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ARAPONGAS 2016 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM SAÚDE E PRODUÇÃO DE RUMINANTES. SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ PR.

SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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ARAPONGAS 2016

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO STRICTO SENSU MESTRADO

EM SAUacuteDE E PRODUCcedilAtildeO DE RUMINANTES

SIMONE MARTINS SPITI

TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE

LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR

SIMONE MARTINS SPITI

Cidade ano

AUTOR

Arapongas

2016

TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE

LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR

Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes Orientador Prof Dr Joatildeo Luis Garcia

SIMONE MARTINS SPITI

TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE

PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR

Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR no Mestrado em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes aacuterea

e concentraccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores

_________________________________________ Prof Dr Joatildeo Luis Garcia

UEL

_________________________________________ Prof Dr Luiz Fernando da Cunha Filho

UNOPAR

_________________________________________ Prof Dr Joseacute da Silva Guimaratildees Juacutenior

UEL

Londrina 01 de marccedilo de 2016

Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)

Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776

SPITI Simone Martins

Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de

leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016

63p

Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes

2016

1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de

Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6

Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo

CDU 619636

DEDICO com muito amor

Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora

Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me

deixando desanimar

Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo

de vida e de dedicaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus

sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento

Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo

amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida

Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha

formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por

terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia

melhor

Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre

me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis

As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes

na minha vida amo demais

Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda

confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna

amizade e admiraccedilatildeo

Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade

natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do

dia a dia

Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de

Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos

escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos

Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura

Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL

que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles

natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho

Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo

mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho

Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e

motivaccedilatildeo

Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de

convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado

A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho

lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com

classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute

muito para ser insignificantersquorsquo

Charles Chaplin

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 2: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

SIMONE MARTINS SPITI

Cidade ano

AUTOR

Arapongas

2016

TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE

LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR

Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes Orientador Prof Dr Joatildeo Luis Garcia

SIMONE MARTINS SPITI

TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE

PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR

Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR no Mestrado em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes aacuterea

e concentraccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores

_________________________________________ Prof Dr Joatildeo Luis Garcia

UEL

_________________________________________ Prof Dr Luiz Fernando da Cunha Filho

UNOPAR

_________________________________________ Prof Dr Joseacute da Silva Guimaratildees Juacutenior

UEL

Londrina 01 de marccedilo de 2016

Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)

Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776

SPITI Simone Martins

Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de

leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016

63p

Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes

2016

1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de

Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6

Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo

CDU 619636

DEDICO com muito amor

Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora

Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me

deixando desanimar

Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo

de vida e de dedicaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus

sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento

Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo

amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida

Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha

formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por

terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia

melhor

Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre

me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis

As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes

na minha vida amo demais

Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda

confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna

amizade e admiraccedilatildeo

Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade

natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do

dia a dia

Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de

Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos

escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos

Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura

Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL

que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles

natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho

Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo

mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho

Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e

motivaccedilatildeo

Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de

convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado

A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho

lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com

classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute

muito para ser insignificantersquorsquo

Charles Chaplin

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

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Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 3: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

SIMONE MARTINS SPITI

TIacuteTULO OCORREcircNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CAtildeES DE

PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORAtilde ndash PR

Dissertaccedilatildeo apresentada agrave UNOPAR no Mestrado em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes aacuterea

e concentraccedilatildeo em Medicina Veterinaacuteria como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores

_________________________________________ Prof Dr Joatildeo Luis Garcia

UEL

_________________________________________ Prof Dr Luiz Fernando da Cunha Filho

UNOPAR

_________________________________________ Prof Dr Joseacute da Silva Guimaratildees Juacutenior

UEL

Londrina 01 de marccedilo de 2016

Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)

Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776

SPITI Simone Martins

Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de

leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016

63p

Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes

2016

1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de

Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6

Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo

CDU 619636

DEDICO com muito amor

Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora

Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me

deixando desanimar

Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo

de vida e de dedicaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus

sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento

Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo

amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida

Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha

formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por

terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia

melhor

Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre

me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis

As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes

na minha vida amo demais

Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda

confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna

amizade e admiraccedilatildeo

Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade

natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do

dia a dia

Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de

Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos

escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos

Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura

Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL

que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles

natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho

Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo

mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho

Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e

motivaccedilatildeo

Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de

convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado

A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho

lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com

classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute

muito para ser insignificantersquorsquo

Charles Chaplin

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 4: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

Ficha catalograacutefica elaborada com dados fornecidos pelo(a) autor (a)

Biblioteca UNOPAR Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB ndash 9776

SPITI Simone Martins

Ocorrecircncia de neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de

leite de Ivaiporatilde ndash PR Arapongas UNOPAR 2016

63p

Orientador Joatildeo Luiacutes Garcia

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinaacuteria - Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes

2016

1 Medicina Veterinaacuteria - Dissertaccedilatildeo de mestrado ndash Unopar 2 Sauacutede e Produccedilatildeo de

Ruminantes 3 Neosporose 4 Neosporose caninum 5 Reproduccedilatildeo de animais 6

Bovinos de leite 7 Soropositivo 8 Aborto I Garcia Joatildeo Luiacutes II Titulo

CDU 619636

DEDICO com muito amor

Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora

Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me

deixando desanimar

Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo

de vida e de dedicaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus

sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento

Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo

amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida

Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha

formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por

terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia

melhor

Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre

me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis

As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes

na minha vida amo demais

Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda

confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna

amizade e admiraccedilatildeo

Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade

natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do

dia a dia

Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de

Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos

escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos

Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura

Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL

que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles

natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho

Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo

mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho

Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e

motivaccedilatildeo

Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de

convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado

A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho

lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com

classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute

muito para ser insignificantersquorsquo

Charles Chaplin

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

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catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

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epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

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variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 5: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

DEDICO com muito amor

Ao Deus Pai nosso criador e Nossa Senhora

Agrave meu namorado Giovani que tanto me apoiou nessa caminhada natildeo me

deixando desanimar

Aos meus pais Edel e Osvaldir que sempre estatildeo do meu lado pelo exemplo

de vida e de dedicaccedilatildeo

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus

sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento

Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo

amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida

Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha

formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por

terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia

melhor

Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre

me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis

As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes

na minha vida amo demais

Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda

confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna

amizade e admiraccedilatildeo

Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade

natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do

dia a dia

Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de

Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos

escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos

Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura

Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL

que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles

natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho

Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo

mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho

Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e

motivaccedilatildeo

Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de

convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado

A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho

lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com

classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute

muito para ser insignificantersquorsquo

Charles Chaplin

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 6: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus pela graccedila maior a VIDA por me fazer capaz de realizar meus

sonhos e natildeo desistir nunca ao longo da estrada sempre buscando o conhecimento

Ao meu namorado Giovani pelo apoio incentivo companheirismo por todo

amor carinho e compreensatildeo nesta etapa da minha vida

Aos meus pais Edel e Osvaldir que dedicaram sua vida natildeo soacute para a minha

formaccedilatildeo acadecircmica mas principalmente para a minha formaccedilatildeo como pessoa por

terem me ensinado os valores nobres da vida e por me inspirar a ser cada dia

melhor

Agrave minha irmatilde Solange meu cunhado Edson e minha avoacute Maria que sempre

me apoiaram em todos os momentos faacuteceis ou difiacuteceis

As minhas sobrinhas Ana Carolina e Lauany Maria que satildeo muito importantes

na minha vida amo demais

Ao Professor Joatildeo Luis Garcia por todo ensinamento dedicaccedilatildeo ajuda

confianccedila e compreensatildeo que me ofereceu ao longo do trabalho Minha eterna

amizade e admiraccedilatildeo

Ao Professor Luiz Fernando Da Cunha Filho pelo incentivo apoio e amizade

natildeo soacute no periacuteodo do mestrado mas tambeacutem como grande parceiro no trabalho do

dia a dia

Agrave Universidade Norte do Paranaacute (UNOPAR) e agrave Universidade Estadual de

Londrina (UEL) que me proporcionaram a oportunidade de voltar aos ldquobancos

escolaresrdquo para atualizar e aprofundar meus conhecimentos

Aos funcionaacuterios e amigos Meacutercia Thais Agostinho Seacutergio Carol Miura

Isabely Ana Flaacutevia e Beatriz do Laboratoacuterio de Protozoologia Veterinaacuteria da UEL

que se colocaram a disposiccedilatildeo para me ajudar a minha eterna gratidatildeo sem eles

natildeo seria possiacutevel realizaccedilatildeo deste trabalho

Aos proprietaacuterios que disponibilizaram suas propriedades e animais e natildeo

mediram esforccedilos para auxiliar na conclusatildeo deste trabalho

Aos professores funcionaacuterios e alunos da UNOPAR e da UEL pela ajuda e

motivaccedilatildeo

Aos colegas de turma do mestrado pela amizade e pelos momentos de

convivecircncia que tornaram mais leves os ldquofardosrdquo deste periacuteodo de mestrado

A todos que direta ou indiretamente me apoiaram neste trabalho

lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com

classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute

muito para ser insignificantersquorsquo

Charles Chaplin

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

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propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

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O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

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A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

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Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

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detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 7: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

lsquolsquoBom mesmo eacute ir a luta com determinaccedilatildeo abraccedilar a vida com paixatildeo perder com

classe e vencer com ousadia pois o triunfo pertence a quem se atreve A vida eacute

muito para ser insignificantersquorsquo

Charles Chaplin

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 8: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

Spiti Simone Martins Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde ndash Pr 2016 63f Dissertaccedilatildeo de

Mestrado Acadecircmico em Sauacutede e Produccedilatildeo de Ruminantes - Universidade Norte do

Paranaacute Arapongas

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos Bovino

de leite Soropositivo Aborto

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 9: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde- Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence of anti-Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora Caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 10: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 ndash Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)50

Tabela 02 ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e

total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica

Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo

pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)51

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho em

hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio ndeg de abortos e ndeg

de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 201552

Tabela 04 ndash Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em

Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)53

Tabela 05 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados

positivos e total de exames realizados prevalecircncia de resultados positivos segundo

a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95

valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do

desenho(2015)54

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999

a 2015)28

LISTA DE FIGURA

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)14

ANEXOS

Figura 1 ndash Localizaccedilatildeo do Municiacutepio de Ivaiporatilde60

Figura 2 ndash Questionaacuterio Epidemioloacutegico61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 11: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RIFI Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta

DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico

microm Micrometro

ELISA Ensaio imunoenzimaacutetico

NAT Teste de aglutinaccedilatildeo para Neospora

IgM Imunoglobulina M

IgG Imunoglobulina G

PCR Reaccedilatildeo de cadeia polimerase

IH Exame histopatoloacutegico e Imunohistoquiacutemico

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatiacutestica

BVDV Viacuterus da Diarreacuteia Viral Bovina

IFN-y Interferon - gamma

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 12: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 10

2 REVISAtildeO DE LITERATURA

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia 12

22 Impacto econocircmico 12

23 Hospedeiros 13

24 Ciclo de vida 14

25 Formas de contaacutegio e transmissatildeo 16

251 Transmissatildeo horizontal 16

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria 17

26 Patogenia 18

261Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por NCaninum 20

27 Sinais cliacutenicos 21

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico 23

29 Diagnoacutestico 23

291 Diagnoacutestico cliacutenico 23

292 Diagnoacutestico Laboratorial 24

210 Controle 25

211 Prevalecircncia em bovinos 27

212 Tratamento da neosporose 28

3 REFEREcircNCIAS 30

4 OBJETIVOS

41 Objetivo Geral 39

42 Objetivos especiacuteficos 39

5 ARTIGO 40

CONCLUSOtildeES 55

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 13: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

