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ANÁLISES MICROSCÓPICAS PARA AVALIAÇÃO DOS
PADRÕES DE QUALIDADE E DETECÇÃO DA PRESENÇA
DE OCRATOXINA A EM AMOSTRAS DE CAFÉ
Bianca de Lima Valle
Rio de Janeiro
2012
BIANCA DE LIMA VALLE
Aluna do Curso de Farmácia
Matrícula: 08238000181
ANÁLISES MICROSCÓPICAS PARA AVALIAÇÃO DOS
PADRÕES DE QUALIDADE E DETECÇÃO DA PRESENÇA
DE OCRATOXINA A EM AMOSTRAS DE CAFÉ
Rio de Janeiro
Junho de 2012
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC,
apresentado ao Curso de Graduação em
Farmácia, da UEZO como parte dos
requisitos para a obtenção do grau em
Farmacêutico, sob a orientação do Prof.
Marco Antonio Mota da Silva.
ANÁLISES MICROSCÓPICAS PARA AVALIAÇÃO DOS
PADRÕES DE QUALIDADE E DETECÇÃO DA PRESENÇA
DE OCRATOXINA A EM AMOSTRAS DE CAFÉ
Elaborado por Bianca de Lima Valle
Aluna do Curso de Farmácia da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com
Grau: Farmacêutico
Rio de Janeiro, 27 de junho de 2012.
______________________________________________
Prof. Orientador Marco Antonio Mota da Silva, (UEZO)
______________________________________________
Prof. Sergio Henrique Seabra, (UEZO)
______________________________________________
Prof. Sabrina da Silva Dias, (UEZO)
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL
JUNHO DE 2012
ii
Dedico este trabalho à minha mãe.
iii
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus e a Nossa Senhora Sant’Ana por está sempre presente nesta minha caminhada, não deixando que eu desistisse nos momentos em que achei mais difíceis. A minha mãe que sempre me apoiou e me incentivou durante toda essa jornada, com uma palavra de conforto. Aos meus familiares e amigos que acreditam no meu sucesso e torcem pelo meu futuro profissional. Ao meu orientador Prof. Marco Antonio Mota da Silva pelo convite para participar do
seu projeto, o qual hoje os seus resultados estão me proporcionando esse trabalho de conclusão de curso. Ao Laboratório de Micotoxinas do INCQS-
FIOCRUZ, na pessoa da Maria Heloísa Paulino de Moraes, por ter possibilitado a realização de nossas análises. A todos os profissionais e instituições que
trabalharam conosco, nos ajudando a realizar esse trabalho. E, aos meus colegas de curso e profissionais da UEZO que me acompanharam diariamente durante
esses anos de formação.
iv
“Ama-se mais o que se conquista com esforço.”
Benjamin Disraeli.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Evolução do consumo interno do café no Brasil.......................................3
Figura 2. Estrutura química da Ocratoxina A...........................................................5
Figura 3. Estrutura da Ocratoxina A, B e C..............................................................6
Figura 4. Técnicas de análise para OTA em alimentos...........................................8
Figura 5. Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca A’ .........14
Figura 6. Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca C’..........15
Figura 7. Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Milho Torrado,
Grânulos de Amido................................................................................................15
Figura 8. Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Trigo Torrado,
Grânulos de Amido................................................................................................15
Figura 9. Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca A’ -
Sujidades...............................................................................................................16
Figura 10. Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca C’ –
Sujidades...............................................................................................................16
Figura 11. Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca D’ –
Sujidades...............................................................................................................16
Figura 12. Cromatograma do padrão de OTA.......................................................18
Figura 13. Cromatograma das amostras de Café verde.......................................18
Figura 14. Cromatogramas de duas marcas comerciais de Café torrado e moído.
