SALINIDADE, LUZ E SACAROSE NA MICROPROPAGAÇÃO … · solução MS líquido, adicionado de 0, 4 e 8 g.L-1 de NaCl, perfazendo três tratamentos. Após Após 90 dias constatou-se

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE

SALINIDADE, LUZ E SACAROSE NA MICROPROPAGAÇÃO DE MANDIOCA

MILENA NASCIMENTO CARDOSO

2016

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE

MILENA NASCIMENTO CARDOSO

SALINIDADE, LUZ E SACAROSE NA MICROPROPAGAÇÃO DE MANDIOCA Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe, como parte das exigências do Curso de Mestrado em Agricultura e Biodiversidade, área de concentração em Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do título de ―Mestre‖. Orientadora Profª. Drª. Ana da Silva Ledo Co-orientadora Drª. Aparecida Gomes Araújo

SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE – BRASIL

2016

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

C268s

Cardoso, Milena Nascimento. Salinidade, luz e sacarose na micropropagação de mandioca /

Milena Nascimento Cardoso; orientadora Ana da Silva Lédo. – São Cristóvão, 2016.

53 f.: il.

Dissertação (mestrado em Agricultura e Biodiversidade)– Universidade Federal de Sergipe, 2016.

1. Mandioca. 2. Sacarose. 3. Salinidade. I. Lédo, Ana da Silva,

orient. II. Título.

CDU 635.23

Aos meus pais, que nunca desistiram de mim e

sempre me apoiaram em toda trajetória até

aqui,

Dedico

AGRADECIMENTOS

À CAPES, pela concessão de bolsa de mestrado.

À EMBRAPA, em especial à Embrapa Tabuleiros Costeiros pelo aporte de recursos.

À Universidade Federal de Sergipe, em especial ao PPGAGRI pela oportunidade.

À minha orientadora Dra Ana da Silva Ledo, obrigada por toda paciência em ensinar e por sempre estar presente mesmo distante.

À Dra Aparecida Gomes Araújo, por todo aprendizado passado e por provar que eu sempre posso conseguir mais do que penso.

Aos doutores que gentilmente concordaram em participar da banca examinadora: Renata Mann e Carlos Alberto Ledo. Obrigada por todas as contribuições e melhorias no meu trabalho.

Ao Analista da Embrapa, Bruno Cardoso, pela paciência e tempo gastos para me ensinar e avaliar meus resultados.

À família LabCult/Embrapa: Leila, Carol, Annie, Inácio, Felipe, Sara, Bela, Paulo, Rafael e Flávia, a convivência diária com vocês foi, e é muito especial. Tenho certeza que vocês foram os presentes que o mestrado me deu!

A meus pais, sem eles nada teria sido possível desde o dia em que nasci. Sem seus esforços, iniciar a graduação não passaria de um sonho.

Aos meus irmãos Amanda e Tarcísio, que me impulsionaram e impulsionam sempre em todos os meus projetos, meu muitíssimo obrigada!

Aos meus avós, tios, primos (as) que sempre torceram e vibraram por cada conquista minha, sem vocês as coisas seriam bem mais difíceis, essa vitória também é de vocês!

Aos amigos da graduação, que sempre me ajudaram em tudo o que eu precisei, ouviram minhas reclamações, me incentivavam a sempre dar o melhor e sempre trocávamos experiências: Deborah, Arthur, Day, Marcélio, Mari, Rafinha, Victor, Júnior e agora Thais vocês sempre conseguem animar os dias mais tristes, mesmo aqueles em que meus experimentos não davam certo. Obrigada por existir!

À todos que contribuíram direta e indiretamente para a conclusão desse trabalho.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. i

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... ii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ......................................................... iii

RESUMO .................................................................................................................................. iv

ABSTRACT ............................................................................................................................... v

1. INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... 1

2. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................................... 2

2.1.Mandioca: origem botânica, usoS e importância .............................................................. 2

2.2 Técnica de micropropagação ............................................................................................ 2

2.3 Estresse salino e teor de prolina ........................................................................................ 4

2.4 Aclimatização ................................................................................................................... 5

2.5 Influência de luz e sacarose na aclimatização................................................................... 6

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 7

5. ARTIGO 1: ESTRESSE SALINO ex vitro EM GENÓTIPOS DE MANDIOCA............... 15

RESUMO ................................................................................................................................. 15

ABSTRACT ............................................................................................................................. 16

5.1. Introdução ...................................................................................................................... 17

5.2. Material e Métodos ........................................................................................................ 17

5.3. Resultados e Discussão .................................................................................................. 18

5.4. Conclusões ..................................................................................................................... 24

5.5. Referências Bibliográficas ............................................................................................. 24

6. ARTIGO 2: INFLUÊNCIA DE LUZ E SACAROSE NO CRESCIMENTO DE GENÓTIPOS DE MANDIOCA ............................................................................................... 28

RESUMO ................................................................................................................................. 28

ABSTRACT ............................................................................................................................. 29

6.1. Introdução ...................................................................................................................... 30

6.2. Material e Métodos ........................................................................................................ 31

6.2.1. Efeito da sacarose na fase de enraizamento in vitro de genótipos de mandioca ..... 31

6.2.2. Efeito da luz natural e artificial e sacarose na fase de enraizamento in vitro de três genótipos de mandioca ...................................................................................................... 31

6.3. Resultados e Discussão .................................................................................................. 32

6.3.1. Efeito da sacarose na fase de enraizamento in vitro de genótipos de mandioca ..... 32

6.3.2 Efeito da luz natural e artificial e da sacarose na fase de enraizamento in vitro de três genótipos de mandioca ............................................................................................... 35

6.5. Conclusões ..................................................................................................................... 37

6.6. Referências Bibliográficas ............................................................................................. 37

7. ARTIGO 3: SALINIDADE in vitro EM GENÓTIPOS DE MANDIOCA ......................... 40

RESUMO .............................................................................................................................. 40

ABSTRACT ............................................................................................................................. 41

7.1. Introdução ...................................................................................................................... 42

7.2 Material e Métodos ......................................................................................................... 42

7.3 Resultados e Discussão ................................................................................................... 43

7.4 Conclusões ...................................................................................................................... 48

7.5 Referências ...................................................................................................................... 48

ANEXOS .................................................................................................................................. 53

i

LISTA DE FIGURAS

Figura Página 5.1 Teores de prolina em genótipos de mandioca na presença de 0; 4 e 8 g.L-1 de

NaCl, com tempo de 45; 60; 75; 90 e 105 dias de exposição............................... 23 6.1 Efeito da sacarose no número de raízes (A), massa seca de tubérculos (B),

diâmetro do pseudocaule (C) e número de gemas (D) dos genótipos Lagoão e BRS Tapioqueira em diferentes concentrações de sacarose................................. 33

7.1 Efeito da salinidade no número de raízes (A), número de folhas (B), massa seca de parte aérea (C), comprimento de parte aérea (D), comprimento de raiz (E) e número de gemas (F) de genótipos de mandioca cultivadas in vitro sob diferentes concentrações salinas (0; 25; 50; 75 e 100 mM) ................................. 43

7.2 Teor de prolina em plantas de mandioca dos genótipos Lagoão e BRS Tapioqueira submetidos a diferentes tratamentos salinos (0; 25; 50; 75 e 100 mM de NaCl) com tempo de 30, 60 e 90 dias de exposição ............................................................................................................................... 46

ii

LISTA DE TABELAS

Tabela Página 5.1 Comprimento da parte aérea, da raiz, número de raízes e de folhas, massa seca

de parte aérea e raízes, número de gemas e diâmetro de pseudocaule de seis genótipos de mandioca submetida a três concentrações de NaCl........................ 19

5.2 Médias dos teores de prolina (µmol.g-1) em genótipos de mandioca na presença de diferentes concentrações de NaCl.................................................................... 27

6.1 Sobrevivência das plantas de mandioca dos genótipos BRS Tapioqueira e Lagoão tratadas com diferentes concentrações de sacarose................................ 31

6.2 Número de folhas, de tubérculos e de gemas, comprimento de parte áerea e da raiz, diâmetro de pseudocaule, massa seca da parte aérea, da raiz e do tubérculo de genótipos de mandioca submetidas a diferentes concentrações de sacarose................................................................................................................. 32

6.3 Comprimento de parte aérea e massa seca de raiz em genótipos de mandioca tratadas com luz natural e artificial....................................................................... 34

6.4 Número de folhas de três genótipos de mandioca sob emprego de luz natural e artificial e tratadas com diferentes concentrações de sacarose.............................. 35

6.5 Massa seca de parte aérea e raiz de três genótipos de mandioca sob efeito de luz natural e artificial e tratadas com diferentes concentrações de sacarose................................................................................................................. 35

7.1 Número de raízes, folhas, brotos e gemas, comprimento e massa seca de parte aérea de plantas de mandioca micropropagadas e sumetidas a diferentes concentrações salinas (0; 25; 50; 75 e 100mM)........................................................................................... 44

7.2 Médias dos teores de prolina (µmol.g-1) em genótipos de mandioca cultivas in

vitro na presença de diferentes concentrações de NaCl ....................................... 46

iii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS Ca+ elemento químico Cálcio g.L-1 gramas por litro K+ elemento químico Potássio µmol.g-1 micromolar por grama Mg2+ elemento químico Magnésio Mmol.g-1 milimolar por grama mM milimol MS meio de cultura estabelecido por Murashige e Skoog (1962) Na+ elemento químico Sódio NaCl cloreto de sódio P5C enzima ∆1-pirrolina-5-carboxilato P5CDH enzima ∆1-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase P5CR enzima ∆1-pirrolina-5-carboxilato redutase P5CS enzima ∆1-pirrolina-5-carboxilato sintetase ProDH enzima prolina desidrogenase

iv

RESUMO CARDOSO, Milena Nascimento. SALINIDADE, LUZ E SACAROSE NA MICROPROPAGAÇÃO DE MANDIOCA. São Cristóvão: UFS, 2016. 53p. (Dissertação – Mestrado em Agricultura e Biodiversidade)*. A mandioca (Manihot esculenta Crantz) pertence à família Euphorbiceae, gênero Manihot, que é composto por 98 espécies, sendo a Manihot esculenta a única comercialmente produzida. Geralmente é propagada vegetativamente, porém, vários fatores como o processo de salinização do solo podem ocasionar danos graves às plantações, diminuindo a produção da mandiocultura. Para a manutenção dos processos fisiológicos em situações adversas como estresse salino, as plantas acumulam aminoácidos compatíveis ao citossol, como a prolina, que auxilia na manutenção da pressão osmótica, mantendo a absorção de água. Mudas micropropagadas in vitro demandam uma série de requisitos, como sala de crescimento com luz artificial e fonte de carbono, o que juntamente com a baixa taxa de sobrevivência na aclimatização, encarecem o produto final. O uso de luz natural ainda na fase de enraizamento in vitro, denominado fotoautotrofia, e a diminuição na concentração de sacarose surgem como possibilidades potenciais para melhorar a aclimatização de plantas, auxiliando na redução de custos e viabilizando o comércio. No capítulo 1, seis genótipos foram utilizados no experimento de salinidade ex vitro: Sergipe, Lagoão, BRS Verdinha, BRS Tapioqueira, BRS Kiriris e BRS Formosa. Durante a aclimatização, as mudas foram regadas semanalmente com solução MS líquido, adicionado de 0, 4 e 8 g.L-1 de NaCl, perfazendo três tratamentos. Após 90 dias constatou-se que as cultivares BRS Formosa e BRS Kiriris apresentaram maior tolerância ao estresse salino e o acúmulo de prolina foi intensificado em todos os genótipos a partir da adição de sal ao substrato. No capítulo 2, os tratamentos foram aplicados na fase de enraizamento in vitro, e com diferentes concentrações de sacarose (10; 20; 30 e 40 g.L-1) para BRS Tapioqueira e Lagoão por 45 dias e transferidas para casa de vegetação, onde permaneceram por 60 dias. Foram avaliados o número de raiz, número de folha, número de tubérculo, comprimento da parte aérea, comprimento de raiz, número de gemas, massa seca da parte aérea, massa seca de raiz e taxa de sobrevivência. Os dois genótipos apresentaram melhor desempenho em concentrações mais altas de sacarose. Num segundo experimento, os tratamentos sacarose (10; 20 e 30 g.L-1) e luz (natural e artificial da sala de crescimento) foram aplicados na mesma fase, e para os genótipos BRS Formosa, BRS Verdinha e Lagoão. Após 45 dias sob luz natural ou luz artificial, os explantes foram transferidos para casa de vegetação. Após 60 dias, a BRS Formosa e Lagoão obtiveram melhores resultados sob luz natural e altas concentrações de sacarose e a BRS Verdinha o melhor desenvolvimento sob luz natural, porem na menor concentração. No Capítulo 3, explantes dos genótipos Lagoão, BRS Tapioqueira e BRS Verdinha foram inoculados em meio MS, sem reguladores de crescimento e com diferentes concentrações salinas (0; 25; 50; 75 e 100 mM). Após 90 dias, BRS Tapioqueira e BRS Verdinha apresentaram maior tolerância ao estresse salino, bem como BRS Tapioqueira maior potencial de osmorregulação devido a sua alta produção de prolina. Palavras-chave: Manihot esculenta Crantz; estresse abiótico; prolina; cultura de tecidos. ___________________

* Comitê Orientador: Drª. Ana da Silva Ledo – Embrapa Tabuleiros Costeiros/ PPGAGRI-UFS (Orientadora),

Drª. Aparecida Gomes Araújo (Co-orientadora)

v

ABSTRACT CARDOSO, Milena Nascimento. SALINITY, LIGHT AND SUCROSE ON THE CASSAVA MICROPROPAGATION. São Cristóvão: UFS, 2016. 53p. (Thesis - Master of Science in Agriculture and Biodiversity)*. Cassava (Manihot esculenta Crantz) belongs to the family Euphorbiceae, Manihot genus, which consists of 98 species Manihot esculenta being the only commercially produced. It is usually propagated vegetatively, but several factors such as the process of soil salination can cause serious damage to crops, decreasing the production of cassava. For the maintenance of physiological processes in adverse conditions such as salt stress, plants accumulate amino acids compatible to the cytosol, such as proline, which assists in maintaining the osmotic pressure, keeping the water absorption. micropropagation in vitro seedlings require a number of requirements, such as growth room with artificial light and carbon source, which together with the low survival rate in the acclimatization, more expensive the final product. The use of natural light even in vitro rooting phase, called photoautotrophy, and the decrease in sucrose concentration appears as potential possibilities to improve the acclimatization of plants, helping reduce costs and enabling trade. In Chapter 1, six genotypes were used in the ex vitro salinity experiment: Sergipe, Lagoão, BRS Verdinha, BRSTapioqueira, BRS Kiriris and BRS Formosa. During acclimatization, the seedlings were watered weekly with MS liquid solution, with or without added 4 or 8 g.L-1 NaCl, making three treatments. After 90 days it was found that the cultivars BRS Formosa and BRS Kiriris had higher salt tolerance and proline accumulation was intensified in all varieties from the addition of salt to the substrate. In Chapter 2, the treatments were applied in vitro rooting phase, and with different concentrations of sucrose (10, 20, 30 and 40 g.L-1) for Tapioqueira and Lagoão for 45 days and transferred to the greenhouse. After 60 days were assessed: root number, leaf number, number of tubercle, shoot length, root length, number of buds, shoot dry weight, root dry weight and survival rate. The two genotypes developed better at higher sucrose concentrations. In a second experiment, the treatments sucrose (10, 20 and 30 g.L-1) and light (natural and artificial growth area) were applied at the same stage, and the BRS Formosa, BRS Verdinha and Lagoão. After 45 days under natural light or artificial light, the explants were transferred to the greenhouse. After 60 days, the BRS Formosa and Lagoão performed better under natural light and high sucrose concentrations, as BRS Verdinha had better development under natural light, but with lower carbohydrate concentration. In Chapter 3, explants of Lagoão, BRS Tapioqueira and BRS Verdinha were inoculated in MS medium without growth regulators and with different salt concentrations (0, 25, 50, 75 and 100 mM). After 90 days, BRS Verdinha and BRS Tapioqueira had higher salt tolerance and BRS Tapioqueira showed greater potential to osmoregulation due to its high proline production. Key-words: Manihot esculenta Crantz; abiotic stress; proline; sucrose; tissue culture. ___________________

* Supervising Committee: Advisor: Drª. Ana da Silva Ledo – Embrapa Tabuleiros Costeiros/ PPGAGRI-UFS,

Drª Aparecida Gomes Araujo (co-advisor)

1

1. INTRODUÇÃO GERAL A mandioca (Manihot esculenta Crantz) se destaca entre as culturas mais importantes

e exploradas pela agricultura. A mandioca pertence à família Euphorbiceae, gênero manihot, que é composto por 98 espécies, sendo a única explorada comercialmente (FIALHO & VIEIRA, 2011). Originária da América do Sul é uma cultura perene e cultivada em várias regiões do mundo pela alta produção de amido em condições adversas. Os prinicpais derivados de importância econômica são a farinha, fécula, doces e salgados (FOTSO et al., 2014; FIALHO & VIEIRA, 2011). Em 2015 foram colhidos mais de um milhão de hectares de mandioca no Brasil, e em Sergipe a produção foi de aproximadamente 380 mil toneladas, atingindo 1,7% da produção do país (IBGE, 2015).

