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DESTINO DA GLICOSE E IDENTIFICAÇÃO DA ENZIMA GSK-3 EM OVIDUTOS DE
VACAS ZEBUÍNAS
HELGA FERNANDES GOMES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
AGOSTO – 2006
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DESTINO DA GLICOSE E IDENTIFICAÇÃO DA ENZIMA GSK-3 EM OVIDUTOS DE VACAS
ZEBUÍNAS
HELGA FERNANDES GOMES
“Dissertação apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologia Agropecuária da
Universidade Estadual do Norte
Fluminense, como parte das exigências
para obtenção do título de Mestre em
Produção Animal”.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Angelo José Burla Dias
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Carlos Logullo
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
AGOSTO - 2006
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DESTINO DA GLICOSE E IDENTIFICAÇÃO DA ENZIMA GSK-3 EM OVIDUTOS DE VACAS
ZEBUÍNAS
HELGA FERNANDES GOMES
“Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologia Agropecuária da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal”.
Aprovada em 18 de Agosto:
________________________________________________________________ Prof. Reginaldo da Silva Fontes (Doutor em Ciência Veterinária) - UENF
________________________________________________________________ Luiz Sérgio de Almeida Camargo (Doutor em Ciência Animal) – EMBRAPA
________________________________________________________________ Prof. Carlos Jorge Logullo de Oliveira (Doutor em Química Biológica) - UENF
Co-Orientador
_______________________________________________________________ Prof. Angelo José Burla Dias (Doutor em Biociências) - UENF
Orientador
4
Dedico esta tese ao meu filho João Vitor
5
Agradecimentos:
Agradeço a Deus por todas as oportunidades que me foram concebidas.
Aos meus pais, porque sem eles o meu caminho seria muito mais tortuoso.
Ao Angelo, por acreditar na minha capacidade e por sua amizade durante a
realização deste trabalho.
Ao Jorge, um grande amigo e incentivador, que me ajudou muito no
desenvolvimento deste trabalho.
Ao professor Reginaldo pelas críticas e disponibilização de artigos
A Carla Paes, principalmente pela amizade, e pelo ensinamento para obter o
material.
Ao Carlos Logullo, em especial, que contribuiu enormemente para os experimentos
realizados nessa tese.
Aos professores Maria Luiza e Cláudio Retamal por liberar o uso do sonicador e a
todos do seu laboratório
A todos do LQFPP, que tiveram a maior paciência comigo, em especial, a Josiana
em quem eu descobri uma amiga.
A galera do laboratório por tornar o ambiente de laboratório descontraído e
agradável para trabalhar.
Ao professor Gonçalo por permitir a realização do RT-PCR
A Beatriz que me auxiliou nas técnicas de RT-PCR.
6
A Georgina que mesmo longe sempre me incentivou.
A Bianca, outra amiga que fiz no mestrado.
Agradeço a todos os meus amigos e colegas que, de alguma forma, contribuíram
para o desenvolvimento deste trabalho e peço desculpas se, por acaso, me esqueci
de citar alguém.
7
BIOGRAFIA
HELGA FERNANDES GOMES, filha de Homero Soares Gomes Filho e
Sonia Maria Fernandes Gomes, nasceu em 23 de maio de 1979, na cidade do
Rio de Janeiro-RJ.
Cursou Medicina Veterinária na Universidade Federal Fluminense no
período de outubro de 1998 a janeiro de 2003.
Foi admitida em agosto de 2004 no curso de Pós-graduação em
Produção Animal, Mestrado, Reprodução Animal, da Universidade Estadual
do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ,
submetendo-se a defesa de tese para conclusão do curso em agosto de
2006.
8
Sumário
ABREVIATURAS x
RESUMO xi
ABSTRACT xii
1 – INTRODUÇÃO 1
2 – REVISÃO DE LITERATURA 4
2.1 – O oviduto: estrutura e função 4
2.2 – Composição do fluido do oviduto 9
2.3 – Fatores que influenciam a secreção do fluido do oviduto 11
2.4 – Proteínas do oviduto envolvidas na fertilização e desenvolvimento
embrionário inicial 13
2.5 – Lactato, piruvato e glicose no desenvolvimento embrionário inicial 15
2.6 – Aspectos gerais sobre metabolismo energético 18
2.7 – Glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3): características e funções 19
3 – OBJETIVOS 24
3.1 – Objetivos gerais 24
3.2 – Objetivos específicos 24
4 – MATERIAL E MÉTODOS 25
4.1 – Coleta dos ovidutos 25
4.2 – Obtenção do fluido e células do oviduto 25
4.3 – Quantificação de proteínas totais de fluido e células de oviduto 26
4.4 – Quantificação de glicose do fluido 27
4.5 – Quantificação de glicogênio em células do oviduto 27
4.6 – Determinação da concentração de fosfoenolpiruvato e de piruvato
em células de oviduto 28
4.7 – Determinação da atividade de hexoquinase (HK) em células 28
4.8 – Determinação da atividade de piruvato quinase (PK) 29
4.9 – Determinação da atividade de PEPCK 29
4.10 – Cultura de células epiteliais de oviduto 30
4.11 – Amplificação de fragmento de GSK-3 de células de oviduto 30
5 – RESULTADOS 31
Figura 9: Atividade de HK em células de oviduto 32
9
Figura 10: Atividade de PK em células de oviduto 33
Figura 11: Dosagem de glicose em fluido de oviduto 33
Figura 12: Dosagem de glicogênio em células de oviduto 34
Figura 13: Dosagem de piruvato em células de oviduto 34
Figura 14: Dosagem de fosfoenolpiruvato em células de oviduto 35
Figura 15: Atividade de PEPCK em células de oviduto em vacas com
corpo lúteo 36
Figura 16: Resultado do RT-PCR do gene da GSK-3 por eletroforese
de DNA em gel de agarose em células de oviduto bovino 37
6 – DISCUSSÃO 38
7 – CONCLUSÃO 43
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45
10
ABREVIATURAS
PBS – tampão fosfato de sódio
HK – hexoquinase
PK – piruvato quinase
PEPCK – piruvato carboxiquinase
PEP – fosfoenolpiruvato
GSK-3 – glicogênio sintase quinase-3
PIV – produção in vitro
FIV – fertilização in vitro
OGP – glicoproteína específica do oviduto
TGF – fator de crescimento de transformação
FGF – fator de crescimento fibroblástico
EGF – fator de crescimento epidermal
HSP – proteína de choque térmico
IGF – fator de crescimento semelhante à insulina
11
RESUMO
Gomes, Helga, F., Universidade Estadual do Norte Fluminense; agosto de 2006;
Destino da glicose e identificação da enzima GSK-3 em ovidutos de vacas zebuínas;
Professor Orientador: Angelo Burla. Professor Co-orientador: Carlos Logullo
O oviduto é responsável por criar um microambiente apropriado para o
ovócito, transporte e reserva de espermatozóides, fertilização e desenvolvimento
inicial do embrião. A glicose desempenha um papel importante na fisiologia e
desenvolvimento de muitos organismos vivos. O presente trabalho visa entender o
papel de enzimas glicolíticas como a hexoquinase, piruvato quinase e a enzima
gliconeogênica PEPCK em ovidutos de vacas zebuínas com e sem corpo lúteo
ipsilateral e a habilidade do oviduto em regular o metabolismo de glicose. Para isso
avaliou-se a concentração de glicose no fluido, bem como as concentrações de
piruvato, fosfoenolpiruvato e glicogênio nas células desse órgão. As atividades de
hexoquinase, piruvato quinase e fosfoenolpiruvato quinase também foram medidas
nessas células. Foi observada uma intensa atividade gliconeogênica em vacas com
corpo lúteo e sem corpo lúteo. A atividade glicolítica diferiu entre as regiões do
oviduto e entre vacas com e sem corpo lúteo. Identificamos também nesse trabalho
a presença de um transcrito de GSK-3 em células de oviduto.
Palavras chaves: Oviduto, vacas zebuínas, glicose, metabolismo, GSK-3
12
ABSTRACT
Oviduct provides the appropriate environment for oocytes, spermatozoa
transport, fertilization and early embryo development. Glucose has an important
function on the fisiology and development of many live organisms. The present study
aims to understand the roles of glycolytic enzymes such as hexokinase, pyruvate
kinase and the gluconeogenic enzyme PEPCK, in oviduct from zebuine cows with or
without corpus luteum and its ability to regulate glucose metabolism. For this we
evaluated glucose concentration on oviduct’s fluid as well as pyruvate,
phosphoenolpyruvate and glycogen in oviduct cells. The hexokinase, pyruvate kinase
and phosphoenolpyruvate kinase were also measured on these cells. We observed
an intense gluconeogenic activity on both oviducts with and without corpus luteum.
The glucolitic activity was different in cow’s with and without corpus luteum and in
each region of bovine oviduct. We identified in this work a transcript of GSK-3 in
oviduct cells.
Key words: Oviduct, zebuine cows, glucose, metabolism, GSK-3
13
1. INTRODUÇÃO
O oviduto de mamíferos é uma estrutura altamente especializada, com um
papel fundamental no processo de reprodução, pois além de ser o local onde ocorre
a fertilização, também proporciona um micro-ambiente favorável ao desenvolvimento
inicial do embrião, até que este seja transportado ao interior do útero.
As células ciliadas e não ciliadas que compõem o epitélio pseudoestratificado
desse órgão, desempenham papel fundamental, auxiliando no transporte dos
espermatozóides e secretando substâncias, que juntamente com o transudato
seletivo dos capilares sangüíneos e componentes do peritônio, irão compor o fluido
do oviduto.
O fluido do oviduto contém íons (como cálcio, sódio e potássio), aminoácidos
(glicina, glutamato, alanina, leucina, fenilalanina taurina e hipotaurina) e proteínas
(principalmente a albumina e a glicoproteína específica do oviduto - OGP), além de
fatores de crescimento (TGF, FGF EGF), enzimas, hormônios e fontes de energia
(lactato, piruvato e glicose) (LAUSCHOVÁ, 2003).
