Capitulo1- Objectivos, Conceitos bsicos, AplicaesO que e para que serve a biotecnologia molecular? Trata-se de uma disciplina baseada na habilidade de transferir pequenas unidades genticas de um organismo para outro, fazendo uso de tcnicas de engenharia gentica (tecnologia de DNA recombinante). O objectivo , muitas vezes, produzir um produto til ou um processo industrial. A pesquisa biotecnolgica visa a maximizao da eficincia global de reaces industriais destinadas produo de produtos biolgicos comerciais assim como encontrar microorganismos que produzam bens teis, suplementares e drogas. A biotecnologia utiliza o conhecimento de vrias disciplinas ( Engenharia Qumica, Biologia Molecular, Microbiologia, Bioqumica, Gentica e Biologia Celular) para criar um vasto leque de produtos industriais ( Drogas, Vacinas, Diagnsticos). Objectivos, Preocupaes e Consequncias Objectivos: - Providenciar oportunidade de diagnosticar e prevenir ou curar um vasto leque de doenas genticas e infecciosas; - Aumentar substancialmente o rendimento de campos de cultivo criando plantas resistentes predao, a infeces e a condies ambientais adversas; - Desenvolver organismos que produzam qumicos,antibiticos, polmeros, aminocidos, enzimas, etc; - Desenvolver animais que tenham sido geneticamente melhorados com determinados atributos; - Facilitar a remoo de poluentes e materiais txicos do ambiente; Preocupaes e Consequncias: - Iro os organismos transgnicos ser perigosos para outros organismos ou para o ambiente? - Ir o recurso a transgnicos diminuir a biodiversidade gentica populacional? - Devero os Humanos ser geneticamente modificados? - Ir o diagnstico molecular menosprezar a privacidade individual? - Ir o financiamento da biotecnologia molecular restringir o desenvolvimento de outras tcnicas? - Ir o nfase comercial significar que os benefcios desta cincia estaro apenas disponveis para pases abastados? - Ir a biotecnologia molecular agrcola prejudicar a agricultura tradicional e os seus trabalhadores? - Iro as terapias baseadas na biotecnologia suprimir os tratamentos tradicionais igualmente efectivos? - Ir a procura de patentes suprimir o livre trnsito de ideias entre cientistas?

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Capitulo2- Tecnologias de DNA RecombinantePolimerase Chain Reaction (PCR) Mtodo para isolar grandes quantidades de molculas simples de DNA. Provida de algumas sequncias conhecidas de molculas de DNA, esta tcnica pode atingir uma alta amplificao de DNA, atravs de reaces inteiramente in vitro. Essencialmente, a DNA polimerase usada para repetir a replicao de um determinado segmento. O nmero de molculas de DNA aumenta exponencialmente, dobrando em cada ciclo de replicao; assim uma quantidade de DNA significativa pode ser obtida a partir de pequenas amostras. Processo da PCR: - Dois oligonucletidos sintticos so preparados, sendo estes complementares s sequncias nas cadeias opostas do DNA alvo na posio adjacente ao final do segmento a ser amplificado (3). Estes oligonucletidos servem como primers para a replicao. - As extremidades 3 de uma sonda encontram-se orientadas de frente uma para a outra e posicionadas de forma a iniciar a sntese de todo o segmento de DNA pretendido. - O DNA isolado com a sequncia a replicar aquecido de forma a desnaturar e depois arrefecido na presena de primers em excesso (oligonucletidos sintticos). - De seguida adicionado mistura desoxinuleosidos trifosfatados (em grande quantidade), para que a replicao do primer possa ento ter inicio. - O ciclo de aquecimentos e arrefecimentos repetido 25 a 30 vezes num processador automtico, amplificando os segmentos de DNA at que eles possam ser prontamente utilizados. Esta tcnica usa uma DNA polimerase resistente ao calor, tal como a Taqpolimerase (derivada de uma bactria que vive a uma temperatura de 90C) que permanece activa aps todos os passos de aquecimento, pelo que no necessita de ser substituda. Uma escolha cuidadosa do primer a ser usado, assim como o uso de endonucleases de restrio facilita o subsequente processo de clonagem do DNA amplificado. Esta tecnologia muito sensvel: PCR consegue detectar e amplificar a mais pequena molcula de DNA numa amostra de qualquer tipo. Esta tcnica funciona optimamente se houver um conhecimento prvio da sequncia do gene a amplificar. Se no se conhecer a verdadeira sequncia pode-se correr o risco de mais emparelhamentos (Vrios locais, errados e diferentes).

Polymerase Chain Reaction (PCR)Reaco em cadeia catalizada pela polimerase

+ DNA polimerase

dATP + Primers em + dCTP excesso dGTP dTT (Nucletidos)

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1 Ciclo

2 Ciclo

3 Ciclo

Conceitos prticos sobre PCR: - Desnaturao das duas cadeias da molcula de DNA faz-se a 95C; - Emparelhamento dos primers: 50-60C (Calcular a temperatura ideal para os primers a usar); - Extenso das cadeias pela DNA polimerase faz-se a uma temperatura de 72C (Taq polimerase) Nota: A temperatura da Taq polimerase varia com o tipo de Taq que se utiliza, mas tambm com o nmero de Citosinas, isto , com o nmero de ligaes triplas presentes na molcula a amplificar. Caractersticas dos primers a usar no PCR: - ~ 20 nucletidos de DNA em cadeia simples; - Emparelhamento com o terminal 3 de cada uma das cadeias a amplificar; - Especficos para os fragmentos a amplificar; - Temperatura de emparelhamento semelhante para os dois primers do par; - No devem formar dmeros consigo prprios ou entre si;

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RT-PCR Trata-se de uma tcnica derivada da PCR e que faz uso da Transcriptase reversa numa primeira fase. O uso desta enzima possibilita transcrever molculas de RNA em DNA, obtendo assim DNA complementar (cDNA) molcula de RNA. Deste modo obtm-se a sequncia codificante do gene, deixando de lado os intres, promotores e outras zonas reguladoras. Esta tcnica consiste em: - Isolamento do RNA total; - Isolamento do mRNA, tirando proveito da cauda polia, por cromatografia de afinidade usando como matriz um oligonucletido de timinas; - Sntese de cDNA (Protocolo de Gubler-Hoffman: Transcriptase reversa, DNA polimerase I e RNAse H, DNA ligase); - Amplificao por PCR utilizando primers especficos; Nota: Convm que a degradao no seja muito intensa e que o RNA clivado no se separe do DNA.O uso da DNA polimerase I faz com que haja uma substituio de RNA por DNA, utilizando os pequenos fragmentos de RNA como primers (da a importncia de clivagem sem separao). A DNAligase liga os vrios fragmentos de DNA formados. Clonagem e DNA Recombinante Um clone definido como uma populao de clulas geneticamente idnticas. A clonagem de um organismo significa a formao de um organismo geneticamente igual a outro organismo. No entanto pode-se falar tambm de clonagem de genes, ou seja a produo de mltiplas cpias de um mesmo gene. Clone de um gene: clulas contendo molculas idnticas de DNA recombinante (DNA no original daquele organismo), contendo o gene de interesse. Objectivos da clonagem de genes: - Interesse em conhecer a sequncia de DNA que codifica uma protena, no possvel saber a identidade de uma protena sem se conhecer a sua sequncia de aminocidos, conhecendo a sequncia de nucletidos que codificam essa protena possibilita essa e outras informaes; - Produo de protena recombinante ( Produo de grandes quantidades da protena codificada pelo gene inserido, com o objectivo de estud-la melhor, ou utilizala na medicina); - Insero do DNA clonado noutro organismo (produo de organismos geneticamente modificados); Utilidade da sequncia que codifica a protena: - Deduo da sequncia de aminocidos da protena; - Comparao com a sequncia de aminocidos de outras protenas; - Reconhecimento de domnios funcionais; - Previso da funo; - Previso da estrutura;

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- Mutagnese: pode-se tirar concluses acerca de uma protena em estudo com o facto de se mutar uma protena numa determinada sequncia e isso inactivar a sua actividade: - Produo de anticorpos: pode-se utilizar esta capacidade de modo a produzir anticorpos especficos para protenas especficas (providencia a criao de marcadores ou sondas). Utilidade da produo de protena recombinante: - Aplicaes na medicina e biotecnologia; - Caracterizao da protena (produo de anticorpos, actividade da protena, estrutura da protena, interaces da protena com outras macromolculas, cristalizao) Nota: Protena recombinante uma protena produzida num organismo onde, naturalmente, no existiria. Como se faz a clonagem de um gene: Uma variedade de tcnicas, referidas como tcnicas de DNA recombinante , so utilizadas para clonar DNA (DNA recombinante: qualquer molcula de DNA composta de sequncias derivadas de uma fonte diferente daquelas onde se encontra). A chave para clonar o fragmento de DNA de interesse lig-lo a um vector, que se pode replicar dentro de uma clula hospedeira. Aps uma simples molcula de DNA recombinante (Vector + fragmento de DNA inserido) ser introduzida numa clula hospedeira, o DNA replica-se juntamente com o vector gerando um largo nmero de molculas de DNA idnticas. Processo enzimtico da clonagem: Apenas molculas de DNA relativamente pequenas podem ser clonadas em qualquer dos vectores disponveis. Por esta razo a grande cadeia de DNA que constitui o genoma de um organismo necessita ser clivada em fragmentos menores de modo a que estes possam ser inseridos no vector de DNA. Dois tipos de enzimas facilitam a produo das molculas de DNA recombinante enzimas de restrio e DNA ligases. As enzimas de restrio so endonuleases, produzidas por bactrias, que clivam as molculas de DNA em pequenos fragmentos. Estas enzimas reconhecem sequncias especficas de 4 a 8 nucletidos, designadas por locais de restrio. Os locais de restrio so geralmente palindromas, isto , a sequncia igual nas duas cadeia de DNA quando lidas na direco 5- 3. As enzimas de restrio provocam a formao de extremidades coesivas nas duas cadeias de DNA no seu local de restrio, formando-se ento fragmentos que possuem uma cauda em cadeia simples nas duas extremidades. A cauda formada num fragmento complementar da formada no outro fragmento pela mesma enzima de restrio( sendo estas capazes de emparelhar entre si temperatura ambiente).

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O DNA isolado de um organismo individual possui uma sequncia especfica, que apenas por acaso vai conter uma srie de locais de restrio. Deste modo uma determinada enzima de restrio vai cortar o DNA numa srie de fragmentos reprodutveis (fragmentos de restrio). Os fragmentos de DNA podem ser inseridos no vector de DNA com a adio de DNA ligases. Durante a replicao normal do DNA, as DNA ligases catalizam a ligao da extremidade 3 extremidade 5 adjacentes dos fragmentos Okazaki. No caso da clonagem esta enzima promove a ligao entre as extremidades dos fragmentos de restrio e os vectores que possuem extremidades complementares. O vector e o fragmento de restrio ligam-se covalentemente por ligaes fosfodister padro.