A cultura é normalmente propagada vegetativamente e vários fatores podem influenciar o seu crescimento e produção agrícola, dentre eles o tipo e condições de solo. A salinidade dos solos ocorre em todo o mundo, principalmente em regiões de clima árido e semiárido. No Brasil, as regiões que apresentam essas características são o Nordeste, Norte e parte de Minas Gerais, onde esse evento é agravado pelo manejo inadequado da adubação em cultivos irrigados (GONDIM et al., 2010; NOBREGA et al., 2012; RIBEIRO, 2010).

O efeito da salinidade nas plantas é consequência do componente osmótico, resultante das altas concentrações de solutos no solo, ocasionando déficit hídrico pela redução do potencial osmótico; e do componente iônico, decorrente da elevação nos teores de Na+ e Cl-. A resposta ao estresse é dependente de fatores como genótipo, estádio de desenvolvimento e características da planta (PRISCO & GOMES FILHO, 2010; DA SILVA et al., 2013).

Para manutenção de suas funções fisiológicas e homeostase, proporcionando a regulação do ambiente interno e mantendo condições estáveis, as espécies vegetais desenvolveram sofisticados mecanismos de adaptação. Quando induzidas ao estresse salino, plantas acumulam solutos compatíveis ao citossol, não tóxicos, como a prolina, um aminoácido não nocivo ao metabolismo que auxilia na manutenção da pressão osmótica, mantendo a absorção de água e a continuidade dos processos fisiológicos (MARIJUAN & BOSCH, 2013).

Dentre as tecnologias mais avançadas utilizadas na melhoria da produção, a cultura de tecidos pode fornecer subsídios para introdução de informações genéticas, seleção de genótipos e genes que expressem características de interesse, principalmente comercial. A micropropagação é uma técnica prática e econômica da biotecnologia vegetal realizada sob condições assépticas (BAIRU et al., 2011), porém sua eficiência depende de protocolos eficientes, que permitam o excelente desenvolvimento in vitro e em seguida ex vitro, durante a fase de aclimatização.

A adaptação das plantas produzidas in vitro para as condições ex vitro deve ser cercada de cuidados visando reduzir o estresse causado pelas diferenças entre os ambientes, o que pode causar a morte do indivíduo. O acréscimo da sacarose no meio de cultura é importante, pois fornece energia para os processos fisiológicos da planta, e por outro lado, altas concentrações de sacarose induzem o desenvolvimento de características heterotróficas, diminuindo a sobrevivência das plantas na fase de aclimatização.

A literatura atual descreve a necessidade de se obter sucesso na fase de aclimatização de mudas micropropagadas de mandioca, que pode ser conseguida pela redução nas concentrações de sacarose. Aliado a tal fator, são escassos os estudos sobre tolerância das diferentes genótipos de mandioca aos efeitos da salinidade no solo observadas em áreas do semiárido brasileiro.

Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar respostas bioquímicas e biométricas de genótipos de mandioca induzidas ao estresse salino in vitro e ex vitro, e analisar a influência da sacarose, luz natural e luz artificial no desenvolvimento de mudas micropropagadas.

2

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1.MANDIOCA: ORIGEM BOTÂNICA, USOS E IMPORTÂNCIA A mandioca (Manihot esculenta Crantz), é uma planta perene (FOTSO et al., 2014) e

constitui-se em uma das culturas mais exploradas na agricultura mundial. Pertence à classe das dicotiledônias, ordem Euphorbiales, família Euphorbiaceae, gênero Manihot, que é composto por cerca de 100 espécies, sendo a Manihot esculenta a única comercialmente produzida (FIALHO & VIEIRA, 2011).

Originária da América do Sul, a espécie é um arbusto perene, ciclo bianual e é colhida como anual aos 10-11 meses de idade. Cultivada em países tropicais pela sua alta produção de amido em condições consideradas inadequadas para outras espécies, constitui a segurança alimentar nos países em desenvolvimento (FIALHO & VIEIRA, 2011). Tendo em vista seu elevador teor de amido, a mandioca torna-se matéria-prima adequada na produção de biocombustíveis como o bioetanol, celulose, indústria têxtil, alimentos e bebidas (FAO, 2011).

Estima-se que a mandioca seja componente cotidiano da refeição de cerca de 1 bilhão de pessoas em 105 países, sendo utilizada a raiz para consumo humano, pois além da produção de amido, apresenta micronutrientes que podem variar de acordo com o genótipo (BURNS et al., 2012); e esta juntamente com a parte aérea para alimentação de animais. A mandioca é de origem brasileira e está amplamente distribuída nas zonas tropicais das Américas, África e Ásia. Rica em carboidratos é a terceira maior fonte calórica e energética (FIALHO & VIEIRA, 2011).

Em escala mundial, em 2014, a maior produção de mandioca foi na Nigéria, com aproximadamente 55 milhões de toneladas (FAOSTAT, 2014). O Brasil ultrapassou 1 milhão de hectares colhidos, em 2015, sendo o Pará o maior produtor, com participação de 20,9% no total a ser colhido. Em Sergipe a produção foi aproximadamente 380 mil toneladas de mandioca, sendo a cidade de Lagarto maior produtora (153,9 t), seguida de Itabaiana (23,950 t) e Santa Luzia do Inthany (10,220 t) (IBGE, 2014). Cerca de 80% da produção sergipana é para o consumo humano, vendida na forma de farinha nas feiras, armazéns e supermercados (SERGIPE, 2011).

Estudos com Manihot esculenta vem crescendo de forma considerável, em todos os campos de pesquisa, justificados pelo alto uso de suas raízes e parte aérea. Dentre esses há ensaios sobre reações alérgicas (SANTOS et al., 2011), estudos do proteoma foliar para avaliação de funções fisiológicas (AN et al., 2014), atividade analgésica (MILADIYAH et al., 2011) e efeitos neurotóxicos (RIVADENEYRA-DOMÍNGUEZ et al., 2013).

2.2 TÉCNICA DE MICROPROPAGAÇÃO

A cultura de tecidos é basicamente o crescimento in vitro de plantas a partir de qualquer parte vegetal, em um meio de cultura sob condições nutricionais adequadas (DEB & IMCHEN, 2010; GARCIA-GONZALES, 2010). Pode fornecer subsídios para introdução de informações genéticas, seleção de melhores genótipos e de exemplares que transportam genes de interesse (GARCÍA-GONZÁLES, 2010; AHMADI et al., 2010).

Dentre as tecnologias mais avançadas, a micropropagação ou propagação in vitro clonal, isto é, exclusão de sementes, é a aplicação mais importante, prática e econômica da biotecnologia vegetal (BAIRU et al., 2011), sendo realizada sob condições assépticas in vitro, utilizando pequenos fragmentos de plantas, ou explantes (LEMA-RUMIŃSKA & KULUS, 2014).

Pela rápida multiplicação de plantas, micropropagação é uma técnica refinada e bem adaptada. Devido a rápida velocidade de propagação, têm grandes lucros, plantas com alta qualidade e habilidade de produzir plantas livres de doenças. O processo de propagação tem vários passos: estocagem de plantas sadias, corte de explantes e esterilização, introdução in

3

vitro, proliferação, enraizamento, aclimatização e crescimento das plantas em condições de campo (BUTT et al., 2015).

Esta técnica baseia-se na propriedade da totipotência da célula vegetal: a capacidade de células indiferenciadas se diferenciarem em um tipo de tecido. A partir desse conceito, numerosos trabalhos foram desenvolvidos com objetivo de regenerar plantas inteiras, utilizando meios nutritivos específicos às necessidades de cada espécie. (DEBNATH et al., 2006; CANÇADO et al., 2012). Em geral, fragmentos acima do solo de plantas cultivadas em condições ex vitro e que não possua botões florais, são preferíveis para maior sucesso da técnica, pois são de fácil desinfecção e tem maior poder de regeneração (LEMA-RUMIŃSKA & NIEDOJADLO, 2012).

O sucesso da técnica, porém, está intimamente relacionado aos protocolos eficientes que permitam o excelente desenvolvimento in vitro, e, em seguida ex vitro, durante aclimatização (CANÇADO et al., 2012). Tais protocolos devem cumprir três requisitos: uniformidade do material repicado, ausência de mutações substanciais ou alterações epigenéticas e custo efetivo menor em comparação aos métodos tradicionais (LEMA-RUMIŃSKA & KULUS, 2014).

Sendo assim, a micropropagação pode ser utilizada como uma ferramenta para rápida proliferação de clones em um curto espaço de tempo, conservação do germoplasma, ferramenta industrial para a propagação de plantas, remoção de doenças, produção de espécies temporais ao longo de todo ano, e fabricação de metabólitos secundários (AKIN-IDOWU et al., 2009; GARCIA-GONZALES, 2010; MORAIS et al., 2012).

A limitação na quantidade de cultivares em algumas regiões contribue para a crescente incidência de pragas na mandiocultura, tais como a mosca branca (Bemisia sp.), que ocasiona, em geral, de 23 a 80% de perda no rendimento, dependendo da variedade, da duração e intensidade da incidência (SCHIMITT, 2002). O ácaro verde, Mononychellus tanajoa (Bondar) (Acari: Tetranychidae), por sua vez, é uma das principais pragas da mandioca no Brasil, devido às condições abióticas (temperatura elevada e umidade relativa) que favorecem sua infestação (MORAES & FLECHTMANN, 2008). Dentre outras pragas, estão mariposa Mandarová, mosca-do-broto, cochonilha-das-raízes e coró. Desta forma, o uso da cultura de tecidos é justificado como sendo uma alternativa na produção de mudas com qualidade fitossanitária, já que o método convencional de propagação vegetativa acarreta problemas de disseminação desses patógenos (MORAIS et al., 2012).

Dentre os fatores que podem influenciar a micropropagação in vitro, podem ser citados os fatores externos como temperatura, umidade relativa, fotoperíodo, intensidade luminosa e fatores intrínsecos ao crescimento e desenvolvimento vegetativo dependente das condições nutricionais do meio de cultivo e a aplicação de reguladores de crescimento (LEITZKE et al., 2010). Além destes, elementos como fonte de carbono, e material orgânico (aminoácidos, vitaminas e fitorreguladores) influenciam no crescimento da planta (KADHIMI et al., 2014).

Protocolos permitem estabelecer padrões para a multiplicação massal de várias espécies utilizadas na agricultura a exemplo de Musa sp - bananeira ‗maçã‘ (SIQUEIRA et al. 2013), da batata (BANDINELLI et al., 2013) e morango (KADHIMI et al., 2014).

A mandioca é normalmente propagada vegetativamente a partir de estacas, porém este cultivo é de longa duração e sua taxa de multiplicação é muito baixa e lenta, tendo coeficiente de multiplicação de 1:10, o que dificulta sua adoção (SHIJI et al., 2014). O emprego da cultura de tecidos utilizando Manihot esculenta Crantz ocorre visando o crescimento in vitro e o aperfeiçoamento da aclimatização nos mais variados genótipos (OGERO et al., 2012; SHIJI et al., 2014; FOTSO et al., 2014), expressão calogênica (FLETCHER et al., 2011), bem como auxilia na produção de plantas livres de patógenos (NKAA et al., 2013) e na adequação da embriogênese na produção de etanol (WONGTIEM et al., 2011).

Estudos com mandioca demonstram que utilizando a cultura in vitro, a taxa de multiplicação pode ser melhorada e o material vegetativo pode ser disponibilizado ao longo

4

do ano. O número potencial de material de plantio a partir de um explante nodal usando técnicas de micropropagação foi estimado em 16.000 a 17.000 no período de um ano (SHIJI et al., 2014).

2.3 ESTRESSE SALINO E TEOR DE PROLINA

Salinização é um processo que conduz ao aumento da concentração de sais solúveis (Na+, Ca2+, Mg2+ e K+) no solo em níveis prejudiciais às plantas. Tal acumulação ocorre em função de fatores, como condições climáticas em que os índices de evapotranspiração superam os de precipitação, drenagem deficiente, riqueza do material de origem, entre outros. Algumas das causas são naturais, mas outras resultam da intervenção humana (HOLANDA et al., 2010). Em ambos os casos, a salinidade é um estresse abiótico que afeta o crescimento e a produtividade das plantas (DING et al., 2010; SHAZMA et al., 2011).

Dois tipos de salinização são identificados, sendo a salinização primária um processo natural onde ocorrem poucas chuvas, elevada evaporação e acumulação gradual de íons oriundos do intemperismo. Em contrapartida, a salinização secundária resulta de um evento antrópico ligado ao ambiente marinho (ESTEVES & SUZUKI, 2008).

As regiões do Brasil que apresentam características de solos salinos são o Nordeste e parte do Norte de Minas Gerais, onde a salinização é agravada em decorrência do manejo inadequado da adubação nos cultivos irrigados (GONDIM et al., 2010; NOBREGA et al., 2012; RIBEIRO, 2010). A salinidade oriunda de sais fertilizantes solúveis e transportados pela água é precursora de danos severos as plantas principalmente se aliadas às concentrações salinas e suas interações na relação água-solo-planta (MEDEIROS et al., 2012). Estima-se que o avanço da salinidade possa levar a perda de 30% das terras agricultáveis nos próximos 25 anos e que até 2050 esse prejuízo chegue a 50% (GHOSH et al., 2011).

O processo de salinização está diretamente relacionado ao acúmulo de sais em excesso na solução do solo e seus efeitos nas plantas é consequência de um componente osmótico e outro iônico. No primeiro, a planta é afetada pelos sais que estão no exterior da mesma e é regulado por sinalização proveniente da raiz, sobretudo pelo ácido abscísico (ABA). A segunda fase é caracterizada pela redução do crescimento em função do acúmulo de sais numa quantidade que ultrapassa a capacidade dos vacúolos (PRISCO & GOMES FILHO, 2010; DA SILVA et al., 2013).

Consequentemente, a concentração de sais aumenta no citoplasma e inibe a atividade de enzimas de várias rotas metabólicas, pois o K+ é ativador de mais de 50 destas, não podendo ser substituído pelo Na+

, de modo que uma alta concentração desse íon acarreta na interrupção de vários processos metabólicos, atrelado ao fato de que enzimas não se adaptam a elevadas concentrações salinas (WILLADINO & CAMARA, 2010; PRISCO & GOMES FILHO, 2010).

Em decorrência do fato de que as plantas não podem mover-se, muitas destas desenvolveram sofisticados mecanismos de adaptação importantes para manutenção da homeostase celular em condições salinas. Dentre essas alterações foram constatadas que sob estresse salino, as plantas acumulam solutos compatíveis no citossol, como polióis, betaína, trealose, ectoine, prolina, e outros, não sendo nocivos ao metabolismo (MARIJUAN & BOSCH, 2013).

Efeitos adversos causados pelo excesso de sais na planta incluem distúrbios osmóticos, dificultando a absorção de água pelas raízes, toxicidade por íons e desequilíbrio nutritivo (TAIZ & ZEIGER, 2013). O acúmulo de solutos não nocivos ao metabolismo celular, possibilita que a planta baixe seu potencial hídrico a um patamar inferior ao do solo e aumente a pressão osmótica dentro das células, mantendo a absorção de água e a pressão de turgor destas, garantindo a continuidade dos processos fisiológicos, ainda que em níveis menores (MARIJUAN & BOSCH, 2013).

