tese anna apos revisor[1]Final de vez - UENF · ERA do vírus da raiva. Tomate Proteína G acumulou-se no complexo de Golgi, vesículas, plasmalema, e parede celular de células do

1

INTRODUÇÃO

Utilização das plantas como veículos para obtenção de proteínas heterólogas

As plantas transgênicas constituem uma das mais importantes aplicações da

tecnologia do DNA recombinante, partindo do princípio que a planta passa a possuir

novas características, as quais visam atender diversas finalidades. Dentre elas

podemos destacar: melhoramento das características agronômicas, das qualidades

nutricionais das plantas modificadas e, ainda, o uso dessas plantas como reatores

biológicos para a produção de biomoléculas de valor terapêutico e profilático, como

exemplo, biofármacos e vacinas (Firek et al., 1993; Borisjuk et al., 1999; Larrick et al.,

2001; da Silva et al., 2002; Tacket, 2004; Rigano and Walmsley, 2005; Almquist et al.,

2006).

No segundo caso, a administração oral da planta reduz possíveis custos de

purificação da proteína recombinante, uma vez que os veículos de apresentação das

proteínas de interesse são os próprios tecidos das plantas (folhas, raízes, caule)

(Tacket, 2004; Rigano and Walmsley, 2005; Kumar et al., 2006).

Há, essencialmente, duas diferentes estratégias para a produção de proteínas

heterólogas em plantas. Uma delas consiste na integração da seqüência codificadora

da proteína de interesse no genoma da planta, o que é mais comumente obtido através

de transformação via Agrobacterium tumefaciens. Outra estratégia baseia-se na

utilização de vírus que infectam naturalmente espécies vegetais. A região codificadora

da proteína de interesse é primeiramente inserida no genoma do vírus, e após infecção

mecânica na planta, o vírus modificado se replica e a seqüência codificadora da

proteína heteróloga é transcrita e traduzida pelo maquinário celular da planta

(Nicolaisen et al.,1992). Nesta estratégia a expressão é transitória e ocorre geralmente

em folhas, podendo ocorrer também de maneira sistêmica (Scholthof et al., 1996). Em

contrapartida, na transformação a integração no genoma da planta é permanente, fato

que permite o direcionamento da expressão para os diversos órgãos, tecidos e

compartimentos celulares. O direcionamento ocorre através da utilização de promotores

tecido-específicos e de sinais de direcionamento intracelulares (da Silva et al., 2002;

Lung et al., 2005).

2

A expressão e produção de proteínas recombinantes, em particular

imunoprofiláticos e imunoterápicos, em plantas transgênicas, são de singular relevância

para o avanço tecnológico e sócio-econômico dos países em vias de desenvolvimento,

onde medidas de prevenção e tratamento de doenças infecciosas são amplamente

requeridas, uma vez que o interesse da iniciativa privada é limitado (Arntzen et al.,

2005). Assim, as plantas geneticamente transformadas representarão uma nova e

importante função para o bem estar da sociedade, dado o seu potencial como

biorreatores na produção de substâncias de interesse.

A utilização de sistemas de expressão em bactérias e leveduras, embora

amplamente difundida, oferece em alguns casos uma alternativa pouco interessante ou

até mesmo inviável para a produção, em grande escala, de proteínas de interesse.

Como, por exemplo, na produção de anticorpos onde a glicosilação interfere na

imunogenicidade (Stoger et al., 2002), como também no fato desses sistemas

possuírem uma limitação intrínseca como sistemas seguros de apresentação para o

consumo animal ou humano. Essa limitação se deve ao risco de toxicidade e/ou

contaminação por bio-produtos, o que pode ser superado pela produção de vacinas a

partir de plantas transgênicas (Walmsley and Arntzen, 2000; Lauterslager and Hilgers,

2002; Arntzen et al., 2005; Rigano and Walmsley; 2005).

A relação custo/benefício dessa tecnologia ainda é discutível, pois é bem

relatado que o custo para obtenção de proteínas heterólogas em sistemas bacterianos

é alto quando comparado ao sistema utilizando em plantas (Fuchs et al., 2002; Tacket,

2004; Rigano and Walmsley; 2005). Um outro atrativo para a utilização de plantas como

reatores é o fato de muitas plantas que podem ser transformadas geneticamente

fazerem parte da dieta humana. Destarte, as plantas transformadas podem ser

utilizadas diretamente, dispensando o processamento do produto de interesse pós-

expressão. Além disso, as plantas oferecem a vantagem de promover alterações pós-

transcricionais, em muitos casos indispensáveis à conformação tridimensional e

funcionalidade das proteínas, enquanto os demais sistemas são limitados nesse sentido

(Mason et al., 1992; Mason and Arntzen, 1995; Mason et al., 1996; Arntzen, 1997;

Gómez et al., 1998; Stoger et al., 2002; Arntzen et al., 2005; Rigano and Walmsley;

2005).

3

No caso particular da produção de vacinas, a tecnologia das plantas

transgênicas oferece ainda outras vantagens como: a manutenção simples para a

produção em grande escala de proteínas recombinantes; possibilidade de desenvolver

vacinas polivalentes ou de múltiplos antígenos; produção em larga escala de forma

rápida (como no caso da cenoura, batata e tomate); possibilidade de administração

oral; segurança notória dos vegetais comestíveis; dispensa a necessidade de seringas

e de profissionais de saúde treinados para administração de vacinas; a parede da

célula vegetal protege potencialmente o antígeno da acidez do estômago; e

dependendo da formulação da vacina pode ser de fácil distribuição, sem a necessidade

dos sistemas de refrigeração necessários para as vacinas atuais (Larrick et al., 2001;

Tacket, 2004; Arntzen et al., 2005).

A determinação e identificação dos processos envolvidos na sensibilização do

sistema imune por administração oral (Kagnoff, 1996; Revillard et al., 1992) vêm

estimulando o desenvolvimento de biorreatores vegetais para a produção de vacinas

recombinantes em plantas comestíveis (Tacket, 2004; Arntzen et al., 2005; Rigano and

Walmsley; 2005). Antígenos imunoprotetores de diversos agentes infecciosos (vírus e

bactérias) têm sido expressos com a utilização da tecnologia do DNA recombinante

(Tacket et al., 1998; da Silva et al., 2002; Tacket et al., 2004). A imunização oral com

batata transgênica contendo a proteína exógena enterotoxina lábil (LT-B) de

Escherichia coli enterotoxigênica estimulou respostas imunológicas, tanto sistêmica

quanto mucosal, em animais de laboratório (Mason et al., 1998). Num outro trabalho, a

administração de meio de cultura contendo BfpA recombinante fitosecretada a

camundongos Balb/C resultou na presença de anticorpos fecais anti-BfpA (da Silva et

al., 2002). Tais resultados sugerem a grande possibilidade de se utilizar plantas como

possíveis veículos de imunização.

Nos últimos anos houve uma busca por diferentes plantas e sistemas de

expressão que produzam diversos antígenos de interesse. Como exemplos podemos

citar a expressão do antígeno de superfície do vírus da Hepatite B (HBsAg) em batata

(Smith et al., 2003; Kumar et al., 2006).

