Tipos de morte celular: Necrose e Apoptose · '-synuclein, parkin mutations Poly-CAG expansions in huntingtin Cu/Zn-SOD mutations Head trauma, low education, calorie intake Head trauma,

Tipos de morte celular: Necrose e Apoptose

Biologia Celular e Molecular, 2008/2009

Objectivos:• Definir o papel da morte celular em biologia, tanto

fisiológica quanto patologicamente.

• Exemplificar a sua função no desenvolvimento embrionário, na organogénese, na renovação de células, na regressão de tumores e ainda em processos neurodegenerativos

• Definir necrose. • Listar alguns tipos de necrose e caracterizar as diferentes

alterações celulares.

• Definir a apoptose.

• Identificar e descrever as diferentes vias apoptóticas.

Biologia Celular e Molecular (1º semestre - 1º ano, 2008-2009) – Ciclo Básico de Medicina e Medicina Dentária Sandra Morais Cardoso

Homeostase de um organismo

multicelular

Controlada por: Proliferação – Diferenciação – Morte Celular

Remoção activa de células indesejáveis a uma comunidade social

Controlo social da comunidade

Sobrevivência do organismo


Longevidade das células• 210 tipos de células diferentes

• Cerca de 5x1011 de células de sangue morrem por dia

• Os neutrófilos vivem 6-7 h na circulação


Em células incapazes de receber sinais de sobrevivência e/ou

capazes de receber sinais de morte

Em células que não podem reparar uma lesão adequadamente

Perda do contacto c/ membrana basal - ANOIKIA (Loss of Home)

Hormonas, citocinas (TNF),

Radiação, citostáticos

Activação de um programa genético de suicídio


Morte celular em diferentes processos

biológicos

Desenvolvimento embrionário

Ex: Formação dos dedos

Sindactilia


Evolução da perda neuronal num doente de Parkinson

Actividade Dopaminérgica

Doenças degenerativas

Morte celular patológica

Cancro


Necrose:

• Processo passivo (independente de ATP)

• Caracterizado por uma destruição massiva da célula:

-Colapso da membrana plasmática e por conseguinte das membranas dos organelos

-Libertação dos componentes intracelulares

-Geralmente, os restos celulares são difíceis de serem fagocitados, por falta de emissão de sinais, pelas células do sistema imunológico !inflamação

Morte acidental das células ou de um tecido, por causas fisiológicas (isquémia, isto é, obstrução arterial), traumatismos graves ou agentes infecciosos (fungos, bactérias e vírus)


Exemplos de doenças onde a necrose está envolvida: Peste bubónica (peste negra)

• Pandemia que, no século XIV (Idade Média), assolou a Europa e dizimou cerca de 25 a 75 milhões de pessoas (1/3 da população).

• Doença infecciosa causada pela Yersinia

pestis, bactéria transmitida ao homem pelas pulgas dos ratos-pretos (Rattusrattus) ou outros roedores.

– Estas bactérias (bacilos) invadem os nódulos linfáticos que ficam inflamados, necróticos e hemorrágicos.


Acidente Vascular Cerebral:

interrupção da irrigação sanguínea (oxigénio e glicose) numa região do cérebro ! perda da função neuronal;

Existem dois tipos:Isquémico: falta de irrigaçãoHemorrágico: ruptura de um vaso sanguíneo intracraniano

Factores de risco para AVC: Hipertensão,Aterosclerose,Diabetes, Colesterol elevado,Tabagismo, Álcool, Problemas cardíacos

Doença Vascular


Gangrena devido a uma úlcera diabetica

• Gangrena: é a necrose de um tecido por isquémia, ou

seja, devido a uma obstrução arterial, por embolia,

choque, infecção, ou por exposição a frio intenso

!1º. perda do fornecimento de

oxigénio e outros nutrientes

!2º. invasão bacteriana

!3º. putrefacção do tecido

Doença Vascular


Necrose - eventos celulares

http://www.youtube.com/watch?v=g4tlx2W8ssY


O que é a Apoptose

Apoptose ou Morte Celular Programada é um modo de "autodestruição celular" que requer energia e síntese proteica, exercendo o papel oposto ao da mitose


Regulação defeituosa - Doenças

Cancro, doenças autoimunes

Doenças neurodegenerativas, SIDA, osteoporose, envelhecimento

Regulação defeituosa - Doenças

Cancro, doenças autoimunes

Doenças neurodegenerativas, SIDA, osteoporose, envelhecimento

Condições fisiológicas

Desenvolvimento embrionário - Metamorfose

- Morfogenese

- Sinaptogenese

Adulto - Normal turnover celular

- Selecção tímica negativa

- Citotoxicidade mediada por células

Condições fisiológicas

Desenvolvimento embrionário - Metamorfose

- Morfogenese

- Sinaptogenese

Adulto - Normal turnover celular

- Selecção tímica negativa

- Citotoxicidade mediada por células

Apoptose


Fases da apoptose

A mitocôndria controla a decisão para a morte celular


Citocromo c

Morte da Célula

Receptores Membranares Apoptóticos

(Família TNF/NGF)