O osmoprotetor mais comum em plantas de solos salinos é a prolina, justificando extensivas pesquisas. É um soluto com alta sensibilidade de resposta as condições de

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alteração ambiental (ASHRAF et al., 2011) e pode ser considerada um osmólito indicador bioquímico e fisiológico dos efeitos de estresse salino (MONTEIRO et al., 2014). Munns (2005) afirma que a prolina tem dois papéis funcionais: altas concentrações indicam ajuste osmótico e baixas concentrações indicam efeito protetor. A distribuição de solutos varia entre as espécies, sendo a prolina acumulada numa série de plantas taxonomicamente distintas, enquanto a β-alanina betaína parece restringir-se a poucos gêneros das famílias Plumbaginaceae e Quenopodiaceae (WILLADINO & CAMARA, 2010).

Em plantas, o aminoácido L-prolina é sintetizado via glutamato e ∆1-pirrolina-5-carboxilato (P5C) por duas sucessivas reduções, catalisadas pelas enzimas P5C sintetase (P5CS) e P5C redutase (P5CR) (HAW et al., 1999). A expressão do P5CR é regulada por variações de potencial osmótico (WILLIANSON & SLOCUM, 1992) e essa redução induzirá a biossíntese de P5C resultando na produção do aminoácido prolina e por essa razão este aminoácido está relacionado ao ajustamento osmótico. Sendo assim, a via glutamato é predominante em plantas sob condições de estresse osmótico e falta de nitrogênio (DELAUNEY & VERMA, 1993).

Alguns autores sugerem que o acúmulo de prolina livre pode auxiliar nos depósitos de energia (HARES & CRESS, 1997), estabilizador de estruturas subcelulares (SCHOBERT & TSCHECHE, 1978), captura de radicais livres (SARADHI et al., 1995), componente de cascata de sinalização molecular de estresse (WERNER & FINKELSTEIN, 1995) e constituinte principal de parede celular de plantas (NANJO, 1999).

A degradação da prolina é feita por duas enzimas: a prolina desidrogenase (ProDH), que catalisa a conversão de prolina em ∆1-pirrolina-5-carboxilato (P5C), que é então oxidada em glutamato pela P5C desidrogenase (P5CDH) (YOSHIBA et al., 1997).

A influência da salinidade nos aspectos fisiológicos ou morfológicos em plantas foram estudados em arroz (BENITEZ, 2010), nim (FREIRE et al., 2010), sorgo Sudão (FEIJÃO et al., 2011), soja (BUSTINGORRI & LAVADO, 2011), girassol (SÁ et al., 2015), milho (CAMARA et al., 2000), feijão (CÁRDENAS-AVILA et al., 2006), cana- de-açúcar (CHA-UM et al., 2008), mandioca (LIMA et al.,1998; CARRETERO et al., 2007) e trigo (DUARTE et al., 2010) .O aumento no teor de prolina em decorrência de estresse salino também foi constatado em plantas como cana-de-açúcar (GUERZONI, 2014; GIMENEZ et al., 2013; WATANABE et al., 2000), feijoeiro (SOUZA et al., 2011), e guandu (MONTEIRO et al., 2014).

2.4 ACLIMATIZAÇÃO A transferência do ambiente in vitro para o ex vitro requer alterações nas plantas

micropropagadas, com finalidade de redução no estresse causado pelas diferenças entre os ambientes (SILVEIRA et al., 2013). Sendo assim, para sobrevivência das mudas é necessária adaptação a uma atmosfera mais natural, processo denominado aclimatização (DEB & IMCHEN, 2010).

Dentre as fases da micropropagação, a aclimatização é considerada uma das mais críticas e por essa razão exige cuidados (LUZ et al., 2014). Nessa etapa ocorre a transferência das plantas para condições externas ao laboratório, ocorrendo a transição do heterotrofismo para o autotrofismo, havendo um número significativo de espécies vegetais micropropagadas que não resiste a essa etapa (HAZARIKA, 2003; DORNELES & TREVELIN, 2011; PEREIRA FILHO, 2014).

Durante a transferência para a casa de vegetação, as mudas cultivadas in vitro são incapazes de competir com microorganismos do solo e lidar com as condições ambientais (CHANDRA et al., 2010). A alta mortalidade no transplante ocorre devido ao sistema radicular das plantas produzidas in vitro ter sua funcionalidade limitada, pois apresentam poucos pêlos radiculares, que são responsáveis pela absorção de íons e água do solo na fase de aclimatização. Aliado a isso, o contato íntimo entre o solo e a superficie radicular pode ser

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facilmente interrompido, aumentado a perda de água das plantas recém-transplantadas, o que pode ocasionar a morte destas (TAIZ & ZEIGER, 2013).

O ambiente in vitro normalmente tem alta umidade relativa, baixa intensidade de luz e redução das trocas gasosas, o que resulta em baixas taxas de transpiração e fotossíntese de plantas propagadas (SHIN et al., 2013). Durante a aclimatização em casa de vegetação, algumas alterações morfológicas e anatômicas ocorrem tornando as plantas capazes de crescer no novo ambiente, mas também pode ocorrer estresse nas plantas, limitando a produção de mudas (PÁDUA et al., 2014).

O ambiente ex vitro, por sua vez, proporciona as mudas micropropagadas condições abióticas adversas, tais como temperatura diferente do laboratório, intensidade de luz e umidade alteradas, além de estresse biótico, a exemplo, a microflora do solo. Por isso há necessidade dessa fase de aclimatização visando o sucesso e sobrevivência das plantas (DEB & IMCHEN, 2010). Sendo assim, características fisiológicas e condições de aclimatização são de extrema importância para a produção bem-sucedida em larga escala de mudas (BERILLI et al., 2011).

2.5 INFLUÊNCIA DE LUZ E SACAROSE NA ACLIMATIZAÇÃO O elevado gasto com energia elétrica em salas de crescimento é um dos principais

fatores limitantes à expansão do uso da micropropagação (BRAGA et al., 2011). Uma alternativa para diminuição desses gastos é utilização de luz natural, redução nas concentrações de sacarose nas fases de multiplicação e enraizamento resultando em baixas perdas na fase de aclimatização, aumentando assim, a eficiência da micropropagação, viabilizando-a comercialmente (ROCHA, 2013; PEREIRA FILHO, 2014).

Células vegetais cultivadas in vitro não são totalmente autotróficas (YASEEN et al., 2012) sendo este um fator adicional na promoção de elevados custos na produção de mudas micropropagadas. Diante de tal problemática, são utilizados cultivos alternativos ao heterotrófico, que são o fotoautotrófico e mixotrófico. No heterotrofismo, são disponibilizadas as células todos os nutrientes necessários para que desempenhem seus processos metabólicos sem a presença de luz; no cultivo fotoautotrófico, a célula através do processo de fotossíntese realiza suas funções vitais e na mixotrofia, atuam o metabolismo heterotrófico e autotrófico simultaneamente assimilando o CO2 autotroficamente e o carbono orgânico a ela fornecido (RADMANN et al., 2009).

O acréscimo de sacarose no meio de cultura é necessário como fonte de carboidrato (DORNELES & TREVELIN, 2011). Esta possui diversas finalidades, entre elas, fonte de carbono e regulador osmótico das células (MARINO et al., 2010), possuem elevada solubilidade, rápida metabolização pela maioria dos vegetais além de ser responsável por grande parte do transporte de açúcar pelo floema de plantas micropropagadas. Além desses, é fonte de energia para processos com grande gasto energético, como indução de raízes, embriogênese e morfogênese (YASEEN et al., 2012).

Plantas cultivadas em meio contendo elevados níveis de sacarose desenvolvem características mixo ou heterotróficas, reduzindo sua sobrevivência na fase de aclimatização e elevando assim os gastos finais. Devido a isso trabalhos têm sido desenvolvidos para reduzir essas concentrações, induzindo maior grau de autotrofia nesses tecidos (DIGNART et al., 2009; DORNELES & TREVELIN, 2011).

Tecidos de plantas formadas e adaptadas às condições de luz baixa são geralmente frágeis, levando a má sobrevivência sob condições de campo (GEORGE & MANUEL, 2013). Cultivos tratados de forma fotoautotrófica passam pelo processo de rustificação, pois geralmente necessitam de uma fase de alongamento após a multiplicação in vitro, para um ótimo crescimento e alongamento dos rebentos, facilitando as fases subsequentes de propagação e diminuindo as chances de um crescimento lento ou morte durante aclimatização (HUANG et al., 2011; MOLLO et al., 2011).

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As mudas produzidas sob sistemas de cultura de tecido fotoautotróficos com ou sem sacarose, enriquecido com CO2, aumento da intensidade de luz, boa troca gasosa e redução da umidade são mais vigorosas, tem sistemas radiculares maiores, e são menos suscetíveis à contaminação microbiana. Indivíduos adaptados gradualmente do meio in vitro para ex vitro tem maiores taxas de sobrevivência após transferência para o solo, o que pode ocasionar uma melhora no desempenho de plantas em ambientes de estresse, consequentemente, aumentando o rendimento (GEORGE & MANUEL, 2013; XIAO et al., 2011).

O regime mixotrófico é de forma geral, definido como um regime de crescimento em que o carbono orgânico e CO2, simultaneamente, são assimilados pelo metabolismo respiratório e fotossintético (RICHMOND, 2004). A fonte de carbono adicional a estes cultivos possibilita maior rendimento em biomassa, havendo maior disponibilidade de carbono além do produzido via metabolismo fotossintético (CERÓN GARCIA et al., 2006).

Avaliações com três variedades de batata demonstraram que com aumento nos níveis de sacarose de 30 para 60 g.L-1, acarretaram uma diminuição no comprimento da parte aérea, número de folhas e consequentemente o número de entrenós durante o cultivo in vitro. Por outro lado, houve aumento na biomassa das raízes de batata e maior acúmulo de substâncias nos tecidos da planta como sacarose, glicose e frutose (BANDINELLI et al., 2013).

Utilizando metodologia semelhante, Silveira et al. (2013) compararam três concentrações de sacarose na pré-aclimatização de caroá e concluíram que a presença de sacarose no meio beneficia as trocas gasosas e o crescimento das plântulas, proporcionando um melhor desenvolvimento destas na pré-aclimatização o que favorece um maior crescimento das plantas na fase de aclimatização.

Avaliações com Musa spp- banana- demonstraram que explantes micropropagados de forma fotoautotrófica tiveram um maior número de folhas, maior área foliar e maiores taxas fotossintéticas do que as plantas com tratamento fotomixotrófico (NGUYEN & KOZAI, 2001). Utilizando metodologia semelhante, Rocha et al. (2013) observaram que o meio de crescimento foi essencial para multiplicação e enraizamento de cana-de-açúcar, porém diferentes concentrações de sacarose necessitam de ajustes na fonte de luz utilizada para obter melhores resultados.

3. CONCLUSÕES GERAIS

Com a crescente salinização dos solos, é de suma importância a avaliação de espécies com potencial crescimento em ambientes que apresentam tolerância ou resistência à condições adversas, viabilizando a produção destas.

Ajustes em protocolos de aclimatização de mudas de mandioca podem gerar plantas micropropagadas de baixo custo e de qualidade fitossanitária.

A geração de conhecimento técnico-científico para estabelecer protocolos que aumentem a sobrevivência de mudas de mandioca a baixo custo e consequente produção destas, torna-se imprescindível a mandiocultura. 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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5. ARTIGO 1: ESTRESSE SALINO ex vitro EM GENÓTIPOS DE MANDIOCA Periódico submetido (ou a ser submetido): Revista Pesquisa Agropecuária Brasileira

RESUMO A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma espécie perene, que pode ter seu crescimento e produção afetados por estresses abióticos, a exemplo da salinidade. Em resposta ao estresse salino, as plantas cultivadas nesse ambiente podem acumular solutos compatíveis com o citossol, os quais auxiliam na manutenção dos processos fisiológicos, e dentre esses, encontra-se a prolina. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a resposta fitotécnica e determinar o teor de prolina de plantas micropropagadas de seis genótipos de mandioca cultivadas em substrato com diferentes concentrações de sais (NaCl) no ambiente ex vitro. Os tratamentos consistiram de três soluções: MS e MS acrescido com 4 e 8 g.L-1 e seis genótipos de mandioca: Sergipe, Lagoão, BRS Verdinha, BRS Tapioqueira, BRS Kiriris e BRS Formosa. As plantas foram irrigadas semanalmente. Após 90 dias do transplantio, as mudas foram avaliadas quanto ao número de raízes, número de folhas, número de brotos, número de tubérculos, comprimento da parte aérea, comprimento de raiz, número de gemas, diâmetro do pseudocaule, massa seca de parte aérea e raízes. O teor de prolina foi avaliado dos 45 aos 105 dias, com coleta realizada a cada 15 dias. Os genótipos BRS Formosa, BRS Kiriris e Sergipe são mais tolerantes aos efeitos da salinidade. Em todas os genótipos houve acúmulo de prolina a partir da adição de sal, sendo então esta, um indicador de estresse salino em plantas de mandioca. Palavras-chave: Manihot esculenta Crantz; prolina; aclimatização; cultura de tecidos.

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ABSTRACT Título: SALT STRESS ex vitro IN CASSAVA GENOTYPES Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a perennial species, which may have their growth and production affected by abiotic stresses, such as salinity. In response to salt stress, plants grown in this environment can accumulate solutes compatible with the cytosol, which aid in the maintenance of physiological processes, and among these, is proline. This study aimed to evaluate the fitotécnica response and determine the micropropagated plant proline content of six varieties of cassava grown in substrate with different concentrations of salts (NaCl) in the ex vitro environment. Treatments consisted of three solutions: MS and MS increased with 4 and 8 g.L-1 and six cassava genotypes: Sergipe, Lagoão, BRS Verdinha, BRS Tapioqueira, BRS Kiriris e BRS Formosa. The plants were irrigated with weekly treatments up to 105 days and variables were evaluated as number of roots, number of leaves, number of shoots, number of tubers, shoot length, root length, number of internodes, stem diameter, dry mass of shoots and roots and proline content. The genotypes BRS Formosa, BRS Kiriris and Sergipe were more tolerant to the effects of salinity. In all genotypes proline was accumulated from the addition of salt, then this is an indicator of salt stress in cassava. Key-words: Manihot esculenta Crantz; proline; acclimatization; tissue culture.

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5.1. INTRODUÇÃO A mandioca (Manihot esculenta Crantz), é uma espécie perene (FOTSO et al., 2014),

originária da América do Sul e cultivada em países tropicais pela sua alta produção de amido em condições consideradas inadequadas para outras espécies (FIALHO & VIEIRA, 2011). A mandioca compõe a dieta alimentar de aproximadamente um milhão de pessoas em 105 países, sendo utilizada também na produção de amido e alimentação animal (SOUZA, 2011). Tais funções são resultados de micronutrientes presentes na raiz e que podem variar de acordo com o genótipo (BURNS et al., 2012).

A salinidade é um estresse abiótico que afeta o crescimento e a produtividade das plantas (SHAZMA et al., 2011). As regiões do Brasil que apresentam características de solos salinos são o Nordeste e parte do Norte de Minas Gerais (GONDIM et al., 2010). O aumento das áreas degradadas pelo acúmulo de sais no solo poderá levar a perda de cerca de 30% das terras agricultáveis dentro dos próximos 25 anos (GHOSH et al., 2011).

O efeito da salinidade nas plantas é consequência de um componente osmótico em que as plantas são afetadas pelos sais presentes em seu exterior; e um componente iônico, que acumula sais em quantidades acima do suportados pelos vacúolos, reduzindo o crescimento da planta (PRISCO & GOMES FILHO, 2010), causando desequilíbrios que podem provocar toxicidade e como consequência pode ocorrer um estresse secundário de caráter oxidativo (PANDOLF et al., 2012).

Em resposta ao estresse provocado por fatores abióticos, as plantas desenvolveram mecanismos adaptativos eficientes para manutenção da integridade celular de proteínas, enzimas e membranas, colaborando para a manutenção dos processos fisiológicos (ASHRAF et al., 2011). Elas se protegem a partir de alterações bioquímico fisiológicas, em que se destaca o ajuste osmótico, mecanismo em que sob efeito de estresse salino, plantas acumulam em seu citossol solutos não tóxicos como polióis, betaína, trealose, ectoine, prolina, dentre outros (MARIJUAN & BOSCH, 2013; SZABADOS et al., 2011).