Plasmdeos de E. coli Plasmdeos so cadeias duplas de DNA circular separadas do cromossoma da clula. Este DNA extracromossomal que ocorre naturalmente em bactrias e em eucariticos inferiores (leveduras) existe em relaes de parasitismo ou simbiose com a sua clula hospedeira. Tal como o cromossoma bacteriano o plasmdeo replicado antes de cada diviso celular. Durante a diviso, cpias do plasmdeo segregam para cada clula filha, assegurando a continuidade do plasmdeo atravs de sucessivas geraes. Os plasmdeos mais usados em tecnologia de DNA recombinante so os E. coli. Investigadores conseguiram j manipular estes plasmdeos de forma a optimizar o seu uso como vectores na clonagem de DNA. Assim, alteraes em pores desnecessrias para o funcionamento normal dos plasmdeos de E. coli produzem um vector de aproximadamente 1.2 3 kb em comprimento circunferencial, que contm trs regies essenciais clonagem: uma origem de replicao, um marcador que permite a seleco, usualmente um gene de resistncia a antibiticos e a regio de insero dos fragmentos de DNA exgenos. Enzimas de replicao da clula hospedeira promovem a replicao do plasmdeo a partir da origem (ORI, uma sequncia com 50 a

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100 nucletidos). Uma vez que a replicao do DNA tenha comeado ela continua volta do plasmdeo a partir do plasmdeo circular qualquer que seja a sua sequncia de nucletidos. Deste modo qualquer sequncia de DNA num plasmdeo replicada durante a replicao deste. A figura que segue ilustra a clonagem de DNA utilizando um plasmdeo de E. coli como vector. Quando clulas de E. coli so misturadas com vectores de DNA recombinantes, sob determinadas condies, uma pequena fraco de clulas vai tomar o plasmdeo, este processo conhecido como transformao. Tipicamente uma clula em cada 10.000 incorpora um nico plasmdeo, esta clula diz-se transformada. Aps o vector ser incubado em E. coli, aquelas clulas que incorporam o plasmdeo podem ser facilmente seleccionadas do outro elevado nmero de clulas. Agora, se o plasmdeo transportar um gene de resistncia a um antibitico (p. e. ampicilina), as clulas transformadas podem ser seleccionadas fazendo-as crescer num meio contendo ampicilina, s aquelas que incorporam o gene de resistncia sobrevivem. Fragmentos de DNA de poucos pares de bases, cerca de 20 kb, so comummente inseridos no vector. Se precaues especiais forem tomadas para evitar manipulaes que possam mecanicamente partir o DNA, at longos fragmentos de DNA podem ser inseridos no plasmdeo. Quando um plasmdeo recombinante com um fragmento de DNA inserido transforma uma clula E. coli todos os genes de resistncia presentes na progenia sero transmitidos aos seus descendentes e toadas as clulas que surjam desta linha possuiro plasmdeos com os mesmos genes inseridos. O DNA inserido replicado ao longo da replicao do plasmdeo e segregado para as clulas filhas medida que a colnia cresce. Desta maneira o fragmento de DNA inicial replicado na colnia num largo nmero de cpias idnticas. Visto que rodas as clulas na colnia originaram-se de uma nica clula parental transformada, elas constituem clones da clula parental, e o segmento inserido no plasmdeo parental referido como clone de DNA, ou DNA clonado. A versatilidade de um vector de plasmdeo E. coli aumenta com a incorporao de um polilinker, uma sequncia sinttica que contm uma cpia de vrios locais de restrio que no esto presentes em mais nenhum local do plasmdeo. Quando tal vector tratado com enzima de restrio que reconhece um desses locais de restrio, o vector cortado apenas uma vez (dentro do polilinker). Subsequentemente qualquer fragmento de DNA de tamanho apropriado produzido utilizando a(s) mesma(s) enzima(s) de restrio pode ser introduzido nesta zona utilizando DNA ligase. Plasmdeos que possuem uma regio polilinker permitem ao investigador clonar fragmentos de DNA gerados com diferentes enzimas de restrio usando o mesmo plasmdeos, o que simplifica o procedimento experimental. Como evitar a re-ligao do plasmdeo Aps a clivagem com enzimas de enzimas de restrio, como referido, os plasmdeos ficam com duas extremidades complementares livres, s quais ns pretendemos adicionar o fragmento de DNA a clonar. com isto surge o problema destas duas extremidades se unirem novamente, fechando o plasmdeo. durante o processo de

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transformao das clulas ns no somos capazes de distinguir os plasmdeos fechados vazios dos plasmdeos fechados com o fragmento a clonar. Assim corremos o risco de transformar bactrias com plasmdeos vazios, cultivlas (os plasmdeos vazios possuem na mesma o gene de resistncia) e depois no ter qualquer resultado. Para que isto no acontea necessrio por vezes recorrer a algumas tcnicas. 1- Clivagem com duas enzimas de restrio Provoca a existncia de duas extremidades diferentes no complementares, pelo que j no possvel a re-ligao. De notar que neste caso temos tambm de clivar o nosso fragmento com as mesmas enzimas de restrio. Este o processo mais simples para impedir a existncia de plasmdeos vazios, o nico problema que acarreta certificarmo-nos que nenhuma das enzimas de restrio digere o fragmento a clonar. 2- Tratamento com fosfatase alcalina Aps a incubao com enzimas de restrio segue-se um tratamento com esta enzima que vai clivar o fosfato no terminal 5. Deste modo a T4 DNA ligase no consegue actuar. Quando o fragmento de DNA se junta ao plasmdeo ele fornece dois grupos fosfato o que possibilita a formao de duas ligaes fosfodister. Mesmo assim o plasmdeo continua com falhas em duas outras regies. Quando se d a transformao das clulas, a prpria maquinaria celular trata de reparar estas falhas, obtendo assim um plasmdeo com o fragmento a clonar e as clulas transformadas.

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3- Seleco azul e branca No se trata de um processo para evitar plasmdeos vazios, mas sim para os identificar. Usa-se um plasmdeo cujo local de clonagem esteja presente no meio de um gene (habitualmente o lacZ), e faz-se uma clonagem normal. No caso do plasmdeo integrar o fragmento de DNA, vai haver uma interrupo no gene lacZ e no vai haver produo de -galactosidase, se o plasmdeo se fechar sobre si mesmo e formar um plasmdeo vazio ento h produo normal da -galactosidase e ocorre degradao da lactose. Fazemos a cultura das clulas num meio apropriado com IPTG (um anlogo da lactose, que quando degradado forma um precipitado azul). Depois de deixar de crescer podemos ver colnias azuis e colnias brancas, as colnias azuis significam que ouve expresso de -galactosidase e por isso as clulas foram transformadas com um plasmdeo vazio. As colnias brancas significam que no ocorreu expresso da galactosidase, e por isso o plasmdeo que as transformou possua o fragmento inserido. Nota: A integrao dos plasmdeos nas clulas um processo pouco eficaz e muito lento devido a alguns aspectos mas principalmente diferena de cargas entre o DNA () e a membrana celular (apolar, com regies hidrofbicas e selectividade). Deste modo so muitas vezes usados processos artificiais para inserir os plasmdeos, como a porao elctrica ou por tratamento com CaCl2, ou pelo uso de bacterifagos que possuem uma elevada taxa de eficincia na infeco de bactrias (mais de 98%). Biblioteca de cDNA At agora sempre que se falou de tcnicas de Biologia Molecular partiu-se do princpio que j se conhecia a sequncia do gene a utilizar. Mas e se pretendermos estudar um gene ou poro dele que ainda no tenha sido estudado e por isso se desconhea a sua sequncia? Como se procura e encontra o cDNA codificante de protenas de interesses cujos genes ainda no so conhecido? Hoje, com a sequnciao do genoma de tantos organismos diferentes torna-se cada vez menos frequente esta prtica. De facto hoje a primeira coisa a fazer-se uma pesquisa da sequncia do gene ou do cDNA numa base de dados disponvel na Internet. Para a replicao do gene necessitamos no do gene em si mas da sequncia de DNA complementar do mRNA (cDNA) que codifica a protena em estudo. O cDNA difere do gene porque no possui intres. importante conhecer o gene que d origem a uma protena para sabermos como a expresso desta e como pode ser controlada, mas quando se quer apenas expressar uma protena (por clonagem, p. e.) convm ter o gene sem intres, ou seja, o cDNA. Assim, se se quer produzir cDNA a partir do mRNA presente num determinado tipo de clulas onde o mRNA

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pretendido exista com alguma abundncia. No podemos pegar numa clula qualquer do corpo do organismo. Uma biblioteca de cDNA um conjunto de clones representativo de todo o mRNA de um conjunto de clulas, a dada altura do desenvolvimento. E para o desenrolar deste processo parte-se do conjunto de molculas de cDNA correspondentes a toadas as clulas de mRNA presentes neste tecido numa dada altura, criam-se todas estas molculas de cDNA a partir de transcrio reversa. Assim a construo de uma biblioteca envolve os seguintes passos: Construo e Rastreio. Nota: cDNA s se coloca esta questo quando se trata de genes eucariticos. Com as procariotas o cDNA igual ao DNA genmico, por isso, geralmente as bibliotecas de genes procariotas so quase sempre bibliotecas genmicas. (os procariotas no possuem intres) Construo: - Extraco do RNA total (Tecido ter em ateno qual) - Isolamento do mRNA - Sntese do cDNA em cadeia dupla - Ligao a um vector (bacterifago ) - Infeco de clulas hospedeiras (E. coli) Deste modo comea-se por isolar o RNA total da clula e depois extrai-se o mRNA do RNA total, por cromatografia de afinidade que tira partido da cauda de poliA para distinguir entre mRNA e os outros tipos de RNA. Colocando oligonucletidos com sequncias de timinas na matriz da coluna de cromatografia, este liga a cauda poliA e deixa todos os outros RNAs passar, ficando o mRNA retido. Depois, para desligar o mRNA da resina da coluna da cauda de poliA aumenta-se o pH na coluna por utilizao de uma soluo com muito sal. Depois de isolar os mRNA presentes nas clulas necessrio por transcrio reversa transformar estes em cDNA de modo a poder utiliz-los na biblioteca. Para isso pode-se novamente tirar partido da cauda de poliA e usar como primer um oligonucletido de timina (no esquecer que as transcriptases do DNA polimerases e por isso necessitam de um primer). Assim ficamos com uma cadeia de DNA em cadeia simples hbrida com uma molcula de RNA. Mas como a ligao do cDNA a um vector tem de ser feita com uma cadeia de DNA de dupla hlice temos de destruir a cadeia de RNA. podemos faz-lo pelo de RNAses ou de alkali, que corta a cadeia de RNA, e apenas a cadeia de RNA, em pequenos fragmentos que se vo desligar da cadeia de DNA. estes pequenos fragmentos vo ser teis porque podem depois ser usados como primers na amplificao deste fragmento. Assim fazemos PCR para ampliar esta cadeia, mas usamos DNA polimerase I, de modo a garantir que depois da sntese os oligonucletidos de RNA so retirados. , contudo, necessrio depois ligar estes cDNA a sequncias de restrio de moda a poder lig-los a vectores de clonagem. Ento necessrio ligar sequncias de restrio em ambas as extremidades do nosso cDNA, isto consegue-se usando cadeiras duplas contendo a

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sequncia de restrio e DNA ligase do bacterifago T4 que capaz de juntar cadeias de DNA em dupla hlice blunt-ended. Embora este tipo de reaco no seja muito eficaz, ns podemos aumentar a sua eficincia usando uma elevada concentrao de ligandos. As cadeias resultantes so ento tratadas com uma enzima de restrio dando origem a molculas de cDNA com sticky ends. O passo final da construo da biblioteca a ligao destes pedaos de cDNA ao vector de clonagem (plasmdeo ou vector viral) que j foi anteriormente tratado com a mesma enzima de restrio e portanto possui sticky ends complementares. O uso de bacterifagos como vectores de clonagem torna esta tcnica mais eficiente do que o uso de plasmdeos. Por isso usamos o bacterifago ao qual ligmos o nosso cDNA, inserindo-o por complementaridade dos sticky ends do cDNA a clonar e o genoma do vrus. Depois de se ligar o cDNA ao DNA viral h que construir um vrus eficiente para que possa infectar as bactrias. Para isso adiciona-se num tubo de ensaio o DNA viral modificado e as protenas que compem a cpsula viral e elas organizamse automaticamente para formar a cpsula. No final juntamos estes vrus funcionais a uma caixa de petri com bactrias em cultura. Estas vo ser infectadas pelos vrus e vo-se replicar formando colnias de bactrias em cultura. Estas vo ser infectadas pelos vrus e vo-se replicar formando colnias de bactrias infectadas de vrus (cada bactria s infectada por um vrus, e devido elevada eficincia destes, mais de 90% dos vrus infectam pelo menos uma clula). Mais tarde, devido ao elevado nmero de vrus (produzidos por ciclo ltico) dentro das clulas, elas rebentam e espalham os vrus, as zonas da colnia rebentada chamam-se placas fgicas.

