Técnicas de Contagem Em Placa

8/16/2019 Técnicas de Contagem Em Placa

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Profª Fláia !uta

"lunos#

$uana Fafi%es

Mariana Magalh%es

&ac'el (ilestre

Thamiris Corr)a

&io de *aneiro+ ,- de Maio de ./,0

1. Objetivos

Quantifcar o número de colônias para dierentes diluições a

partir de uma suspensão de ermento biológico utilizando técnicas de

plaqueamento distintas e estimar o número de UF!m"#

2. Introdução

$#% "e&eduras

"e&eduras são micro'organismos cu(o crescimento dominante se

d) na orma unicelular* não possuem +agelos ou outros órgãos de

locomoção# , reprodução é asse-uada por brotamento multilateral e

polar ou por fssão* e se-uada por meio de esporos# ,s caracter.sticas

morológicas das le&eduras determinadas por microscopia mostram

ormas eséricas e o&óides* p/ra* cil.ndrica e mesmo alongadas em

pseudomicélio# 0m geral* as células de le&eduras são maiores do que

das bactérias* mas as menores le&eduras não são tão grandes como

as maiores bactérias# 0sses microrganismos &ariam

considera&elmente* no que se reere 1s suas dimensões* com limites

desde % a 2 3 de largura e 2 a 45 3 de comprimento# 67890:,9;

,""09; 8?>8?,; FU970; ,@0* $55$A#


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ada espécie tem uma orma caracter.stica* mas* mesmo em

culturas puras* B) consider)&eis &ariações de tamanBo e de orma

das células indi&iduais* dependendo da idade e do ambiente#

,presentam partes &is.&eis como parede celular* citoplasma*

&acúolos* glóbulos de gordura* grCnulos e núcleo 60,>8

,9>89D9D*$555A#

=e&ido 1 importCncia econômica dos processos biotecnológicos

en&ol&endo a le&edura Saccharomyces* na panifcação* produção de

cer&e(a* &inBo e outras bebidas alcoólicas* querem como no caso no

Erasil* na produção de um combust.&el alternati&o e reno&)&el* tal

organismo pode ser considerado o eucariótico mais estudado e cu(o

metabolismo é o mais conBecido entre a espécie 6,QU,?890; "D:,;

E8?,9D* $55%A#

>endo em &ista a importCncia apresentadas pelas le&eduras* as

linBagens desses micro'organismos oram sendo selecionadas

segundo caracter.sticas dese()&eis ao processo e ao produto# ,

produti&idade e a efci/ncia de ermentação* a tolerCncia ao etanol e

1 temperatura* a resist/ncia 1s altas concentrações de açúcares* a

Babilidade de +ocular e de produzir ou não certos componentes do

aroma das bebidas e a propriedade de produzir metabólitos anti'

contaminantes são constantes ontes de interesse 6G,::89=* %HH2A#

eccato',ntonini 6$55IA ad&erte que além da escolBa e da

preparação do ermento* algumas condições ótimas de&em ser

mantidas durante o processo industrial no sentido de obter

produti&idade m)-ima de etanol a partir dos açúcares

ermentesc.&eis# 0ntre os parCmetros a serem considerados* de&em

fgurar* o teor de ermento na dorna* a &iabilidade celular* a

ocorr/ncia de inecções* o pG* a temperatura e a concentração de

açúcares redutores totais no mosto# G)* dessa orma* necessidade de

um rigoroso controle do processo de ermentação* en&ol&endo a

a&aliação dos rendimentos pr)ticos e simultaneamente o

monitoramento microbiológico#


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8 estudo da reciclagem das le&eduras durante o processo