10

1 INTRODUCcedilAtildeO

A primeira descriccedilatildeo de um parasita semelhante ao Toxoplasma gondii

foi feita em catildees na Noruega (BJERKAS MOHN PRESTHUS 1984) e

posteriormente Dubey et al (1988) descreveram esse parasita como sendo

Neospora caninum A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente

disseminada pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento

esporaacutedico endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose uma

doenccedila primaacuteria de catildees e bovinos (DUBEY SCHARES 2011)

Num estudo recente Michael et al (2013) considera N caninum como

uma das causas infecciosas mais importantes de abortamentos em bovinos em

todo o mundo e tambeacutem uma das doenccedilas que mais causa prejuiacutezos

econocircmicos tanto para os produtores como para induacutestrias do setor de

laticiacutenios

A importacircncia da identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (Andreotti et al 2003) tais como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

A transmissatildeo vertical eacute a principal forma de disseminaccedilatildeo de N

caninum em bovinos e o abortamento eacute o sinal clinico mais evidente (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007) Poreacutem a patogenia desta enfermidade

nos bovinos eacute complexa e ainda natildeo eacute totalmente esclarecida uma vez que

alguns animais tecircm abortamento e outros natildeo (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007) Nos animais infectados naturalmente a imunidade adquirida

contra a infecccedilatildeo antes da gestaccedilatildeo natildeo eacute suficiente para prevenir a

transmissatildeo transplacentaacuteria de N caninum para o feto (THURMOND

HIETALA 1996) Vaacuterios estudos usando testes soroloacutegicos demonstraram que

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

ALMERIacuteA S et al Specific anti-Neospora caninum IgG1 and IgG2 antibody responses during gestation in naturally infected cattle and their relationship with gamma interferon production Veterinary Immunology and Immunopathology Amsterdam v 130 v 1 p 35-42 Jan 2009 AacuteLVAREZ-GARCIA G Identificacioacuten y caracterizacioacuten de antiacutegenos de Neospora caninum con intereacutes inmunodiagnoacutestico en bovinos 2002 279p Tese (Doutorado) ndash Universidad Complutense de Madrid Madrid 2003

ANDERSON ML ANDRIANARIVO AG CONRAD PA Neosporosis in cattle Animal Reproduction Science 60-61 417-431 2000

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

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propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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59

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 14: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

11

fecircmeas soropositivas tem um maior risco de abortamento do que as fecircmeas

soronegativas (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO 2001)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens satildeo expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em bovinos nas propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

No Brasil foi relatada uma correlaccedilatildeo significativa entre a presenccedila de

anticorpos contra N caninum e o histoacuterico de abortamento (SILVA et al 2008

SANTOS et al 2005) Desta forma estudos epidemioloacutegicos que permitam

conhecer melhor o panorama da neosporose bovina satildeo de fundamental

importacircncia nas diferentes regiotildees do Brasil

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 15: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

12

2 Revisatildeo de literatura

21 Classificaccedilatildeo e Etiologia

Neospora caninum eacute protozoaacuterio do Filo Apicomplexa Famiacutelia

Sarcocystidae sub-famiacutelia Toxoplasmatinae (MUGRIDGE et al1999) eacute hoje

reconhecido como importante parasita de bovinos catildees ovinos caprinos

equinos e cerviacutedeos (BUXTON et al 1997 DUBEY 1999)

Em 1984 na Noruega foram encontrados cistos teciduais

semelhantes ao Toxoplasma gondii em ceacuterebros de catildees com sintomas

neuroloacutegicos (BJERKAS et al 1984) Ateacute 1988 o N caninum era confundido

com o Toxoplasma gondii por apresentar semelhanccedilas bioloacutegicas e estruturais

entretanto estes dois parasitas satildeo antigenicamente diferentes (DUBEY et al

1988) N caninum eacute o agente etioloacutegico da neosporose bovina

22 Impacto econocircmico

O principal impacto econocircmico da neosporose eacute devido agraves falhas

reprodutivas em bovinos O impacto varia conforme a idade o valor geneacutetico

da matildee e da capacidade produtiva da progecircnie Os custos diretos estatildeo

relacionados agraves perdas fetais e aos problemas reprodutivos e os custos

indiretos agrave ajuda profissional gastos com o diagnoacutestico possiacutevel perda da

produccedilatildeo de leite e aos custos de reposiccedilatildeo do rebanho (DUBEY SCHARES

2011)

As perdas econocircmicas apoacutes o nascimento satildeo difiacuteceis de avaliar

porque natildeo existem sinais cliacutenicos em bovinos adultos A neosporose eacute citada

ainda como causa da diminuiccedilatildeo de um litro por dia da produccedilatildeo de leite aleacutem

da propensatildeo de abortamento e elevar a possibilidade de descarte da matriz de

forma precoce (BOWMAN 2006 RADOSTITIS et al 2010)

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada

pelo mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMAGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 16: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

13

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996 HERNAacuteNDEZ RISCO DONOVAN

2001)

O abate e o descarte satildeo prejuiacutezos importantes associadas agrave

neosporose Vacas soropositivas satildeo descartadas em meacutedia seis meses antes

do que vacas soronegativas O risco de descarte foi 17 vezes maior em vacas

soropositivas que em soronegativas em rebanhos aleatoriamente selecionados

Vacas soropositivas em rebanhos epidecircmicos tiveram 19 vezes mais

probabilidade de abortamento que vacas soronegativas (DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

N caninum eacute uma importante causa de abortamentos no gado

leiteiro Santos et al (2005) examinando 34 fetos bovinos abortados

detectaram N caninum em oito atraveacutes de exames histoloacutegicos

imunohistoquiacutemico e soroloacutegico Este foi o primeiro relato de neosporose

congecircnita no estado do Paranaacute comprovando o envolvimento do parasita em

problemas reprodutivos

23 Hospedeiros

Estudos mostram que vaacuterias espeacutecies animais tiveram contato com

N caninum foram detectados anticorpos anti-N caninum em caprinos aves

roedores lagomorfos suiacutenos humanos e em uma seacuterie de animais domeacutesticos

e silvestres Entretanto N caninum viaacuteveis foram isolados somente em alguns

hospedeiros como bovinos ovinos buacutefalos catildees cavalos bisons e veados de

rabo branco (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES

2011)

Os hospedeiros definitivos conhecidos para N caninum satildeo o catildeo

(Canis familiaris) (McALLISTER et al 1998) o coiote (Canis latrans) (GONDIM

et al 2004) o dingo australiano (Canis lupus dingo) (KING et al 2010) e o

lobo cinzento (Canis lupus) (DUBEY et al 2011) Estes hospedeiros definitivos

provavelmente tornam-se infectados ao ingerirem tecidos contento bradizoiacutetos

(DIJKSTRA et al 2001 McALLISTER et al 1998) e consequentemente

eliminam oocistos natildeo esporulados nas fezes que no meio ambiente se tornam

esporulados (DUBEY et al 2002)

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 17: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

14

Neospora caninum possui vaacuterios hospedeiros intermediaacuterios tanto

animais domeacutesticos quanto silvestres jaacute relatados como o catildeo bovinos ovinos

caprinos equumlinos buacutefalos pacas e lhamas dentre outros e em animais

silvestres tem sido detectado em veados felinos selvagens antiacutelopes coiotes

dentre outros (DUBEY 2003 VIANNA et al 2005)

Os hospedeiros intermediaacuterios principalmente os herbiacutevoros

tornam-se infectados ao ingerirem alimento e aacutegua contaminados com oocistos

esporulados de N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

24 Ciclo de vida

O ciclo de vida do N caninum envolve trecircs estaacutegios taquizoiacutetos

cistos teciduais contendo em seu interior bradizoiacutetos e oocistos (Figura 1)

(DUBEY 2003 DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Figura 1 ndash Ciclo de vida N caninum Adaptado de Dubey (2003)

O ciclo de vida do parasita eacute heteroxecircnico e envolve de um lado um

hospedeiro definitivo e de outro um hospedeiro intermediaacuterio herbiacutevoro Os

15

catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

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Page 18: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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catildees atuam tanto como hospedeiros definitivos quanto intermediaacuterios para o N

caninum (McALLISTER et al 1998 DUBEY et al 2002)

Neospora caninum utiliza duas formas distintas de reproduccedilatildeo

assexuada que acontece nos tecidos do organismo dos hospedeiros

intermediaacuterios e definitivos caracterizada pela multiplicaccedilatildeo raacutepida dos

taquizoiacutetos ou lenta dos bradizoiacutetos e sexuada que embora natildeo tenha sido

totalmente descrita acontece no sistema digestivo dos hospedeiros definitivos

Acredita-se pela semelhanccedila que apresenta com Toxoplasma que ocorra a

invasatildeo das ceacutelulas ciliacutendricas ciliadas do epiteacutelio intestinal formaccedilatildeo de macro

e microgametas com posterior fecundaccedilatildeo e produccedilatildeo de oocistos

caracterizando o chamado ciclo enteroepitelial comum a outros membros da

famiacutelia Sarcocystidae (DUBEY et al 2002 DUBEY et al 2007)

Os taquizoiacutetos satildeo organismos proliferativos redondos ovoacuteides ou

em forma semi lunar Medem 3-7 x 1-5 microm dependendo do estaacutegio de

crescimento de divisatildeo e do plano de corte dos tecidos (MONTEIRO 2010)

Penetram no interior das ceacutelulas por invasatildeo ativa em aproximadamente 5

minutos (HEMPHILL GOTTSTEIN KAUFMANN 1996) e se localizam no

citoplasma delas formando um vacuacuteolo parasitoacuteforo (DUBEY BUXTON

WOUDA 2006) Este estaacutegio eacute de multiplicaccedilatildeo raacutepida e na ausecircncia de

resposta imune do hospedeiro haacute disseminaccedilatildeo e multiplicaccedilatildeo contiacutenua

causando destruiccedilatildeo progressiva das ceacutelulas ateacute a morte do animal Nos

animais infectados os taquizoiacutetos se localizam nas ceacutelulas nervosas

macroacutefagos fibroblastos ceacutelulas endoteliais mioacutecitos ceacutelulas epiteliais dos

tuacutebulos renais e hepatoacutecitos (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Os hospedeiros definitivos se tornam infectados ao ingerirem tecidos

dos hospedeiros intermediaacuterios que contenham cistos com bradizoiacutetos Dentro

de cinco a 20 dias apoacutes a ingestatildeo dos bradizoiacutetos oocistos imaturos (ainda

natildeo esporulados) comeccedilam a ser eliminados nas fezes (BJERKAS

PRESTHUS 1987) Estes se tornam maduros (esporulados) em 24 a 72 horas

dependendo de condiccedilotildees favoraacuteveis de umidade temperatura e concentraccedilatildeo

de dioacutexido de carbono no meio tornando-se assim infectantes aos hospedeiros

intermediaacuterios que se infectam ao ingerirem aacutegua e alimentos contaminados

com oocistos maduros (BJERKAS PRESTHUS 1987) Na luz intestinal a

parede do oocisto e dos esporocistos eacute digerida e os esporozoiacutetos penetram no

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epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

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variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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VANLEEUWEN JAA HADDAD JP DOHOO IR KEEFE GP TIWARI A SCOTT HM Risk factors associated with Neospora caninum seropositivity in randomly sampled Canadian dairy cows and herds Preventive Veterinary Medicine 93 (2-3) 129-39 2010

VANLEEUWEN JA GREENWOOD S CLARK F ACORN A MARKHAN F MACARRON J OrsquoHANDLEY R Monensin use against Neospora caninum challenge in dairy cattle Veterinary Parasitology 175 372ndash376 2011

VIANNA LC SARTOR IF PITUCO EM OKUDA LH CAMARGO CN KRONKA SN Incidence and a transplacental transmission of Neospora caninum in primiparous females from Bos indicus slaughtered in Presidente Prudente Satildeo Paulo Brazil Semina Ciecircncias Agraacuterias Londrina v29 n2 p 387-392 2008