Os íons apresentam funções bioquímicas importantes como em outros
sistemas biológicos. Eles estão envolvidos no processo de reação acrossômica,
motilidade, fertilização e capacitação espermática.
Estudos sobre a morfologia e fisiologia do oviduto têm sido desenvolvidos em
diferentes espécies animais como coelhas (FEIGELSON e KAY, 1972; HYDE e
BLACK, 1986; ERICKSON-LAWRENCE et al., 1989), macacas (MASTROIANNI et
al., 1970; FAZLEABAS e VERHAGE, 1986; VERHAGE et al., 1988; 1997), porcas
14
(BUHI et al., 1989; 1990; 1996; WALTER e BAVDEK, 1997; VATZIAS e HAGEN,
1999), éguas (WILLIS et al., 1994) e vacas (GERENA E KILLIAN , 1990). Em todas
essas espécies foi observado que o fluido do oviduto é bioquimicamente complexo e
sua constituição varia com as fases do ciclo estral. Essa variação na constituição
reforça o papel que o oviduto desempenha no processo de reprodução.
O conhecimento das características desse micro-ambiente, no entanto tem
sido utilizado para o estabelecimento de estratégias de produção in vitro de
embriões. Atualmente essa tecnologia é considerada a terceira biotecnologia ligada
à reprodução animal de maior importância, após a inseminação artificial e
transferência de embriões.
Entretanto, apesar do grande desenvolvimento observado nesse campo nos
últimos anos, vários problemas ainda persistem. A baixa taxa de formação de
blastocistos e de gestação alcançadas, enorme sensibilidade desses blastocistos à
criopreservação, entre outros, acabam comprometendo a plena aplicação da
produção in vitro de embriões.
Embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) mostram diferenças marcantes
daqueles produzidos in vivo com respeito à morfologia, tempo de desenvolvimento,
metabolismo embrionário, expressão gênica e resistência a baixas temperaturas.
Diversas alterações encontradas nos embriões PIV podem estar relacionadas às
condições adversas de cultivo in vitro, as quais os embriões são expostos nesse
sistema de produção, o que acaba influenciando sua qualidade (KHURANA e
NIEMANN, 2000).
Embriões bovinos cultivados no oviduto de ovelhas ou coelhas são capazes
de se desenvolver desde o estádio de zigoto até o estádio de blastocisto com maior
sucesso do que em condições in vitro. Da mesma forma, o co-cultivo de embriões
com células de oviduto, permite o aumento na taxa de blastocistos, além de uma
melhor resistência dos embriões ao congelamento.
Células de oviduto têm sido usadas com sucesso como co-cultura para
ovócitos de uma variedade de espécies de mamíferos, uma vez que é conhecido o
efeito benéfico da interação física entre os gametas femininos e o epitélio do oviduto,
tanto em sistemas in vivo como in vitro, proporcionando o aumento da competência
de desenvolvimento dos ovócitos (BOATMAN, 1997). Culturas de células epiteliais
de oviduto podem ainda afetar, de maneira semelhante à observada em condições
in vivo, as funções dos espermatozóides como a motilidade, capacitação e
15
fertilização (ABE e HOSHI, 1997; QUINTERO et al., 2005). Tais situações
demonstram a efetiva contribuição direta ou indireta do oviduto para o
desenvolvimento embrionário e sugerem que alguns fatores críticos para o sucesso
dos eventos de fertilização e desenvolvimento inicial do embrião são secretados pelo
oviduto.
Entretanto, o conhecimento preciso do ambiente do oviduto ainda não foi
atingido, consequentemente, a determinação de um sistema in vitro que permita o
desenvolvimento embrionário de modo eficiente ainda não foi alcançado.
A melhoria dos meios utilizados na produção in vitro de embriões, deve
proporcionar não apenas o aumento do número total de embriões para transferência,
mas também a diminuição do estresse, que pode impedir o desenvolvimento fetal
posteriormente. Isso inclui o desenvolvimento do zigoto ao estádio de blastocisto
com um número adequado de células da massa celular interna e do trofoblasto, além
de um padrão normal de expressão gênica.
Muitos trabalhos vêm sendo realizados para determinar os principais
constituintes do fluido do oviduto de bovinos (BORLAND et al., 1980; GERENA e
KILLIAN, 1990; RODRIGUEZ e KILLIAN, 1998; LEESE et al., 2001; KILLIAN, 2004).
No entanto esses estudos estão relacionados na maioria das vezes a animais Bos
taurus enquanto que o rebanho nacional é constituído por mais de 80% de animais
de sangue Bos indicus. Deste modo, torna-se necessária a análise da composição
desse fluido, visando gerar conhecimentos que permitam desenvolver meios mais
adequados para elevar a eficiência da produção in vitro de embriões zebuínos.
16
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1- O oviduto: estrutura e função
Os ovidutos são órgãos do sistema reprodutor feminino de formato sinusóide,
presentes em número par, que se estendem desde a extremidade dos cornos
uterinos até a proximidade dos ovários. Eles são divididos em três regiões:
infundíbulo, ampola e istmo (Figura 1). A extremidade livre do infundíbulo é chamada
de fímbria, a qual tem a função de captar o ovócito durante a ovulação, por meio de
um processo de massagem sobre a superfície do ovário (Figura 1) (JUNQUEIRA e
CARNEIRO, 1995).
A parede da tuba é formada por uma camada mucosa, uma muscular e uma
serosa representada pelo peritônio. O epitélio que reveste a mucosa é pseudo-
estratificado, ciliado, apresentando algumas células secretoras cilíndricas, mas
desprovidas de cílios (Figuras 2 e 3) (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1995; KAMACI et
al., 1999). No período do estro a relação numérica dessas células não se altera na
região da ampola e istmo, porém muda significativamente na fímbria (WALTER e
BAVDEK, 1997).
17
Figura 1: Esquema da divisão anatômica do oviduto
(www.ansi.okstate.edu)
Figura 2. Aspecto histológico do oviduto. Fotomicrografia do epitélio pseudo-estratificado que reveste a mucosa desse órgão. As setas apontam núcleos em diferentes alturas (TAY et al. 1997)
Corno uterino
Junção útero-
tubária
istmo
Junção istmo-
ampolar
infundíbulo ampola
ovário
fímbria
folículo
18
Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura de monocamada de células epiteliais de oviduto bovino. Notar células ciliadas (seta) e não ciliadas. Barra = 2 µm (BENCHIMOL et al, 2006).
Diferenças morfológicas são encontradas entre as regiões do oviduto. No
infundíbulo, observa-se a ocorrência de pregas primárias altas e estreitas, com
pregas secundárias e terciárias revestidas por epitélio pseudo-estratificado e
cilíndrico simples, com cílios em grande quantidade para que eles possam fazer um
movimento de turbilhão e impulsionar o ovócito captado pelas fímbrias até a região
de ampola, que é a região de fertilização (MONTEIRO et al., 2003). A região da
ampola apresenta pregas primárias altas e delgadas, com pregas secundárias
revestidas por epitélio pseudo-estratificado, com cílios em quantidade moderada
(MONTEIRO et al., 2003). O istmo apresenta pregas longitudinais curtas e largas,
revestidas por epitélio pseudo-estratificado com cílios curtos em pequena quantidade
e uma espessa camada muscular constituída por duas subcamadas, a circular
interna espessa e a longitudinal externa delgada (MONTEIRO et al., 2003). Essa
espessa camada muscular que promove um movimento rítmico de contração
juntamente com os batimentos ciliares são responsáveis por direcionar o embrião
em desenvolvimento para o interior do útero onde irá se fixar e permanecer até o
momento de parto.
Essas diferenças histológicas regionais proporcionam mudanças na
composição do fluido do oviduto, tendo sido demonstrado alterações na
concentração de proteínas totais (9.6 mg/mL na fase luteínica e 8.5 mg/ mL na fase
não luteínica), colesterol (175 µg/ mL na fase não luteínica e 143 µg/ mL na fase
não luteínica) e carboidratos totais (90 µmol/ mL na fase luteínica e 324 µmol/ mL
19
na fase não luteínica) (Killian et al., 1989). Tais diferenças regionais na composição
do fluido do oviduto podem refletir diferentes funções desses segmentos (WALTER e
BAVDEK, 1997).
Há uma diversidade de eventos cronologicamente controlados que ocorrem
no oviduto: estoque de espermatozóides, capacitação espermática no istmo,
liberação e transporte de espermatozóides, captação dos ovócitos, maturação final
dos ovócitos no infundíbulo, fertilização na ampola, desenvolvimento embrionário
inicial e transporte dos embriões até o útero. Esses eventos seqüenciais requerem
um sistema de suporte dinâmico e bem sincronizado pelo oviduto para ocorrer o
sucesso no processo de fertilização. Várias interações estímulo-resposta (gameta-
tuba, tuba-gameta, gameta-gameta) fazem parte de um mecanismo que controla a
fisiologia do oviduto (AGUILAR e REYLEY, 2005).
O fluido do oviduto é capaz de prover um ambiente ótimo para a maturação
final do ovócito, fusão do ovócito com o espermatozóide, início do desenvolvimento
embrionário, além de servir como reservatório de espermatozóides após a cópula
(LEESE et al., 2001; LAPOINTE e BILODEAU, 2003).
O fluido do oviduto apresenta ainda um efeito direto sobre o processo de
capacitação espermática, motilidade espermática e reação acrossômica, eventos
necessários para a fertilização (KILLIAN, 2004).
GRIPPO et al. (1995) demonstraram que o fluido de oviduto bovino obtido da
ampola e istmo, das fases luteal e não-luteal, tem diferentes efeitos sobre a
motilidade, reação acrossômica e fertilidade sobre espermatozóides de bovinos.
Espermatozóides pré-incubados em fluido obtido do istmo do oviduto apresentaram
maior capacidade de ligação à zona pelúcida de ovócitos, que aqueles pré-
incubados em fluido da região da ampola (KILLIAN, 2004). No entanto,
espermatozóides incubados em fluido da ampola obtido na fase não luteal do ciclo
estral resultaram em maiores taxas de fertilização do que espermatozóides pré-
incubados com fluido do istmo (KILLIAN, 2004).