O ciclo ltico de um vrus consiste na produo de mais cpias de si mesmo, isto possvel porque o genoma viral natural, assim como o utilizado, tm sequncias que codificam protenas para a cabea e cauda do invlucro do vrus. O vrus quando infecta bactrias pode integrar o seu genoma hospedeiro e reproduzir-se com a bactria (ciclo lisognico) ou ento pode tirar partido da maquinaria celular e comear a produzir vrias cpias de si mesmo (replicar, transcrever e traduzir o seu genoma) ciclo ltico , o elevado nmero de cpias geradas por este processo acabam por rebentar com a clula (lise).

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Assim, dado que cada bactria apenas infectada por um vrus, criam-se placas fgicas (clone) resultantes de apenas uma bactria me, ou seja, temos numa placa fgica vrias cpias de um cDNA inserido. E em cada placa fgica existe um cDNA diferente, pois derivam de vrus diferentes com diferentes cDNAs introduzidos. Bacteriofago em ciclo ltico

Rastreio: Primeiro o que temos de fazer transferir uma amostra de todas as placas fgicas para uma membrana, de modo a podermos manipul-las sem danificar toda a placa. Assim, coloca-se um filtro de nitrocelulose a cobrir as placas fgicas e parte destas vai ser transferida para a membrana; a partir daqui trabalharemos sempre com esta membrana. De seguira pegamos na membrana e incubamo-la numa soluo alcalina de forma a provocar a lise de todos os vrus e libertar o seu material gentico. Depois de extrado, a membrana incubada a altas temperaturas de forma a desnaturar as cadeia de DNA em dupla hlice hibridizada com uma sonda marcada com fosfato radioactivo ou com fluorescncia. Esta sonda possui uma sequncia complementar a uma zona do cDNA a detectar, por isso ela apenas se vai ligar ao nosso DNA, deste modo atravs da tcnica de autorradiografia podemos detectar qual a zona marcada radioactivamente na membrana de celulose, e por correspondncia sabemos qual a placa fgica que possui o cDNA que nos interessa. Agora podemos ir buscar o nosso cDNA directamente placa e utiliz-lo para os mais diversos fins.

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Mas se um dos objectivos desta tcnica descobrir qual a sequncia de DNA que d origem a uma protena, como construmos uma sonda complementar? possvel produzir uma sonda complementar se se conhecer uma sequncia parcial do nosso cDNA, nesse caso sintetizamos um oligonucletido complementar, caso no se conhea nenhuma sequncia parcial podemos sempre tirar partido de informaes anteriores, caso seja cDNA codificante para um factor de transcrio ou uma protena de determinada famlia que possua uma regio conservada, podemos tirar partido disto e construir uma sonda complementar a esta zona conservada. Imaginando que se trata de uma protena bastante conhecida em outros organismos como a actina, se estivermos a estudar a actina de Capivara podemos sempre fazer uma sonda partindo da sequncia conhecida de actina de ratinho, porque elas no ho-de variar muito. Caso no se tenha qualquer destes conhecimentos, a hiptese que nos resta sequenciar a protena em estudo e tentar criar uma sonda, tendo como base a sequncia da protena. Temos, no entanto, de ter vrios aspectos em ateno: o cdigo gentico degenerado pelo que um aminocido pode ter sido originado a partir de vrios codes e no sabemos ao certo qual deles foi. Por isso escolhemos uma zona em que a variabilidade de codes possvel seja menos. E tambm conveniente ter em conta a frequncia de codes utilizados por aquela espcie. Se partida j sabemos que em 80% dos casos a Capivara utiliza o codo CCA para codificar Prolina, ento usamos esse mesmo codo na nossa sonda, pois mais provvel que seja esse o correcto. No caso de construirmos a sonda atravs da sequncia de aminocidos da protena temos muitas vezes de construir mais uma sonda devido s vrias possibilidades de sequncias do cDNA. Por isso, tambm convm escolher um local e uma sequncia que no seja muito varivel, pois isso iria dar mais trabalho e dispndio de dinheiro, assim como podia no ser especfico.

Depois de sintetizar a sonda e de a marcar radioactivamente pode-se utiliz-la como descrito anteriormente. Em mais pormenor:

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Biblioteca Genmica No caso de se pretender obter o gene tal e qual ele existe no ncleo, com intres, exes e promotores, no podemos fazer uma biblioteca de cDNA, em vez disso temos que fazer uma biblioteca genmica conjunto de clones representativo de todos os genes de um organismo. A construo de uma biblioteca genmica bastante semelhantes construo de uma biblioteca de cDNA, tambm esta composta por duas partes principais: Construo e Rastreio. Construo: - Extraco do DNA - Digesto parcial com uma enzima de restrio - Ligao a um vector (bacterifago ) - Infeco de clulas hospedeiras (E. coli) A extraco do DNA processa-se de maneira diferente, pois no interessa qual o tipo celular que utilizamos dado que o que queremos o genoma completo e esse est presente em todas as clulas. Para extrair os genes o que temos de fazer clivar todo o genoma com enzimas de restrio de modo a obter fragmentos pequenos que vo ser ligados a vectores e infectar as clulas hospedeiras. A estratgia de clonagem igual em ambas as bibliotecas, clivagem, ligao ao DNA viral, infeco, construo de placas fgicas. De seguida temos de fazer o screening (rastreio) das placas para encontrar o genoma viral associado ao fragmento de DNA com o gene de interesse. O rastreio igual ao rastreio usado na construo de uma biblioteca de cDNA. A construo da sonda pode ser feita de igual maneira ou, caso j haja informao de qual o cDNA para a protena codificada por este gene, podemos ainda tirar partido desta informao. Contudo, a biblioteca no termina por aqui. ainda necessrio fazer-se um Southern Blot de modo a identificar quais as pores importantes do nosso gene. Southern blot Consiste na anlise de um genoma clivado em vrios fragmentos por enzimas de restrio, nos quais queremos saber qual(ais) o(s) fragmento(s) que correspondem ao nosso gene fragmentos aos quais a sonda se liga. Para isso, clivamos o nosso genoma (no caso da biblioteca genmica, clivamos o fragmento presente na placa fgica com resultado positivo) e corremos em electroforese, de modo a separ-los por peso molecular. De seguida transferimos o contedo do gel para uma membrana formando-se uma rplica do gel. De seguida incuba-se a membrana com a sonda usada no rastreio, esta vai ligar-se a alguns fragmentos resultantes da segunda digesto por enzimas de restrio (inicio do Southern blot), esses fragmentos so os fragmentos que correspondem ao nosso gene, os fragmentos a que ela no se ligar so exteriores ao gene.

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Ateno: Durante a primeira clivagem com enzimas de restrio usa-se uma quantidade mnima destas enzimas de moda a que a digesto seja parcial (incompleta). Isto faz com que alguns cromossomas de umas clulas sejam cortados em pedaos mais pequenos e outros de outras clulas em pedaos maiores. Com isto o que ns podemos ter (e termos) so fragmentos do gene que nos interessa de vrios tamanhos, cada um deles proveniente de cromossomas de diferentes clulas que sofreram diferentes digestes. Ns vamos tirar partido disto, porque aps o primeiro Southern blot podemos no possuir a sequncia total do gene (muito dificilmente obteremos isso logo primeira). Assim, pegamos na informao que o primeiro Southern blot nos d e construmos uma nova sonda para uma zona que no aquela que foi usada na primeira sonda. Com esta nova sonda voltamos a fazer um rastreio da biblioteca genmica (membrana e autoradiografia), provavelmente obtemos outras placas marcadas, e fazemos novo Southern blot. Isto repete-se at se possuir toda a sequncia do gene. A este processo de percorrer o gene chama-se Chromosome Walking. Pegando e comparando a informao obtida por cada Southern blot conseguimos alinhar toda a sequncia do gene. Para conhecer os exes e intres basta comparar a sequncia do gene com a cDNA, ou ento, procurar as sequncias tpicas, presentes nos intres, reconhecidas pelo spliciossoma. Anlise dos Nveis de Expresso de uma Protena J sabemos que uma protena est presente, qual o seu cDNA e at mesmo qual o gene que a codifica, mas e a quantidade desta? Ser que ela necessria em grande quantidade ou em pequena quantidade? Existem vrias maneiras de analisar os nveis de expresso de uma protena, desde formas qualitativas at formas quantitativas. E esses estudos podem ser a nvel da prpria protena ou por anlise do mRNA que lhe d origem. Uma das formas qualitativas de o fazer por hibridizao in situ por anlise de um gene reprter, criando um organismo transgnico onde se associa o promotor dessa protena (por isso necessrio conhecer o gene que a codifica e no apenas o cDNA) a um gene essencial sobrevivncia da clula, pelo que a sua produo da protena reprter no vai ser prejudicial clula e vai-nos ser til, pois o seu nvel de expresso, ou o do seu mRNA vai ser igual ao da protena em estudo. Podemos ainda aproveitar o facto de se conhecer a sequncia do promotor para estudar em que zona se ligam os

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factores de transcrio (eliminando sequncias deste) e analisando depois a expressai do gene reprter. O uso de genes reprteres bom porque no interfere com o desenvolvimento do organismo. Outro processo para analisar os nveis de expresso por Northern blot, o processo equivalente ao utilizado em southern blot, alterando apenas o incio. Com Northern fazemos uma anlise dos RNA em ds de DNA, a sonda feita a partir de sequncias de cDNA conhecidas. Assim vemos qual a quantidade de RNA marcado e tiramos concluses.

