Tese de Mestrado - Educadores · e terminar mais este trabalho. ... Bioquímica pelos esclarecimentos. ... Relaciona a proporção de tempo sobre o número de entradas em

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PENÉLOPE GIACOMITTI

EFEITOS do HERBICIDA “TORDON 2,4-D 64/240 TRIETANOLAMINA BR”

em FILHOTES de MÃES CONTAMINADAS durante a GESTAÇÃO e LACTAÇÃO

Curitiba – Paraná 1995

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação

em Morfologia – área de concentração em

Biologia Celular,

da Universidade Federal do Paraná,

visando à obtenção do título de

mestre em Ciências Morfológicas

ii

Orientadora: Profª Drª Maria Teresa Barros Schütz

Co-orientadora: Profª Dirnei Seli F. Baroni

iii

À DEUS que em Seu infinito Amor me deu condições para desenvolver

e terminar mais este trabalho.

Aos meus pais, Joâni Giacomitti e Alba Ceccon Giacomitti

(sem palavras).

Aos meus irmãos : Cícero Ceccon Giacomitti Lúcia Ceccon Giacomitti Joâni Giacomitti Júnior e

Vitor Hugo Giacomitti, pela paciência.

Ao meu namorado :Leônidas Alves Rosa,

com carinho, pela compreensão.

À minha “nonna”: Gema Catarina Simioni Ceccon

(sem palavras).

iv

Todas as figuras deste trabalho são,

exceção feita a capa inicial,

Clip-art windons 2008

permitida reprodução

não comercializável

v

AGRADECIMENTOS

Agradeço a orientação precisa, a paciência e a presença amiga da Profª Drª Maria Teresa Barros Schütz, que tornou possível levar a bom termo este trabalho. A co-orientação da Profª Dirnei Seli F. Baroni, que soube com maestria diremir todas as dúvidas surgidas a partir da metodologia e do material histológico. Ao Prof. Romeu Afonso Schütz pelo apoio e amizade. A todos os professores e funcionários do Departamento de Fisiologia, de Farmacologia e do Biotério, que de algum modo auxiliaram, aliviando tarefas ou facilitando o acesso ao material necessário, e muito contribuíram para o término deste trabalho. Em especial, Prof. Cláudio da Cunha, pelo auxílio no uso do computador, Cândido José Thomaz Pereira, técnico responsável pelo Biotério do Setor de Ciências Biológicas, Terezinha de Jesus do Carmo Andrade (D. Teresa) e Armelinda Silvino dos Santos e todos/as os/as demais funcionárias/os do Biotério. À Profª Drª Orieta Silveira, professora do Departamento de Bioquímica pelos esclarecimentos. Todo a apoio e amizade do Prof. Dr. Waldemiro Gremski, professor de pós-graduação do Departamento de Biologia Celular. A Joâni Giacomitti Júnior, pelo empenho e capricho na elaboração final deste trabalho. Aos amigos e colegas da turma: Cecília, Luís, Hamilton, Ivone Maria, Ivone Cipriano, Sônia e todos os demais colegas, pelo carinho, incentivo e apoio. À Coordenação do Curso de Pós-Graduação, professores, funcionários e amigos do Departamento de Morfologia/Biologia Celular da Universidade Federal do Paraná, pelo incentivo e apoio. Em especial, Elinor, ex-secretária do curso de pós-graduação, Rubens Gaier e auxiliar, técnicos em histologia, Ana Maria Brauza Cunha, funcionária, e Marlene Bonifácio, atual secretária do curso de pós-graduação. A todos aqueles que direta ou indiretamente tornaram possível a execução e término deste trabalho. Ao CNPq pela bolsa de mestrado e à PRPPG pelo apoio financeiro.

vi

ÍNDICE

PÁGINA

AGRADECIMENTOS .............................................................................. V

ORGANOGRAMAS E TABELAS ......................................................... VIII

GRÁFICOS E FIGURAS ......................................................................... X

ABREVIATURAS .................................................................................. XII

RESUMO ............................................................................................. XIV

ABSTRACT .......................................................................................... XVI

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS ....................................................................... 7

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 9

3.1. Local de trabalho

3.2. Animais experimentais

3.3. Herbicida

3.4. Metodologia...............................................................................................................10

3.4.1. Acasalamento

3.4.2. Nascimento dos Filhotes

3.4.3. Peso Corporal

3.4.4. Reflexo de Endireitamento

3.4.5. Abertura Palpebral

3.4.6. Sexagem

3.4.7. Testes comportamentais...............................................................................14

3.4.7.1. Movimentação espontânea

3.4.7.2. Teste do “Rota-Rod”

3.4.7.3. Exposição ao “Open-Field” .............................................................................. 17

3.4.7.4. Teste do “Plus Maze” ou Labirinto em X ................................................... 20

3.4.7.5. Esquiva Ativa ................................................................................................. 21

vii

3.5. Estatística ....................................................................................................24

3.6. Morfologia ....................................................................................................24

3.6.1. Coloração por H.E.

3.6.2. Nitratação

3.6.3. Evidenciação da Bainha de Mielina

4. RESULTADOS .................................................................................................. 27

4.1. Dias de Acasalamento e Gestação

4.2. Proporção Sexual

4.2.1. Organogramas

4.3. Peso Corporal

4.4. Desenvolvimento pós-natal........................................................................28



4.5. Testes Comportamentais aos 40 dias de idade....................................28

4.5.1. Movimentação Espontânea

4.5.2. “Rota-Rod”

4.6. Testes Comportamentais aos 90 dias de idade....................................29


4.6.2. “Rota-Rod”

4.6.3. Exposição ao “Open-Field”.................................................................29

4.6.4. Teste do “Plus-Maze” ou “Labirinto em X”........................................31

4.6.5. Esquiva Ativa......................................................................................31

4.7. Fêmeas que não se apresentaram prenhas.............................................32

4.8. Número de Filhotes mortos/devorados..................................................33

4.9. Outras Observações...................................................................................33

4.10. Morfologia....................................................................................................34

4.10.1. Coloração com hematoxilina-eosina (H.E.)

4.10.2. Nitratação

4.10.3. Evidenciação da bainha de mielina

5. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 66

6. CONCLUSÃO ................................................................................................... 78

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 81

viii

LISTA DE ORGANOGRAMAS E TABELAS

página

Organograma 1. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F1 do grupo controle ................................................................................ 41



Organograma 4. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F1 do grupo Tordon 1 .............................................................................. 44






Tabela 1. Descreve a análise estatística pelo método x2, feita para avaliar a proporção sexual observada nos grupos experimentais (C, T, TT) ....................... 50

Tabela 2. Apresenta os resultados obtidos em cada um dos parâmetros observados durante o teste no “Open-Field” ......................................................... 57

Tabela 3. Representa as porcentagens da ocorrência, em cada geração, de fêmeas não prenhas ou com filhotes mortos e/ou devorados ............................... 64

ix

x

LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS

página

Gráfico 1. Representação do número de dias que os animais demoraram a nascer, a partir do primeiro dia de acasalamento dos pais ................................... 40

Gráfico 2. Representação da proporção sexual observada durante as três gerações (F1, F2 e F3) dos três grupos experimentais ........................................... 51

Gráfico 3. Representa a curva de peso corporal apresentada pelos filhotes dos grupos C e T, da primeira geração, do 1º ao 101º dia de vida .............................. 52

Gráfico 4. Representa o número de dias que os filhotes dos dois grupos experimentais (C e T) demoraram a desenvolver o reflexo de endireitamento e para abrir completamente a fenda palpebral ......................................................... 54

Gráfico 5. Representa a motricidade dos filhotes quando jovens (com 40 dias) e depois de adultos (com 90 dias), a partir do número de vezes que interrompem feixes fotoelétricos ................................................................................................ 55

Gráfico 6. Representa o equilíbrio apresentado pelos filhotes, quando jovens (com 40 dias) e depois já adultos (90 dias), no teste do “Rota-Rod” .................... 56

Gráfico 7.1. Representa a motricidade espontânea e a completa imobilidade dos animais experimentais em resposta a situação de exposição ao “Open-Field”, por 5 minutos .............................................................................................................. 58

Gráfico 7.2. Representa o tempo de “grooming”, o número de “rearing” ocorridos e o número de bolos fecais excretados durante a exposição ao “Open-Field”, por 5 minutos ................................................................................................................. 59

Gráfico 8.1. Representa a porcentagem média do número de vezes que os animais experimentais entraram, espontaneamente, no braço aberto ou fechado durante o teste do “Plus-Maze” ............................................................................. 60

Gráfico 8.2. Representa a porcentagem média de tempo que os animais experimentais permaneceram em cada tipo de braço (aberto ou fechado) durante o teste do “Plus-Maze” .......................................................................................... 61

Gráfico 8.3. Relaciona a proporção de tempo sobre o número de entradas em cada braço (aberto ou fechado), observados durante o teste do “Plus-Maze” ...... 62

xi

Gráfico 9. Representa os diferentes parâmetros observados durante o teste comportamental que mede aprendizagem através da esquiva em situação aversiva (esquiva ativa) ........................................................................................ 63

Figura 1. Caixa de movimentação espontânea .................................................... 15

Figura 2. Aparelho do “Rota-Rod” ........................................................................ 15

Figura 3. Aparelho do “Open-Field” ...................................................................... 17

Figura 4. Piso do “Open-Field” ............................................................................. 18

Figura 5. Aparelho do “Plus-Maze” ....................................................................... 20

Figura 6. Caixa de esquiva ativa .......................................................................... 22

Figura 7. Epidídimo controle corado por H.E. (200x) ........................................... 35

Figura 8. Epidídimo controle corado por H.E. (400x) ........................................... 35

Figura 9. Testículo controle corado por H.E. (200x) ............................................. 36

Figura 10. Testículo controle corado por H.E. (400x) ........................................... 36

Figura 11. Epidídimo contaminado corado por H.E. (400x) .................................. 37

Figura 12. Testículo contaminado corado por H.E. (400x) ................................... 37

Figura 13. Cérebro controle corado por H.E. (200 e 400x) .................................. 38

Figura 14. Cérebro contaminado corado por H.E. (400x) ..................................... 38

Figura 15. Nitratação de cérebro controle (400x) ................................................. 39

Figura 16. Nitratação de cérebro contaminado (400x) ......................................... 39

xii

ABREVIATURAS

AChE---------------------Acetilcolinesterase

ATPase------------------Adenosina tri-fosfatase

2,4-D ---------------------Ácido diclorophenoxiacético

2,4-D éster-------------Éster do ácido diclorophenoxiacético

2,4,5-T-------------------Ácido 2,4,5-triclorophenoxiacético

C ---------------------Grupo controle

Ca++ ---------------------íon Cálcio

14C ---------------------Carbono radioativo com 14 neutrons

5-HTP---------------------5-hidroxitriptofano

5-HIAA-------------------Ácido 5- hidroxiindolacético

5-HT ---------------------Serotonina

CIP ---------------------Cruzamento Inter-Provas

DA ---------------------Dopamina

DL50 ---------------------Metade da dose necessária para matar o animal

DPC ---------------------Situação”esquiva de duas vias”

F1 ---------------------Primeira geração

F2 ---------------------Segunda geração

F3 ---------------------Terceira geração

GABA---------------------Ácido gama aminobutírico

Hz ---------------------Hertz

mA ---------------------mili-ampére

Na+ ----------------------íon sódio

NE ----------------------Norepinifrina

NEA ----------------------Número de Entradas no braço Aberto

NEF ----------------------Número de Entradas no braço Fechado

P ---------------------Geração parental ou pais

P.A. ----------------------produto químico puro Para Análise

PCPA --------------------p-clorofenilalanina

xiii

RC ---------------------Resposta de Cruzamento

“t” ---------------------Teste estatístico “t” de “student”

T ---------------------grupo 1 contaminado com Tordon

TA ---------------------Tempo de permanência no braço Aberto

TBPS----------------------t-butilbiciclofosforotionato

TF ----------------------Tempo de permanência no braço Fechado

T/NEA---------------------Tempo de permanência dividido pelo Número de

Entradas no braço Aberto

T/NEF---------------------Tempo de permanência dividido pelo Número de

Entradas no braço Fechado

TT--------------------------Grupo 2 contaminado com Tordon

S.N.C.---------------------Sistema Nervoso Central

X2---------------------------Teste estatístico – “Qui-Quadrado”

xiv

RESUMO

Ratos das gerações P, F1, F2, foram contaminados com uma solução

do herbicida Tordon 0,1% na água de beber. O processo de contaminação pelo

Tordon foi efetuado sobre os filhotes, através de suas mães, durante o período de

gestação e amamentação.

