TESE DE DOUTORADO AMIDAS HALOGENADAS: REAÇÕES DE …repositorio.ufpb.br/jspui/bitstream/tede/8806/2/arquivotototal.pdf · À toda família do IPeFarM, onde, apesar das dificuldades,

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTÉTICOS BIOATIVOS

TESE DE DOUTORADO

AMIDAS HALOGENADAS: REAÇÕES DE ACOPLAMENTO E

INVESTIGAÇÃO IN SILICO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

RICARDO CARNEIRO MONTES

João Pessoa

UFPB-2016

II

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos

TESE DE DOUTORADO



Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos

Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da

Universidade Federal da Paraíba, em

cumprimento às exigências para a obtenção

do título de Doutor em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos, área de Concentração:

FARMACOQUÍMICA.

Orientador: Professor Dr. Damião Pergentino de Sousa

Co-orientadora: Professora Dra. Celidarque da Silva Dias

João Pessoa

UFPB-2016

M779a Montes, Ricardo Carneiro.

Amidas halogenadas: reações de acoplamento e investigação in silico da atividade antimicrobiana / Ricardo Carneiro Montes.- João Pessoa, 2016.

276f. : il. Orientador: Damião Pergentino de Sousa Coorientadora: Celidarque da Silva Dias Tese (Doutorado) - UFPB/CCS

1. Produtos naturais. 2. Farmacoquímica. 3. Benzilamidas.

4. Antifúngico. 5. Antibacteriano. 6. Amida vanílica.

UFPB/BC CDU: 547.9(043

IV

V

Dedicatória

À minha mãe Severina

Carneiro por todo amor, a profa

Celidarque que sempre acreditou em

mim e a minha esposa Kátia Vitória

que esteve sempre me apoiando e

aos meus filhos queridos.

VI

Agradecimentos

A Deus por iluminar sempre meus passos e por me dar compreensão e esperança.

A minha mãe Severina por ter dado tanto carinho e ao mesmo não me deixa fraquejar

nas horas mais difíceis. Quero agradecer por te me incentivado a estudar. Só pude

chegar onde estou por me espelhar em sua imagem de heroína.

Aos meus irmãos Guilherme e Nayara pelo apoio e estímulo em busca dos meus

propósitos.

A minha esposa Kátia Vitória e aos meus filhos Leonardo e Beatriz a quem eu amos

muito e que sempre me deram incentivo moral e apoio sentimental.

A todos os familiares os quais sempre se fizeram presentes em todo momento que

precisei de apoio.

A meu Orientador Dr. Damião Pergentino por ter confiado em mim para executar um

projeto tão grandioso, o qual fiz o possível para concretizar. Espero que possamos

trabalhar em outros projetos tão grandiosos como este.

A Professora Celidarque pela confiança, amizade e dedicação em sua orientação. Seus

ensinamentos irei levar para o resto da vida, guiando sempre com muito cuidado dentro

da vida acadêmica.

Aos professores do curso de Farmácia, especialmente a Regina, Rossana, Kaliandra,

Bagnólia, Damião, Liana, Pablo, Fátima Vanderlei, Cristiane por toda dedicação na

minha formação como farmacêutico.

Aos professores do curso de Farmácia Industrial, especialmente a professores Josean

Tênio, Fábio e a professora Nubia que me mostraram um caminho vasto a percorrer

dentro da indústria.

Aos Professores da Pós-Graduação, cujos ensinamentos me fizeram olhar um novo

horizonte.

Ao Professor Vital do departamento de engenharia química, por me conceder

horários livres para realizar tanto o mestrado quanto esse doutorado, estimulando a me

capacitar cada vez mais.

Aos meus amigos de trabalho, Fátima, Aurenildo, Patrícia, Ricardo, Rafael, Herbert e

Diego, por me dar incentivo e apoio na caminhada do mestrado e doutorado.

Aos companheiros de laboratório, especialmente Jeane, Graciele, Madalena, Ana

Silva, Otemberg, Sara, Géssica, Daniele, Flávio, Raquel que eu pude contar nas horas

tristes e alegres.

Aos amigos adquiridos durante a graduação, Jonh, Gilmar, Fabiola, Raquel pelas

conversas alegres, conselhos e ajuda que puderam dar em minha caminhada.

VII

Aos alunos de iniciação científica, Heitor, Alana, Sayonara e Ewerton pela amizade e

dedicação e positividade dentro do laboratório.

Aos técnicos e funcionários do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos

(IPeFarM-UFPB) pela competência e apoio, pois foram fundamentais para o bom

andamento deste trabalho.

A Raimundo Nonato, o qual eu tenho uma consideração especial, pois nesses anos

dentro do laboratório a sua boa vontade e perseverança me ajudaram muito na minha

vida desde a iniciação cientifica até a Pós-grauduação.

À toda família do IPeFarM, onde, apesar das dificuldades, caminhei para a

concretização de grandes realizações.

A todos aqueles que puderam contribuir de alguma forma com uma conversa, um

conselho, uma compreensão ou um simples sorriso.

A todos vocês

Muito Obrigado!

VIII

RESUMO



Ricardo Carneiro Montes

Tese em produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (Farmacoquímica)

Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências da Saúde – 2016

O presente trabalho teve como finalidade preparar uma coleção de benzilamidas para-

halogenadas derivadas de ácidos cinâmicos e benzoicos estruturalmente relacionadas

através de reações de acoplamento com 4-(cloro, fluro e bromo) benzilaminas,

utilizando o benzotriazol-1-iloxi-tris-(dimetilamino)-fosfônio (BOP) como agente de

acoplamento. Além disso, foram preparados derivados éteres e ésteres da amida do

ácido vanílico. Todos os compostos preparados foram submetidos a testes

antimicrobianos pelo método microdiluição em caldo, tendo como controle

antimicrobiano a gentamicina, a amicacina, o norfloxacino, a penicilina e a nistatina.

Também, foi realizado um estudo de relação estrutura-atividade quantitativo (QSAR)

utilizando softwares computacionais como o KNIME v. 3.1.0 e Volsurf v. 1.0.7. O

estudo realizado resultou na obtenção de 22 amidas e 10 derivados éteres e ésteres da

amida do ácido vanílico, com os rendimentos variando entre 29-89%, sendo 30

compostos inéditos na literatura e identificados por métodos espectroscópicos de

infravermelho e ressonância magnética de 1H e

13C bem como por espectrometria de

massas de alta resolução. A avaliação antimicrobiana demonstrou que onze amidas

apresentaram atividade antifúngica, apenas uma apresentou atividade antibacteriana e

nenhum derivado da amida do ácido vanílico apresentou atividade antimicrobiana. O

estudo QSAR demonstrou que descritores moleculares relacionados à hidrofobicidade,

hidrofilia, variação de pH, momentos de interação de energia e diferença de energia

como DRDRDR, DRDRAC, L4LgS, IW4 e DD2, respectivamente, influenciam na

atividade antifúngica das haloamidas. Conclui-se que as amidas NR14 (amida gálica) e

NR15 (amida vanílica) apresentam concentrações inibitórias mínimas antifúngicas

consideráveis (CIM), assim como NR4 (amida 4-metoxicinâmica) no ensaio

antibacteriano. Esse resultado demonstra que grupos espaçadores como a dupla ligação

dos derivados cinâmicos e adição de hidroxilas na posição para e metoxila na posição

meta no anel aromático da amida potencializam a atividade antifúngica.

Palavras-chaves: Benzilamidas, antifúngico, antibacteriano, amida vanílica

IX

ABSTRACT

HALOGENATED AMIDES: COUPLING REACTIONS AND IN SILICO

RESEARCH OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY

Ricardo Carneiro Montes

Thesis in Natural and Synthetic Bioactive (of Pharmacochemistry) products

Federal University of Paraíba, Centro de Ciências da Saúde – 2016

This study aimed to prepare a collection of benzylamides to-halogenated derivatives of

structurally related benzoic and cinnamic acids by coupling reactions with 4- (chlorine,

bromine and fluro) benzylamines using the Benzotriazol-1-

yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate (BOP) as coupling agent.

All compounds prepared were subjected to antimicrobial testing the method broth

microdilution, with the antimicrobial control gentamicin, amikacin, norfloxacin,

penicillin and nystatin. Also, a study was conducted of quantitative structure-activity

relationship (QSAR) using computational software like KNIME v. 3.1.0 and Volsurf v.

1.0.7. The study achieved the preparation of amides 22 and 10 derived ethers and esters

of vanillic acid amide, with yields ranging from 29-89%, including 30 novel compounds

in the literature and identified by spectroscopic methods such as Infrared and 1H and

13C Magnetic Resonance (NMR) as well as by high resolution mass spectrometry. The

antimicrobial evaluation showed that eleven amides showed antifungal activity, an

amide presented an antibacterial activity and no amide derivative of vanillic acid

showed antimicrobial activity. The QSAR study showed that molecular descriptors

related to hydrophobicity, hydrophilicity, pH change, energy interaction and energy

difference as DRDRDR, DRDRAC, L4LgS, IW4 and DD2, respectively, influence the

antifungal activity of haloamides. It follows that the NR14 amides (Gallic amide) and

NR15 (vanillic amide) had considerable Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) in

antifungal essays, and NR4 (4-methoxycinnamic amide) in the antibacterial test,

considered the most active antimicrobial. This result shows that spacer groups as double

bond of cinnamic derivatives and addition of hydroxyls in the position para and

methoxyl in the meta position on the aromatic ring of the amide enhance the antifungal

activity.

Keywords: Benzylamides, antifungal, antibacterial, vanillic amide

X

LISTAS DE FIGURAS

Figura 01. Métodos usados na síntese de amidas. Os produtos podem ser obtidos a

partir de os cloretos ácidos (a), anidridos (b), ésteres (c), rearranjo de aldoximas (d) e

hidração de nitrilas (e) ...................................................................................................... 6

Figura 02. Exemplos de drogas no mercado contendo função amida, ilustrando a

importância desse grupo funcional na atividade biológica. .............................................. 7

Figura 03. Métodos de preparação de amidas (Formação do agente de acilação (cloreto

ácido) para a aminólise) (Adaptado de SOLOMONS e FRYHLE, 2012). ...................... 8

Figura 04. Exemplos de sais de fosfônio usados na síntese. ........................................... 9

Figura 05. Proposta de ativação do BOP e mecanismo de reação de aminólise. (1)

Ativação através da espécie fosfônica; (2) ativação pelo anel Bt (adaptado de

MONTALBETTI e FALQUE, 2005). ............................................................................ 10

Figura 06. Mecanismo de reação da benzilação da o-vanilina. ..................................... 11

Figura 07. Reação de esterificação usando cloreto de acila e ciclohexanol. ................. 12

Figura 08. Mecanismo de reação da esterificação a partir do anidrido acético e piridina.

........................................................................................................................................ 12

Figura 09. Interações entre um fámaco e um receptor farmacológico .......................... 13

Figura 10. Layout do programa Volsuf 1.0.7. (a) Tela de campos de GRID onde são

mostradas as interações hidrofóbicas, aceptoras (vermelho) e doadoras de hidrogênio da

molécula (azul) e regiões hidrofóbicas (verde). (b) descritores calculados a partir da

molécula em estudo. ....................................................................................................... 15

Figura 11. Layout do programa KNIME de acesso livre. ............................................. 16

Figura 12. Ácido clorogênico, éster cinâmico com propriedades atividades

antibacterianas, antioxidantes, anticancerígenas e reguladoras da glicose e lipídios

séricos (adaptado de MENG et al ,2013) ....................................................................... 17

XI

Figura 13. Amidas do ácido cafeico com atividade antimicrobiana no estudo de FU e

colaboradores (a), modelo de estruturura química para preparação das amidas cinâmicas

de benzoicas halogenadas (b). ........................................................................................ 23

Figura 14. Levedura (a), tubos germinadores hifais (b), hifa (c) e pseudohifa (d) hifas

(e) e morfologias da Candida albicans. (adaptado de KABIR, HUSSAIN & AHMAD,

2012) ............................................................................................................................... 25

Figura 15. Espectro de Ação de antifúngicos sistêmicos. Os blocos fechados

representam as espécies nas quais o agente antifúngico demonstrou eficácia clínica e

microbiológica. Blocos com linhas pontilhadas indicam gêneros e espécies fúngicas em

que a resistência é comum. (adaptado de LEWIS, 2011) ............................................... 30

Figura 16. Proposta de mecanismo de reação das amidas derivados do ácido cinâmico e

benzóico (adaptado de MONTALBETTI e FALQUE, 2005). ....................................... 36

Figura 17. Bandas de infravermelho observados nas amidas eterificadas e esterificadas.

........................................................................................................................................ 55

Figura 18. Sinais de RMN de 1H e

13C observados nas amidas eterificadas e

esterificadas. ................................................................................................................... 61

Figura 19. Amidas obtidas de derivados dos ácidos cinâmicos e benzoicos. .............. 63

Figura 20. Derivados éteres e ésteres da amida do ácido vanílico (NR15). ................. 64

Figura 21. Campos de interações da amida gálica (NR14), amida vanílica (NR15),

amida 4-hidoxibenzoica (NR17) e amida benzoica (NR12), com nível de energia -0.6

kcal/mol de DRY e -3 kcal/mol de N1 no Volsuf. ......................................................... 74

Figura 22. Campos de interações da amida gálica (NR15), amida benzoica (NR12),

amida ferúlica (NR3) e amida cinâmica (NR1), com nível de energia -3,5 kcal/mol de

OH2 no Volsuf. ............................................................................................................... 81

Figura 23. Campos de interações da amida cinâmica (NR1), amida 4-clorocinâmica

(NR8), amida gálica (NR14) e amida vanílica (NR15), com nível de energia -0,99

kcal/mol de DRY no software Volsuf. ........................................................................... 82

Figura 24. Ácido cinâmico e seus derivados ácidos usados como material de partida

para a obtenção das amidas cloradas .............................................................................. 89

XII

Figura 25. Ácido benzoico e seus derivados ácidos usados como material de partida

para a obtenção das amidas cloradas. ............................................................................. 90

Figura 26. Aminas halogenadas usadas como material de partida para a obtenção das

amidas cloradas............................................................................................................... 90

Figura 27. Brometos de alquila usados como material de partida para a obtenção das

dos éteres da amida clorada vanílica. ............................................................................. 91

Figura 28. Cloretos de acila usados como material de partida para a obtenção das dos

éteres da amida clorada vanílica. .................................................................................... 91

XIII

LISTAS DE GRÁFICOS

Gráfico 01. Prevalência de espécies de Candida em infecções hospitalares no Brasil 27

Gráfico 02. Resultado do ensaio antibacteriano por microdiluição das amidas NR1 a

NR22, utilizando cepas de Escherichia coli. .................................................................. 83


NR22, utilizando cepas de Staphylococcus aureus. ....................................................... 83

Gráfico 04. Resultado do ensaio antibacteriano por microdiluição derivados éteres de

NR15, série AR (vaniloil 4-clorobenzamida), utilizando cepas de Escherichia coli e

Staphylococcus aureus. .................................................................................................. 84


NR15, série AK (vaniloil 4-clorobenzamida), utilizando cepas de Escherichia coli e

Staphylococcus aureus. .................................................................................................. 84

XIV

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Dados das reações das amidas derivadas do ácido cinâmico....................... 38

Tabela 02. Dados da reação das amidas derivadas do ácido benzoico. ......................... 39

Tabela 03. Dados da reação dos derivados éteres e ésteres da amida clorada do ácido

vanílico. .......................................................................................................................... 42

Tabela 04. Dados das bandas de infravermelho das amidas cinâmicas e benzoicas ..... 44

Tabela 05. Assinalamentos dos espectros de RMN de 1H das amidas derivado do ácido

cinâmico (200 MHz) ....................................................................................................... 47

Tabela 06. Continuação de assinalamentosdos espectros de RMN de 1H das amidas

derivado do ácido cinâmico (200 MHz) ......................................................................... 48

Tabela 07. Assinalamentos dos espectros de RMN de 1H das amidasderivado do ácido

benzoico(200 MHz). ....................................................................................................... 49

Tabela 08. Assinalamentos dos espectros de RMN de 1H das amidasderivado do ácido

benzoico (200 MHz). ...................................................................................................... 50

Tabela 09. Assinalamentos dos espectros de RMN de 13

C-APT das amidasm derivado

do ácido cinâmico (50 MHz). ......................................................................................... 51

Tabela 10. Assinalamentos de RMN de 13

C-APT das amidas derivado do ácido

benzoico (50 MHz). ........................................................................................................ 52

Tabela 11. Dados do espectro de massas tipo MALDI das amidas NR1 a NR22 ......... 53

Tabela 12. Espectro de infravermelho de ésteres e éteres derivados da amida vanílica

clorada. ........................................................................................................................... 55

Tabela 13. Assinalamentos de RMN de 1H dos derivados da amida do ácido vanílico. 57

Tabela 14. Assinalamentos de RMN de 1H dos derivados da amida do ácido vanilico 58


C-APT dos derivados da amida do ácido

vanílico. .......................................................................................................................... 59

XV

Tabela 16. Comparação dos dados de RMN de 13

C-APT da amida do ácido vanílico e

seus derivados ésteres ..................................................................................................... 60


C -APT da amida do ácido vanílico e

seus derivados éteres. ..................................................................................................... 61

Tabela 17. Dados do espectro de massa tipo MALDI da Série AR e série AK ............ 62

Tabela 18. Atividade antifúngica das amidas derivadas do ácido cinâmico e do ácido

benzoico sobre em ensaio de microdiluição em caldo. .................................................. 70

Tabela 19. Atividade antifúngica de derivados éteres e ésteres da amida do ácido

vanílico em ensaio de diluição em meio liquido e em meio sólido (disco-difusão). ...... 71

Tabela 20. Resumo do treinamento, validação cruzada interna, e os resultados dos

acertos correspondentes, que foram obtidos utilizando método de validação leave-one-

out sobre o conjunto total de 32 haloamidas submetidos a testes antifúngicos. ............. 73

Tabela 21. Atividade antifúngica das amidas da série cinâmica e benzoica em ensaio de

diluição em meio liquido e em meio sólido (disco-difusão). ......................................... 77

Tabela 22. Atividade antifúngica de derivados éteres e ésteres da amida do ácido

vanílico em ensaio de diluição em meio liquido e em meio sólido (disco-difusão). ..... 78


acertos correspondentes, que foram obtidos utilizando método leave-one-out sobre o

conjunto total de 32 haloamidas submetidos a teste antifúngico.................................... 80

XVI

LISTA DE QUADROS

Quadro 01. Derivados cinâmicos que se destacam por sua atividade antimicrobiana. . 21

Quadro 02. Sítios de ação e mecanismos de antifúngicos sistêmicos. .......................... 28

XVII

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 01. Delineamento do estudo antimicrobiano e relação estrutura-atividade

quantitativo das 4-halobenzilamidas .............................................................................. 34

Esquema 02. Reações de acoplamento utilizando ácidos derivados do ácido cinâmico e

do ácido benzoico e 4-clorobenzilamina como materiais de partida. R1, R2 e R3 = H, Cl,

OH, CH3, OCH3, NO2, tert-Bu ou C6H5 e R4=F, Cl e Br conforme estruturas químicas da

figura 19. ........................................................................................................................ 35

Esquema 02. Preparação dos éteres AK1-AK6 e ésteres AR1-AR4 e AC1 derivadas da

amida vanílica (NR15). .................................................................................................. 40

XVIII

LISTA DE ESPECTROS

Espectro 01. Espectro de Infravermelho (KBr, cm-1

) de N-(4-clorobenzil)cinamamida

(NR1). ........................................................................................................................... 103

Espectro 02. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)cinamamida (NR1) (CDCl3,

200 MHz). ..................................................................................................................... 104

Espectro 03. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)cinamamida

(NR1) (CDCl3, 200 MHz). ........................................................................................... 104

Espectro 04. Espectro de RMN 13

C-APT de N-(4-clorobenzil)cinamamida (NR1)

(CDCl3, 50 MHz). ......................................................................................................... 105



(NR2). ........................................................................................................................... 106

Espectro 06. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4-

dihidroxifenil)acrilamida (NR2) (MeOD, 200 MHz).................................................. 106

Espectro 07. Expansão do espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4-

dihidroxifenil)acrilamida (NR2) (MeOD, 200 MHz).................................................. 107



(MeOD, 50 MHz). ........................................................................................................ 107

Espectro 09. Expansão do espectro de RMN 13

C-APT de N-(4-clorobenzil)cinamamida

(NR2) (MeOD, 50 MHz). ............................................................................................. 108

Espectro 10. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-

clorobenzil)cinamamida (NR2). ................................................................................... 108


) de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-

hidroxi-3-metoxifenil)acrilamida (NR3). .................................................................... 109

Espectro 12. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3-

metoxifenil)acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 200 MHz). ............................................... 110

Espectro 13. Expansão do espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-

3-metoxifenil)acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 200 MHz). ............................................ 110

XIX


C-APT de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3-

metoxifenil) acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 50 MHz). ................................................ 111

Espectro 15. Expsão do espectro de RMN 13

C-APT de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-

hidroxi-3-metoxifenil) acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 50 MHz). ................................ 111

Espectro 16. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de (E)-N-(4-

clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamida (NR3). ....................................... 112



metoxifenil)acrilamida (NR4). ..................................................................................... 113

Espectro 18. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-

metoxifenil)acrilamida (NR4) (DMSO-d6, 200 MHz). ................................................ 114

Espectro 19. Expansão do espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-

metoxifenil)acrilamida (NR4) (DMSO-d6, 200 MHz). ................................................ 114



metoxifenil)acrilamida (NR4) (DMSO-d6, 50 MHz). .................................................. 115


clorobenzil)-3-(4-metoxifenil)acrilamida (NR4). ........................................................ 115


) de o-cumaroil 4-clorobenzilamida

(NR5). ........................................................................................................................... 116

Espectro 23. Espectro de RMN 1H de o-cumaroil 4-clorobenzilamida (NR5) (DMSO-

d6, 200 MHz). ............................................................................................................... 117

Espectro 24. Expansão do espectro de RMN 1H de o-cumaroil 4-clorobenzilamida

(NR5) (DMSO-d6, 200 MHz). ...................................................................................... 117


C-APT de o-cumaroil 4-clorobenzilamida (NR5)

(DMSO-d6, 50 MHz). ................................................................................................... 118


C-APT de o-cumaroil 4-

clorobenzilamida (NR5) (DMSO-d6, 50 MHz). .......................................................... 118

XX

Espectro 27. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de de o-cumaroil 4-

clorobenzilamida (NR5). .............................................................................................. 119



hidroxifenil)acrilamida (NR6). ..................................................................................... 120


hidroxifenil)acrilamida (NR6) (DMSO-d6, 200 MHz). ............................................... 121


hidroxifenil)acrilamida (NR6) (DMSO-d6, 200 MHz). ............................................... 121



hidroxifenil)acrilamida (NR6) (DMSO-d6, 50 MHz). ................................................. 122



hidroxifenil)acrilamida (NR6) (DMSO-d6, 50 MHz). ................................................. 122


clorobenzil)-3-(3-hidroxifenil)acrilamida (NR6). ........................................................ 123



hidroxifenil) acrilamida (NR7). .................................................................................... 124

Espectro 35. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxifenil)

acrilamida (NR7) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................... 125


hidroxifenil) acrilamida (NR7) (DMSO-d6, 200 MHz). .............................................. 125


C-APT de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxifenil)

acrilamida (NR7) (DMSO-d6, 50 MHz). ...................................................................... 126



hidroxifenil) acrilamida (NR7) (DMSO-d6, 50 MHz). ................................................ 126


clorobenzil)-3-(4-hidroxifenil) acrilamida (NR27). ..................................................... 127

XXI

Espectro 40 Espectro de Infravermelho (KBr, cm-1


clorofenil)acrilamida (NR8). ........................................................................................ 128

Espectro 41. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-clorofenil)acrilamida

(NR8) (DMSO-d6, 200 MHz). ...................................................................................... 129


clorofenil)acrilamida (NR8) (DMSO-d6, 200 MHz). ................................................... 129



clorofenil)acrilamida (NR8) (DMSO-d6, 50 MHz). ..................................................... 130



clorofenil)acrilamida (NR8) (DMSO-d6, 50 MHz). ..................................................... 130


clorobenzil)-3-(4-clorofenil)acrilamida (NR8). ........................................................... 131



hidroxi-3,5-dimetoxifenil)acrilamida (NR9). ............................................................... 132

Espectro 47. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3,5-

dimetoxifenil)acrilamida (NR9) (DMSO-d6, 200 MHz). ............................................. 133


3,5-dimetoxifenil)acrilamida (NR9) (DMSO-d6, 200 MHz)........................................ 133


C-APT de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3,5-

dimetoxifenil)acrilamida (NR9) (DMSO-d6, 50 MHz). ............................................... 134



dimetoxifenil)acrilamida (NR9) (DMSO-d6, 50 MHz). ............................................... 134



nitrofenil)acrilamida (NR10). ....................................................................................... 136

Espectro 52. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(2-nitrofenil)acrilamida

(NR10) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................................... 136

XXII


C-APT (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(2-

nitrofenil)acrilamida (NR10) (DMSO-d6, 50 MHz).................................................... 137








clorobenzil)-3-(2-nitrofenil)acrilamida (NR10). .......................................................... 138


) de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-

trimetoxifenil)acrilamida (NR11)................................................................................. 139

Espectro 58. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)

acrilamida (NR11) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................. 140

Espectro 59. Expansão do espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-

trimetoxifenil) acrilamida (NR11) (DMSO-d6, 200 MHz). ......................................... 140


C-APT (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)

acrilamida (NR11) (DMSO-d6, 50 MHz). .................................................................... 141


C-APT (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-

trimetoxifenil) acrilamida (NR11) (DMSO-d6, 50 MHz). ........................................... 141


clorobenzil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil) acrilamida (NR11) ............................................. 142


) N-(4-clorobenzil) benzamida

(NR12). ......................................................................................................................... 143

Espectro 64. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil) benzamida (NR12) (DMSO-d6,

200 MHz). ..................................................................................................................... 143

Espectro 65. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil) benzamida

(NR12) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................................... 144

XXIII

Espectro 66. Expansspectro de RMN 13

C-APT de N-(4-clorobenzil) benzamida (NR12)

(DMSO-d6, 50 MHz). ................................................................................................... 144


C-APT de N-(4-clorobenzil) benzamida

(NR12) (DMSO-d6, 50 MHz). ...................................................................................... 145


) de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-

4-carboxamida (NR13). ................................................................................................ 146

Espectro 69. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-4-carboxamida

(NR13) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................................... 146

Espectro 70. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-4-

carboxamida (NR13) (DMSO-d6, 200 MHz). .............................................................. 147


C-APT de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-4-

carboxamida (NR13) (DMSO-d6, 50 MHz). ............................................................... 147


C-APT de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-

bifenil]-4-carboxamida (NR13) (DMSO-d6, 50 MHz). .............................................. 148

Espectro 73. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI N-(4-clorobenzil)-[1,1'-

bifenil]-4-carboxamida (NR13). ................................................................................... 148


) de N-(4-clorobenzil)-3,4,5-

triidroxibenzamida (NR14). ......................................................................................... 149

Espectro 75. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3,4,5-triidroxibenzamida

(NR14) (MeOD, 200 MHz). ......................................................................................... 150


C-APT de N-(4-chlorobenzyl)-3,4,5-

triidroxibenzamida (NR14) (MeOD, 50 MHz). ........................................................... 150



triidroxibenzamida (NR14) (MeOD, 50 MHz). ........................................................... 151

Espectro 78. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-chlorobenzyl)-

3,4,5-triidroxibenzamida (NR14). ................................................................................ 151

XXIV


) de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3-

metoxibenzamida (NR15). ........................................................................................... 152

Espectro 80. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3-metoxibenzamida

(NR15) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................................... 153

Espectro 81. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3-

metoxibenzamida (NR15) (DMSO-d6, 200 MHz). ...................................................... 153


C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3-

metoxibenzamida (NR15) (DMSO-d6, 50 MHz). ........................................................ 154




Espectro 84. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI N-(4-clorobenzil)-4-

hidroxi-3-metoxibenzamida (NR15). ........................................................................... 155


) de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-

3,5-dimetoxibenzamida (NR16). .................................................................................. 156

Espectro 86. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3,5-

dimetoxibenzamida (NR16) (DMSO-d6, 200 MHz). ................................................... 157

Espectro 87. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3,5-

dimetoxibenzamida (NR16) (DMSO-d6, 200 MHz). ................................................... 157


C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3,5-

dimetoxibenzamida (NR16) (DMSO-d6, 50 MHz). ..................................................... 158


C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-

3,5-dimetoxibenzamida (NR16) (DMSO-d6, 50 MHz). ............................................... 158

Espectro 90. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-clorobenzil)-4-

hidroxi-3,5-dimetoxibenzamida (NR16). ..................................................................... 159


) de N-(4-clorobenzil)-4-

hidroxibenzamida (NR17). ........................................................................................... 160

XXV

Espectro 92. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida (NR17)

(DMSO-d6, 200 MHz). ................................................................................................. 161

Espectro 93. Expasão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-

hidroxibenzamida (NR17) (DMSO-d6, 200 MHz). ...................................................... 161


C -APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida

(NR17) (DMSO-d6, 50 MHz). ..................................................................................... 162


C -APT de N-(4-clorobenzil)-4-

hidroxibenzamida (NR17) (DMSO-d6, 50 MHz). ....................................................... 162


hidroxibenzamida (NR17). ........................................................................................... 163


) de 3,5-di-tert-butil-N-(4-

clorobenzil)-4-hidroxibenzamida (NR18). ................................................................... 164

Espectro 98. Espectro de RMN 1H de 3,5-di-tert-butil-N-(4-clorobenzil)-4-





C-APT de 3,5-di-tert-butil-N-(4-clorobenzil)-4-

hidroxibenzamida (NR18) (DMSO-d6, 50 MHz). ........................................................ 166

Espectro 101. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de 3,5-di-tert-butil-N-

(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida (NR18). .............................................................. 166



metoxibenzamida (NR19). ........................................................................................... 167


(NR19) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................................... 168



XXVI


C-APT N-(4-clorobenzil)-2-hidroxi-5-

metoxibenzamida (NR19) (DMSO-d6, 50 MHz). ....................................................... 169



metoxibenzamida (NR19) (DMSO-d6, 50 MHz). ....................................................... 169




) de N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-

nitrobenzamida (NR20). ............................................................................................... 171

Espectro 109. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-nitrobenzamida

(NR20) (DMSO-d6, 200 MHz). .................................................................................... 171

Espectro 110. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-

nitrobenzamida (NR20) (DMSO-d6, 200 MHz). .......................................................... 172


C-APT de N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-

nitrobenzamida (NR20) (DMSO-d6, 50 MHz). ............................................................ 172



nitrobenzamida (NR20) (DMSO-d6, 50 MHz). ............................................................ 173


metil-4-nitrobenzamida (NR20). .................................................................................. 173


) de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-

3-metoxibenzamida (NR21). ........................................................................................ 174

Espectro 115. Espectro de RMN 1H de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-3-


Espectro 116. Expansão de espectro de RMN 1H de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-3-



C-APT de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-3-


XXVII

Espectro 118. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-fluorobenzil)-

4-hidroxi-3-metoxibenzamida (NR21). ........................................................................ 176


) de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-

3-metoxibenzamida (NR22). ........................................................................................ 177

Espectro 120. Espectro de RMN 1H de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-3-

metoxibenzamida (NR22) (CDCl3, 200 MHz). ............................................................ 178

Espectro 121. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-3-

metoxibenzamida (NR22) (CDCl3, 200 MHz). ............................................................ 178


C-APT de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-3-

metoxibenzamida (NR22) (CDCl3, 50 MHz). .............................................................. 179


C-APT de N-(4-bromobenzil)-4-

hidroxi-3-metoxibenzamida (NR22) (CDCl3, 50 MHz)............................................... 179

Espectro 124. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-bromobenzil)-

4-hidroxi-3-metoxibenzamida (NR22). ........................................................................ 180


) de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-

2-metoxifenil (AR1). .................................................................................................... 181

Espectro 126. Espectro de RMN 1H de Benzoato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 200 MHz). ................................................................ 182

Espectro 127. Expansão do espectro de RMN 1H de Benzoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 200 MHz). ....................... 182


C-APT Benzoato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 50 MHz). ................................................................. 183


C-APT Benzoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 50 MHz). ........................ 183

Espectro 130. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR1). .............................................................. 184

XXVIII


) de 2-fenilacetato de 4-((4-


Espectro 132. Espectro de RMN 1H de 2-fenilacetato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-

2-metoxifenil (AR2) (DMSO-d6, 200 MHz). ............................................................... 186

Espectro 133. Expansão do espectro de RMN 1H de 2-fenilacetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR2) (DMSO-d6, 200 MHz). ......................... 186


C-APT de 2-fenilacetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR2) (DMSO-d6, 50 MHz). ........................... 187



clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR2) (DMSO-d6, 50 MHz). ........................... 187

Espectro 136. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de 2-fenilacetato de 4-

((4-clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR2). ........................................................ 188


) de Pentanoato de 4-((4-


Espectro 138. Espectro de RMN 1H de Pentanoato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenil (AR3) (CDCl3, 200 MHz). ........................................................................ 190

Espectro 139. Expansão do espectro de RMN 1H de Pentanoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR3) (CDCl3, 200 MHz). .............................. 190


C-APT de Pentanoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR3) (CDCl3, 50 MHz). ............................... 191

Espectro 141. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de Pentanoato de 4-((4-



) de 3-bromobenzoato de 4-((4-


Espectro 143. Espectro de RMN 1H de 3-bromobenzoato de 4-((4-clorobenzil)

carbamoil)-2-metoxifenil (AR4) (CDCl3, 200 MHz). .................................................. 193

XXIX

Espectro 144. Expansão do espectro de RMN 1H de 3-bromobenzoato de 4-((4-

clorobenzil) carbamoil)-2-metoxifenil (AR4) (CDCl3, 200 MHz). ............................. 194


C-APT de 3-bromobenzoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR4) (CDCl3, 50 MHz). ................................ 194



clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR4) (CDCl3, 50 MHz). ................................ 195




) de Acetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AC1). .............................................................. 197

Espectro 149. Espectro de RMN 1H de Acetato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenil (AC1) (CDCl3, 200 MHz). ........................................................................ 197

Espectro 150. Expansão do espectro de RMN 1H de Acetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AC1) (CDCl3, 200 MHz). .............................. 198


C-APT de Acetato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-

2-metoxifenil (AC1) (CDCl3, 50 MHz). ..................................................................... 198


C-APT de Acetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AC1) (CDCl3, 50 MHz). ................................ 199




) de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-

(4-metilfenetoxi) benzamida (AK1). ............................................................................ 201

Espectro 155. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-(4-metilfenetoxi)

benzamida (AK1) (CDCl3, 200 MHz). ......................................................................... 201

Espectro 156. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-(4-

metilfenetoxi) benzamida (AK1) (CDCl3, 200 MHz). ................................................. 202

XXX


C-APT de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-(4-

metilfenetoxi) benzamida (AK1) (CDCl3, 50 MHz). ................................................... 202


C-APT de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-

4-(4-metilfenetoxi) benzamida (AK1) (CDCl3, 50 MHz). ........................................... 203


metoxi-4-(4-metilfenetoxi) benzamida (AK1). ............................................................ 203


) de N-(4-clorobenzil)-4-(4-

hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2)................................................................. 205

Espectro 161. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(4-hidroxifenetox)-3-

metoxibenzamida (AK2) (CDCl3, 200 MHz). ............................................................. 205

Espectro 162. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(4-

hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2) (CDCl3, 200 MHz). ................................ 206


C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-(4-hidroxifenetox)-3-

metoxibenzamida (AK2) (CDCl3, 50 MHz). .............................................................. 206


C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-(4-

hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2) (CDCl3, 50 MHz). ................................. 207



hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2) (CDCl3, 50 MHz). ................................. 207


