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INTRODUÇÃO
Nos últimos 30 anos, a primatologia tem recebido grande atenção devido às
similaridades anatômicas, fisiológicas e etológicas com a espécie humana, tornando-
se um modelo experimental de escolha para a pesquisa biomédica (AURICHIO,
1995).
Os primatas pertencem à ordem Primates, que, por sua vez, é subdividida
em duas subordens: a Strepsirhini, formada pelas superfamílias Lemuroidea
(lêmures) e Lorisoidea (lóris), e Haplorhini, que inclui as infra-ordens Tarsii (társios),
Platyrrhini e Catarrhini (MONTEIRO da CRUZ, 1998). Os Platirrinos são chamados
de Primatas Neotropicais ou do Novo Mundo, que compreende o sul do México, a
América Central e a do Sul, enquanto que os primatas do Velho Mundo, também
chamados de Catarrinos, compreendem os primatas da África e Ásia (AURIQUIO,
1995; LASLEY e SHIDELER, 1999).
Conforme a primatologia avançou em seus estudos, pode-se constatar a
fragilidade na qual se encontra a grande maioria dos primatas (AURICHIO, 1995).
No Brasil, podemos destacar as seguintes Famílias de primatas não-humanos:
Callimiconidae, Callitrichidae e Cebidae, com uma, dez e quinze espécies em perigo
de extinção, respectivamente (PORTARIA n° 1.522 do IBAMA). Dentro deste
contexto, o desenvolvimento de programas de reprodução de primatas não-humanos
utilizados na pesquisa biomédica pode receber um grande impulso com o
desenvolvimento de biotécnicas aplicadas à reprodução desenvolvidas para estas
espécies, visando tanto à obtenção de animais hígidos para a pesquisa biomédica,
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quanto para a sua preservação (MORREL et al., 1998; DOMINGUES et al., 2003a;
DOMINGUES et al., 2004). Contudo, os conhecimentos acerca dos mecanismos que
regulam a reprodução dos primatas neotropicais ainda são escassos (HEARN, 1994;
FRAGASZY e ADAMS-CURTIS, 1998, MORREL et al., 1998; GILCHRIST et al.,
2001).
Estudos com fêmeas envolvendo estimulação hormonal ovariana
(DUKELOW, 1970 e 1979) e fertilização in vitro (ASAKAWA e DUKELOW, 1982)
foram realizados na espécie Saimiri sciureus. Em Callitrhix jacchus, têm-se descrito
protocolos de sincronização de ciclo, utilizando-se principalmente a prostaglandina
F2α, ou o seu análogo, cloprostenol (SUMMERS et al., 1985; EINSPANIER et al.,
1994 e 1997; GILCHRIST et al., 2001). MORREL et al. (1998) realizaram estudos
envolvendo inseminação artificial (IA) também na espécie C. jacchus, enquanto que
NAYDU e MICHELMANN (2003) desenvolveram protocolos de cultivo de folículos
pré-antrais, a partir de fragmentos de tecidos ovarianos nesta mesma espécie. Na
espécie C. apella, além de ter sido descrita a população folicular ovariana in situ em
fêmeas adultas (DOMINGUES et al.,2004), foi realizada a adaptação de um método
mecânico para o isolamento de folículos ovarianos pré-antrais, com intuito de
desenvolver protocolos de cultivo in vitro de oócitos provenientes de folículos pré-
antrais (DOMINGUES et al., 2003a).
Apesar de existirem trabalhos visando ao desenvolvimento de biotécnicas
aplicadas à reprodução de primatas neotropicais, existe a necessidade de mais
estudos sobre os aspectos morfológicos, bioquímicos e fisiológicos da oogênese e
foliculogênese nestas espécies, para se otimizar a utilização de técnicas tais como a
IA, a maturação (MIV) e a fertilização in vitro (FIV), transferência de embriões (TE) e
o cultivo de folículos pré-antrais in vitro. Portanto, a espécie Cebus apella (macaco-
prego) foi escolhida como modelo experimental para ser utilizado neste trabalho por
ser largamente empregada na pesquisa biomédica e ser considerada o primata
neotropical de melhor adaptação ao cativeiro (DE LUCA et.al., 1990), sendo um
ótimo modelo experimental para se iniciar o desenvolvimento de biotécnicas de
reprodução que, futuramente, poderão ser empregadas em primatas neotropicais em
perigo de extinção.
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REVISÃO DE LITERATURA 1. Produção de gametas femininos
Nos mamíferos, a produção de gametas femininos é resultante da interação
de dois fenômenos que ocorrem no ovário: a oogênese e a foliculogênese
(SAUMANDE, 1981).
2. Oogênese
A oogênese compreende o desenvolvimento e a diferenciação das células
germinativas primordiais (CGP) da fêmea até a formação do oócito haplóide
fertilizado, quando se tem o término da oogênese (RÜSSE, 1983). Nos mamíferos, a
oogênese tem início ainda no início do desenvolvimento fetal e pode terminar dentro
de meses a anos da vida adulta da fêmea, resultando na constituição de um pool de
gametas femininos (MONIAUX et al., 1997; PICTON et al., 1998; van den HURK e
ZHAO, 2005).
A oogênese pode ser dividida nas seguintes etapas: (i) formação das CGP;
(ii) migração das CGP para a gônada indiferenciada; (iii) colonização da gônada
indiferenciada pelas CGP; (iv) diferenciação das CGP em oogônias, (v) proliferação
das oogônias; início do processo de meiose, (vi) parada da meiose no estádio de
diplóteno na prófase da primeira divisão meiótica, (vii) retomada da primeira divisão
meiótica, (viii) segunda parada da meiose no estádio de metáfase II, (ix) e segunda
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retomada da meiose, sendo que esta última somente irá acontecer se houver a
fertilização do oócito (HIRSHFIELD, 1991; van den HURK e ZHAO, 2005).
Após o crescimento celular e redistribuição de organelas citoplasmáticas, as
CGP multiplicam-se ativamente e se transformam em oogônias por meio de divisões
mitóticas (RÜSSE, 1983). As oogônias transformam-se em oócito quando param de
se dividir por mitose e iniciam a meiose. Os oócitos progridem através dos estádios
da prófase meiótica (distinguível pela aparência do núcleo), a saber: leptóteno,
zigóteno, paquíteno e diplóteno. Contudo, o processo de meiose não se completa,
permanecendo parado no estádio de diplóteno da prófase da primeira divisão
meiótica (RÜSSE, 1983; ERICKSON, 1986; HIRSHFIELD, 1991; PICTON et al.,
1998; KANATSU-SHINOHARA et al., 2000; SUN et al., 2004; van den HURK e
ZHAO, 2005).
Coincidentemente com o início da meiose, os oócitos tornam-se rodeados
por células pavimentosas da pré-granulosa e por uma membrana basal (RÜSSE,
1983; PICTON et al., 1998; FORTUNE et al., 2000; FORTUNE, 2003; van den HURK
e ZHAO, 2005). Este conjunto de células é classificado como folículo primordial
(GONDOS, 1970; LINTERN-MOORE e MOORE, 1979; GOUGEON e CHAINY,
1987; HIRSHIFIELD, 1991; HULSHOF et al., 1994; PICTON et al., 1998;
DOMINGUES, 2000). O oócito não é fertilizável neste estádio de desenvolvimento,
sendo necessário o crescimento deste no folículo ovariano, a fim de que o oócito se
torne competente para reassumir a maturação oocitária e que ocorra uma possível
fertilização com subseqüente desenvolvimento embrionário (PICTON et al., 1998;
KANATSU-SHINOHARA et al., 2000; MACHATKOVA et al., 2004; RODRÍGUEZ e
FARIN, 2004; LEQUARRE et al., 2005).
O início do crescimento do oócito dentro de folículos ovarianos é
caracterizado pelo tamanho reduzido do oócito e pela total inabilidade deste em
progredir durante o ciclo meiótico. Estas duas características serão modificadas
durante o crescimento oocitário, no qual o ooplasma irá se tornar um sítio de
estoque de RNA e proteínas (MOOR e GANDOLFI, 1987; PICTON et al., 1998).
Durante a fase de crescimento oocitário, o ooplasma acumula numerosas vesículas
ligadas às membranas, grânulos de glicogênio, gotas de lipídeos e corpos
multivesiculares e cristalizados, que refletem o estoque e o transporte através do
oolema (membrana citoplasmática do oócito). Estas estruturas, provavelmente, são
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suprimento de energia e substratos para a síntese de novas membranas após a
fertilização (PICTON et al., 1998).
O oócito em crescimento é bastante ativo na síntese de proteínas transcritas
pelo núcleo e pelas mitocôndrias. Algumas destas proteínas são requeridas para a
diferenciação do próprio oócito, outras podem atuar na interação deste com as
células da granulosa que o rodeiam, na formação da zona pelúcida, na fertilização
ou no desenvolvimento embrionário inicial (MOOR e GANDOLFI, 1987; PICTON et
al., 1998; KANATSU-SHINOHARA et al., 2000; MOOD et al., 2004; DEKEL, 2005).
Algumas das proteínas presentes no ooplasma podem ser adquiridas pela
endocitose de produtos presentes no fluido folicular ou das secreções das células da
granulosa (PICTON et al., 1998).
Um exemplo marcante de proteínas que são sintetizadas ainda durante o
período de crescimento do oócito, mas que possuem importância no final do
desenvolvimento oocitário são as glicoproteínas que formam a zona pelúcida
(MOOR e GANDOLFI, 1987; MARESH et al., 1990; COONROD et al., 2002;
GAHLAY et al., 2002). Completada a fase de crescimento, o oócito possuirá um
estoque de componentes requeridos no seu desenvolvimento subseqüente e terá
adquirido a capacidade de progredir do estádio de prófase I (dictiado) para a
metáfase II do ciclo celular. Contudo, o oócito ainda não estará apto para a
fertilização e desenvolvimento embrionário. A aquisição destas características
depende da etapa posterior à fase de crescimento, ou seja, do período de
maturação oocitária, que é iniciada in vivo pela liberação pré-ovulatória de hormônio
luteinizante (LH) (MOOR e GANDOLFI, 1987; MATTIOLI e BARBONI, 2000).
2.1. Maturação oocitária
A maturação oocitária compreende os processos de maturação nuclear e
citoplasmática. Durante a maturação nuclear, a meiose é reassumida de prófase I
até o estádio de metáfase II, quando o núcleo do oócito sai do estado de vesícula
germinativa (VG) (rompimento da vesícula germinativa - GVB) (BUCCIONE et al.,
1990). Enquanto que na maturação citoplasmática, mudanças na distribuição dos
grânulos corticais do oócito, na distribuição das organelas e o acúmulo de
determinados tipos de RNAm’s e proteínas têm sido observados (DRIANCOURT e
THUEL, 1998, FAIR, 2003).
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Em muitas espécies de mamíferos, a maturação do oócito completa-se até o
momento da ovulação. A maturação espontânea (independente de gonadotrofina)
ocorre com a remoção do oócito ou do complexo cumulus-oophorus (CCO) de
folículos antrais, e posterior cultivo em meios de suporte, mostrando que a indução
hormonal da ovulação não é necessária para o início do programa de maturação
oocitária (EPPIG, 1993 e 1996, DRIANCOURT e THUEL, 1998, RODRIGUEZ e
FARIN, 2004).
2.1.1. Maturação nuclear do oócito
In vivo, o rompimento da vesícula germinativa dá-se com os picos pré-
ovulatórios de gonadotrofinas hipofisárias: hormônio folículo-estimulante (FSH) e
hormônio luteinizante (LH) (EPPIG, 1993; KOTANI e YAMASHITA, 2002; DEKEL,
2005; LEVI-SETTI, 2004; HUMBLOT et al., 2005), ou quando ocorre atresia folicular
(EPPIG, 1993; WEHREND e MEINECKE, 2001; BILODEAU-GOESEELS, 2003;
RODRIGUEZ e FARIN, 2004). A retomada da meiose a partir da prófase I até a
segunda parada na meiose II, ou seja, a maturação nuclear é caracterizada pela
dissolução do envelope nuclear (GVBD), condensação dos cromossomos, formação
do fuso meiótico e separação dos cromossomos, com a liberação do primeiro
corpúsculo polar (RODRÍGUEZ e FARIN, 2004; SU et al., 2003; HUMBLOT et al.,
2005).
A primeira retomada da meiose (GVBD) é controlada por proteínas kinases e
fosfatases, que modulam os processos celulares através de fosforilação e
defosforilação (FERREL, 1999ab; KANATSU-SHINOHARA et al., 2000; TAY et al.,
2000; CASTRO et al., 2001; LEDAN et al., 2001; WEHREND e MEINECKE, 2001,
KOTANI e YAMASHITA, 2002; MALLER et al., 2002; SU et al., 2003; VORONINA et
al., 2003; DEKEL, 2005). Duas destas enzimas são o fator promotor de maturação,
chamado de MPF (M-phase promoting factor) (MASUI e MARKET, 1971; MASUI e
CLARKE, 1979; LOHKA et al., 1988; FERREL, 1999ab; WHITAKER, 1996; TAY et
al.2000; LEDAN et al., 2001; BODART et al., 2002; KOTANI e YAMASHITA, 2002) e
as proteínas kinases que pertencem à família do fator promotor de mitose,
conhecidas como MAP Kinases (Mitogen- activating protein kinase family) (FERREL,
1999ab; WEHREND e MEINECKE, 2001; CASTRO et al., 2001; BODART et al.,
2002; KOTANI e YAMASHITA, 2002; SU et al., 2003; MOOD et al., 2004; DEKEL,
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2005), que mostram atividade oscilatória durante o processo de maturação nuclear
(MASUI e MARKET, 1971; MASUI e CLARKE, 1979; LOHKA et al., 1988;
WHITAKER, 1996; FERREL, 1999ab; TAY et al., 2000; CASTRO et al., 2001;
LEDAN et al., 2001; WEHREND e MEINECKE, 2001; BODART et al., 2002; KOTANI
e YAMASHITA, 2002; SU et al, 2003; SUN et al., 2004).
2.1.2. Maturação citoplasmática do oócito
Na maturação citoplasmática, por sua vez, mudanças na distribuição dos
grânulos corticais do oócito, na distribuição das organelas e o acúmulo de
determinados tipos de RNAm’s e proteínas têm sido observados (DRIANCOURT e
THUEL, 1998). Todas estas mudanças são importantes para gerar oócitos de boa
qualidade, capazes de produzir um novo indivíduo após a fertilização do oócito e
subseqüente desenvolvimento embrionário (EPPIG, 1993 e 1996, DRIANCOURT e
THUEL, 1998).
Os eventos nucleares e citoplasmáticos que ocorrem durante estes processos
chamados de maturação oocitária são necessários para evitar a ocorrência de
poliespermia e dar suporte ao desenvolvimento embrionário inicial (EPPIG, 1993 e
1996, DRIANCOURT e THUEL, 1998, GAVIN et al., 1999; BODART et al., 2002;
FAIR, 2003; SU et al, 2003).
Mudanças na zona pelúcida que bloqueiam a poliespermia após a
fertilização estão relacionadas com a exocitose de constituintes de grânulos corticais
presentes no citoplasma do oócito (WASSARMAN, 1988). Durante a maturação
citoplasmática do oócito, os grânulos da cortical (GC) mudam a sua distribuição
(NICOSIA et al, 1977; DUCIBELLA et al., 1988; PIERCE et al., 1990; GOUDET et al.,
1997). Quando os oócitos estão em prófase I (GV), os GC estão dispersos no córtex
do oócito e se apresentam em maior concentração do que em oócitos em metáfase
II (DUCIBELLA et al., 1988; PIERCE et al.,1990). Os grânulos da cortical estão
presentes durante toda a maturação oocitária (NICOSIA et al., 1977; GOUDET et al.,
1997), contudo passam a se concentrar no hemisfério oposto ao dos cromossomos
meióticos em metáfase II (DUCIBELLA et al., 1988), e estão praticamente ausentes
em oócitos fertilizados (NICOSIA et al., 1977; DUCIBELLA et al., 1988)
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3. Foliculogênese
A foliculogênese pode ser definida como o processo de formação,
crescimento e maturação folicular, iniciando com a formação do folículo primordial e
culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório (SAUMANDE, 1981).
3.1. Folículos ovarianos
De acordo com o grau de evolução, os folículos podem ser divididos em
folículos pré-antrais ou não-cavitários e folículos antrais ou cavitários. Segundo
HULSHOF et al. (1994), os folículos pré-antrais incluem três tipos: 1) primordiais,
que consistem de um oócito circundado por uma única camada de células da pré-
granulosa de forma pavimentosa; 2) primários, caracterizados pela presença de um
oócito central, circundado por uma camada de células da granulosa de forma cúbica;
3) secundários, constituídos por um oócito central, circundado por duas ou mais
camadas de células da granulosa de forma cúbica. Em camundongos (LINTERN-
MOORE e MOORE, 1979), mulheres (GOUGEON e CHAINY, 1987), caprinos
(BEZERRA et al, 1998) e fêmeas de C. apella (DOMINGUES et al., 2004) relata-se
que existe um folículo de transição entre o folículo primordial e o primário. Este
folículo de transição apresenta células da pré-granulosa pavimentosas e células da
granulosa cúbicas. A categoria de folículos antrais compreende os folículos terciários
e os folículos De Graaf, sendo este último o estádio final do desenvolvimento
folicular (SAUMANDE, 1981).
Existem critérios funcionais para a classificação dos folículos baseados na
sua dependência de gonadotrofinas. Desta forma, os folículos podem ser
quiescentes (primordial), recrutados para crescer (pré-antrais e antrais), ovulatórios
e atrésicos (FINDLAY et al., 2002). Independente da classificação dos folículos
ovarianos, não se conhece o mecanismo que retira um folículo do estado
quiescente. A hipótese mais aceita é a de que fatores locais seriam responsáveis
pela ativação de um folículo do estado de qüiescência (FORTUNE et al., 2000;
FINDLAY et al., 2002).
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3.2. Crescimento dos folículos
Os folículos primordiais representam um pool de reserva que dão origem a
todos os folículos dominantes que poderão ser ou não selecionados para ovular.
Neste sentido, os folículos primordiais são fundamentalmente as unidades
reprodutivas do ovário (ERICKSON, 1986, FIGUEIREDO et al, 1997; FORTUNE et
al., 2000; FINDLAY et al., 2002; FORTUNE, 2003; DOMINGUES et al., 2004). Desta
forma, durante toda a vida da fêmea, muitos folículos primordiais são ativados para
dar início à foliculogênese (GOUGEON, 1998; FORTUNE, 2003). Através da vida da
fêmea, os folículos primordiais que não estão crescendo compreendem 90 a 95%
dos folículos ovarianos. Conseqüentemente, em dado momento, o número de
folículos primordiais que entram no pool de folículos em crescimento é relativamente
pequeno (ERICKSON, 1986, HIRSHFIELD, 1991, FIGUEIREDO et al., 1997;
FINDLAY et al., 2002; FORTUNE, 2003).
O primeiro sinal de crescimento é a retomada da proliferação celular das
células pavimentosas da pré-granulosa, que pode ser demonstrado por auto-
radiografia, seguindo a incorporação de timidina triciada ([3H]). Os estádios
posteriores de crescimento podem ser reconhecidos pelo aumento do tamanho do
oócito e pelas mudanças no formato das células da granulosa (HIRSHFIELD, 1991;
GOUGEON, 1998; DOMINGUES et al., 2004). Os volumes do citoplasma e núcleo
do oócito aumentam drasticamente (LINTERN-MOORE e MOORE, 1979;
GOUGEON e CHAYNY, 1998; DOMINGUES et al., 2004) e as células da granulosa,
que, usualmente, possuem um formato pavimentoso no folículo qüiescente,
apresentam um formato cúbico quando estão se proliferando (ERICKSON, 1986;
GOUGEON, 1998). Junções GAP estabelecem-se entre as células da granulosa e o
oócito. Esta observação dá suporte ao conceito de que as células da granulosa e o
oócito tornam-se elétrica e metabolicamente acoplados ainda no início da
foliculogênese (ERICKSON, 1986; MATTTIOLI e BARBONI, 1998; NASHTA et al.,
1998, TAY et al., 2000; WEHREND e MEINECKE, 2001; BODART et al, 2002;
RODRIGUEZ e FARIN, 2004; TEILMANN, 2005).