WILLIAMS D J L et al Neospora caninum-associated abortion in cattle the time of experimentally-induced parasitaemia during gestation determines foetal survival Parasitology London v 121 n 4 p 347-358 Oct 2000

WILLIAMS DJL HARTLEY CSBJOumlRKMAN C TREES AJ Endogenous and exogenous transplacental transmission of Neospora caninum - how the

38

route of transmission impacts on epidemiology and control of disease Parasitology ndash Cambridge University 136 1895-1900 2009

WOUDA W BRINKHOF J VAN MAANEN C DE GEE AL MOEN AR Serodiagnosis of neosporosis in individual cows and dairy herds A comparative study of three enzyme-linked immunosorbent assays Clinical Diagnotic Laboratory Immunological v5 p711-716 1998

39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 19: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

16

epiteacutelio intestinal diferenciando-se em taquizoiacutetos e dando iniacutecio ao processo

de invasatildeo das ceacutelulas hospedeiras (BJERKAS PRESTHUS 1987)

Nos bovinos os taquizoiacutetos podem ser encontrados no ceacuterebro

coraccedilatildeo fiacutegado e pulmotildees de fetos na placenta e na medula espinhal de

bezerros Os parasitas destroem as ceacutelulas nervosas do sistema nervoso

central e dos nervos alterando a condutividade (DUBEY BUXTON WOUDA

2006)

Os cistos satildeo encontrados principalmente no tecido nervoso

(ceacuterebro medula espinhal cerebelo nervos) na retina e no muacutesculo

esqueleacutetico Em fetos bovinos satildeo encontrados principalmente no ceacuterebro Nos

bezerros com neosporose congecircnita localizam-se no ceacuterebro e medula

espinhal (MCALLISTER et al 1998)

Nos hospedeiros definitivos ocorre a fase sexual com o ciclo

enteroepitelial do parasita (MCALLISTER et al 1998 GONDIM 2006) com a

formaccedilatildeo de oocistos Estes satildeo esfeacutericos ou sub-esfeacutericos e medem

aproximadamente 10 x 12 microm contendo dois esporocistos com quatro

esporozoiacutetos (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Satildeo eliminados pelas fezes

dos hospedeiros definitivos de forma natildeo esporulada e natildeo infectiva No meio

ambiente estes oocistos esporulam tornado infectantes e resistentes (DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

25 Formas de Contaacutegio e Transmissatildeo

Os trecircs estaacutegios de N caninum estatildeo envolvidos na transmissatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

251 Transmissatildeo horizontal

Os hospedeiros definitivos se infectam ao ingerirem tecidos de

hospedeiros intermediaacuterios contendo cistos viaacuteveis de N caninum e eliminam

os oocistos pelas fezes No catildeo a infecccedilatildeo ocorre pela ingestatildeo de tecidos de

animais com cistos de N caninum como placentas fetos bovinos e bezerros

infectados por via congecircnita (MCALLISTER et al 1998) e tambeacutem por

ingestatildeo de oocistos no meio ambiente Entretanto existem poucos relatos

sobre a eliminaccedilatildeo de oocistos por catildees naturalmente infectados devido agrave

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 20: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

17

variaccedilatildeo da quantidade do periacuteodo de eliminaccedilatildeo destes oocistos e do periacuteodo

preacute-patente do N caninum (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

Jaacute os hospedeiros intermediaacuterios infectam-se pela ingestatildeo de aacutegua

e alimentos contaminados com estes oocistos esporulados Essa forma de

transmissatildeo eacute o principal modo de infecccedilatildeo em bovinos apoacutes o nascimento

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN et al 2007)

A placentofagia eacute um comportamento observado em vaacuterios

mamiacuteferos As vacas ingerem a sua placenta e a de outras vacas e a presenccedila

de estaacutegios infectivos de N caninum nesse material originou uma questatildeo de

debate de que essa fosse uma via de transmissatildeo horizontal para bovinos

(ANDREOTTI et al 2003)

252 Transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria

A transmissatildeo vertical congecircnita ou transplacentaacuteria ocorre quando

os taquizoiacutetos satildeo transmitidos da matildee para o feto durante a gestaccedilatildeo

(DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007) A transmissatildeo vertical assume

papel importante na manutenccedilatildeo da doenccedila porque a maioria das infecccedilotildees

congecircnitas resulta em bezerros clinicamente normais poreacutem persistentemente

infectados (SARTOR et al 2005)

N caninum eacute um dos parasitas mais eficientemente transmitidos por

via transplacentaacuteria que eacute considerada a principal via de infecccedilatildeo em bovinos

e pode ocorrer por gestaccedilotildees sucessivas (BJORKMANN et al 1996 DUBEY

SCHARES ORTEGA-MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

Locatelli-Dittrich et al (2004) fizeram o primeiro isolamento de N

caninum de ceacuterebro de feto no Brasil confirmando a transmissatildeo congecircnita

Vianna et al (2008) avaliou 518 novilhas prenhas abatidas e seus fetos e

observaram uma taxa de transmissatildeo vertical de 368 demonstrando ser

esta uma importante forma de propagaccedilatildeo do N caninum

Os seguintes termos satildeo utilizados transmissatildeo transplacentaacuteria

endoacutegena e exoacutegena A transmissatildeo transplacentaacuteria exoacutegena ocorre quando

haacute a ingestatildeo pela fecircmea gestante de oocistos esporulados presentes no meio

ambiente a endoacutegena ocorre quando haacute a recrudescecircncia ou reativaccedilatildeo da

infecccedilatildeo nas fecircmeas infectadas (WILLIAMS et al 2009 DUBEY SCHARES

ORTEGA-MORA 2007)

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 21: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

18

26 Patogenia

A patogenia da neosporose bovina eacute muito complexa sendo os

taquizoiacutetas responsaacuteveis pela fase aguda da infecccedilatildeo dependendo do

equiliacutebrio entre a capacidade do taquizoiacuteta penetrar e se multiplicar nas ceacutelulas

e a capacidade do hospedeiro de impedir essa proliferaccedilatildeo (BUXTON et al

2002)

N caninum pode causar seacuteria doenccedila em catildees e bovinos e

ocasionalmente em outros animais Infecccedilotildees em vaacuterios hospedeiros satildeo

comuns mas a doenccedila cliacutenica eacute rara (DUBEY SCHARES 2011)

Para a neosporose bovina causar abortamento a placenta ou o feto

tecircm que ser infectados (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Primariamente o

parasita induz um dano placentaacuterio e pode ameaccedilar a sobrevivecircncia fetal ou

causar a liberaccedilatildeo de prostaglandinas maternais que por sua vez causam

luteoacutelise e abortamento (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) A morte fetal pode

ocorrer devido ao dano tecidual resultante das lesotildees extensas em oacutergatildeos

vitais causadas pela multiplicaccedilatildeo de N caninum no feto ou devido a uma

insuficiente oxigenaccedilatildeo ou nutriccedilatildeo (DUBEY BUXTON WOUDA 2006

DUBEY SCHARES 2011)

A invasatildeo da ceacutelula hospedeira compreende dois eventos distintos

adesatildeo agrave superfiacutecie da ceacutelula hospedeira e o processo de entrada na ceacutelula O

evento inicial no processo de adesatildeo eacute mediado por um contato de baixa

afinidade que subsequumlentemente conduz agrave secreccedilatildeo de micronemas como

consequecircncia segue-se uma ligaccedilatildeo mais especiacutefica com a superfiacutecie da

ceacutelula hospedeira ocorrendo assim agrave entrada na ceacutelula Para que esse evento

ocorra eacute necessaacuterio que haja a presenccedila de receptores adequados na

superfiacutecie da ceacutelula hospedeira que forneccedilam o sinal para a entrada do

parasita no citoplasma dessa ceacutelula (HEMPHIL GOTTSTEIN 1996)

O parasita ao invadir as ceacutelulas uterinas multiplica-se causando

uma destruiccedilatildeo local nos tecidos do feto e da matildee e estes tecidos iniciam uma

resposta inflamatoacuteria A partir daiacute as lesotildees se estendem para a regiatildeo corio-

alantoacuteide entre os cotileacutedones Ao mesmo tempo em que essas lesotildees

ocorrem o parasita tambeacutem entra na corrente sanguiacutenea e invade outros

tecidos com uma predileccedilatildeo pelo sistema nervoso central onde se localiza

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 22: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

19

preferencialmente ao redor dos vasos sanguiacuteneos A destruiccedilatildeo de ceacutelulas

fetais associada agrave inflamaccedilatildeo linfoacuteide tambeacutem pode ocorrer em outros tecidos

como coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico pulmatildeo e fiacutegado (BARR et al 1994)

Neospora caninum eacute capaz de produzir lesotildees necroacuteticas visiacuteveis em

poucos dias causando morte celular pela ativa multiplicaccedilatildeo dos taquizoiacutetas

podendo produzir doenccedilas neuromusculares graves em catildees bovinos e

provavelmente em outras espeacutecies destruindo um grande nuacutemero de ceacutelulas

neurais incluindo nervos craniais e espinhais afetando assim a condutibilidade

dessas ceacutelulas (CANTILE ARISPICI 2002)

Se o animal estiver com uma boa resposta imune os taquizoiacutetas se

transformam em bradizoiacutetas (fase de multiplicaccedilatildeo lenta) formando os cistos

teciduais localizados principalmente no Sistema nervoso central Este estaacutegio eacute

mantido na fase crocircnica da infecccedilatildeo e o animal natildeo apresenta nenhuma

sintomatologia nesta fase Entretanto alguns fatores como por exemplo o

periacuteodo de gestaccedilatildeo (QUINN et al 2002) pode levar a uma queda nessa

imunidade reativando essa infecccedilatildeo Os bradizoiacutetas se transformam em

taquizoiacutetas e desenvolve infecccedilatildeo aguda

Nos estaacutegios iniciais da gestaccedilatildeo o sistema imune fetal estaacute

imaturo tornando o feto extremamente vulneraacutevel e este dificilmente

sobreviveraacute agrave infecccedilatildeo por N caninum Os abortamentos podem ocorrer a

partir dos trecircs meses de idade sendo que a maioria ocorre em torno do quinto

e sexto mecircs de gestaccedilatildeo (ANDERSON ADRIANARIVO CONRAD 2000

DUBEY SCHARES 2011)

Os fetos podem morrer no uacutetero serem reabsorvidos autolisados

mumificados nascerem mortos ou nascerem vivos poreacutem doentes ou ainda

nascerem clinicamente normais mas com infecccedilatildeo crocircnica (BOWMAN 2006

RADOSTITIS 2010) A infecccedilatildeo eacute caracterizada por perdas reprodutivas

podendo determinar morte embrionaacuteria no primeiro terccedilo de gestaccedilatildeo e

abortamento durante o segundo No terccedilo final a infecccedilatildeo dificilmente resultaraacute

em morte fetal e abortamento mas sim em nascimento de bezerros

persistentemente infectados (CAMILLO et al 2010)

Foi demonstrado que eacute no terccedilo meacutedio (ao redor de 140 dias) que

ocorre a resposta imune humoral e celular especiacutefica da vaca prenhe e do feto

frente a este parasita (BARTLEY et al 2004 INNES et al 2005) Sendo

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 23: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

20

assim fetos infectados nos estaacutegios finais de gestaccedilatildeo teratildeo maior chance de

sobrevivecircncia (GIBNEY et al 2008)

261 Imunidade na gestaccedilatildeo de animais infectados por N caninum

Para que o abortamento ocorra o feto ou placenta tem que ser

infectados de maneira que natildeo satildeo mais viaacuteveis (DUBEY BUXTON WOUDA

2006) Geralmente eacute aceito que o abortamento na neosporose ocorra devido a

uma inversatildeo de uma imunidade do tipo Th2 a qual eacute favoraacutevel a manutenccedilatildeo

da gestaccedilatildeo para uma resposta do tipo Th1 excessiva (INNES et al 2005)