Nas três gerações foram quantificados: a proporção sexual em cada

ninhada, número de dias para o nascimento dos filhotes, número de filhotes que

morriam após o nascimento em cada ninhada e em cada grupo experimental.

Na geração F1 foram quantificados o reflexo de endireitamento, o

tempo de abertura palpebral, e o peso corporal, bem como, foram feitos testes

comportamentais (movimentação espontânea, teste do “Rota-Rod”, teste do

“Open-Field”, teste do “Plus-Maze” e esquiva ativa). Após todos estes processos,

foi feito um estudo histológico a nível de sistema nervoso central e de testículos.

Nossos resultados mostraram que a proporção sexual entre os

filhotes de mães contaminadas (1 macho : 1 fêmea) é diferente (p<0,05) da

proporção observada entre os filhotes do grupo controle (6 machos : 5 fêmeas).

As fêmeas contaminadas demoraram mais (p<0,05) para dar cria que as fêmeas

do grupo controle. Os animais contaminados nasceram com uma tendência de

peso corporal menor, que se manteve até, aproximadamente, os 49 dias de idade.

Aos 53 dias de idade o peso corporal destes animais tornou-se maior que os dos

controles, permanecendo assim até a idade adulta. O reflexo de endireitamento

levou mais tempo para ser adquirido no grupo Tordon, enquanto que o tempo de

abertura palpebral é igual nos dois grupos.

Nos testes comportamentais, verificamos que a movimentação

espontânea aos 40 e aos 90 dias de idade é maior no grupo Tordon, sendo que

no grupo controle há um decréscimo e no grupo Tordon um aumento da

movimentação espontânea dos 40 para os 90 dias de idade. Por outro lado, no

teste do “Rota-Rod” não se observou diferença entre os grupos experimentais.

No teste do “Open-Field” os animais contaminados ambularam

menos, tiveram um tempo de “freezing” maior, um número de “rearing-up” menor

xv

e um tempo de “grooming” maior. Em relação aos parâmetros de defecação e

micção, não foram observadas diferenças.

No teste de “Plus-Maze”, os parâmetros %TA e T/NEA foram

maiores no grupo Tordon.

No teste de esquiva ativa os animais Tordon mostraram tendência a

um desempenho maior.

Apesar de todos estes resultados, o material histológico corado com

H.E e/ou impregnado por prata não apresentou nenhuma alteração morfológica,

quer seja a nível de S.N.C. ou a nível de testículos.

Assim, devido a todas as alterações comportamentais observadas,

podemos inferir que o herbicida Tordon contamina os filhotes através da barreira

placentária, hemato-encefáfica e mesmo através do leite na amamentação.

Podendo, com isto, causar alterações funcionais irreversíveis no S.N.C.

Alterações estas que foram observadas na idade adulta do animal, quando foram

feitos os testes comportamentais e não havia contato com o herbicida há, pelo

menos, 40 dias.

xvi

ABSTRACT

Three generation of rats P, F1, F2 was contaminated with “Tordon”

0,1% solution in water drink.

The offspring Tordon contamination was done via their mothers

during pregnancy and lactation.

At the three generation was quantified the sexual ratio in each

progeny; number of days for bird offspring and number of dead offspring in each

experimental group.

The F1 was used for quantified the time to respond stand upright

reflex; eyelid opening time; body weight and behavioral tests (spontaneous

movement, “Rota-Rod” time, “Open-Field” test, “Plus-Maze” test and active

avoidance) and histological studies of C.N.S and testicles.

Our experimental results demonstrated a sexual ratio 1 male : 1

female at the contaminated animal (TA) and 6 males : 5 females in control group

(CA); contaminated females had longer gestational period than the control

females; the (TA) were born with non significant lower body weight in comparison

the (CA). However from 53 days old their average body weight become higher

than the mean of non contaminated group; the contaminated rats were able to

responsed to the stand upright reflex later than (CA) in spite of eyelid opening time

being the same for both groups.

At behavioral tests we have found that : Tordon group spontaneous

movement rate was higher than the (CA) at 40 and 90 days old with a increasing

rate in (TA) and decreasing rate in (CA) between first and second measurement.

The results from “Rota-Rod test” were similar to both groups.

Contaminated animals at the Open-Fields test, ambulated less, had

a higher time of freezing, lower number of rearing-up and a higher time of

grooming. Number of boluses and miction equal to control group.

Plus-Maze test showed higher TA% and T/NEA for (TA), while

active-avoidance test demonstrated a tendency of worse of performance for (TA).

In spite of morphological alteration of C.N.S. and testicles were not

observed at histological examinations, the behavioral changes found led us to

condud that probably Tordon herbicide was able to cross the placentary and

hemato-encephalic barrier and were present at the milk, causing irreversible

functional alterations at C.N.S. that stayed until adult age when the behavior test

occurred.

xvii

1

1.INTRODUÇÃO

Segundo as pesquisas da EMATER do Paraná, na região

metropolitana de Curitiba, apenas 13% dos agricultores utilizam agrotóxicos

seguindo as instruções; 75% não respeitam os períodos de carência; 91% não

usam proteção quando fazem aplicação; 67% poluem rios e córregos e 24%

reutilizam as embalagens para guardar ou transportar alimentos (Tararthuch,

1992).

O Tordon é um agrotóxico organoclorado comumente usado em

sítios e fazendas no norte do Paraná para combater ervas daninhas do pasto e

impedir o crescimento de vegetais de folhas largas (dicotiledôneas). O Tordon

nada mais é do que a associação de dois herbicidas : o 2,4-D (ácido 2,4-

diclorofenoxiacético) e o picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico) e seus

sais de potássio (C6H2Cl3KN2O2), que no entanto, recebem "impurezas" durante

a produção, as chamadas dioxinas. Sua composição age exatamente como o

"Agente Laranja" que por sua ação desfolhante foi utilizado, pelos norte-

americanos, como arma química durante a guerra do Vietnã para descamuflar os

soldados. Esta barbárie produziu inúmeras crianças, com má-formações

congênitas, filhas de pais anteriormente expostos ao agrotóxico (Reis, 1991).

O TORDON é composto pelo 2,4-D, pelo picloram e por resíduos

chamados dioxinas. O 2,4-D é prontamente degradado por hidrólise não

representando um risco de longo prazo ao meio. No entanto, o picloram é

altamente persistente, com resíduos detectáveis no solo até três anos após a

aplicação e mantém sua toxicidade por até cinco anos para certas cepas

suceptíveis (Fao, 1964).

A DL50 do 2,4-D ingerido na comida é de 666 mg/kg para ratos e foi

descrita em 1947 por Hill e Carlisle. Os mesmos autores afirmam que a maior

dose, sem efeitos indesejáveis, para macacos é de 214 mg/kg e, que existe

perigo potencial para a saúde humana através da inalação ou ingestão de

alimentos contaminados.

Entretanto, Gorzinski et al. (1987), trabalhando num laboratório da

DOW CHEMICAL COMPANY, observaram que doses de até 20 mg/kg na dieta

de ratos machos e fêmeas não tiveram efeitos tóxicos observáveis.

Goldstein et al.(1959) afirmam que este herbicida se for usado

deverá sê-lo com grande cautela. Segundo o mesmo autor a DL50 oral do Tordon

22K (25% sal potássio do picloram) em ratos é estimada em mais que 10.000

2

mg/kg, enquanto que do ácido picloram é de 8.000 mg/kg (nível igual ao

encontrado por McCollister & Leng, 1969).

Defendendo-se do crescente mal estar criado pelos casos de

contaminação e intoxicação humanas causados pelo Tordon, a empresa DOW

CHEMICAL (que detém a marca registrada do herbicida) pediu revisão das

informações toxicológicas sobre o produto e concluiu-se que a toxidade é baixa e

não haverá risco algum se o produto for usado como recomendado no rótulo

(Lynn, 1965).

Erne (1966) verificou que, quando administrado oralmente, o

composto é prontamente absorvido e distribuído pelo organismo. Os órgãos mais

contaminados são o fígado, rim, pulmão e baço. Dados corroborados por

Guzelian (1982) que descreveu a mesma ordem indicando níveis decrescentes de

intoxicação e incluiu por último os músculos esqueléticos. No mesmo trabalho o

autor observou que a difusão do 2,4-D no tecido adiposo e S.N.C. foi restrito,

enquanto que ocorreu pronta transferência placentária em suínos e foram

encontradas pequenas quantidades de 2,4-D nos ovos de galinhas. Estes

resultados são concordantes com os de Bernard et al. (1985).

Sabe-se que a maior parte do composto herbicida Tordon é

excretada pelos rins por mecanismo aniônico orgânico que, segundo Berndt

(1973), contribui com sua baixa toxicidade.

No entanto, Tararthuch (1992) observou injúria no processo global

de filtração e caracterizou o Tordon como agente nefrotóxico.

Outrossim, Knopp & Shiller (1992) descreveram o aumento

significante do volume de urina após administração oral de dois sais do 2,4-D.

Knopp (1994) observou que os empregados que trabalhavam na produção e

formulação do herbicida excretavam o 2,4-D na urina de maneira cumulativa, o

qual só não era mais detectado após três semanas de interrupção da exposição.

Os autores encontraram aumento das atividades do citocromo hepático p-450.

Cipriano et al. (1991) verificaram que a ação do Tordon em

macrófagos peritoniais intoxicados "in vitro" provoca intensa vacuolização.

Por outro lado, Paulino & Palermo Neto (1991) verificaram que a

intoxicação aguda pelo 2,4-D altera os níveis de algumas enzimas e componentes

dos soro considerados indicadores de tecido injuriado, refletindo principalmente

prejuízo hepático e muscular induzido pelo herbicida.

Opistótonos (contração tetânica em arco) podem aparecer

momentaneamente em animais intoxicados com 2,4-D, através de uma injeção

subcutânea de 150 a 200 mg/kg, e membros posteriores são comumente mais

nocivamente afetados do que membros anteriores (Bucher, 1946).

3

Goldstein et al. (1959) observaram que apenas algumas horas após

o manuseio do 2,4-D para matar ervas daninhas, três pessoas (dois homens com

52 e 65 anos de idade e uma mulher com 50 anos) foram hospitalizadas com

sintomas progressivos de dor, parestesias e paralisias graves. Têm-se poucas

dúvidas de que a contaminação não tenha ocorrido por absorção dérmica do

produto. A prostração foi grande e a recuperação incompleta mesmo após anos.

O diagnóstico de neuropatia periférica foi suportado por exame eletromiográfico.

Pelletier et al. (1990) verificaram que a aplicação dérmica do 2,4-D

provoca níveis altos do herbicida no sangue e na urina 24 horas após a

exposição. Embora Knopp & Schiller (1992) tenham constatado que a absorção

do 2,4-D por aplicação tópica é muito mais baixa do que a observada na dose

oral.

Schulze & Dougherty (1988) verificaram que a administração diária

do 2,4-D inicialmente deprime a atividade locomotora espontânea em ratos e

desenvolve tolerância após 10 dias de exposição repetida.

No entanto, o tratamento crônico com 2,4-D resulta em miopatias

graves e aparentemente irreversíveis em ratos (Dux et al., 1977) e parece que isto

se deve a uma falha na recaptação de Ca++, pela inibição de um passo na

produção de energia mitocondrial (Guzelian, 1982; Pereira, 1991).

Guzelian (1982) observou que a toxicidade neuromuscular e as

anormalidades neuropsiquiátricas em humanos desaparecem após a remoção do

organoclorado. Seu mecanismo de neurotoxicidade tem sido atribuído à inibição

da membrana mitocondrial e sinaptossomal para sódio-potássio ATPase. E, seu

sítio de ação pode ser a formação reticular mesencefálica.

Pereira (1991) observou que o Tordon atua sobre as enzimas da

cadeia respiratória inibindo de maneira significativa as atividades enzimáticas da

NADH-oxidase e NADH citocromo c redutase, alterando a elasticidade da

membrana mitocondrial interna ou a sua permeabilidade para o íon Na+. Verificou

também que o picloram e o 2,4-D tem efeito inferior ao observado com o Tordon

comercial, reforçando a ação de "impurezas" chamadas dioxinas.

Schulze (1988) observou que diferentes formulações do mesmo

herbicida podem produzir efeitos comportamentais diferentes.

Outros autores verificaram, através de cortes histológicos, que o

picloram é altamente carcinogênico em ratos e camundongos (Reuber, 1981).

Resultados contrários aos de John-Greene (1985) que conduziu um estudo sobre

os efeitos teratogênicos do composto para que os produtos Tordon pudessem ter

seu registro continuado.

