Universidade Federal de Goiás

Faculdade de Farmácia

Determinação de Compostos Fenólicos Totais pelo Método de Folin-Denis em Chá Verde (Camellia

sinensis) comercial

Discente: Sabryne de Oliveira Souza

Docente: Dr. Virgínia Farias Alves

Turma: A01

Trabalho nº 06 Como exigência da discipli-na de Química e Bio-química de Alimentos

Goiânia, junho de 2015.

1. Introdução

O chá produzido a partir das folhas da planta Camellia sinensis (C. sinensis) é, depois da água, a bebida não alcoólica mais consumida no mundo. Durante séculos, o chá tem sido considerado pelos orientais como uma bebida saudável, sendo utilizado na China há aproximadamente 3.000 anos, sendo este país o seu principal produtor. A C. sinensis é amplamente cultivada no sul da Ásia, incluindo China, Índia, Japão, Tailândia, Sri Lanka e Indonésia (RIETVELD e WISEMAN, 2003; TANAKA e KOUNO, 2003).

A partir das folhas da Camellia sinensis são produzidos os tipos de chá, que são dividos em categorias dependendo do tipo de processo a que são submetidas (ASIA, 2010). Basicamente há três tipos de chás tendo como nome científico Camelia sinensis, que são mais consumidos mundialmente: chá verde (sem fermentação), Oolong (parcialmente fermentado) e chá preto (totalmente fermentado) (LIMA et al., 2004; MATSUBARA & RODRIGUEZ-AMAYA, 2006; BETTELHEIM et al., 1995; FERRARA et al., 2001).

O chá verde tem como principal característica suas folhas que não sofrem fermentação. Após a colheita, elas recebem uma vaporização e depois vão para a secagem. Dentro da categoria dos chás verdes, os japoneses ainda subdividem conforme a composição do mix (folhas de primeira colheita, colheita de verão e outono, folhas grandes, misturadas a talos, selecionadas, com grãos grelhados). A escolha é uma questão de preferência. De uma forma geral, o sabor é levemente amargo e o aroma sempre remete a natureza e frescor (ASIA, 2010).

O chá verde é estimulante, adstringente, antioxidante, bactericida e diurético. Tem atividade anti-tumor reportada em estudos clínicos. Rico em flúor, o chá verde previne a queda de dentes. É também útil como cicatrizante, para combater câncer do estômago e da pele, e para reforçar o sistema imunológico. O chá verde é utilizado para desordens estomacais, vômitos e diarréia. A cafeína, como agente ativo, resulta na estimulação do SNC. O tanino tem efeito anti-diarréico (ODY, 1993), proteção da parede do intestino e ataque a bactérias nocivas (O GLOBO, 1999).

Os constituintes mais importantes das folhas do chá de Camelia sinensis são compostos fenólicos, em especial taninos (ácido gálico) e flavonóides (quercetina, miricetina, canferol e catequinas) (LIMA et al., 2004; MATSUBARA & RODRIGUEZ-AMAYA, 2006; BETTELHEIM et al., 1995; FERRARA et al., 2001).

Os taninos são distribuídos em plantas, alimentos e bebidas (MAKKAR e BECKER, 1998; SANTOS et al. 1997). São solúveis em água e em solventes orgânicos polares, sendo capazes de precipitar proteínas (HARTISH e KOLODZIEJ, 1997). Podem atuar como agentes de quelação, removendo as moléculas de metal do organismo e impedindo a sua absorção. Contudo, os cientistas ressalvam que, como a maioria das pessoas recebe através da dieta alimentar uma dose de ferro superior à necessária, uma ou duas chávenas de chá por dia dificilmente resultarão em índices insuficientes de ferro no organismo (ALERT, 2009).

Existem várias técnicas para a determinação de taninos em vegetais, entre os métodos colorimétricos, o método de Folin-Denis é bem reconhecido e largamente usado, mas não faz distinção entre compostos fenólicos e outros materiais redutores ou antioxidantes, como o ácido ascórbico, formando precipitados que interferem na leitura espectrofotométrica (SCHOFIELD e PELL, 2001).

O objetivo desta prática foi determinar a quantidade de taninos presentes em chá verde através do método de Folin-Denis.