industrial torna'se de &ital importCncia quando da an)lise dos teores

de compostos tó-icos 1 ermentação* &isto que* se eles são

produzidos durante o processo e podem acumular'se no inóculo

promo&endo perdas de &iabilidade* abai-ando a efci/ncia e

comprometendo a produti&idade industrial 6878"8* %HJKA#

,lém do rendimento industrial* outro ponto a ser considerado na

manutenção da &iabilidade das le&eduras* assim como da qualidade

desses micro'organismos é a possibilidade de comercialização para

utilização na nutrição de animais#

,s le&eduras reúnem caracter.sticas a&or)&eis para seu

emprego como complemento nutricional animal principalmente pelo

alto conteúdo de nutrientes

acilmente assimilados pelo organismo e de alto &alor nutricional*

sendo um e-celente componente alimentar e de r)pido crescimento

68LM?DNG>* $552A#

@egundo dados da 0mbrapa 6%HH%A* a le&edura de destilaria de

)lcool de cana'de açúcar é um alimento rico em prote.na de alto &alor

biológico e uma boa onte de lisina* leucina* treonina* &itaminas do

comple-o E* carboidratos* lip.dios e minerais#

$#$ ontagem de "e&eduras

eccato',ntonini 6$55IA e-plica que a estimati&a de células

&i)&eis é importante também para estabelecer a tolerCncia da

le&edura ao seu produto#

Lara estimar a proporção de células &i)&eis* métodos baseados

no plaqueamento ou obser&ação microscópica t/m sido utilizados# 8s

métodos de contagem direta no microscópio são r)pidos e simples*

e-igem um m.nimo de equipamento* permitindo que se(a obser&ada*

simultaneamente* a morologia celular 60,>8',9>89D9D* $55IA#

$#4 ontagem por plaqueamento


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8 método de contagem de micro'organismos em placas é um

método geral e &ers)til que pode ser utilizado tanto para a contagem

de grandes grupos microbianos* como aeróbios mesóflos* aeróbios

psicrotróflos* bolores e le&eduras e clostr.dios sulfto redutores* como

também para a contagem de g/neros e espécies em particular* como

Staphylococcus aureus* Bacillus cereus e Clostridium perfringens#

Oariando o tipo de meio 6enriquecimento* seleti&o* seleti&o'

dierencialA e as condições de incubação 6temperatura e atmoseraA* é

poss.&el selecionar o grupo* g/nero ou espécie que se dese(a contar

6@D"O,;


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Figura 1: Esquema explicativo do procedimento para execução da tcnica de

diluiç!es seriada e plaqueamento em placas e contagem. Fonte: adaptado de

"omeiro #2$$2%.

8 método de microbiologia cl)ssico de contagem de

microrganismos &i)&eis é o da inoculação em placas de Letri

contendo meio de cultura adequado com incubação por um per.odo

de até K$ Boras* tempo que é necess)rio para conseguir contagem

mais precisa* mas em razão do tempo necess)rio para a leitura* esse

método não é usado nas usinas#

0m razão deste obst)culo* o método padronizado e adotado

pelas usinas é o descrito por "ee; ?obinson; Pang 6%HJ%A que utiliza

azul de metileno como corante seguido de contagem em cCmara de

9eubauer* usando um microscópio óptico* em aumento de I55#

$#I ontagem pela cCmara de 9eubauer

, Cmara de 9eubauer consiste de uma lCmina de microscopia*

bem mais alta do que uma lCmina normal* onde e-iste uma cCmara

gra&ada no &idro 6as duas partes indicadas por setas no centro da

Figura $ R cada lCmina contém geralmente duas cCmarasA# ,o lado da

cCmara e-istem dois suportes 6as duas barras cinza claras ao lado da

cCmara na Figura $A que mantém uma lam.nula especial de quartzo

e-atamente a %5'% mm acima da base da cCmara# Lortanto* quandose coloca uma solução na cCmara e se cobre a mesma com a


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lam.nula* a proundidade da solução é conBecida 6"U,?D9D; @D"O,;