O uso de plantas, como produtores de vacinas, busca, ainda, solucionar doenças

como a peste, que é uma doença que rapidamente se desenvolve e chega a quase

100% de mortalidade dos indivíduos infectados. Alvarez e colaboradores (2006)

4

expressaram a proteína de fusão antigênica F1-V de Y.pestis em tomate e sua

imunogenicidade foi confirmada em camundongo. O Quadro 1 apresenta diferentes

exemplos de plantas, nas quais foram produzidos antígenos de interesse:

5

Doença Antígeno Planta transgênica Observações Referênc

ia

Hepatite B Antígeno de superfície da Hepate B (HBsAg)

Batata Resposta imune primária foi observada em camundongos

Richter et al. (2000)

HBsAg Tomate Imunização oral de camundongos disparada com vacina comercial induziu resposta imune significativa

Gao et al. (2003)

Hepatite E (HEV) HEV-E2 Tomate O gene HEV-E2 expressou-se corretamente e o antígeno apresentou imunogenicidade normal

Ma et al. (2003)

Cólera Subunidade B da Toxina do Cólera (CTB) fundida a um sinal de retenção no RE

Batata Propriedades imunológicas e bioquímicas foram idênticas à da proteína CTB nativa

Arakawa et al. (1997)

Subunidade CTB contendo o sinal de retenção no RE

Tomate CTB derivada de plantas ligou-se especificamente ao receptor G (M1)-gangliosideo

Jani et al. (2002)

Doença entérica viral

Subunidade CTB fusionada com a proteína NSP4 do rotavírus Batata

Foram observadas a sintese e a montagem de oligomeros biologicamente ativos

Kim and Langridge (2003)

Rotavirus Murino Proteína VP6 estrutural do capsídeo do rotavírus

Batata Imunização oral de camundongos induziu a produção de anticorpos humoral e intestinal detectáveis

Yu and Langridge (2003)

Diabetes autoimune

Fusão CTB::Insulina Batata Atraso no avanço do Diabetes em camundongos diabéticos alimentados com batata transgênica.

Arakawa et al. (1998b)

GAD65 humano Cenoura GAD65 foi imunoreativa e manteve atividade enzimática

Porceddu et al. (1999)

Sarampo Epitopo do formador da alça em células B (H386-400) da proteína hemaglutinina do vírus do sarampo

Cenoura Imunização peritoneal de camundongos com extratos de plantas de cenoura induziu alta titulação de anticorpos.

Bouche et al. (2003)

Partículas do papillomavirus-símile humano (HPV)

Proteína majoritária do capsídeo HPV tipo 11 (HPV11) L1

Batata Imunização oral induziu resposta imune anti-VLP em camundongos

Warzecha et al. (2003)

Vírus Respiratório Sincicial (RSV)

Proteína RSV-F Tomate Imunização oral de camundongos induziu a produção de anticorpos séricos e mucosais específicos anti RSV-F

Sandhu et al. (2000)

Vírus da Raiva Glicoproteína (proteína G) da superfície externa da linhagem ERA do vírus da raiva.

Tomate Proteína G acumulou-se no complexo de Golgi, vesículas, plasmalema, e parede celular de células do parênquima vascular

McGarvey et al. (1995)

Epítopos do vírus da raiva fundidos com o vírus do mosaico do fumo Espinafre

Camundongos imunizados mostraram resposta imune e proteção contra doses letais do vírus da raiva.

Modelska et al. (1998)

Glico e nucleoproteína do vírus fundida com proteína do capsídeo do AlMV

Espinafre Imunização oral de voluntários humanos induziu anticorpos neutralizadores.

Yusibov et al. (2002)

Anthrax Fator protéico letal (LF), ligado ao CTB Batata CTB-LF foram montados em pentâmeros

biologicamente ativos. Kim et al. (2004a)

Doença hemorrágica de coelhos

VP60 do vírus da doença hemorrágica

Batata Coelhos imunizados produziram anticorpos e foram protegidos contra a doença.

Castanon et al. (1999)

Bronquite infecciosa de galinhas

Proteina spike (S) integral do IBV Batata Galinhas imunizadas produziram níveis detectáveis de anticorpos séricos e foram protegidas contra o IBV virulento

Zhou et al. (2004)

Quadro 1. Produção de antígenos em plantas transgênicas, de acordo com Dalal e

colaboradores (2006).

6

Sistemas vegetais de expressão de proteínas heteról ogas

Um dos primeiros aspectos a ser considerado é o desenvolvimento de sistemas

vegetais de expressão, o que envolve inicialmente a escolha do sistema de

transformação genética. A produção de plantas transgênicas é considerada, hoje em

dia, uma prática de rotina em laboratórios de Biotecnologia Vegetal, sendo que a

transferência gênica mediada por Agrobacterium tumefaciens se destaca como a mais

freqüentemente utilizada (Mason et al., 1998; Borisjuk et al., 1999; Larrick et al., 2001;

da Silva, 2002; Alvarez et al., 2006; Kumar et al., 2006). Sendo que existem outros

métodos como a biobalística que utiliza microprojéteis de ouro ou tungstênio acelerados

a altas velocidades para carrear e introduzir ácidos nucléicos e outras moléculas em

células e tecidos. As micropartículas aceleradas penetram na parede e membrana

celular, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é

dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de

integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado (Ma and Chen,

2005).

O método de transformação vegetal via Agrobacterium tumefaciens está

baseado no aproveitamento do maquinário desenvolvido ao longo da evolução. Esse

sistema natural de transformação garante a transferência dos genes de interesse para

os sistemas vegetais alvo por meio de infecção da planta pelo Agrobacterium

tumefaciens transformada. O uso de Agrobacterium tumefaciens pode ser aplicado a

uma grande variedade de espécies de dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas,

sendo geralmente o método mais adotado para sistemas específicos de expressão em

plantas (Birch, 1997).

Um outro sistema que tem sido utilizado mais recentemente consiste de

expressão de epítopos de proteínas animais ou humanas na superfície de vírus de

planta (Tobacco Mosaic Virus (TMV), Cowpea Mosaic Virus (CPMV) e Johnsongrass

Mosaic Virus (JMV) (Porta et al., 1996 e 2002; Dalsgaard et al., 1997).

O CPMV é um membro típico do grupo Comovirus (Lomonossoff and Hamilton,

1999), o qual infecta algumas espécies de leguminosas, e se prolifera, particularmente,

no hospedeiro natural feijão-de-corda (Vigna unguiculata). O grupo Comovírus é

facilmente transmitido pelo processo de inoculação mecânica e eficientemente

7

disseminado na natureza através de coleópteros. CPMV é um vírus icosaédrico, com

um genoma RNA simples fita bipartido no sentido positivo (Araújo and Watt, 1998; Porta

et al., 1996 e 2002; Mittmann, 2004; Gesualdi-Mesquita, 2006).

O cDNA do RNA-2 do CPMV foi desenvolvido como um vetor de replicação

autônoma, e a sua utilização resulta na formação de partículas virais quiméricas (CVPs)

geneticamente estáveis. As CVPs são obtidas pela inserção de oligonucleotídeos que

codificam para um curto epítopo linear da proteína de interesse em um dos cDNAs

infecciosos clonados do CPMV (Porta et al., 1996 e 2002; Mittmann, 2004; Moura,

2004; Liu et al., 2005; Gesualdi-Mesquita, 2006).

As plantas infectadas apresentam sintomas característicos tais como lesões

cloróticas nas folhas, formando um mosaico (Liu and Lomonossoff, 2002), sintomas

estes que indicam a expressão do gene de interesse. Atualmente, o método baseado

no CPMV está sendo considerado como um método adequado para a obtenção de

altos níveis de produção de proteínas heterólogas em plantas (Gopinath et. al., 2000).

