Teste hipocrático do óleo essencial de citronela

Teste hipocrático do óleo essencial de citronela

(Cymbopogon sp. Spreng, 1815) e avaliação in vitro do efeito

larvicida do geraniol e citronelal sobre Contracaecum sp.

Railliet & Henry, 1912 (Nematoda: Anisakidae).

ANDREIA RIZZIERI YAMANAKA

Dissertação apresentada ao curso de mestrado em

Ciências da Saúde da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Federal de Mato Grosso

para obtenção do Grau de Mestre.

Área de concentração: Enfermidades Infecciosas e Tropicais

ORIENTADOR: PROF. DR. LUCIANO ANTUNES BARROS

Cuiabá, MT

2008

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Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução

total ou parcial desta dissertação, por processos foto copiadores.

Assinatura:

Data:



A todos os professores, mestres pela

vocação, que buscam o aperfeiçoamento

contínuo objetivando a formação profissional

e moral dos seus alunos!



Agradecimentos

A Deus por permitir que nessa existência eu tenha o prazer da busca

e transmissão do conhecimento;

Ao meu esposo, Dimas Yamanaka, que acompanha e incentiva os

meus sonhos desde a Faculdade sempre com total doação. Meu amor sem

você à vida não teria graça, Eu te amo!!;

Aos meus filhos, Fernanda (Fê) e Arthur (Tui) por quem tudo vale a

pena, pela ausência e falta de paciência dispensada nesses dois anos de

estudo, Mamãe ama vocês!!;

Aos meus sogros, Jorge e Bernadeth, pelo amor incondicional e

presença contínua nas vidas dos seus netos, pois sem suas participações

muitas aulas e estudos não seriam possíveis;

À minha mãe, Ilda, e aos meus irmãos, Eduardo, Marcelo e Adriana

que estão sempre presentes na minha vida, Amo vocês!!,

Ao meu orientador, Prof. Dr. Luciano A. Barros, me orientando

novamente com dedicação e paciência e contribuindo com a minha

formação ética e profissional;

Ao Dr. Lázaro Manoel de Camargo, por tornar este mestrado possível,

flexibilizando meus horários e afazeres profissionais;

Ao Prof. Dr. Edson Moleta Colodel, pela assistência constante na

histopatologia, que mesmo estando muito ocupado, conseguiu

disponibilidade para a realização desse trabalho;

À Profa. Dr. Maria Luzinete A. Vanzeler pela participação ativa em

todas as etapas do experimento;

Ao Dr. Luiz Everson Silva que contribuiu na etapa metodológica desse

trabalho estando sempre à disposição quando solicitado;

Aos professores do Curso de Pós-graduação em Ciências da Saúde

pela contribuição teórica necessária para que esse trabalho fosse realizado

e que também será útil na minha vida profissional;

Ao Prof. Dr. Joadil Gonçalves de Abreu pela contribuição na análise

dos dados obtidos;



Ao Biotério do Hospital Veterinário da UNIC, por ter fornecido os

animais para este experimento;

Ao técnico do laboratório de Farmacologia da UNIC, Adonel Pacheco

de Almeida, pela contribuição na realização do teste hipocrático;

Às amigas Elaine de Arruda Campos e Rosymeire da Silva, pelo

auxílio no inglês gramatical;

Aos discentes Dionatan Tatieri Braum e Jhonatan Bonaldo, pelo

auxilio nas necropsias das traíras e coleta das larvas durante o experimento;

À todos que contribuíram, direta e indiretamente, para que esta etapa

tão importante na minha vida profissional se concretizasse o meu muito

obrigado!!!!



RESUMO

Yamanaka AR. Teste hipocrático do óleo essencial de citronela (Cymbopogon sp. Spreng, 1815) e avaliação in vitro do efeito larvicida do geraniol e citronelal sobre Contracaecum sp. Railliet & Henry, 1912

(Nematoda: Anisakidae). Cuiabá; 2008. [Dissertação – Faculdade de

Ciências Médicas da UFMT] A infecção do homem com parasitos de peixes pode ocorrer a partir da

ingestão de pescado cru ou mal cozido, promovendo a ocorrência de

doenças parasitárias entre as quais destaca-se a anisaquiose que é causada

por parasitos da família Anisakidae. No Brasil há uma ocorrência maior do

gênero Contracaecum, no entanto nenhum caso humano ainda foi relatado

para essa parasitose, provavelmente pela falta de diagnóstico adequado e

não pela ausência da doença no país. Devido ao crescente uso de plantas

medicinais e compostos monoterpênicos no controle parasitário, objetivou-se

avaliar o efeito larvicida in vitro de dois compostos monoterpênicos, o

geraniol e o citronelal sobre Contracaecum sp. e o possível efeito tóxico do

óleo essencial de citronela (Cymbopogon sp.) em camundongos (Mus

musculus) através do teste de toxicidade aguda, visto que esse óleo tem

como principais constituintes compostos monoterpênicos. Foram utilizadas

quatrocentas larvas vivas de Contracaecum sp., obtidas de traíras (Hoplias

malabaricus, Bloch, 1794) mantidas em placas de petri com os compostos a

serem testados (geraniol e citronelal). As concentrações finais testadas, para

cada composto, foram de 250, 125, 62,5 e 31,2μg/ml e a avaliação realizada

em cinco tempos diferentes (2, 4, 8, 24 e 48 horas). As larvas mortas foram

processadas e avaliadas histopatologicamente. O teste de toxicidade aguda

(teste hipocrático), foi realizado com doze camundongos e estes foram

submetidos a gavagem orogástrica com óleo essencial de citronela nas

seguintes doses: 3033,33mg/Kg, 1516,66mg/Kg, 758,33mg/Kg, além do

grupo controle que recebeu óleo vegetal. Foram observados os efeitos

comportamentais resultantes de possíveis ações estimulante ou depressora

do Sistema Nervoso Central e ao final do teste os animais foram sacrificados



e seus órgãos submetidos a exame histopatológico. A ação larvicida do

geraniol, nas concentrações de 250μg/ml e 31,2 μg/ml e do citronelal, nas

concentrações de250μg/ml, 125μg/ml e 62,5μg/ml, apresentou diferença

estatisticamente significante (p<0,005) quando comparada ao controle

(etanol 1%). Quando comparou-se a ação larvicida do geraniol em relação

ao citronelal, o primeiro apresentou diferença estatisticamente significante

(p<0,05) ao segundo nas concentrações de 250μg/ml e 31,2 μg/ml. Por

outro lado o citronelal apresentou diferença estatisticamente significante

(p<0,005) ao geraniol nas concentrações de 125μg/ml e 62,5μg/ml. A

equação estimada da taxa de mortalidade das larvas em função do tempo

(horas), mostrou maior ação larvicida do geraniol com o passar do tempo na

concentração de 250μg/ml. O dano histológico observado nas larvas

submetidas ao geraniol foi o descolamento cuticular. Nas larvas submetidas

ao citronelal foi observado ruptura cuticular e ductos excretores

entumecidos. Dos camundongos submetidos ao teste hipocrático apenas

um, que recebeu a dose de 3033,33mg/Kg, apresentou aumento de

motilidade e não houve nenhuma morte no final dos 14 dias. O exame

histopatológico não mostrou alterações nos órgãos examinados. Os

compostos monoterpênicos apresentaram ação larvicida in vitro sobre

Contracaecum sp. e isto sugere que o uso do óleo essencial de citronela é

eficaz para tratamento de anisaquiose, pois o mesmo não apresenta

toxicidade aguda, porém análises in vivo e determinação do mecanismo de

ação do geraniol e citronelal ainda devem ser investigados.

Descritores: geraniol; citronelal; larvicida; Contracaecum sp., teste

hipocrático



SUMMARY

Yamanaka AR. Hippocratic test of citronela essential oil (Cymbopogon

sp. Spreng, 1815) and in vitro evaluation of the larvicidal effect of the geraniol and citronellal upon Contracaecum sp. Railliet & Henry, 1912

(Nematoda: Anisakidae). Cuiabá; 2008. [Master Dissertation – Faculdade

de Ciências Médicas da UFMT] Man’s infection with fish parasites can occur after raw or uncooked fishes,

causing a parasitic disease among which the most important is anisaquiosis

that is caused by parasites of the Anisakidae family. In Brazil there is a big

incidence of the gender Contracaecum sp., however, no other human case

has been reported for this parasitosis, probably due to lack of an adequate

diagnosis and not for the absence of the disease in the country. Because of

the increasing number of medicinal plants and monoterpene compounds in

the parasitic control we aimed at evaluating the in vitro larvicidal effect of the

two monoterpene compounds, the geraniol and the citronellal upon

Contracaecum sp. and the possible toxic effect of the citronella essential oil

(Cymbopogon sp.) in mice (Mus musculus) through the acute toxicity test,

since this oil has as the main components monoterpene compounds. Four

hundred live larvae of Contracaecum sp. were used, obtained from the fish

called traíra (Hoplias malabaricus, Bloch, 1794) maintained in Petri’s plate

with the compounds to be tested (geraniol e citronellal). The final

concentrations tested for each compound, were of 250, 125, 62,5 and

31,2μg/ml and the evaluation was carried out in five different times (2, 4, 8,

24 and 48 hours). The dead larvae were processed and evaluated

histopalogically. The acute toxicity test (hippocratic test), was performed with

twelve mice and these one were submitted to orogastric gavage with the

citronela essential oil in the following doses: 3033,33mg/Kg, 1516,66mg/Kg,

758,33mg/Kg, and the control groupreceived vegetable oil. The behavioral

effects resulting from possible actions stimulating or depressing of the



Central Nervous System were observed and at the end of the test the

animals were sacrificed and their organs submitted to histopatological exam.