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2. Materiais e Métodos2.1. Materiais

2.1.1.Equipamentos Balança analítica

Balão volumétrico

Béquer

Condensador

Espectrofotômetro

Pipetas

Suporte de tubo de ensaio

Tubos de ensaio

2.1.2.Reagentes Reagente de Folin-Denis

Solução saturada de carbonato de sódio

Solução recém preparada de ácido tânico

Reagente Folin-Denis Adicionou-se 100 g de tungstato de sódio diidratado p.a, 20 g

de ácido fosfomolíbdico, 50 mL de ácido fosfórico p.a.

concentrado em 750 mL de água destilada

Colocou-se em refluxo durante 2 horas

Esfriou-se e diluiu-se para 1000 mL (o reagente foi protegido

da exposição à luz)

Esta solução foi preparada pelo monitor.

Solução saturada de carbonato de sódio Adicionou-se 25 g de carbonato de sódio anidro e 100 mL de

água destilada, dissolveu-se a 70ºC e deixou-se esfriar

durante a noite

Adicionou-se alguns cristais de carbonato de sódio

decaidratado p.a., deixou-se em repouso até cristalização e

filtrou-se através de lã de vidro

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Solução preparada pelo monitor

Solução recém preparada de ácido tânico Dissolveu-se 50 mg de ácido tânico p.a. com água destilada

em balão volumétrico de 500 mL

2.2. Amostra (Chá Verde) Esquentou-se em chapa elétrica 200 mL de água destilada

em um béquer até 80ºC.

Pesou-se 1,5 g do chá verde em um béquer. Adicionou-se a

água destilada. Manteve-se a infusão por 5 minutos, com

agitação periódica

Filtrou-se o chá verde (papel de filtro) em um balão

volumétrico de 200 mL

Esfriou-se o chá em banho de gelo e completou-se o volume

do balão com água destilada para 200 mL.

2.3. Procedimento

2.3.1.Padrão de ácido tânico Pipetou-se alíquotas de 8,5 – 8,3 – 8,1 – 7,9 – 7,7 – 7,5 mL de

água destilada em tubos de ensaio previamente numerados

Adicionou-se, respectivamente, 0,0 – 0,2 – 0,4 – 0,6 – 0,8 – 1,0 mL

da solução de ácido tânico nos tubos de ensaio

Adicionou-se 0,5 mL do reagente de Folin-Denis em cada tubo

Adicionou-se 1,0 mL da solução de carbonato de sódio em cada

tubo. Agitou-se todos os tubos

Deixou-se em repouso por 30 minutos e leu-se a absorbância a

760 nm.

2.3.2. Amostra Transferiu-se 5 mL da amostra para um balão volumétrico de 50

mL e completou-se o volume com água destilada. Agitou-se o

balão

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Pipetou-se alíquotas de 8,3 – 8,2 – 8,1 – 8,0 – 7,9 mL de água

destilada em tubos de ensaio previamente numerados

Adicionou-se, respectivamente, 0,2 – 0,3 – 0,4 – 0,5 mL da

amostra nos tubos de ensaio

Adicionou-se 0,5 mL do reagente de Folin-Denis em cada tubo

Adicionou-se 1,0 mL da solução de carbonato de sódio em cada

tubo. Agitou-se todos os tubos

Deixou-se em repouso por 30 minutos e leu-se a absorbância a

760 nm.

3. Resultados 3.1. Método de Origin

3.1.1. Padrão de Ácido Tânico

Os valores para as absorbâncias do conteúdo dos tubos de ensaio

encontram-se na tabela abaixo, relacionados com a quantidade de ácido tânico

contida nas respectivas alíquotas retiradas da solução estoque.

A quantidade pesada de para solução estoque foi de 50 mg. O cálculo da massa de

ácido tânico presente nas alíquotas foi realizado da seguinte maneira:

500 mL solução estoque ___________ 0,50 mg de ácido tânico

0,2 mL (alíquota tubo 01) ___________ XXXXXXXXXX

X = 0,02 mg de ácido tânico

X’ = 0,04 mg de ácido tânico

X’’ = 0,06 mg de ácido tânico

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Tubo Alíquota (mL) Absorbância Quantidade de ácido tânico (mg)

1 0,2 0,139 0,02

2 0,4 0,241 0,04

3 0,6 0,328 0,06

4 0,8 0,394 0,08

5 1,0 0,469 0,10

X’’’ = 0,08 mg de ácido tânico

X’’’’ = 0,10 mg de ácido tânico

Utilizando o software “Excel 2010” lançou-se os valores das concentrações de

ácido tânico e das absorbâncias para os eixos X e Y, respectivamente, obtendo-se a

curva padrão a seguir:

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.110

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

f(x) = 4.065 x + 0.0702999999999999R² = 0.992821608176067

Series2Linear (Series2)

3.1.2. Amostra

Após leitura de absorbância da amostra de chá verde a 760 nm,

obteve-se os valores apresentados na tabela a seguir:

Tubo Volume da alíquota de amostra no tubo (mL)

Absorbância (nm)

1 0,2 0,2472 0,3 0,3373 0,4 0,4294 0,5 0,493

Tabela 2: Absorbância da amostra de chá verde

Comparando os valores de absorbância da solução padrão com os

valores da amostra, observa-se que a absorbância da amostra de chá que

mais se aproxima do valor central da curva padrão, é a absorbância do tubo

2, com 0,337 nm comparando-se a absorbância de 0,328 nm do tubo 3 da

curva padrão. Portanto, tomamos como melhor tubo, o tubo número 2 da

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amostra de chá, utilizando este valor de absorbância para efeito do cálculo

da concentração de taninos nesta amostra.

Então, a partir da equação da reta:

Y=4,065 x+0,0703

X é a concentração de taninos existente na amostra e Y é a melhor

absorbância observada. Isolando X, e substituindo o valor de 0,337 nm em

Y, temos:

4,065 x=Y−0,0703

4,065 x=0,337−0,0703

4,065 x=0,2667

X=0,0656mgde tanino em0,3mLdeamostra

Então, considerando a amostra de chá verde analisada, um saquinho,

que continha 1,6 g foi diluído em 200 mL e posteriormente em 50 mL, temos:

1,5 g 200 mL --------------------------------- C

A 5 mL 50 mL -------- B

0,3 mL ------- 0,0656 mg de

tanino

Por regra de três simples, encontra-se A:

1,5 g ----- 200 mL

A ------ 5 mL

A = 0,0375 g

Encontra-se B:

50 mL ----- B

0,3 mL ----- 0,0656 mg de tanino

B = 10,93 mg

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E encontra-se C:

1,5 g ---- 200 mL ------ C

0,0375 g ---- 5 mL ------ 10,93 mg

C = 437,2 mg

1500 mg de chá ------ 100%

437,2mg ------ x

X = 29,15% de taninos

4. Discussão

Portanto, a amostra de chá verde analisada contém 29,15% de taninos. Simões

et. al (2004), em estudo para determinação de taninos em folhas não fermentadas

da Camellia sinensis L., as folhas do chá verde, encontrou valores entre 10 a 24%

de taninos. Já Schimitz (2005) encontrou em seu experimento, que as folhas do chá

verde continham, cerca de 30% de compostos fenólicos, que contribuem para o

sabor, o aroma e a coloração dos vegetais em geral, sendo que o tanino é um

composto fenólico. E Lima et. al (2009), obteve valores de taninos para o chá verde

entre 13% e 69%. Nota-se que, o valor encontrado neste experimento está de

acordo com os citados em literatura, principalmente o valor verificado por Schimitz

(2005), já que este encontrou variações nos teores de até 30% de taninos, um valor

muito próximo de 29,15% que foi o encontrado no experimento.

A maioria dos compostos fenólicos não é encontrada no estado livre na natureza,

mas sob forma de ésteres ou de heterosídeos sendo, portanto, solúveis em água e

em solventes orgânicos polares (MELLO e SANTOS, 2001). Por serem fenólicos, os

taninos são muito reativos quimicamente, formam pontes de hidrogênio, intra e

intermoleculares. Um mol de taninos pode ligar-se a doze moles de proteínas;

fundamentando-se nessa propriedade pode-se identificar taninos por teste de

precipitação de gelatinas, por exemplo (MELLO e SANTOS, 2001; CHUNG1 et. al,

1998; BIANCO e SAVOLAINEN, 1997; VICKERY e VICKERY, 1981). Estes

compostos são facilmente oxidáveis, tanto através de enzimas vegetais específicas

quanto por influência de metais, como cloreto férrico, o que ocasiona o

escurecimento de suas soluções (MELLO e SANTOS, 2001).

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Como o método de Folin-Denis não faz distinção entre compostos fenólicos e

outros materiais redutores ou antioxidantes, pode-se afirmar que o valor encontrado

é uma estimativa da quantidade de taninos presentes na amostra de chá verde, o

que pode justificar ainda as diferenças dos valores encontrados em literatura. Os

taninos vegetais têm sido quantificados por diversos tipos de ensaios, como

precipitação de metais ou proteínas e por métodos colorimétricos, sendo esses

últimos mais comuns. Os métodos mais apropriados para determinação de taninos

são os ensaios com precipitação de proteínas (HAGERMAN e BUTLER, 1989;

HAGERMAN et. al, 1997). Alguns ensaios colorimétricos são usados para quantificar

grupos de taninos específicos, muito embora estes métodos sejam amplamente

usados para analisar taninos de uma maneira geral (MONDAL et. al, 2001;

MUELLER-HARVEY, 2001), talvez por isto, haja ainda tais variações encontradas

pelos autores e neste experimento.