Embora o IFN-γ seja um importante componente da imunidade protetora contra

o N caninum este tipo de resposta ocorrendo na placenta pode ser prejudicial

agrave gestaccedilatildeo No entanto em estudo em vacas naturalmente infectadas por N

caninum observou-se que a resposta mediada por IgG2 associada a produccedilatildeo

de IFN-γ (Th1) foi protetora contra a ocorrecircncia do abortamento (ALMERIacuteA et

al 2009) Em bovinos experimentalmente infectados durante a gestaccedilatildeo

observou-se uma resposta mediada por IgG2 com aumento da resposta imune

celular e produccedilatildeo de IFN-γ indicativos de uma resposta do tipo Th1

(WILLIAMS et al 2000) Em bovinos naturalmente infectados por N caninum

o aumento nos valores de anticorpos anti-N caninum estavam associados a

uma reativaccedilatildeo de uma infecccedilatildeo latente e predominantemente associados agrave

resposta mediada por IgG2 (ANDRIANARIVO et al 2005 GUY et al 2001)

O periacuteodo de infecccedilatildeo placentaacuteria e fetal durante a gestaccedilatildeo satildeo

fatores determinantes na ocorrecircncia do aborto Evidecircncias geradas por estudos

em bovinos experimentalmente infectados indicam que quanto mais cedo na

gestaccedilatildeo ocorrer a parasitemia mais severas seratildeo as consequecircncias para o

feto (MACALDOWIE et al 2004) Um feto muito novo natildeo tem um sistema

imune desenvolvido suficientemente para controlar a multiplicaccedilatildeo parasitaacuteria

nos tecidos ao passo que um feto mais desenvolvido estaacute mais apto a limitar o

crescimento parasitaacuterio e favorece o desenvolvimento de cistos teciduais e

infecccedilatildeo persistente (DUBEY BUXTON WOUDA 2006) Portanto no primeiro

trimestre de gestaccedilatildeo em bovinos o feto eacute excepcionalmente vulneraacutevel agrave

infecccedilatildeo por N caninum e muito provavelmente natildeo sobrevive Ao passo que

fetos no terceiro trimestre de gestaccedilatildeo podem montar uma resposta imune

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 24: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

21

(INNES et al 2005) o que pode ser suficiente ou natildeo para sua proteccedilatildeo

(DUBEY BUXTON WOUDA 2006)

Segundo Dubey (2003) bovinos soropositivos para N caninum satildeo

mais propensos a abortar do que os bovinos soronegativos ocorrendo um

aumento no tiacutetulo de anticorpos 4 a 5 meses antes do parto Vacas que

durante a gestaccedilatildeo mantiveram altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum e

que tiveram um aumento entre os 90 e 240 dias de gestaccedilatildeo satildeo mais

propensas a gerarem conceptos congenitamente infectados se comparadas

com as vacas que natildeo tiveram esse aumento ou aquelas que mantiveram

baixos tiacutetulos de anticorpos (PAREacute THURMOND HIETALA 1996)

Semelhantemente os aumentos nos tiacutetulos de anticorpos na segunda metade

gestacional estavam relacionados com a ocorrecircncia da transmissatildeo

transplacentaacuteria (GUY et al 2001) Aumentos significantes nos tiacutetulos de

anticorpos anti-N caninum no uacuteltimo trimestre de gestaccedilatildeo tambeacutem satildeo

relatados (HAumlSLER et al 2006) Num estudo longitudinal Haumlsler et al (2006)

verificaram que das 30 vacas soropositivas 28 permaneceram soropositivas

durante toda a gestaccedilatildeo e duas testaram negativas pelo menos uma vez

durante a gestaccedilatildeo

27 Sinais Cliacutenicos

O aborto eacute a principal manifestaccedilatildeo cliacutenica de neosporose em vacas

adultas natildeo existindo quaisquer sinais de doenccedila nas vacas que abortam A

infecccedilatildeo pode provocar reabsorccedilatildeo do embriatildeo mumificaccedilatildeo nascimento de

vitelos mortos de vitelos vivos doentes ou mais frequentemente o nascimento

de vitelos cronicamente infectados mas clinicamente normais Normalmente

natildeo se verifica a ocorrecircncia de retenccedilatildeo placentaacuteria como sequela do aborto

Os abortos podem ocorrer desde os trecircs meses de gestaccedilatildeo ateacute ao seu termo

no entanto a maioria destes ocorre entre o quinto e o sexto mecircs As vacas

infectadas normalmente apresentam na primeira lactaccedilatildeo um decreacutescimo da

produccedilatildeo leiteira apresentando maior risco de abortamento e tambeacutem maior

probabilidade de serem refugadas Os sinais cliacutenicos apenas foram reportados

em vitelos ateacute aos dois meses de idade podendo estes apresentar sinais

neuroloacutegicos e baixo peso corporal Os vitelos nascidos de vacas

congenitamente infectadas frequentemente nascem persistentemente

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 25: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

22

infectados Estes animais apresentam maior risco de aborto particularmente na

sua primeira gestaccedilatildeo Seguidamente estes animais exibem maior tendecircncia

para originar vitelos tambeacutem congenitamente infectados do que para abortar

(MCALLISTER et al 2000)

Nos bovinos adultos o abortamento eacute o uacutenico sinal clinico observado

em fecircmeas gestantes infectadas (vacas ou novilhas) ocorrendo do 3deg ao 9deg

mecircs de gestaccedilatildeo principalmente entre 5 e 6 meses A maior parte dos bovinos

adultos consegue controlar a infecccedilatildeo e permanecer clinicamente normal

poreacutem persistentemente infectado Entre 5 e 6 desses animais podem

abortar novamente em sucessivas gestaccedilotildees (ANDERSON et al 1995

WOUDA et al1998)

A infecccedilatildeo fetal pode ocasionar morte embrionaacuteria reabsorccedilatildeo ou

mumificaccedilatildeo A infecccedilatildeo no feto nem sempre provoca a sua morte e em

algumas ocasiotildees ocorre o nascimento de bezerros infectados congenitamente

e com sintomatologia nervosa (DUBEY LINDSAY 1996) Os sintomas podem

ser desde coordenaccedilatildeo ligeira dificuldade para se levantar ateacute paralisia

completa e debilidade

A maioria dos bezerros infectados intra-uterinamente ao nascer

apresenta altos tiacutetulos de anticorpos anti-N caninum THURMOND et al (1999)

80 a 90 dos filhos das vacas soropositivas satildeo congenitamente infectados

sendo responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da doenccedila no rebanho

Em catildees a neosporose manifesta-se de forma generalizada

incluindo a pele Animais jovens ou filhotes congenitamente infectados

apresentam uma paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia

Outras disfunccedilotildees que podem ocorrer e consistem em dificuldade na

degluticcedilatildeo paralisia das mandiacutebulas flacidez e atrofia muscular e falha

cardiacuteaca (DUBEY 2003)

Outros sinais cliacutenicos tecircm sido relatados em bezerros com menos de

dois meses de idade (MOTA FERRE FARIA 2008) Nos bezerros a infecccedilatildeo

congecircnita pode se manifestar com membros anteriores eou posteriores

flexionados ou hiperextendidos ataxia e perda da consciecircncia Tambeacutem podem

ocorrer bezerros com exoftalmia ou aparecircncia assimeacutetrica dos olhos e

deformidades associadas com lesotildees em ceacutelulas nervosas na fase

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 26: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

23

embrionaacuteria (MONTEIRO 2010 RODOSTITIS 2010 DUBEY SCHARES

2011)

28 Abortamento endecircmico e epidecircmico

O abortamento associado ao N caninum pode ter padratildeo endecircmico

ou epidecircmico O padratildeo de abortos eacute considerado epideacutemico se 10 ou mais

dos animais em risco abortarem em seis a oito semanas Pelo contraacuterio eacute

considerado endeacutemico se mais de 5 dos animais da exploraccedilatildeo abortarem

durante vaacuterios anos Pensa-se que os surtos epizooacuteticos ocorram por infecccedilatildeo

primaacuteria dos animais isto eacute por ingestatildeo de alimento ou aacutegua contaminados

com oocistos (McAllister et al 2000) ou por exposiccedilatildeo dos animais a outro

agente infeccioso como o viacuterus do BVDV ou ainda por exposiccedilatildeo a um fator

capaz de provocar imunossupressatildeo (Parkison 2009) Os abortos endeacutemicos

ocorrem com maior frequecircncia nas vacas infectadas congenitamente Os fetos

infectados precocemente na gestaccedilatildeo estatildeo mais susceptiacuteveis ao aborto Pelo

contraacuterio quando a infecccedilatildeo fetal ocorre numa fase tardia os fetos sobrevivem

nascendo congenitamente infectados (Guy et al 2001) As taxas de

transmissatildeo atraveacutes da placenta sofrem um decreacutescimo com o aumento do

nuacutemero de partos dos animais sugerindo que existe alguma imunidade nos

animais congenitamente infectados apesar de esta natildeo ser totalmente efetiva

(Dubey et al 2006)

Abortamentos epidecircmicos ocorrem devido a uma infecccedilatildeo primaacuteria

das fecircmeas susceptiacuteveis causado pela ingestatildeo de aacutegua eou alimento

contaminado com oocistos Neste caso os abortamentos ocorrem dentro de

um curto periacuteodo de tempo quando as fecircmeas prenhes satildeo expostas agrave

infecccedilatildeo por oocistos (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 MCCANN

et al 2007)

29 Diagnoacutestico

291 Diagnoacutestico Cliacutenico

A histoacuteria cliacutenica do animal ou rebanho pode facilitar a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico acertado Nos rebanhos infectados por N caninum os abortos

podem ocorrer tanto em novilhas quanto em vacas e podem apresentar-se de

forma esporaacutedica endecircmica ou epidecircmica em qualquer eacutepoca do ano A

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 27: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

24

existecircncia de antecedentes de aborto em algum dos ascendentes ou

descendentes dos animais afetados eacute importante (Aacutelvarez-Garcia 2003)

292 Diagnoacutestico Laboratorial

O diagnoacutestico da neosporose eacute complexo e normalmente caro

(DUBEY SCHARES 2011) devido agrave ausecircncia de manifestaccedilotildees cliacutenicas nos

animais cronicamente infectados agrave dificuldade de isolamento de N caninum no

feto abortado pelo escasso nuacutemero de parasitas e pelo fato de ocorrerem

abortamentos sem manifestaccedilatildeo de outros sinais cliacutenicos (MOTA FERRE

FARIA 2008)

Os meacutetodos diretos utilizados no diagnoacutestico e pesquisa de N

caninum satildeo os exames histopatoloacutegicos imunohistoquiacutemico o isolamento in

vitro e in vivo atraveacutes da inoculaccedilatildeo do material suspeito em cultivo celular ou

em animais de laboratoacuterio a detecccedilatildeo do DNA do parasita por PCR e a

observaccedilatildeo dos cistos nos tecidos a fresco (sem coloraccedilatildeo) Entre os meacutetodos

indiretos estatildeo Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia indireta (RIFI) Ensaio

imunoenzimaacutetico (ELISA) Imunoblotting (IB) teste de aglutinaccedilatildeo (NAT) que

podem detectar anticorpos especiacuteficos para N caninum (BJOumlRKMAN UGLLA

1999 DUBEY 2003)

Como o isolamento do agente eacute difiacutecil o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos tornou-se uma ferramenta bastante uacutetil

Lesotildees compatiacuteveis com a enfermidade em ceacuterebro coraccedilatildeo e fiacutegado de fetos

abortados associados aos exames histoquiacutemicos e moleculares do parasito

mediante o PCR em tecidos fetais aleacutem da realizaccedilatildeo da sorologia fetal

confirmam a infecccedilatildeo pelo agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