Pró-Caspase-8

Domínio Apoptótico

Molécula Adaptadora

Caspase-8

Insultos Celulares(comp. citotóxicos, radiação, choque térmico, privação de

factores de crescimento)

Pró-Caspase-9

ApoptossomaApoptossoma

Caspase-9

Caspase-3 Caspase-7

Caspase-6 Caspase-2

Pró-Caspase-4

RERE

Caspase-4

Insultos ao RE(Tapsigargina)

NNúúcleocleo

Condensação e Fragmentação do

ADN


Via membranar ou

extrínseca

Via membranar ou

extrínseca


Via mitocondrial ou intrínsecaVia mitocondrial ou intrínseca


Libertação de Citocromo c da Mitocôndria

A

B C D

BaxBaxtBidtBid

!![Ca[Ca2+2+], ROS, ], ROS, !"#!"#mm, , Bax, Bax, !!pH, PpH, Pii, ,

$$[[nuclenucleóótidos adeninatidos adenina]]

(Desagher & Matinou, 2000)

A) Formação de um megacanal mitocondrial não selectivo de elevada condutância(PTP: ANT + VDAC + Ciclofilina D)

Ruptura não EspecRuptura não Especíífica da fica da Membrana Mitocondrial Membrana Mitocondrial

ExternaExterna

FormaFormaçção de Canais ão de Canais Condutores de Citocromo cCondutores de Citocromo c

Função Mitocondrial Preservada(Importante para o processo de

activação das caspases)


Via mitocondrial ou intrínsecaVia mitocondrial ou intrínseca


ProteProteíínasnas

AntiAnti--apoptapoptóóticasticas

ProteProteíínana

ProPro--apoptapoptóóticatica

MorteMorte celularcelular porpor apoptoseapoptose


Proteínas que promovem ou suprimem a

apoptose

• Pró-apoptóticas FunçãoCaspases Clivagem de enzimas, citosqueleto e canais iónicosBax, Bad Formação de poros, libertação de Cit cReceptores do glutamato Influxo de Ca2+, activação de cinases e proteasesFas Inicia cascata da morte/caspase-8Par-4 Disfunção mitocondrial, inibição NF-kBp53 Transcrição genes de morte, aumento de acção da Bax

• Anti-apoptóticasBcl-2, Bcl-XL Estabiliza função mitocondrial, antioxidanteIAPs Inibição das caspasesFactores tróficos/Citoquinas Expressão de enzimas antioxidantes, proteínas

reguladoras de Ca2+, IAPs, Bcl-2Telomerase Previne o encurtamento dos telómerosEnzimas antioxidantes Reduz o stresse oxidativo

Proteína cinase C% Estimula a expressão de NF-kBProteínas que ligam Ca2+ Homeostase de Ca2+


APOPTOSE

Activação de Caspases

(cysteine-aspartic proteases)

&Activação de endonucleases

&Fragmentação do DNA


Apoptose: eventos celulares

http://www.youtube.com/watch?v=witLM-V2v8Biologia Celular e Molecular (1º semestre - 1º ano, 2008-2009) – Ciclo Básico de Medicina e Medicina Dentária Sandra Morais Cardoso

• Anexina

• Br-dUTP

• TUNEL

• Imunohistoquímica

• Função mitocondrial

• Microarrays

Análise da Apoptose


• São proteínas que ligam fosfolipidos na presença de cálcio• As alterações celulares que ocorrem durante o processo apoptótico

incluem a perda da assimetria dos fosfolípidos numa fase inicial• Os conjugados de Anexina V são utilizados para se detectar células

apoptóticas• Utiliza-se a Anexina V marcada fluorescentemente (Citometria de fluxo,

microscopia de fluorescência e confocal)

Anexina

PI Annexin V


• Degradação do ADN genómico em fragmentos de 180-200 pb• A fragmentação cria locais 3’-OH• Estes locais podem ser marcados com Br-dUTP (bromodeoxiuridina

trifosfato)• Pela acção da TdT (transferase terminal)

“DNA Laddering”


• Análise da expressão génica diferencial

• Genes agrupados em famílias de genes

Nº total de genes envolvidos na apoptose: 198

“Microarrays”


• Seres humanos têm aproximadamente 1014

células-Capazes de entrarem em apoptose

• O processo apoptótico pode ficar comprometido-Pode resultar numa morte celular inapropriada dando origem a doença

• Potencial uso terapêutico-Modulação da apoptose para o tratamento de doenças

Apoptose na clínica


Factores Genéticos e Ambientais podem

desencadear a apoptose:

Disorder Genetic factors Environmental factors

AD

PD

HD

ALS

APP, Presenilin mutations, ApoE

'-synuclein, parkin mutations

Poly-CAG expansions in huntingtin

Cu/Zn-SOD mutations

Head trauma, low education, calorie intake

Head trauma, toxins, calorie intake

Toxins, autoimmune response


Doença de Alzheimer

* Doença neurodegenerativa que ocorre tardiamente:

- clinicamente ( decréscimo progressivo da capacidade cognitiva

- primeiro sintoma da DA ( declínio da memória recente

* Estadio inicial da DA: Alteração do citosqueleto por hiperfosforilação anormal

da proteína tau (neurónios piramidais corticais)

- A tau fosforilada dissocia-se dos microtúbulos ( filamentos

insolúveis

* Cortex cerebral de doentes de DA: depósitos extracelulares de b-amilóide (Ab,

)4 kDa); Ab - produto minoritário do metabolismo da APP

Evidências de morte celular por apoptose: - decréscimo Bcl-2 em neurónios contendo tranças neurofibrilhares- aumento dos níveis de Bax (obs. antes da clivagem do ADN)- abertura PTP; libertação citocromo c; activação de caspases


“Gostaria de não ficar inutilizada e se possivel melhorar”

(Escrito por um doente de Alzheimer)


• Causadas por repitição do codão CAG, que codifica a glutamina

Doença de Poliglutaminas

Disease Gene name Chromosomal

location

Pattern of

inheritance

Protein Normal repeat

length

Disease repeat

length

Spinobulbar

muscular atrophy

(Kennedy disease)

AR Xq13–21 X-linked recessive androgen receptor

(AR)

9–36 38–62

Huntington disease HD 4p16.3 autosomal dominant huntingtin 6–35 36–121

Dentatorubral-

pallidoluysian

atrophy (Haw River

syndrome)

DRPLA 12p13.31 autosomal dominant atrophin-1 6–35 49–88

Spinocerebellar

ataxia type 1

SCA1 6p23 autosomal dominant ataxin-1 6–44 39–82

Spinocerebellar

ataxia type 2

SCA2 12q24.1 autosomal dominant ataxin-2 15–31 36–63

Spinocerebellar

ataxia type 3

(Machado-Joseph

disease)

SCA3 14q32.1 autosomal dominant ataxin-3 12–40 55–84

Spinocerebellar

ataxia type 6

SCA6 19p13 autosomal dominant '1A-voltage-

dependent calcium

channel subunit

4–18 21–33

Spinocerebellar

ataxia type 7

SCA7 3p12–13 autosomal dominant ataxin-7 4–35 37–306

Spinocerebellar

ataxia type 17

SCA17 6q27 autosomal dominant TATA binding

protein

25–42 45–63


Mecanismos

celulares


Biologia da Proteólise:Autofagia e Sistema Ubiquitina

Proteassoma

Biologia Celular e Molecular, 2008/2009

Objectivos:• Descrever o processo autofágico e relacionar este

processo com a doença.• Descrever autofagia celular como a chave para o

desenvolvimento de novos tratamentos contra o cancro, doenças degenerativas e infecções.

• Descrever o papel dos lisossomas na função celular.• Identificar as doenças associadas à disfunção dos

lisossomas.

• Definir o papel do sistema ubiquitina-proteassoma na função celular.

• Identificar as doenças associadas à disfunção do proteassoma.


Rough ER Smooth ER

Centrosome

CYTOSKELETON

Microfilaments

Microtubules

Microvilli

Peroxisome

Lysosome

Golgi apparatus

Ribosomes

Nucleolus

Chromatin

NUCLEUS

Flagelium

Intermediate filaments

ENDOPLASMIC RETICULUM (ER)

Mitochondrion

Nuclear envelope

Plasma membrane


Lisossomas: compartimentosDigestivos

Lisossoma– É um organelo membranar do citosol das células

– Contem várias enzimas hidrolíticas

– Tem um pH de 4.5 a 5.5

– Tem como função a digestão intracelular



As enzimas do lisossoma são as hidrolases

Peptidases

DNAases

RNAases

Lipases

Fosfatases

Glucosidases

Carboxilases

Sulfatases

Esterases

Existe uma hidrolase para cada tipo de biomolécula



H+

Glicoproteínas que protegem contra a hidrólise

Transportadores membranares

Bomba de protões

H+

H+

H+

H+

aminoácidos

glucose

nucleótidos


Função dos lisossomas

• Fagocitose: processo pelo qual as células internalizam material do meio extracelular (<0.5 !m) que é depois digerido pela acção do lisossoma. Ex: macrofagos

• Autofagocitose ou autofagia: processo pelo qual as células degradam organelos velhos ou danificados

• Endocitose mediada por receptores: processo pelo qual as células que tem determinados receptores tomam determinadas macromoléculas. Ex: hormonas, anticorpos, lipoproteínas


Digestão intracelular

Fagocitose

(a) Phagocytosis: lysosome digesting food

1 µm

Lysosome containsactive hydrolyticenzymes

Food vacuole fuses with lysosome

Hydrolyticenzymes digestfood particles

Digestion

Food vacuole

Plasma membrane

Lysosome

Digestiveenzymes

Lysosome

Nucleus


Autofagocitose Fagocitose


Doenças associadas aos lisossomasMorquio A Disease

Morquio B Disease

Mucolipidosis IIIC

Mucolipidosis IV

Mucopolysaccharidosis IX

Multiple Sulfatase Deficiency

Neuronal Ceroid Lipofuscinosis

Niemann-Pick Disease A, B, C1, and C2

Northern Epilepsy

Pompe Disease

Pseudo-Hurler Polydystrophy (mucolipidosis

IIIC)