The larvicidal action of geraniol, at the concentrations of 250 μg/ml and 31,2

μg/ml and citronelal, at the concentrations of 250 μg/ml, 125 μg/ml and 62,5

μg/ml, showed a difference significant statistically (p <0005) compared the

control (1% ethanol). When compared the larvicidal action between geraniol

and citronelal, the first one presented difference significant statistically (p

<0,05) at the concentrations of 250 μg/ml and 31,2 μg/ml. On the other hand,

the citronelal showed a significance statistically different (p <0005) to the

geraniol at concentrations of 125 μg/ml and 62,5 μg/ml. The estimated

equation of the mortality rate of the larvae in relation to time (hours), showed

a higher larvicidal activity of the geraniol with the passing of time in the

concentration of 250μg/ml. The histological damage observed in the larvae

submitted to the geraniol was of cuticular displacement and in the larvae

submitted to the citronellal were also observed the cuticular rupture and

swallowed excretory ducts. The mices submitted to the hippocratic test only

one, which received the dose of 3033,33mg/Kg, presented an increase of

motility and there was no death at the end of the 14 days. The

histopatological exam did not show any alteration in the organs that were

examined. The monoterpene compounds presented in vitro larvicidal activity

upon Contracaecum sp. and we may suggest the use of the citronella

essential oil for the treatment of anisaquiose because it does not present

acute toxicity, yet, in vivo analyses and the determination of the activity

mechanism of the geraniol and citronellal should still be researched.

Key words: geraniol; citronellal; larvicide; Contracaecum sp., hippocratic test



ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura química do praziquantel .............................................. 05

Figura 2 – Estrutura química do geraniol ..................................................... 15

Figura 3 – Estrutura química do citronelal ................................................... 16

Figura 4 – Espécimes de traíra (Hoplias malabaricus) capturados do rio

Mimoso, município de Santo Antônio de Leverger-MT, em

setembro de 2007 ........................................................................ 17

Figura 5 –Mapa de localização do município de Santo Antônio do Leverger,

estado de Mato Grosso, Brasil, local de captura das espécimes de

traíras.. ......................................................................................... 17

Figura 6 – Recepção de espécimes de traíra (Hoplias malabaricus) no

laboratório de Parasitologia - UFMT ........................................ ... 18

Figura 7 – Larva de Contracaecum sp. na cavidade celomática de um

espécime de traíra (Hoplias malabaricus). ................................... 19

Figura 8 – Camundongos (Mus musculus) identificados e acondicionados

em gaiolas de polipropileno para realização de teste hipocrático

.................................................................................................... .22

Figura 9 - Camundongo (Mus musculus) sendo submetido a gavagem

orogástrica com óleo essencial de citronela (Cymbopogon sp.) .. 23

Figura 10 – Representação esquemática do teste hipocrático do óleo

essencial de citronela, utilizando camundongos (Mus musculus)..

..................................................................................................... 25

Figura 11 - Corte transversal de larva de Contracaecum sp., larva controle,

corados por hematoxilina-eosina (barra=10μm) ........................... 28

Figura 12 - Corte transversal de larva de Contracaecum sp., exposta ao

composto monoterpênico geraniol, demonstrado descolamento da

cutícula, corados por hematoxilina-eosina (barra=30μm) ............ 28 Figura 13 - Corte transversal de larva de Contracaecum sp., exposta ao

composto monoterpênico citronelal, demonstrando ruptura

cuticular, corados por hematoxilina-eosina (barra=10μm) ........... 29



Figura 14 - Corte transversal de larva de Contracaecum sp., exposta ao

composto monoterpênico citronelal, demonstrando ductos

excretores entumecidos, corados por hematoxilina-eosina

(barra=50μm) ............................................................................... 29

Figura 15 - Corte histológico do sistema nervoso central de camundongo

(Mus musculus) sem alterações histológicas, corado por

hematoxilina-eosina.(barra =20μm) ............................................. 30

Figura 16 – Corte histológico do pulmão de camundongo (Mus musculus)

sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-

eosina.(barra =100μm) ................................................................. 31

Figura 17 - Corte histológico do coração de camundongo (Mus musculus)

sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina.(barra =20μm ). ................................................................. 31

Figura 18 – Corte histológico do baço de camundongo (Mus musculus) sem

alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina.(barra

=100μm) ....................................................................................... 32

Figura 19 - Corte histológico do fígado de camundongo (Mus musculus) sem

alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina.(barra

=100μm) ....................................................................................... 32

Figura 20 – Corte histológico do intestino de camundongo (Mus musculus)

sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-

eosina.(barra =20μm) ................................................................... 33

Figura 21 – Corte histológico do estômago de camundongo (Mus musculus)

sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina.(barra

=200 μm )......................................................................................33

Figura 22 – Corte histológico do osso (fêmur) de camundongo (Mus

musculus) sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-

eosina.(barra =200μm ).................................................................34 Figura 23 – Corte histológico do rim de camundongo (Mus musculus) sem

alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina.(barra =20

μm)................................................................................................34



ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Avaliação in vitro da atividade larvicida do Geraniol e Citronelal

contra Contracaecum sp. (Nematoda:Anisakidae)..................... 26

Tabela 2 – Taxa de mortalidade real e estimada de larvas de Contracaecum

sp.em função do tempo quando utilizado geraniol a 250 μg/ml in

vitro. ....................................................................................... ....27



13

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO............................................................................................1

2. REVISÁO DA LITERATURA.......................................................................3

2.1 PRINCIPAIS ZOONOSES PARASITÁRIAS TRANSMITIDAS POR PESCADO...........3

2.2 PARASITOS DA FAMÍLIA ANISAKIDAE: TAXONOMIA, CICLO BIOLÓGICO,

PATOGENIA, SINAIS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO............................................6

2.3 USO DE PLANTAS MEDICINAIS E COMPOSTOS MONOTERPÊNICOS NO

CONTROLE

PARASITÁRIO..........................................................................................9

3. OBJETIVOS..............................................................................................14

3.1 OBJETIVOS GERAIS 14

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14

4. MATERIAL E MÉTODOS 15

4.1 AVALIAÇÃO IN VITRO DO EFEITO LARVICIDA DE COMPOSTOS

MONOTERPÊNICOS SOBRE CONTRACAECUM SP. 15

4.1.1 Compostos monoterpênicos 15

4.1.2 Espécie de peixe utilizada para a obtenção de larvas de

Contracaecum sp. 16

4.1.3 Captura e necropsia dos peixes 18

4.1.4 Avaliação e identificação das larvas 19

4.1.5 Diluição dos compostos monoterpênicos e distribuição dos

grupos.20

4.1.6 Avaliação in

vitro................................................................................20

4.2 TESTE HIPOCRÁTICO DA CITRONELA (CYMBOPOGON SP., SPRENG, 1815) 21

4.2.1 Óleo essencial de Citronela 21

4.2.2 Animais utilizados no experimento 22

4.2.3 Determinação da toxicidade aguda (Teste hipocrático) 23



14

5. RESULTADOS 26

5.1 AVALIAÇÃO IN VITRO 26

5.1.2 DANOS HISTOLÓGICOS NAS LARVAS MORTAS SOB AÇÃO DOS COMPOSTOS

MONOTERPÊNICOS 27

5.2 EFEITOS GERAIS COMPORTAMENTAIS E TÓXICOS DA CITRONELA MEDIANTE

TESTE HIPOCRÁTICO 30

6. DISCUSSÃO 35

7. CONCLUSÕES 38

8. REFERÊNCIAS 39

ANEXO 1: Yamanaka AR, Silva LE, Barros LA. In Vitro Test of the larvicidal

activity of the Geraniol and Citronellal against Contracaecum sp. (Raillet &

Henry, 1912) (Nematoda: Anisakidae). Phytother Res 2007; (No

prelo)........................................................... A-1

ANEXO 2: Tabela de Malone …………………………………………………. ... A-7



15

1 INTRODUÇÃO

O pescado é uma fonte alimentar de fácil digestão, rico em

aminoácidos não sintetizados e necessários para o organismo, além de ser

abundante em vitaminas e sais minerais. Entretanto a população mundial

torna-se cada vez mais dependente da cultura artificial de peixes, uma vez

que os estoques naturais dos mesmos estão reduzindo gradativamente,

devido à pesca predatória e aos impactos ambientais decorrentes do

desenvolvimento humano. Vários fatores causam doença e morte dos

peixes, fatores esses que podem ser potencializados em criações intensivas

(pisciculturas), devido à restrição do espaço físico e a não ocorrência dos

agentes controladores naturais. Dentre esses fatores estão as doenças

parasitárias que além de trazer prejuízos econômicos podem causar danos à

saúde humana, pois muitas delas possuem caráter zoonótico.