O espermatozóide de mamíferos não é imediatamente capaz de fertilizar o
ovócito quando é depositado no trato reprodutivo feminino, tendo que passar por
uma fase de preparação conhecida por capacitação (AUSTIN, 1951; CHANG, 1951).
Na fase de capacitação ocorre uma alteração inicial da membrana (WOLF et al.,
1986), que permite ao espermatozóide passar para a fase seguinte, que é a fase de
fusão da membrana plasmática e a membrana acrossomal externa, denominada de
20
fase de reação acrossômica (PARRISH et al., 1989). Nessa fase há liberação de
acrosina que permitirá que o espermatozóide penetre na zona pelúcida (Figura 4). O
local certo da ocorrência da capacitação ainda não está bem definido, podendo
ocorrer tanto no útero, quanto no oviduto.
Em bovinos (HUNTER e WILMUT, 1982), ovinos (HUNTER e NICHOL, 1983)
e suínos (HUNTER, 1984), existem duas fases de transporte dos espermatozóides.
Uma primeira fase dita rápida, que está associada com o aparecimento dos
espermatozóides no oviduto aproximadamente 15 minutos após a sua deposição no
trato genital feminino, porém esses espermatozóides não estão associados com a
fertilização (PARRISH et al., 1989). A segunda fase conhecida como fase lenta, com
duração de 6-12 horas em animais domésticos, permite que haja uma deposição e
acúmulo de espermatozóides próximo à junção útero-tubárica na região de istmo
(PARRISH et al., 1989). No momento da ovulação os espermatozóides saem dessa
reserva para encontrar o ovócito próximo à junção istmo-ampolar (PARRISH et al.,
1989). Os espermatozóides podem permanecer nesse reservatório por volta de 18-
20h em bovinos (HUNTER e WILMUT, 1982), 17-18h em ovinos (HUNTER e
NICHOL, 1983), e 36h em suínos (HUNTER, 1984). Pelo longo tempo que os
espermatozóides permanecem no istmo, é provável que a capacitação ocorra
mesmo no oviduto.
As células epiteliais da região do istmo do oviduto de mamíferos possuem
uma ação importante sobre os espermatozóides. Elas podem se ligar aos
espermatozóides via carboidratos presentes em sua membrana plasmática e pelas
proteínas de choque térmico 60 (HSP 60). A finalidade dessa ligação seria de
manter os espermatozóides vivos por um tempo suficiente para a fertilização
(BOILARD et al., 2004), mantendo baixa a concentração de cálcio intracelular e
regulando os níveis de glicose que são importantes para o processo de capacitação.
Isso sugere que a membrana plasmática apical das células do oviduto contém
fatores capazes de influenciar no fluxo de cálcio no espermatozóide (BOILARD et al.,
2002).
HUNTER et al. (1987) observaram, com auxílio da microscopia eletrônica, que
durante o tempo de permanência no oviduto, os espermatozóides de suínos
encontram-se associados à superfície das células epiteliais, estando também
aprofundados nas criptas do epitélio do oviduto.
21
As células do oviduto podem ainda estar participando da regulação da tensão
de oxigênio, e conseqüentemente, impedindo os danos oxidativos, uma vez que a
redução da tensão de oxigênio foi observada em meios após a cultura de células de
epitélio do oviduto bovino. Além disso, enzimas antioxidantes tais como a glutationa-
peroxidase, superóxido-dismutase-Cu-Zn e catalase foram descritas em ovidutos de
vacas (LOCATELLI et al.; 2005).
2.2 - Composição do fluido do oviduto
O fluido do oviduto deriva de duas fontes principais, o soro sangüíneo e as
células do epitélio secretor (KILLIAN et al., 1989), e sua composição tem sido
descrita por vários autores (LARDY e PHILLIPS, 1941; MEIZEL, 1978; BORLAND et
al., 1980; FLEMING e YANAGIMACHI, 1981; BAVISTER, 1988; NANCARROW e
HILL, 1995; BOATMAN, 1997; RODRÍGUEZ e KILLIAN, 1998; HUNTER, 2002;
ROSSELI et al., 2003; HUNTER e RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2004).
Esse fluido é transparente, levemente alcalino (pH 7,7 a 8,2), com gravidade
específica menor que 1,0 e osmolaridade de 310 mOsm (HUNTER, 1988).
Fazendo parte deste fluido já foram relatadas diversas proteínas (GANDOLFI
et al., 1989), aminoácidos (LEESE et al. 2001), íons (BORLAND et al., 1980),
colesterol (RODRÍGUEZ e KILLIAN, 1998), fosfolipídeos (KILLIAN et al., 1989) e
enzimas antioxidantes (LAPOINTE e BILODEAU, 2003).
Um total de 20 aminoácidos foi encontrado no fluido de oviduto de bovinos
(STANKE et al., 1974), mas um estudo posterior mostrou a presença de 25
aminoácidos livres em fluido de oviduto de vacas, éguas, porcas, coelhas e ratas
(GUÉRIN et al., 1995). A presença desses aminoácidos livres parece ser importante
para a função de gametas e sobrevivência do embrião (AGUILAR e REYLEY, 2005).
A arginina e o glutamato são os aminoácidos presentes em maior
concentração no oviduto humano, enquanto que a glicina, o glutamato e a alanina
são os predominantes no fluido de coelhas. Leucina e fenilalanina também têm sido
encontradas no oviduto de coelhas, porém em menores concentrações (LEESE et
al., 2001). Taurina e hipotaurina são importantes constituintes do fluido do oviduto e
22
estão relacionadas com a manutenção da viabilidade dos gametas e embriões
(GUÉRIN e MENEZO, 1995; LEESE et al., 2001). A hipotaurina, um aminoácido
sulfônico, apresenta efeitos protetores contra danos celulares peroxidativos
(ARUOMA et al., 1988; GREEN et al., 1991; BAKER et al., 1996).
As proteínas encontradas no fluido do oviduto estão na concentração de 10-
15% em relação à concentração encontrada no soro (LEESE et al., 1988) e se
dividem em dois grupos, aquelas que são sintetizadas continuamente durante o ciclo
estral e as que são sintetizadas de forma cíclica e compõem a maior parte das
proteínas do oviduto (GANDOLFI et al., 1989).
Muitas proteínas presentes no fluido parecem ser similares às encontradas no
soro e incluem a albumina, α, β e ϒ globulinas, lipoproteínas de alta densidade
(HDL), proteínas do complemento C3b, imunoglobulinas de cadeia pesada A, pré-
procolágeno, haptoglobina, osteopontina e clusterina (KILLIAN, 2004).
As enzimas detectadas no fluido do oviduto incluem fosfolipase A2, lisozima,
diesterase, α-amilase, β-N-acetilgalactosaminidase, β-N-acetilglucosaminidase e
catalase (Killian, 2004). Também foram detectados inibidores de proteases, incluindo
inibidores teciduais de metaloproteinases, inibidor do ativador do plasminogênio,
além de fatores de crescimento, incluindo fator de crescimento epidermal (EGF),
fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1 e 2) e fator de crescimento de
fibroblastos (FGF) (KILLIAN, 2004).
As proteínas majoritárias encontradas no fluido do oviduto de vacas
Holandesas apresentam massa molecular de 47, 60, 66, 80 e 95 kDa (KILLIAN e
GERENA, 1990). Entretanto no fluido obtido da ampola foram descritas as proteínas
de massas moleculares de 24, 28, 34, 48, 55, 66, 75 e 97 kDa, as quais têm a
capacidade de associação com a membrana espermática (RODRÍGUEZ e KILLIAN,
1998).
Recentemente KILLIAN (2004) descreveu a presença da osteopontina no
fluido do oviduto bovino. Essa glicoproteína tem sido encontrada em muitos tecidos
do organismo e está envolvida no processo de adesão e sinalização celular.
BORLAND et al. (1980) descreveram a concentração dos principais íons
constituintes do fluido de oviduto humano, onde verificaram que as concentrações
de Na+2 (130 mM) e Mg+2 (1,42 mM) foram similares as concentrações desses íons
no soro sanguíneo. No entanto a concentração de Ca+2 no fluido do oviduto (1,13
mM) foi menor que a metade da sua concentração no soro sanguíneo (2,50 mM),
23
enquanto a concentração de K+ (21,2 mM) e Cl- (132 mM) no fluido do oviduto foram
maiores que as respectivas concentrações no soro sanguíneo (4 mM e 110 mM).
Fato semelhante foi descrito por LEESE et al. (2001), que também encontraram
maiores concentrações de K+ e HCO3- no fluido do oviduto que no plasma
sangüíneo.
KILLIAN et al. (1989) descreveram a presença de colesterol e fosfolipídeos no
fluido do oviduto de vacas holandesas. Dentre os fosfolipídeos presentes, a
lisofosfatidilcolina e a fosfatidilcolina foram os que apresentaram maiores
concentrações (40% do total), enquanto que o fosfatidilinositol e lisofosfatidilinositol
formaram mais de 20% dos fosfolipídeos.
A concentração de colesterol do fluido do oviduto é influenciada pela fase do
ciclo estral, além de apresentar uma variação regional, da mesma forma como
descrito para proteínas. A concentração de colesterol encontra-se aumentada na
região do istmo, chegando a um máximo de 175 mg/mL na fase luteínica do ciclo
estral em vacas (KILLIAN et al., 1989), o que pode ser influenciado pelo efluxo de
colesterol das membranas espermáticas no processo de capacitação (AGUILAR e
REYLEY, 2005).
O trato genital feminino possui naturalmente fatores que protegem o embrião
contra o estresse oxidativo, tais como a superóxido dismutase, taurina e agentes
queladores de metais de transição, como a lactotransferrina e albumina (CHUN et
al., 1994; JOHNSON e NASR- ESFAHANI, 1994; GUÉRIN e MENEZO, 1995).