(4-hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2). ........................................................... 208



propoxibenzamida (AK3). ............................................................................................ 210

Espectro 168. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-

propoxibenzamida (AK3) (CDCl3, 200 MHz). ............................................................ 210

Espectro 169. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-

propoxibenzamida (AK3) (CDCl3, 200 MHz). ............................................................ 211

XXXI


C-APT de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-

propoxibenzamida (AK3) (CDCl3, 50 MHz). .............................................................. 211



4-propoxibenzamida (AK3) (CDCl3, 50 MHz). ........................................................... 212


metoxi-4-propoxibenzamida (AK3). ............................................................................ 212



isopropoxi-3-metoxibenzamida (AK4). ....................................................................... 214

Espectro 174. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-isopropoxi-3-


Espectro 175. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-isopropoxi-3-



C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-isopropoxi-3-

metoxibenzamida (AK4) (CDCl3, 50 MHz). ............................................................... 215


isopropoxi-3-metoxibenzamida (AK4). ....................................................................... 216


) de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-

3-metoxibenzamida (AK6). .......................................................................................... 218

Espectro 179. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-3-


Espectro 180. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-3-



C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-3-

metoxibenzamida (AK6) (CDCl3, 50 MHz). ............................................................... 219


(deciloxi)-3-metoxibenzamida (AK6). ......................................................................... 220

XXXII

XXXIII

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E FÓRMULAS

µg micrograma

2D Duas dimensões

3D três dimensões

ACP Análise de Componentes Principais

APT Attached Proton Test

ADME absorção distribuição, metabolismo e distribuição

BOP Benzotriazol-1-iloxi-tris-(dimetilamino)-fosfônio hexafluorofosfato

CC Cromatografia em coluna

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

CHCl3 Clorofórmio

CIM Concentração inibitória mínina

COSY Correlation Spectroscopy

d Dubleto

dd Duplo dubleto

ddd Duplo duplo dubleto

DMF Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

DRDRDR Dry-Dry-Dry

DRDRAC Dry-Dry-Aceptor

DD2 Differences of the Hydrophobic volumes (nível 2)

Et3N trietilamina

EtOH Etanol

FDA Food And Drug Administration

HOBt ester do hidroxibenzotriazol

Hz Hertz

IV Infravermelho

IW4 Integy moments (nível 4)

J Constante de acoplamento

KI Iodeto de Potássio

KNIME (The Konstanz Information Miner)

LMCA Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise

Me Metila

XXXIV

MHz Megahertz

mL mililitro

OMe Metoxila

P.F. Ponto de fusão

PKa log da constante ácida

ppm Partes por milhão

PyAOP Benzotriazol-1-yl-oxi-tris-pirrolidinofosfônio hexafluorofosfato

QSAR Relação estrutura-atividade quantitiativa

RMN 13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio 1

s Singleto

SDS Dodecilsulfato de sódio

sp subníveis de enegia eletrônica s e p

UV Ultravioleta

δ Deslocamento químico em ppm

XXXV

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................. 5

2.1. Considerações sobre a química das amidas ....................................................... 5

2.1.1. A química das amidas e a sua importância no desenvolvimento de fármacos . 5 2.1.2. Síntese de amidas a partir de agentes acopladores (BOP) ................................ 7

2.2. Eterificação e esterificação de anéis aromáticos hidroxilados ....................... 11

2.3. Relação estrutura atividade quantitativa (QSAR, Quantitative Structure

Activity Relationship) ............................................................................................... 13

2.4. Considerações sobre os compostos cinâmicos e benzoicos ............................. 16

2.4.1. Potencial terapêutico dos compostos cinâmicos ............................................. 16

2.4.2. Derivados cinâmicos e benzoicos com atividade antimicrobiana .................. 18 2.4.3. A importância de amidas halogenadas no estudo antimicrobiano .................. 22

2.5. Considerações gerais sobre bactérias e fungoS patogênicos .......................... 23

2.5.1 Staphylococcus aureus ..................................................................................... 23

2.5.3. Escherichia coli .............................................................................................. 24 2.5.4. Considerações o genêro Candida e sua patogenicidade ................................. 25 2.5.5. Drogas usadas na terapia antifúngica .............................................................. 27

3. OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 32

3.1 Objetivos Específicos .......................................................................................... 32

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 34

4.1. Delineamento dos estudos desenvolvidos ......................................................... 34

4.2. Etapa química .................................................................................................... 35

4.2.1. Etapa de obtenção e preparação das amidas cinâmicas e benzoicas

halogenadas ............................................................................................................... 35 4.2.2 Etapa de obtenção e preparação dos éteres e dos ésteres da amida clorada

vanílica ...................................................................................................................... 40

4.3. Análise espectroscópica das amidas cinâmicas e benzoicas halogenadas ..... 43

4.3.1. Interpretação dos espectros de infravermelho dos compostos NR1 a NR22 .. 43 4.3.2 Interpretação dos espectros de RMN de

1H e

13C dos compostos NR1 a NR 22

.................................................................................................................................. 44

4.3.3. Interpretação dos espectros de massas dos compostos NR1 a NR22 ............. 53 4.3.4. Interpretação dos espectros de infravermelho dos compostos ésteres (AR1 a

AR4 e AC1) e dos compostos éteres (AK1-AK6) .................................................... 54 4.3.5. Interpretação dos espectros de RMN de

1H e

13C dos compostos ésteres (AR1

a AR4 e AC1) e dos compostos éteres (AK1-AK6) ................................................. 56

4.3.6. Interpretação dos espectros de massas dos compostos da Série AR e série AK

.................................................................................................................................. 62

4.4. Atividade antifúngica das amidas cinâmicas e benzoicas cloradas ............... 64

4.4.1. Relação estrutura atividade das 4-halobenzilamidas no estudo antifúngico I 64

XXXVI

4.4.2. Relação estrutura atividade quantitativa do estudo antifúngico I ................... 72

4.4.3. Relação estrutura atividade das 4-clorobenzilamidas no estudo antifúngico II

.................................................................................................................................. 75 4.4.4. Relação estrutura atividade quantitativa do estudo antifúngico II .................. 79 4.4.5. Avaliação antibacteriana das amidas .............................................................. 82

5. CONCLUSÕES ......................................................................................................... 86

6. PERPECTIVAS ........................................................................................................ 86

6. Parte experimental ................................................................................................ 89

6.1. Substâncias, reagentes e outros materiais utilizados.......................................... 89 6.2. Métodos cromatográficos................................................................................... 92

6.3. Ponto de fusão .................................................................................................... 92 6.4. Pureza da amostra .............................................................................................. 92 6.5. Métodos espectroscópicos ................................................................................. 92 6.5.1. Infravermelho .................................................................................................. 92

6.5.2. Ressonância Magnética Nuclear ..................................................................... 93 6.5.3. Espectrometria de Massa de Análise .............................................................. 93 6.6. Avaliação da atividade antimicrobiana das amidas ........................................... 94

6.6.1. Estudo de atividade antifúngica I ............................................................. 94 6.6.1.1 – Espaço e responsáveis para o desenvolvimento de estudo .................. 94 6.6.1.2 - Produtos testados .................................................................................. 94

6.6.1.3 -Meios de cultura usados nos ensaios ..................................................... 94 6.6.1.4 - Controle do ensaio antifúngico ............................................................. 94

6.6.1.5 - Leveduras do gênero Candida .............................................................. 95 6.6.1.6 - Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ................... 95

6.6.2. Estudo de atividade antifúngica II ............................................................ 96 6.6.2.1. Espaço e responsáveis para o desenvolvimento de estudo .................... 96

6.6.2.2. Produtos testados ................................................................................... 96 6.6.2.3 - Controle do ensaio antifúngico ............................................................. 96 6.6.2.4 - Microrganismos do gênero Candida usado .......................................... 97

6.6.2.5- Meios de cultura usados nos ensaios ..................................................... 97

6.6.2.6 - Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ..................... 97 6.6.3. Estudo de Atividade antibacteriana das amidas cloradas e derivados éteres

e ésteres da amida do vanílico ............................................................................ 97 6.6.3.1. Local do estudo desenvolvido e pesquisadores envolvidos ................... 97

6.6.3.2. Compostos ............................................................................................. 98 6.6.3.3. Cepas microbianas ................................................................................. 98 6.6.3.4. Preparo das substâncias ......................................................................... 98

6.6.3.5. Preparo dos Antibióticos ........................................................................ 99 6.6.3.6 Determinação da concentração inibitória mínima ................................ 100 6.6.3.7 Análise estatística ................................................................................. 100

6.6. Estudo de relação estrutura-atividade quantitativo .......................................... 100 6.6.1. Materiais e métodos ................................................................................ 100

6.6.2. Modelos para o estudo de QSAR ............................................................ 101

7. Preparação das amidas HALOGENADAS cinâmicas e derivados de éteres e

ésteres da amida do ácido vanílico ........................................................................ 102

7.1. Preparação das amidas halogenadas cinâmicas e benzoicas ............................ 102 7.1.1. NR1 - Amida do ácido cinâmico clorada ...................................................... 103 7.1.2. NR2 - Amida do ácido cafeico clorada ......................................................... 105

XXXVII

7.1.3. NR3 - Amida do ácido ferúlico clorada ........................................................ 109

7.1.4. NR4 – Amida do ácido 4-metoxicinâmico clorada ...................................... 113 7.1.5. NR5 - Amida do ácido o-cumárico clorada .................................................. 116 7.1.6. NR6 – Amida do ácido m-cumárico clorada ................................................ 120 7.1.7. NR7 - Amida do ácido p-cumárico clorada .................................................. 124 7.1.8. NR8 - Amida do ácido clorocinâmico clorada ............................................. 128

7.1.9. NR9 - Amida do ácido sinápico clorada ....................................................... 132 7.1.10. NR10 - Amida do ácido 2-trans-cinâmico clorada ..................................... 135 7.1.11. NR11 - Amida do ácido trimetoxicinâmico clorada ................................... 139 7.1.12. NR12 – Amida do ácido benzóico clorada ................................................. 142 7.1.13. NR13- Amida do ácido 4-bifenilcarboxílico clorada.................................. 145

7.1.14. NR14 – Amida do ácido gálico clorada ...................................................... 149 7.1.15. NR15 – Amida do ácido vanílico clorada ................................................... 152

7.1.16. NR16 – Amida do ácido siríngico clorada .................................................. 156

7.1.17. NR17 – Amida do ácido 4-hidroxibenzóico clorada .................................. 160 7.1.18. NR18 – Amida do ácido 3,5-di-tert-butil-4-hidroxibenzóico clorada ........ 164 7.1.19. NR19 - Amida do ácido 2-hidroxi-5-metoxibenzóico clorada ................... 167 7.1.20. NR20 – Amida do ácido 3-metil-4-nitrobenzóico clorada ......................... 170 7.1.21. NR21 – amida do ácido vanílico fluorada .................................................. 174

7.1.22. NR22 – amida do ácido vanílico bromada .................................................. 177

7.2. Preparação dos derivados ésteres da amida do ácido vanílico .................... 180

7.2.1. AR1 - Benzoato da amida do ácido vanílico ................................................ 180

7.2.2. AR2 – Fenilacetato da amida do ácido vanílico ........................................... 184 7.2.3. AR3 – Valeroato da amida do ácido vanílico ............................................... 188

7.2.4. AR4 – 3-Bromobenzoato da amida do ácido vanílico .................................. 192 7.2.5. AC1 – Acetilado da amida do ácido vanílico ............................................... 196

7.2.6. AK1 – 4-metil-fenóxido da amida do ácido vanílico.................................... 200 7.2.7. AK2 – 4-hidroxi-fenóxido da amida do ácido vanílico ................................ 204 7.2.8. AK3 – 1-Propanóxido da amida do ácido vanílico ....................................... 209

7.2.9. AK4 – 2-Propanóxido da amida do ácido vanílico ....................................... 213 7.2.10. AK6 – Decilóxido da amida do ácido vanílico ........................................... 217

8. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 222

1

1. INTRODUÇÃO

O surgimento de surtos epidemiológicos provocados por micro-organismos a

exemplo do vírus H1N1 vem intensificando o estudo de novos fármacos. Esse fato pode

ser observado no relatório FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA), uma

instituição norte-americana fiscalizadora e reguladora de medicamentos. Nos últimos 10

anos, houve um aumento na aprovação pela FDA de novos medicamentos para doenças

raras como mucopolissacaridose Tipo IVA e lipodistrofia, para doenças comuns,

consideradas gravíssimas a exemplo da hepatite C, tumores cancerígenos avançados,

como também para doenças bastante esclarecidas na literatura como no caso de

infecções complexas e profundas provocadas por bactérias e fungos patogênicos (FDA,

2015).

O relatório da FDA do ano 2014 descreve o lançamento de Zerbaxa, Dalvance ,

Sivextro e Orbactiv, sendo o primeiro utilizado em infecções intra-abdominais e do trato

urinário e os outros para infecções agudas e complexas da estrutura da pele. Esses

exemplos mostram que grupos de pesquisa buscam desenvolver novos protótipos

farmacalogicamente ativos com a finalidade de combater micro-organismos resistentes

a antibióticos usuais. Apesar do impressionante sucesso terapêutico de antibióticos ao

longo das últimas décadas, as doenças infecciosas agudas são responsáveis por 25% das

mortes no mundo e 45% nos países em desenvolvimento, matando cerca de 13 a 17

milhões de pessoas por ano (BINDER et al. 1999).

A resistência de bactérias Gram-positivas é encontrada principalmente em

pacientes com infecções nosocomiais em unidades de terapia intensiva (UTI), mas agora

também é observada em infecções adquiridas no meio social (EADY & COVE, 2003).

Muito importante salientar que a resistência antimicrobiana não se resume às bactérias,

mas também, aos vírus (Hepatite B ou gripe), aos parasitas (Malária) e aos fungos

(principalmente do gênero Candida) que também mostram ser resistentes aos seus

respectivos agentes antimicrobianos (IZA et al.,2014).

Na busca de novos medicamentos, a síntese química se torna um caminho

viável e prático, oferecendo uma rápida resposta e de baixo custo, quando comparado ao

desenvolvimento de drogas por biologia molecular e abordagens da farmacogenética.

Quando é feito um trabalho de otimização da estrutura química em cima do princípio

ativo para a doença em estudo, os compostos molecularmente modificados com

2

atividade, seletividade superiores ao fármaco original poderão se tornar alternativas

medicamentosas mais eficazes (LLOYD-WILLIAMS et al., 1997).

A união da síntese química com os conhecimentos do design de drogas por

assistência computacional ou vice-versa aumenta a confiabilidade dos resultados

propostos de protótipos que sejam mais eficazes, mais eficientes ou produzam menos

efeitos adversos (BAIG et al., 2014). Entre as metodologias assistidas por design de

drogas, existe uma divisão generalizada em duas linhas metodológicas. São elas: o

design de drogas baseado na estrutura e o design de drogas baseado no ligante

(KATSILA et al., 2016).

A abordagem baseado na estrutura está relacionada ao uso de QSAR 2D e 3D,

screening virtual de alto processamento e o estudo da similiaridade dos grupos

farmacofóricos. O fluxo de trabalho geral do QSAR consiste no armazenamento de um

conjunto de informações sobre moléculas ativas e inativas contra um alvo específico e

produção pelo software de descritores moleculares que correlacionam as suas

propriedades estruturais e físico-químicas à atividade em estudo. O modelo pode, então,

ser utilizado para correlacionar estes descritores e a atividade experimental, resultando

em uma ferramenta preditiva para novas entidades moleculares. Os algoritmos QSAR

estão em constante evolução, com a implementação de vários descritores 2D e 3D, que

podem ser estruturais ou físico-químicas (por exemplo, peso, volume, títulos rotativos,

distâncias interatômicas, tipos de átomos, contagens de caminhada moleculares,

eletronegatividade, distribuição de átomo, aromaticidade, solvatação molecular

Propriedades) e podem ser descritos em vários níveis de complexidade crescente

(ZHANG, 2011)

Diante da problemática abordada da resistência dos micro-organismos aos

medicamentos atuais, O presente estudo desenvolvido no laboratório de Química

Farmaceutica/DCF/CCS/UFPB deteu-se no foco de preparar moléculas estruturalmente

relacionadas que tenham uma potencial atividade inibitória contra bactérias e fungos

patogênicos. Foi preparada uma coleção de amidas cinâmicas e benzoicas

estruturalmente relacionadas com substituinte halogenado na posição para, sendo

possível observar quais substituintes no anel aromático cinâmico ou benzoico foram

importantes para atividade antimicrobiana. Além do estudo estrutura-atividade, a

assistência computacional foi empregada no sentido definir que tipos de grupos

químicos causam um aumento na atividade no núcleo base das amidas preparadas.

3

Espera-se que estudo traga mais informações sobre a relação estrutura-

atividade da molécula em modelos em que haja a substituição do ácido a ser introduzido

na estrutura da amida.

4

FUNDAMENTAÇÃO

TEÓRICA

MONTES, R. C./ FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

5

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. CONSIDERAÇÕES SOBRE A QUÍMICA DAS AMIDAS

2.1.1. A química das amidas e a sua importância no desenvolvimento de fármacos

A função carboxila dá origem a vários compostos denominados de derivados

dos ácidos carboxílicos, dentre eles estão às amidas, formadas basicamente da reação

entre um ácido carboxílico e uma amina, ilustrada na Figura 02.

As amidas são comumente encontradas na natureza e se destacam pela baixa

reatividade em comparação com os outros derivados carboxílicos, pois formam ligações

de hidrogênio altamente estáveis. Uma consequência disso são seus altos pontos de

fusão e ebulição, uma vez que suas interações moleculares se tornam mais fortes devido

a essas ligações. Por outro lado, amidas terciárias não formam ligações de hidrogênio e,

portanto, tem pontos de fusão ebulição baixos (VALEUR & BRADLEY 2009).

As amidas são uma das classes mais importante de compostos. Essa classe tem

sido encontrada em abundância na natureza como produtos naturais (KUNG et al. 2010)

proteínas e em polímeros biológicos e sintéticos (GLOMB & PFAHLER, 2001).

Consequentemente, muitos métodos para a síntese das amidas têm sido descritos, como

as reações de aminas com os cloreto de acila (a), ou com anidridos (b), ou com ésteres

(c), rearranjo de aldoximas (KIM et al., 2009) (d) e hidração de nitrilas (e) (Figura 01,

pag 6) (WU et al. 2014).


6

Figura 01. Métodos usados na síntese de amidas. Os produtos podem ser obtidos a

partir de os cloretos ácidos (a), anidridos (b), ésteres (c), rearranjo de aldoximas (d) e

hidração de nitrilas (e)

As funções amida não estão limitadas a sistemas biológicos, mas também em

uma enorme variedade de moléculas sintéticas, incluindo diversos medicamentos

comercializados. De acordo com os relatórios estatísticos das principais empresas

farmacêuticas, quase 25% das drogas contêm uma unidade de ligação amida (GHOSE,

VISWANADHAN & WENDOLOSKI, 1999). Por exemplo, os fármacos ilustrados na

figura 02 (pag 7), como benzilpenicilina, conhecido como penicilina G, um antibiótico

de estreito espectro de ação (WRIGHT, 1999). O lisinopril (inibidor de enzima

conversora de angiotensina), valsartana (bloqueio dos receptores da angiotensina-II), e

diltiazem (bloqueador do canal de cálcio utilizado no tratamento da angina e

hipertensão) são medicamentos com grupos de amidas na estrutura (VALEUR E

BRADLEY, 2009).


7

Figura 02. Exemplos de fármacos no mercado contendo função amida, ilustrando a

importância desse grupo funcional na atividade biológica.

2.1.2. Síntese de amidas a partir de agentes acopladores (BOP)

Existem três maneiras diferentes de formação das ligações amida como

ilustrado na figura 03 (pag 8), embora essas metodologias nem sempre são

distinguíveis: o agente de acilação reativo é formado em passo separado, antes da reação

com a amina, a própria aminólise (f); o reagente de acilação é formado a partir de um

derivado ácido em um passo separado, seguido de um tratamento imediato com a amina

(g); o reagente é gerado in situ na presença de um grupo amino, adicionando o agente de

ativação ou um agente de acoplamento, reações de único passo o qual é utilizado na

metodologia desse estudo de doutorado (h). Na literatura, existem vários tipos de

agentes acopladores de grupos carboximadas: Azidas, ésteres ativos, haletos de acila,

anidridos, anidrido de Leuche, carxiimidas, pirocarbonatos, sais de isoxazólio, fosfônio

e sais fosfônicos, sais amônio, sais amínio


8

Figura 03. Métodos de preparação de amidas (Formação do agente de acilação (cloreto

ácido) para a aminólise) (Adaptado de SOLOMONS e FRYHLE, 2012).

Aminólise de passo único têm sido desenvolvidos para síntese de péptideos em

que o éster ativo é preparado in situ como um intermediário e, subsequentemente, reage

com a amina desejada (MONTALBETTI & FALQUE, 2005).

Os sais de fosfônio (Figura 04, pag 9) foram pesquisados pelos pioneiros

GAWNE, KENNER & SHEPPARD (1969) e estão tornando muito conhecido no

mundo da química orgânica por realizar a aminólise em passo único, gerando o reagente

ativo in situ. De regra, a parte catiônica do sal de fosfônio reage com o ânion do ácido

carboxílico, formando um intermediário acilofosfônio. Um dos sais de fosfônio mais


9

utilizado para síntese de amidas é o hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris-

(dimetilamino)-fosfônio (BOP) também chamado de reagente de Castro, um sólido

cristalino e termolábil, utilizado na preparação de amidas a partir de várias combinações

de ácidos carboxílicos com aminas orgânicas. Além disso, a reação pode ser feita sem a

presença de gás inerte (N2) e a temperatura ambiente, sendo uma reação mais prática do

que as amidas por outras metodologias como, por exemplo, a produção de amidas a

partir cloretos ácidos (exemplo (a) da Figura 01 (pag 6) que necessitam de um ambiente

inerte e o controle da temperatura (MONTALBETTI & FALQUE, 2005). A

desvantagem da utilização do BOP é a produção da triamida hexametilfosfórica (do

inglês: HMPA) que é um produto extremamente tóxico e carcinogênico. Por isso foi

desenvolvido outros agentes acopladores mais eficientes e menos tóxicos como e os

hexafluorofosfatos de Bromotris(dimetilamino) fosfonío (BrOP) e de benzotriazol-1-il-

oxi-tris-pirrolidinofosfônio (PyBOP). Esse último é mais eficiente e produz 1,1’,1’’-

fosforiltripirrolidina, um produto menos tóxico.

Foram desenvolvidos vários sais de fosfônio mais reativos, todavia são mais

caros a exemplo PyAOP. Já o derivado de benzotriazol, PyBOP, também é mais caro do

que o seu análogo, mas é especialmente útil para as etapas de ciclização em que

ativação de aminoácidos fica impedida (FRÉROT et al , 1991)

Figura 04. Exemplos de sais de fosfônio usados na síntese.

O acoplamento in situ é realizado (Figura 05, pag 10) misturando o ácido

carboxílico diluído e amina desejada na presença de BOP na proporção de 1:1:1. O


10

ácido deve estar desprotonado na sua forma aniônica, por isso é adicionada uma amina

terciária como a trietilamina e a mistura do ácido com a amina e o BOP deve estar

solubilizado em um solvente inerte. Muitos mecanismos de reação são possíveis, mas o

mais aceito é por via éster do hidroxibenzotriazol (HOBt). Nesse tipo de mecanismo, o

ácido ionizado reage primeiramente com BOP para gerar espécies ativas de fosfônio

aciladas e HOBt. O HOBt (éster ativo) facilmente reage com o ácido ativado para

produzir um éster reativo de Bt, que finalmente sofre o processo de aminólise. A força

de condução desta reação à base de fosfônio é gerar o correspondente óxido. Nesse tipo

de reação, a dimetilformamida (DMF) é necessário para solubilizar HOBt e

frequentemente é único solvente específico (JOULLIÉ & LASSEN, 2010). Os possíveis

mecanismos estão mostrados na figura abaixo

Figura 05. Proposta de ativação do BOP e mecanismo de reação de aminólise. (1)

Ativação através da espécie fosfônica; (2) ativação pelo anel Bt (adaptado de

MONTALBETTI e FALQUE, 2005).


11

2.2. ETERIFICAÇÃO E ESTERIFICAÇÃO DE ANÉIS AROMÁTICOS

HIDROXILADOS

Historicamente, n-alquil éteres formados pela reação entre o fenol e haletos ou

sulfonatos são clivados sob condições drásticas (refluxo com HBr) (WUTS &

GREENE, 2007). Os éteres podem ser formados por vários métodos, mas o método

mais comum é a sua formação a partir de álcoois. Seja através da desidratação

intermolecular de álcoois, ou através da síntese de Williamson. Os álcoois, na maioria

das vezes, sofrem a perda do hidrogênio molecular para um eletrófilo. A síntese de

Williamson é uma das mais importantes para preparação de éteres assimétricos.

Esse tipo de reação foi estudado por vários químicos e pode ser feita utilizando

diversos reagentes. A reação de Williamson é adequada para alquilação específica de

grupos fenólicosa exemplo da o-vanilina, ilustrado na Figura 06 (pag 11), que possui

uma hidroxila fenólica susceptível ao ataque do haleto orgânico em meio básico (AL–

DOUH, HAMID & OSMAN, 2008).

Figura 06. Mecanismo de reação da benzilação da o-vanilina.

A esterificação utilizada dentro da metodologia desse trabalho se baseou em

dois tipos de reações: a esterificação realizada a partir do cloreto de acila e a

esterificação a partir do anidrido acético e a piridina. A reação de um cloreto de acila

com um álcool ou um fenol para formar um éster ocorre rapidamente e não requer um

catalisador ácido (SOLOMONS & FRYHLE, 2012), pois os cloretos ácidos são

compostos com menores pKa, permitindo a rápida saída do íon cloreto ligado ao grupo

carbonila (Figura 07 pag 12) (CLAYDEN et al. 2012).


12

Figura 07. Reação de esterificação usando cloreto de acila e ciclohexanol.

A esterificação com anidrido acético e a piridina se faz por um mecanismo

muito semelhante ao anterior como pode ser visto na figura 08. A piridina é importante

no sentido de remover o próton gerado pela ligação do grupo carbonila do anidrido

acético ao OH do fenol.

Figura 08. Mecanismo de reação da esterificação a partir do anidrido acético e piridina.


13

2.3. RELAÇÃO ESTRUTURA ATIVIDADE QUANTITATIVA (QSAR,

QUANTITATIVE STRUCTURE ACTIVITY RELATIONSHIP)

O estudo de relação estrutura-atividade tem estabelecido alguns conceitos a

respeito das alterações feitas na molécula líder e a atividade dos análogos. A

investigação de numerosos compostos líderes e seus análogos tornou possível realizar

algumas observações sobre mudanças estruturais e os efeitos biológicos. Essas

mudanças podem ser classificadas de várias formas, como (LIMA, 2007):

O tamanho e forma do esqueleto de carbono;

A natureza e grau de substituição;

A estereoquímica do líder;

Os fármacos interagem com seu receptor biológico através de determinadas

forças intermoleculares, sendo elas: interações polares, lipofílicas, eletrostáticas e

estéreas. Esses exemplos são ilustrados na figura 9 (pag 13). Um composto ativo ao

interagir com um alvo específico deve possuir uma estrutura tridimensional de forma

que as disposições de seus grupos funcionais favoreçam uma maior complementaridade

ao sítio de ligação. Geralmente os alvos específicos são uma enzima, um receptor, um

canal de íons, um ácido nucleico ou qualquer outra macromolécula biológica

(SIMMONS, CHOPRA & FISHWICK, 2010).

Porém as pesquisas atuais trabalham com o conceito de drogas multifuncionais

que possuem vários alvos biológicos. Como exemplo desse conceito, têm-se drogas

utilizadas na terapia de alguns tipos de câncer cuja oncogênese é conhecido por ser

mutagênico, podendo ter de quatro a sete mutações independentes. Há também agentes

anticolesterêmicos que não apenas inibem a síntese pelo fígado do colesterol como

também impedem a absorção no trato gastrointestinal (ZIMMERMANN, LEHÁR &

KEITH, 2007).

Figura 09. Interações entre um fámaco e um receptor farmacológico


14

Em estudos de QSAR, é comum o uso de softwares que calculam descritores a

partir da estrutura química dos compostos orgânicos. Esses descritores caracterizam

quantitativamente o tamanho, a forma, a polaridade, a hidrofobicidade das moléculas e

o equilíbrio entre elas (SCOTTI, 2008). Dentre os softwares usados para a geração dos

descritores moleculares para serem utilizados em QSAR, pode-se citar Volsurf (Figura

10, pag 15) (CRUCIANI et al, 2000), DRAGON (TALETE, 2006) e CODESSA

(KATRITZKY et al. 2001).

Os descritores do Volsurf têm um significado químico claro e também não são

sensíveis a regras de alinhamento de campo de interação molecular (estérico,

hidrofóbico ou columbino), mostrando-se útil na predição de modelos de absorção

distribuição, metabolismo e distribuição (ADME). O Volsurf é aplicado em:

Modelos para a solubilidade, permeação CaCO-2 através monocamada celular,

permeação da barreira hematoencefálica, classificação biofarmacêutica, solubilidade em

água / DMSO, estabilidade metabólica da CYP3A4;

Métodos estatísticos de Análise de Componentes Principais (PCA) em que

funciona pela decomposição a matriz X como o produto de duas matrizes menores, que

são chamados matrizes de carregamento e marcação para a criação de modelos QSAR;

Consenso de análise de componentes principais (CPCA) produz blocos de escores

(Tb) e blocos de pesos (Pb) para cada uma das sondas usadas e uma matriz de pesos que

expressa a participação de cada bloco nos escores totais (Fernandes, 2012).

Métodos dos mínimos quadrados parciais (PLS) baseados em uma análise,

utilizando a técnica de regressão cujo objetivo é explicar uma ou mais variáveis

dependentes (do Y) em termos de um número de variáveis explicativas (preditoras, X

's).

Inúmeras opções de sonda atômica para campos moleculares de geração locais

de ligação energeticamente favoráveis em moléculas de estrutura conhecida. Essas

sondas detectam regiões aquosas, hidrófobas, anfipáticas, carregadas.

Descritores em que incluem o volume, superfície, globularidade,

superfície/relação de volume, áreas hidrofóbicas e hidrofílicas, energia de interação

sonda, embalagem crítico, polarizabilidade, momento anfifílico e capacidade de ligação

de hidrogênio.

A PCA é uma técnica extremamente útil para "resumir" toda a informação

contida em uma matriz. No PLS, diferentes métodos produzem modelos que se


15

"encaixam" nos Y's com maior ou menor precisão. O melhor método será capaz de

calcular os valores de Y que correspondem aos valores experimentais, mesmo para

moléculas não incluídas na construção do modelo. Estes modelos são "preditivos" e

pode ser utilizado para calcular estimativas confiáveis de valores de Y para novas

moléculas, antes da sua disponibilidade.

Figura 10. Layout do programa Volsuf 1.0.7. (a) Tela de campos de GRID onde são

mostradas as interações hidrofóbicas, aceptoras (vermelho) e doadoras de hidrogênio da

molécula (azul) e regiões hidrofóbicas (verde). (b) descritores calculados a partir da

molécula em estudo.

Outro software também utilizado para estudos no QSAR é o KNIME (The

Konstanz Information Miner, Figura 11, pag 17), um software aberto, o qual permite

uma fácil montagem visual e execução interativa de um pipeline de dados, como

também, tem uma grande aplicação na área farmacêutica. Ele é projetado como uma

plataforma de ensino, pesquisa e colaboração, que permite a integração simples de

novos algoritmos e ferramentas, bem como métodos de manipulação de dados ou

visualização na forma de novos módulos ou nós. (BERTHOLD et al., 2007).


16

Figura 11. Layout do programa KNIME de acesso livre.

2.4. CONSIDERAÇÕES SOBRE OS COMPOSTOS CINÂMICOS E

BENZOICOS

2.4.1. Potencial terapêutico dos compostos cinâmicos

Os derivados cinâmicos e benzoicos são os que mais se destacam por sua

distribuição e versatilidade (DIXON et al. 1999). O ácido cinâmico surge nas plantas

através da eliminação da amônia proveniente de aminoácidos fenilalanina ou tirosina

pela via do chiquimato (DEWICK, 2009). Um estudo recente propôs que os ácidos

cinâmicos causar inibição do crescimento de fungos através da interacção com o

benzoato de 4-hidroxilase, enzima responsável para a desintoxicação aromática

(KOROŠEC et al., 2014). Os outros derivados cinâmicos mais ácidos são produzidos

por reações de hidroxilação enzimática do citocromo P450 sobre o ácido cinâmico, a

exemplo do ácido p-cumárico e o ácido ferúlico. Reações de metilação e hidroxilação

são desenvolvidas sobre o ácido cinâmico para gerar outros metabólitos, em uma

sequência de construção de padrões de substituição típicos de metabólitos do ácido

chiquímico, a exemplo do ácido sinápico (DEWICK, 2009). Esses constituintes são

importantes na via bioquímica das plantas que produzem a lignina (BALTAS &

BEDOS-BELVAL, 2011). Todos derivados cinâmicos, incluindo também o ácido

cafeico e o ácido clorogênico (ácido 3-cafeoilquínico) (Figura 12, pag 17), são

antioxidantes bem conhecidos devido ao seu elevado potencial redox. Eles podem atuar

como agentes redutores, desativadores de radicais de oxigênio, doadores de hidrogênio

e agentes quelantes de metais (FARAH et al., 2008). A inibição da oxidação de lípidos


17

ou os seus efeitos sobre eliminação de radicais livres, tais como o anion superóxido

foram umas das propriedades determinadas sobre esses derivados cinâmicos (SOVA,

2012).

Figura 12. Ácido clorogênico, éster cinâmico com propriedades atividades

antibacterianas, antioxidantes, anticancerígenas e reguladoras da glicose e lipídeos

séricos (adaptado de MENG et al ,2013)

Ácidos benzoicos são produtos naturais estruturalmente simples, muito

embora, as rotas de sua biossíntese são variadas. Os caminhos para o mesmo composto

podem ser bastante diferentes de acordo com o organismo, e por vezes mais de uma via

podem existir em um único organismo. Mas existem vias alternativas nas quais os

derivados do ácido cinâmico (C6C3) são clivados na dupla ligação e perder dois átomos

de carbono da cadeia lateral. Assim, o ácido 4-cumárico pode atuar como um precursor

de ácido 4-hidroxibenzóico, e ácido ferúlico pode dar origem ao ácido vanílico (ácido 4-

hidroxi-3-metoxibenzóico). Alternativamente, o próprio ácido cinâmico pode ser

convertido em ácido benzoico (DEWICK, 2009). Outros derivados benzoicos como o

ácido gálico e seus derivados metilados (ácido siríngico) ou conjugados galoís de

derivados de catequinas são encontrados na natureza com abundância no reino vegetal.

O ácido gálico e seus derivados naturais têm sido amplamente relatados para várias

atividades biológicas e farmacológicas, incluindo efeitos anti-inflamatórios e

neuroprotetores (CHHILLAR & DHINGRA 2013; DHINGRA, CHHILLAR, &


18

GUPTA, 2012; KROES et al. 1992; LORUSSO et al. 2009). Além disso, o ácido gálico

é um bom indutor da apoptose (TARAPHDER, ROY & BHATTACHARYA, 2001).

Vários estudos têm fornecido evidências da eficácia do ácido vanílico no tratamento de

respostas imunitárias ou inflamatórias. São descritos na literatura sobre o ácido vanílico:

atividade de proliferação de linfócitos humanos; secreção de interferon-gama em células

mononucleares de sangue periférico; efeito hepatoprotetor através da sua ação

supressora sobre a inflamação hepática imunomediada em lesão hepática induzida por

concanavalina A e colite ulcerosa induzida por sulfato de sódio de dextrano (KIM et al.