Pycnodysostosis

Salla Disease

Sandhoff Disease

Sanfilippo disease A, B, C, and D

Santavuori-Haltia disease

Scheie Disease

Schindler Disease

Sialidosis

Sly disease

Sphingolipid Activator Protein Deficiency

Tay-Sachs Disease

Wolman Disease

Aspartylglucosaminuria

Batten Disease

Cholesterol Ester Storage Disease

Cystinosis

Danon Disease

Fabry Disease

Farber Disease

Fucosidosis

Galactosialidosis

Gaucher Disease

GM1 Gangliosidosis

GM2 Gangliosidosis (AB Variant)

Hunter Disease

Hurler Disease

Hurler-Scheie Disease

I-Cell Disease (mucolipidosis II)

Infantile Free Sialic Acid Storage

Disease

Jansky-Bielschowsky Disease

Krabbé Disease

Kuf Disease

Mannosidosis

Maroteaux-Lamy Disease

Metachromatic Leukodystrophy

Sistema Ubiquitina-Proteassoma: processo de degradação proteica

• Ubiquitinação– Marcação da proteína alvo a uma cadeia de

poliubiquitina

– Direciona estas proteínas para o proteassoma

• Proteassoma– É um complexo multienzimático que degrada

proteínas

– Estas enzimas são proteases


Via da Ubiquitinação

E1, activadora da ubiquitina

E2, conjugadora da ubiquitina

E3, ligase da ubiquitina4 monomeros de

ubiquitina


Translocação de proteínas marcadas

DUB: Enzimas que desubiquitinam ou são proteases específicas para a ubiquitina; ambas removem a ubiquitina das proteinas alvo, impedindo a sua degradação

Proteólise

A subunidade 20S do proteassoma tem 3 subunidades catalíticas com diferentes especificidades para o substracto:

-“Quimiotripsina-like”

-“Tripsina-like”

-“PHGH-like” (peptidyl-glutamyl peptide-hydrolyzing)

O resultado da proteólise são polipeptídeos de 4 a 25 resíduos


Via de degradação

• Essencial para muitos

processos celulares:

Ciclo celular-mitose

Expressão génica

Respostas ao stress oxidativo

Apoptose

• Produtos da degradação:

Pequenos peptídeos

Factores de transcrição activos-NFkB

Reguladores do ciclo celular activos-p53


Função do Proteossoma

http://www.youtube.com/watch?v=w2Qd6v-4IIc


Disfunção do proteossoma

• InibiçãoActividade anti-tumural

Redução das lesões da psoriase

Efeito positivo na asma

Doenças associadas ao proteossoma

• Directamente: Duas formas familiares de Parkinson:

Mutação no gene da parkina (ligase E3 da ubiquitina)

Mutação no gene da UCHL1 (terminal carboxilico da hidrolase 1 da ubiquitina)

• Indirectamente: Doença de Parkinson

Doença de Creutzfeldt-Jakob

Doença de HuntingtonBiologia Celular e Molecular (1º semestre - 1º ano, 2008-2009) – Ciclo Básico de Medicina e Medicina Dentária Sandra Morais Cardoso

Doença de Parkinson• Afecta 1-2 % da população >65 anos• Esporádica ou familiar• Marcadores Neuropatológicos:- Morte dos neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta

seguida de perda da inervação dopaminérgica do striatum

- Corpos de Lewy ('-sinucleína agregada)

• Característica clínicas:- distúrbios extrapiramidais : bradicinésia, tremor de repouso, rigidez


Kuru

Doença neurológica descoberta em 1950 no povo Fore da Papua Nova Guiné

Tipo de encefalia espongiforme

Sintomas: tremores


Doença Creutzfeldt-Jakob• Afecta 1-1000000 de indivíduos

• Idade média de início 50 anos

• Sintomas:

perda de memória, tremores, desordem na marcha, postura rígida e ataques epilépticos devida à uma rápida perda de células cerebrais causada por uma proteína transmissível chamada prião


Doença de Hungtinton


• Idade média de início: 40-50 anos (tb alguns casos de ocorrência juvenil)

• Morte dos doentes após 10-20 anos• Autossómica dominante (1:10000 indivíduos)

• Marcadores Neuropatológicos:- Morte dos neurónios ao nível do estriado, envolvido na iniciação dos

movimentos voluntários, e do cortex cerebral

• Característica clínicas:

- Movimentos involuntários, frequentes e rápidos,

- Redução da função cognitiva e demência progressiva distúrbios

Doença de Hungtinton


AutofagiaLysosome containingtwo damaged organelles 1 µ m

Mitochondrionfragment

Peroxisomefragment

É um processo catabólico que envolve a degradação de componentes celulares através da maquinaria do lisossoma

Permite manter a homeostase celular, entre a síntese e a degradação de produtos celulares


Tipos de autofagia

MacroautofagiaCaracteriza-se pela sequestração de organelos ou de proteínas numa vesícula membranar- autofagossoma- que posteriormente funde com o lisossoma –autofagolisossoma- sendo o seu conteúdo degradado por hidrolaseslisossomais


Microautofagia

Ocorre quando os lisossomas “engolem” partes do citoplasma

Tipos de autofagia

H+

H+


Tipos de autofagia


Desde o principio…


Autofagia: visualização por M.E.