O oócito cresce rapidamente, atingindo seu tamanho máximo ainda no início
do processo de desenvolvimento folicular (HIRSHFIELD e SCHMIDT, 1987;
DRIANCOURT e THUEL, 1998). O oócito atinge aproximadamente 85% de seu
tamanho final quando ocorre o início da formação do antro. As células da granulosa,
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por sua vez, continuam a proliferar extensivamente, enquanto o oócito cessa seu
crescimento (DRIANCOURT e THUEL, 1998)
Sugere-se que o crescimento dos folículos pré-antrais é pouco dependente
de gonadotrofinas (DRIANCOURT et al., 1991; DRIANCOURT e THUEL, 1998;
GOUGEON, 1998; FORTUNE et al., 2000; FINDLAY et al., 2002; FORTUNE, 2003),
e que está relacionado com a interação de fatores intra-ovarianos (WANDJI et
al.,1992ab; FORTUNE et al., 2000; ERICKSON e SHIMASAKI, 2001; FINDLAY et
al.,2002). Contudo, WANDJI et al. (1992a) constataram a presença de receptores
para o FSH em folículos pré-antrais bovinos desde o estádio de folículo primário.
3.3. Dinâmica folicular
A formação de um folículo pré-ovulatório é um processo altamente seletivo,
que envolve uma série de passos nos quais um folículo primordial completa todos os
aspectos da foliculogênese e libera um oócito maduro (SAUMANDE, 1981). Em
mulheres, apenas uma pequena porção dos 2 milhões de folículos primordiais
originais irão sobreviver ao processo de seleção (BAKER, 1976). De um modo geral,
a seleção reflete um alto nível de organização, que está baseada na
citodiferenciação das células da granulosa, tecais e oócitos (ERICKSON, 1986;
FORTUNE, 1994). No decorrer de seu desenvolvimento, os folículos antrais podem
passar por três etapas: recrutamento, seleção e dominância (FORTUNE, 1994;
DRIANCOURT e THUEL, 1998; GOUGEON, 1998; GILCHRIST et al., 2001).
Com a liberação do hormônio folículo-estimulante (FSH) e do hormônio
luteinizante (LH), que são trazidos até os folículos através dos capilares tecais, o
folículo terciário aumenta em tamanho de forma surpreendente. Na mulher, o
crescimento pode ser de aproximadamente 75 vezes em diâmetro, que corresponde
a um aumento de 0,4 mm a 30 mm em diâmetro antes da ovulação (ERICKSON,
1986; GOUGEON, 1998). Em C. apella o folículo terciário pode ter em média 514,4
µm (DOMINGUES et al., 2003; DOMINGUES et al., 2004) e atingir o diâmetro de um
folículo pré-ovulatório com 10-12 mm (NAGLE et al., 1980; ORTIZ et al., 2004). A
base para este crescimento é a proliferação das células da granulosa e o acúmulo
de líquido folicular (ERICKSON, 1986; DRIANCOURT e THUEL, 1998; GOUGEON,
1998). Na macaca-prego, existe um hiato de informações entre os processos de
recrutamento e dominância folicular.
22
Durante o desenvolvimento do folículo De Graaf, as células da teca passam
a expressar a sua diferenciação. Na teca interna, células intersticiais altamente
diferenciadas acumulam-se progressivamente até que existam 5 a 8 camadas
destas células em um folículo pré-ovulatório. Na teca externa do folículo De Graaf,
os fibroblastos se diferenciam em células com características típicas de músculo liso,
as quais contêm actina e miosina. Estas células contráteis são inervadas por fibras
simpáticas e parassimpáticas (ERICKSON, 1986). No decorrer de seu
desenvolvimento, os folículos antrais podem passar por três etapas: recrutamento,
seleção e dominância (FORTUNE, 1994).
O termo recrutamento tem sido dado para os folículos em crescimento que
não sofrem atresia. Durante o recrutamento, os folículos tentam ultrapassar a
barreira que os separa da ovulação. O recrutamento não é um fenômeno
generalizado ou isolado, ao contrário, os folículos parecem ser recrutados em
grupamentos, sugerindo que eles recebem um sinal que permite que continuem a
crescer, ao invés de regredirem. O sinal que parece estimular o recrutamento é um
sutil aumento da concentração plasmática de FSH. Existem várias evidências que
dão suporte a esta hipótese. A primeira é que o recrutamento é temporalmente
correlacionado com aumentos nas concentrações de FSH circulante (FORTUNE,
1994; GILCHRIST et al., 2001). Em primatas de ciclo menstrual, as concentrações
basais de FSH são ligeiramente mais altas no início da fase folicular do que no fim
desta e durante a fase luteal (NAGLE et al., 1979 e 1980).
Existe uma correlação temporal entre as elevações plasmáticas de FSH e o
recrutamento de folículos, de forma que perturbações na concentração de FSH
também levam a mudanças concomitantes nas características e/ou no número de
folículos recrutados (FORTUNE, 1994; MACKLON e FAUSER, 1998). Um exemplo
do efeito do FSH sob o número de folículos recrutados é que uma elevação
dramática dos níveis plasmáticos de FSH, empregados em regime de superovulação
em mulheres e animais domésticos, aumenta o número de folículos recrutados
(FORTUNE, 1994).
Para uma dada espécie, geralmente a quantidade de folículos recrutados é
maior do que a de folículos ovulatórios. Portanto, o número de folículos que
continuam a crescer até alcançar o tamanho de um folículo ovulatório constitui uma
característica espécie-específica (MONNIAUX et al., 1997). Imediatamente após o
crescimento, inicia-se a fase de seleção, na qual um único folículo emerge do
23
conjunto de folículos recrutados e continua a crescer, enquanto os outros folículos
recrutados diminuem de tamanho (FORTUNE et al., 1991). Na mulher, os folículos
passam do recrutamento para a seleção com o diâmetro de 2 a 8 mm
(DRIANCOURT e THUEL, 1998).
Aqueles folículos que alcançam o tamanho de folículo ovulatório são
chamados de folículos dominantes, porque se acredita que uma vez selecionados,
eles evitam o crescimento, a diferenciação e o recrutamento dos folículos
subordinados (FORTUNE, 1994). Na mulher, os folículos dominantes são aqueles
que possuem diâmetro de 8 mm em diante (DRIANCOURT e THUEL, 1998). Duas
hipóteses têm sido postuladas a fim de explicar como o folículo dominante exerce
dominância. A primeira é que o folículo dominante secreta alguma substância que
impede o crescimento e o desenvolvimento dos folículos subordinados, e a segunda
é que o folículo dominante inibe o crescimento e o recrutamento de outros folículos
através de feedback negativo sobre a secreção de gonadotrofinas. Neste segundo
caso, o estradiol e/ou a inibina produzidos pelo folículo dominante causam declínio
nos níveis de FSH, os quais não seriam suficientes para manter o crescimento dos
folículos subordinados (FORTUNE, 1994).
3.4. Atresia
Quando um folículo sai do pool de reserva, ele pode seguir dois destinos: o
desenvolvimento até o estádio pré-ovulatório ou a morte por atresia. A atresia é um
processo fisiológico que leva à morte 99,9% dos folículos presentes nos ovários
(ERICKSON, 1986; ASA, 1996; FIGUEIREDO, 1995; MONIAUX et al., 1997;
FIGUEIREDO et al., 1997). Segundo MONIAUX et al. (1997), a taxa de atresia é
baixa em folículos pré-antrais, aumenta em folículos com alta taxa de proliferação
das células da granulosa e permanece alta durante a fase terminal do crescimento
folicular. Independente da fase na qual ocorre, a atresia reduz de maneira
significativa o número de oócitos que poderiam ovular (FIGUEIREDO, 1995;
FIGUEIREDO et al, 1997).
Vários estudos têm evidenciado uma estreita associação entre o processo
de apoptose e a morte de oócitos e células da granulosa, demonstrando que a
apoptose está envolvida com a indução da atresia folicular (HUGHES e GOROSPE,
1991; TILLY et al., 1991). A apoptose é um processo evolutivamente conservado,
24
governado geneticamente, pelo qual as células morrem em reposta a um controle
intrínseco de morte celular. A apoptose se caracteriza por uma variedade de
alterações morfológicas, incluindo condensação da cromatina ao redor da periferia
do núcleo, dilatação do retículo endoplasmático, alterações na composição da
membrana celular, formação de corpos apoptóticos e subseqüente fagocitose destas
estruturas pelas células vizinhas (HUGHES e GOROSPE, 1991; ALLEN et al., 1998;
SHAWN et al., 2000; SANTOS et al., 2000).
4. Aspectos gerais da fisiologia reprodutiva de primatas não-humanos
Segundo HODGES (1987), o ciclo ovariano em primatas compreende uma
seqüência de eventos que refletem o crescimento folicular, a ovulação de um oócito
maduro e a formação do corpus lutheum. De acordo com o mesmo autor,
funcionalmente, o ciclo ovariano pode ser dividido em 3 fases: 1) folicular ou
proliferativa, que compreende os eventos que levam ao desenvolvimento de um
folículo pré-ovulatório; 2) ovulatória, que tem início com o pico de LH (hormônio
luteinizante) e culmina com a ruptura folicular e extrusão de um oócito maduro; 3)
luteal ou secretória, que se segue à ovulação e geralmente é mais constante em
tamanho e reflete a vida funcional do corpus lutheum. Contudo, em primatas de ciclo
menstrual, existe ainda uma quarta fase, chamada menstrual (ASA, 1996). A fase
menstrual ocorre quando não há a fertilização do oócito liberado na ovulação e,
conseqüentemente, não há a nidação. A fase menstrual dá-se com o colapso e
parcial destruição do endométrio, seguida de descamação deste (HERNANDÉZ-
LÓPEZ, 1998).
As diferenças básicas entre os ciclos estral e menstrual são que no estral, a
cobertura está limitada ao período do cio, que coincide com a ovulação, enquanto
que, em espécies de ciclo menstrual, a relação sexual não está restrita a uma fase
específica do ciclo, e a ovulação ocorre na metade deste. O ciclo estral estende-se
de uma ovulação a outra, enquanto que o menstrual delimita-se entre uma
menstruação e outra (ASA, 1996). O sangramento característico que ocorre no estro
é decorrente do aumento de estrógeno, e acontece no período periovulatório,
durante o estro. No ciclo menstrual, o sangramento dá-se pela diminuição a níveis
basais de estrógeno e progesterona e ocorre logo após a fase luteal (HERNANDÉZ-
LÓPEZ, 1998).
25
4.1. O gênero Cebus
O gênero Cebus habita quase toda a região neotropical e seu habitat é o
mais diversificado dos primatas neotropicais, utilizando todos os estratos arbóreos
de florestas chuvosas inundáveis ou não, florestas primárias, secundárias, caatinga,
palmeirais, campos mangues, adaptando-se a uma alimentação onívora
grandemente variada (AURIQUIO, 1995).
Formam grupos de 8 a 16 indivíduos. As fêmeas do gênero Cebus atingem
a maturidade sexual com aproximadamente 04 anos, apresentam um ciclo menstrual
que dura de 15 a 20 dias e a gestação pode levar em média 180 dias. Podem se
reproduzir até os 25 anos, e chegar aos 44 anos em cativeiro (AURIQUIO, 1995).
Dentro do gênero Cebus, destacamos a espécie C. apella, que tem sido considerada
o primata neotropical mais inteligente, sendo muito utilizada na pesquisa biomédica
(DE LUCA, 1995).
4.1.1. A espécie Cebus apella
A espécie C.apella é um primata neotropical que pertence à infra-ordem
Platyrrhini, superfamília Ceboidea, família Cebidae, subfamília Cebinae, gênero
Cebus (MONTEIRO da CRUZ, 1998). Dentro da subfamília Cebinae, o gênero
Cebus está entre os primatas neotropicais mais importantes para a pesquisa
biomédica, incluindo reprodução, neurofisiologia, imunologia e virologia (HEARN,
1994).
4.2. O ciclo menstrual de Cebus apella
Em uma revisão acerca da atividade sexual em primatas não-humanos,
BLAFFER e WHITTEN (1987) referem-se ao ciclo menstrual como sendo típico de
primatas do Velho Mundo. Estes autores basearam-se na observação do
sangramento cíclico. Contudo, sabe-se que, para uma classificação precisa do ciclo
ovariano em primatas, são necessários estudos endocrinológicos e citológicos.
Recentemente, tem sido descrito o ciclo ovariano de várias espécies de primatas
26
neotropicais e demonstrado que existem espécies de primatas do Novo Mundo que
possuem ciclo menstrual (HERNANDÉZ-LÓPEZ, 1998).
As fêmeas da espécie Cebus apella atingem a puberdade com 6-8 anos de
idade (HEARN, 1994), e apresentam um ciclo menstrual que varia de 18 a 21 dias
(WRIGHT e BUSH, 1977; NAGLE et al., 1979 e 1980, LINN et al., 1995, FRAGASZY
e ADAMS-CURTIS, 1998). A duração do período gestacional é, em média, de 153 a
160 dias (WRIGHT e BUSH, 1977; FRAGASZY e ADAMS-CURTIS, 1998). A fêmea
da espécie C. apella pode conceber pela primeira vez aos 5 anos de idade, quando
apresentam 90% do peso de um indivíduo adulto. Entre 4-6 anos, os animais ainda
são considerados sub-adultos (FRAGASZY e ADAMS-CURTIS, 1998) e podem
apresentar atividade reprodutiva até os 25 anos, e chegar aos 44 anos em cativeiro
(AURIQUIO, 1995).
4.2.1. Fase folicular
Segundo WRIGHT e BUSH (1977), a fase folicular dura 4 dias, enquanto
que NAGLE et al. (1979) consideram que a fase folicular em C. apella dura 7-9 dias.
Contudo, vale ressaltar que WRIGHT e BUSH (1977) dividem o ciclo menstrual da
fêmea de C. apella em proestro, estro, metaestro e diestro. Para estes autores, o
proestro e estro possuem 4 e 3 dias, respectivamente, dando um total de 7 dias, o
que corresponde a um valor próximo ao de NAGLE et al. (1979).
No início da fase de crescimento folicular (dias 01-04 do ciclo), os níveis
plasmáticos de 17β-estradiol estão por volta de 70-100 pg/mL. Os valores de 17β-
estradiol aumentam gradativamente, e ocorre um pico deste hormônio entre os dias
7-10 do ciclo (NAGLE et al., 1979 e 1980), quando os valores plasmáticos de 17β-
estradiol atingem 503,3 + 30,6 pg/mL (NAGLE et al., 1979). O pico de 17β-estradiol
é seguido pelo seu declínio gradual que começa a partir de 24 horas após o seu
pico, quando seus níveis plasmáticos estão basais (NAGLE et al., 1980). Os níveis
plasmáticos de progesterona estão baixos durante toda a fase folicular (2,1-10
ng/mL) (NAGLE et al., 1979 e 1980). Contudo, 12 horas após o pico de 17β-
estradiol, os níveis plasmáticos de progesterona começam a aumentar e dentro de
24 horas após o pico de 17β-estradiol atingem os valores de 12 - 15 ng/mL (NAGLE
et al., 1980). Ambos os ovários liberam quantidades similares de progesterona
durante a fase folicular (NAGLE et al., 1994).
27
4.2.2. Ovulação
NAGLE et al. (1980) descreveram com o emprego da laparoscopia que a
ovulação na espécie C. apella ocorre entre os dias 08 – 11 do ciclo menstrual. O
folículo pré-ovulatório pode alcançar 10 -12 mm de diâmetro, apresenta um aspecto
edemaciado, a parede folicular está translúcida e chega a ocupar mais da metade do
ovário. A ovulação de um único folículo ocorre dentro de 10-24 horas (18,1 + 0,9
horas) após o pico de estradiol. No momento da ovulação, as fímbrias ficam em
íntimo contato com o ovário, impossibilitando a manipulação destas estruturas sem
acarretar danos. Este processo pode levar até 2 horas. A fossa de ovulação em C.
apella pode permanecer aberta no corpus luteum em regressão durante muito
tempo, independente da ciclicidade da fêmea (NAGLE et al., 1980).
Segundo NAGLE et al. (1994), a taxa de ovulação em C. apella é de
aproximadamente 90%, sendo que 67,5% ocorrem no ovário esquerdo, existindo um
mecanismo intrínseco que regula a alternância na ovulação entre os ovários. A base
anatômica deste mecanismo seria o ligamento útero-ovariano, que participa
promovendo a transferência de substâncias originadas no útero que irão regular a
função ovariana (NAGLE et al., 1989).
NAGLE et al. (1994) descreveram detalhadamente o ligamento útero-
ovariano. Segundo estes autores, o exame histológico deste ligamento mostra que
este contém muitos vasos linfáticos, capilares, nervos e um tronco arterial principal
altamente convoluta que se interconecta com um complexo venoso. A secção do
ligamento útero-ovariano de um dos ovários leva à diminuição dos valores
plasmáticos de estradiol e progesterona durante a fase luteal, e esta tende a ser
mais curta do que em fêmeas com os ligamentos direito e esquerdo intactos.
Contudo, quando o ovário desconectado é removido, a taxa de ovulação, bem como
os níveis hormonais e o tamanho da fase luteal voltam aos valores normais. Para
estes autores, o ligamento útero-ovariano da fêmea de C. apella está envolvido na
alternância da ovulação entre os ovários, bem como no controle da função do corpus
luteum por substâncias produzidas pelo útero. Contudo, mais estudos ainda são
necessários para a compreensão destes mecanismos.
No intuito de estudar a fisiologia das estruturas ovarianas tais como o
crescimento do folículo dominante e a formação do corpo lúteo, atualmente a ultra-
sonografia emerge como um método essencial. A ultra-sonografia é uma importante
28
ferramenta em programas de reprodução assistida por ser um método não invasivo,
quando comparado com a laparotomia e laparoscopia, sem risco para a vida do
indivíduo em estudo, e que permite não somente o monitoramento das estruturas
ovarianas, mas também a obtenção de mapas representativos do fluxo sanguíneo
através do doppler colorido (Collor Doppler) e do Doppler-fluxométrico (Spectral
Doppler) (COLLINS et al., 1991; BRANNSTROM et al., 1998; ACOSTA et al., 2002).
No entanto, em se tratando da espécie C. apella, ainda são necessários estudos que
utilizem a ultra-sonografia como método de avaliação da atividade ovariana.
4.2.3. Fase luteal
A fase luteal tem duração de 12-13 dias. Cinco dias após o pico de 17β-
estradiol, os valore plasmáticos deste hormônio atingem a menor concentração (53,
6 + 5,1 pg/mL), não sofrendo nenhum aumento significativo durante toda a fase
luteal. O primeiro aumento na concentração de plasmática de progesterona ocorre
entre 12-24 horas após pico de 17β-estradiol, e 6 dias após, alcança o valor máximo
de 66,9 + 5,6 ng/mL. Um dia antes da menstruação, ocorre um declínio abrupto da
progesterona plasmática, que chega a assumir a sua menor concentração (NAGLE
et al., 1979).
NAGLE et al. (1980) relataram a persistência do corpus luteum por vários
ciclos, inclusive com a manutenção do local da ovulação evidentes. Contudo, estes
autores não estudaram a funcionalidade deste corpus luteum de ciclos anteriores.
Em condições basais, concentrações de progesterona são semelhantes nas veias
dos ovários com (+CL) e sem (- CL) o corpus luteum. Sugere-se que a alta taxa de
secreção de progesterona e a simetria da produção deste hormônio pelos ovários
direito e esquerdo da macaca-prego indicam que existe um sistema de comunicação
entre os ovários, bem como há a possibilidade de existir um tecido semelhante ao
luteal no ovário – CL, capaz de produzir quantidades relativamente grandes de
progesterona (NAGLE et al., 1989).
4.2.4. Fase menstrual
A fase menstrual dura de 0-8 dias segundo WRIGHT e BUSH (1977) e 1-5
dias para NAGLE et al. (1979 e 1980). Durante a menstruação, têm-se os menores
valores plasmáticos de 17β-estradiol e progesterona (NAGLE et al., 1979). De
29
acordo com WRIGHT e BUSH (1977), NAGLE et al. (1979 e 1980), LINN et al.
(1995) e AURICHIO (1995), é possível a visualização de um pequeno sangramento,
caracterizando a fase menstrual. Contudo, WRIGHT e BUSH (1977) e NAGLE et al
(1979 e 1980) realizaram estudos citológicos para determinar o tipo de ciclo da
fêmea de C. apella, constatando que o sangramento, apesar de não ser
pronunciado, ocorre logo após a fase luteal, e não no período periovulatório, como
acontece em fêmeas de ciclo estral como a cadela. Segundo STRASSMANN (1996),
o pequeno sangramento durante a fase menstrual nos platyrrhines é decorrente da
presença de arteríolas uterinas retas ao invés de espiraladas.