A: Marca C; B: Marca U........................................................................................20
Figura 15. Concentrações de OTA de todas as marcas analisadas.....................21
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Resultado da análise cromatográfica do café verde............................17
Tabela 3: Níveis encontrados para OTA em café verde......................................19
Tabela 2: Níveis encontrados para OTA em café torrado e moído......................20
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AOAC: Association of Official Analytical Chemist International
BEN: Nefropatia Endêmica dos Balcãs
CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
EFS: Extração em Fase Sólida
ELISA: Ensaios Imunoenzimáticos
IARC: International Agency for Research on Cancer
JECFA: Joint Expert Committee on Food Additives
LMT: Limites Máximos Tolerados
LTM: Laboratório de Tecnologia de Materiais
MAPA: Ministério da Agricultura Pecuária e do Abastecimento
MEV: Microscópio Eletrônico de Varredura
OMS: Organização Mundial da Saúde
OTA: Ocratoxina A
PBS: Tampão Fosfato Salino
ppb: parte por bilhão
ppm: parte por milhão
PTWI: Provisional Tolerable Weekly intake
viii
Resumo
A cafeicultura é uma das principais atividades agrícolas do Brasil, por isso
deve-se manter os padrões de qualidade, obtendo um produto sem adulterações.
Assim, este estudo propõe a utilização da Microscopia Eletrônica de Varredura
para detectar a presença de fraudes e sujidades e a Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência como uma metodologia analítica para determinação da Ocratoxina
A no café. As análises microscópicas foram realizadas em amostras de café
torrado e moído adquiridas no comércio da cidade do Rio de Janeiro sendo
também avaliadas para pesquisa e identificação da Ocratoxina A; o café verde foi
também usado para a determinação da concentração de Ocratoxina A em uma
análise preliminar. Através da utilização da Microscopia Eletrônica de Varredura
foi possível identificar sujidades que poderiam implicar na qualidade dos produtos.
Em nossas análises químicas encontramos como valores para Ocratoxina A,
152,8 µg/kg, em café verde, e 3,1 µg/kg no café torrado e moído, o nível
encontrado no café verde está muito acima do que preconiza a ANVISA, que é de
10 µg/kg e no café torrado e moído está abaixo do limite máximo tolerado, o que
denota a não implementação de boas práticas agrícolas. Por esta razão o nosso
trabalho tem por finalidade determinar, de acordo com a legislação, níveis
seguros para o consumo humano desta substância com o auxilio de métodos
analíticos que englobam procedimentos químicos e biológicos para que o Brasil
possa oferecer para todo o seu mercado consumidor um produto com qualidade e
segurança alimentar.
Palavras-chaves: Microscopia Eletrônica de Varredura, Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência, Boas Práticas Agrícolas.
ix
Abstract
The coffee is a major agricultural activities in Brazil, so you should keep the
quality standards, getting an unadulterated product. Thus, this study proposes the
use of Scanning Electron Microscopy to detect fraud and dirt and High
Performance Liquid Chromatography as an analytical methodology for
determination of Ochratoxin A in coffee. The microscopic analyzes were
performed on samples of roast and ground coffee acquired in trade from the city of
Rio de Janeiro was also evaluated for search and identification of Ochratoxin A;
green coffee was also used for determining the concentration of Ochratoxin A in a
preliminary analysis. Through the use of Scanning Electron Microscopy was
possible to identify dirt that could result in product quality. In our chemical
analyzes found as values for Ochratoxin A, 152.8 g / kg in green coffee, and 3.1
mg / kg in the roasted and ground coffee, the level found in green coffee is much
higher than recommended ANVISA, which is 10 mg / kg and the roasted and
ground coffee is below the maximum tolerated, which denotes the non-
implementation of good agricultural practices. For this reason our work is to
establish, in accordance with the law, safe levels for human consumption of this
substance with the aid of analytical methods that include chemical and biological
procedures so that Brazil can offer for its entire consumer market a product quality
and food safety.
Keywords: Scanning Electron Microscopy, High Performance Liquid
Chromatography, Good Agricultural Practices.
x
SUMÁRIO
Lista de Figuras....................................................................................................vii
Lista de Tabelas...................................................................................................viii
Lista de Siglas e Abreviatura................................................................................viii
Resumo................................................................................................................ix
Abstract................................................................................................................x
1. INTRODUÇÃO................................................................................................1
2. OBJETIVOS....................................................................................................2
2.1. OBJETIVO GERAL..................................................................................2
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................2
3. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................3
3.1. O CAFÉ....................................................................................................3
3.2. MICOTOXINAS........................................................................................4
3.3. OCRATOXINA A......................................................................................5
3.3.1. Toxicologia da Ocratoxina A........................................................6
3.3.2. Métodos Analíticos........................................................................7
3.3.3. Legislação......................................................................................10
4. METODOLOGIA.............................................................................................11
4.1. AMOSTRAS.............................................................................................11
4.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA..................................11
4.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM CAFÉ
VERDE............................................................................................................12
4.4. DETERINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM CAFÉ
TORRADO E MOÍDO......................................................................................12
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES...................................................................14
5.1. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA...................................14
5.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM CAFÉ
VERDE.............................................................................................................17
5.3. DETERINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM CAFÉ
TORRADO E MOÍDO.......................................................................................19
6. CONCLUSÃO..................................................................................................22
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................23
1. INTRODUÇÃO
O café é uma das bebidas mais consumidas mundialmente. E, o Brasil por
se destacar como um grande produtor deste grão tem a necessidade de fornecer
para os seus consumidores, tanto externos quanto internos, um produto com alta
qualidade, puro e sem adulterações.