1-Western blot No varia muito de todos os outros blots falados at agora, a principal diferena a anlise de protenas em vez de DNA (Southern) ou de RNA (Northern), a sonda usada um anticorpo especfico para a protena. Comea-se por se desnaturar as protenas, pois a protena nativa pode esconder a zona reconhecida pelo anticorpo. De seguida faz-se uma electroforese (em condies desnaturantes) e faz-se um blot (passagem do resultado da electroforese para uma membrana) e incubamos o anticorpo. Para visualizarmos incubamos esta membrana com um anticorpo secundrio, marcado radioactivamente (ou com flurforos ou com fosfatos alcalina ou enzimas reprter), especfico para o primeiro. O uso do anticorpo secundrio tem vantagens no sentido em que pode ser usado vrias vezes em vrias experincias, diminuindo o gasto econmico, assim como a produo de vrios anticorpos marcados (uma para cada experincia, cada blot). Nota: Para podermos identificar por imunodeteco importante que a nossa protena esteja a ser expressa, por isso temos de ter em ateno o tipo de biblioteca e vector em uso. 2- Identificao por Anlise Proteica o mtodo de identificao mais directo possvel, poupa muito trabalho em fases seguintes, pois s possvel identificar se a enzima estiver activa, ou seja, completa e funcional. Podemos fazer a identificao por ensaio enzimtico na prpria placa, atravs do uso de substratos modificados que emitam cor, ou luz, ou usando meios de sobrevivncia (onde s sobrevive aquela colnia que possuir a enzima activa gene todo e funcional). Depois as fases seguintes so mais fceis, porque sabendo que o gene se encontra completo naquela colnia poupa trabalhos como o gene walking. Bastando apenas cultivar aquela colnia de clulas e proceder sequnciao de genes.

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3- Complementao Funcional o mtodo mais invulgar e difcil, alm disto demora mais a ser elaborado. Numa fase inicial constri-se toda a biblioteca genmica com determinada estirpe bacteriana (+), no final transforma-se uma outra estirpe (-), a qual s sobrevive na presena do gene A+ e A-, pelo que estes sero os seleccionados.

Um outro mtodo indirecto para a quantificao de protena o uso de PCR em que as molculas de RNA so ampliadas de acordo com a sua concentrao inicial. Isto , na clula quantidades destes RNAs podem ser vestigiais e por isso no so detectadas, assim quando sujeitas a PCR elas vo ser ampliadas em proporo assim, conhecendo a expresso do RNA de uma protena podemos comparar a expresso da nossa protena. No entanto, esta tcnica trs desvantagens, como no caso das protenas terem expresses muito semelhantes, a diferena entre as duas bandas pode no ser muito notria, visto o PCR ter uma amplificao exponencial. Para contornar este problema faz-se um ajuste ao protocolo, fazendo medies da quantidade de DNA em intervalos de tempo. Sequenciao de Genes Depois do rastreio da nossa biblioteca vamos sequenciar o gene clonado de modo a podermos obter a sequncia de nucletidos e, consequentemente, a de aminocidos (caso ainda no se conhea) e a identidade da protena. Ou podemos apenas querer saber a sequncia de nucletidos a fim de podermos utilizar esta informao em trabalhos posteriores, como clonagem ou organismos transgnicos. O mtodo mais utilizado nesta sequnciao o mtodo de Sanger. Este faz uso de um primer (convm saber qualquer coisa sobre o fragmento a sequenciar, ou ento, caso se faa esta tcnica com o uso de vrus tambm podemos utilizar um primer complementar de ao DNA viral na zona de insero do cDNA primers para o vector e de ddNTPs marcados. Fazem-se quatro reaces em tubos de ensaio diferentes, onde se coloca o DNA, DNA polimerase e dNTPs normais,

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contudo tambm se adicionam dNTPs modificados, ou seja, ddNTPs. Estes possuem uma alterao no grupo OH 3, que substitudo por um H (pra a transcrio) e encontram-se marcados com fluorescncia. Assim, no primeiro tubo de ensaio coloca-se para alm dos trs componentes principais (DNA, DNA polimerase e dNTPs) coloca-se tambm ddGTP, deste modo, dado que este no possui o grupo 3OH, a transcrio pra quando este adicionado. Nos outros tubos adiciona-se o mesmo mas em cada um deles um ddNTP diferente. Assim, a cada adio de um ddNTP a transcrio pra, o que se passa no primeiro tubo ilustrado na figura ao lado, a cada adio de G modificada a transcrio pra e assim formam-se vrias molculas de vrios comprimentos. A presena de G no modificadas em maior quantidade permite que estas tambm sejam adicionadas e deste modo a transcrio no parar sempre no primeiro nucletido de G. Com isto vo haver cadeias que pararam a sua sntese na primeira G, outras que interromperam na segunda, e assim sucessivamente at quelas que foram at ao final sem serem travadas.

Depois das vrias cadeias serem sintetizadas corre-se em electroforese por tamanho molecular, as molculas mais pequenas (aquelas que foram travadas no incio) correm mais no gel, porque so mais pequenas, enquanto as maiores correm menos porque so maiores e no passam to bem nos poros. Assim, a cadeia que se deslocar mais ser aquela que parou logo no primeiro nucletido e assim sucessivamente, como mostra a figura. Neste caso foram feitas quatro reaces diferentes para cada um dos nucletidos diferentes em quatro tubos separados e correram-se em diferentes poos na electroforese. Nestes casos mais comum marcar os ddNTPs radioactivamente do que com marcadores fluorescentes, a leitura faz-se da mesma maneira consoante a posio relativa de cada banda no gel. Podemos por vezes encontrar bandas mais intensas que outras, isso depende do nmero de cadeias que foram travadas naquela posio. Ateno, para fazer a separao de fragmentos de DNA que variam to pouco (diferenas de um nucletido por vezes) tem de se usar um gel poliacrilamida. Notar que esta tcnica tem de ser feita com o DNA em cadeia simples, ou seja, depois de sintetizar as cadeia necessrio submet-las primeiro a um processo desnaturante.

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Mas e se o que queremos sequenciar muito grande? E se as diferenas entre as bandas forem to pequenas que no sejam fceis de distinguir qual est primeiro e qual est depois? Para isso usa-se a sequenciao automtica e marcam-se os ddNTPs com fluorescncia (neste caso no pode ser por radioactividade), mas pode-se fazer ocorrer todas as reaces no mesmo tubo de ensaio, juntando todos os ddNTPs. Aps a sntese estar completa desnaturam-se as molculas e procede-se um electroforese capilar que tem muito mais sensibilidade para as diferenas no tamanho das molculas, alm disso utilizam-se leitores a lazer que detectam com tamanha preciso variaes na absorvncia (cor) das bandas e possibilitam uma leitura mais eficiente electrofluorograma. Onde cada pico corresponde a um nucletido, o tamanho dos picos variam com a concentrao de molculas daquele tamanho. A leitura faz-se da esquerda (5) para a direita (3).

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Capitulo3- BioinformticaO que a bioinformtica? A bioinformtica a fuso da biologia com sistemas tecnolgicos de informao. o ramo da cincia que lida com anlise computadorizada de dados biolgicos. Nos programas de bioinformtica h registo de uma grande variedade de sequncias de aminocidos ou nucletidos, assim como estruturas tercirias e quaternrias de protenas. Essencialmente a bioinformtica uma base de dados e a sua consulta necessria para a realizao de grande parte das tcnicas que so abordadas nesta disciplina. A bioinformtica no pode ser vista como um captulo independente, mas sim como o ponto de partida ou base de todos os captulos da biotecnologia e de outras cincias. Basicamente a bioinformtica necessria para: - Identificar protenas; - Desenhar estratgias, ou parte delas; - Procurar homologias; O que est disponvel na Internet? EMBL EBI: Base de dados de artigos, sequncias, microarrays, servios MEROPS: Base de dados para enzimas Nota: A informao igual para as diferentes bases de dados, pois estas esto interligadas.

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Capitulo4- Produo de Protena Recombinante1- Produo de Protena Recombinante em ProcariotasO objectivo principal da clonagem de um gene com aplicaes biotecnolgicas a sua expresso num organismo hospedeiro. No entanto, a introduo de um gene num o vector de clonagem no significa necessariamente sucesso na sua expresso. Para alm disso sempre necessrio uma expresso elevada da protena. Em resposta a esta elevada necessidade, muitas foram as estratgias de clonagem desenhadas usando e especializando diferentes vectores por manipulao gentica, estas no aumentam apenas a sua produo, como tambm a optimizam. Estas modificaes incidem sobre um variado nmero de elementos que controlam a transcrio, traduo, estabilidade proteica, limitaes ao oxignio e a segregao na clula do hospedeiro. Mais especificamente, as caractersticas moleculares a manipular incluem: - Natureza do promotor e a sequncia terminal; - Fora da ligao ao ribossoma; - Nmero de cpias do gene clonado e se este integrado num plasmdeo ou inserido no genoma do hospedeiro; - Localizao celular final da protena produzida; - Eficincia na traduo do organismo hospedeiro; - Estabilidade intrnseca do gene clonado na clula hospedeira; No existe uma nica estratgia para atingir a expresso mxima de todos os genes a clonar. A maioria dos genes clonados possuem propriedades moleculares distintas que requerem um investimento de tempo e esforo, antes de se encontrar um determinado conjunto de condies que resultem num nvel de expresso aceitvel. O nvel de expresso obtido tambm varia com a identidade do organismo utilizado na expresso. O mais comum E. coli, mesmo apesar de existir um vasto nmero de procariotas e eucariotas capazes de expressar genes estrangeiros. Contudo muitos outros organismos como a bactria Bacillus subtilis, leveduras como a Saccharomyces cerevisae, animais, plantas e clulas de insectos e mamferos em cultura. De notar que nunca uma estratgia desenhada para E. coli deve, em principio, ser utilizada nos outros sistemas. Nota: Uma protena nica e diferente de todas as outras, por isso uma estratgia corrente nem sempre funciona e podem ser necessrio uma ou mais alteraes de modo a conseguir expressar correctamente a protena em causa. Alteraes ao nvel do promotor O requisito mnimo para a expresso eficiente de um gene a presena de um promotor forte e regulvel a montante do gene a clonar. Um promotor forte um promotor com alta afinidade para a RNA polimerase. A capacidade de regular um promotor possibilita clula e ao investigador o controlo da extenso da transcrio de forma precisa. Nota: o promotor do opero Lac de E. coli tem sido altamente utilizado para a expresso de genes clonados. Contudo, outros promotores com caractersticas distintas tambm tm sido teis no controlo da expresso de protenas. 21

Desta forma, um modo fcil para aumentar a expresso de um gene seria colocar um promotor forte na regio a montante desse gene. Contudo, um nvel elevado de produo e a sua expresso contnua muitas vezes prejudicial para a clula hospedeira. A instabilidade do plasmdeo o maior problema que a expresso de protenas enfrenta, isto porque todo ou uma poro do plasmdeo que contm o gene a ser expresso continuamente pode ser perdido ao fim de algumas divises celulares, dado que as clulas sem plasmdeo crescem mais rapidamente. Para ultrapassar este obstculo necessrio o controlo da transcrio de forma a que o gene clonado seja expresso apenas em estgios especficos do ciclo de vida da clula hospedeira (baixa expresso da protena numa fase precoce do desenvolvimento, e alta quando a clula hospedeira j est desenvolvida). Isto consegue-se pelo uso de promotores fortes e regulveis. Os plasmdeos construdos para atingir esta tarefa so chamados vectores de expresso. Promotores regulveis: Os mais usados so os operes Lac e Trp de E. coli. 1- Opero lac As bactrias possuem um mecanismo geral muito simples, para coordenar a regulao de genes que codificam produtos que participam numa srie de processos relacionados. Estes genes encontram-se reunidos no cromossoma e so transcritos juntos. Muitos mRNAs procariticos so policistrnicos muitos genes num nico transcrito e o nico promotor que inicia a transcrio desta reunio , tambm, zona de regulao para a expresso destes genes. O conjunto de genes do promotor, e sequncias adicionais que funcionam juntos na regulao, chamado de opero.

