Subsídio - Oxidação de Alfa Ácidos No Lúpulo

7/21/2019 Subsdio - Oxidao de Alfa cidos No Lpulo

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Universidade de So Paulo

Instituto de Qumica de So Carlos

Reatividade de iso--cidos e seus derivadoshidrogenados frente ao radical 1-hidroxietila:

implicaes na perda de qualidade sensorial dacerveja

Natlia Ellen Castilho de Almeida

Dissertao apresentada ao Instituto deQumica de So Carlos, da Universidade deSo Paulo, como um dos requisitos para oobteno do ttulo de Mestre em Cincias.

rea de Concentrao: Qumica Analtical

Orientador: Prof. Dr. Daniel Rodrigues Cardoso

So Carlos2011


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Este exemplar foi revisado e alteradoem relao verso original, sob aexclusiva responsabilidade do autor.

So Carlos, 11/03/2011

___________________________

Natlia Ellen Castilho de Almeida


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DEDICATRIA

Aos meus pais, Antnio e lia, e ao

meu irmo Kayo, pelo apoio, incentivo

constante e amor. A minha av Maria

pelos ensinamentos e carinho.

Ao meu namorado Gustavo Metzker

pelo carinho, apoio, conselhos e

ajuda.


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EPGRAFE

"A diferena entre o possvel e o

impossvel est na vontade humana"

(Louis Pasteur)


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AGRADECIMENTOS

Agradecimentos

Agradeo primeiramente a Deus por me acompanhar sempre. O meu Deus

o Deus do impossvel.

Ao Prof. Dr. Daniel R. Cardoso pela orientao e ensinamentos. Ao Prof. Dr.

Douglas W. Franco pela infra-estrutura utilizada.

Aos amigos Clayston e Tatiane (Fefe) por compartilharem momentos bons e

difceis.

A Rafaela e Leandro pelo companheirismo desde 2004 (Turma de

Bacharelado do IQSC-USP).

Aos colegas do Laboratrio da Qumica da Aguardente e Laboratrio de

Qumica Analtica e Inorgnica, IQSC-USP, pela convivncia. Em especial, agradeo

ao Wendel Aquino, Fernanda Seixas, Juliana Grippa e Andr (Barbie) pela ajuda e

amizade.

Ao Sr. Julio Landmann (Hopsteiner) pela gentileza de doar o extrato de lpulo

isomerizado.

Ao Prof. Dr. Antnio Gilberto Ferreira e Eduardo Sanches pela disponibilidade

na realizao dos experimentos de ressonncia magntica nuclear (DQ - UFSCar).

Ao Instituto de Qumica de So Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo

(USP) pela oportunidade.

Ao Prof. Dr. Antonio C. Burtoloso e a Viviana pela ajuda nas snteses (IQSC -

USP).

A FAPESP pelo auxlio financeiro.


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SUMRIO

SUMRIO

Lista de EsquemasLista de Figuras

Lista de Tabelas

Abreviaturas

Resumo

Abstract

1. INTRODUO 18

2. OBJETIVOS 333. MATERIAL E MTODO 34

3.1. Reagentes 34

3.2. Isolamento das trans-isohumulonas 35

3.3. Isolamento das cis-isohumulonas 36

3.4. Preparo das dihidro-isohumulonas 37

3.5. Preparo das tetrahidro-isohumulonas 38

3.6. Caracterizao qumica dos compostos 39

3.6.1. Estudo eletroqumico das isohumulonas 40

3.7. Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical1-hidroxietila

41

3.7.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao eestabilidade do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

41

3.7.2. Determinao das constantes de velocidade aparentesdecorrentes das reaes dos compostos de interesse frente ao radical1-hidroxietila

43

3.8. Clculo quntico, ab initio DFT, na determinao daspropriedades eletrnicas das isohumulonas

45

3.9. Caracterizao qumica dos produtos da reao entre oradical 1-hidroxietila e os iso--cidos

46

4. RESULTADOS E DISCUSSO 47

4.1. Isolamento das isohumulonas 47

4.2. Preparo dos derivados reduzidos/hidrogenados dasisohumulonas

48


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SUMRIO

4.2.1. Preparo das dihidro-isohumulonas 48

4.2.2. Preparo das tetrahidro-isohumulonas 49

4.3. Caracterizao qumica das isohumulonas isoladas e seus

derivados reduzidos/hidrogenados

50

4.3.1. Caracterizao qumica das trans-isohumulonasisoladas

50

4.3.2. Caracterizao qumica das cis-isohumulonas isoladas 57

4.3.3. Caracterizao qumica das dihidro-isohumulonas 61

4.3.4. Caracterizao qumica das tetrahidro-isohumulonas 65

4.3.5. Estudo eletroqumico das isohumulonas 70

4.4. Reatividade dos iso--cidos e seus derivados e algunsfenis frente o radical 1-hidroxietila

73

4.4.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao do adutoradical [4-POBN/CH(CH3)OH]

73

4.4.2. Estudos com o radical 1-hidroxietila: estabilidade doaduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

79

4.4.3. Estudos com o radical 1-hidroxietila: determinao dasconstantes de velocidades aparentes da reao entre o radical

1-hidroxietila e os compostos de interesse

83

4.4.3.1. Reatividade dos iso--cidos e seus derivados frenteo radical 1-hidroxietila

85

4.4.3.2. Reatividade de alguns fenis frente ao radical 1-hidroxietila

93

4.5. Identificao dos produtos de reao 96

4.6. Mecanismo da reao 99

5. CONCLUSES 102

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 105

APNDICES


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LISTA DE ESQUEMAS

Lista de Esquemas

Esquema 1. Reao de isomerizao trmica das humulonas cis-(2-ac) e trans-isohumulonas (1-ac) durante o cozimento do mostofermentado e adicionado de lpulo. A relao trans-/cis-ishumulonas emcondies normais de fabricao da cerveja de 32:68. (a) iso-n-humulona, (b) isocohumulona, (c) isoadhumulona

23

Esquema 2. Reao de degradao fotoqumica dos iso--cidos emcerveja

27

Esquema 3. Formao e reaes subseqentes dos radicais1-hidroxietila, em destaque, e 2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o

proposto dor Andersen e Skibsted

30

Esquema 4.Reao de Fenton 31

Esquema 5. Reao de formao do spin radical [4-POBN/CH(CH3)OH] 41

Esquema 6. Ilustrao da reao de competio entre a armadilhaqumica 4-POBN e a isohumulonas pelo radical 1-hidroxietila

44

Esquema 7. Reao de formao das espcies aduto oxidado e4-POBN ligado a duas molculas de radical 1-hidroxietila

82

Esquema 8. Esquema de reao propondo o efeito de polifeniscontendo o grupo catecol na oxidao do etanol no vinho e na cerveja.Adaptado de Elias e Andersen

96

Esquema 9. Mecanismo proposto para a reao entre as isohumulonase o radical 1-hidroxietila

101


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LISTA DE FIGURAS

Lista de Figuras

Figura 1. Consumo mdio anual de cerveja per capita por pas e grficoda distribuio de bebidas alcolicas no mercado brasileiro 18

Figura 2. Fluxograma do processo industrial cervejeiro 19

Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) n-lupulona, (1b) colupulona, (1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b)cohumulona, (2c) adhumulona

22

Figura 4. Estrutura qumica das isohumulonas em sua forma molecular(a) e aninica (b)

24

Figura 5. Estrutura qumica da dihidro-isohumulonas (1a-c) e tetrahidro-isohumulonas (2a-c), derivados reduzidos e hidrogenados dos iso--cidos, respectivamente. (1a) dihidro-iso-n-humulona, (1b) dihidro-isocohumulona, (1c) dihidro-isoadhumulona, (2a) tetrahidro-iso-n-humulona, (2b) tetrahidro-isocohumulona, (2c) tetrahidro-isoadhumulona

28

Figura 6. Estrutura qumica de alguns fenis presentes na cerveja. (a)quercetina, (b) morina, (c) kaempferol, (d) cido p-cumrico, (e) cidoclorognico, (f) cido cafeico

32

Figura 7. Ilustrao esquemtica da separao dos diastereoismeros

por complexao com a -ciclodextrina

48

Figura 8. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos dareao dihidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planarutilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico (1:4 v/v)acidificado com cido actico como fase mvel. (R) reao; (M) mistura;(P) precursores

49

Figura 9. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos dareao tetrahidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planar

utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico (1:1 v/v)acidificado com cido actico como fase mvel.(R) reao; (M) mistura;(P) precursores

50

Figura 10. Espectro eletrnico de absoro das trans-isohumulonasisoladas em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluoaquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de trans-isohumulonas de 3,210-5mol L-1

51


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LISTA DE FIGURAS

Figura 11. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercialcontendo as isohumulonas, formas cis- e trans- (em vermelho) e dastrans-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans-coisohumulona referente ao pico 2, tr= 11,4

min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans-iso-n-humulonareferente ao pico 4, tr= 16,5 min

52

Figura 12. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das trans-isohumulonasisoladas, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezaspresentes na amostra

54

Figura 13. Cromatograma caracterstico das trans-isohumulonas emmeio alcolico (5,0 10-3mol L-1) submetido a separao em uma colunaLUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da fase mvel2,5 mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de

monitoramento = 270 nm

55

Figura 14. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 1 contendo trans-isohumulona

56

Figura 15. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 2 contendo trans-isohumulonas

56

Figura 16. Espectro eletrnico de absoro das cis-isohumulonasisoladas em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluoaquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 4,6 10-5mol L-1

57

Figura 17. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercialcontendo as isohumulonas, formas cis- e trans-, (em vermelho) e das cis-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas (ESI(-)MS) daespcie cis-isocohumulona referente ao pico 1, tr= 10,5 min. (c) Espectrode massas (ESI(-)MS) das espcies cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr= 14,7 min. Os sinais marcados com (*)indicam impurezas presentes na amostra

58

Figura 18. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das cis-isohumulonasisoladas, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas

presentes na amostra

59

Figura 19. Cromatograma caracterstico das cis-isohumulonas em meioalcolico (1,0 10-3mol L-1) submetido a separao em uma coluna LUNAC-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da fase mvel 2,5mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda demonitoramento = 270 nm

60

Figura 20. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 1 contendo cis-isohumulonas

