TRATAMENTO DO BAMBU USANDO NANOPARTÍCULAS DE … · As condições são apresentadas nas Tabelas 1 e 2 ... Pode-se controlar a quantidade de células inoculadas através de diluições

Departamento de Química

TRATAMENTO DO BAMBU USANDO NANOPARTÍCULAS DE PRATA: I- SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM

PROPRIEDADES ANTIFUNGICAS

Aluno: Eric Luz Orientadores: Omar Pandoli e Fatima Ventura Pereira Meirelles

Apresentação

Este trabalho dá início a uma parceria entre o Grupo de Pesquisa em Materiais e Tec-nologias não Convencionais, do Departamento de Engenharia Civil e o Departamento de Química da Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio)

1. Introdução A prata coloidal, ou solução de nanopartículas de prata (NPs-Ag) de tamanho de 5-100

nm, é um excepcional bactericida e germicida por excelência. Sabe-se que esta elimina mais de 650 espécies de, vírus, bactérias, parasitas, fungos e micoplasmas em poucos minutos[1].

Nos últimos anos tem sido uma constante na área da construção civil a preocupação pelo estudo de materiais, equipamentos e técnicas que possibilitem o barateamento da habita-ção popular. Os países em desenvolvimento possuem uma grande reserva de materiais poten-cialmente utilizáveis, mas faz-se necessário o desenvolvimento e implantação de técnicas de baixo consumo de energia, ao mesmo tempo em que se incentive a renovação dos produtos naturais.

O bambu é uma gramínea cuja macroestrutura e mesoestrutura possibilitam sua classi-ficação como material compósito inteligente. O baixo consumo de energia em sua produção, a grande abundância e seu baixo preço o caracterizam como material potencialmente promissor para esta finalidade, além de evitar a poluição, mantendo-se a conservação dos recursos natu-rais. Assim, a utilização do bambu pode ser de fundamental importância para o desenvolvi-mento sustentável, principalmente no que diz respeito às habitações populares [2].

A preservação do bambu pode ser alcançada por diferentes métodos, a depender do tempo em que está sendo feito o tratamento e da infra-estrutura disponível [3]. Dentre estes métodos, podem ser citados o tratamento com fumaça (fumegação) e a aplicação de soluções químicas impregnadas com aplicação de pressão (método boucherie) o por imersão. O trata-mento do bambu com objetivo de preencher os canais meso e microestruturados internos das fibras vegetais usando soluções coloidais de prata (materias nanoestruturados) poderá levar ao desenvolvimento de materiais não-convencionais com propriedades antifúngicas capazes de preservar a matriz biológica do bambu e com isso aumentar a durabilidade do bambu e melho-rar suas propriedades mecânicas.

Os principais agressores microscópicos do bambu são os fungos. Micro-organismo bem diferente das bactérias, os fungos são eucariotos formados por hifas, estruturas filamen-tosas e cilíndricas com diâmetro inferior a 10nm. Além de apresentarem duas principais par-tes: o micélio, um conjunto de hifas, (parte celular) e os esporângios, responsável pela esporu-lação e parte reprodutiva do fungo. Os fungos por apresentarem maior resistência do que as bactérias e o pouco estudo da ação das nanopartículas sobre estas espécies, tornam esse traba-lho inédito e de mais difícil comparação com a literatura.


2. Materiais e Métodos Experimentais

2.1 Síntese da nanopartículas de prata (NP-Ag) A síntese das nanopartículas de prata (NPs-Ag) foi executada por redução química con-

vencional do nitrato de prata (AgNO3) na presença do agente redutor borohidreto de sódio (NaBH4) e de agentes ligantes como tartarato de sódio (Na2C4H4O6) [4] e citrato trissódico (Na3C6H5O7) [5]. A reação pode ser simplificadamente representada abaixo.

AgNO3 + Ligante + NaBH4 Agº /Ligante + ½ H2 + ½ B2H6 +NaNO3

Foram utilizadas duas diferentes formas de condução: em batelada e fluxo continuo.

As condições são apresentadas nas Tabelas 1 e 2 respectivamente.