4

No entanto, é de conhecimento da população brasileira alfabetizada

(muito provavelmente não agrícola), através da Folha de São Paulo (Reis,1991)

que estudos intensivos estão sendo feitos sobre a carcinogenicidade dos

herbicidas organoclorados que como o Tordon contêm o 2,4-D. Sendo que esta

patologia é mais comumente associada com hormônios, ou seja, o 2,4-D produz

linfomas não Hodgkin e sarcomas de tecido mole em homens (ou ratos e não

produz em ratas) e produz câncer de fígado somente em ratas que produzam

estrogênio (ou seja, não estéreis).

Dados concordantes com os de Ibrahim et al. (1991) que elaboraram

estudos sobre a carcinogenicidade humana e a opinião predominante entre os

cientistas é que há indicação de que a exposição do 2,4-D pode causar câncer

em humanos como doença de Hodgkin do tecido mole e outros linfomas.

Esta opinião está de acordo com os resultados apresentados por

Reis (1991) que ligam o 2,4-D a tumores cerebrais.

Entretanto, Goetz et al. (1994) estudando os efeitos neurológicos do

Agente Laranja (Tordon) sobre os veteranos da guerra do Vietnã, apesar da

fragilidade metodológica, concluíram que não existe evidência de associação

entre exposição ao herbicida e tumores cerebrais.

Tyynela et al. (1990) descrevem a distribuição dos organoclorados

em diversas áreas cerebrais mostrando que apesar do nível relativamente baixo

(5% relativo ao plasma), de acordo com o conceito corrente de transferência de

droga através de membranas corporais (menor solubilidade lipídica das formas

ionizadas - Bernard et al., 1985), o 2,4-D atravessa a barreira hematoencefálica.

Elo et al. (1988) concluíram que todas as doses tóxicas em ratos

causaram injúria nos vasos sangüíneos cerebrais.

Os resultados de Kim et al. (1983) indicam que o 2,4-D é

transportado do fluído cérebro-espinhal através de um sistema ânion orgânico e

que inibidores deste sistema podem bloquear sua eliminação do cérebro "in vivo".

Dados confirmados por Ylitalo et al. (1990).

Lawrence & Casida (1984) afirmam que os organoclorados são

potentes inibidores competitivos estéreo específicos do t-butilbiciclofosforotionato

(TBPS) que ligando-se ao sítio cerebral específico do ácido gama-aminobutírico

(GABA) regulam o canal de cloro.

Enquanto que, Bernard et al. (1985) concluíram que o 2,4-D causa

um decréscimo da atividade da acetilcolinesterase (AChE) no botão sináptico bem

como mudanças comportamentais e eletrofisiológicas. A diminuição da atividade

da AChE pode ser uma pré-etapa no desenvolvimento de miopatias que ocorrem

após grandes doses de 2,4-D.

5

Elo e MacDonald (1989) endossaram a hipótese de que o 2,4-D

inibe o transporte ácido orgânico para fora do cérebro, o que pode resultar em

níveis cerebrais aumentados de metabólitos acidificados de aminas biogênicas, e

assim pode também ter efeitos sobre a atividade de neurônios serotonérgicos e

dopaminérgicos.

Boyd et al. (1990) determinaram alterações no nível colinérgico do

neostriatum de ratos tratados com inseticidas/pesticidas, bem como observaram

diminuição significante na proporção acetilcolina/colina em seus hipocampos.

Da mesma forma, E. de Duffard et al. (1990 - 28) determinaram o

aumento da serotonina (5-HT) e do ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) em ratos

machos e fêmeas adultos expostos ao 2,4-D e, a reversão para níveis mais

baixos que o controle quando os animais foram alimentados sem o herbicida.

Oliveira e Palermo Neto (1993), observando os efeitos do 2,4-D

sobre o comportamento no "open-field", verificaram que a ação do herbicida é

contrária ao 5-hidroxitriptofano (5-HTP). Ratos pré-tratados com 5-HTP e p-

clorofenilalanina (PCPA) tiveram diminuídos e aumentados, respectivamente, os

efeitos do 2,4-D dimetil-lamina. O herbicida administrado oralmente diminuiu os

níveis estriatais do 5-HT ( discordante dos resultados de E. de Duffard et al., 28,

com alimentos) e aumentou os níveis do 5-HIAA, sugerindo, assim, que há

modificação da atividade funcional dentro do S.N.C.

Por outro lado, St. Omer & Mohamed (1987) observaram

neurotoxicidade sutil no desenvolvimento de ratos expostos ao 2,4-D pré-

natalmente. Embora, não se observassem sinais tóxicos claros os resultados

indicaram alterações funcionais.

McCollister & Leng (1969) descreveram os resultados de um estudo

sobre a reprodução durante três gerações de ratos alimentados com picloram na

ração. Não encontraram diferença significante entre os grupos controle e

contaminado com relação a viabilidade, sobrevivência ou crescimento dos jovens.

Não encontraram também resíduos do herbicida no leite de vaca, exceto em uma

das três vacas estudadas que apresentou um resíduo de 0,05 ppm quando em

tratamento. Estes dados não correspondem aos encontrados por Guzelian (1982),

segundo o qual em animais de laboratório a função reprodutora bloqueada ou

enfraquecida foi bem documentada. Lagenbach (1989) afirma que "... os

organoclorados, ... , contaminam intensamente a carne, o leite e seus derivados,

... ". Da mesma forma, Fang et al.(1973) encontraram herbicida organoclorado

marcado com 14C em fetos e no leite.

6

Por outro lado, cortes histológicos indicaram que houve atrofia em

testículos e a produção de esperma foi afetada, com espermatozóides anormais

ou "pacotes" em degeneração, bem como a espermatogênese pareceu ser

suprimida (Eroschenko, 1978).

Evangelista de Duffard et al. (1990) descreveram o papel da

testosterona e/ou sua ausência exercendo influência sobre os efeitos tóxicos do

2,4-D em testes comportamentais.

Vin' et al.(1990) descreveram a ação do 2,4-D sobre a função

reprodutiva de ratas que resultaram em certos distúrbios no ciclo estral, bem

como em um aumento significativo de morte intra-uterina com tratamentos agudos

e crônicos. Várias aberrações cromossomais foram identificadas (resultados estes

que estão de acordo com os dados de Adhikari & Grover, 1988).

Blakley et al. (1989) observaram que a exposição pré-concepcional e

gestacional de ratas ao Tordon 202c acarreta a incidência de má-formações fetais

(palato-fendido, agenesia renal, hidronefrose, agenesia unilateral dos testículos e

hérnia umbilical) e fetos com variantes (especialmente ossificação incompleta do

esqueleto). Chernoff et al., 1.990, citam costelas supernumerárias. Chernoff et al.

(1990) e Blakley et al. (1989) concordam que nas dosagens mais tóxicas o peso

materno foi diminuído e/ou a letalidade materna aumentada. Chernoff et al. (1990)

afirmam ainda que houve diminuição do peso fetal e alargamento da pelve renal e

que o composto 2,4-D foi escolhido porque estudos prévios indicavam baixa ou

nenhuma toxicidade para o desenvolvimento de animais. Blakley et al. (1989)

sugerem que a exposição preconcepcional e gestacional ao Tordon 202c provoca

efeitos teratogênicos e de diminuição do crescimento fetal. Sugere, porém, que

somente exposição no período preconcepcional não é suficiente para somatizar

efeitos embriotóxicos. Este resultado está de acordo com os resultados de

Evangelista de Duffard et al. (1990 - 27) que sugerem que a exposição pré-natal

não tem nenhuma influência sobre a condição pós-natal dos neurotransmissores.

O fator que nos levou a fazer este trabalho foi o fato de que todas as

pessoas (trabalhadores rurais ou não) contaminadas ou intoxicadas pelo herbicida

Tordon apresentaram neuropatias periféricas, confusão mental e até esterilidade

presumida em homens (ou seja, número de espermatozóides zerado).

7

2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS

Tendo em vista que os agrotóxicos desenvolvidos para atender as

necessidades dos países desenvolvidos chamados de "primeiro mundo" são

manuseados pelas pessoas menos esclarecidas a seu respeito (mesmo em seus

países de origem) e que por isso são responsáveis pelos inúmeros "acidentes" de

intoxicação e contaminação dos seres vivos e de seu meio ambiente (Lagenbach,

1989), escolhemos um modelo experimental que mimetizasse um nível de

contaminação que não é considerado tóxico e que pode ocorrer normalmente,

principalmente no meio rural.

Este trabalho tem por objetivo estudar os efeitos da contaminação

materna (durante o período de acasalamento, gestação e lactação) com o

herbicida "Tordon 2,4-D 64/240 trietanolamina BR" sobre o desenvolvimento do

Sistema Nervoso Central (S.N.C.) dos filhotes.

Foi escolhido este esquema experimental porque, o mesmo,

compreende a embriogênese e a ontogênese do S.N.C. Os resultados

comportamentais aqui apresentados foram realizados para verificar se ocorre

passagem do herbicida através da placenta e/ou leite e/ou barreira

hematoencefálica.

Neste trabalho também foram avaliados os efeitos do herbicida Tordon sobre a

função reprodutora dos animais experimentais, bem como a proporção de filhotes

machos e fêmeas nascidos em cada ninhada de cada grupo experimental.

8

9

3.MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. LOCAL DE TRABALHO

Os Experimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia e

Farmacologia do S.N.C., do Departamento de Fisiologia da UFPr, por apresentar

as condições mínimas de manutenção da temperatura constante para os animais

experimentais, bem como locais adequados para os testes comportamentais.

O material para as lâminas histológicas foi preparado em parte nas

dependências do Departamento de Fisiologia e em parte no Laboratório Central

do Departamento de Morfologia - Biologia Celular da UFPr.

3.2. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Os animais experimentais utilizados foram ratos Wistar (ratos

brancos de laboratório - Ratus ratus, variante albino), obtidos do Biotério do Setor

de Ciências Biológicas da UFPr e/ou de outras instituições através do técnico

responsável - Cândido J. T. Pereira.

3.3. HERBICIDA

O herbicida usado na contaminação dos grupos experimentais é o

agrotóxico comercial "TORDON 2,4-D 64/240 trietanolamina BR"

O TORDON apresenta a seguinte composição: sal trietanolamina do

ácido 4-amino 3,5,6-tricloropicolínico (picloram, sal trietanolamina) 103 g/l.

Equivalente ácido do picloram :64 g/l.

Sal trietanolamina do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, sal

trietanolamina) 406 g/l.

Equivalente ácido do 2,4-D: 240 g/l.

O picloram é derivado do ácido picolínico e o 2,4-D do grupo dos

fenoxiacéticos.

10

O picloram é o composto ativo e o 2,4-D se apresenta comumente

como éster no Tordon.

Optou-se pela contaminação crônica oral com uma dose

considerada sem efeito tóxico, propriamente dito, no período reprodutivo do

animal. Em doses maiores o sabor e o odor impedem que o animal beba

normalmente.

A contaminação dos animais ocorre através da água de beber na

proporção de 1 (um) ml do agrotóxico para 999 ml de água (0,1% V/V), durante o

período de acasalamento, gestação e lactação.

Nascidos os filhotes, o trabalho prosseguiu somente com os machos

que, a partir do desmame, receberam água igual a do grupo controle.

3.4. METODOLOGIA

3.4.1. Acasalamento

O período de acasalamento ideal é de dez dias. No entanto, por

medida de precaução, o tempo de acasalamento no nosso experimento foi de

vinte dias.

Acasalaram-se dois grupos experimentais em um total de dez

fêmeas e dois machos. Sendo um macho e cinco fêmeas em cada caixa. Um dos

grupos foi o controle (C) e o outro foi contaminado por Tordon na água de beber

(grupo Tordon 1 ou T).

3.4.2. Nascimento dos filhotes

Verificada a proporção sexual obtida nos dois grupos experimentais

da primeira etapa, propusemo-nos a fazer novos acasalamentos observando-se a

proporção durante três gerações consecutivas (F1, F2 e F3). Onde F1 é a

primeira geração nascida de mães contaminadas, F2 são os filhos de F1 e, F3

são os filhos de F2, sendo que nas três gerações as mães do grupo T foram

contaminadas da mesma maneira com Tordon.

11

Para se chegar a segunda e terceira gerações foram acasalados

machos e fêmeas filhos de mães contaminadas da geração anterior. O modelo

experimental do acasalamento evitou cruzamento consangüíneo.

Observando-se, ainda, a diferença estatística do peso obtido a partir

do 53o dia nos filhotes de mães T em relação aos controles, optou-se por um novo

grupo experimental. Este novo grupo (Tordon 2 ou TT) foi igualmente

contaminado pelo herbicida Tordon diferenciando-se apenas o tempo de

exposição das fêmeas ao agrotóxico. A contaminação começou aos 60 dias de

idade, ou seja, 30 dias antes do período de acasalamento e terminou com o

desmame dos filhotes.