61

Figura 21. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo diretada frao 2 contendo cis-isohumulonas

61


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LISTA DE FIGURAS

Figura 22. Espectro eletrnico de absoro das dihidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL desoluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 2,3 10-5mol L-1

62

Figura 23. (a) Cromatograma de ons total das dihidro-isohumulonas. (b)Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr= 6,3 e 7,6 min. (c) Espectrode massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-iso-n-humulonareferente aos picos 3 e 4, tr= 8,2 e 10,0 min. (d) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie cis- e trans-dihidro-isoadhumulona referente aospicos 5 e 6, tr= 11,7 e 15,1 min

63

Figura 24. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das dihidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam

impurezas presentes na amostra

65

Figura 25. Espectro eletrnico de absoro das tetrahidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em meio etanol. Concentrao de 2,3 10-5mol L-1

66

Figura 26. (a) Cromatograma de ons total das tetrahidro-isohumulonas,formas cis- e trans-. (b) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espciecis- etrans-tetrahidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr= 19,2 e 21,5min., respectivamente. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espciescis- e trans-tetrahidro-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr= 26,0 min.(d) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espcies cis- e trans-tetrahidro-

isoadhumulona referente ao pico 4, tr= 29,6 min

68

Figura 27. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das tetrahidro-isohumulonas,formas cis- e trans-, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicamimpurezas presentes na amostra

69

Figura 28. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua formaaninica, em acetonitrila contendo 0,2 mol L-1 de perclorato detetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante dopadocom boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia

interna). A velocidade de varredura foi 50 mV s

-1

71

Figura 29. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua formamolecular, em acetonitrila contendo 0,2 mol L-1 de perclorato detetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante dopadocom boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (refernciainterna). As velocidades de varredura foram: a = 10 mV s-1,b = 50 mV s-1,c = 100 mv s-1, d = 200 mV s-1

72


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LISTA DE FIGURAS

Figura 30. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes dareao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

sobatmosfera de O2. T = 25

0 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas(ESI(+)MS) do eluato em tr= 6 min referente espcie 4-POBN

74

Figura 31. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes dareao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

sobatmosfera de Ar. T = 250 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas(ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr = 7,9 min. (c)Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr= 8,6 min. (d) Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos onsdo eluato em tr = 9,2 min. (e) Espectro de massas (ESI(+)MS) comatribuio dos ons do eluato em tr= 12,8 min

77

Figura 32. Estruturas qumicas das quatro espcies formadas da reaoentre 4-POBN e o radical 1-hidroxietila: (a) aduto oxidado; (b) adutoradical; (c) e (d) 4-POBN ligado a duas molculas do radical 1-hidroxietil;(e) aduto reduzido

77

Figura 33. Espectro de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE)registrado em banda-X (9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

obtido em soluo aquosa gua/etanol ( 5%) atemperatura de 250C

78

Figura 34. Decaimento do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] na

presena e ausncia de catalase (47,4 mg mL-1). T = 250C

80

Figura 35. rea dos picos cromatogrficos referentes s espcies adutooxidado, aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

e 4-POBN contendo duasmolculas do radical 1-hidroxietila em funo do tempo de reao e napresena de catalase

81

Figura 36. Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] vs. concentrao de trans-isohumulonas. Medidas obtidas por espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS e espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons

(EPR). T = 25

o

C; 1 minuto de reao

85

Figura 37. Configurao espacial das cis-isohumulonas (a) e trans-isohumulonas (b), com os respectivos momentos de dipolo eltrico

90

Figura 38. Ilustrao dos orbitais moleculares ocupados de maiorenergia (HOMO) calculados para os diastereoismeros cis- (a) e trans-isohumulonas (b)

91

Figura 39. Representao das ligaes C-H envolvidas na abstrao dotomo de hidrognio na reao. (a) trans-isohumulonas; (b) cis-isohumulonas

92


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LISTA DE FIGURAS

Figura 40. Espectro de on isolado 240,1 m/z decorrente da reao doradical 1-hidroxietila e 4-POBN (pico 1), na presena de cidoclorognico (pico 2) ou cido cafeico (pico 3). As injees foramrealizadas em batelada

94

Figura 41. Espectros de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE)registrados em banda-X (9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

decorrente da reao controle (em preto), reaoprocessada na presena cido clorognico (em vermelho) e reaoprocessada na presena do cido cafeico (em azul). Os espectros foramobtidos a temperatura de 25oC

95

Figura 42. (a) Cromatogramas de ons total da soluo alcolicacontendo as trans-isohumulonas (em vermelho) e dos produtos

decorrentes da reao das trans-isohumulonas e o radical 1-hidroxietila(em azul),sob atmosfera de Ar, T = 250C, t = 1 minuto de reao. (b)Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio do on do eluato em t r=17,7 min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio do on doeluato em tr= 21,5 min

98


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LISTA DE TABELAS

Lista de Tabelas

Tabela 1. Percentuais de isohumulonas no extrato de lpulo pr-isomerizado 53

Tabela 2. Dados cinticos com respeito ao decaimento do aduto radical[4-POBN/CH(CH3)OH]

no meio reacional e a temperatura de 25 0C80

Tabela 3. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical1-hidroxietila e os iso--cidos e seus derivados, em sua forma aninica,determinadas por EPR e ESI-(+)-MS/MS, em 1 minuto de amostragem

86

Tabela 4. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical1-hidroxietila e as iso-n-humulonas, em sua forma molecular,determinadas ESI-(+)-MS/MS, em 1 minuto de amostragem

88

Tabela 5. Propriedades eletrnicas dos diastereismeros cis- e trans-iso--cidos, em sua forma molecular, calculadas usando o mtodo M06/6-31+G(d)

89


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ABREVIATURAS

Abreviaturas

4-POBN - -4-piridil-1-xido-N-tert-butilnitrona-CD - -ciclodextrina

BDE - Bond Dissociation Energy

CDCl3 - Clorofrmio deuterado

CID - Colision Induced Dissociation

ESI-MSn - Espectrmetro de Massas

DFT - Density Functional Theory

IEF-PCM - Integral Equation Formalism as PolarizableContinuum Model

HER - 1-hydroxyethyl radical1H RMN - Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio

HOMO - Highest Occuped Molecular Orbital

IAA - Iso--cidos

LC-MSn - Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

MBT - 3-metil-but-2-eno-1-tiolNHE - Normal hydrogen electrode

Rf - Riboflavina 5-monofosfato de sdio

RPE - Ressonncia Paramagntica de eltrons


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RESUMO

RESUMO

Os iso--cidos so os principais constituintes responsveis pelo sabor amargo da

cerveja, sendo estes facilmente degradados durante o seu processo de

envelhecimento ou exposio a radiao luminosa, em particular o diastereoismero

trans-. O radical 1-hidroxietila o radical majoritrio formado na cerveja durante o

processo de envelhecimento. O presente trabalho descreve a reatividade dos iso--

cidos frente ao radical 1-hidroxetila atravs do uso da tcnica de spin-trappingcom

deteco por espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE) e

espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS). Observou-se que ambos os

diastereoismeros cis-e trans-iso--cidos so degradados na presena do radical

1-hidroxietila com constantes de velocidade aparentes de 1,8 108e 9,2 109L mol-1s-

1, respectivamente. A reatividade dos dihidro-iso--cidos com o radical estudado foi

similar reatividade da mistura diastereoisomrica dos iso--cidos, apresentando

constante de velocidade aparente de 1,5 109L mol-1s-1. Os anlogos tetrahidro-iso-

-cidos no apresentaram reatividade para com o radical 1-hidroxietila, sugerindo

os hidrognios allicos como stio reacional. Adicionalmente, os clculos ab initiopor

DFTdemonstraram que os valores de BDEpara os hidrognios allicos das cadeias

laterais prenila e isohexenoila so equivalentes e, desta maneira, sugerindo a maior

reatividade do diastereoismero trans- a ser creditada a um fator entrpico, j queambos os grupos esto no mesmo plano espacial. Os produtos de oxidao foram

determinados por LC-ESI-MSn e verificou-se a formao dos hidroxi-allo-iso--

cidos, recentemente descritos na literatura. O conjunto de resultados obtidos

possibilitou a proposta de mecanismo para processo de oxidao e perda dos cidos

amargos da cerveja, observado no envelhecimento da bebida.


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ABSTRACT

ABSTRACT

The iso--acids are the main responsible constituents for the bitter taste of beer, they

are easily degraded during the aging and light exposed process, specially the trans-

diastereoisomer. The 1-hydroxyethyl radical is the major radical produced during the

beer aging process. The present work describes the reactivity of iso--acids towards

the 1-hydroxyethyl radical as probed by the spin-trapping technique and detected by

electron paramagnetic resonance (EPR) and mass spectrometry (ESI-(+)-MS/MS). It

was observed that both diastereoisomers cis- and trans-iso--acids are degraded in

the presence of 1-hydroxyethyl radical with apparent rate constant of 1.8 108e 9.2

109L mol-1s-1, respectively. The reactivity of dihydro-iso--acids towards the studied

radical was similar to the reactivity of the iso--acids diastereoisomeric mixture,

showing apparent rate Constant of 1.5 109 L mol-1 s-1. The tetrahydro-iso--acids

analogues did not observed reactivity towards the 1-hydroxyethyl radical suggesting

the allilic hydrogens as the reaction sites. In addition, the ab initioDFT calculations

demonstrated that the BDE values for the allilic hydrogens of the prenyl and

isohexenoyl side chains are equivalents and according to that suggesting the higher

reactivity of the trans- diastereoisomer to be accounted to an entropic factor since

both goups are in the same plane of the space. The oxidation products were

determined by LC-ESI-MS

n

and its was verified the formation of hydroxyl-allo-iso-

-acids. The data colected allows a mechanism to be proposed for the oxidation

process and loss of bitter acids of beer during the beverage aging.


