TÉCNICAS DE MARCADORES MOLECULARES

Antonio costa de Oliveira, PhD

Aula 6 - 2013

Marcadores moleculares

• Marcadores moleculares são fragmentos de DNA associados/responsáveis por uma característica genética, apresentando uma variação detectável entre indivíduos da população testada (marcador genético)

Marcadores podem ser dominantes?

• Dominantes (presença x ausência de banda)

• Codominantes (bandas de diferentes tamanhos)

Detecção de polimorfismo - Introdução

• Detectando polimorfismos de DNA • Molécula de DNA > 10 pb = mesma razão massa/carga.• Eletroforese em gel – ferramenta mais comum;• Detecção de um grande número de amostras – era pós

genômica;• Eletroforese capilar -capillary array electrophoresis• MALDI-TOF MS - matrix-assisted laser

desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

F2

P2

F1

P1 x

large populations consisting of thousands of plants

PHENOTYPIC SELECTION

Field trialsGlasshouse trials

DonorRecipient

CONVENTIONAL PLANT BREEDING

Salinity screening in phytotron Bacterial blight screening Phosphorus deficiency plot

F2

P2

F1

P1 x

large populations consisting of thousands of plants

ResistantSusceptible

MARKER-ASSISTED SELECTION (MAS)

MARKER-ASSISTED BREEDING

Method whereby phenotypic selection is based on DNA markers

Eletroforese

• Amostras são carregadas em um gel e submetidas a um campo elétrico. Como o DNA carrega-se negativamente, as moléculas migram para o pólo positivo. A separação de moléculas é estritamente devida a sua massa molecular;

• Matrizes: agarose e poliacrilamida

Agarose Poliacrilamida

% Resolução (kb) % Resolução (pb)

0.9 0.5 - 0.7 3.5 1000 – 2000

1.2 0.4 - 6.0 5.0 80 – 500

1.5 0.2 - 3.0 8.0 60 – 400

2.0 0.1 - 2.0 12.0 440 - 200

Poder de resolução

Idéias iniciais

• Dependendo do marcador, usa-se o polímero mais adequado.• RFLP e RAPD – agarose• Microsatélites e AFLPs – geram fragmentos menores – poliacrilamida é mais

indicado • Após a eletroforese, um agente de detecção é utilizado. Brometo de etídio

(agarose)ou Nitrato de prata (poliacrilamida). Pode-se incorporar um nucleotídeo marcado durante o passo de PCR (AFLP e SSR). A revelação é então feita com autorradiografia.

• Microsatélites – Também usada a técnica de laser. Neste caso o primer é marcado com um corante fluorescente e separado em gel de poliacrilamida.

• RFLPs – requer o uso de uma hibridização de Southern. Moléculas separadas em um gel de agarose são transferidas para uma mebrana de nylon. A membrana então contém uma cópia da distribuição dos fragmentos no gel. Uma sonda da sequência de interesse é então hibridizada à membrana. As sondas não ligadas são removidas por uma série de lavagens estringentes. A membrana é exposta a um filme de autorradiografia e o polimorfismo é revelado no filme.

TIPOS DE MARCADORES

FenotípicoFenotípicoss morfológicos

bioquímicos: isoenzimas, proteínas de reserva

GenotípicosGenotípicos

RFLP (restriction fragment length polymorphism)

RAPD (random amplified polymorphism DNA)SSR (simple sequence repeats) = microsatélitesAFLP (amplified fragment length polymorphism)ISSR (inter-simple sequence repeats)SCAR (sequence-characterized amplified regions)STS (sequence-tagged sites)SNPs (single nucleotide polimorphisms)

PCR

Locos RFLP• Uma análise de RFLP é uma aplicação da técnica de Southern. • • Clones, Enzimas e hibridizações informativas• Marcadores RFLP são definidos por uma combinação específica de enzima-sonda.• Clones genômicos escolhidos ao acaso podem frequentemente não funcionar por causa

que genomas de plantas muitas vezes consistem de um grande número de sequências repetitivas.

• As duas fontes primárias de clones para mapeamento dde plantas e animais usando RFLP são clones de cDNA e clones genômicos derivados de PstI. Clones PstI são baseados na idéia de que genes expressos não são metilados. A enzima PstI é sensível à metilação e protanto estes fragmentos teriam grande probabilidade de ter poucas cópias no genoma.

• Quando vários clones são obtidos, DNA de genótipos paternos são digeridos com uma série de enzimas e hibridizados com os clones. Algumas destas hibridizações irão gerar polimorfismos que podem ser utilizados para o mapeamento na progênie.

Genetics Techniques: Genetics Techniques: RFLP & PCRRFLP & PCR

RFLP

• To see RFLP, DNA is digested with the appropriate restriction enzymes and run on an agarose gel.

• A Southern Blot is performed to complete the analysis.

RFLP

• Stands for Restriction Fragment Length Polymorphism

• Takes advantage of differences in DNA between individuals that result in different fragments when digested with restriction enzymes

How many fragments will result when each of these alleles are digested with DdeI?

3 fragments

2 fragments

Southern Blotting

• A method to visualize specific segments of DNA– usually a particular gene.

• Uses radioactive probes that bind to the specific DNA segments– Ex. When testing for the

hemoglobin alleles, the probe would bind to these regions

Southern Blotting

• Steps: – Soak gel in basic solution to separate DNA

strands– Transfer DNA on to a nylon membrane

(spacing of DNA is maintained)– Incubate with radioactive probe for specific

segment– Wash away unbound probe– Detect probes using x-ray film

autoradiograph

RFLP

AUTORRADIOGRAFIA

Extração de DNA

TransferênciaDo DNA paramembrana denitrocelulose

Gel de agarose:Separação dosfragmentos

Digestão total

Hibridização c/sonda radioativa

RFLPs in varieties

• Availability of aneuploids

1 2 4 5 6 7

A

B

D

3

RFLPs group 3s