Os grupos C e T foram acasalados quando os animais se

apresentavam em idade de maturidade sexual (entre 90 e 100 dias) nas três

gerações.

Em todos os grupos observou-se também, o número de dias para o

nascimento dos filhotes a partir do primeiro dia de acasalamento; o número de

fêmeas que procriaram, a proporção macho/fêmea de cada grupo e a mortalidade

de animais durante o período de contaminação.

3.4.3. Peso Corporal

Os filhotes machos, apenas da primeira geração dos grupos C e T,

foram pesados individualmente, a partir do primeiro dia após o nascimento até o

101o dia de idade, sendo que a pesagem foi feita de quatro em quatro dias.

Desta maneira os animais são pesados no dia seguinte ao

nascimento (1o dia), no 5o dia, no 9o dia e assim sucessivamente até o 101o.

Cada grupo experimental foi pesado com a mesma idade (em número de dias)

para posterior comparação estatística entre os grupos experimentais.

Outro fator observado, dado o ciclo vital do rato Wistar e como este

animal dorme durante o dia e desperta à noite, foi manter fixo o período de

manuseio e pesagem dos animais das 14 as 18 horas, visando com isso interferir

o mínimo possível em seu comportamento devido ao stress, ou mesmo, para se

ter uma melhor avaliação com relação à proporção idade/peso do animal. Dentro

deste contexto todos os comportamentos quantificados foram verificados no

mesmo período.


12

O reflexo de endireitamento é um teste que nos dá parâmetros de

como o Sistema Nervoso Central (S.N.C.) está quanto ao seu desenvolvimento

pós-natal.

Consiste em se colocar o animal em decúbito dorsal e verificar

quanto tempo o mesmo demora para pôr-se na posição normal, ou seja, em

decúbito ventral. Se o reflexo for imediato, ou seja, seu tempo de incursão for

menor que um segundo, considera-se reflexo adquirido. Se as ninhadas do grupo

contaminado adquirirem o reflexo no mesmo número de dias que o grupo

controle, pode-se inferir que o desenvolvimento do S.N.C. foi igual nos dois

grupos.

Considera-se que todos os filhotes da mesma ninhada devem

adquirir o reflexo no mesmo dia.


Outro modo de se verificar o desenvolvimento do animal é pela

observação do número de dias decorridos do nascimento até a abertura palpebral

completa dos filhotes. Como no ítem anterior é importante anotar a idade da

ninhada, para isso todos os filhotes devem estar com as pálpebras

completamente abertas.

3.4.6. Sexagem

Ocorre de 5 a 7 dias após o nascimento. Observa-se o número de

filhotes e a proporção macho/fêmea em cada ninhada. Permanecem com a mãe

até o desmame apenas machos ou apenas fêmeas, mantendo-se no máximo 6

filhotes por mãe. Apenas os machos, por terem um ciclo reprodutivo constante e

contínuo durante toda a vida, serão utilizados nos testes comportamentais e

histológicos. Foram utilizados um número mínimo de 15 animais em cada

experimento comportamental.

Os filhotes fêmeas serão matrizes para um novo acasalamento e

obtenção de uma geração posterior, durante o qual seu processo reprodutivo será

observado.

13

14

3.4.7. Testes Comportamentais

3.4.7.1. MOVIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA

Este experimento nos dá uma idéia da tendência natural do animal

para a atividade exploratória. Consiste em quantificar a atividade motora do

animal dentro de uma caixa de movimentação espontânea durante cinco minutos.

A contagem é feita por um aparelho eletrônico, acoplado à caixa, que marca

quantas vezes o animal interrompe feixes fotoelétricos quando cruza o assoalho.

Estes feixes são emitidos por três pares de células fotoelétricas dispostas

paralelamente e distantes 15 mm do nível do assoalho da caixa. Localizam-se nas

paredes anterior e posterior.

Esta caixa possui 50,0 cm de largura, 20,5 cm de profundidade e

22,3 cm de altura (medidas internas). As paredes laterais e de fundo são

formadas por alumínio. O teto da caixa é feito do mesmo material e possui

dobradiças para que se abra como porta. O chão é formado por barras paralelas

de quatro milímetros de diâmetro que servem de apoio ao animal não permitindo

que suas excreções se acumulem no interior da caixa. A parede anterior é

formada por acrílico de cor fumê que permite a observação do animal. O ambiente

é mantido o mais silencioso possível e a luz externa não é intensa.

3.4.7.2. TESTE DO "ROTA-ROD"

Este experimento determina a capacidade de equilíbrio do animal.

Rota-rod é um aparelho que consiste em uma barra giratória de 72

cm de comprimento e 2,8 cm de diâmetro, estando elevada a 37 cm da base e

que possui uma rotação de 12 rpm.

Liga-se o aparelho e coloca-se o animal, pela cauda, de modo que

suas patas toquem a barra. Solta-se o animal e cronometra-se o tempo que

conseguir permanecer na barra. O experimento é repetido por três vezes,

somando-se o tempo total de permanência do animal na barra.

Os testes comportamentais de Movimentação Espontânea e no

"Rota-Rod" são feitos aos 40 e aos 90 dias de idade. Os aparelhos utilizados

nestes testes podem ser visualizados na figura 1 e figura 2, respectivamente.

15

FIGURA 1. Mostra um animal experimental dentro da caixa de

Movimentação Espontânea. O reflexo, proporcionado pelo "flash" da máquina

fotográfica, no piso da bancada revela a estrutura do assoalho da caixa deste

modelo experimental.

FIGURA 2. Ilustra o aparelho do "Rota-Rod" com um animal

experimental.

16

17

3.4.7.3. EXPOSIÇÃO AO "OPEN FIELD"

Este teste avalia a reatividade emocional do animal quando exposto

a aversividade do campo aberto.

Sobre o "Open-Field" encontram-se 4 lâmpadas de 60 wats cada e

um auto falante que produz um ruído contínuo e monótono de 78 decibéis que

deixa camuflados outros possíveis ruídos estranhos ao experimento.

O ambiente do "Open-Field" é separado do observador através de

uma cortina, conforme figura 3, que permite a quantificação dos comportamentos

do animal em experimentação.

FIGURA 3. Ilustra o aparelho do "Open-Field".

18

O campo aberto "Open-Field" consiste em uma arena de fundo

redondo com 80 cm de diâmetro e parede lateral de 30 cm de altura. O piso do

aparelho é dividido em raios e círculos concêntricos de maneira a formar figuras

geométricas semelhantes que possuem relativamente a mesma área, conforme

fig.4. Cada figura geométrica é considerada um "quadrado".

FIGURA 4. Ilustra o piso da arena do "Open-Field" com um animal

experimental em posição de "rearing-up´.

Este teste comportamental compreende a observação de vários

parâmetros, tais como ambulação, "freezing", "rearing-up", "grooming", defecação

e micção, durante cinco minutos de experimentação.

19

a. Ambulação

Observa-se quantos "quadrados" foram "invadidos" pelo animal com

pelo menos as duas patas anteriores.

b. Tempo de "Freezing"

Observa-se o tempo de imobilização total do animal, com pelos

eriçados, olhos fixos e orelhas orientadas em dada direção.

c. "Rearing-up"

Observa-se a atitude exploratória do animal contando-se o número

de vezes que explorou o ambiente levantando-se e permanecendo apoiado

apenas sobre as patas posteriores, conforme figura 3.

d. Tempo de "Grooming"

Observa-se o comportamento deslocado do animal. Em ratos

cronometra-se o tempo em segundos que o animal passa se "limpando".

e. Número de bolos fecais

Conta-se, neste tipo de observação, o número de bolos fecais

excretados pelo animal durante os cinco minutos de teste no Open-Field.

f. Micção

Neste parâmetro foi observada a presença ou ausência de urina na

arena após completado o teste de Campo Aberto.

20

3.4.7.4. TESTE DO "PLUS-MAZE" OU LABIRINTO EM "X":

Teste experimental que quantifica medo ou ansiedade, através da

exposição do animal a espaços abertos e fechados.

O "Plus-Maze" é um labirinto em X elevado 50 cm do chão, que

possui dois braços abertos (como prancha de navio pirata) e dois braços fechados

(com "paredes" em suas laterais e em uma de suas extremidades). Os braços se

intercomunicam por uma das extremidades de maneira a formarem um X quando

observados de cima. Cada braço mede 50 cm de comprimento por 10 cm de

largura, e as "paredes" do braço fechado medem 40 cm de altura. Não há parede

nas laterais do quadrado central (10x10 cm) que faz a intercomunicação entre os

braços. Os braços fechados não possuem "teto", permitindo assim a observação

do animal, conforme ilustrado na figura 5.

FIGURA 5. Mostra os quatro braços do "Plus-Maze" e um animal

experimental explorando um deles.

21

Este experimento é realizado em um ambiente com isolamento

acústico da mesma maneira que os outros dois testes comportamentais: "Open-

field" e Esquiva Ativa. Utiliza-se luz vermelha para que o observador possa

observar sem ser observado.

O animal é colocado no quadrado central e observa-se (durante

cinco minutos) sua atividade exploratória pelos braços. Conta-se uma entrada em

cada braço cada vez que o animal fizer uma "invasão" com, no mínimo, as duas

patas dianteiras e, cronometra-se o tempo de permanência durante cada

"invasão". O quadrado central é considerado neutro e o tempo de permanência

neste lugar não é computado.

Segundo Sharon Pellow mede-se a porcentagem do número de

entradas (% de NEA ou % de NEF) e a porcentagem do tempo de permanência

do animal em cada braço (% de TA ou % de TF).

Numa tentativa de melhor evidenciar o medo ou ansiedade dos

animais em relação ao braço aberto, os nossos dados foram computados

verificando-se a relação T/N (tempo de permanência sobre número de entradas)

que nos mostra como o animal entra no braço aberto ou fechado e não apenas o

quanto entra.

3.4.7.5. ESQUIVA ATIVA

Teste experimental que mede o aprendizado do animal. Aprendizado

este que consiste em o animal associar o estímulo incondicionado do som da

campainha com o comportamento de cruzar a caixa (uma "shüttle-box") para se

esquivar do choque elétrico nas patas.

Todas as observações comportamentais deste teste foram feitas

numa "shüttle-box" de alumínio de 50x25x25 cm, pintada com esmalte cinza,

exceto em sua parte anterior que é de vidro transparente. Isto possibilita a

observação do animal durante o experimento. Presa ao teto da linha média da

caixa há uma lâmpada de 10 w e, em situação oposta à lâmpada, do lado externo

da caixa, encontra-se uma campainha. O piso da caixa é formado por uma grelha

metálica, constituída por barras de bronze de 2 mm de diâmetro, separadas entre

si por uma distância de 7 mm. Na linha média do piso, separando o lado direito do

esquerdo da caixa, há uma trave de alumínio de 0,5x0,5x25 cm pintada com

esmalte cinza e colocada no mesmo nível das barras de bronze. Esta "shüttle-

box" está ilustrada na figura 6.

22

FIGURA 6. Mostra a atividade exploratória de um animal

experimental dentro de uma "shüttle-box" utilizada no teste de Esquiva Ativa. Ao

lado visualiza-se o aparelho que produz a estimulação sonora e elétrica.

No teste de Esquiva Ativa o animal experimental é colocado dentro

da caixa de condicionamento onde permanece de 5 a 10 minutos para que possa

explorar livremente a caixa e se habituar a ela. Após este período de tempo inicial

na "shüttle-box", os animais ouvem toques de campainha com 5 seg de duração e

recebem choques elétricos de 1,5 mA, 60 Hz, durante 2 seg, nas patas. Os

intervalos entre os toques de campainha variam aleatoriamente entre 10 e 40

segundos.

Esta situação experimental que constitui o teste DPC, ou situação de

"esquiva ativa de duas vias" típica, consiste de 50 toques de campainha de 5 seg

de duração pareados ao choque nas patas. Caracterizando, assim, contigüidade

de estímulos ou "pareamento", como na situação experimental do paradigma

clássico ou pavloviano. Nas provas em que a campainha provoca uma resposta

de cruzamento (de um lado ao outro da caixa), o animal não recebe choque nas

patas. "Prêmio" por haver aprendido a se esquivar.