O balanço entre a geração de espécies de oxigênio reativo (ROS) e a sua
remoção é comprometida in vitro, e isto é explicado pela exposição do embrião à luz,
oxigênio e pela presença de metais pesados, que catalisam a formação de radicais
hidroxil altamente tóxicos na presença de H2O2 e O-2 (PABON et al., 1989;
NAKAYAMA et al., 1994; MORALES et al., 1999).
2.3 – Fatores que influenciam a secreção do fluido do oviduto
O oviduto de mamíferos não é somente um tubo de condução para a
passagem dos gametas e embriões, mas também um órgão secretório sofisticado
24
que mantém e modula um micro-ambiente, que é necessário para a fertilização e
desenvolvimento inicial do embrião (LAUSCHOVÁ, 2003).
O fluido do oviduto é formado pela secreção de células epiteliais que
revestem a mucosa desse órgão e pelo transudato dos vasos sanguíneos
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1995), mas existem vários fatores que interferem na
sua formação (LEESE e GRAY, 1985).
O oviduto de mamíferos é um tecido responsivo aos esteróides, e mudanças
hormonais que ocorrem durante o ciclo estral influenciam as atividades fisiológicas e
secretórias das células ciliadas e não ciliadas do epitélio (LAPOINTE E BILODEAU,
2003). Em vacas são descritas produções diárias de fluido pelo oviduto de
aproximadamente 0,2 mL no diestro e 2,0 mL no estro (LEESE et al., 2001). Os
hormônios esteróides modificam qualitativamente e quantitativamente o fluido da
tuba por um efeito direto nas células epiteliais e indiretamente pela sua ação no leito
vascular (JANSEN, 1984).
A administração de estrogênio promove o aparecimento de células
secretoras, enquanto a influência da progesterona no epitélio do oviduto foi
manifestada pelo decréscimo do número total de células ciliadas, diminuição da
altura do epitélio e sinais ultraestruturais de diminuição da atividade secretora
(LAUSCHOVÁ, 1999).
A sensibilidade do epitélio do oviduto à progesterona e estrogênio também se
manifesta regionalmente, onde as maiores diferenças em relação a altura do epitélio
do oviduto ocorreram na região da ampola (19.69 µm de altura com a administração
de estrogênio e 15.23 µm com a administração de progesterona) e as menores na
região do istmo (22.2 µm de altura com a administração de estrogênio e 21.17 µm
com a administração de progesterona) (LAUSCHOVÁ, 1999).
A concentração de proteínas tende a ser menor durante a fase não luteínica
(8,5 mg/mL) do que na fase luteínica (9,6 mg/mL) (KILLIAN et al., 1989; GERENA e
KILLIAN, 1990; RODRÍGUEZ e KILLIAN, 1998). Porém a maior concentração dos
fosfolipídios acontece na fase não luteínica (324 µmol/mL) (KILLIAN et al., 1989).
Essas diferenças podem influenciar diferentemente a viabilidade espermática,
motilidade, reação do acrossômica e habilidade de fertilizar o ovócito (GRIPPO et al.,
1995).
Outro fator de variação é a gestação, onde têm sido descritas alterações
histológicas do epitélio do oviduto, porém sem explicações para tais mudanças. Na
25
segunda metade da gestação ou no início do puerpério, o número de células ciliadas
aumenta nas regiões da ampola e fímbria, assim como diminui no istmo. No entanto,
durante o puerpério e lactação o número dessas células diminui (KAMACI et al.,
1999). Porém no final da gestação, as células secretoras não apresentam atividade
(KAMACI et al., 1999).
Tem sido demonstrado que algumas substâncias químicas podem alterar a
composição do fluido do oviduto. O AMPc e agentes que mimetizam o seu efeito
(toxina do cólera, forskolin e teofilina) reduzem a produção de fluido pelo oviduto
(LEESE e GRAY, 1985; GOTT et al., 1988; DICKENS e LEESE, 1994; TAY et al.,
1997 e MAHMOOD et al., 2001). No entanto, o isoproterenol induz o aumento da
secreção de fluido do oviduto em humanos (TAY et al., 1997).
O epitélio do oviduto apresenta além de propriedades secretórias, funções
absortivas. A vilina, uma proteína actina-associada de 95 kDa, considerada como um
marcador de células absortivas, foi detectada na porção proximal do oviduto de
camundongas (pré-ampola, ampola e parte do istmo) sugerindo uma possível função
absortiva (HORVART et al., 1990). LEESE (1988) descreve que as células não-
ciliadas estão envolvidas na absorção de macromoléculas do fluido do oviduto.
2.4 – Proteínas do oviduto envolvidas na fertilização e desenvolvimento embrionário inicial
Tem sido sugerido que proteínas do oviduto podem estar envolvidas na
modulação da função espermática, capacidade fertilizante e desenvolvimento
embrionário inicial.
Até recentemente, atribuía-se a uma única proteína, a OGP (glicoproteína
específica do oviduto), as funções do oviduto de manutenção da motilidade do
espermatozóide, estímulo da capacitação espermática, aumento nas taxas de
fertilização e clivagem do embrião (SENDAI et al., 1995; O-DAY-BOWMAN et al.,
1996). Entretanto a descoberta de uma linhagem de camundongos que não possuía
o gene para OGP, porém apresentava fertilidade normal (ARAKI et al., 2003), fez
com que essa participação da OGP na reprodução fosse repensada.
26
As OGPs pertencem a uma família de glicoproteínas composta pelas
seguintes proteínas: glicoproteínas secretórias do oviduto (pOSP; BUHI et al., 1996),
glicoproteína associada ao estro (EAP; BUHI et al., 1990; KING e KILLIAN, 1994),
glicoproteína associada ao estro específica do oviduto (EGP; NANCARROW e HILL.,
1995), glicoproteína do oviduto (sOP92; GANDOLFI et al., 1991), ovidutina
(ROBITAILLE et al., 1988), MUC-9 (LAGOW et al., 1999) e glicoproteína GP 215
(KAPUR e JOHNSON, 1988).
Essas glicoproteínas apresentam diferentes massas moleculares e conteúdo
de carboidratos e são sintetizadas e liberadas exclusivamente pelo epitélio secretório
do oviduto (BUHI, 2002). A diferença regional na localização dessas glicoproteínas
tem sido mostrada repetidamente (KAPUR e JOHNSON, 1986; 1988; ABE e
OIKAWA, 1991; GANDOLFI et al., 1991; ABE, 1996), indicando um importante passo
na especificidade regional na síntese de glicoproteínas (AGUILAR e REYLEY, 2005).
As OGPs são sintetizadas nas células do oviduto e secretadas no interior do
lúmen exclusivamente pelo epitélio secretório do oviduto em todos os mamíferos,
com exceção de ratas e éguas. Esta proteína é considerada específica do oviduto
por nunca ter sido encontrada em outro tecido ou compartimento (BUHI, 2002).
KING e KILLIAN (1994) demonstraram que a OGP se liga a cabeça e a peça
intermediária dos espermatozóides e está envolvida na capacitação e reação
acrossômica. Da mesma forma O’DAY-BOWMAN et al. (1996) demonstraram que a
adição da OGP no meio de incubação promoveu um aumento na taxa de ligação do
espermatozóide com a hemizona e a penetração em ovócitos de hamster.
Na maioria das espécies, a síntese máxima de OGPs ocorre durante o final
da fase folicular, sendo a ampola o local de maior produção, seguido do infundíbulo
e posteriormente o istmo (BUHI, 2002). SUN et al. (1997) sugeriram que a síntese e
secreção dessas glicoproteínas é mais estimulada pelo LH do que pelo estrogênio,
enquanto KILLIAN (2004) descreveu que a síntese máxima ocorre quando a
concentração de estrogênio no plasma está mais elevada.
Por meio da imunolocalização, pode-se observar que as OGPs se associam
com a zona pelúcida e o espaço perivitelino do ovócito ovulado e embriões,
indicando que essas proteínas têm um papel fundamental como reguladoras da
fertilização ou do desenvolvimento embrionário inicial (BUHI, 2002).
Fatores de crescimento são reguladores multifuncionais de proliferação e
diferenciação celular (SIMMEN e SIMMEN, 1991). Vários fatores de crescimento não
27
específicos, secretados pelo oviduto bovino têm sido descritos. O FGF (fator de
crescimento fibroblástico) e EGF (fator de crescimento epidermal), agindo
sinergicamente ou sozinhos, LIF (fator inibidor de leucemia), insulina e IGF-1(fator
de crescimento semelhante à insulina), TGFα (fator de crescimento e transformação)
e bFGF (fator de crescimento básico fibroblástico), ativina subunidade βA e PDGF
(fator de crescimento derivado de plaquetas), estão envolvidos no desenvolvimento
embrionário (GOMEZ e DIEZ, 2000).
Os fatores de crescimento possuem função de estimular o desenvolvimento
embrionário (GOMEZ e DIEZ, 2000), assim como a OGP, que apresentou efeitos
embriotróficos aumentando a clivagem e formação de blastocisto quando adicionado
ao meio de cultura de embriões suínos produzidos in vitro (McCAULEY et al., 2003).
2.5 – Lactato, piruvato e glicose no desenvolvimento embrionário inicial
O lactato, o piruvato e a glicose são importantes componentes do fluido do
oviduto bovino, e por isso utilizados em meios de cultura de embriões bovinos
(LEESE, 1988; BARNETT e BAVISTER, 1996). Tem sido demonstrado em vários
estudos que o desenvolvimento embrionário é reduzido na ausência desses
substratos (TAKAHASHI e FIRST, 1992; KIM et al., 1993; ROSENKRANS et al.,
1993).
Em coelhas, 25% do lactato é filtrado do sangue e 75% produzido pelo
epitélio do oviduto a partir da glicose vascular. O piruvato pode ser sintetizado pelo
epitélio a partir de glicose ou lactato (NICHOL et al., 1998). A difusão facilitada
permite que haja um movimento da glicose ao longo de todo o epitélio (LEESE e
JEFFRIES, 1997).