Tabela 1: Síntese de NP-Ag em batelada Cód. Ligante Ag+:Lig. pH R18 Citrato 1:10 6,7 R19 Tartarato 1:10 6,7 R20 Citrato 1:1 6,7 R21 Tartarato 1:1 6,7 R23 Citrato 1:8 6,7 R24 Citrato 1:6 6,7 R25 Citrato 1:4 6,7 R59 Tartarato 1:1 6,7 R71 Ac. Tartárico 1:1 10,0 R72 Ac. Tartárico 1:1 9,0 R74 Ac. Tartárico 1:1 7,0

Tabela 2: Síntese de NP-Ag em fluxo

Cód. Ligante Ag+:Lig. Ag+ (mL/min) Lig. (mL/min) R99 Tartarato 1:1 1 1 R102 Citrato 1:1 1 1 R103 Citrato 1:2 0,5 1 R104 Citrato 1:4 0,25 1 R105 Citrato 1:1 0,5 0,5 R106 Citrato 2:1 0,5 0,25

2.1.1 Síntese da NP-Ag em batelada: No processo em batelada, coloca-se uma mistura de AgNO3 em concentração fixa e li-

gante em concentração variada, ao abrigo da luz e agitação constante, até formação do com-plexo metal-orgânico. Em seguida a mistura transferida para uma seringa (Figura1) e gotejada num recipiente contendo NaBH4 na sob agitação constante (figura 2) e temperatura controla-da. Ao final avoluma-se a 8,5 mL com água. Utilizou-se diferentes razões molares (1:1; 1:2; 1:5 e 1:10) Ag+/Ligante.


Figura 1: Bomba Seringa Figura 2: Nanopartículas sob agitação

2.1.2 Síntese da nanopartícula de prata em fluxo [6]: Na síntese em fluxo (Figura 3), a solução de AgNO3 e ligante são sugadas por duas

bombas peristálticas (Figura 4) e injetas no microreator de vidro (Figura 5) aonde ocorre a formação do complexo prata-ligante. A proporção equivalente entre prata e o ligante é deter-minada pela velocidade parcial de cada reagente no sistema reacional microfluidico. No reci-piente de coleta, encontra-se o NaBH4 aonde ocorrerá a redução da prata sobre agitação cons-tante.

Figura 3: Síntese em Fluxo [6]

Figura 4: Bombas Peristálticas Figura 5: Microreator


2.2 Caracterização parcial das nanopartículas de prata: A solução coloidal preparada de acordo com o item 1é caracterizada pela determinação

de tamanho e dispersão das NPs-Ag. A caracterização morfológica e dimensões das nanopartículas de prata foram estima-

das por um espectrômetro UV-Vis da marca Perkin (Figura 6). O diâmetro das nanopartículas é proporcional ao comprimento de onda λ máximo de absorbância característico a 400 nm (Figura 7) [6-7].

Figura 6: Espectrômetro UV-Vis Figura 7: Esquema da oscilação de um plas-

mão para uma esfera, e o deslocamento eletrô-nica dos elétrons [7]

2.3 Testes Microbiológicos:

2.3.1 Micro-organismo: Neste estudo utilizou-se o fungo Aspergillus niger. Pode-se observar as células como

uma massa branca e os esporos como as partes escuras.

2.3.2 Preparo de meios de cultura e esterilização de materias: • Dissolve-se o Agar Saubourad ou Agar PDA (meios de cultura especifico para fungos)

em água destilada mantendo a concentração descrita no rotulo. Despeja-se o conteúdo num erlenmeyer, lacrando-o com uma rolha de algodão.

• Todo material (ponteiras, placas, erlenmeyer com o meio) deverá ser embrulhado com papel apropriado e colocado na autoclave (Figura 8) durante 20 minutos na temperatu-ra de 121 ºC a pressão de 1 atm.

• Após termino da esterilização, na câmara de fluxo laminar (Figura 9), um ambiente es-téril, despeja-se o meio de cultura nas placas Petri, antes que ocorra seu endurecimento do meio.