As variações dos teores encontrados para fenóis totais e taninos, em literatura e

no experimento, não são fixos, o que foi observado. Como as plantas, que apesar de

imóveis são organismos dinâmicos, o esperado é que o acúmulo de polifenóis varie

ao longo das estações do ano, pois o conteúdo polifenólico é dependente de fatores

intrínsecos (genéticos) e extrínsecos - ambientais (FRATIANNI et al. 2007) variando

diante de diversas situações, como o tipo de órgão da planta (FALLEH et al. 2008),

fase do desenvolvimento vegetal (SCHWEITZER et al. 2008), local de cultivo ou

ocorrência e entre as diferentes estações do ano (BUSSOTTI et al. 1998, MA et al.

2003, BROOKS & FEENY 2004). As variações do conteúdo polifenólico são

definidas por base genética que é fortemente afetada pelas condições seja do

ambiente natural ou de cultivo (CONDE et al. 2008). Estas justificativas servem

ainda, para explicar e confirmar as variações existentes em cada pesquisa

encontrada por literatura e no experimento realizado.

Os taninos são considerados nutricionalmente indesejáveis porque precipitam

proteínas, inibem enzimas digestivas e afetam a utilização de vitaminas e minerais

podendo, ainda, em alta concentração, desenvolver câncer de bochecha e esôfago

(CHUNG1 et. al, 1998; CHUNG2 et. al, 1998; CASTRO et. al, 1999; SINGH et. al,

2001) e são responsáveis pela adstringência de muitos frutos e plantas em geral

(AERTS et. al, 1999). Apesar de apresentar desvantagens, um alimento rico em

taninos é considerado um alimento funcional, por isso recomenda-se o consumo de

chá verde: várias doenças degenerativas como câncer, esclerose múltipla,

9

arteroesclerose e o próprio processo de envelhecimento estão associados a altas

concentrações intercelulares de radicais livres, estudos recentes mostram que vários

taninos atuam como captadores de radicais, os quais interceptam o oxigênio ativo

formando radicais estáveis (MELLO e SANTOS, 2001), ou seja, atuam como

antioxidantes naturais.

Além disso, por via interna exercem efeito antidiarréico e anti-séptico; por via

externa impermeabilizam as camadas mais expostas da pele e mucosas,

protegendo assim as camadas subjacentes. Ao precipitar proteínas, os taninos

propiciam um efeito antimicrobiano e antifúngico. Ademais, os taninos são

hemostáticos e, como precipitam alcalóides, podem servir de antídoto em casos de

intoxicações (BRUNETON, 1991). Em processos de cura de feridas, queimaduras e

inflamações, os taninos auxiliam formando uma camada protetora (complexo tanino-

proteína e/ou polissacarídeo) sobre tecidos epiteliais lesionados, podendo, logo

abaixo dessa camada, o processo curativo ocorrer naturalmente (MELLO e

SANTOS, 2001).

5. Conclusão Pode-se concluir que o método de Folin-Denis foi efetivo para a extração e

taninos totais em chá verde (Camellia sinensis), devido ao valor encontrado no

experimento estar compreendido nas faixas encontradas para essa determinação

em literatura. Apesar das diferenças apresentadas pelos autores, pode-se dizer que

o valor é aceitavél, já que a própria técnica utilizada apresenta desvantagens e que

também, as técnicas utilizadas pelos autores citados, pode não ser a mesma

utilizada neste experimento, sendo outras mais específicas, fornecendo, portanto,

valores mais específicos ou para diferentes formas de taninos.

Outro ponto observado foi que condições ambientais que a planta estava sujeita

também interferem na quantificação destes compostos, portanto, para conferir total

eficiência para tal comparação, seria necessário padronizar as amostra analisadas

quanto, por exemplo, idade, época de colheita, condições de armazenamento, etc.,

visto que os taninos são muito reativos e isto afetará no valor final destes.

Esta aula foi de grande valia ao conhecimento de um profissional farmacêutico,

visto que, pode se aprender acerca de um composto considerado nutricional, mas

que em determinadas condições se torna um fator antinutricional.

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O resultado está dentro dos valores esperados e a experiência adquirida foi de

suma valia. Uma maior atenção por parte dos alunos, assim como um maior

interesse acarretaria em resultados ainda melhores e um aprendizado mais sólido.

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