TCNICAS BSICAS DETCNICAS BSICAS DETCNICAS BSICAS DETCNICAS BSICAS DE MORFOLOGIA VEGETALMORFOLOGIA VEGETALMORFOLOGIA VEGETALMORFOLOGIA VEGETAL

A morfologia vegetal, ao estudar a forma descrevendo as relaes

espaciais dos elementos estruturais, utiliza-se de recursos diversos, tais como: lupa

para a anlise de rgos (escala em cm ou mm), microscpio fotnico para a

observao de sistemas, tecidos e clulas (escala em m), e microscpio eletrnico

para o estudo de organelas celulares (escala em ) . Para que o material possa ser

visualizado ao microscpio deve ser processado segundo microtcnicas vegetais.

MICROTCNICA VEGETALMICROTCNICA VEGETALMICROTCNICA VEGETALMICROTCNICA VEGETAL O material a ser observado ao microscpio deve ser fino e transparente,

de modo a permitir a passagem de luz. Pode ser preparado a fresco, indicado para

estruturas delicadas ou muito hidratadas e para testes histoqumicos; ou pode ser

fixado, o que detm os processos vitais de autlise. As amostras so fragmentadas

e diafanizadas, ou seccionadas mo livre ou por micrtomo (de deslize, rotativo,

ultramicrtomo etc.), obtendo-se preparaes temporrias, semipermanentes ou

permanentes.

CORTES HISTOLGICOSCORTES HISTOLGICOSCORTES HISTOLGICOSCORTES HISTOLGICOS

CORTES MO LIVRECORTES MO LIVRECORTES MO LIVRECORTES MO LIVRE

uma tcnica simples e rpida, que requer certa habilidade manual

para obteno de cortes finos, executando-se como se segue :

selecionar parte adequada do vegetal e apar-la segundo o sentido do corte

(transversal ou longitudinal);

quando material muito rgido, reidrat-lo ou ferv-lo em gua;

quando muito delicado, inclu-lo em suporte (isopor, cortia, medula de embaba

ou sabugueiro etc.);

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segurar o material com uma das mos e com a outra seccion-lo com navalha ou

lmina cortante nova;

receber os cortes em vidro-de-relgio contendo gua;

selecionar os mais delgados, transportando-os com pincel ou estilete;

se necessrio, diafanizar com soluo de cloral hidratado a 60% ou de hipoclorito

de sdio a 20%;

lavar os cortes com gua;

cor-los com reagentes ou corantes adequados;

para preparao temporria, confeccionar as lminas utilizando como meio de

montagem gua ou soluo de etanol a 30%, cobrindo com lamnula;

para preparao semipermanente, confeccionar as lminas com soluo de

glicerina a 60% ou gelatina glicerinada, cobri-las com lamnula e lutar com esmalte

incolor;

para preparao permanente, desidratar progressivamente os cortes em srie

etanlica (50, 70, 90, 100 e novamente 100%) e diafanizar em srie etanol-xillica

(3:1, 1:1, 1:3 e xilol puro); montar as lminas com blsamo-do-canad ou resina

sinttica.

CORTES CORTES CORTES CORTES EM EM EM EM MICRTOMOMICRTOMOMICRTOMOMICRTOMO

O micrtomo permite que se obtenham cortes com espessura definida, a

partir de material rgido ou, quando frgil, infiltrado em suporte adequado. O

micrtomo de deslize secciona o material em cortes individuais, enquanto que o

rotatrio possibilita a formao de uma fita, com cortes sequenciais.

O preparo das amostras para seccionamento geralmente envolve

fixao, desidratao, infiltrao e emblocamento.

FixaoFixaoFixaoFixao

O processo de fixao procura preservar a estrutura celular, sem alterar

a qumica da clula. Os fixadores so agentes fsicos (calor, frio, dessecamento) ou

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qumicos, sendo que estes ltimos, coagulam ou precipitam protenas celulares e

endurecem os tecidos.

Os fixadores qumicos podem ser simples ou misturas. Os primeiros

so geralmente solues aquosas de uma nica substncia, como :

etanol a 70% - precipita as protenas e os cidos nucleicos e dissolve os lipdios;

cido actico a 5% - precipita as nucleoprotenas e difunde-se com facilidade;

acetona - poderoso solvente de lipdios e preservante de enzimas;

tetrxido de smio - forte oxidante, muito voltil e irritante;

formalina ou formaldedo a 40% - endurece os tecidos, embora no dissolva os

lipdios.

