Espécie ID gene recA ID MALDI-TOF

n/%

Não identificadas

n/%

B. cenocepacia 49 20 / 24% 11 / 21,7%

B. multivorans 12 3 / 3,6% 5 / 6%

B. vietnamiensis 10 3 / 3,6% 1 / 1,2%

B. lata 6 0 1 / 1,2%

B. pyrrocinia 3 0 0

B. ambifaria 1 0 1 / 1,2%

B. contaminans 1 0 0

B. stabilis 1 0 0

MH07 - 032

Análise comparativa entre o sequenciamento do gene recA

e a técnica de MALDI-TOF na identificação de espécies do

complexo Burkholderia cepacia

LORENA C.C. FEHLBERG1; RODRIGO CAYÔ1; DIEGO M. ASSIS2; ROSANA H. V. PEREIRA3; LUIS J. NETO3; ANA C. GALES1; ELIZABETH A. MARQUES3

1. Laboratório Alerta, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo/SP

2. Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo/SP

3. Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), Rio de Janeiro/RJ

RESUMO MODIFICADO

Introdução: A identificação rápida e confiável de bactérias isoladas de amostras clínicas é de extrema importância para guiar a terapia antimicrobiana. A espectrometria de massa por MALDI-TOF (matrix assisted lazer desorption/ionization - time of flight) (MT) permite a análise

de macromoléculas biológicas, as quais podem ser um importante marcador na classificação e identificação de microorganismos. Objetivo: Comparar o sequenciamento do gene recA e a técnica de MT na identificação de isolados clínicos do complexo Burkholderia cepacia (CBc). Metodologia: Foram analisadas 83 amostras pertencentes ao CBc (49 B. cenocepacia; 10 B. vietnamiensis; 12 B. multivorans; 6 B. lata; 3 B. pyrrocinia; 1 B. contaminans; 1 B. stabilis; 1 B. ambifaria), previamente identificadas pelo sequenciamento do gene recA,

considerado método padrão-ouro para a identificação do CBc. Posteriormente, foi realizada a identificação pela técnica de MT. A extração de proteínas totais foi realizada em duas etapas. A 1ª etapa consistiu na lavagem da colônia isolada com água:etanol (3:1) seguida de

centrifugação (2 min/13.000 rpm). A 2ª etapa consistiu na ressuspensão do sedimento em 50 uL de ácido fórmico 70% e 50 uL de acetonitrila, seguida de centrifugação (2 min/13.000 rpm). Em uma placa de aço inox de 96 poços, foi inoculado 1 µL do sobrenadante de cada

amostra, em triplicata, seguido de 1 µL da matriz ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg/ml). As amostras foram analisadas em espectrômetro de massa Microflex LT (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) utilizando o programa MALDI-Biotyper 2.0. Como controle da

extração e da identificação foi utilizada a cepa B. cepacia ATCC 25608. Resultados: O MT não conseguiu identificar 23% (n=19) das amostras e em 45,7% (n=38) dos casos somente foi possível a identificação do gênero Burkholderia. Em 27/38 amostras (70,9%), o sistema MT

reportou de 2 a 3 espécies de Burkholderia em uma mesma amostra, sendo que em 10/27 (37%) isolados nenhuma identificação da espécie foi concordante com a identificação genotípica. A concordância entre as duas técnicas utilizadas para a identificação da espécie foi

observada em 45,7% dos isolados. O tempo médio gasto para a análise de uma placa de MT foi de 2 horas e 30 minutos. Conclusão: O sistema MT não apresentou boa concordância na identificação das espécies do CBc e, além disso, o tempo gasto na identificação foi

superior ao reportado na literatura.

INTRODUÇÃO

O complexo Burkholderia cepacia (CBc) constitui um grupo de microrganismos Gram-negativos não fermentadores da

glicose amplamente encontrados no meio ambiente. Embora a maioria das espécies deste gênero tenha sido descrita

inicialmente como fitopatógenos, estes microrganismos têm sido identificados com uma frequência cada vez maior

como patógenos oportunistas em unidades hospitalares. A principal patologia associada às infecções causadas por

espécies do CBc é a “síndrome cepacia”, um quadro séptico muito frequente em pacientes com fibrose cística,

caracterizado por um declínio da função pulmonar, com posterior bacteremia e, em muitos casos, o óbito [1].

Atualmente, o CBc é formado por 17 espécies, as quais apresentam aproximadamente 95% de similaridade genética,

de acordo com estudos realizados com o sequenciamento do gene recA. As espécies que fazem parte do CBc são: B. ambifaria, B. anthina, B. arboris, B. cenocepacia, B. cepacia, B. contaminans, B. diffusa, B. dolosa, B. lata, B. latens, B. metallica, B. multivorans, B. pyrrocinia, B. seminalis, B. stabilis, B. ubonensis e B. vietnamiensis [1].