O piruvato é utilizado pelo embrião bovino ao longo do seu desenvolvimento
(LEESE e BARTON, 1984; GARDNER e LEESE, 1986; THOMPSON et al., 1996;
KHURANA e NIEMANN, 2000), com um aumento após a blastulação, sendo esse
aumento essencial para a viabilidade do blastocisto (DORLAND et al., 1992). No
entanto, RIEGER et al. (1992) mostraram que do piruvato captado pelo embrião,
44% são metabolizados no estádio de duas células e 17% pela mórula, quando a
glicose passa a ser o substrato predominantemente utilizado, enquanto que em
28
fases anteriores do desenvolvimento, o consumo de glicose é mínimo (Figura 4)
(MARTIN e LEESE, 1995). O blastocisto utiliza apenas 29% do piruvato captado,
nessa etapa 44% da glicose captada é convertida em lactato (Figura 4) (GARDNER
e LEESE, 1990). A taxa entre piruvato e lactato é essencial para o balanço do
potencial oxidação/redução (MORALES et al., 1999).
O piruvato desempenha uma função de proteção parcial ao blastocisto
degradando a H2O2 exógena e protegendo o embrião do stress oxidativo. Embriões
bovinos cultivados em meio SOF contendo H2O2 e piruvato apresentaram uma maior
taxa de sobrevivência que aqueles mantidos nessa mesma condição, porém sem
piruvato (MORALES et al., 1999). Essa proteção é dita parcial, pois a sensibilidade
do embrião bovino à H2O2 depende do seu estádio de desenvolvimento. A
sobrevivência de embriões de 6 células e blastocistos foi reduzida pela exposição ao
meio contendo H2O2, de forma dose-dependente, enquanto embriões em estádio de
8-16 células não foram afetados de tal maneira (MORALES et al., 1999).
Outro papel desempenhado pelo piruvato no desenvolvimento embrionário foi
sugerido por BUTCHER et al. (1998) onde o piruvato poderia ser convertido em
alanina e atuar na remoção da amônia do embrião.
A glicose contribui com apenas 17% da produção de ATP produzido pelo
embrião, enquanto a oxidação do piruvato é responsável por 40% do ATP produzido
(HOUGHTON e LEESE, 2004). A captação e utilização de glicose é vital para a
sobrevivência do embrião e o seu desenvolvimento durante o período de pré-
implantação. Esse período se estende desde a fertilização até o estádio de
blastocisto e o decréscimo na captação de glicose durante esse estádio pode
comprometer o desenvolvimento embrionário (RILEY e MOLEY, 2006).
A síntese de lactato foi detectada desde o estádio de uma célula até
blastocisto, sugerindo que o embrião bovino possui, desde o estádio inicial, a
maquinaria completa de enzimas glicolíticas (Figura 4). O metabolismo de glicose
em fases embrionárias iniciais está relacionado à síntese de uma ou mais enzimas
glicolíticas pelo genoma do embrião, que é ativado na fase de blastocisto. A glicólise
(Figuras 4 e 5) é funcional na fase de blastocisto, quando há uma demanda de
energia necessária para a compactação, expansão e formação de blastocele. A
utilização dessa via de produção de energia pelo embrião pode ser um reflexo de
estresse metabólico ou de longo tempo submetido a condições subótimas de PIV
(KHURANA e NIEMANN, 2000).
29
O glicogênio é a principal forma de estoque de glicose em células animais.
Ele se acumula em grânulos citoplasmáticos eletron-densos e é sintetizado pela
glicogênio sintase (GS), a enzima limitante na deposição de glicogênio
(CARACCIOLO et al.,1998).
Figura 4: Representação das diferenças na via metabólica entre os
estádios de clivagem inicial e compactação e blastulação em
embriões bovinos. Durante o estádio inicial a captação de glicose é baixa,
enquanto predomina a captação de piruvato e lactato. Nessa fase a
produção de ATP é baixa, já que a demanda também não é alta. Na fase
de compactação e blastulação a demanda de ATP aumenta, assim a
contribuição da glicólise na produção de ATP também aumenta e
consequentemente aumenta o consumo de glicose (THOMPSON, 2000).
30
Figura 5: Esquema demonstrando as diferenças entre a via glicolítica
e gliconeogênica. A hexoquinase, a fosfofrutoquinase e a piruvato
quinase são exclusivas da glicólise, enquanto a glicose-6 fosfatase, a
frutose 1-6 bi-fosfatase, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase e a piruvato
carboxylase são exclusivas da gliconeogênese. As outras enzimas são
comuns a ambas vias (www.med.unibs.it ).
2.6 – Aspectos Gerais Sobre Metabolismo Energético
Os processos metabólicos, de uma forma geral, visam suprir os organismos
de energia para manutenção de suas funções vitais. Esta energia, em seres
heterotróficos, é retirada dos alimentos que fornecem os carboidratos, os lipídeos, as
proteínas, as vitaminas, os nucleotídeos e os sais minerais. A utilização destas
moléculas tem como objetivo principal a obtenção de energia na forma de ATP
(adenosina trifosfato) para as células. Quando o ATP é hidrolisado é capaz de liberar
31
uma grande quantidade de energia livre. Dentro das células a degradação de
moléculas energéticas como a glicose não acontece em um único passo e sim, em
múltiplas etapas reacionais coordenadas, denominadas vias metabólicas. Especula-
se que a primeira via metabólica de obtenção de energia que surgiu na natureza
tenha sido a glicólise (Duley, 1998).
A glicólise ou via glicolítica é uma via metabólica de 10 reações, sendo as
principais enzimas a hexoquinase que fosforila a glicose em glicose-6-fosfato, a
fosfofrutoquinase que converte frutose-6-fosfato em frutose 1,6-bifosfato e piruvato
quinase, que converte fosfoenolpiruvato em piruvato (Figura 5). Esta via
metabolicamente é dividida em duas etapas: a primeira caracterizada pelo consumo
de 2 ATPs e uma segunda fase caracterizada pela produção de 4 ATPs, tendo esta
via um saldo positivo de 2 ATPs.
Gliconeogênese é a síntese de “novas moléculas de glicose” a partir de
metabólitos não glicídicos. Em mamíferos esta via tem como finalidade a
manutenção dos níveis constantes de glicose em situações metabólicas extremas
como o jejum, exercício físico e outras situações em que as células estejam em alta
atividade metabólica. Os passos irreversíveis da glicólise são substituídos por outros
na gliconeogênese. A conversão de fosfoenolpiruvato em piruvato, que é uma etapa
irreversível da glicólise, é realizada por uma enzima, a piruvato quinase. Já na
gliconeogênese, para a conversão de piruvato em fosfoenolpiruvato, são
necessárias duas enzimas: a piruvato carboxilase, que converte o piruvato em
oxaloacetato e a fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) que converte o
oxaloacetato em fosfoenolpiruvato (Figura 5) ( MORAES et al.,2006)
2.7 – Glicogênio sintase quinase-3 (GSK 3): características e funções
A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3) é uma serina/treonina quinase
que foi descoberta há mais de 20 anos como uma das muitas proteínas quinase que
fosforilam e inativam a enzima glicogênio sintase (EMBI et al. 1980).
A GSK-3 é tradicionalmente uma proteína citosólica (onde é
predominantemente localizada), mas também está presente no núcleo
(CARACCIOLO et al., 1998) e mitocôndrias.
32
A partir de sua purificação do músculo esquelético de mamíferos
(WOODGETT e COHEN, 1984) e posterior clonagem molecular, descobriu-se que a
GSK-3 possui duas isoformas, a GSK-3α (51kDa) e GSK-3β (47 kDa) (WOODGETT,
1990; 1991). Essas duas isoformas são expressas por diferentes genes e
compartilham seqüências quase idênticas nos seus domínios quinase (JOPE e
JOHNSON, 2004). ALI et al. (2001) citam que existem em todos os eucariotos
examinados, homólogos de GSK-3 com um alto grau de identidade entre as
isoformas de espécies distantes, como moscas e humanos, que possuem mais de
90% da seqüência similar dentro de seus domínios.
O papel da insulina descrito há mais tempo em vertebrados é controlar o nível
de glicose no sangue, aumentando o transporte de glicose, a síntese de glicogênio,
além de diminuir a gliconeogênese e a quebra de glicogênio. Um mecanismo pelo
qual a insulina interfere no metabolismo de glicogênio é através da fosforilação da
GSK-3 via Akt (PARKER et al., 1983) (Figura 6). A Akt, também conhecida como
proteína quinase B (PKB) e cujo principal substrato é a GSK-3 (PAP e COOPER,
1998), é ativada por insulina pela via dependente de fosfatidil inositol (PI) 3-quinase
(COHEN et al., 1997; COHEN, 1999) que também influencia a sobrevivência celular
(PAP e COOPER, 1998; ALI et al., 2001). Recentemente foi descrito por RILEY e
MOLEY (2006) a presença da via de sinalização da Akt e PI3-quinase em embriões,
como sendo uma via de regulação de utilização de glicose, onde a Akt promove a
expressão do transportador de glicose GLUT-1 e a atividade da enzima hexoquinase
(HK) (Figura 7).
33
Figura 6: Regulação da GSK-3 pela cascata de insulina. A insulina
ao se ligar ao seu receptor ativa várias enzimas, dentre elas a PKB (ou
Akt) e assim fosforila a GSK-3 inativando-a, o que possibilita que a GS
se torne ativa, aumentando a síntese de glicogênio (JOPE e
JOHNSON, 2004).
Os fatores de crescimento, que estão presentes no fluido do oviduto, também
desempenham função na regulação da GSK-3 inibindo-a via cascata MAPK ou via
PkB (proteína quinase B) (Figura 8).
Os aminoácidos, assim como a insulina e os fatores de crescimento,
interferem na atividade da GSK-3. Altos níveis de aminoácidos, em cultura de
miócitos humanos, induziram a inibição da GSK-3 via mTOR (mammalian target of
rapamycin (ARMSTRONG et al., 2001) (Figura 8).