2010a). Análogos vaniloides e isovaniloides se mostraram eficazes na inibição

Aminoacil-ARNt-sintetases, uma importante enzima-alvo de bactérias resistentes a

antibióticos (LEE et al. 2001).

As amidas cinâmicas e benzoicas não são muito comuns, mesmo assim podem

ser encontrados em algumas plantas. As amidas fenilpropanoicas são muito importantes

na batata (Solanum tuberosum), pois esse vegetal produz esses compostos como um

mecanismo de defesa do fungo Phytophthora infestans, causador de uma doença

destrutiva na plantação (SCHMIDT et al. 1998). Na literatura, são descritas amidas

cafeicas sintéticas com sensibilidade inibitória sobre cepas bacterianas e fúngicas (FU et

al. 2010) e anticolesterolêmicas (KIM et al. 2005). Amidas derivadas do benzaldeído e

do ácido benzoico demonstraram atividade em receptores alfa e delta proliferadores-

ativados de peroxissoma, recepetor envolvido na oxidação de lipídeos endógenos

(KASUGA et al. 2006a; KASUGA et al. 2006b)

2.4.2. Derivados cinâmicos e benzoicos com atividade antimicrobiana

A funcionalidade cinamoíla e benzoíla também está presente numa variedade

de metabolitos secundários de origem biossintética fenilpropanóide que mostra uma

versatilidade farmacológica. Cinamatos hidroxilados naturais são agentes antitumorais

extremamente potentes (BALTAS & BEDOS-BELVAL, 2011). Plantas com teor de

compostos cinamoílos como Cinnamomum verum J.S. Presl., Cinnamomum cassia

Blume, cujas concentrações de cinamaldeído no óleo essencial está entre 65 a 80% e é

maior do que 85%, respectivamente. Tanto o óleo essencial quanto o cinamaldeído

isolado já tiveram suas atividades antimicrobianas relatadas na literatura sobre cepas de

bactérias Gram-positivas como Staphylococcus aureus e bactérias Gram-negativas

(Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae,

Vibrio parahaemolyticus e Samonella typhymurium) com CIM de 75 μg/mL a 600

μg/mL, sobre cepas de leveduras (quatro espécies de Candida: C. albicans, C.


19

tropicalis, C. glabrata, e C. krusei) com CIM de 100 μg/mL a 450 μg/mL, sobre cepas

de bolores filamentosos (quatro espécies de Aspergillus spp. e um de Fusarium sp.)

com CIM de 75 μg/mL a 600 μg/mL e dermatófitos (Microsporum gypseum,

Trichophyton rubrum e T. mentagraphytes) com CIM de 18,8 μg/mL a 37,5 μg/mL.

(OOI, 2006). A própolis, produto produzido pelas abelhas a partir de exsudatos e

secreções das plantas, é outra fonte rica em ácidos e ésteres cinâmicos, como o ácido

cafeico, o ácido ferúlico e ácidos e ésteres benzoicos como o ácido benzoico, o ácido 4-

hidroxibenzoico, o ácido vanílico com propriedades anti-inflamatórias,

imunoestimuladoras e antimicrobianas (VELIKOVA et al., 2000). Já foi comprovada na

literatura que o cinamato de metila tem ótima atividade antifúngica contra cepas

aflatoxigênicos de Aspergillus flavus (LHP-10) (PRAKASH et al. 2012). Todos esses

ácidos e seus derivados ésteres tiveram atividade antimicrobiana comprovada contra

bactérias e fungos patogênicos.

As amidas fenilpropânicas são produzidas por algumas plantas e tem a função

de combater seus inimigos naturais como é o caso da batata (Solanum tuberosum) ao se

defender do fungo Phytophthora infestans que causa uma doença destrutiva na

plantação (SCHMIDT, SCHEEL & STRACK, 1998). Mais do que isso, descobriu-se

que amidas cinâmicas das frutas de Tribulus terrestres possuem atividade inibitória a

uma protease semelhante a papaína, podendo tratar síndrome aguda grave respiratório

provocada pelo coronavírus, um vírus de RNA que provoca uma doença respiratória

altamente contagiosa (SONG et al. 2014). As propriedades antimicrobianas de alguns

derivados cinâmicos estão descritos no Quadro 01 (pag 21).

Entre as amidas cinâmicas, a literatura relata que a amida cinâmica mais

simples, a cinamida, inibe os fungos A. niger e C. albicans na concentração de 60.8 µM,

enquanto a mesma é menos ativa nas bactérias, com valores de CIM de 252 μM para B.

subtilis, E. coli e S. aureus. Uma atividade inibitória maior contra fungos do que contra

bactérias parece ser regra para maioria das amidas cinamoílas, com exceção da cinamoil

dopamina (GUZMAN, 2014b). As amidas cinâmicas que tiveram atividade

antimicrobiana comprovada são aquelas com núcleo cinâmico, cafeico, ferúlico,

sinápico, p-cumárico e 3,4,5-trimetoxicinâmico. Além disso, amidas cinâmicas

hidroxicinâmicas tem ação antimicrobiana maior do que seus respectivos ácidos

(GEORGIEV et al. 2012).

Existem poucas publicações sobre as amidas derivadas do núcleo benzoico,

porém são relatados galamidas com ação anti-inflamatória em células da mucosa


20

gástrica, (PAL et al. 2012). Outro estudo revelou que alquisirigamidas ativam a indução

do gene da Agrobacterium tumefaciens, um microrganismo usado para transgenia em

plantas (DYÉ et al. 1997). A ação antimicrobiana é evidenciada em derivados

protocatequetico, gentísico vanílico e p-hidroxibenzoico (MERKL et al., 2010).

Além disso, algumas amidas apresentam valores de CIM acima da média como

é o caso da N,N-dietilcinamamida e da N,N-dimetilcinamamida e N-butilcinamamida

(NARASIMHAN et al. 2004). O modo de ação relativo atividade antibacteriana

envolve uma interação inespecífica (estritamente relacionada com o carácter

hidrofóbico das moléculas) com os grupos tiol proteínas do microrganismo. Como

demonstrado no trabalho de Narasimhan e colaboradores (2004), o núcleo cinâmico é

necessário para a atividade antimicrobiana a ser estudada.


21

Classse Química Composto Gênero de cepa microbiana Referências

Ácidos

Ácido cinâmico

Aeromonas, Aspergillus,

Escherichia, Candida,

Edwardiella, Enterococcus

faecalis, Escherichia coli,

Listeria monocytogenes,

Morganella, Mycobacterium,

Neisseria gonorrhoeae,

Pasteurella, roteus,

Pseudomonas, Salmonella,

Salmonella, Staphylococcus,

Streptococcus, Vibrio

parahaemolyticus

CHANG et al. 2001

BISOGNO et al. 2007

GEORGIEV et al. 2012

WEN et al. 2003

OLASUPO et al. 2003

RASTOGI et al. 2008

ALVES et al. 2013

PRASAD et al. 2014

SCHMIDT et al. 2010

Ácido o-cumárico

Aspergillus e Mycobacterium GUZMAN et al. 2014b

BISOGNO et al. 2007

Aldeídos

Cinamaldeído

Aspergillus, Bacillus,

Burkholderia, Candida,

Clostridium, Enterobacter e

Enterococcus

CHANG et al. 2001

SHAHVERDI et al. 2007

HSU, CHANG, CHANG, 2007

COX et al. 2007

PEI et al. 2009

DOMADIA et al. 2007

KIM, PARK & PARK, 2004

SHARMA et al. 2013

Ésteres

Ácido 5-o-cafeoilquinico

Agrobacterium, Aspergillus,

Bacillus, Candida,

Cladosporium,

Enterococcus, Escherichia,

Micrococcus, Mucor,

Penicillium, Pseudomonas,

Saccharomyces, Salmonella,

Shigella, Staphylococcus,

Streptococcus, Vibrio

ZHU et al. 2004

DAGLIA et al. 2007

XIA et al. 2011

FIAMEGOS et al. 2011

LOU et al. 2011

Amidas

Dopamina cinamoil

Bacillus, Candida, Listeria,

Staphylococcus e

Streptococcus

GEORGIEV et al. 2012

Morfina p-cumaroil

Aspergillus, Bacillus,

Candida, Escherichia e

Staphylococcus

KHATKAR et al.

2014

Quadro 01. Derivados cinâmicos que se destacam por sua atividade antimicrobiana.


22

2.4.3. A importância de amidas halogenadas no estudo antimicrobiano

A incorporação de átomos halogenados em composto líder resulta em análogos

que são mais lipofílicos e são menos solúveis em água. Consequentemente, átomos de

halogênio aumentam a capacidade do fármaco em atravessar a membrana lipídica.

Todavia, existe uma tendência indesejada das drogas halogenadas se acumularem no

tecido adiposo.

No estudo desenvolvido com amidas cafeicas de FU e colaboradores (2010),

verificou-se que disposição de halogênios, mais precisamente o flúor, o cloro e o bromo

no anel aromático dessas moléculas aumenta a atividade inibitória microbiana, sendo a

amida clorada aquela com maior espectro de ação ilustrado na Figura 13 (pag 23). No

modelo de trabalho a ser desenvolvido para preparação de amidas neste projeto, foi

levado em consideração, além do anel aromático para-halogenado, um outro anel

aromático, não apenas com estrutura cafeica, mas com substituintes como grupamento

nitro, metilas, metoxilas, hidroxilas, grupos volumosos estéricos (grupos terc-butilas)

como também a mudança da disposição dos grupos inseridos no anel. Diante da

problemática abordada para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos e do

conceito de química medicinal, esse trabalho propõe um estudo da atividade

antimicrobiana de amidas halogenadas de derivados cinâmicos e benzoicos como

também uma investigação in silico.


23

Figura 13. Amidas do ácido cafeico com atividade antimicrobiana no estudo de FU e

colaboradores (a), modelo de estruturura química para preparação das amidas cinâmicas

de benzoicas halogenadas (b).

2.5. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE BACTÉRIAS E FUNGOS

PATOGÊNICOS

2.5.1 Staphylococcus aureus

O Staphylococcus aureus constitui um importante agente patogênico que causa

uma variedade de doenças, incluindo abcessos profundos, endocardite (DAS et al.,

2016). Staphylococcus aureus são bactérias Gram positivas e as maiores causadoras de

infecções adquiridas principalmente ambientes hospitalares. A resistência aos agentes

0,0010,0020,0030,0040,0050,0060,0070,0080,00

A B C

Con

cen

traçã

o i

nib

itóri

a

mín

ima (

CIM

) em

µ

g/m

L

Amidas halogenadas

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE AMIDAS

CAFEICAS HALOGENADAS

Bacillus subtilis

Pseudomonas fluorescens

Staphylococcus aureus

Candida albicans


24

antimicrobianos é prevalente nesta espécie (PALOMBO & SEMPLE, 2002). Estes

microorganismos são patógenos humanos e de outros mamíferos, e integram a

microbiota da pele (comensais), embora como patógenos oportunistas possam causar

infecções. O S. aureus é um patógeno que pode ser encontrado na flora epitelial de 30 a

70% da população, colonizando a pele úmida em diferentes regiões (narinas, axilas,

períneo e intestino) de pessoas saudáveis onde podem permanecer colonizando por

longos períodos sem causar nenhuma patologia infecciosa, porém, em determinadas

circunstâncias e conjuntamente a seus fatores de virulência exibem sua patogenicidade,

podendo invadir o organismo do indivíduo provocando infecções freqüentemente

agudas e piogênicas (LINDSAY & HOLDEN, 2004).

Apesar de muito esforço, alguns determinantes da virulência de S. aureus ainda

permanecem incompreendidos. Sabe-se que o S. aureus pode secretar uma vasta gama

de proteínas, incluindo as adesinas como proteína estafilocócica A (SpA) (POWERS &

WARDENBURG, 2014) e proteínas ligadas a fibronectina A e B (FnbpA e FnbpB)

(THAMMAVONGSA et al. 2015), nucleases (BERENDS et al., 2010,

THAMMAVONGSA, MISSIAKAS & SCHNEEWIND, 2013), proteínas do

complemento de controle (LAMBRIS, RICKLIN e GEISBRECHT, 2008; SERRUTO

2010 ), e várias toxinas, que interferem com a função imune do hospedeiro. Assim,

entre as infecções da pele provocadas por este, destaque-se pela freqüência: o furúnculo,

a celulite, o impetigo, bem como infecções cirúrgicas, pós-operatórias (CORBELLA et

al., 1997).

2.5.3. Escherichia coli

E. coli, é um bacilo Gram negativo pertence à família Enterobacteriaceae,

anaeróbico facultativo, membro normal da microbiota do cólon humano e de animais de

sangue quente. Essa bactéria tem distribuição mundial, sendo, também, encontrada em

solos, em superfícies de plantas, em legumes, verduras e frutas, em água doce ou

salgada em fezes de animais e humanas (TRABULSI & ALTERTHUM, 2008).

A maioria das linhagens de E. coli permanece no cólon como comensal

inofensivo (RAJILICESTOJANOVIC et al., 2007), mas existem linhagens patogênicas

que são responsáveis pela ocorrência de diarréia em crianças e adultos (SABRÁ, 2002).

Porém existem formas mais virulentas: Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC) e

E. coli enteropatogênica (EPEC). Essas subespécies são tipos diarreiogênicas de E. coli,

possuindo similaridades nos seus mecanismos de virulência. EHEC pode causar uma


25

doença mais grave, incluindo síndrome de ligeira à grave diarreia hemolítica-urémica-

sanguinolenta (HUS), resultando em insuficiência renal e morte, com a maioria dos

casos que ocorrem no mundo desenvolvido (KAPER, NATARO & MOBLEY, 2004).

Enquanto isso, EPEC é uma das principais causas de mortalidade associada à diarréia

em crianças pequenas nos países em desenvolvimento (TENAILLON, 2010).

As linhagens de E. coli patogênicas possuem numerosos fatores de virulência

localizados em cromossomos, bacteriófagos e plasmídios. A patogenicidade está

relacionada à combinação de um ou de vários fatores de virulência, que diferenciam

linhagens patogênicas das não patogênicas (PENNINGTON, 2010).

2.5.4. Considerações o genêro Candida e sua patogenicidade

Sabe-se que o gênero Candida está repleto de causadores de doenças fúngicas

superficiais e invasivas nos seres humanos. O gênero Candida abriga mais de 200

espécies de patógenos humanos, dentre as mais importantes estão: Candida

albicans(Figura 14), Candida tropicalis e Candida krusei. Alterações nos mecanismos

de defesa do hospedeiro, procedimentos médicos invasivos e comprometimento de

barreiras anatômicas por queimaduras, por exemplo, são fatores que favorecem a

proliferação do microrganismo e o consequente desenvolvimento da infecção

(BARBEDO & SGARBI, 2010).

Figura 14. Levedura (a), tubos germinadores hifais (b), hifa (c) e pseudohifa (d) hifas

(e) e morfologias da Candida albicans. (adaptado de KABIR, HUSSAIN & AHMAD,

2012)

Um dos atributos significativamente importantes de C. albicans é a formação

de biofilmes em superfícies sólidas, tais como esmalte dentário e válvulas cardíacas

humanas numa forma tridimensional. Esses biofilmes podem se desenvolver em

dispositivos médicos implantados, provocando graves quadros de infecções (KABIR;

HUSSAIN & AHMAD, 2012).


26

A candidíase corresponde às infecções causadas por leveduras do gênero

Candida. Envolvem um amplo espectro de micoses superficiais e invasivas

oportunistas, acometendo os pacientes expostos a uma grande diversidade de fatores de

risco (GIRI & KINDO, 2012). As infecções causadas por Candida na pele e mucosas

podem ser documentadas em pacientes saudáveis, mas apresentam poucas alterações no

local da infecção; já as infecções sistêmicas por Candida podem comprometer o

funcionamento normal do organismo e geralmente ocorrem em pacientes críticos

acometidos por doenças degenerativas e/ou neoplasias (ENDO, 2007). Outra condição

importante é o uso de antibióticos de amplo espectro por um longo período, o qual pode

provocar alterações na microbiota autóctone do paciente, suprimindo a colonização por

bactérias e propiciando a proliferação de leveduras (COLOMBO & GUIMARAES,

2003).

Existem outras espécies de Candida que são mais resistentes aos antifúngicos

descritos no Quadro 02 (pag 29). A espécie C. krusei é conhecida como um patógeno

resistente a uma ampla quantidade de antifúngicos, principalmente a sua resistência

intrínseca ao fluconazol como também tem sido um problema para pacientes em geral,

principalmente imunocomprometidos (HIV-positivos, com leucemia, hanseníase, dentre

outros). Com relação C. tropicalis, os estudos comprovaram que ela e a segunda ou

terceira causa de candidemias em adultos, especialmente em pacientes com câncer,

diabetes mellitus, complicações hematológicas, dentre outras (BARBEDO & SGARBI,

2010).

Em um estudo sobre a candidemia (apresentação clínica das infecções por

Candida spp) realizado por DOI e colaboradores (2016) da UNIFESP em 16 hospitais

da região, no perído de junho de 2007 a março de 2010, permitiu observar que há uma

maior prevalência da doença em pacientes do gênero masculino que têm, em média, 56

anos. A espécie Candida ssp é o sétimo agente infeccioso mais prevalente nas infecções

hospitalares, como mostrado no Gráfico 01 (pag 26). De acordo com esse estudo, a taxa

de mortalidade é bem maior do que observado nos países de hemisfério norte,

necessitando haver um diagnostico mais rápido, um controle da fonte de incidência e

uma terapia antifúngica eficaz contra a candidemia.


27

Gráfico 01. Prevalência de espécies de Candida em infecções hospitalares no Brasil

2.5.5. Drogas usadas na terapia antifúngica

Entre essas classes de agentes antifúgicos, pode-se citar os azóis, os polienos,

as alilaminas, as equinocandinas os análogos de pirimidina (inibidor da timidilato

sintase) e inibidores da mitose (quimioterápicos contra o câncer) (LEWIS, 2011). O

desenvolvimento da indústria de quimioterápicos permite hoje escolher um arsenal de

drogas que combatem fungos patogênicos, principalmente os do gênero Candida. O

fluconazol é hoje considerado a droga de primeira linha para o tratamento dessas

infecções, porque possui excelente biodisponibilidade por via oral; farmacocinética

linear previsíveis com ampla distribuição em muitos tecidos, incluindo o fluido espinhal

cerebral e câmara vítrea do olho; e um risco muito menor de interações medicamentosas

e de toxicidade em pacientes criticamente doentes em comparação com primeiros azóis

(MARTIN, 1999). Sendo coleção de agentes antifúngicos uma quantidade pequena, é

necessário estudo para a descoberta de novas drogas no mercado que seja capaz de

impedir a resistência mutagênica de fungos que podem causar um grande prejuízo no

futuro da humanidade.

Apesar das diferenças na composição da membrana celular e da presença da

parede celular, os fungos são metabolicamente semelhantes às células de mamíferos e

oferecem poucos alvos específicos de agentes patogênicos. Os agentes antifúngicos

sistêmicos podem ser geralmente agrupados com base no seu local de ação no fungo

patogénico (LEWIS, 2011). No quadro 02 (pag 28 e 29) se observa como agem os

agentes antifúngicos de forma suncinta e seu espectro de ação Figura 15 (pag 30).

0

10

20

30

40

Po

rcen

tag

em d

e

inci

dên

cia

(%

)

Espécies do gênero Candida encontrada em hospitais

C. albicans

Candida parapsilosis

Candida tropicalis

C. glabrata

Candida krusei

Candida pelliculosa

Candida lusitaniae

Candida famata

Candida guilliermondii


28

Mecanismo Classe da droga Droga Mecanismo de ação Fonte

Ação sobre a

membrana celular

(atuação sobre o

ergosterol)

Azóis (inibidores da 14-α-

demetilase)

Fluconazol

Inibe 14α-desmetilase (lanosterol-

desmetilase), esgotando o ergosterol

da membrana celular, prejudicando

a fluidez da membrana, e levar a

uma acumulação de esteróis

metilado 14α-tóxicos, o que resulta

na morte da célula fúngica

HEERES, MEERPOEL, &

LEWI, 2010

Polienos

Anfotericina B (OH nos carbonos 7-10 são os mais

importantes)

Mata a levedura principalmente por

se ligar ao ergosterol, podendo

formar poros que desenvolve a saída

de íons da célula

TEVYASHOVA et al. 2013

Alilaminas

Terbinafina

Inibe da enzima esqualeno-

epoxidase em células fúngicas

GOKHALE & KULKARNI,

2000

Quadro 02. Sítios de ação e mecanismos de antifúngicos sistêmicos.


29

Continuação do Quadro 02

Mecanismo Classe da droga Droga Mecanismo de ação Fonte

Parede celular Equinocandinas

Anidulafungina

Inibe a síntese do polímero à base

de (1,3)-β-glucano, importante

componente da parede ceular

fúngica

DENNING, 2003

Intracelular

Análogos de pirimidina /

inibidor da timidilato sintase

Flucitosina

Após a metabolização na célula

fúngica, o 5-fluorouracil inibe a

timidalato sintase, causando erro da

codificação do RNA.

VERMES, GUCHELAAR &

DANKERT, 2000

Inibidor da mitose

Griseofulvina

Inibe aglomeração centrosomal,

interagindo com a tubulina RONNEST et al. 2009


30

Figura 15. Espectro de Ação de antifúngicos sistêmicos. Os blocos fechados

representam as espécies nas quais o agente antifúngico demonstrou eficácia clínica e

microbiológica. Blocos com linhas pontilhadas indicam gêneros e espécies fúngicas em

que a resistência é comum. (adaptado de LEWIS, 2011)

Candida albicans

Candida tropicalis

Candida krusei

Candida glabrata

Candida parapsilosis

Cryptococcus neoformans

Aspergillus fumigatus

Aspergillus terreus

Mucorales

Fusarium species

Histoplasma capsulatum

Blastomyces dermatitidis

Coccidioides immitis

Polienos Azóis Equinocandinas Outros L

EV

ED

UR

AS

B

OL

OR

D

IFÓ

RM

ICO

MONTES, R. C./ OBJETIVOS

31

OBJETIVOS


32

3. OBJETIVO GERAL

Preparar uma coleção de amidas fenilpropanoicas e benzoicas estruturalmente

relacionadas e avaliar a atividade antimicrobiana.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Preparar amidas potencialmente bioativas derivadas de ácidos cinâmicos e ácido

benzoico;

Avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica in vitro das moléculas sintetizadas;

Estabelecer a relação estrutura-atividade das substâncias avaliadas;

Realizar uma abordagem de relação estrutura-atividade quantitativa assistida por

softwares computacionais dos dados experimentais


33

RESULTADOS E

DISCUSSÃO

MONTES, R. C./ RESULTADOS

34

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. DELINEAMENTO DOS ESTUDOS DESENVOLVIDOS

Esse projeto de doutorado foi estruturado para a preparação de uma coleção de

amidas halogenadas. Essas amidas foram submetidas à testes antimicrobianos e uma

delas, a que apresentou menor CIM, foi selecionada como material de partida para a

preparação de análogos com a finalidade de obter um derivado com melhor atividade

antimicrobiana, bem como verificar a influência de grupos substituintes na estrutura

química da amida selecionada na atividade biológica, conforme apresentado no

esquema 01.

Esquema 01. Delineamento do estudo antimicrobiano e relação estrutura-atividade

quantitativo das 4-halobenzilamidas

Preparação de 4-halobezilamidas

Amidas 4-clorocinâmicas

Amidas 4-halobenzoicas

Avaliação antimicrobiana

Atividade antifúngica

Preparação de

derivados ésteres e éteres da amida vanílica

Atividade antifúngica

Estudo QSAR

Atividade antibactériana

Estudo QSAR

Atividade antibactériana

Método de microdiluição

Aminólise

com BOP


35

4.2. ETAPA QUÍMICA

4.2.1. Etapa de obtenção e preparação das amidas cinâmicas e benzoicas

halogenadas

As amidas foram obtidas a partir da reação dos ácidos cinâmicos e benzoicos e

aminas halogenadas (Figura 19, pag 63), conforme mostrado no Esquema 02,

utilizando dimetilformamida (DMF), trietilamina (Et3N), e agente de acoplamento

(BOP), monitorado por cromatografia em camada delgada analítica, utilizando um

sistema AcOEt:Hex, segundo a metodologia de FU e colaboradores (2010). Nessa

reação de aminólise demonstrado na Figura 16 (pag 36), a Et3N tem o papel de ionizar

o ácido para que ocorra o ataque da amina que é um reagente nucleófilo forte. O banho

de gelo utilizado nos primeiros 30 minutos da reação é necessário para impedir o ataque

de outros nucleófilos, já que a amina, mesmo em baixas temperaturas, ainda permaneça

como um bom nucleófilo (KIM & PATEL, 1994).

De acordo com Tabela 01 e 02 (pag 38 e 39), pode-se observar que as reações

duraram entre 2-7 horas, tendo-se obtido rendimentos entre 21-92%, sendo a amida

NR4 com maior rendimento e um dos menores tempo de reação (2 horas) e a amida

NR14 a de menor rendimento. A preparação de NR14 forma artefatos em longas horas

de reação.

Esquema 02. Reações de acoplamento utilizando ácidos derivados do ácido cinâmico e

do ácido benzoico e 4-clorobenzilamina como materiais de partida. R1, R2 e R3 = H, Cl,

OH, CH3, OCH3, NO2, tert-Bu ou C6H5 e R4=F, Cl e Br conforme estruturas químicas da

figura 19.

Foram preparadas vinte 22 (vinte e duas) amidas cloradas derivadas do ácido

cinâmico e do ácido benzoico as quais foram identificados por métodos

espectroscópicos de infravermelho, RMN de 1H,

13C e espectrometria de massas.

Contudo, ocorreram dificuldades sintéticas decorrentes da metodologia, levando ao


36

desenvolvimento empírico de variações na reação. As seguintes variações

metodológicas foram observadas:

As reações variaram entre 2 a 7 horas, as quais eram monitoradas por CCDA, pois

segundo alguns autores as reações chegam no máximo 5 horas.

É necessário interromper a reação assim que foi verificado a ausência de material

de partida, pois corre o risco formar produtos indesejados;

Na extração do produto obtido, às vezes, ocorria a formação de emulsões ou

precipitados, os quais interferiam no rendimento da amida.

Quase todas as amidas tinham um aspecto cristalino e possuíam um cheiro doce

característico.

Figura 16. Proposta de mecanismo de reação das amidas derivados do ácido cinâmico e

benzóico (adaptado de MONTALBETTI e FALQUE, 2005).

Após o processo cromatográfico, algumas amidas possuíam resquícios de

impurezas que eram retirados após uma lavagem à quente com um sistema de solução

Hex: CHCl3 ou/até CHCl3. As amidas halogenadas tiveram suas estruturas comprovadas


37

através de espectros de Infravermelho, RMN de 1H e

13C e espectrometria de massas de

alta resolução.


38

Tabela 01. Dados das reações das amidas derivadas do ácido cinâmico.

Composto R1 R2 R3 R4 Fórmula molecular

Massa

molar

(g/mol)

P.F. (oC)

Tempo de

reação (h)

Quantidade em

massa (mg)

Sistema da coluna

(Hex:ACOet)

Rendimento

(%)

NR1 - - - - C16H14ClNO 271,74 152-155 3 274 80:20 75

NR2 - OH OH - C16H14ClNO3 317,77 103 -105 7 228 80:20 70

NR3 - OMe OH - C17H16ClNO3 303,07 129-131 4 273 70:30 81

NR4 - - OMe - C17H16ClNO2 301,09 148-150 2 311 60:40 91

NR5 OH - - - C16H14ClNO2 287,74 171 5 277 50:50 79

NR6 - OH - - C16H14ClNO2 287,74 142 4 268 70:30 76

NR7 - - OH - C16H14ClNO2 287,74 160 3 221 60:40 63

NR8 - - Cl - C16H13Cl2NO 182,6 161 2 240 20:80 71

NR9 - OCH3 OH OCH3 C18H18ClNO4 361,82 185 6 193 60:40 60

NR10 NO2 - - - C16H13ClN2O3 316,06 167 2 260 60:40 79

NR11 - OMe OMe OMe C19H20ClNO4 361,11 150 3 260 60:40 86


39

Tabela 02. Dados da reação das amidas derivadas do ácido benzoico.

Composto R1 R2 R3 R4 X Fórmula

molecular

Massa molar

(g/mol) P.F. (

oC)

Tempo de

reação (h)

Quantidade em

massa mg

Sistema da

coluna

(Hex:ACOet)

Rendimento

(%)

NR12 - - - - Cl C14H12ClNO 245,06 136-139 3 260 80:20 65

NR13 - - C6H5 Cl C20H16ClNO 321.09 222-228 6 198 60:40 56

NR14 - OH OH OH Cl C14H12ClNO4 293,05 96-100 3 73 30:70 21

NR15 - OMe OH - Cl C15H14ClNO3 291,73 75-77 6 151 70:30 44

NR16 - OMe OH OMe Cl C16H16ClNO4 321,76 110-115 3 164 60:40 50

NR17 - - OH - Cl C14H12ClNO2 261,70 189-192 3 246 70:30 73

NR18 - C(CH3)3 OH C(CH3)3 Cl C22H28ClNO2 373,18 184-186 3 203 80:20 54

NR19 OH - - OMe Cl C15H14ClNO3 291.73 137-140 6 180 80:20 60

NR20 - Me - NO2 Cl C15H13ClN2O3 304.73 148-151 4 143 90:10 41

NR21 - OMe OH - F C15H14FNO3 275.27 161-165 2 90 80:20 27

NR22 - OMe OH - Br C15H14BrNO3 336.18 119-122 2 252 80:20 63


40

4.2.2 Etapa de obtenção e preparação dos éteres e dos ésteres da amida clorada

vanílica

Visto que a amida do ácido vanílico (NR15) obteve a melhor atividade

antifúngica cuja discussão se encontra na seção 4.4.1., foram preparados éteres e ésteres

pela substituição da hidroxila da posição para do anel vanílico da amida NR15. Para

esta etapa foram preparados 5 éteres da amida do vanílico (AK1, AK2, AK3, AK4 e

AK6), utilizando metodologias com haletos orgânicos como também foram preparados

5 ésteres da amida vanílica (NR15.), utilizando uma metodologia com cloretos de acila

(AR1, AR2, AR3, AR4) e outra metodologia utilizando piridina e anidrido acético

(AC1), exemplificado no esquema a seguir.

Esquema 03. Preparação dos éteres AK1-AK6 e ésteres AR1-AR4 e AC1 derivadas da

amida vanílica (NR15).


41

As preparações tanto dos ésteres como dos éteres da amida vanílica se

mostraram reações bem específica, pois permitiu a troca do hidrogênio da hidroxila do

anel vanílico por um grupo alquila ou acila sem haver o ataque dos hidrogênios do NH2

do grupo amida. As preparações dos ésteres foram de rápida formação, uma vez que o

cloreto de acila tem uma alta reatividade e pode ser considerado um bom eletrófilo para

o oxigênio da hidroxila (SOLOMONS & FRYHLE, 2012). As preparações dos éteres

são reações lentas, mas bons rendimentos. Como houve baixos rendimentos para a

preparação da 4-hidroxi-fenóxido da amida do ácido vanílico (AK2) e 2-propanóxido da

amida do ácido vanílico (AK4) a partir da reação com brometo de alquila em acetona

com K2CO3, houve uma alteração na metodologia de obtenção, utilizando DMF e

K2CO3 e os brometos de alquila como reagente. Os brometos de 4-hidroxi-fenila e de 2-

propanila devem ter uma menor reatividade em relação aos demais, possivelmente por

uma maior estabilidade no meio reacional.

De acordo com Tabela 03 (pag 42), pode-se observar que as reações dos

ésteres duraram entre 1-5 horas para os compostos AR1-AR4, tendo-se obtido

rendimentos entre 43-86%. As reações dos éteres foram de 12 horas segundo a

metodologia de COOLEN e colaboradores (1995) para os compostos AK1, AK3, e

AK6 ou de 24 horas segundo a metodologia de XIANG e colaboradores (2013) para

AK2 e AK4.

A reação de acetilação para obtenção de AC1 foi realizada empregando

anidrido acético na presença de piridina anidra para acetilação do grupamento hidroxila

da amida vanílica NR15, conforme a metodologia de ANDRADE, BATISTA & DE

SOUSA (2011). Nessa reação, a piridina (base fraca) atua como catalisador, enquanto o

anidrido acético é agente acilante (doador do grupamento).

Os éteres e ésteres da amida vanílica clorada foram analisadas através de

espectros de Infravermelho, RMN de 1H e

13C e espectrometria de massas de alta

resolução e suas estruturas ilustradas na Figura 20 (pag 64).


42

Tabela 03. Dados da reação dos derivados éteres e ésteres da amida clorada do ácido vanílico.

Composto R Fórmula

molecular

Massa

molar

(g/mol)

P.F. (oC)

Tempo de

reação (h)

Quantidade em

massa (mg)

Sistema da

coluna

(Hex:ACOet)

Rendimento

(%)

AR1 C6H5- C22H18ClNO4 395,94 122-125 1 103,00 65:35 76

AR2 C6H5CH2- C23H20ClNO4 409,86 141-145 2 110,00 65:35 78

AR3 CH3(CH2)3- C20H22ClNO4 375,85 97-100 5 55,00 65:35 43

AR4 3-Br-C6H4- C22H17BrClNO4 474,73 143-145 1 140,00 65:35 86

AC1 CH3 C17H16ClNO4 333,77 117-119 24 159,00 65:35 98

AK1 4-Me-C6H4CH2- C24H24ClNO3 409,91 126-129 12 42,00 65:35 30

AK2 4-OH-C6H4CH2- C23H22ClNO4 411,88 100-101 24 106,00 65:35 75

AK3 CH3(CH2)2- C18H20ClNO3 333,81 124-126 12 62,00 65:35 54

AK4 (CH3) 2CH- C18H20ClNO3 333,81 142-147 24 62,00 65:35 54

AK6 CH3(CH2)8CH2- C20H24ClNO3 432,00 110-105 12 120,00 65:35 81


43

4.3. ANÁLISE ESPECTROSCÓPICA DAS AMIDAS CINÂMICAS E

BENZOICAS HALOGENADAS

4.3.1. Interpretação dos espectros de infravermelho dos compostos NR1 a NR22

A análise dos espectros de infravermelho das amidas foi feita seguindo dados

de literatura especializada como SILVERSTEIN & WEBSTER (2007) e PAVIA e

colaboradores (2010). Diante desse suporte, os sinais de NR1-NR22 revelaram a

presença de bandas características da estrutura como (Tabela 04, pag 44): uma banda de

estiramento de N-H geralmente na região de 3460 a 3070 cm-1

típico de amida

secundária. As bandas largas de estiramento O-H de algumas amidas sobrepõem as

bandas de N-H por absorver na mesma região entre 3550 a 3200 cm-1

, a exemplo dos

compostos NR5-NR6 e NR14. As bandas de estiramento de C=O são observadas em

faixa de 1680-1631 cm-1

, típicas de amidas, uma vez que os ácidos carboxílicos

absorvem em regiões mais altas (1730-1700 cm-1

). A diminuição da frequência de

absorção de C=O em amidas se dá porque o nitrogênio (menos eletronegativo do que o

oxigênio) acomoda uma carga positiva mais facilmente, caracterizando o C=O como

uma ligação simples. As bandas acima de 3000 referentes a estiramento sp2 quanto

bandas em 1600 e 1475 cm-1

sugerem a presença de anéis aromáticos e cadeia vinílica

nas amidas. A banda de estiramento de C-Cl se mostrou na faixa de 1012 a 1116 cm-1

.