Funções da autofagia

• Privação de nutrientes

– Durante o jejum prolongado, os níveis de autofagia aumentam: !degradação de componentes celulares não vitais e, consequentemente, !libertação de nutrientes para a própria célula ! processo de sobrevivência, adaptativo, da célula e do organismo.

• Infecção

– Quando as células são infectadas por determinadas bactérias, o processo autofágico é activado como forma de as eliminar.

• Morte celular autogáfica (autophagic cell death)

– Morte celular tipo II


Regulação da autofagia

Estimulam a autofagia

Inibem a autofagia

TOR-Regulador da autofagia


Como é que a autofagia mata uma célula?

Autofagia massiva (Morte celular tipo II)

Durante este processo ocorre a destruição de largas porções de citosol e de organelos, causando uma irreversível atrofia celular, induzindo o colapso da função celular.

Autofagia activa a Apoptose (Morte celular tipo I)

A autofagia desenvolve-se como a primeira resposta ao estimulo (stress) e sódepois activa a apoptose que vai ser responsável pela morte celular


A relação entre a autofagia e a apoptose


Interacção entre a autofagia e a apoptose


Doenças associadas

• Indirectamente: Doença de Parkinson

Doença de Alzheimer

Doença de Huntington

Cancro

SIDA


Doença de Parkinson


• A SIDA é provocada pelo vírus da imunodeficiência humana (human

imunnedeficiency virus, HIV), podendo a sua transmissão ocorrer por:

– relações sexuais,

– contacto com sangue infectado (por exemplo, transmissão de mãe para filho durante a gravidez ou durante o parto),

– amamentação (transmissão de mãe para filho).

• A SIDA matou mais de 20 milhões de pessoas nos últimos 20 anos.

• Ao atingir o sistema sanguíneo do organismo humano, o VIH começa de imediato a reproduzir-se nos linfócitos T4 (células CD4+) conduzindo-os àsua morte.

• Sob a acção do vírus, a função de defesa do organismo fica enfraquecida; a pessoa infectada, ou seropositiva, torna-se mais vulnerável à infecção por outras bactérias e vírus ! doenças oportunistas: são exemplos as formas raras de pneumonia, toxoplasmose, candidose, meningite criptocócica e cancros, como o Sarcoma de Kaposi.

HIV-SIDA


HIV-SIDA

• No início ! infecção aguda (até quatro semanas após o contágio)

– O indivíduo infectado manifesta vários sintomas pouco característicos, semelhantes aos de uma gripe;

• O vírus continua-se a multiplicar, podendo o indivíduo ser seropositivo e não apresentar quaisquer sintomas por um período de tempo longo (exemplo, 15 anos);

• O organismo já não consegue repor completamente a quantidade de células CD4+ destruídas pelo vírus; esta fase caracteriza-se por uma imunodepressão moderada, com sintomas e sinais associados: emagrecimento, suores nocturnos, diarreia prolongada e febre;

• O indivíduo seropositivo passa a desenvolver a doença – SIDA –quando as células CD4+ baixam para valores inferiores a 200 celulas por mililitro de sangue, ficando o organismo desprotegido ! infecções e/ou doenças oportunistas.


HIV-SIDA


HIV-SIDA


Cancro


Cancro


Bibliografia• Papers:

- Kanduc D et al. Cell death: apoptosis versus necrosis (review). Int J Oncol, 21: 165-170 (2002)

– Klionsky DJ. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding inless than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 931-937 (2007).

– Ravikumar B, Rubinsztein DC. Role of autophagy in the clearance of mutanthuntingtin: a step towards therapy? (Review) Mol Aspects Med, 27: 520-527(2006).

– Espert L et al. Autophagy and CD4+ T lymphocyte destruction by HIV-1(Review). Autophagy. 3: 32-34 (2007).

- Karantza-Wadsworth V, White E. Role of autophagy in breast cancer.Autophagy. 3: 610-613 (2007)

– Kanduc D et al. Cell death: apoptosis versus necrosis (review). Int J Oncol,21: 165-170 (2002)

– Maiuri MC et al. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagyand apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol, 8: 741-752 (2007)

– Thorburn A. Apoptosis and autophagy: regulatory connections between twosupposedly different processes. Apoptosis (in press, 2008)

• Livros:

- Alberts et al. Cell Biology: Chapter 18


Biologia das células estaminais:Terapias Celular e Génica

Biologia Celular e Molecular 2008/2009

Objectivos:• Definir o que são células estaminais.

• Identificar os diferentes tipos de células estaminais.

• Explicar o cancro como uma doença das células estaminais.