Ao se pensar na utilização de plantas como veículos para obtenção de proteínas

de interesse é necessário também definir o tipo de sistema de expressão vegetal que

se deseja obter. Plantas transgênicas inteiras ou a cultura de tecidos e/ou células,

obtidas a partir das mesmas, podem ser utilizadas para a produção em grande escala

do bioproduto de interesse. A cultura de células (que consiste em aglomerados

celulares em meio liquido), tecidos e órgãos pode ser estabelecida a partir de

fragmentos de tecidos maduros (folhas, caules, raízes) (Mason et al., 1998; Borisjuk et

al., 1999; Larrick et al., 2001; Carvalho, 2003), bem como de tecidos meristemáticos,

formados por células com alta taxa de divisão e que estão localizados, geralmente, nos

ápices dos caules e raízes em crescimento. É sabido que tecidos e órgãos jovens são

mais suscetíveis à propagação clonal do que os maduros, o que significa que à medida

que a especialização celular progride durante o desenvolvimento do órgão e/ou da

planta, a desdiferenciação torna-se mais difícil. Assim, os ápices meristemáticos são

preferencialmente utilizados como principais fontes de explantes. Os explantes são

transferidos assepticamente para os meios de cultura, compostos de uma mistura

balanceada de macro e micronutrientes, aminoácidos, vitaminas, além de uma fonte de

carbono, e de uma auxina e uma citocinina em proporções adequadas às finalidades

8

desejadas, sob condições de temperatura, umidade, fotoperíodo e irradiância

controladas, em sala de crescimento (Cid, 1998; Hong et al., 2002; Doran, 2006).

Fitosecreção de proteínas heterólogas

Com o intuito de desenvolver um vetor de expressão e secreção de proteínas

heterólogas em plantas transgênicas, o Grupo de pesquisa Quorum-sensing,

Interferência Microbiana e Infecção, do Laboratório de Biotecnologia (LBT) da UENF,

engenhou um sistema baseado no sistema de expressão pIBT o qual resultou em 1%

de proteína recombinante na fração protéica total (Mason and Arntzen, 1995; Mason et

al., 1996). Para direcionar a secreção protéica, foi escolhida a seqüência peptídica sinal

de endereçamento da proteína calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia, baseando-se

nos trabalhos de Borisjuk e colaboradores (1999). A calreticulina é uma proteína

residente do retículo endoplasmático e possui dois peptídeos sinais. Um peptídeo de

endereçamento e um de retenção no retículo. A seqüência sinal de endereçamento da

calreticulina mostrou-se eficiente no encaminhamento de proteínas repórteres para o

meio extracelular (Borisjuk et al., 1999). Utilizando-se essa estratégia, a secreção

ocorre através da rota retículo endoplasmático – complexo de Golgi – vesículas – meio

extracelular (Boyko et al., 2000; Wales et al., 1992), podendo ser detectada em tecidos

de fumo transgênicos (Nicotiana tabacum), bem como no meio de cultura de

manutenção dos tecidos (da Silva et al; 2002). Nesse trabalho, para garantir altos níveis

de expressão, tomou-se o cuidado de combinar um promotor constitutivo (CaMV 35),

uma seqüência enhancer (TEV), a seqüência codificadora para o peptídeo sinal

(calreticulina), além da região terminadora (VSP).

da Silva e colaboradores (2002) demonstraram que a seqüência sinal da

calreticulina foi capaz de direcionar a secreção da proteína bacteriana BfpA para o meio

externo, e que a combinação de promotor e enhancer resultou em altos níveis de

expressão da proteína recombinante. O gene bfpA presente no Plasmídio do Fator de

Aderência Entérica (EAF) codifica a proteína BfpA (subunidade A do feixe de pili) que é

a proteína principal formadora da fímbria do tipo IV das bactérias enteropatogênicas

(Sohel et al., 1996). Estudos de seqüenciamento, mapeamento e mutagênese do

9

plasmídio EAF mostraram que existem 13 genes responsáveis pela biogênese da

fímbria, sendo que o gene bfpA codifica a subunidade principal, bfpB codifica uma

lipoproteína requerida para a exportação da proteína e bfpP codifica a peptidase da

seqüência sinal da prepilina (Sohel et al., 1996).

Através de imunodetecção em membrana, utilizando anticorpo policlonal anti-

BfpA, foi possível detectar a proteína recombinante, tanto nos tecidos transgênicos

quanto no meio de cultura de manutenção. Resultados de quantificação do produto

secretado demonstraram que o sistema foi capaz de dirigir a produção de cerca de 7%

da proteína total, como proteína recombinante, confirmando sua eficiência na

expressão e secreção em plantas transgênicas de fumo. A imunogenicidade oral da

proteína BfpA fitosecretada foi demonstrada em camundongos BALB/c pela indução

persistente de anticorpos fecais anti-BfpA (da Silva, et al., 2002).

Porém, devido a uma fatalidade, na qual o pesquisador Jeferson Vieira da Silva,

responsável pela construção do sistema pJVS, adoeceu e faleceu repentinamente,

ocorreu perda de parte dos dados protocolares, o que nos deixou sem as devidas

condições de prosseguir acertadamente nos passos de purificação e quantificação da

proteína de interesse.

Com isso, o presente trabalho buscou através de diversas tentativas resgatar o

sistema de expressão e fitosecreção pJVS, que demonstrou em trabalho anterior ser

um sistema viável na produção de proteínas heterólogas de interesse. Essa

recuperação é de suma importância para o nosso grupo de pesquisa que vem

trabalhando com a expressão e purificação das proteínas bacterianas BfpA, EspA e

EspB em sistema viral (CPMV) bem como em sistema bacteriano, sendo previsto para

trabalhos futuros a obtenção de possíveis formulações vacinais.

10

OBJETIVO

Recuperação do sistema de expressão e fitosecreção pJVS visando sua

utilização na produção de proteínas heterólogas.

11

MATERIAL E MÉTODOS

Material

Linhagem das Bactérias Utilizadas

Escherichia coli, linhagem DH5α, utilizada para a preparação de células

competentes para os ensaios de transformação feitos nos passo de clonagem.

Agrobacterium tumefaciens C58C1 RifR (Holsters et al., 1980), utilizada na

transformação de células em suspensão de cenoura.

Plasmídios Utilizados

Plasmídios de expressão vegetal pIBT110 e pIBT210 (Mason and Arntzen,

1995).

Plasmídios de expressão e fitosecreção pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA,

desenvolvidos pelo Grupo de pesquisa Quorum-sensing, Interferência Microbiana e

Infecção, do Laboratório de Biotecnologia (LBT) da UENF (da Silva, et al., 2002),

conforme Figura 1.

Material Vegetal

Plantas de fumo (Nicotiana tabacum, var petit Havana, cv SR1), foram mantidas

em meio MS (Anexo I.2) (Murashige and Skoog, 1962), e em potes individuais, a 26oC,

sob fotoperíodo de 16h no claro e 8h no escuro. A cada 20 dias, as plantas foram

subclonadas e transferidas para potes individuais contendo meio de cultura fresco.

Sementes de cenoura (Daucus carota), cultivar comercial "CENOURA DE

VERÃO" (distribuído pela Horticeris sementes - Campinas/SP) e o cultivar

"ALVORADA" (distribuído pela EMBRAPA - Brasília/DF), foram germinadas em meio

MS (Anexo I.2) e acondicionadas em frascos mantidos nas mesmas condições das

plantas de fumo. Posteriormente, os calos de cenoura obtidos foram transformados via

Agrobacterium tumefaciens.

12

Figura 1. Esquema do vetor de expressão pJVS. sv, seqüência do vetor; T7 promotor

do vírus T7; bla, gene de resistência à ampicilina; ter, região terminadora do gene bla;

CaMV 35S, promotor constitutivo do vírus do mosaico da couve-flor; TEV, seqüência

enhancer; calSP, seqüência codificadora do peptídeo sinal de calreticulina; SMC, sítio

múltiplo de clonagem do vetor pSK∆; VSP, região terminadora da proteína de reserva

vegetativa; nas caixas estão indicados os sítios das enzimas de restrição.

ter bla

calSP+0 G 6xHis/bfpA pJVS +0bfpA

6xHis/bfpA calSP+1 G pJVS +1bfpA

CaMV 35S calSP+ N TEV MCS VSP vs T7 vs

pJVS +0,+1,+2

XbaI, BamHI, SmaI, PstI, ClaI, SalI, XhoI,DraI, ApaI, StuI, HindIII, BspMI, SphI, [PstI

(nt12)], [HincII (nt14)]

[XhoI (nt692)] [EcoRI (nt697)] EcoRV

vs

13

Métodos

Estabelecimento da cultura de células em suspensão de cenoura

Calos de cenoura (n=8) foram transferidos para frascos de 250 mL devidamente

esterilizados, contendo 30 mL de meio de indução de calo líquido (Anexo I.3),

suplementado com hormônio 2,4D (2,4-ácido diclorofenoxiacético). Os frascos foram

mantidos sob agitação constante de 30 rpm, na ausência de luz. Após um período de

30 dias, retirou-se uma alíquota de 8 mL para semear novas culturas.