De acordo com Germano (1998) citado por SOUZA (2003, p.11),

diversas populações no mundo, situadas particularmente nos países

subdesenvolvidos, tem sua sobrevivência altamente dependente do

pescado. No entanto o consumo per capita é muito maior nos países

desenvolvidos, sendo crescente a procura por uma alimentação mais

saudável pelas populações de média e alta renda. Para as populações de

baixa renda, é observado um consumo maior nas regiões ribeirinhas ou

litorâneas.

A infecção do homem com parasitos de peixes pode ocorrer a partir

da ingestão de pescado cru ou mal cozido. Dentre as doenças parasitárias

podemos destacar a anisaquiose que é uma doença causada por parasitas

da família Anisakidae, sendo o Anisakis simplex a espécie com maior

número de relato de casos em diferentes países (LITTLE e MACPHAIL

1972; OSHIMA 1987; CABRERA et. al 2004; SZOSTAKOWSKA et. al 2005).

Sua sintomatologia varia desde quadros alérgicos até crises de dores

epigástricas e obstrução intestinal. O diagnóstico e tratamento são baseados

principalmente na visualização e extirpação das larvas da mucosa



16

gastroentérica através do uso da endoscopia (DÓI et. al 1989; TAKABE et. al

1998; MUGURUMA et. al 1999; ESTEVE et. al 2000; GOMEZ et. al 2003;

PETITHORY 2007). No Brasil há uma ocorrência maior de Contracaecum sp. parasitando

peixes em relação a Anisakis sp., ambos da família Anisakidae (MARTINS

et. al 2005; PRADO e CAPUANO 2006), fato observado também no estado

de Mato Grosso (BARROS et. al 2006; BARROS et. al 2007).

Apesar da infecção experimental em coelhos e gatos domésticos

(VIDAL-MARTINEZ et. al 1994; BARROS et. al 2004), nenhum caso humano

foi relatado dessa parasitose, provavelmente devido à falta de diagnóstico e

não à ausência da doença no país (OKUMURA et. al 1999).

A infecção por parasitos da família Anisakidae é ainda de difícil

diagnóstico e pouco se sabe sobre as possibilidades de tratamento,

constituindo um bom campo para investigação científica.

O uso de plantas medicinais com a finalidade de realizar o controle de

helmintos tem aumentado nos últimos anos, devido principalmente à

resistência parasitária dos produtos comercializados e o crescente uso de

produtos ecologicamente mais seguros. Compostos monoterpênicos foram

testados por HIERRO et. al (2004), contra helmintos da família Anisakidae

demonstrando uma boa ação larvicida. No entanto a preocupação com

intoxicações também é pertinente no uso dessas substâncias in vivo.

A preocupação com as doenças zoonóticas parasitárias transmitidas

por peixes e a necessidade de buscar procedimentos terapêuticos seguros

para o controle destas zoonoses, são os principais motivos que justificam

este trabalho.



17

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Principais zoonoses parasitárias transmitidas por pescado

As zoonoses parasitárias transmitidas por pescado ocorrem devido ao

consumo de pescado cru ou mal cozido. O aumento do intercâmbio de

viajantes para o Sudeste Asiático, a importação de alimentos daquela região

e a “moda” de pratos como o sushi e sashimi tem aumentado a ocorrência

dessas doenças de difícil diagnóstico e tratamento. Podemos citar como

principais zoonoses a anisaquiose, a eustrongilidiose, a capilariose, a

fagicolose, a clonorquiose e a difilobotriose. (OKUMURA et. al 1999;

WOLFF et. al 1999). No Brasil existem relatos em humanos apenas de

fagicolose, difilobotriose e clonorquiose (LEITE et. al 1989; CHIEFFI et. al

1990; CHIEFFI et. al 1992; DIAS et. al 1992; EDUARDO et. al 2005a;

EDUARDO et. al 2005b; SANTOS e FARO 2005; EMMEL 2006). A difilobotriose é causada em humanos pela infecção com vermes

adultos da espécie Diphyllobothrium latum, conhecido como a tênia do peixe,

após ingestão de crustáceos e peixes. Seus principais sinais clínicos são:

distensão abdominal, flatulência, dor epigástrica, anorexia, náuseas,

vômitos, astenia, perda de peso, eosinofilia e diarréia após 10 dias do

consumo do peixe cru ou mal cozido. O diagnóstico consiste no exame de

fezes observando os ovos típicos operculados e o tratamento com

praziquantel surte bom resultado (EDUARDO 2005; SANTOS 2005; EMMEL

et. al 2006).

A clornoquiose é uma doença dos ductos biliares, causada em

humanos através da infecção por trematódeos adultos da espécie Clonorchis

sinensis, após a ingestão de peixe cru ou mal-cozido contendo o parasito. A

ingestão de peixes defumados, em conserva ou secos, não afasta o risco de

contrair a infecção. A infecção aguda caracteriza-se por febre, eosinofilia,

hepatomegalia, artralgia e urticária. Na fase crônica, observa-se anorexia,

dor epigástrica, diarréia, febre baixa e prolongada, com progressiva



18

hepatomegalia. Esse quadro ocorre em pacientes gravemente infectados. As

complicações mais sérias estão relacionadas à colangite ascendente

recidivante e à pancreatite, podendo desenvolver colangiocarcinoma. O

diagnóstico pode ser através da visualização dos ovos em repetidas

amostras de fezes e no aspirado duodenal. O tratamento de escolha é o

praziquantel (LEITE et. al 1989; OKUMURA et. al 1999; WOLFF et. al 1999).

A fagicolose é a doença causada por Ascocotyle (Phagicola) longa,

sendo associada à ingestão de carne de tainhas cruas ou mal cozidas

podendo infectar o homem e diferentes espécies de aves e mamíferos

piscívoros, uma vez que possuem baixa especificidade parasitária (CHIEFFI

et. al 1990; CHIEFFI et. al 1992; DIAS et. al 1992; BARROS e AMATO

1995a; BARROS e AMATO 1995b; BARROS e AMATO 1996). Os principais

sinais clínicos são aqueles observados na maioria das verminoses, como

cólicas, flatulência, diarréias, emagrecimento. O tratamento consiste no uso

do anti-helmíntico a base de praziquantel (CHIEFFI et. al 1990; CHIEFFI et.

al 1992; OKUMURA et. al 1999).

O praziquantel (2-ciclo-hexilcarbonil-[1,2,3,6,7,11b] hexa-hidro-4H-

pirazino [2,1-a] isoquinolona-4-1), fármaco anti-helmíntico utilizado no

tratamento de várias parasitoses, tem efeito no parasito sobre o potencial de

membrana das células musculares, promovendo a entrada de íon cálcio para

o interior da célula, o que resulta na contração muscular, na vacuolização e

desintegração do tegumento do helminto. Suas etapas sintéticas são

incompletas e na sua maioria patenteadas por indústrias farmacêuticas, ou

seja, apesar da estrutura química final ser conhecida às etapas de

desenvolvimento não são bem elucidadas, o que torna sua execução

complexa e utilização onerosa. Algumas rotas sintéticas são propostas,

utilizando a glicina como matéria-prima, visando simplicar o método de

produção desse produto, embora ainda careçam de otimização do

rendimento global (NOVAES et. al 1999; SPINOSA et. al 2006).