O osmoprotetor frequentemente encontrado em plantas de solos salinos é a prolina, sendo um aminoácido essencial, com alta sensibilidade de resposta a alterações ambientais, consistindo em um indicador bioquímico e fisiológico (ASHRAF et al., 2011; MONTEIRO, et al., 2014). A prolina, então, desempenha um papel importante em plantas, protegendo-as de várias tensões e ajudando-as a recuperar o estresse mais rapidamente (HAYAT et al., 2012).

A prolina reduziu o acúmulo de sódio em genótipos de cana-de-açúcar (Saccharum

spp.) avaliadas por Medeiros et al. (2015), demonstrando o potencial osmorregulatório da prolina, já que a inativação de muitas enzimas e da síntese proteica ocorre pela ausência de K+, decorrente de uma maior absorção de Na+ e anormalidade na razão entre os dois, sendo este, então, um fator que contribui para a continuação do crescimento das plantas, mesmo que em menor expressividade.

Trabalhos envolvendo salinidade em mandioca são escassos, Carretero et al. (2007) testaram salinidade em três clones de mandioca e mostraram que os sais afetam negativamente a sobrevivência, desenvolvimento, teor de água nas folhas e composição mineral. Lima et al. (1998) constataram também que a salinidade em plantas de mandioca afeta o crescimento, metabolismo de carboidratos e atividade da peroxidase. O presente estudo teve como objetivo avaliar a resposta bioquímica e biométricas de plantas micropropagadas de mandioca induzidas ao estresse salino ex vitro.

5.2. MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi instalado na casa de vegetação da Embrapa Tabuleiros Costeiros, na

cidade de Aracaju, Sergipe e as mudas de mandioca utilizadas foram provenientes do Instituto Biofábrica Cacau (IBC), localizado na cidade de Uruçuca/BA. Seis genótipos foram utilizados: Sergipe, Lagoão, BRS Verdinha, BRS Tapioqueira, BRS Kiriris e BRS Formosa.

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Mudas enraizadas in vitro foram transplantadas em recipientes com capacidade de 200 mL contendo substrato numa proporção de 50% de pó de fibra de coco e 50% de substrato vegetal comercial (Topstrato) e aclimatizadas em estufa com irrigação por nebulização e sombrite com 50% de filtro de luz solar. Durante a aclimatização, as mudas foram regadas semanalmente com meio de cultura MS líquido, com 0, 4 e 8 g.L-1 de NaCl, perfazendo três tratamentos.

As plantas receberam os tratamentos salinos durante 60 dias de aclimatização. Ao final desse período, foram avaliadas as variáveis: número de raízes, número e folhas, comprimento da parte aérea, número de gemas, diâmetro de pseudocaule, massa seca de parte aérea e raízes. Para determinação do teor de prolina, as plantas receberam os tratamentos até os 105 dias. O teor de prolina foi determinado utilizando o método de reação de ninidrina segundo método colorimétrico (BATES et al., 1973) modificado com a substituição da filtração por centrifugação dos extratros. A extração de prolina foi feita aos 45; 60; 75; 90 e 105 dias após o início da aplicação de cloreto de sódio (NaCl) nas mudas. Foram utilizados 0,7 g de folhas para as amostras com tratamentos MS, 0,5 g de folhas para o tratamento com 4 g.L-1 e 0,3 g de folhas para a solução contendo 8 g.L-1 de sal.

As alíquotas de folhas frescas foram homogeneizadas em 10 mL de ácido sulfosalicílico a 3%, sendo 3 mL para macerar por cerca de 2 minutos e 7 mL para lavar o almofariz. Todos os extratos foram levados para centrifuga a 5000 rpm por 20 minutos a 2ºC para que os aminoácidos presentes se translocassem para o sobrenadante. Após esse processo, foram adicionados à amostra 1 mL de ácido acético, 1mL de ninidrina ácida e levados a banho-maria por 1h a 100ºC. Depois de 1h, o processo foi interrompido em banho de gelo, onde o teste branco (curva padrão) apresentou a cor rosácea e as amostras, cor amarela. Acrescentou-se 2 mL de Tolueno e a solução foi agitada por 5 segundos em vórtex, para separação das fases (formando uma fase transparente e outra rosácea). Com auxílio da pipeta Pasteur, o cromóforo (parte rósea) foi aspirado e colocado em cubeta de quartzo. A mistura foi levada para leitura em Espectrofotômetro molecular e a absorbância foi medida a 520 nm, tanto para as amostras quanto para a curva analítica.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial (6 genótipos x 3 tratamentos salinos), com sete repetições compostas por uma planta cada uma.

Para comparar o teor de prolina foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado (DIC) em parcela subdividida no tempo, com os fatores genótipos e NaCl na parcela e o tempo na na subparcela, com duas repetições. Para o fator tempo, foi utilizado o teste de Regressão, para genótipos o teste de Skott Knott e para salinidade teste de Tukey com 5% de significância. Para todas as análises foi utilizando o software estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011).

5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Houve efeito significativo dos genótipos, dos tratamentos salinos e sua interação para todas as variáveis avaliadas: comprimento da parte aérea, comprimento de raiz, número de raiz, número de folhas, massa seca da parte aérea, massa seca de raízes, número de gemas e diâmetro de pseudocaule. Na variável prolina, houve efeito significativo da interação tripla concentrações salinas, tempo de exposição ao tratamento e genótipos testados (ANEXO 1A).

A salinidade afetou o crescimento dos genótipos aos 60 dias após a aclimatização. Houve redução em comprimento na parte aérea, exceto para BRS Verdinha, na presença de NaCl. BRS Formosa, BRS Kiriris e Sergipe obtiveram as maiores médias quando tratadas com 4 g.L-1 de sal, com médias de 39,27; 43,37 e 46,42 cm, respectivamente e no tratamento 8 g.L-1 o genótipo que mais se destacou foi BRS Formosa com média de 26,88 cm (TABELA 5.1). A inibição no alongamento da parte aérea é resultado de dois processos: redução da absorção de água resultante do déficit hídrico causado pela salinidade e elevada concentração de íons no fluxo transpiratório, ocasionando transformações nas folhas (FARIAS et al., 2009;

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SILVA et al., 2009; GORDIN et al., 2012). Esse resultado também pode ter sido ocasionado pela restrição de nitrogênio, causado pela mineralização do mesmo no solo em consequência da presença de sais nesse ambiente. Sendo assim, o crescimento pode ter sido afetado pela redução de N orgânico disponível, e não pelo excesso de sal (DIAS & BLANCO, 2010).

Houve redução do número de raízes para BRS Kiriris, Lagoão, Sergipe, BRS Tapioqueira e BRS Verdinha quando em adição de cloreto de sódio ao substrato. A cultivar BRS Formosa, continuou emitindo raízes de forma normal mesmo com aumento de NaCl, sendo esta a que mais produziu raízes no tratamento 8 g.L-1, alcançando, em média, 9,87. Munns (2002) afirma que a redução de raizes em estresse salino é consequência exclusiva de alterações nas relações hídricas da célula.

Para BRS Tapioqueira, Lagoão e Verdinha houve redução no número de folhas, na presença de 4 g.L-1NaCl. A cultivar BRS Tapioqueira teve uma redução de aproximadamente cinco vezes, o que pode ser explicado pela dificuldade do ajustamento osmótico em tecidos meristemáticos, como folhas, possibilitando o crescimento continuado (SILVEIRA et al., 2013). Por outro lado, BRS Formosa e Sergipe tiveram as maiores produções nos tratamentos 0 e 4 g.L-1.

TABELA 5.1. Comprimento da parte aérea, da raiz, número de raízes e de folhas, massa seca de parte aérea e raízes, número de gemas e diâmetro de pseudocaule de seis genótipos de mandioca submetidas a três concentrações de NaCl.

NaCl Genótipos

(g.L-1) Formosa Kiriris Lagoão Sergipe Tapioqueira Verdinha

Comprimento parte aérea (cm)

0 50,18 aA 44,68 aA 40,85 aB 36,68 aB 45,86 aA 21,76 aC

4 39,27 bA 43,37 aA 35,37 aB 46,42 aA 32,75 bB 26,63 aB

8 26,88 cA 22,05 bA 22,11 bA 8,80 bB 13,25 cB 26,54 aA

CV (%) 21,65

Comprimento raiz (cm)

0 13,77 aA 17,18 aA 13,57 aA 11,46 abB 16,74 aA 8,07 aB

4 14,33 aA 15,21 aA 12,75 abA 14,16 aA 11,35 bA 11,17 aA

8 9,81 aA 6,71 bA 7,72 bA 6,14 bA 3,85 cA 6,55 aA

CV (%) 39,02

Número de raízes

0 11,25 aB 18,50 aA 20,71 aA 25,00 aA 22,44 aA 8,12 abB

4 12,5 aA 17,12 aA 16,12 abA 16,8 aA 13,62 aA 10,00 aA

8 9,87 aA 9,12 bA 9,42 bA 5,40 bB 5,77 bB 4,87 bB

CV (%) 23,16

Número de folhas

0 8,62 aA 6,87 aA 5,42 aB 8,80 aA 5,77 aB 4,87 aB

4 6,62 abA 7,87 aA 4,25 aB 7,00 aA 3,12 abB 5,00 aB

8 4,75 bA 3,00 bA 1,00 bB 1,40 bB 1,00 bB 3,00 aA

CV (%) 26,43

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Massa seca da parte aérea (g)

0 4,81 aA 3,33 aB 3,53 aB 2,69 aB 3,23 aB 1,28 aC

4 5,23 aA 2,93 aB 2,59 aB 1,87 abC 1,53 bC 1,36 aC

8 2,45 bA 0,77 bB 0,72 bB 0,35 bB 0,52 bB 0,74 aB

CV (%) 43,91

Massa seca das raízes (g)

0 1,50 aA 0,44 aB 0,55 aB 0,28 aB 0,70 aB 1,12 bA

4 0,18 bB 0,58 aB 0,66 aB 0,26 aB 0,32 aB 2,11 aA

8 0,07 bA 0,03 aA 0,03 aA 0,03 aA 0,03 aA 0,56 bA

CV (%) 134,73

Número de gemas

0 18,62 aA 17,12 aA 13,00 aA 13,80 aA 13,66 aA 13,00 aA

4 19,62 aA 16,25 aA 17,62 aA 16,40 aA 13,87 aB 10,62 aB

8 23,62 aA 13,12 aB 14,28 aB 5,00 bC 7,42 bC 15,28 aB

CV (%) 17,17

Diâmetro de pseudocaule (cm)

0 0,66 aA 0,58 aA 0,21 abC 0,34 aB 0,33 aB 0,26 aC

4 0,72 aA 0,54 aB 0,22 aD 0,38 aC 0,38 aC 0,31 aC

8 0,63 aA 0,51 aB 0,11 bD 0,19 bD 0,17 bD 0,27 aC

CV (%) 22,70 Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas não diferem estatisticamente, pelo teste de Tukey e maiúsculas nas

linhas, pertencem ao mesmo grupo pelo teste de Skott Knott, ambos, a 5% de probabilidade de erro.

A presença de 8 g.L-1 de NaCl proporcionou uma diminuição na emissão foliar nos genótipos BRS Formosa, BRS Kiriris, Lagoão, BRS Tapioqueira e Sergipe, do contrário, BRS Verdinha obteve a melhor produção, com uma média de 3,00 folhas por planta. Nesse mesmo tratamento, Lagoão, Sergipe e BRS Tapioqueira tiveram as menores médias de produção foliar, sendo 1,00; 1,40 e 1,00 respectivamente. Esse decréscimo na velocidade de elongação foliar ocasionado pelo estresse salino resulta de uma redução no número de células em processo de elongação, na taxa de elongação dessas células, ou em ambos (WILLADINO & CAMARA, 2010).

Os genótipos BRS Tapioqueira, BRS Verdinha e Sergipe alcançaram menores médias na massa seca de parte aérea no tratamento 4 g.L-1 (1,53 e 1,36, respectivamente). No tratamento com 8 g.L-1 NaCl a maior produção de massa seca foi da cultivar BRS Formosa, com 2,45 g em média. Portanto, os teores de salinidade utilizados foram suficientes para reduzir o crescimento dos genótipos de mandioca. A redução na produtividade em tratamento salino mais severo também foi relatada em sorgo sudão (FEIJÃO et al., 2011) e cana-de-açúcar (MEDEIROS et al., 2015).

O número de gemas reduziu na Sergipe e BRS Tapioqueira, no tratamento salino de maior concentração. Santos (2009) destaca que os efeitos da salinidade na taxa de crescimento de plantas são mais acentuados em tecidos mais jovens, como brotos e gemas, comprometendo os pontos de crescimento e expansão celular em pontos de crescimento das plantas. A cultivar BRS Formosa mostrou-se mais tolerante a salinidade, sendo a que obteve

21

as maiores médias em todos os tratamentos, com 16,82 na ausência de NaCl, 19,62 para 4 g.L-

1 e 23,62 para 8 g.L-1. O diâmetro de pseudocaule também apresentou menores valores na Lagoão em todos os

tratamentos salinos (0,18 em média), contrastando com BRS Formosa, que apresentou as maiores médias em todas as concentrações (0,67, em média). De acordo com Taiz & Zeiger (2013) essa diminuição é fundamental para sobrevivência das mudas, pois possibilita o aumento da pressão hídrica da raiz, auxiliando na subida e absorção de água, permitindo o desenvolvimento, entre outros órgãos, das folhas. A redução do crecimento de caracteres morfológicos em altas concentrações salinas também foram observados por Benitez et al. (2010) em cultivares de arroz.

O estresse salino afetou o crescimento dos genótipos de mandioca testadas, comprovado pela redução no crescimento, na produção de biomassa no teor mais elevado de NaCl (8 g.L-

1). Carretero et al. (2007) demonstraram que o crescimento de mandioca foi afetado a partir de 4 g.L-1 NaCl, porém, danos mais severos foram relatados na presença de 8 g.L-1. Essas alterações no crescimento foram acompanhadas pelo aumento na produção da prolina, o osmoprotetor responsável pela regulação osmótica e manutenção das atividades fisiológicas normais.

Em geral, a BRS Formosa, BRS Kiriris, Sergipe e Lagoão tiveram um aumento significativo na produção de prolina com adição de sal ao substrato, principalmente na maior concentração (8 g.L-1), conforme TABELA 5.2. Esta mesma relação foi observada em folhas maduras de choupo-do-eufrates (Populus euphratica Oliv) cultivadas in vitro e tratadas com 250 mM de NaCl (WATANABE et al., 2000). Esse acúmulo proporcionou a sobrevivência e manutenção do crescimento, apesar de menor, nas plantas quando comparado ao tratamento sem NaCl. Resultados semelhantes foram encontrados por Monteiro et al. (2014) em plântulas de guandu que tiveram redução no crescimento apesar do acúmulo de prolina. Por outro lado, Calvet et al. (2013) observaram em feijão-de-corda comportamento contrário, onde o estresse salino não afetou o crescimento.

TABELA 5.2. Médias dos teores de prolina (µmol.g-1) em genótipos de mandioca na presença de diferentes concentrações de NaCl.

NaCl (g.L-1) Genótipos

Formosa Kiriris Lagoão Sergipe Tapioqueira Verdinha

45 dias

0 1,29 Bb 1,91 Bb 1,05 Bb 1,84 Bb 14,15 Aa 1,64 Bb

4 2,20 Ab 2,22 Ab 1,74 Ab 1,40 Ab 2,61 Ac 1,78 Ab

8 8,11 Da 14,54 Ba 4,88 Ea 8,63 Da 12,13 Cb 20,93 Aa

60 dias

0 1,85 Bb 1,42 Bc 0,52 Bc 1,58 Bb 1,22 Bb 10,22 Ab

4 3,21 Cb 5,88 Bb 3,46 Cb 1,52 Db 8,41 Aa 8,66 Ac

8 20,20 Aa 7,93 Ca 6,47 Da 15,36 Ba 2,26 Eb 16,32 Ba

75 dias

0 1,29 Ba 1,29 Bb 2,15 Aa 0,96 Ba 1,53 Bb 2,78 Ab

4 2,68 Ba 2,03 Bab 1,73 Ba 1,27 Ba 2,10 Bab 6,03 Aa

8 2,43 Ca 3,48 Ba 3,14 Ba 1,54 Ca 3,32 Ba 4,67 Aa

22

90 dias

0 6,03 Aa 1,25 Cb 4,72 Ba 1,54 Cab 1,66 Cb 2,55 Cb

4 1,40 Bb 2,14 Bab 3,50 Aa 0,96 Bb 1,39 Bb 2,15 Bb

8 2,34 Bb 3,23 Ba 3,84 Aa 3,06 Ba 4,24 Aa 4,91 Aa

105 dias

0 1,42 Aa 1,06 Aa 1,38 Aa 0,57 Aa 1,40 Aa 1,50 Aa

4 0,64 Aa 2,45 Aa 1,55 Aa 0,65 Aa 1,46 Aa 1,47 Aa

8 1,66 Ba 1,46 Ba 4,29 Aa 1,8 Ba 1,57 Ba 1,02 Ba

CV (%) 16,82

Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente, pelo teste de

Tukey, a 5% de probabilidade de erro.