A RIFI foi agrave primeira teacutecnica soroloacutegica descrita e eacute utilizada como

prova de referecircncia (DUBEY et al 1988) Os testes de ELISA do soro ou do

leite satildeo mais objetivos e podem ser automatizados permitindo uma anaacutelise

mais raacutepida podendo ser utilizados em estudos epidemioloacutegicos em larga

escala (MOTA FERRE FARIA 2008) Foram desenvolvidas provas de ELISA

de avidez que permitem detectar antiacutegenos de superfiacutecie localizados no

taquizoiacuteto (NcGRA7) ou no bradizoiacuteto (NcSAG4) permitindo distinguir uma

primo-infecccedilatildeo de uma infecccedilatildeo crocircnica com recrudescecircncia

(MORENOMONTEJO GARCIA 2008)

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 28: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

25

As provas de aglutinaccedilatildeo direta (NAT ndash neospora agglutination test)

utiliza poucos equipamentos e materiais aleacutem de serem de faacutecil interpretaccedilatildeo

(ROMAND THULLIEZ DUBEY 1998) Ela degrada a IgM atraveacutes do 2

mercaptoetanol expressando desta forma a IgG com sensibilidade de 97 a

99 (MOTA FERRE FARIA 2008)

A reaccedilatildeo da polimerase em cadeia (PCR) eacute uma das teacutecnicas mais

importantes da biologia molecular e representa um grande avanccedilo no

diagnoacutestico de vaacuterias doenccedilas pela amplificaccedilatildeo de segmentos especiacuteficos do

DNA Este meacutetodo de diagnoacutestico possibilitou a caracterizaccedilatildeo molecular do N

caninum (DUBEY LINDSAY 1996) e levou a descoberta de que os isolados do

parasita de catildees e de bovinos pertencem agrave mesma espeacutecie e satildeo

geneticamente idecircnticos (MARSH et al 1998) A PCR eacute altamente sensiacutevel e

especiacutefica para o diagnoacutestico da neosporose (ELLIS 1998 ELLIS et al 1999)

Esta teacutecnica vem sendo utilizada para detectar o DNA de N caninum tanto em

infecccedilotildees naturais quanto experimentais (HOLMDAHL MATTSSON 1996 HO

et al 1997)

210 Controle

O conhecimento dos fatores de risco de um rebanho se infectar e

desenvolver abortamentos associados com N caninum satildeo importantes para a

adoccedilatildeo de medidas de controle da neosporose (DUBEY SCHARES ORTEGA-

MORA 2007 DUBEY SCHARES 2011)

As estrateacutegias de controle e prevenccedilatildeo da neosporose bovina estatildeo

basicamente focalizadas em programas para reduzir o nuacutemero de animais

congenitamente infectados no rebanho e de minimizar a oportunidade de

infecccedilatildeo poacutes-natal atraveacutes do ambiente (ANDERSON ANDRIANARIVO

CONRAD 2000)

O programa de controle da doenccedila deve ser feito considerando as

particularidades regionais na epidemiologia o tipo de rebanho (leite ou corte) o

sistema de manejo a prevalecircncia dentro do rebanho a rota predominante de

transmissatildeo e a existecircncia de medidas de bioseguridade Deve ser

considerado ainda o custo benefiacutecio comparando as despesas dos testes

diagnoacutesticos e das medidas de controle com a reduccedilatildeo das perdas econocircmicas

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 29: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

26

ocasionadas pelos efeitos da neosporose sobre o desempenho produtivo e

reprodutivo do rebanho (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007)

As vacinas e os quimioteraacutepicos ainda natildeo satildeo eficazes contra esta

enfermidade Por isso devem-se implantar praacuteticas de manejo e escolher as

medidas de controle mais adequadas para tentar eliminar ou reduzir os riscos

de infecccedilatildeo e os prejuiacutezos causados por N caninum (ANDREOTTI et al

2003)

A triagem soroloacutegica anual do rebanho eacute uacutetil no controle estrateacutegico

(DUBEY SCHARES 2011) sendo que o desenvolvimento de testes

soroloacutegicos especiacuteficos de baixo custo para N caninum eacute essencial para os

avanccedilos no conhecimento da epidemiologia (MELLO 2008) e para o controle

desta enfermidade Essa triagem pode estimar a extensatildeo da infecccedilatildeo no

rebanho e a sorologia com amostras preacute-colostrais pode nos dar uma

estimativa das infecccedilotildees congecircnitas (ANDREOTTI et al 2003)

A sorologia deve ser feita em todos os animais do rebanho e natildeo

apenas naquelas que abortaram (MELLO 2008) A recomendaccedilatildeo para

animais soropositivos eacute o descarte de modo gradativo evitando prejuiacutezos

econocircmicos na produccedilatildeo Os animais soropositivos e as bezerras nascidas

infectadas natildeo devem ser mantidos na reproduccedilatildeo para evitar a transmissatildeo

vertical do parasita No entanto dependendo da prevalecircncia da doenccedila essa

praacutetica pode ser economicamente inviaacutevel (ANDREOTTI et al 2003) Diante

disto a reposiccedilatildeo do rebanho com animais soronegativos representa uma

alternativa importante e de menor custo para a eliminaccedilatildeo da infecccedilatildeo em

meacutedio prazo A realizaccedilatildeo de testes para Ncaninum em animais que seratildeo

introduzidos no rebanho seguida da exclusatildeo das fecircmeas provenientes de

matildees soropositivas na reposiccedilatildeo do rebanho parece ser uma estrateacutegia de

controle com melhor retorno econocircmico (MELLO 2008)

O programa deveraacute incluir ainda o controle de catildees existentes nas

exploraccedilotildees pois satildeo os hospedeiros definitivos desta parasitose Deve-se

controlar a fonte de infecccedilatildeo aos catildees removendo os tecidos infectados como

placentas fetos e carcaccedilas de bezerros e evitar o acesso agrave carne crua ou mal

cozida (OBANDO et al 2010) A reduccedilatildeo da contaminaccedilatildeo de bovinos por

oocistos pode ser feita reduzindo a presenccedila de catildees nos estaacutebulos e nos

centros de manejo Portanto deve-se reduzir o nuacutemero de catildees convivendo

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 30: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

27

com o rebanho bovino proteger os locais de armazenamento de alimento e de

aacutegua e remover as fezes dos catildees de locais como os cochos e bebedouros

Existe ainda o risco do aparecimento de catildees da vizinhanccedila na propriedade

por isso haacute necessidade da educaccedilatildeo no sentido da posse responsaacutevel de

catildees (MONTEIRO 2010)

Uma medida indicada para vacas infectadas de alto valor geneacutetico eacute

a transferecircncia de embriatildeo Devem-se usar receptoras natildeo infectadas para

prevenir a transmissatildeo transplacentaacuteria endoacutegena de N caninum

(BAILLARGEON et al 2001) O teste de receptoras antes da transferecircncia eacute

altamente recomendado (OLIVEIRA et al 2010 LANDMANN et al 2011)

211 Prevalecircncia em bovinos

No Brasil o primeiro estudo de soroprevalecircncia de N caninum

em bovinos foi realizado por Gondim et al (1999) na Bahia utilizando a RIFI

Estes autores detectaram anticorpos anti-N caninum em 1409 dos bovinos

testados com tiacutetulos de 200 a 3200 e somente uma propriedade natildeo

apresentou evidecircncias da presenccedila de N caninum (GONDIM et al 1999)

Diversos pesquisadores fizeram levantamentos

sorepidemioloacutegicos e os valores de soroprevalecircncia variaram de 143

(GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534 (BENETTI et al 2009) conforme

Quadro 01

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 31: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

28

Quadro 01 ndash Prevalecircncia de anticorpos antindashN caninum em bovinos no Brasil ndash 1999 a 2015

Autor Ano Estado Teste Tiacutetulo de

positivo

Gondim et al 1999 BA RIFI 200 a 3200 1409

Costa et al 2001 SP e MG RIFI ge 200 1683 (me)

Corbellini et al 2002 RS RIFI ge 200 112 (HPB)

Corbellini et al 2005 RS RIFI ge 200 178

Ragozo et al 2003 MT MG PR e

RJ RIFI ge 25 236

PR RIFI ge 25 222

262 (le)

191 (co)

Sartor et al 2003 SP RIFI ge 200 159 (le)

ELISA 305 (le)

Guimaracirces Jr et al

2004 PR RIFI ge 25 143

151 (HPB)

77 (cru)

Ogawa et al 2005 PR RIFI ge 200 12

Sartor et al 2005 SP ELISA 2000 (co)

355 (le)

Melo et al 2006 GO RIFI ge 250 304

296 (co)

304 (le)

433 (mi)

Vianna et al 2008 SP ELISA 1988 (nel)

Benetti et al 2009 MS RIFI ge 200 535

Camillo et al 2010 PR RIFI ge 100 242

Macedo et al 2013 SC ELISA ge 100 425

Langoni et al 2013 PR RIFI ge 25 24

Boas et al 2015 RO RIFI ge100 1062(le)

Fonte autor Siglas- me (animais mesticcedilos) HPB (raccedila Holandecircs Preto e Branco) le (bovinos de leite) co (bovinos de corte) cru (animais cruzados) mi (animais mistos) e nel (raccedila Nelore)

212 Tratamentos da neosporose

Atualmente os quimioteraacutepicos natildeo tecircm mostrado seguranccedila e

efetividade para o tratamento da neosporose

Estudos experimentais com o toltrazuril e ponazuril tecircm demonstrado

efeitos sobre taquizoiacutetos de N caninum in vitro e in vivo em bezerros

(STROHBUSCH et al 2009) O parasita natildeo foi detectado no ceacuterebro e em

outros oacutergatildeos de bezerros tratados com ponazuril Tentativas de fazer alterar o

29

curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

30

30 Referecircncias

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

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Page 32: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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curso da infecccedilatildeo de N caninum utilizando bolus de monensina com liberaccedilatildeo

lenta em vacas tiveram resultados inconclusivos (VANLEEUWEN et al 2011)

VanLeeuwen et al 2010 no Canadaacute alimentaram vacas secas com monensina

e observaram reduccedilatildeo do risco de soropositividade para N caninum

Entretanto o tratamento em bovinos parece ser antieconocircmico pois esses

quimioteraacutepicos poderiam ser utilizados de forma preventiva e por isso por

longo tempo havendo o risco de resiacuteduos no leite e na carne produzidos

(DUBEY SCHARES 2011)

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

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ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

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O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

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Page 33: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

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ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

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Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

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INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

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Page 34: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

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4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

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42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

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Page 36: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 37: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 39: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 40: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

37

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 41: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

38

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39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 42: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

39

4 OBJETIVOS

41 Objetivo geral

- Avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de

propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde Pr

42 Objetivos especiacuteficos

-Detectar anticorpos contra N caninum em soros de bovinos e catildees

- Avaliar agrave associaccedilatildeo de riscos para a infecccedilatildeo por Ncaninum em bovinos

e catildees pertencentes a este ecossistema

- Detectar DNA do parasita em amostras de sangue total

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 43: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

40

ARTIGO

Ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades

produtoras de leite de Ivaiporatilde Paranaacute 2016 63f

RESUMO

A neosporose eacute uma das principais causas de problemas reprodutivos em bovinos mundialmente ocasionando abortamentos e responsaacutevel por significativas perdas econocircmicas na pecuaacuteria leiteira aumentando o intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de animais O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrecircncia de Neospora caninum em bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de Ivaiporatilde-Pr Sangue com e sem EDTA foram colhidos de 400 bovinos e 46 catildees provenientes de 20 propriedades A Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada a partir do sangue total e a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI) a partir do soro Os bovinos e os catildees foram considerados positivos quando apresentaram tiacutetulos na RIFI ge 100 e ge 50 respectivamente Anticorpos anti-Neospora caninum foram detectados em 201 (80400) dos bovinos cujos tiacutetulos variaram de 100 a 1600 A PCR apresentou apenas dois animais positivos 20 (2400) dos bovinos Com relaccedilatildeo aos catildees foram detectados anticorpos anti-Neospora caninum em 196 (946) cujos tiacutetulos variaram de 50 a 6400 Os resultados obtidos permitem concluir que na regiatildeo de Ivaiporatilde a soroprevalecircncia para N caninum em bovinos leiteiros e em catildees foram similares aos estudos realizados no Brasil A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute rara Natildeo houve diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a soropositividade em catildees e bovinos