44

Tabela 04. Dados das bandas de infravermelho das amidas cinâmicas e benzoicas

Composto ν (O-H) ν (N-H) ν (C-Hsp2

) ν (C=O) ν (C=C) ν (CAr-X) ν (CAr-NO)

NR1 - 3253 3080 1654 1616 e 1489 1040 -

NR2 3460 e 3406 3230 3018 1651 1602 e 1490 1089 -

NR3 3414 3275 3010 1645 1612 e 1460 1039 -

NR4 - 3282 3041 1647 1602 e 1462 1029 -

NR5 3369 3369a 3072 1649 1589 e 1458 1093 -

NR6 3460 3460a 3075 1649 1591 e 1448 1089 -

NR7 3479 3369a 3072 1647 1589 e 1458 1093 -

NR8 - 3414 3041 1651 1614 e 1487 1089 -

NR9 3414 3358 3000 1658 1624 e 1458 1091 -

NR10 - 3290 3030 1651 1624 e 1458 1091 1525 e 1342

NR11 - 3290 3070 1651 1614 e 1415 1029 -

NR12 - 3300 3082 1637 1618 e 1490 1091 -

NR13 3414 3271 3078 1633 1606 e 1487 1089 -

NR14 3400 3400a 3000 1614 1589 e 1494 1043 -

NR15 3319 3251 3000 1639 1589 e 1487 1091 -

NR16 3493 3277 3084 1666 1597 e 1492 1016 -

NR17 3450 3122 3055 1631 1593 e 1440 1085 -

NR18 3450 3236 3066 1680 1544 e 1431 1012 -

NR19 3360 3360 3076 1651 1598 e 1435 1045 -

NR20 - 3278 3080 1637 1587 e 1423 1089 1521 e 1355

NR21 3304 3078 3040 1631 1593 e 1423 1116 -

NR22 3304 3070 3003 1631 1593 e 1423 1072 -

a banda

encoberta pelo sinal largo da hidroxila (estiramento O-H)

4.3.2 Interpretação dos espectros de RMN de 1H e

13C dos compostos NR1 a NR 22

As técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e

13C são ferramentas importantes

e suficientes para confirmar a formação das amidas após a reação do ácido cinâmico ou

do ácido benzoico com a amina proposta. Em todos os espectros de RMN de 1H, como

pode ser observado na Tabela 05, Tabela 06, Tabela 07, Tabela 08, Tabela 09 e

Tabela 10 (pag 47-52) pode-se observar dois sinais típicos: um dubleto atribuído aos

hidrogênios metilênicos (NH-CH2) na região alifática (4,59-4,36 ppm) e um tripleto

atribuído aos hidrogênios do NH da amida em região desblindada (8,50-8,70 ppm)

quando obtidos em DMSO-d6, sendo um singleto (6,03 ppm) largo quando são

solubilizados em CDCl3. Enquanto nos espectros de RMN de 13

C-APT das amidas

cinâmicas e benzoicas, como pode ser observado nas Tabelas 09 e 10 (pag 51 e 52), os

sinais característicos são C=O entre 169,0 e 164,0 ppm e NH-CH2 em região alquílica

entre de 41.7 e 43,5 ppm.


45

A estrutura do espectro de RMN de 1H da série das amidas derivadas do ácido

cinâmico (NR1-NR11) na Tabela 05 e 06 apresenta um modelo simples: um tripleto de

NH e o dubleto alifático do grupo metilênico (NH-CH2) descrito anteriormente, os

sinais dos prótons aromáticos que absorvem na região de 6,50-8,0 ppm. Além disso, são

observados os sinais do grupo olefínico dos prótons H-7 e H-8 apresentando-se na

maioria dos compostos como um dubleto em 7,21-8,05 ppm (J= 15,7 Hz, 1H) e outro

dubleto 6,44-6,73 pm (J= 15,7 Hz, 1H). O espectro de RMN de 13

C-APT da série das

amidas derivadas do ácido cinâmico na tabela 09 (pag 51) segue uma regra semelhante:

o sinal desblindado da carbonila de amida (O=C-NH) na faixao de 164,9-169,2 ppm,

enquanto o sinal do NH-CH2 em região alifática (41,7-43,5 ppm), os sinais dos

carbonos aromáticos desblindados (105,1- 153,1 ppm), como também sinais dos

carbonos olefínicos do carbono C-7 (135,2-141,9 ppm) e C-8 (118,0-124,7ppm).

Além desses sinais, são observados no espectro RMN de 13

C-APT a influência

dos substituintes no deslocamento do carbono oléfínico C-7. Nota-se que os

substituintes do anel cinâmico causam maior deslocamento do sinal de C-7 para região

desblindada na seguinte ordem: anel cafeico (NR2) > anel cinâmico (NR1) > anel

sinápico (NR9) > anel ferúlico (NR3) > anel meta-cumárico (NR6) = anel para-

cumárico (NR7) = anel trimetoxicinâmico (NR11) > anel metoxicinâmico (NR4) > anel

orto-cumárico (NR5) > anel para-cloro-cinâmico (NR8) > anel ortonitrocinâmico

(NR10). Os espectros de RMN de 1H e de

13C dos outros produtos derivados do ácido

cinâmico apresentaram sinais semelhantes ao espectro anteriormente discutido, sendo

observada a mudança em alguns deslocamentos de acordo com a substituição no anel.

Ao se comparar com os dados da literatura, pode-se se corroborar a estrutura das outras

dez amidas cinâmicas sintetizadas (NR02-NR11). Com exceção da amida derivada do

ácido cinâmico (NR1), todas as outras nove amidas derivadas do ácido cinâmico são

descritas pela primeira vez na literatura. Os dados de RMN de 1H e de

13C podem ser

encontrados na seção 7.

Os espectros de RMN de 1H e de

13C da série das amidas benzoicas (NR12-

NR22) apresentam um perfil de sinais semelhante ao das amidas cinâmicas, com

ausência dos sinais da cadeia olefínica. Os espectros de RMN de 1H da série das amidas

derivadas do ácido benzoico na Tabela 07 e 08 apresentam um modelo simples: um

tripleto do NH desblindado (9,35-8,83 ppm J= 6,0-5,9 Hz) e o dubleto do grupo

metilênico (NH-CH2) em região alifática (4,37-4,54 ppm J= 6,0-5,9 Hz). Além disso,


46

são observados os sinais do protóns aromáticos, em sua maioria, na forma de

multipletos na faixa de 6,81-8,06 ppm. O espectro de RMN de 13

C-APT da série das

amidas derivadas do ácido benzoico (NR12-NR22) segue uma regra geral, como

observado na Tabela 10 também: o sinal da carbonila de amida (O=C-NH) em região

desblindada (170,5-164,8 ppm), o sinal do carbono metilênico NH-CH2 (4,9-41,7 ppm),

os sinais dos carbonos aromáticos desblindados (106,0- 161,2 ppm). Os espectros dos

análogos fluorado (NR21), clorado (NR12) e bromado (NR22) apresentaram uma

desblindagem dos seus deslocamentos na respectiva ordem. No espectro do N-(4-

fluorobenzil)-4-hidroxi-3-methoxibenzamida (NR21), observa-se o dubleto

correspondente ao acoplamento de 13

C-19

F, cuja constante de acoplamento a uma

ligação 1JCF = 242,0 Hz foi atribuída acoplamento (C-F) em δC 161,2 ppm (DE

OLIVEIRA, 2013).

Ao se comparar com os dados da literatura, pode-se se corroborar que a

estrutura da séria das amidas benzoicas (NR12-NR22) são inéditas na literatura, ou seja,

essa é a primeira vez que houve evidência de suas descrições em publicações científicas,

com exceção da amida do ácido benzoico cujo relato foi descrito por WU e

colaboradores (2014).


47

Tabela 05. Assinalamentos dos espectros de RMN de 1H das amidas derivado do ácido cinâmico (200 MHz)

Posição NR1

NR2

NR3

NR4

NR5

δH δH δH δH δH

1 - - - - -

2 7,53 (m, 2H) 7,13 (d, J= 1,7 Hz, 1H) 7,13 (s, 1H) 7,50 (t, J= 7,3 Hz, 2H) -

3 7,39 (m, 3H) - - 6,97 (d, J= 8,7 Hz, 2H) 7,49-7,15 (6H, m)

4 7,39 (m, 3H) - - - 6,91-6,76 (2H, m)

5 7,39 (m, 3H) 7,02 (dd, J= 8,2, 1,8 Hz, 1H) 6,78 (d, J= 8,1 Hz, 1H) 6,97 (d, J= 8,7 Hz, 2H) 6,91-6,76 (2H, m)

6 7, 53 (m, 2H) 6,88 (d, J= 8,1 Hz, 1H) 6,99 (dd, J= 8,1 e 1,5 Hz, 1H), 7,50 (t, J= 7,3 Hz, 2H) 7,49-7,15 (6H, m)

7 7,71(d, J=16Hz, 1H) 7,55 (d, J= 15,7 Hz, 1H) 7,47 – 7,21 (m, 5H) 7,44 – 7,18 (m, 5H) 7,78 (d, 1H, J=15,9)

8 6,45(d, J=16Hz, 1H) 6,52 (d, J= 15,7 Hz, 1H) 6,49 (d, J= 15,7 Hz, 1H) 6,54 (d, J= 15,7 Hz, 1H) 6,73 (d, 1H, J=15,9)

1’ - - - - -

2’ 7,31 (m, 4H) 7,24 (4H, m) 7,47 – 7,21 (m, 5H) 7,44 – 7,18 (m, 5H) 7,49-7,15 (6H, m)

3’ 7,31 (m, 4H) 7,24 (4H, m) 7,47 – 7,21 (m, 5H)) 7,44 – 7,18 (m, 5H) 7,49-7,15 (6H, m)

4’ - - - - -

5’ 7,31 (m, 4H) 724 (4H, m) 7,47 – 7,21 (m, 5H) 7,44 – 7,18 (m, 5H) 7,49-7,15 (6H, m)

6’ 7,31 (m, 4H) 7,24 (4H, m) 7,47 – 7,21 (m, 5H)) 7,44 – 7,18 (m, 5H) 7,49-7,15 (6H, m)

7’ 4,57 (d, J= 4,0Hz) 4,55 (2H, sl) 4,36 (d, J= 5,9 Hz, 2H) 4,38 (d, J= 6,0 Hz, 2H) 4,47 (d, 2H, 5,86)

NH 6,03(1H, sl) - 8,50 (t, J= 5,9 Hz, 1H) δ 8,59 (t, J= 6,0 Hz, 1H) 8,64 (t, 1H, J=5,83)

o-OH - - - - -

m-OH - - - - -

p-OH - - 9,44 (s, 1H) - 10,00 (sl, 1H)

OMe - - - - -

3-Me - - - - -

p-OMe - - 3,79 (s, 3H) 3,77 (s, 3H) -


48

Tabela 06. Continuação de assinalamentosdos espectros de RMN de 1H das amidas derivado do ácido cinâmico (200 MHz)

Posição

NR6

NR7

NR8

NR9

NR10

NR11

δH δH δH δH δH δH

1 - - - - - -

2 6,84 – 6,70 (m, 1H) 7,38 (m, 5H) 7,45 – 7,25 (m, 5H) 6,86 (2H, s) - 6,90 (s, 2H)

3 - 6,77 (2H, d, J=8,5) 7,45 – 7,25 (m, 5H) - 8,05 (d, J= 8,0 Hz, 1H) -

4 7,03 – 6,92 (m, 2H) - - - 7,72 – 7,57 (m, 2H) -

5 7,47 – 7,14 (m, 6H) 6,77 (2H, d, J=8,5) 7,45 – 7,25 (m, 5H) - 7,72 – 7,57 (m, 2H) -

6 7,03 – 6,92 (m, 2H) 7,38 (m, 5H) 7,45 – 7,25 (m, 5H) 6,86 (2H, s) 7,78-7,75 (m, 2H) 6,90 (s, 2H)

7 7,47 – 7,14 (m, 6H) 7,38 (m, 5H) 7,45 – 7,25 (m, 5H) 7,48-7,28 (5 H, m) 7,78-7,75 (m, 2H) 7,37 (m, 5H)

8 6,60 (d, J= 15,8 Hz, 1H) 6,44 (d, J=15,73 Hz, 1H) 6,69 (d, J= 15,8 Hz, 1H) 6,55 (1H, d, J= 15,8) 6,67 (d, J= 15,6 Hz, 1H) 6,64 (d, J= 15,7 Hz, 1H)

1’ - - - - - -

2’ 7,47 – 7,14 (m, 6H) 7,38 (m, 5H) 7,64 – 7,46 (m, 4H) 7,48-7,28 (5 H, m) 7,36 (m, 4H) 7,37 (m, 5H)

3’ 7,47 – 7,14 (m, 6H) 7,28 (m, 2H) 7,64 – 7,46 (m, 4H) 7,48-7,28 (5 H, m) 7,36 (m, 4H) 7,37 (m, 5H)

4’ - - - - - -

5’ 7,47 – 7,14 (m, 6H) 7,28 (m, 2H) 7,64 – 7,46 (m, 4H) 7,48-7,28 (5 H, m) 7,36 (m, 4H) 7,37 (m, 5H)

6’ 7,47 – 7,14 (m, 6H) 7,38 (m, 5H) 7,64 – 7,46 (m, 4H) 7,48-7,28 (5 H, m) 7,36 (m, 4H) 7,37 (m, 5H)

7’ 4,38 (d, J= 5,9 Hz, 2H) 4,39 (2H, d, J=6,4 Hz) 4,36 (d, J= 6,0 Hz, 2H) 4,37(2H, d, J=6 Hz) 4,39 (d, J= 5,9 Hz, 1H) 4,38 (d, J= 5,9 Hz, 1H)

NH 8,67 (t, J= 5,9 Hz, 1H) 8,53 (t, J=5,87 Hz, 1H) 8,70 (t, J= 6,0 Hz, 1H) 8,52 (1H, t, J= 6Hz) 8,82 (t, J= 4,7 Hz, 1H) 8,60 (t, J= 5,9 Hz, 1H)

o-OH - - - - -

m-OH 9,61 (s, 1H) - - - - 3,80 (s, 6H)

p-OH - 9,87 (sl, 1H) - - -

p-OMe - 3,68 (s, 3H)

m-OMe - - - 3,79 (6H, s) - 3,80 (s, 6H)


49

Tabela 07. Assinalamentos dos espectros de RMN de 1H das amidasderivado do ácido benzoico(200 MHz).

Posição

NR12

NR13

NR14

NR15

NR16

NR17

δH δH δH δH δH δH

1 - - - - - -

2 7,89 (dd, J= 8,0, 1,6 Hz, 2H) 7,99 (d, J= 8,3 Hz, 2H 6,88 (s, 2H) 7,56 – 7,22 (m, 8H) 7,25 – 7,15 (m, , 2H) 7,75 (d, J= 8,6 Hz, 2H)

3 7,64 – 7,09 (m, 7H) 7,84 – 7,65 (m, 4H) - - - 6,80 (d, J= 8,8 Hz, 3H)

4 7,64 – 7,09 (m, 7H) - - - - -

5 7,64 – 7,09 (m, 7H) 7,84 – 7,65 (m, 4H) - 7,56 – 7,22 (m, 8H) - 6,80 (d, J= 8,8 Hz, 3H)

6 7,89 (dd, J= 8,0, 1,6 Hz, 2H) 7,99 (d, J= 8,3 Hz, 2H 6,88 (s, 2H) 7,56 – 7,22 (m, 8H) 7,25 – 7,15 (m, 2H) 7,75 (d, J= 8,6 Hz, 2H)

1’ - - - - -

2’ 7,64 – 7,09 (m, 7H) 7,56 – 7,29 (m, 7H) 7,44 – 6,88 (m, 4H) 7,56 – 7,22 (m, 8H) 7,43 – 7,27 (m, 4H) 7,59 – 7,43 (m, 4H)

3’ 7,64 – 7,09 (m, 7H) 7,56 – 7,29 (m, 7H) 7,44 – 6,88 (m, 4H) 7,56 – 7,22 (m, 8H) 7,43 – 7,27 (m, 4H) 7,59 – 7,43 (m, 4H)

4’ - - - - -

5’ 7,64 – 7,09 (m, 7H) 7,56 – 7,29 (m, 7H) 7,44 – 6,88 (m, 4H) 7,56 – 7,22 (m, 8H) 7,43 – 7,27 (m, 4H) 7,59 – 7,43 (m, 4H)

6’ 7,64 – 7,09 (m, 7H) 7,56 – 7,29 (m, 7H) 7,44 – 6,88 (m, 4H) 7,56 – 7,22 (m, 8H) 7,43 – 7,27 (m, 4H) 7,59 – 7,43 (m, 4H)

7’ 4,46 (d, J= 6,0 Hz, 2H) 4,48 (d, J= 5,9 Hz, 2H) 4,49 (s, 2H) 4,52 (s, 2H) 4,54 (s, 2H) 4,42 (d, J= 6,0 Hz, 2H)

NH 9,10 (t, J= 5,9 Hz, 1H) 9,15 (t, J= 6,1 Hz, 1H) 8,15 (s, 1H) 8,12 (d, J= 9,2 Hz, 1H) 8,15 (s, 1H) 8,83 (t, J= 5,9 Hz, 1H)

1’’ - 7,84 – 7,65 (m, 4H) - - - -

2’’ - 7,56 – 7,29 (m, 7H) - - - -

3’’ - 7,56 – 7,29 (m, 7H) - - - -

4’’ - 7,56 – 7,29 (m, 7H) - - - -

5’’ - 7,84 – 7,65 (m, 4H) - - - -

o-OH - - - - - -

m-OH - - 4,62 (s, 2H) - - -

p-OH - - 4,38 (s, 1H) 3,88 (s, 3H) 7,43 (s, 1H) -

m-OMe - - - 3,88 (s, 17H) -


50

Tabela 08. Assinalamentos dos espectros de RMN de 1H das amidasderivado do ácido benzoico (200 MHz).

Posição

NR18

NR19

NR20

NR21

NR22

δH δH δH δH δH

1 - - - - -

2 7,70 – 7,54 (m, 2H) - 7,96 (s, 1H) 7,52 – 7,28 (m, 4H) 7,43 (d, J= 8,4 Hz, 3H)

3 - 7,04 (dd, J= 9,0 e 3,0 Hz, 1H) - - -

4 - 6,85 (d, J= 9,0 Hz, 1H) - - -

5 - 8,06 (dd, J= 8,4, 1H) 6,81 (d, J= 8,2 Hz, 1H) 6,88 (d, J= 8,2 Hz, 1H)

6 7,70 – 7,54 (m, 2H) 7,48 – 7,26 (m, 5H) 7,89 (dd, J= 8,4, 1,7 Hz, 1H) 7,52 – 7,28 (m, 4H) 7,29 – 7,12 (m, 3H)

1’ - - - - -

2’ 7,54 – 7,20 (m, 4H) 7,48 – 7,26 (m, 5H) 7,42-7,31 (m, 4H) 7,52 – 7,28 (m, 4H) 7,29 – 7,12 (m, 3H)

3’ 7,54 – 7,20 (m, 4H) 7,48 – 7,26 (m, 5H) 7,42-7,31 (m, 4H) 7,22 – 7,05 (m, 2H) 7,43 (d, J= 8,4 Hz, 3H)

4’ - - - - -

5’ 7,54 – 7,20 (m, 4H) 7,48 – 7,26 (m, 5H) 7,42-7,31 (m, 4H) 7,22 – 7,05 (m, 2H) 7,43 (d, J= 8,4 Hz, 3H)

6’ 7,54 – 7,20 (m, 4H) 7,48 – 7,26 (m, 5H) 7,42-7,31 (m, 4H) 7,52 – 7,28 (m, 4H) 7,29 – 7,12 (m, 3H)

7’ 4,42 (d, J= 5,9 Hz, 3H) 4,49 (d, J= 5,9 Hz, 2H) 4,47 (dd, J= 5,9, 1,7 Hz, 2H) 4,43 (d, J= 5,8 Hz, 2H) 4,54 (d, J= 5,8 Hz, 2H)

NH 8,89 (t, J= 6,0 Hz, 1H) 9,35 (t, J= 5,8 Hz, 1H) 9,31 (t, J= 5,8 Hz, 1H) 8,83 (t, J= 5,8 Hz, 1H) 6,65 (t, J= 5,2 Hz, 1H)

o-OH - - -

p-OH 6,09 – 5,94 (m, 1H) - - 6,21 (s, 1H)

3,5-((CH3)3 1,39 (s, 18H), - - -

m-OMe - 3,72 (s, 3H) - 3,80 (s, 3H) 3,88 (s, 3H),

Me - - 2,54 (m, 3H)


51

Tabela 09. Assinalamentos dos espectros de RMN de 13

C-APT das amidasm derivado do ácido cinâmico (50 MHz).

Posição NR1 NR2 NR3 NR4 NR5 NR6 NR7 NR8 NR9 NR10 NR11

δC δC δC δC δC δC δC δC δC δC δC

1 134,8 128,2 126,3 127,4 121,6 136,1 125,9 133,8 125,3 130,0 130,5

2 128,0 115,0 110,8 129,3* 156,4 116,8 129,4 129,3 105,3 148,4 105,1

3 129,0 146,7 148,4 114,5 116,2 157,7 115,8 129,0 148,1 126,6 153,1

4 128,0 148,8 147,8 160,4 135,0 113,8 159,0 134,0 138,7 130,4 138,7

5 129,0 116,4 115,7 114,5 121,3 130,0 115,8 129,0 148,1 133,9 153,1

6 129,0 122,2 121,7 129,3* 128,4 118,8 129,4 129,3 105,4 128,8 105,1

7 141,9 142,8 139,6 139,0 135,2 139,4 139,4 137,9 140,0 134,3 139,4

8 120,2 118,0 118,6 119,4 119,4 121,7 118,3 122,7 119,1 124,7 121,3

1’ 136,9 138,9 138,7 138,7 138,8 138,5 138,8 138,5 137,4 138,3 130,5

2’ 130,0 130,1 129,2 129,3* 129,3 129,3 129,3 129,3 129,2 129,4 129,2

3’ 129,4 129,6 128,3 128,3 128,3 128,3 128,3 128,4 128,4 128,4 128,4

4’ 133,5 128,2 131,3 131,4 130,6 131,4 131,4 131,5 131,4 131,6 131,4

5’ 129,4 129,6 128,3 128,3 128,3 128,3 128,3 128,4 128,4 128,4 128,4

6’ 130,0 130,1 129,2 129,3* 129,3 129,3 129,3 129,3 129,2 129,4 129,2

7’ 43,3 43,5 41,6 41,7 41,7 41,7 41,6 41,7 41,7 41,8 41,7

NH - - - - - - - - -

CO 166,0 169,2 165,5 165,5 165,8 165,1 165,6 164,9 165,6 164,3 165,2

OMe - - - 55,3 - - - - 56,0 60,2

3-Me - - - - - - - - - - -

m-OMe - - 55,6 - - - - - - - 55,9

* Sinal forte que dá a entender que são a presença de 4 carbonos magneticamente equivalentes.


52


C-APT das amidas derivado do ácido benzoico (50 MHz).

Posição NR12 NR13 NR14 NR15 NR16 NR17 NR18 NR19 NR20 NR21 NR22

δC δC δC δC δC δC δC δC δC δC δC

1 134,2 133,0 125,9 126,5 106,4 124,9 125,26 115,2 138,1 125,3 126,1

2 127,3 128,4 107,8 115,8 106,0 130,9 124,2 151,7 128,4 111,3 110,4

3 128,3 126,7 146,7 148,8 149,0 114,9 138,3 121,2 131,5 147,2 146,7

4 131,3 143,0 139,4 151,3 139,3 160,3 156,9 118,4 150,5 149,6 148,9

5 128,3 126,7 146,7 111,9 149,0 114,9 138,3 154,0 126,2 115,2 113,9

6 127,3 128,4 107,8 122,1 106,0 130,9 124,2 111,3 124,6 120,9 119,8

1’ 138,8 138,8 136,1 139,3 133,8 139,2 140,0 138,2 138,3 136,2 137,4

2’ 131,4 129,2 130,5 130,1 130,1 129,3 129,2 129,3 131,8 129,2 129,4

3’ 129,1 127,0 130,1 129,5 129,5 128,3 128,3 128,5 129,3 114,9 131,7

4’ 134,2 131,4 134,2 133,8 125,3 133,4 131,2 131,6 132,9 161,2 119,8

5’ 129,1 127,0 130,1 129,5 129,5 128,3 128,3 128,5 129,3 114,9 131,7

6’ 131,4 129,2 130,5 130,1 130,1 129,3 129,2 129,3 131,8 129,2 129,4

7’ 42,1 42,1 43,6 43,8 43,9 41,7 42,0 41,9 42,3 42,0 43,4

CO 166,4 166,1 170,5 169,8 169,8 166,1 167,0 168,7 164,8 166,0 167,1

3,5-((C)CH3)3 - - - - - 30,3 - -

3’,5’-Cq - - - - - - 34,7 - - -

m-OMe - - - 56,4 56,8 - - 55,8 - 55,7 56,0

Me - - - - - - - - 19,5 - -

1’’ 139,2 - - - - - - - - - -

2’’ 126,7 - - - - - - - - - -

3’’ 128,1 - - - - - - - - - -

4’’ 126,7 - - - - - - - - - -

5’’ 128,1 - - - - - - - - - -

6’’ 126,7 - - - - - - - - - -

R= H, Cl, OH, CH3, OCH3, NO2, terc-butil ou C6H5 e X=Cl, F ou Br


53

4.3.3. Interpretação dos espectros de massas dos compostos NR1 a NR22

Os espectros de massas das amidas inéditas na literatura foram obtidos por

espectrômetro de massas tipo MALDI de alta resolução, o qual permitiu a obtenção das

massas com elevada exatidão das amidas halogenadas com precisão de 4 casas

decimais. Segundo BRENTON & GODFREY, 2010, foram considerados como massas

exatas, aqueles sinais cujos valores ficaram entre + 20% das massas calculadas teóricas,

os quais estão descritos na tabela a seguir.

Tabela 11. Dados do espectro de massas tipo MALDI das amidas NR1 a NR22

Composto Pico íon-

molecular

Massa

calculada

Massa do

espectro

Erro

percentual

(%)

NR2 [M+Na]+ 326,0560 326,0561 0,31

NR3 [M+H]+ 318,0887 318,0870 5,34

NR4 [M+H]+ 324,0767 324,0771 1,23

NR5 [M+H]+ 288,0781 288,0785 1,39

NR6 [M+Na]+ 310,0611 310,0619 2,58

NR7 [M+Na]+ 310,0611 310,0596 -4,84

NR8 [M+Na]+ 328,0272 328,0273 0,30

NR9 [M+Na]+ 370,0822 370,0813 -2,43

NR10 [M+H]+ 317,0683 317,0683 0,00

NR11 [M+H]+ 384,0979 384,0913 -17,18

NR13 [M+H]+ 322,0988 322,0969 -5,90

NR14 [M+Na]+ 316,0353 316,0373 6,33

NR15 [M+Na]+ 316,0530 316,0543 4,11

NR16 [M+Na]+ 346,0636 346,0666 8,67

NR17 [M+Na]+ 286,0425 286,0432 2,45

NR18 [M+H]+ 374,1877 374,1877 0,00

NR19 [M+H]+ 292,0730 292,0746 5,48

NR20 [M+Na]+ 327,0512 327,0516 1,22

NR21 [M+Na]+ 298,0855 298,0882 9,06

NR22 [M]+ 335,0157 335,0156 -0,30


54

4.3.4. Interpretação dos espectros de infravermelho dos compostos ésteres (AR1 a

AR4 e AC1) e dos compostos éteres (AK1-AK6)

A análise dos espectros de infravermelho dos ésteres das amidas do ácido

vanílico mostrou o desaparecimento da banda O-H (estiramento) e o aparecimento de

bandas correspondentes ao estiramento de N-H da amida na faixa de 3446-3250 cm-1

,

revelando que não houve comprometimento do grupo NH da amida. Foram observadas

também as bandas de estiramento de C=O distintas, sendo uma próxima a 1750 cm-1

e

outra em 1640 cm-1

. Essas duas bandas são atribuídas respectivamente à carbonila de

éster (O=C-O) e à carbonila de amida (O=C-N), confirmando o sucesso da esterificação

da hidroxila do anel vanílico. Além dessas bandas, foram observadas bandas de

estiramento C=C de anel aromático próximas a 1600 e 1475 cm-1

e bandas de

estiramento C-Cl na faixa de 1031-1089 cm-1

referentes ao de cloretos de arila,

revelando a presença dos anéis aromáticos e do átomo de cloro nos ésteres sintetizados.

Todos esses dados foram compilados na Tabela 11 (pag 48).

Na análise dos espectros de infravermelho dos éteres (AK1-AK6) das amidas

do ácido vanílico, observou-se bandas de estiramento de N-H da amida na faixa de

3350-3284 cm-1

, como também, a presença da carbonila típica de amida (O=C-N) na

faixa 1627-1645 cm-1

, revelando o não comprometimento do grupo NH da amida.

Foram observadas as bandas de estiramento C=C de anel aromático (1607 e 1475 cm-1

)

e bandas de estiramento C-Cl (1014-1089 cm-1

) referentes ao de cloretos de arila,

revelando a presença dos anéis aromáticos e do átomo de cloro nos ésteres sintetizados

como pode ser observado na Tabela 11 e Figura 16 (pag 48).


55

Tabela 12. Espectro de infravermelho de ésteres e éteres derivados da amida vanílica

clorada.

Composto ν (O-H) ν (N-H) ν (C-Hsp2

) ν (O=C-O) ν (O=C-N) ν (C=C) ν (CAr-X)

AR1 - 3334 3000 1734 1637 1607 e 1425 1089

AR2 - 3331 3050 1761 1633 1602 e 1456 1033

AR3 - 3253 3088 1761 1631 1602 e 1450 1031

AR4 - 3334 3050 1734 1637 1602 e 1490 1089

AC1 - 3446 3088 1770 1635 1602 e 1421 1089

AK1 - 3290 3001 - 1629 1600 e 1490 1029

AK2 3350 3350a 3000 - 1645 1600 e 1489 1014

AK3 - 3296 3000 - 1631 1581 e 1450 1014

AK4 - 3284 3078 - 1631 1598 e 1455 1031

AK6 - 3305 3000 - 1627 1602 e 1508 1035

Figura 17. Bandas de infravermelho observados nas amidas eterificadas e esterificadas.


56

4.3.5. Interpretação dos espectros de RMN de 1H e

13C dos compostos ésteres (AR1

a AR4 e AC1) e dos compostos éteres (AK1-AK6)

Os espectros de RMN de 1H, bem como o de

13C ilustrados na Tabela 13 (pag

57), Tabela 14 (pag 58), Tabela 15 (pag 59), Tabela 16 (pag 60) e Tabela 17 (pag 61)

mostram com clareza a formação dos ésteres e éteres derivados da amida clorada do

ácido vanílico através da alquilação e acilação. Além disso, foram observados sinais que

corroboram que a hidroxila do anel sofreu processo de esterificação ou de eterificação

com sucesso, sendo obtidos os produtos desejados.

Na análise dos espectros de RMN de 1H dos ésteres da amida do vanílico

(AR1, AR2, AR3, AR4, AC1) ( DMSO-d6 e CDCl3, 200 MHz), ilustrados na Tabela

13 e 14 (pag 57 e 58), foram observados os sinais característicos da amida do vanílico:

na região de sinais aromáticos, foram observados dois sinais em região blindada

(dubleto ou multipleto) na faixa de 7,80-7,20 atribuídos aos prótons H-2 e H-6 e um

dubleto levemente desblindado (J=8,2 Hz, 1H) na faixa de 7.20-6.88 ppm do próton H-

5, um tripleto em 9,17-9,12 ppm do NH (AR1 e AR2) ou um tripleto na faixa de 6,79-

6,81 ppm (AR3 e AR4), todos com constante de acoplamento semelhante (J=5,9 Hz-

5,5 Hz), evidenciando seu acoplamento com os prótons metilênicos (H-7’) 4,53-4,47

ppm com J entre 5,9-5,8 Hz. Os espectros de RMN de 13

C-APT obtidos (DMSO-d6 e

CDCl3, 50 MHz), ilustrados na Tabela 15 (pag 59), revelam a presença de sinas típicos

de todas as estruturas (AR1, AR2, AR3, AR4, AC1): dois sinais de carbonilas, sendo

um na faixa de 165,9-171,7 ppm do O=C-O do éster e outro sinal em 163,2-167,2 ppm

do O=C-N da amida. São observados também os carbonos aromáticos que absorvem na

faixa de 110,9-151,3 ppm e o sinal do carbono metilênico (C-7’) na faixa de 42,5- 43,5

ppm. Os sinais do anel vanílico quase não houve um grande deslocamento após a

esterificação como pode ser visto na tabela 15.


57

Tabela 13. Assinalamentos de RMN de 1H dos derivados da amida do ácido vanílico.