4.2.5. Ciclicidade do epitélio vaginal
A fêmea de C. apella apresenta mudanças cíclicas no epitélio vaginal que
acompanham a ciclicidade ovariana (HEARN, 1994). De acordo com WRIGHT e
BUSH (1977) tais mudanças no epitélio vaginal podem ser utilizadas para determinar
o período em que a ovulação irá ocorrer. Estes autores descrevem que durante o
proestro, estro, metaestro e diestro, o número de células epiteliais imaturas (basais)
é relativamente constante. Contudo, é a presença de células epiteliais maduras
(parabasais), de transição (intermediárias) e cornificadas (superficiais) que indica
que a fêmea está no estro e, neste momento, o acasalamento resultará em
gestação. O número de células epiteliais maduras é grande durante o estro, diminui
no proestro e está em quantidades médias durante o metaestro e diestro. Contudo,
apesar de WRIGTH e BUSH (1977) terem utilizado esta classificação para dividir as
fases do ciclo da fêmea de C. apella, estes autores concluem que esta espécie de
primata neotropical possui ciclo menstrual. Segundo NAGLE e DENARI (1979), cinco
fases podem ser identificadas através da citologia vaginal em fêmeas de C. apella de
acordo com as características das células vaginais e pela presença ou ausência de
eritrócitos e leucócitos, sendo estas fases divididas em menstrual, folicular,
periovulatória, luteal inicial e luteal. Em Cebus apella, o aumento da quantidade de
células superficiais e intermediárias é que pode ser usado como parâmetro para
identificar a fase periovulatória, sendo, desta forma, possível identificar o início e o
fim desta fase.
30
4.3. O uso de técnicas de reprodução assistida na espécie C.apella
Apesar da espécie C. apella ser uma das mais importantes para a pesquisa
biomédica, ainda existem poucos trabalhos visando ao desenvolvimento de
biotécnicas de reprodução nesta espécie de primata neotropical. O uso da espécie
C.apella como modelo experimental no desenvolvimento de técnicas de reprodução
assistida que visem a aumentar o potencial reprodutivo de fêmeas de primatas
neotropicais ameaçadas de extinção ainda é muito restrita, apesar de alguns
aspectos de sua fisiologia reprodutiva ser objeto de estudo de muitos pesquisadores
(WRIGHT e BUSH, 1977; NAGLE et al., 1979 e 1980; NAGLE et al., 1989; NAGLE et
al., 1994; LINN et al.,1995; DOMINGUES et al., 2004; ORTIZ et al., 2004).
As técnicas de reprodução assistida, tais como produção e transferência de
embriões, transgênese e clonagem podem ser empregadas tanto em animais de alto
valor genético, bem como em espécies ameaçadas de extinção. No entanto, estas
possuem o seu impacto limitado devido à dificuldade de obtenção de oócitos viáveis
através da maturação in vitro. Dentro deste contexto, DOMINGUES et al. (2003)
adaptaram uma técnica de isolamento de folículos pré-antrais (FOPA) de Cebus
apella utilizando o Tissue Chopper. No entanto, vale ressaltar que o cultivo de
folículos pré-antrais somente está mais bem estabelecida apenas em camundongos.
EPPIG e SCHROEDER (1989) obtiveram o nascimento de camundongos a partir de
oócitos obtidos de folículos pré-antrais cultivados in vitro. Posteriormente, CARROL
et al. (1990) obtiveram produtos viáveis, após isolar, criopreservar e cultivar folículos
pré-antrais de camundongo. Para que tais feitos sejam possíveis na espécie C.
apella são necessários estudos sobre a oogênese e a foliculogênese nas fases pré-
antral e antral.
DOMINGUES et al. (2004) descreveram aspectos gerais da oogênese e
foliculogênese nas fases pré-antral e antral na espécie C. apella através do estudo
da população folicular ovariana. No entanto, o presente estudo limita-se pelo
emprego da histologia óptica, que não permite acompanhar exatamente crescimento
dos folículos ovarianos, mas apenas estimá-los através de modelos matemáticos.
Técnicas tais como a laparotomia, laparoscopia e a ultra-sonografia em tempo real
são de grande valor, por permitirem acompanhar o crescimento de folículos antrais
in situ. No entanto, estas técnicas estão limitadas pelo fato de que não permitem
acompanhar o crescimento de folículos antrais menores do que 1,0 mm. Para tal o
cultivo in vitro de folículos pré-antrais poderá ser de grande valor. Dentro deste
31
contexto, ressaltamos que ainda são necessários muitos estudos visando ao
desenvolvimento de técnicas de reprodução assistida na espécie C. apella, o que
justificou ao presente trabalho de tese.
4.4. Recuperação de oócitos oriundos de folículos antrais
Um dos principais fatores limitantes das biotécnicas aplicadas à
reprodução, como FIV, TE e a clonagem em primatas neotropicais, é a obtenção de
oócitos viáveis e o desenvolvimento de protocolos de maturação in vitro
desenvolvidos especificamente para a espécie em estudo. Estes oócitos podem ser
obtidos a partir de folículos antrais (DOMINGUES et al., 2003a)
Oócitos de folículos antrais podem ser obtidos a partir de laparotomia,
laparoscopia ou ultra-sonografia. Ainda existe a possibilidade de obtenção de
oócitos de folículos antrais de ovários obtidos post mortem ou através de
ovariectomias (DONOGHUE et al., 1990; WILDT, 1991; LUVONI E OLIVA,1993). No
entanto, oócitos obtidos post mortem têm a desvantagem de nem sempre terem uma
boa qualidade do oócito, considerando os efeitos deletérios dos eventos post
mortem sobre o ovário, enquanto que as ovariectomias têm a desvantagem de
esterilizar irreversivelmente a fêmea doadora do ovário. Desta forma, a obtenção de
oócitos por meio da punção de folículos antrais com o auxílio da laparotomia,
laparoscopia ou ultra-sonografia são métodos a serem considerados com atenção.
Em primatas neotropicais da espécie C. apella existem poucos trabalhos
sobre os folículos antrais (NAGLE et al., 1980, DOMINGUES et al., 2003a;
DOMINGUES et al., 2004), e a inexistência de técnicas visando à obtenção de
oócitos a partir de folículos antrais dificulta a elaboração de protocolos para a
maturação in vitro (MIV) de oócitos provenientes desses folículos.
Caso os oócitos não sejam imediatamente submetidos à FIV, existe a
possibilidade de sua preservação (AMAN e PARKS, 1994; RODRIGUES et al.,
2002). A criopreservação de oócitos oriundos de folículos antrais já demonstrou
sucesso em camundongos (CARROL e GOSDEN, 1993), coelhos (VICENT et al.,
1989) e bovinos (FUKU et al., 1992), sendo realizada FIV após a descongelação,
resultando no nascimento de crias normais em todas essas espécies.
Segundo HILDEBRANT et al. (2000), a obtenção de imagens
ultrassonográficas do trato reprodutor oferece novas oportunidades no que diz
respeito à indução de ciclos sexuais e ovulação, à implantação de regimes de
32
superovulação, programas de contracepção, coleta de sêmen e técnicas de extração
espermática diretamente do testículo, bem como à aplicação da punção oocitária
ecoguiada.
A técnica de punção oocitária ecoguiada foi primeiramente descrita por
PIETERSE et al. (1988). Faz-se a visualização dos folículos ovarianos através da
ultra-sonografia, puncionando-os com uma agulha acoplada a uma guia de biópsia,
sendo que o conteúdo puncionado será direcionado para um tubo coletor. Os oócitos
coletados podem ser, então, utilizados em estudos de maturação, fertilização e
cultivo in vitro (NIBART et al., 1997). Essa técnica é amplamente utilizada na espécie
bovina e os resultados obtidos mostram a possibilidade de repetidas coletas, tanto
em fêmeas gestantes quanto não-gestantes (NIBART et al., 1995; LACAZE et al.,
1997; GUYADER-JOLY et al., 1997). Mas para que o punção oocitária ecoguiada
seja uma realidade em primatas neotropicais, faz-se necessário, primeiramente, o
estudo do crescimento folicular a partir da ultra-sonografia.
Por sua vez, a laparotomia e laparoscopia são métodos diretos de
referência para observar o crescimento folicular e a ovulação. Em fêmea de C.
apella, o folículo pré-ovulatório em desenvolvimento pode ser identificado 04 dias
antes da ovulação através de laparoscopia (NAGLE et al., 1980) e até 06 dias
através da laparotomia (DOMINGUES et al., 2003b). Apesar da eficiência da
laparotomia e da laparoscopia como técnicas para predizer o período da ovulação,
estas são difíceis de serem utilizadas rotineiramente por serem invasivas. Desta
forma, estudos visando a descrever as particularidades do crescimento folicular a
partir da ultra-sonografia são de grande importância, não somente para a
compreensão da foliculogênese na fase antral, mas também porque permite
estabelecer protocolos menos invasivos de obtenção de oócitos in vivo a partir de
folículos antrais, sem a necessidade de remoção do ovário.
33
OBJETIVOS
Objetivo geral
• Estudar a oogênese e a foliculogênese a partir de folículos antrais, bem como a
maturação oocitária in vivo na espécie Cebus apella.
Objetivos específicos
• Estabelecer um protocolo para a obtenção de oócitos provenientes de folículos
antrais.
• Caracterizar o crescimento de folículos antrais na fase folicular em fêmeas adultas
de C. apella com o uso da ultra-sonografia.
• Estudar o perfil protéico do complexo cumulus oophurus, correlacionando com a
qualidade deste último (atrésico ou saudável) e a fase de desenvolvimento
(tamanho do folículo e fase do ciclo menstrual).
34
TRABALHOS
35
OBTENÇÃO DE OÓCITOS PROVENIENTES DE FOLÍCULOS ANTRAIS EM
FÊMEAS ADULTAS DE Cebus apella (MACACO-PREGO)
Oocyte recovery from antral follicles in Cebus apella adult female
Domingues, S. F. S.1,2; Caldas-Bussiere, M. C.2; Martins, D. N. 1; Amorim, R. A.3
1Universidade Federal do Pará, Castanhal - PA, 2 Setor de Reprodução Animal, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuária, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes-RJ, 3Centro Nacional de Primatas – Secretaria
de Vigilância Sanitária (CNP-SVS), Ananindeua-PA
Endereço para correspondência: 1Universidade Federal do Pará, Curso de Medicina
Veterinária, Núcleo de Ciência Animal, Centro Agrociências, Belém – PA, (Rua Augusto
Corrêa, Campus Básico, cep: 66075-110), e-mail: [email protected]
36
Resumo
A espécie Cebus apella (macaco-prego) é um importante modelo experimental
para a pesquisa biomédica, e potencialmente para o desenvolvimento de programas de
biotecnologia de reprodução aplicados a primatas neotropicais em perigo de extinção.
Visto que existem poucos trabalhos visando ao desenvolvimento de biotécnicas de
reprodução em fêmeas desta espécie, o presente trabalho visa a descrever o número de
oócitos obtidos pela punção folicular nos dias 5, 7 e 9 do ciclo menstrual em fêmeas
(n=6) adultas de C. apella. No dia 5 do ciclo tem-se o predomínio de folículos pequenos,
que vão diminuindo gradualmente até o dia 9 do ciclo. O total de oócitos recuperados por
meio da punção folicular foi de 31, o que corresponde a uma média (M + EP) de 2,0 +
0,5; 1,7 + 0,2 e 2,2 + 0,7 oócitos por animal nos dias 5, 7 e 9 do ciclo, respectivamente.
A média do diâmetro dos oócitos foi de 136,6 + 10,2 µm. Demonstramos que é possível
obter complexos cumulus-oophurus de C. apella, por meio da punção folicular com o
uso da laparotomia nos dias 5, 7 e 9 do ciclo.
Palavras -chave: Punção folicular, ovário, C. apella, complexo cumulus oophurus
Abstract
The Cebus apella species (capuchin monkey) is an important experimental model
to the biomedical research and potentially for the development of biotechnologies
reproduction programs applied in endangered neotropical primates. Since there are few
works about folliculogenesis in females of this species, the present study aimed to
describe the number of oocyte recovered from antral follicles on days 5, 7 and 9 of
menstrual cycle of Cebus apella female (n=6). In the 5 of the cycle the prevalence of
small follicles is had, that are going decreasing gradually until the 9 of the cycle. The
total of oocytes recovered by the follicular aspiration were of 31.0, which corresponds
2.0 + 0.5; 1.7 + 0.2 and 2.2 + 0.7 mean (M+ SEM) of oocytes per animal on day 5, 7 and
9 of the cycle, respectively. The average of the diameter of the oócitos was of 136,6 +
10,2 mm. It is demonstrated that is possible to obtain complex cumulus-oophurus of C.
apella, using the follicular aspiration by laparotomy in the 5, 7 and 9 days of the cycle.
Key-words: Follicle aspiration, ovary, C. apella, cumulus oophurus complex
Introdução
O Brasil é o país com a maior diversidade de primatas do mundo, mas que,
atualmente, segundo a categoria de ameaça, possui 08 espécies de primatas neotropicais
37
criticamente em perigo, 05 em perigo e 10 vulneráveis (BRASIL, 1989), distribuídos nas
famílias Atelidae, Callitrichidae, Cebidae e Pitheciidae. Dentro deste contexto, torna-se de
grande importância o estudo da biologia e da fisiologia da reprodução dos primatas
brasileiros, bem como o fortalecimento da pesquisa básica e aplicada que vise o
desenvolvimento de biotecnologias aplicadas à reprodução em primatas neotropicais em
perigo de extinção.
Dentre os primatas neotropicais, a espécie Cebus apella (macaco-prego) destaca-se
como uma das mais importantes para a pesquisa biomédica, por ser de fácil manutenção em
cativeiro, reproduzindo-se anualmente (De Luca, 1995) e devido à sua semelhança
fisiológica, morfológica e filogenética com a espécie humana (Domingues, 2000; Silva Jr.;
2001; Domingues e Bussiere, 2002; Domingues et al., 2003). No tocante à fisiologia
reprodutiva, a espécie C. apella apresenta um ciclo menstrual variando de 18 a 21 dias
(Wright e Bush, 1977; Nagle et al., 1979 e 1980, Linn et al., 1995, Fragaszy e Adams-Curtis,
1998), sendo dividido em fases folicular, luteal e menstrual (Nagle et al., 1979, 1980), com a
ovulação ocorrendo entre os dias 07 e 11 (Nagle et al., 1979).
A facilidade de monitorar as diferentes fases do ciclo menstrual de fêmeas adultas de
C. apella é uma das características que fazem desta espécie um modelo experimental de
grande importância para a pesquisa biomédica. No entanto, apesar de seu grande potencial, no
Brasil ainda existem poucos trabalhos visando ao desenvolvimento de biotecnologias
aplicadas à reprodução nesta espécie (Domingues, 2000; Domingues e Bussiere, 2002;
Domingues et al., 2003).
Em outras espécies de primatas neotropicais, o uso de biotécnicas aplicadas à
reprodução, como fertilização in vitro (FIV) (Marshall et al., 2003), transferência de embrião
(TE) (Marshall et al., 2003), ativação partenogenética (Marshall et al., 1998) e cultivo de
folículos pré-antrais (Nayudu e Michelmann, 2003) tem sido empregado em Callithrix
jacchus. Por sua vez, trabalhos visando à FIV e TE têm sido descritos em Saimiri sciureus
(Cline et al., 1972; Kuehl e Dukelow, 1975; Asakawa e Dukelow, 1982; Pierce et al., 1993).
Entretanto, vale ressaltar que C. jacchus (Abbot e Hearn, 1978) e S. sciureus (Gould et al.,
1973) são primatas neotropicais de ciclo estral e, conseqüentemente, apresentam uma
fisiologia reprodutiva distinta da espécie C. apella.
Em primatas de ciclo menstrual do Velho Mundo, existem vários trabalhos
desenvolvidos, principalmente com macaco rhesus (Macaca mulata), envolvendo MIV
(Zheng et al., 2001), FIV e TE (Vande Voort et al., 2003), clonagem por bipartição
38
embrionária (Mitalipov et al., 2002b) e transferência nuclear (Wolf et al., 1999; Mitalipov et
al., 2002a).
Um dos principais fatores limitantes das biotécnicas aplicadas à reprodução é a
obtenção de oócitos viáveis e o desenvolvimento de protocolos de maturação in vitro
desenvolvidos especificamente para a espécie em estudo. Dentro deste contexto é que foram
realizados estudos da população folicular ovariana de C. apella (Domingues, 2000;
Domingues et al., 2003; Domigues et al., 2004) e, posteriormente, a adaptação de um método
de isolamento de folículos pré-antrais nesta espécie, com o intuito de obter folículos pré-
antrais para o cultivo in vitro e disponibilizar um maior número de oócitos viáveis para a FIV,
TE e até mesmo a clonagem (Domingues, 2000; Domingues et al., 2003).
Entretanto, apesar de existirem dados sobre a população de folículos pré-antrais em C.
apella (Domingues, 2000; Domingues et al., 2003; Domingues et al., 2004), ainda são poucos
os trabalhos sobre a dinâmica folicular nesta espécie (Nagle et al., 1980, Domingues et al.,
2003), além da inexistência do estabelecimento de técnicas visando à obtenção de oócitos a
partir de folículos antrais, o que dificulta a elaboração de protocolos para a maturação de
oócitos in vitro (MIV) provenientes de folículos pré-antrais e antrais.
Desta forma, considerando a escassez de dados sobre o desenvolvimento de folículos
antrais, bem como a ausência da descrição de técnicas visando a obtenção de oócitos in vivo a
partir de folículos antrais de primatas C. apella, objetivou-se no presente trabalho descrever o
número e o tamanho de folículos e corpos lúteos presentes nos ovários nos dias 5, 7 e 9 do
ciclo ovariano de C. apella, bem como relatar o número, as dimensões e a qualidade dos
oócitos obtidos pela punção folicular por laparotomia.
Material e Métodos
Todos os procedimentos realizados no presente trabalho foram avaliados e aprovados
pelo comitê de ética em pesquisa com animais do Instituto Evandro Chagas (CEPAN-IEC-
SVS). Foram utilizadas fêmeas (n=6) adultas de C. apella do Centro Nacional de Primatas
(CENP-SVS), com histórico prévio de ciclicidade ovariana normal. O CENP localiza-se na
cidade de Ananindeua (latitude: 1º 22' 30"sul, longitude: 48º 22' 30" oeste; Miranda e
Coutinho; 2005). O clima é megatérmico, úmido, temperatura média em torno de 25ºC, com
pequena amplitude térmica. O regime pluviométrico é de 2.250 a 2.500mm, com chuvas
regulares, porém com maior concentração de janeiro a junho. A umidade relativa do ar é de
aproximadamente 85% (http://www.governodopara.gov.br).
39
As fêmeas foram mantidas em galpões telados, onde permaneceram em gaiolas
individuais de alumínio, com dimensões de 80x90x80 cm, ficando então sujeitas ao
fotoperíodo natural. A alimentação diária foi à base de frutas, verduras, legumes, ração
peletizada (FOXY Junior Supreme 1) e água ad libitum.
Citologia vaginal diária foi realizada em todos os animais com o objetivo de
determinar o primeiro dia do ciclo menstrual. Os animais foram contidos com o uso de
cloridrato de ketamina2 (10mg/Kg) e xilazina1 (1mg/Kg) durante este procedimento. As
fêmeas C. apella foram submetidas à laparotomia sob anestesia inalatória com halotano3,
fornecido por um circuito anestésico semi-fechado, diluído em O2/N2O (50:50%), com
concentração de indução de 8% e manutenção de 2 %. A cirurgia foi iniciada depois de
instalado o plano anestésico adequado, com relaxamento muscular e analgesia. As punções
foliculares foram realizadas nos dias 05 (n=5), 07 (n=6) e 09 (n=5) do ciclo menstrual.
Os folículos antrais pequenos (2 mm), médios (2 mm > e < 4 mm) e grandes (> 4 mm)
foram puncionados utilizando-se uma seringa de insulina (1,0 ml) com agulha (12x7). Foi
utilizada uma seringa diferente para cada folículo antral puncionado. A qualidade do oócito
foi avaliada com o auxílio de um microscópio invertido (ZEISS), sendo usado como critério
de boa qualidade do oócito a homogeneidade e transparência do ooplasma e presença de
várias camadas de células do cumulus rodeando o oócito. Desta forma, os oócitos coletados
foram classificados em desnudo (OD) ou contendo várias células do cumulus (CCO intacto)
(Rodrigues e Farin, 2004).
Durante os procedimentos cirúrgicos, todos os folículos antrais e corpos lúteos visíveis
presentes na superfície dos ovários direito e esquerdo foram contados e mensurados com o
auxílio de uma escala milimétrica. Foi administrado às fêmeas flunixim-meglumine4 (1
mg/kg) durante três dias, com o intuito de promover analgesia durante o período de
recuperação após as cirurgias. As fêmeas somente eram manipuladas novamente após a
recuperação completa da laparotomia e quando a atividade cíclica do ovário estava dentro dos
parâmetros normais para a espécie durante dois ciclos consecutivos.