A redução do processo de homeostase como resposta fisiológica ao estresse consiste em respostas fisiológicas da planta para adaptar-se ao estresse ao qual foi induzida e que por muitos é tratado como efeitos negativos do mesmo (SILVEIRA et al., 2013).

Aos 45 dias, todos os genótipos apresentaram resposta à produção de prolina na presença de 4 g.L-1 de NaCl de forma semelhante as plantas controle. BRS Verdinha, por sua vez, mostrou ser mais sensível, aumentando significativamente a produção do osmólito protetor, principalmente na concentração salina mais alta (8 g.L-1). As cultivares BRS Tapioqueira e BRS Kiriris apresentaram produção muito alta, com sinuosa diminuição em 8 g.L-1, que pode ter ocorrido por um retardo na resposta fisiológica ao sal. Isto leva a considerar que a escala de tempo de exposição pode gerar variados mecanismos de tolerância em diferentes gentótipos dentro de uma mesma espécie (WILADINO & CÂMARA, 2010).

Aos 60 dias, a BRS Tapioqueira e BRS Verdinha apresentaram maior sensibilidade a concentração intermediária de NaCl (4 g.L-1), com alto metabolismo de prolina (8,41 e 8,66 µmol.g-1). BRS Formosa apresentou a maior média quando submetida a alta concentração salina (20 µmol.g-1), demonstrando uma maior tolerância quando comparada com as demais. Entretanto, aos 75 dias, BRS Tapioqueira demonstrou uma resposta mais eficaz em alta concentração salina, porém o genótipo que se mostrou mais tolerante nesse tempo foi BRS Verdinha, respondendo a adição de sal ao substrato, obtendo médias 6,03 e 4,67, respectivamente, diferentes significativamente do controle. Tal resposta fez-se necessário para um ajuste osmótivo na célula vegetal, assegurando a manutenção do turgor e entrada de água para o crescimento celular (WILLADINO & CÂMARA, 2010).

A partir dos 90 dias, a produção de prolina tornou-se maior para o tratamento salino mais rigoroso (8 g.L-1) em todas os genótipos testados, o que demonstra tentativas de osmorregulação natural das plantas, já que o acúmulo de solutos como a prolina possibilita que a planta desenvolva reações que permitas a continuidade dos processos fisiológicos (MARIJUAN & BOSCH, 2013).

Os genótipos BRS Kiriris, Lagoão e Sergipe (Figuras 5.1A, 5.1B, 5.1C) apresentaram uma menor produção de prolina e constante na ausência de NaCl, sendo que com o aumento do tempo, houve uma redução sutil na produção do aminoácido. Esse resultado é esperado considerando que a prolina é um aminoácido não essencial produzido pelas plantas (RIBEIRO et al., 2007). Para os demais genótipos, a alteração no padrão do acúmulo de prolina pode estar relacionada ao fato das respostas ao estresse serem dependentes de fatores como genótipo e características da planta (PRISCO & GOMES FILHO, 2010).

Em torno dos 60 dias ocorreu a maior produção da prolina na presença de 4 g.L-1, nas cultivares BRS Kiriris, BRS Tapioqueira e BRS Verdinha e com posterior diminuição e

23

manutenção da produção (Figura 5.1A, 5.1D e 5.1E). Tal resposta é resultado de um maior tempo de exposição e tentativa de osmorregulação pelas plantas. Comprovando tais considerações, nesse tratamento, praticamente todos os caracteres morfológicos avaliados não diferiram das plantas controle. Aos 75 dias, todos os genótipos apresentaram uma tendência de redução no teor de prolina com exposição ao tratamento salino 4 g.L-1, mostrando uma possível homeostase e manutenção dos processos fisiológicos, já que em altas concentrações, a prolina ocasiona ajuste osmótico (MUNNS, 2002).

FIGURA 5.1. Teores de prolina em genótipos de mandioca na presença de 0; 4 e 8 g.L-1 de NaCl, com tempo de 45; 60; 75; 90 e 105 dias de exposição. (A) Cultivar BRS Kiriris. (B) Genótipo Lagoão. (C) Genótipo Sergipe. (D) Cultivar BRS Tapioqueira. (E) Cultivar BRS Verdinha. (F) Cultivar BRS Formosa. ● 0 g.L-1 NaCl; ■ 4,0 g.L-1 NaCl ; ▲ 8,0 g.L-1 NaCl.

O aumento na produção do aminoácido aos 45 e 60 dias, com posterior declínio foi observado em todos os materiais testados. Confirmando tais efeitos, os aspectos fitotécnicos analisados, sofreram decréscimo à medida que houve diminuição da presença do osmólito na planta. Ao contrário em Morinda citrifolia, conhecido como noni, as plantas que mais acumularam prolina foram as que tiveram reduções mais drásticas no crescimento (DE SOUZA et al., 2014).

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5 Teo

r de

pro

lina

(µ

m.g

-1)

Tempo (dias)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5

Teo

r de

pro

lina

(µ

m.g

-

1 )

Tempo (dias)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5 Teo

r de

pro

lina

(µ

m.g

-1)

Tempo (dias)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5 Teo

r de

pro

lina

(µ

m.g

-1)

Tempo (dias)

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5

Teo

r de

pro

lina

(µ

m.g

-1)

Tempo (dias) 0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

4 5 6 0 7 5 9 0 1 0 5

Teo

r de

pro

lina

(µ

m.g

-1)

Tempo (dias)

A B

C D

E F

24

5.4. CONCLUSÕES

1. As cultivares BRS Formosa e BRS Kiriris são tolerantes ao estresse salino na

concentração 8 g.L-1;

2. Os genótipos BRS Verdinha e Lagoão são sensíveis ao estresse salino ao longo do tempo;

3. O acúmulo de prolina é intensificado com a presença de NaCl em todas os genótipos de mandioca;

4. A prolina pode ser utilizada como um indicador bioquímico de resposta ao estresse salino em plantas de mandioca.

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6. ARTIGO 2: INFLUÊNCIA DE LUZ E SACAROSE NO CRESCIMENTO DE GENÓTIPOS DE MANDIOCA Periódico submetido (ou a ser submetido): Revista Plant Cell and Micropropagation

RESUMO A mandioca é a única espécie do gênero Manihot comercialmente produzida. A produção de mudas micropropagadas possui limitações, e entre estas está o alto custo com energia utilizadas nas salas de crescimento, e na taxa de sobrevivência das plantas na fase de aclimatização, porém a cultura de tecidos é uma ferramenta de multiplicação rápida e obtenção de plantas sadias (cultura de meristema), pois o método de propagação vegetativa acarreta problemas fitossanitários como disseminação de patógenos. Uma alternativa para diminuir gastos dessa técnica seria a redução de sacarose ao meio e indução de enraizamento sob luz natural em casa de vegetação. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a influência da luz e sacarose na sobrevivência e desenvolvimento de mudas de mandioca micropropagada de diferentes genótipos. Os genótipos BRS Formosa, Lagoão e BRS Verdinha foram cultivados em meio MS acrescido de diferentes concentrações de sacarose (10; 20 e 30 g.L-1), e após 30 dias em sala de crescimento metade dos frascos foram transferidos para casa de vegetação por 15 dias e a outra metade foi mantida em sala de crescimento. Após esse período, todos os tratamentos forma transferidos para bandejas com substratos em mantidos em casa de vegetação até 60 dias. Em cultivos envolvendo diferentes tipos de luz, BRS Formosa e Lagoão, tiveram melhores médias sob luz natural e altas concentrações de sacarose, enquanto que BRS Verdinha teve um melhor desenvolvimento em luz natural e baixa concentração de sacarose. Palavras-chave: Manihot esculenta; carboidratos; micropropagação; aclimatização.

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ABSTRACT Título: LIGHT INFLUENCE AND SUCROSE ON THE CASSAVA GENOTYPES GROWTH Cassava is the only species of Manihot commercially produced genre. The production of plantlets has limitations, and among these is the high cost of energy used in growing areas, and the survival rate of plants during the acclimatization phase, but the tissue culture is a rapid multiplication of tools and production of plants sound (meristem culture), for the vegetative propagation method entails phytosanitary problems such as the spread of pathogens. An alternative to reduce spending this technique would be the reduction of sucrose in half and induction rooting under natural light in the greenhouse. Thus, the aim of this study was to evaluate the influence of light and sucrose on the survival and development of micropropagated cassava seedlings of different genotypes. The genotypes BRS Formosa, Lagoão and BRS Verdinha grown in MS medium supplemented with different concentrations of sucrose (10; 20 e 30 g.L-1), and after 30 days in a growth chamber, the flasks were incubated in a growth room and house a greenhouse for 15 days. The plants were transferred to the greenhouse and evaluated after 60 days of acclimatization. In crops involving different types of light, BRS Formosa and Lagoão, had better averages under natural light and high sucrose concentrations, while BRS Verdinha had a better development in natural light and low concentrations of sucrose. Key-words: Manihot esculenta carbohydrates; micropropagation; acclimatization.

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6.1. INTRODUÇÃO

A mandioca é amplamente cultivada pelo mundo, principalmente em regiões tropicais e

ocupa a quarta maior fonte de hidratos de carbono (BLAGBROUGH et al., 2010). Pertence à classe das dicotiledôneas, ordem Euphorbiales, família Euphorbiaceae, gênero Manihot, que é composto por cerca de 100 espécies, sendo a Manihot esculenta Crantz a única comercialmente produzida (FIALHO & VIEIRA, 2011).

Nos países em desenvolvimento, a mandioca muitas vezes é cultivada por agricultores de subsistência, pois apresenta fácil sistema de propagação e tolerância a condições severas, como seca e pouca demanda nutricional (COSTA et al., 2011). Porém, este cultivo é de longa duração e sua taxa de multiplicação é muito baixa e lenta, o que se constitui uma limitação para a produção de mudas e estabelecimento de cultivos racionais (SHIJI et al., 2014; SILVEIRA et al., 2009b). Desse modo a cultura de tecidos de plantas, com suas variadas técnicas, tem sido aplicada em programas de conservação, melhoramento genético e propagação, visando a melhoria do sistema de produção de mandioca.

O processo de micropropagação tem vários passos: estocagem de plantas sadias, corte de explantes e esterilização, introdução in vitro proliferação, enraizamento, aclimatização e crescimento das plantas em condições de campo (BUTT et al., 2015). Dentre esses, a aclimatização é considerada uma das mais críticas e por essa razão exige cuidados (LUZ et al., 2014). Nessa etapa, ocorre a transferência das plantas para condições externas ao laboratório, sendo esta a transição do heterotrofismo para o autotrofismo, havendo um número expressivo de espécies vegetais micropropagadas que não sobrevive a esse período (HAZARIKA, 2003; DORNELES & TREVELIN, 2011; PEREIRA FILHO, 2014).

Uma alternativa para diminuição do tempo e aumento nas taxas de sobrevivência das plantas nessa etapa é a passagem das plantas por um período de rustificação ou pré-aclimatização, que consiste em mudanças no ambiente in vitro para estimular a transição do heterotrofismo para o autotrofismo (CHANDRA et al., 2010). Nesse cultivo, o crescimento da planta depende da presença de açúcar, tornando-se fundamental como fonte de carboidratos (KOZAI & ZOBAYED, 2000).

Uma alternativa para o aumento da sobrevivência das mudas é o cultivo fotoautotrófico, que consiste em um sistema de cultivo in vitro em ambiente de luz natural (BRAGA et al., 2011). Indivíduos adaptados gradualmente do meio in vitro para ex vitro podem apresentar uma melhora no desempenho em ambientes de estresse, consequentemente aumentando o rendimento (GEORGE & MANUEL, 2013; XIAO et al., 2011).

Existem poucos estudos in vitro e ex vitro considerando diferentes concentrações de sacarose no processo de micropropagação de mandioca, a maioria dos estudos tem enfoque em alterações na concentração de sacarose para fins de conservação (VIEIRA et al., 2015; SINTIM & AKROMAH, 2015). A influência de luz e diferentes concentrações de sacarose no meio foram testadas em porta-enxertos de pereira (LEITE et al., 2000), mirtilo (DAMIANI & SCHUCH, 2008), tomilho (BANDEIRA et al., 2008) e ginseng brasileiro (MALDANER et al., 2006).

Estudos demonstrando a eficiência da sacarose na aclimatização das plantas foram feitos por Tanno & Biasi (2013), que avaliaram doses crescentes de açúcar no meio MS em cultivo de videiras, e após 35 dias, proporcionaram 100% de plantas enraizadas e com maior altura, maior número de folhas e maior comprimento médio das raízes, em relação à ausência de sacarose. Para as plantas de caroá, características como comprimento, produção de matéria seca, taxa de sobrevivência e enraizamento mostraram-se dependentes das concentrações de açúcar, e os melhores resultados foram obtidos quando o meio MS foi suplementado com sacarose a 15 ou 30 g.L-1 (SILVEIRA et al., 2013).

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O objetivo desse trabalho foi avaliar as respostas biométricas de mudas de mandioca micropropagadas na presença de diferentes concentrações de sacarose em luz natural e artificial, visando otimizar o protocolo de micropropagação. 6.2. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram instalados no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas e na casa de vegetação da Embrapa Tabuleiros Costeiros, na cidade de Aracaju, Sergipe.

Ápices caulinares já estabelecidos in vitro de todas os genótipos foram repicados a cada trinta dias em meio MS, acrescidos com 30 g.L-1 de sacarose, reguladores de crescimento (BAP, ANA e GA3) e gelificado com 4 g.L-1 de Phytagel®, para obtenção de brotações.

6.2.1. Efeito da sacarose na fase de enraizamento in vitro de genótipos de mandioca Os tratamentos foram aplicados na etapa de enraizamento in vitro, sendo constituídos de

meios de cultivos MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), sem reguladores de crescimento, gelificados com 4 g.L-1 de Phytagel® e contendo as seguintes concentrações de sacarose (10, 20, 30 e 40 g.L-1) e os genótipos BRS Tapioqueira e Lagoão. O tratamento controle foi considerado aquele contendo 30 g.L-1 de sacarose, concentração esta componente da formulação do meio MS.

Após inoculação dos explantes, os frascos permaneceram na sala de crescimento (temperatura de 25± 2º C, umidade relativa do ar média em torno de 70%, fotoperíodo de 12 horas e intensidade luminosa de 60 µmol.m-2.s-1) por 45 dias. Após esse período, as plantas tiveram suas raízes lavadas e podadas (permanecendo aproximadamente 1 cm de raízes), sendo em seguida transferidas para bandejas com volume aproximado de 50 mL por célula, contendo, substrato comercial Topstrato e vermiculita, na proporção de 1:1. As bandejas foram mantidas em telado sombreado a 50% com irrigação por nebulização durante 60 dias. Após esse período, foram avaliadas as variáveis: número de raiz, número de folha, número de tubérculo, comprimento da parte aérea, comprimento de raiz, número de gemas, massa seca da parte aérea, massa seca de raiz e taxa de sobrevivência.

O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial (4x2) sendo quatro concentrações de sacarose, dois genótipos com 3 repetições, contendo três explantes cada uma. Para comparar os genótipos analisadas foi utilizado o Teste de Tukey e para o fator concentração de sacarose foi utilizado o Teste de Regressão, a 5% de significância utilizando o software estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011). Os dados de contagem foram transformados pela equação (x+0,5)^0,5, visando o atendimento das pressuposições da análise de variância.