Palavras Chaves Neosporose Neospora caninum Problemas reprodutivos

Bovino de leite Soropositivo Aborto

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 44: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

41

Spiti Simone Martins Occurrence of Neospora caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr 2016 63f Master Dissertation in Health and Ruminant Production - Paranaacute North University of Paranaacute Arapongas Abstract The neosporosis is one of the principal causes of reproductive problems in cattles worldwide causing abortion and responsible for significant economic losses in dairy farming increasing the calving interval the decreased milk production and disposal of animals The objective of this study was to evaluate the occurrence Neospora Caninum in cattle and dogs in the producing properties of milk in Ivaiporatilde-Pr Blood with and without EDTA were collected from 400 cattle and 46 dogs from 20 properties Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed from whole blood and indirect immunofluorescence reaction (RIFI) from the serum (after clot retraction) Cattle and dogs were considered positive when presented titles at IIR ge 100 and ge 50 respectively Antibodies Anti-Neospora caninum were detected in 2010 (80400) of cattle whose titles ranged from 100 to 1600 The PCR presented only two positive animals 20 (2400) of cattle In relation to the dogs were detected antibodies anti-Neospora caninum in 196 (946) whose titles ranged from 50 to 6400 The results obtained allow to show that in region of Ivaiporatilde the seroprevalence for N Caninum in dairy cattle and dogs were similar to studies realized in Brazil The PCR the total blood showed a low positivity in cattle and all the dogs were negative showing that the probability of detecting parasitemia in epidemiological studies is rare There werenrsquot significant differences between variables studied with seropositivity in dogs and cattle Word Keys Neosporosis Neospora caninum Reproductive Problems Dairy cattle Seropositive Abortion

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 45: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

42

INTRODUCcedilAtildeO

A neosporose bovina eacute uma enfermidade amplamente disseminada pelo

mundo e que tem sido associada a casos de abortamento esporaacutedico

endecircmico e epidecircmico em bovinos causando perdas econocircmicas

consideraacuteveis (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007 KAMGA-

WALADJO et al 2010) Natildeo haacute estudos estimando as reais perdas da

pecuaacuteria bovina leiteira sobre os danos agregados agrave neosporose O impacto

econocircmico depende aleacutem do valor dos fetos abortados dos custos indiretos

com assistecircncia veterinaacuteria e testes diagnoacutesticos aumento do tempo de

lactaccedilatildeo e do intervalo entre partos queda na produccedilatildeo de leite e descarte de

animais (THURMOND HIETALA 1996)

Dubey e Schares (2011) mostraram que N caninum estaacute disseminado

por todos os continentes inclusive no Brasil e que uma grande quantidade de

animais domeacutesticos e selvagens foram expostos a este parasita Guimaratildees

Juacutenior et al (2004) comprovaram a presenccedila de anticorpos anti-N caninum

em propriedades leiteira no norte do estado do Paranaacute

A importacircncia na identificaccedilatildeo da presenccedila do N caninum num rebanho

bovino deve-se aos prejuiacutezos econocircmicos causados pelos problemas

reprodutivos (ANDREOTTI et al 2003) como fetos mumificados natimortos

nascimento de bezerros com problemas neuroloacutegicos bem como aos custos

com a reproduccedilatildeo (inseminaccedilatildeo artificial ou cobertura e valor dos fetos) aos

custos indiretos (aumento do intervalo entre partos diminuiccedilatildeo da produccedilatildeo de

leite aumento do descarte e reposiccedilatildeo dos animais diminuiccedilatildeo da vida

produtiva) aleacutem de custos com assistecircncia veterinaacuteria medicamentos e

diagnoacutestico da doenccedila (DUBEY SCHARES ORTEGA-MORA 2007

MONTEIRO 2010)

O diagnoacutestico cliacutenico eacute complexo sendo que o exame soroloacutegico com a

detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos eacute uma das ferramentas mais importantes

para confirmar a presenccedila do agente (MOTA FERRE FARIA 2008)

Vacinas e quimioteraacutepicos existentes natildeo tecircm demonstrado seguranccedila e

efetividade no controle da enfermidade por isso satildeo necessaacuterias informaccedilotildees

sobre a epidemiologia para se implantar accedilotildees objetivas e praacuteticas de controle

da infecccedilatildeo

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 46: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

43

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrecircncia de N caninum em

soro e sangue de bovinos e catildees de propriedades produtoras de leite de

Ivaiporatilde Pr

MATERIAL E MEacuteTODOS

Caracterizaccedilatildeo do local de estudo

O presente estudo foi realizado no municiacutepio de Ivaiporatilde localizado na

mesorregiatildeo Norte Central do Estado do Paranaacute O municiacutepio possui uma aacuterea

de 434662kmsup2 e 31816 habitantes localiza-se a uma latitude de 24ordm14rsquo52rsquorsquosul

e a uma longitude 51ordm41rsquo05rsquorsquooeste estando a uma altitude de 692m (IPARDES

2015)

O tipo climaacutetico segundo a classificaccedilatildeo de Koumlppen eacute tipo Cfa ndash

subtropical uacutemido caracterizada por temperaturas meacutedias nos meses mais frios

inferiores a 18 ordmC (mesoteacutermico) e nos meses mais quentes acima de 22 ordmC

verotildees quentes invernos com geadas pouco frequentes e tendecircncia de

concentraccedilotildees de chuvas nos meses de veratildeo contudo sem estaccedilatildeo seca

definida (RITTA NETO 2010) A precipitaccedilatildeo meacutedia eacute de 1600 a 1800 mm

anuais e a temperatura meacutedia anual eacute de 21 a 22 ordmC (CAVIGLIONE 2000)

De acordo com o IBGE (2013) o rebanho bovino eacute composto de 23748

cabeccedilas A regiatildeo estudada constitui-se por propriedades rurais que se

dedicam agrave produccedilatildeo de leite tipo C

Amostras

Os animais que participaram do presente estudo eram das raccedilas

Holandesa Jersey e Girolanda O rebanho trabalhado tem uma produccedilatildeo

meacutedia diaacuteria de leite de 19 litros Todas as propriedades tecircm histoacutericos de

problemas reprodutivos com alto taxa de repeticcedilatildeo de cio retenccedilatildeo de placenta

e abortos dentre outros O sistema predominante de manejo dos bovinos eacute o

semi-confinado Os animais tecircm acesso agraves pastagens rotacionadas

suplementados com volumosos praticamente o ano todo e com raccedilatildeo

concentrada o ano inteiro Os locais de armazenagem e fornecimento desses

alimentos permitem o acesso de catildees roedores e outros animais Todas as

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 47: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

44

propriedades fornecem aacutegua atraveacutes de bebedouros provenientes de minas ou

poccedilos artesianos

Para o caacutelculo do nuacutemero de amostras dos bovinos foi utilizado o

Programa Epi Info versatildeo 6 utilizando uma prevalecircncia de 50 com intervalo

de confianccedila de 95 Foi calculado um total de 400 amostras de sangue de

bovinos que foram obtidas de 20 animais de faixas etaacuterias diferentes das 20

propriedades escolhidas aleatoriamente

As colheitas de sangue foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10

de abril de 2015 As amostras foram colhidas com o animal contido atraveacutes de

venocentese da veia cocciacutegena utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com

tampa com e sem anticoagulantes e devidamente identificados Apoacutes a

retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado em tubos tipo Eppendorfreg

identificados e armazenados em temperatura de -20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do

teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram utilizadas para extraccedilatildeo do

DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Dos catildees foram colhidas amostras de todos os animais possiacutevel em

todas as propriedades que participaram do estudo As colheitas de sangue

foram feitas no periacuteodo de 15 de fevereiro a 10 de abril de 2015 As amostras

foram colhidas com o animal contido atraveacutes de venocentese da veia jugular

utilizando tubos a vaacutecuo siliconizados com tampa com e sem anticoagulantes

e devidamente identificados Apoacutes a retraccedilatildeo do coaacutegulo o soro foi aliquotado

em tubos tipo Eppendorfreg identificados e armazenados em temperatura de -

20ordmC ateacute a realizaccedilatildeo do teste soroloacutegico As amostras de sangue total foram

utilizadas para extraccedilatildeo do DNA e realizaccedilatildeo da PCR

Questionaacuterio epidemioloacutegico

Inicialmente foram aplicados questionaacuterios epidemioloacutegicos nas 20

propriedades abordando o manejo sanitaacuterio e contemplando aspectos

relacionados agrave neosporose Nesta ocasiatildeo foi obtida de todos os produtores a

autorizaccedilatildeo para a utilizaccedilatildeo e divulgaccedilatildeo dos dados para esta dissertaccedilatildeo

Estes questionaacuterios foram feitos atraveacutes de entrevistas individuais

Sorologia

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 48: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

45

O meacutetodo soroloacutegico utilizado para detectar anticorpos IgG contra N

caninum foi a Reaccedilatildeo de Imunofluorescecircncia Indireta (RIFI)

Conforme descrito anteriormente por Conrad et al (1993) O antiacutegeno

de N caninum foi produzido a partir de cultura celular derivada de taquizoiacutetas

da cepa NC-1 Foi feita a diluiccedilatildeo dos soros dos animais em 150 e 1100 os

quais foram incubados em lacircminas com antiacutegeno por 30 minutos em

temperatura de 37ordm C e depois lavados com PBS (pH 90) Anticorpos IgG

foram detectados com isoticianato de fluorescecircncia anti-bovino IgG Os soros

foram considerados positivos quando toda a superfiacutecie de taquizoiacutetas foi

fluorescente (PAREacute et al 1995) e os tiacutetulos de anticorpos ge 100 para os

bovinos e ge 50 para os catildees

Extraccedilatildeo de DNA e Nested PCR

A extraccedilatildeo de DNA foi realizada utilizando o kit de extraccedilatildeo de DNA

PureLink Genomic DNA Mini Kit (Life Technologies) seguindo a metodologia

proposta pelo fabricante Apoacutes a extraccedilatildeo do DNA as amostras foram

submetidas ao Nested PCR em triplicata baseada na regiatildeo ITS-1 para

detecccedilatildeo de amostras positivas para Neospora caninum segundo protocolo

descrito anteriormente por Buxton et al (1999) Os primers utilizados foram

externos NN1 ndash TCAACCTTTGAATCCCAA NN2 ndash

CGAGCCAAGACATCCATT e internos NEO1 ndash TACTACTCCCTGTGAGTTG

NEO2 - TCTCTTCCCTCAAACGCT

Aliacutequotas de cada PCR foram submetidas a eletroforese em gel agarose

a 2 Taquizoiacutetas da estirpe NC-1 (106 taqml) foram diluiacutedos em TE e o DNA

foi extraiacutedo para ser usado como controle positivo O controle negativo constou

de amostras de aacutegua sem N caninum Um controle positivo e negativo foi

incluiacutedo em cada teste

Comitecirc de eacutetica

O presente trabalho foi aprovado pelo ldquoComitecirc de Eacutetica Para Uso de

Animais da Universidade Norte do Paranaacute ndash UNOPARrdquo sob o protocolo de

nuacutemero 00914

Anaacutelise Estatiacutestica

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 49: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