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1. INTRODUO

A cerveja cons

com um consumo mun

produo anual em torn

apresenta uma mdia

bebidas alcolicas no pa

Figura 1. Consumo mdio analcolicas no mercado brasile

INTRODUO

iderada a bebida alcolica mais consu

dial mdio per capita ao redor de 21

o de 1,22 106hectolitros1. O consumo

de 47,6 litros/ano2, representando 66

s, Figura 1.

ual de cerveja per capita por pas e grfico da diiro1.

ida mundialmente,

,9 litros/ano e uma

per capita no Brasil

% do mercado de

tribuio de bebidas


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INTRODUO

Por regulamentao, a cerveja produzida a partir de gua de boa qualidade,

malte de cevada, fermento e lpulo (Humulus lupulus), podendo ainda ser utilizadas

outras fontes de carboidratos como co-adjuntos tais como arroz, milho e trigo3

. A

cerveja , por definio, uma bebida carbonatada de baixo teor alcolico que tem

atrado consumidores h mais de 100 anos por apresentar atributos sensoriais

peculiares, tais como frescor, aroma e amargor caracterstico4.

O processo industrial para a produo de cerveja encontra-se ilustrado na

Figura 2. O incio do processo ocorre pela moagem do malte de cevada juntamente

com a gua, resultando em uma suspenso que submetida a aquecimento a

temperatura de aproximadamente 60 oC para que as enzimas, amilase e protease,

degradem o amido e protenas do malte, formando uma mistura de glicose e

aminocidos tambm denominada mosto doce.

Figura 2. Fluxograma do processo industrial cervejeiro.

MOAGEMgua

FILTRAO

FERVURA

FERMENTAO

FILTRAO

MATURAO

ENVASE PASTEURIZAO

lpulo

CO2

leveduras

malte de cevada


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INTRODUO

Logo aps a etapa de filtrao, h adio do lpulo#e em seguida aplica-se

um gradiente de temperatura, podendo chegar at 95 oC, durante aproximadamente

uma hora; tem-se ento o processo de fervura/cozimento dos mosto doce. Em

seguida, os materiais suspensos provenientes do lpulo so retidos e a mistura

ento resfriada para a adio das leveduras; dar-se- a fermentao. Esta etapa

dividida em dois estgios: aerbico e anaerbico. No estgio aerbico ocorre o

crescimento das leveduras na presena de oxignio, ao passo que no estgio

anaerbico, as leveduras transformam a glicose em etanol e dixido de carbono,

sendo este ltimo recuperado e armazenado para o reaproveitamento ao final do

processo. Existem dois tipos de leveduras que so utilizadas no processo cervejeiro,

Saccharomyces carlsbergensis e Saccharomyces cerevisiae, as quais conferem o

tipo de fermentao empregado. Utilizando leveduras do tipo Saccharomyces

carlsbergensis tem-se uma cerveja de baixa fermentao, as quais decantam

durante a produo de etanol, ao passo que uma cerveja tida como de alta

fermentao so empregadas leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae, as quais

ficam suspensas no final do processo e suportam altas concentraes de etanol.

Ao final da fermentao, as leveduras so removidas, obtendo uma cerveja

denominada green beer, esta ltima ainda no adequada ao consumo imediato por

apresentar compostos de sabor e aroma indesejveis. Consequentemente, requerido um perodo denominado de maturao, no qual a cerveja mantida em

torno de 0 oC por um tempo relativamente grande (semanas) para que tais

compostos sejam vagarosamente degradados/transformados at atingirem nveis de

concentrao abaixo de seus valores crticos (limiares de sensao). Ainda,

comumente empregada, ao final do processo cervejeiro, uma correo do amargor

#O lpulo pode ser adicionado ao processo cervejeiro atravs da adio direta de flores secas (innatura),pelletsou extratos3.


21/115

INTRODUO

da cerveja acabada adicionando-se extrato de lpulo pr-isomerizado. Por fim, a

cerveja segue para o envase, aps filtrao e adio de dixido de carbono,

podendo ainda passar ou no pelo processo de pasteurizao5,6

.

De acordo com a Lei da Pureza da Cerveja (Reinheitsgebot), promulgada

pelo Duque Guilherme IV da Baviera em 1516, foi institudo na Alemanha o uso

apenas do malte de cevada, gua, lpulo e fermento como ingredientes para a

fabricao da cerveja7. Desta forma, o uso do lpulo no processo de fabricao da

cerveja foi reforado. Este ingrediente foi introduzido na cervejaria durante a Idade

Mdia pelos monges europeus que refinaram as tcnicas de produo. Inicialmente,

o lpulo era adicionado como um preservativo de ao bactericida de origem natural

para que a cerveja pudesse ser estocada por longos perodos; porm, passou a ser

um agente de aroma essencial e singular da cerveja.

O lpulo uma planta trepadeira perene, pertencente famlia

Cannabinaceae, espcie Humulus lupulus, cuja composio qumica complexa,

compreendendo uma gama muito grande de metablitos secundrios localizados

especialmente nas glndulas localizadas atrs das brcteas do cone de lpulo.

Estas glndulas so cobertas com um p resinoso amarelo chamado de lupulina.

Entre as diversas classes de compostos qumicos presentes na lupulina encontram-

se os leos essenciais (0,5 5% v/m), polifenis (3 6% m/m) e os -cidos e -cidos (4 30% m/m)5,8, tambm denominados humulonas e lupulonas

respectivamente, os quais possuem grande impacto na qualidade da cerveja. As

estruturas qumicas dos -cidos e -cidos esto apresentadas na Figura 3.


22/115

INTRODUO

Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) n-lupulona, (1b) colupulona,(1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b) cohumulona, (2c) adhumulona.

Desta forma, o lpulo e seus componentes so considerados essenciais na

produo de cerveja e responsveis pela distino desta de qualquer outra bebida

alcolica carbonatada. Ainda, dentre os componentes utilizados no processo

industrial da cerveja, o lpulo representa o de menor custo6 e, neste contexto,

interessante enfatizar que apenas as plantas femininas formam o cone de lpulo e,

portanto, somente estas so comercializadas.

Apesar de no possurem impacto direto nas propriedades sensoriais dacerveja, os -cidos so os precursores dos iso--cidos, comumente chamadas por

isohumulonas, responsveis pelo amargor caracterstico e qualidade da espuma da

cerveja9,10. Conforme j mencionado, as humulonas so introduzidas ao processo

cervejeiro pela adio do lpulo ao mosto e, aps a fervura deste, h converso das

humulonas, pouco solveis em meio aquoso (60 mg L-1a 100 oC), s espcies mais

hidroflicas denominadas isohumulonas, conforme ilustrado no Esquema 1.

1a-c 2a-c


23/115

INTRODUO

Esquema 1. Reao de isomerizao trmica das humulonas cis- (2-ac) e trans-isohumulonas(1-ac) durante o cozimento do mosto fermentado e adicionado de lpulo. A relao trans-/cis-ishumulonas em condies normais de fabricao da cerveja de 32:68. (a) iso-n-humulona, (b)isocohumulona, (c) isoadhumulona9.

Estes compostos contendo um anel de 5 membros consistem em pares de

diastereoismeros, trans-isohumulonas (1a-c, Esquema 1) e cis-isohumulonas (2a-c, Esquema 1), cada qual com 3 anlogos: iso-n-humulona (a), isocohumulona (b) e

isoadhumulona (c), Esquema 1. A configurao absoluta cis-/trans- determinada

pela orientao do grupo hidroxila em C4 e a cadeia lateral prenila em C5, sendo a

denominao trans- referente direo oposta de ambos os substituintes com

respeito ao anel de 5 membros. Verifica-se que, aps a fervura do mosto, a razo

cis-/trans- em geral 7:3, uma vez que os diastereoismeros cis- so


24/115

INTRODUO

termodinamicamente mais estveis (configurao de menor energia), visto que os

grupos laterais volumosos prenila e isohexenoila esto transposicionadas9.

O valor de pKa varia sensivelmente para cada anlogo de iso--cidos; porm,

este pode ser aproximado para 311,12. Sabe-se que o pH da maioria da cerveja gira

em torno de 4,2 e 4,4, principalmente para cervejas do tipo large11,12. Desta forma,

as isohumulonas encontram-se predominantemente na forma aninica na bebida

(aproximadamente 84%), cuja frmula estrutural est apresentada na Figura 4b.

Evidentemente, esta afirmativa pode no ser verdadeira para cervejas mais cidas,

estando presentes, neste caso, os iso--cidos em sua forma molecular, Figura 4a.

Figura 4. Estrutura qumica das isohumulonas em sua forma molecular (a) e aninica (b).

A concentrao de iso--cidos presentes no produto acabado varia entre 15

a 80 mg L-1 (4,1 10-5a 2,2 10-4mol L-1), conferindo diferentes graus de amargor13.

Desta forma, as isohumulonas representam aproximadamente 80% de todo

componente derivado do lpulo presente na cerveja10.

Quimicamente, a cerveja pode ser considerada uma soluo alcolica com

concentrao hidrogeninica (CH+) de 10-4,2 mol L-1, contendo centenas de

substncias dissolvidas14. Entretanto, os constituintes de uma cerveja fresca, recm

engarrafada, no esto em equilbrio qumico. Termodinamicamente, uma garrafa de

cerveja um sistema fechado e ir empenhar-se para alcanar uma condio demenor energia e mxima entropia. Por conseguinte, muitas converses de seus

(a) (b)


25/115

INTRODUO

constituintes so termodinamicamente possveis, sendo que sua relevncia para a

qualidade de cerveja , em sua maioria, determinada pelas velocidades de reao

em condies prticas de armazenamento do produto14

.

Com o aumento da exportao da cerveja, principalmente devido

globalizao do mercado, problemas relacionados ao tempo de prateleira do produto

(shelf-life) tornam-se de extrema importncia para a indstria cervejeira. Sabe-se

que a cerveja suscetvel a sofrer diversas reaes durante o seu armazenamento,

as quais levam a perda de amargor e frescor do produto, bem como o

desenvolvimento de compostos que conferem aroma e sabor indesejveis14. Desta

forma, o conhecimento dos possveis caminhos, mecanismos e constantes de

velocidade especficasdas reaes que ocasionam a perda da qualidade sensorial

do produto podem auxiliar no desenvolvimento de tcnicas e mtodos para a

conservao do produto.

Neste aspecto, as isohumulonas so particularmente sensveis a degradao

durante o armazenamento15, o que leva no somente a perda sensorial de amargor,

mas tambm formao de compostos volteis de aroma, tais como 4-metil-2-

pentanona e 3-penteno-2-ona14,15. Existem indcios fortes que apontam o

envolvimento dos iso--cidos na formao de aromas indesejveis tpicos de

cerveja velha, podendo estes cidos sofrerem degradao oxidativa, mesmo na

ausncia de oxignio molecular12.