ED,9GD* $55IA#

Figura 2& '(mara de )eubauer

9o centro desta lCmina e-istem &)rias linBas perpendiculares

com marcações em quadrantes# ,o analisar em microscópico com

aumento de %55-* pode'se perceber que e-istem tr/s tipos de

quadrantes* conorme ilustrado na Figura 4,* que (untos ormam um

quadrado maior# 9o caso de contagem de le&eduras os quadrantes

utilizados são os que estão dentro do c.rculo* de acordo apresentado

na Figura 4E# 0m lCminas padrão esses quadrantes centrais totalizam

$2# ada quadrante é composto por %S ret.culos* como mostrado na

Figura 4# 0stes quadrantes são utilizados para azer as contagens e

assim determinar a concentração de células em um determinado

&olume de amostra* e deste modo calcular a concentração total de

células de le&eduras#


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Figura *& Esquema do quadrante e ret+culos da '(mara de )eubauer

, técnica de coloração com azul de metileno consiste na misturade partes iguais da suspensão de le&eduras* se necess)rio dilu.da* e

da solução corante azul de metileno# ,s células com alta ati&idade

fsiológica não se colorem enquanto que as células inati&as

apresentar'se'ão coloridas de azul# , porcentagem ou o número de

células &i)&eis é determinado transerindo'se com uma pipeta de

Lasteur a amostra para cCmara de 9eubauer 60,>8',9>89D9D*

$55IA#9a literatura e-istem poucos trabalBos realizados com

comparação entre

métodos de contagens#

8s resultados apresentados por astro; ereda; Erasil 6%HJ$A que

compararam a contagem de le&eduras &i)&eis por plaqueamento em

,gar Eatata com o de corante &ital* usando azul de metileno e

eritrosina* em laboratório* com le&edura comercial* indicaram queBa&ia correlação entre o método de plaqueamento e as contagens

pelos dois corantes* pois não dieriram entre si# @egundo esses

autores a seleção do corante seria apenas uma questão de acuidade

&isual e preer/ncia pessoal#

>re&ors et al# 6%HJ4A* em trabalBo com quatro linBagens de

Saccharomyces culti&adas em meio :MNL 6e-trato de malte* peptona

e glicoseA e incubadas a $2T* utilizando oito métodos para a

contagem de células* relatam que a contagem de células de le&edura


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com o corante azul de metileno em cCmara de 9eubauer

proporcionou correlação aceit)&el* comparando'se com a técnica

padrão de contagem em placa# Lortanto esses mesmos autores

destacam que dependendo do ob(eti&o da utilização desses

microrganismos principalmente em ermentações em escala industrial

pode ser necess)rio usar uma técnica de contagem dierente para as

espécies ou &ariedades#

"ogo 7ocB et al# 6%HJSA ad&ertem que a contagem de células de

le&edura pela cCmara de 9eubauer em n.&eis mais bai-os de

contagens* apresenta alta de precisão#

,pesar da importCncia desta an)lise* ela tem sido eita de orma

manual e

demorada que causa cansaço &isual* podendo le&ar 1 imprecisão* e

ainda e-ige um técnico treinado# 0ntretanto essa técnica apresenta

bai-o rendimento e su(eito 1 interer/ncia por acuidade &isual#

8 rendimento das usinas na produção do etanol pode ser

incrementado de orma consider)&el* com o incremento de um

sistema para a contagem autom)tica de células de le&eduras &i)&eis

e in&i)&eis em imagens microscópicas digitalizadas#

$#2 :étodo pour plate

8 método pour plate* ou semeadura em proundidade* é

empregado para obter colônias isoladas pela mistura do inóculo com

)gar liqueeito resriado e distribu.do numa placa de Letri estéril

6L0",? et al#; %HHKA# 8 inóculo é realizado diretamente na placa deLetri# 8 meio nutriti&o é mantido em banBo maria a 25T para impedir

a solidifcação do )gar e é &ertido sobre a amostra* seguido por um

per.odo de agitação# 0sta metodologia permite o crescimento das

colônias dentro do )gar nutriente* assim como na super.cie da placa

de )gar nutriente 6>8?>8?, et al#; $555A#

$#S ontagem automatizada


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, automação () alcançou alguns setores da microbiologia