23

Na esquiva ativa observam-se os seguintes parâmetros:

a. Resposta de Cruzamento (RC)

Indica o desempenho do animal na "shüttle-box" em termos de

comportamento aprendido. Consiste em quantificar o número de cruzamentos que

ocorrem na "shüttle-box" (de um lado ao outro) dentro do intervalo de cinco

segundos de duração da campainha.

b. Cruzamentos Inter Provas (CIP)

Índice que indica ansiedade. Consiste no número de cruzamentos

que ocorrem na "shüttle-box" sem estimulação externa, ou seja, o animal cruza a

"shüttle-box" no período entre as provas.

c. "Jumping"

Número de saltos que ocorrem durante o tempo de estimulação

sonora (no caso a campainha). O "jumping" nos fornece um índice de reatividade

emocional do animal.

d. Orientação

Neste parâmetro observa-se se o animal procura identificar a origem

do som, ou seja, verifica-se em cada prova se ele está escutando a campainha.

24

3.5. ESTATÍSTICA

Todos os resultados foram expressos através da média ± erro

padrão da média.

Nas observações comportamentais que foram quantificadas com

grandezas paramétricas foi feita a avaliação estatística pelo teste "t" de "student",

tais como na avaliação da variação do peso corporal, número de dias para o

reflexo de endireitamento, número de dias para a abertura da fenda palpebral e

nos parâmetros observados nos testes de Movimentação Espontânea, "Rota-

Rod", "Open-Field" (exceto micção), "Plus-Maze" e Esquiva Ativa. Foi aplicado ,

também, o teste "t" para avaliar o número de dias que os filhotes levaram para

nascer a partir do primeiro dia de acasalamento dos pais.

Os dados não paramétricos foram analisados pelo teste do "Qui-

Quadrado", como a proporção sexual observada, outras observações (fêmeas

estéreis, filhotes mortos/devorados e mães mortas) e o parâmetro micção do teste

do "Open-Field", que também foi analisado pelo teste de FISHER.

3.6. MORFOLOGIA

Foram feitos cortes histológicos do S.N.C. e testículos de 10 filhotes

machos da geração F1 do grupo C e 15 do grupo T, que já contavam com 110

dias de idade e que eram filhos de mães diferentes em ambos os grupos.

Utilizou-se o médoto de perfusão para a retirada dos órgãos, da

seguinte maneira:

Os animais foram anestesiados com éter etílico, via inalação, e

imobilizados em mesas cirúrgicas próprias. Os tecidos abdominais foram

rebatidos e presos por pinças de maneira a permitir a invasão da caixa toráxica e

exposição do coração. Imediatamente o ventrículo esquerdo recebeu cerca de

200 ml de solução salina, (através de uma agulha butterfly, cânula e seringa)

aproveitando as contrações do músculo cardíaco para "limpar" os vasos

sangüíneos dos órgãos em questão. Evitando-se, assim, material desnecessário

na lâmina histológica. A aurícula direita recebeu um pique para que o sangue que

vinha da grande circulação extravasasse. Quando o líquido que jorrava da

aurícula direita tornou-se transparente considerou-se que os vasos sangüíneos

estavam "limpos".

25

Em seguida, através do mesmo processo com outra seringa, os

tecidos foram perfundidos com cerca de 200 ml de formalina (solução de formol a

40%) para que os tecidos fossem sendo fixados o mais breve possível. Como a

partir da invasão toráxica o animal já é considerado morto, não se utiliza mais

anestésico e o tremor observado, bem como a rigidez da cauda e da nuca, é sinal

característico da ação da formalina nos tecidos.

Sendo assim procedeu-se a retirada dos testículos, por simples

desalojamento da bolsa escrotal, e do cérebro, por decaptação da cabeça e

abertura - extremamente cuidadosa - da caixa craniana e das meninges. Os

órgãos foram, então, colocados em um recipiente contendo formalina e após uma

hora de fixação foram seccionados. O cérebro foi dividido em três partes com

cortes frontais: cérebro anterior, diencéfalo e tronco cerebral. Os testículos foram

divididos em três partes por cortes transversais ou duas partes por um corte

longitudinal.

Prosseguiu-se com a metodologia corrente de fixação, emblocagem,

corte, desidratação, diafanização e coloração dos tecidos com hematoxilina-

eosina em algumas das peças, e nitratação em outras.

3.6.1.Coloração por H.E.:

Fixação em formol 40%.

Emblocagem em parafina com 3% de cera de abelha.

Cortes histológicos - A única diferença metodológica foi o corte

seriado do cérebro, do qual aproveitavam-se dez fatias e desprezavam-se vinte,

totalizando, de cinco peças, cerca de quinhentas lâminas aproveitáveis.

Desidratação em soluções com concentração alcóolica crescente -

álcool 70%, álcool 90%, álcool I PA., álcool II PA., ácool III PA.

Diafanização com xilol.

Método corrente de coloração por H.E.

Montagem em lâmina e lamínula com bálsamo do Canadá.

3.6.2. Nitratação

Utilizou-se o método do nitrato de cobalto de DA FANO, descrito por

Beçak & Paulete (1970).

26

Fixação em nitrato de cobalto, impregnação em nitrato de prata

(1,5%), redução na mistura de Ramón y Cajal, desidratação, inclusão e corte.

Virar os cortes por meio de cloreto de ouro (0,2%), fixar em

hipossulfito de Na+ (5%) e montar em lâmina e lamínula com bálsamo da Canadá.

Além de evidenciar os corpos dos neurônios, esta técnica cora em

marrom o Complexo de Golgi.

3.6.3. Evidenciação da bainha de mielina

A técnica LUXOL FAST BLUE - LEVAFIX RED VIOLET para

evidenciação das células gliais e da bainha de mielina, descrita por Vacca (1985),

resulta na mielina corada em azul, grânulos em neurócitos (parecidos com

corpúsculo de Nissl), proteínas e corpúsculos de Nissl em vermelho, musculatura

lisa de vasos sangüíneos normais em vermelho violeta e musculatura lisa de

vasos sangüíneos com fibrose média ou espessamento da íntima, bem como o

colágeno, não se coram.

O método de PTAH modificado para demonstração da glia em tecido

do S.N.C., descrito pela mesma autora acima, tem como resultado a coloração da

glia e mielina em azul, das fibras musculares normais em vários tons de azul e do

músculo degenerado em tons do púrpura ao vermelho. Esta técnica usa uma

grama de IODINE.

A demonstração da mielina degenerada, para animais que não têm

contato com o herbicida a mais de 60 dias como no nosso experimento, pode ser

feita por algumas técnicas.

Como o tempo após o término da exposição é grande (mais de 60

dias), as células fagocitárias provavelmente terão removido a mielina degenerada.

A demonstração positiva pelo método clássico de Marchi - de 1895 (descrito no

Cel. Pat. Tech.) ou de 1935 (descrito por Conn, 1962),ou pelo método de Swank-

Davenport de 1935 (descrito por Conn, 1962 e no Cel. Path. Tech.), resultam na

precipitação do tetróxido de ósmio apresentando mielina degenerada e gorduras

neutras (ou seja, tecido adiposo) na cor preta.

Outro método de demonstração positiva é a tecnica do LUXOL FAST

BLUE-OIL RED, que resulta na coloração azul-esverdeada da mielina normal e

coloração vermelha da mielina degenerada. A coloração por OIL RED não é tão

intensa como quando se faz a contra-coloração com CRESIL VIOLET (Cel. Path.

Tech.).

27

4.RESULTADOS

4.1. DIAS DE ACASALAMENTO E GESTAÇÃO

Um ciclo estral completo varia de 3 a 5 dias numa fêmea adulta (90

dias de idade) de ratos Wistar (ratos brancos de laboratório - Ratus ratus variante

albino), portanto um período de dez dias seria o ideal para o acasalamento. No

entanto, verificamos que enquanto para animais controle este tempo é suficiente,

para animais contaminados pelo Tordon chegou a dobrar (26 dias) e mesmo

assim houveram fêmeas que não tiveram filhotes. O período de gestação normal,

reconhecido por todos os que trabalham com reprodução de ratos, é de 21 dias.

Conforme gráfico 1.

4.2. PROPORÇÃO SEXUAL

As porcentagens da proporção sexual observada em filhotes de

ratas controle (C) é de 56,18±2,039 machos (n = 249) para 43,82±2,039 fêmeas

(n = 196) na geração F1 (p<0,05), 57,02±2,381 machos (n = 269) para

42,93±2,384 fêmeas (n = 202) na geração F2 (p<0,05) e 57,16±2,232 machos (n

= 334) para 42,84±2,232 fêmeas (n = 251) na geração F3 (p<0,01).

Nas ninhadas das mães contaminadas por Tordon (T) verificou-se,

em três gerações consecutivas, a proporção de um macho para uma fêmea.

Conforme demonstrado nos organogramas 4-9 e no gráfico 2.

O teste do "X2" ("qui-quadrado") confirmou a diferença significante

observada no grupo controle, conforme tabela 1.

4.3. PESO CORPORAL

Os animais filhos de mães T nasceram com peso levemente inferior

ao observado no grupo C. Esta tendência permaneceu até o 53o dia, quando

então aumentaram significativamente seu peso corporal (p<0,05) em relação aos

controles. Observou-se que a diferença de peso corporal entre os dois grupos

continuou aumentando na idade adulta (p<0,01).

Estes resultados estão expressos no gráfico 3.

28

4.4. DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL


Nos animais controle o tempo médio de endireitamento foi de

4,22±0,15 dias que é significantemente menor (p<0,05) que o tempo médio de

endireitamento dos animais filhos de mães contaminadas (T): 4,65±0,07 dias,

descritos no gráfico 4.


Os animais controle levaram em média 14,51±0,08 dias para a

abertura completa das pálpebras e os animais filhos de mães T levaram

14,6±0,07 dias, com p>0,05. Dados descritos no gráfico 4.

4.5. TESTES COMPORTAMENTAIS AOS 40 DIAS DE IDADE


Animais controle apresentaram em média 129,911,96 cruzamentos

na caixa de movimentação espontânea, enquanto que os animais filhos de mães

T apresentaram em média 158,2617,27 cruzamentos, com p>0,05.

4.5.2. "Rota-Rod"

Os animais controle conseguiram permanecer na barra giratória do

"rota-rod" em média por 26,6±3,46 segundos, e os animais filhos de mães T

permaneceram 29,78±2,92 segundos. Tempos estatisticamente iguais (p>0,05).

29

4.6. TESTES COMPORTAMENTAIS AOS 90 DIAS DE IDADE

4.6.1. Movimentaçao Espontânea

Neste teste verificou-se que os animais controle apresentaram um

número de cruzamentos médio de 119,8612,5, enquanto que os filhos de mães

T apresentaram um número de cruzamentos de 169,3818,9, estatisticamente

significante com p<0,05.

Os resultados da movimentação espontânea observada estão

descritos no gráfico 5.

4.6.2. "Rota-Rod"

Da mesma maneira que aos 40 dias o equilíbrio dos animais foi

quantificado na idade adulta.

Os animais controle ficaram em média 50,577,39 seg na barra

giratória do "rota-rod", enquanto que os animais filhos de mães T permaneceram

45,813,79 seg em média, com p>0,05.

Não houve diferença significante entre os grupos, conforme gráfico

6.

4.6.3.Exposição ao "Open-Field"

a. Ambulação

Os animais controle apresentaram ambulação média de 57,055,87

"quadrados" invadidos, enquanto que os filhos de mães T apresentaram

43,003,99 "quadrados" invadidos. Diferença estatisticamente significante com

p<0,05, conforme tabela 2 e gráfico 7.1.

b Tempo de "Freezing"

Os animais controle permaneceram em média 91,5212,00 seg

"congelados", enquanto que os filhos de mães contaminadas permaneceram

30

119,339,53 seg "congelados", embora, de um modo geral, não se

apresentassem com os pêlos eriçados. Dados com uma significância estatística

de p<0,05, conforme tabela 2 e gráfico 7.1.

c. Número de "Rearings"

Os animais controle apresentaram uma média de 16,812,04

"rearings", enquanto que os filhos de mãe T apenas 12,671,47 "rearings",

diferença estatisticamente significante com p<0,05. Conforme tabela 2 e gráfico

7.2.

d. Tempo de "Grooming"

Nos animais controle observou-se que os mesmos apresentaram um

tempo de "grooming" de 11,831,86 segundos e os animais filhos de mães T

apresentaram 19,251,74 segundos, com p<0,05. Conforme tabela 2 e gráfico

7.2.

e. Número de bolos fecais

Para os animais controle obteve-se uma média de 5,710,64 bolos

fecais e para os filhos de mães contaminadas 5,051,96 bolos fecais em média,

com p>0,05. Conforme tabela 2 e gráfico 7.2.

f. Micção

Nos animais controle verificou-se que 90,4% do total apresentaram

micção e nos filhos de mães T 85,7% do total . Resultado considerado

semelhante estatisticamente, pelo teste de FISHER e do "qui-quadrado".

Conforme tabela 2.