Diversos estudos reportaram que o envelhecimento da cerveja est

diretamente relacionado com a degradao das trans-isohumulonas, visto que a

configurao cis- mostrou-se mais estveis e menos suscetveis aos processos

A velocidade de cada reao ir determinar a viabilidade de cada caminho e est intrinsecamenterelacionada a constante de velocidade especfica da reao e ao teor dos reagentes.Constante de velocidade especfica refere-se constante de velocidade determinada diretamentepelo decaimento ou formao da espcie de interesse.


26/115

INTRODUO

deteriorativos4,5,16. Todavia, produtos de oxidao de ambos os diastereoismeros,

cis- e trans-isohumulonas, formados durante o armazenamento da cerveja contida

em garrafa PET, foram apontados em estudos recentes17,18

. Estes compostos foram

chamados de hidroperoxi-allo-isohumulonas e hidroxi-allo-isohumulonas e so

decorrentes de reaes de degradao dos iso--cidos via radicalide, na presena

de traos de metais de transio, tais como ons de ferro, e oxignio molecular17.

Durante um tempo considervel a reao de degradao via foto-oxidao

das isohumulonas foi estudada com muito afinco11,19-22. Neste contexto, verificou-se

que os iso--cidos sofrem degradao na presena de luz e riboflavina,

fotosensibilizador naturalmente presente na cerveja19,20. Este tipo de reao tem

impacto direto na qualidade sensorial da bebida no somente pela perda do amargor

caracterstico do produto, mas, sobretudo, pelo impacto negativo de alguns produtos

de degradao.

A ttulo de exemplificao, pode-se citar a formao do 3-metil-2-buteno-1-tiol

(MBT)19-22, cujo mecanismo de formao est ilustrado no Esquema 2. Verifica-se

que aps iniciada a reao com a transferncia de 1 eltron do cromforo

-tricarbonila das isohumulonas para a riboflavina no estado tripleto excitado (3RF*),

excelente aceptor de eltrons (E = + 1,77 V vs. NHE)22, o radical alcoxila formado

sofre uma clivagem de Norrish do Tipo I gerando o cido dihidrohumulnico e oradical 4-metilpenta-3-enol. Este radical sofre rpida descarbonilao e, na presena

de radicais tiis (SH) o MBT ento formado11,21. A presena desta substncia

confere um odor extremamente desagradvel ao produto, lembrando o odor

decorrente dos tiis secretados pelas glndulas anais do gamb listrado (Mustela

Vison L.), fato este agravado pelo baixo limiar de percepo do produto formado

(aproximadamente 1 ng L-1)19,22.


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INTRODUO

Esquema 2. Reao de degradao fotoqumica dos iso--cidos em cerveja11,21.

Em adio, Lusk e Murakami23revelaram recentemente a existncia de dois

novos compostos formados a partir da exposio da cerveja luz. Pouco se

conhece sobre a estrutura destes compostos; no entanto, sabe-se que estes so

decorrentes da fotodegradao dos iso--cidos sensibilizado pela riboflavina. Como

resultado, atravs da anlise sensorial dos mesmos, verificou-se que estas

substncias possuem aroma indistinguvel ao conferido pelo MBT, alm de

apresentarem a mesma massa molecular.


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INTRODUO

Verifica-se uma crescente busca pelas indstrias cervejeiras por

aperfeioamento em seu processo industrial, cuja finalidade consiste em atribuir ao

produto acabado melhorias referentes estabilidade, qualidade sensorial e aumento

do tempo de prateleira do mesmo. De fato, os derivados hidrogenados e reduzidos

dos iso--cidos, em especial tetrahidro-isohumulonas (2a-c, Figura 5) e dihidro-

isohumulonas (1a-c, Figura 5), vm sendo empregados no processo industrial da

cerveja por serem reconhecidamente menos sensveis* a degradao via

fotoqumica que os seus precursores, isohumulonas.

Figura 5. Estrutura qumica da dihidro-isohumulonas (1a-c) e tetrahidro-isohumulonas (2a-c),

derivados reduzidos e hidrogenados dos iso--cidos, respectivamente. (1a) dihidro-iso-n-humulona,(1b) dihidro-isocohumulona, (1c) dihidro-isoadhumulona, (2a) tetrahidro-iso-n-humulona, (2b)tetrahidro-isocohumulona, (2c) tetrahidro-isoadhumulona.

Assim, o uso dos derivados reduzidos dos cidos amargos do lpulo vem de

encontro melhoria na qualidade sensorial do produto, uma vez h, em parte, uma

minimizao na formao de aromas indesejveis e perda sensorial de amargor19-22.

Entretanto, na prtica, vrios problemas so detectados, j que os derivados

reduzidos tambm podem sofrer decomposio via radicalide, levando a formao

de produtos de degradao especficos, tais como 4-metil-3-pentenal, o qual lembra

o odor de papelo e assim conferindo um aroma tpico de cerveja velha22. A

exposio das tetrahidro-isohumulonas luz conduz a formao do composto

* O atributo menos sensvel est relacionado ao menor impacto sensorial dos fotoprodutos dedegradao e no a estabilidade qumica da espcie.

(1a-c) (2a-c)


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INTRODUO

4-metilpentanal, sendo, neste caso, a descarbonilao do radical 4-metil-pentanoil

competitiva com a abstrao de hidrognio a partir de um doador apropriado22.

Entretanto, os produtos de degradao dos derivados hidrogenados e reduzidos dos

iso--cidos no apresentam um impacto negativo to expressivo quanto ao

conferido ao MBT, formado a partir da isohumulonas.

Adicionalmente, a presena das tetrahidro-isohumulonas na cerveja resulta

em uma maior estabilidade da espuma, bem como o aumento no poder de amargor

do produto. Por outro lado, o uso das dihidro-isohumulonas no processo cervejeiro

culmina em uma reduo do amargor, bem como o decrscimo da estabilidade da

espuma5,24. Neste contexto, um aspecto importante a ser lembrado o fato de que o

uso dos derivados de iso--cidos, os quais no so de origem natural, no

permitido na fabricao de cervejas destinadas ao mercado Alemo em decorrncia

do Reinheitsgebot.

A partir desses exemplos de alteraes que ocorrem durante o

armazenamento da cerveja, segue que a natureza das mudanas do sabor um

processo complexo e depende principalmente do tipo da cerveja, concentrao de

oxignio dissolvido e das variaes de temperatura submetidas ao produto durante o

transporte e estocagem.

Sabe-se que a concentrao de radicais gerados durantes o processo deenvelhecimento natural da cerveja aumenta com o teor de oxignio dissolvido, com

elevadas temperaturas de armazenamento14ou com o aumento das concentraes

de alguns metais de transio, tais como ons de ferro e cobre. Entretanto, pelo fato

do radical hidroxila (OH) apresentar alta reatividade (E0= + 2,7 V vs. NHE) e baixa

seletividade, Andersen e Skibsted25 demonstraram, atravs de experimentos de


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INTRODUO

spin-trapping e ressonncia paramagntica de eltrons, que o radical 1-hidroxietila

(HER) o radical predominante formado na cerveja.

O radical HER proposto por originar-se da reao entre o etanol, co-

solvente, com o radical hidroxila, conforme ilustrado o Esquema 325,26. De fato,

verificou-se que radicais hidroxila abstraem tomos de hidrognio de molculas de

etanol com uma constante de velocidade de 1,9 109L mol-1s-1. Esta abstrao de

tomo de hidrognio ocorre preferencialmente no carbono C1 (85%), formando o

radical 1-hidroxietila, sendo em menor extenso no carbono C2 (13%), resultando no

radical 2-hidroxietila25. Sabe-se ainda que ambos os radicais formados durante a

oxidao do etanol reagem com o oxignio molecular (O2), resultando na formao

do radical hidroperoxila (OOH) e acetaldedo como produto principal ao final25.

Esquema 3. Formao e reaes subseqentes dos radicais 1-hidroxietila, em destaque, e2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o proposto dor Andersen e Skibsted25.

Ainda, Elias e Andersen27 demonstraram recentemente que o radical HER

quantitativamente a espcie radical responsvel pela oxidao do vinho. Desta


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INTRODUO

forma, o radical 1-hidroxietila formado a partir da oxidao do etanol pelo radical

hidroxila decorrente da reao de Fenton25,28, Esquema 4.

Esquema 4.Reao de Fenton25,28.

interessante ressaltar que compostos fenlicos, presentes tanto na cerveja

quanto no mosto, so reativos frente ao radical 1-hidroxietila29,30. Estas substncias

fenlicas esto presentes na bebida em teores considerveis, os quais giram em

torno de 460 mg L

-1

(2,7 10

-3

mol L

-1

expresso em equivalente de cido glico)

30-32

.Dentre estes compostos fenlicos, pode-se citar compostos pertencentes classe

dos flavonides, tais como: quercetina, kaempferol e morina; bem como alguns

cidos cinmicos como cido cafeico, clorognico e p-cumrico, cujas estruturas

qumicas esto apresentadas na Figura 6.


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INTRODUO

Figura 6. Estrutura qumica de alguns fenis presentes na cerveja. (a) quercetina, (b) morina, (c)kaempferol, (d) cido p-cumrico, (e) cido clorognico, (f) cido cafeico.

Substncias fenlicas so conhecidas pela suas propriedades antioxidantes,

sendo ento de extrema importncia na preservao de alimentos ao evitar ou inibir

processos oxidativos que levam a deteriorao o produto. Neste contexto, Marfak e

Trouillas30determinaram as constantes de velocidade da reao entre o radical HER

e alguns flavonides, tais como quercetina (4,0 104 L mol-1 s-1), kaempferol

(3,1 104 L mol-1 s-1) e morina (2,9 104 L mol-1 s-1). Consequentemente, esta

reatividade ocasiona a decomposio destes antioxidantes naturais e, portanto, a

diminuio da capacidade redox do produto.