6.2.2. Efeito da luz natural e artificial e sacarose na fase de enraizamento in vitro de três genótipos de mandioca

Para avaliação da influência da luz, os tratamentos foram aplicados na etapa de enraizamento in vitro, sendo constituídos de meios de cultivo com as seguintes concentrações de sacarose (10, 20 e 30 g.L-1) e ambientes de cultivo (Sala de crescimento – luz artificial – mesmas condições citadas anteriormente e Estufa – luz natural) e três genótipos: BRS Formosa, BRS Verdinha e Lagoão, perfazendo um total de 18 tratamentos. O meio utilizado foi o MS sem reguladores de crescimento e solidificado com ágar (6 g.L-1).

Todos os frascos permaneceram em sala de crescimento por 30 dias, sendo que após esse período metade dos frascos de cada tratamento foram transferidos para luz natural ou casa de vegetação para enraizamento in vitro por mais 15 dias e os outros permaneceram em sala de crescimento (luz artificial). Decorridos esse período, as plantas tiveram suas raízes lavadas e podadas (deixando-se 1 cm de raízes), sendo em seguida transplantadas em bandejas preenchidas com substrato comercial Topstrato e fibra de coco (1:1). As plantas foram mantidas em casa de vegetação, por 60 dias. Após esse período, analisou-se o crescimento das plantas, determinando-se as seguintes variáveis: número de folhas, comprimento da parte

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aérea, diâmetro do pseudocaule (medido no colo da planta) e massa seca de parte aérea e de raízes.

O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial (3x3x2), sendo três genótipos, três concentrações de sacarose e dois tipos de luz, com cinco repetições contendo três explantes cada uma. Os dados obtidos foram submetidos à análise da variância pelo teste F a 5% de probabilidade e, nos casos de significância, realizou-se teste de Tukey, utilizando o software estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011). Os dados de contagem foram transformados pela equação (x+0,5)^0,5, visando o atendimento das pressuposições da análise de variância.

6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.3.1. Efeito da sacarose na fase de enraizamento in vitro de genótipos de mandioca

Não houve efeito significativo dos genótipos e de concentrações de sacarose para número de folhas, número de tubérculos, número de gemas, massa seca da parte aérea e massa seca de raiz. Houve efeito significativo da sacarose para número de raízes e sobrevivência e dos genótipos para comprimento de parte aérea e comprimento de raiz. A interação entre genótipos e concentrações de sacarose foi significativa para massa seca de tubérculo, diâmetro de pseudocaule e número de gemas. A sacarose influenciou no crescimento de raízes (ANEXO 3A).

Nas concentrações mais baixas de sacarose, a taxa de sobrevivência das plantas foi menor (TABELA 6.1), demonstrando a importância deste carboidrato no desenvolvimento das plantas in vitro, suprindo suas necessidades metabólicas, participando da geração de energia ou como fonte de esqueletos carbônicos para vários processos biossintéticos implicados no crescimento e diferenciação celular (LEIFERT et al., 1995) e principalmente em sua adaptação durante o processo de aclimatização. Resultados semelhantes foram encontrados por Tanno & Biasi (2013), em que nas concentrações de 15 e 30 g.L-1 de sacarose, a taxa de sobrevivência de videiras foi maior, que quando cultivadas sem o açúcar.

TABELA 6.1. Sobrevivência de plantas de mandioca dos genótipos BRS Tapioqueira e Lagoão tratadas com diferentes concentrações de sacarose.

Sacarose (g.L-1) Sobrevivência (%) 10 17,35 20 20,50 30 57,50 40 76,00

Ao contrário, Bandinelli et al. (2013) afirmou que a concentração de sacarose ao meio

MS não afetou a sobrevivência ex vitro de batata. Esses resultados contraditórios reforçam que o efeito da sacarose em condições in vitro e ex vitro é dependente do genótipo (SANTANA et al., 2011; VIEIRA et al., 2015; COSTA et al., 2009). A sacarose influenciou no crescimento radicular (TABELA 6.2), principalmente da Lagoão, que suas raízes tiveram em média 11,99 cm de comprimento, diferindo de BRS Tapioqueira.

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TABELA 6.2. Número de folhas, de tubérculos e de gemas, comprimento de parte aérea e da raiz, diâmetro de pseudocaule, massa seca de parte aérea, da raiz e do tubérculo de genótipos de mandioca submetidas a diferentes concentrações de sacarose.

Sacarose ( g.L-1) Genótipos 10 20 30 40 Média

Número de folhas Lagoão 7,2 6,33 6,14 5,87 6,30

BRS Tapioqueira 7,0 2,00 6,80 7,55 6,94 CV (%) 18,73

Número de tubérculos Lagoão 0,40 0,00 0,57 0,87 0,73 a

BRS Tapioqueira 1,00 1,33 0,60 0,44 0,59 a CV (%) 26,38

Comprimento de parte aérea (cm) Lagoão 12,58 12,86 12,40 13,06 12,73 a

BRS Tapioqueira 8,60 4,00 9,40 10,60 9,62 b CV (%) 28,30

Comprimento de raiz (cm) Lagoão 11,38 14,16 10,84 12,56 11,99 a

BRS Tapioqueira 6,95 5,90 9,60 9,83 9,19 b CV (%) 24,25

Número de gemas Lagoão 9,60 a 12,00 a 10,00 a 10,75 a 10,43

BRS Tapioqueira 10,5 a 2,00 b 9,20 a 11,00 a 9,88 CV(%) 16,17

Diâmetro de pseudocaule (cm) Lagoão 0,23 a 0,29 a 0,27 a 0,31 a 0,28

BRS Tapioqueira 0,24 a 0,09 b 0,22 a 0,26 a 0,23 CV(%) 20,25

Massa seca de parte aérea (g) Lagoão 0,15 0,18 0,17 0,23 0,19

BRS Tapioqueira 0,12 0,01 0,12 0,20 0,15 CV(%) 50,38

Massa seca de raiz (g) Lagoão 0,02 0,000 0,03 0,02 0,02

BRS Tapioqueira 0,01 0,006 0,01 0,02 0,01 CV(%) 67,49

Massa seca de tubérculo (g) Lagoão 0,01 b 0,00 a 0,05 a 0,04 a 0,05

BRS Tapioqueira 0,16 a 0,10 a 0,05 a 0,07 a 0,05 CV(%) 117,50

Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas não diferem estatisticamente, pelo teste de Tukey e maiúsculas nas

linhas, não diferem estatisticamente, pelo teste de Skott Knott, ambos, a 5% de probabilidade de erro.

De forma geral, a maior produção de raízes de seu na concentração 40 g.L-1, com produção média de 6,17 (FIGURA 6.1A). Sacarose como fonte de carboidrato também influenciou o crescimento médio das raízes de morango (CALVETE et al., 2002) e mamoeiro (SCHMILDT et al., 2007).

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FIGURA 6.1. Efeito da sacarose no número de raízes (A), massa seca de tubérculos (B), diâmetro do pseudocaule (C) e número de gemas (D) dos genótipos Lagoão e BRS Tapioqueira em diferentes concentrações de sacarose.

A produção foliar na Lagoão teve um decréscimo com o incremento de sacarose ao meio, fato também mencionado por Bandeira et al. (2007) em estudos com tomilho. Este fato pode estar relacionado com a diminuição da capacidade fotoautotrófica das plantas cultivadas em concentrações maiores de sacarose, o que afetaria o desenvolvimento da parte aérea das mesmas (LEITE et al., 2000).

O número de tubérculos mostrou um acréscimo para a Lagoão, com o aumento da concentração de sacarose (FIGURA 6.1.B). Lima et al. (1999) em estudo de caracterização físico-química de raízes de oito variedades de mandioca observaram que o amido nas raízes variou de 23 a 37%. Esses podem estar relacionados a sacarose, um dissacarídeo precursor do amido, principal constituinte dos tubérculos de mandioca e sua produção ocasionar exclusão do uso de sacarose como fonte energética (TAIZ & ZEIGER, 2013). Para a variedade BRS Tapioqueira houve redução de número de tubérculos com o aumento da concentração de sacarose. Este fato que pode estar relacionado ao incremento das demais variáveis, indicando que o carboidrato foi utilizado prioritariamente como fonte de carbono no auxílio do crescimento da planta.

O genótipo Lagoão obteve as melhores médias para comprimento de parte aérea quando tratada com diferentes concentrações de sacarose. Uma redução, apesar de não significativa foi constatada para esta variável, na concentração de 20 g.L-1 na variedade BRS Tapioqueira mostrando que tal concentração não é interessante para trabalhos de multiplicação dessa variedade. A altura de brotos de Agapanthus umbellatus foi medida por Fogaça et al. (2007) e as maiores médias foram encontradas no tratamento com meio MS acrescido de 15 g.L-1 de sacarose.

Ocorreu uma constância na formação de gemas para os dois genótipos ((FIGURA 6.1.D), contrariando resultados encontrados por Bandinelli et al. (2013) em variedades de batata, que sob aumento nas concentrações de açúcar, houve diminuição de produção foliar e

0

0,05

0,1

0,15

0,2

10 20 30 40Mas

sa s

eca

de tu

bérc

ulo

(g)

Sacarose (g.L-1)

Lagoão BRS Tapioqueira

▲y = 0,002x + 0,229 R² = 0,718

●y = 0,0005x2 - 0,0226x + 0,4038 R² = 0,6109

0

0,1

0,2

0,3

0,4

10 20 30 40

Diâ

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m)

Sacarose (g.L-1)


0

5

10

15

10 20 30 40Núm

ero

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emas

Sacarose (g.L-1)


y = 0,0918x + 1,95 R² = 0,5878

02468

10 20 30 40Núm

ero

de r

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s

Sacarose (g.L-1) A B

C D

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entrenós. Rocha et al. (2013) afirmou que a presença de sacarose no meio de crescimento foi essencial para a multiplicação de gemas em cana-de-açúcar.

O diâmetro do pseudocaule apresentou diferença entre os genótipos na concentração de 20 g.L-1 de sacarose, sendo que Lagoão foi mais responsiva quanto a essa variável. O Diâmetro de pseudocaule apresentou um comportamento linear para Lagoão e de segundo grau para a BRS Tapioqueira (FIGURA 6.1C). Tais resultados indicam, que as exigências de sacarose in vitro para o crescimento é variável até mesmo entre genótipos da mesma espécie.

Não houve diferença na produção de massa seca de parte aérea e massa seca de raiz entre os dois genótipos, porém para na BRS Tapioqueira, houve um decréscimo na média da massa seca de parte aérea no tratamento com 20 g.L-1 de sacarose.

A BRS Tapioqueira apresentou redução na massa seca de tubérculo de acordo com o aumento na concentração de sacarose, fato que pode estar relacionado ao aumento das demais variáveis analisadas, indicando que o carboidrato foi utilizado prioritariamente como fonte de carbono no auxílio do crescimento da planta. A Lagoão apresentou uma menor produção no tratamento contendo 10 g.L-1 de açúcar, com posterior aumento para os demais tratamentos, indicando a importância do uso do carboidrato na produção de amido (TAIZ & ZEIGER, 2013).

6.3.2 Efeito da luz natural e artificial e da sacarose na fase de enraizamento in vitro de três genótipos de mandioca

Houve efeito significativo da interação tripla (variedade x sacarose x luz) para as variáveis número de folhas; da interação dupla (luz x variedade) para comprimento da parte aérea, massa seca de parte aérea e da interação luz x sacarose para massa seca da parte aérea. Os fatores variedade, luz e sacarose foram significativos isoladamente para massa seca de raiz (ANEXO 4A).

Para o comprimento de parte aérea, a Lagoão em luz artificial e BRS Formosa em luz natural foram as que obtiveram as maiores médias com 8,66 e 7,77 respectivamente. Houve incremento de biomassa na luz natural na Lagoão (TABELA 6.3). A diminuição na altura em plantas cultivadas em luz natural quando comparadas com luz artificial, pode ser atribuída ao fato do cultivo inicialmente em sala de crescimento com baixa intensidade luminosa, originam plantas com elevado conteúdo de água que, quando aclimatadas, possuem desordens anatômicas e fisiológicas que não possibilitam que o aparato fotossintético opere normalmente (ARIGITA et al., 2002), inibindo o alongamento do caule (estiolamento). TABELA 6.3. Comprimento de parte aérea e massa seca de raiz em genótipos de mandioca tratadas com luz natural e artificial.

Genótipos

BRS Formosa

Lagoão BRS Verdinha

Comprimento de parte aérea (cm) Luz Artificial 7,62 aB 8,66 aA 7,71 aB Luz Natural 7,77 aA 6,32 bC 7,02 bB

CV (%) 16,96 Massa seca de parte aérea (g)

Luz Artificial 0,25 aB 0,45 aA 0,25 aB Luz Natural 0,21 aB 0,30 bA 0,22 aB

CV (%) 54,43 Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas não diferem estatisticamente, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.

Não houve diferença significativa para o número de folhas formadas inicialmente na fase in vitro, em todas as concentrações de sacarose para a Lagoão e BRS Formosa, com uma

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sinuosa queda para esta, na concentração 20 g.L-1 e em luz artificial e para Lagoão, a produção foi eficaz para luz natural e artificial na concentração 10 g.L-1 de sacarose. Em BRS Verdinha, tal variável teve as maiores médias no tratamento 30 g.L-1 de sacarose em luz artificial e 10 g.L-1 do mesmo carboidrato com emprego de luz natural (TABELA 6.4). TABELA 6.4. Número de folhas de três genótipos de mandioca sob emprego de luz natural e artificial e tratadas com diferentes concentrações de sacarose.

Sacarose (g.L-1) BRS Formosa

Luz Artificial Luz Natural 10 9,58 aA 10,62 aA 20 9,54 aB 10,70 aA 30 10,15 aA 10,94 aA Lagoão Luz Artificial Luz Natural

10 10,87 aA 11,40 aA 20 10,58 aB 11,98 aA 30 11,16 aB 12,46 aA BRS Verdinha Luz Artificial Luz Natural

10 9,86 bB 11,98 aA 20 10,92 abA 11,72 abA 30 11,38 aA 10,71 bA

CV (%) 13,43 Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas não diferem estatisticamente, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.

A micropropagação em sala de crescimento (Luz artificial) proporcionou um aumento na biomassa na concentração 30 g.L-1. Esse fato pode ser atribuído as condições ambientais da sala de cultivo, com temperatura amena e baixa irradiância (SILVA et al., 2014). Adição de 15 g.L-1 de sacarose em baixa intensidade luminosa (70 mmol.m-2.s-1) possibilitou um incremento de biomassa em espécie do gênero Agaphantus (FOGAÇA et al., 2007). Sob luz natural, esse aumento se deu nas menores concentrações de sacarose (10 e 20 g.L-1). De acordo com Silva et al. (2014) isso pode ocorrer porque o cultivo mantido sob luz natural pode resultar em alterações na anatomia foliar, o que aproxima esse cultivo do fotoautotrófico (TABELA 6.5).

TABELA 6.5. Massa seca de parte aérea e raiz de três genótipos de mandioca sob efeito de luz natural e artificial e tratadas com diferentes concentrações de sacarose.

Sacarose (g.L-1) 10 20 30 Médias Massa seca de parte aérea (g)

Luz artificial 0,26 Ba 0,30 Ba 0,38 Aa 0,31 Luz natural 0,24 Aa 0,24 Aa 0,25 Ab 0,24

Média 0,25 0,27 0,32 CV (%) 54,43

Massa seca de raiz (g) 10 20 30 Média

Luz artificial 0,041 0,048 0,049 0,047 b Luz natural 0,049 0,057 0,051 0,052 a

Média 0,045 B 0,053 A 0,050 AB CV (%) 39,04

Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas não diferem estatisticamente, pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro

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Contrariando tais resultados, nos estudos de Silva et al. (2014), sob cultivo de luz natural, as concentrações de 30 e 40 g.L-1 foram as que possibilitaram aumento na biomassa de abacaxizeiros.

A biomassa de raiz teve incremento nas concentrações 20 e 30 g.L-1 de sacarose, resultado semelhante ao que Fotopoulos & Sotiropoulos (2004) encontraram em porta-enxerto de pêssegos. Houve aumento na massa seca de raiz em alta intensidade luminosa vinda da casa de vegetação. Para tal variável, a maior produção ocorreu nos genótipos BRS Formosa e Lagoão, apresentando médias de 0,055 e 0,053 de massa seca, respectivamente.

6.5. CONCLUSÕES

1. Os genótipos BRS Tapioqueira e Lagoão tem um melhor desenvolvimento in vitro na presença de 20 ou 30 g.L-1 de sacarose.