19

Figura 1 – Estrutura química do praziquantel

Como medidas profiláticas, em relação à essas zoonoses

parasitárias, recomenda-se a inspeção visual do peixe, o cozimento

adequado dos mesmos, o destino adequado aos excretos humanos, a

inspeção do pescado e o congelamento adequado dos peixes nos frigoríficos

(EMMEL et. al 2006). Segundo EDUARDO et. al (2005a), deve-se fazer a

recomendação aos órgãos de fiscalização sanitária para que ocorra a

aplicação de medidas cautelares aos restaurantes com culinária japonesa e

fornecedores, a fim de prevenir o consumo de peixes crus suspeitos de

contaminação, além de alertar à população sobre os riscos de consumo de

peixes crus e comunicar aos laboratórios e serviços médicos para

notificação dos casos.

Para que a população possa ingerir os pratos típicos à base de peixe

cru recomenda-se o congelamento à temperatura de -20°C durante 7 dias ou

a -35°C por 15 horas (EMMEL et. al 2006). O uso da salmoura por 72 horas

e a cocção à temperatura de 100°C por 60 minutos são suficientes para

matar as larvas (SÃO CLEMENTE et. al 1996).

Segundo THATCHER e NETO (1994) as autoridades sanitárias, os

piscicultores, ictiopatologistas e veterinários devem atentar para um maior

controle, desde a produção até a comercialização do pescado, para diminuir



20

as taxas de morbidade e mortalidade nas criações, melhorando a qualidade

do pescado destinado ao consumidor e prevenindo as zoonoses

transmissíveis por peixes.

2.2 Parasitos da família Anisakidae: taxonomia, ciclo biológico, patogenia, sinais clínicos e diagnóstico.

Data de 1845 a primeira descrição de vermes adultos de Anisakis, por

um naturalista francês chamado Félix Dujardin. Em 1876 foi descrito pela

primeira vez um caso desta parasitose em um menino na Groelândia e em

1960 foi identificado como uma larva de terceiro estágio de Anisakis o

parasito agressor (LÓPEZ-SERRANO et. al 2000b).

A taxonomia da família Anisakidae consiste em: classe Nematoda;

subclasse Secernentea; Ordem Ascaridida; subordem Ascaridina e

superfamília Ascaridoidea (VICENTE e PINTO 1999).

Os parasitos da família Anisakidae, são de ampla distribuição

geográfica, parasitando peixes como hospedeiros intermediários, e

mamíferos marinhos e aves piscívoras como hospedeiros definitivos. Seus

ovos são eliminados juntamente com as fezes do hospedeiro definitivo em

meio aquático, quando então embrionam tornando-se larva infectante (L2),

esta será ingerida pelo hospedeiro intermediário e se desenvolverá até o

terceiro estágio larval (L3), que por sua vez será a forma infectante para o

hospedeiro definitivo, que ingere o hospedeiro intermediário contendo a larva

e se desenvolve até o estágio adulto. O homem (hospedeiro acidental) pode

ser infectado após o consumo do peixe, com larvas de terceiro estágio (L3),

cru ou mal cozido. O principal agente etiológico da anisaquiose humana é o

Anisakis simplex e ocasionalmente outros anisaquídeos (GERMANO e

GERMANO 1998; LOPES-SERRANO et. al 2000b; GÓMEZ et. al 2003;

MADI e SILVA 2005; SZOSTAKOWSKA et. al 2005; PETITHORY 2007).

Raramente o homem infecta-se com larvas de quarto estágio (L4)

(ROSALES et. al 1999).



21

A larva pode migrar pelo organismo do homem, com possibilidade de

localização diversa. Existem relatos de larvas encontradas na garganta de

um esquimó no Alaska e de uma mulher em Nova York, também em um

aneurisma do lado direito da artéria ilíaca de um homem em Massachusetts

e na mucosa esofagiana de um homem no Japão, porém a localização mais

comum é no estômago e intestino. Nestes órgãos a larva pode penetrar na

submucosa desenvolvendo reações na parede causando a anisaquiose

subaguda ou crônica e mesmo, mais raramente atravessar a parede gástrica

e intestinal originando granulomas e abcessos peritoniais. O granuloma

eosinofílico, resultante da resposta inflamatória do organismo ao parasita,

pode ser observado na parede do estômago, no intestino preferencialmente

no jejuno e íleo e com menor freqüência no cólon (LITLE e MACPHAIL 1972;

LITTLE e MOST 1973; LICHTENFELS e BRANCATO 1976; GERMANO e

GERMANO 1998; MUGURUMA et. al 1999; LOPEZ-SERRANO et. al

2000b).

Desde 1972 o Japão e alguns países como o EUA, tem mostrado um

aumento de casos de anisaquioses em humanos. Acredita-se que o

repentino aumento dessas infecções esteja associado à melhora da

performace dos aparelhos de endoscopia e radiologia e ao movimento de

proteção para os mamíferos marinhos, uma vez que os mesmos podem ser

hospedeiros definitivos desse parasito (OSHIMA 1987). Os principais sinais

clínicos da doença vão desde dores epigástricas e abdominais até obstrução

intestinal, podendo também ser observado tosse, expectoração, dores na

faringe, náusea e prurido anal ou nasal (DOI et. al 1989; TAKABE et. al

1998; MUGURUMA et. al 1999; MERCADO et. al 2001; YU et. al 2001). Nas

infecções crônicas o paciente relata mal estar e dor abdominal intermitente,

com perda de peso e frequentemente confundidos com outras enfermidades

gastrintestinais (GERMANO e GERMANO 1998). O principal meio

diagnóstico da anisaquiose é a endoscopia que além de diagnosticar e

remover o parasito permite sua identificação (OSHIMA 1987; MUGURAMA

et. al 1999; KOH et. al 1999; YU et. al 2001). Outras técnicas são utilizadas

com menor precisão no diagnóstico, como é o caso da ultrassonografia,



22

radiologia contrastada e colonoscopia, que associadas ao histórico de

consumo de peixe cru, aos sinais gastroentericos e tratamento com sucesso

reduzem a necessidade de uma intervenção cirúrgica (MATSUMOTO et. al

1992; SHIRAHAMA et. al 1992).

A ingestão do peixe mesmo que cozido pode desenvolver um quadro

alérgico conhecido como anisaquiose gastroalérgica ou gastrite eosinofílica,

podendo desenvolver urticária, angioedema e até mesmo reação anafilática,

isso se deve à presença de antígenos de superfície termoestáveis presentes

no parasito, o quadro alérgico se desenvolve em média após 6 horas do

consumo do peixe (LÓPEZ-SERRANO et. al 2000a; GÓMEZ et. al 2003;

CHO et. al 2005; PETITHORY 2007). FOTI et. al (2006) testaram os fatores

de risco através de uma análise multivariada, para sensibilidade alérgica ao

Anisakis e sugeriram que pessoas atópicas tem menor risco de desenvolver

o quadro alérgico que as não atópicas. Estes autores concluíram ainda que

há associação entre o consumo de peixe mal cozido e frutos do mar com os

quadros alérgicos e o risco aumenta com a idade. LÓPEZ-SERRANO et. al

(2000a) diagnosticaram 22 pacientes com gastroalergia por anisaquiose em

um ano na Espanha, a maioria dos pacientes apresentavam-se na sala de

emergência com sintomas alérgicos e sintomas gástricos moderados, o

diagnóstico foi através de teste de reação intradérmica para Anisakis

simplex, sorologia para IgE específica para Anisakis através de ensaio

imunoenzimático, gastroscopia e histórico de sintomas de persistência

gástrica após ingestão de frutos do mar. Segundo PETITHORY (2007) as

vítimas da gastroalergia tem predisposição genética, sendo incomum na

França e Alemanha e freqüente no Japão.

No Brasil há uma prevalência maior de Contracaecum sp. parasitando

peixes em relação à Anisakis sp. (BARROS e AMATO 1993; REGO et. al

1983; BARROS 1994; SÃO CLEMENTE et. al 1995; SILVA et. al 2000;

THIENGO et. al 2000; MARTINS et. al 2005; PRADO e CAPUANO 2006),

fato observado também no estado de Mato Grosso (BARROS et. al 2006;

BARROS et. al 2007) e em países como México, Colômbia e Argentina

(OLIVERO-VERBEL et. al 2006; AGUIRRE-MACEDO et. al 2007; GARBIN



23

et. al 2007). Apesar da infecção experimental em coelhos e gatos

domésticos (VIDAL-MARTINEZ et. al 1994; BARROS et. al 2004) não há

relatos em humanos no Brasil, acredita-se que seja pela falta de diagnóstico

e não pela ausência da doença, tornando-se necessário a intensificação dos

estudos da fauna parasitária de peixes no país, aumentando assim o

conhecimento das características morfológicas e biológicas dos parasitos de

importância em saúde pública (OKUMURA et. al 1999; BICUDO et. al 2005).

2.3 Uso de plantas medicinais e compostos monoterpênicos no controle parasitário

O uso de plantas para o tratamento de enfermidades é um costume

tão antigo quanto à espécie humana, as observações populares contribuem

na divulgação das virtudes terapêuticas, mesmo sem o seu conhecimento

químico e farmacológico, despertando dessa maneira interesse dos

pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidiciplinares (MACIEL et.

al 2002).