Por isso, é importante que sejam realizadas análises nesse café em grãos
para que sejam detectadas as suas características microbiológicas e
microscópicas. E, no futuro essas análises poderão ser utilizadas para comparar e
provar possíveis fraudes realizadas por fabricantes que misturam no café
produtos como, por exemplo, milho e cevada, com a finalidade de aumentar a sua
produção, adquirindo mais lucro com poucos gastos financeiros.
Os frutos do café também estão susceptíveis as contaminações
microbiológicas, que podem ocorrer durante a colheita, preparo, transporte e
armazenamento, principalmente por fungos que são capazes de afetar a sua
coloração, composição nutricional e através da produção de micotoxinas,
destaque para a Ocratoxina A (OTA), que é produzida por algumas espécies de
Aspergillus spp. e Penicillium spp.
Por esta razão, é importante de acordo com as legislações, se estabelecer
níveis seguros para o consumo humano desta substância com o auxilio de
métodos analíticos que englobam procedimentos químicos e biológicos para que
o Brasil possa produzir grãos de café com qualidade e segurança alimentar.
2
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho foi avaliar nas amostras obtidas no comércio da
cidade do Rio de Janeiro, os padrões de qualidade do café, comercializado no
varejo, com relação a materiais biológicos e não biológicos, além de avaliar os
níveis de contaminação por OTA.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Usar a Microscopia Eletrônica de Varredura para detectar a presença de
sujidades, assim como possíveis fraudes nas amostras de café torrado e
moído;
Utilizar a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) como
metodologia analítica para determinação da OTA nos grãos de café.
3
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. O CAFÉ
O café foi introduzido no Brasil em 1727, no Pará, por Francisco de Mello
Palheta e, em poucos anos, espalhou-se por todo o país, tornando-se o principal
produto de exportação da pauta brasileira e uma fonte geradora de renda e
empregos em toda cadeia produtiva, desde a lavoura passando pela indústria e
chegando ao comércio (TOLEDO, BARBOSA,1998).
Tem-se hoje a cafeicultura como uma das principais atividades agrícolas do
Brasil, com um papel importante para a economia mundial, perdendo apenas para
o petróleo. Pois além de ser um país produtor e exportador, o Brasil é também um
grande consumidor desta bebida.
A Figura 1 apresenta a evolução do consumo interno de café no Brasil. O
consumo de café deve-se basicamente ao efeito fisiológico causado pela
presença de cafeína, e principalmente pelo prazer e satisfação que seu aroma e
sabor são capazes de proporcionar (CLARKE, MACRAE, 1985).
Figura 1: Evolução do consumo interno do café no Brasil Fonte: ABIC, 2010
4
Para que o Brasil continue sendo um grande produtor, exportador e
consumidor de café acredita-se que padrões de qualidades devem ser seguidos.
Esta qualidade é determinada por fermentações favoráveis ou desfavoráveis e as
reações enzimáticas podem ser responsáveis pela obtenção de boa ou má
qualidade da bebida. O desenvolvimento de microorganismos, fungos e bactérias
nos grãos de café afetam a qualidade da bebida, e associada a essas
fermentações, podem contribuir de forma positiva ou negativa, quando se referir à
qualidade do produto.
Os frutos de café estão expostos à contaminação por uma variedade de
microrganismos, principalmente de fungos capazes de afetar fases de pré e pós
colheita, resultando em perda no rendimento, descoloração, redução do valor
nutricional e contaminação por micotoxinas (LEONI et al. , 2001).