2. Os genótipos BRS Formosa e Lagoão apresentam maior desenvolvimento vegetativo em luz natural e na presença de 20 e 30 g.L-1 de sacarose.

3. A cultivar BRS Verdinha apresenta maior desenvolvimento vegetativo sob luz natural e na presença de 10 g.L-1 de sacarose.

4. A luz natural possui potencial para reduzir os custos da produção de mudas de mandioca micropropagadas na fase de enraizamento in vitro.

6.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7. ARTIGO 3: SALINIDADE in vitro EM GENÓTIPOS DE MANDIOCA Periódico submetido (ou a ser submetido): Revista Ciência Rural RESUMO A mandioca (Manihot esculenta Crantz) possui maior parte de sua produção destinada a alimentação humana, justificando sua grande importância. Aliado a este fato, o aumento da salinidade nos solos, principalmente da região Nordeste do Brasil, pode causar perda de pelo menos 30% da produção. Para suportar situações adversas como essas, as plantas desenvolveram um mecanismo de proteção, entre eles o acúmulo de osmólitos compatíveis com o citosol, e dentre esses está a prolina, porém, avaliar tais aspectos sob condições naturais pode tornar-se inviável, tendo a cultura in vitro como em alternativa. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta bioquímica e biométricas de genótipos de mandioca micropropagadas e induzidas ao estresse salino in vitro. Microestacas dos genótipos BRS Tapioqueira, BRS Verdinha e Lagoão previamente estabelecidas in vitro foram inoculadas em meio MS acrescido de diferentes concentrações de NaCl (0; 25; 50; 75 e 100 mM) e aos 90 dias foram analisados: número de raiz, folhas, brotos e gemas, comprimento de parte aérea e de raiz e massa seca de parte aérea. O teor de prolina da BRS Tapioqueira e Lagoão foi determinado aos 30, 60 e 90 dias. A salinidade afetou o crescimento de todos os genótipos, porém BRS Tapioqueira e BRS Verdinha mostraram-se mais tolerantes ao estresse salino induzido. Houve aumento no acumulo de prolina a partir do incremento de sal, sendo então esta, um indicador de estresse salino em plantas de mandioca cultivadas in vitro. Palavras-chave: Manihot esculenta; micropropagação; estresse abiótico; osmoprotetores.

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ABSTRACT Título: SALINITY in vitro IN CASSAVA GENOTYPES Cassava (Manihot esculenta Crantz) has most of its production destined for human consumption, justifying its importance. Allied to this fact, the increase of salinity in the soil, especially at the Brazil Northeast region, can cause loss of at least 30% of production. To withstand adverse situations such as these, plants have developed a protective mechanism, including osmolytes accumulation compatible with the cytosol, and among these is proline, however, assess these aspects under natural conditions may become unviable, having in vitro culture the alternatively. Objective of this study was to evaluate the biochemical response and Morphophysiological of micropropagated cassava genotypes induced to salt stress in vitro. Varieties BRS Tapioqueira, BRS Verdinha and Lagoão Microcuttings previously established in vitro were inoculated in MS medium supplemented with different NaCl concentrations (0, 25, 50, 75 and 100 mM) and 90 days were analyzed: root number, leaves, buds and gems, shoot length and root, dry weight of shoot. The proline content was determined at 30, 60 and 90 days of varieties BRS Tapioqueira and Lagoão. Salinity affected the growth of all genotypes but Tapioqueira BRS and BRS Verdinha were more tolerant to salt stress induced. There was an increase in proline accumulation from the salt increment, then this is an indicator of salt stress in cassava plants grown in vitro. Key-words: micropropagation; Manihot esculenta; micropropagation; abiotic stress; osmoprotectors

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7.1. INTRODUÇÃO

A mandioca (Manihot esculenta Crantz), pertence à classe das dicotiledônias, ordem Euphorbiales, família Euphorbiaceae, gênero Manihot. É uma planta que tem a maior parte de sua produção destinada à alimentação humana, através do consumo de suas raízes, pois possui alta produção de amido em condições consideradas inadequadas para outras espécies (FIALHO; VIEIRA, 2011; LIMA et al., 2002).

A região Nordeste apresenta solos caracteristicamente salinos (GONDIM et al., 2010; NOBREGA et al., 2012; RIBEIRO, 2010), o que pode acarretar a perda de 30% das terras agricultáveis (GHOSH et al., 2011), causando danos as produções, como a mandiocultura. Dentre os mecanismos de tolerância ao estresse salino, as plantas destacam-se pela osmorregulação, que inclui um aumento na concentração de solutos nas células. Estes desempenham um papel fundamental no equilíbrio osmótico, proteção de enzimas em presença de elevadas concentrações de eletrólitos no citoplasma (GREENWAY & MUNNS, 1980).

Dentre os solutos orgânicos que se acumulam no citoplasma em resposta ao estresse, destacam-se a prolina (WATANABE et al., 2000; ERRABII, et al., 2007; CÁRDENAS-AVILA, et al., 2006; PONTE et al., 2011; KANAWAPEE et al., 2012) pois é um soluto com alta sensibilidade de resposta a condições de alteração ambiental (ASHRAF et al., 2011) e pode ser considerada um osmólito indicador bioquímico e fisiológicos dos efeitos de estresse salino de plantas cultivadas nessas condições adversas (MONTEIRO et al., 2014).

Em condições naturais, pode haver dificuldade em avaliar a tolerância de espécies cultivadas a alguns tipos de estresse. As técnicas in vitro de plantas surgiram como alternativa para o desenvolvimento de vegetais resistentes a esse tipo de restrição (LIMA et al., 1998). Dentre as tecnologias mais avançadas, a micropropagação ou propagação clonal, é a aplicação mais importante, prática e econômica da biotecnologia vegetal (BAIRU et al., 2011). É um método de propagação vegetativa da planta, realizada sob condições assépticas in vitro (LEMA-RUMIŃSKA & KULUS, 2014).

A influência da salinidade in vitro no crescimento e desenvolvimento de plantas tem sido alvo de estudos em outras culturas como batata (MARTINEZ et al., 1996), alcachofra (HUANG, et al., 2013); arroz (BENITEZ et al., 2010), cana-de-açúcar (ERRABII et al., 2006; PATADE et al., 2008; GANDONOU et al., 2005; GIMENZEZ et al., 2013), nim (FREIRE et al., 2010), soja (BUSTINGORRI & LAVADO et al., 2011) e gandu (MONTEIRO et al., 2014).

O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta bioquímica e biométrica de genótipos de mandioca induzidas ao estresse salino in vitro.

7.2 MATERIAL E MÉTODOS

Os trabalhos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas e

Laboratório de Ecofisiologia e Nutrição Vegetal da Embrapa Tabuleiros Costeiros, em Aracaju, Sergipe. Como material vegetal, foram utilizadas microestacas de aproximadamente 1,0 cm contendo uma única gema, extraídas de plantas pré-estabelecidas e multiplicadas in

vitro dos genótipos BRS Verdinha, BRS Tapioqueira e Lagoão. Os ápices meristemáticos iniciais foram provenientes do Instituto Biofábrica Cacau (IBC).

Em câmara de fluxo laminar, as microestacas foram inoculadas em frascos de vidro (9,5 x 5,5 cm) contendo 30 mL de meio de cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), acrescido de 30 g.L-1 de sacarose e diferentes concentrações de NaCl (0; 25; 50; 75; 100 mM), com 4 g.L-1 de Phytagel® e pH ajustado para 5,7 ± 0,1. Após inoculação, os recipientes foram vedados com filme plástico de polietileno e as culturas transferidas para sala de crescimento com temperatura de 25º C ± 2º C, umidade relativa do ar média em torno de 70%, fotoperíodo de 12 horas e intensidade luminosa de 60 µmol.m-2.s -1.

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Aos 90 dias, foram avaliados o número de raiz, folhas, brotos e gemas, comprimento de parte aérea e de raiz e massa seca de parte aérea.

O teor de prolina das cultivares BRS Tapioqueira e BRS Lagoão foi determinado utilizando o método de reação de ninidrina segundo método colorimétrico (BATES et al., 1973) modificado com a substituição da filtração por centrifugação dos extratros. A extração de prolina foi feita aos 30, 60 e 90 dias após a inoculação dos explantes ao meio de cultura contendo NaCl. Foram utilizados 0,1g de folhas frescas, e estas foram homogeneizadas em 10 mL de ácido sulfosalicílico a 3%, sendo 3 mL para macerar por cerca de 2 minutos e 7 mL para lavar o almofariz. Todos os extratos foram levados para centrifuga a 5000 rpm por 20 minutos a 2ºC para que os aminoácidos presentes se translocassem para o sobrenadante. Após esse processo, foram adicionados à amostra 1 mL de ácido acético, 1 mL de ninidrina ácida e levados a banho-maria por 1 h a 100ºC. Depois de 1 h, o processo foi interrompido em banho de gelo, onde o teste branco (curva padrão) apresentou a cor rosácea e as amostras, cor amarela. Acrescentou-se 2 mL de Tolueno e a solução foi agitados por 5 segundos em vórtex, para separação das fases (formando uma fase transparente e outra rosácea). Com auxílio da pipeta de Pasteur, o cromóforo (parte rósea) foi aspirado e colocado em cubeta de vidro. A mistura foi levada para leitura em Espectrofotômetro molecular e a absorbância foi medida a 520 nm, tanto para as amostras quanto para a curva analítica.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) em esquema foi fatorial duplo (3 genótipos x 5 tratamentos salinos), com 7 repetições, sendo a parcela experimental composta por 4 plantas cada uma.

Para comparar o teor de prolina foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado (DIC) em parcela subdividida no tempo, com os fatores genótipos e NaCl na parcela e o tempo na na subparcela, com duas repetições. Para os níveis de NaCl foi utilizado o teste de Regressão e para o tempo e genótipos o teste de teste de Tukey com 5% de significância. Para todas as análises foi utilizando o software estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011).

7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A presença de NaCl afetou significativamente o padrão de crescimento in vitro dos explantes de mandioca. Houve efeito significativo da interação entre os tratamentos salinos e genótipos para o número de raiz e comprimento da parte aérea. O efeito dos fatores genótipo e tratamento salino isoladamente foi significativo para as variáveis número de folhas, brotos, gemas e massa seca de parte aérea. Para o comprimento de raiz, houve apenas efeito significativo do tratamento salino (Anexo 5A).

Houve uma resposta quadrática com redução significativa na produção de raízes nos três genótipos com aumento de NaCl no meio de cultura (Figura 7.1 A). As menores produções foram observadas nas concentrações de 66,65mM na Lagoão; 77,5mM para BRS Tapioqueira e 83,33mM para BRS Verdinha, com médias estimadas de 0,60, 0,75 e 1,03 raízes por planta respectivamente. Na ausência de NaCl, a maior produção se deu pela cultivar BRS Tapioqueira, nos tratamentos intermediários (25 e 50 mM), Lagoão e BRS Tapioqueira produziram mais e em média 1,95 e 2,72 respectivamente (Tabela 7.1). Na concentração 75 mM, a BRS Tapioqueira obteve a maior média (1,29) em número de raízes e no tratamento mais severo (100 mM), não houve diferença entre os genótipos. A redução na produção de raízes pode ser explicada pela inibição da divisão celular e expansão das células no tecido em crescimento causado pela salinidade (AAZAMI et al., 2010; FORNER - GINER et al., 2011), isso por ser o primeiro órgão afetado pelo estresse (BHATNAGAR-MATHUR et al., 2008).

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Figura 7.1. Efeito da salinidade no número de raízes (A), número de folhas (B), massa seca de parte aérea (C), comprimento de parte aérea (D), comprimento de raiz (E) e número de gemas (F) de genótipos de mandioca cultivados in vitro sob diferentes concentrações salinas (0; 25; 50; 75 e 100 mM). ●Lagoão; ■ BRS Tapioqueira; ▲BRS Verdinha.

Explantes de amoreiras, quando inoculadas em diferentes concentrações salinas (0; 25; 50; 75 e 100 mM), diminuíram a produção de raízes, sendo que este não ocorreu nos genótipos testados ao tratamento mais severo (VIJAYAN et al., 2003). Da mesma forma, a salinidade afetou o crescimento de genótipo de mandioca in vitro, diminuição no desenvolvimento de seus órgãos, principalmente raízes, folhas e caule (CARRETERO et al., 2007). Do contrário, a cevada teve indução na produção de raiz no tratamento salino de 50 mM (DEMIRKIRAN et al., 2013). Comportamentos opostos evidenciam o fato de que a resposta ao estresse é dependente de fatores como genótipo, estádios de desenvolvimento e características da planta (PRISCO & GOMES FILHO, 2010; DA SILVA et al., 2013).

A formação de folhas apresentou um comportamento quadrático, sendo a menor média na concentração 81,35 mM, atingindo 0,08 folhas por planta (Figura 7.1B). Esse resultado evidencia o efeito da toxicidade do sal nas plantas de, corroborando com Khoushbakht et al. (2010), que evidenciaram a diminuição do número de folhas não como resultado da inibição

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y■ = 0,0003x2 - 0,0465x + 2,5511 R² = 0,9683

y▲ = 0,0003x2 - 0,0395x + 2,2409 R² = 0,9347

0123456

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NaCl (mM)

y = 0,0007x2 - 0,1139x + 5,435 R² = 0,9627

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NaCl (mM)

E F

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do crescimento pela salinidade, mas tambem pela toxidez, qe ocasiona perda na produção, desfolhagem ou folhas danificadas. O genótipo com maior número de folhas foi BRS Verdinha, com uma média de 3,65 (Tabela 7.1).

Tabela 7.1 Número de raízes, folhas, brotos e gemas, comprimento e massa seca de parte aérea de plantas de mandioca micropropagadas e submetidos a diferentes concentrações salinas (0; 25; 50; 75 e 100mM).

Genótipos NaCl (mM)

Médias 0 25 50 75 100

Número de raízes Lagoão 5,98 b 1,95 a 0,78 a 0,29 ab 0,02 a 1,64

Tapioqueira 9,44 a 2,72 a 0,64 a 1,29 a 0,05 a 3,28 Verdinha 2,58 c 0,56 b 0,20 a 0,08 b 0,03 a 0,70 CV (%) 25,97

Número de folhas Lagoão 4,41 1,96 1,01 0,31 0,00 1,44 b

Tapioqueira 4,47 1,58 0,28 0,68 0,05 1,63 b Verdinha 7,82 3,69 2,83 2,34 1,39 3,65 a CV (%) 22,82

Número de brotos Lagoão 0,08 0,07 0,00 0,00 0,00 0,02 b

Tapioqueira 0,23 0,09 0,05 0,13 0,00 0,11 ab Verdinha 0,33 0,22 0,13 0,02 0,00 0,14 a CV (%) 12,46

Comprimento de parte aérea (cm) Lagoão 13,47 a 2,8 a 1,40 a 1,73 a 1,06 a 3,59

Tapioqueira 5,11 b 2,12 a 1,11 a 1,26 a 1,00 a 2,33 Verdinha 4,64 b 1,73 a 1,16 a 1,06 a 1,03 a 1,95 CV (%) 65,90

Número de gemas Lagoão 5,31 b 3,20 a 1,88 ab 1,66 a 1,13 a 2,54

Tapioqueira 5,32 b 3,15 a 1,18 b 1,45 a 1,05 a 2,68 Verdinha 8,48 a 4,18 a 2,61 a 1,77 a 2,03 a 3,88 CV (%) 14,75

Massa seca de parte aérea (g) Lagoão 0,05 0,01 0,07 0,004 0,003 0,01 b

Tapioqueira 0,19 0,07 0,05 0,03 0,01 0,08 a Verdinha 0,10 0,03 0,02 0,02 0,01 0,04 b CV (%) 119,01

Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas não diferem estatisticamente, pelo teste de a 5% de probabilidade de erro.

O número de brotos, de forma geral, foi muito baixo e linear, diminuindo à medida que fora adicionado sal ao meio de cultura. A maior formação destes foi alcançada pela cultivar BRS Verdinha com média de 0,14 brotos por planta e a menor foi Lagoão, com produção média de 0,02. A indução ao estresse salino afeta a formação de novos brotos em plantas micropropagadas in vitro (QRUNFLEH et al., 2013; SATISH et al., 2016).