Figura 8: Autoclave Figura 9: Câmara de Fluxo Laminar

2.3.3 Repique (inóculo) do Fungo: Os testes antimicrobianos utilizaram o fungo do gênero Aspergillus como agente de

prova. A fim de manter o fungo vivo foi necessário fazer um repique a cada quinze dias, isto é, transferi-lo para uma nova placa com meio de cultura e deixa-lo crescer. O repique poder ser feito por dois métodos:

2.3.3.1 Técnica de esgotamento: Este método [7] é utilizado para isolar células pois devido à sua praticidade é muito uti-

lizado para fazer repiques de manutenção de estirpes: • Flamba-se a alça de inóculo, • Raspa-se um pouco da estirpe mãe, • Numa nova placa faz-se linhas de estrias (rabiscos) tentado ocupar o máximo da su-

perfície da placa e obtendo-se diferentes concentrações celulares. (Figura 10).

Figura 10: Técnica de esgotamento para obtenção de cultura pura: (a) modo espalhamento do inóculo; (b) aspecto da placa estriada após incubação. Notar a presença de crescimento na região correspondente ao início do procedimento e de colônias isoladas no final do processo [7]


2.3.3.2 Diluições Sucessivas:

Este método [7] é usado para testar efeitos de uma determinada substância sobre o mi-cro-organismo. Pode-se controlar a quantidade de células inoculadas através de diluições su-cessivas a partir de uma suspensão inicial (Figura 11).

• Por meio de alça de inoculo, raspa-se um pouco da estirpe mãe e suspende-se em tam-pão.

• Realiza-se diluições sucessivas da suspensão celular até que alcance a concentração desejada.

• Espalha-se o volume desejado (100 µL), com a alça de Drigalski, de forma uniforme na placa com meio de cultura Incuba-se na temperatura de crescimento do fungo pelo tempo desejado.

Figura 11: Ilustração método das Diluições Sucessivas [7].

2.3.4 Atividade microbiana: As suspensões diluídas sucessivamente, conforme item 2.3.3.2, foram espalhadas em placas de Petri contendo diferentes soluções de NP. A saber:

• Diferentes ligantes • Diferentes pH • Diferentes proporções de ligantes • Obtidas por diferentes formas de condução

As placas são incubadas a 37ºC durante uma semana e a observação do crescimento mi-

crobiano é feita diariamente ao longo deste tempo.


Foram utilizadas duas abordagens: • Teste (Figura 12) com NP diluídas, espalhadas uniformemente na placa • Teste (Figura 13) com NP concentradas no papel de filtro

Figura 12: Placa com NP diluídas Figura 13: Placa com NP concentrada

3. Resultados e Discussão: Os experimentos foram realizados em duplicata e os resultados típicos são apresenta-

dos.

3.1 Síntese e caracterização das nanopartículas Na síntese das nanopartículas de prata (NPs-Ag) foram utilizados agentes ligantes como

citrato e tartarato em diferentes proporções. A figura 15 demonstra diferentes soluções coloi-dais de nanopartículas apresentando colorações diferentes. Tais cores indicam NPs com dife-rentes diâmetros, como será verificado na Tabela 3.

Figura 15: Exemplos de soluções coloidais de nanopartículas

Os espectros de absorção de cada NP utilizada nesta fase do trabalho encontram-se agrupadas nos gráficos 1 e 2 para os experimentos em batelada com citrato e tartarato respec-tivamente e no gráfico 3 para os experimentos em fluxo.

Na tabela 3 encontram-se os resultados obtidos na síntese e caracterização das nanopar-tículas de pratas utilizadas nesta fase do projeto.


Tabela 3: Características das NP obtidas

Ag+ : ligante 1:1 1:4 1:6 1:8 1:10 NP R20 R25 R24 R23 R18

λ máximo(nm) 404,19 402,99 405,78 405,61 417,17 C

itrat

o Diâmetro (nm)* 29,397 27,882 31,379 31,168 44,778

NP R21/R59 R19 λ máximo(nm) 401,63/394,88 405,05

Em B

atel

ada

Tarta

rato

Diâmetro (nm)* 26,146/17,235 30,472

Ag+ : ligante 1:1 1:1 1:2 1:4 2:1 NP R102 R105 R103 R104 R106

λ máximo(nm) 420,50 392,91 400,08 412,21 407,89 Diâmetro (nm)* 48,428 14,541 24,144 39,116 33,967 C

itrat

o

Fluxo(mL\min) 1 0,5 0,5:1 0,25:1 0,5:0,25 NP R99

λ máximo(nm) 397,52 Diâmetro (nm)* 20,7796 Em

Flu

xo (F

)