31

4.6.4. Teste do "Plus-Maze" ou Labirinto em "X"

No braço aberto do "Plus-Maze", os animais controle apresentaram

uma média de 50,763,04% de NEA (número de entradas no braço aberto) e

12,182,08% de TA (tempo de permanência neste braço). Por sua vez, os

animais filhos de mães T apresentaram uma média de porcentagem de

54,783,21 entradas no braço aberto (% de NEA) e ali permaneceram

22,944,5% do tempo total em segundos. Para % de TA houve diferença

significante com p<0,05.

Por sua vez, no braço fechado os animais C apresentaram

49,243,04% do total de entradas (% de NEF) e os filhos de mães T entraram

45,223,21% do total. Os animais controle permaneceram 754,02% do tempo

total em segundos no braço fechado (% de TF), enquanto que os filhos de mães

contaminadas permaneceram 65,764,96% do tempo total em segundos. Para %

de TF houve diferença significante com p<0,05.

Os animais C tiveram T/NEA igual a 5,510,95 e os filhotes do grupo

T 8,641,44, com p<0,05.

Os animais C apresentaram T/NEF igual a 48,048,26 e os animais

filhos de mães T 71,0820,46. Diferença não significante.

Os parâmetros % de NEA, % de NEF e T/NEF não apresentaram

diferença significante, com p>0,05.

Enquanto que, os parâmetros % de TA, % de TF e T/NEA

apresentaram significância estatística com p<0,05.

Todos os dados do Plus-Maze estão representados nos gráficos 8.1,

8.2 e 8.3.

4.6.5. Esquiva Ativa

a. Resposta de Cruzamento (RC)

A resposta de cruzamento dos animais controle foi de 33,24±4,01%

do total de testes e dos animais filhos de mães T foi de 28,00±5,46%, com

p>0,05.

32

b. Cruzamento Inter-Provas (CIP)

Os animais controle apresentaram 1,22±0,34% de CIP e os

descendentes de mães T 3,63±1,04%. Dados considerados não diferentes

estatisticamente, com p<0,05.

c. "Jumping"

Animais controle e filhos de mães Tordon 1 apresentaram a mesma

porcentagem de saltos, a saber 3,10±0,98% para os controle e 3,07±0,96% para

o segundo grupo. Houveram animais do grupo contaminado que saltaram durante

e após a aplicação do estímulo sonoro.

d. Orientação

Foi 100% positiva para os dois grupos.

Todos os resultados do teste de esquiva ativa estão representados

no gráfico 9.

4.7. FÊMEAS QUE NÃO SE APRESENTARAM PRENHAS

No grupo controle foram observadas 138 fêmeas, das quais

nenhuma deixou de dar cria.

No grupo Tordon 1 observou-se que de 55 fêmeas 10 não tiveram

filhotes. Originando uma média de 18,2% de nuliparidade nas três gerações

consecutivas.

No grupo Tordon 2 a média observada foi de 19,7% de nuliparidade,

ou seja, de 61 fêmeas 12 não tiveram filhotes. Estas fêmeas foram acasaladas

novamente por igual período e mesmo assim 4 delas (acasaladas com machos

diferentes) permaneceram sem filhotes.

Dados observados na tabela 3.

33

4.8. FILHOTES MORTOS/DEVORADOS

Nenhum dos 1506 filhotes do grupo controle foi encontrado morto,

semi-devorado ou dado por desaparecido.

Entretanto, dos 469 filhotes do grupo T 71 (15%) morreram, dos

quais 34 (63%) desapareceram (devorados pela mãe).

E, no grupo TT observou-se que dos 498 filhotes 29 (6%) morreram,

dos quais 16 (55%) desapareceram (devorados pela mãe ).

Provavelmente a mãe devora ou deixa morrer os filhotes não aptos,

como normalmente ocorre em outra espécies de mamíferos (gato e outros felinos,

cão,coelho etc.)

4.9. OUTRAS OBSERVAÇÕES

A contaminação crônica com Tordon foi o suficiente para fazer com

que algumas ninhadas perdessem mais de 70% da pelagem, da mesma forma

que suas mães. Duas dessas mães apresentaram emagrecimento grave e dorso

exageradamente arqueado, deixando seus filhotes com aparente desnutrição. A

partir do desmame, quando não receberam mais o Tordon, os filhotes foram

gradativamente recuperando a pelagem até sua aparente totalidade (em torno do

65o dia).

Quase metade das fêmeas contaminadas, com ou sem filhotes após

o período de gestação, apresentaram-se agressivas ao manuseio.

Comportamento não observado nas fêmeas controle.

Em nossos experimentos, observamos ainda que os ossos dos

crânios dos filhotes do grupo contaminado apresentaram menor resistência ao

manuseio que os do grupo controle. Da mesma forma, Guzelian (1982) afirma que

a firmeza e espessura da casca dos ovos de aves se apresentaram reduzidas.

Das 37 mães do grupo Tordon 1, observou-se que uma da primeira

geração, sem filhotes, e outra da segunda geração, com 11 filhotes, não

conseguiam se levantar nem se alimentar e acabaram morrendo.

Estes animais não passaram pelos testes comportamentais.

Os dados dos ítens 4.8 e 4.9 estão descritos na tabela 3.

34

4.10. MORFOLOGIA

4.10.1. Coloração com Hematoxilina-Eosina (H.E.):

Não foram encontradas diferenças morfológicas nos cérebros e na

espermatogênese (testículos e epidídimos), dos animais dos dois grupos (C e T),

preparados com esta técnica. Conforme figuras 7 a 14.

4.10.2. Nitratação:

Não foram encontradas diferenças morfológicas nos cérebros, dos

animais dos dois grupos (C e T), preparados com esta técnica. Conforme figuras

15 e 16.

4.10.3. Evidenciação da bainha de mielina degenerada:

Não foi possível evidenciar se houve degeneração na bainha de

mielina pela dificuldade de encontrar os corantes CRESIL VIOLET, IODINE,

LUXOL FAST BLUE, OIL RED específico e RED VIOLET e, quando encontrados,

pela dificuldade financeira de aquisição, bem como pela demora da chegada dos

produtos.

Os métodos de simples evidenciação da bainha de mielina com

ácido ósmico, nitratação e outros não são capazes de diferenciar a mielina normal

da degenerada.

35

FIGURA 7. Ilustra epidídimo de animal normal com epitélio íntegro, em aumento

de 200 vezes ao M.O.

FIGURA 8. Ilustra epidídimo de animal normal com epitélio íntregro e estereocílios

(seta menor), em aumento de 400 vezes ao M.O.

36

FIGURA 9. Ilustra túbulo seminífero de testículo normal com núcleo de fibroblasto

(seta menor) e tecido intersticial (seta maior) bem evidentes

(aumento de 200 X aoM.O.).

FIGURA 10. Ilustra a formação de espermatozóides em túbulo seminífero normal

com espermatócito primário (seta curta curta) e espermátide (seta mais

longa) indicados(aumento de 400 X ao M.O.)

A letra "c" indica Célula de Sertoli.

37

FIGURA 11. Ilustra epidídimo de animal contaminado por Tordon evidenciando

estereocílios (seta menor) em epitélio íntegro.

Aumento de 400 vezes observado ao microscópio de luz.

FIGURA 12. Ilustra túbulo seminífero de animal contaminado por Tordon com

núcleo de fibroblasto (seta menor) e espermatogônia (seta maior)

evidentes (400 X ao M.O.).

A espermatogênese não foi alterada de maneira quantitativa.

38

FIGURA 13. Ilustra cérebro de animal controle corado por H.E. em aumento de

400 vezes (13.a) e de 200 X (13.b).

FIGURA 14. Ilustra cérebro de animal contaminado por Tordon corado por H.E.

(400 X). Com esta técnica não foi possível evidenciar nenhuma alteração

morfológica.

39

FIGURA 15. Ilustra cérebro de animal controle impregnado pelo nitrato de

cobalto, com oligodendrócitos bem evidentes, em aumento de 400 vezes.

FIGURA 16. Ilustra cérebro de animal contaminado por Tordon, com

oligodendrócitos bem evidentes, impregnado pelo nitrato de cobalto

(400 X). Não se observou alteração morfológica com esta técnica.

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5. DISCUSSÃO

Nos últimos anos uma quantidade considerável de trabalhos têm

sido publicada na imprensa científica a respeito do TORDON e/ou seus

componentes : o 2,4-D (normalmente encontrado na forma de éster neste

composto), o picloram e as dioxinas.

As dioxinas e o picloram já foram muito bem estudados, sendo que o

picloram (2,4,5-T) está proibido nos E.U.A. desde 1985 (Reis, 1991) e no Brasil

desde 1984. A legislação brasileira proibiu os organoclorados (compostos

orgânicos que contém moléculas de cloro e atuam no fator de crescimento dos

vegetais - Ferri, 1986) desde 1979, liberando-os de forma restrita em 1984. Por

isso, o 2,4-D continua sendo empregado sem restrições em quase todos os

países. Mas o Tordon que contém todos os componentes acima, a rigor estaria

proibido por lei, mas continua sendo comercializado.

Apesar dos registros de doses letais, inclusive em seres humanos,

todos os autores pesquisados relataram reversibilidade dos efeitos tóxicos

causados pelo herbicida. Em alguns casos há regeneração total dos tecidos

afetados, porém, em outros tais como no trabalho de Goldstein et al (1959) que

relata neuropatia periférica (sistema nervoso e tecido muscular) ocorrida por

absorção dérmica, o tecido muscular esquelético foi regenerado, mas a

neuropatia (tremores e estados alucinatórios) permaneceu mesmo após anos de

tratamento; no trabalho de Eroschenko (1978) que relata atrofia de testículos,

alguns animais conseguiram regenerar todo o tecido do aparelho reprodutor,

enquanto que outros permaneceram com os testículos e seus dutos severamente

afetados, prejudicando ou abolindo completamente sua capacidade reprodutiva;

no trabalho de Lerda & Rizzi (1991) que relatam astenospermia, necrospermia e

teratospermia em trabalhadores rurais, o número e quantidade dos

espermatozóides voltou ao normal e não se encontraram mais espermatozóides

mortos, mas a grande quantidade de espermatozóides anormais permaneceu

mesmo após anos de não contato com o herbicida; e ainda, no trabalho de E. de

Duffard et al (1990-27) que observaram efeitos permanentes nos níveis de

neurotransmissores cerebrais, ocorridos durante o desenvolvimento cerebral de

ratos nascidos de mães contaminadas durante gestação e lactação.

Tomando por base estes dados da literatura podemos inferir que as

alterações somáticas e comportamentais verificadas em nossos experimentos

67

estão relacionadas com alterações a nível de sistema nervoso, de sistema

reprodutor e, possivelmente a nível cromossomal.

Os efeitos do Tordon em nossos animais experimentais nos mostrou

que este herbicida tem efeito tóxico sobre a fertilidade dos ratos, tanto em fêmeas

como em machos. De tal maneira que filhotes de mães contaminadas nascem

mais tardiamente (p<0,01) que os animais controle. Estes dados concordam com

os trabalhos de Guzelian (1982) e Vin' et al (1990) que dizem "que a

administração crônica do 2,4-D resulta em certos distúrbios no ciclo estral,

manifestado como um prolongamento da fase diestro e mudanças na duração do

estro e meta-estro, bem como em um aumento na proporção de ciclos

anuvolatórios". Deste modo, os autores acima concluem que herbicidas

organoclorados têm "efeito tóxico sobre os sistemas endócrinos e reprodutivos",

tais como número de espermatozóides baixo ou ausente, baixa porcentagem de

espermatozóides móveis, efeito indireto no sistema pituitário hipotalâmico, pela

liberação do hormônio folículo estimulante (FSH) e prevenindo a liberação de

hormônios luteinizantes, com fortes evidências de efeitos estrogênicos diretos.

Por outro lado, Reuber (1981) observou atrofia de testículos de ratos

e camundongos tratados com picloram.

Entre os autores pesquisados acima é consenso geral que os efeitos

dos herbicidas organoclorados mimetizam a situação de excesso de estrogênio.

O tempo que os filhotes do grupo TT levaram para nascer (tempo

entre o acasalamento e o nascimento) diminuiu significativamente (p<0,05) no

decorrer das três gerações, tendendo a voltar ao mesmo tempo do grupo controle,

indicando que houve tolerância ao Tordon. Isto provavelmente é devido a um

processo de seleção natural, onde aqueles que se reproduzem conseguem

eliminar mais rapidamente os compostos herbicidas de seu organismo,

diminuindo seus efeitos tóxicos.

Esta nossa observação está de acordo com o trabalho de Schulze &

Dougherty (1988) que afirmam a ocorrência de desenvolvimento de tolerância ao

herbicida 2,4-D éster após dez dias de exposição.