46

A anaacutelise de associaccedilatildeo entre os grupos foi realizada pelo teste de Qui-

quadrado (X2) considerando o niacutevel de significacircncia estatiacutestica de 5

utilizando o ldquosoftwarerdquo EpiInfo 6

Foi calculado o coeficiente de correlaccedilatildeo de Spermann atraveacutes do

ldquosoftwarerdquo GraphPad Prism 50 para determinar a relaccedilatildeo da distribuiccedilatildeo dos

tiacutetulos de anticorpos com as idades

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Dos 400 soros de bovinos estudados 80 animais (2010) foram

positivos para N caninum sendo que em todas as propriedades ao menos um

animal foi positivo na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave

1600 15 (38) com tiacutetulo de 100 28 (70) de 200 22 (55) de 400 8

(20) de 800 e 7 (18) com 1600 Na Tabela 01 encontra-se a porcentagem

de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e maacutexima em cada propriedade e o

resultado da PCR dos bovinos

Estudos epidemioloacutegicos mostram que existem diferenccedilas na

prevalecircncia da neosporose entre paiacuteses dentro dos paiacuteses entre regiotildees

entre gado de leite e corte e entre sistemas de manejo (DUBEY SCHARES

2011) A prevalecircncia de anticorpos contra N caninum em bovinos de leite no

Brasil pode variar de 143 (GUIMARAtildeES JUacuteNIOR et al 2004) a 534

(BENETTI et al 2009) No Mato Grosso do Sul Andreotti et al (2004)

verificaram soroprevalecircncia de 30 e em Minas Gerais Fernandes et al

(2004) encontraram prevalecircncia de 217 Jaacute Camillo et al (2010) constataram

uma prevalecircncia de 24 de neosporose bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste

Paranaense Entretanto deve-se ter cuidado ao comparar os resultados por

causa das diferentes teacutecnicas soroloacutegicas e do ponto de corte do modelo de

estudo e do tamanho das amostras utilizadas (DUBEY SCHARES 2011)

Langoni et al (2013) constatou uma prevalecircncia de 24 de neosporose

bovina na Mesorregiatildeo do Sudoeste Paranaense Neste estudo constatou-se

tambeacutem uma associaccedilatildeo entre soropositividade e o histoacuterico de abortamento

Concluiu que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo concepccedilatildeo e a presenccedila

de anticorpos anti-N caninum em bovinos

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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57

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58

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 50: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

47

Com base na idade dos bovinos natildeo houve nenhuma diferenccedila

estatiacutestica em relaccedilatildeo agrave soropositividade (Tabela 02) Esses dados satildeo

similares ao encontrado por Camillo et al(2010) no Brasil

Pesquisadores na Inglaterra e Franccedila natildeo observaram nenhuma

evidecircncia no aumento da soroprevalecircncia de acordo com a idade dos bovinos

estudados (HEMPHILL GOTTESTEIN 2000 PITEL et al 2001) tambeacutem Melo

et al (2001) em Minas Gerais observaram que natildeo houve associaccedilatildeo

significativa na distribuiccedilatildeo da soropositividade nas faixas etaacuterias ou seja a

frequumlecircncia foi distribuiacuteda uniformemente provavelmente a infecccedilatildeo sendo

mantida por transmissatildeo vertical

Dyer et al (2000) e Sanderson et al (2000) ambos nos EUA

observaram aumento de sororeagentes com o aumento da idade dos bovinos

sugerindo a ocorrecircncia de infecccedilatildeo poacutes-natal no rebanho Guimaratildees Juacutenior

(2004) no Brasil observou em fecircmeas bovinas acima de 24 meses de idade

maior prevalecircncia para o agente e encontrou a idade como um importante fator

de risco para infecccedilatildeo pelo N caninum

Todos os produtores que participaram do estudo relataram histoacuterico de

problemas reprodutivos nas propriedades sendo os de maior incidecircncia aborto

(447) retenccedilatildeo de placenta (372) e repeticcedilatildeo de cio (1810) Entretanto

natildeo foi possiacutevel fazer associaccedilatildeo destes fatores com a soropositividade para

Neospora caninum

Vaacuterios autores estudaram a importacircncia do N caninum na reproduccedilatildeo

dos bovinos Innes et al (2000) relatam que fecircmeas podem apresentar-se

soronegativas pouco tempo depois do aborto No Rio Grande do Sul Corbellini

et al (2002) observaram que vacas soropositivas tinham 33 vezes mais

probabilidade de abortar que as vacas soronegativas No Paranaacute infecccedilatildeo

congecircnita por N caninum foi confirmada com o isolamento do parasita no feto

bovino de sete meses de gestaccedilatildeo (LOCATELLI-DITTRICH et al 2004)

Oliveira et al (2010) em Neroacutepolis (GO) observaram que 75 dos

abortamentos estudados foram de animais soropositivos e 25 de animais

soronegativos Na Austraacutelia Landmann et al (2011) estimaram que vacas

soropositivas tiveram 29 a 39 vezes mais risco de abortamento do que em

vacas soronegativas e que a probabilidade dos bezerros de matildees

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

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60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 51: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

48

soropositivas se tornarem soropositivos foi 35 vezes maior do que bezerros de

vacas soronegativas

Com relaccedilatildeo agrave repeticcedilatildeo de cio Macaldowie et al (2004) relataram que

N caninum pode ser responsaacutevel pela morte embrionaacuteria na fase inicial da

gestaccedilatildeo causando um aumento do iacutendice de retorno ao cio nos animais

Andreotti et al (2010) concluiacuteram que haacute uma significante correlaccedilatildeo entre natildeo-

concepccedilatildeo e a presenccedila de anticorpos anti-N caninum em bovinos O que

confirma tambeacutem Kamga-Waladjo et al (2010) que verificaram que vacas

infectadas por N caninum requerem um nuacutemero maior de inseminaccedilotildees para

conceberem do que as soronegativas indicando que a morte embrionaacuteria pode

ocorrer

A presenccedila de fecircmeas soropositivas tambeacutem interfere no desempenho

reprodutivo do rebanho e propriedades onde existem animais soropositivos

apresentam maior taxa de descarte comparado com propriedades livres desse

agente (CAMILLO et al 2010)

O rebanho total que fez parte deste estudo era de 939 cabeccedilas sendo

que a maioria era composto pelas raccedilas Holandesa e Jersey O sistema de

criaccedilatildeo que prevalece eacute o semi-confinado ou seja todas as categorias animais

tem acesso a aacuterea de pastagens e tambeacutem recebem silagem de milho e

concentrado no cocho diariamente As propriedades que fizeram parte deste

estudo satildeo compostas por pequenas propriedades com aacuterea territorial natildeo

superior a 5500 hectares (Tabela 03) com exclusiva matildeo de obra familiar e

destinadas a produccedilatildeo de leite No entanto natildeo houveram associaccedilotildees dessas

variaacuteveis com a soropositividade (pgt005)

Na PCR foram obtidos 20 (2) de positividade Esses dois animais

eram negativos na RIFI portanto provavelmente estariam em uma infecccedilatildeo

aguda

As teacutecnicas de PCR satildeo de grande utilidade no diagnoacutestico de

Neospora pois permitem amplificar quantidades muito pequenas de DNA

mesmo em tecidos que estejam autolisados e tecircm uma alta sensibilidade e

especificidade O desenvolvimento de teacutecnicas de PCR quantitativas

(Collantes-Fernaacutendez et al 2002 Muller et al 2002) permitiu natildeo soacute a

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

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Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

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KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 52: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

49

detecccedilatildeo mas tambeacutem a quantificaccedilatildeo do DNA do parasito em diferentes

tecidos de animais infectados

Guimaratildees Juacutenior et al (2004) observaram nas propriedades produtoras

de leite ldquotipo Brdquo na regiatildeo norte do estado do Paranaacute que a presenccedila de catildees

soropositivos teve uma correlaccedilatildeo positiva em relaccedilatildeo agrave ocorrecircncia de

anticorpos anti-N caninum na populaccedilatildeo de bovinos No entanto em Rondocircnia

Aguiar et al (2006) natildeo encontraram associaccedilatildeo significativa entre a presenccedila

de catildees No presente estudo natildeo houve diferenccedilas significativas quando

comparamos a soropositividade entre bovinos com presenccedila de catildees (Tabela

4)

Dos 46 soros de catildees estudados 9 animais (196) animais foram

positivos para N caninum nem todas as propriedades tiveram animais

positivos na RIFI Os tiacutetulos de anticorpos obtidos variaram de 100 agrave 1600

sendo 2 (43) de 50 1 (22) de 100 1 (22) de 200 2 (43) de 400 1

(22) de 800 e 1 (22) de 3200 Nenhum catildeo foi positivo na PCR A Tabela

05 encontra-se a porcentagem de animais reagentes titulaccedilatildeo miacutenima e

maacutexima em cada propriedade dos catildees

No Paranaacute Souza et al (2002) e Romanelli et al (2007) verificaram

soroprevalecircncias de 216 e 291 em catildees respectivamente no norte do

estado e em Guarapuava resultados esses que se assemelham ao que foi

obtido no presente estudo

50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

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COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

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LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

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MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

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50

Tabela 1 - Soropositividade pela RIFI e resultado de PCR para N caninum em

bovinos em Ivaiporatilde- Paranaacute (2015)

Propriedad

e Rebanho

Total

coletado()

RIFI Titulo PCR

reag() neg min maacutex pos neg

1 48 20(416) 5(25) 15 100 1600 + (n=1) 19

2 59 20(338) 1(5) 19 1600 1600 0 20

3 82 20(243) 1(5) 19 100 100 0 20

4 28 20(714) 3(15) 17 100 400 0 20

5 69 20(289) 9(45) 11 200 1600 0 20

6 29 20(689) 3(15) 17 200 400 0 20

7 34 20(548) 7(35) 13 100 800 + (n=1) 19

8 43 20(465) 4(20) 16 100 400 0 20

9 46 20434) 3(15) 17 400 1600 0 20

10 69 20(289) 5(25) 15 100 400 0 20

11 32 20(625) 7(35) 13 200 800 0 20

12 75 20(266) 3(15) 17 200 400 0 20

13 70 20(285) 5(25) 15 100 1600 0 20

14 32 20(625) 5(25) 15 200 800 0 20

15 20 20(100) 5(25) 15 100 800 0 20

16 37 20(540) 1(5) 19 400 400 0 20

17 46 20(434) 1(5) 19 800 800 0 20

18 43 20(465) 5(25) 15 100 1600 0 20

19 41 20(487) 2(10) 18 100 400 0 20

20 36 20(555) 5(25) 15 100 800 0 20

Total 939 400 80 (2010) 319 100 1600 200 9800

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 54: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

51

Tabela 02ndash Comparaccedilatildeo de faixa etaacuteria nuacutemero de resultados positivos na RIFI e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos valor da estatiacutestica Qui-quadrado para o teste de associaccedilatildeo e valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel teste No posittotal Ocorrecircncia () Qui-quadrado () p

RIFI

Idade (meses)

Bezerras (0-12) 1290 1330 31053 02117

Novilhas (12-24) 2298 2244

Vacas (acima de 24) 46212 2169

Total 80400

() corrigido pelo efeito do desenho

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 55: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

52

Tabela 03 ndash Distribuiccedilatildeo das propriedades estudadas segundo seu tamanho

em hectares ndeg de animais produccedilatildeo diaacuteria ndeg de repeticcedilatildeo de cio

ndeg de abortos e ndeg de retenccedilatildeo de placenta Ivaiporatilde 2015

Propriedade Tamanho (hectares)

Ndeg de Animais

Produccedilatildeo diaacuteria (Litros)