Tarta

rato

Fluxo (mL\min) 1 *Diâmetro da nanopartícula estimado de acordo com a FlowChemistryPracticalCourse [2], utilizando λ

máximo no espectro UV-Vis

Gráfico 1: Espectro UV-Vis das Nanopartículas em batelada, citrato como ligante Pela valores da tabela 3 e do gráfico 1 observa-se a importância da proporção entre Ag+

: ligante. Utilizando o citrato como agente ligante obtém-se nanopartículas com diferentes λ máximo de absorbância. Encontra-se NP com médias de pico em 402,98nm conferindo um tamanho próximo a 27nm a nanopartículas grande com absorbância máxima em 417,17nm caracterizando um diâmetro aproximadamente de 45nm [6].


Gráfico 2: Espectro UV-Vis das Nanopartículas em batelada, tartarato como ligante

Pelos valores da tabela 3 e do gráfico 2 comprova-se um deslocamento dos picos de ab-

sorção máxima de duas nanopartículas, ambas obedecendo condições idênticas de preparo, a R21 e R59: apresentaram uma grande diferença no λ máximo de absorbância (394,88 a 491,63). Observa-se que no caso do tartarato a proporção de Ag+ : ligante, 1:10 (R19), apre-senta nanopartículas maiores do que a proporção 1:1 (R21 e R59).

Gráfico 3: Espectro UV-Vis das nanopartículas em fluxo continuo


Pelos valores da tabela e do gráfico 3 verifica-se a influência da velocidade de fluxo na síntese de NP. Comparando-se R102 com R105, obtidas com a mesma proporção equivalente de prata e agente ligante, 1:1, verifica-se diferentes tamanhos: nanopartículas grandes, com pico no espectro em 420,50nm, e nanopartículas pequenas com λ máximo de absorbância de 392,91nm. Tal diferença pode ser decorrente dos diferentes fluxos utilizados 1 e 0,5mL/min. Constatou-se também uma diferença de resultados para os dois ligantes tartarato e citrato. A R99 e R102, ambas com a mesma velocidade de fluxo e mesma proporção equivalente Ag+ : ligante (1:1), apresentaram resultados extremos. A R99 com o pico no espectro na casa dos 397,52nm resultou numa das menores nanopartículas obtida no estudo e a R102 com λ máxi-mo de 420,50nm caracteriza uma das maiores nanopartículas obtidas.

Na síntese em fluxo essa variação é menor, provavelmente devido ao encontro de Ag+ e ligante na proporção desejada. Verifica-se que velocidade de fluxo, de mesma proporção e-quivalente, menores favorecem sínteses de NP menores.

Segundo a literatura as menores nanopartículas são os agentes antimicrobianos mais efi-cientes [5]. Assim, pode dizer que todas as nanopartículas R21, R99 e R59, utilizando o tarta-rato como agente ligante podem ser as mais promissoras para estudos futuros do que as sinte-tizadas com citrato, tanto em batelada e como em fluxo continuo.

Em alguns casos a síntese em batelada forneceu nanopartículas (R59 e R20) menores do que fluxo, mas essa diferença está dentro da margem de variação da síntese em batelada, mencionado anteriormente para as nanopartículas R21 e R59.

Um fator de bastante peso a favor da síntese em fluxo é o tempo total do processo: em batelada a síntese pode demorar uma semana devido a formação do complexo prata-ligante, enquanto no caso de fluxo continuo a formação do complexo é imediata e controlada. Nesta forma de condução a síntese leva apenas alguns minutos.


3.2 Testes microbiológicos

3.2.1 Efeito da proporção de Ag+: ligante

Na literatura, um dos ligantes orgânicos mais utilizados em sínteses de nanopartículas de prata é o citrato [5]. Foram realizados testes microbiológicos com NP-Ag (figura 16), sin-tetizadas em batelada, variando a proporção do ligante (Tabela 3). As imagens são apresenta-das na Tabela 4.