Por outro lado, observou-se que cerca de 20% das fêmeas

acasaladas, nos dois grupos contaminados, não tiveram filhotes mesmo depois de

um longo período de acasalamento (26 dias) com vários machos. Estes dados

estão de acordo com os resultados de Guzelian (1982). Sendo que nenhuma das

fêmeas do grupo controle, acasalada por dez dias, deixou de ter filhotes.

Além disso, observou-se que a proporção sexual das ninhadas do

grupo controle foi diferente (p<0,05) da proporção obtida nas ninhadas dos grupos

contaminados.

68

Eroschenko (1978) apresentou resultados expressivos da ação do

herbicida organoclorado sobre a reprodução de pombas japonesas. Tais como

mudanças estruturais nos testículos e seus dutos seminíferos (testículos

aumentados com túbulos seminíferos dilatados e epitélio germinativo

severamente dilacerado e/ou testículos atrofiados com túbulos seminíferos

reduzidos e espermatogênese suprimida, onde o epitélio germinativo apresentava

espermatozóides anormais). Conclue o autor que, embora se observassem

reparações estruturais na maioria dos testículos e dutos de alguns animais,

"prejuízos permanentes verificados em testículos e dutos seminíferos" de outros

animais limitavam severamente, se não aboliam por completo, sua capacidade

reprodutiva.

Da mesma forma Lerda e Rizzi (1991), que usaram o teste YFF -

que identifica espermatozóides com dois cromossomos Y devido a não disjunção

meiótica, observaram níveis significantes de astenospermia (redução do número e

motilidade dos espermatozóides), necrospermia (espermatozóides mortos) e

teratospermia (espermatozóides anormais) em trabalhadores rurais que usavam o

herbicida. Embora a astenospermia e a necrospermia diminuíssem com o passar

do tempo, a quantidade de espermatozóides anormais permaneceu. Lembrando

que "a motilidade e a quantidade de espermatozóides normais (número de

espermatozóides por ml de ejaculado) são os dois melhores indicadores de

fertilidade, o último sendo um indicador de toxicidade espermatogênica em

humanos". As autoras demonstraram, assim, que o 2,4-D influencia nocivamente

a fertilidade em machos a partir de um efeito tóxico sobre o epitélio germinativo

que causa alterações na espermatogênese.

Guzelian (1982) estudando os efeitos do 2,4-D afirma que "em

animais de laboratório a função reprodutora bloqueada ou enfraquecida foi bem

documentada". Afirma , também, que em aves, o número e o tamanho dos ovos

se apresentou reduzido.

Vin' et al. (1990) afirmam que a administração crônica do 2,4-D em

ratas "aumenta a proporção de morte intra-uterina, principalmente por causa de

morte pós-implantacional de embriões".

Os dados observados no nosso grupo controle nos levaram a

proporção de 6 machos para cada 5 fêmeas, proporcionalmente diferentes

(p<0,05) entre si, enquanto que, nos grupos contaminados (T e TT) o número de

machos é estatisticamente igual ao número de fêmeas. Todos estes dados

levantados em relação à contaminação pelo Tordon nos leva a inferir que este

herbicida provavelmente ativa ou inativa algum fator seletivo em detrimento do

número de machos, ou a favor do número de fêmeas, nascidos vivos. Estes

69

resultados concordam com Cavalli-Sforza & Bodmer (1971) que descrevem que

as proporções sexuais obtidas em pássaros é diferente da proporção esperada de

1 macho para 1 fêmea, assim como observado também na espécie humana, onde

o número de meninos nascidos é maior do que o número de meninas.

Observando-se que morrem mais meninos durante o primeiro ano de vida e, não

havendo nenhuma guerra ou catástrofe, a proporção sexual tenda a se igualar em

idade adulta.

Em nossos experimentos também observamos que, nos grupos

contaminados, entre 6% e 15% dos filhotes morreram logo após o nascimento.

Dos quais mais da metade foram devorados por suas mães. Provavelmente

repetindo o gesto instintivo, facilmente observado em outras espécies, de devorar

ou deixar morrer os filhotes doentes ou não aptos.

Neste mesmo sentido, Guzelian (1982) observou que os animais

tratados com 2,4-D nascem com peso fetal menor e sua sobrevivência pós-parto

é reduzida e Blakley et al. (1989) observaram aumento da incidência de fetos

mortos/reabsorvidos e fetos mal formados.

Duas das fêmeas contaminadas (com dose de 0,1%) do grupo T

morreram. A primeira sem filhotes, a segunda uma semana após dar cria. Blakley

et al. (1989) e Chernoff et al. (1990) tiveram resultados semelhantes quando

investigaram a toxicidade maternal induzida quimicamente, pois verificaram que o

2,4-D reduz de maneira significante o peso maternal e produz mortalidade das

fêmeas que receberam o composto do 6o ao 15o dia de gestação.

Isto pode explicar porque algumas das fêmeas perderam peso a

ponto de deixar à mostra a coluna vertebral bem arqueada, como se estivessem

em constante posição de ataque, apresentando certa dificuldade de locomoção.

Phyllis et al. (1985) descrevem a diminuição "dramática" da atividade

locomotora espontânea causada pelo tratamento agudo com 2,4-D que diminui a

atividade da acetilcolinesterase (AChE) no botão sináptico, causando "latência

motora distal prolongada".

Outros autores (Goldstein et al., 1959; Dux et al., 1977; Guzelian,

1982; Pereira, 1991) documentam bem a ação do 2,4-D causando miopatias

graves a partir da inibição do potencial elétrico da membrana, diminuindo a

recaptação de Ca++ e aumentando sua concentração intracelular. Ou seja, o

músculo se contrai e, devido a ação direta do 2,4-D sobre a cadeia respiratória

(Pereira, 1991), a mitocôndria sem capacidade de manter os níveis normais de

recaptação de Ca++ (Guzelian, 1982) tem uma diminuição dos níveis de ATP, o

que impede a descontração das fibras musculares. Este processo é dependente

de Ca++ e ATP. Isto pode levar ao extremo de uma paralisia muscular (tetania)

70

seguida de morte (Berwick, 1970) ou apenas opistótonos (contração tetânica em

arco) momentâneos (Bucher, 1946).

Logo após o nascimento dos filhotes verificamos que o

desenvolvimento do S.N.C. foi prejudicado nos recém-nascidos do grupo

contaminado. Evidenciando que houve algum tipo de injúria a nível neural ou

muscular ocasionada pela contaminação com Tordon através do leite e/ou

placenta. Uma vez que os filhotes não têm contato direto com o herbicida em

nenhuma etapa de sua vida.

Estes resultados estão de acordo com Lagenbach (1989) que afirma

que os organoclorados "contaminam intensamente a carne, o leite e seus

derivados", bem como as gorduras animais que concentram alto teor de

organoclorados. Tudo isto poderia servir de contaminação para o ser humano no

período de gestação e amamentação, tal como em nosso experimento.

Muito embora, McCollister & Leng (1969) e Erne (1966) afirmem o

contrário quando dizem que nenhum resíduo do fenoxiherbicida Tordon pôde ser

detectado no leite, o próprio Erne (1966) conclue que houve pronta transferência

placentária em porcas.

Além disso, com um método de marcação radioativa (com 14C) Fang

et al. (1973) puderam detectar o picloram em fetos e no leite, concluindo que a

meia vida do herbicida em ratos adultos é de 3,4 hs e no recém-nascido é de 97

horas.

Com base neste dados, podemos afirmar que os filhotes são

realmente contaminados pela mãe através da placenta e do leite.

Embora a pronta transferência placentária tenha sido comprovada

(Erne, 1966; Guzelian, 1982), apenas a exposição pré-natal ao Tordon (Blakley et

al., 1989) ou a um de seus componentes (E. de Duffard et al., 1990 - 28) não é

considerada suficiente para causar algum prejuízo neurotóxico.

No entanto, efeitos permanentes do herbicida foram estabelecidos

durante a exposição pré- e pós-natal (E de Duffard et al., 1990 - 27). Por isso,

apesar de se considerar que o 2,4-D éster é lentamente absorvido pelo organismo

(Gering, 1973),seus efeitos fetotóxicos evidenciaram a vulnerabilidade do período

de desenvolvimento pré- e pós-natal, incluindo proliferação e desenvolvimento

das células que formam a mielina, pela redução desta bainha na medula espinhal,

cerebelo e tronco cerebral em pintainhos recém-eclodidos de ovos pré-tratados

com o herbicida (Duffard et al., 1987).

Nossos animais experimentais apresentaram uma curva de peso

corporal diferente da observada nos animais controle. Embora não significante,

esses animais nasceram e permaneceram com o peso levemente abaixo do

71

verificado no grupo controle até o 53o dia de idade. Daí em diante, os filhotes

machos do grupo contaminado apresentaram um peso corporal maior (p<0,05)

que os filhotes machos do grupo controle que tinham a mesma idade.

Considerando-se que a função gonadal se torna mais ativa ao redor

deste período, que seria o período de puberdade para o animal, estes resultados

sugerem uma deficiência gonadal nos animais contaminados durante gestação e

lactação. Ou seja, estes animais seriam hipogonádicos ou pseudo

gonadectomizados. O que justificaria o peso corporal aumentado, sendo que, com

o passar dos dias a diferença entre os dois grupos tornou-se maior (p<0,01).

Entretanto, Bucher (1946) já tinha observado um leve retardo no

crescimento de ratos jovens e associou este fato a redução da ingestão de

alimento.

Ratos tratados com 2,4-D apresentam um decréscimo na

capacidade reprodutiva quando adultos (Guzelian, 1982) e a presença de

testosterona é importante para que se evidenciem os efeitos tóxicos do 2,4-D

éster (E. de Duffard et al., 1990 - 28).

Há também relatos na literatura ligando o 2,4-D a tumores cerebrais

somente em ratos e não em ratas (Reis, 1991). Isto mostra um efeito associativo

da testosterona e a toxicidade do Tordon.

Outros efeitos tóxicos foram observados no nível dos

neurotransmissores. St. Omer & Mohammad (1987) observaram níveis

aumentados de dopamina (DA) e nor-epinifrina (NE) no período pós-natal de ratos

contaminados, em relação aos controles.

Do mesmo modo, foram encontradas altas concentrações cerebrais

de serotonina (5-HT) e do ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA) em ratos adultos

nascidos de mães tratadas com 2,4-D éster durante gestação e lactação (E. de

Duffard et al., 1990 - 27). Sabe-se que este período de contaminação produz,

segundo os autores, efeitos permanentes nos animais.

Um dos efeitos permanentes observados em nossos animais

experimentais foi o aumento da motricidade. Sabe-se que todo animal novo

movimenta-se mais do que o adulto da mesma espécie. Entretanto, nosso

animais experimentais não só movimentavam-se mais quando jovens, em relação

aos controles da mesma idade, como movimentavam-se mais quando adultos do

que quando jovens. Dado este sustentado, também, pelo maior número de

cruzamentos inter-provas observados do teste de esquiva ativa.

Mohammad & St. Omer (1988) descrevem a ação do Tordon

mudando os níveis cerebrais de glutamato, proteínas, ácidos nucleicos e GABA

(ácido gama-aminobutírico). Estes autores afirmam que os herbicidas

72

organoclorados são potentes inibidores competitivos estéreo-específicos do t-

butilbiciclofosforotionato (TBPS), indicando interferência no sistema gabaérgico

que regula o canal de cloro (Lawrence & Casida, 1984).

Os autores acima concluem que as maiores classes de herbicidas

organoclorados agem de maneira similar, "isto é, como antagonistas não

competitivos do GABA-A", sendo esta sua base de ação convulsivante (sistema

neuromuscular) em mamíferos.

A função muscular e o sistema de equilíbrio são bem evidenciados

no teste do "Rota-Rod". Em nossos animais experimentais não se observou

diferença significante no tempo de permanência no "Rota-Rod" em relação aos

controles, aos 40 e aos 90 dias de idade. Os mesmos resultados foram

encontrados por Schulze & Dougherty (1988). Sugerindo com isso que não houve

alteração muscular ou de equilíbrio. No entanto, o teste de movimentação

expontânea mostrou que há exacerbação da movimentação nos animais

contaminados maternalmente. Isto indica que áreas do S.N.C., que não as do

equilíbrio, podem estar alteradas.

Já em ambiente aversivo, no teste do "Open-Field", os animais

contaminados através das mães tiveram a sua atividade locomotora deprimida,

aumentando o tempo parado (que nestes animais pareceu mais ser

catatonia/apatia do que medo ou pavor). Resultados semelhantes aos

encontrados por Schulze (1987 e 1988) e Schulze & Dougherty (1988).