3.2. MICOTOXINAS
As micotoxinas são metabólitos secundários de fungos filamentosos, e são
tóxicas ao homem e animais mesmo em pequenas concentrações (PITT, 2000).
Como nas demais culturas, os frutos e grãos de café estão sujeitos à
contaminação e consequentemente a colonização de microrganismos durante
todas as fases de desenvolvimento, colheita, preparo, transporte e
armazenamento (BATISTA et al., 2003). Vários gêneros de fungos ocorrem sobre
os frutos do cafeeiro, desde o campo até o armazenamento, entre eles espécies
de Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Eurotium, Fusarium, Penicillium,
Rhizopus, Trichoderma, Wallemia e outros. Dentre estes gêneros estão os
principais responsáveis pela presença de micotoxinas em produtos agrícolas que
são: Aspergillus, Fusarium e Penicillium (CHALFOUN, BATISTA, 2003; PRADO et
al., 2004).
Entretanto, o tipo e a quantidade de micotoxinas que um fungo produz,
depende dos parâmetros ecológicos e de processamento de um produto particular
(FILTENBORG et al., 1996). A prevenção da deterioração fúngica e produção de
micotoxinas em café só ocorrem com sucesso quando as espécies e os pontos
críticos do pré-processamento são conhecidos.
5
A principal micotoxina estudada em café é a OTA, e sua presença tem sido
atribuída principalmente ao fungo Aspergillus ochraceus e espécies relacionadas,
Aspergillus carbonarius e raramente por Aspergillus niger (CHALFOUN, BATISTA,
2003). A ocorrência dessa toxina em grãos de café tem gerado grande
preocupação no mercado consumidor do produto, em consequência de seu
potencial hepatóxico, nefrotóxico, teratogênico e carcinogênico (STURDER-
RHOR et al., 1995), podendo comprometer, além da saúde do consumidor, a
comercialização do produto.
3.3. OCRATOXINA A
A OTA pertence a grupo de metabólito secundário produzido na fase
exponencial tardia, ou no início da fase estacionária de crescimento por alguns
Aspergillus spp. e Penicillium spp., que frequentemente contaminam o café e
ampla variedade de cereais (LARSEN, SVENDSEN, SMEDSGAARD, 2001).
Como mostra a Figura 2, quimicamente, a OTA (7-[L-bfenilalanilcarbonil]
carboxil-5-cloro-8 hidroxi-3,4diidro-3R metilisocumarina) consiste de uma
diidroisocumarina ligada através de seu grupo 7-carboxil, por uma ligação amida,
à L-fenilalanina (TRUCKSESS, 1999). Sendo uma molécula de polaridade média
e alta estabilidade térmica, caracteriza-se pela presença de grupos cromóforos
com propriedades fluorescentes sob luz UV a 335nm. Por outro lado, o caráter
isocumarina da molécula e o grupo carbonil lactona conferem a atividade tóxica
(XIAO et al.,1996; PETRACCO, 1998).
Figura 2: Estrutura química da Ocratoxina A
Fonte: RINGOT et al., 2006.
6
Entre as ocratoxinas e análogos que compõem o grupo das micotoxinas, já
foram relatadas a ocorrência de ocratoxina A, B e C (FUJI et al., 2002). A OTA
destaca-se pela maior toxicidade e ocorrência natural em produtos vegetais e
animais. Na Figura 3 encontram-se as estruturas das ocratoxina A, B e C
(ALMEIDA et al., 2007; FUJI et al., 2002).
Figura 3: Estrutura da Ocratoxina A, B e C.
Fonte: FUJI et al., 2002
3.3.1. Toxicologia da Ocratoxina A
Os fatores que determinam a toxicidade de OTA são: os toxicocinéticos,
que estão relacionados as alterações das concentrações do composto no
organismo ao longo do tempo; e os toxicodinâmicos, relacionados as interações
dinâmicas do composto e seus efeitos biológicos (RINGOT et al., 2006).
Após a sua absorção pelo trato gastrointestinal a OTA se liga as proteínas
do soro, com um alto grau de afinidade de ligação. Depois da sua reabsorção pelo
intestino ela volta para a circulação, como uma consequência da reciclagem biliar,
favorecendo a redistribuição sistemática em direção aos diferentes tecidos. Além
disso, a reabsorção de OTA ocorre nos túbulos renais, proximais e distais. Sua
acumulação ocorre principalmente no sangue, fígado e rins. Sendo o fígado e os
7
rins os principais órgãos responsáveis pela biotransformação da OTA. O seu
metabolismo ainda não foi elucidado com detalhes (RINGOT et al., 2006).
