.; LAURINO, J.; HATANAKA, T.; MONSERRAT, J. M.; MARINS, L. F.

cDNA cloning and expression analysis of the catalytic subunit of glutamate cysteine ligase

gene in an annelid polychaete after cadmium exposure: A potential tool for pollution

biomonitoring. Comparative Biochemistry and Physiology, (Parte C). v. 143, p. 410-415,

2006.

SANGAMAHESWARAN, A. P. & JEYASEELAN, M. J. P. White spot viral disease in

shrimp-a review. The ICLARM Quarterly. v. 24, p. 16-22, 2001.


100

SANGRUNGRUANG, K.; CHOTCHUANG, A.; UENO, R. Comparative pharmacokinetics

and bioavailability of oxytetracycline in giant tiger prawn. Fisheries Science. v. 70, p. 467-

472, 2004.

SAULNIER, D.; HAFFNER, P.; GOARANT, C.; LEVY, P.; ANSQUER, D. Experimental

infection models for shrimp vibrioses studies: a review. Aquaculture. v. 191, p. 133-144,

2000.

SEIFFERT, W. Q. A mancha Branca em Santa Catarina. Revista da ABCC. p. 34-37, Recife,

ano 7, n.1, 2005.

SEIFFERT, W. Q.; WHINCKLER, S.; MAGGIONI, D. A mancha Branca em Santa Catarina.

Panorama da Aqüicultura. p. 51-53. jan/fev. 2005. SENAPIN, S; PHEWSAIYA, K.; BRIGGS, M.; FLEGEL, T. W. Outbreaks of infectious

myonecrosis virus (IMNV) in Indonesia confirmed by genome sequencing and use of an

alternative RT-PCR detection method. Aquaculture. v. 266, p. 32-38, 2007.

SHEKHAR, M. S.; AZAD, I. S.; RAVICHANDRAN, P. Comparison of dot blot and PCR

diagnostic techniques for detection of white spot syndrome virus in different tissues of

Penaeus monodon. Aquaculture. v. 261, p. 1122-1127, 2006.

SHEN, X.; REN, J.; CUI, Z.; SHA, Z.; WANG, B.; XIANG, J.; LIU, B. The complete

mitochondrial genomes of two common shrimps (Litopenaeus vannamei and Fenneropenaeus

chinensis) and their phylogenomic considerations. Gene. v. 403, n. 1/2, p. 98-109, 2007.

SHIGEHO, I.; HIROYO, K.; TOHRU, K.; DE-SHOU, W.; FUMIE, S.; BINDHU, P. P.;

MASARU, N.; YOSHITAKA, N. Sexual Dimorphic Expression of Genes in Gonads During

Early Differentiation of a Teleost Fish, the Nile Tilapia Oreochromis niloticus. Biology of

Reproduction. v. 78, p. 333-341, 2008.

SHIKE, H.; DHAR , A. K.; BURNS, J. C.; SHIMIZU, C.; JOUSSET, F. X.; KLIMPLE, K.R.

& BERGOIN, M. Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis virus of shrimp related

to Mosquito Brevidensoviruses. Virology. v. 277, p. 167-177, 2000.


101

SONG, Y. L.; CHENG, W.; WANG, C. H. Isolation and characterization of Vibrio damsela

infectious for cultured shrimp in Taiwan. J. Invertebr. Pathol. v. 61, p. 24-31, 1993.

SPANN, K. M.; VICKERS, J. E.; LESTER, R. J. Lymphoid organ virus of Penaeus monodon

from Australia. Dis. Aquat. Org. v. 23, p. 127-134, 1995.

SRITUNYALUCKSANA, K.; CERENIUS, L.; SÖDERHÄLL, K. Molecular cloning and

characterization of prophenoloxidase in the black tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev.

Comp. Immunol. v. 23, n. 1, p. 79-86, 1999.

SRITUNYALUCKSANA, K.; SRISALA, J.; MCCOLL, K.; NIELSEN, L.; FLEGEL, T. W.

Comparison of PCR testing methods for white spot syndrome virus (WSSV) infections in

penaeid shrimp. Aquaculture. v. 15, p. 33-43, 2005.

STURTEVANT, J. Application of Differential-Display Reverse Transcription-PCR to

Molecular Pathogenesis and Medical Mycology. Clinical Microbiology Reviews. v. 13, p.

408-427, 2000.

SUDHEESH, P. S.; XU, H. S. Pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus in tiger prawn

Penaeus monodon Fabricius: possible role of extracellular proteases. Aquaculture. v. 196, p.

37-46, 2001.