A inibição da GSK-3 se dá pela fosforilação dos resíduos serina Ser21 em
GSK-3α e Ser9 em GSK-3β (ALI et al., 2001).
34
Figura 7: Regulação da utilização de glicose em embriões em
desenvolvimento inicial (retirado de RILEY e MOLEY, 2006).
A GSK-3 também foi demonstrada em espermatozóides de bovinos e
primatas (SMITH et al., 1996; VIJAYARAGHAVAN et al., 2000). Os eventos de
motilidade espermática e fertilização envolvem mudanças na fosforilação de
proteínas, que são um balanço entre a ação de proteínas quinase e fosfatase
(VIJAYARAGHAVAN et al., 2000). Essa motilidade está associada à fosforilação
tirosina da GSK-3, onde os espermatozóides presentes na cauda do epidídimo, que
são móveis, apresentaram maior sinal de fosforilação comparado aos
espermatozóides imóveis da cabeça do epidídimo (VIJAYARAGHAVAN et al., 2000).
35
Figura 8: Regulação da atividade da GSK-3 por outras vias de
sinalização (retirado de FRAME e COHEN, 2001).
36
3 – OBJETIVOS
3.1 – Objetivos gerais
� Avaliar aspectos relacionados ao metabolismo de glicose em ovidutos de
vacas zebuínas, além de identificar a enzima GSK-3 em células de oviduto.
3.2 – Objetivos específicos
• Dosar glicose de fluido de oviduto bovino
• Dosar glicogênio de células de oviduto
• Quantificar piruvato e PEP de células de oviduto
• Avaliar a atividade das enzimas hexoquinase, piruvato quinase e
fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) em células em cada região do
oviduto
• Comparar os resultados obtidos de cada região do oviduto
• Identificação da enzima GSK-3 em células de oviduto
37
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 – Coleta dos ovidutos
Os ovidutos foram obtidos em matadouros da região de Campos dos
Goytacazes, transportados até o laboratório, individualmente em sacos plásticos,
dentro de isopor com gelo, onde foram separados de acordo com a presença ou
ausência de corpo lúteo ipsilateral e posteriormente dissecados.
4.2 – Obtenção do fluido e células do oviduto
Após dissecação, os ovidutos foram divididos em três regiões, classificadas
como anterior, média e posterior, e em seguida, massageados com um bastão,
dando leves batidas no sentido ovário-útero. A luz de cada segmento foi lavada com
3 mL de PBS livre de cálcio e magnésio, pH 7,2, acrescido de inibidores de protease
38
(pepstatina, leupeptina, EDTA e PMSF) e fosfatase (molibidato e vanadato) para
isolamento do fluido e das células epiteliais. O material obtido da lavagem foi
centrifugado a 3.000 x g, obtendo-se então duas frações: fluido (sobrenadante) e
células (precipitado). Todo procedimento foi realizado sob condições de refrigeração.
O fluido foi centrifugado a 18.000 x g, durante 30 min., a 4ºC. O sobrenadante
foi armazenado em alíquotas de 15 mL, as quais foram liofilizadas em Speed Vac
Plus Sc 110A (Savant), estocadas a -20ºC e posteriormente descongeladas e
ressuspendidas com 500 µL de água ultra pura.
O precipitado de células, foi ressuspendido com 2,0 mL de PBS livre de
cálcio e magnésio, pH 7,2 (diluído 1:5 em água destilada) acrescido de inibidores de
protease e fosfatase e sonicado com o auxílio de um sonicador Sonic Dismembrator
60 (Fisher Scientific), com potência de 60w, por 6 ciclos de 30 segundos e descanso
do mesmo período de tempo entre cada ciclo. Posteriormente as amostras foram
centrifugadas a 18.000 x g, por 30 min., a 4ºC. O sobrenadante foi fracionado em
alíquotas de 1000 µL, as quais foram liofilizadas em Speed Vac Plus Sc 110A
(Savant) e estocadas a -20ºC. Após descongelamento, as amostras foram
ressuspendidas com 150µL de água ultra pura.
4.3 - Quantificação de proteínas totais de fluido e células de oviduto
A concentração de proteínas totais de cada região do oviduto e do oviduto
inteiro foi realizada pelo método de Bradford (1976), utilizando a albumina como
padrão. As amostras foram ensaiadas em quadruplicata, com alíquotas de 10 µL
ressuspendido adicionadas de 1 mL do reagente de Bradford e 90 µL de H2O. As
amostras foram agitadas vigorosamente e incubadas a temperatura ambiente por 5
min e em seguida foram lidas em espectrofotômetro (Shimadzu UV-visível-1240) a
595 nm. O conteúdo de proteínas foi calculado com base em uma curva padrão de
albumina bovina submetida às mesmas condições de ensaio.
39
4.4 - Quantificação de glicose do fluido
Para a dosagem de glicose juntamos o fluido de 6 ovidutos dividido por
regiões lavados com 3 mL de PBS livre de cálcio e magnésio, pH 7,2, fracionando
alíquotas de 15 mL que posteriormente foram liofilizados e ressuspendidos com 500
µL de água ultra pura. As amostras foram ensaiadas em quadruplicatas, com
alíquotas de 10 µL do fluido ressuspendido avolumadas até 500 µL com PBS pH 7,4
e reagidas com 500 µL de glucox®. O meio reacional foi incubado a 37ºC por 10
minutos. As amostras foram lidas em espectrofotômetro (Shimadzu UV-visível-1240)
a 510 nm. A glicose contida em cada região foi calculada com base em uma curva
padrão de glicose (Kit enzimático glucox® para dosagem de glicose, registro MS
fabricante 10231810011) submetida às mesmas condições de ensaio.
4.5 - Quantificação de glicogênio em células do oviduto
Para a dosagem de glicogênio utilizamos liofilizados de células
ressuspendidos com 150µL de água ultra pura. As amostras foram ensaiadas em
quadruplicatas, com alíquotas de 10 µL adicionada de 40 µL da enzima
amiloglicosidase (1mg/mL) e incubadas a 40ºC por 4 horas. Em seguida foram
avolumadas até 500 µL com PBS pH 7,4 e reagidas com 500 µL de glucox®. O meio
reacional foi incubado a 37ºC por 10 minutos. As amostras foram lidas em
espectrofotômetro (Shimadzu UV-visível-1240) a 510 nm. A glicose contida em cada
região foi calculada com base em uma curva padrão de glicose (Kit enzimático
glucox® para dosagem de glicose, registro MS fabricante 10231810011) submetida
às mesmas condições de ensaio.
40
4.6 - Determinação da concentração de fosfoenolpiruvato e de piruvato em
células de oviduto
Alíquotas de 150 µL de material liofilizado e ressuspendido com água ultra
pura foram utilizadas para a determinação da concentração destes metabólitos. O
ensaio foi realizado em meio de reação contendo 100 mM de tampão HEPES pH
7,6, 8 mM de MgSO4, 37 mM de KCl, 1,5mM de KH2PO4, 0,15 mM de ADP e 0,2
mM de NADH. Primeiramente, a reação da medida de piruvato foi iniciada pela
adição de 3 unidades de Lactato desidrogenase. Subseqüentemente, a
concentração de fosfoenolpiruvato foi determinada após adição de 4 unidades de
piruvato quinase. O decréscimo de NADH foi observado em leitor de ELISA a 340
nm (PETERSEN et al., 2001).
4.7 – Determinação da atividade da hexokinase (HK) em células
Para esse experimento foram utilizadas células imediatamente coletadas de
cada porção do oviduto que foram sonicadas e centrifugadas. O sobrenadante foi
incubado com 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5 contendo 6 mM de glicose. A glicose-6-
fosfato formada foi medida pela adição de um volume igual de 20 mM Tris-HCL pH
7,5, 6 mM MgCl2, 1 unidade/mL de glicose-6-fosfato desidrogenase de Leuconostoc
mesenteroides e 0,3 mM ß-NADH. A leitura das amostras foi realizada em
espectrofotômetro (Shimadzu UV-visílvel-1240) a 340nm em intervalos de 1 minuto,
durante 10 minutos de reação. A atividade da HK foi determinada indiretamente pela
oxidação de β-NADH, acoplada ao consumo de glicose pela glicose 6-fosfato
desidrogenase. O método fundamenta-se na detecção da formação de β-NADH a
340 nm, que é proporcional a velocidade de formação de glicose 6-fosfato no meio
(Galina Filho et al., 1999). A atividade específica foi obtida pela razão entre a
atividade total, proporcional à formação de β-NADH, pela quantidade de proteínas
(em mg) na amostra.
41
4.8 – Determinação da atividade de piruvato quinase (PK) em células
As amostras foram preparadas como descrito anteriormente. A atividade de
PK foi medida em 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM ADP, 0,4 mM NADH,
1 unidade/mL de lactato desidrogenase e a reação foi iniciada com PEP 1 mM. A
leitura das amostras foi realizada em espectrofotômetro (Shimadzu UV-visílvel-1240)
a 340nm em intervalos de 1 minuto, durante 10 minutos de reação. A atividade de
PK foi medida indiretamente pela oxidação de β-NADH acoplada ao consumo de
PEP pela lactato desidrogenase. O método fundamenta-se na detecção do consumo
de β-NADH a 340 nm, que é proporcional a velocidade de formação de piruvato no
meio (Worthington, 1998). A atividade específica foi obtida pela razão entre a
atividade total, proporcional ao consumo de β-NADH, pela quantidade de proteínas
(em mg) na amostra.
4.9 – Determinação da atividade da PEPCK
As amostras foram preparadas como descrito para atividade de HK e PK. O
sobrenadante foi incubado com tampão Hepes 100 mM pH 7,0 contendo 10 mM de
PEP, 0,2 mM de NADH e 24 unidades de malato desidrogenase. A reação foi
iniciada com 2,5 mM de IDP (inoside difosfato). O consumo de ß-NADH foi
monitorado a 340 nm e a atividade fisiológica de PEPCK foi determinada como descrito
por Petersen et al. (2001).