A OTA é um composto tóxico, acumulativo, com rápida absorção e lenta
eliminação. A via de eliminação da OTA ocorre pelas fezes e principalmente pela
urina, onde as excreções desempenham papéis importantes na depuração
plasmática da toxina. Além da excreção renal e fecal, a excreção através do leite
nos mamíferos parece ser também relativamente eficaz. A contribuição relativa de
cada rota de excreção é influenciada pela via de administração, a dose, o seu
grau de ligação com as proteínas plasmáticas e a sua circulação entero-hepática
(WHO/FAO, 2001).
Os mecanismos toxicológicos da OTA envolvidos em várias espécies de
animais decorrem da redução na síntese proteica por inibição competitiva na
atividade de fenilalanina-RNA-sintetase, devido à semelhança estrutural entre
OTA e fenilalanina; inibição de respiração mitocondrial com depleção de síntese
de ATP e aumento na peroxidação lipídica (XIAO et al.,1996; HOHLER,1998).
Aliado a efeitos primários, o processo de biotransformação hepática da OTA, com
formação de intermediários reativos instáveis, emerge como elemento contribuinte
na genotoxicidade e mutagenicidade da toxina, cujo mecanismo de ação consiste
em ataque direto, ou bioativação de OTA no organismo animal (FINK-
GREMMELS, JAHN, BLOM, 1995)
A OTA foi classificada pela International Agency for Research on Cancer
(IARC), como pertencente ao grupo 2B, ou seja, possível carcinogênico humano
(IARC, 1993). A nefrotoxicidade em humanos foi sustentada pela provável
associação de OTA com a Nefropatia Endêmica dos Balcãs (BEN), uma disfunção
renal crônica degenerativa capaz de induzir falência renal, que atingiu população
adulta da área rural da região (STUDER-ROHR et al.,1995; PLESTINA, 1996;
STOEV, 1998).
3.3.2. Métodos Analíticos
As legislações e os limites máximos que permitem a presença de OTA no
café, implicam na procura por métodos precisos e sensíveis, em nível de parte por
bilhão (ppb). A dificuldade na análise de extração de OTA em café ocorre devido
8
ao fato desse analito se ligar facilmente à proteínas e DNA presentes nesta
complexa matriz. (ALMEIDA et al., 2007).
Diferentes métodos analíticos têm sido desenvolvidos para determinação
de ocratoxina A em alimentos. No café, utilizam-se técnicas como: Ensaios
Imunoenzimáticos (ELISA), Cromatografia em Camada Delgada, Cromatografia
Gasosa com Detecção por Espectrometria de Massas e CLAE, com detector de
fluorescência (FUJI et al., 2002). Na Figura 4 encontra-se um gráfico das técnicas
de análise para OTA em alimentos encontrados na literatura, no período 1990 a
2006. A CLAE, com detector de fluorescência, tem sido a técnica mais utilizada
para as diversas matrizes seguida pela CLAE, acoplada à espectrometria de
massas.
Figura 4: Técnicas de análise para OTA em alimentos.
Fonte:UEKANE, et al., 2010
Estudos realizados utilizando a CLAE demonstraram que esta técnica é
sensível, apresentando alto poder de separação e cuja eficiência depende da
etapa de pré-limpeza e do tipo de detector utilizado. Apesar desta técnica quando
acoplada ao detector de fluorescência ser sensível, esta pode apresentar
problemas analíticos como a coeluição dos analitos com interferentes e também
deslocamento do tempo de retenção, que pode gerar resultados errôneos.
Entretanto, estes problemas podem ser solucionados com ajuste cromatográfico
9
adequado (TANIWAKI et al., 2003).
Atualmente a metodologia oficial da Association of Official Analytical
Chemists International (AOAC) para o café verde e torrado é a CLAE com
detecção por fluorescência. Esta técnica é a mais utilizada, devido à fluorescência
natural da OTA (VARGAS et al., 2005; VEGA et al., 2006). O método utilizado
para análise de OTA em café verde pelo Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento (MAPA), baseia-se na extração com solventes orgânicos puros ou
combinados com soluções de bicarbonato de sódio e metanol. A purificação da
toxina ocorre através da extração em fase sólida, com cartucho recheado com
octadecilsilano, e detecção e quantificação por CLAE com detector de
fluorescência. No entanto, a crescente demanda para a detecção e a
quantificação da OTA em alimentos, em especial no café, devido às barreiras
técnicas nos quais este produto vem sendo submetido, requer a utilização de
técnicas analíticas cada vez mais sensíveis e seletivas a fim de evitar um
resultado falso-positivo durante as análises.