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)


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OBJETIVOS

2. OBJETIVOS

Aparte do melhor conhecimento a respeito do processo de deteriorao

oxidativa da cerveja, os principais objetivos e metas do presente trabalho podem ser

resumidos conforme descrito a seguir:

- Estudo da reatividade de isohumulonas frente ao radical 1-hidroxietila;

- Estudo da reatividade dos derivados reduzidos e hidrogenados dos

iso--cidos, dihidro-isohumulonas e tetrahidro-isohumulonas respectivamente,

frente ao radical 1-hidroxietila;

- Determinao dos produtos de reao;

- Estudo eletroqumico da forma molecular das trans-isohumulonas;

- Propor o mecanismo de degradao das isohumulonas via radicalide, bem

como elucidar o stio de reao e verificar a dependncia estereoqumica da reao;

- Estudo da reatividade de alguns fenis, presentes na cerveja, frente ao

radical 1-hidroxietila.


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MATERIAL E MTODO

3. MATERIAL E MTODO

3.1. Reagentes.

Acetonitrila, cido clordrico 36-38% e etanol foram obtidos da J. T. Baker;

acetato de etila e metanol foram obtidos da Tedia, cido frmico 98-100%, cloreto de

ferro (II) (FeCl2.4H2O), hidrxido de amnia e o perxido de hidrognio 30% foram

obtidos da Merck; acetato de amnio, cido p-cumrico, borohidreto de sdio,

-4-piridil-1-xido-N-tert-butilnitrona (4-POBN), -ciclodextrina 98%, catalase de

fgado bovino, catalisador paldio suportado em carbono 10%, diciclohexilamina

99%, ferroceno, quercetina e o perclorato de tetrabutilamnio foram obtidos da

Sigma-Aldrich; sulfato de sdio (Hexis); clorofrmio deuterado (Acros Organics);

gases argnio (5,0), hidrognio (4,5), Helio (5,0) e nitrognio foram obtidos da White

Martins. O extrato de lpulo pr-isomerizado (30% massa/volume) foi gentilmente

cedido pela empresa Hopsteiner. A gua de alta pureza (18 M cm-1) utilizada foi

previamente destilada e purificada utilizando um sistema de purificao Milli-Q

(Millipore). Placas de TLC com matriz slica gel suportadas em alumnio contendo

200 m de espessura de camada e indicador fluorescente (254 nm) foram obtidas da

Fluka Analytical. Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico e utilizados

sem prvio tratamento. Os solventes foram de grau cromatogrfico (HPLC) utilizados

sem prvio tratamento, com exceo do acetato de etila que foi tratado seguindo

procedimento descrito na literatura33.


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MATERIAL E MTODO

3.2. Isolamento das trans-isohumulonas.

Os diastereoismeros trans- foram isolados utilizando metodologia proposta

por Khatib e Verpoorte34, na qual se partiu de uma soluo aquosa comercial

contendo uma mistura de sais de potssio das isohumulonas na forma cis- e trans-

(6,6 g). A esta soluo foi adicionada uma soluo aquosa de -ciclodextrina (1,5 g,

em 12 mL de gua), gota a gota, mantida a 70 oC, utilizando-se a razo molar

(Riso--cidos/-ciclodextrina) 4:1. A mistura reacional foi mantida sob agitao a 70oC

durante 30 minutos, ocorrendo a complexao seletiva ao formar complexos de

-ciclodextrina com os trans-iso--cidos. A seguir, a mistura reacional foi

devidamente armazenada a 4 oC, sob o abrigo de luz e em repouso, por 48 horas.

Ao trmino da reao de complexao, formou-se um precipitado amarelo

claro, o qual foi filtrado e lavado vrias vezes com etanol/gua (1:2 v/v) e acetato de

etila. Na etapa seguinte, adicionou-se 50 mL de metanol ao complexo, sob agitao,

para que houvesse a liberao das trans-isohumulonas, as quais ficaram em

soluo enquanto que a -ciclodextrina precipitou. Por conseguinte, um novo

processo de filtrao foi realizado utilizando-se um filtro de placa porosa e o solvente

removido por roto-evaporao a presso reduzida. Ento, adicionou-se acetato de

etila (25 mL) para que resqucios de -ciclodextrina fossem precipitados e, por fim, asoluo resultante de uma nova filtrao foi roto-evaporada at a secura. Obteve-se,

desta forma, uma mistura contendo as trans-isohumulonas na sua forma aninica, a

qual foi posteriormente caracterizada por espectroscopia eletrnica de absoro

(UV-vis), ressonncia magntica nuclear (1H RMN) e cromatografia lquida hifenada

ao espectrmetro de massas (LC-ESI-MSn).


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MATERIAL E MTODO

Adicionalmente, a trans-isocohumulona foi cromatograficamente separada da

trans-iso-n-humulona utilizando-se um sistema de cromatografia lquida de alta

eficincia (HPLC) semi-preparativo, detector de arranjo de diodos na regio do

UV-vis. A separao foi obtida atravs de uma coluna LUNA C-18 10 m (20 cm x

0,7 cm); fluxo 2,5 mL min.-1; fase mvel solvente A H2O/cido frmico (99:1 v/v) e

solvente B Etanol/cido frmico (99:1 v/v); sistema isocrtico, cuja relao da fase

mvel foi 56% do solvente B em A. Uma soluo alcolica contendo apenas os

diastereismeros trans- (20 mg/injeo) foi ento injetada para obter o perfil

cromatogrfico desejado, coletando as fraes dos analitos de acordo com os

respectivos tempos de reteno. As fraes foram posteriormente caracterizadas por

LC-ESI-MSn.

3.3. Isolamento das cis-isohumulonas.

Os cis-iso--cidos foram isolados partindo-se se uma soluo comercial

contendo sais de potssio dos diastereismeros cis- e trans- (1,6 g). A esta soluo

contendo a mistura diastereoisomrica foi adicionada vagarosamente a uma soluo

aquosa equimolar de -ciclodextrina (1,5 g, em 12 mL de gua)(Riso--cidos/-ciclodextrina= 1:1)

34, mantida a 70 oC. A reao seguiu durante 30 minutos,

sob agitao a 70 oC, havendo a complexao das trans-isohumulonas com a

-ciclodextrina. A mistura reacional foi armazenada a 4 oC, sob o abrigo de luz e em

repouso, por 48 horas e, aps a precipitao do complexo, este foi isolado atravs

de uma prvia filtrao e o sobrenadante, contendo os cis-iso--cidos dissolvidos,

foi centrifugado a 7.000 rpm, 4 oC, por 30 minutos, com o intuito de precipitar


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MATERIAL E MTODO

resqucios de complexo na soluo. Em seguida, todo complexo foi retido no filtro de

placa porosa e a soluo resultante liofilizada.Adicionou-se cuidadosamente acetato

de etila (25 mL) ao slido resultante e -ciclodextrina remanescente foi retida em um

filtro de placa porosa, sendo a soluo sobrenadante roto-evaporada at a secura.

Por fim, obteve-se uma mistura contendo os diastereoismeros cis- em sua forma

aninica, a qual foi caracterizada por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.

Ainda, a cis-isocohumulona foi separada dos homlogos cis-isoadhumulona e

cis-iso-n-humulona aplicando as mesmas condies experimentais empregadas na

separao dos trans-iso--cidos, partindo-se de uma soluo alcolica contendo os

trs anlogos de cis-iso--cidos. Em seguida, as fraes foram caracterizadas por

LC-ESI-MSn.

3.4. Preparo das dihidro-isohumulonas.

As dihidro-isohumuloonas foram preparadas partindo-se de uma mistura de

cis- e trans-iso--cidos (400 mg; 1,1 10-3mol) em metanol (27 mL) e adicionando-

se borohidreto de sdio (92,0 mg), sobre agitao, por 23 horas, a temperatura

ambiente (25

o

C). Aps o trmino da reao, a mistura reacional foi acidificada comcido clordrico (12 mol L-1) a pH 1 e o solvente foi removido por roto-evaporao a

presso reduzida. O resduo foi ento re-dissolvido em gua (20 mL) e a soluo

resultando extrada com acetato de etila (3 x 20 mL), sendo a fase orgnica

posteriormente seca com Na2SO4. Aps seca, o solvente da fase orgnica foi

removido por roto-evaporao, obtendo uma mistura cis- e trans-dihidro-

isohumulonas, a qual foi caracterizada por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.


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MATERIAL E MTODO

O desenvolvimento da reao foi monitorado atravs de cromatografia planar,

TLC, utilizando-se placas de matriz slica gel suportada em alumnio contendo

200 m de espessura de camada e indicador fluorescente (254 nm). Como solvente

de eluio foram utilizados Hexano/ter etlico (1:4 v/v) acidificado com cido actico

e como revelador foi utilizado o permanganato de potssio (KMnO4).

3.5. Preparo das tetrahidro-isohumulonas.

Os derivados hidrogenados dos iso--cidos foram obtidos seguindo a rota

sinttica descrita por Verzele e De Keukeleire9. Assim, a hidrogenao das olefinas

das cadeias laterais conectadas aos carbonos C5 e C4, referentes aos grupos

prenila e isohexenoila respectivamente, foi obtida partindo-se de uma soluo

contendo os diastereismeros cis- e trans- (200 mg; 5,52 10-4 mol) em metanol

(25 mL), com adio do catalisador paldio suportando no carbono 10% (59,0 mg),

sob atmosfera de hidrognio (H2) (presso ambiente). Depois de decorrido 6 horas

de reao, sobre agitao vigorosa e a temperatura ambiente (25 oC), o catalisador

foi retido e a mistura reacional roto-evaporada at a secura para a obteno da

mistura cis- e trans- tetrahidroisohumulonas. Os produtos da reao seguiram paraposterior caracterizao qumica por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.

A reao foi monitorada atravs de cromatografia planar TLC, utilizando-se

placas de slica gel e solventes de eluio Hexano/ter etlico (1:1 v/v) acidificado

com cido actico.


39/115

MATERIAL E MTODO

3.6. Caracterizao qumica dos compostos.

A pureza dos compostos isolados e sintetizados foi avaliada por

Espectroscopia Eletrnica de Absoro (UV-vis), Cromatografia Lquida hifenada ao

Espectrmetro de Massas (LC-ESI-MSn) e Ressonncia Magntica Nuclear

(1H RMN).

- LC-ESI-MSn: Sistema de HPLC Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao

espectrmetro de massas de mltiplo estgio do tipo ion-trap Bruker modelo

Esquire 4000.