• Analisar a aplicabilidade da terapia celular na prática clínica. -Doenças autoimunes-Diabetes-Doenças Neurodegenerativas

• Descrever a Terapia Génica como um novo ramo terapêutico da medicina moderna.

• Analisar a aplicabilidade da terapia génica na terapia celular

-Exemplificar a importância dos siRNA


Células estaminais

• Células indiferenciadas com capacidade proliferativa.

• Podem-se diferenciar em diferentes tipos celulares em resposta a diferentes estímulos.

• Têm o potencial de se desenvolver em células maduras, com funções especializadas


Classificação das células estaminais

• Células Totipotentes: Zigoto ou Ovo fertilizado

• Células Pluripotentes: Células que dão origem a todas as células das camadas embriónicasgerminativas

• Unipotente: dão origem a um tipo específico de células


Células estaminais embrionárias

Derivam do embrião antes da sua implantaçãono útero

Oviducto




• Uma fonte de células estaminais não embrionárias é o sangue do cordão umbilical, que possui uma grande concentração de células estaminais hematopoiéticas, para além de células estaminais mesenquimais e células estaminais/progenitoras endoteliais.

• Estas células estaminais neonatais podem ser colhidas e processadas logo após o nascimento, num processo totalmente seguro e indolor para a mãe e para o recém-nascido, tendo substancial aplicabilidade terapêutica

Células estaminais da placenta e do cordão umbilical


Células estaminais adultas

Como qualquer célula estaminal divide-se durante longos períodos dando origem a cópias idênticas,

Podem dar origem a diferentes tipos de células diferenciadas


Tipicamente são chamadas de células precursoras ou progenitoras de um determinado tipo de células diferenciadas


Tipos de células estaminais adultas

• Células estaminais neuronais:- na zona Subventricular

- na zona Ventricular

- no Hipocampo

- no cérebro fetal

- na crista neural

• Células estaminais da medula óssea e sangue:- Hematopoiéticas

- Medula óssea

• Células estaminais adultas em diferentes tecidos:- Células progenitoras endoteliais

- Células musculo esquelético

- Células precursoras epiteliais da pele e sistema digestivo

- Células do pâncreas e fígado


Plasticidade de células estaminais adultas



Doenças autoimunes

• Esclerose múltipla

• Diabetes tipo1

• Lúpus

• Tem de distinguir os mais variados componentes celulares do próprio corpo dos componentes celulares dos organismos invasores

•Infecção versus Doenças autoimunes

• Pneumonia

• Cistite


Sistema Imunológico• No Timo as células T são educadas a

distinguirem as proteínas do próprio corpo das outras

• As células T auto-reactivas, são eliminadas no Timo

• Se o sistema falha: doenças auto-imunes


Células estaminais hematopoiéticas

• Hematopoiese: todas as células derivadas de uma única

célula precursora, o hemocitoblasto, que dá origem a um progenitor para cada tipo de célula

- Eritrócitos

- Leucócitos

- Plaquetas


Diferenciação das células hematopoiéticas e da medula


Selecção de células estaminais hematopoiéticas

FACS

Células marcadas com fluorescência

(1:10000 células)

Células ligadas a ferro


Cancrouma doença das células estaminais

• As células estaminais adultas permaneceram no organismo durante um período de tempo alargado, podendo acumular mutações pró-oncogénicas.

• As células estaminais (em constante divisão) podem facilmente adquirir um fenótipo tumorogénico.

• O transplante de células estaminais em indivíduos adultos pode conduzir à formação de tumores: teratocarcinomas, tumores complexos derivados de células embrionárias pluripotentes. No entanto nunca foram encontradas metástases após transplantes de células estaminais embrionárias.


Terapêutica

• Drogas anti-inflamatórias, imunossupressores (esteróides, inibidores de citocinas)

• Transplante de células hematopoiéticas do próprio indivíduo (autólogo)

- Injecções de um factor de crescimento: libertação de células estaminais da medula óssea para a corrente sanguínea

- Isolam-se as células estaminais do sangue do doente

- Faz-se quimioterapia e/ou radioterapia para eliminar as células maduras do sistema imunológico

- Transfusão das células estaminais, que migram para a medula óssea onde se começam a diferenciar

7 doentes com Lúpus receberam este tratamento e durante 3 anos

não necessitaram de medicação imunossupressora


Diabetes• Caracterizada por níveis elevados

de glicose no sangue (hiperglicemia).

• Os sintomas mais comuns são: secreção excessiva de urina(poliuria), sede (polidpsia) e fome (polifagia) intensas.

• O diabetes tipo 1 é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células beta pancreáticas pelas células do sistema imune, e os pacientes necessitam de injecções de insulina exógena para sobreviver.

• O diabetes tipo 2, está intimamente relacionado a obesidade e atinge principalmente pessoas com mais de 40 anos.



How are embryonic stem cells stimulated to differentiate?