Entre os segundos - as misturas - diversas substncias tm

demonstrado poder de fixao superior, a saber :

FAA 50 ou 70 - compe-se de formalina, cido actico e lcool etlico. O etanol

produz retrao do protoplasma, no entanto o cido actico o expande; o lcool e a

formalina endurecem os tecidos, enquanto o cido os amacia;

FPA - modificao do fixador anterior, onde o cido actico substitudo pelo cido

propinico;

Nawaschin - no causa endurecimento nem retrao do material, porm possui

pequena penetrao.

O tempo para que ocorra fixao varivel, dependendo do fixador

escolhido, do volume da pea a ser fixada e da resistncia da mesma penetrao

dos reagentes. Exemplificando, material delicado, como folhas membranceas, pode

ser fixado em 12h, enquanto que ramos lenhosos podem necessitar de 7 dias.

Depois de fixado, o material estocado em soluo de etanol a 70% indefinidamente.

DesidrataoDesidrataoDesidrataoDesidratao

A desidratao remove a gua dos tecidos fixados e endurecidos, para

que a matriz possa penetrar nas clulas e tornar o material resistente ao impacto do

micrtomo. O mtodo de desidratao mais comum emprega srie etanlica, onde o

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material passa sucessivamente por solues cada vez mais concentradas de etanol

(50, 70, 90, 100 e 100%), por um tempo determinado.

InfiltraoInfiltraoInfiltraoInfiltrao

Quando a matriz escolhida insolvel em etanol, este deve ser

substitudo gradualmente por um solvente onde a mesma seja solvel, para que

possa penetrar no interior da clula. No caso da matriz ser parafina, aps

desidratao, o material passa por srie etanol-xillica (3:1, 1:1, 1:3, xilol puro), o que

o torna apto a receber a matriz. Procede-se substituio gradativa do xilol pela

parafina, adicionando-se parafina fundida em estufa ao solvente e descartando-se

metade da mistura, repetidamente aps tempo adequado.

Frequentemente, a matriz de escolha a parafina, por ser menos

onerosa e apresentar bons resultados. Entretanto, pode-se optar por :

paraplast - mistura de parafina altamente purificada com polmeros plsticos e

dimetilsulfxido, que permite melhor penetrao e infiltrao (aderncia);

celoidina - nitrato de celulose, que se solubiliza em mistura de lcool e ter, em

ambiente anidro;

metacrilato - historresina ou metacrilato glicol diestearato, solvel em gua e usado

para materiais duros.

Incluso Incluso Incluso Incluso ou ou ou ou emblocamentoemblocamentoemblocamentoemblocamento

O material devidamente infiltrado colocado em um molde (caixinha de

papel ou de plstico), que preenchido pela matriz, de modo a formar um pequeno

bloco. Este aparado e pode ser encaixado no micrtomo para ser seccionado.

Seccionamento Seccionamento Seccionamento Seccionamento em em em em micrtomomicrtomomicrtomomicrtomo

O bloco devidamente aparado colocado sobre suporte, fixado no

micrtomo e seccionado. A fita formada ou os cortes individuais so apoiados em

fundo escuro para facilitar a visualizao.

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Distenso dos cortesDistenso dos cortesDistenso dos cortesDistenso dos cortes

Os cortes so aderidos a lminas histolgicas, geralmente utilizando-se

dos adesivos de Haupt ou Bissing. Essas lminas so colocadas em placa

aquecedora at distenso dos cortes (ficam translcidos) e depois levadas estufa

para secar.

Desparafinizao e diafanizaoDesparafinizao e diafanizaoDesparafinizao e diafanizaoDesparafinizao e diafanizao

As lminas so retiradas da estufa e imersas em xilol para retirada da

parafina (matriz). So coradas, usualmente por meio de reidratao, soluo de

corante e desidratao, como se segue : srie etanol-xillica (1:3, 1:1, 3:1 e etanol a

100%), srie etanlica descendente (100, 90, 70 e 50%), colorao com soluo de

corante a 50% em etanol, srie etanlica ascendente (50, 70, 90, 100 e 100%) e srie

etanol-xillica (3:1, 1:1, 1:3 e xilol puro). O xilol favorece a transparncia dos cortes.

MontagemMontagemMontagemMontagem

lamnula adiciona-se o meio de montagem (blsamo-do-canad,

euparal ou resinas sintticas: Harlecco, Permount etc.) e esta sobreposta na lmina,

deixando secar.

DISSOCIAO DISSOCIAO DISSOCIAO DISSOCIAO DE DE DE DE ELEMENTOS ELEMENTOS ELEMENTOS ELEMENTOS CELULCELULCELULCELULARES ARES ARES ARES Os cortes histolgicos apresentam as estruturas bidimensionalmente.