AR1 AR2 AR3 AR4 AC1

δH δH δH δH

1 - - - - -

2 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7,61 (d, J= 1.7 Hz, 1H) 7,44 (s, 1H) 7,51 (d, J= 1,8 Hz, 1H) 7,43 (d, J= 1,9 Hz, 1H)

3 - - - - -

4 - - - - -

5 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7,20 (d, J= 8,2 Hz, 1H) 6,96 (d, J= 8,2 Hz, 1H) 7,09 (d, J= 8,2 Hz, 1H) 6,88 – 6,69 (m, 1H)

6 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7,52 (dd, J= 8,2; 1,8 Hz, 1H) 7,31 – 7,15 (m, 5H) 7,44 – 7,15 (m, 6H) 7,03 – 6,86 (m, 1H)

1’ - - -

2’ 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7.43 – 7.26 (m, 9H) 7.31 – 7.15 (m, 5H) 7.44 – 7.15 (m, 6H) 7.33 – 7.12 (m, 4H)

3’ 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7.43 – 7.26 (m, 9H) 7.31 – 7.15 (m, 5H) 7.44 – 7.15 (m, 6H) 7.33 – 7.12 (m, 4H)

4’ - - - - -

5’ 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7.43 – 7.26 (m, 9H) 7.31 – 7.15 (m, 5H) 7.44 – 7.15 (m, 6H) 7.33 – 7.12 (m, 4H)

6’ 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7.43 – 7.26 (m, 9H) 7.31 – 7.15 (m, 5H) 7.44 – 7.15 (m, 6H) 7.33 – 7.12 (m, 4H)

7’ 4,50 (d, J= 5,8 Hz, 2H) 4.47 (d, J= 5.9 Hz, 2H) 4.49 (d, J= 5.8 Hz, 1H) 4.53 (d, J= 5.8 Hz, 2H) 4.47 (d, J= 5.8 Hz, 2H)

NH 9,20 (t, J= 5,9 Hz, 1H) 9.12 (t, J= 5.9 Hz, 1H) 6.79 (d, J= 5.5 Hz, 1H) 6.81 (t, J= 5.7 Hz, 1H) -

O=C-N - - - - -

O=C-O - - - - -

OMe 3,83 (d, J= 6,0 Hz, 3H) 3.80 (s, 3H) 3.78 (s, 3H) 3.80 (s, 3H) 3.77 (s, 3H)

CH2-C6H5 - 3.98 (s, 2H) - - -

1’’ - - 2,56 (t, J= 7.4 Hz, 2H) - -

2’’ 8,13 (d, J= 7,1 Hz, 2H) 7,43 – 7.26 (m, 9H) 1,71 (quint, J= 7.7 Hz, 2H) 8,30 (t, J= 1.7 Hz, 1H) -

3’’ 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7,43 – 7.26 (m, 9H) 1,42 (sex, J= 7.3 Hz, 2H) - -

4’’ 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7,43 – 7.26 (m, 9H) - 8,14 – 8,03 (m, 1H) -

5’’ 7,84 – 7,20 (m, 10H) 7,43 – 7.26 (m, 9H) - 7,44 – 7,15 (m, 6H) -

6’’ 8,13 (d, J= 7,1 Hz, 2H) 7,43 – 7.26 (m, 9H) - 7,81 – 7,71 (m, 1H) -

Me - - 0,94 (t, J= 7.2 Hz, 3H) - 2,27 (s, 3H)


58

Tabela 14. Assinalamentos de RMN de 1H dos derivados da amida do ácido vanilico

AK1 AK2 AK3 AK4 AK6

δH δH δH δH -

1 - - - -

2 7,44 (s, 1H) 7,44 (s, 1H) 7,40 (d, J= 1,8 Hz, 1H) 7,22 (m, 5H) 7,26 (s, 5H)

3 - - - - -

4 - - - - -

5 6,80 (d, J= 8,4 Hz, 1H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) 6,81 (d, J= 8,4 Hz, 1H) 6,79 (d, J= 8,4 Hz, 2H) 6,54 (s, 1H)

6 7,32 – 7,07 (m, 7H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) 7,31-7,22 (m, 5H) 7,40 (d, J= 1,8 Hz, 1H) 7,42 (s, 1H)

1’ - - - -

2’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) 7,31-7,22 (m, 5H) 7,22 (m, 5H) 7,26 (s, 5H)

3’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) 7,31-7,22 (m, 5H) 7,22 (m, 5H) 7,26 (s, 5H)

4’ - - - - -

5’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) 7,31-7,22 (m, 5H) 7,22 (m, 5H) 7,26 (s, 5H)

6’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) 7,31-7,22 (m, 5H) 7,22 (m, 5H) 7,26 (s, 5H)

7’ 4,56 (d, J= 5,8 Hz, 2H) 4,54 (d, J= 5,8 Hz, 2H) 4,55 (d, J= 5,8 Hz, 2H) 4,51 (d, J= 5,7 Hz, 2H) 4,56 (d, J= 5,8 Hz, 2H)

NH 6,49 (t, J= 5,2 Hz, 1H) 7,95 (s, 1H) 6,74 (sl, 1H) 6,79 (d, J= 8,4 Hz, 2H) -

O=C-N - - - - -

O=C-O - - - - 3,86 (s, 3H)

OMe 3,88 (s, 3H) 3,82 (s, 3H) 3,86 (s, 3H) 3,81 (s, 3H)

CH2-C6H5 3,11 (t, J= 7,6 Hz, 2H) 3,04 (t, J= 7,5 Hz, 2H) - -

CH2-O 4,18 (t, J= 7,6 Hz, 2H) 4,14 (t, J= 7,6 Hz, 2H) - -

1’’ - - 3,98 (t, J= 6,8 Hz, 2H) 4,01 (t, J= 6,8 Hz, 2H)

2’’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) 2,04 – 1,76 (m, 2H) 4,51 (sept, J= 6,2 Hz, 1H) 1,83 (dt, J= 14,1, 6,9 Hz, 2H)

3’’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 6,79 (dd, J= 8,5, 2,6 Hz, 2H) - - 1,74 – 1,15 (m, 14H)

4’’ - - - - 1,74 – 1,15 (m, 14H)

5’’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 6,79 (dd, J= 8,5, 2,6 Hz, 2H) - - 1,74 – 1,15 (m, 14H)

6’’ 7,32 – 7,07 (m, 9H) 7,30 – 6,94 (m, 8H) - - 0,86 (t, J= 6,1 Hz, 3H)

Me 3,11 (t, J= 7,6 Hz, 2H) - 1,03 (t, J= 7,4 Hz, 3H) 1,33 (d, J= 6,0 Hz, 6H)


59


C-APT dos derivados da amida do ácido vanílico. AR1 AR2 AR3 AR4 AC1 AK1 AK2 AK3 AK4 AK6

δC δC δC δC δC δC δC δC δC δC

1 133,2 131,4 133,2 133,3 133,2 126,7 126,5 126,3 126,4 126,5

2 111,8 112,0 111,8 112,0 111,8 111,6 111,7 110,9 111,1 111,6

3 150,8 150,7 151,3 151,4 151,3 151,2 149,2 149,2 149,9 149,4

4 141,7 141,7 142,4 142,2 142,3 149,3 151,3 151,4 150,2 151,7

5 122,7 122,9 122,6 122,6 122,6 111,1 111,2 111,4 113,5 111,1

6 119,9 120,2 118,7 118,7 118,7 119,3 119,8 119,4 119,4 119,5

1’ 138,7 138,7 136,7 136,6 136,6 136,9 137,0 137,0 137,0 137,1

2’ 134,3 129,5 129,1 129,1 129,0 129,2 130,1 129,1 129,0 129,3

3’ 127,1 127,3 128,7 128,8 128,7 128,9 128,8 128,7 128,7 128,9

4’ 131,4 133,0 132,8 130,7 132,9 133,3 133,2 133,1 133,1 133,4

5’ 127,1 127,3 128,7 128,8 128,7 128,9 128,8 128,7 128,7 128,9

6’ 134,3 129,5 129,1 129,1 129,0 129,2 130,1 129,1 129,0 129,3

7’ 42,5 42,1 43,3 43,4 43,3 43,3 43,4 43,3 43,2 43,5

O=C-N 163,9 165,5 166,6 163,2 166,6 167,0 167,5 167,0 167,1 167,2

O=C-O 165,5 169,3 171,7 166,6 168,8 - - - - -

OMe 56,4 56,3 55,9 56,0 55,9 56,1 56,1 56,0 55,9 56,2

CH2-C6H5 - 39,8 - - - 35,1 34,8 - - -

OCH2 - - - - - 70,0 - - -

1’’ 128,4 133,8 33,6 133,2 - 69,9 128,7 70,4 71,1 69,2

2’’ 129,1 128,7 26,9 133,2 - 134,3 129,2 22,3 - 32,0

3’’ 128,5 128,6 22,1 122,7 - 128,8 115,6 - - 29,7- 22,8

4’’ 128,4 127,3 - 136,7 - 129,1 155,5 - - 29,7- 22,8

5’’ 128,5 128,6 - 130,1 - 136,2 115,6 - - 29,7- 22,8

6’’ 129,1 128,7 - 128,8 - 129,1 129,2 - - 29,7- 22,8

Me - - 13,7 - 20,6 128,8 - 10,3 21,8 14,25

CH6H4Me - - - - 21,0 - - - -


60


C-APT da amida do ácido vanílico e

seus derivados ésteres

NR15

Composto NR15 AR1 AR2 AR3 AR4 AC1

δC δC δC δC δC δC

1 126,5 133,6 131,6 133,2 133,3 133,2

2 111,9 112,2 112,0 111,8 112,0 111,8

3 151,3 151,2 150,9 151,3 151,4 151,3

4 148,8 142,1 142,0 142,4 142,2 142,3

5 122,1 123,4 122,9 122,6 122,6 122,6

6 115,8 120,4 120,2 118,7 118,7 118,7

Na análise dos espectros de RMN de 1H dos éteres (AK1, AK2, AK3,

AK4 e AK6) da amida do vanílico (obtidos em CDCl3, 200 MHz), ilustrado na Tabela

15 (pag 59), o sinal do hidrogênio amídico (O=C-NH-) se apresenta como singleto largo

na faixa de 6.49-7.15 ppm devido ao solvente deuterado usado (CDCl3). Foram

observados, além dos sinais da amida vanílica, os sinais caraterísticos dos prótons da

cadeia éter inserida, principalmente o sinal na faixa de 3.98-4.18 ppm atribuído aos

hidrogênios metilênicos (CH2-O) na forma de um tripleto (com exceção do éter

isopropila que forma um septeto 4.51 (sept, J= 6.2 Hz, 1H), já que esse sinal acopla

com outro CH2 com mesma constante de acoplamento, pois esse sinal acopla com seis

hidrogênios. O espectro de RMN de 13

C-APT desses compostos éteres (AK1, AK2,

AK3, AK4 e AK6) assim como o de RMN de 1H revela o sucesso das reações ao

mostrar sinais da junção das cadeias alcoxilas à amida vanílica. De acordo com a

Tabelas 13 e 14 e Figura 17, vemos sinais típicos da formação dos éteres com a amida

em 69,2-70,4 ppm atribuídos aos hidrogênios metilênicos O-CH2 que faz parte da

inserção da cadeia alcoxila proveniente do brometo de alquila utilizado (R-Br). Sinal da

carbonila se encontra em torno de 167,0-167,5 ppm


61


C -APT da amida do ácido vanílico e

seus derivados éteres.

NR15

Composto NR15 AK1 AK2 AK3 AK4 AK6

δC δC δC δC δC δC

1 126,5 126,7 126,5 126,3 126,5 126,5

2 111,9 111,6 111,7 110,9 111,2 111,6

3 151,3 151,2 149,2 149,2 150,0 149,4

4 148,8 149,3 151,3 151,4 150,3 151,7

5 122,1 111,1 111,2 111,4 113,6 111,1

6 115,8 119,3 119,8 119,4 119,4 119,5

Figura 18. Sinais de RMN de 1H e

13C observados nas amidas eterificadas e

esterificadas.


62

4.3.6. Interpretação dos espectros de massas dos compostos da Série AR e série AK

Os espectros de massas das amidas inéditas na literatura foram obtidos por

espectrômetro de massas tipo MALDI de alta resolução, o qual permitiu a obtenção da

massas exatas das amidas cloradas com precisão de 4 casas decimais. Segundo

BRENTON & GODFREY (2010), foram considerados como massas exatas, aqueles

sinais cujos valores ficaram entre + 20% das massas calculadas teóricas, os quais estão

descritos na tabela a seguir.

Tabela 17. Dados do espectro de massa tipo MALDI da Série AR e série AK

Composto Pico íon-

molecular

Massa

calculada

Massa do

espectro

Erro

percentual

(%)

AR1 [M+Na]+ 418,0822 418,0809 -3,11

AR2 [M+Na]+ 432,0979 432,0914 -15,04

AR3 [M+Na]+ 398,1135 398,1118 -4,27

AR4 [M]+ 495,9927 495,9912 -3,02

AC1 [M+Na]+ 356,0666 356,0664 -0,56

AK1 [M+Na]+ 432,1342 432,1328 -3,24

AK2 [M+Na]+ 434,1135 434,1123 -2,76

AK3 [M+Na]+ 356,1029 356,1038 2,53

AK4 [M+Na]+ 356,1059 356,1027 -8,99

AK6 [M+Na]+ 454,2125 454,2119 -1,32


63

AMIDAS CINÂMICAS

Amida cinâmica – NR1

Amida o-cumárica – NR5

Amida sinápico – NR9

Amida cafeica – NR2

Amida m-cumárico – NR6

(76%)

Amida trans-2-nitrocinâmico –

NR10

Amida ferúlica – NR3

Amida p-cumárica – NR7

Amida 3,4,5-trimetoxicinâmico

– NR11

Amida 4-metoxicinâmica – NR4

Amida 4-cloro-cinâmico – NR8

AMIDAS BENZOICAS

Amida benzoica – NR12

Amida siríngico – NR16

Amida 3-metil-4-nitrobenzoico

– NR20

Amida bifenil-carboxílico –

NR13

Amida 4-hidroxibenzoico –

NR17

Amida vanílico fluorada –

NR21

Amida gálico – NR14

Amida 3,5-ditertbutil-4-

hidroxibenzoico – NR18

Amida vanílico bromada –

NR22

Amida vanílico – NR15

Amida 2-hidroxi-5-metoxi-benzoico – NR19

Figura 19. Amidas obtidas de derivados dos ácidos cinâmicos e benzoicos.


64

DERIVADOS ÉTERES DERIVADOS ÉSTERES

AK1

AR1

AK2

AR2

AK3

AR3

AK4

AR4

AK6

AC1

Figura 20. Derivados éteres e ésteres da amida do ácido vanílico (NR15).

4.4. ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DAS AMIDAS CINÂMICAS E BENZOICAS

CLORADAS

4.4.1. Relação estrutura atividade das 4-halobenzilamidas no estudo antifúngico I

No intuito de avaliar a atividade antifúngica das amidas preparadas a partir dos

ácidos cinâmicos e benzoicos com as 4-halobenzilamina, as amidas foram testadas em

dois tipos de atividade antifúngica. A primeira foi a técnica de microdiluição em caldo

de acordo com o protocolo de SARTORATTO et al., 2004; ELOFF et al., 1978 e

HOUGHTON et al., 2005, utilizando 7 cepas de Candida albicans: C. albicans ATCC


65

76645, C. albicans LM-106; C. albicans LM-23, C. tropicalis ATCC-13803, C.

tropicalis LM-36, C. krusei LM-13 e C. krusei LM-656. A outra metodologia foi

técnica de microdiluição em caldo de acordo com o documento M27-A3 (CLSI, 2008),

utilizando 2 cepas de coleção: Candida parapsilosis (ATCC® 22019™) e Candida

krusei (ATCC® 14243™) que estão descritos na Seção 4.6.3. A atividade antifúngica

(Tabela 9) dos produtos foi interpretada e considerada ativa ou não de acordo com os

seguintes parâmetros: 50-100 μg/mL = boa atividade; 100-500 μg/mL = atividade

moderada; 500-1000 = fraca atividade; > 1000 μg/mL = produto inativo (HOLETZ et

al., 2002).

O estudo de relação estrutura-atividade entre a amida cinâmica, a amida

benzoica e seus análogos químicos foi baseado nos resultados da atividade inibitória

sobre as cepas fúngicas do gênero Candida testadas. Esse procedimento é relevante

devido ao fato desses compostos serem estruturalmente semelhantes, havendo mudança

no número e no tipo de substituintes no anel aromático que podem causar alterações

significativas nas propriedades dos compostos. Logo os resultados obtidos neste

trabalho podem servir de referência para o desenvolvimento de novos agentes

antifúngicos com perfil biológico mais acentuado.

Os resultados dos ensaios de atividade antifúngica das amidas NR1 a NR22, de

acordo com o protocolo de SARTORATTO et al., 2004 e HOUGHTON et al.; 2005,

desenvolvido no laboratório de microbiologia, coordenado pela profa. Dra. Edeltrudes,

estão registrados na Tabela 18 (pag 70). As espécies de leveduras apresentaram

sensibilidade às amidas NR1, NR2, NR3, NR5, NR6, NR7, NR10, NR14, NR15,

NR21. As demais substâncias não produziram inibição sobre o crescimento das cepas.

Considerando NR1 como esqueleto base de estudo por sua estrutura simples

em relação às outras amidas e que obteve uma CIM de 512 µg/mL sobre duas cepas (29

% das cepas testadas) e 1024 µg/mL sobre 4 cepas (57% das cepas testadas), observa-se

que seus análogos orto e meta-hidroxilados NR5 e NR6 obtiveram um aumento na

inibição fúngica, obtendo CIM de 256 sobre três das sete cepas (43 % das cepas

testadas), 512 µg/mL sobre duas cepas (29 % das cepas testadas) e 1024 µg/mL sobre o

restante das cepas testadas, havendo um aumento no espectro de ação para 100%

testadas com CIM’s menores em algumas delas. Contudo, o análogo para-hidroxilado

NR7 obteve uma inibição inferior à amida cinâmica, sugerindo que a hidroxila no anel

age potencializando a inibição do núcleo básico da estrutura nas posições orto e meta e


66

diminuindo esse efeito na posição para em relação à amida do ácido cinâmico. As

amidas do ácido cafeico e férulico obtiveram resultados moderados, inibindo 100% das

cepas. O NR2 obteve CIM’s de 256 sobre três cepas de Candida albicans (43 % das

cepas testadas), 512 µg/mL sobre três cepas de Candida tropicalis e Candida krusei (43

% das cepas testadas) e 1024 µg/mL sobre o restante das cepas testadas. Ao analisar as

estruturas dos compostos NR2 e NR3, percebe-se que dissubstituição nas posições 3 e 4

com hidroxilas e metoxilas contribuiem para o aumento da atividade antifúngica. A

amida do ácido 2-trans-nitrocinâmco (NR10) obteve o melhor efeito inibitório dentre as

amidas cinâmicas, sugerindo que um grupo nitro causa uma inibição considerável

sobre os fungos do gênero Candida. A literatura relata que o ácido cinâmico possui

atividade de 110 µg/mL sobre algumas espécies de cepas de Candida albicans

(SCHMIDT et al., 2010) e inativo sobre outras espécies desse gênero (GEORGIEV et

al., 2012). De maneira geral, ao se comparar a amida NR1 ao seu ácido de origem,

observa-se que anel aromático clorado da amida como foi feito nas reações, causa uma

ampliação no espectro de ação fungistático dos derivados nitrogenados. A mesma

observação pode ser feita sobre NR7 cujo ácido de origem, o ácido p-cumárico, não tem

atividade alguma sobre as cepas de Candida (GUZMAN, 2014a). Ao comparar a

atividade sobre cepas do gênero Candida, a amida cafeica (NR2) obteve uma maior

CIM do que seu ácido de origem (123 µg/mL), porém uma atividade igual e maior,

respectivamente, do que a cafeoilfeniletalamina (250 µg/mL) e cafeoiltriptamina (500

µg/mL) (GEORGIEV et al., 2012; GUZMAN, 2014a). A amida ferúlica (NR3) tem

uma CIM maior do que o ácido ferúlico (199 µg/mL sobre espécies de C. albicans C.

krusei) e uma CIM menor, do que os análogos ésteres estudados como é o caso do

ferulato de metila, etila , butila de CIM iguais a 1212 µg/mL como também é menos

sensível do que amidas análogas a exemplo feruloil tiramina (123 µg/mL) e feruloil

triptamina (123 µg/mL) (GEORGIEV et al., 2012; NAKAUCHI et al., 2002). Diante do

que foi exposto a anel aromático para-clorado tem um papel fundamental na atividade

antifúngica das amidas em estudo, já que é observado uma ação fugistática em várias

espécies do gênero Candida em comparação a trabalhos de revisão (GUZMAN, 2014a).

Entretanto, alguns substituintes no anel aromático cinâmico, como metoxila

(NR4) e cloro (NR8) na posição para, não afetam o crescimento fúngico sobre as cepas

testadas. Também se observou que trissubstituições como um anel 3,4,5-trimetoxilado

(NR11) ou 3,5-dimetoxilado-4-hidroxilado (NR9) não interferem no crescimento dessas


67

leveduras, apesar da literatura demonstrar que amidas sinápicas terem atividade

antifúngica (GUZMAN, 2014a).

Ao analisar o grupo de amidas benzoicas, observa-se que a grande maioria das

amidas desse grupo não obteve a atividade antifúngica sobre as cepas testadas. Um

exemplo notório é a amida do ácido benzoico, quando se compara com a amida do

ácido cinâmico, não obteve sequer uma atividade sobre as cepas testadas. A

incapacidade da NR12 de inibição sobre as cepas fúngicas pode estar relacionada com

ausência do espaçador (CH2=CH2) entre o anel aromático e a carbonila da amida.

Quimicamente, a dupla ligação no esqueleto das amidas cinâmicas pode ter o papel de

um agente espaçador que contribui para a atividade antifúngica, como também pode

estar aumentando a conjugação eletrônica. No caso das amidas benzoicas sua estrutura

terá uma conjugação menor, diminuindo drasticamente a sua sensibilidade aos fungos

testados.

As amidas benzoicas que tiveram atividade biológica foram aquelas

sintetizadas a partir ácido 4-hidroxibenzóico, do ácido gálico e do ácido vanílico. A

amida do ácido 4-hidroxibenzoico (NR17) obteve uma CIM de 256 µg/mL sobre a cepa

de Candida krusei LM-656 e 1024 µg/mL sobre a cepa de Candida tropicalis LM-36,

ou seja, inibindo apenas 29% das cepas testadas. Essa amida tem uma atividade fraca,

enquanto as amidas do ácido gálico (NR14) e do ácido vanílico (NR15) mostraram

atividades consideráveis de acordo com suas CIM’s.

Algumas amidas benzoicas mostraram maiores sensibilidades consideráveis.

Isso pode ser observado de acordo com os resultados de duas amidas benzoicas: a amida

NR14 e principalmente a amida NR15 que obtiveram uma atividade antifúngica alta. A

NR14 inibiu 57% das cepas de espécies de Candida (quatro das sete cepas) com CIM

de 256 µg/mL e 43% das outras cepas (três das sete espécies testadas) com CIM de 512

µg/mL. A NR15 inibiu 86 % das cepas de Candida, seis das sete cepas desse gênero)

com CIM de 256 µg/mL e a cepa testada de Candida albicans ATCC-76645 com CIM

de 512 µg/mL. Esses resultados mostram que mesmo com ausência do espaçador (dupla

ligação), as amidas benzoicas 3,4,5-triidroxiladas ou amidas 3-metoxi-4-hidroxiladas

demonstram inibição sobre os fungos com alta sensibilidade. A amida vanílica se

destacou como melhor antifúngico dentre as amidas em estudo. Mesmo tendo uma CIM

menor do que seu ácido de origem (o ácido vanílico), que tem uma CIM de 50 µg/mL

sobre cepas do gênero Candida (REN et al., 2009), a amida vanílica foi considerada


68

dentro da coleção de amidas preparadas o composto com maior atividade antifúngica.

Não existem muitos estudos de atividade antimicrobiana sobre os compostos benzoicos.

Porém um estudo desenvolvido por REDDY, RAVINDER & KANJILAL (2012)

demonstra que tanto derivados ferúlicos como derivados vanílicos possuem atividade

antifúngica sobre espécies do gênero Candida.

Segundo um estudo de ALVES e colaboradores (2013) feito por meio de

docking a partir da estrutura 3D da proteína PBP2a (transpeptidase de bactérias

resistenstes a β-lactâmicos) e testes in vitro de batérias Gram-positivas e Gram-

negativas, a presença de grupos hidroxilas nas posições orto e para como também a

presença de metoxila em posição meta no anel benzênico são importantes para atividade

antimicrobiana de compostos fenólicos de estrutura química cinâmica e benzoica. A

partir dessa correlação com estudo de ALVES e colaboradores (2013), seria previsto

que existe uma importância de grupos hidroxilas e/ou metoxilas nos anéis aromáticos de

NR14, NR15.

Os fungos foram mais sensíveis a NR15 do que a seus análogos fluorado NR21

e bromado NR22, sugerindo que as amidas cloradas têm um perfil antifúngico mais

específico. Além disso, ALVES e colaboradores (2013) descrevem que a presença de

grupos hidroxilas nas posições orto e para bem como a presença de metoxila em

posição meta são importantes para atividade antimicrobiana. Diante desses resultados,

pode dizer que a amida derivada do ácido vanílico foi eleita a 4-clorobezilamida com o

melhor perfil antifúngico por ter em sua estrutura uma metoxila em meta, uma hidroxila

em para e um cloro no anel básico da estrutura.

Considerando que amida vanílica apresentou melhor efeito inibitório sobre as

cepas fúngicas, foram preparados vários derivados a partir dessa amida com a finalidade

de obter uma amida com melhor perfil antifúngico e avaliar a contribuição da hidroxila

a atividade biológica. Conforme é mostrado na Tabela 19 (pag 71), os derivados da

amida do ácido vanílico não apresentarem atividade antifúngica sobre as cepas testadas.

Esse resultado indica que substituintes na forma de ésteres como acetilado (AC1),

benzoato (AR1), o fenilacetato (AR2), o valerato (AR3) e 3-bromobenzoato (AR4) e

grupos éteres tais como 4-metil-fenóxido (AK1), 4-hidroxi-fenóxido (AK2), 1-

propanóxido (AK3), 2-propanóxido (AK4) e 1-pentilóxido (AK5), decilóxido(AK6) na

posição 4 de NR15 não causa algum efeito inibitório sobre as cepas fúngicas. A


69

proteção da hidroxila com estes substituintes tornou a amida inativa e evidenciou a

importância da presença do OH na posição 4 do anel aromático.


70

Tabela 18. Atividade antifúngica das amidas derivadas do ácido cinâmico e do ácido benzoico sobre em ensaio de microdiluição em caldo.

CIMb

(µg/mL) / Leveduras

NR1-NR11

NR12-NR22

Composto R1 R2 R3 R4 R5 Candida

albicans

ATCC-76645

Candida

albicans

LM-106

Candida

albicans

LM- 23

Candida

tropicalis

ATCC-13803

Candida

tropicalis

LM-36

Candida

krusei

LM-13

Candida

krusei

LM-656

NR1 - - - - Cl 1024 1024 1024 512 512 + 1024

NR2 - OH OH - Cl 256 256 256 512 1024 512 512

NR3 - OCH3 OH - Cl 256 256 256 512 512 512 512

NR4 - - OCH3 - Cl + + + + + + +

NR5 OH - - - Cl 256 256 256 512 512 1024 1024

NR6 - OH - - Cl 256 256 256 512 512 1024 1024

NR7 - - OH - Cl 1024 1024 512 + + + 1024

NR8 - - Cl - Cl + + + + + + +

NR9 - OCH3 OH OCH3 Cl + + + + + + +

NR10 NO2 - - - Cl 256 256 256 256 256 512 512

NR11 - OCH3 OCH3 OCH3 Cl + + + + + + +

NR12 - - - - Cl + + + + + + +

NR13 - - C6H5 Cl + + + + + + +

NR14 - OH OH OH Cl 256 256 512 512 512 256 256

NR15 - OCH3 OH - Cl 512 256 256 256 256 256 256

NR16 - OCH3 OH OCH3 Cl + + + + + + +

NR17 - - OH - Cl + + + + 1024 + 256

NR18 - C(CH3)3 OH C(CH3)3 Cl + + + + + + +

NR19 OH - - OCH3 Cl + + + + + + +

NR20 - CH3 - NO2 Cl + + + + + + +

NR21 - OCH3 OH - F 512 512 512 + + 1024 1024

NR22 - OCH3 OH - Br + + + + + + +

Nistatina - - - - - 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125

+: Crescimento do micro-organismo b

não houve crescimento das cepas com controle de nistatina em nehuma das concentrações


71

Tabela 19. Atividade antifúngica de derivados éteres e ésteres da amida do ácido vanílico em ensaio de diluição em meio liquido e em meio sólido (disco-difusão).

HALO DE INIBIÇÃOb

Composto R Candida albicans

ATCC-76645

Candida

albicans

LM-106

Candida

albicans

LM- 23

Candida

tropicalis

ATCC-13803

Candida

tropicalis

LM-36

Candida

krusei

LM-13

Candida

krusei

LM-656

AR1 C6H5- + + + + + + +

AR2 C6H5CH2- + + + + + + +

AR3 CH3(CH2)3- + + + + + + +

AR4 3-Br-C6H4- + + + + + + +

AK1 4-Me-C6H4CH2- + + + + + + +

AK2 4-OH-C6H4CH2- + + + + + + +

AK3 CH3(CH2)2- + + + + + + +

AK4 (CH3) 2CH2- + + + + + + +

AK6 CH3(CH2)8CH2- + + + + + + +

AC1 CH3 + + + + + + +

Nistatina - 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125 3,125

+: Crescimento do micro-organismo

b não houve crescimento das cepas com controle de nistatina em nehuma das concentrações


72

4.4.2. Relação estrutura atividade quantitativa do estudo antifúngico I

O Volsurf+ 1.0.7 gerou 128 descritores em conjunto com a variável dependente

(classificação binária), que descreve se o composto é ativo (A) ou inativo (I). Esses

dados foram utilizados como entrada para o software KNIME v. 3.1.0. É importante

salientar que a geração de descritores é relativamente rápida, para todas as 32 amidas

que os conjuntos de dados de treino compreendem a geração de todos os 128 descritores

por Volsurf+ levou menos de 1 minuto, utilizando um computador equipado com um

processador i7, rodando a 3.4GHz e equipado com 12 GB de memória RAM.

A Tabela 20 (próxima pag) resume os índices estatísticos do modelo de Treino

para a formação e a validação cruzada em todos os ensaios antifúngicos. Para a

validação, a árvore de decisão gerou altas taxas de acertos para os compostos inativos

que estavam acima de 83,3% e baixas taxas para os compostos ativos, 22,2%. Para a

validação cruzada, o modelo apresentou desempenho semelhante ao conjunto de

treinamento. A especificidade (verdadeiro negativo) foi maior que a sensibilidade

(verdadeiro positivo). Isso significa que no geral, houve uma menor percentagem de

falso positivo em relação verdadeiro positivo na predição, o que mostra que o método se

mostra com predição de bom desempenho. Os resultados podem ser visualizados na

Tabela 20.


73


acertos correspondentes, que foram obtidos utilizando método de validação leave-one-

out sobre o conjunto total de 32 haloamidas submetidos a testes antifúngicos.

C. albicans LM- 23

Treino Validação

Amostras Acerto %Acerto Acerto %Acerto

Ativo 10 3 30.0 3 30,0

Inativo 22 19 86.4 19 86,4

Total 32 22 68,8 22 68,8

C. albicans ATCC-76645

Treino Validação


Ativo 10 3 30,0 3 30,0

Inativo 22 19 86,4 19 86,4

Total 32 22 68,8 22 68,8

C. albicans LM-106

Treino Validação


Ativo 10 3 30,0 3 30,0

Inativo 22 19 86,4 19 86,4

Total 32 22 68,8 22 68,8

C. krusei LM-13

Treino Validação


Ativo 8 3 37,5 3 37,5

Inativo 24 19 79,2 19 79,2

Total 32 22 68,8 22 68,8

C. tropicalis ATCC-13803

Treino Validação


Ativo 8 2 25,0 2 25,0

Inativo 24 20 83,3 20 83,3

Total 32 22 68,8 22 68,8

C. tropicalis LM-36

Treino Validação


Ativo 9 2 22,2 2 22,2

Inativo 23 20 87,0 20 87,0

Total 32 22 68,8 22 68,8

C. krusei LM-656

Treino Validação


Ativo 11 3 27,3% 3 27,3

Inativo 21 19 90,5% 19 90,5

Total 32 22 68,8% 22 68,8


74

De acordo com a árvore de decisão (um organograma que mostra como

KMINE compara os descritores, para prever a atividade biológica), a predição dos

ativos e inativos foi baseada em dois descritores das haloamidas: o DRDRDR e o

DRDRAC, os quais são descritores farmacofóricos, que formam a máxima área

triangular DRY-DRY-DRY (formação hidrofóbica) e DRY-DRY-Aceptor (contendo

um aceptor ligação-H). Valores normalizados de DRDRDR > -0.6599 consideraram os

compostos em sua maioria como inativos, enquanto valores normalizados DRDRAC > -

0.6681 consideraram os compostos como ativos.

A Figura 21 mostra a grade molecular dos campos de interação (MIF-

Molecula Interaction Fields) em torno do composto mais ativo (composto 15) e

compostos mais inativos (16,17). Para as amidas menos ativas, a sonda DRY (verde),

que se refere às regiões hidrofóbicas da molécula, se concentra nos anéis de todas as

amidas. Entretanto a sonda N1 (azul escuro), que mostra regiões da molécula aceptoras

de hidrogênios, estão mais presentes nos anéis aromáticos devido às hidroxilas das

amidas gálica (NR14), vanílica (NR15) e 4-hidoxibenzoica (NR17). Embora esse

estudo não tenha uma alta taxa de precisão dos acertos com relação a especificidade nos

descritores relacionados com relação à atividade biológica, foi possível estabelecer

regiões dos análogos que demonstram uma sensibilidade ao crescimento antifúngico.

Figura 21. Campos de interações da amida gálica (NR14), amida vanílica (NR15),

amida 4-hidoxibenzoica (NR17) e amida benzoica (NR12), com nível de energia -0.6

kcal/mol de DRY e -3 kcal/mol de N1 no Volsuf.


75

4.4.3. Relação estrutura atividade das 4-clorobenzilamidas no estudo antifúngico II

No estudo antifúngico II em que foram analisadas as amostras sobre as cepas

fúngica de C. parapsilosis (ATCC® 22019™) e C. krusei (ATCC® 14243™),

observou-se, nitidamente, que os compostos hidroxilados são responsáveis pela ação

antifúngica. Seguindo critérios de concentração mínima inibitória e de espectro de ação

mais amplo, de acordo com a mudança do anel das amidas, a ordem de ação antifúngica

foi: anel gálico (NR14) > Anel siríngico (NR16) > Anel 3,5-ditert-butil-4-hidroxi

(NR18) > anel cafeico (NR2) > anel benzoico (NR12) = anel sinápico (NR9) > anel

vanílico (NR15) que podem ser visualizados na Tabela 21 (pag 77).

A amida NR16 tem uma CIM quase duas vezes menor do que seu ácido de

origem (ácido siríngico) que, de acordo com a literatura, o valor é de 50 µg/mL (REN et

al., 2009), reforçando o aumento da atividade antifúngica devido a presença do anel

aromático para-clorado. Além disso, a amida gálica NR14 inibiu 100% das cepas

fúngicas com CIM de 7,8 µg/mL, considerado uma atividade muito mais alta que o

ácido gálico cujo valor de CIM é de 100 µg/mL para Candida albicans e Candida

tropicalis (GEHRKE et al., 2013).

Pode-se sugerir que o sítio de ação inibitória tem um encaixe inibitório bem

acentuado, quando está presente uma tríade de grupos para-oxigenada no anel

aromático. Os compostos com substituições que tenham uma hidroxila na posição para

e mais duas substituições na posição meta de preferência oxigenadas como é o caso

NR14 e NR16 se ligam de forma a ter um encaixe com mais afinidade no sítio inibitório

inviabilizando o crescimento dos fungos. A inibição formada pela tríade mostrou-se ser

duas vezes mais efetivo do que o controle de fluconazol, uma vez que as CIM’s de

NR14 e NR16 foram de 7,8 µg/mL para C. krusei ATCC® 14243™ contra 16,0 µg/mL

do fluconazol. A NR14 (CIM=7,8 µg/mL) mostrou-se mais efetiva também do que o

fluconazol (CIM=16,0 µg/mL) na inibição de C. parapsilosis (ATCC® 22019™).

Esse encaixe parece ser melhor com a amida do ácido gálico, uma vez que as

três hidroxilas do anel aromático causam uma acidez maior, se comparado às outras

amidas, e como consequência esses grupamentos hidroxilados aumenta a polaridade

bem maior em relação às outras amidas. A literatura relata que o mecanismo de ação do

ácido gálico, material de partida de NR14, tem um mecanismo de ação relacionado à

alteração da hidrofobicidade da superfície bacteriana, interagindo com componentes

apolares, polares e aceptores de elétrons da célula (BORGES et al., 2013).


76

Em seguida, observou-se que com a diminuição da polaridade nas posições

meta ocorre uma diminuição da atividade e consequentemente um crescimento

microbiano maior. Constatou-se que o espaçador (ligação trans das moléculas NR1-11)

reduz a atividade das moléculas, uma vez que a amida sinápica (NR9) tem um mesmo

esqueleto base da amida do siríngico (NR16), mas não tem uma atividade tão

acentuada.

Com relação aos derivados vanílico ilustrados na Tabela 22 (pag 78), pode-se

observar que todos inibiram as cepas em concentração acima de 128 µg/mL, o que

indica que tanto as substituições éteres quanto as substituições ésteres não

desempenharam um efeito inibidor sobre C. parapsilosis (ATCC® 22019™), uma vez

que o ensaio com a amida NR15 obteve uma sensibilidade maior frente às cepas de C.

parapsilosis. Porém os derivados tiveram uma atividade inibitória sobre as cepas de C.

krusei (ATCC® 14243™), na qual a amida NR15 não causou nenhum efeito.


77

Tabela 21. Atividade antifúngica das amidas da série cinâmica e benzoica em ensaio de diluição em meio liquido e em meio sólido (disco-difusão).