SURACHETPONG, W.; POULOS, B. T.; TANG, K. F. J.; LIGHTNER, D. V. Improvement

of PCR method for the detection of monodon baculovirus (MBV) in penaeid shrimp.

Aquaculture. v. 249, p. 69-75, 2005.

TAKAHASHI, Y.; SHIMOYAMA, Y.; MOMOYAMA, K. Pathogenicity and characteristics

of Vibrio sp. Isolated from cultured kuruma prawn, Penaeus japonicus Bate. Bull. Jpn. Soc.

Sci. Fish. v. 51, p. 721-730, 1985.

TANG, K. F. J. & LIGHTNER, D. V. Detection and quantification of infectious hypodermal

and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp by real-time PCR. Department of

Veterinary Science and Microbiology. v. 44, p. 79-85, 2001.


102

TANG, K. F. J & LIGHTNER, D. V. High genetic variation among isolates of Infectious

Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) collected from southeast Asia,

Madagascar and east Africa. World Aquaculture Society. Baton Rouge, LA, USA. 328 p.,

2002a.

TANG, K. F. J. & LIGHTNER, D. V. Low sequence variation among isolates of Infectious

Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) originating from Hawaii and the

Americas. Dis Aquat Org. v. 49, p. 93-97, 2002b.

TANG, K. F. J.; DURAND, S. V.; WHITE, B. L.; REDMAN, R. M.; MOHNEY, L. L.;

LIGHTNER, D. V. Induced resistance to white spot syndrome virus infection in Penaeus

stylirostris through pre-infection with infectious hypodermal and hematopoietic necrosis

virus-a preliminary study. Aquaculture. v. 216, p. 19-29, 2003.

TANG, K. F. J.; PANTOJA, C. R.; POULOS, B. T.; REDMAN, R. M.; LIGHTNER, D. V. In

situ hybridization demonstrates that Litopenaeus vannamei, L. stylirostris and Penaeus

monodon are susceptible to experimental infection with infectious myonecrosis virus (IMNV).

Dis. Aquat. Org. v. 63, p. 261-265, 2005.

TANG, K. F. J. & LIGHTNER, D. V. Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis

virus (IHHNV)-related sequences in the genome of the black tiger prawn Penaeus monodon

from Africa and Australia. Virus Research. v. 118, p. 185-191, 2006.

TANG, K. F. J.; PANTOJA, C. R.; REDMAN, R. M.; LIGHTNER, D. V. Development in

situ hybridization an RT-PCR assay for the detection of a nodavirus (PvNV) that causes

muscle necrosis in Penaeus vannamei. Dis. Aquat. Org. v. 75, p. 183-190, 2007.

THEOPOLD, U.; SCHMIDT, O.; SÖDERHÄLL, K.; DUSHAY, M. S. Coagulation in

arthropods: defense, wound closure and healing. Trends in Immunology. v. 25, p. 378-388,

2004.

TIAN, X. L.; LI, D. S.; DONG, S. L.; YAN, X. Z.; QI, Z. X.; LIU, G. C. An experimental

study on closed-polyculture of penaeid shrimp with tilapia and constricted tagelus.

Aquaculture. v. 202, p. 57-71, 2001.


103

TIRASOPHON, W.; ROSHORM, Y.; PANYIM, S. Silencing of yellow head virus replication

in penaeid shrimp cells by dsRNA. Biochem Biophys Res Commun. v. 334, p. 102-107,

2005.

TORRES, G. A. M.; PFLIEGER, S.; CORRE-MENGUY, F.; MAZUBERT, C.;

HARTMANN, C.; LELANDAIS-BRIÈRE, C. Identification of novel drought-related mRNAs

in common bean roots by differential display RT-PCR. Plant Science. v. 171, p. 300-307,

2006.

UHRIK, B.; RÝDLOVÁ, K.; ZACHAROVÁ, J. The roles of haemocytes during degeneration

and regeneration of crayfish muscle fibres. Cell Tissue Res. v. 255, p. 443-449, 1989.

VAN BLERKON, L. M. Role of Viruses in Human Evolution. Yearbook of Physical

Anthropology. v. 46, p. 14-46, 2003.

VAN DE BRAAK, C. B; BOTTERBLOM, M. H. A.; TAVERNE, N.; VAN MUISWINKEL,

W. B.; ROMBOUT, J. H. W. M.; VAN DER KNAAP, W. P. W. The roles of haemocytes

and the lymphoid organ in the clearance of injected Vibrio bacteria in Penaeus monodon

shrimp. Fish and Shellfish Immunology. v. 13, p. 293-309, 2002a.