Muitos dos princpios da expresso gnica em procariotas foram inicialmente definidos por estudos do metabolismo da lactose em E. coli, que pode usar a lactose como sua nica fonte de carbono. O opero da lactose (lac)inclui o gene da galactosidase (z), galactosidase permease (Y) e thiogalactoside transacetylase (A). Esta ultima parece modificar galacatosdeos txicos para facilitar a sua remoo da clula. Cada um destes trs genes precedido por um local de ligao de ribossomas, que independentemente direcciona a traduo daquele gene. A regulao do opero lac por protenas repressoras lac segue os padres delineados anteriormente. Estudos de operes lac mutantes revelaram alguns detalhes no funcionamento do sistema de regulao dos operes. Na ausncia de lactose, os genes do opero lac so reprimidos. Mutaes no operador ou noutro gene, no gene I, resultava numa sntese constitutiva dos produtos dos genes.

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Quando o gene I defeituoso, a represso pode ser restaurada pela introduo do gene I funcional na clula numa outra molcula de DNA, demonstrando que o gene I codifica uma molcula difundvel que causa a represso do gene. Esta molcula, uma protena, agora chamada o repressor lac. O operador ao qual ele se liga mais fortemente (O1) bloqueia a iniciao da transcrio. O gene I possui o seu prprio promotor (PI) independentemente dos genes do opero lac. O opero lac possui, ainda, dois locais de ligao do repressor. Um deles (O2) encontra-se na regio +410, dentro do gene que codifica a -galactosidase (Z); o outro (O3) encontra-se prximo da zona -90, dentro do gene I. Para reprimir o opero, parece que o repressor lac se liga a ambos, o local principal de ligao e um dos locais secundrios, formando um loop. Qualquer uma das combinaes bloqueia a transcrio. Apesar deste elaborado complexo de ligao a represso no absoluta. A ligao do repressor lac reduz a transcrio a uma taxa de 103. Se os locais O2 e O3 forem eliminados do opero, a simples ligao do repressor ao local O1 reduz a transcrio numa taxa de 102. Quando as clulas possuem lactose, o opero lac encontra-se induzido. Uma molcula indutora liga-se a um local especfico no repressor lac e provoca uma alterao conformacional que resulta na dissociao do repressor do operador. O indutor no sistema de represso do opero lac no a lactose por si mesma, mas a alolactose, um ismero da lactose. Aps a lactose entrar na clula por uma das poucas permeases ainda existentes, a lactose convertida em alolactose por uma das poucas galactosidases ainda existentes. Libertando o operador do repressor, permitindo ao opero lac ser transcrito, conduzindo a um aumento da expresso de permeases e galactosidases. Os mecanismos pelos quais os operes so regulados podem variar muito do modelo aqui apresentado anteriormente, de facto, o prprio opero da lactose mais complexo do que aquilo que aqui foi indicado, com um activador que contribui para o esquema global. Nota: Em biotecnologia no se utiliza lactose mas sim IPTG como indutor do promotor. Isto porque o IPTG tem o mesmo efeito anlogo da lactose e no degradado metabolicamente pela clula. Regulao positiva o opero lac As interaces operador/repressor/indutor descritas anteriormente para o opero lac providenciam um modelo satisfatrio e intuitivo para um mecanismo on/off na regulao da expresso gnica. Na verdade, a regulao de um opero raramente assim to simples. O ambiente bacteriano demasiado complexo para que os seus genes sejam controlados apenas por um sinal. Outros factores para alm da lactose controlam a expresso dos genes lac, tais como a disponibilidade da glucose. A glucose proveniente directamente da gliclise a fonte principal de energia da clula.

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Claramente a expresso de genes para protenas que metabolizem aucares tais como a lactose ou a arabinose um desperdcio quando a glucose abundante. O que acontece ao opero lac quando ambas a glucose e a lactose esto presentes? Um mecanismo de regulao conhecido como represso cataboltica restringe a expresso dos genes necessrios para o catabolismo da lactose, arabinose e outros acares na presena de glucose, mesmo quando estes acares esto presentes. O efeito da glucose mediado pelo AMP cclico (cAMP), como coativador, e uma protena activadora conhecida como protena receptora de cAMP (CRP) por vezes referida como CAP.

Quando a glucose est ausente, CRP-cAMP liga-se a um local perto do promotor lac e estimula a transcrio do RNA. CRP-cAMP , portanto, um regulador positivo responsivo aos nveis de glucose, enquanto o repressor lac um regulador negativo responsivo aos nveis de lactose. CRP-cAMP tem pouco efeito no opero lac quando o repressor lac est a bloquear a transcrio, assim como a dissociao do repressor do operador tem pouco efeito na transcrio do opero lac, a menos que a CRP-cAMP esteja presente para facilitar a transcrio; quando o CRP no se encontra ligado, o tipo selvagem de promotor lac um promotor relativamente fraco. O complexo aberto de RNA polimerase e do promotor no se forma automaticamente, necessria a presena de CRP-cAMP. CRP interage directamente com RNA polimerase. O efeito da glucose no CRP mediado pelas interaces com o cAMP. CRP liga-se ao DNA quase avidamente quando as concentraes de cAMP so altas. Na presena de glucose, a sntese de cAMP inibida e o fluxo do cAMP diminui, a ligao do CRP ao DNA, consequentemente diminuindo a expresso do opero lac. Fortes indues do opero lac so depois necessrias, ambas a lactose (para inactivar o repressor) e baixas concentraes de glucose (para desencadear o aumento na concentrao de cAMP e o aumento da ligao de cAMP ao CRP). As protenas CRP e cAMP esto envolvidas em muitos sistemas regulatrios de vrios operes.

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Concluso: Baixa glicose aumenta a produo de lactose e consequentemente IPTG -, um aumento na concentrao de cAMP e isto tudo resulta na elevada taxa de transcrio. 2- Opero do triptofano Os 20 aminocidos so necessrios em grandes quantidades para a sntese proteica, e a E. coli consegue sintetiz-los a todos. Os genes para as enzimas necessrias para a sntese de aminocidos esto geralmente reunidos num opero e so expressos sempre que haja necessidade. Quando o aminocido est em abundncia na clula, as enzimas biossintticas no so necessrias e o opero reprimido. O opero triptofano (trp) em E. coli inclui cinco genes para as enzimas necessrias para a sntese de triptofano. De notar que duas das enzimas catalizam para de um passo na vida metablica. O mRNA resultante deste opero tem um tempo de meia-vida de apenas 3 minutos, permitindo clula responder rapidamente a mudanas de necessidades para este aminocido. Quando o triptofano abundante ele liga-se ao repressor de trp, causando uma alterao conformacional que permite ao repressor ligarse ao operador trp e inibir a expresso do opero trp. O operador trp sobrepe-se ao promotor, assim a ligao do repressor bloqueia a ligao da RNA polimerase. Uma vez mais, este simples mecanismo on/off mediado por um repressor no a histria completa da regulao. - O inibidor na ausncia de trp forma um dmero incapaz de ligar ao promotor. - O inibidor na presena de trp forma um dmero que liga trp e sofre alterao conformacional, ligando-se ao promotor. - Na biotecnologia, a activao deste produtor pode ser feita por remoo de trp ou por adio de cido 3-indoleacrylic ao meio.

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Em laboratrio foram criados promotores artificiais, por exemplo foi criado um promotor que rene o melhor do opero Lac e do opero Trp, o promotor tac (3 vezes mais forte que o trp e 10 vezes mais forte que o lac). O promotor tac inclui a regio -10 do promotor lac e a regio -35 do promotor trp. Nota: Existe outro promotor hbrido entre o lac e o trp, o promotor trc. A diferena deste para o tac a distncia entre as regies -35 e -10 dos promotores trp e lac, 17 pb no caso do promotor trc e 16 pb no caso do promotor tac. Outros promotores artificiais so o promotor pL criado a partir do bacterifago e o promotor do gene 10 do bacterifago T7 pT7. Cada um destes promotores interage com repressores, o que providencia um interruptor especfico da transcrio. Alm disso todos estes reconhecem especificamente a RNA polimerase presente em E. coli. O promotor pL controlado pela protena repressora CI do bacterifago . Na prtica, um mutante do repressor CI sensvel temperatura, normalmente usado para regular directa do pL. As clulas contendo este mutante so cultivadas a 28/30C, temperatura para qual o repressor previne a transcrio directa do promotor. Com a continuao do crescimento bacteriano tambm a temperatura elevada sendo que ao atingir os 42C o repressor inactivado e a transcrio pode acontecer, isto quebra o efeito de toxicidade em estgios precoces do desenvolvimento. O promotor do bacterifago T7 necessita de uma RNA polimerase especifica. Para utilizar este promotor o gene para a RNA polimerase T7 inserido no cromossoma de E. coli, por aco de um bacterifago lisognico, sob o controlo do promotor lac. Assim pela regulao do promotor lac regula-se tambm a expresso da RNA polimerase e consequentemente a transcrio do plasmdeo com o promotor T7. IPTG Opero Lac RNAT7 Transcrio do gene Nota: O sistema pET foi elaborado de forma a explorar a fora do promotor T7. Problemas: A eficincia em desactivar o repressor e com isso activar a transcrio depende da razo entre o nmero de cpias do promotor: - Se existirem poucas molculas de repressor torna-se difcil de induzir a traduo - Se existirem poucas molculas repressoras (mesmo que em maior quantidade que o nmero de cpias do promotor) a transcrio ocorre mesmo sem induo. No caso de ocorrer transcrio sem induo, estamos na presena de um promotor Leaky. Este tipo de promotores so um problema pois podem causar resultados antes do esperado, o que pode ser prejudicial experincia ou, em casos extremos, morte celular por intoxicao. J foram especuladas muitas formas de como manter estes sistemas controlveis. Por exemplo, manter o gene para o repressor e o seu promotor em dois plasmdeos distintos com nmeros de cpias por clula diferentes. Actualmente, o gene para o repressor colocado num plasmdeo com um baixo nmero de cpias por clula (1 a 8) e o gene para o promotor mantido num plasmdeo com um elevado nmero de cpias por clula (30 a 100). Alternativamente o gene do repressor pode ser transportado em cpia nica via genoma da bactria. O promotor lac um destes casos uma vez que pode ser induzido por lactose endgena e por isso, geralmente, utiliza-se um mutante (gene lac I9) que produz muito maior quantidade de repressor, baixando o nvel de leakiness.