O uso de plantas medicinais tem aumentado nos últimos anos com a

finalidade de realizar o controle parasitário, seja para endo ou ectoparasitas,

como é o caso do Cymbopogon citratus e Digitaria insularis, conhecidos

respectivamente como capim-santo e capim-açu, sobre cultura de

nematóides gastrintestinas de caprinos, onde demostraram efeito larvicida

de até 95% (ALMEIDA et. al 2003). Já COSTA et. al (2002) testou o extrato

hexânico e a fração etanólica do extrato hexânico obtido a partir de

sementes de Mangifera indica L.(Anacardiaceae) sobre ovos de

Haemonchus contortus, a fração etanólica do extrato hexânico inibiu 95,66%

da eclosão dos ovos na concentração de 50 mg/ml, no entanto o extrato

hexânico apresentou atividade insignificante na mesma concentração.

MOORE et. al (2007) testaram a ação repelente do Cymbopogon citratus

sobre Anopheles darling em voluntários na Bolívia demonstrando um

resultado satisfatório (p=0.0159). O eucalyptol também foi testado quanto a



24

ação inseticida in vitro sobre Musca domestica e Chrysomya megacephala,

demostrando excelentes resultados (SUKONTASON et. al 2004).

Os carrapatos de bovinos, Boophilus microplus, trazem perdas

econômicas inestimáveis à pecuária de corte, devido à transmissão de

doenças e depreciação do couro. O uso de produtos químicos tem

propiciado o aparecimento de cepas resistentes e contaminação ambiental,

o Cymbopogon tem demostrado acaricida (HEIMERDINGER et. al 2006;

MARTINS 2006). AMBROZIN et. al (2004) testaram a atividade

tripanosomicida in vitro de 22 extratos de plantas das famílias Meliaceae e

Rutaceae, buscando novas drogas para a doença de Chagas.

As plantas também podem ser utilizadas profilaticamente, foi o que

NWABUISI (2002) concluiu quando usou extrato de multiervas ( Agbo-Iba)

em ratos inoculados com malária. O uso da planta preveniu o

desenvolvimento da parasitemia nesses animais.

As substâncias químicas extraídas das plantas são classificadas em

metabólitos primários e secundários. Os metabólitos primários são

substâncias amplamente distribuídas na natureza, ocorrendo em

praticamente todos os organismos, já os secundários tem distribuição

limitada a determinados grupos taxonômicos do Reino Vegetal, não

possuindo função aparente no metabolismo primário da planta, mas

possuem papel ecológico como atrativos para polinizadores e defensores

químicos contra microorganismos, insetos e predadores (BALANDRIN et al

1985).

Os terpenóides constituem uma família numerosa de compostos

muito diversos que se encontram espalhados por todos os seres vivos,

podendo também ser designados por terpenos ou isoprenóides e fazem

parte do metabolismo secundário das plantas. São formados pela união de

unidades com cinco átomos de carbono. Todos os terpenóides (com

algumas exceções) são moléculas cujo esqueleto possui um número de

átomos de carbono múltiplo de cinco. As duas unidades que dão origem a

todos os terpenos são o pirofosfato de isopentenilo (IPP) e o pirofosfato de

dimetilalili (DMAPP). Compostos pertencentes a essa família estão



25

presentes em todas as partes: sementes, folhas, flores, raízes, em bolores,

fungos e líquens. Os esteróides, subconjunto desta família de compostos,

encontram-se presentes em todos os animais, plantas e na maioria dos

microrganismos. Os compostos mais simples são os constituintes principais

dos óleos essenciais e são os responsáveis pelo aroma das plantas

(ARAÚJO 2005).

De acordo com Dey e Harbone (1997) citado por PRADO (2007,

p.10), os monoterpenos fazem parte da classe mais simples dos

terpenóides, sendo constituídos por 10 átomos de carbono, ou seja, duas

unidades de isopreno. São componentes da maioria dos óleos essenciais. O

maior interesse nestes compostos se deve ao seu uso como perfumes e

flavorizantes em alimentos, apresentando também efeito farmacológico.

Compostos monoterpênicos também foram utilizados com sucesso

para promover ação fitotóxica contra ervas daninhas, problema atual na

agropecuária mundial, com destaque para o citronelal. Este composto

causou injúria nas plantas na forma de necrose, ruptura cuticular, obstrução

do estroma e encolhimento das células epidermais (BATISH et. al 2006;

SINGH et. al 2006). Os compostos monoterpênicos também são utilizados

com sucesso quanto à ação inseticida (RICE e COATS 1994; MOMIN e

NAIR 2002; BARNAND e XUE 2004) e acaricida (TAK et. al 2006). Segundo

LEYVA e TACORONTE (2007) os compostos monoterpênicos e

sesquiterpenos são tipicamente lipofílicos e afetam de maneira negativa o

crescimento, desenvolvimento e reprodução de insetos das espécies Aedes

aegypti e Musca domestica. SIMAS et. al (2004) relatam a ação larvicida do

sesquiterpeno E- nerolidol sobre larvas de A. aegypti, e a importância da

lipofilicidade de terpenos para essa atividade larvicida.

GOTO et. al (1990) relataram que o uso in vitro do extrato de Zingiber

officinale é efetivo contra larvas de Anisakis, e suas frações [6]-shogaol e [6]-

gingerol com a concentração de 62,5 e 250μg/ml respectivamente é a dose

efetiva mínima para matar as larvas de Anisakis. De acordo com KASUYA

et. al (1990) o extrato de Perilla frutescens usado na medicina tradicional

chinesa, tem ação larvicida para Anisakis e sua fração perillaldehyde na



26

concentração de 125 μg/ml é a dose efetiva mínima para matar essas larvas,

sugerindo que o perillaldeído é o componente ativo desse extrato contra

Anisakis.

HIERRO et. al (2004) testaram in vitro a ação anti-helmíntica de

diferentes compostos monotêrpenicos (geraniol, citronellol, citral, carvacrol,

cuminaldeído e eugenol) nas concentrações de 12,5 μg/ml, 6,25 μg/ml e

3,12 μg/ml, contra larvas de terceiro estágio (L3) de Anisakis simplex. O

geraniol mostrou seu efeito letal máximo entre 8 e 24 horas a 12,5 μg/ml, o

citronellol foi 100% letal a 4 horas na concentração de 12,5 μg/ml, o citral

mostrou os melhores resultados em todas as três concentrações, o carvacrol

foi muito eficiente a 4 horas exceto na concentração de 3.12 μg/ml e o

eugenol não mostrou efeito larvicida na concentração máxima testada, assim

conclui-se que todos os compostos acima citados foram ativos na

concentração máxima testada com exceção do eugenol.

ASHA et. al (2003) testaram in vitro a atividade anti-helmíntica do

geraniol e da planta Cymbopogon martinii contra o helminto Caenorhabditis

elegans e sugerem que o geraniol, o principal constituinte dessa planta, seja

o princípio anti-helmintico da mesma, onde obteve-se a ED50 (dose efetiva)

de 66,7 μg/ml para o geraniol. ASHA et. al (2001) testaram in vitro a

atividade anti-helmíntica do eugenol e da planta Ocimum sanctum contra o

helminto Caenorhabditis elegans e sugerem que o eugenol, o principal

constituinte dessa planta, seja o princípio anti-helmíntico da mesma, onde

obteve-se a ED50 de 66,7 μg/ml para eugenol.

Quando relatado o uso de plantas e produtos naturais há a

preocupação com a toxicidade das mesmas para o homem. LEITE et. al

(1986) utilizaram em voluntários da saúde um chá de ervas à base de

Cymbopogon citratus para avaliar o efeito tóxico, hipnótico e ansiolítico do

mesmo, chegando à conclusão que não produz efeito tóxico clínico e

laboratorial, não sendo observadas propriedades hipnóticas e ansiolíticas.

SOUZA et. al (1986) utilizaram a infusão em ratos antes da cópula e durante

a gestação e não foram observados efeitos tóxicos. ADENEYE e AGBAJE

(2007) testaram o Cymbopogon citratus quanto ao efeito hipoglicêmico,



27

hipolipidêmico e toxicidade aguda. Os resultados demonstraram baixa

toxicidade sendo considerado relativamente seguro na exposição aguda.

COSTA et. al (2007) através de estudos de toxicidade aguda da DCTN

(diterpeno isolado do Croton cajucara), concluíram que a mesma possui

baixa toxicidade, porém quando usada indevidamente na medicina

alternativa pode acarretar efeitos hepatotóxicos irreversíveis.