A leitura das amostras foi realizada em espectrofotômetro (Shimadzu UV-
visílvel-1240) a 340nm em intervalos de 1 minuto, durante 10 minutos de reação. A
atividade de PEPCK foi medida indiretamente pela oxidação de β-NADH acoplada
ao consumo de malato pela malato desidrogenase. A atividade de PEPCK foi
determinada na direção da formação de oxaloacetato, pela detecção da formação de
β-NADH (Peters-Wendisch, 1996). A atividade específica foi obtida pela razão entre
42
a atividade total, proporcional à formação de β-NADH, pela quantidade de proteínas
(em mg) na amostra.
4.10 – Cultura de células epiteliais de oviduto
Uma vez obtidos os ovidutos eles foram dissecados e massageados com um
bastão. A luz do oviduto foi lavada com 3 mL de PBS livre de cálcio e magnésio, pH
7,2. As células obtidas foram pipetadas na superfície do tubo e após decantarem
foram aspiradas do fundo do tubo. Essa etapa foi repetida em 5 diferentes tubos
para diminuir a contaminação. Posteriormente as células foram adicionadas ao meio
de cultivo composto de 10 % de soro fetal bovino, 0,1% de antibiótico (penicilina e
estreptomicina), meio TCM sem hepes, 1% de gentamicina e 1% de inibidor de
fibroblasto (citosina arabinosídeo). Ao final de 72 horas de cultivo as células
epiteliais do oviduto foram removidas com auxílio de tripsina.
4.11 – Amplificação de fragmento de GSK-3 de células de oviduto
O mRNA de células de oviduto em 72 horas de cultura foi extraído utilizando o
protocolo de Trizol® (Invitriogen) de acordo com o manual do fabricante. Em
seguida foi feita uma técnica de transcrição reversa para obtenção de cDNA. A
amplificação dos cDNAs por PCR foi feita segundo o protocolo modificado de
SCHUMMER et al.(1999), utilizando-se “primers” degenerados, sendo o primeiro
primer GTIGCIATHAARAARGTIYTICARGAY e o primer reverso
YTTRWRYTCIRTRTARTTIGGRTTCAT, para uma região quinase extremamente
conservada da GSK-3 em Drosophila, Xenopus, humano e ouriço do mar,
depositadas no “genbank”. O programa utilizado para amplificação no PCR foi:
94oC/5min; 40 x ( 94oC/1min.; 45oC/1min.; 72oC/1min); 72oC/10min; 4oC (∞).O
produto da reação de PCR foi observado por eletroforese de DNA em gel de
agarose 0,8% corado com brometo de etídio.
43
5 – RESULTADOS
5.1 – Glicólise
O estudo da via glicolítica em ovidutos de vacas zebuínas foi avaliado pela
medida da atividade dos passos inicial (Hexoquinase – HK) e final (Piruvato quinase
– PK) da glicólise.
O menor nível das atividades da HK (Figura 9) e PK (Figura 10) em células
da porção anterior de ovidutos ipsilateral ao corpo lúteo está correlacionada com o
menor nível de glicose no fluido (Figura 11) e glicogênio (Figura 12) e elevação no
nível de piruvato (Figura 13). Foi detectada uma alta atividade de HK (Figura 9) e PK
(Figura 10) na porção média, a qual é confirmada pela maior concentração de
glicose (Figura 11) e glicogênio (Figura 12). Na porção posterior foi observado um
menor nível na atividade de HK (Figura 9) em função do menor nível de glicose
(Figura 11) e glicogênio (Figura 12). O nível da atividade de PK está intermediário,
que pode ser um reflexo dos níveis de PEP (Figura 14) e piruvato nesta região.
44
Em vacas sem corpo lúteo, na porção anterior houve um menor nível da
atividade de HK (Figura 9) e PK (figura 10) e maiores níveis de glicose (Figura 11),
PEP (Figura 14) e piruvato (Figura 13). Na porção média foi observado um menor
nível de glicogênio (Figura 12), glicose (Figura 11) e atividade de HK (Figura 9). O
PEP (Figura 14) está em maior nível nesta região, enquanto a atividade de PK
(Figura 10) e piruvato (Figura 13) estão em menores níveis. Na porção posterior
ocorre um acúmulo de glicogênio (Figura 12), baixos níveis de PEP (Figura 14),
piruvato (Figura 13) e de atividade de HK (Figura 9) e PK (Figura 10).
Figura 9: Atividade de HK em células de oviduto. A atividade de
hexoquinase foi medida no homogenato de células de oviduto nas
diferentes regiões utilizando meio de reação contendo tampão Tris-HCl
pH 7,5, MgCl2, 1 unidade / mL de glicose-6-fosfato desidrogenase. A
reação foi iniciada pela adição de 0,3 mM de ß-NADH.
Anterior Média Posterior0.0
0.1
0.2
0.3Com Corpo lúteoSem corpo lúteo
Un
idad
es /
mg
ptn
45
Figura 10: Atividade de PK em células de oviduto. A atividade de
piruvatoquinase foi medida no homogenato de células de oviduto nas diferentes
regiões utilizando meio de reação contendo tampão Tris-HCl pH 7,5, MgCl2, 1
unidade / mL de lactato desidrogenase e ß-NADH . A reação foi iniciada pela adição
de 1 mM de fosfoenolpiruvato.
Figura 11: Dosagem de glicose em fluido de oviduto. A concentração de glicose
foi medida no fluido de oviduto nas diferentes regiões pela reação de oxidação de
glucose usando o Kit Glucox. Cada região foi lavada com PBS sem Ca² e Mg ², pH
7,4 e submetida à centrifugação de 11.000 X g por 5 min. O sobrenadante foi usado
para o ensaio.
Anterior Média Posterior0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Com corpo lúteo
Sem corpo lúteo
ug
de
glic
ose
/ uL
flu
ido
Anterior Média Posterior0.0
0.5
1.0
1.5Com corpo lúteoSem corpo lúteo
Un
idad
es /
mg
ptn
46
Figura 12: Dosagem de glicogênio em células de oviduto. A concentração de
glicogênio foi medida no homogenato de células de cada região. A glicose contida
em cada região foi calculada com base em uma curva padrão.
Figura 13: Dosagem de piruvato em células de oviduto. A concentração de
piruvato foi medida no fluido de oviduto nas diferentes regiões utilizando meio de
reação contendo tampão HEPES pH 7,6, MgSO4, KCl, KH2PO4, ADP e NADH. A
reação foi iniciada pela adição de 3 unidades de lactato desidrogenase.
Anterior Média Posterior0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
Com Corpo lúteo
Sem Corpo lúteou
g d
e g
lico
gên
io/u
g p
tn
Anterior Média Posterior0
10
20
30
40
50 Com Corpo lúteo
Sem Corpo lúteo
Pir
uva
to (
nM
) / u
g p
tn
47
Figura 14: Dosagem de fosfoenolpiruvato em células de oviduto A concentração
de fosfoenolpituvato foi medida no fluido de oviduto nas diferentes regiões utilizando
meio de reação contendo tampão HEPES pH 7,6, MgSO4, KCl, KH2PO4, ADP e
NADH. A reação foi iniciada pela adição de 4 unidades de piruvato quinase.
5.2 – Gliconeogênese em ovidutos de vacas com corpo lúteo
A avaliação da gliconeogênese em oviduto foi realizada pela atividade da
enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase em células (Figura 15). A alta atividade
desta enzima demonstra que essas células estão realizando gliconeogênese.
Células da porção posterior demonstraram uma maior atividade gliconeogênica
como determinado pela atividade da PEPCK (Figura 15). No entanto, a
gliconeogênese foi intermediária na porção média, onde a concentração de PEP
(Figura 14) e glicose (Figura 11) foram maiores, já na porção anterior, a atividade de
PEPCK (Figura 15) foi a menor.
Anterior Média Posterior0
5
10
15
20
25 Com Corpo lúteo
Sem Corpo lúteoP
EP
(n
M)/
ug
ptn
48
Figura 15: Atividade de PEPCK em células de oviduto em vacas com corpo
lúteo. A atividade da enzima fosfoenolpiruvato foi medida em células de oviduto com
corpo lúteo ipsilateral nas diferentes regiões dissecadas.
5.4 – Amplificação do fragmento de GSK-3 em células de oviduto
O conjunto dos dados obtidos sugere um possível controle do metabolismo de
glicose e glicogênio nas células do oviduto de vacas zebuínas. Assim voltamos
nossos esforços para amplificação de um fragmento do gene da enzima GSK3 a
partir de primers degenerados. revelando o aparecimento de uma banda em torno
de 600 pb (Figura 16).
Anterior Média Posterior0.0
0.1
0.2
0.3
Un
idad
es /
mg
ptn
49
Figura 16: Resultado do RT-PCR do gene da GSK3 por eletroforese de DNA em gel de agarose em células de oviduto bovino. A amplificação dos cDNAs obtidos de células de oviduto em cultura gerou uma banda próxima de 600pb. O produto do PCR foi analisado por eletroforese em gel de agorose 0,8% corado com brometo de etídio.
Diluição 1/10
600 pb
Diluição 1/ 2 Diluição 1/ 5
Diluição 1/ 25
250 pb
750 pb
500 pb
50
6 – DISCUSSÃO
O oviduto de mamíferos tem sido reconhecido como um órgão responsável
por criar um microambiente para facilitar o transporte e maturação de ovócitos,
capacitação espermática, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial. Esta
evidência é baseada em artigos que fornecem uma visão geral das funções do
oviduto e dos componentes encontrados em suas secreções (KILLIAN, 2004).
Muitos componentes do fluido do oviduto de mamíferos têm sido relatados
(CARLSON et al., 1970; LEESE, 1983; NICHOL et al., 1998). Carboidratos tais como
glicose, piruvato e lactato são as principais fontes de energia para os gametas e
embriões em desenvolvimento inicial (RIEGER et al., 1992; KILLIAN, 2004;
AGUILAR e REYLEY, 2005).