Ndeg de Repeticcedilatildeo de cio

Ndeg de Abortos

Ndeg de Retenccedilatilde

o de Placenta

1 931 48 480 7 2 0

2 1694 59 520 10 1 2

3 2784 82 755 15 5 4

4 726 28 210 2 0 2

5 3414 69 800 15 3 3

6 242 29 160 10 2 0

7 2904 34 180 5 3 2

8 1089 43 150 4 2 2

9 121 46 400 10 2 2

10 242 69 600 12 3 4

11 121 32 80 2 1 3

12 1331 75 350 10 6 2

13 5445 70 640 8 3 3

14 859 32 330 20 4 1

15 482 20 80 2 1 1

16 1689 37 150 5 1 0

17 1452 46 160 2 0 1

18 121 43 400 10 2 4

19 242 41 270 15 1 0

20 726 36 200 8 1 1

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 56: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

53

Tabela 04 ndash Presenccedila de catildees positivos na propriedade nuacutemero de resultados positivos e total de exames realizados ocorrecircncia de resultados positivos segundo a presenccedila de catildees odds ratio de soropositividade intervalo de confianccedila de 95 valor de p para o teste de associaccedilatildeo pelo qui-quadrado corrigido pelo efeito do desenho (2015)

Variaacutevel No posittotal Ocorrecircncia () OR CI 95 p Presenccedila de catildees positivos na propriedade

Sim 946 196 144 04129 - 50563

00854

Natildeo 3746 8043

54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

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54

Tabela 05 - Soropositividade na RIFI e a titulaccedilatildeo para N caninum em catildees em Ivaiporatilde ndash Paranaacute (2015)

Propriedade Ndeg

Catildees Total

coletado

RIFI Titulo

reag min maacutex

1 8 6 0(000) _ _

2 4 3 1(3300) 50 50

3 5 3 0(000) _ _

4 2 2 1(5000) 6400 6400

5 6 6 1(2000) 3200 3200

6 2 1 0(000) _ _

7 4 1 1(10000) 800 800

8 3 0 0(000) _ _

9 2 0 0(000) _ _

10 6 2 1(5000) 400 400

11 4 2 0(000) _ _

12 3 2 0(000) _ _

13 2 1 1(10000) 400 400

14 4 4 1(2500) 100 100

15 2 1 0(000) _ _

16 5 3 0(000) _ _

17 6 5 1(2000) 50 50

18 1 1 0(000) _ _

19 4 2 1(5000) 200 200

20 4 1 0(000) _ _

Total 77 46 9(1960) 50 6400

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

60

ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

63

Page 58: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

55

CONCLUSOtildeES

- A PCR de sangue total revelou uma baixa positividade em bovinos e todos os

catildees foram negativos mostrando que a probabilidade de se detectar

parasitemia em estudos epidemioloacutegicos eacute baixa

- Natildeo houveram diferenccedilas significativas entre as variaacuteveis estudadas com a

soropositividade em catildees e bovinos

- Os resultados permitem concluir que anticorpos de N caninum estatildeo

presentes em bovinos e catildees na regiatildeo de Ivaiporatilde Paranaacute

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

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DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

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LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

61

62

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Page 59: SIMONE MARTINS SPITI - s3.amazonaws.com · SIMONE MARTINS SPITI TÍTULO: OCORRÊNCIA DE NEOSPORA CANINUM EM BOVINOS E CÃES DE PROPRIEDADES PRODUTORAS DE LEITE DE IVAIPORÃ – PR

56

Referecircncias

AGUIAR DM CAVALCANTE GT RODRIGUES AAR LABRUNA MB CAMARGO LMA CAMARGO EP GENNARI SM Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in cattle and dogs from Western Amazon Brazil in association with some possible risk factors Veterinary Parasitology v 142 n 1-2 p 71-77 2006 ANDREOTII R BARROS JC PEREIRA AR OSHIRO LM CUNHA RC NETO LFF Associaccedilatildeo entre soropositividade para Neospora caninum e o desempenho reprodutivo de novilhas de corte no Pantanal Sul-Mato-Grossense Brasil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria 201019119-23 ANDREOTTI R PINCKNEY RD PIRES PP SILVA EA Evidence of Neospora caninum in beef cattle and dogs in the State of Mato Grosso do Sul Center-Western region Brazil Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p 129-131 2004

ANDREOTTI R LOCATELLI-DITTRICH R SOCCOL V T PAIVA F Diagnoacutestico e controle da neosporose em bovinos EMBRAPA Documento 136 Campo Grande ndash MS 2003

BENETTI AH SCHEIN FB SANTOS TR TONIOLLO GH COSTA AJ MINEO JR LOBATO J SILVA DAO GENNARI SM Pesquisa de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos leiteiros catildees e trabalhadores rurais da regiatildeo sudoeste do estado de Mato Grosso Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria Jaboticabal v 18 p 29-33 2009

CAVIGLIONE JH KIIHLL R B CARAMORI P H OLIVEIRA D Cartas climaacuteticas do Paranaacute IAPAR Londrina 2000

CAMILLO G CADORE G CEZAR AS TOSCAN G BRAumlUNIG P SANGIONI LA VOGEL FSF Anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos de leite do sudoeste do estado do Paranaacute Arquivo Brasileiro Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v62 n6 p1511-1513 2010

COLLANTES-FERNAacuteNDEZ E ZABALLOS A AacuteLVAREZGARCIA G ORTEGA-MORA L M Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR Journal of Clinical Microbiology v40 p 1194-1198 2002

CORBELLINI LG DRIEMEIER D CRUZ CFE GONDIN LFP WALD V Neosporosis as a cause of obortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul southern Brazil Veterinary Parasitology 103 195-202 2002

CONRAD P A BARR B C SVERLOW K W ANDERSON M DAFT B KINDE H DUBEY J P MUNSON L amp ARDANS A In vitro isolation and characterization of a Neospora sp from aborted foetuses Parasitology v 106n 3 p 239-249 1993

57

DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

58

LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

59

SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

Fonte Wikipeacutedia

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DUBEY JP Review of Neospora caninum and neosporosis in animals Korean Journal of Parasitology v 41 n 1 p 1-16 2003

DUBEY JP SCHARES G ORTEGA-MORA LM Epidemiology and Control of neosporosis and Neospora Caninum Clinical Microbiology Reviews v 20 n 2 p 323-367 2007

DUBEY JP SCHARES G Neosporosis in animals ndash The last five years Veterinary Parasitology 180 90-108 2011

DYER R M JENKINS M C KWOK O C H DOUGLAS L W amp DUBEY J P Serologic survey of Neospora caninum infection in a closed dairy cattle herd in Maryland risk of serologic reactivity by production groups Veterinary Parasitology v 90 n 3 p 171-181 2000 FERNANDES BCTM GENNARI SM SOUZA SLP CARVALHO JM OLIVEIRA WG CURY MC Prevalence of anti-Neospora caninum antibodies in dogs from urban periurban and rural areas of the city of Uberlacircndia Minas Gerais Brazil Veterinary Parasitology v123 n 1-2 p33-40 2004

GUIMARAtildeES JUNIOR JS SOUZA SLP BERGAMASCHI DP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their presence in dairy cattle of the north of Paranaacute state Brazil Veterinary Parasitology 124 1-8 2004

HEMPHILL A amp GOTTSTEIN B A European perspective on Neospora caninum International Journal of Parasitology v 30 n 8 p 1887-1924 2000 INNES E A BUXTON D MALEY S WRIGHT S MARKS J ESTEBAN I RAE A SCHOCK A amp WASTLING J Neosporosis Aspects of epidemiology and host immune response Annals of the New York Academic Science v 916 n 93 p 93-101 2000

KAMGA-WALADJO AR GBATI OB KONE P LAPO RA CHATOGNON G BAKOU SN ET AL Seroprevalence of Neospora caninum antibodies and its consequences for reproductive parameters in dairy cows from Dakar-Senegal West Africa Tropical Animal Health Production 201042953-9

LANGONI H ET AL Avaliaccedilatildeo soroloacutegica para Neospora caninum em propriedades de bovinos leiteiros com alteraccedilotildees reprodutivas Veterinaacuteria e Zootecnia 2013 mar 20(1) 124-130

LANDMANN JK GUNN AA OrsquoDONOGHUE PJ TRANTER WP MCGOWAN MR Epidemiology and impact of Neospora caninum infection in three Queensland tropical dairy cattle Reproduction in Domestic Animals 46 734-737 2011

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LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

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LOCATELLI-DITTRICH R THOMAZ-SOCCOL V RICHARTZ RRTB GASINO-JOINEAU ME VAN DER VINNE R PINCKNEY RD Isolamento de Neospora caninum de feto bovino de rebanho leiteiro no Paranaacute Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaacuteria v 13 n3 p103-109 2004

MACALDOWIE C MALEY SW WRIGHT S BARTLEY P ESTEBAN-REDONDO I BUXTON D ET AL Placental pathology associated with fetal death in cattle inoculated with Neospora caninum by two different routes in early pregnancy Journal of Comparative Pathology 2004131142-56

MELO C B LEITE R C SOUZA G N amp LEITE R C Frequumlecircncia de infecccedilatildeo por Neospora caninum em dois diferentes sistemas de produccedilatildeo de leite e fatores predisponentes agrave infecccedilatildeo em bovinos em Minas Gerais Revista Brasileira Parasitologia Veterinaacuteria v 10 n 2 p 67-74 2001

MOTA RA FERRE I FARIA EB Situaccedilatildeo da neosporose no Brasil e meacutetodos de diagnoacutestico Medicina Veterinaacuteria Recife v2 n1 38-48 2008

MONTEIRO S G Parasitologia na Medicina Veterinaacuteria 1ordf Ed Satildeo Paulo Rocca p151 ndash 153 2010

MUumlLLER N VONLAUFEN N GIANINAZZI C LEIB S L HEMPHILL A Application of real-time fluorescent PCR for quantitative assessment of Neospora caninum infections in organotypic slice cultures of rat central nervous system tissue Journal of Clinical Microbiology v 40 p 252-255 2002

OLIVEIRA VSF AacuteLVAREZ-GARCIA G ORTEGA-MORA LM BORGES LMF SILVA AC Abortions in bovines and Neospora caninum transmission in an embryo transfer center Veterinary Parasitology 173 206-210 2010

PAREacute J HIETALA SK THURMOND MC An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp infection in cattle Journal of Veterinary Diagnostic Investigation v7 p352-359 1995 PITEL P H PRONOST S CHATAGNON G TAINTUNIER D FORTIER G amp BALLET J J Neosporosis in bovine dairy herds from the west of France detection of Neospora caninum DNA of abortes fetuses seroepidemiology of Ncaninum in cattle and dogs Veterinary Parasitology v 102 n 4 p 269-277 2001 ROMANELLI PR FREIRE RL VIDOTTO O MARANA ERM OGAWA L DEPAULA VSO GARCIA JL NAVARRO IT Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in sheep and dogs from Guarapuava farms Paranaacute State Brazil Research in Veterinary Science v 82 n 2 p 202-207 2007 RITTA NETO A S Anaacutelise da conjuntura agropecuaacuteria ndash Agrometeorologia ndash Safra 201011 ndash PARANAacute SEABDERAL 2010

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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

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SANDERSON M W GAY J M amp BASZLER T V Neospora caninum seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in northwestern United States Veterinary Parasitology v 90 n 1-2 p 15-24 2000 SOUZA SLP GUIMARAtildeES JR JS FERREIRA F DUBEY JP GENNARI SM Prevalence of Neospora caninum antibodies in dogs from dairy cattle farms in Parana Brazil Journal of Parasitology v 88 n 2 p408- 409 2002 THURMOND MC HIETALA SK Culling associated with Neospora caninum infection in dairy cows American Journal of Veterinary Research 1996571559-62 httpwwwcidadesibgegovbrxtrasperfilphplang=ampcodmun=411150ampsearch=||infogrE1ficos-informaE7F5es-completas httpwwwipardesgovbrcadernosMontaCadPdf1phpMunicipio=86870

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ANEXOS

Figura 1 - Localizaccedilatildeo do municiacutepio de Ivaiporatilde ndash Pr

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