28

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivos Gerais

• Avaliar o efeito larvicida de compostos monoterpênicos

(citronelal e geraniol) in vitro sobre Contracaecum sp.

• Avaliar o possível efeito tóxico do óleo essencial de

citronela (Cymbopogon sp.) em camundongos (Mus

musculus).

3.2 Objetivos específicos

• Comparar a ação larvicida entre os compostos monoterpênicos

(geraniol e citronelal).

• Avaliar a taxa de mortalidade das larvas de Contracaecum sp.

em função do tempo.

• Determinar toxicidade do óleo essencial de citronela para

camundongos por meio de teste hipocrático.



29

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Avaliação in vitro do efeito larvicida de compostos monoterpênicos sobre Contracaecum sp.

4.1.1 Compostos monoterpênicos (geraniol e citronelal) Para a etapa de avaliação in vitro, foram utilizados o geraniol (Acros®,

USA; Lote: A0122403) (Figura 1) e citronelal (Spectrum®, USA: Lote:

RP0474R) (Figura 2), seus níveis de pureza foram fornecidos pela empresa

fabricante (Tedia do Brasil Ltda) conferindo grau de pureza de 96,6 e 94%

respectivamente. Uma amostra de cada composto foi analisada por

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas CG/EM1, a fim

de confirmar o grau de pureza dos compostos.

Figura 2 – Estrutura química do geraniol

____________________



30

1Aparelho Shimadzu® GCMS-QP5050A

1



31

Figura 3 – Estrutura química do citronelal

4.1.2 Espécie de peixe utilizada para a obtenção de larvas de Contracaecum sp.

As larvas de Contracaecum sp. foram obtidas de traíras (Hoplias

malabaricus, Bloch, 1794) (Figura 3) um peixe carnívoro de água doce da

família Caracidae, presente em quase todos os açudes, lagos, lagoas e rios

do território nacional. Nas regiões que oferecem boa alimentação é comum

que atinjam 69 cm de comprimento e alguns exemplares excedem 2 Kg de

peso, predador de hábitos noturnos tem marcada predileção por sombras e

escuridão. Tendo ampla distribuição na América do Sul, é utilizado como

fonte alimentar de aves e mamíferos, incluindo o homem; assim as traíras

atuam além de hospedeiros definitivos e intermediários como hospedeiros

paratêmicos de helmintos, com destaque para Contracaecum sp.



32

Figura 4 – Espécimes de traíra (Hoplias malabaricus) capturados do

rio Mimoso, município de Santo Antônio de Leverger,MT, em setembro de 2007.

Figura 5 – Mapa de localização do município de Santo Antônio do Leverger, estado de Mato Grosso, Brasil, local de captura das espécimes de traíras. Fonte: google earth 2007



33

4.1.3 Captura e necrópsia dos peixes

Os peixes foram capturados pelo funcionário Luiz Carlos de Sá

Neves, no mês de setembro. A captura foi realizada com anzol no rio

Mimoso, município de Santo Antônio de Leverger, localizado a 140 km de

Cuiabá, a 16° 12' 50" Sul, 55° 48' 29" Oeste, O município foi escolhido por

se tratar de uma localidade aonde tem como a pesca o principal produto de

subsistência e turismo da região (Figura 4). Após a coleta foram

acondicionados em caixas térmicas e transportados ao laboratório de

Parasitologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (Figura

5).

As traíras foram necropsiadas seguindo a metodologia adotada por

PAVANELLI et. al (1998) através de uma incisão ventral longitudinal da

abertura cloacal à região branquial, com retirada das vísceras da cavidade

celomática, para exame e coleta dos parasitos (Figura 6).

Figura 6 – Recepção de espécimes de traíra (Hoplias malabaricus)

no laboratório de Parasitologia – UFMT.



34

Figura 7 – Larva de Contracaecum sp. na cavidade celomática de um

espécime de traíra (Hoplias malabaricus)

4.1.4 Avaliação e identificação das larvas

As larvas encontradas durante a necropsia foram mantidas em

placas de Petri com solução fisiológica 0,65% NaCl. Posteriormente as

mesmas foram avaliadas em microscópio estereoscópico2, utilizando como

parâmetros a motilidade e a integridade estrutural. A identificação

taxonômica foi realizada de acordo com HARTWICH (1974) e espécimes

representativos foram depositados na Coleção Helmintológica do Instituto

Oswaldo Cruz, sob o número CHIOC 35505.

____________________2 Olympus® SZ-4045



35

2



36

4.1.5 Diluição dos compostos monoterpênicos e distribuição dos grupos

Os compostos monoterpênicos (geraniol e citronelal) foram pesados

em balança analítica3 e diluídos em etanol a 96° chegando as seguintes

concentrações: 25, 12,5, 6,25 e 3,12mg/ml.

As larvas de Contracaecum sp., consideradas viáveis, foram

separadas em vinte grupos de dez larvas cada, para cada composto

testado, totalizando duzentas larvas por composto avaliado e quatrocentas

larvas para os dois compostos. Além dos grupos testados foi destinado um

grupo de 10 larvas em etanol a 1% para ser usado como controle.

4.1.6 Avaliação in vitro

Um total de 5 ml de água destilada e 50μl do produto diluído nas

quatro concentrações foram depositados em placas de Petri nos grupos

citados acima, obtendo concentração final de 250, 125, 62,5 e 31,2 μg/ml.

As placas foram mantidas em incubadora tipo B.O.D4 (carência

bioquímica de O2 dissolvido) à 37o C (± 0,6 o C), com 90% de umidade. As

observações foram realizadas a 2, 4, 8, 24 e 48 horas, após o início do

experimento. No momento da avaliação, a placa de Petri era retirada da

B.O.D e as larvas lavadas com água destilada e levadas ao microscópio

estereoscópico para ser avaliado o efeito larvicida do produto, utilizando

como parâmetros a motilidade e a integridade estrutural. O grupo controle

também foi avaliado nos mesmos intervalos de tempo, utilizando-se os

mesmos parâmetros.

As larvas mortas foram fixadas com AFA (álcool, formalina e ácido

acético) produto esse utilizado como fixador de helmintos. Posteriormente

processadas conforme as técnicas histológicas descritas por PROPHET

(1992), sendo cortadas em espessura de 2µm, utilizando-se um micrótomo

manual5. 3 Shimadzu Libror AEG-220g 4 B.O.D. 347 CD 5 Microm® HM 325



37

As lâminas confeccionadas foram coradas pela técnica de

hematoxilina-eosina descrita por ALLEN (1992) e posteriormente

examinadas e microfotografadas, com aumentos de 40X e 100X, com o

auxílio de microscópio óptico6 visando avaliar alterações decorrentes da

ação dos compostos sobre as larvas.

Utilizou-se o teste exato de Fisher a fim de avaliar se houve ação

larvicida do produto quando comparado ao grupo controle (etanol 1 %) e

entre os dois produtos (SIEGEL 1975). A determinação da equação de

regressão foi utilizada para avaliar a taxa de mortalidade das larvas em

função do tempo, utilizando como ferramenta o programa estatístico

SAEG® 4.0 (RIBEIRO JUNIOR 2001).

4.2 Teste hipocrático da Citronela (Cymbopogon sp., Spreng, 1815)

Foi realizado o teste hipocrático (MALONE 1977) com o objetivo de

avaliar o possível efeito tóxico do óleo essencial de citronela (Cymbopogon

sp.) em camundongos.

4.2.1 Óleo essencial de Citronela

O óleo essencial de citronela foi adquirido em farmácia de

manipulação (Fórmula Certa, Cuiabá, MT, Lote N.º 1256) com densidade de

0,910g/ml. Os seus níveis de pureza foram garantidos através de análises

sensoriais e físicas, as quais encontravam-se dentro da normalidade,

segundo laudo fornecido pela EML - Distribuidora Ely Martins. Uma amostra

do mesmo lote do óleo foi analisada por cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massa (CG-EM), a fim de determinar os compostos

presentes em sua formulação, determinando que os principais compostos

presentes no óleo essencial de citronela, utilizado para o experimento in

vitro, foram o geraniol, o citronelal e o citronelol.

6 Olympus® MOD. BX-41



38

4.2.2 Animais utilizados no experimento

Foram utilizados camundongos Swiss Webster (Mus musculus),

machos, entre 29 e 31 gramas, provenientes do Biotério da Universidade de

Cuiabá (UNIC), localizado no Hospital Veterinário da mesma instituição

(Figura 7).

Figura 8 – Camundongos (Mus musculus) identificados e

acondicionados em gaiolas de polipropileno para realização de teste hipocrático .