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Nota: Em biotecnologia sempre importante encontrar um equilbrio entre o nvel de expresso pretendido e o nmero de cpias do gene inserido. bom ter em conta o nmero de ribossomas, tRNA, O2 para a respirao e produo de ATP, metabolitos, etc alinhados com o pretendido, caso contrrio por mais estimuladas que as clulas sejam no h obteno de mais produto. Na realidade por vezes melhor uma sntese mais lenta de forma a obter maior taxa de produo. Soluo: Utilizar mltiplas cpias , geralmente 3 ( bom no exagerar seno o resultado o mesmo), num plasmdeo low copy ou no DNA cromossomal. Eficincia na traduo Colocar um gene a clonar sobre a influncia de um promotor forte e regulvel, apesar de essencial, pode no ser suficiente para maximizar a correcta produo da protena clonada. Outros factores como a eficincia na traduo e a estabilidade do novo traduzido podem tambm afectar a quantidade de produto. Em clulas procariticas muitos mRNAs no so traduzidos com a mesma fora, de facto eles podem ser expressos em nveis bastante distintos. A base molecular para esta diferena a presena de uma regio designada por Ribossome binding site (RBS) no mRNA que funciona como sinal para a traduo. O RBS uma sequncia de 6 a 8 nucletidos (UAAGGAGG) no mRNA que emparelha com uma sequncia complementar na subunidade menor do ribossoma. Geralmente, quanto mais forte a ligao desta sequncia ao ribossoma mais eficiente a traduo. Assim sendo, muitos vectores de expresso de E. coli foram desenhados de maneira a assegurar que o mRNA do gene clonado contenha um RBS forte e que se encontre distncia apropriada do codo de iniciao. Nota: No RNA o codo de iniciao AUG. No DNA a cadeia com a sequncia ATG denominada a cadeia codificante, pois igual (em sequncia de nucletidos) ao mRNA a ser traduzido) enquanto que a cadeia complementar aquela que serve de molde ao mRNA denominando-se cadeia no codificante, sendo por conveno ATG o codo de iniciao no DNA. Para alm da RBS ser forte e bem posicionada, a sequncia que inclui a RBS e que se extende at aos primeiros codes do gene, no pode possuir sequncias de nucletidos que, aps transcrio, consigam emparelhar e formar loops, diminuindo assim a interaco do RBS e mRNA com o ribossoma. Assim, para cada gene clonado importante estabelecer que o RBS esteja propriamente colocado e que a estrutura secundria do mRNA no previne o seu acesso ao ribossoma. Como fazer isto na prtica? Utilizao de um plasmdeo especial com a sequncia RBS e restantes nucletidos inseridos no prprio vector. Assim, quando se adiciona o gene a clonar adiciona-se s a sequncia a partir do codo AUG. Alm disto uma incompatibilidade celular que pode interferir com o processo o uso de codes diferentes para o mesmo aminocido por parte de organismos distintos. Em alguns casos a clula hospedeira pode no possuir tRNAs para determinado codo, ou possuir muito poucos, o que pode impedir ou atrasar a expresso de novas protenas.

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Muito pouco pode ser feito para contrariar isto, no entanto este efeito pode ser revertido recorrendo sntese qumica do gene substituindo os codes raros por outros mais comuns, utilizao de outros hospedeiros ou sobrexpresso do tRNA pretendido no organismo hospedeiro atravs do uso de um plasmdeo especial o pRARE. A E. coli apesar de bem caracterizada nem sempre a melhor para a expresso de alguns genes, por isso existe investigao a fim de encontrar outro organismo gramnegativo para a substituir. No existe um vector perfeito. Existem vrios organismos, vrias influncias, vrias condies e por isso o que existe so vrios vectores com bastantes variaes. Aumentar a estabilidade da protena As protenas com tempo de meia vida maior podem ser acumuladas nas clulas e aumentar a concentrao do produto final. Sob condies normais de crescimento o tempo de meia vida pode variar entre alguns minutos e algumas horas. A base para esta diferena de estabilidade deve-se tanto exteno/fora das pontes dissulfito como a alguns aminocidos no N-terminal. Por exemplo: - adicionando arginina (Arg) ao N-terminal da protena, o seu tempo de meia vida passa a ser de 2 minutos apenas; - adicionando alanina o tempo de meia vida da protena varia para mais de 20 horas; Contrariamente a esta teoria, existe uma sequncia de aminocidos no interior da protena que a torna mais susceptvel, a regio PEST. Esta regio rica em prolina (P), glutamato (E), serina (S) e trionina (T) e encontra-se muitas vezes, mas nem sempre, rodeada por clusters de aminocidos positivos que podem actuar como marcadores da degradao da protena. Nota: A teoria do N-terminal pode ser falaciosa dado que as caudas de algumas protenas encontram-se enterradas na sua estrutura terciria e por isso a identidade do aminocido no N-terminal no tem qualquer efeito a este nvel. Outros aspectos que podem influenciar a estabilidade de uma protena so as suas modificaes ps-traducionais, por exemplo as glicosilaes e formao de pontes dissulfito. Secreo Proteica A estabilidade de uma protena clonada em E. coli muitas vezes depende da sua localizao celular. Por exemplo, a proinsulina recombinante aproximadamente 10 vezes mais estvel quando secretada (exportada) para o periplasma (espao entre a membrana citoplasmtica e a membrana externa) do que se ficasse retida no citoplasma. As protenas secretadas so tambm mais fceis de purificar. Normalmente uma sequncia de aminocidos, designada por sequncia sinal, localizada no N-terminal da protena responsvel por comandar o destino da protena, inclusive a sua secreo ou no. possvel, atravs da engenharia gentica, adicionar esta sequncia sinal de modo a aumentar/facilitar a exportao da protena em causa. Contudo esta sequncia no garante a alta taxa de exportao proteica, at porque bactrias gram-negativas como E. coli no so capazes de exportar para o meio devido parede celular que se

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revela como uma barreira fsica. Para este problema existem duas solues: utilizar bactrias gram-positivas ou eucariotas, ou fazer com que as gram-negativas consigam exportar para o meio. Uma coisa til na excreo de protenas para o periplasma afast-las de proteases endgenas. Este problema tambm se resolve pelo uso de estirpes pobres em proteases. Em E. coli as glicosilaes e a formao de pontes dissulfito so difceis de promover devido falta de complexo de golgi e falta de capacidade de gerar microambientes oxi-redox necessrios formao de pontes dissulfito. A biotecnologia consegue, em parte, resolver este problema modificando o ambiente periplasmtico para oxi-redox e provocando a excreo da protena, provocando assim um ambiente ptimo para a formao das pontes dissulfito. Protenas de Fuso Durante a expresso de algumas protenas existem problemas ao nvel da degradao e da purificao, entre outros. Uma forma de resolver estes dois problemas em conjunto ligando o gene a clonar a um gene estvel do hospedeiro. Esta construo cria o que designado por protenas de fuso e protege o produto do gene clonado do ataque de proteases da clula hospedeira. As protenas de fuso so criadas a um nvel bsico, DNA, ligando as duas regies codificantes dos genes (ORF), removendo o codo STOP de uma delas e colocando-as sob o efeito do mesmo promotor. Isto consegue-se usando um vector de fuso que possui dois locais de clonagem, um para o gene da protena nativa e outro para o gene a clonar. comum nos vectores actualmente no mercado j possuem gene da protena nativa, sendo que o processo de insero do gene a clonar no sofre alteraes significativas. A protena de fuso mais utilizada a -Galactosidase-gene lac7. Uma das questes que este tipo de clonagem nos coloca Qual das extremidades da protena se deixa livre e qual se usa na fuso com a protena nativa?. Esta questo coloca-se primeiro porque temos ambas as oportunidades e depois porque necessrio, aps a produo, purificar a protena separando-a das restantes. Para a purificao usual fazer-se uso da cauda da protena numa cromatografia de afinidade. As caudas podem ser: - 6 Histidinas; - FLAG; - Calmodulin binding protein; - Glutaniona-S-transferase-GST: - Protena A; - Maltose binding protein; A cauda de 6 Histidinas uma sequncia de 6 a 10 aminocidos que ligam facilmente Ni2+, que pode ser incorporado na matriz da cromatografia. A cauda FLAG consiste numa sequncia de aminocidos (Asp-Tyr-Lys-AspAsp-Asp-Asp-Lys) que reconhecida por um anticorpo ( a ser usado na matriz) e por uma enzima, enterocinase intestinal bovina, que facilita a clivagem entre a GLAG e a protena clonada. A Calmodulina binding protein uma protena de fuso muito usada pois tratase de um pptido com capacidade de ligar e desligar calmodulina. Na presena de Ca2+ a Calmodulina binding protein liga-se calmodulina, pelo que se faz a cromatografia com

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uma matriz com calmodulina e um meio rico em Ca2+.Quando no h Ca2+ a calmodulina binding protein desliga da calmodulina, pelo que se faz a separao da protena de fuso da matriz atravs do uso de agentes quelantes (ligam Ca2+), como o EDTA. O problema neste caso coloca-se na altura de separar a Calmodulina binding protein da protena clonada. Para isso geralmente utiliza-se uma protease para uma sequncia especfica, sequncia essa inserida previamente no local de juno das duas protenas. Pode usar-se a Trombina, Tripsina, TEV, etc. Apenas tem que se assegurar que o local de clivagem se situa no final da protena de interesse. Porm surge um problema, com a adio da protease cliva-se a fuso das protenas mas tambm se contamina o meio. Soluo: - Pode-se usar, em vez de Calmodulin binding protein, maltose binding protein. Esta liga-se maltose durante a cromatografia e pode ser logo separada com uso de uma protease, porm em quantidades inferiores. mais usada para protenas com menos de 20 kDa. Contudo embora isto reduza o problema, no o soluciona. - Utilizao de Intenas. Intenas so protenas que ligam quitina com grande afinidade, e por isso esta pode ser usada na matriz da cromatografia. As intenas possuem capacidade proteoltica intrnseca e podem-se separar da protena clonada fazendo uso dessa capacidade. Para que tal ocorra penas se tem de provocar uma alterao conformacional usando agentes redutores e baixando a temperatura para aumentar a actividade proteoltica. Esta actividade geralmente lenta e feita durante a noite. A questo que aqui se coloca que este sistema no possui uma elevada taxa de produo. Concluindo, as caudas servem para solubilizar, proteger, purificar, identificar e ajudar a enrolar. No entanto temos vrios factores a ter em conta antes de escolher uma cauda. Por exemplo: - O tamanho da protena, se for uma protena pequena no adianta adicionar uma cauda de 6 histidinas pois o efeito ser nulo, claro que o contrrio tambm se verifica, para uma protena grande no valer a pena fundi-la com uma outra de grandes dimenses uma vez que isto pode tornar-se prejudicial. - Tem que se ter em conta a qual a extremidade a fundir, pois a expresso de uma protena de fuso do lado errado no conduz a lugar nenhum. Isto , adicionar uma cauda de Histidina na extremidade N quando esta se encontra no interior da protena no tem qualquer vantagem. Pode-se sempre resolver este problema fazendo a cromatografia sob condies desnaturantes, no entanto isto pode no ser til, tudo depende do objectivo final que se pretende dar protena. Corpos de incluso Muitas das vezes que expressamos protena recombinante fazemo-lo de forma exagerada, sobreexpressando a protena. Esta sobreexpresso leva formao de corpos de incluso. Os corpos de incluso so estruturas insolveis, intracelulares de protena biologicamente inactiva. Forma-se porque a protena expressa instvel e no se consegue enrolar correctamente, pode haver exposio da parte hidrofbica da protena fazendo com que esta interaja consigo e semelhantes precipitando. Isto faz com que apesar de se expressar mais protena a taxa de produo da mesma seja bastante baixa, pois o que conta para a taxa de produo a protena activa. Na verdade existe alguma quantidade de protena activa nestes corpos, e alguns investigadores gostam de os utilizar para purificar a protena em estudo. Contudo a