Todos os parâmetros observados no "Open-Field" que tiveram

resultados estatisticamente diferentes (p<0,05) revelaram detrimento da atuação

os animais contaminados. Tais como, ambulação diminuída, "freezing"

aumentado e "rearing" diminuído, indicando que estes animais exploraram menos

o ambiente, bem como, tempo de "grooming" aumentado indicando que estes

animais têm uma reação emocional aumentada. Todos estes resultados sugerem

que a contaminação pelo Tordon produz uma reatividade emocional mais intensa

que o observado nos animais controle, embora, o número de bolos fecais e a

porcentagem de micção dos animais contaminados tenham sido considerados

estatisticamente iguais ao observado nos animais controle.

Oliveira & Pallermo Neto (1993) obtiveram resultados semelhantes

com a administração oral aguda de 2,4-D em ratos. Este tratamento foi suficiente

para diminuir a locomoção e freqüência de "rearings", bem como para aumentar a

duração da imobilidade. Estes resultados são iguais aos encontrados em nosso

experimento, os quais se mantêm na idade adulta dos animais contaminados.

Os autores acima verificaram ainda que o herbicida diminuiu os

níveis estriatais de 5-HT (resultados contrários aos encontrados por E. de Duffard

73

et al., 1990-27, em ratos adultos contaminados pela mãe) e aumentou os níveis

do 5-HIAA estriatal e do tronco cerebral (resultados semelhantes aos encontrados

por E. de Duffard et al., 1990-27, em ratos adultos contaminados pela mãe).

No teste do "Plus-Maze" observou-se que os animais contaminados,

através da mãe, permaneceram mais tempo no braço aberto (%TA), embora

tenham entrado o mesmo número de vezes que os animais controle. Isto nos leva

a levantar duas hipótese : ou os animais contaminados são menos medrosos (ou

ansiosos) na situação do "Plus-Maze" ou estes animais têm um prejuízo da

percepção dos estímulos deste teste. Esta segunda hipótese se baseia no fato de

que o animal nascido de mãe contaminada não só entra no braço aberto e

permanece mais tempo lá, como também chega até a borda do braço aberto, olha

para baixo, continua andando e cai. Isto poderia estar relacionado ao fato deste

mesmo animal apresentar menor atividade exploratória ("rearing") no "Open-

Field".

No teste de esquiva ativa nossos animais experimentais

apresentaram o mesmo desempenho que os controles. Sua orientação também

apresentou-se normal.

Embora, estes resultados indiquem aparente normalidade, nossos

animais experimentais mostraram uma tendência de menor desempenho na

aquisição e retenção da aprendizagem na esquiva ativa. Por outro lado,

apresentavam maior ambulação (CIP), cruzando a caixa na ausência de

estímulos externos, indicando claramente que há prejuízo a nível de S.N.C. (nos

processos de inibição comportamental, que permitiriam ao animal estabelecer

associação entre os estímulos da esquiva ativa). Este prejuízo se expressa na

vida adulta dos animais, embora sua contaminação tenha ocorrido apenas

durante o desenvolvimento embrionário e na lactação.

Tyynela et al. (1990) conseguiram verificar, por marcação do

herbicida com 14C, que os dois compostos que compõem o Tordon (2,4-D e

picloram) realmente atravessam a barreira hemato-encefálica por difusão (e

outros mecanismos ainda não elucidados) e se distribuem de maneira semelhante

no cérebro. Isto reforça a nossa hipótese de prejuízo cerebral nos animais

contaminados.

Sabe-se que o Tordon é lipossolúvel em concentrações baixas e

solubiliza-se em pH 7.0 (Profa. Dra. Orieta Silveira). A concentração utilizada em

nosso experimento é baixa (0,1%).

Baker (1984) observou a interação dos organoclorados com a

proteína heme do sangue. Elo et al. (1988) chegaram a verificar injúria cérebro-

vascular causada pelo 2,4-D.

74

Com isso, e apesar de ser considerada restrita a infiltração do

herbicida no tecido adiposo e dentro do S.N.C. (Erne, 1966), Lagenbach (1989)

encontrou alto teor de organoclorados no tecido adiposo animal. Lembrando, que

a bainha de mielina é formada essencialmente por várias camadas sobrepostas

da bicamada lipídica que forma a membrana celular.

Isto sugere que há saturação do composto dentro dos tecidos e

concorda com os resultados obtidos sobre as mudanças ocorridas na

permeabilidade e fluidez da membrana plasmática (Pritchard et al., 1982 e Videla

et al., 1990), onde a interação dos pesticidas organoclorados (Antunes-Madeira et

al., 1981) com a bicamada lipídica podem formar radicais livres, intermediários

que ligando-se a lipídeos ou proteínas interfeririam na fluidez da membrana

(Baker & Dyke, 1984; Baker et al., 1985 e Videla et al., 1990).

Esta mudança de fluidez e permeabilidade inibe o transporte de

elétrons (Pritchard et al.,1982) e promove a perda da capacidade que a

mitocôndria tem de manter níveis normais de recaptação de Ca++ (Dux et al.,

1977 e Guzelian, 1982) pela inibição de um passo no processo de produção de

energia mitocondrial (Pereira, 1991). Assim, há menos energia disponível para as

atividades comuns a cada tipo de célula.

Um neurônio que apresente um aumento de Ca++ citoplasmático

teria despolarização da membrana neuronal, promovendo desligamento de

neurotransmissores (Guzelian, 1982). Tendo diminuída sua ATPase mitocondrial

haveria menor quantidade de energia disponível para a recaptação de

neurotransmissores. Em conseqüência, a quantidade e freqüência do potencial

sináptico ficariam alteradas, se não bloqueassem o próprio potencial de ação.

A toxicidade neuromuscular do 2,4-D é primariamente pós-juncional

por natureza (Guzelian, 1982). Uma vez que é a recaptação dos

neurotransmissores que está diminuída ou inibida, causando "diminuição da

AChE no botão sináptico" (Bernard et al., 1985) e aumento de sua concentração

na placa motora, torna-se evidente que as mudanças eletrofisiológicas levem a

mudanças comportamentais.

Hrdina et al. (1971) acreditam que os efeitos neurotóxicos dos

herbicidas organoclorados envolvem mecanismos colinérgicos do núcleo estriado.

A acetilcolina (ACh) é secretada entre outros pelos motoneurônios que inervam os

músculos esqueléticos, tendo geralmente efeito excitatório. Isto explicaria a

movimentação exagerada do animal contaminado maternalmente.

Além de afetar o sistema colinérgico, outros autores sugerem

interferência na ação de neurônios dopaminérgicos e serotonérgicos (Elo &

MacDonald, 1989;), bem como modificação na maturação do sistema

75

serotonérgico (E. de Duffard et al., 1990 - 27). Isto está de acordo com os

resultados que obtivemos da observação dos filhotes contaminados que

apresentaram retardo no desenvolvimento pós-natal do S.N.C., atividade

neuromuscular aumentada no correr do seu desenvolvimento e percepção

alterada para vários estímulos em idade adulta.

A recaptação do 2,4-D em neo-natos ocorre contra um gradiente de

concentração (Kim et al., 1983), portanto com gasto de energia (que já está

debilitada), causando saturação do composto nos tecidos fetais incluindo o

cérebro (Kim et al., 1983; Schulze & Dougherty, 1988 e E de Duffard et al., 1990 -

27). O 2,4-D inibe o transporte ácido orgânico para fora do cérebro (Elo &

MacDonald, 1989) e isto pode explicar o aumento da concentração de alguns

neurotransmissores e seus metabólitos.

De acordo com Gonzalez et al.(1994) serotonina e testosterona

têm efeito oposto sobre o comportamento sexual em machos. Se isto realmente

ocorre pode-se inferir que o aumento da 5-HT em ratos adultos contaminados, na

vida intra-uterina e na lactação, diminua a ação da testosterona, e estes animais

passem a apresentar comportamento de animal gonadectomizado (castrado). Isto

explica o aumento de peso iniciado na fase de puberdade nos nossos animais

experimentais, persistindo na idade adulta.

Apesar de todo comportamento alterado, o animal contaminado

apresentou, a nível morfológico, espermatogênese quantitativamente normal. No

entanto, sabemos que, qualitativamente, sua espermatogênese está modificada,

possivelmente apresentando alto nível de teratospermia (produção de

espermatozóide anormal), descrita por Lerda & Rizzi (1991), uma vez que se

verificou alteração no processo reprodutivo destes animais.

Da mesma forma, o tecido nervoso não apresentou alterações

estruturais, quando corado com H.E. e quando impregnado por prata (ao M.O.),

que justificassem as reações do animal contaminado nos testes comportamentais.

Entretanto, se as alterações funcionais observadas a nível de

sistema nervoso e sistema reprodutor não causaram alterações morfológicas que

pudessem ser evidenciadas pelas técnicas por nós utilizadas para microscópio de

luz, outras técnicas mais específicas podem, possivelmente, vir a evidenciar as

alterações funcionais já descritas.

Assim, apesar de alguns autores acharem que o Tordon e/ou seus

componentes apresentam baixa (McCollister & Leng, 1969; Berndt &

Koschier,1973 e Hayes et al., 1986) ou nenhuma (John-Greene et al., 1985)

toxicidade, inclusive embriológica, os nossos dados mostram que os efeitos deste

herbicida podem ser devastadores. Tendo deprimido o medo ou a função do

76

sistema de inibição comportamental, o animal pode colocar-se em situação de

risco diminuindo as possibilidades de sobrevivência no próprio habitat.

O tratamento de extensas terras, ou de campos cortados por

pequenos veios, com dosagens efetivas do herbicida Tordon, além de contaminar

o solo por até 5 anos, polui toda a água que através da chuva, ou outro veículo,

entre em contato com o agrotóxico. E, mesmo doses sub-crônicas (0,1%)

dissolvidas na água que serve aos seres vivos que habitam esta área, ou ao seu

redor, são capazes de provocar efeitos neurotóxicos permanentes em seus

descendentes.

Por isso, sabemos que a dita lei de 1979, como tantas outras, não

impediu que interesses escusos de grandes companhias fizessem, mais uma vez,

com que nosso país servisse de aterro público ao "lixo" proibido em seu país de

origem, bem como não impediu que o não menos aviltante desinteresse das

chamadas "autoridades competentes" se fizesse presente.

Quando há interesse as pessoas são informadas e pela educação

inteligente a população evitaria um número enorme de acidentes de saúde, de

alimentação e outros. Com certeza não envenenaria aquilo que é básico para sua

sobrevivência neste planeta.

77

78

6. CONCLUSÃO

Verificando os efeitos do herbicida Tordon em filhotes de mães

contaminadas, podemos concluir que:

1. Nosso trabalho sugere que o herbicida atravessa a barreira

placentária e a barreira hemato-encefálica.

2. A contaminação reduz o número de ninhadas e o tempo de

sobrevida dos filhotes.

3. Os filhotes nascem significativamente mais tardiamente (p<0,01)

que os controles.

4. Por motivo ainda não elucidado, há um detrimento no número de

machos ou um favorecimento no número de fêmeas que nascem

de mães contaminadas.

5. Os descendentes de mães contaminadas são realmente

contaminados.

6. O desenvolvimento do S.N.C. é significativamente mais lento.

7. A contaminação através da mãe produz efeitos neurotóxicos

observados durante toda a vida do animal.

8. Em ambiente novo, uma situação considerada aversiva, há um

prejuízo da atividade exploratória do animal contaminado.

9. Apesar de se movimentar muito mais do que quando jovem,

contrariamente ao controle, o animal contaminado através da

mãe apresenta um aumento significativo em seu peso corporal,

causado, possivelmente, por uma deficiência no sistema

reprodutor que é reflexo do retardo na maturação ou mau

funcionamento do S.N.C.

79

10. O sistema de equilíbrio, dentro do S.N.C., não parece ter sido

afetado pelo Tordon.

11. Os filhotes, aparentemente, não percebem as situações de

perigo, e podem colocar-se em situação de risco.

12. A falta de "medo" deveria aumentar sua capacidade de

aprendizagem, pois o animal estaria menos "ansioso", no entanto

observou-se que o animal contaminado tem uma capacidade de

retenção de aprendizagem levemente inferior ao observado no

controle. Evidenciando uma tendência de prejuízo em nível de

S.N.C., nos processos envolvidos na aquisição e consolidação da

memória.

13. Aparentemente não houve alteração, a nível morfológico, dos

tecidos que apresentaram alteração funcional, tais como

testículo, epidídimo e cérebro.

Por isso, podemos afirmar que os filhos de mães contaminadas por

TORDON, além de serem realmente contaminados, apresentam prejuízo

permanente em nível de S.N.C. que se reflete no sistema neuromuscular e no

sistema reprodutor do animal.

80

81

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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