39

4.2.3 Determinação da toxicidade aguda (Teste hipocrático)

O teste hipocrático é utilizado com o objetivo de determinar a

toxicidade aguda de substâncias, através da observação dos efeitos gerais

comportamentais e tóxicos das mesmas.

Foram utilizados doze camundongos machos , submetidos a dezoito

horas de jejum alimentar sem restrição hídrica e separados aleatoriamente

em quatro grupos com três animais cada. Por gavagem, utilizando sonda

orogástrica, foi administrado óleo essencial de citronela ou veículo (óleo de

soja Sadia®, Lote: 00106P), no volume de 0,1ml para cada 30 gramas de

peso corporal (Figura 8).

Figura 9 – Camundongo (Mus musculus) sendo submetido a

gavagem orogástrica com óleo essencial de citronela (Cymbopogon sp.).

O grupo 1 recebeu óleo essencial de citronela sem diluição. O grupo

2 recebeu óleo essencial diluído em óleo de soja sendo 50% de óleo

essencial de Citronela e 50% de óleo de soja. O grupo 3 recebeu óleo

essencial diluído em óleo de soja, sendo 25% de óleo essencial de



40

Citronela e 75% de óleo de soja. O grupo 4 recebeu somente o óleo de soja

(controle). As doses administradas foram as seguintes: grupo 1

(3033,33mg/Kg), grupo 2 (1516,66mg/Kg), grupo 3 (758,33mg/Kg) e grupo 4

(óleo de soja).

Os animais devidamente identificados foram distribuídos em gaiolas

individuais de polipropileno (16 X 26 X 13 cm), em temperatura ambiente de

28 ±2°C, umidade de 60 ± 5% e ciclo claro/escuro de 12 horas, com livre

acesso à água e ração para roedores (Purina®). O ambiente foi mantido em

silêncio a fim de evitar o estresse e possível influência nos resultados.

Foram observados os efeitos comportamentais resultantes de

possíveis ações estimulantes ou depressoras do Sistema Nervoso Central

(SNC), efeitos toxicológicos e morte. Estas possíveis alterações foram

acompanhadas desde o instante da administração e por 10, 15, 30, 240 e

480 minutos pós administração. Após a avaliação de 480h seguiu-se

observações a cada 24 horas durante 14 dias consecutivos (Figura 9). Os

dados foram anotados em tabela de Malone (ANEXO I).

Os parâmetros observados, relacionados às ações estimulantes,

foram: coçar o focinho, convulsão clônica e tônica, exoftalmia, aumento da

freqüência respiratória, lamber patas, morder cauda, aumento da motilidade,

movimentos estereotipados, piloereção, tremores finos e grosseiros. Os

parâmetros observados, relacionados às ações depressoras, foram:

alienação ao meio, analgesia (por teste de compressão da cauda do

animal), anestesia (puxando o pêlo e suspendendo o animal), ataxia,

diminuição da apreensão da pata, catatonia, dispnéia, exoftalmia,

diminuição da freqüência respiratória, diminuição da motilidade, diminuição

do reflexo corneano, tônus dorsal, ptose palpebral e sedação. Outros

parâmetros observados foram: agressividade, contorção, coloração da

urina, diâmetro da pupila, diarréia, ereção da cauda, fasciculações,

grunhidos, aumento ou diminuição da micção, midríase, orelha (cianótica,

hiperêmica ou pálida), passividade, reação de fuga, sialorréia, tremor da

cauda, lacrimejamento, sudorese, coma e morte.



41

Ao fim do período de observação todos os animais foram sacrificados

obedecendo às normas preconizadas por BRASIL (2000) e a necropsia foi

realizada segundo a técnica descrita por FELDMAN e SEELY (1988). Foi

realizado exame macroscópico e coletado os seguintes órgãos para exame

histopatológico: SNC, coração pulmão, baço, fígado, intestino, estômago,

osso (fêmur), rim; sendo os mesmos conservados em formalina 10% e

realizada técnica histológicas e confecção das lâminas utilizando-se

métodos já descritos no processamento das larvas de Contracaecum sp.

Figura 10 – Representação esquemática do teste hipocrático do

óleo essencial de citronela, utilizando camundongos (Mus musculus).



42

5 RESULTADOS

5.1 Avaliação in vitro

O geraniol teve efeito larvicida a partir de 2 horas na concentração

máxima testada, 250 μg/ml, demonstrando um aumento de taxa de

mortalidade em função do tempo. Com 48 horas o geraniol matou 90% das

larvas avaliadas. Nas concentrações de 125 e 62,5 μg/ml este composto

não teve efeito larvicida no período de 48 horas e na concentração de 31,2

μg/ml obteve efeito larvicida com 48 horas para apenas 10% das larvas.

(Tabela 1)

O citronelal teve efeito larvicida contra Contracaecum sp., na

concentração de 250μg/ml com 8 e 24 horas, na concentração de 125μg/ml

com 24 horas e na concentração de 62,5 μg/ml com 48 horas.(Tabela 1)

Tabela 1 - Avaliação in vitro da atividade larvicida do Geraniol e Citronelal contra Contracaecum sp (Nematoda: Anisakidae).

SUBSTÂNCIAS % DE LARVAS MORTAS

TESTADAS 2 hs 4 hs 8 hs 24 hs 48 hs GERANIOL μg/ml

250 10% - 30% 70% 90% 125 - - - - - 62,5 - - - - - 31,2 - - - - 10%

CITRONELAL Controle (etanol 1%)

250 - - 20% 10% - 125 - - - 10% - 62,5 - - - - 20% 31,2 -

-

- -

- -

- -

- -

Quando comparou-se a ação do citronelal e do geraniol em relação

ao controle (etanol 1%), observou-se que ambos tiveram ação larvicida

sobre Contracaecum sp. (p <0,005). O geraniol na concentração de

250μg/ml às 2, 8, 24 e 48 horas e na concentração de 31,2 μg/ml às 48



43

horas. O citronelal na concentração de 250μg/ml às 8 e 24 horas, na

concentração de 125μg/ml às 24 horas e na concentração de 62,5μg/ml às

48 horas. Quando comparou-se a ação entre o geraniol e o citronelal

observou-se que o geraniol tem maior ação larvicida que o citronelal (p

<0,05) na concentração de 250μg/ml às 2, 8, 24 e 48 horas e na

concentração de 31,2 μg/ml às 48 horas e o citronelal tem maior ação

larvicida que o geraniol (p < 0,005) na concentração de 125μg/ml às 24

horas e na concentração de 62,5μg/ml às 48 horas.

A equação estimada da taxa de mortalidade das larvas de

Contracaecum sp. em função do tempo (horas), na concentração de

250μg/ml do geraniol foi: y = 7,33297 + 1,899925x (R2 = 0,8926), mostrando

maior ação larvicida com o passar do tempo nessa concentração. (Tabela 2)

Tabela 2 - Taxa de mortalidade real e estimada de larvas de Contracaecum

sp. em função do tempo quando utilizado geraniol a 250μg/ml in vitro.

Horas Mortalidade Real (%) Mortal. estimada (%)

2 10 11,13

4 0 14,93

8 30 22,53

24 70 52,91

48 90 98,50

5.1.2 Danos histológicos nas larvas mortas sob ação dos compostos monoterpênicos

Nas larvas de Contracaecum sp., quando submetidas ao geraniol in

vitro foi observado principalmente descolamento cuticular (Figura

11).Quanto ao citronelal, observou-se ruptura cuticular e ductos excretores

entumecidos (Figura 12-13) .



44

Figura 11 – Corte transversal de larva de Contracaecum sp., larva

controle, corados por hematoxilina-eosina. (barra=10 μm)

Figura 12 – Corte transversal de larva de Contracaecum sp.,

exposta ao composto monoterpênico geraniol, demonstrando descolamento da cutícula, corados por hematoxilina-eosina. (barra = 30μm)



45


exposta ao composto monoterpênico citronelal, demonstrando ruptura cuticular, corados por hematoxilina-eosina. (barra = 10μm)


exposta ao composto monoterpênico citronelal, demonstrando ductos excretores entumecidos, corados por hematoxilina-eosina. (barra = 50μm)



46

5.2 Efeitos gerais comportamentais e tóxicos da citronela mediante teste hipocrático

O óleo essencial de citronela nas doses administradas de

3033,33mg/Kg, 1516,66mg/Kg e 758,33mg/Kg, provocou apenas alterações

de aumento de atividade motora em um animal do grupo que recebeu a

dose de 3033,33mg/Kg, nos primeiros trinta minutos do experimento. Não

houve morte de nenhum animal durante os 14 dias de tratamento, bem

como não foram observados alterações comportamentais ou efeito tóxico no

grupo controle (óleo de soja).