A glicose está envolvida em um fenômeno conhecido como “efeito Crabtree”.
O “efeito Crabtree” é a inibição da fosforilação oxidativa quando há um aumento no
estímulo da glicólise devido à competição de ambas por ADP e Pi (Fosfato
inorgânico) (WOJTCZAK, 1996). Este efeito tem sido observado em tipos celulares
com alta atividade glicolítica como as leveduras e as células tumorais. No cultivo in
vitro de embriões bovinos em presença de alta concentração de glicose disponível
no meio, também é possível observar o efeito semelhante ao Crabtree, onde a
respiração celular é inibida pela alta concentração de glicose levando a morte do
51
embrião (THOMPSON, 2000). Neste trabalho foi encontrada uma concentração de
glicose de 1 nM no fluido da porção média do oviduto (Figura 11) que corresponde a
concentração máxima de glicose encontrada em todas as porções, tanto em vacas
com corpo lúteo, quanto sem corpo lúteo. O único relato da concentração de glicose
em ovidutos de bovinos é do CARLSON et al. (1970), que determinaram uma
concentração fisiológica de 20 – 40 nM de glicose em fluido de oviduto inteiro, sendo
que nesse trabalho foram utilizadas vacas taurinas.
Leese (1983) determinou no fluido do oviduto de coelhas uma concentração
de glicose maior na região de ampola, de forma semelhante ao encontrado em
vacas zebuínas com corpo lúteo.
O metabolismo de glicose de embriões bovinos é baixo durante as primeiras
clivagens, apesar da presença de RNAm para o transportador de glicose GLUT-1 ao
longo do desenvolvimento embrionário inicial, e aumenta consideravelmente após a
ativação do genoma embrionário (8-16 células) (LEQUARRE et al., 1997). A principal
via metabólica de utilização de glicose após o estádio de 8-16 células e até a fase de
blastocisto é a glicólise (THOMPSON et al., 1996). A glicose intracelular é fosforilada
pela hexoquinase em glicose-6-fosfato. O aumento de RNAm de hexoquinase na
fase de mórula pode estar relacionado ao aumento no consumo de glicose e
produção de ATP necessário para a fase de compactação do embrião (LEQUARRE
et al., 1997).
A manutenção dos níveis de glicose, tanto por parte do embrião quanto pelo
meio em que ele está banhado, é crucial para a sua sobrevivência durante o
desenvolvimento inicial. A chave dessa regulação pelo oviduto bovino pode estar na
atuação conjunta das enzimas da via glicolítica, como HK e PK, das enzimas da
gliconeogênese, além da enzima GSK-3, uma vez que ela regula a atividade da
enzima glicogênio sintase, responsável pelo aumento na síntese de glicogênio. A
detecção do transcrito para essa enzima em células de oviduto de vacas com corpo
lúteo, juntamente com o perfil das atividades de HK, PK e PEPCK, enfatizam que o
oviduto é um órgão que apresenta um refinado controle do metabolismo de glicose.
Esse controle é influenciado pela presença ou ausência de corpo lúteo, uma vez que
o perfil metabólico em cada região do oviduto de vacas com corpo lúteo difere do
perfil encontrado nas regiões do oviduto de vacas sem corpo lúteo.
O piruvato pode ser sintetizado pelo oviduto a partir de glicose ou lactato
(NICHOL et al. 1992) e é utilizado pelo embrião bovino durante todo o seu
52
desenvolvimento com um aumento após a blastulação sendo prontamente
metabolizado durante o ciclo do ácido tricarboxílico (MORALES et al., 1999;
KHURANA e NIEMANN, 2000). Trabalhos descrevem a presença de enzimas que
participam do metabolismo de glicose, tais com hexokinase, glicose-6-fosfato
desidrogenase e glicose fosfato isomerase (RIEGER et al., 1992; LEQUARRE et al.,
1997; RILEY e MOLEY, 2006) em embriões.
Até o momento não há evidência da concentração de piruvato, lactato e
fosfoenolpiruvato (AGUILAR e REYLEY, 2005), além da atividade de enzimas
importantes da glicólise e da gliconeogênese em ovidutos de vacas zebuínas. Em
nosso trabalho foi possível não só quantificar os principais substratos das vias
glicolítica e gliconeogênica, como também caracterizar a atividade de algumas
enzimas dessas vias.
A visão geral desses resultados mostra que há uma intensa atividade de
gliconeogênese em células de oviduto de vacas com corpo lúteo, evidenciada pela
atividade da enzima PEPCK. A PEPCK é a principal enzima da gliconeogêse e sua
atividade é um marcador dessa via. Desse modo, quando ela está em alta atividade,
significa que está havendo uma intensa gliconeogênese. Na porção anterior do
oviduto, houve uma menor atividade gliconeogênica e glicolítica, o que
provavelmente está relacionado a um acúmulo de glicogênio e piruvato intracelular,
os quais podem servir como estoque de energia a ser utilizada por todo o oviduto.
Na porção média, onde a atividade da PEPCK foi intermediária e da hexoquinase foi
elevada, o substrato preferencialmente formado foi o fosfoenolpiruvato. Na porção
posterior, no entanto onde a atividade da PEPCK foi máxima, possivelmente exista
uma intensa produção de piruvato. No entanto a concentração de piruvato
encontrada nessa região foi menor que o esperado, sugerindo que esse metabólito
possa estar sendo consumido pela própria célula ou sendo secretado para o lúmen
do oviduto, uma vez que o embrião utiliza preferencialmente piruvato ao invés de
glicose na fase inicial de desenvolvimento.
O glicogênio pode ser estocado na região de istmo de ovidutos humanos
durante o período proliferativo, enquanto que durante o período de ovulação, o
glicogênio é lançado juntamente com partes citoplasmáticas para o lúmen do oviduto
nas outras porções, sendo diminuída essa secreção no período luteal (KAMACI et
al., 1999). Nossos resultados mostram que o perfil da concentração de glicogênio
nas células de oviduto bovino em vacas sem corpo lúteo está de acordo com os
53
encontrados por KAMACI et al (1999). Este acúmulo de glicogênio reflete a baixa
atividade glicolítica encontrada na região posterior de vacas sem corpo lúteo. Além
disso, uma maior concentração de glicogênio pode acarretar um acúmulo de glicose-
6-fosfato que pode estar regulando a atividade da HK (Figura 11)
Em vacas com corpo lúteo, as maiores concentrações dos metabólitos
analisados foram encontradas na região média do oviduto, a qual engloba a região
da ampola. Esse fato pode estar relacionado à maior atividade secretora observada
nessa região do oviduto. A atividade secretora da ampola em vacas e coelhas é
mais intensa do que no istmo. A ampola produz aproximadamente 2/3 da secreção
diária total do oviduto, enquanto o istmo fornece o restante (KAVANAUGH et al.,
1992). Na porção posterior do oviduto de vacas com corpo lúteo foi observado um
menor nível na atividade de HK (Figura 9), em função do menor nível de glicose
(Figura 11) e glicogênio (Figura 12). O fluxo glicolítico é influenciado pela
disponibilidade dos substratos para a via, assim em baixas concentrações de
glicogênio e glicose ocorre uma diminuição da atividade glicolítica.
Em vacas sem corpo lúteo, na porção anterior foi encontrado um menor nível
da atividade de HK (Figura 9) e PK (figura 10) e maiores níveis de glicose (Figura
11), PEP (Figura 14) e piruvato (Figura 13), sugerindo que nesta porção esteja
ocorrendo gliconeogênese e consequentemente acúmulo destes metabólitos.
A produção in vitro de embriões se torna uma excelente ferramenta de oferta
de ovócitos e embriões em estágios pré-definidos para estudos sobre o
desenvolvimento embrionário inicial. No entanto, ao contrário do considerável
progresso na tecnologia de desenvolvimento de PIV de embriões bovinos nos
últimos anos, as taxas de sucesso em termos de rendimento de embriões ainda
estão baixas, alcançando 30% a 40%, com apenas 50% desses estando aptos a
iniciar uma gestação após a transferência (KHURANA e NIEMANN, 2000). Os
embriões produzidos in vitro se diferenciam de diversas maneiras dos produzidos in
vivo. Essas diferenças incluem a morfologia e a ultraestrutura, fisiologia,
sensibilidade a crioinjúria, atividade genômica, assim como o desenvolvimento fetal.
Uma das possíveis causas para as várias diferenças observadas entre os
embriões gerados in vitro e in vivo pode ser as condições subótimas dos meios de
cultivo e os substratos energéticos estão entre os mais importantes ingredientes de
qualquer meio de cultivo.
54
O conhecimento sobre a composição e função dos componentes do fluido do
oviduto teve uma retomada na última década. O desenvolvimento de diferentes
meios baseados na composição específica do fluido em tempos particulares do ciclo
estral e/ou de regiões específicas da tuba pode resolver parte das maiores
limitações para o desenvolvimento de fertilização in vitro e sistemas de cultivo
embrionário que permitam a produção em taxas comparadas às obtidas in vivo.
55
7 –CONCLUSÃO
1. A presença de corpo lúteo em ovário ipsilateral ao oviduto é um importante
componente de variação do metabolismo de células do oviduto
2. Existe uma diferença no perfil metabólico entre as regiões do oviduto bovino
3. A concentração de glicose no fluido do oviduto de vacas zebuínas foi inferior
ao descrito na literatura
4. Os produtos preferencialmente formados em células de oviduto foram piruvato
e fosfoenolpiruvato
5. Há uma intensa atividade de gliconeogênese em células de oviduto de vacas
com corpo lúteo, evidenciada pela atividade da enzima PEPCK
6. Foi identificado um transcrito da enzima GSK-3 em células de oviduto bovino
56
7. A regulação dos níveis de glicose pelo oviduto bovino pode estar na atuação
conjunta das enzimas da via glicolítica, como HK e PK, das enzimas da
gliconeogênese e da enzima GSK-3
57
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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