1 FOXY Junior Supreme, PROVIMI, Brasil. 2 Kőning, Avellaneda, Argentina. 3 Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda, Brasil. 4 Schering-Plough Coopers, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil.
40
Análise Estatística
Os dados obtidos no presente trabalho estão representados em média + EP. Para
comparar a média dos folículos antrais, a média e os percentuais de oócitos desnudos e CCOs
recuperados dentro de um mesmo dia e entre os diferentes dias do ciclo menstrual de C.
apella, foi utilizado o teste t não-pareado. As médias de folículos antrais, complexos cumulus-
oophurus (CCO), percentual de oócitos desnudos e CCOs recuperados nos ovários direito e
esquerdo nos dias 5, 7 e 9 do ciclo foram comparadas utilizando-se o teste de Whitney-Mann.
Todos os testes foram aplicados a 5% de probabilidade.
Resultados
No presente trabalho, foi descrito a distribuição de folículos antrais pequenos, médios,
grandes e de corpos lúteos, bem como a obtenção e a qualidade de oócitos provenientes de
folículos antrais durante os dias 05, 07 e 09 do ciclo menstrual de C. apella por laparotomia.
Foram realizadas 16 punções foliculares por laparotomia, em decorrência de duas fêmeas terem
participado apenas de duas cirurgias, nos dia 05 e 07, e 07 e 09, respectivamente.
A distribuição dos folículos antrais presentes nos ovários nos dias 05, 07 e 09 do ciclo
menstrual de C. apella está representada na Tabela 01. As médias de folículos pequenos
presentes por ovário foram superiores às dos folículos médios e grandes encontrados nos dias
05 (p=0,0001), 07 (p=0,002 e p=0,007) e 09 (p=0,007 e p=0,02). O número de folículos
médios foi menor em relação ao número de folículos grandes (p=0,006) no dia 07 do ciclo
Não houve diferença estatística entre os ovários direito e esquerda em relação às médias dos
folículos antrais encontrados nos três dias do ciclo.
Tabela 01. Número de folículos antrais presentes por ovário nos dias 5, 7 e 9 do ciclo
menstrual de fêmeas adultas de primatas da espécie C. apella.
Dia do ciclo
05 07 09
Pequeno (2mm) 3,7 + 0,5aA 2,6 + 0,7aAB 1,4 + 0,4aB
Médio (>2 a ≤ 4mm) 0,4 + 0,2bA 0bA 0,2 + 0,1bA
Grande (≥4mm) 0,4 + 0,2bA 0,4 + 0,1cA 0,4 + 0,2bA
Total 4,2 + 0,7A 3,0 + 0,8AB 2,0 + 0,4B
a-b Diferenças significativas entre linhas dentro de uma mesma coluna indicam (P<0,05). A-B Diferenças significativas entre colunas dentro de uma mesma linha (P<0,05).
41
O número médio de corpos lúteos de ciclos anteriores (sem a fossa de ovulação
aparente) encontrado nos ovários direito e esquerdo foi de 0,73 + 0,2 e 0,55 + 0,2,
respectivamente. Duas fêmeas ovularam antes da punção folicular no dia 7 e uma fêmea no
dia 9, sendo possível, inclusive, constatar a fossa de ovulação recém-formada e a cavidade
antral repleta de sangue. Das fêmeas que ovularam antes da punção folicular, em apenas uma
não conseguimos coletar nenhum CCO, o que significa que em 94,4% das cirurgias foi
possível recuperar oócito por meio da punção folicular de outros folículos (pequenos e
médios).
A Tabela 02 apresenta a média de CCOs recuperados de folículos antrais por animal
nos dias 05, 07 e 09 do ciclo. O total de oócitos recuperados por meio da punção folicular foi
de 31, o que corresponde a uma média de 2,0 + 0,5; 1,7 + 0,2 e 2,0 + 0,8 oócitos por animal
nos dias 5, 7 e 9 do ciclo, respectivamente. Em uma das fêmeas, foram obtidos 5 complexos
cumulus-oophurus no dia 9 do ciclo.
Não houve diferença estatística no número total de oócitos coletados entre os três dias
do ciclo (Tabela 02). No entanto, o número médio de oócitos provenientes de folículos
pequenos no dia 5 foi superior ao dos recuperados a partir de folículos médios (p=0,01). No
dia 7 do ciclo, a média de oócitos recuperados de folículos grandes por animal foi
estatisticamente superior à dos oócitos recuperados de folículos médios (p= 0,03). Não houve
diferença significativa no número de oócitos recuperados de folículos pequenos, médios e
grandes no dia 9 do ciclo em ambos os ovários.
Tabela 02. Número de complexos cumulus oophorus (CCO) recuperados por animal nos dias
5, 7 e 9 do ciclo menstrual de fêmeas adultas de primatas da espécie C. apella.
Dia do ciclo 05 07 09
Pequeno (2mm) 1,2 + 0,2aA 0,7+ 0,2aB 1,2+ 0,7 aA
Médio (>2 a ≤ 4mm) 0,2+ 0,2bA 0,0bA 0,2+ 0,2 aA
Grande (≥4mm) 0,6+ 0,2abA 1,0+ 0,2 aB 0,6+ 0,2 aA
Total 2,0 + 0,5A 1,7 + 0,2A 2,0 + 0,8A
a-b Diferenças significativas entre linhas dentro de uma mesma (P<0,05) A-B Diferenças significativas entre colunas dentro de uma mesma linha (P<0,05)
Em relação à qualidade dos CCOs obtidos por meio da punção folicular, as médias de
OD e CCOs obtidos estão representados na Tabela 03. Não houve diferença estatística entre a
média de OD e CCO recuperados nos dia 5 e 7. No entanto, no dia 9 do ciclo todos os CCOs
42
recuperados eram intactos e, conseqüentemente, a média de CCOs intactos recuperados foi
estatisticamente superior à de OD (p=0,05). Quando a quantidade de CCOs intactos e OD
recuperados foi comparada entre os diferentes dias, tem-se que a média de OD recuperados no
dia 9 (p=0,006) foi inferior ao do dia 7, e a média de CCOs (p=0,05) obtidos foi superior.
Tabela 03. Qualidade dos oócitos obtidos nos dias 5, 7 e 9 do ciclo menstrual de fêmeas
adultas de primatas da espécie Cebus apella.
Dia do ciclo menstrual
Qualidade do CCO 05 07 09
Compacto 1,2 + 0,4 aAB 0,6 + 0,2 aA 2,2 + 0,7aB
Desnudo 0,8 + 0,5 aAB 1,0 + 0,2 aA 0 bB a-b Diferenças significativas entre linhas dentro de uma mesma (P<0,05) A-B Diferenças significativas entre colunas dentro de uma mesma linha (P<0,05)
No tocante ao aspecto dos CCO (Figura I), tanto oócitos quanto células do cumulus
eram claros quando comparados ao de outras espécies domésticas, tais como bovinos e
camundongos, o que dificultava bastante encontrá-los no fluido folicular após a punção. Para
mensurar os oócitos com precisão, foi necessário desnudá-los, devido à dificuldade na
visualização da zona pelúcida quando o CCO apresentava várias células do cumulus. O
diâmetro médio dos oócitos foi de 136,6 + 10,2 µm. Não houve diferença estatística entre o
diâmetro de oócitos desnudos ou com várias células do cumulus, provenientes de folículos
pequenos, médios e grandes obtidos nos três dias do ciclo de C. apella.
A B C
Figura I- CCO intacto (a), com poucas células do cumulus (b) e desnudos (c) de Cebus apella
obtido a partir de folículo antral pequeno no dia 05 do ciclo (400x).
43
Discussão
No presente trabalho, caracterizamos alguns aspectos do crescimento de folículos
antrais pequenos (2 mm), médios (2 mm > e < 4 mm) e grandes (> 4 mm) durante a fase
folicular de fêmeas adultas de C. apella. Domingues (2000) descreveu, utilizando análise
estereológica, uma população média de 60 folículos antrais por ovário com diâmetro médio
de 514,4 µm (262,0 µm a 983,0 µm) nesta espécie de primata neotropical. Entretanto, devido
à limitação do uso da laparotomia para a aspiração folicular, folículos antrais menores que 2,0
mm não foram objeto de presente estudo.
Os folículos pequenos estavam em maior quantidade em relação aos folículos médios
e grandes nos ovários 5, 7 e 9 do ciclo. No dias 7 e 9, ocorreu um declínio significativo no
número de folículos pequenos quando comparado com o dia 5. Os folículos médios e grandes,
por sua vez, permaneceram constantes durante os três dias do ciclo estudados. Pode-se
sugerir, também, que, entre os dias 7 e 9, além do folículo dominante que continua o seu
crescimento, folículos pequenos com CCOs intactos podem ter sido recrutados e,
conseqüentemente, estavam presentes no dia 9 do ciclo.
Parte dos folículos grandes presentes no dia 5 do ciclo apresentaram CCOs com várias
células do cumulus. Com o delineamento experimental utilizado no presente trabalho, não
podemos afirmar que os folículos grandes presentes no dia 5 do ciclo chegam a crescer até o
estádio de folículo pré-ovulatório. Entretanto, considerando-se que todos os folículos grandes
puncionados nos dias 7 e 9 possuíam oócitos rodeados por várias camadas de células do
cumulus, pode-se sugerir que, desde o dia 5 pode haver um folículo que irá continuar o seu
crescimento até os dias 7 e 9, alcançando o estádio pré-ovulatório.
No dia 9 do ciclo, foram encontrados folículos grandes de até 8 mm, corroborando
com os dados de tamanho de folículo pré-ovulatório observados por Nagle et al. (1980). Os
dados obtidos no presente trabalho permitem a compreensão de algumas características do
crescimento dos folículos antrais em C. apella, entretanto, mecanismos de grande importância
tais como a desvio entre folículos grandes e subordinados ainda necessitam ser mais
elucidados nesta espécie de primata neotropical com o uso da ultra-sonografia.
Em relação a outras espécies de primatas neotropicais, Gilchrist et al. (2001)
realizaram retiradas dos ovários e a dissecção de folículos antrais de C. jacchus durante
quatro períodos da fase folicular, distribuídos entre os dias 1-2, 3-4, 6-7, e 8-9 do ciclo, e um
período da fase luteal, por volta do dia 22. Os autores dividiram os folículos antrais de C.
jacchus em 04 categorias: 0,6-1,0 mm; 1,0-1,5 mm; 1,5-2,0 mm; e > 2,0 mm. Segundo estes
autores, foi possível obter em torno de 68 folículos antrais a partir de 55 pares de ovários,
44
sendo que o percentual médio dos folículos pequenos, com diâmetro médio de 0,6 mm, variou
de 77 % a 100%. Os folículos grandes (2,0 mm) começaram a surgir a partir dos dias 3-4 do
ciclo, com valores máximos nos dias 8-9.
Apesar de Gilchrist et al. (2001) terem trabalhado com folículos bem menores (0,6-1,0
mm), semelhanças com a espécie C. apella foram encontradas, tais como o predomínio de
folículos pequenos durante toda a fase folicular, e o surgimento dos folículos grandes com a
gradual diminuição dos folículos médios a partir desta fase. Vale ressaltar que a espécie C.
jacchus é um primata neotropical poliovular (Abbot e Hearn, 1978), o que acarreta um
recrutamento e seleção de uma maior quantidade de folículos, quando comparado com
espécies monovulares (Fortune, 1994), como é o caso da C. apella.
No presente trabalho, foi possível obter oócitos de folículos antrais durante a fase
folicular de C. apella, com diâmetros variando entre 2 mm a 8 mm, sem a utilização de
estimulação hormonal ovariana. A média de recuperação de oócitos foi semelhante à descrita
para algumas espécies de animais domésticos monovulares. Em eqüinos, Gouldet et al. (1997)
obtiveram uma taxa de recuperação de 3,7 oócitos com aspiração folicular guiada por ultra-
sonografia, tendo sido empregada a estimulação hormonal com eCG previamente.
Em primatas neotropicais, foram realizados trabalhos com o objetivo de se obter
CCOs em S. sciureus (Asakawa e Dukelow, 1982; Pierce et al., 1993) e C. jacchus (Marshall
et al., 2003). Em S. sciureus, foi possível recuperar 877 CCOs de 65 animais 16 h após a
administração de hCG com o uso de laparoscopia (Asakawa e Dukelow, 1982).
Posteriormente, Pierce et al. (1993) descrevem uma média variando entre 0,4 a 2,0 CCOs
obtidos de S. sciureus estimulados com FSH-hCG e hCG. Em C. jacchus, Marshall et al.
(2003), utilizando r-hFSH (1, 10, 25 ou 50 UI), administrados duas vezes ao dia, durante 6
dias e, em seguida, administrando hCG, obtiveram uma média de 1,25; 0,5; 1 e 5 CCOs
respectivamente.
No presente trabalho foi possível obter 1,7 a 2,2 oócitos/animal nos dias 5, 7 e 9 da
fase folicular acompanhando o ciclo menstrual das fêmeas por meio da citologia vaginal
diária, para determinar o primeiro dia do ciclo. Assim, as fêmeas somente eram manejadas no
dia da realização da punção folicular. Com esta rotina simples e de baixo custo, quando
comparadas à da estimulação hormonal, foi possível obter CCOs em C. apella numa
quantidade similar à descrita para outros primatas neotropicais nos quais foi utilizada a
estimulação hormonal.
No tocante ao diâmetro dos oócitos obtidos, Domingues et al. (2004) descreveram que
folículos antrais de diâmetro de até 983,00 µm apresentam oócitos com tamanhos médios de
45
56,6 + 1,5 µm. No presente trabalho, os diâmetros dos oócitos foram de 136,6 + 10,2 µm, não
havendo diferença estatística entre o diâmetro de oócitos desnudos ou com várias células do
cumulus provenientes de folículos pequenos, médios e grandes. Estes dados podem indicar
que, a partir de folículos pequenos (2 mm), o oócito de C. apella atinge seu diâmetro
máximo.
Conclusões
O presente trabalho mostra que é possível obter complexos cumulus-oophurus de C.
apella por meio da punção folicular por laparotomia nos dia 5, 7 e 9 do ciclo. No dia 5 do
ciclo observou-se o predomínio de folículos pequenos em relação aos outros dias e que vão
diminuindo gradualmente de tamanho até o dia 9 do ciclo. Os folículos médios e grandes
estavam presentes nos três dias ciclo, mas no dia 9 é que se observou a maior quantidade de
folículos médios e grandes contendo oócitos de melhor qualidade. A partir dos folículos
pequenos (2mm), o oócito de C. apella atinge o seu diâmetro máximo. Os dados obtidos no
presente trabalho demonstram alguns aspectos sobre a dinâmica folicular em Cebus apella,
que ainda não eram conhecidos, mas que poderão ser de grande importância no
desenvolvimento de biotécnicas aplicadas à reprodução em primatas neotropicais.
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49
PERFIL PROTÉICO DE OÓCITOS E CÉLULAS DO CUMULUS OBTIDOS DE
FOLÍCULOS ANTRAIS DE FÊMEAS ADULTAS DE
MACACO-PREGO (Cebus apella)
Protein profile of oocytes and cumulus cells obtained from antral follicles of adult
Cebus apella female
Domingues, S. F. S.1,2; Silva, L. G.; Caldas-Bussiere, M. C.2; Petretski, M. D;
Martins; N. D. 1; Amorim, R. A.4
1Universidade Federal do Pará, Castanhal - PA, 2 Laboratório de Melhoramento
Genético Animal, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias, Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes-RJ, 3
Laboratório de Química e Fisiologia de Peptídeos e Proteínas, Centro de Biociências e
Biotecnologias; 4Centro Nacional de Primatas – Secretaria de Vigilância Sanitária
(CNP-SVS), Ananindeua-PA
Endereço para correspondência: 1Universidade Federal do Pará, Curso de Medicina
Veterinária, Núcleo de Ciência Animal, Centro Agrociências, Belém – PA, (Rua Augusto
Corrêa, Campus Básico, cep: 66075-110), e-mail: [email protected]
50
RESUMO
A espécie Cebus apella (macaco-prego) é um importante modelo experimental para
o desenvolvimento de biotecnologias de reprodução. Existem poucos trabalhos
sobre a maturação oocitária em fêmeas de macaco-prego, assim, o presente
trabalho visou a descrever o perfil protéico de oócitos e células do cumulus obtidos a
partir da punção de folículos antrais pequenos (2 mm), médios (2mm > e < 4 mm) e
grandes (> 4 mm) nos dias 5, 7 e 9 do ciclo menstrual em fêmeas adultas de C.
apella (n = 5). Os oócitos coletados foram classificados em desnudos ou intactos
(contendo várias células do cumulus). Após a classificação, os oócitos intactos
foram desnudos mecanicamente em PBS para separação das células do cumulus.
Em seguida, tanto os oócitos quanto as células do cumulus foram lavados
separadamente em solução salina (NaCl, 0,15%), lisados em SDS (dodecil sulfato
de sódio) a 15% e analisados individualmente em SDS-PAGE (5-15%). Os géis de
eletroforese foram submetidos à análise densitométrica. No dia 05, houve um
predomínio de proteínas oocitárias de alto peso molecular, enquanto que nos dias
07 e 09 ocorreu um predomínio de proteínas de baixo peso molecular. Nos dias 05,
07 ocorreram diferenças marcantes no perfil protéico de oócitos de acordo com a
qualidade do CCOs, enquanto que, no dia 09, as diferenças foram de acordo com a
qualidade do CCO e a categoria do folículo. O perfil protéico das células do cumulus
se modifica de acordo com o dia da fase folicular e qualidade do CCO.
Palavras-chave: Cebus apella, maturação do oócito, perfil protéico.
ABSTRACT
The Cebus apella species (capuchin monkey) is an important experimental
model for the development of biotechnologies of reproduction. Since there are few
works about oocyte maturation in females of this species, the present study aimed to
describe the protein profile of oocyte recovered from antral follicles on days 05, 07
and 09 of menstrual cycle obtained by follicular aspiration of small (2 mm), medium
(2mm > e < 4 mm) and large (2mm > e < 4 mm) antral follicles. The oocytes were
classified in denuded and intact. Lysated of oocytes and cumulus cells were
individually analyzed by SDS-PAGE (5-15%). After classification, intact oocytes were
mechanically denuded using PBS. Oocytes and cumulus cells were separately
51
washed in salt solution (NaCl, 0.15%) and analyzed by SDS-PAGE (5-15%). The
eletrophoresis gels were submitted to densitometric analysis. On day 05 there was
the prevalence of protein band with high molecular height, meanwhile on days 07
and 09 were the prevalence of protein bands with lower molecular height. On days
05 and 07 differences among protein profile occur in accordance with COCs quality,
meanwhile on day 09 differences occur in accordance with COCs quality and follicle
category. The protein profile in the cumulus cells modifies by day and follicle
category.
Key-words: Cebus apella, oocyte maturation, protein profile
INTRODUÇÃO
A espécie Cebus apella (macaco-prego) é um importante modelo
experimental para a pesquisa biomédica, e, potencialmente, para o desenvolvimento
de programas de biotecnologia de reprodução aplicados a primatas neotropicais em
perigo de extinção. Contudo, ainda existem poucos trabalhos que visem a estudar a
maturação oocitária nesta espécie de primata neotropical. Ressaltamos que o
estabelecimento de protocolos de maturação oocitária in vitro é de grande
importância em programas de fertilização in vitro e transferência de embriões e até
mesmo para a clonagem.
A fêmea de macaco-prego (C. apella) apresenta um ciclo menstrual que varia
de 18 a 21 dias (WRIGHT & BUSH, 1977; NAGLE et al., 1979 e 1980, LINN et al.,
1995, FRAGASZY & ADAMS-CURTIS, 1998). Utilizando a citologia vaginal, o ciclo
da fêmea de C. apella pode ser dividido nas fases menstrual, folicular e luteal, sendo
que cada fase dura em média 4,1 + 0,4; 7,9 + 0,2 e 10,1 + 0,3 dias, respectivamente
(MARTINS, 2004). A partir do dia 03 do ciclo, é possível detectar o folículo
dominante tanto por meio da laparotomia quanto pela ultra-sonografia
(DOMINGUES, dado não publicado).
Apesar de existirem dados sobre o crescimento folicular na fase pré-antral
(DOMINGUES et al., 2003 e 2004) e na fase antral (NAGLE et al., 1980,
DOMINGUES et al., 2003), pouco se sabe sobre as características do crescimento
oocitário em C. apella. Em outras espécies, tem sido descrito que o início do
crescimento do oócito dentro de folículos ovarianos é caracterizado pelo tamanho
reduzido do oócito e pela total inabilidade deste em progredir durante o ciclo
52
meiótico. Estas duas características serão modificadas durante o crescimento
oocitário, no qual o ooplasma irá se tornar um sítio de estoque de RNAm e proteínas
(MOOR & GANDOLFI, 1987; PICTON et al., 1998).