VAN DE BRAAK, C. B; BOTTERBLOM, M. H. A.; TAVERNE, N.; VAN MUISWINKEL,

W. B.; ROMBOUT, J. H. W. M. The role of the haematopoietic tissue in haemocyte

production and maturation in the black tiger shrimp (Penaeus monodon). Fish and Shellfish

Immunology. v. 12, p. 253-272, 2002b.

VAN HULTEN, M. C. W.; WITTEVELDT, J.; PETERS, S.; KLOOSTERBOER, N.;

TARCHINI, R.; FIERS, M.; SANDBRINK, H.; KLEIN-LANGHORST, R.; VLAK, J. M.

The white spot syndrome virus DNA genome sequence. Virology. v. 286, p. 7-22, 2001.

VENKATESH, B.; HETTWER, U.; KOOPMANN, B.; KARLOVSKY, P. Conversion of

cDNA differential display results (DDRT-PCR) into quantitative transcription profiles. BMC

Genomics. v. 6, n. 51, p. 1-12, 2005.

VILA-NOVA, C. M. V. M.; COELHO, M. G. L.; OLIVEIRA-NETO, J. M.; FEIJÓ, R. G.;

GESTEIRA, T. C. V.; APOLINÁRIO, D. F. In: Padronização e Implantação de Protocolo


104

RT-PCR para a Detecção do Vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV) no CEDECAM –

Instituto de Ciências do Mar - UFC. In: III CONGRESSO BRASILEIRO DE

OCEANOGRAFIA E I CONGRESSO ÍBERO-AMERICANO DE OCEANOGRAFIA

(Resumos), Associação Brasileira de Oceanografia, Fortaleza, p. 51, 2002.

VINATEA, A. L. Fundamentos de Aqüicultura. Florianópolis: Ed. UFSC, 349 p., 2004.

VINCENT, A. G. & LOTZ, J. M. Time course of necrotizing hepatopancreatitis (NHP) in

experimentally infected Litopenaeus vannamei and quantification of NHP-bacterium using

real-time PCR. Diseases of Aquatic Organisms. v. 67, n. 2, p. 163-169, 2005.

WANG, C. H.; LO, C. F.; LEU, J. H.; CHOU, C. M.; YEH, P. Y.; CHOU, H. Y.; TUNG, M.

C.; CHANG, C. F.; SU, M. S.; KOU, G. H. Purification and genomic analysis of baculovirus

associated with white spot syndrome (WSBV) of Penaeus monodon. Diseases of Aquatic

Organisms. v. 23, p. 239-242, 1995.

WANG, H. C.; WANG, H. C.; LEU, J. H.; KOUC, G, H.; WANG, A. H. J.; LO, C. F. Protein

expression profiling of the shrimp cellular response to white spot syndrome virus infection.


WANG, Y. C.; CHANG, P. S.; CHEN, H. Y. Tissue distribution of prophenoloxidase

transcript in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Fish & Shellfish Immunology.

v. 20, p. 414-418, 2006.

WANG, B.; LI, F.; LUAN, W.; XIE, Y.; ZHANG, C.; LUO, Z.; GUI, L.; YAN, H.; XIANG,

J. Comparison of Gene Expression Profiles of Fenneropenaeus chinensis Challenged with

WSSV and Vibrio. Mar. Biotechnol. v. 10, p. 664-675, 2008a.

WANG, Y.; CHANG, P. S; CHEN, H. Y. Differential time-series expression of immune-

related genes of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei in response to dietary inclusion

of β-1,3-glucan. Fish & Shellfish Immunology. v. 24, p. 113-121, 2008b. WHETTEN, R.; SUN, Y. H.; ZHANG, Y.; SEDEROFF, R. Functional genomics and cell

wall biosynthesis in loblolly pine. Plant Molecular Biology. v. 47, p. 275-291, 2001.


105

WIBAN, I. Domestication of Pacific White Shrimp Revolutionizes Aquaculture. Global

Aquaculture Advocate. p. 42. Jul/Aug. 2007.

WIJEGOONAWARDANEA, P. K. M.; COWLEY, J. A.; PHANA, T.; HODGSONA, R. A.

J.; NIELSENC, L.; KIATPATHOMCHAIC, W.; WALKER, P. J. Genetic diversity in the

yellow head nidovirus complex. Virology. v. 380, n. 2, p. 213-225, 2008.

YANG, F.; HE, J.; LIN, X.; LI, Q.; PAN, D.; ZHANG, X.; XU, X. Complete genome

sequence of the shrimp white spot bacilliform virus. Journal of Virology. v. 75, p. 11811-

11820, 2001.