NR1-NR11

NR12-NR22

Estruturas R1 R2 R3 R4 R5 Cepas/ CIM

b,c(µg/mL)

C. parapsilosis (ATCC® 22019™) C. krusei

(ATCC® 14243™)

NR1 - - - - Cl NE NE

NR2 - OH OH - Cl 31,25 250

NR3 - OCH3 OH - Cl NE NE

NR4 - - OCH3 - Cl NE NE

NR5 OH - - - Cl NE NE

NR6 - OH - - Cl NE NE

NR7 - - OH - Cl NE NE

NR8 - - Cl - Cl NE NE

NR9 - OCH3 OH OCH3 Cl 250 150

NR10 NO2 - - - Cl NE NE

NR11 - OCH3 OCH3 OCH3 Cl NE NE

NR12 - - - - Cl 125 250

NR13 - - C6H5 Cl NE NE

NR14 - OH OH OH Cl 7,8 7,8

NR15 - OMe OH - Cl 21,25 NE

NR16 - OMe OH OMe Cl 31,25 31,25

NR17 - - OH - Cl 250 250

NR18 - C(CH3)3 OH C(CH3)3 Cl 125 7,8

NR19 - OH - OMe Cl NE NE

NR20 - Me - NO2 Cl NE NE

NR21 - OMe OH - F NE NE

NR22 - OMe OH - Br NE NE

Fluconazol - - - - 2 µg/mL 16 µg/mL

Voriconazol - - - - 0,125 µg/mL 0,25 µg/mL

a Cepas de leveduras isoladas de coleção.

b CIM foi definido como a mais baixa concentração que produziu 50% de redução do crescimento das células fúngicas após 24h de

incubação. c

O procedimento foi realizado de acordo com o protocolo M27- S4 do CLSI 2012. d O intervalo dos compostos testados variou de 500 a 0,97 µg/mL. O CIM é a

representação da média geométrica de dois experimentos distintos em dois dias diferentes. NE= não efetivo.


78

Tabela 22. Atividade antifúngica de derivados éteres e ésteres da amida do ácido vanílico em ensaio de diluição em meio liquido e em meio sólido

(disco-difusão).

HALO DE INIBIÇÃOb

Composto R

Cepasa

/CIMb (µg/mL)

c

ATCC® C.parapsilosis

22019

ATCC® C.krusei

6258

AR1 C6H5- >128 >128

AR2 C6H5CH2- >128 >128

AR3 CH3(CH2)3- >128 >128

AR4 3-Br-C6H4- >128 >128

AK1 4-Me-C6H4CH2- >128 >128

AK2 4-OH-C6H4CH2- >128 >128

AK3 CH3(CH2)2- >128 >128

AK4 (CH3) 2CH2- >128 >128

AK6 CH3(CH2)8CH2- >128 >128

AC1 CH3 >128 >128

Fluconazol - 2 µg/mL 16 µg/mL

Voriconazol - 0,125 µg/mL 0,25 µg/mL

a Cepas de leveduras isoladas de coleção.

b CIM foi definido como a mais baixa concentração que produziu 50% de redução do crescimento das

células fúngicas após 24h de incubação. c

O procedimento foi realizado de acordo com o protocolo M27- A3 do CLSI, 2008. O intervalo dos

compostos testados variou de 128 a 0,25 µg/ mL.


79

4.4.4. Relação estrutura atividade quantitativa do estudo antifúngico II

O Volsurf+ 1.0.7 gerou 128 descritores em conjunto com a variável dependente

(classificação binária), que descreve se o composto é ativo (A) ou inativo (I). Esses

dados foram utilizados como entrada para o software KNIME v. 3.1.0. É importante

salientar que a geração de descritores é relativamente rápida, para todos os 32 amidas

que os conjuntos de dados de treino compreendem a geração de todos os 128 descritores

por Volsurf+ levou menos de 1 minuto, utilizando um computador equipado com um

processador i7, rodando a 3.4GHz e equipado com 12 GB de memória RAM.

A tabela 23 (pag 80) resume os índices estatísticos do modelo de Treino para a

formação e a validação cruzada em todos os ensaios antifúngicos. Para o teste Learnig

Machine gerou altas taxas de compostos inativos os quais obtiveram taxa de 100%

como também altas taxas para ativas que estavam acima 83%. Para a validação cruzada

do tipo leave-one-out, o modelo apresentou desempenho menor para os ativos que pode

ser atribuído ao baixo espaço amostral. A especificidade (verdadeiro negativo) foi maior

que a sensibilidade (verdadeiro positivo). Isso significa que no geral, houve uma menor

percentagem de falso positivo em relação verdadeiro positivo na predição, o que mostra

que o método se mostra com predição de bom desempenho em todos os ensaios

antifúngicos no conjunto de treinamento e a validação cruzada, porém pouco sensível.


80


acertos correspondentes, que foram obtidos utilizando método leave-one-out sobre o

conjunto total de 32 haloamidas submetidos a teste antifúngico.

C. parapsilosis (ATCC® 22019™)

Treino Validação


Ativo 6 5 83 2 33,3

Inativo 26 26 100 18 69,2

Total 32 31 97 20 62,5

C. krusei (ATCC® 14243™)

Treino Validação


Ativo 6 6 100% 1 33,3

Inativo 26 25 96% 27 93,1

Total 32 31 97% 28 87,5

De acordo com a árvore de decisão (um organograma que mostra como

KMINE compara os descritores, para prever a atividade biológica), a predição dos

ativos e inativos submetidos ao ensaio com C. parapsilosis (ATCC® 22019™) foi

baseada nos descritores L4LgS e IW4, os quais são descritores de perfis de coeficiente

de solubilidade e de momentos de interação de energia, respectivamente. O primeiro

descritor está relacionado a compostos que apresentam solubilidade semelhante, mas

diferente do perfil dependente do pH, ou vice-versa, enquanto o IW4 expressa o

desequilíbrio entre o centro de massa de uma molécula e o baricentro das suas regiões

hidrofílicos ou hidrofóbicos. Valores normalizados de L4LgS>0.0998 consideraram os

compostos em sua maioria como inativos, enquanto valores normalizados IW4 > 0.3644

consideraram os compostos como ativos. Isso significa que quando há uma polarização

hidrofílica do lado do anel aromático cinâmico ou benzoico maior que o anel da outra

extremidade, os compostos tendem a ser mais ativos. Neste caso, a sonda OH2 encobre

o anel aromático cinâmico e benzoico das estruturas de NR3 e NR14, ilustrando uma

polarização hidrofílica maior que seu segundo anel para-clorado. Enquanto nas

estruturas NR1 e NR112, a sonda OH2 se torna escassa por não haver substituintes com

afinidade hidrofílica considerável em relação ao outro anel da estrutura para-clorado,

ilustrado na Figura 22.


81

Figura 22. Campos de interações da amida gálica (NR15), amida benzoica (NR12),

amida ferúlica (NR3) e amida cinâmica (NR1), com nível de energia -3,5 kcal/mol de

OH2 no Volsuf.

Já a predição dos ativos e inativos submetidos ao ensaio com C. krusei

(ATCC® 14243™) foi baseada nos descritores DD2, que é um descritor da diferença

dos volumes hidrofóbicos. Nesse caso, o DD2 está relacionado a diferença entre os

volumes máximos hidrofóbicos (obtidos mediante variação da conformação do ligante)

e os volumes hidrofóbicos (D2) da estrutura 3D importado calculada ao segundo nível

de energia, sendo esse nível de energia de 0,25 kcal/mol. De acordo com esse descritor

uma molécula é mais ativa ao C. krusei (ATCC® 14243™) quando o anel cinâmico é

mais hidrofóbico, ou seja, possui pouca afinidade com regiões hidrofílicas, como pode

ser averiguado nas estruturas de NR1 e NR8, onde a sonda DRY encobre o anel

aromático cinâmico, que não possui substituintes muito hidrofilicos. Enquanto nas

estruturas NR14 (análogo meta e para hidroxilado) e NR15 (análogo meta- metoxilado

e para-hidroxilado), a sonda DRY se torna escassa nos anéis aromáticos benzoicos,

ilustrado na Figura 23.


82

Figura 23. Campos de interações da amida cinâmica (NR1), amida 4-clorocinâmica

(NR8), amida gálica (NR14) e amida vanílica (NR15), com nível de energia -0,99

kcal/mol de DRY no software Volsuf.

4.4.5. Avaliação antibacteriana das amidas

Os ensaios antibacterianos foram realizados com as vinte e duas amidas e com

os 10 derivados éteres e ésteres da vaniloil 4-clorobenzamida (NR15) através do

procedimento de microdiluição em caldo (NCCLS, 2003), utilizando linhagens padrão

de bactérias Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923. A

solução inicial dos controles gentamicina, amicacina, norfloxacino, penicilina

lbenzatina foi de 512 μg/mL.

De acordo com os resultados ilustrados nos gráficos 02, 03, 04 e 05 (pag 83 e

84), a amida NR4 (4-metoxi-cinamoil 4-clorobenzinamida) obteve atividade inibitória

considerável, apresentando uma CIM próximo a 150 µg/mL sobre a cepa de E. coli,

porém, as demais amidas NR1-NR3 e NR5-NR22 não apresentaram a inibição das

cepas bacterianas. Esses resultados demonstram que o anel halogenado pouco interfere

no crescimento bacteriano das cepas testadas. A literatura relata a atividade

antibacteriana sobre cepas bacterianas, inclusive sobre cepas de E. coli dos ácidos orto,

meta, e para-trans-metoxicinâmicos (RAHMAN, 2007; ZEMEK, 1987; XU, 2011),

porém esse é o primeiro estudo sobre o relato de amida metoxicinâmica com atividade

antibacteriana.


83


NR22, utilizando cepas de Escherichia coli.


NR22, utilizando cepas de Staphylococcus aureus.


84

S e r ie A R

CIM

Sta

ph

ylo

co

ccu

s A

ure

us

Esch

er i

ch

ia C

oli

0

5 0

1 0 0

1 5 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

C o n tro le A m ic a c in a

C o n tro le N o rflo x a c in o

C o n tro le G e n ta m ic in a

C o n tro le P e n ic ilin a 6 0 0

A R 1

A R 2

A R 3

A R 4

4 * 4 *


NR15, série AR (vaniloil 4-clorobenzamida), utilizando cepas de Escherichia coli e

Staphylococcus aureus.

S e r ie A K

CIM

Sta

ph

ylo

co

ccu

s A

ure

us

Esch

er i

ch

ia C

oli

0

5 0

1 0 0

1 5 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

6 0 0

C o n tro le A m ic a c in a

C o n tro le N o rflo x a c in o

C o n tro le G e n ta m ic in a

C o n tro le P e n ic ilin a 6 0 0

A K 1

A K 3

A K 4

A K 6

A C 1

4*

4 *

4 *


NR15, série AK (vaniloil 4-clorobenzamida), utilizando cepas de Escherichia coli e

Staphylococcus aureus.

MONTES, R. C./ CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

85

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS


86

5. CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos com esse estudo, pode-se chegar as seguintes

conclusões:

Os produtos foram obtidos via reação de uma ou duas etapas de fácil execução;

Foram sintetizadas 11 amidas cloradas derivadas do ácido cinâmico, 11 amidas

halogenadas derivadas do ácido benzoico, 5 derivados éteres e 5 derivados ésteres da

amida do ácido vanílico, sendo preparadas no total 32 moléculas.

As estruturas químicas das amidas inéditas foram elucidadas por meio de técnicas

espectroscópicas de RMN 1H e

13C, IV e espectrometria de massas de alta resolução,

como também foram verificados seus pontos de fusão;

No ensaio antifúngico, destacaram-se as amidas do ácido vanílico (NR15) e do ácido

gálico (NR14). De acordo com o estudo realizado, a presença da hidroxila na posição

para e metoxila na posição meta no anel aromático como também a presença de

hidroxilas em para e meta nas 4-halobenzilamidas potencializa a atividade inibitória

sobre os fungos testados.

No ensaio antibacteriano, a amida do ácido 4-metoxicinâmico (NR4) obteve uma

atividade inibitória considerável.

Nesse trabalho, a partir da utilização de descritores do Volsurf+ e os testes de

predição do KNIME, pode-se sugerir que anéis aromáticos, assim como, grupos

lipofílicos e grupos estéricos diminuem a atividade antifúngica. No entanto grupos

aceptores de hidrogênio ou quando anel cinâmico da amida tem uma região mais

hidrofílica, ocorre uma tendência a serem mais ativos a exemplo da amida vanílica e

a gálica.

6. PERPECTIVAS

Diante do que foi apresentado, O estudo de relação estrutura-atividade das amidas

cinâmicas e benzoicas foi feito, porém ficaram algumas lacunas que poderão ser feitas

em estudos futuros. Como foi observado, duas amidas (NR14 e NR15) se destacaram

por sua atividade antifúngica devido a presença de hidroxila no anel benzoico. São

perspectivas futuras:

Realizar estudos com análogos dessas amidas hidroxiladas que apresentem

atividade antifúngica mais potente.


87

Realizar modificações estruturais nos compostos (NR14 e NR15), a fim de

identificar as características químicas que influenciam a atividade antifúngica;

MONTES, R. C./ PARTE EXPERIMENTAL

88

PARTE EXPERIMENTAL


89

6. PARTE EXPERIMENTAL

6.1. Substâncias, reagentes e outros materiais utilizados.

Todos os reagentes foram obtidos da Sigma Aldrich. Para preparação das

amidas, foram utilizados 11 ácidos cinâmicos e 9 ácidos benzoicos. Os 20 ácidos foram

submetidos a uma reação com a 4-clorobenzilamina. Além da reação anterior, o ácido

vanílico foi submetido a uma reação com 4-fluorbenzilamina e outra reação com 4-

bromobenzilamina. Os ácidos e aminas utilizados para a preparação estão dispostos nas

duas figuras seguintes:

Ácido cinâmico (A1)

Ácido cafeico (A2)

Ácido ferúlico (A3)

Ácido 4-metoxicinâmico (A4)

Ácido o-cumárico (A5)

Ácido m-cinâmico (A6)

Ácido p-cumárico (A7)

Ácido 4-clorocinâmico (A8)

Ácido sináptico (A9)

Ácido trans-2-nitrocinâmico (A10)

Ácido 3,4,5-trimetoxicinâmico (A11)

Figura 24. Ácido cinâmico e seus derivados ácidos usados como material de partida

para a obtenção das amidas cloradas


90

Ácido benzóico (A12)

Ácido bifenil-carboxílico

(A13)

Ácido gálico (A14)

Ácido vanílico (A15)

Ácido siringico (A16)

Ácido 4-hidroxibenzoico

(A17)

Ácido 3,5-ditertbutil-4-

hidroxibenzoico (A18)

Ácido 2-hidroxi-5-

metoxibenzoico (A19)

Ácido 3-metil-4-nitrobenzoico

(A20)

Figura 25. Ácido benzoico e seus derivados ácidos usados como material de partida

para a obtenção das amidas cloradas.

4-clorobenzilamina

4-fluorbenzilamina

4-bromobenzilamina

Figura 26. Aminas halogenadas usadas como material de partida para a obtenção das

amidas cloradas.


91

Para a preparação dos éteres das amidas clorada do vanílico NR15, foram

usados os haletos de alquila ilustrados na figura abaixo:

Brometo de 4-metilbenzila

Brometo de 4-hidroxifenila

Brometo de 1-propanila

Brometo de 2-propanila

Brometo de 1-decila

Figura 27. Brometos de alquila usados como material de partida para a obtenção das

dos éteres da amida clorada vanílica.

Para a preparação dos ésteres das amidas cloradas do vanílico, foram usados os

cloretos de acila ilustrados na figura abaixo:

Cloreto de benzoíla

Cloreto de fenilacetila

Cloreto valeroíla

Cloreto de 3-bromo-

benzoíla

Figura 28. Cloretos de acila usados como material de partida para a obtenção das dos

éteres da amida clorada vanílica.


92

6.2. Métodos cromatográficos

Para as cromatografias de adsorção em coluna (CC) utilizou-se sílica gel 60,

ART 7734 da MERCK, de partículas com dimensões entre 0,063-0,200 mm, tendo

como suporte colunas de vidro cilíndricas cujas dimensões variaram de acordo com a

quantidade de amostra a ser cromatografada. Para cromatografia em camada delgada

(CCD) utilizou-se sílica gel 60 PF254, ART 7749 da MERCK. Como fase móvel foram

utilizados os solventes grau p.a., hexano (Hex), clorofórmio (CHCl3), acetato de etila

(AcOEt) e metanol (MeOH), isoladamente ou em misturas binárias, em gradiente

crescente de polaridade.

A cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) foi empregada para a

análise das frações obtidas por CC. As revelações das substâncias nas CCDA foram

executadas pela exposição das cromatoplacas à lâmpada de irradiação ultravioleta em

dois comprimentos de onda (254 e 366 nm) por meio de aparelho MINERALIGHT,

modelo UVGL-58. As placas também poderam ser reveladas com revelador líquido a

base de 5% de H2SO4 em etanol e depois aquecidas para revelação.

6.3. Ponto de fusão

O ponto de fusão (PF) de cada amostra foi determinado em placa de

aquecimento de aparelho digital para ponto de fusão da marca GEHAKA, modelo PF

1500, funcionado a 110 V, com temperatura que varia de 0-350 0C.

6.4. Pureza da amostra

A pureza das substâncias evidenciadas por CCDA foi determinado quando

houve a percepção de uma única mancha após revelação. Além disso, também foram

considerados a determinação do ponto de fusão das substâncias (o critério de pureza

adotado é que a diferença entre o PF final e o PF inicial não seja maior que 3 oC), bem

como a análise dos dados espectrais.

6.5. Métodos espectroscópicos

6.5.1. Infravermelho

Os dados espectrais na região do infravermelho (IV) foram obtidos em

aparelho de IRprestige-21 Shimadzu Fourier Tranform –Infrared Spectrophotometer, do


93

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica/UFPB, utilizando de 1,00 a 3,00 mg de

amostra em pastilhas de KBr, com freqüência medida em cm-1

.

6.5.2. Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) e

Ressonância Magnética Nuclear de carbono treze (RMN de 13

C) foram obtidos em

espectrômetro VARIAN MERCURY, operando na frequência do hidrogênio a 200

MHz e do carbono a 50 MHz. As amostras para análise foram preparadas dissolvendo-

se uma pequena quantidade em solvente deuterado (CDCl3 e MeOD ou DMSO-d6). Os

deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm), sendo

referenciados para RMN de 1H os picos característicos dos hidrogênios pertencentes às

frações não deuteradas dos solventes: clorofórmio (δH = 7,24 ppm, singleto), metanol

(δH = 3,3 ppm, quinteto, J=1,7 Hz) e Dimetilsufóxido (2,50 ppm, quinteto, J=1,9 Hz;

ou 3,33 ppm, singleto). Para os espectros de RMN de 13

C, estes mesmos parâmetros

foram utilizados: clorofórmio (δc = 77,00 ppm, septeto, J= 32,0 Hz), metanol (δc =

49,00 ppm, septeto, J=21,4 Hz) e e dimetilsufóxido (39,52 ppm, septeto, J=21,0 Hz).

6.5.3. Espectrometria de Massa de Análise

Os espectros de alta resolução foram desenvolvidos pelo Espectrômetro de

Massas de Alta Resolução localizado no Centro de Tecnologias Estratégicas do

Nordeste (CETENE). Matrizes e produtos químicos de calibração foram adquiridos da

Sigma-Aldrich. As medições foram realizadas utilizando um espectrómetro de massas

Ultraflex II TOF / TOF equipado com um laser de alta performance de estado sólido (λ=

355 nm) e um reflector. O sistema é operado pelo pacote de software FlexControl 2,4

(Bruker Daltonics GmbsH, Bremen, Alemanha).

As amostras foram irradiadas com um laser de potência de 20% e medido em

forma linear e refletida, em forma de íons positivos e negativos. As amostras foram

carregadas numa placa formada de aço para amostra (base de aço MTP 384; Bruker

Daltonics GmbsH). Os espectros de massas foram a soma de 100 a 300 disparos de laser

individuais, dependendo das condições da amostra.


94

6.6. Avaliação da atividade antimicrobiana das amidas

6.6.1. Estudo de atividade antifúngica I

6.6.1.1 – Espaço e responsáveis para o desenvolvimento de estudo

O estudo antifúngico foi desenvolvido no Laboratório de Micologia do

Departamento de Ciências Farmacêuticas localizado no Centro de Ciências da

Saúde/Universidade Federal da Paraíba. Os responsáveis para o desenvolvimento desse

trabalho foram os alunos de pós-graduação Ana Luiza A. L. Perez e Cássio Ilan S.

Medeiros com a supervisão da Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima no período de

novembro de 2014 a abril de 2015.

6.6.1.2 - Produtos testados

Nos ensaios de atividades biológicos foram utilizadas na primeira etapa vinte e

duas amidas codificadas de NR1 até NR22. Logo depois, em uma segunda etapa, foram

disponibilizados 10 compostos éteres e ésteres derivados da amida do ácido vanílico

(AR1-AR4; AC-1; AK1-AK6). As substâncias foram usadas nos ensaios na

concentração 1024 até 64 µg/mL. Foram solubilizadas em dimetilsulfóxido- DMSO

(MERK), numa proporção até 2%, para não ocorrer interferência sobre a biologia do

micro-organismo. Foi adicionado 10 µL de Tween 80 % e, em seguida, água destilada

esterilizada na quantidade suficiente para dois (02) mL (CLELAND; SQUIRES, 1991).

6.6.1.3 -Meios de cultura usados nos ensaios

Para o controle de atividade antifúngica foram utilizados caldo Sabouraud

dextrose como o controle do meio (isento de leveduras), controle de crescimento do

micro-organismo (leveduras) e nistatina (100 UI), adquirida comercialmente da

SIGMA-ALDRICH®

.

6.6.1.4 - Controle do ensaio antifúngico

Para os controles dos ensaios de atividade antifúngica foram utilizados caldo

Sabouraud dextrose (meio isento de produto e de leveduras), controle de crescimento do

micro-organismo (leveduras) e nistatina (100 UI/mL), adquirida comercialmente da

SIGMA-ALDRICH®.


95

6.6.1.5 - Leveduras do gênero Candida

Nos ensaios para avaliação da atividade biológica do produto, foram incluídas

5 cepas de Candida albicans: ATCC 76.645, C. albicans LM-36; C. albicans LM-P20,

C. topicalis ATCC-13803, C. tropicalis LM-36, C.krusei LM-13 e C. krusei LM-656.

As cepas foram adquiridas no Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, Laboratório

de Micologia e de Microbiologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal da Paraíba. As mesmas foram mantidas em meio de cultura

apropriado, agar Sabouraud Dextrose- ASD (DIFCO LABORATORIES/France/USA) e

conservadas a 4 ºC (geladeira); e a 35 ºC (leveduras).

A suspensão dos micro-organismos foi preparada conforme o tubo 0,5 da

Escala McFarland, ajustada através de leitura espectrofotométrica (Leitz-Photometer

340-800), para 90% T (530 nm), correspondendo, aproximadamente, a 106 UFC/mL

(NCCLS 2008; HADACEK & GREGER, 2000; CLELAND; SQUIRES, 1991).

6.6.1.6 - Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A determinação da CIM dos produtos testados foi realizada pela técnica de

microdiluição, utilizando placas de microdiluição contendo 96 cavidades com fundo em

forma de “U” e em duplicata. Em cada orifício da placa, foi adicionado 100 µL do meio

líquido duplamente concentrado. Em seguida, 100 µL de cada produto solubilizado,

também duplamente concentrado, foram dispensados nas cavidades da primeira linha da

placa. E por meio de uma diluição seriada a uma razão de dois, foram obtidas

concentrações de 1024 µg/mL até 64 µg/mL, de modo que na primeira linha da placa se

encontrará a maior concentração e na última, a menor concentração. Por fim, foram

adicionados 10 µL do inóculo dos micro-organismos nas cavidades, onde cada coluna

da placa referiu-se, especificamente, a uma cepa (ESPINEL-INGROFF et al., 2002).

Foi feito o controle de crescimento do micro-organismo no meio de cultura; e

do antifúngico fluconazol (100 µg/mL) como medida comparativa com os obtidos pelas

substâncias testadas. As placas foram seladas e incubadas a 35°C / 24-72 h (Leveduras).

E foi considerada como CIM, a menor concentração do produto capaz de inibir

visualmente o crescimento microbiano verificado nas cavidades, quando comparado

com o crescimento controle.


96

A determinação da Concentração Fungicida Mínima- CFM das substâncias foi

realizada após leitura da CIM. Foram retiradas alíquotas de 10 μL do sobrenadante das

cavidades, onde foi observada completa inibição do crescimento fúngico e semeadas em

placas contendo 20 mL ágar Sabouraud dextrose. Incubação: 35° C por 24-48 horas.

Após a realização da leitura, a CFM foi considerada como a menor concentração na

qual ocorreu o crescimento inferior a três (3) colônias/ aproximadamente 99 a 99,5 % de

atividade de morte (ESPINEL-INGROFF et al., 2002).

Os ensaios foram realizados em duplicata e o resultado expresso pela média

geométrica dos valores de CIM e CFM obtidas nos dois ensaios (CLEELAND;

SQUIRES, 1991; ELOFF, 1998; SOUZA et al., 2007).

A atividade antimicrobiana dos produtos foi interpretada e considerada ativa ou

não, conforme os seguintes critérios: 50-500 µg/mL= forte/ótima atividade; 600-1500

µg/mL= moderada atividade; >acima de 1500 µg/mL= fraca atividade ou produto

inativo (SARTORATTO et al., 2004; HOUGHTON et al.; 2005).

6.6.2. Estudo de atividade antifúngica II

6.6.2.1. Espaço e responsáveis para o desenvolvimento de estudo

O estudo antifúngico foi desenvolvido na Instituição: Laboratório de

Bioprospecção e Experimentação em Leveduras (LABEL) da Universidade Federal do

Ceará pelos pesquisadores: Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior, Ma. Cecília Rocha

da Silva e João Batista de Andrade Neto em fevereiro de 2015.

6.6.2.2. Produtos testados

Nos ensaios de atividades biológicos foram utilizadas vinte e duas amidas

codificadas de NR1 até NR22 e 10 compostos éteres e ésteres derivados da amida do

ácido vanílico (AR1-AR4; AC-1; AK1-AK6), resultando no total de 32 compostos. Os

compostos mencionados acima foram solubilizados em dimetilsulfóxido - DMSO

(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) numa proporção até 2% para não ocorrer

interferência sobre a biologia do micro-organismo.

6.6.2.3 - Controle do ensaio antifúngico

Para o controle de atividade antifúngica foi utilizado apenas o meio de cultura

e o inóculo padronizado.


97

6.6.2.4 - Microrganismos do gênero Candida usado

Foram utilizadas 2 cepas de coleção: Candida parapsilosis (ATCC® 22019™)

e Candida krusei (ATCC® 14243™) pertencentes ao LABEL.

6.6.2.5- Meios de cultura usados nos ensaios

Os meios de culturas utilizados nos ensaios de atividade antifúngica foram ágar

Sabouraud dextrose preparada a partir de uma suspensão de inóculo inicial de acordo

com a escala 0,5 McFarland. Os meios foram preparados conforme as instruções do

fabricante.

6.6.2.6 - Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

Foi utilizado a técnica de microdiluição em caldo de acordo com o documento

M27-A3 (CLSI, 2008), utilizando o meio de cultura RPMI 1640 (pH 7,0 ± 0,1)

tamponado com 0,165 M do ácido morfolinopropanosulfônico (MOPS) (Sigma, EUA).

As substâncias foram testadas no intervalo de concentração de 500 - 0,97 µg/ mL. As

placas foram preparadas no dia da realização do teste para evitar que a mesma fosse

congelada.

A partir de um cultivo de 24h das leveduras a serem testadas, realizado em ágar

Sabouraud dextrose foi preparada uma suspensão de inóculo inicial de acordo com a

escala 0,5 McFarland. Em seguida, foram realizadas diluições seriadas em meio RPMI

1640 para obtenção de inóculo final contendo 0,5 a 2,5 x 10³ UFC/mL. As microplacas

foram incubadas por um período de 24 horas a uma temperatura de 35ºC (± 2ºC). As

leituras visuais foram realizadas após esse período.

A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada como a menor

concentração da droga capaz de inibir 90% do crescimento do micro-organismo, em

comparação com o verificado no poço controle contendo somente o meio de cultura e o

inóculo padronizado (CLSI, 2012).

6.6.3. Estudo de Atividade antibacteriana das amidas cloradas e derivados éteres e

ésteres da amida do vanílico

6.6.3.1. Local do estudo desenvolvido e pesquisadores envolvidos

O estudo antibacteriano foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia e

Biologia Molecular localizado Departamento de Química Biológica/ Universidade de

Região Do Cariri – URCA. A equipe de pesquisadores é composta pelo Professor Dr.


98

Henrique Douglas Melo Coutinho e os estudantes colaboradores Thiago Sampaio de

Freitas, Maria do Socorro Costa, Fernanda de Sousa Oliveira.

6.6.3.2. Compostos

Os compostos submetidos ao ensaio antibacteriano foram: NR1; NR2; NR3;

NR4; NR5; NR6; NR7; NR8; NR9; NR10; NR11; NR12; NR13; NR14; NR15; NR16;

NR17; NR18; NR19; NR20; NR21; NR22; AK1; AK3; AK4; AK6; AC1; AR1; AR2;

AR3; AR4;

6.6.3.3. Cepas microbianas

Os micro-organismos utilizados nos testes foram obtidos através do

Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular (LMBM) da Universidade Regional

do Cariri (URCA). Foram utilizadas linhagens padrão de bactérias Escherichia coli

ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923.

6.6.3.4. Preparo das substâncias

Foram pesadas 10 mg (10000 µg) de cada substância a ser testada e colocadas

em eppendorfs individualizados, rotulados com os respectivos nomes. Esses 10 mg

foram então diluídos em 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), compondo uma solução de

concentração igual a 10 mg/mL (10000 µg/mL). Foram retirados 51 µl de solução de

cada Eppendorf e diluídos em 949 µL de água destilada em outro Eppendorf também

identificado, resultando em uma solução de 1 mL. A concentração final da solução foi

de 512 µg/mL para cada substância. Essa solução final foi utilizada para os testes de

CIM.


99

A adição de DMSO foi feita dentro da câmara de fluxo laminar com as luzes

apagadas, devido o DMSO ser fotossensível.

6.6.3.5 Preparo dos inóculos

No dia que antecedeu a realização dos testes, as culturas de bactérias foram

semeadas em Placas de Petri contendo HIA e colocadas na estufa a 37°C para

crescimento por 24 horas.

No dia do teste, com uma haste de platina esterilizada em Bico de Bunsen, foi

retirada uma porção das colônias bacterianas e colocadas em tubos de ensaio

identificados. Esse procedimento foi feito em triplicata. Os tubos foram fechados com

chumaços de algodão estéreis e levados ao vórtex para homogeinização. Após esse

procedimento, foi testado a turbidez da solução com um controle de McFarland.

Os Eppendorfs foram preparados em triplicata para cada bactéria e para cada

substância (2 bactérias X Triplicata X 31 substâncias = 186 Eppendorfs), cada um

contendo 900 μL de BHI a 10% + 100 μL do inóculo (correspondente a 10% da solução

total). O volume de cada Eppendorf foi distribuído em 8 poços no sentido alfabético,

sendo retirados 100 μL para cada poço das placas de microdiluição.

6.6.3.5. Preparo dos Antibióticos

Gentamicina: Foram retirados 63 μL de Gentamicina a 40000 μg/mL (volume

que corresponde a 2500 μg) e colocados em um Eppendorf. Posteriormente foram

adicionados 4,819 mL de água destilada, perfazendo uma solução com concentração de

512 μg/mL.

Amicacina: Foram retirados 10 μL de Amicacina a 250000 μg/mL (volume que

corresponde a 2500 μg) e colocados em um Eppendorf. Posteriormente foram

adicionados 4,872 mL de água destilada, perfazendo uma solução com concentração de

512 μg/mL.

Norfloxacino: Foram mensurados 2,5 mg de Norfloxacino em um Eppendorf,

sendo que esta massa foi diluída em 4,882 mL de água destilada, perfazendo uma

solução com concentração de 512 μg/mL.


100

Penicilina: Foram mensurados 2,5 mg de Penicilina Benzatina de 600.000 UI

em um Eppendorf, sendo que esta massa foi diluída em 4,882 mL de água destilada,

perfazendo uma solução com concentração de 512 μg/mL.

6.6.3.6 Determinação da concentração inibitória mínima

Foi adotado o procedimento de microdiluição em caldo (NCCLS, 2003). Foram

preparados os inóculos em tubos eppendorf contendo cada um deles 1 mL de solução,

com 900 μL de BHI a 10% e 100 μL da suspensão bacteriana com 106

UFC segundo a

escala de McFarland. A placa foi preenchida no sentido alfabético, resultando em 8

poços por coluna para a microdiluição. Foi adicionando 100 μL da solução acima em

cada poço, e em seguida foi feita a microdiluição seriada com a solução de 100 μL de

cada substância a ser testada, por coluna, variando nas concentrações de 256 a 2 μg/mL.

As microdiluições foram realizadas em triplicata. As placas foram levadas à incubadora

por 24 horas a 37 ºC. A determinação da CIM bacteriana foi feita utilizando-se a adição

de 20 μL de resazurina em cada poço e observação ocular após 1 hora.

A CIM foi averiguada através da observação de turvação visível em cada poço e da

mudança de cor provocada pela resazurina, constatando qual a menor concentração do

produto capaz de inibir o crescimento bacteriano (SALES et al. 2014).

6.6.3.7 Análise estatística

Os dados foram analisados através de um teste ANOVA de duas vias para as

séries AR, AK e AC, e um teste ANOVA de uma via para a série NR. Em seguida foi

feito um teste de Bonferroni post hoc (onde p < 0,05 e p <0,0001 são considerados

significativos e p > 0,05 não significativo).

6.6. Estudo de relação estrutura-atividade quantitativo

6.6.1. Materiais e métodos

Descritores do Volsurf

Em parceria com prof Dr. Marcus Tullius Scotti, as estruturas das moléculas

em três dimensões (3D) foram usadas como dados de entrada no programa Volsurf+ v.

1.0.7 (Cruciani et al., 2000) e foram submetidas a campos de interação molecular (CIM)

(Cruciani et al., 2000) para gerar descritores usando as seguintes sondas: N1 (sonda

doadora da ligação de hidrogênio–nitrogênio de amida), O (sonda aceptora de ligação


101

hidrogênio-oxigênio de carbonila), OH2 (sonda de água) e DRY (sonda hidrofóbica).

Descritores que não utilizam sondas foram gerados para criar um total de 128

descritores (Cruciani et al., 2000).

6.6.2. Modelos para o estudo de QSAR

KNIME 3.1.0 software (KNIME 3.1.0 do Konstanz Informação Miner direitos

autorais, 2003-2014, www.knime.org) (BERTHOLD et al., 2007) foi usado para

realizar todas as análises seguintes. Para a validação interna, foi empregada a validação

cruzada usando o método “leave-one-out”. Descritores foram selecionados, e um

modelo foi gerado utilizando o conjunto de treinamento e cross-validação, usando os

nós de WEKA (Hall et al., 2009). Os desempenhos internos dos modelos selecionados

foram analisados quanto à sensibilidade (taxa de verdadeiros positivos), especificidade

(verdadeira taxa negativo), e precisão (previsibilidade geral).


102

7. PREPARAÇÃO DAS AMIDAS HALOGENADAS CINÂMICAS E

DERIVADOS DE ÉTERES E ÉSTERES DA AMIDA DO ÁCIDO VANÍLICO

7.1. Preparação das amidas halogenadas cinâmicas e benzoicas

Em um balão de 100 mL, equipado com agitação magnética, o ácido orgânico (1,35

mmol, 200 mg) foi dissolvido em 2,7 mL de DMF e em 0,14 mL (1,35 mmol) de

trietilamina (Et3N). A solução foi arrefecida em um banho de gelo (0 oC). Em seguida,

1,35 mmol de 4-clorobenzamina foi adicionado. Logo depois uma solução de 1,35

mmol de BOP em 10 mL de CH2Cl2 foi adicionado ao balão. A reação foi agitada a 0 oC

durante 30 min e depois por um período adicional à temperatura ambiente durante 2

horas. Terminada a reação, o CH2Cl2 foi removido sob pressão reduzida e a solução foi

vertida em um funil de separação, contendo 10 mL de água e 10 mL de AcOEt. O

produto foi extraído com três porções de 10 ml de AcOEt (3 x 10mL). A fase orgânica

foi lavada sequencialmente com 10 mL de HCl a 1 N, água, 10 mL de NaHCO3 a 1M e

10 mL de água, seca com Na2SO4, filtrada e concentrada em rotavapor. A amida foi

purificada por cromatografia em uma coluna de gel de sílica gel, usando como fase

móvel, a mistura AcOEt:Hex em gradiente crescente de polaridade e um sistema

isocrático de AcOEt:Hex na saída do produto (FU et al. 2010).