Após 15 dias, a cultura foi novamente semeada em meio de cultura fresco (Anexo I.3) e

mantida a 26oC, sob agitação constante e posteriormente utilizada como material

vegetal para transformação por Agrobacterium tumefaciens.

Transformação de células em suspensão de cenoura ( Daucus carota ) com

Agrobacterium tumefaciens transconjugante

Cultura de células em suspensão de cenoura foi transformada com Agrobacterium

tumefaciens transconjugante, contendo o clone pJVS+1bfpA, que possui a região

codificadora da proteína de interesse na linha correta de leitura. Primeiramente foram

feitas alíquotas de 7mL de cultura em suspensão (Anexo I.3), em erlenmeyers de

250mL, e acrescentou-se 500µL da Agrobacterium tumefaciens transconjugante. Após

o período de 48 h de co-cultivo no escuro adicionou-se 250mg/L de antibiótico

cefotaxime (Kefoxin - BioChimico), para o controle da Agrobacterium tumefaciens.

As culturas foram plaqueadas em meio de cultura sólido (Anexo I.3) contendo o agente

seletivo canamicina e cefotaxime, como inibidor do crescimento bacteriano, a fim de

selecionar os possíveis calos transgênicos. Os calos foram mantidos nesse meio por

um período de 15 dias.

14

Ensaio de imunodetecção para verificar a presença d a proteína BfpA em tecidos

de plantas transgênicas de fumo

Plântulas de fumo transgênicas, com o sistema de expressão e fitosecreção

pJVS, previamente obtidas (Carvalho, 2003) foram macerados em nitrogênio líquido

para extração protéica e posterior ensaio de imunodetecção em membrana, a fim de

verificar se houve a expressão de BfpA. Após a separação das amostras protéicas de

interesse por eletroforese em gel desnaturante de acrilamida 12% (Anexo II.4)

(Laemmli, 1970), as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose

embebida em tampão fosfato 50 mM pH 7.4 (Anexo II.2) (Dr. Enrique Medina-Acosta

não publicado). Após este passo, o conjunto de transferência foi montado observando-

se o sentido de migração dos eletrodos. A transferência foi realizada por 2 horas a 10

volts. Após a transferência as membranas foram retiradas e lavadas por 5 minutos em

tampão TST 1X (Anexo II.3) sob agitação. Após a lavagem as membranas foram

incubadas, sob agitação constante, por um período de 12h, com a solução de bloqueio,

isto é, tampão TST1X suplementado com 5% de leite em pó desnatado (Nestlé),

posteriormente a solução de bloqueio foi decantada e então foi acrescentada a solução

do primeiro anticorpo, consistindo de 50 ml de tampão TST1X contendo 0,5% de leite

desnatado e 10 µl (diluição 1:5000) de anticorpo monoclonal anti-His

(Amersham/Pharmacia/USA). As membranas foram incubadas com o primeiro anticorpo

sob agitação moderada por 10 horas, após esse período foram lavadas 3 vezes, 5 min

cada, sob agitação em tampão TST1X. As membranas foram então incubadas por 2

horas na presença de proteína A (Sigma) ligada à peroxidase dissolvida em tampão

TST20 1X (Anexo II.3) + 0,5% de leite desnatado. Para as membranas contendo

material fitosecretado de fumo, o conjugado proteína A peroxidase (diluição 1:5000) em

tampão TST1X contendo 0,5% de leite desnatado foi utilizado. Após o período de 2h a

membrana foi lavada 3 vezes, 5 min cada, sob agitação em tampão TST1X. Utilizou-se

o sistema de revelação com DAB (Diaminobenzidina) de acordo com as modificações

descritas por da Silva e colaboradores (2002).

15

Preparo de células competentes de Escherichia coli

Células de Escherichia coli DH5α competentes foram preparadas de acordo com os

métodos descritos por Sambrook e colaboradores (2001), utilizando-se cloreto de

cálcio.

Amplificação da região codificadora da BfpA no veto r pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA

As reações foram montadas contendo 50 ng de DNA das construções pJ17, pJ18 e

pJ19; 5 µL de tampão específico 10X; 0,4 µL de dNTP mix (25 mM); 3 µL de MgCl2

(25mM); 1 µL do iniciador 1 (TTACTTCATAAAATATGTAACTTT) (50 pmol/µL); 1,0µL do

iniciador 2 (CTGTCTTTGATTGAATCTGCA) (50 pmol/µL) específicos para a região

codificadora da proteína BfpA (Carvalho, 2003); 0,2 µL(1U) da enzima Taq polimerase.

Os volumes finais das reações foram ajustados para 50 µL com água deionizada, e

utilizado o termociclador Techo (Hybaid USA). A programação consistiu de 1 ciclo inicial

de desnaturação das fitas, com temperatura de 94oC e duração de 5 minutos; 35 ciclos

de amplificação com: passo 1, temperatura de 94oC e duração de 1 minuto, passo 2,

temperatura de 50oC e duração de 1 minuto e passo 3, temperatura de 72oC e duração

de 1minuto; e 1 ciclo final com: passo 1, temperatura de 72oC e duração de 15 minutos

e passo 2, temperatura de 8oC e duração 2 h, para manter a reação. Os produtos da

amplificação foram separados em eletroforese em gel de agarose 0,8%, contendo

brometo de etídeo.

Obtenção dos clones pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA via transformação de células

competentes de E.coli

Os clones pJVS+0bfpA, que contém a região codificadora para o gene bfpA na linha

incorreta de leitura, e pJVS+1bfpA que contém a região codificadora para o gene bfpA

na linha correta de leitura, foram individualmente adicionados à 100 µL de células

competentes e incubados em gelo por 30 minutos. Em seguida submetidos a choque

térmico a 42oC por 90 segundos. Após o choque térmico, foram acrescentados 1mL de

16

meio LB líquido (Anexo I.1), as culturas transferidas para tubos de 15 mL estéreis e a

reação foi incubada a 37oC, sob agitação constante, por 2h e plaqueadas em meio LB

sólido (Anexo I.1) suplementado com 100 µg/mL do agente seletivo canamicina. Foram

feitas culturas das colônias obtidas na transformação e subseqüentes mini-preparações

para obtenção de DNA plasmidial.

Validação dos clones pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA via seqüenciamento

Para confirmar a seqüência do clone pJVS+1bfpA, que é a construção em que o gene

bfpA está na linha correta de leitura, DNA dos clones obtidos no passo anterior,

denominados pJVS+0bfpA e pJVS+1bfpA, foram concentrados à 2ng/µL. O

seqüenciamento parcial foi feito por encomenda à empresa Genemed Synthesis Inc.,

(CA, USA), e ao longo desse seqüenciamento é possível se verificar a fusão da

seqüência codificadora para o peptídeo sinal (calreticulina), além da região codificadora

para o gene bfpA. O iniciador utilizado no seqüenciamento parcial foi o complementar à

região enhancer TEV (5’TCTCAAgCAATCAAgCATTCTAC3’), que compõe o sistema de

expressão pJVS (da Silva, et al., 2002).