aplicada# @ão dispon.&eis no mercado equipamentos que possibilitam

a contagem de células de le&eduras de orma autom)tica* tais como o

%Nucleo Counter M'%55 V da

empresa Bemometec da =inamarca# 8 equipamento consta de um

microscópio de +uoresc/ncia integrada* pro(etado para detectar sinais

do corante +uorescente* iodeto de prop.dio que se liga ao =9, da

le&edura# Quando entra em contato com as células o iodeto de

prop.dio é dissol&ido e o =9, celular é corado# 8utro equipamento

dispon.&el é o $Vi-CELL um analisador de &iabilidade celular abricada

por EecWman oulter* situada nos 0stados Unidos# 8 Vi-CELL realiza

automaticamente a contagem utilizando o corante azul de tripan*

utilizando uma célula de +u-o cont.nuo e um sistema de an)lise de

imagem# Um terceiro equipamento o 4Nalco Yeast Activity Monitor

abricado pela empresa americana 9ational ,luminate orporation*

este equipamento e-trai sua energia de reação*atra&és da reação

entre enzimas da le&edura e das moléculas de emissão bioqu.mica# 8

equipamento é dotado de uma sonda que é colocada em contato

diretamente com a amostra preparada* proporcionando as ta-as de

ati&idade metabólica das le&eduras#

orr/a et al# 6%HH5A realizaram a an)lise de &iabilidade de células

úngicas em amostras coradas com solução de diacetato de

+uoresce.na e brometo de et.dio* posteriormente e-aminadas em

microscópio de +uoresc/ncia# 8s autores conclu.ram que o tempo de

coloração ideal oi de 45 minutos para que Bou&esse a pereita

dierenciação entre células &i)&eis e não &i)&eis* no entanto* o

método é oneroso* apesar de se mostrar sens.&el e simples#

, automação na an)lise de amostras biológicas oi tema do

trabalBo de "amprecBt; @abatini; arpenter 6$55KA que

desen&ol&eram um sotXare de código aberto que pode reconBecer

as part.culas por dierentes atributos das regiões de interesse 6?8DA*

tais como a morologia* cor* te-tura* entre outros* com dierentes

técnicas de &isão computacional#


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@Barma et al#* 6$55HA desen&ol&eram tecnologia para aplicações

laboratoriais na )rea armac/utica* que permitem a detecção e

reconBecimento de microorganismo dentro de +uidos#

*. ,ateriais

• ,utocla&e

• >ubos de 0nsaio

• Ealão Oolumétrico

• Ygua =estilada

• Fermento Eiológico

• Lipeta Nraduada

•

,lça de =rigalsWi

• Llaca de Letri

• Eico de EZnsen

• Ylcool 0t.lico K5[

• :eio Ygar @abouraud


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-. rocedimento Experimental

!"#" Lreparação de uma série de diluições decimais de uma

cultura da le&edura Saccharomyces cerevisiae

Lara preparação da diluição da cultura da le&edura* os tubos de

ensaio contendo H ml de )gua destilada* as pipetas e as placas de

petri utilizadas oram esterilizadas em autocla&e a uma temperatura

de %$5\ a % atm durante $5 minutos#

Lara uma diluição %]%55* pesou'se %*5 g de ermento biológico

que oi dilu.do em um bécBer contendo %55 ml de )gua estéril# om o

au-.lio de uma pipeta estéril oi retirado % ml da suspensão

microbiana* que então oi adicionado ao primeiro tubo de diluição 6%5 '

%A# , cada diluição a solução oi Bomogeneizada por agitação#

,pós a Bomogeneização* com uma no&a pipeta estéril* retirou'

se % ml da primeira diluição* %5'%* e a transeriu para outro tubo

contendo os H ml de )gua estéril para obtenção da diluição %5 '$# Foi

realizado o mesmo procedimento para as diluições seguintes até a

obtenção da diluição %5'S#

I#$# Dnoculação da cultura da le&edura Saccharomyces

cerevisiae por espalBamento em meio sólido

Lara inoculação da le&edura* oram selecionadas as tr/s últimasdiluições da suspensão de ermento biológico* %5'I* %5'2 e %5'S# ,s