103

7.1.1. NR1 - Amida do ácido cinâmico clorada

N-(4-clorobenzil)cinamamida

Sólido cristalino; rendimento 75% (274 mg), P.F.: 152-156 oC, IV ʋmax (KBr, cm

-1):

3253 (N-H), 3080 (C-H sp2), 1654 (C=O), 1616 e 1489 (C=C aromático), 1040

(Estiramento C-Cl), RMN de 1H (200 MHz, DMSO-d6) 7,71 (d, J=16 Hz, 1H, H-7);

7,53 (m, 2H, H-2, H-6); 7,39 (m, 3H, H-3,4,5); 7,31 (m, 4H, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’);

6,45 (d, J=16 Hz, 1H, H-8); 6,03 (sl, 1H, O=C-NH); 4,57 (d, J= 4,0Hz, H-7’); RMN

de 13

C (50 MHz, DMSO-d6) 166,0 (C=O); 141,9 (C-7); 136,9 (C-1’); 134,8 (C-1); 133,5

(C-4’); 130,0 (C-2’, C-6’); 129,4 (C-3’, C-5’) ; 129,0 (C-3, C-5, C-6); 128,0 (C-2, C-4);

120,2 (C-8); 43,3 (C-7’); (UEDA, OKADA & NAGASAWA, 2010).



(NR1).


104

Espectro 02. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)cinamamida (NR1) (CDCl3,

200 MHz).

Espectro 03. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)cinamamida

(NR1) (CDCl3, 200 MHz).


105



(CDCl3, 50 MHz).

7.1.2. NR2 - Amida do ácido cafeico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4-dihidroxifenil)acrilamida

Sólido amorfo escuro; rendimento: 70% (228 mg), P.F.: 103-105 oC, IV ʋmax (KBr, cm

-

1): 3460 e 3406 (OH) 3230 (N-H), 3018 (C-H sp

2), 1651 (C=O), 1602 e 1490 (C=C

aromático), 1089 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (CD3OD, 200 MHz): 7,55 (d, J=

15,7 Hz, 1H; H-7), 7,13 (d, J= 1,7 Hz, 1H; H-2); 7,02 (dd, J= 8,2, 1,8 Hz, 1H; H-5),

6,88 (d, J= 8,1 Hz, 1H; H-6), 6,52 (d, J= 15,7 Hz, 1H, H-8), 7,24 (m, 4H; H-2’, H-3’,

H-5’, H-6’), 4,55 (sl, 2H; H-7’). RMN de 13

C (CD3OD, 50 MHz): 169,2 (C=O); 148,8


106

(C-4); 146,7 (C-3); 142,8 (C-7); 138,9 (C-1’); 131,4 (C-4’),130,1 (C-2’, C-6’); 129,6

(C-3’; C-5’); 128,2 (C-1); 122,2 (C-6); 118,0 (C-8); 115,0 (C-2); 116,4 (C-5); 43,5 (C-

7’); (WENG et al. 2010; ANIS et al. 2002), EMAR (MALDI) calculado para

C16H14ClNNaO3 [M+Na]+: 326,0560; encontrada 326,0561.



(NR2).

Espectro 06. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4-

dihidroxifenil)acrilamida (NR2) (MeOD, 200 MHz).


107

Espectro 07. Expansão do espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4-

dihidroxifenil)acrilamida (NR2) (MeOD, 200 MHz).



(MeOD, 50 MHz).


108


C-APT de N-(4-clorobenzil)cinamamida

(NR2) (MeOD, 50 MHz).

Espectro 10. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-

clorobenzil)cinamamida (NR2).


109

7.1.3. NR3 - Amida do ácido ferúlico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Pó branco amorfo; rendimento: 81%

(273 mg), P.F.: 129-131oC, IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3414 (OH) 3275 (N-H), 3010 (C-H

sp2), 1645 (C=O), 1612 e 1460 (C=C aromático), 1039 (Estiramento C-Cl), RMN de

1H (DMSO-d6, 200 MHz): 9,44 (s, OH); 7,59 (d, J=16Hz, 1H; H-7); 7,28 (dd, J=2,0

Hz, 6,0Hz, 2H; H-2’, H-6’); 7,22 (dd, J=2,0 Hz, 6,0Hz, 2H, H-3’, H-5’) 7.13 (s, 1H;

H-2); 6,95 (d, J= 8,1 Hz;1H; H-5); 6,87 (d, J= 8,1 Hz; 1H; H-6); 6,27(d, J=16Hz, 1H;

H-8); 4,52 (d, J= 6,0 Hz); 3,90 (s, 3H); RMN de 13

C (DMSO-d6, 50 MHz): 165,5 (CO),

148,4 (C-3), 147,8 (C-4), 139,6 (C-7), 138,7 (C-1’), 131,3 (C-4’), 129,2 (C-2’, C-6’),

128,3 (C-3’, C-5’), 126,3 (C-1), 121,7 (C-6), 118,6 (C-8), 115,7 (C-5), 110,8 (C-2), 55,6

(OCH3), 41,6 (C-7’) (NOMURA et al., 2003). EMAR (MALDI) calculado para

C17H16ClNO3 [M+H]+: 318,0887; encontrada 318,0870.



hidroxi-3-metoxifenil)acrilamida (NR3).


110

Espectro 12. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3-

metoxifenil)acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 200 MHz).


3-metoxifenil)acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 200 MHz).


111


C-APT de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3-

metoxifenil) acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 50 MHz).

Espectro 15. Expsão do espectro de RMN 13


hidroxi-3-metoxifenil) acrilamida (NR3) (DMSO-d6, 50 MHz).


112


clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)acrilamida (NR3).


113

7.1.4. NR4 – Amida do ácido 4-metoxicinâmico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-metoxifenil)acrilamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Sólido cristalino; rendimento: 91%

(311 mg), P.F.: 148-150 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3282 (N-H), 3041 (C-H sp

2), 1647

(C=O), 1602 e 1462 (C=C aromático), 1029 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (200

MHz, DMSO-d6): 8,59 (t, J= 6,0 Hz, 1H, O=C-NH), 7,50 (t, J= 7,3 Hz, 2H; H-2; H-6),

7,44 – 7,18 (m, 5H; H-7, H-2’ H-3’, H-5’ H-6’), 6,97 (d, J= 8,7 Hz, 2H, H-3, H-5),

6,54 (d, J= 15,7 Hz, 1H; H-8), 4,38 (d, J= 6,0 Hz, 2H; H-7’), 3,77 (s, 3H, Me), RMN de

13C (50 MHz, DMSO-d6): 165,5(C=O); 160,4 (C-4); 139,0 (C-7); 138,7 (C-1’); 131,4

(C-4’); 129,3 (C-2; C-6, C-2’; C-6’); 128,3(C-3’, C-5’); 127,4 (C-1); 119,4 (C-8); 114,5

(C-3, C-5); 55,3 (OCH3); 41,7 (C-7’) (KIM et al. 2012), EMAR (MALDI) calculado

para C16H14ClNO2 [M+H]+: 324,0767; encontrada 324,0771.



metoxifenil)acrilamida (NR4).


114






115





clorobenzil)-3-(4-metoxifenil)acrilamida (NR4).

218.0778

326.0561284.3426182.1092 242.2960 342.0187 368.4117 449.2877

NR2 0:O16 MS Raw

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

318.0870

340.0647

177.0359 356.0314

NR3 0:K16 MS Raw

0

200

400

600

800

Inte

ns. [a

.u.]

324.0771 NR4 0:O14 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

2500

Inte

ns. [a

.u.]

200 250 300 350 400 450m/z


116

7.1.5. NR5 - Amida do ácido o-cumárico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(2-hidroxifenil)acrilamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. sólido amorfo amarelo; rendimento:

79% (277 mg), P.F.: 165-171 oC, IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3369 (OH), 3072 (C-H sp

2),

1649 (C=O), 1589 e 1458 (C=C aromático), 1093 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H

(200 MHz, DMSO-d6) 10,00 (sl, 1H, OH), 8,64 (t, 1H, J=5,83 Hz; O=C-NH), 7,78 (d,

J=15,92 Hz; 1H; H-7), 7,49-7,15 (m, 6H; H-6, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 6,91-6,76 (m,

2H; H-4, H-5), 6,73 (d, 1H, J=15,92 Hz; H-8), 4,47 (d, 2H, 5,86 Hz, H-7’); RMN de

13C (50 MHz, DMSO-d6) 165,8 (C=O) ; 156,4 (C-2); 138,8 (C-1’); 135,2 (C-4); 135,0;

130,6 (C-4’); 129,3(C-2’, C-6’); 128,4 (C-6,); 128,3 (C-3’, C-5’); 121,6 (C-1); 121,3

(C-5); 119,4 (C-8); 116,2; 41,7 (C-7’) (WANG & ZHENG, 1997 e KIM et al. 2010b).

EMAR (MALDI) calculado para C16H14ClNO2 [M+H]+: 288,0781; encontrada

288,0785.


) de o-cumaroil 4-clorobenzilamida

(NR5).


117

Espectro 23. Espectro de RMN 1H de o-cumaroil 4-clorobenzilamida (NR5) (DMSO-

d6, 200 MHz).

Espectro 24. Expansão do espectro de RMN 1H de o-cumaroil 4-clorobenzilamida

(NR5) (DMSO-d6, 200 MHz).


118


C-APT de o-cumaroil 4-clorobenzilamida (NR5)

(DMSO-d6, 50 MHz).

Espectro 26. Expansão do espectro de RMN

13C-APT de o-cumaroil 4-

clorobenzilamida (NR5) (DMSO-d6, 50 MHz).


119

Espectro 27. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de de o-cumaroil 4-

clorobenzilamida (NR5).

288.0785 NR5.2 0:P3 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

Inte

ns. [a

.u.]

310.0619

449.1162

178.1331 326.0257282.1809202.1057 463.2290243.0524

NR6.2 0:J2 MS Raw

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

310.0596

326.0295218.0735 288.0806

385.2649348.0088 413.2702172.1100 257.9983

NR7 0:O1 MS Raw

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

200 250 300 350 400 450m/z


120

7.1.6. NR6 – Amida do ácido m-cumárico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3-hidroxifenil)acrilamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Sólido cristalino amarelo;

rendimento: 76% (268 mg), P.F.: 140-143 oC, IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3460 (OH), 3075 (C-

H sp2), 1649 (C=O), 1591 e 1448 (C=C aromático), 1089 (Estiramento C-Cl). RMN de

1H (200 MHz, DMSO-d6): 9,61 (sl, 1H, OH), 8,67 (t, J= 5,9 Hz, 1H, O=C-NH), 7,47 –

7,14 (m, 6H; H-5, H-7, H-2’, H-3’, H-5’ e H-6’), 7,03 – 6,92 (m, 2H; H-4, H-6), 6,84 –

6,70 (m, 1H; H-2), 6,60 (d, J= 15,8 Hz, 1H; H-8), 4,38 (d, J= 5,9 Hz, 2H; H-7’), RMN

de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 165,1 (C=O); 157,7 (C-3); 139,4 (C-7); 138,5 (C-1’);

136,1 (C-1);131,4 (C-4’); 130,0 (C-5); 129,3 (C-2’, C-6’); 128,3 (C-3’, C-5’); 121,7 (C-

8); 118,8 (C-6); 116,8 (C-2); 113,8 (C-4); 41,7 (C-7’) (KIM et al. 2010). EMAR

(MALDI) calculado para C16H14ClNNaO2 [M+Na]+: 310.0611; encontrada 310.0619.



hidroxifenil)acrilamida (NR6).


121


hidroxifenil)acrilamida (NR6) (DMSO-d6, 200 MHz).


1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3-



122








123


clorobenzil)-3-(3-hidroxifenil)acrilamida (NR6).


124

7.1.7. NR7 - Amida do ácido p-cumárico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxifenil) acrilamida



-1): 3479 e 3369 (OH), 3072 (C-H sp

2),

1647 (C=O), 1589 e 1458 (C=C aromático), 1093 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (200

MHz, DMSO-d6): 9,87 (sl, 1H, OH); 8,53 (t, J=5,87 Hz, 1H, O=C-NH ); 7,38 (m, 5H,

H-2, H-6, H-7, H-2’, H-6’); 7,28 (m, 3H; H-2; H-3’e H-5’); 6,77 (d, J=8,5 Hz, 2H; H-3

e H-5); 6,44 (d, J=15,73 Hz, 1H; H-8); 4,36 (d, J= 6,0 Hz, 2H; H-7’) ; RMN de 13

C (50

MHz, DMSO-d6) 165,6 (C=O); 159,0 (C-4); 139,4 (C-7); 138,8 (C-1’); 131,4 (C-4’);

129,4 (C-2, C-6); 129,3 (C-2’, C-6’); 128,3 (C-3’, C-5’); 125,9 (C-1); 118,3 (C-8);

115,8 (C-3, C-5); 41,6 (C-7’) (LÓPEZ-GRESA et al. 2011), EMAR (MALDI)

calculado para C16H14ClNNaO2 [M+Na]+: 310,0611; encontrada 310,0596.



hidroxifenil) acrilamida (NR7).


125

Espectro 35. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxifenil)

acrilamida (NR7) (DMSO-d6, 200 MHz).


hidroxifenil) acrilamida (NR7) (DMSO-d6, 200 MHz).


126


C-APT de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxifenil)




hidroxifenil) acrilamida (NR7) (DMSO-d6, 50 MHz).


127


clorobenzil)-3-(4-hidroxifenil) acrilamida (NR7).

288.0785 NR5.2 0:P3 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

Inte

ns. [a

.u.]

310.0619

449.1162

178.1331 326.0257282.1809202.1057 463.2290243.0524

NR6.2 0:J2 MS Raw

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

310.0596

326.0295218.0735 288.0806

385.2649348.0088 413.2702172.1100 257.9983

NR7 0:O1 MS Raw

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

200 250 300 350 400 450m/z


128

7.1.8. NR8 - Amida do ácido clorocinâmico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-clorofenil)acrilamida



-1): 3414 (N-H), 3041 (C-H sp

2), 1651

(C=O), 1614 e 1487 (C=C aromático), 1089 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (DMSO-

d6, 200 MHz,) 8.70 (t, J= 6.0 Hz, 1H, O=C-NH), 7.64 – 7.46 (m, 4H, H-2’, H-3’, H-5’,

H-6’), 7.45 – 7.25 (m, 5H; H-2, H-6, H-3, H-5, H-7), 6.69 (d, J= 15.8 Hz, 1H; H-8),

4.39 (d, J= 6.0 Hz, 2H). RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6) 164.9 (C=O); 138.5 (C-1’);

137.9 (C-7); 134.0 (C-4); 133.8 (C-1); 131.5 (C-4’); 129.3 (C-2, C-6, C-2’ e C-6’);

129.0 (C-3, C-5); 128.3 (C-3’, C-5’);122.7 (C-8); 41.7 (C-7’) (FOO, OISHI & SAITO,

2012). EMAR (MALDI) calculado para C16H13Cl2NNaO [M+Na]+: 328.0272;

encontrada 328.0273.

Espectro 40 Espectro de Infravermelho (KBr, cm-1


clorofenil)acrilamida (NR8).


129

Espectro 41. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-clorofenil)acrilamida



clorofenil)acrilamida (NR8) (DMSO-d6, 200 MHz).


130








131


clorobenzil)-3-(4-clorofenil)acrilamida (NR8).


132

7.1.9. NR9 - Amida do ácido sinápico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)acrilamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Sólido amorfo amarelo; rendimento:

60% (193 mg), P.F.: 182-185 oC, IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3414 (O-H) e 3358 ou N-H),

3000 (C-H sp2), 1658 (C=O), 1624 e 1458 (C=C aromático), 1091 (Estiramento C-Cl).

RMN de 1H (DMSO-d6, 200 MHz) 8,52 (t, J= 6Hz; 1H, O=C-NH), 7,28-7,48 (m, 5H;

H-7, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 6,86 (s, 2H; H-2, H-6), 6,55 (d, J= 15,8, 1H; H-8), 4,37

(d, J=6 Hz, 2H; H-7’) 3,79 (s, 6H; OCH3); RMN de 13

C (DMSO-d6, 50 MHz) 165,6

(C=O); 148,1 (C-3, C-5); 140,0 (C-7) 138,7 (C-4); 137,4 (C-1’); 131,4 ; C-4’); 129,2

(C-2’, C-6’); 128,4 (C-3’, C-5’); 125,3 (C-1); 119,1 (C-8); 105,3 (C-2, C-6); 56,0

(OCH3); 41,7 (C-7’) (LIANG et al., 2006), EMAR (MALDI) calculado para




hidroxi-3,5-dimetoxifenil)acrilamida (NR9).


133

Espectro 47. Espectro de RMN

1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-3,5-

dimetoxifenil)acrilamida (NR9) (DMSO-d6, 200 MHz).


1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(4-hidroxi-

3,5-dimetoxifenil)acrilamida (NR9) (DMSO-d6, 200 MHz).


134








135

Espectro 35. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI (E)-N-(4-clorobenzil)-3-

(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)acrilamida (NR9).

7.1.10. NR10 - Amida do ácido 2-trans-cinâmico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(2-nitrofenil)acrilamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Sólido cristalino branco;

rendimento: 79% (260 mg), P.F.: 164-167 oC, IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3290 (N-H), 3030

(C-H sp2), 1651 (C=O), 1624 e 1458 (C=C aromático), 1525 e 1342 (CAr-NO), 1091

(Estiramento C-Cl). RMN de 1H (200 MHz, DMSO-d6): 8,82 (t, J= 4,7 Hz, 1H, O=C-

NH), 8,05 (d, J= 8,0 Hz, 1H; H-3), 7,78-7,75 (m, 2H; H-6, H-7), 7,72 – 7,57 (m, 2H; H-

4, H-5), 7,40 (m, 4H, H-2’, H-3’, H-5’ e H-6’), 6,67 (d, J= 5,6 Hz, 1H; H-8), 4,39 (d,

J= 5,9 Hz, 1H; H-7’), RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 164,3 (C=O); 148,4 (C-2);

138,3 (C-1’); 134,3 (C-7); 133,9 (C-5); 131,6 (C-4’); 130,4 (C-4); 130,0 (C-1); 129,4

(C-2’, C-6’); 128,8 (C-6); 128,4(C-3’, C-5’); 126,6 (C-3); 124,7 (C-8); 41,8 (C-7’)

(GARG & MILTON, 2013), EMAR (MALDI) calculado para C16H13ClN2O3 [M+H]+:

317,0683; encontrada 317,0683,


136



nitrofenil)acrilamida (NR10).

Espectro 52. Espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(2-nitrofenil)acrilamida

(NR10) (DMSO-d6, 200 MHz).


137


13C-APT (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(2-

nitrofenil)acrilamida (NR10) (DMSO-d6, 50 MHz).





138





clorobenzil)-3-(2-nitrofenil)acrilamida (NR10).

328.0273 NR8 0:L9 MS Raw

0

500

1000

1500

Inte

ns. [a

.u.]

370.0813 NR9 0:O7 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [a

.u.]

339.0431

355.0078

411.2464

284.3395317.0683271.1132 371.1522 419.2358385.1598 401.1172299.1471

362.0280

NR10 0:O3 MS Raw

0

1

2

3

4

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

260 280 300 320 340 360 380 400 420m/z


139

7.1.11. NR11 - Amida do ácido trimetoxicinâmico clorada

(E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)acrilamida



-1): 3290 (N-H), 3070 (C-H sp

2), 1651


MHz, DMSO-d6): 8,60 (t, J= 5,9 Hz, 1H; O=C-NH), 7,37 (m, 5H; H-7, H-2’, H-3’, H-

5’, H-6’), 6,90 (s, 2H; H-2, H-6), 6,64 (d, J= 15,7 Hz, 1H; H-8), 4,38 (d, J= 5,9 Hz, 1H;

H-7’), 3,80 (s, 6H; m-OMe), 3,68 (s, 3H; p-OMe) RMN de 13

C (DMSO-d6,50 MHz)

165,2 (C=O); 153,1 (C-3, C-5); 139,4 (C-7); 138,7 (C-4); 138,6 (C-1’); 131,4 (C-4’);

130,5 (C-1); 129,2 (C-2’, C-6’); 128,4 (C-3’, C-5’); 121,3 (C-8); 105,1 (C-2, C-6); 60,2

(C-4-OMe); 55,9 (C-3,5-OMe); 41,7 (C-7’) (JUNG et al. 2010), EMAR (MALDI)

calculado para C19H20ClNO4 [M+H]+: 384,0979; encontrada 384,0913.


) de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-

trimetoxifenil)acrilamida (NR11)


140


1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)


Espectro 59. Expansão do espectro de RMN 1H de (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-

trimetoxifenil) acrilamida (NR11) (DMSO-d6, 200 MHz).


141


C-APT (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)



C-APT (E)-N-(4-clorobenzil)-3-(3,4,5-

trimetoxifenil) acrilamida (NR11) (DMSO-d6, 50 MHz).


142


clorobenzil)-3-(3,4,5-trimetoxifenil) acrilamida (NR11)

7.1.12. NR12 – Amida do ácido benzóico clorada

N-(4-clorobenzil)benzamida



-1): 3300 (N-H), 3082 (C-H sp

2), 1637


MHz, DMSO-d6): 9,10 (t, J= 5,9 Hz, 1H, O=C-NH), 7,89 (dd, J= 8,0 e 1,6 Hz, 2H; H-

2, H-6), 7,64 – 7,09 (m, 7H; H-3, H-4, H-5, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 4,46 (d, J= 6,0 Hz,

2H; H-7’); RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 166,4 (C=O); 138,8 (C-1’); 134,2 (C-1);

131,4 (C-4); 131,3 (C-2’, C-6’); 129,1 (C-3’, C-5’); 128,3 (C-3 C-5); 127,3 (C-2, C-6);

42,1 (C-7’) (WU et al., 2014).


143


) N-(4-clorobenzil) benzamida

(NR12).

Espectro 64. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil) benzamida (NR12) (DMSO-d6,

200 MHz).


144


1H de N-(4-clorobenzil) benzamida

(NR12) (DMSO-d6, 200 MHz).

Espectro 66. Expansspectro de RMN 13

C-APT de N-(4-clorobenzil) benzamida (NR12)

(DMSO-d6, 50 MHz).


145


C-APT de N-(4-clorobenzil) benzamida


7.1.13. NR13- Amida do ácido 4-bifenilcarboxílico clorada

N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-4-carboxamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Sólido amorfo amarelo;

Rendimento: 21% (73 mg), P.F.: 96-100 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3400 (O-H), 3400 (N-

H), 3000 (C-H sp2), 1614 (C=O), 1589 e 1494 (C=C aromático), 1043 (Estiramento C-

Cl). RMN de 1H (MeOD, 200 MHz): 8,12 (s, 1H; O=C-NH), 7,53 – 7,15 (m, 4H, H-2’,

H-3’, H-5’, H-6), 6,85 (s, 2H; H-2, H-6), 4,58 (s, 2H, H-7’), 4,46 (s, 2H; m-OH), 4,35

(s, 1H, p-OH), RMN de 13

C (MeOD, 50 MHz):170,5 (C=O), 146,7 (C-3, C-5), 139,4

(C-4), 136,1 (C-1), 134,2 (C-4), 130,5 (C-5’, C-6’), 130,1 (C-3’, C-5’), 125,9 (C-1),


146

107,8 (C-2, C-6), 43,6 (C-7’) (YANG, DUAN & LI, 2006), EMAR (MALDI) calculado

para C16H12ClNNaO3 [M+Na]+: 316,0353; encontrada 316,0373.


) de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-

4-carboxamida (NR13).

Espectro 69. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-4-carboxamida

(NR13) (DMSO-d6, 200 MHz).


147

Espectro 70. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-4-

carboxamida (NR13) (DMSO-d6, 200 MHz).


C-APT de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-bifenil]-4-

carboxamida (NR13) (DMSO-d6, 50 MHz).


148


C-APT de N-(4-clorobenzil)-[1,1'-

bifenil]-4-carboxamida (NR13) (DMSO-d6, 50 MHz).

Espectro 73. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI N-(4-clorobenzil)-[1,1'-

bifenil]-4-carboxamida (NR13).


149

7.1.14. NR14 – Amida do ácido gálico clorada

N-(4-chlorobenzyl)-3,4,5-triidroxibenzamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. sólido amorfo amarelo;


-1): 3400 (O-H), 3400 (N-

H), 3000 (C-H sp2), 1614 (C=O), 1589 e 1494 (C=C aromático), 1043 (Estiramento C-

Cl). RMN de 1H (200 MHz, DMSO-d6): 8,15 (s, 1H), 7,44 – 6,88 (m, 4H, H-2’, H-3’,

H-5’, H-6), 6,88 (s, 2H; H-2, H-6), 4,62 (s, 2H, H-7’), 4,49 (s, 2H; C3,5-OH), 4,38 (s,

1H, C4-OH). RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 170,5 (C=O), 146,7 (C-3, C-5), 139,4

(C-4), 136,1 (C-1), 134,2 (C-4), 130,5 (C-5’, C-6’), 130,1 (C-3’, C-5’), 125,9 (C-1),

107,8 (C-2, C-6), 43,6 (C-7’) (YANG, DUAN & LI, 2006), EMAR (MALDI) calculado



) de N-(4-clorobenzil)-3,4,5-

triidroxibenzamida (NR14).


150

Espectro 75. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3,4,5-triidroxibenzamida

(NR14) (MeOD, 200 MHz).



triidroxibenzamida (NR14) (MeOD, 50 MHz).


151


13C-APT de N-(4-chlorobenzyl)-3,4,5-

triidroxibenzamida (NR14) (MeOD, 50 MHz).

Espectro 78. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-chlorobenzyl)-

3,4,5-triidroxibenzamida (NR14).


152

7.1.15. NR15 – Amida do ácido vanílico clorada

N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3-metoxibenzamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Sólido amorfo branco; Rendimento:

44% (151 mg), P.F.: 75-77 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3319 (O-H) 3251 (N-H), 3000 (C-H

sp2), 1639 (C=O), 1589 e 1487 (C=C aromático), 1091 (Estiramento C-Cl). RMN de

1H

(200 MHz, DMSO-d6): 8,12 (d, J= 9,2 Hz, 1H; O=C-NH), 7,56 – 7,22 (m, 7H; H-2, H-

4, H-6, H-3’, H-5’, H-2’, H-6’), 4,52 (s, 2H), 3,88 (s, 1H; OMe), RMN de 13

C (50 MHz,

DMSO-d6): 169,8 (C=O); 151,3 (C-3); 148,8 (C-4); 139,3 (C-1’); 133,8 (C-4’); 130,1

(C-2’, C-6’); 129,5 (C-5’, C-3’); 126,5 (C-1); 122,1 (C-5); 115,8 (C-6); 111,9 (C-2);

56,4 (3-OMe); 43,8 (C-7’) (KIM, KIM & RHEE, 2004), EMAR (MALDI) calculado

para C16H16ClNO4 [M+Na]+: 316,0530; encontrada 316,0543.



metoxibenzamida (NR15).


153


1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3-metoxibenzamida

(NR15) (DMSO-d6, 200 MHz).


metoxibenzamida (NR15) (DMSO-d6, 200 MHz).


154


13C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3-






155


hidroxi-3-metoxibenzamida (NR15).


156

7.1.16. NR16 – Amida do ácido siríngico clorada

N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1. Sólido branco amorfo; rendimento:


-1): 3493(O-H), 3277 (N-H), 3084

(C-H sp2), 1666 (C=O), 1597 e 1492 (C=C aromático), 1016 (Estiramento C-Cl). RMN

de 1H (200 MHz, MeOD): 8,15 (s, 1H, O=C-NH), 7,43 (s, 1H, OH), 7,35 – 7,27 (m, 4H;

H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 7,25 – 7,15 (m, 2H; H-2, H-6), 4,54 (s, 2H, H-7’), 3,88 (s, 6H;

OCH3), RMN de 13

C (50 MHz, MeOD): 169,8 (C=O), 149,0 (C-3, C-5), 139,3 (C-4),

133,8 (C-1’), 130,1 (C-2’, C-6’), 129,5 (C-3’, C-5’), 125,3 (C-4’), 106,4 (C-1), 106,0

(C-2, C-6), 56,8 (OCH3), 43,9 (C-7’) (BAO et al., 2009), EMAR (MALDI) calculado



) de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-

3,5-dimetoxibenzamida (NR16).


157


1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3,5-

dimetoxibenzamida (NR16) (DMSO-d6, 200 MHz).

Espectro 87. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3,5-



158


C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-3,5-



13C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxi-

3,5-dimetoxibenzamida (NR16) (DMSO-d6, 50 MHz).


159


hidroxi-3,5-dimetoxibenzamida (NR16).

316.0373 NR14 0:I4 MS Raw

0

50

100

150

200

Inte

ns. [a

.u.]

316.0543

NR15 0:K10 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Inte

ns. [a

.u.]

346.0666

NR16.2 0:P18 MS Raw

0

200

400

600

800

Inte

ns. [a

.u.]

200 250 300 350 400 450m/z


160

7.1.17. NR17 – Amida do ácido 4-hidroxibenzóico clorada

N-(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida



-1): 3450 (O-H), 3122 (N-H), 3055

(C-H sp2), 1631 (C=O), 1593 e 1440 (C=C aromático), 1085 (Estiramento C-Cl). RMN

de 1H (200 MHz, DMSO-d6): 8.83 (t, J= 5.9 Hz, 1H; O=C-NH), 7.75 (d, J= 8.6 Hz,

2H, H-2, H-6), 6.80 (d, J= 8.8 Hz, 2H, H-3, H-5), 7.59 – 7.43 (m, 4H, H-2’ ; H-3’, H-5 ,

H-6’), 4.42 (d, J= 6.0 Hz, 2H), RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 166,1 (C=O); 160,3

(C-4); 139,2 (C-1’); 133,4 (C-4’); 130,9 (C-2, C-6); 129,3 (C-2’, C-6’); 128,3 (C-3’, C-

5’); 124,9 (C-1); 114,9 (C-3, C-5); 41,7 (C-7’) (YU et al. 2006). EMAR (MALDI)




hidroxibenzamida (NR17).


161

Espectro 92. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida (NR17)

(DMSO-d6, 200 MHz).

Espectro 93. Expasão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-

hidroxibenzamida (NR17) (DMSO-d6, 200 MHz).


162


C -APT de N-(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida



C -APT de N-(4-clorobenzil)-4-



163


hidroxibenzamida (NR17).


164

7.1.18. NR18 – Amida do ácido 3,5-di-tert-butil-4-hidroxibenzóico clorada

3,5-di-tert-butil-N-(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida



-1): 3450 (O-H) e 3236 (N-H), 3066

(C-H sp2), 1680 (C=O), 1544 e 1431 (C=C aromático), 1012 (Estiramento C-Cl).

RMN de 1H (200 MHz, DMSO-d6): 8.89 (t, J= 6.0 Hz, 1H; O=C-NH), 6.09 – 5.94 (m,

1H), 7.87 – 7.54 (m, 2H, H-2, H-6), 7.54 - 7.20 (m, 4H, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 4.42

(d, J= 5.9 Hz, 3H), 3.42 (s, 18H). RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 167.0 (C=O);

156.9 (C-4); 140.0 (C-1’); 138.3 (C-3, C-5); 131.2 (C-4’); 129.2 (C-2’, C-6’); 128.3 (C-

5’, C-3’); 125.3 (C-1); 124.2 (C-2, C-6); 42.0 (C-7’); 34.7 (3,5-(C(CH3)3 ; 30.3 (3,5-

(C(CH3)3)(SDBS, 2015). EMAR (MALDI) calculado para C22H28ClNO3 [M+H]+:

374,1877; encontrada 374,1877.


) de 3,5-di-tert-butil-N-(4-

clorobenzil)-4-hidroxibenzamida (NR18).


165






166


C-APT de 3,5-di-tert-butil-N-(4-clorobenzil)-4-


Espectro 101. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de 3,5-di-tert-butil-N-

(4-clorobenzil)-4-hidroxibenzamida (NR18).


167

7.1.19. NR19 - Amida do ácido 2-hidroxi-5-metoxibenzóico clorada

N-(4-clorobenzil)-2-hidroxi-5-metoxibenzamida



-1): 3360 (O-H e N-H), 3076 (C-H sp

2),

1651 (C=O), 1598 e 1435 (C=C aromático), 1045 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (200

MHz, DMSO-d6): 9,35 (t, J= 5,8 Hz, 1H, O=C-NH), 7,48 – 7,26 (m, 5H, H-6, H-2’, H-

3’, H-5’, H-6’), 7,04 (dd, J= 9,0, 3,0 Hz, 1H; H-3), 6,85 (d, J= 9,0 Hz, 1H; H-4), 4,49

(d, J= 5,9 Hz, 2H, H-7’), 3,72 (s, 3H; OCH3), RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 168,7

(C=O); 154,0 (C-5); 151,7 (C-2); 115,2 (C-1); 138,2 (C-1’); 131,6 (C-4’); 129,3; C-2’,

C-6’);, 128,5 (C-5’, C-3’); 121,2 (C-3); 118,4 (C-4); 111,3 (C-6); ; 55,8 (O-Me); 41,9

(C-7’) (LEGRAND, 2004), EMAR (MALDI) calculado para C15H14ClNO3 [M+H]+:

327,0512; encontrada 327,0516.



metoxibenzamida (NR19).


168


(NR19) (DMSO-d6, 200 MHz).




169








170



7.1.20. NR20 – Amida do ácido 3-metil-4-nitrobenzóico clorada

N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-nitrobenzamida



-1): 3278 (N-H), 3080 (C-H sp

2), 1637

(C=O), 1587 e 1423 (C=C aromático), 1521 e 1355 (CAr-NO), 1089 (Estiramento C-

Cl). RMN de 1H (200 MHz, DMSO-d6): 9,31 (t, J= 5.8 Hz, 1H, O=C-NH ), 8,06 (dd,

J= 8.4, 1.9 Hz, 1H; H-5), 7.96 (s, 1H, H-2), 7,89 (dd, J= 8.4, 1.7 Hz, 1H; H-6), 7,42-

7,31 (m, 4H, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 4,47 (dd, J= 5.9, 1.7 Hz, 2H, H-7’), 2,54 (d, J=

1.9 Hz, 3H; CH3). RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 164.8 (C=O); 150,5 (C-4); 138.3

(C-1); 138,1 (C-1’); 132,9 (C-4’); 131,8 (C-2’, C-6’); 131,5 (C-3); 129,3 (C-3’, C-5’);

128.4 (C-2); 126,2 (C-5); 124,6 (C-6); 42,3 (C-7’); 19,5 (CH3) (WANG et al., 2012).

EMAR (MALDI) calculado para C15H13ClN2NaO3 [M+Na]+: 327,0512; encontrada

327,0516.

286.0432 NR17 0:L2 MS Raw

0

2000

4000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

374.1877

NR18 0:P9 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

Inte

ns. [a

.u.]

292.0746314.0509

330.0158357.1295 387.1026197.0736

NR19 0:J5 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns. [a

.u.]

200 250 300 350 400 450m/z


171


) de N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-

nitrobenzamida (NR20).

Espectro 109. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-nitrobenzamida

(NR20) (DMSO-d6, 200 MHz).


172

Espectro 110. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metil-4-

nitrobenzamida (NR20) (DMSO-d6, 200 MHz).