Extração de DNA plasmidial

O fato de o vetor binário ser um plasmídio grande, e ainda, o fato do vetor pré-binário

contendo o cassete de expressão+1bfpA ter passos posteriores de digestões parciais

requer grandes quantidades de DNA de ambos os vetores. Além disso, em ambos os

casos houve a necessidade de garantir a não contaminação da preparação com DNA

genômico. Assim, lançou-se mão de um método eficiente de extração de DNA

plasmidial, o que precisou ser bem estabelecido. Utilizou-se o protocolo do Kit Max-

Prep da Qiagen, com modificações, seguindo como passos: 250mL da cultura obtida

após 16h de crescimento foi centrifugada a 2.800xg por 15 minutos, após centrifugação

o sobrenadante foi descartado, o cultivo decantado foi suspenso em 5mL de solução

contendo 50 mM Tris-HCl pH8,0; 10mM de EDTA pH8,0; 100µg/mL de RNAse A.

Posteriormente a amostra foi agitada no vortex. Então, adicionou-se 5mL de solução

17

contendo 0,2M NaOH; SDS 1%, e misturou-se por inversão, incubando-se a amostra

por 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se posteriormente 5mL de acetato de

potássio 3M pH 5,5 e misturou-se por inversão. Adicionou-se clorofórmio na proporção

de 1:1 e centrifugou-se a amostra a 4oC por 30 minutos a 20.300xg. Em seguida retirou-

se suavemente a fase superior. Adicionou-se isopropanol gelado na proporção de 1:1 e

centrifugou-se a 4oC por 20 minutos a 20.300xg. O sobrenadante foi então descartado e

o sedimento, lavado com etanol 70%, por 5 minutos a 20.300xg. Após serem secas na

estufa a 37oC, foram suspensas em 250µL de H2O deionizada.

O grande diferencial nesse método de extração foi no passo seguinte ao acréscimo de

acetato de sódio. As amostras sobre extração devem repousar à temperatura ambiente

por 5 minutos, isso facilitou a ação do acetato de sódio na eliminação do DNA

genômico. Outro passo importante, é que após esse período de 5 minutos há o

acréscimo do clorofórmio que resulta na partição da mistura em duas fases: superior

hidrofílica e inferior hidrofóbica, e como resultado as proteínas e lipídeos são

efetivamente extraídos.

Clonagem do cassete de expressão pBJVS+1bfpA no vetor binário pIBT110

O clone pJVS+1bfpA confirmado via seqüenciamento foi digerido parcialmente com as

enzimas EcoRI e HindIII. Na digestão parcial primeiramente utilizou-se uma quantidade

de enzima menor do que usualmente utilizado (0.3 u para cada µg de DNA), nesse caso

foi digerido 250ng de DNA, por período de tempo de 15 e 30 minutos em banho-maria,

a 37ºC. Após diversas tentativas notou-se a necessidade de utilizar uma quantidade

maior de DNA para execução da digestão parcial, visto que na digestão parcial a

enzima não age uniformemente no substrato o que requer grandes quantidades de

DNA alvo, a fim de que após as digestões as quantidades de DNA sejam suficientes

para as reações de ligação.

Assim, montou-se primeiramente uma reação de digestão parcial contendo: 1 µg

de DNA, 0.3 unidades de EcoRI, 5 µL de tampão específico, em 6 tubos

separadamente. O volume final das reações foi ajustado para 50 µL com água

deionizada e a digestão foi incubada a 37oC por 15’ e 30’. Os fragmentos de DNA foram

18

separados em gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídeo e purificados utilizando

DEAE- celulose DE-81, de acordo com técnica descrita por Dretzen (1981) e Danner

(1982). Após a visualização do DNA em luz ultravioleta, duas incisões foram feitas no

gel com lâmina de bisturi, uma anterior e outra posterior à banda de DNA de interesse e

nestas foram inseridos os pedaços de papel DE-81 no tamanho mínimo referente à

largura da banda e altura do gel. A eletroforese foi, então, reiniciada até o DNA ser

totalmente transferido ao papel. Os fragmentos de papel foram retirados e lavados

cuidadosamente no tampão de corrida. O papel foi então depositado em tubo de 1,5 mL

e acrescido 400 µL de tampão de eluição(Anexo II.1). Os tubos foram mantidos por 30

minutos a 68oC e, então, centrifugados por 20 minutos a 4oC. O sobrenadante foi

transferido para outro tubo e a ele foram acrescidos 4 µL de MgCl2 (1M) e 1 mL de

etanol absoluto gelado para precipitação do DNA. Os tubos foram mantidos em freezer

a -70oC por 30 minutos, seguido de centrifugação por 20 minutos a 4oC. O

sobrenadante foi então descartado e o sedimento, lavado com etanol 70%, seco e

suspenso em 44 µL de água deionizada, de acordo com técnica descrita por Dretzen

(1981) e Danner (1982). Com esse fragmento de, aproximadamente, 4700pb obtido no

passo anterior foi montada a digestão parcial com a enzima HindIII: 0.3 unidades de

enzima foram acrescentadas a 5 µL de tampão específico. A digestão foi incubada a

37oC por 15’ e 30’. Após a clivagem, os fragmentos de DNA foram separados em um

gel de agarose 0,8% e purificados conforme descrito anteriormente.

Preparo do vetor binário pIBT110

O vetor binário pIBT110 (Mason et al., 1996) foi digerido com as enzimas EcoRI e

HindIII. Foram feitas reações contendo 500 ng de DNA, 5 unidades de EcoRI, 5 µL de

tampão específico. A digestão teve seu volume final ajustado para 50 µL com água

deionizada e foram incubadas a 37oC por 4 h. Após o tempo de incubação foi retirada

um alíquota de 5µL do tubo de digestão, e aplicado em gel de agarose 0,8%.

Confirmada a digestão pela visualização de um banda de aproximadamente 13Kb,

acrescentou-se ao tubo 10 µL de Acetato de Sódio (3M), 45 µL de água deionizada, e

500 µL de etanol absoluto gelado, e prosseguiu-se a precipitação do DNA, conforme

19

procedimento descrito acima. O DNA foi suspenso em 44 µL de água deionizada, por

conseguinte, foram acrescentados 5 unidades de HindIII e 5 µL de tampão específico. A

digestão teve seu volume final ajustado para 50 µL e foi incubada a 37oC por 4 h. Após

a clivagem, os fragmentos de DNA foram separados em gel de agarose 0,8% e

purificados conforme descrito acima, utilizando-se DEAE-celulose DE-81 conforme

técnica descrita por Dretzen (1981) e Danner (1982).

20

Ligação do cassete de expressão +1bfpA com o

21

veöööööööööööö öööö ööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö





ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

22


23


24



25

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööö öööööööööööööööööööö


















öööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

ööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööö

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööö

öööööööööööööö öööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö







öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööö

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööö

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö












ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö








ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

ööööööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

1 2 3 4 7 6 5

1 2 3 4

BfpA

A

26







27


28

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö öööö

öööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö





29


30




31


32

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö öööö öööööö

ööööööö öööööööööööö ööö ööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööö

33


34



35


36


37


38


39


40







41


42

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

43



44




45


46

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööö öööö ööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööö










47


48

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ö





10000 pb

3500 pb

500 pb 600 pb

1 2 3 4 7 6 5 8

49


50


ööö öööööööööö öööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööö














51


52





53


54







55


56


öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööö

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

ööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö







57


58

ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö








59


60


ööööööööööööööööööööööööö ööööööööööö öööööööööööööööööö öööö ööö ööö









61


62

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö






ööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö




3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2 1

6500 pb

23000 pb

4.700 pb

1 2 3

4.300 pb

2.300 pb

63


64

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööö






öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö2.500 pb

5 6 7 8 9 1 2 3 4

4300 pb

2300 pb

65


66







67


68

ööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö




2300 pb

23000 pb

13.000 pb

800 pb

1 2 3

69


70




71


72


ööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööö öööööööööööööööööööööö ööö






73


74

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööö��

��

��

��

��

��öööööööööööö




3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 2 1 17 18 16 15

2300 pb 23000 pb

75


76

ööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö










77


78







79


80

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö



81


82




83


84


85



86
















87


88














89


90











91


92









93


94




öö��

��

��

��

��ööö












95


96


97



98





99


100


101


102







103


104











105


106








107


108







109


110

öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö




111


112












113


114

ööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö

pode se concluir:

• O sistema de expressão e fitosecreção pJVS (pJVS+0, pJVS+1 e pJVS+2),

composto pelo cassete de expressão contendo somente a seqüência

codificadora do peptídeo sinal da calreticulina acrescida de 0, +1 e +2

nucleotídeos, foi recuperado.