suspensões oram Bomogeneizadas por &agarosa agitação* para

prosseguir com a inoculação#

>r/s placas de petri oram entreabertas e preencBidas com o

meio )gar sabouraud pró-imas a temperatura de cBama do bico de

Eunsen* que então oram colocadas na bancada ainda pró-imo 1

cBama até sua solidifcação# ,pós a solidifcação* da mesma orma*


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oram entreabertas e pipetadas com % ml de cada uma das tr/s

diluições#

Lara espalBamento da suspensão na super.cie do meio*

utilizou'se um espalBador esterilizado pela cBama do bico de Eunsen*

inicialmente introduzido em meio alcoólico# 0ntão* cuidadosamente* o

espalBador oi passado pela super.cie do meio até uma poss.&el

identifcação de resist/ncia a mo&imentação indicando a absorção do

inóculo pelo meio# ,pós o termino do espalBamento* as placas oram

incubadas 1 temperatura ambiente por % semana#

I#4# Dnoculação da cultura da le&edura Saccharomyces

cerevisiae por incorporação 6pour'plateA

Lara inoculação da cultura da le&edura por incorporação* as tr/s

últimas diluições* %5'I* %5'2 e %5'S da suspensão do ermento biológico

oram cuidadosamente agitadas e igualmente pipetadas* para tr/s

placas de petri entreabertas pró-imo a cBama do bico de Eunsen# 8

meio )gar sabouraud undido oi então adicionado 1s placas e

delicadamente misturados com mo&imentos giratórios em orma de J#

=a mesma maneira* as placas oram incubadas a temperatura

ambiente por % semana#

/. "esultados e 0iscuss!es

2#%# :étodos de ontagem

8 número de células totais podem ser contadas diretamente

com o uso de um microscópio a partir de amostras secas em lCminas


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ou amostras l.quidas# ,s amostras secas podem ser coradas* pelo

método de Nram* por e-emplo* para aumento de contraste* enquanto

que para as l.quidas são utilizadas cCmaras especiais ^%_#

,pesar do uso do microscópio proporcionar a obser&ação

morológica dos micro'organismos* a contagem microscópica

apresenta algumas limitações# @em o uso de corantes espec.fcos não

é poss.&el distinguir células mortas de células &i&as* cu(a &iabilidade

est) relacionada com a integridade da membrana citoplasm)tica# 0 se

amostra não esti&er corada é necess)rio o uso de microscópios de

contraste de ase* entre outras ^%_#

0m muitos casos* o ob(eti&o principal é somente a contagem do

número de células &i)&eis# ,ssim* o método da contagem em placa

pressupõe que cada célula é capaz de se multiplicar originando uma

colônia em um meio sólido adequado para o micro'organismo de

escolBa* sendo o número de colônias e o número de células

proporcionais ^$_#

=e acordo com o método* cada colônia de&e ser originada a

partir de uma única célula &i)&el* o que nem sempre acontece# 9as

próprias placas oram obser&adas colônias agregadas ormadas por

duas ou mais células e consequentemente de tamanBos

dierenciados#

Foram utilizados dois métodos para a contagem das colônias# 8

método de inoculação por espalBamento ou spread plate* no qual o

crescimento das colônias ocorre e-clusi&amente na super.cie* em

razão da amostra ser espalBada no meio de cultura () solidifcado#

8 tempo de solidifcação é importante* pois caso a super.cie

este(a muito úmida* a absorção da suspensão é difcultada e as

células acabam se deslocando# Oolumes de amostra superiores a 5*%

m" de&em ser e&itados* () que o e-cesso não é absor&ido pro&ocando

aglutinação das células e difcultando a contagem ^%_#

9o método de inoculação em proundidade ou pour plate* o

meio de cultura é &ertido ainda undido* e somente após a adição da

supensão na placa# Dsso permite que os micro'organismos cresçam na


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super.cie e abai-o desta# 8 meio e a suspensão de&em ser bem

misturados* porém com mo&imentos delicados para não comprometer

o crescimento das colônias* que assumem ormas não arredondadas*

o que oi também obser&ado em uma das placas#

,o utilizar esta técnica de&e'se saber de antemão se o micro'