O oócito em crescimento é bastante ativo na síntese de proteínas transcritas
pelo núcleo e pelas mitocôndrias. Algumas destas proteínas são requeridas para a
diferenciação do próprio oócito, outras podem atuar na interação deste com as
células da granulosa que o rodeiam, na formação da zona pelúcida, na fertilização
ou no desenvolvimento embrionário inicial (MOOR & GANDOLFI, 1987; PICTON et
al., 1998; KANATSU-SHINOHARA et al., 2000; GRANOT & DEKEL, 2002;
TEILMANN, 2005).
Um exemplo marcante de proteínas que são sintetizadas ainda durante o
período de crescimento do oócito, mas que possuem importância no final do
desenvolvimento oocitário são as glicoproteínas que formam a zona pelúcida
(ERICKSON, 1986; MOOR & GANDOLFI, 1987; HIRSHFIELD, 1991; WASSARMAN
et al., 1996; PICTON et al., 1998; COONROD et al., 2002) e as conexinas que
participam da formação de junções comunicantes entre os oócitos e as células do
cumulus, permitindo a comunicação bidirecional entre os componentes do complexo
cumulus oophururs (CCO), que é mecanismo importante na retomada da meiose dos
oócitos a partir da prófase I (GRANOT & DEKEL, 2002; TEILMANN, 2005).
Completada a fase de crescimento, o oócito possuirá um estoque de
componentes requeridos ao seu desenvolvimento subseqüente e terá adquirido a
capacidade de progredir do estádio de prófase I (dictiado) para a metáfase II (M II)
do ciclo celular. Contudo, o oócito ainda não estará apto para a fertilização e o
desenvolvimento embrionário. A aquisição destas características depende do
período da maturação oocitária (MOOR & GANDOLFI, 1987; MATTIOLI &
BARBONI, 2000; WEHREND & MEINECKE, 2001; MARCHAL et al., 2002).
A maturação oocitária compreende os processos de maturação nuclear e
citoplasmática. Durante a maturação nuclear, a meiose é reassumida até o estádio
de M II, enquanto que, na maturação citoplasmática, mudanças na distribuição dos
grânulos corticais do oócito, na distribuição das organelas e o acúmulo de
determinados tipos de RNAm’s e proteínas têm sido observados (DRIANCOURT &
THUEL, 1998, FAIR et al., 2001, MARSHAL et al., 2002).
Portanto, a facilidade de monitoramento do ciclo menstrual de C. apella faz
desta espécie um excelente modelo experimental para estudos da oogênese e
53
foliculogênese na fase antral que poderão dar suporte à pesquisa sobre a maturação
oocitária in vitro. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo
estudar o perfil protéico do complexo cumulus oophurus durante a fase folicular de
fêmeas adultas de Cebus apella, relacionando-o com a qualidade e tamanho do
folículo ovariano.
Material e métodos
Todos os procedimentos realizados no presente trabalho foram avaliados e
aprovados pelo comitê de ética em pesquisa com animais do instituto Evandro
Chagas (CEPAN-IEC), órgão ligado à Secretaria de Vigilância Sanitária (SVS), e
autorizados pelo IBAMA-PA (Instituto Brasileiro de Meio Ambiente). Foram utilizadas
fêmeas (n=5) adultas de C. apella do Centro Nacional de Primatas (CENP-SVS),
com histórico prévio de ciclicidade ovariana normal. O CENP localiza-se na cidade
de Ananindeua (latitude: 1º 22' 30“ sul, longitude: 48º 22' 30" oeste, MIRANDA &
COUTINHO; 2005). O clima é megatérmico, úmido, temperatura em torno de 25ºC
com pequena amplitude térmica. O índice pluviométrico é de aproximadamente
2.250 a 2.500 mm, com chuvas regulares, mas maior concentração de janeiro a
junho. A umidade relativa do ar é em torno de 85%
(http://www.governodopara.gov.br). As fêmeas foram mantidas em galpões telados,
onde permaneciam em gaiolas individuais de alumínio, com dimensões de 80x90x80
cm, ficando então sujeitas ao fotoperíodo natural. A alimentação diária foi à base de
frutas, verduras, legumes, ração peletizada5 e água ad libitum.
Coleta das amostras
Citologia vaginal diária foi realizada para determinar o primeiro dia do ciclo
menstrual das fêmeas C. apella. Os animais foram contidos com o uso de cloridrato
de ketamina6 (10mg/Kg) e xilazina2 (1mg/Kg) durante este procedimento. Conforme
o primeiro dia do ciclo (dia 01) foi determinado, as fêmeas C. apella (n=5) foram
submetidas à laparotomia sob anestesia inalatória (Halotano7 à 8%) nos dias 05, 07
e 09 do ciclo menstrual. Os folículos antrais pequenos (2 mm), médios (2 mm > e <
4 mm) e grandes (> 4 mm) foram puncionados utilizando-se uma seringa de insulina
5 FOXY Junior Supreme, PROVIMI, Brasil 6 Kőning, Avellaneda, Argentina. 7 Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda, Brasil.
54
(1,0 mL) com agulha (12x7). Foi utilizada uma seringa diferente para cada folículo
antral puncionado.
Após as cirurgias, foi administrado flunixim-meglumine8 (1 mg/kg) às fêmeas,
durante três dias, com o intuito de promover analgesia durante o período de
recuperação. Após a realização de cada punção folicular, as fêmeas somente eram
manipuladas novamente após recuperação completa da laparotomia e quando a
atividade cíclica do ovário estava dentro dos parâmetros normais para a espécie
durante dois ciclos consecutivos.
O fluido folicular contendo os oócitos foi centrifugado imediatamente após a
coleta, e o sobrenadante foi separado, enquanto que o sedimento foi ressuspenso
com PBS para recuperação dos oócitos e células do cumulus. Os complexos
cumulus oophurus (CCOs) foram avaliados com o auxílio de um microscópio
invertido (ZEISS), tendo como parâmetros de boa qualidade do CCO a presença de
várias camadas de células do cumulus e a homogeneidade do ooplasma, sendo
estes classificados de CCOs intactos, enquanto que oócitos de baixa qualidade
foram considerados aqueles que apresentavam citoplasma heterogêneo, células do
cumulus expandidas ou desprendidas dos oócitos em aglomerados, sendo estes
classificados de desnudos (OD) (RODRÍGUEZ & FARIN, 2004).
Após a avaliação da qualidade, os CCO intactos foram desnudos
mecanicamente em PBS para separação das células do cumulus. Em seguida, tanto
os oócitos quanto as células do cumulus provenientes de CCOs intactos e desnudos
foram lavados, separadamente, em solução salina (0,15M) e lisados. Para lise
celular, foram utilizados 5µl de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 15%. Os lisados do
oócito e das células do cumulus foram mantidos a - 20o C, e, posteriormente,
submetidos à eletroforese.
Perfil protéico das células do cumulus e oócitos
Os lisados de células do cumulus e dos oócitos foram submetidos à
eletroforese em gel de acrilamida (SDS-PAGE), sob condições desnaturantes,
utilizando-se um gradiente contínuo de concentração de 5-15% de poliacrilamida no
gel de separação e uma concentração de 4% de poliacrilamida no gel de
empacotamento. As proteínas no gel foram submetidas a uma corrente constante de
20 mA, durante, aproximadamente, 1 h de corrida (LAEMMLI, 1970).
8 Schering-Plough Coopers, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil
55
Os géis foram polimerizados em um sistema de eletroforese vertical Mini-
PROTEAN II, Bio-Rad. O tampão de corrida utilizado foi o Tris (0,025 M), glicina
(0,192 M), pH 8,4 e 0,1% de SDS, e o de amostra desnaturante foi o Tris-HCl (0,06
M), pH 6.8, 2% de SDS, β mercaptoetanol (5%) adicionado de glicerol (10 % ) e azul
de bromofenol (0,025%). Para visualização do perfil protéico, os géis foram corados
com prata.
Análise densitométrica
Os géis obtidos foram submetidos à análise densitométrica. Para esse fim, foi
utilizado o programa de análise de imagens Scion Image para Windows (Scion
Corporation, Frederick, MD, USA). Os géis corados por prata foram digitalizados
com o auxílio de um scanner de mesa de 9800 DPI de resolução interpolada e
transformados em 256 tons de cinza pelo Adobe Photoshop 5.0.h.
Resultados
Foram realizadas 14 punções foliculares, sendo que nas fêmeas B, C, D e G
foi possível realizar as punções foliculares nos dias 05, 07 e 09 de diferentes ciclos.
Na fêmea (A), a cirurgia do dia 09 do ciclo não pôde ser realizada, porque a fêmea
teve que ser excluída do experimento. Foram obtidos 25 oócitos, o que representa
uma média de 1,79 oócitos por cirurgia.
Cada poço do gel de poliacrilamida foi ocupado por apenas um oócito ou um
lisado de células do cumulus proveniente de um CCO. Nos dias 05 e 07 do ciclo,
não houve diferenças marcantes no perfil eletroforético de acordo com o tamanho
do folículo, mas houve em relação à qualidade do CCO, enquanto que no dia 09
houve diferenças no perfil protéico dos oócitos em relação ao tamanho do folículo e
à qualidade do CCO.
A Figura 01 mostra os géis dos oócitos do dia 05 das fêmeas A, B, C, D e G.
Ocorreram 11 bandas diferentes de proteínas oocitárias obtidas de folículos
pequenos, médios e grandes (Tabela 01), sendo que foram detectadas de 2 a 8
proteínas diferentes por oócito. Os pesos moleculares das proteínas encontradas no
dia 05 variaram de 5,7 KDa a 194,0 kDa.
56
Tabela 01. Perfil protéico dos oócitos provenientes de folículos ovarianos antrais
presentes no dia 05 do ciclo menstrual de fêmeas C. apella.
Fêmea A D C B G
Banda MW (kda) FG* FP1 FP2 FM FP* FP FG FP FG* FP* 01 194,0 X 02 192,4b X 03 183,6b X X 04 178,6 X X X X X X X 05 171,5b X X 06 165,8a X X X X 07 135,3c X X X X X X X X 08 128,3c X X X X X X X X 09 84,3a X 10 24,3a X 11 5,7s X
* CCO intactos a Banda de proteína somente presente em oócitos desnudos (Fig 01) b Banda de proteína também presente em oócitos obtidos no dia 07 do ciclo c Banda de proteína fase específica
10
08
09
01
03
07 06
04
* CCO intactos
Figura 01. Perfil eletroforético (SDS-PAGE, 5-15%) dos oócitos de fêmeas de C.
apella (A, B, C, D e G) provenientes de folículos ovarianos antrais
pequenos (FP), médios (FM) e grandes (FG) do dia 05 do ciclo
menstrual.
B
FG
B
FP
A
FG*
A
FP1
A
FP2
A
FM
C
FP*
D
FP*
G
FG*
G
FP*
02 03 05
57
Ocorreu a presença de uma proteína majoritária de peso molecular 178,6 Kda
(Figura 01) nos oócitos provenientes de folículos pequenos, médios e grandes das
fêmeas A, B e C. Ressaltamos que esta proteína apresentou-se com maior
expressão nos oócitos desnudos (OD) obtidos de folículos pequenos (Figura 03 e
04). Nas fêmeas A, B, C e D foi detectada a presença de duas bandas protéicas
fases-específicas provenientes de folículos pequenos, médios e grandes com peso
molecular de 128,3 e 135,8 Kda.
Na fêmea A, o oócito desnudo e com citoplasma de aspecto heterogêneo,
proveniente do folículo pequeno (FP2), apresentou 8 bandas de proteínas (Figura
02), sendo que as proteínas de peso molecular 194,0; 84,3; 24,3 e 5.7 Kda (Tabela
01) somente foram detectadas neste oócito. Da mesma maneira, uma proteína de
peso molecular de 165,8 kda somente foi detectada em oócitos desnudos obtidos de
folículos pequenos e grandes das fêmeas A, B e C. Na fêmea G, os oócitos obtidos
no dia 05 do ciclo menstrual apresentaram pesos moleculares que variaram de 171,5
Kda a 192,4 Kda (Tabela 01), sendo estes semelhantes aos observados em oócitos
do dia 07 das fêmeas A e D (Figura 05).
Figura 02. Análise densitométrica do SDS-PAGE (5-15%) de oócito desnudo de C. apella
(A) proveniente de folículo ovariano antral pequeno (FP2) obtido no dia 05 do
ciclo menstrual.
Pixel
58
FG* FP FP2 FM
* Oócitos (CCO) intactos
Figura 03. Análise densitométrica do SDS-PAGE (5-15%) de proteína de majoritária (178,6
kda) obtida de oócitos desnudos e intactos (*) de C. apella (A) proveniente de
folículos ovarianos antrais pequeno (FP), médio (FM) e grande (FG) obtidos no
dia 05 do ciclo menstrual.
Figura 04. Análise densitométrica de SDS-PAGE (5-15%) de proteína majoritária (178,6 kda)
de oócitos desnudos proveniente de folículos ovarianos antrais grande (FG) e
pequeno (FP) obtido no dia 05 do ciclo menstrual de uma fêmea (B) C. apella.
Na figura 05 temos o perfil eletroforético de oócitos obtidos no dia 07 do ciclo
menstrual de todas as fêmeas C. apella. Foram detectadas 08 bandas protéicas
diferentes, sendo que ocorreram de 1 a 3 proteínas presentes por oócito. Bandas de
169,13
10,00
220,00 0,0
117,41
13,91
96,00 0,0
FG FP
59
proteínas de alto peso molecular foram encontradas em apenas duas fêmeas (A e
D), sendo estas 171,5 e 183,6 Kda. A presença de uma proteína com peso
molecular de 192,4 Kda (Tabela 02) ocorreu somente em um oócito desnudo
proveniente de um folículo pequeno na fêmea A. Diferentemente, nas fêmeas B, C e
G houve o predomínio das proteínas de baixo peso molecular no dia 07. As
proteínas de pesos moleculares de 39,0; 37,0 e 36,0 Kda estiveram presentes
apenas em oócitos intactos de folículos pequenos, médios e grandes.
Especificamente na fêmea B foram detectadas duas proteínas de peso 54,5 e 38,5
Kda obtidas a partir de um oócito desnudo proveniente de um folículo médio.
A B C D G
FP FM FP* FG* FG* FP FP* FM
* CCO intactos
Figura 05. Perfil eletroforético de oócitos de fêmeas C. apella provenientes de
folículos ovarianos antrais pequenos (FP), médios (FM) e grandes (FG)
do dia 07 do ciclo menstrual.
54,5
38,5
39,0 37,0 36,0
192,4
183,6 171,5
39,0 37,0 36,0
183,6 171,5
60
Tabela 02. Peso molecular de proteínas de oócitos provenientes de folículos
ovarianos antrais presentes no do dia 07 do ciclo de C. apella.
* Oócitos (CCO) intactos a Banda de proteína somente presente em oócitos desnudos b Banda de proteína presente em oócitos intactos
A figura 06 mostra o perfil eletroforético (SDS PAGE, 5-15%) de oócitos
obtidos no dia 09 do ciclo menstrual de C. apella. Neste dia do ciclo, todos os CCOs
obtidos eram intactos, com exceção de um oócito obtido de um folículo médio que
apresentou poucas células do cumulus. Foram detectadas 13 bandas de proteínas
oocitárias provenientes de folículos pequenos, médios e grandes, sendo que a
quantidade de proteínas encontradas por oócito variou de 1 a 6 (Tabela 03). A
proteína de peso molecular de 38,0 Kda somente esteve presente em oócitos
obtidos a partir de CCos intactos no dia 09 do ciclo.
Na fêmea C, os pesos moleculares das proteínas dos oócitos intactos
provenientes dos folículos pequenos foram em torno de 38,0; 37,0 e 35,0 Kda,
enquanto que no oócito intacto proveniente do folículo grande foi de 40,5 (ver seta),
37,2 e 35,7 Kda. Na fêmea D foi detectada uma banda de proteína com peso
molecular de 40,8 Kda a partir de um oócito intacto recuperado de um folículo
pequeno, uma banda de proteína com peso molecular semelhante também foi
detectada nas células do cumulus deste oócito (Figura 15).
Na fêmea G, foram obtidos oócitos provenientes de folículos médio e grande
no dia 09 do ciclo. O oócito proveniente do folículo médio apresentou-se rodeado por
poucas células do cumulus. Neste oócito ocorreu a maior quantidade de bandas de
proteínas oocitárias detectadas pelo SDS-PAGE no dia 09 do ciclo, sendo o total de
06 bandas de proteínas com pesos moleculares variando de 35,0 a 64,1 kda,
conforme indicado pelas setas (Figura 06), enquanto que o oócito obtido do folículo
Fêmeas MW (kda) A B C D G
FP FM FP* FG* FP FG* FP* FM 192,4a X 183,6 X X 171,5a X 54,5a X 39,0b X X X X 38,5a X 37,0b X X X X 36,0b X X X X
61
grande apresentou perfil protéico marcadamente diferente, ocorrendo apenas duas
bandas de proteínas com pesos moleculares de 41,7e 38,0 Kda.
Tabela 03. Perfil protéico dos oócitos provenientes de folículos ovarianos antrais
presentes no do dia 09 do ciclo de fêmeas C. apella.
*CCO intactos ** Oócito rodeado por poucas células do cumulus a Banda de proteína presente em oócitos rodeado por poucas células do cumulus b Banda de proteína presente em oócitos intactos
Fêmea MW (kda) C D G
FP* FP* FG* FP* FM** FG* 64,1a X 48,3a X 41,7b X 41,5a X 40,8b X 40,5b X 38,6a X 38,0b X X X 37,2b X 37,0b X X 36,6a X 35,7b X 35,0 X X X
40,8 50
105
250 160
75
35
30
25
15 10
105
250 160 75 50
35
30
25
15
10
38.6
64.1 48.0
35.0
41.5
36.6
41.7
38.00
C D G FP* FG* FP* FP* FM** FG*
* CCO intactos
Figura 06. Ferfil eletroforético (SDS-PAGE, 5-15%) de oócitos de fêmeas C. apella
(C, D e G) provenientes de folículos ovarianos antrais pequenos (FP),
médios (FM) e grandes (FG) do dia 09 do ciclo menstrual.
62
Da mesma forma que aconteceu nos dias 05 e 07, também no dia 09 os
oócitos não intactos apresentaram um maior número e maior quantidade de proteína
por banda protéica detectável pelo SDS-PAGE. A figura 07 representa a análise
densitométrica da banda protéica de peso molecular de 41,0 Kda presente nos
oócitos provenientes de folículos médio e grande coletados no dia 09 (fêmea G).
Pode ser observado que esta banda de protéica acumulou-se no oócito do folículo
médio que apresentava poucas células do cumulus quando comparado com o oócito
intacto proveniente do folículo grande.
No tocante ao SDS-PAGE das células do cumulus de folículos antrais
pequenos, médios e grandes, as diferenças marcantes não foram quanto à
qualidade do CCO, mas em relação ao tamanho dos folículos antrais. No mesmo
sentido, ocorreram diferenças acentuadas no perfil protéico de células do cumulus
de folículos antrais obtidos de dias diferentes do ciclo.
A Figura 08 mostra o perfil eletroforético das células do cumulus obtidas no dia
05 do ciclo menstrual de C. apella. Não foi possível precisar os pesos moleculares
em decorrência do empacotamento das proteínas do padrão de peso molecular. Nas
células do cumulus dos folículos médio e grande da fêmea A foram detectadas duas
proteínas com peso molecular acima de 250 Kda (seta).
Figura 07. Análise densitométrica de SDS-PAGE (5-15%) de proteínas de 41,0 Kda
de oócito não-intacto proveniente de folículo ovariano antral médio
(FM) e de oócito intacto proveniente de folículo grande obtido no dia
09 do ciclo menstrual uma fêmea (G) de C. apella.
210,33
34,87
0,0 93,00
FM FG
63
Ocorreu uma maior quantidade de bandas de proteínas nas células do cumulus
provenientes de folículos médios e grandes quando comparados com os folículos
pequenos. Na Figura 09, tem-se a análise densitométrica do perfil protéico das
células do cumulus de um CCO intacto proveniente de um folículo grande, no qual
09 bandas de proteínas diferentes estão representadas. Da mesma forma, a análise
densitométrica (Figura 10) mostra que uma proteína majoritária presente nas três
categorias de folículos aparece em maior quantidade nas células do cumulus dos
folículos médios e grandes.
Figura 09. Análise densitométrica de SDS-PAGE (5-15%) de proteínas das
células do cumulus de CCOs intactos provenientes de folículos
ovarianos antrais grande, obtido no dia 05 do ciclo menstrual de
fêmeas C. apella (A).