• O clone pJVS+1bfpA (região codificadora da proteína BfpA fundida ao cassete

de expressão pJVS+1) foi recuperado, o que permitirá a validação do sistema

de fitosecreção utilizando-se a proteína BfpA em sistema de produção contínua.

• O clone pBJVS+1bfpA ainda não foi recuperado. Acredita-se que a limitação

esteja na necessidade de digestão parcial. Propõe-se, assim, a eliminação dos

sítios de restrição ambíguos (HindIII e EcoRI) no vetor de clonagem pEU84,

através de digestão com as enzimas e subseqüente preenchimento ou

degradação das extremidades. Essa estratégia permitirá que o sistema tenha

uma versatilidade ainda maior, pois continuará adicionado o hexâmero de

histidina e, ainda, não haverá mais a necessidade de digestão parcial.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

115

Almquist, K. C., McLean, M. D., Niu, Y., Byrne,G., Olea-Popelka, F. C., Murrant, C.,

Barclay, J. and Hall J. C. (2006) Expression of an anti-botulinum toxin A neutralizing

single-chain Fv recombinant antibody in transgenic tobacco. Vaccine. 24: 2079-2086.

Alvarez, M. L., Pinyerd, H. L., Crisantes, J. D., Rigano, M. M., Pinkhasov, J., Walmsley,

A M., Mason, H. S. and Cardineau G. A. (2006) Plant-made subunit vaccine against

pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice. Vaccine. 24: 2477-2490.

Arakawa, T., Chong, D.K.X., Merritt, J.L, Langridge,W.H.R. (1997) Expression of cholera

toxin-B subunit oligomers in transgenic potato plants. Transgenic Res. 6: 403–413.

Arakawa, T., Yu, J., Chong, D.K., Hough, J., Engen, P.C., Langridge, W.H.R. (1998) A

Plant-based cholera toxin B subunit-insulin fusion protein protects against the

development of autoimmune diabetes. Nat. Biotech. 16: 934–938.

Araújo, J. P. P. and Watt, E. E. (1988) Vírus que infectam a caupi no Brasil. O caupi no

Brasil. Brasília - D. F. Departamento de Publicações Embrapa – CNPAF: 507-545.

Arntzen, C.J. (1997) Edible vaccines. Public Health Rep. 112: 190-197.

Arntzen, C.J., Plotkin, S. and Dodet, B. (2005) Plant-derived vaccines and antibodies:

potencial and limitations. Vaccine. 23: 1753-1756.

Birch, R. G. (1997) Plant transformation: problems and strategies for practical aplication.

Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 297-326.

Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Logendra, S., Petersen, F., Gleba, Y., and Raskin, I.

(1999) Production of recombinant proteins in plant root exudates. Nature Biotech. 17:

466-469.

116

Bouche, F.B., Marquet-Blouin, E., Yanagi, Y., Steinmetz, A., Muller, C.P. (2003)

Neutralising immunogenicity of a polyepitope antigen expressed in a transgenic food

plant: a novel antigen to protect against measles. Vaccine 21: 2074–2081.

Boyko, V., van der Laak, J., Ferralli, J., Suslova, E., Kwon, M.O. and Heinlein, M. (2000)

Cellular targets of functional and dysfunctional mutants of tobacco mosaic virus

movement protein fused to green fluorescent protein. J Virol. 74: 11339-46.

Carvalho, A. R. B. (2003) Obtenção de cultura de células em suspensão de cenoura e

fumo transgênicos: uma plataforma experimental para obtenção de inóculos

biorreatores de proteínas recombinantes por fitosecreção. Monografia defendida no

Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes - RJ. 67p.

Castanon, S., Marý´n, M.S., Martý´n-Alonso, J.M., Boga, J.A., Casais, R., Humara, J.M.,

Orda´s, R.J., Parra, F. (1999) Immunization with potato plants expressing VP60 protein

protects against rabbit hemorrhagic disease virus. J. Virol. 73: 4452–4455.

Cid, L.P.B. (1998) Suspensão celular em Cultura de tecidos e transformação genética

de plantas. Vol I - Embrapa-SPI, Editores: Antônio Carlos Torres, Linda Styer Caldas e

José Amauri Buso.

Dalal, M., Dani, R. G. and Kumar, P. A. (2006) Current trends in the genetic engineering

of vegetable crops. Scientia Horticulturae. 107: 215-225.

Dalsgaard, K., Uttenthal, A., Jones, T. D., Xu, F., Merryweather, A., Hamilton, W. D. O.,

Langeveld, J. P. M., Boshuizen, R. S., Kamstrup, S., Lomonossoff, G. P., Porta, C.,

Vela, C., Casal, J. I., Meloen, R. H. and Rodgers, P. B. (1997) Plant-derived vaccine

protects target animals against a viral disease. Nat Biotechnol. 15: 248-252.

117

Danner, D.B. (1982) Recovery of DNA Fragments from gels by transfer to DEAE-paper

in eletrophoresis chamber. Anal Biochem. 125: 139-142.

da Silva (2001) Produção de um sistema de expressão e secreção de proteínas

recombinantes em plantas transgênicas. Tese de mestrado em Biociências e

Biotecnologia - Centro de Biociências e Biotecnologia - Laboratório de Biotecnologia,

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes -

RJ. 103p.

da Silva, J.V., Garcia, A.B., Flores, V.M.Q., Macedo, Z.S.M. and Medina-Acosta, E.

(2002) Phytosecretion of enteropathogenic Escherichia coli pilin subunit A in transgenic

tobacco and its suitability for early life vaccinology. Vaccine. 20: 2091-2101.

Doran, P. M. (2006) Loss of secreted antibody from transgenic plant tissue cultures due

to surface adsorption. Journal Biotechnol. 122: 39-54.

Dretzen, D.B., M.; Sassone-Corsi, P. and Chambon, P. A. (1981) Reliable method for

recovery of DNA fragments from agarose and acrilamide gels. Anal Biochem. 112: 295-

298.

Firek, S., Draper, J., Owen, M.R.L., Gandecha, A., Cockburn, B. and Whitelam, G.C.

(1993) Secretion of a functional single-chain Fv protein in transgenic tobacco plants and

cell supension cultures. Plant Molec. Biol. 23: 861-870.

Flores, V. M. Q., Fernandes, R. C. C. S., Macedo, Z. S. and , Medina-Acosta, E. (2002)

Expression and Purification of the Recombinant Enteropathogenic Escherichia coli

Vaccine Candidates BfpA and EspB. Prot. Expr. and Purif. 25: 16-22.

Fuchs, C., Köster, D., Wiebusch, S., Mahr, K., Eisbrenner, G. and Märkl, H. (2002)

Scale-up of dialysis fermentation for high cell density cultivation of Escherichia.coli.