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extraco um processo que custa muito dinheiro e ocupa muito tempo para solubilizar e re-enrolar a protena na sua conformao nativa. Dado que muitos dos corpos de incluso se devem a um enrolamento incorrecto das protenas foram desenhadas vrias estratgias para evitar este problema. Por exemplo, protenas de fuso contendo thioredoxina que ajuda na solubilizao e posterior enrolamento das protenas. Contudo surge o mesmo problema na hora de remover a cauda. Uma outra hiptese para evitar os corpos de incluso provocar a expresso de chaperonas (co-expresso no plasmdeo). Mesmo assim existe quem veja benefcios no uso de corpos de incluso e por isso provoca-os. A sua produo fcil e natural em E. coli, e a sua purificao tambm, basta centrifugar. A obteno de protena activa que difcil, para isso necessrio desnaturar completamente as protenas (eliminando assim as interaces proteicas). Pode-se fazer facilmente recorrendo ureia, no aconselhvel o uso de SDS. Depois necessrio renatur-las correctamente, que se torna a parte mais difcil. Para isso necessrio remover a ureia por diluio rpida com um tampo ou recorrendo a dilise (no aconselhvel porque se perde muita protena). Para renaturar ento necessrio moldar o ambiente atravs de agentes redutores oxidantes e de pH at atingir um ambiente ptimo. Isto torna-se por vezes uma utopia dado energia necessria para a formao de algumas ligaes. Exemplo da utilizao da clonagem de genes na biotecnologia Muitas hormonas, protenas sinalizadoras ou reguladoras so normalmente expressas em quantidades muito baixas, impedido o deu isolamento e purificao em grandes quantidades por tcnicas bioqumicas bsicas. O uso teraputico difuso de tais protenas, assim como pesquisas na sua estrutura e funo, depende da eficincia dos processos para produzir grandes quantidades a custo razovel. A tcnica de DNA recombinante que transforma clulas de E. coli em fbricas para a sntese de protenas pouco abundantes agora utilizada para a produo do factor VIII (factor de coagulao do sangue), factores estimulantes das colnias de granulcitos (G-CSF), insulina, hormonas de crescimento e outras protenas humanas com usos teraputicos. Por exemplo, G-CSF estimula o crescimento de granulcitos, glbulos brancos fagoctos essenciais para a defesa contra infeces bacterianas. A administrao de G-CSF a doentes com cancro ajuda reduo da produo de granulcitos provocados pela quimioterapia, protegendo os pacientes contra infeces srias enquanto eles fazem quimioterapia. O primeiro passo na produo de grandes quantidades de protenas pouco abundantes obter clones de cDNA que codifiquem para a protena em interesse, atravs do PCR. O segundo passo de fabricar plasmdeos que vo expressar largas quantidades de protenas codificadas quando inseridos nas clulas de E. coli. A chave para desenhar tais vectores de expresso adicionar um promotor, uma sequncia de DNA a partir da qual a transcrio de cDNA pode comear como, por exemplo, no processo para expressar G-CSF mostrado na figura. Neste caso, G-CSF expresso em E. coli transformada com plasmdeos que contenham promotores lac adjacentes ao cDNA que codifica para G-CSF. A transcrio do promotor lac ocorre a alta velocidade apenas quando a lactose, ou anlogos (IPTG), so adicionadas ao meio de cultura. Para ajudar a purificao de uma protena eucaritica produzida em E. coli, os investigadores muitas vezes modificam o cDNA que codifica a protena recombinante para facilitar a sua separao de protenas endgenas de E. coli. Uma modificao comum deste tipo, adicionar uma curta sequncia de nucletidos no final do cDNA, de

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modo a que a protena expressa tenha seis resduos de histidina no terminal C. As protenas modificadas deste modo ligam-se levemente a uma matriz com tomos de nquel, enquanto que a maioria das protenas endgenas no se iro ligar a esta matriz. As protenas ligadas podem ser libertadas dos tomos de nquel por um decrscimo no pH do meio. Na maioria dos casos, este procedimento retm uma protena pura recombinante que funcional, visto que a adio de pequenas sequncias de aminocidos a qualquer dos extremos de uma protena no interfere com a actividade bioqumica da protena.

2- Produo de Protena Recombinante em EucariotasA expresso em sistemas procariticos geralmente til para produzir protena heterloga (recombinante) a partir de cDNA eucariota. Contudo, em alguns casos, protenas eucariotas sintetizadas em bactrias ou so instveis ou tm falta de actividade biolgica. Tambm pode ocorrer, apesar dos cuidadosos processo de purificao, a contaminao da amostra final por alguns compostos bacterianos, txicos ou pirognicos. Para evitar estes problemas, os investigadores desenharam sistemas de expresso eucariticos para a produo de protena que pudessem ser usadas como agentes teraputicos em animais. Nota: Uma protena humana a ser usada com fins teraputicos tem como requisitos ser igual em termos bioqumicos e biofsicos e em propriedades funcionais, sua forma natural. A incapacidade, por vezes, de organismos procariticos produzirem verses activas de protenas eucariticas deve-se em grande parte necessidade de mecanismos adequados para gerar certas modificaes ps-traducionais. Nos eucariotas existe um elevado nmero de modificaes que podem ocorrer aps a sntese estar completa: - Formao correcta de pontes dissulfito. Esta reaco mediada pela aco de uma enzima chamada dissulfito isomerase. Uma protena mal enrolada instvel e falta-lhe actividade fisiolgica; - Clivagem proteoltica de forma percursora. Um grupo selecto de aminocidos clivado para assegurar a funcionalidade proteica; - Glicosilao. Esta reaco a maior modificao que estabelece finalmente a estabilidade de uma protena, e por vezes, as suas propriedades distintas. A glicosilao mais comum ocorre pela adio de resduos de acar especficos a serinas e treonimas (glicosilao O-linked) ou a asparginas ( glicosilao N-linked). - Adies a aminocidos nas protenas. Adies como: fosforilao, acetilao, sulfatao, acilao, miristilao, palmitilaoe y-carboxilao. Destas modificaes a glicosilao e a adio a aminocidos nas protenas so as piores para induzir em protenas expressas em sistemas procariticos. De uma forma geral nenhuma clula eucaritica capaz de desempenhar todas estas funes de forma correcta para qualquer protena heterloga. Por isso mesmo se determinada protena necessita de uma srie especfica de modificaes necessrio examinar diferentes sistemas de expresso eucariticos at descobrir um que seja capaz de produzir um produto biolgico autntico. No geral, os vectores de expresso eucariticos possuem o mesmo tipo de caractersticas que os seus companheiros procariticos: 32

- Um gene/marca de seleco eucaritico; - Um promotor eucaritico; - Sinais STOP apropriados de transcrio e traduo; - Sequncia sinal de poliadenilao do transcrito primrio (mRNA); Como agentes de clonagem eucaritica existem: leveduras (unicelulares), clulas de mamfero em cultura (In vitro e In vivo); clulas de insecto em cultura , plantas e animais transgnicos. Se o vector de clonagem para ser usado como um plasmdeo (replicao extra cromossmica) ele tem ainda de ter uma origem de replicao que funcione na clula hospedeira. Em alternativa, se for desenhado para interagir com o DNA cromossmico do hospedeiro ele deve carregar uma sequncia complementar a uma regio do cromossoma do hospedeiro, ou seja, um local de recombinao homloga. Porm como muitos processos de DNA recombinante so difceis de executar em clulas eucariticas, muitos vectores eucariticos so desenhados para serem Shuttle. Estes vectores carregam dois tipos de origem de replicao e genes de seleco, um tipo funciona para E. coli e outro que funciona melhor em clulas eucariticas. Tais vectores foram j desenhados para leveduras, insectos e mamferos. A introduo destes dois tipos permite fazer manipulaes de DNA em procariotas, pois mais fcil, e depois transferir o gene manipulado/vector manipulado para clulas eucariticas com a finalidade de expressar a protena correctamente. Por isso tambm importante um iniciador e terminador adequados tanto a eucariotas como procariotas. A introduo de DNA estranho em bactrias e leveduras chamado de Transformao. Em sistemas micorbianos, transformao descreve uma alterao hereditria devida aquisio de DNA exgeno. Contudo em clulas animais, a transformao refere-se a alteraes no crescimento das clulas quando elas se tornam cancerosas. Para distinguir o processo de biologia molecular deste utiliza-se o termo Transfeco para indicar alteraes provocadas por DNA exgeno. Existem 3 tcnicas que so normalmente usadas para transformar leveduras: - Remoo das paredes com formao de protoplastos; - Tratamento com acetato de ltio; - Electroporao; Para a transfeco de clulas animais usa-se geralmente: - Coprecipitao de DNA com fosfato de clcio (CaPO4); - Electroporao; - Microinjeco - Vrus eucariota; - Lipossomas; - Genes Gun (alvejamento gentico); Sistemas de expresso em Saccharomyces cerevisae Vantagens Por uma variedade de razes a levedura S. cerevisae tem sido extensamente usada como hospedeira para a expresso de variados genes eucariticos. Primeiro, porque um ser unicelular extremamente bem caracterizado gentica e fisiologicamente, e pode crescer rapidamente tanto em placas de cultura como em bioreactores de longa escala.