A* FG
A FP1
A FP2
A FM
B FP
B FG
C FP
*CCO intacto
Figura 08. Perfil eletroforético (SDS-PAGE, 5-15%) das células do cumulus
provenientes de CCOs de fêmeas C. apella (A, B, C e D) provenientes
de folículos ovarianos antrais pequenos (FP), médios (FM) e grandes
(FG) do dia 05 do ciclo menstrual.
64
No dia 07 do ciclo, ocorre uma diminuição na quantidade de bandas de
proteínas detectadas no SDS-PAGE em relação aos dias 05 e 09. Não houve
diferenças marcantes em relação ao tamanho do oócito, mas houve quanto à
qualidade do CCO, sendo que células do cumulus provenientes de CCOs não-
intactos apresentaram mais bandas protéicas.
Na Figura 11, tem-se o perfil protéico de células do cumulus obtidos no dia
07 do ciclo de fêmeas de C. apella (B, C, D, G). Proteínas com peso molecular de
54,5 e 38,5 Kda (Fêmea B) foram detectadas tanto no oócito desnudo (Figura 06)
quanto nas células do cumulus (Figuras 12) obtidos de um único folículo médio. Nas
fêmeas D e G não foi possível estimar o peso molecular das proteínas detectadas.
Comparando-se células do cumulus provenientes de CCO intactos com as obtidas a
partir de folículos que possuíam oócitos desnudos, ocorreu uma maior quantidade
de proteínas detectadas nos lisados de células do cumulus provenientes de folículos
com CCO não-intactos (Figura 12).
FG* FP FP FM
*CCO intacto
Figura 10. Análise densitométrica de SDS-PAGE (5-15%) da proteína majoritária
das células do cumulus (A) proveniente de CCOs intactos e não-
intactos de folículos ovarianos antrais pequenos, médio (FM) e
grande do 05 do ciclo menstrual de fêmeas C. apella
65
.
Na Figura 13, tem-se o SDS-Page (5-15%) de células do cumulus presentes
no dias 09 do ciclo. As bandas de proteínas que foram possíveis estimar os pesos
moleculares estão indicadas com setas. Ocorrem diferenças marcantes em relação
ao tamanho do folículo, mas não em relação à qualidade do CCo. Células do
cumulus obtidos a partir de CCO intacto e não-intacto apresentaram perfis protéicos
semelhantes (Fêmea G). Em todos os folículos médios e grandes houve o
predomínio de proteínas de baixo peso molecular, enquanto que num folículo
D FG*
D FP
G FM
G FP*
* CCO intacto
B FM
C FP
C FG*
54,5 38,5 40,3
Figura 11. Perfil eletroforético (SDS-PAGE, 5-15%) de proteínas das células do
cumulus de CCOs não-intactos provenientes de folículos ovarianos
antrais pequenos (FP), médios (FM) e grandes obtidos no dia 07 do
ciclo menstrual de fêmeas C. apella.
D FP
237.0
109.00
10.00
0.0
G FM
254.00
9.00
0.00 106.00
Figura 12. Análise densitométrica de SDS-PAGE (5-15%) de células do cumulus de
CCOs não intactos provenientes de folículos antrais pequeno e médio
obtidos no dia 07 do ciclo menstrual de fêmeas C. apella
66
pequeno (Fêmea C) ocorreu a presença de duas proteínas de alto peso molecular
(123,1 e 216 Kda).
A banda de proteína de peso 40,8 Kda esteve presente em células do
cumulus obtidas de folículos pequenos (fêmeas C e D) e também no oócito obtido do
mesmo folículo (fêmea D, ver seta). Na fêmea C, foram detectadas 06 proteínas
diferentes obtidas das células do cumulus de um folículo pequeno, com os seguintes
pesos moleculares: 32,0; 40,8; 47,4; 86,3; 123,1 e 216,0 kda. Na fêmea G não foi
possível estimar os pesos moleculares, no entanto as células do cumulus de ambos
os folículos apresentaram perfis protéicos semelhantes, cada um com 7 bandas de
proteínas de baixo peso molecular.
*CCO intacto
Figura 13. Perfil eletroforético (SDS-PAGE, 5-15%) de proteínas das células do cumulus de
CCOs não-intactos provenientes de folículos ovarianos antrais grandes obtidos
no dia 09 do ciclo menstrual de fêmeas C. apella.
DISCUSSÃO
No presente trabalho, foi possível determinar o perfil protéico de oócitos e
células do cumulus provenientes de folículos pequenos, médios e grandes nos dias
05, 07 e 09 do ciclo menstrual de C. apella, sendo este um dos aspectos de grande
relevância a serem estudados durante a oogênese e foliculogênese de primatas. Os
dias 05, 07 e 09 do ciclo menstrual de C. apella representam não somente o
momento em que se tem o folículo dominante destacado dos folículos subordinados,
mas também há a produção de 17β-estradiol. Segundo descrito por NAGLE et al.
(1980), os níveis plasmáticos de 17β-estradiol estão por volta de 70-100 pg/mL entre
G FG*
G FM*
C FP*
C FG*
216.0
123.1 86.3
47.4 40.8 32.0
42.7
D FPC*
D FPOc*
40.8
D FG*
54.9
38.3
67
os dias 01-04 do ciclo, aumentando gradativamente e atingindo o seu o pico pré-
ovulatório entre os dias 7-10 do ciclo, com valores plasmáticos de 503,3 + 30,6
pg/mL.
Nos dias 05 e 07 do ciclo, houve diferenças marcantes no perfil
eletroforético de acordo com a qualidade do CCO, enquanto que no dia 09 houve
diferenças no perfil protéico dos oócitos em relação ao tamanho do folículo e à
qualidade do CCO. Quando comparados o perfil protéico dos oócitos obtidos nos
diferentes dias do ciclo, demonstramos que diferenças marcantes são detectadas
no SDS-PAGE, sendo necessários mais trabalhos que analisem a relação destas
mudanças do perfil protéico do CCO em relação aos valores plasmáticos de 17β-
estradiol
A partir de folículos de 2,00 mm, o oócito apresenta o seu diâmetro máximo
em C.apella, que é de 136,6 + 10,2 µm (dado não publicado). De acordo com os
resultados, podemos constatar que, mesmo tendo atingindo o seu tamanho máximo,
o oócito de C. apella sofre modificações no seu perfil protéico, até o folículo atingir o
seu tamanho pré-ovulatório, que acontece por volta do dia 09 do ciclo.
A competência para oócitos provenientes de folículos de diversos tamanhos
retomarem a meiose a partir da prófase I tem sido investigada. Em bovinos, foi
descrito que apenas 1,4 % dos oócitos provenientes de folículos com diâmetro >0,9
mm atingem a GVBD, enquanto que 47,8 % dos oócitos provenientes de folículos
com diâmetro de 2-8 mm conseguem maturar até a metáfase II (FUHRER et al.,
1989). Resultados semelhantes foram obtidos em outras espécies em oócitos
porcinos (MOTLIK et al., 1984) e caprinos (DE SMEDT et al., 1994).
Recentemente, LEQUARRE et al. (2005) estudaram a competência de
oócitos cultivados in vitro bovinos obtidos de folículos pequenos, médios e grandes
em relação à neosíntese de proteínas, que foi avaliada pela incorporação de
metionina (S35) durante 24h de maturação in vitro dos CCOs, sendo, posteriormente,
realizado a eletroforese em SDS-PAGE. Utilizando um pool de 10 a 15 lisados de
oócitos provenientes de folículos de um mesmo tamanho, os autores descrevem que
não houve diferenças entre os oócitos em relação à síntese protéica. Contudo,
embriões obtidos da FIV de oócitos provenientes de folículos maiores do que 06 mm
apresentaram desenvolvimento mais rápido. Os resultados obtidos por LEQUARRE
et al. (2005) foram diferentes do descrito no presente trabalho em C. apella,
provavelmente pelo fato de não termos trabalhado com pool de lisado de oócitos e
68
termos avaliado folículos de diferentes tamanhos em relação a dias específicos da
fase folicular.
No dias 05, houve um predomínio de proteínas oocitárias de alto peso
molecular, que variaram de 128,3 a 194,0 Kda. Bandas de proteínas fase
específicas de peso molecular de 135,3 a 128,3 Kda estiveram presentes nos
oócitos provenientes de folículos pequenos, médios e grandes. A banda de proteína
de peso molecular 178,6 Kda acumula-se em oócitos desnudos de folículos
pequenos quando comparada com oócitos provenientes de folículos médios e
grandes. Ainda no dia 05 do ciclo, foi constatada a presença de bandas de proteínas
de peso molecular de 194,0; 165,8; 84,3; 24,3 e 5.7 Kda que podem estar
relacionadas à baixa qualidade do oócito.
Também no dia 05, a fêmea G apresentou bandas de proteínas de alto peso
molecular (192,4; 183,6; 171,5 Kda), mas diferentes das encontradas em outros
oócitos do dia 05. As bandas de proteínas de peso 183,6; 171,5 Kda repetiram-se
em oócitos com características de boa qualidade nas fêmeas A e B no dia 07,
enquanto que a banda de 192,4 Kda repetiu-se em oócitos desnudos. Não é
possível afirmar se esta banda de proteína poderia ser a mesma presente em outros
oócitos desnudos, apesar da proximidade do peso molecular de 192,2 Kda para
194,0 Kda. Contudo, podemos sugerir que estudos são necessários para avaliar se
a presença de proteínas de peso molecular acima de 190 Kda pode estar
relacionada à baixa qualidade do oócitos de C. apella obtidos nos dias 05 e 07 do
ciclo.
Em oócitos obtidos das fêmeas C, G e B de folículos pequenos, médios e
grandes no dia 07 e 09 houve um predomínio de proteínas de baixo peso molecular.
De acordo com os resultados, tem-se que no dia 07 alguns oócitos ainda podem
apresentar bandas de proteínas com alto peso molecular, como acontece no dia 05,
enquanto que em outros oócitos tem-se a transição para proteínas de baixo peso
molecular. No dia 09, por sua vez, houve o predomínio marcante de proteínas de
baixo peso molecular. Desta forma, podemos demonstrar que, mesmo com o oócito
apresentando seu tamanho máximo, o seu perfil protéico se modifica durante a fase
folicular em fêmeas de C. apella.
No dia 07 do ciclo, as bandas de proteínas que podem estar relacionadas
com a boa qualidade do CCO apresentam peso molecular de 39,0; 37,0; e 36,0 kda,
sendo que a banda de proteína de peso molecular de 37,0 kda também ocorre em
69
CCOs intactos no 09 do ciclo. Ainda no dia 09, na fêmea G foram obtidos oócitos
provenientes de folículos médio e grande, sendo que o oócito proveniente do folículo
médio apresentou-se rodeado por poucas células do cumulus, o que pode ser uma
característica de baixa qualidade do oócito. Neste oócito, ocorrem 06 bandas de
proteínas, enquanto que no oócito obtido do folículo grande, que apresentava o CCO
com várias células do cumulus, foram detectadas apenas duas bandas de proteínas
com pesos moleculares de 41,5 e 38,0 Kda. Ressaltamos que os perfis protéicos
das células do cumulus destes dois oócitos foram semelhantes.
KHATIR et al. (1998) avaliaram o perfil protéico em pool de 30 oócitos de
bezerras e vacas adultas em relação à cinética nuclear após 24 horas de cultivo in
vitro. Estes autores demonstram a presença de proteínas de peso molecular
variando de 28 a 70 Kda. Estes resultados são semelhantes aos encontrados no
presente trabalho, considerando-se que, no dia 09, os oócitos de C. apella podem
ter avançado em sua maturação oocitária in vivo. A diferença é que no presente
trabalho foi possível detectar proteínas diferentes por oócito de acordo com o
tamanho do folículo e da qualidade do CCO.
No tocante ao perfil protéico dos lisados de células do cumulus, no dia 05 não
encontramos diferenças entre CCO intactos e não-intactos. A diferença marcante foi
uma maior quantidade de bandas de proteínas nos CCO obtidos de folículos
grandes e médios em relação aos pequenos. Quando comparado com o dia 07 do
ciclo, houve uma diminuição da quantidade de bandas de proteínas detectadas nos
lisados de células do cumulus. Ao contrário do que aconteceu no dia 05, no dia 07
os CCO não-intactos apresentaram mais bandas protéicas em relação aos CCOs
intactos e não houve diferença entre folículos de diferentes tamanhos.
No dia 09, por sua vez, várias bandas protéicas em lisados de célula do
cumulus de folículos pequenos, médios e grandes voltam a ser detectadas quando
comparadas com o dia 07. Bandas de proteínas de peso molecular semelhante
foram encontradas nos lisados de oócitos e células do cumulus provenientes de um
mesmo folículo no dia 09 do ciclo menstrual de C. apella. Os lisados de células do
cumulus dos folículos pequenos apresentaram bandas de proteínas de alto e baixo
peso molecular, enquanto que nas células do cumulus de folículos grandes e médios
predominaram bandas de proteína de baixo peso molecular.
Recentemente, tem sido demonstrado que o emprego de inibidores de
transcrição em meios de cultivo de oócitos suplementados com gonadotrofinas
70
acarreta a parada na meiose efetivamente apenas quando os oócitos estão
circundados por várias células do cumulus, ou seja, quando são cultivados CCOs
intactos. Estes dados indicam que o estímulo das gonadotrofinas resulta em
transcrição de produtos protéicos nas células do cumulus que são importantes na
retomada da meiose do oócito (GVBD) (RODRIGUEZ et al., 2004).
Exemplo de proteínas que são importantes na retomada da meiose do oócito,
cuja regulação da transcrição é influenciada pelas gonadotrofinas, são as conexinas,
que formam as junções GAP (junções comunicantes) entre oócitos e células do
cumulus (GRANOT e DEKEL, 2002; TEILMANN, 2005). As gonadotrofinas também
induzem a expansão das células do cumulus, também conhecida como mucificação
(ELVIN et al., 1999; FULOP et al., 2003; JOYCE et al., 2001, LIM et al, 1997;
OCHSNER et al; 2003; VARANI et al., 2002), e que são necessárias para uma taxa
de ovulação normal (CHEN et al., 1993; HESS et al., 1999). Estes são exemplos de
como a transcrição de proteínas é modificada durante a maturação oocitária in vivo
tanto no oócito quanto nas células do cumulus, dado este que foi confirmado no
presente trabalho.
CONCLUSÕES
Demonstramos que ocorrem mudanças no perfil protéico de oócitos intactos e
desnudos, bem como nas células do cumulus obtidos a partir de folículos pequenos,
médios e grandes nos dias 05, 07 e 09 do ciclo menstrual de C. apella. Mesmo com
o oócito apresentando seu tamanho máximo, a expressão das proteínas se modifica
durante a fase folicular em fêmeas de C. apella. No dia 05, houve um predomínio de
proteínas oocitárias de alto peso molecular. Em oócitos obtidos de folículos
pequenos, médios e grandes nos dias 07 e 09 ocorreu um predomínio de proteínas
de baixo peso molecular. Nos dias 05, 07 e 09 os oócitos desnudos apresentaram
mais bandas de proteínas detectáveis pela eletroforese do que os oócitos
provenientes de CCOs intactos.
Não houve diferença no perfil protéico dos lisados de células do cumulus, no
dia 05 obtidos de CCO intactos e não-intactos. Contudo, houve uma maior
quantidade de bandas de proteínas nos CCOs obtidos de folículos grandes e médios
em relação aos pequenos. No dia 07 do ciclo, houve uma diminuição da quantidade
de bandas de proteínas detectadas nos lisados de células do cumulus em relação
71
aos dias 05 e 09. Ao contrário do que aconteceu no dia 05, no dia 07 os CCOs não-
intactos apresentaram mais bandas protéicas em relação aos CCOs intactos.
No dia 09, algumas bandas de proteínas de peso molecular semelhante foram
encontradas nos lisados de oócitos e células do cumulus provenientes de um
mesmo folículo. Os lisados de células do cumulus dos folículos pequenos
apresentaram bandas de proteínas de alto e baixo peso molecular, enquanto que,
nas células do cumulus de folículos grandes e médios, predominaram bandas de
proteína de baixo peso molecular.
AGRADECIMENTOS
Universidade Federal do Pará (UFPA), Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF), Centro Nacional de Primatas (CENP-SVS), Instituto Brasileiro
de Meio Ambiente (IBAMA-PA), CAPES, FINEP.
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egg zona pellucida: some new pieces of an old puzzle. J. Cell. Sci., 8: 2001-
2004.
WEHREND, A. & MEINECKE, B. (2001). Kinects of meiotic progression, M-phase
promoting factor (MPF) and mitogen-activated protein kinase (MAP Kinase) activities
during in vitro maturation of porcine and bovine oocytes: species especific differences in
the length of the meiotic stages. Anim. Reprod. Sci. 66: 175-184
WRIGHT E. M. & BUSH D. E. (1977) The reproductive cycle of the Capuchin (Cebus
apella). Lab. Anim. Sci., 27: 651-654.
75
ANÁLISE ULTRA-SONOGRÁFICA, DOPPLER COLORIDO E DOPPLER-
FLUXOMETRIA DO OVÁRIO E ÚTERO EM FÊMEAS ADULTAS Cebus apella
(MACACO-PREGO) DURANTE A FASE FOLICULAR
Color and spectral doppler ultrasound analysis of ovary and uterus in adult Cebus
apella females (Capuchin monkey) during follicular phase
Domingues, S. F. S.1,2; Caldas-Bussiere, M. C.2; Martins, D. N. 1; Amorim, R. A.3
1Universidade Federal do Pará, Castanhal - PA, 2 Setor de Reprodução Animal, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuária, Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes-RJ, 3Centro Nacional de Primatas (SVS), Ananindeua-PA, [email protected]; [email protected]
Endereço para correspondência: 1Universidade Federal do Pará (UFPA), Curso de
Medicina Veterinária, Núcleo de Ciência Animal, Centro Agropecuário, Universidade
Federal do Pará (UFPA), Belém – PA, (Rua Augusto Corrêa, Campus Básico, cep:
66075-110), e-mail: [email protected].
76
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo descrever as dimensões uterinas e
ovarianas, a dinâmica folicular, a ovulação, e o fluxo sanguíneo nas artérias uterinas
e do ligamento útero-ovariano (LOU), por meio da ultra-sonografia com Doppler
colorido e Doppler-fluxometria (HDI 4000; Philips Medical Systems) durante a fase
folicular do ciclo menstrual de fêmeas adultas de Cebus apella (n=06). Os diâmetros
médios longitudinal (DL), dorsoventral (DDV) e transversal (DT) e o volume (V)
uterino foram de 1,77+0,03; 1,21+0,4 e 1,37+0,04 cm, e 1,55+0,10 ml;
respectivamente, enquanto que o DL, DDV e DT, e o volume médio dos ovários
foram de 1,35+0,04; 0,82+0,2 e 0,77+0,02 cm, e 0,47+0,04 ml. A ovulação ocorreu
no dia 9,3 + 0,5 (variação 07 a 11), sendo que 86,0% destas ocorreram no ovário
direito. O diâmetro e o volume médio do folículo dominante no dia da ovulação foram
9,6 + 0,4 mm e 0,54 + 0,07 ml. O corpo lúteo formado apresentou diâmetro e volume
médio de 8,1 + 0,4 mm e 0,3 + 0,05 ml. Os índices de resistividade (IR) e de
pulsatilidade (IP) médios das artérias uterinas e do LOU foram de 0,86 + 0,03; 2,19 +
0,11 e 1,11 + 0,15, 1,39+ 0,15. Foi possível acompanhar o crescimento do diâmetro
e o volume do folículo dominante a partir do dia 03 do ciclo. A média do IR e IP das
artérias uterinas e do LUO laterais ao ovário dominante sofreram modificações no
período periovulatório. Os presentes dados poderão ser de grande importância na
escolha de fêmeas de Cebus apella em programas de reprodução assistida nesta
espécie.
Palavras-chaves: Ultra-sonografia, útero, ovário, ligamento útero-ovariano, Cebus
apella.