O comprimento da parte aérea foi diferente somente no tratamento controle, em que a o genótipo Lagoão obteve a maior média (13,47 cm), os demais não apresentaram diferenças significativas. Comportamento posto foi observado em álamo Eufrates (Salicaceae), onde as concentrações salinas mais severas (150 e 250 mM) ocasionaram uma redução na altura média de suas plantas (WATANABE et al., 2000). Da mesma forma, houve redução no crescimento em dez genótipos de arroz em condições de alta salinidade (BENITEZ et al., 2010). De forma geral, o maior crescimento da parte aérea se deu no tratamento controle (Figura 7.1 D). Esses resultados reforçam o efeito negativo da salinidade não só na síntese de

46

reguladores de crescimento (citocininas e auxinas), mas também na sua absorção pelas plantas, prejudicando a sua ação, o crescimento (ROUSSOS et al., 2006).

O número de gemas diminuiu em todos os genótipos com o aumento da concentração de NaCl. Além dos efeitos relatados anteriormente, o aumento do potencial osmótico em meio salino, afeta a absorção de água e nutrientes no meio, o que pode inibir o metabolismo de atividades necessárias ao crescimento de tecidos jovens como brotos e gemas (VIJAYAN et al., 2003). O menor número de gemas foi obtido na concentração 78,31 mM, com produção média de 1,47 gemas por planta, resultado que sugere um maior estresse osmótico causado pela salinidade nos genótipos, com consequente diminuição na produção de tecidos jovens.

No que se refere ao desempenho relativo quanto ao comprimento das raízes, o menor valor foi alcançado na concentração salina 81,36mM (Figura 7.1 E), evidenciando que o excesso de sais na zona radicular promove a redução no comprimento e no número de raízes, ocasionando efeitos nocivos no desenvolvimento e crescimento da planta (RHOADES et al., 2000). Estudos de Benitez et al., (2010) em genótipos de arroz, mostraram que BRS Pelota manteve sua produção normal do sistema radicular, mesmo com acréscimo de sal ao meio nas concentrações 4 e 8 g.L-1. As variedades de batata Spunta e Cardinal apresentaram tolerância as concentrações 40 e 80 mM de NaCl, por outro lado, a variedade Bartina apresentou 40% de redução no comprimento de suas raizes na concentração 40 mM de sal (KHENIFI ET al., 2011). Tais resultados ressaltam que a presença de sais influencia no alongamento radicular (SHARMA et al., 2013; ERTURK et al., 2007; VIJAYAN et al., 2003).

De forma geral, houve diminuição de biomassa nos genótipos quando houve incremento de sal ao meio (Figura 7.1 G). Esse resultado era esperado considerando a redução de todas as variáveis estudadas a partir do aumento de NaCl. Os genótipos Lagoão e BRS Verdinha alcançaram as menores médias na massa seca de parte aérea, 0,01 e 0,04 g respectivamente, e a cultivar BRS Tapioqueira a maior média (0,08g). A redução da produtividade em tratamentos salinos mais severos também foi observada em amoreira (VIJAYAN et al., 2003), cerejeira (ERTURK et al., 2007), capim pé-de-galinha (SATISH et al., 2016), figueira (QRUNFLEH et al., 2013) e batata (KHENIFI et al., 2011).

Houve efeito significativo da interação tripla entre os fatores tempo, genótipo e tratamento salino na produção de prolina (Anexo 6.A). De forma geral, houve aumento na produção de prolina com aumento de NaCl e do tempo de exposição nos dois genótipos (Figuras 7.2 A e 7.2 B).

Na ausência de NaCl houve maior acumulo de prolina aos 30 dias na Lagoão (Tabela 7.2), com média de 18,66 µmol.g -1 e uma menor produção em BRS Tapioqueira (10,43µmol.g-1). Este resultado deve-se ao fato de a prolina ser um aminoácido para o metabolismo primário, tanto como um aminoácido livre, como na composição de proteínas (LEHMANN et al., 2010).

No tratamento salino com 25 mM de NaCl, a Lagoão foi mais sensível, acumulando o osmoprotetor aos 30 dias (10,67 µmol.g-1) e BRS Tapioqueira apresentou maior média sob o mesmo tratamento, após 60 dias, mostrando-se mais tolerante (Tabela 7.2). Essa variação na produção, evidencia que a salinidade pode induzir diferentes respostas entre variedades de uma mesma espécie (MEDEIROS et al., 2015; FARISSI et al., 2013; BAKHT et al., 2012).

Na concentração salina 50 mM, a BRS Tapioqueira alcançou o acúmulom medio de de 7,69 µmol.g-1 aos 90 dias, evidenciando um maior potencial de osmorregulação quando comparada a Lagoão, que teve seu ápice de produção aos 60 dias. A partir dos tratamentos mais severos (75 e 100 mM), a BRS Tapioqueira demonstrou uma maior sensibilidade ao tempo de exposição, principalmente no tratamento 100 mM (21 µmol.g-1) , em comparação com a Lagoão. Tal fato pode estar mais relacionado com uma defesa antioxidante do que ajuste osmótico propriamente (MOLINARI et al., 2007), já que o crescimento das plantas nesse tratamento não foi igual aos tratamentos menos severos (0; 25 e 50 mM). Além de ajuste osmótico, a prolina também tem sido implicada na manutenção do pH citoplasmático,

47

armazenamento de carbono e nitrogênio, além da estabilização de proteínas e limpeza de agentes oxidativos (TROVATO et al., 2008). Tabela 7.2. Médias do teor de prolina (µmol.g-1) em genótipos de mandioca cultivas in vitro na presença de diferentes concentrações de NaCl.

Dias

NaCl (mM) 0 25 50 75 100

Genótipos

Lagoão TPQ Lagoão TPQ Lagoão TPQ Lagoão TPQ Lagoão TP

30 18,66

Aa 10,43

Ba 10,67

Aa 8,52 Ab

15,59 Aab

11,26 Aa

22,86 Aa

15,82 Ba

21,01 Aa

15,43 Aa

60 6,69 Ab

7,46 Aab

9,16 Bab

18,23 Aa

17,71 Aa

9,28 Ba

14,37 Ab

13,02 Aa

19,31 Aa

14,95 Aa

90 11,27

Ab 2,30 Bb

3,07 Ab

3,37 Ab

9,45 Ab

7,69 Aa

21,14 Aab

15,35 Aa

11,12 Bb

21,58 Aa

Médias seguidas de letras iguais, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem estatisticamente, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade de erro; TPQ- BRS Tapioqueira

A Lagoão comportou-se de forma semelhante aos 30, 60 e 90 dias para os tratamentos 25; 50 e 75mM de NaCl (Figura 7.2A). Entretanto, na presença de 100 mM, não foi tolerante, diminuindo drasticamente o acúmulo do osmoprotetor. Esse resultado é corroborado com os baixos índices de crescimento e desenvolvimento (Tabela 7.1). A produção de prolina na BRS Tapioqueira ocorreu de forma similar aos 30 e 90 dias, aumentando o teor do aminoácido com o aumento de NaCl (Figura 7.2B). Esse comportamento reflete a tentativa de osmorregulação das plantas comprovado pelo incremento de biomassa nessa cultivar. Isso pode ter sido ocasionado pelo excesso de sal. Esse resultado concorda com Gandonou et al. (2015) que estudando variedades de cana-de-açúcar sob condições de estresse salino in vitro observaram que tanto a variedade sensível CP65- 357, quanto a variedade resistente NCo310 se comportam de forma semelhante, acumulando maior quantidade de prolina em tratamentos salinos mais severos (102 mM).

Figura 7.2. Teor de prolina em plantas de mandioca dos genótipos Lagoão (A) e BRS Tapioqueira (B) submetidas a diferentes tratamentos salinos (0; 25; 50; 75 e 100 mM de NaCl) com tempo de 30, 60 e 90 dias de exposição. ●30 dias; ■ 60 dias; ▲90 dias.

O acúmulo de prolina nas plantas de mandioca, é a resposta a pressão osmótica no meio de cultura e tipo de estressores, sendo este osmólito a primeira resposta das plantas aos diferentes tipos de estresses (ASHRAF & FOOLAD, 2007). Isto tem sido observado em várias espécies, como cana-de-açúcar (MEDEIROS et al, 2015; MUNAWARTI et al., 2013), sorgo (LACERDA et al., 2003), arroz (LIMA et al., 2004), cactos (BALEN et al, 2013) e alfafa (FARISSI et al, 2013).

0

5

10

15

20

25

0 2 5 5 0 7 5 1 0 0

Pro

lina

(µ

mol

.g1 )

NaCl (mM)

0

5

10

15

20

25

0 2 5 5 0 7 5 1 0 0

Pro

lina

(µm

ol.g

-1)

NaCl (mM) B A

48

7.4 CONCLUSÕES

1. A salinidade afeta o crescimento dos genótipos Lagoão, BRS Tapioqueira e BRS Verdinha cultivadas in vitro.

2. As cultivares BRS Tapioqueira e BRS Verdinha apresentam um maior desenvolvimento quando induzidas ao estresse salino.

3. O acúmulo de prolina é intensificado com a presença de NaCl nos genótipos BRS Tapioqueira e Lagoão.

4. O genótipo Lagoão apresenta maior dificuldade na regulação osmótica do que a cultivar BRS Tapioqueira em alta concentração de NaCl

5. A prolina pode ser utilizada como um indicador bioquímico de resposta ao estresse em plantas de mandioca cultivadas in vitro.

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53

ANEXOS

TABELA 1A. Resumo da análise de variância de caracteres de crescimento de genótipos de mandioca em função de diferentes tratamentos salinos.

Fonte de variação

GL Quadrado Médio

NF1 CR NR1 NF1 MSPA MSR NG1 DP Variedade

(V) 2 548,41** 56,06** 4,78** 1,93** 26,80** 3,33** 4,73** 0,79**

NaCl (S) 5 4701,52** 605,54** 24,82** 13,63** 56,67** 5,77** 2,30** 0,10** V x S 10 479,01** 42,89** 2,08** 0,63* 3,32** 1,29** 2,24** 0,01**

Resíduo 114 50,55 19,51 0,65 0,33 1,03 0,57 0,42 0,01 CV (%) 21,65 39,02 23,16 26,43 43,91 134,73 17,17 22,57

GL: graus de liberdade; NF: Número de folhas; CR: Comprimento de raiz; NR: Número de raízes; MSPA: massa seca de parte aérea; MSR: massa seca de raiz; NG: número de gemas; DP: diâmetro de pseudocaule; ** Significativo a 1% de probabilidade; * significativo a 5% de probabilidade; ns: Não significativo pelo Teste a 5% de probabilidade; 1 Dados transformados em (X+0,5)1/2.

TABELA 2A. Resumo da análise de variância do teor de prolina em genótipos de mandioca em função do tempo e tratamentos salinos.

Fonte de variação GL Quadrado Médio NaCl (S) 2 286,87**

Genótipo (G) 5 33,83** S x G 10 11,63**

Resíduo 1 18 0,33 Tempo (T) 4 168,93**

T x S 8 70,06** T x G 20 20,60**

T x S x G 40 17,72** Resíduo 2 72 0,40 CV (%) 16,82

GL: graus de liberdade; ** Significativo a 1% de probabilidade; * significativo a 5% de probabilidade; ns: Não significativo pelo Teste Tukey ou Skott knott a 5% de probabilidade;

TABELA 3A. Resumo da análise de variância de caracteres de crescimento em genótipos de mandioca em função de diferentes concentrações de sacarose no meio MS.

Fonte de Variação

GL Quadrado Médio

NR1 NT1 CPA CR NG1 DP MSPA MSR MST

Genótipo(G) 1 0,132

ns 0,08 ns

94,35** 76,48* 0,08 ns

0,021* 0,01 ns

0,0004 ns

0,00002 ns

Sacarose (S) 3 0,972* 0,03 ns

1,73 ns 4,82 ns

0,14 ns

0,004 ns

0,01 ns

0,0004 ns

0,00060 ns

V x G 3 0,225

ns 0,17 ns

13,05 ns

12,95 ns

0,95* 0,010

* 0,008

ns 0,0002

ns 0,01435

ns

Resíduo 32 0,280 0,07 10,42 13,68 13,68 0,002 0,007

ns 0,0001 0,00472

CV (%) 23,79 26,38 28,30 34,25 16,17 20,25 50,38 67,49 117,50 GL: graus de liberdade; NR: número de raiz; NT: número de tubérculo; CPA: comprimento de parte aérea; CR: comprimento de raiz; NG: número de gemas; DP: diâmetro de pseudocaule; MSPA: massa seca de parte aérea; MSR: massa seca de raiz; MST: massa seca de tubérculo. ** Significativo a 1% de probabilidade; * significativo a 5% de probabilidade; ns: Não significativo pelo Teste Tukey a 5% de probabilidade; 1 Dados transformados em (X+0,5)1/2.

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TABELA 4A. Resumo da analise de variância de caracteres de crescimento em genótipos de mandioca em função de diferentes concentrações de sacarose e diferentes luzes.

Fonte de variação GL Quadrado Médio

NF1 CPA MSPA MSR Luz (L) 1 1,26** 62,06 ** 0,3356 ** 0,0017 *

Sacarose (S) 2 0,09 ns 4,47 ns 0,1195 ** 0,0014 * Genótipo (G) 2 0,72 ** 2,45 ns 0,6553 ** 0,0052 *

L x S 2 0,08 ns 2,75 ns 0,0679 ns 0,0007 ns L x G 2 0,01 ns 36,37 ** 0,0989 * 0,0007 ns S x G 4 0,03 ns 0,09 ns 0,0005 ns 0,0004 ns

L x S x G 4 0,14 * 0,71 ns 0,0219 ns 0,0002 ns Resíduo 252 0,04 1,62 0,0239 0,0003 CV (%) 6,52 16,96 54,43 39,04

GL: graus de liberdade; NF: número de folhas; CPA: comprimento de parte áerea; MSPA: massa seca de parte aérea; MSR: massa seca de raiz; ** Significativo a 1% de probabilidade; * significativo a 5% de probabilidade; ns: Não significativo pelo Teste Tukey 5% de probabilidade; 1 Dados transformados em (X+0,5)1/2.

TABELA 5.A. Resumo da analise de variância de caracteres de crescimento em genótipos de mandioca cultivadas in vitro em função de diferentes tratamentos salinos.

Fonte de variação GL Quadrado Médio

NR1 NF1 NB1 CPA CR NG2 MSPA Genótipo (G) 2 3,65 4,33** 0,04 * 23,73 ** 1,32 ns 1,03 ** 0,03 **

NaCl (S) 4 8,63 6,19 ** 0,05 ** 125,79 ** 188,55 ** 4,84 ** 0,04 ** G x S 8 0,33 0,08 ns 0,006 ns 28,64 ** 3,57 ns 0,10 ns 0,001 ns

Resíduo 80 0,11 0,12 0,009 2,94 3,21 0,07 0,003 CV (%) 25,97 22,82 12,46 65,90 64,66 14,75 119,01

GL: graus de liberdade; NR: número de raízes; NF: número de folhas; NB: número de brotos; CPA: comprimento de parte aérea; CR: comprimento de raiz; NG: número de gemas; MSPA: massa seca de parte aérea; ** Significativo a 1% de probabilidade; * significativo a 5% de probabilidade; ns: Não significativo pelo Teste Tukey 5% de probabilidade; 1 Dados transformados em (X+0,5)1/2; 2 Dados transformados em (X+10)1/2. TABELA 6.A. Resumo da análise de variância do teor de prolina nos genótipos de mandioca cultivas in vitro em função do tempo de exposição e diferentes tratamentos salinos.

Fonte de variação GL Quadrado Médio NaCl (S) 4 197,44 **

Genótipo (G) 1 93,15 ** S x G 4 37,91 **

Resíduo 1 10 0,90 Tempo (T) 2 96,59 **

T x S 8 40,84 ** T x G 2 33,25 *

T x S x G 8 37,72 ** Resíduo 2 20 7,92 CV (%) 21,84

GL: graus de liberdade; ** Significativo a 1% de probabilidade; * significativo a 5% de probabilidade; ns: Não significativo pelo Teste Tukey a 5% de probabilidade.

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SALINIDADE, LUZ E SACAROSE NA MICROPROPAGAÇÃO … · solução MS líquido, adicionado de 0, 4 e 8 g.L-1 de NaCl, perfazendo três tratamentos. Após Após 90 dias constatou-se