Doenças Neurodegenerativas: Doença de Parkinson

!! Segunda doença neurodegenerativa mais comum - idade média de início: 55 anos

!! Afecta 1-2 % da população > 65 anos!! Idade é o principal factor de risco

Características clínicas

!! ~80% dos casos de Parkinsonismo!! distúrbios motores graves

- bradicinésia (lentidão de movimentos)- tremor de repouso- rigidez


Na doença de Parkinson a via nigrostriatal degenera

! Perda acentuada de neurónios dopaminérgicos que projectam para o putamen

e modesta dos neurónios que projectam para o caudate

! Despigmentação da SNpc devido à perda de neurónios dopaminérgicos (perda do pigmento castanho escuro neuromelanina)

Início dos sintomas: ~80% de

deplecção de DA no putamen e

~60% de morte de neurónios

dopaminérgicos na SNpc


Terapias Neuroprotectoras

"Antioxidantes" L-DOPA" Agonistas dopaminérgicos" Antagonistas dos receptores do glutamato" Inibidores da NOS

Terapias de Substituição Celular

" Transplantes: células neuronais fetaiscélulas estaminais embrionáriascélulas estaminais neuronais adultas

Terapias na doença de Parkinson

Terapias Cirúrgicas

" Estimulação cerebral profunda" Palidotomia


Transplante de células neuronais fetais dopaminérgicas

Problemas: éticos (neurónios de mesencéfalo de fetos com 6 a 9 semanas)células não formam sinapses

viabilidade e funcionalidade das células

aquisição de um fenótipo dopaminérgico


Investigação em células estaminais: porquê?

http://www.youtube.com/watch?v=a9WB_PXjTBo


Ensaios clínicos em 2005:10% doenças hereditárias monogénicas (ex: fibrose quística, SCID)

66% doenças poligénicas (ex: cancro)

Embora esta tenha muito potencial, é ainda muito experimental

Fase I: número pequeno de pacientes que são cuidadosamente observados, sendo dada atenção especial a quaisquer efeito colateral detectados. Testada em várias doses, com o objectivo de descobrir a dosagem ideal.

Fase II: se o tratamento apresenta um efeito positivamente útil, serátestado num número maior de pacientes

Fase III: Geralmente, esse ensaio envolve a comparação do novo tratamento com o que tem sido o tratamento padrão até o momento. Num ensaio aleatório, geralmente metade dos pacientes recebem o tratamento padrão e metade, o tratamento experimental.

A promessa:

• Transplantes terapêuticos

1. Podem crescer em cultura indefinidamente (fáceis de manter)2. Pluripotentes (formam vários tipos de células)3. A presença de vírus/doenças transmissíveis pode ser analisada4. Assumem o fenótipo das células vizinhas após transplante5. Possuem a capacidade de migração após transplante6. Produzem factores que contribuem para a reparação tecidular


Terapia Génica

• É um novo ramo terapêutico da medicina moderna.

• Permite a transferência de informação genética em células, tecidos ou órgãos de pacientes para que o produto da sua expressão possa curar ou retardar a progressão da doença.


Terapia Génica

• Esta abordagem permite tratar doenças:

- eliminando genes deletérios

- substituir genes anormais por genes normais

- introduzir genes que codificam proteínas mediadoras, por ex do sistema imunológico que ajudem a combater o cancro


Tipos de Terapia Génica

• Terapia Génica in situ – O gene(s) terapêutico transportado por um vector é directamente administrado ao tecido afectado.

• Terapia Génica in vivo - O gene(s) terapêutico transportado por um vector é directamente administrado ao doente.

• Terapia Génica ex vivo – As células do paciente são colhidas e semeadas em laboratório. São incubadas com vectores que transportam o gene terapêutico. As células com a nova informação genética são colhidas e transplantadas no paciente.


Terapia génica: onde?

• Terapia germinativa – O gene é inserido no DNA das células germinativas (óvulo ou espermatozóide), de modo a que a descendência tenha o gene inserido.

• Terapia somática – Envolve a manipulação da expressão génica em células que ser alteradas no paciente mas não nos seus descendentes. As células somáticas incluem todas as células do corpo humano menos as reprodutivas.


Vectores: veículos que transportam e protegem o DNA até à

sua chegada a uma população celular alvo

• Viralintegram o seu material

genético no genoma hospedeiro

-Retrovirus-Lentivirus (HIV)-Adeno-associados

Mantêm o seu material genético epissomal

-Adenovirus

• Não viralFísico

-Injecção do DNA livre na célula-Electroporação

Químico

-Lipossomas



• SCID ligada ao X (Severe Combined Immune Deficiency)

- Mutação no gene que codifica a proteína "c presente na membrana celular dos precursores dos linfócitos

- Estes não diferenciam em linfócitos NK e T- 3 das 17 crianças tratadas desenvolveram leucemia

• Hemofilia

- Mutação nos genes que codificam factores de coagulação- O gene terapêutico foi inserido no fígado dos doentes - O efeito terapêutico foi transiente, pois as células geneticamente

modificadas foram destruídas pelo sistema imune dos doentes.

Terapia Génica: Doenças

genéticas


• Cancro

Terapêutica: Terapia Génica suicida; Terapia viral oncogénica ( Vírus modificados que reconhecem as células tumorais e promovem a sua lise) etc.