O desenvolvimento de colunas eficazes, capazes de atingir o nível de
separação e purificação em apenas uma etapa cromatográfica, tem sido um
desafio constante em análise química, que foi a implementação do uso das
minicolunas, na qual constituíram a base para introdução da ferramenta biológica
na metodologia analítica, iniciando-se a implementação da coluna de
imunoafinidade, que pode e que passou a ser considerada uma inovação na área
de metodologia analítica, já que a imunoafinidade introduziu um componente
biológico como principal reagente na análise (FUJI et al., 2002).
As colunas de imunoafinidade, preparadas com anticorpos anti-
micotoxinas, destacam-se por conferir, rapidez, simplicidade, alta especificidade e
recuperação melhorando os limites de detecção. As colunas compõem-se de um
suporte de fase sólida ativa na qual imobiliza-se os anticorpos específicos contra
determinadas micotoxinas (FUJI et al., 2002).
Métodos analíticos para determinação de micotoxinas devem ser validados
para serem utilizados na implementação de legislação, monitoramento e estudos
de avaliação de riscos. Para OTA alguns métodos já foram validados, entretanto,
para o café torrado a validação esteve atrelada à técnica de CLAE com detecção
por fluorescência, necessitando de maiores estudos de validação com a utilização
10
da técnica de CLAE, acoplada à espectrometria de massas com diferentes formas
de ionização (BATISTA et al., 2001).
3.3.3. Legislação
Baseado na toxicologia de OTA, aliada a presença inevitável em produtos
alimentícios, “Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives” (JECFA)
estabeleceu um limite tolerável provisório de ingestão semanal (PTWI) em
100ng/Kg de peso corpóreo, visando assegurar ausência de efeitos nefrotóxicos
(LEONI et al., 2000). Limites máximos para OTA são regulamentados em diversos
países e variam de 1 a 5ng/g para alimentos infantis, 2 a 50ng/g para cereais e 5
a 300ng/g para rações (VAN EGMOND, 1996). A Organização Mundial da Saúde
(OMS) propôs limite de 5µg/Kg de OTA em cereais.
Embora o café constitua uma fonte marginal de OTA na dieta, limites para
os níveis desta micotoxina nos grãos de café têm sido propostos pela União
Européia e adotados por vários países, sendo 8µg/Kg para café cru e 4µg/Kg para
café torrado (HOYLAND et al., 2000). No Brasil, a legislação que vigora é a RDC
n° 7 de 18 de fevereiro de 2011 que dispõe sobre os limites máximos tolerados
(LMT) de micotoxinas em alimentos no qual para o café torrado e moído
apresenta como LMT 10 µg/Kg (BRASIL, 2011).
Por isso, o alto consumo da bebida de café no Brasil, associado a
implicações de OTA na saúde pública e comércio exterior, justificam a importância
da pesquisa desta toxina em café brasileiro.
11
4. METODOLOGIA
4.1. AMOSTRAS
Foi utilizada para a realização da pesquisa amostras de café torrado e
moído, adquiridos no comércio da cidade do Rio de Janeiro. As marcas adquiridas
foram codificadas em (A’, B’, C’ e D’). Foram analisados também alguns cereais
que são utilizados para fraudar o café, farinha de trigo e farinha de milho. Estes
cereais foram torrados em Mufla no LTM (Laboratório de Tecnologia de Materiais)
da UEZO a uma temperatura de 220°C por 50 minutos.
Para pesquisa e identificação da OTA, foi utilizado o café verde como
amostras, colhidas nos arredores da cidade de Mercês-MG, localizada na zona da
mata, a uma latitude 21º11'39" sul e a uma longitude 43º20'29" oeste. As
amostras foram preparadas e analisadas conforme as diretrizes estabelecidas no
INCQS-FIOCRUZ, através do (POP n° 65.3120.058, 2001).