173





metil-4-nitrobenzamida (NR20).


174

7.1.21. NR21 – amida do ácido vanílico fluorada

N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-3-methoxibenzamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1, sendo usado a 4-fluorbenzilamina

como reagente. Sólido branco amorfo; rendimento: 21% (90 mg), P.F.: 161-165 oC. IV

ʋmax (KBr, cm-1

): 3304 (O-H), 3078 (N-H), 1631 (C=O), 1593 e 1423 (C=C aromático),

1116 (Estiramento C-F). RMN de 1H (200 MHz, DMSO-d6): 9,60 (s, 1H; OH), 8,83 (t,

J= 5,8 Hz, 1H; NH), 7,52 – 7,28 (m, 4H; H-2, H-6, H-2’, H-6’), 7,22 –7,05 (m, 2H; H-

3’, H-5’), 6,81 (d, J= 8,2 Hz, 1H; H-5), 4,43 (d, J= 5,8 Hz, 2H; H-7’), 3,80 (s, 3H;

OMe), RMN de 13

C (50 MHz, DMSO-d6): 166,0 (CO), 161,2 (d, J= 242,0 Hz; C-4’),

149,6 (C-4), 147,2 (C-3), 136,2 (C-1’), 129,2 (C-2’, C-6’), 125,3 (C-1), , 120,9 (C-6),

114,9 (C-3’, C-5’), 115,2 (C-5), 111,3 (C-2), 55,7 (OMe), 42,0 (C-7’), (KIM et al.,

2004), EMAR (MALDI) calculado para C15H14FNNaO3 [M+Na]+: 298,0855;

encontrada 298,0882.

Espectro 114. Espectro de Infravermelho (KBr, cm

-1) de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-

3-metoxibenzamida (NR21).


175


1H de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-3-


Espectro 116. Expansão de espectro de RMN 1H de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-3-



176


C-APT de N-(4-fluorobenzil)-4-hidroxi-3-


Espectro 118. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-fluorobenzil)-

4-hidroxi-3-metoxibenzamida (NR21).


177

7.1.22. NR22 – amida do ácido vanílico bromada

N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-3-metoxibenzamida

O produto foi preparado conforme procedimento 1, sendo usado a 4-bromobenzilamina

como reagente. Sólido vermelho amorfo; rendimento: 63% (252 mg), P.F.: 119-122 oC.

IV ʋmax (KBr, cm-1

): 3304 (O-H), 3078 (N-H), 3003 (C-H sp2), 1631 (C=O), 1593 e

1423 (C=C aromático), 1072 (Estiramento C-Br). RMN de 1H (CDCl3, 200 MHz): 9,60

(s, 1H; OH), 8,83 (t, J= 5,8 Hz, 1H; NH), 7,52 – 7,28 (m, 4H; H-2, H-6, H-2’, H-6’),

7,22 –7,05 (m, 2H; H-3’, H-5’), 6,81 (d, J= 8,2 Hz, 1H; H-5), 4,43 (d, J= 5,8 Hz, 2H;

H-7’), 3,80 (s, 3H; OMe), RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz): 167.1 (CO), 148.9 (C-4),

146.7 (C-3), 137.4 (C-1’), 131.7 (C-3’, C-5’),129.4 (C-2’, C-6’), 126.1 (C-1), 119.8 (C-6,

C-4’), 113.9 (C-5), 110.4 (C-2), 56.0 (OMe), 43.4 (C-7’), (KIM et al., 2004), EMAR

(MALDI) calculado para C15H14BrNNaO3 [M]+: 335,0157; encontrada 335,0156.


) de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-

3-metoxibenzamida (NR22).


178

Espectro 120. Espectro de RMN 1H de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-3-

metoxibenzamida (NR22) (CDCl3, 200 MHz).

Espectro 121. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-3-



179


C-APT de N-(4-bromobenzil)-4-hidroxi-3-



C-APT de N-(4-bromobenzil)-4-

hidroxi-3-metoxibenzamida (NR22) (CDCl3, 50 MHz).


180

Espectro 124. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de N-(4-bromobenzil)-

4-hidroxi-3-metoxibenzamida (NR22).

7.2. PREPARAÇÃO DOS DERIVADOS ÉSTERES DA AMIDA DO ÁCIDO

VANÍLICO

7.2.1. AR1 - Benzoato da amida do ácido vanílico

Em um balão de 100 mL, equipado com agitação magnética, adicionou-se a uma

solução aquosa de hidróxido de sódio a 10% (0,51 mL, 0,1275 mmols de NaOH) 0,100

g da amida NR15 (0,3400 mmol). Em seguida, foi adicionado, gota a gota, o cloreto de

benzoíla (0,04mL, 0,343 mmols). A reação foi submetida à agitação constante durante

um período de uma hora a temperatura ambiente. Depois, a mistura reacional foi

colocada em um funil de separação e fez-se a extração com diclorometano (3x15 mL),

tratou-se a fase orgânica com carbonato de sódio (Na2CO3) a 5% ( 2 x 5 mL), secou-se

com anidro sulfato de sódio. Após a filtração, a solução foi concentrada sob pressão

reduzida (SADEGHIAN et al. 2008). O produto foi purificado por cromatografia em

uma coluna de vidro, contendo sílica gel como fase estácionária e usando como fase

284.3375

327.0516

NR20 0:J3 MS Raw

0

1000

2000

3000

Inte

ns. [a

.u.]

298.0882

276.1033314.0488

NR21 0:K3 MS Raw

0

200

400

600

Inte

ns. [a

.u.]

335.0126 NR22 0:O10 MS Raw

0

200

400

600

800

1000

1200

Inte

ns. [a

.u.]

200 250 300 350 400 450m/z


181

móvel, a mistura AcOEt:Hex em gradiente crescente de polaridade. Após a aplicação de

100 mL de fase móvel, o produto foi retirado da coluna por um sistema isocrático de

AcOEt:Hex (65:35) com a finalidade de melhor purificação do produto que se

apresentou como um sólido cristalino, rendimento: 76% (103 mg), P.F.: 122-125 oC. IV

ʋmax (KBr, cm-1

): 3334 (N-H), 3000 (C-H sp2), 1734 e 1637 (C=O), 1607 e 1425 (C=C

aromático), 1089 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (CDCl3, 200 MHz): 9,20 (t, J= 5,9

Hz, 1H, NH), 8,13 (d, J= 7,1 Hz, 2H, H-2’’, H-6’’), 7,84 – 7,20 (m, 10H; H-2, H-5, H-

6, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’, H-3’’, H-4’’, H-5’’), 4,50 (d, J= 5,8 Hz, 2H; H-7’), 3,83 (s,

J= 6,0 Hz, 3H; OMe); RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz): 165,5 (O=C-O), 163,9 (O=C-

N), 150,8 (C-3), 141,7 (C-4), 138,7 (C-1’), 134,3 (C-2’, C-6’), 133,2 (C-1), 131,4 (C-

4’), 129,9 (C-2’’, C-4’’, C-6’’), 129,2 (C-3’’, C-5’’), 128,3 (C-1’’), 128,4 (C-3’, C-5’),

123,0 (C-5), 120,0 (C-6), 111,8 (C-2), 56,0 (OMe) , 42,2 (C-7’), (DE MORAIS et al.,

2014), EMAR (MALDI) calculado para C22H18ClNNaO4 [M+Na]+: 418,0822;



) de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-

2-metoxifenil (AR1).


182

Espectro 126. Espectro de RMN 1H de Benzoato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 200 MHz).

Espectro 127. Expansão do espectro de RMN 1H de Benzoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 200 MHz).


183


C-APT Benzoato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 50 MHz).


C-APT Benzoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenila (AR1) (DMSO-d6, 50 MHz).


184


clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR1).

7.2.2. AR2 – Fenilacetato da amida do ácido vanílico




fenilacetila (0,05mL, 0,343 mmols). A reação foi submetida à agitação constante

durante um período de duas horas a temperatura ambiente. Depois, a mistura reacional

foi colocada em um funil de separação e fez-se a extração com diclorometano (3x15

mL), tratou-se a fase orgânica com carbonato de sódio (Na2CO3) a 5% ( 2 x 5 mL),

secou-se com anidro sulfato de sódio. Após a filtração, a solução foi concentrada sob

pressão reduzida (SADEGHIAN et al. 2008). O produto foi purificado por

cromatografia em uma coluna de vidro, contendo sílica gel como fase estácionária e

usando como fase móvel, a mistura AcOEt:Hex em gradiente crescente de polaridade.

Após a aplicação de 100 mL de fase móvel, o produto foi retirado da coluna por um

sistema isocrático de AcOEt:Hex (65:35) com a finalidade de melhor purificação do

produto quese apresentou como sólido cristalino; rendimento: 78% (110mg), P.F.: 141-

145 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3331 (N-H), 3050 (C-H sp

2), 1761 e 1633 (C=O), 1602 e

1456 (C=C aromático), 1033 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (200 MHz, CDCl3): 9,12


185

(t, J= 5,9 Hz, 1H; NH), 7,61 (d, J= 1,7 Hz, 1H; H-2), 7,52 (dd, J= 8,2, 1,8 Hz, 1H; H-

6), 7,43 – 7,26 (m, 10H; H-2’, H-3’, H-5’, H-6’, H-2’’, H-3’’, H-4’’, H-5’’, H-6’’), 7,20

(d, J= 8,2 Hz, 1H; H-5), 4,47 (d, J= 5,9 Hz, 2H; H-7’), 3,98 (s, 2H, CH2-C6H5), 3,80 (s,

3H; OMe), RMN de 13

C (50 MHz, CDCl3): 169,3 (O=C-O), 165,5 (O=C-N), 150,7 (C-

3), 141,7 (C-4), 138,7 (C-1’), 133,8 (C-1’’), 133,0 (C-4’), 131,4 (C-1), 129,5 (C-2’, C-

6’), 129,1 (C-2’’, C-6’’), 128,5 (C-3’’, C-5’’), 128,3 (C-4’’), 127,1 (C-3’, C-5’), 122,7

(C-5), 119,9 (C-6), 111,8 (C-2), 56,0 (OMe), 42,1 (C-7’), 39,8 (CH2-C6H5) (D'AVILA

et al., 2014), EMAR (MALDI) calculado para C23H20ClNNaO4 [M+Na]+: 432,0979;



) de 2-fenilacetato de 4-((4-



186

Espectro 132. Espectro de RMN 1H de 2-fenilacetato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-

2-metoxifenil (AR2) (DMSO-d6, 200 MHz).

Espectro 133. Expansão do espectro de RMN 1H de 2-fenilacetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR2) (DMSO-d6, 200 MHz).


187








188

Espectro 136. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de 2-fenilacetato de 4-

((4-clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR2).

7.2.3. AR3 – Valeroato da amida do ácido vanílico




vareloíla (0,05mL, 0,343 mmols). A reação foi submetida à agitação constante durante

um período de cinco horas a temperatura ambiente. Depois, a mistura reacional foi

colocada em um funil de separação e fez-se a extração com diclorometano (3x15 mL),

tratou-se a fase orgânica com carbonato de sódio (Na2CO3) a 5% ( 2 x 5 mL), secou-se

com anidro sulfato de sódio. Após a filtração, a solução foi concentrada sob pressão

reduzida (SADEGHIAN et al. 2008). O produto foi purificado por cromatografia em

uma coluna de vidro, contendo sílica gel como fase estácionária e usando como fase

móvel, a mistura AcOEt:Hex em gradiente crescente de polaridade. Após a aplicação de

100 mL de fase móvel, o produto foi retirado da coluna por um sistema isocrático de

AcOEt:Hex (65:35) com a finalidade de melhor purificação do produto que se

apresentou como sólido amorfo branco; rendimento: 43% (55 mg), P.F.: 97-100 oC. IV


189

ʋmax (KBr, cm-1

): 3253 (N-H), 3088 (C-H sp2), 1761 e 1631 (C=O), 1602 e 1450 (C=C

aromático), 1031 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (CDCl3, 200 MHz): 7,44 (s, 1H; H-

2); 7,31 – 7,15 (m, 5H; H-6, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 6,96 (d, J= 8,2 Hz, 1H; H-5), 6,79

(t, J= 5,5 Hz, 1H; NH), 4,49 (d, J= 5,8 Hz, 2H; H-7’), 3,78 (s, 3H; OMe), 2,56 (t, J=

7,4 Hz, 2H; H-1’’), 1,71 (quint, J= 7,7 Hz, 2H; H-2’’), 1,42 (sex, J= 7,3 Hz, 2H; H-

3’’), 0,94 (t, J= 7,2 Hz, 3H; Me), RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz): 171,7 (O=C-O),

166,6 (O=C-N), 151,3 (C-3), 142,4 (C-4), 136,7 (C-1’), 133,2 (C-1), 132,8 (C-4’), 129,1

(C-2’, C-6’), 128,7 (C-3’, C-5’), 122,6 (C-5), 118,7 (C-6), 111,8 (C-2), 55,9 (OMe),

43,3 (C-7’), 33,7 (C-1’’), 26,9 (C-2’’), 22,1 (C-3’’), 13,7 (Me) (D'AVILA et al., 2014),

EMAR (MALDI) calculado para C20H22ClNNaO4 [M+Na]+: 398,1135; encontrada

398,1118.


) de Pentanoato de 4-((4-



190

Espectro 138. Espectro de RMN 1H de Pentanoato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenil (AR3) (CDCl3, 200 MHz).

Espectro 139. Expansão do espectro de RMN 1H de Pentanoato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AR3) (CDCl3, 200 MHz).


191


C-APT de Pentanoato de 4-((4-


Espectro 141. Espectro de massa de alta resolução tipo MALDI de Pentanoato de 4-((4-


418.0809 AR1 0:L5 MS Raw

0

500

1000

1500

2000

Inte

ns. [a

.u.]

432.0914

AR2.2 0:M1 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Inte

ns. [a

.u.]

398.1118

80.8318

96.8287

595.2009

AR3 0:P5 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [a

.u.]

0 200 400 600 800 1000 1200 1400m/z


192

7.2.4. AR4 – 3-Bromobenzoato da amida do ácido vanílico




3-bromobenzoíla (0,05mL, 0,343 mmols). A reação foi submetida à agitação constante

durante um período de uma hora a temperatura ambiente. Depois, a mistura reacional

foi colocada em um funil de separação e fez-se a extração com diclorometano (3x15

mL), tratou-se a fase orgânica com carbonato de sódio (Na2CO3) a 5% (2 x 5 mL),

secou-se com anidro sulfato de sódio. Após a filtração, a solução foi concentrada sob

pressão reduzida (SADEGHIAN et al. 2008). O produto foi purificada por

cromatografia em uma coluna de gel de sílica gel, usando como fase móvel, a mistura

AcOEt:Hex em gradiente crescente de polaridade e um sistema isocrático de

AcOEt:Hex (65:35) na saída da substância. O produto se apresentou como sólido

amorfo branco; rendimento: 86% (140 mg), P.F.: 143-145 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3334

(N-H), 3050 (C-H sp2), 1734 e 1637 (C=O), 1602 e 1490 (C=C aromático), 1089

(Estiramento C-Cl). RMN de 1H (CDCl3, 200 MHz): 8,30 (t, J= 1,7 Hz, 1H; H-2’’),

8,14 – 8,03 (m, 1H; H-4’’), 7,81 – 7,71 (m, 1H; H-6’’), 7,51 (d, J= 1,8 Hz, 1H; H-2),

7,44 – 7,15 (m, 6H; H-6, H-2’, H-3’, H-5’, H-60’, H-5’’),7,09 (d, J= 8,2 Hz, 1H; H-5),

6,81 (t, J= 5,7 Hz, 1H; NH), 4,53 (d, J= 5,8 Hz, 2H; H-7’), 3,80 (s, 3H; OMe), RMN de

13C (CDCl3, 50 MHz): 166,6 (O=C-O), 163,2 (O=C-N), 151,4 (C-3), 142,2 (C-4), 136,7

(C-4’’), 136,6 (C-1’), 133,3 (C-1), 133,2 (C-1’’), 133,2 (C-2’’), 130,7 (C-4’), 130,1 (C-

5’’), 129,1 (C-2’, C-6’), 128,8 (C-3’, C-5’, C-6’’), 122,7 (C-3’’), 122,6 (C-5), 118,7 (C-

6), 112,0 (C-2), 43,4 (C-7’), 56,0 (OMe), (GEORGSSON, HALLBERG & LARHED,

2003), EMAR (MALDI) calculado para C20H22ClNO4 [M]+: 495,9927; encontrada

495,9912.


193


) de 3-bromobenzoato de 4-((4-


Espectro 143. Espectro de RMN 1H de 3-bromobenzoato de 4-((4-clorobenzil)

carbamoil)-2-metoxifenil (AR4) (CDCl3, 200 MHz).


194

Espectro 144. Expansão do espectro de RMN 1H de 3-bromobenzoato de 4-((4-

clorobenzil) carbamoil)-2-metoxifenil (AR4) (CDCl3, 200 MHz).





195







196

7.2.5. AC1 – Acetilado da amida do ácido vanílico

Em um balão de 50 mL, equipado com agitador magnético, adicionou-se a 0,1000 g

amida clorada vanílica (0,034 mmols), NR15, a ser acetilado, piridina (0,13 mL;

0,15924 mmols) e anidrido acético (0,08 mL; 0,8111 mmols). A mistura reacional foi

submetida à agitação magnética constante durante 24 horas. Em seguida, foi realizada a

primeira etapa de extração do produto reacional e para isso, este foi vertido em água

gelada (30 mL) em um funil de decantação utilizando acetato de etila como solvente

extrator (3 x 10 mL). A fase orgânica foi tratada com solução saturada de sulfato de

cobre (3 x 20 mL). A fase de acetato de etila foi lavada com água (3 x 30 mL) e secada

com sulfato de sódio anidro (Na2SO4). Posteriormente, a fase orgânica foi filtrada e

concentrada em evaporador rotativo (ANDRADE, BATISTA & DE SOUSA, 2011). O

produto foi purificado por cromatografia em uma coluna de vidro, contendo sílica gel

como fase estácionária e usando como fase móvel, a mistura AcOEt:Hex em gradiente

crescente de polaridade. Após a aplicação de 100 mL de fase móvel, o produto foi

retirado da coluna por um sistema isocrático de AcOEt:Hex (65:35) com a finalidade de

melhor purificação do produto AC1 que se apresentou como sólido cristalino;


-1): 3446 (N-H), 3088

(C-H sp2), 1770 e 1635 (C=O), 1602 e 1421 (C=C aromático), 1089 (Estiramento C-

Cl). RMN de 1H (CDCl3, 200 MHz): 7,43 (d, J= 1,9 Hz, 1H; H-2), 7,33 – 7,12 (m, 4H;

H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 7,03 – 6,86 , m, 1H; H-6), 6,88 – 6,69 (m, 1H; H-5) ,4,47 (d, J=

5,8 Hz, 2H, H-7’), 3,77 (s, 3H; , Me), 2,27 (s, 3H; Me), RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz):

168,8 (O=C-O), 166,6 (O=C-N), 151,3 (C-3), 142,3 (C-4), 136,6 (C-1’), 133,2 (C-1),

132,9 (C-4’), 129,0 (C-2’, C-6’), 128,7 (C-3’, C-5’), 122,6 (C-5), 118,7 (C-6), 111,8 (C-

2), 55,9 (OMe), 43,3 (C-7’), 20,6 (Me) (DE MORAIS, 2014), EMAR (MALDI)



197


) de Acetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AC1).

Espectro 149. Espectro de RMN 1H de Acetato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-2-

metoxifenil (AC1) (CDCl3, 200 MHz).


198

Espectro 150. Expansão do espectro de RMN 1H de Acetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AC1) (CDCl3, 200 MHz).


C-APT de Acetato de 4-((4-clorobenzil)carbamoil)-

2-metoxifenil (AC1) (CDCl3, 50 MHz).


199


C-APT de Acetato de 4-((4-

clorobenzil)carbamoil)-2-metoxifenil (AC1) (CDCl3, 50 MHz).




200

7.2.6. AK1 – 4-metil-fenóxido da amida do ácido vanílico

Em um balão de 100 mL, equipado com agitação magnética, adicionou-se 0,1000 g

amida do ácido vanílico NR15 (0,3400 mmol) a uma solução de 4 mL de acetona

juntamente com K2CO3 (0,1388g, 1,0046 mmol) e 0,08 mL de brometo de 4-

metilbenzila (0,6011 mmols) sob refluxo (60 oC) por 16 horas. Terminada a reação, o

solvente foi removido sob pressão reduzida. Uma solução de CH2Cl2:H2O foi vertida

sobre o produto, colocada em um funil de separação e extraída com três porções de 10

mL CH2Cl2. A fase orgânica foi lavada 1 N NaOH (3x 10 mL) e seca com Na2SO4,

filtrada e concentrada em rotavapor (COOLEN et al., 1995). O produto foi purificado

por cromatografia em uma coluna de vidro, contendo sílica gel como fase estácionária e




produto AK1 que se apresentou como sólido amorfo branco; rendimento: 30% (42 mg),

P.F.: 126-129 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3290 (N-H), 3001 (C-H sp

2), 1629 (C=O), 1600

e 1490 (C=C aromático), 1029 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (CDCl3, 200 MHz):

7,44 (s, 1H; H-2), 7,32 – 7,07 (m, 9H; H-6, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’, H-2’’, H-3’’, H-5’’,

H-6’’), 6,80 (d, J= 8,4 Hz, 1H; H-5), 6,49 (t, J= 5,2 Hz, 1H, NH), 4,56 (d, J= 5,8 Hz,

2H; H-7’), 4,18 (t, J= 7,6 Hz, 2H; CH2-O), 3,88 (s, 3H; OMe), 3,11 (t, J= 7,6 Hz, 2H;

CH2-C6H5), RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz): 167,0 (O=C-N),151,2 (C-3), 149,3 (C-4),

136,9 (C-1’), 136,2 (C-4’’), 134,3 (C-1’’),133,3 (C-4’), 129,2 (C-2’, C-6’), 129,1 (C-

3’’, C-5’’), 128,9 (C-3’, C-5’), 128,8 (C-2’’, C-6’’), 126,7 (C-1), 119,3 (C-6), 111,6 (C-

2), 111,1 (C-5), 69,9 (CH2-O), 56,1 (OMe), 43,3 (C-7’), 35,1 (CH2-C6H5), 21,0 (Me)

(LEIGH et al., 1996), EMAR (MALDI) calculado para C24H24ClNNaO3 [M+Na]+:

432,1342; encontrada 432,1328.


201



(4-metilfenetoxi) benzamida (AK1).

Espectro 155. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-(4-metilfenetoxi)

benzamida (AK1) (CDCl3, 200 MHz).


202

Espectro 156. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-(4-

metilfenetoxi) benzamida (AK1) (CDCl3, 200 MHz).


C-APT de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-(4-

metilfenetoxi) benzamida (AK1) (CDCl3, 50 MHz).


203



4-(4-metilfenetoxi) benzamida (AK1) (CDCl3, 50 MHz).


metoxi-4-(4-metilfenetoxi) benzamida (AK1).

326.3971

360.3293304.3244

522.4887 550.4993449.3157376.3135280.9236 473.9650

495.9912 AR4 0:M16 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [a

.u.]

356.0664

396.0975

AC1.2 0:P14 MS Raw

0

200

400

600

Inte

ns. [a

.u.]

432.1328 AK1 0:N10 MS Raw

0

200

400

600

Inte

ns. [a

.u.]

300 350 400 450 500 550 600m/z


204

7.2.7. AK2 – 4-hidroxi-fenóxido da amida do ácido vanílico

Em um balão de 100 mL, equipado com agitação magnética, adicionou-se a amida do

ácido vanílico NR15 (0,1000 g, 0,3400 mmol) a uma solução de 3,43 mL de DMF e

0,0711 g de K2CO3 (0,5142 mmol) e 0,0827 g de brometo de 4-hidroxifenila (0,4113

mmols) por uma 24 h a temperatura ambiente. Terminada a reação, o produto foi

extraído em um funil de separação com CH2Cl2 (3 x 10 mL). A solução extrativa foi

lavada com água destilada (3x 10 mL) e depois com NaOH a 10% (10 mL). A solução

foi tratada com Na2SO4, filtrada e concentrada em rotavapor (XIANG et al. 2013). O





melhor purificação do produto AK2 que se apresentou como um óleo incolor;

rendimento: 75% (106 mg), IV ʋmax (KBr, cm-1

): 3350 (OH) 3016 (C-H sp2), 1645

(C=O), 1600 e 1489 (C=C aromático), 1014 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (CDCl3,

200 MHz): 7,95 (s, 1H; NH), 7,44 (s, 1H; H-2), 7,30 – 6,94 (m, 8H; H-5, H-6, H-2’, H-

3’, H-5’, H-6’, H-2’’, H-6’’), 6,79 (dd, J= 8,5, 2,6 Hz, 2H; H-3’’, H-5’’), 4,54 (d, J=

5,8 Hz, 2H; H-7’), 4,14 (t, J= 7,6 Hz, 2H; CH2-O), 3,82 (s, 3H; OMe), 3,04 (t, J= 7,5

Hz, 2H; CH2-C6H5), RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz): 167,5 (O=C-N), 155,0 (C-4’’),

151,3 (C-4), 149,2 (C-3), 136,7 (C-1’), 133,3 (C-4’), 130,0 (C-2’, C-6’), 129,1 (C-2’’,

C-6’’), 128,8 (C-3’, C-5’), 128,9 (C-1’’), 126,4 (C-1), 119,5 (C-6), 115,6 (C-3’’, C-5’’),

111,6 (C-2), 111,2 (C-5), 70,1 (CH2-O), 56,1 (OMe), 43,4 (C-7’), 34,8 (CH2-C6H5)

(LEIGH et al., 1996) EMAR (MALDI) calculado para C23H22ClNNaO4 [M+Na]+:

434,1135; encontrada 434,1123.


205


) de N-(4-clorobenzil)-4-(4-

hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2).

Espectro 161. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(4-hidroxifenetox)-3-

metoxibenzamida (AK2) (CDCl3, 200 MHz).


206

Espectro 162. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(4-

hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2) (CDCl3, 200 MHz).


C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-(4-hidroxifenetox)-3-



207








208


(4-hidroxifenetox)-3-metoxibenzamida (AK2).


209

7.2.8. AK3 – 1-Propanóxido da amida do ácido vanílico



juntamente com K2CO3 (0,1388g, 1,0046 mmol) e 0,05 mL de brometo de 1-propanila

(0,4102 mmols) sob refluxo (60 oC) por 16 horas. Terminada a reação, o solvente foi

removido sob pressão reduzida. Uma solução de CH2Cl2:H2O foi vertida sobre o

produto, colocada em um funil de separação e extraída com três porções de 10 mL

CH2Cl2. A fase orgânica foi lavada 1 N NaOH (3x 10 mL) e seca com Na2SO4, filtrada

e concentrada em rotavapor (COOLEN et al. 1995). O produto foi purificado por





produto AK3 que se apresentou como sólido amorfo branco; rendimento: 54% (62 mg),

P.F.: 124-126 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3296 (N-H), 3000 (C-H sp

2), 1631 (C=O), 1581 e

1450 (C=C aromático), 1014 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (200 MHz, CDCl3): 7,40

(d, J= 1,8 Hz, 1H; H-2), 7,31-7,22 (m, 5H; H-6, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 6,81 (d, J= 8,4

Hz, 1H; H-5), 6,74 (sl, 1H; NH), 4,55 (d, J= 5,8 Hz, 2H; H-7’), 3,98 (t, J= 6,8 Hz, 2H;

H-1’’), 3,86 (s, 3H; OMe), 2,04 – 1,76 (m, 2H; H-2’’), 1,03 (t, J= 7,4 Hz, 3H; H-3’’),

RMN de 13

C (50 MHz, CDCl3): 167,0 (O=C-N), 151,4 (C-4), 149,2 (C-3), 137,0 (C-

1’), 133,1 (C-4’), 129,1 (C-2’, C-6’), 128,7 (C-3’, C-5’), 126,3 (C-1), , 119,4 (C-6),

110,9 (C-2), 111,4 (C-5), 70,4 (C-1’’), 56,0 (OMe), 43,3 (C-7’), 22,3 (C-2’’), 10,3 (C-

3’’) (PLOYPRADITH et al., 2007), EMAR (MALDI) calculado para C18H20ClNNaO3

[M+Na]+: 356,1029; encontrada 356,1038.


210



propoxibenzamida (AK3).

Espectro 168. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-

propoxibenzamida (AK3) (CDCl3, 200 MHz).


211

Espectro 169. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-



C-APT de N-(4-clorobenzil)-3-metoxi-4-



212



4-propoxibenzamida (AK3) (CDCl3, 50 MHz).


metoxi-4-propoxibenzamida (AK3).

434.1123

450.0236554.0219

462.9834

295.2212412.1107

AK2 0:P11 MS Raw

0

200

400

600

800

1000

Inte

ns. [a

.u.]

356.1038

372.0766

AK3 0:N6 MS Raw

0

100

200

300

Inte

ns. [a

.u.]

356.1027

443.2919399.2928372.0622

334.1301550.4898284.3625 522.4923459.2523 487.2879385.1907

575.2588

AK4 0:M5 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [a

.u.]

300 350 400 450 500 550 600m/z

434.1123

450.0236554.0219

462.9834

295.2212412.1107

AK2 0:P11 MS Raw

0

200

400

600

800

1000

Inte

ns. [a

.u.]

356.1038

372.0766

AK3 0:N6 MS Raw

0

100

200

300

Inte

ns. [a

.u.]

356.1027

443.2919399.2928372.0622

334.1301550.4898284.3625 522.4923459.2523 487.2879385.1907

575.2588

AK4 0:M5 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [a

.u.]

300 350 400 450 500 550 600m/z


213

7.2.9. AK4 – 2-Propanóxido da amida do ácido vanílico

Em um balão de 100 mL, equipado com agitação magnética, adicionou-se a amida do

ácido vanílico NR15 (0,1000 g, 0,3400 mmol) a uma solução de 3,43 mL de DMF e

0,0711 g de K2CO3 (0,5142 mmol) e 0,05 mL de brometo de 2-propanila (0,4102

mmols) por uma 24 h a temperatura ambiente. Terminada a reação, o produto foi

extraído em um funil de separação com CH2Cl2 (3 X 10 mL). A solução extrativa foi

lavada com água destilada (3x 10 mL) e depois com NaOH a 10% (10 mL). A solução

foi tratada com Na2SO4, filtrada e concentrada em rotavapor (XIANG et al. 2013). O





melhor purificação do produto AK4 que se apresentou como sólido amorfo branco;

rendimento: 54% (62 mg), P.F.: 142-147 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3284 (N-H), 3078 (C-

H sp2), 1631 (C=O), 1598 e 1455 (C=C aromático), 1031 (Estiramento C-Cl). RMN

de 1H (CDCl3, 200 MHz): 7,40 (d, J= 1,8 Hz, 1H; H-6), 7,22 (m, 5H; H-2, H-2’, H-3’,

H-5’, H-6’, ), 6,79 (d, J= 8,4 Hz, 2H; H-5), 6,79* (sl, J= 8,4 Hz, 2H; NH), 4,51* (sept,

J= 6,2 Hz, 1H; H-2’’), 4,51 (d, J= 5,7 Hz, 2H; H-7’), 3,81 (s, 3H; OMe), 1,33 (d, J=

6,0 Hz, 6H; H-1’’ H-3’’), RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz): 167,1 (O=C-N), 150,2 (C-4),

149,9 (C-3), 137,0 (C-1’), 133,1 (C-4’), 129,0 (C-2’, C-6’), 128,7 (C-3’, C-5’), 126,4

(C-1), 119,4 (C-6), 113,5 (C-5), 111,1 (C-2), 71,1 (C-1’’), 55,9 (OMe), 43,2 (C-7’),

21,8 (Me) (PLOYPRADITH et al., 2007), EMAR (MALDI) calculado para



214



isopropoxi-3-metoxibenzamida (AK4).

Espectro 174. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-isopropoxi-3-



215

Espectro 175. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-isopropoxi-3-



13C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-isopropoxi-3-



216


isopropoxi-3-metoxibenzamida (AK4).

434.1123

450.0236554.0219

462.9834

295.2212412.1107

AK2 0:P11 MS Raw

0

200

400

600

800

1000

Inte

ns. [a

.u.]

356.1038

372.0766

AK3 0:N6 MS Raw

0

100

200

300

Inte

ns. [a

.u.]

356.1027

443.2919399.2928372.0622

334.1301550.4898284.3625 522.4923459.2523 487.2879385.1907

575.2588

AK4 0:M5 MS Raw

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns. [a

.u.]

300 350 400 450 500 550 600m/z


217

7.2.10. AK6 – Decilóxido da amida do ácido vanílico



juntamente com K2CO3 (0,1388g, 1,0046 mmol) e 0,05 mL de brometo de 1-decila

(0,4102 mmols) sob refluxo (60 oC) por 16 horas. Terminada a reação, o solvente foi

removido sob pressão reduzida. Uma solução de CH2Cl2:H2O foi vertida sobre o

produto, colocada em um funil de separação e extraída com três porções de 10 mL

CH2Cl2. A fase orgânica foi lavada 1 N NaOH (3x 10 mL) e seca com Na2SO4, filtrada

e concentrada em rotavapor (COOLEN et al. 1995). O produto foi purificado por





produto AK6 que se apresentou como um sólido amorfo branco; rendimento: 81% (120

mg), P.F.: 110-105 oC. IV ʋmax (KBr, cm

-1): 3305 (N-H), 3000 (C-H sp

2), 1627 (C=O),

1602 e 1508 (C=C aromático), 1035 (Estiramento C-Cl). RMN de 1H (CDCl3, 200

MHz): 7,42 (s, 1H; H-6), 7,26 (s, 5H; H-2, H-2’, H-3’, H-5’, H-6’), 6,54 (s, 1H; H-5),

4,56 (d, J= 5,8 Hz, 2H; H-7’), 4,01 (t, J= 6,8 Hz, 2H; CH2-C6H5), 3,86 (s, 3H; OMe),

1,83 (dt, J= 14,1, 6,9 Hz, 2H; CH2-O), 1,74 – 1,15 (m, 14H; (CH2)8), 0,86 (t, J= 6,1 Hz,

3H; CH3), RMN de 13

C (CDCl3, 50 MHz): 167,0 (O=C-N), 151,5 (C-4), 149,2 (C-3),

137,0 (C-1’), 133,2 (C-4’), 129,1 (C-2’, C-6’), 128,8 (C-3’, C-5’), 126,4 (C-1), 119,3

(C-6), 111,4 (C-2), 111,1 (C-5), 69,2 (CH2O), 56,2 (OMe), 43,5 (C-7’), 32,0

(CH2CH2O), 29,7- 22,8 ((CH2)7CH2O), 14,3 (CH3), (SUNITHA, VISHNUMURTHY &

ADHIKARI, 2013), EMAR (MALDI) calculado para C18H20ClNaNO3 [M+Na]+:

454,2125; encontrada 454,2119.


218


) de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-

3-metoxibenzamida (AK6).

Espectro 179. Espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-3-



219

Espectro 180. Expansão do espectro de RMN 1H de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-3-



C-APT de N-(4-clorobenzil)-4-(deciloxi)-3-



220


(deciloxi)-3-metoxibenzamida (AK6).

AK3 0:N6 MS Raw

0

5

10

15

20

25

Inte

ns. [a

.u.]

443.2919

459.2523 463.2423

AK4 0:M5 MS Raw

0

500

1000

1500

Inte

ns. [a

.u.]

456.1324

454.2119

470.0856473.1523443.2788 463.2384449.2957

AK6 0:N3 MS Raw

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

440 445 450 455 460 465 470m/z

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TESE DE DOUTORADO AMIDAS HALOGENADAS: REAÇÕES DE …repositorio.ufpb.br/jspui/bitstream/tede/8806/2/arquivotototal.pdf · À toda família do IPeFarM, onde, apesar das dificuldades,