A avaliação microscópica, através do exame histopatológico, não

demonstrou alterações nos órgãos examinados (SNC, coração, pulmão,

baço, fígado, intestino, estômago, osso e rim) (Figuras 14 a 22)

Figura 15 – Corte histológico do sistema nervoso central de

camundongo (Mus musculus) sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina. (barra = 20 µm)



47

Figura 16 – Corte histológico do pulmão de camundongo (Mus

musculus) sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina. (barra = 100µm)

Figura 17 – Corte histológico do coração de camundongo (Mus




48

Figura 18 – Corte histológico do baço de camundongo (Mus


Figura 19 – Corte histológico do fígado de camundongo (Mus




49

Figura 20 – Corte histológico do intestino de camundongo (Mus


Figura 21 – Corte histológico do estômago de camundongo (Mus

musculus) sem alterações histológicas, corado por hematoxilina-eosina. (barra = 200 µm)



50

Figura 22 – Corte histológico do osso (fêmur) de camundongo (Mus


Figura 23 – Corte histológico do rim de camundongo (Mus




51

6 DISCUSSÃO

O presente trabalho testou dois compostos monoterpênicos, o

geraniol e o citronelal, que são frações do óleo essencial de citronela

(Cymbopogon sp.), sobre larvas de Contracaecum sp. Os mesmos além de

já terem sido utilizados para obter efeito anti-helmíntico (HIERRO et. al

2004; ASHA et. al 2003) foram também utilizados com sucesso quanto à

ação inseticida (RICE e COATS 1994; MOMIM e NAIR 2002; BARNAND e

XUE 2004) e acaricida (TAK et. al 2006).

O geraniol teve efeito larvicida a partir de 2 horas na concentração

máxima testada (250 μg/ml) matando 10% das larvas. Com 48 horas o

mesmo matou 90% das larvas na mesma concentração, demonstrando um

aumento de taxa de mortalidade em função do tempo. Nas concentrações

de 125 e 62,5 μg/ml o geraniol não teve efeito larvicida no período de 48

horas e na concentração de 31,2 μg/ml obteve efeito larvicida com 48 horas

para apenas 10% das larvas. Quando comparado aos resultados obtidos

por HIERRO et. al (2004) que utilizaram o geraniol, além de outros

compostos monoterpênicos, sobre larvas de Anisakis simplex na

concentração de 12,5 μg/ml obtendo efeito letal máximo entre 8 e 24 horas,

podemos observar que para Anisakis simplex, parasito da mesma família

do Contracaecum sp., o efeito larvicida do geraniol é efetivo em

concentrações muito menores.

ASHA et. al (2003) testaram o geraniol, principal constituinte da

planta Cymbopogon martinii, contra helmintos Caenorhabditis elegans e os

mesmos mostraram a ED50 de 66,7 μg/ml. Podemos observar que este

composto possui efeito anti-helmíntico sobre outros parasitos, além do

Anisakis simplex descrito por HIERRO et. al (2004) e do Contracaecum sp.

utilizado nesse trabalho. Outro composto monoterpênico utilizado contra

Caenorhabditis elegans por ASHA et. al (2001) foi o eugenol, principal

constituinte da planta Ocimum sanctum. Estes autores obtiveram a ED50 de

62,1 μg/ml demonstrando o efeito anti-helmíntico do eugenol. HIERRO et. al

(2004) testaram o eugenol contra larvas de Anisakis simplex e não



52

obtiveram efeito larvicida na concentração máxima testada, que foi de 12,5

μg/ml. Com esses resultados podemos observar que apesar dos compostos

monoterpênicos serem descritos como anti-helmínticos, a dose e o helminto

estudado influencia diretamente no resultado encontrado.

Observamos alterações de descolamento de cutícula no exame

histopatológico das larvas de Contracaecum sp. mortas sob efeito do

geraniol. HIERRO et. al, em 2004, relataram protuberâncias na cutícula e

danos intestinais na histopatologia das larvas de Anisakis simplex mortas

sob efeito do geraniol, demonstrando que a ação do geraniol nas larvas de

Contracaecum sp. e Anisakis simplex é na estrutura cuticular do parasito.

O citronelal teve efeito larvicida contra Contracaecum sp, na

concentração de 250μg/ml com 8 e 24 horas, na concentração de 125μg/ml

com 24 horas e na concentração de 62,5 μg/ml com 48 horas. O citronelal já

foi testado quanto sua ação fitotóxica em ervas daninhas tendo excelentes

resultados, o mesmo causou injúria nas plantas na forma de necrose,

ruptura cuticular, obstrução do estroma e encolhimento das células

epidermais (BATISH et. al 2006; SINGH et. al 2006). Quando analisamos a

histopatologia das larvas mortas por citronelal, observamos ruptura da

cutícula e ductos excretores entumecidos, o que possivelmente é a causa

da morte das larvas.

GOTO et. al (1990) relatam a ação larvicida in vitro do extrato de

Zingiber officinale contra larvas de Anisakis, avaliando suas frações [6]-

shogaol e [6]-gingerol com a concentração de 62,5 e 250μg/ml

respectivamente, concluindo que são doses efetivas mínimas suficientes

para matar as larvas de Anisakis. Segundo KASUYA et. al (1990) o extrato

de Perilla frutescens, usado na medicina tradicional chinesa, é eficiente

contra larvas de Anisakis e sua fração perillaldehyde na concentração

mínima de 125 μg/ml é efetiva para matar larvas de Anisakis. As

concentrações utilizadas nesses trabalhos foram as mesmas utilizadas para

Contracaecum sp. neste trabalho, porém com outros compostos (geraniol e

citronelal). Estes dados demonstram que outros compostos monoterpênicos

também apresentam ação larvicida sobre parasitos da família Anisakidae.



53

Realizamos o teste de toxicidade aguda (teste hipocrático) com o

objetivo de determinar a toxicidade do óleo essencial de citronela

(Cymbopogon sp), uma vez que seus principais constituintes são o geraniol,

citronelol e citronelal. O teste determinou que o óleo essencial de citronela

não é tóxico, nas doses estudadas (3033,33mg/Kg, 1516,66mg/Kg e

758,33mg/Kg) pois apresentou apenas aumento da motilidade motora em

um animal do grupo que recebeu a dose de 3033,33mg/Kg nos primeiros

trinta minuto e não houve nenhum óbito no final dos 14 dias de

acompanhamento. Segundo LEITE et. al (1986) o chá de ervas a base de

Cymbopogon citratus não demonstrou efeito tóxico, hipnótico ou ansiolítico

quando foi utilizado em voluntários de saúde, o mesmo foi observado por

ADENEY e AGBAJE (2007) e SOUZA et. al (1986) quanto ao uso do

mesmo produto em pessoas. Esses resultados demonstram que é seguro o

uso dos produtos a base de Cymbopogon sp, porém deve-se levar em

consideração que, o uso indevido na medicina alternativa de plantas

medicinais pode acarretar em sérios prejuízos à saúde humana, conforme

relatado por COSTA et. al (2007).

Segundo LEYVA e TACORONTE (2007) os compostos

monoterpênicos e sesquiterpenos são tipicamente lipofílicos e afetam de

maneira negativa o crescimento, desenvolvimento e reprodução de insetos

das espécies Aedes aegypti e Musca domestica, esta lipofilicidade também

foi observado por SIMAS et. al (2004) sobre larvas de A aegypti na

utilização do sesquiterpeno E-nerolidol. Esta ação lipofílica dos compostos

pode ser um possível mecanismo de ação larvicida contra Contracaecum

sp..

Assim associando o resultado satisfatório do efeito larvicida dos

monoterpenos, geraniol e citronelal e a não toxicidade de produtos à base

de Cymbopogon, sugerimos estudos adicionais, para que no futuro os

derivados da planta Cymbopogon sp. ou mesmo seus principais

constituintes possam ser usados como terapêutica da anisaquiose.



54

7 CONCLUSÕES

o Os compostos monoterpênicos geraniol e citronelal

apresentam ação larvicida sobre Contracaecum sp. em teste

in vitro. O geraniol nas concentrações de 250μg/ml e 31,2

μg/ml e o citronelal nas concentrações de 250μg/ml, 125 μg/ml

e 62,5 μg/ml.

o A taxa de mortalidade das larvas aumenta em função do

tempo quando se utiliza o geraniol na concentração de

250μg/ml

o O óleo essencial de citronela, que tem como principais

compostos os monoterpenos utilizados nesse estudo, não

apresentam toxicidade aguda. Os compostos geraniol e

citronelal podem ser utilizados como fitofármacos no

tratamento de anisaquiose.

o Análises in vivo e determinação do mecanismo de ação do

geraniol e citronelal quanto ao efeito anti-helmíntico, ainda

devem ser realizadas.



55

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Teste hipocrático do óleo essencial de citronela