Journal of Biotech. 93: 243-251.

118

Gao, Y., Ma, Y., Li, M., Cheng, T., Li, S.W., Zhang, J., Xia, N.S. (2003) Oral

immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg. World J.

Gastroenterol. 9: 996–1002.

Gesualdi-Mesquita, G. G. P. (2006) O vírus do mosaico do feijão-de-corda como vetor

para a expressão transiente de fatores de virulência em plantas via agroinfiltração. Tese

de mestrado em Biociências e Biotecnologia - Centro de Biociências e Biotecnologia -

Laboratório de Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro, Campos dos Goytacazes - RJ. 105p.

Gómez, N., Carrilo, C., Salinas, J., Parra, F., Borca, M.V. and Escribano, J.M. (1998)

Expression of immunogenic glycoprotein S polypetidesfrom transmissible gastroenteritis

coronavirus in transgenic plants. Virology. 249: 352-358.

Gopinath, K., Wellink, J., Porta, C., Taylor, K. M., Lomonossoff, G. P. and Kammen, A.

(2000) Engineering Cowpea Mosaic Virus RNA-2 into a vector to express heterologous

proteins in plants. Virology. 267: 159-173.

Holsters, M., Silva, B., Van Vliet, F., Genetello, C., De Block, M., Dhaese, P., Depicker,

A., Inze, D., Engler, G., Villarroel, R. and (1980) The functional organization of the

nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid. 3: 212-30.

Hong, S., Kwon, T., Lee, J., Jang, Y. and Yang, M. (2002) Production of biologically

active hG-CSF by transgenic plant cell suspension culture. Enz. And Microb. Techn. 30:

763-767.

Jani, D., Meena, L.S., Rizwan-ul-Haq, Q.M., Singh, Y., Sharma, A.K., Tyagi, A.K. (2002)

Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants. Transgenic Res. 11:

447–454.

Kagnoff, M.F. (1996) Oral tolerance: mechanisms and possible role in inflammatory joint

diseases. Baillieres Clin Rheumatol. 10: 41-54.

119

Kim, T.G., Langridge, W.H. (2003) Assembly of cholera toxin B subunit fulllength

rotavirus NSP4 fusion protein oligomers in transgenic potato. Plant Cell Rep. 21: 884–

890.

Kim, T.G., Galloway, D.R., Langridg, W.H. (2004) Synthesis and assembly of anthrax

lethal factor-cholera toxin B-subunit fusion protein in transgenic potato. Mol. Biotech. 28:

175–183.

Kumar, G. B. S., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J. and Bapat V. A. (2006)

Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170: 918-

925.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature. 227: 680-5.

Larrick, J.W., Yu, L., Naftzger, C., Jaiswal, S. and Wycoff, K. (2001) Production of

secretory IgA antibodies in plants. Biomol. Engineering. 18: 87-94.

Lauterslager, T.G.M. and Hilgers, L.A.Th. (2002) Efficacy of oral administration and oral

intake of edible vaccines. Immun. Letters. 84: 185-190.

Liu, L. and Lomonossoff, G.P. (2002) Agroinfection as a rapid method for propagating

Cowpea mosaic virus-based constructs. Journal of Virological Methods. 105: 343-348.

Liu, L., Cañizares, M. C., Monger, W., Perrin, Y., Tsakiris, E., Porta, C., Shariat, N.,

Nicholson, L. and Lomonossoff, G.P. (2005) Cowpea mosaic virus-based systems for

the production of antigens and antibodies in plants. Vaccine. 23: 1788-1792.

Lomonossoff, G.P. and Hamilton, W. P.(1999) Cowpea Mosaic Virus-based vaccines.

Curr. Top. Microbiol. Immunol. J. Hammond, P. McGarvey and V.Yusilov, Springer-

Verlag Berlin Heidelberg. 240: 177-189.

120

Lung, S., Chan, W., Yip, W., Wang, L., Yeung, E. C. and Lim, B. L. (2005) Secretion of

beta-propeller phytase from tobacco and Arabidopsis roots enhances phosphorus

utilization. Plant science. 169: 341-349.

Ma, Y., Lin, S.Q., Gao, Y., Li, M., Luo, W.X., Zhang, J., Xia, N.S. (2003) Expression of

ORF2 partial gene of hepatitis E virus in tomatoes and immunoactivity of expression

products. World J. Gastroenterol. 9: 2211– 2215.

Ma, H. and Chen, G. (2005) Gene transfer technique. Nature and Science. 3(1): 25-31.

McGarvey, P.B., Hammond, J., Dienelt, M.M., Hooper, D.C., Fu, Z.F., Dietzschold, B.,

Koprowski, H., Michael, F.H. (1995) Expression of the rabies virus glycoprotein in

transgenic tomatoes. Bio/Tech. 13: 1484–1487.

Mason, H.S., Lam, D.M. and Arntzen, C.J. (1992) Expression of hepatitis B surface

antigen in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA . 89: 11745-9.

Mason, H.S. and Arntzen, C.J. (1995) Transgenic plants as vaccine production systems.

Trends Biotechnol. 13: 388-92.

Mason, H.S., Ball, J.M., Shi, J.J., Jiang, X., Estes, M.K. and Arntzen, C.J. (1996)

Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral

immunogenicity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A . 93: 5335-40.

Mason, H.S., Haq, T. A., Clements, J. D. and Arntzen, C.J. (1998) Edible vaccine

protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing

a synthetic LT-B gene. Vaccine. 16: 1336-1343.

Mittmann, J. (2004) Obtenção e produção de partículas virais quiméricas do vírus do

mosaico do feijão-de-corda que expressam epitopos das proteínas gp63, LACK e

LDP23 de Leishmania chagasi. Tese de Doutorado em Biociências e Biotecnologia -

121

Centro de Biociências e Biotecnologia - Laboratório de Biotecnologia, Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes - RJ. 150p.

Modelska, A., Dietzschold, B., Sleysh, N., Fu, Z.F., Steplewski, K., Hooper, D.C.,

Koprowski, H., Yusibov, V. (1998) Immunization against rabies with plant-derived

antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 2481–2485.

Moura, R. S. (2004) Produção de partículas quiméricas do vírus do feijão-de-corda

expressando o peptídeo sinal de transcitose da enterotoxina estafilocócica tipo B.

Trabalho de Conclusão de Curso - Centro de Biociências e Biotecnologia - Laboratório

de Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos

dos Goytacazes - RJ. 74p.

Murashige, T. and. Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays

with tobacco tissue culture. Plant Physiol. 15: 562-568.

Nicolaisen, M., Johansen, E., Poulsen, G.B. and Borkhardt, B. (1992) The 5'

untranslated region from pea seedborne mosaic potyvirus RNA as a translational

enhancer in pea and tobacco protoplasts. Elsevier Science Publishers B.V. 303: 169-

172.

Porceddu, A., Falorni, A., Ferradini, N., Cosentino, A., Calcinaro, P., Faleri, C., Cresti,

M., Lorenzetti, F., Brunettiand, P., Pezzotti, M. (1999) Transgenic plants expressing

human glutamic acid decarboxylase (GAD65), a major autoantigen in insulin-dependent

diabetes mellitus. Mol. Breed. 5: 553–560.

Porta, C., Spall, V. E., Lin, T., Johnson, J. E. and Lomonossoff, G.P. (1996) The

development of Cowpea Mosaic Virus as a potencial source of novel vaccines.

Intervirology. 39: 79-84.

Porta, C., and Lomonossoff, G.P. (2002) Viroses as vectors for the expression of foreign

sequences in plants. Biotech. and Genetic Engin. Reviews. 19: 245-291.