organismo suporta a temperatura no qual o meio se liqueaz* e se

meio de cultura or &ertido na placa ainda muito quente as células

podem ser in&iabilizadas# 8 ideal é trabalBar com o meio em torno de

I2 a 25 \ ^$_#

@e(a qual or a metodologia utilizada* por espalBamento ou em

proundidade* os resultados são normalmente e-pressos em Unidades

Formadoras de olônias 6UFA#

2#$# =iluição da @uspensão

8 ponto mais cr.tico desta pr)tica est) relacionado com o

preparo da suspensão* ou se(a* o quanto de ermento de&e ser

solubilizado para uma dada quantidade de )gua* &isto que as

diluições são eitas com base na amostra a ser quantifcada antes de

realizar os plaqueamentos#

@e após o per.odo de incubação or obtido uma distribuição

uniorme das colônias* a contagem em placa oerece resultados mais

precisos quando comparado com a contagem miscroscópica# omo

erros e-perimentais estão en&ol&idos* o &alor de UF!m" calculado é

baseado em uma estimati&a* no qual o número de colônias não pode

ser muito ele&ado* pois as células sem agrupam induzindo erros de

contagem* e nem muito bai-o* pois a importCncia estat.stica da

contagem é reduzida# 8 ideal é selecionar placas que possuam entre

45 e 455 colônias buscando reduzir ao m)-imo os erros embutidos na

metodologia ^%*S_#

9o entanto* cBegar nessa ai-a de &alores é uma das maiores

difculdades do método# =urante a primeira pr)tica oram pesados %2

mg de ermento biológico para %55 m" de )gua estéril* o que


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impossibilitou a contagem e a repetição do e-perimento oi ine&it)&el#


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ada colônia que pode ser contada é cBamada de unidade

ormadora de colônia# Lor e-trapolação* este número pode ser usado

para calcular o número de UF na amostra original# =e maneira geral*

para encontrar o número de unidade ormadora de colônias por m"* o

número de colônias 6reerente 1 uma placa que contenBa entre 45 e

455 colôniasA é multiplicado pelo ator de diluição da placa escolBida#

omo o resultado é dado em mililitro* no caso de uma al.quota de 5*%

m"* é necess)rio multiplicar o resultado encontrado por %5 ^K_#

• @pread Llate]

UFC /mL=nº decolônias x 10 x Fator de diluição

Quando duas diluições consecuti&as apresentam contagem

dentro do padrão* calcula'se o número de UF para cada diluição* os

resultados de&em ser e-pressos com o mesmo e-ponte* e estes são

comparados# @e um dos resultados não ultrapassar o dobro do outro*

ambos os &alores são considerados e o resultado fnal é a média das

contagens# aso um dos resultados se(a maior que o dobro do outro*

é considerado apenas a menor contagem ^2_#

UFC

mL =161 x10 x10

5=1,61.10

8

UFC

mL =133 x10 x106

=13,3.108

13,3.108>1,61.10

8 x2=3,22.10

8

UFC /mL=1,33.109

• Lour Llate]


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UFC /mL=nº de colônias x Fator dediluição

@e a contagem oi eita em uma placa inoculada com diluição a

%5'% ou maior* e sem duplicata* escolBer a placa com número de

colônias entre 45 e 455 e eetuar o c)lculo# omo o &olume da

al.quota era de % m" não é necess)rio o ator de correrção ^2_#

UFC

mL =226 x 10

5=2,26. 10

7

Nota-se pelo quadro 1, e pelas figuras 4, 5 e 6, que para o plaqueamento em

superfície, o número de colônias diminui na medida em que o fator de diluição aumenta.

ssumindo que as diluiç!es foram feitas nas mel"ores condiç!es possí#eis e que a fonte

das alíquotas a serem inoculadas possuem a mesma proced$ncia, era esperado que essa

tend$ncia se repetisse para a m%todo por incorporação. &ontudo, este comportamento

num%rico não % constatado sugerindo uma possí#el contaminação.