Figura 16: Nanopartículas sintetizadas com citrato

Tabela 4: Efeito da proporção Ag+:Citrato utilizada na síntese de NP em batelada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo

Ag+:Citrato 1:1 1:4 1:6 1:8 1:10 NP R20 R25 R24 R23 R18 24h

48h

120h

pH da solução de nanopartícula: 6,7

Em pH 6,7 o aumento da proporção Ag+ : citrato afetou o crescimento microbiano e a

esporulação. Nas primeiras 24 horas, verifica-se uma relação diretamente proporcional entre a quantidade de ligante e o crescimento, isto é, quanto maior a quantidade de ligante, maior o crescimento celular. Além disso observa-se o efeito das nanopartículas na esporulação a partir de 48 horas, acelerado pelas nanopartículas com proporções entre Ag+ : Ligante superiores 1:6. No período de 120 horas ocorreu a esporulação completa em todas as seis placas.


3.2.1 Efeito do ligante Outro possível ligante orgânico citado na literatura é o tartarato [4]. Nos testes microbi-

ológicos compararam-se esses dois ligante em duas proporção de Ag+ : Ligante diferentes (Figura 17) (Tabela 5).

Figura 17: Nanopartículas sintetizadas com diferentes ligantes, citrato ou tartarato

Tabela 5: Efeito da proporção Ag+:Citrato e Ag+:Tartarato utilizada na síntese de NP em bate-lada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo

Ag+ : Lig. Citrato 1:1 Tartarato 1:1 Citrato 1:10 Tartarato 1:10 NP R20 R21 R18 R19 24h

48h

120h

Observa-se pela tabela 5 que o crescimento do fungo tanto nas soluções com citrato

quanto com tartarato na proporção Ag+: ligante 1:1 parece ter sido levemente inibido em 24h. Quando aumenta-se a proporção metal: ligante para 1:10, ou seja, quanto menos prata,

proporcionalmente, verifica-se que o tartarato além de inibir o crescimento nas primeiras 24h retarda a esporulação pelo menos até as 48h. Em 120 horas ocorreu a esporulação completa em todas as cinco placas.


3.2.2 Efeito do pH da preparação de Ag+ : ligante Um outro fator importante constatado na literatura é o pH [5] no preparo das nanopartí-

culas de prata. Realizou-se dois testes para avaliar o efeito do pH das soluções de NP (Figu-ra_18) na atividade microbiana utilizando duas diferentes abordagens como previamente a-presentadas:

• Teste com NP diluídas (Tabela 6)

• Teste com NP concentradas (Tabela 7)

Figura 18: Nanopartículas sintetizadas em diferentes pH

Tabela 6: Efeito do pH da preparação 1:1 de Ag+ : tartarato utilizada na síntese

de NP em batelada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo pH 10,0 9,0 7,0

Sem NP R71 R72 R74 24h

48h

120h

Observa-se pela tabela 6 que nas primeiras 24 horas, na proporção 1:1 de Ag+: tartarato,

em pH 10,0 não houve efeito da NP no crescimento. Porém em pH 9,0 e 7,0 o crescimento parece ter sido menor. Em 48 horas a NP R74, com pH 7,0, parece ter atrasado a esporulação.


Em 120 horas embora tenha ocorrido esporulação em todas as placas, uma menor densidade de esporos é observada na placa contendo nanopartícula R74.

Tabela 7: Efeito do pH da preparação 1:1 de Ag+ : tartarato utilizada na síntese

de NP em batelada, sobre o crescimento e a esporulação do fungo pH 10,0 9,0 7,0

Sem NP R71 R72 R74 24h

72h

120h

Utilizando a técnica de halos de difusão onde a nanopartícula é concentrada sobre um

papel de filtro, observa-se nitidamente um halo, sendo este mais pronunciado em pH 7,0. Tais resultados corroboram os anteriores de que algumas nanopartículas afetam a esporulação do fungo

3.2.3 Efeito da forma de condução da síntese das NP

A figura 19 apresenta as nanoparticulas testadas nesta etapa do trabalho, enquanto a ta-bela 8 os resultados com os λ máximos. Foram utilizadas soluções de Ag+ : tartarato 1:1 com seus respectivos picos de absorbância de λ máximo.