2/3 dos ensaios clínicos são para cancro

• Doenças Neurodegenerativas

Terapêutica: Remover células da pele de doentes de Alzheimer, introduzir o gene que codifica o NGF (Nerve growth factor), e injectar estas células no cérebro dos doentes.

Terapia Génica: Doenças

adquiridas


Terapia Génica & Terapia Celular

• Terapia Celular – Infusão ou transplante de células num paciente para o tratamento de doenças herdadas ou adquiridas

Sobreposição das terapias génicae celular: Ex – Utilização de linfócitos-T no tratamento do cancro. Muitos tumores são reconhecidos e destruídos pelas células T dos doentes. Isolam-se os linfócitos-Te expandem-se fora do corpo, para depois serem administrados ao doente. Estas células podem ser manipuladas geneticamente por forma a tornarem as células eficientes a matarem as células tumorais.


Manipulação genética e selecção das células

estaminais em cultura

Para introduzir o material genético no interior da célula é necessário fazer chegar o gene até às células defeituosas.

Transfecção, processo de entrega e expressão de material genético com sucesso.

(lipossomas, DNA desaparece em poucos dias ou semanas se transiente)

(vector viral, transfecção estável, integração no genoma da células hospedeiras, mas episomal)


Integração “random”-silenciamento de genes, -introdução de mutações

Recombinação homóloga(processo de reparação do DNA)

Processo raroIntegração do transgene no genoma das células


Terapia génica: Hoje Janeiro, 2008

• Distrofia Muscular Duchenne

Gene que codifica a proteína distrofina (A distrofina é uma proteína que faz parte do complexo que liga o citoesqueleto de uma fibra muscular à matrix extracelular, através da membrana celular) está presente no cromossoma X. Mutações neste gene dão origem à distrofia muscular Duchenne em indivíduos do sexo masculino.

Injecção no musculo: gene da distrofina


Estes doentes não têm linfócitos-T e têm poucos ou disfuncionais linfócitos B.

Terapêutica: Transplante de medula ossea.

Ou Terapia Génica: o gene da ADA é inserido nas células da medula

óssea do próprio doente. Estas células são depois administradas ao doente após

uma depleção moderada das células da medula óssea.

(SCID) (severe combined immunodeficient)

por deficiência da adenosina deaminase

(ADA)

Terapia génica: Hoje Outubro, 2007


RNAi em células estaminais

• O RNA de interferência pode ser usado para manter um

determinado nível de actividade de um gene.

• A supressão estável de genes deletérios por RNAi, em células

estaminais adultas isoladas e modificadas ex vivo e depois

reintroduzidas, pode ser uma nova estratégia no tratamento de

determinadas doenças.


RNA de interferência (RNAi):

• Processo biológico

altamente conservado,

desde os nemátodos até

ao homem.

• Regulação da expressão

génica por silenciamento

RNA de interferência


Aplicações

1. Análise funcional de genes (genómica funcional)

a supressão estável dos genes pode ser induzida nas células de mamíferos, permitindo estudar os seus fenótipos em várias gerações de células,

estudo de genes implicados nas vias metabólicas;

2. Identificação de genes implicados no processo

tumoral;

3. Desenvolvimento de novas abordagens

terapêuticas:

cancro " inibição da expressão de oncogenes ou de genes que conferem resistência à quimioterapia,

doenças virais " inibição da replicação do vírus da SIDA ou do vírus da hepatite.

A quase totalidade dos 19 000 genes do C. elegans foi estudada por RNAi.

RNA de interferência e sua importância na

biomedicina molecular




A promessa:

• Terapia génica

1. São facilmente transfectáveis com genes terapêuticos, podendo expressar mais de um gene de interesse

2. Apresentam uma implantação correcta no tecido hospedeiro, permitindo a transcrição genética, logo a expressão proteíca

3. Migram para áreas lesadas, permitindo a “distribuição”de genes em diferentes áreas (cérebro)



Bioética

• O que é a vida?

• Um ser Humano vivo tem de ser protegido jurídica, ética e moralmente.

Critérios de morte cerebral por declaração da Ordem dos Médicos prevista no artigo 12º da Lei nº 12/93 de 22 de Abril, pressupõem que a certificação requer a demonstração da cessação das funções do tronco cerebral e da sua irreversibilidade. Após se assegurarem as condições prévias, como por exemplo a ausência de respiração espontânea e se observarem as regras de semiologia, que presupõem a ausência na totalidade de determinados reflexos do tronco cerebral, a verificação de morte cerebral requer entre outras metodologias a execução das provas de morte cerebral por dois médicos especialistas.


• Portanto, se um indivíduo morto é aquele que não responde a um estimulo doloroso, não respira espontaneamente, etc

então será cientificamente correcto dizer que um zigoto ou óvulo fertilizado não é um indivíduo vivo, mesmo que tenha todo o potencial de vir a ser?

Bioética


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Tipos de morte celular: Necrose e Apoptose · '-synuclein, parkin mutations Poly-CAG expansions in huntingtin Cu/Zn-SOD mutations Head trauma, low education, calorie intake Head trauma,