122

Revillard, J.P., Cozon, G. and Czerkinsky, C. (1992) Oral administration of

immunomodulators and the mucosal immune system. Dev Biol Stand. 77: 31-7.

Richter, L.J., Thanavala, Y., Arntzen, C.J., Mason, H.S. (2000) Production of hepatitis B

surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nat. Biotech. 18: 1167–1171.

Rigano, M. M. and Walmsley, A. M. (2005) Expression systems and developments in

plant-made vaccines. Immun. And Cell Biol. 83: 271-277.

Sambrook and Russel. (2001) Molecular cloning. A laboratory manual. Vol.1, 3. Ed.

Edition Cold Spring Harbor, NY. 1:112-1.115.

Sandhu, J.S., Krasnyanski, S.F., Domier, L.L., Korban, S.S., Osadjan, M.D., Buetow,

D.E.(2000) Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory

syncytial virus-F protein induces a systemic immune response. Transgenic Res. 9: 127–

135.

Scholthof, H.B., Scholthof, K.G., and Jackson, A, O. (1996) Plant virus gene vectors for

transient expression of foreign proteins in plants. Annual Reviews of Phytopahology. 34:

299-323.

Smith, M. L., Richter, L., Arntzen, C. J., Shuler, M. L. and Mason, H. S. (2003) Structural

characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral

immunization studies. Vaccine. 21: 4011-4021.

Sohel, I., Puente, J. L., Ramer, S. W., Bieber, D., Wu, C. Y.and Schoolnik, G. K. (1996)

Enteropathogenic Escherichia coli: identification of a gene cluster coding for bundle-

forming pilus morphogenesis. Journal Bacteriol. 178: 2613-2628.

Stoger, E., Sack, M., Fischer, R. and Christou, P. (2002) Plantbodies: applications,

advantages and bottlenecks. Curr. Opin. In Biotec. 13: 161-6.

123

Tacket, C.O., Mason, H.S., Losonsky, G., Clements, J.D., Levine, M.M. and Arntzen,

C.J. (1998) Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a

transgenic potato. Nat Med. 4: 607-9.

Tacket, C.O., Pasetti, M.F., Edelman, R., Howard, J.A., and Streatfield, S. (2004)

Immunogenicity of recombinant LT-B delivered orally to humans in transgenic corn.

Vaccine. 23: 1866-1869.

Wales, R., Chaddock, J.A., Roberts, L.M. and Lord, J.M. (1992) Addition of an ER

retention signal to the ricin A chain increases the cytotoxicity of the holotoxin. Exp Cell

Res. 203: 1-4.

Walmsley, A. M. and Arntzen, C.J. (2000) Plants for delivery of edible vaccines. Plant

Biotechnology. 11: 126-129.

Warzecha, H., Mason, H.S., Lane, C., Tryggvesson, A., Rybicki, E., Williamson, A.L.,

Clements, J.D., Rose, R.C.J. (2003) Oral immunogenicity of human papillomavirus-like

particles expressed in potato. Virology 77: 8702–8711.

Yu, J., Langridge, W.H. (2003) Expression of rotavirus capsid protein VP6 in transgenic

potato and its oral immunogenicity in mice. Transgenic Res. 12: 163–169.

Yusibov, V., Hooper, D.C., Spitsin, S.V., Fleysh, N., Kean, R.B., Mikheeva, T., Deka, D.,

Karasev, A., Cox, S., Randall, J., Koprowski, H. (2002) Expression in plants and

immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine. Vaccine 20: 3155–

3164.

Zhou, J.Y., Cheng, L.Q., Zheng, X.J., Wu, J.X., Shang, S.B., Wang, J.Y., Chen, J.G.

(2004) Generation of the transgenic potato expressing full-length spike protein of

infectious bronchitis virus. J. Biotech. 111: 121–130.

124

ANEXO I

125

MEIOS DE CULTURA

1. LB (Meio Luria-Bertani)

Triptona ..............................................................................10,0 g

Extrato de Levedo .............................................................. 5,0 g

NaCl ...................................................................................10,0 g

H2O .....................................................................................800 ml

Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 2 N

Acrescentar água para 1000 ml.

Meio sólido - agar ...............................................................15,0 g

Esterilizar por autoclavagem por 20 minutos

2. Meio de germinação e manutenção de plantas de fu mo e cenoura (MS)

Macro e micro elementos MS (Sigma) ................................2,2 g/l

Sacarose .............................................................................10 g/l

Ajustar o pH para 5,7 com NaOH

Ágar.....................................................................................8 g/l

Esterelizar por autoclavagem

3. Meio de indução de calos de cenoura (MS)

Sais MS (Sigma) .................................................................4,4 g/l

Sacarose .............................................................................30g/l

Ajustar o pH para 5,7 com NaOH

Ágar.....................................................................................8 g/l

2,4D.....................................................................................1 mg/l

Esterelizar por autoclavagem

Após a autoclavagem acrescentar

Canamicina .......................................................................75 mg/l

Cefotaxime ........................................................................250 mg/l

126

ANEXO II

127

TAMPÕES

1) Tampão de eluição

Tris-HCl 1M pH8,0..................................... 400µL

EDTA 0,5M pH8,0 ..................................... 80µL

NaCl 5M .................................................... 8mL

2) Tampão fosfato 0,5 M pH 7,4

3.1. Soluções estoque

200 ml NaHPO4 ......................................... 1 M

200 ml Na2HPO4........................................ 1 M

3.2. Preparo

200 ml da solução 1

59,2 ml da solução 2

Ajustar o volume para 400 ml com água ultra pura

3) Tampão TST-20 (10X)

Tris-HCl pH 7.4(12,11 g/l) ......................... 100 mM

NaCl (87,1 g/l) ........................................... 1,5 M

Tween-20 (5 ml/l) ...................................... .0,5 %

4) Soluções para preparo de géis de acrilamida

5.1. Tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8

Dissolver 27,23 g de Tris-base em aproximadamente 100 ml de água bidestilada;

ajustar o pH a 8,8 com HCl 6 N; completar volume para 150 ml e guardar a 4oC

5.2.Tampão Tris -HCl 0,5 M pH 6,8

Dissolver 6 g de Tris-base em aproximadamente 60 ml de água bidestilada, ajustar o pH

a 6,8 com HCl 6 N; completar o volume para 100 ml e guardar a 4oC.

5.3. Tampão de amostra (desnaturante 4 X concentrado)

- SDS 10%................................................. 1,6 ml

- Tris-HCl (1M pH 6,8) ............................... 1,0 ml

- Glicerol .................................................... 10 %

128

- Azul de bromo fenol ............................... 0,5 %

- Água ultra pura........................................ 3,8 ml

5.4. Tampão para o gel de resolução

-Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8

5.5. Tampão para o gel concentrador

- Tris-HCl 0,5 M pH 6,8

5.6. Preparo dos Géis (Cálculo para 10 ml)

Concentração final

de acrilamida

Água

bidestilada(ml)

Solução

tampão(ml)

Solução(ml)

estoque

4 % 6,15 2,50 1,33

5 % 5,80 2,50 1,67

6 % 5,45 2,50 2,00

7 % 5,15 2,50 2,33

8 % 4,80 2,50 2,67

9 % 4,45 2,50 3,00

10 % 4,15 2,50 3,33

11 % 3,80 2,50 3,67

12% 3,45 2,50 4,00

13% 3,15 2,50 4,30

14% 2,80 2,50 4,67

15% 2,45 2,50 5,00

16% 2,15 2,50 5,33

17% 1,80 2,50 5,67

5.7. Catalisadores (para 10 ml de gel)

50µl APS 10% e 5 µl TEMED

Documents

tese anna apos revisor[1]Final de vez - UENF · ERA do vírus da raiva. Tomate Proteína G acumulou-se no complexo de Golgi, vesículas, plasmalema, e parede celular de células do