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Segundo, porque possui promotores fortes bem caracterizados, tambm devido ocorrncia de um plasmdeo natural que pode ser usado como sistema de expresso. Terceiro, ela capaz de levar a cabo muitas modificaes ps-traducionais. Quarto, geralmente excreta to poucas protenas que, quando alterado por engenharia gentica para excretar a protena heterloga, o produto pode ser facilmente purificado. Quinto, por ser to amplamente utilizada pela indstria durante anos ela um organismo GRAS (generally recognize ou safe) pela FDA. Por ser um organismo GRAS o uso deste para a produo de agentes teraputicos no requer uma experimentao excessiva at aprovao do mesmo. Muitas protenas actualmente no mercado foram produzidas em S. cerevisae. Exemplo disso so: o antignio de superfcie para a hepatite B, a vacina contra protenas de superfcie do HIV-1, a insulina, o Epidermal growth factor, etc. Vectores de expresso Existem trs classes de vectores de expresso em S. cerevisae: Epissomal, ou plasmdeo, YEP; integrativos YIP e cromossomas artificiais YAC. Destes o YEP tem sido largamente utilizado para a produo de protena tanto intra como extracelular. Contudo, tais sistemas de expresso baseados em plasmdeos so muitas vezes instveis em condies de larga produo (a partir de 10 litros). O YEP nico para S. cerevisae pois a nica levedura capaz de manter um plasmdeo, devido presena de um naturalmente. A marca de seleco usada com YEP o uso de estirpes mutantes eu necessitam de aminocidos especficos (presentes na YEP). necessrio adequar o meio de crescimento s estirpes em uso. Por vezes mais rentvel usar procaritas numa fase inicial e por isso este tambm um vector Shuttle (possui Ori C e Amp). Apesar da integrao de um vector de expresso ou unidade de transcrio no DNA cromossomal (YIP) ser uma opo experimental que assegura a estabilidade gentica do organismo, esta tcnica no tem sido muito usada. A razo o baixo nmero de cpias do gene a clonar ser limitado a uma cpia por cromossoma, o que resulta numa baixa produo da protena heterloga. Sequncias Tandem (genes vrias vezes repetidos uns a seguir aos outros) podem ser usadas, no entanto elas so geralmente instveis. Consequentemente, investigadores tm usado vectores epissomais com uma nica cpia do gene a clonar, mas tm tentado alterar a estabilidade modificando as condies de crescimento. Um YAC desenhado com fim a clonar um largo segmento de DNA (+ de 100 kb), que mantido como um cromossoma separado no organismo hospedeiro. O YAC altamente estvel e foi usado para o mapeamento do genoma humano, para a anlise de largas unidades de transcrio e para a formao de grandes bibliotecas genmicas contendo o DNA de cromossomas humanos. Um vector YAC mimetiza um cromossoma pois tem uma sequncia que actua como origem de replicao, uma sequncia semelhante do centrmero da levedura, e uma sequncia que aparece em ambos os terminais aps linearizao do DNA e actuar como telmeros de forma a manter a estabilidade. Por vezes o DNA inserido para clonagem interrompe a expresso de um outro gene, resultando num produto colorido, ou no quando a crescer num meio especializado. Alternativamente, alguns vectores YAC contm uma marca de seleco independente do local de clonagem. Contudo, at agora, YAC ainda no foi utilizado como sistema de expresso de produtos comerciais.

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Nota: Apesar de no referido no esquecer a presena de promotores e local de insero do gene associado a enzimas de restrio. Secreo de Protenas heterlogas/promotores de Leveduras Em leveduras apenas protenas glicosiladas so secretadas, assim o sistema de secreo tem de ser usado para protenas recombinantes que requerem adio de acares quer no terminal N-linked quer no O-linked, para facilitar a secreo o pptido sinal adicionado a montante da regio codificante de cDNA. Durante o processo de exportao d-se a formao de pontes dissulfito, clivagem proteoltica e outras modificaes ps-traducionais, em muitos casos a protena exportada j se encontra na sua forma activa. O pptido sinal possibilita a paragem da protena pela membrana, mas durante o processo de secreo este reconhecido por uma endoprotease que cliva o dipptido Lisina-Arginina. Os codes para a Lisina-Arginina encontram-se, portanto, posicionados imediatamente a montante da sequncia de cDNA a clonar de modo a que quando clivado o pptido sinal a protena alvo adquira a sequncia de aminocidos correcta, assim como o aminocido correcto no seu N-terminal. Alm disto outras estratgias foram desenhadas para aumentar a secreo de protena heterloga em S. cerevisae. o estudo dos seus promotores tem contribudo bastante para ajudar a desenhar estas estratgias. Geralmente as protenas expressas com o auxlio de promotores de leveduras so expressos em grande quantidade, o problema que alguns destes promotores so indutveis (controlveis), mas sim constitutivos (no se capaz de controlar to bem a sua actividade). Uma destas estratgias foi avaliar se a sobrexpresso conjunta de uma protena endgena e naturalmente secretada iria influenciar a taxa de secreo da protena heterloga. Outra tcnica foi utilizar o promotor da desidrogenase alcolica (muito estudada e utilizada pelo homem na industria) assim como o seu terminador aumentava a produo de protena. Verificou-se ainda que a sobrexpresso da protena endgena dissulfito isomerase aumentava a secreo de protenas com pontes dissulfito. Por fim verificou-se que muitas das indues elaboradas em S. cerevisae fazemse pela introduo de um lcool no sistema e que a manipulao de variadas protenas do sistema secretor pode aumentar a secreo de protenas heterlogas com diferentes necessidades de enrolamento. Desvantagens no uso de Saccharomyces cerevisae e outros sistemas A expresso de protenas recombinantes em S. cerevisae tem tido bastante sucesso com algumas protenas. Mas apesar de algumas taxas elevadas, a expresso geralmente baixa, isto porque existem limitaes: - Instabilidade o YEP: perda do plasmdeo durante o processo, mesmo quando se utilizam promotores indutveis; - Hiperglicosilao. Uma protena heterloga geralmente hiperglicosilada, contendo mais de 100 resduos de manose em cada oligossacardeo Nlinked; - Protena aprisionada no espao periplasmtico: dificulta a purificao pois necessrio recorrer lise das leveduras (processo difcil); - Produo de etanol: o etanol em grandes quantidades torna-se txico, at para as leveduras;

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Nota: Foi publicado em 2003 um artigo que revela uma forma de produzir protena heterloga em S. cerevisae sem que ocorra hiperglicosilao, atravs da deteco dos genes responsveis pela glicosilao em leveduras e insero de genes de glicosilao humanos. Tendo em conta estas desvantagens os investigadores tm examinado outras espcies de leveduras e sistemas eucariticos que possam actuar como clulas hospedeira para a expresso proteica. Os atributos que tm sido investigados incluem: - Adaptao a vrios vectores; - Sistemas de expresso de clonagem com sequncias reguladoras da transcrio e traduo especificas do hospedeiro; - Capacidade de sofrer transformao; - Elevada taxa de produo de protenas; - Capacidade para crescer sob condies industriais; Os candidatos mais bem qualificados do Pichio pastoris e Hansenula polymorpha, que conseguem usar metanol como fonte de carbono e energia. Claro que existem outros tambm j utilizados em processos industriais como Kluyueromyces lactis ou Yarecwia lipolitica que produzem lactose e crescem em meios com alcanos, respectivamente. Vantagens em Pichia pastoris A levedura metilotrfica Pichia pastoris consegue crescer fcil e economicamente em largos biorreactores. fcil fazer a expresso atravs de factores integrativos (YIP), logo a expresso mais estvel, utilizando o gene da lcool oxidase como promotor e terminador, sem que a clula perdesse a sua capacidade de diviso. A lcool oxidase na presena de metanol pode representar mais de 30% das protenas totais. O plasmdeo completo produzido para esta levedura possui: - Uma unidade AOX1p-gene-AOX1t (promotor lcool oxidase-geneterminador lcool oxidase); - Uma origem de replicao (oripp), uma origem e marca de seleco procariotas (oriE e Ampr) de E. coli; - Um segmento a jusante do terminador (3-AOX1) que facilita a integrao do DNA num local especfico do cromossoma; - Um gene funcional da histidol desidrogenase (HIS4), que codifica uma enzima capaz de sintetizar histidina e por isso funciona como marca de seleco eucaritica; De forma a evitar problemas de instabilidade, a estratgia neste sistema integrar a unidade AOX1p-geneAOX1t no genoma de Pichia pastoris. Para isto existem dois sistemas de insero: Simples e Dupla

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1- Integrao Simples A integrao simples usada tambm em S. cerevisae, mais difcil de concretizar e usam-se estirpes + e para o conseguir. A integrao simples ocorre com a insero de todo o plasmdeo no genoma da levedura. Utiliza-se o segmento de seleco como parte principal na integrao do vector. Usam-se estirpes defeituosas na produo de histidina (His 4-), depois das clulas transformadas um simples crossing-over entre os genes His4 e His4- provoca a integrao completa do plasmdeo no genoma, ficando o plasmdeo ladeado por dois genes His4, um funcional e outro no. 2- Integrao Dupla A integrao dupla caracterstica de Pichia pastoris e consiste num crossingover duplo entre o AOX1p e o gene AOX1 e a sequncia 3-AOX1 e este mesmo gene. Esta integrao leva a uma perda do restante vector, visto que apenas a sequncia AOX1p-geneAOX1t e o gene de seleco so inseridos. A seleco pode depois ser feita por crescimento num meio sem histidina (as clulas transformadas podem produzir histidina por insero do gene His4 funcional) ou por crescimento lento em metanol (as clulas transformadas tm o gene AOX1 interrompido pelo que no produzem lcool desidrogenase em grande quantidade, dado que apenas o gene AOX2 est a funcionar). Na presena de metanol o promotor AOX1p activado e d-se uma elevada expresso da protena para o citoplasma. Nota: No existe qualquer problema para a Pichia perder o gene funcional AOX1, isto porque para alm de no ser um gene essencial, existe um outro gene(AOX2) que codifica para a lcool oxidase, sendo que a nica consequncia um crescimento mais lento.

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Vectores de expresso em mamferos Apesar de bastante eficientes a expresso de protenas em leveduras nem sempre suficientemente satisfatria. Por vezes, dependendo do uso que se pretende dar protena, somos obrigados a fazer a expresso de algumas protenas em clulas de mamfero em cultura. Trata-se de um processo mais caro, com melhor taxa de produo e que leva mais tempo. No entanto certas protenas, como as que possuem fins teraputicos, tm de ser expressar nestes sistemas. Exemplo disso do: receptor CD4 do HIV, hormona de crescimento, eritropoetina, antignio de superfcie da hepatite B, etc. De notar que alguns estudos de biologia bsica tambm so feitos nestes sistema, como por exemplo na rea da neurobiologia, a fim de ter mais preciso nos resultados. Em clulas de mamfero pode-se utilizar dois tipos de sistemas diferentes: - Sistemas de expresso transiente, ou seja, transitria, que expresso a protena durante um determinado espao de tempo at que o gene seja detectado. Por exemplo a cultura de clulas de rim de macaco (COS), rim de hamster (BHK) e rim de embrio humano (HEK); - Sistemas de expresso estvel, que tm uma produo contnua de protena e o gene encontra-se estvel no genoma. Por exemplo a expresso em clulas do ovrio de hamster (CHO); A escolha de um sistema em detrimento de outro passa pelo objectivo da expresso e dinheiro disponvel. Um vector de expresso para clulas de mamferos pode ser representado de uma maneira geral como possuindo: - Origem de replicao de um vrus animal (simian vrus 40-SV40, Citomegalovrus, herpes simplex vrus, etc); - Sequncia promotor a montante do gene a clonar e do gene da marca de seleco, sendo que o promotor igual para os dois; - Sequncia terminadora (local de poliadenilao) para cada um (estes tambm derivam dos mesmos vrus, ou de genes de mamferos que se expresso naturalmente em grandes quantidades, como -actina, timidina cinase, hormona de crescimento bovina, etc); As sequncias necessrias para a seleco e propagao de vectores de mamferos em E. coli so derivados do plasmdeo standart de E. coli. A expresso em vectores de mamferos to verstil e eficiente quanto qualquer outro sistema eucaritico quando as protenas recombinantes so necessrias para fins de pesquisa, ensaios clnicos ou teraputicos. Contudo a produo industrial nestes sistemas torna-se dispendiosa. Consequentemente sistemas menos caros so favorveis, a menos que a protena autntica apenas se consiga obter com