'ntretanto, #isualmente, % nítido a redução do número de colônias de uma placa

para outra, como pode ser #isto nas figuras (, ) e *. ssim, não pode ser descartada a

possi+ilidade de in#ersão na "ora de nomear as placas. e isto de fato ocorreu, o quadro

1 de#e ser apresentado conforme o quadro

Quadro . 1 Quadro , corrigido

0iluição'ontagem #'ol3nia5laca%

Spread $late $our $late%-%5'I %#%4$ %5SJ%-%5'2 %S% I5K%-%5'S %44 $SS

Lor conseguinte* o c)lculo para determinação do número de

UF!m" também ser) alterado para o método pour plate#

UFC mL

=226 x 106=2,26.108


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Figura - & 6pread late 0iluição 1$&-

Figura / & 6pread late 0iluição 1$&/


20/27

Figura 7 & 6pread late 0iluição 1$&7

Figura 8 & our late 0iluição 1$&7


21/27

Figura 9 & our late 0iluição 1$&-

Figura & our late 0iluição 1$&/

2#I# omparação entre os :étodos Quanto ao rescimento das

"e&eduras#


22/27

8s meios de cultura sólidos imobilizam as células* que crescem

originando massas isoladas e &.si&eis* permitindo que a pureza da

cultura se(a obser&ada ^%_#

,s colônias podem e-ibir &)rias ormas e tamanBos* podendo

ser coloridas de&ido 1 produção de pigmentos# 8s ungos

flamentosos ormam colônias rugosas dierentemente das le&eduras*

que apesar de eucariontes são unicelulares* assim como as bactérias*

dando origem 1 colônias lisas brilBantes e de bordas regulares ^$_# ,s

colônias de @accBarom`ces cere&isiae apresentaram as

caracter.sticas macroscópicas citadas na literatura* além de uma

coloração esbranquiçada#

8s micro'organismos podem ser classifcados quanto a

presença de o-ig/nio# 8s aeróbios requerem o-ig/nio para

crescimento* podendo crescer mais lentamente se este or limitado#

8s acultati&os são aqueles que crescem na presença de ar

atmosérico* porém crescem também em anaerobiose# 8s anaeróbios

estritos podem ser mortos na presença de 8$* não crescem na

presença do ar e não utilizam o-ig/nio para as reações de produção

de energia# ,naeróbios aerotolerantes* que toleram pequanas

quantidade de o-ig/no* porém sem utiliz)'lo# 0 os microaeróflos* que

utilizam o o-ig/nio* mas o contr)rio dos aeróbios* não resistem aos

n.&eis de 8$ presentes na atmosera ^$_#

=e posse dessas inormações pressupõe'se que o método de

inoculação em super.cie pode ser utilizado para micro'organismos

aeróbios e acultati&os* equanto que o método em proundidade pode

ser utilizado para os micro'organismos microaeróflos* pois abai-o da

super.cie é ornecido um ambiente defciente em o-ig/nio* porém

isso não impede que micro'organismos aeróbios ou acultati&os

cresçam na super.cie onde B) maior disponibilidade de 8$#

8s micro'organismos anaeróbios* por sua &ez* precisam de uma

atmosera li&re de o-ig/nio# Lara isso* são utilizadas incubadoras

especiais cBamada de camCra de anaerobiose# , atmosera no


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interior da camCra é uma mistura de Bidrog/nio* dió-ido de carbono e