ABSTRACT
The present study aimed describe the uterine and ovarian dimensions, as well
the follicular dynamics, ovulation and blood-flow of uterine and uteri-ovarian ligament
arteries, by ultrasound (US) 2-D examination and color and spectral Doppler
ultrasonography (HDI 4000; Philips Medical Systems) during follicular phase of
menstrual cycle in Cebus apella (n=6) adult female. The longitudinal (L), height (H)
and weight (W) uterine diameters and volume were 1.77+0.03, 1.21+0.4, 1.37+0.04
cm and 1.55+0.10 ml, respectively. Meanwhile the same ovary parameters were
77
1.35+0.04, 0.82+0.2, 0.77+0.02 cm and 0.47+0.04 ml, respectively. The ovulation
occurs on day 9.3 + 0.5 (range 07 up to 11) and 86% of ovulations were in the right
ovary. The dominant follicle diameter and volume were 9.6 + 0.4 mm e 0.54 + 0.07
ml. The corpus lutheum formed presented 8.1 + 0,4 mm e 0.3 + 0.05 ml diameter and
volume mean. The RI and PI mean values of uterine and UOL arteries were 0.86 +
0.03, 2.19 + 0.11 e 1.11 + 0.15, 1.39+ 0.5. It was possible accompanies the diameter
and volume follicular growth starting from day 03 of the menstrual cycle. The RI and
PI medium of uterine and UOL arteries suffer modifications near time of ovulation.
Key-word: Ultrasound examination, uterus, ovary, uteri-ovarian ligament, Cebus
apella.
INTRODUÇÃO
A espécie Cebus apella tem larga distribuição geográfica na América do Sul.
Esta espécie de primata neotropical possui uma grande capacidade de adaptação
ao cativeiro, sendo, inclusive, possível a reprodução anual destes animais (De Luca
et al., 1990). Desta forma, a espécie C. apella é um importante modelo experimental
para a pesquisa biomédica. Alguns aspectos da fisiologia reprodutiva da fêmea de
Cebus apella, como a ciclicidade do epitélio vaginal durante o ciclo menstrual,
duração do ciclo (WRIGTH & BUSSH, 1979; NAGLE et al., 1979; DOMINGUES et
al., 2003; MARTINS, 2004), concentrações plasmáticas de hormônios esteróides
ovarianos (NAGLE et al., 1979, 1980) e hormônio luteinizante (NAGLE & DENARI,
1985), têm sido descritos. A fêmea de C. apella possui um ciclo menstrual cuja
duração é de 18 a 21 dias, que pode ser dividido nas fases folicular, luteal e
menstrual (WRIGHT e BUSH, 1977; NAGLE et al 1979, 1980; LINN et al, 1995,
FRAGASZY e ADAMS-CURTIS, 1998; MARTINS, 2004).
Embora estes parâmetros ajudem a predizer o momento da ovulação em C.
apella, estes são usados como métodos indiretos para estimar o momento da
ovulação. Dentro deste contexto, a laparotomia e a laparoscopia seriam os métodos
de referência para predizer o momento da ovulação por permitir a visualização direta
do ovário. Em fêmeas de C. apella, o folículo pré-ovulatório pode ser identificado 04
dias antes da ovulação pela laparoscopia (NAGLE et al., 1980) e 6 dias antes pela
laparotomia (DOMINGUES et al., 2003). NAGLE et al. (1994), usando laparoscopia,
mostraram que a taxa de ovulação entre os ovários direito e esquerdo são de 37,5%
78
e 62,5%, respectivamente. Os mesmos autores descreveram que um mecanismo
local controla a alternância de ovulação entre os ovários através do ligamento útero-
ovariano.
Apesar da eficiência da laparotomia e da laparoscopia para predizer o
momento da ovulação, estes métodos são técnicas difíceis de serem realizadas
rotineiramente. Desta forma, novas técnicas estão sendo avaliadas e, em especial, a
ultra-sonografia vem atualmente sendo uma importante referência. A visualização
ultra-sonográfica das estruturas reprodutivas pélvicas de fêmeas, ou seja, o útero e
os ovários, foram primeiramente demonstradas por KRATOCHWIL et al., (1972).
Estes autores foram os primeirosa descrever mudanças ultra-sonográficas nos
ovários e no útero em relação ao ciclo menstrual de mulheres. Posteriormente,
HACKELOER et al. (1979) reportaram que existia uma correlação positiva entre o
diâmetro folicular e as concentrações plasmáticas de estradiol em mulheres cíclicas.
Desde então, a ultra-sonografia tem sido extensivamente usada para monitorar o
crescimento folicular e predizer o período da ovulação em mulheres com ciclos
espontâneos ou sob estímulo hormonal (ECOCHARD et al., 2000; SINGH et al.,
2003).
Um dos aspectos de maior avanço na ultra-sonografia são as imagens que
representam o mapeamento do fluxo sanguíneo baseado no princípio Doppler
(KADAH, 2002). Imagens ultra-sonográficas do fluxo sangüíneo (Color or Spectral
Doppler) são usadas principalmente para mensurações de movimentos. Entretanto,
recentemente o Color e a Doppler-fluxometria têm sido usados para descrever
mudanças hemodinâmicas nas artérias uterina (SLADKEVICIUS e VALENTIN, 1995;
PELLIZZARI et al., 2002) e ovariana (SLADKEVICIUS e VALENTIN, 1995;
PELLIZZARI et al., 2002) durante os processos de crescimento folicular, ovulação e
formação e regressão do corpo lúteo (CL) (COLLINS et al., 1991; BRANNSTROM et
al., 1998; ACOSTA et al., 2002). Desta forma, os objetivos do presente estudo foram
avaliar o útero e ovários e suas estruturas durante a fase folicular, bem como as
características do fluxo sanguíneo nas artérias uterinas e do ligamento útero-
ovariano (LUO), por meio da ultra-sonografia transabdominal utilizando o spectral
doppler.
79
MATERIAIS AND MÉTODOS
Fêmeas adultas de Cebus apella (n=06) sexualmente maduras, com histórico
prévio de ciclos reprodutivos regulares foram usadas. Todos os procedimentos
realizados no presente trabalho foram avaliados e aprovados pelo comitê de ética
em pesquisa com animais do Instituto Evandro Chagas (CEPAN-IEC-SVS) e pelo
Instituto Brasileiro de Meio Ambiente (IBAMA-PA). As fêmeas de C. apella utilizadas
foram mantidas do Centro Nacional de Primatas da Secretaria de Vigilância em
Saúde (CENP-SVS), localizado na cidade de Ananindeua (latitude: 1º 22' 30"sul,
longitude: 48º 22' 30" oeste, MIRANDA e COUTINHO; 2005). O clima é
megatérmico, úmido, temperatura média de 25ºC e com pequena amplitude térmica.
O regime pluviométrico é de 2.250 a 2.500mm, com chuvas regulares, mas com
maior concentração de janeiro a junho. A umidade relativa do ar está de,
aproximadamente, 85% (http://www.governodopara.gov.br).
As fêmeas foram mantidas em galpões telados, onde permaneceram em
gaiolas individuais de alumínio, com dimensões de 80x90x80 cm, ficando então
sujeitas ao fotoperíodo natural. A alimentação diária foi à base de frutas, verduras,
legumes, ração peletizada (FOXY Junior Supreme 9) e água ad libitum. As fêmeas
foram previamente selecionadas por meio de exames ultra-sonográficos
transabdominais do útero e do ovário. Somente fêmeas que apresentaram útero e
ovários com formatos normais foram incluídas no estudo.
As fêmeas de C. apella foram monitoradas utilizando-se a citologia vaginal e exames
ultrassonográficos sob contenção química com cloridrato de ketamina10 (10mg/kg
PV) e cloridrato de xilazina2 (1 mg/kg PV). A citologia vaginal foi realizada
diariamente para determinar o primeiro dia do ciclo menstrual. Suco de fruta foi
administrado 30 minutos antes da contenção química para as fêmeas, a fim de obter
uma melhor resolução durante a ultra-sonografia transabdominal, que requer uma
bexiga urinária repleta. Logo após a contenção química, a tricotomia da região
abdominal foi realizada antes de ser realizado o primeiro exame ultrassonográfico.
Exames ultra-sonográficos
As fêmeas foram examinadas com equipamento de ultra-sonografia HDI 4000
(Philips). Apenas um único examinador realizou todas as ultra-sonografias. A ultra-
9 FOXY Junior Supreme, PROVIMI, Brasil. 10 Kőning, Avellaneda, Argentina
80
sonografia transabdominal 2-D (US) foi realizada usando-se um transdutor micro-
convexo multifreqüêncial para visualizar o útero, ovários e estruturas ovarianas. A
ultra-sonografia pélvica foi realizada durante toda a fase folicular de (n=02) dois
ciclos menstruais consecutivos. As fêmeas de C. apella foram colocadas na posição
de decúbito dorsal e os exames US foram realizados após a aplicação de gel ao
transdutor.
As dimensões, o formato e a orientação do útero e dos ovários foram documentados
durantes os exames. Os comprimentos (diâmetro longitudinal - DL) do útero e dos
ovários foram avaliados utilizando-se seus eixos longitudinais; no caso do útero
especificamente, pela distância do fundo até a cérvix. As profundidades do útero e
ovários (dimensão dorsoventral - DDV) foram medidas no mesmo eixo, da sua parte
anterior até a posterior, perpendicularmente ao eixo longitudinal. Os diâmetros
transversais (DT) do útero e ovários foram medidos ao corte transversal. Os volumes
do útero e dos ovários foram calculados pelo sistema operacional do equipamento
de ultra-som usando a fórmula de um elipsóide (π/6[D1xD2xD3]).
O folículo dominante foi visto como uma estrutura ovariana anecóica circular
ou ligeiramente ovóide, com uma borda bem-delimitada. O corpo lúteo foi
identificado como uma estrutura hipoecóica, ovóide, com bordas irregulares. As
dimensões das estruturas ovarianas foram determinadas medindo-se os diâmetros
maior e menor perpendiculares entre si. A média aritmética entre o maior e o menor
diâmetro foi utilizada como parâmetro para se determinar as dimensões das
estruturas ovarianas em estudo.
Os índices ultra-sononográficos de ovulação foram: (1) desaparecimento ou
diminuição súbita do diâmetro do folículo; (2) aumento da ecogenicidade e (3)
irregularidade da parede folicular. O dia de ovulação foi designado como o dia em
que o folículo atingiu seu diâmetro máximo ou que houve a ruptura de folículo. Os
ovários foram categorizados como dominante ou não-dominante conforme o
surgimento do folículo dominante até a ovulação (ARDAENS et al., 2002; JÄRVELÄ
et al., 2002; JÄRVELÄ et al., 2003ab).
As artérias uterinas e do ligamento útero-ovariano (LUO) foram visualizadas
usando o Doppler colorido e o Doppler de fluxo. Os valores de fluxo medidos foram o
índice de resistência (IR) (POURCELOT, 1974) e o índice de pulsatilidade (IP)
(GOSLING et al., 1971). O IR foi calculado pela diferença entre o fluxo sistólico
máximo e o fluxo diastólico final, dividido pelo fluxo sistólico máximo. O IP foi
81
calculado pela diferença entre a freqüência sistólica máxima e a freqüência diastólica
máxima, dividido pelo tempo médio entre a freqüência sistólica máxima durante um
ciclo cardíaco. As vantagens do IR e IP estão na independência destes índices em
relação ao tipo e ao posicionamento do transdutor, bem como à simplicidade e
sensibilidade adequada para mudanças de fluxo do sangue (GOSLING et al., 1971;
POURCELOT, 1974).
Análise estatística
Os dados obtidos foram demonstrados como média + erro padrão. O teste t
não pareado foi usado para comparar os diâmetros e volumes uterinos, ovarianos,
folicular, bem como o IR e IP das artérias uterinas e do LOU nos diferentes dias do
ciclo menstrual de C. apella. O teste t pareado foi usado para comparações entre as
dimensões dos ovários direito e esquerdo, entre IR e IP das artérias uterinas e do
LOU dominantes e não-dominantes. A regressão linear simples foi usada para
analisar a relação entre o diâmetro e o volume de folículo dominante durante a fase
folicular do ciclo menstrual.
Para verificar se o diâmetro e o volume do folículo pré-ovulatório tiveram
influência nas dimensões e no volume do ovário dominante, análises de regressão
linear simples entre as dimensões DL (longitudinal), DDV (dorsoventral) e DT
(transversal), volume do ovário dominante (cm) e diâmetro (cm) e volume (ml) do
folículo ovulatório foram realizadas. Análise de regressão linear simples também foi
realizada para avaliar as variações do IR em relação ao IP das artérias uterinas e do
LOU. Os resultados foram considerados significativos quando P<0,05. O programa
estatístico Stat view para computador PC foi utilizado para realizar todos os testes
estatísticos e análises de regressão linear.
RESULTADOS
Setenta e quatro (74) exames ultra-sonográficos (US) foram realizados em
fêmeas adultas de C. apella. Os diâmetros e volumes uterinos medidos durante
exames US estão representados na Tabela 01. Os úteros das fêmeas de C. apella
apresentaram formato piriforme, diâmetro longitudinal alongado (Figura 05) em
relação aos diâmetros dorsoventral (p=0,0001) e transversal (p=0.0001). O diâmetro
transversal foi superior ao dorsoventral (p=0.0005). Não houve diferenças
estatísticas entre os diâmetros e o volume uterino em relação aos diferentes dias da
82
fase de folicular. O útero apresentou-se localizado posterior à bexiga, na posição
médio-versão. O fundo e o corpo foram individualizados ecograficamente, porém, a
cérvix teve difícil individualização, devido ao seu posicionamento em relação à púbis,
o que dificultou uma mensuração correta, principalmente no corte longitudinal. Todas
as fêmeas usadas neste estudo apresentaram útero com contornos regulares e
textura ecogênica homogênea.
Tabela 01. Média (+ EP) dos diâmetros longitudinal (DL), dorsoventral (DDV),
transversal (DT) e volume(V) uterino de fêmeas adultas de Cebus apella
mensurado por ultra-sonografia transabdominal.
Comparação entre colunas dentro de uma mesma linha (P<0,05): a, b, c
A Tabela 02 mostra os diâmetros médios dos ovários direito e esquerdo. Em
ambos os ovários o diâmetro longitudinal (DL) foi superior ao dorsoventral (DDV)
(p=0,0001) e ao transversal (DT) (p=0,0001). Da mesma forma, o diâmetro
dorsoventral (DDV) foi superior ao transversal (DT) (p=0,0001). Não houve diferença
estatística entre as médias dos diâmetros e volumes dos ovários direito e esquerdo
medidos nos diferentes dias da fase folicular.
Tabela 02. Média (+ EP) dos diâmetros longitudinal (DL), dorsoventral (DDV),
transversal (DT) e volume(V) do ovário de fêmeas adultas de Cebus
apella mensurados pela ultra-sonografia transabdominal
DL (cm) DDV (cm) DT (cm) V (ml)
Ovário direito 1,35 +0,04aA 0,82 +0,02bB 0,77+0,02cC 0,47+0,04D
Ovário esquerdo 1,28+0,03aA 0,80+0,02bB 0,76+0,03cC 0,41+0,02D
P<0,05, a, b, c (comparação entre colunas dentro de uma mesma linha) P<0,05, A, B, C (comparação entre linhas dentro de uma mesma coluna)
Diâmetro uterino
DL (cm) DDV (cm) DT (cm) V (ml)
1,77+0,03a 1,21+0,4b 1,37+0,04c 1,55+0,10
83
Os diâmetros e os volumes dos folículos ovarianos dominantes (Figura 07)
mensurados dos dias 03 ao 11 do ciclo menstrual estão demonstrados na Tabela 03.
O folículo dominante pode ser distinguido facilmente a partir do dia 03, apesar do
diâmetro e do volume serem os menores em relação aos outros dias do ciclo
(p=0,001). Nos dias 05 e 07 (p=0,001), o diâmetro e o volume do folículo dominante
foram menores em relação aos mesmos parâmetros dos dias 09, 10 e 11. A Figura
01 apresenta a análise de regressão linear simples entre diâmetro e volume dos
folículos dominante dos dias 03 a 11 do ciclo menstrual de C. apella. As relações
lineares entre os diâmetros e os volumes do folículo dominante nos dias do ciclo
menstrual foram significativas (p=0.0001). Os coeficientes de regressão linear para o
diâmetro e o volume do folículo dominante foram de 0,95 e 0,048, respectivamente.
Tabela 03. Médias (+ EP) do diâmetro (mm) e volume (ml) do folículo dominante de
fêmeas adultas de Cebus apella durante a fase folicular.
Dia do ciclo
03 05 07 09 10 11
Diâmetro 4,0 + 0,4A 5.5 + 0,3B 6,4 + 0,5 B 8,8 + 0,5C 8,9 + 0,9C 9,1 + 0,9 C
Volume 0,035 + 0,007A 0,13+0,04B 0,15 +0,02B 0,43 + 0,04C 0,53 + 0,1C 0,43 + 0,03C
P<0.001, A, B, C (comparação entre colunas dentro de uma mesma linha).
84
Os diâmetros médios longitudinal (DL), dorsoventral (DDV) e transversal (DT)
e volume (V) dos ovários dominantes e não-dominantes estão na Tabela 04 e 05.
Somente o DT do ovário dominante no dia 10 foi superior ao diâmetro transversal do
ovário não-dominante (p=0,02). Os diâmetros longitudinal e transversal e o volume
do ovário dominante variaram significativamente (p=0.05) durante os diferentes dias
da fase de folicular. O diâmetro longitudinal do ovário dominante foi menor no dia 07
quando comparado com o dia 10 do ciclo menstrual, enquanto que o diâmetro
transversal e o volume do ovário dominante nos dias 01 e 07 foram os menores
quando comparados com os dos outros dias do ciclo. Em relação ao ovário não-
dominante (Tabela 05), o diâmetro longitudinal do dia 07 foi o menor, enquanto que
o observado no dia 11 foi o maior do período em estudo. A relação linear (Figura 02)
entre o volume do ovário dominante e o do folículo foi significativa (p=0,0001), sendo
que o coeficiente de determinação foi 0,15.
Y =0,20 + 0,95 X; R2 = 0,84 Y = -0,091 + 0,048X; R2 =0,74
0
2
4
6
8
10
12
Diâ
met
ro F
olic
ular
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Dia do Ciclo
0
,1
,2
,3
,4
,5
,6
,7
,8
,9
1
Vo
lum
e F
olic
ula
r
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Dia do Ciclo
Diâmetro folicular Volume folicular
Figura 01. Regressão linear entre diâmetro e volume do folículo dominante em
relação os diferentes dias do ciclo menstrual estudados em fêmeas de
C apella.
85
Tabela 04. Médias (M+EP) dos diâmetros longitudinal (DL), dorsoventral (DDV),
transversal (DT) e volume(V) do ovário dominante durante as fases
menstrual, início e fim da fase folicular em fêmeas adultas de C. apella
mensurados durante exames ultrassonográficos 2-D transabdominal.
Dia do ciclo DL (cm) DDV (cm) DT (cm) V (ml)
01 1,26 + 0,11ab 0,81 + 0,03 0,62 + 0,05a 0,34 + 0,07a
03 1,32 + 0,11ab 0,85 + 0,06 0,75 + 0,04b 0,44 + 0,07ab
05 1,36 + 0,10ab 0,79 + 0,03 0,78 + 0,03b 0,42 + 0,06ab
07 1,25 + 0,08a 0,82 + 0,07 0,69 + 0,02c 0,38 + 0,06ab
09 1,39 + 0,14ab 0,82 + 0,09 0,91 + 0,04d 0,63 + 0,17bc
10 1,53 + 0,11b 0,88 + 0,06 0,97+ 0,04d 0,69 + 0,08c
11 1,49 + 0,11ab 0,87+ 0,01 0,91+ 0,01d 0,62 + 0,05b
Comparação entre linhas dentro de uma mesma coluna. P<0.05, a, b, c
O dia médio da ovulação foi 9,4 + 0,3 (07 a 11) do ciclo menstrual, sendo que
86,0% das ovulações ocorreram no ovário direito e 14,0% no ovário esquerdo. O
diâmetro e o volume médio do folículo dominante no dia de ovulação foi de 9,6 + 0,4
mm e 0,54 + 0,07 ml, respectivamente. Depois da ovulação, o corpo lúteo formado
apresentou diâmetro e volume de 8,1 + 0.4 e 0,3 + 0,05 ml, respectivamente.
86
Tabela 05. Médias (M+EP) dos diâmetros longitudinal (DL), dorsoventral (DDV),
transversal (DT) e volume (V) do ovário não-dominante durante as fases
menstrual, início e fim da fase folicular em fêmeas adultas de C. apella
mensurados durante exames ultrassonográficos 2-D transabdominal.
Dia do ciclo DL (cm) DDV (cm) DT (cm) V (ml)
01 1,27 + 0,14ab 0,79 + 0,07a 0,68 + 0,07a 0,37 + 0,08a
03 1,33 + 0,06a 0,79 + 0,03a 0,68 + 0,04a 0,38 + 0,04ab
05 1,32 + 0,03a 0,82 + 0,05a 0,73 + 0,02a 0,38 + 0,03ab
07 1,13 + 0,05b 0,76 + 0,05a 0,75 + 0,04a 0,34 + 0,03ab
09 1,33 + 0,06a 0,73 + 0,05a 0,92 + 0,08b 0,46 + 0,05bc
10 1,41 + 0,07a 0,86 + 0,08a 0,80+ 0,04b 0,52 + 0,08c
11 1,53 + 0,11c 1,04 + 0,08b 0,88 + 0,08bc 0,69 + 0,20d
Comparação entre linhas dentro de uma mesma coluna. P<0.05, a, b, c.