YANG, L. S.; YIN, Z. X.; LIAO, J. X.; HUANG, X. D.; GUO, C. J.; WENG, S. P.; CHAN,

S. M.; YU, X. Q.; HE, J. G. A Toll receptor in Shrimp. Molecular Immunology. v. 40, p.

1999-2008, 2007.

YEH, S. P.; HSIEH, S. L.; CHENG, W.; LIU, C. H. Immune response of white shrimp,

Litopenaeus vannamei, after a concurrent infection with white spot syndrome virus and

infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus. Fish and Shellfish Immunology.

DOI: 10.1016/j.fsi.2008.09.010, 2008.

YODMUANG, S, TIRASOPHON, W.; ROSHORM, Y.; CHINNIRUNVONG, W.;

PANYIM, S. YHV-protease dsRNA inhibits YHV replication in Penaeus monodon and

prevents mortality. Biochem Biophys Res Commun. v. 341, p. 351-356, 2006.

ZHANG, X. B.; HUANG, C. H.; QIN, Q. W. Antiviral properties of hemocyanin isolated

from shrimp Penaeus monodon. Antivir. Res. v. 61, p. 93-99, 2004.


106

ANEXO 1 - Sequências de nucleotídeos referentes aos genes 882 (A1R2), 730 (A4R10) e 842

(A2R6) prospectados.

- Gene 882 (A1R2) GGACTGGAGTAACATTCGGGAAGCTAGACTGTCCATTATAACAGGCAATGTACACGTTCTCTTCCT

TCAAAGACATCTCAGAGACCACTTACTGAGACACTGTAACCCGGAGTAATCTAAGCTCACTCCTAA

CAAAAGGCTATATGGAAATGAAACTAGCCACAATGAGAATTGAAGATAAGCGTGACGTTTCGAAC

TCTCCACGAGTTCCTCTTCAGACAAAAACTGAAATGGATACCAGAAGAGAAGTTTATATAGTGATA

GGGAGACAGAATTAACAAGATCTGAATCAGGTCTCAGGCGGTGGGT

- Gene 730 (A4R10) ACGATTGGACCCTTACTATAAAACAAGGCAACGAGATCATCATTTATTCAACATTTAAAAGATTCA

TTGGTTCCAATTGAAAGATGTATGTATGCCACTGAAACACTTCTTTACTTATTTTTATATATTTTAAA

GACGTATCAATACAGAAAAATTTAGTGCTAGCCAACAGAGTAAATTATGATGATTGTGTAAGACGA

GGTGTGTTGAGTGCTATTATTAGAAATCGCTTTTTGCCCAAATATTGGATGTTGTGATGCTTGAAAG

GTGAATTAATATAGTTTTGAATGTGTGTTTTGTATTGAGATAATTCAGACGAGGTCCTGCTCTCCCC

CCATGTGCAAAGAGAAGAAAAGATTGAGAAAATTTGTGGTGAAAACAACACGCCAGGATGCCTTG

TTGTTAGGAACATAAAAATAGTTGCTGATTTATATATTTTTGGCCCATGGATACAGCAATGGAATTA

ATCAAAGGTGACAGTTCCAGTGGTATCAAGTAACAGATTGAGAATATAATAGTTTATGTGAAGTGT

AGCAGAGGAAAATTATGGAGATTTAAAAGAATGATTACCTTACATGCAAGTAAAATAATGGAAAG

ATGCTGGTAGAATGGAGGTAAGGGTCCA

- Gene 842 (A2R6) ATTTCTGTCTGAGCTCCGTCTCCTGTCCCGACTCTTTTAACCAAACTCCAAAATCCTCCAGATACCA

AACCGCCAAACTTTGTCCCGATGTTTTTCCTCTATCCGGCATCTTTTTCATCATATCCACAGCCATTC

CGTAGATGTTGACTCCTGATCTATACTCCTCGTTGAAAAATTCTCGATTTTTGGCTCGAACTTTTCTC

TCCCGCTCAGACTCGGGTCCATTCATAATTGCTTTCAGAACTTCCCGGCGTGACTTCAACGGTTCGG

CGTAGTCTGTTCGATATTTTGCCTTTTTCTCGGCTTTCGTTAGCTTTCTTTTGTACGGTTCTTCTTCCA

TTACCTTACGCTTCTTCTTTGGTT

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RUBENS GALDINO FEIJÓ - UFC · Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal do Rio Grande (FURG) ... enfermidades no camarão L. vannamei, sendo duas sequências (882-A1R2