nitrog/nio# Qualquer res.duo de 8$ é remo&ido pela reação com o G$

na presença do pal)dio como catalisador ^$_#

, @accBarom`ces cere&isiae é uma le&edura acultati&a* ou

se(a* possui a capacidade de se a(ustar metabolicamente tanto em

condições de aerobiose quanto de anaerobiose# ,pós a glicólise* as

moléculas de glicose são transormadas em piru&ato atra&és de uma

série de reações catalisadas por enzimas# 9a presença de o-ig/nio* a

@accBarom`ces cere&isiae realiza respiração aeróbia e o produto fnal

é 8$ e G$8# 0m situação de Bipó-ia ou de total aus/ncia de o-ig/nio*

esta le&edura não é capaz de eeturar a respiração anaeróbia e como

alternati&a realizam ermentação alcoólica* e o piru&ato é con&ertido

em etanol e 8$ ^I_#

, capacidade da le&edura de ermentar o açúcar em etanol não

implica a capacidade de crescer em condições anaeróbicas# 9a

&erdade* a maioria das le&eduras acultati&as não crescem bem na

aus/ncia completa de o-ig/nio nem mesmo em meio comple-os#

"ogo* o o-ig/nio é um importante ator na regulação do metabolismo

do açúcar nos ermentos ^4_#

9a presença de altas concentrações de o-ig/nio* as le&eduras

crescem efcientemente* pois a produção de energia é muito maior e

no&as células são ormadas# 0ntretanto* em situações de Bipó-ia a

produção de no&as células é reduzida ^$_#

om este embasamento teórico* no método pour plate* era

pre&isto maiores quantidades de colônias na super.cie* &isto que

abai-o desta a quatidade de o-ig/nio dissol&ido no meio é limitado e

a multiplicação das células não é tão eeti&a# Lelas mesmas

(ustifcati&as* também era esperado um maior crescimento das

células de le&edura no método por espalBamento quando comparado

diretamente com o método anterior# Lorém* conorme o quadro %*

este não oi o resultado obtido#

7. 'onclusão


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, partir dos resultados encontrados* pode'se concluir que a

dierença identifcada no número de colônias* ou células &i)&eis* para

os métodos de inoculação por espalBamento e de inoculação em

proundidade não se de&e 1 erros de preparo da suspensão do

ermento biológico nem de suas diluições* pois para o método de

espalBamento em super.cie* o resultado se apresentou coerente com

relação 1s diluições* ou se(a* obte&e'se a diminuição do número de

colônias com o aumento da diluição#

Lor outro lado* o resultado para o método de inoculação em

proundidade se apresentou incoerente* que além de ter sido obtido o

aumento do número de colônias com o aumento da diluição* o

número se demonstrou aleatório# omo a dierença no número de

colônias nas tr/s placas pode ser obser&ado a olBo nú* o erro por

contagem não pode ser considerado# =essa orma* uma possibilidade

para tal erro est) no momento de identifcação das placas* um erro do

operador#

abe'se ressaltar* que ainda que osse gerado um resultado não

aleatório mas da mesma orma in&ertido para o método de inoculaçãoem proundidade* nada se pode concluir sobre tal método pois a

le&edura Saccharomyces cerevisiae é classifcada como anaeróbia

acultati&a* não sendo aetada pela quantidade de o-ig/nio*

permanecendo com um resultado não esperado para o e-perimento#


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8. "e;er


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%5# ,@>?8* :#D#F#de; 0?0=,* :#L# e E?,@D"* :#,#:#omparação entre métodos de contagem de células &i)&eis dele&eduras em ermentação alcoolica# Dn]

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%$# 0,>8',9>89D9D* @#?#* @D"O,* =#F# 0fci/ncia de meiosdierenciais no isolamento de cepas de le&eduras de processosindustriais de ermentação alcoólica# @>,E* Liracicaba* %J* n#I*p#I5'IS* $555#

%4# 0,>>8',9>89D9D* @#?# :étodos de an)lises emonitoramento microbiológico em laboratório de =estilaria# Dn]urso de treinamento ministrado a unidades pertencentes 1usina de açúcar @anta >eresinBa* Dguatemi* $55I# p#44

%I# 8LM?DNG>* Nlucos Dnternacional' , le&edura da cana#:anual >écnico* %'$ p* $552#

%2# 8??h,* E# et al# :étodo +uorescente 6diacetato de+uoresce.na e brometo de et.dioA para o estudo da &iabilidadede cr`ptococcus neoormans em liquor# Oer# Dnst# :ed# >rop# @ãoLaulo 4$* p#IS'25* %HH5#

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pesquisa e tecnologia F0D* @ão Eernardo do ampo* $S* p# 4S'I5* $55I#

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Técnicas de Contagem Em Placa