Para se obter uma viso tridimensional, os elementos celulares devem estar isolados,

mediante tcnica de dissociao ou macerao. Essa tcnica consiste na separao

mecnica e qumica das clulas, por meio de reagentes que desintegram a lamela

mdia. Vrios mtodos podem ser aplicados, tais como :

mtodo de Jeffrey - mistura de cido ntrico a 10% e cido crmico a 10%,

na proporo de 1:1;

mtodo de Foster - mistura de etanol a 70% e cido clordrico concentrado

(3:1);

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mtodo de Franklin - mistura de gua oxigenada 20 vol. e cido actico

glacial (1:1).

DIAFANIZAO DIAFANIZAO DIAFANIZAO DIAFANIZAO OU OU OU OU CLARIFICAOCLARIFICAOCLARIFICAOCLARIFICAO A tcnica de tornar semitransparentes peas vegetais de tamanhos

variados, geralmente laminares, denominada de diafanizao ou clarificao.

Basicamente consiste na dissoluo do contedo celular, restando apenas a parede

celular, o que se presta eficientemente para o estudo da nervao foliar.

Os reagentes empregados para diafanizao comumente so solues

aquosas de hidrxido de sdio a 5-20%, cloral hidratado a 30-60% ou hipoclorito de

sdio a 10-20%. Para se confeccionar lminas permanentes, o material diafanizado

corado, desidratado em srie etanlica e etanol-xillica e montado com blsamo ou

resina, entre lmina e lamnula.

PREPARO PREPARO PREPARO PREPARO DE DE DE DE SOLUES SOLUES SOLUES SOLUES

Fixadores

NawaschinNawaschinNawaschinNawaschin cido crmico a 1% 75ml cido actico glacial 5ml formalina 20ml

FFFF AAAA A A A A 50505050 ((((ou ou ou ou 70 70 70 70 )))) formalina 5ml cido actico glacial 5ml lcool etlico a 50% (ou 70%) 90ml

Craft Craft Craft Craft IIIIIIIIIIII cido crmico a 1% 30ml cido actico a 10% 20ml formalina 10ml gua destilada 40ml

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Corantes e reagentes SudanSudanSudanSudan IVIVIVIV Sudan IV 5g etanol a 80% 100ml glicerina 10ml LugolLugolLugolLugol iodo 1g iodeto de potssio 3g gua destilada 300ml

Cloreto Cloreto Cloreto Cloreto de de de de zinco zinco zinco zinco iodadoiodadoiodadoiodado cloreto de zinco 30g iodo 0,9g iodeto de potssio 5g gua destilada 14ml Floroglucinol Floroglucinol Floroglucinol Floroglucinol clordricoclordricoclordricoclordrico etanol a 95% 100ml cido clordrico 25ml floroglucinol 1g gua destilada 25ml

Sulfato Sulfato Sulfato Sulfato frricofrricofrricofrrico sulfato frrico 10g formalina 5ml gua destilada 100ml Cloreto Cloreto Cloreto Cloreto frricofrricofrricofrrico cloreto frrico 10g carbonato de clcio traos gua destilada 100ml Azul Azul Azul Azul de de de de astraastraastraastra azul de astra 0,5g cido tartrico 2g gua destilada 100ml

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Fucsina Fucsina Fucsina Fucsina bsicabsicabsicabsica fucsina bsica 0,5g etanol a 50% 100ml

SafraninaSafraninaSafraninaSafranina safranina 1g etanol a 95% 100ml * no momento do uso, diluir em gua destilada (1:1).

Adesivos

Adesivo Adesivo Adesivo Adesivo de de de de HauptHauptHauptHaupt gelatina 1g fenol 2g glicerina 15g gua destilada 100ml Adesivo Adesivo Adesivo Adesivo dededede BissingBissingBissingBissing formalina 6ml adesivo de Haupt 1,4ml gua destilada 194ml

Meio de montagem

GelatinaGelatinaGelatinaGelatina glicerinada glicerinada glicerinada glicerinada de de de de KaiserKaiserKaiserKaiser glicerina 70ml gelatina 10g fenol 1,4g gua destilada 60ml

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BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

BERLYN, G.P. & MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa Sate University Press, 1976. BUCHERL, W. Tcnica microscpica. 3.ed. So Paulo: Polgono, 1962. FOSTER, A.S. Practical plant anatomy. 2.ed. Princeton: D. Van Nostrand, 1949. FRANKLIN, G.L. Preparation of thin sections of synthetic resins and wood-resin composites, and a new macerating method for wood. Nature, London, v. 155, n. 3924, p. 51, 1945. JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw-Hill Book, 1940. ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur. Mikrokosmos, Stuttgart, v. 61, n. 2, p. 33-36, 1962. SASS, J.E. Botanical microtechnique. 2.ed. Ames: Iowa State College Press, 1951.