Coluna: Agilent C-18 extended (5 m, 2,1 x 150 mm); fluxo 0,5 mL min -1; fase

mvel35solvent A Acetato de Amnio (5 10-3mol L-1)/H2O/Etanol (80:20 v/v), pH

aparente ajustado a 9,4 com hidrxido de amnia, solvente B Acetonitrila/Etanol

(60:40 v/v); gradiente 0,3 min: 0% B isocrtico, 3 4 min.: 0 16% B, 4 - 54 min.: 16

30% B, 54 57 min.: 30 95% B, 57 65 min.: 95% B isocrtico.

Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na

interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi 150

L min-1. Condies de nebulizao: presso 40 psi, fluxo do gs (N2) 9 L min-1;

temperatura de desolvatao 365 oC, voltagem do capilar 3500 V; modo de deteco

de ons negativo.- 1H RMN: para realizar as anlises de ressonncia magntica nuclear, os

compostos foram previamente dissolvidos em uma soluo etanol/cido frmico

(99:1 v/v) e todo solvente foi removido por roto-evaporao a presso reduzida. Este

procedimento foi requerido para garantir que os iso--cidos e seus derivados

estivessem em sua forma protonada. Assim, os espectros de ressonncia magntica

nuclear foram obtidos utilizando-se clorofrmio deuterado (CDCl3) como solvente,


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MATERIAL E MTODO

nos equipamentos: Bruker 200 MHz, 4,7 T, AC200, Instituto de Qumica de So

Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo (USP); Bruker, 400,21 MHz, DRX 400-9.4

T, Departamento de Qumica (DQ), Universidade Federal de So Carlos (UFSCar).

- UV-vis: os espectros eletrnicos de absoro na regio do ultravioleta visvel

dos compostos foram obtidos em um espectrofotmetro Hitachi modelo U-3501.

Utilizou-se uma cela de quartzo de caminho tico 1,0 x 1,0 cm. As medidas de

absoro foram efetuadas pela leitura direta dos espectros, sendo utilizado como

referncia o prprio solvente.

3.6.1. Estudo eletroqumico das isohumulonas.

As medidas eletroqumicas foram realizadas em um potenciostato AUTOLAB

modelo PGSTAT100, utilizando-se o eletrodo de diamante dopado com boro como

eletrodo de trabalho, fabricado pela Adamant Technologies S.A., Sua, com

dopagem 8.000 ppm de boro e rea superficial 6,25 mm2. O contra-eletrodo utilizado

foi uma rede de platina, cuja rea superficial de 3,0 mm 2. O potencial do eletrodo

de referncia foi checado contra o potencial padro do par de ferroceno (Fe+1/Fe).

Neste caso, o potencial medido relatado contra o Eletrodo Normal de Hidrognio(NHE) usando Eo= 0,630 V vs. NHEpara o Fe+1/Fe, em acetonitrila36.

Variou-se a taxa de velocidade de varredura de 10 mV s -1 a 200 mV s-1.

Ainda, as medidas foram efetuadas em meio orgnico (perclorato de

tetrabutilamnio em acetonitrila 0,1 mol L-1), a temperatura ambiente (25 oC), sob

atmosfera inerte (N2).


41/115

MATERIAL E MTODO

3.7. Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical 1-hidroxietila.

3.7.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao e estabilidade do

aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH].

O radical 1-hidroxietila foi gerado, conforme j demonstrado no Esquema 3, a

partir do radical hidroxila, o qual resulta da Reao de Fenton25,28, Esquema 4.

Entretanto, em funo da dificuldade na deteco direta da maioria dos radicais

devido seus baixos tempo de meia vida, a reao deste com os compostos de

interesse, presentes na cerveja, foi estudada utilizando-se o 4-POBN como

armadilha qumica (spin-trap), formando o aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH],

Esquema 5.

Esquema 5. Reao de formao do spin radical [4-POBN/CH(CH3)OH].

O valor da constante de velocidade especfica da reao entre o 4-POBN e o

radical 1-hidroxietila est relatada na literatura com o valor de 3,1 107L mol-1s-1 37.

Como um todo, a reao foi conferida adicionando-se 60 L de uma soluo

de FeCl2.4H2O (2,0 10-3mol L-1) levemente acidificada (pH ~ 4,5) a 1 mL de uma

soluo contendo o 4-POBN (3,2 10-3 mol L-1) a 6% de etanol (ca. 1 mol L-1). A

mistura reacional foi cuidadosamente desgaseificada com argnio, seguida do

acrscimo de 80 L de soluo de H2O230% (59,0 10-3mol L-1) para promover a


42/115

MATERIAL E MTODO

formao do radical 1-hidroxietila e posterior gerao do aduto radical. A reao foi

monitorada at os 5 primeiros minutos aps a adio do perxido de hidrognio,

verificando as espcies formadas. Vale ressaltar que a concentrao analtica do

perxido de hidrognio foi determinada atravs do espectro eletrnico de absoro

(= 240 nm; 240= 39,4 L mol-1cm-1)38.

A reao foi ento monitorada atravs de duas tcnicas: Espectroscopia de

Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE) e Cromatografia Lquida hifenada ao

Espectrmetro de Massas (LC-ESI-MSn).

Parmetros instrumentais:

- Espectrmetro de Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE):

Espectrmetro Bruker modelo EMX operando na banda-X.

Campo magntico central: 3.378 G; freqncia: 9,53 GHz; atenuao: 23 dB;

potncia: 1 mW; modulao da freqncia: 100 KHz; modulao da amplitude: 1 G.


espectrmetro de massas de mltiplo estgio de tipo ion-trap Bruker Esquire 4000.

Coluna Agilente C-18 extended (5 m; 2,1 x 150 mm); fluxo 0,3 mL min.-1;

fase mvel solvente A H2O/cido Frmico (99,9:0,1 v/v), solvente B

Acetonitrila/cido Frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 - 15 min.: 0 25% B, 15 20

min.: 25 100% B, 20 23 min.: 100% B isocrtico, 23 25 min.: 100 0% B.Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na

interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi

100 L min.-1. As condies de nebulizao foram presso 30 psi, fluxo de gs (N2)

9 L min.-1, temperatura 250 oC, voltagem do capilar de 3.000 V, operando no modo

de deteco de ons positivo.


43/115

MATERIAL E MTODO

Avaliou-se tambm a influncia da adio de catalase na estabilidade do

aduto radical, a qual decompe o excesso de perxido adicionado que

supostamente pode interferir na quantificao do aduto [4-POBN/CH(CH3)OH]

.

Assim, foi realizado um estudo sobre a estabilidade do aduto radical na presena e

ausncia de catalase. Desta forma, para o estudo na presena de catalase,

adicionou-se 100 L da enzima (47,4 mg mL-1)38 mistura reacional aps decorrido

o tempo de amostragem da reao, seguindo para a anlise por ESI-(+)-MSn,

segundo os parmetros instrumentais abaixo:

Espectrmetro de Massas (ESI-(+)-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na



9 L min.-1, temperatura de desolvatao 250 oC, voltagem do capilar de 3000 V.

Modo de deteco de ons positivo.

3.7.2. Determinao das constantes de velocidade aparentes

decorrentes das reaes dos compostos de interesse frente ao radical 1-hidroxietila.

Para estimar as constantes de velocidade de segunda ordem de capitao do

radical 1-hidroxietila pelos iso--cidos e seus derivados, foi utilizada a abordagem

de cintica de competio39,40. Neste contexto, o 4-POBN compete com os

compostos de interesse pela captao do radical 1-hidroxietila formado, conforme

ilustrado no Esquema 6.

Constante de velocidade aparente refere-se constante de velocidade determinada indiretamenteatravs da utilizao de uma sonda qumica.


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MATERIAL E MTODO

Esquema 6. Ilustrao da reao de competio entre a armadilha qumica 4-POBN e aisohumulonas pelo radical 1-hidroxietila.

Desta forma, os compostos foram primeiramente dissolvidos em etanol. No

caso dos cidos amargos derivados do lpulo, as concentraes destes foram

determinadas atravs da leitura da soluo pelo espectrofotmetro UV-vis, de

acordo com os respectivos coeficientes de absortividade (279 nm = 11.150

L mol-1 cm-1, iso--cidos; 279 nm = 11.150 L mol-1 cm-1, dihidro-isohumulonas;

254 nm= 17.690 L mol-1cm-1, tetrahidro-isohumulonas)9.

Seguindo uma cintica de competio, volumes diferentes da soluo de iso-

-cidos foram adicionados em 60 L de uma soluo aquosa de FeCl2.4H2O

(2,0 10-3mol L-1) levemente acidificada (pH ~ 4) e 1 mL de uma soluo de 4-POBN

(3,2 10-3 mol L-1) a 6% de etanol (1 mol L-1). Desgaseificou-se a mistura por 5

minutos para ento acrescentar 80 L da soluo de H2O230% (59,0 10-3mol L-1). A

reao foi monitorada pelo aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] aps decorrido 1

minuto da adio do perxido de hidrognio, acrescentando 100 L de catalase

(47,4 mg mL-1) ao final.


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MATERIAL E MTODO

interessante ressaltar que a sonda utilizada foi o aduto radical

[4-POBN/CH(CH3)OH], sendo este monitorado pelas tcnicas RPE e

ESI-(+)-MS/MS.

Parmetros instrumentais:

Espectrmetro de Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE):

Espectrmetro Bruker modelo EMX operando na banda-X.

Campo magntico central: 3.378 G; frequncia: 9,53 GHz; atenuao: 23 dB;

potncia: 1 mW; modulao da frequncia: 100 KHz; modulao da amplitude: 1 G.

Espectrmetro de Massas (ESI-(+)-MS/MS): utilizou-se um divisor de fluxo na



9 L min.-1, temperatura de desolvatao 250 oC, voltagem do capilar de 3000 V.

Modo de deteco de ons positivo.

3.8. Clculo quntico, ab initio DFT, na determinao das propriedades

eletrnicas das isohumulonas.

Para a determinao das configuraes espaciais mais estveis das

molculas dos diastereoismeros cis- e trans-isohumulonas foi utilizado o clculo de

dinmica molecular por DFT (Teoria de Densidade do Funcional), com o mtodo

B3LYP, base 6-311+G(d,p), otimizando em um contnuo dieltrico simulado em

etanol com o formalismo da equao integral como modelo contnuo polarizado

(IEF-PCM). Por outro lado, as entalpias de dissociao dos hidrognios (BDE),


46/115

MATERIAL E MTODO

momento dipolo eltrico e energia dos orbitais de fronteira HOMO foram obtidas

atravs de clculo usando o mtodo DFTutilizando a base M06/6-31+G(d).