As espécies que constituem o CBc, bem como outras espécies da família Burkholderiaceae, apresentam crescimento

lento em meios de cultura e, muitas vezes, o seu isolamento a partir de amostras clínicas é dificultado pelo crescimento

mais rápido de outros microrganismos que podem estar presentes na amostra. Além disso, a identificação laboratorial a

partir de provas bioquímicas manuais ou com sistemas disponíveis comercialmente geralmente é difícil e conflitante,

pois algumas espécies bacterianas não estão presentes no banco de dados destes sistemas. Por outro lado, as técnicas

moleculares, apesar da sua alta acurácia, não são amplamente acessíveis aos laboratórios de microbiologia clínica [2].

A identificação rápida e confiável de agentes infecciosos a partir de amostras clínicas constitui um fator de extrema

importância para introdução da terapia antimicrobiana adequada. Atualmente, a espectrometria de massa por MALDI-

TOF (Matrix Assisted Laser Dessorption Ionization/Time-of-Flight) tem sido cada vez mais utilizada para a identificação

de microrganismos, podendo ser aplicada para a identificação de bactérias Gram-negativas, Gram-positivas, leveduras

e fungos filamentosos. É considerado um método rápido, prático, barato, sendo baseado nos espectros de massa

espécie-específicos, os quais contem predominantemente proteínas conservadas do DNA ribossomal [3]. Os espectros

de massa gerados de acordo com o perfil protéico da amostra são comparados com uma série de espectros

depositados no banco de dados do software Biotyper MALDI 2.0 para, então, determinar a espécie bacteriana.

O objetivo deste trabalho foi comparar a acurácia da espectrometria de massa MALDI-TOF com o sequenciamento do

gene recA na identificação de espécies pertencentes ao CBc.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisadas 83 amostras clínicas pertencentes ao CBc (Figura 1), previamente identificadas pelo

sequenciamento do gene recA, considerado o método padrão-ouro para a identificação destas espécies. Estes isolados

foram coletados de diferentes sítios corpóreos de pacientes atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto,

Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

As amostras foram semeadas em ágar Burkholderia cepacia, suplementado com polimixina 75.000 IU, gentamicina

2,5 mg e ticarcilina 50 mg (Oxoid; Basingstoke; Inglaterra). Após o isolamento bacteriano, foi realizada a extração das

proteínas de acordo com o esquema apresentado na Figura 2. Cada amostra foi inoculada em triplicata em uma placa

de aço inox e, posteriormente, esta placa foi introduzida no espectrômetro de massas Microflex LT MALDI-TOF (Bruker

Daltonics, Alemanha). Os resultados foram analisados no software MALDI Biotyper versão 2.0 (Bruker Daltonics,

Alemanha). Conforme especificado pelo fabricante, os critérios para a identificação bacteriana são: scores ≥ 2 e entre

1.7 e 1.9 foram considerados como identificação confiável para a espécie e para o gênero bacteriano, respectivamente,

enquanto scores de identificação abaixo de 1.7 foram considerados como não confiáveis, não sendo possível realizar a

identificação bacteriana. Como controle da extração e da leitura das proteínas, foi utilizada a cepa Burkholderia cepacia ATCC 25608.

1

49

1

6

12

3

1

10

B. ambifaria

B. cenocepacia

B. contaminans

B. lata

B. multivorans

B. pyrrocinia

B. stabilis

B. vietnamiensis

Figura 1. Distribuição das espécies bacterianas do complexo Burkholderia cepacia analisadas neste estudo. RESULTADOS

Figura 2. Demonstração da técnica de extração das proteínas e princípio da identificação dos microrganismos pela espectrometria de massa

MALDI-TOF.

Tabela 1. Identificação das espécies bacterianas do complexo Burkholderia cepacia pela espectrometria de

massa MALDI-TOF em comparação com o sequencimento do gene recA.

A concordância entre as duas técnicas utilizadas para identificação do gênero Burkholderia foi observada em 64 (77%)

amostras. Entretanto, não foi possível realizar a identificação bacteriana pelo MALDI-TOF em 19 (23%) isolados

estudados (Figura 3).

Em 38 isolados (45,7%) somente foi possível realizar a identificação correta do gênero Burkholderia, sendo as espécies

discordantes com as identificadas pelo sequenciamento do gene recA. Em 27 das 38 amostras (70,9%) o MALDI-TOF

reportou de duas a três espécies diferentes de Burkholderia para uma mesma amostra, sendo que em 37% (10/27) dos

isolados nenhuma identificação da espécie foi concordante com a identificação genotípica.