Volume do ovário = 0,37 + 0,46 * Volume Folicular; R2 = 0,15
,1,2
,3,4
,5,6
,7,8
,91
1,11,2
Vo
lum
e d
o o
vári
o
0 ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 1Volume Folicular
Figura 02. Regressão linear simples entre o volume do ovário dominante e volume
do folículo dominante (ml) fêmeas adultas de Cebus apella.
87
A Tabela 06 apresenta o IR e IP da artéria do ligamento útero-ovariano
(Figura 06) dos dias 03 ao 11 do ciclo menstrual de C. apella. O IR de artéria de
LOU conectada ao ovário dominante no dia 05 do ciclo foi maior em relação aos dias
09 (p=0,02), 10 (p=0,02) e 11 (p=0,021), enquanto os IP’s dos dias 09 a 11 foram
menores do que os observados nos dias 03 (p=0.05), 05 (p=0.03) e 07 (p=0.03). Na
artéria do LOU conectada ao ovário não-dominante, não houve diferença estatística
entre as médias do IR durante os diferentes dias do ciclo menstrual. Porém, o IP do
dia 09 foi menor em relação aos dias 03 (p=0.05), 05 (0.03) e 07 (p=0.05). Não
houve diferença estatística no IR e IP entre os ovários dominantes e não-dominantes
nos dias do ciclo menstrual.
Tabela 06. Médias (M + EP) do IR e IP da artéria do ligamento útero-ovariano (LUO)
conectado ao ovário dominante e não dominante nos dias 03 ao 11 do
ciclo menstrual de C. apella.
Ovário dominante Ovário não dominante
Dia do ciclo IR IP IR IP
D03 0,7 + 0,1ab 1,9 + 0,7a 0,8 + 0,2 2,3 + 0,8a
D05 0,8 + 0,0 a 1,9 + 0,5 a 1,1 + 0,3 2,1 + 0,3a
D07 0,6 +0,1 ab 1,9 + 0,5 a 0,9 + 0,2 2,2 + 0,6a
D09 0,5 + 0,1b 0,9 + 0,2 b 0,6 + 0,6 1,1 + 0,2b
D10 0,6 + 0,6b 1,1 + 0,2ab 0,8 + 0,3 1,6 + 0,6ab
D11 0,5 + 0,1b 0,8 + 0,1b 0,7 + 0,2 1,6 + 0,8ab
Comparação entre linhas dentro de uma mesma coluna. P<0.05, a e b
Na Figura 03, demonstra-se a análise de regressão linear entre o IR e o IP da
artéria do LUO conectado ao ovário dominante e não-dominante durante os dias 01
a 11 do ciclo menstrual de fêmeas C. apella. As relações lineares entre o IR e IP de
ambos os ovários foram significativas (p=0.0001). Os coeficientes de regressão
linear e de determinação ajustados dos ovários dominantes e não-dominantes foram
de 0,17 e 0,21;.60% e 36%, respectivamente.
88
O IR e o IP médios das artérias uterinas (Figura 06) direita e esquerda foram
de 0,81 + 0,04; 2,01 + 0,16 e 0,88 + 0,03; 2,27 + 0,14; respectivamente. Não houve
diferença estatística entre as artérias uterinas direita e esquerda. O IR e o IP médio
das artérias uterinas laterais ao ovário dominante e não-dominante durante
diferentes dias de estudo estão demonstrados na Tabela 07. O IR da artéria uterina
lateral ao ovário dominante foi inferior nos dias 01 (p=0.02, p=0.03), 03 (p=0.01,
p=0.03) e 05 (p=0.008, p=0.03) quando comparado com os dias 09 e 11. A média
do IR da artéria uterina do lado dominante no dia 07 (p=0.03) foi inferior em relação
ao dia 09, enquanto que o IP foi inferior no dia 01 (p=0.05), 03 (p=0.03) e 10
(p=0.05, p=0.03) quando comparado com o dia 09.
Lado dominante Lado não dominante
Y =0.38 + 0.17X; R2 = 0.60
0
,5
1
1,5
2
2,5
3
RI
0 1 2 3 4 5 6 7
PI
Y =0.43 + 0.21X; R2 = 0.36
0
,5
1
1,5
2
2,5
3
RI
0 1 2 3 4 5 6PI
Figura 03. Regressão linear entre o IR e IP da artéria do LUO conectado ao ovário
dominante e não-dominante durante a fase folicular de fêmeas de
Cebus apella.
89
Tabela 07. Médias (M + EP) do IR e IP da artéria uterina lateral ao ovário dominante
e não-dominante durante nos dias 03 ao 11 do ciclo menstrual de C.
apella.
Ovário dominante Ovário não dominante
Dia do ciclo IR IP IR IP
01 0,60 + 0,17a* 1,25 + 0,63a* 0,94 + 0,10a 2,63 + 0,36a
03 0,75 + 0,06a 1,61 + 0,30a 0,73+ 0,10a 2,70 + 1,06a
05 0,78 + 0,05a 1,87 + 0,27a 0,89 0,07a 2,02 + 0,22a
07 0,81 + 0,07a 2,22 + 0,36ab 0,87+ 0,05a 2,55 + 0,29a
09 1,08 + 0,09bc 2,82 + 0,39b 0,88+ 0,05a 2,10 + 0,19a
10 0,80 + 0,05ac 1,97 + 0,27a 1,06 + 0,30a 2,01 + 0,43a
11 0,90 + 0,06c 2,26 + 0,43ab 0,83 + 0,05a 2,04 + 0,34a
Comparações realizadas entre linhas dentro de uma mesma coluna. P<0.05, a, b, c. Comparações realizadas entre ovário dominante e não dominante (P<0,05): *
Não houve variação do IR e IP durante os diferentes dias do ciclo menstrual
estudados no lado não-dominante. Ambos IR (p=0.05) e IP (p=0.05) foram
superiores quando se comparou ao lado dominante no dia 01 do ciclo menstrual. A
relação linear entre o IR e IP das artérias uterinas lateral aos ovários dominante e
não-dominante (Figura 04) foram altamente significativas (p=0.0001). Os
coeficientes de determinação das análises de regressão linear simples entre o IR e o
IP das artérias uterinas laterais ao ovário dominante e não-dominante foram 0,17 (R2
= 0,70) e 0,15 (R2 = 0,40), respectivamente.
90
Y = 0.48 + 0.17X; R2 = 0.70 Y = 0.66 + 0.1X; R2 = 0.14
0
,5
1
1,5
2
2,5
3
RI
0 1 2 3 4 5 6 7 8PI
Artéria uterina não dominante
0
,5
1
1,5
2
2,5
3
RI
0 1 2 3 4 5 6PI
Artéria uterina dominante
Figura 04. Regressão linear entre o IR e IP da artéria uterina lateral ao ovário
dominante e não-dominante durante a fase folicular de fêmeas de
Cebus apella.
A B
Figura 05. Secções longitudinais do útero (A), útero e ovário direito (B) obtidos
durante exame ultra-sonográfico de fêmeas adultas de C. apella
91
DISCUSSÃO
A espécie C. apella é um dos primatas neotropicais mais estudados na
pesquisa biomédica, porém, existem poucos trabalhos sobre a reprodução desta
espécie. O presente estudo mostra dados morfofisiológicos do sistema reprodutivo
de fêmeas adultas de C. apella, usando ultra-sonografia 2D transabdominal. Deste
modo, considerando-se a ausência de dados morfofisiológicos sobre o sistema
LLtt.. UUOOLL AArrtteerryy]]
A B
Figura 06. Doppler-fluxometria da artéria uterina (A) e do LUO (B) de fêmeas de
C. apella.
FD
Figura 07. Folículo dominante no dia da ovulação (dia 10 do ciclo menstrual) de
uma fêmea Cebus apella
92
reprodutivo de fêmeas C. apella, a ultra-sonografia 2D transabdominal surge como
um método de relativa precisão, não invasivo, sem risco para a vida do indivíduo
(NARDO et al., 2003), que permite estudos exploratórios da anatomia e fisiologia
reprodutiva de fêmeas adultas de C. apella.
O uso da US pélvica transabdominal permitiu determinar o posicionamento e
dimensões uterinas. A limitação de exame US transabdominal está em relação à
pouca individualização da região cervical, devido ao seu posicionamento dorsal em
relação ao púbis, o que não permite mensurações confiáveis no corte longitudinal. O
desenvolvimento da ultra-sonografia transvaginal poderá oferecer dados
morfométricos mais precisos em relação à cérvix.
No presente trabalho, dados morfométricos do útero foram obtidos em fêmeas
cíclicas de C.apella. A compreensão dos diversos fatores envolvidos na reprodução
é de grande importância para o sucesso de programas de reprodução assistidas em
animais de cativeiro. Desta forma, o detalhamento anatômico do sistema reprodutivo
de fêmeas C.apella é muito importante para ajudar na escolha de fêmeas em
programas de reprodução assistida nesta espécie.
IOANNOU (1972) descreveu que os primatas neotropicais (platyrrhines) têm
ovários alongados, compactos e maiores em relação ao corpo do animal, quando
comparados às dimensões dos ovários dos primatas do Velho Mundo (catarrhines).
O mesmo autor reporta que os diâmetros médios dos ovários de fêmeas de C. apella
são de 13X9X8 mm. Não houve diferença estatística entre os diâmetros e o volume
dos ovários direito e esquerdo. Os resultados obtidos no presente trabalho são
semelhantes aos descritos previamente por IOANNOU (1972). Apesar de 86.0% das
ovulações terem ocorrido no ovário direito, não houve grandes variações nas
medidas de ambos os ovários dentro do período de estudo.
A partir do dia 03, foi possível detectar o folículo dominante, que apresentou
dois momentos de crescimento acentuado durante o período de estudo: o primeiro
entre os dias 03 e 05 e o segundo entre os 07 e 09 de ciclo menstrual. O diâmetro
médio do folículo pré-ovulatório no dia da ovulação foi de 9.6 + 0.4 mm, enquanto
que o volume foi de 0,54 + 0,07 ml. O diâmetro médio do folículo pré-ovulatório foi
semelhante aos descritos por NAGLE et al. (1980) usando a laparoscopia, e por nós
usando a laparotomia (dados não publicados). Usando a US transabdominal 2-D,
ORTIZ et al. (2004) reportaram que a ovulação acontece quando o diâmetro médio
do folículo ovulatório é de 8,2 mm (variação de 6,4 a 9,6 mm), sendo que o folículo
93
dominante de 5,0 mm leva de 01 a 05 dias para atingir o diâmetro médio do folículo
no dia da ovulação em fêmeas de C.apella. Os dados descritos por ORTIZ et al.
(2004) confirmam os resultados obtidos no presente trabalho.
Após a ovulação, o corpo lúteo formado apresenta diâmetro e volume médios
de 8,1 + 0,4 e 0,3 + 0,05 ml, respectivamente. A redução do diâmetro e do volume
do folículo dominante, o aumento do ecogenicidade e a irregularidade da parede
folicular foram os parâmetros que indicaram o rompimento folicular (ovulação)
(ECOCHARD et al., 2000).
As relações lineares entre os diâmetros e volumes dos folículos dominantes
em relação aos dias do ciclo menstrual mostraram que o crescimento do diâmetro
folicular é mais rápido do que o do volume folicular. A regressão linear simples entre
DL, DDV e DT do ovário em relação ao diâmetro e ao volume do folículo ovulatório
em fêmeas de C. apella foram realizadas para verificar a influência do diâmetro e
volume folicular sob as dimensões dos ovários dominantes. O diâmetro transversal
do ovário dominante foi o que sofreu variações significativas em relação ao
crescimento folicular. Por conseguinte, o crescimento do folículo dominante teve
pouca influência sobre as variações do volume total do ovário dominante. Esta
hipótese pode ser confirmada pelo fato de que somente o diâmetro transversal do
ovário dominante (DT) no dia 10 foi estatisticamente superior ao diâmetro transversal
do ovário não-dominante, sendo que não houve diferença estatística entre os
ovários em relação aos três diâmetros e volumes mensurados nos outros dias do
ciclo menstrual.
Existem várias técnicas para predizer o período periovulatório. NAGLE et al.
(1980), usando laparoscopia, mostraram que o período periovulatório ocorre entre os
dias 07 e 11 do ciclo menstrual em C. apella. Da mesma forma, usando a
laparotomia, temos diagnosticado que o período periovulatório ocorre entre dias 5 e
11 do ciclo menstrual (dados não publicados). No presente estudo, a ovulação
ocorreu em média no dia 9,4 + 0,3; variando entre os dias 07 e 11. Estes resultados
demonstram que o diagnóstico da ovulação realizado com o uso daUS
transabdominal 2-D confirmou os dados descritos por NAGLE et al. (1980) e os
obtidos previamente por nós com a laparotomia.
O presente estudo descreveu a velocidade do fluxo de sangue das artérias do
LUO e uterinas em fêmea de C. apella. O IR da artéria do LUO conectado ao ovário
dominante apresentou diminuição nos dias 09, 10 e 11 em relação ao dia 05 do
94
ciclo, enquanto que o IR da artéria do LUO conectado ao ovário não-dominante
permaneceu constante. Analisando os valores de IP das artérias do LUO’s
conectadas a ambos os ovários, ocorreu uma diminuição nos dias 09 e 11 no ovário
dominante e só no dia 09 no ovário não-dominante.
Estes resultados sugerem que ocorreu manutenção da velocidade do fluxo
sangüíneo do LUO conectado ao ovário dominante na fase que precede o período
de maior crescimento do folículo pré-ovulatório, a partir do dia 05 do ciclo. A
diminuição de IP no dia 09 foi acompanhada pela diminuição do IR da artéria do
LUO conectado ao ovário dominante. Este pode ser um mecanismo compensatório
entre o IR e IP que não foi observado no lado não-dominante. A análise de
regressão linear confirma esta hipótese, considerando que o coeficiente de
determinação entre o IR e o IP da artéria do LUO conectado ao ovário dominante foi
maior em relação ao lado não-dominante.
NAGLE et al. (1994) sugeriram a existência de um controle local do fluxo
sangüíneo na artéria do LUO que poderia influenciar na alternação da ovulação
entre os ovários. Os autores demonstraram que houve uma grande síntese/secreção
de estradiol pelo ovário dominante, seguida pela ovulação quando o LUO conectado
ao ovário dominante recebeu um estímulo elétrico. Contudo, a concentração
plasmática de progesterona do sangue drenado de ambas as veias ovarianas foi
baixa após a excitação elétrica do LUO conectado ao ovário dominante. No presente
estudo, a concentração plasmática de esteróides ovarianos nas veias ovarianas não
foi mensurada, porém o Doppler colorido e a dopplerfluxometria podem ser dados
importantes sobre o efeito de IP e IR da artéria do LUO sob a concentração de
esteróides liberados pelos ovários no período periovulatório.
A relação linear entre IR e o IP da artéria do LUO de ambos ovários foi
altamente significativa (P <0.0001). Porém, o coeficiente de determinação entre o IR
e PI da artéria do LUO conectado ao ovário dominante foi maior (60%) do que no
lado não-dominante (36%). Os mecanismos que controlam os IR e IP das artéria dos
LUO’s durante a fase folicular podem ser objeto de mais estudos em fêmeas C.
apella. Uma hipótese a ser estudada é se a ação do gonadotrofinas tem influência
nos RI e PI das artérias dos LUO’s. Considerando-se esta hipótese, relatos
descrevem que a liberação pulsátil do hormônio luteinizante (LH) (ARDAENS et al.,
2002; BRANNSTROM et al., 1998) tem efeito local na produção e liberação de
substâncias vasoativas, como histamina (PIACSEK et al., 1971) e óxido nítrico
95
(BONELLO et al., 1996), sendo que estes fatores podem influenciar o IR e IP das
artérias dos LUO’s.
Em relação ao IR e IP da artéria uterina em fêmeas adultas de C. apella, os
resultados da regressão linear simples e a comparação entre as médias nos
diferentes dias indicam um aumento do IR da artéria uterina lateral ao ovário
dominante e a oscilação do seu IP no final da fase folicular, enquanto na artéria
uterina lateral ao ovário não-dominante, o IR e o IP permaneceram constantes em
todo o período de estudo. Pode ser sugerido que a diminuição do fluxo sanguíneo da
artéria uterina lateral ao ovário dominante pode estar sendo, em parte, devido ao
direcionamento do fluxo sanguíneo para o ovário dominante no período pré-
ovulatório. Os dados obtidos no presente estudo são diferentes dos descritos por
VRTACNIK-BOKAL & MEDEN-VRTOVEC (1998) em mulheres. Eles relataram que
os IR’s das artérias uterinas diminuíram no final da fase folicular, atingindo seus
menores valores no período pré-ovulatório.
Estudos para determinar se as variações no IR e IP da artéria uterina lateral
ao ovário dominante estão sob o controle de gonadotrofinas, ou substâncias
secretadas no local, ou ambos, podem ser importantes não somente na
compreensão da fisiologia reprodutiva de fêmeas da espécie C. apella, mas também
de outras espécies de primatas.
Os conhecimentos dos parâmetros normais para o Doppler colorido e a
dopplerfluxometria são importantes, porque contribuem na diagnose de patologias
reprodutivas de fêmeas (VALENTIN, 1997). No presente trabalho, obtivemos
medidas de fluxo de sangue das artérias uterinas e do LUO de fêmeas adultas
cíclicas de C. apella durante a fase folicular. As artérias ovarianas, como também a
vascularização do folículo dominante e do corpo lúteo foram difíceis de ser
individualizadas pela ultra-sonografia transabdominal devido à impossibilidade de
posicionar o transdutor mais próximo do ovário, como acontece na ultra-sonografia
transvaginal, que permite a individualização de vasos que estão no estroma
ovariano.
Para finalizar, o presente estudo obteve dados morfométricos do útero e
ovários de fêmeas C. apella com o uso da ultra-sonografia transabdominal 2-D. Foi
possível acompanhar o crescimento do diâmetro e volume do folículo dominante a
partir do dia 03 do ciclo menstrual de C. apella. O crescimento do diâmetro e do
volume do folículo dominante foram acompanhados pelo aumento do diâmetro
96
transversal do ovário dominante. A ovulação aconteceu entre os dias 07 e 11.
Reportamos medidas de fluxo sangüíneo da artéria uterina e do LUO durante início e
fim da fase folicular. A média do IR e IP das artérias uterina e do LUO do mesmo
lado do ovário dominante sofreram modificações que indicam diminuição e aumento
no fluxo de sangue no período periovulatório, respectivamente. Os presentes dados
serão de grande importância no desenvolvimento de biotécnicas de reprodução em
primatas neotropicais da espécie Cebus apella, podendo auxiliar como parâmetro na
escolha de fêmeas em programas de reprodução assistida nesta espécie.
Agradecimentos
Universidade Federal do Pará (UFPA), Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF), Centro Nacional de Primatas (CENP-SVS), Instituto Brasileiro
de Meio Ambiente (IBAMA-PA), CAPES, FINEP.
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100
CONCLUSÕES GERAIS
• A partir dos folículos pequenos (2mm), o oócito de C. apella atinge o seu
diâmetro máximo. É possível obter complexos cumulus-oophurus de C.
apella por meio da punção folicular por laparotomia nos dia 5, 7 e 9 do
ciclo.
• Demonstramos que ocorrem mudanças no perfil protéico de oócitos
intactos e desnudos, bem como nas células do cumulus obtidos a partir de
folículos pequenos, médios e grandes nos dias 05, 07 e 09 do ciclo
menstrual de C. apella.
• Mesmo com o oócito apresentando seu tamanho máximo, a expressão
das proteínas se modifica durante a fase folicular em fêmeas de C. apella.
• O dia 09 é o dia mais indicado para realizar a punção folicular, por ser o
dia médio em que ocorre a ovulação, todos os CCOs obtidos
apresentavam células do cumulus e o crescimento folicular poder ser
acompanhado pela da ultrassonografia desde o dia 03 do ciclo.
• A média do IR e IP das artérias uterina e do LUO do mesmo lado do
ovário dominante sofreram modificações que indicam diminuição e
aumento no fluxo de sangue no período periovulatório, respectivamente.
• Os presentes dados serão de grande importância no desenvolvimento de
biotécnicas de reprodução em primatas neotropicais da espécie Cebus
apella, podendo auxiliar como parâmetro na escolha de fêmeas em
programas de reprodução assistida nesta espécie.
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