3.9. Caracterizao qumica dos produtos da reao entre o radical

1-hidroxietila e os iso--cidos.

Os produtos da reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila foram

caracterizados por LC-ESI-MSn.


espectrmetro de massas de mltiplo estgio do tipo on-trap Bruker modelo

Esquire 4000.

Coluna: Agilent C-18 extended (5 m, 2,1 x 150 mm); fluxo 0,3 mL min -1; fase

mvel solvente A H2O/cido frmico (99,9:0,1 v/v), solvente B Acetonitrila/cido

frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 5 min: 0 30% B, 5 20 min.: 30 50% B, 20 -

35 min.: 50 65% B, 35 55 min.: 65 100% B, 55 60 min.: 100 0% B.

Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na


100 L min

-1

. Condies de nebulizao: presso 30 psi, fluxo do gs (N2) 9 L min

-1

;temperatura de desolvatao 365 oC, voltagem do capilar 3500 V; modo de deteco

de ons negativo.


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RESULTADOS E DISCUSSO

4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Isolamento das isohumulonas.

Primeiramente, foi testada uma metodologia clssica consolidada por Verzele

e De Keukeleire9para promover o isolamento dos diastereoismeros cis- e trans-.

De acordo com este procedimento, formam-se sais de diciclohexilamina das trans-

isohumulonas ao final. No entanto, este mtodo eficaz somente na situao em

que se tem ao menos 30% das espcies trans- em soluo comparado com a forma

cis-. Como no se obteve os sais de diciclohexilamina dos diastereoismeros trans-,

sups ser devido presena de contaminantes oriundo da oxidao do extrato, o

que em princpio pode inibir a precipitao dos sais de deciclohexilamina. Deve-se

dizer que no se obteve sucesso mesmo aps exaustivas tentativas.

As trans- e cis-isohumulonas foram isoladas e purificadas eficientemente com

o emprego da -ciclodextrina para promover a complexao estreo-seletiva dos

diastereoisomeros trans-32. A Figura 7 ilustra esquematicamente o processo de

separao dos iso--cidos por complexao seletiva com -ciclodextrina, o qual se

d pelas interaes hidrofbicas entre a cavidade interior da -ciclodextrina(hidrofbica) com as cadeias laterais isohexenoila e prenila dos ismeros trans-,

conectadas aos carbonos C4 e C5, respectivamente.


48/115

Figura 7. Ilustrao esque-ciclodextrina.

4.2. Preparo dos

4.2.1. Prepar

Os derivados

com a metodologia des

monitorada atravs de c

dos compostos na placa

reao foi completada c

representado pela letra

passo que o fator de

representado pela letra

de reduo foi de 87%.


tica da separao dos diastereoismeros p

erivados reduzidos/hidrogenados das is

das dihidro-isohumulonas.

reduzidos dos iso--cidos foram pr

crita anteriormente no item 3.4. A evo

omatografia planar (TLC). Desta forma,

de slica gel, apresentada na Figura 8,

om 23 horas de amostragem. Neste ca

P apresentaram um fator de reteno

reteno (Rf) verificado para os pro

R foi igual a 0,32. O rendimento final

or complexao com a

ohumulonas.

parados de acordo

luo da reao foi

atravs da evoluo

constatou-se que a

o, os precursores

(Rf) igual a 0,35, ao

dutos da reao

btido para a reao


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Figura 8. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao dihidro-isohumulonas -no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico(1:4 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel. (R) reao; (M) mistura; (P) precursores.

4.2.2. Preparo das tetrahidro-isohumulonas.

Os derivados hidrogenados dos iso--cidos foram preparados de acordo

com a metodologia proposta por Verzele e De Keukeleire9. A reao foi

acompanhada utilizando-se uma placa de slica gel (TLC), em um sistema de

cromatografia planar, conforme consta na Figura 9. Desta forma, de acordo com os

fatores de reteno (Rf) dos precursores e produtos da reao, 0,11 e 0,20

respectivamente, aps 6 horas de amostragem todos precursores foram

consumidos, sendo ento a reao finalizada. O rendimento verificado para a reao

de hidrogenlise foi de 89%.


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Figura 9. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao tetrahidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria ehexano/ter etlico (1:1 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel.(R) reao; (M) mistura;(P) precursores.

4.3. Caracterizao qumica das isohumulonas isoladas e seus derivados

reduzidos/hidrogenados.

4.3.1. Caracterizao qumica das trans-isohumulonas isoladas.

Primeiramente, os diastereoismeros trans- foram caracterizados por

espectrofotometria UV-vis pela leitura direta das trans-isohumulonas isoladas em

soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1).

Desta forma, atravs da leitura do espectro eletrnico de absoro, Figura 10, nota-

se a presena de duas bandas centradas em 227 e 279 nm, cujos coeficientes de

absortividade molar so 10.200 e 11.150 L mol-1 cm-1, respectivamente. Estes

valores esto de acordo com os reportados na literatura9 para a espcie trans-

isohumulona.


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Figura 10. Espectro eletrnico de absoro das trans-isohumulonas isoladas em soluo contendo10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de trans-isohumulonasde 3,2 10-5mol L-1.

A segunda tcnica utilizada na caracterizao qumica das trans-

isohumulonas isoladas foi a LC-ESI-MSn. Comparando-se o perfil cromatogrfico dos

diastereoismeros trans- isolados (em azul) com o cromatograma da soluo

comercial de iso--cidos contendo as formas cis- e trans- (em vermelho), Figura

11, constata-se que h uma sobreposio do segundo pico do cromatograma

inerente a soluo das isohumulonas com o primeiro pico do cromatograma das

trans-isohumulonas, cujo tempo de reteno (tr) 11,4 minutos. Estes picos so

referentes aos diastereoismeros trans-, sendo o pico em 10,5 minutos (tr) do

cromatograma da soluo de isohumulonas referente forma cis-. Esta informao

deve-se ao fato de que os compostos trans- esto presentes em menor proporoque as formas cis-, pois a formao deste ltimo termodinamicamente favorecida9.


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Figura 11. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formascis- e trans- (em vermelho) e das trans-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans-coisohumulona referente ao pico 2, tr= 11,4 min. (c) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans-iso-n-humulona referente ao pico 4, tr= 16,5 min.

A Figura 11bapresenta o espectro de massas do pico 2 do cromatograma

das trans-isohumulonas isoladas, no qual se observa o on [M-H]-347 m/z referente

molcula desprotonada. Este on referente espcie trans-isocohumulona, a

qual apresenta uma massa molecular igual a 348 g mol-1.

Por outro lado, o pico 4, tr = 16,5 minutos, refere-se a trans-iso-n-humulona,

cuja massa molecular 362 g mol-1, resultando no on referente molcula

0 5 10 15 20 25 Time [min]

0

2

4

6

5x10

Intens.

0 5 10 15 20 25 Time [min]

0

2

4

6

5x10

Intens.

251.1278.1 329.2

347.2

369.2

-MS, 11.3-11.5min #(1117-1137), Background Subtracted

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

265.2283.3 343.2

361.3

383.2

-MS, 16.1-16.7min #(1595-1653)

0

1

2

3

4

4x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

soluo comercial de iso--cidos

trans-isohumulonas isoladas

1

2

3

4

5

[M-H]-

[M-H-H2O]-

[M-H-prenila]-

[M-H-isohexenoila]-

[M-H]-

[M-H-H2O]-

[M-H-isohexenoila]-

(a)

(b)

(c)

-

-


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desprotonada [M-H]-= 361 m/z , Figura 11c. interessante ressaltar que a trans-

isoadhumulona, por estar presente inicialmente no extrato de lpulo isomerizado em

pequena quantidade, sua complexao no foi efetiva; consequentemente, no foi

detectada a trans-isoadhumulona na soluo final das trans-isohumulonas isoladas.

Ainda, pela da anlise cromatogrfica do extrato de lpulo pr-isomerizado

(cromatograma em vermelho apresentada na Figura 11a), concedido gentilmente

pela Hopsteiner, constatou-se um excesso de 70% dos ismeros cis- em relao aos

trans-iso--cidos, sendo os percentuais dos compostos apresentados na Tabela 1.

Como um todo, a pureza verificada para a soluo aquosa comercial contendo as

formas cis- e trans-iso--cidos foi de 90%.

Tabela 1. Percentuais de isohumulonas no extrato de lpulo pr-isomerizado.

cis-

isocohumulona

trans-

isocohumulona

iso-n-humulona

(cis- e trans-)

isoadhumulona

(cis- e trans-)25,9% 3,6% 66,0% 4,5%

As trans-isohumulonas isoladas foram caracterizadas ainda por 1H RMN, cujo

espectro obtido encontra-se na Figura 12. A partir deste, foram identificados alguns

sinais caractersticos dos diastereoismeros trans-9,13, cujos deslocamentos

qumicos () so: 2,14 ppm (1H, m); 2,40 ppm (2H, m); 2,70 ppm (2H, d, J = 7 Hz);

3,27 ppm (2H, d, J = 7 Hz); 5,00 ppm (1H, t, J = 7 Hz); 5,18 ppm (1H, t, J = 7 Hz).

Ainda, interessante ressaltar que o sinal em 2,70 ppm caracterstico das trans-

isohumulonas, sendo este parmetro utilizado para a distino destes compostos

dos seus ismeros cis- pela leitura dos espectros de ressonncia magntica nuclear.


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Figura 12. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das trans-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinaismarcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Portanto, constata-se que as formas trans- foram isoladas com sucesso a

partir da complexao seletiva utilizando a -ciclodextrina, resultando em uma

pureza estimada de 95%.

Utilizando um sistema HPLC semi-preparativo, buscou-se isolar os anlogos

trans-isocohumulona e trans-iso-n-humulona. Para tal, testou-se vrias condies

cromatogrficas, variando-se desde a composio da fase mvel at o tipo de

coluna utilizada. Referente fase mvel, testou-se diversos solventes de eluio,

acidificados ou no, bem como a aplicao de gradiente de eluio ou no modo

isocrtico, variando, neste ltimo, a proporo entre os solventes empregados.