Os espectros de massa gerados a partir das espécies sabidamente identificadas pelo gene recA demonstram que a

dificuldade na diferenciação interespécies pode ser ocasionada pela alta semelhança entre os picos de massa para as

diferentes espécies estudadas, conforme demonstrado na Figura 4.

Identificado

Não identificado

23%(n=19)

77%

(n=64)

A 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Gênero Gênero+espécie

45,7

31,3

CONCLUSÃO

A identificação das espécies dentro do CBc pelo MALDI-TOF foi abaixo do reportado na literatura [4];

O tempo de leitura de uma placa contendo 96 poços foi de, aproximadamente, 2 horas e 30 minutos, tempo superior

ao reportado na literatura [5];

A dificuldade na diferenciação das espécies do CBc pode ser ocasionada pela semelhança entre os espectros de

massa destas espécies;

Apesar de inúmeras tentativas diferentes de extração das proteínas e inúmeras repetições, não foi possível realizar a

identificação bacteriana em 23% dos isolados de CBc estudados.

B

Figura 3. Distribuição dos resultados obtidos a partir do MALDI-TOF para a identificação bacteriana do complexo Burkholderia cepacia. A. Porcentagem de amostras identificadas e não identificadas pelo MALDI-TOF. B. Porcentagem de amostras as quais o

MALDI-TOF foi capaz de identificar somente o gênero e o gênero e a espécie.

26

05

.05

9

65

05

.75

6

44

11

.87

3

71

69

.35

2

48

04

.35

8

35

89

.25

9

76

96

.41

3

32

58

.08

3

96

09

.92

4

82

65

.17

4

51

92

.98

1

* Burkholderia ambifaria_alerta\0_E7\1\1SLin

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

51

96

.50

9

73

84

.30

4

64

90

.97

9

44

10

.90

1

26

03

.07

3

48

04

.87

9

36

95

.13

2

96

00

.40

8

* Burkholderia ATCC_alerta\0_F7\1\1SLin

0

1000

2000

3000

Inte

ns. [a

.u.]

73

83

.15

9

51

95

.67

7

64

90

.48

1

44

09

.54

4

48

03

.95

3

95

98

.59

3

36

95

.30

1

26

04

.45

5

* Burkholderia cenocepacia_alerta\0_E4\1\1SLin

0

1000

2000

3000

Inte

ns. [a

.u.]

51

97

.06

1

26

05

.19

3

44

11

.46

3

48

04

.81

0

64

91

.30

4

35

89

.72

4

72

88

.37

4

96

08

.54

3

* Burkholderia lata_alerta\0_F1\1\1SLin

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [a

.u.]

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000m/z

51

96

.15

0

26

04

.50

7

65

07

.38

0

35

88

.85

4

48

04

.13

0

73

08

.23

9

44

03

.78

9

95

83

.23

2

* Burkholderia pyrrocinia_alerta\0_E1\1\1SLin

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

52

00

.23

6

26

04

.97

3

65

11

.78

5

44

10

.97

0

48

07

.88

2

73

07

.30

4

35

69

.14

5

96

01

.48

0

* Burkholderia stabilis_alerta\0_F10\1\1SLin

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [a

.u.]

51

96

.61

2

26

04

.93

2

64

92

.22

5

35

89

.39

1

44

11

.82

1

48

04

.53

4

73

02

.22

5

95

86

.75

4

* Burkholderia vietnamiensis_alerta\0_E10\1\1SLin

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

51

97

.08

6

48

05

.33

2

65

05

.86

6

26

05

.69

9

44

12

.29

3

35

89

.99

7

96

08

.57

6

73

11

.34

6

* Burkholderia multivorans_alerta\0_F4\1\1SLin

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000m/z

Figura 4. Espectros de massa gerados a partir do software MALDI Biotyper 2.0 para as amostras do complexo Burkholderia cepacia estudadas.

Referências

1. Sousa SA, CG Ramos, JH Leitão. 2011. Inter J Microbiol. ID607575. [Epub ahead of print].

2. Shelly DB, T Spilker, EJ Gracely, T Coenye, P Vandamme, JJ LiPuma. 2000. J Clin Microbiol. 38: 3112-3115.

3. JO Lay, Jr. 2001. Mass Spectrometry Rev. 20: 172-194.

4. Degand N, E Carbonnelle, B Dauphin, JL Beretti, M Le Bourgeois, I Sermet-Gaudelus, C Segonds, P Berche, X Nassif, A Ferroni. 2008. J Clin Microbiol. 46: 3361-3367.

5. Mellmann A, J Cloud, T Maier, U Keckevoet, I Ramminger, P Iwen, J Dunn, G Hall, D Wilson, P LaSala, M Kostrzewa, D Harmsen. 2008 J Clin Microbiol. 46:1946-1954.

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