Figura 19: Nanopartículas sintetizadas em diferentes formas de condução


Tabela 8: Resultados da comparação entre sínteses, tartarato como ligante Tartarato 1:1 Batelada Fluxo NP / λ máx. R59 / 394,88nm R21 / 401,63nm R99 / 397,52nm 24h Placa 1

72h

120h

Analisando os resultados dos experimentos em batelada pode-se dizer que em 72 horas verifica-se o nítido aparecimento de halos entorno do papel filtro contendo as NP. Tanto NP obtidas em batelada quanto aquelas obtidas em fluxo atuaram sobre o fungo. As diferenças nos halos são provavelmente devidas aos diferentes tamanhos das NP, como previamente dis-cutido neste relatório. No marco de 120 horas ocorreu a esporulação completa de todas as quatro placas.

3.2.4 Efeito da velocidade de fluxo e da proporção Ag+ : Citrato Testes realizados com NP obtidas em fluxo (Figura 20) foram realizados. A avaliação

microbiológica dos efeitos destas NP é apresentada na Tabela 9. Foram utilizados aqui citrato como agente ligante em diferente proporções e e velocidades de fluxo.

Figura 20: Nanopartículas sintetizadas em fluxo, com citrato


Tabela 9: Resultados do efeito da proporção Ag+: Citrato, em fluxo

Observa-se no período de 72h, um pequeno halo de indução de esporulação sendo estes

mais pronunciados nas nanopartículas R102 e R104. Quando se mantém a proporção e varia-se o fluxo (R105 e R102), obtém-se NP de dife-

rentes tamanhos e com efeitos de diferentes intensidades sobre o fungo. R105 e R106 foram menos efetivas.

4. Conclusões A técnica de síntese das NPs-Ag em fluxo continuo em comparação à técnica em bate-

lada permitiu a diminuição do tempo pela síntese de nanopartículas, facilitando a reprodutivi-dade do processo e consequentemente da obtenção de NPs-Ag com características físico-químicas mais uniformes.

Durantes os testes microbiológicos verificaram-se uma relação de proporcionalidade en-tre o a capacidade na nanopartícula atrapalhar crescimento celular e proporção de prata e a-gente ligante. Aparentemente o melhor ligante, o tartarato, apresentou melhores propriedades microbiológicas, sendo a proporção 1 de prata para 1 de ligante a mais adequada. Foi com-provado a influência do pH durante o processo de síntese nanopartículas, na atividade antimi-crobiana. Na faixa de pH testada, o pH 7,0, neutro, apresentou melhores atividades antimicro-bianas do que as nanopartículas sintetizadas a partir de pH mais elevados (9,0 e 10,0).

Ainda não foram encontradas nanopartículas realmente com propriedades fungicidas, em alguns casos observam-se um efeito fungo estático principalmente em relação a etapa de esporulação que ainda precisam de mais estudos. Comprovou-se que a resposta do fungo é inversamente proporcional ao tamanho das nanopartículas, neste caso a lambda máximo de absorbância.

5. Referências


1. Rai M., Yadav A., Gade A., Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobi-als; Biotechnology Advances 27 76–83 2009

2. Ghavami, K. E Fang, H.Y. (editor) Low Cost and Energy Saving Construction Materials, Vol.1 ENVO Publishing Company, Lehigh, Estados Unidos, 1984.

3. Ashori, A.; Nourbakhsh, A. Effect of press cycle time and resin content on physical and mechanical properties of particleboard panels made from the underutilized low-quality raw materials. Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Iran. Industrial Crops and Products, Amsterdam, v. 28, n. 2, p. 225–230, 2008.

4. Dias Garcia M. V. Síntese, caracterização e estabilização de nanopartículas de prata para aplicações bactericidas em têxteis, Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnolo-gia dos Materiais) Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 89p 2011 2011

5. Agnihotri S. Mukherji S. Mukherji S. Size-controlled silver nanoparticles synthesized over the range 5–100 nm using the same protocol and their antibacterial efficacy. RSC Adv., 4,3974 2014

6. FlowChemistryPracticalCourse, 2ª ed. FutureChemistry Holding BV 2011 7. Vermelho, A. B. - Pereira, A. F. - Coelho, R. R. R. Práticas de Microbiologia 1ª ed.

Rio de Janeiro Editora Guanabara Kogran (Grupo Gen) 2006

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