Dentre as colunas testadas, Waters X-Bridge C18 5 m (10 mm x 250 mm) e LUNA

C-18 10 m (20 cm x 0,7 cm), a coluna LUNA foi aquela que apresentou maior

eficincia na separao dos anlogos. Desta forma, as melhores condies obtidas


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na separao esto descritas no item 3.2, na qual foi empregado um sistema

isocrtico com a relao de fase mvel de 56% do solvente B sobre o solvente A.

O cromatograma resultante est apresentado na Figura 13, no qual se pode

notar a presena de dois picos majoritrios P.1 e P.2. De fato, o primeiro pico

apresenta o tempo de reteno de 15,0 minutos e refere-se trans-isocohumulona,

ao passo que o pico 2, tr = 18,6 minutos, referente eluio da trans-iso-n-

humulona.

Figura 13. Cromatograma caracterstico das trans-isohumulonas em meio alcolico (5,0 10-3mol L-1)submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo dafase mvel 2,5 mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento= 270 nm.

Assim, os compostos foram coletados em duas fraes respectivas aos picos

P.1 e P.2. No espectro de massas da frao 1, Figura 14, verificou-se a presena

dos ons das molculas desprotonadas [M-H]- 347 e 361 m/z, os quais so

referentes a trans-isocohumulona, [Ma-H]-, e resqucios da trans-iso-n-humulona,

[Mb-H]-, respectivamente. Ainda, os ons 379 e 393 remetem a produtos (impurezas

na amostra) decorrentes da oxidao dos iso--cidos. Como um todo, o percentual


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verificado para a trans-isocohumulona foi de 55% com relao aos demais

compostos presentes, no obtendo uma boa separao cromatogrfica.

Figura 14. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo trans-isohumulona.

Por outro lado, pelo espectro de massas da frao 2, apresentado na Figura

15, obteve-se um percentual de 85% referente a trans-isocohumulona. Aqui, nota-se

a presena dos mesmos ons contidos no espectro de massas da frao 1;

entretanto, a intensidade relativa ao on da molcula desprotonada [M-H]-361 m/z,

respectivo a trans-isocohumulona, bem maior que os demais ons.

Figura 15. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo trans-isohumulonas.

251.0

347.1

361.1

379.1

393.1

-MS, 0.2-2.5min #(27-297)

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.505x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

265.0347.1

361.1

379.1

393.1

-MS, 0.2-1.6min #(20-187)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.05x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

[Ma-H]-

[Mb-H]-

[Mb-H+O2]-

[Ma-H+O2]-

[Ma-H-isohexenoila]-

-

[Ma-H]-

[Mb-H]-

[Mb-H+O2]-

[Ma-H+O2]-


-


57/115


4.3.2. Caracterizao qumica das cis-isohumulonas isoladas.

O espectro eletrnico de absoro da soluo contendo as cis-isohumulonas

isoladas, apresentado na Figura 16, foi similar ao espectro apresentado pelas trans-

isohumulonas, Figura 10. De fato, as bandas centradas em 227 e 279 nm aqui

apresentadas so condizente com os dados reportados na literatura9, sendo os

coeficientes de absortividade molar (227 nm = 10.200 e 279 nm = 11.150 L mol-1cm-1)

iguais para ambos os diastereoismeros cis- e trans-iso--cidos.

Figura 16. Espectro eletrnico de absoro das cis-isohumulonas isoladas em soluo contendo 10mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 4,6 10-5mol L-1.

Caracterizou-se as cis-isohumulonas isoladas por LC-ESI-MSn, obtendo ento

o perfil cromatogrfico apresentado na Figura 17. Neste, possvel observar a

sobreposio do primeiro pico do cromatograma de ons total inerente soluo

comercial de iso--cidos (em vermelho) com o pico 1 do cromatograma de ons

total dos diastereoismeros cis- isolados (em azul). Conforme j mencionado no

texto, estes picos, cujo tempo de reteno 10,5 minutos, so referentes s formas

cis-, sendo que as formas trans- eluem em 11,4 minutos, representado pelo pico 2.


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Figura 17. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formascis- e trans-, (em vermelho) e das cis-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie cis-isocohumulona referente ao pico 1, tr= 10,5 min. (c) Espectro de massas(ESI(-)MS) das espcies cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr= 14,7 min.Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Pelo espectro de massas do pico 1 contido cromatograma das cis-

isohumulonas isoladas, nota-se o on [M-H]- 347 m/z respectivo molcula

desprotonada referente forma cis-isocohumulona, Figura 17b. Por outro lado, o

espectro de massas do pico 3, Figura 17c, cujo tempo de reteno 14,7 minutos,

0 5 10 15 20 25 30 Time [min]

0

2

4

6

8

5x10

Intens.

0 5 10 15 20 25 30 Time [min]

0

2

4

6

8

5x10

Intens.

182.0 233.1

251.0

278.1

329.1

347.1

-MS, 10.2-10.3min # (1018-1026), Background Subtracted

0

2

4

6

4x10Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

196.0

265.1 343.1

361.1

-MS, 14.6-14.8min # (1456-1475), Background Subtracted

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

5x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

1

2

3

4

soluo comercial de iso--cidos

cis-isohumulonas isoladas

(a)

(b)

(c)

-

-

[M-H-prenila-isohexenoila] -

[M-H-isohexenoila-H2O]

-

[M-H-isohexenoila]-

[M-H-prenila]-[M-H-H2O]

-

[M-H]-

[M-H-prenila-isohexenoila]-

[M-H-isohexenoila]- [M-H-H2O]-

[M-H]-


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aponta o on 361 m/z como sendo o on das molculas desprotonadas. Este

referente s formas cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona.

Por fim, as cis-isohumulonas isoladas foram caracterizadas por1

H RMN,

sendo possvel identificar alguns sinais caractersticos destes compostos9,13,

conforme consta na Figura 18. Pela leitura do espectro, pode-se identificar alguns

sinais caractersticos das espcies cis-, cujos deslocamentos qumicos () so:

2,43 ppm (2H, m); 3,30 ppm (2H, d, J = 6,5 Hz); 5,01 ppm (1H, t, J = 6,5 Hz);

5,19 ppm (1H, t, J = 6,5 Hz). Ainda, podem ser notados alguns sinais referentes a

impurezas presentes na amostra, os quais esto marcados no espectro e so

referentes a possveis produtos de oxidao advindos do extrato de lpulo.

Figura 18. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das cis-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinaismarcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Logo, constata-se que as cis-isohumulonas foram isoladas de forma eficaz ao

empregar a complexao seletiva com a -ciclodextrina, obtendo uma pureza

estimada de 90%.


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Empregando a mesma metodologia utilizada ao buscar isolar cada anlogo

das trans-isohumulonas isoladas, os anlogos dos diastereoismeros cis- foram

tentativamente isolados atravs do sistema HPLC semi-preparativo. Pela leitura do

cromatograma contido na Figura 19, verifica-se que os picos P.2 e P.3 referem-se

eluio dos homlogos cis-iso-n-humulona e cis-isoadhumulona da coluna, em 16,9

e 18,6 minutos (tr), respectivamente. O pico P.1 remete a cis-isocohumulona, cujo

tempo de reteno 13,9 minutos.

Figura 19. Cromatograma caracterstico das cis-isohumulonas em meio alcolico (1,0 10-3mol L-1)submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo dafase mvel 2,5 mL min.-1Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento = 270nm.

O espectro de massas do pico P.1, Figura 20, apresenta os ons majoritrios

das molculas desprotonadas [M-H]-361 m/z, [Mb-H]-, e 347 m/z, [Ma-H]

-, os quais

so referentes cis-iso-n-humulona e cis-isocohumulona, respectivamente. Logo, o

percentual verificado da cis-isocohumulona foi estimado em 60% com relao aos

demais compostos presentes; portanto, no se obteve uma separao

cromatogrfica eficiente.


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Figura 20. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo cis-isohumulonas.

No espectro de massas dos picos P.2 e P.3, Figura 21, o on 361 m/z

consiste no on das molculas desprotonadas, o qual referente aos homlogos cis-

isoadhumulona e cis-iso-n-humulona. De fato, a amostra apresentou uma pureza

estimada em 95%, verificando uma boa separao cromatogrfica.

Figura 21. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo cis-isohumulonas.

4.3.3. Caracterizao qumica das dihidro-isohumulonas.

Conforme j exposto, a reduo da funo carbonila do isohexenoila dos iso--cidos conduz a formao dos dihidro-iso--cidos. Logo, verifica-se que estes

251.1265.1

329.1

347.1

361.1

-MS, 3.9-6.8min #(462-815)

0

1

2

3

5x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

265.1 343.1

361.1

-MS, 4.3-7.2min #(518-870)

0

2

4

6

8

5x10

Intens.

100 150 200 250 300 350 m/z

[Ma-H]-

[Mb-H]-

[Ma-H-H2O]-


[Mb-H-isohexenoila]-

-

[M-H]-

[M-H-H2O]-

[M-H-isohexenoila]-

-


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compostos reduzidos apresentam um centro quiral a mais na molcula, o qual se

situa no carbono contendo o grupo hidroxila formado.

Pela leitura do espectro eletrnico de absoro dos dihidro-iso--cidos,

contido na Figura 22, nota-se uma similaridade com os espectros apresentado pelos

precursores, iso--cidos. Este resultado est de acordo com relatos na literatura9,

sendo ento os coeficientes de absortividade molar 10.200 e 11.150 L mol -1 cm-1

respectivos s bandas centradas em 227 e 279 nm.

Figura 22. Espectro eletrnico de absoro das dihidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, emsoluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de2,3 10-5mol L-1.

O perfil cromatogrfico resultante da caracterizao dos derivados reduzidos

dos iso--cidos por LC-ESI-MSn est apresentado na Figura 23. Nota-se a

presena de 6 picos majoritrios, cujos tempos de reteno so: 6,3 minutos, pico 1;

7,6 minutos, pico 2; 8,2 minutos, pico 3; 10 minutos, pico 4; 11,7 minutos, pico 5;

15,1 minutos, pico 6.


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Figura 23. (a) Cromatograma de ons total das dihidro-isohumulonas. (b) Espectro de massas(ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr= 6,3 e 7,6 min.

(c) Espectro d

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