Também para essa pesquisa e identificação de OTA foram avaliadas 26
marcas de cafés torrados e moídos obtidas no comércio da cidade do Rio de
Janeiro, no período de novembro a dezembro de 2011. As amostras tinham
apresentação comercial de 250 e 500 g por embalagem. As amostras foram
codificadas de (A a Z), e em seguida quarteadas e pesadas uma alíquota de 25 g
da amostra.
4.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
A Microscopia Eletrônica de Varredura foi utilizada para identificar se as
amostras estão dentro dos parâmetros de qualidade ou se apresentam algumas
não conformidades ou possíveis fraudes nas amostras de café. O equipamento
utilizado foi o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) da marca JEOL JSM
6490 LV a 30 Kv, do laboratório de microscopia da UEZO.
12
As amostras foram preparadas e analisadas na própria instituição, elas
foram fixadas em suportes de alumínio, chamados “stubs” com o uso de uma cola
condutora. Após isto foi realizado a metalização das amostras, aplicado sob elas
uma camada condutora, usando ouro. No qual foram depositados sob as
amostras por um intervalo de 120 segundos. A espessura da camada de ouro
deve ser suficientemente fina para não influir na resolução da imagem, mas
suficientemente espessa, para garantir uma boa produção de elétrons
secundários, que serão usados para formar a imagem.
Através das fotomicrografias das amostras, grãos de amidos de milho e
trigo, que são dois dos adulterantes mais comumente usados desde a década de
80, auge da adulteração de café no Brasil, podem ser detectados através da
diferenciação morfológica entre esses grãos de amido.
4.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM CAFÉ
VERDE
O café verde foi secado e moído e foram submetidos através de um
sistema de cartuchos de extração em fase sólida, sílica-C18, (WATERS®), para
purificação da amostra, e em seguida realizado a detecção da OTA, usando
cromatógrafo a líquido com detector por fluorescência (RF-10Axl – Shimadzu),
com as seguintes condições cromatográficas: coluna C18, dimensões (250mm x
4,6 mm), 5μm; detector por fluorescência λ = 336 nm; fase móvel: acetonitrila
(Tedia Brasil®): água desionizada (1:1), contendo 2% de ácido acético; fluxo 1,0
mL/min.
4.4. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM CAFÉ
TORRADO E MOÍDO
Para essa determinação foram utilizados: o padrão de OTA, adquirido da
Sigma® (St. Louis, MO, EUA); acetonitrila, grau CLAE adquirido da Merck®
(Darmstadt, Alemanha); metanol grau CLAE adquirido da Tedia Company®
(Fairfield, EUA); bicarbonato de sódio, adquirido da Merck® (Darmstadt,
13
Alemanha) e ácido acético glacial e tolueno, adquiridos da Merck® (Darmstadt,
Alemanha).
Na extração de OTA foram pesadas alíquota de 25 g de cada uma das
amostras de café, e transferidas para um copo de liquidificador, onde foram
adicionados 200mL de metanol e solução de bicarbonato de sódio 3% (1:1, v/v), e
misturados por 5 min. Centrifugou-se por 15 min. a 300 rpm a 20 °C e filtrou à
vácuo em membrana de vidro. Foram retiradas alíquota de 5,0 mL e avolumadas
para 100 mL com tampão fosfato salino (PBS), pH 7,0. Depois, adaptou-se uma
seringa de vidro de 20mL à coluna de imunoafinidade Ochratest (VICAM®). E,
todo o extrato diluído (100mL) foi transvazado através da coluna com fluxo de 2 a
3mL/min. Efeito isso, a coluna foi lavada com 10 mL de água destilada seguida
por 4,0 mL de metanol. O eluído foi coletado em frasco tipo “vial” evaporado a
secura sob fluxo de N2 à 40 °C positivo. O resíduo foi ressuspendido em 1,0 mL
de fase móvel.
Para a limpeza do extrato, é comumente empregada extração líquido-
líquido ou partição líquido-líquido seguido de extração por fase sólida em
cartuchos recheados (EFS), sendo utilizadas principalmente as colunas de
imunoafinidade desde sua introdução na análise de café em 1990, esta técnica
pode ser considerada como uma inovação já que introduziu o componente
biológico nas análises químicas (FUJI et al., 2002). O uso da coluna de
imunoafinidade se faz necessário pelo fato do café torrado representar uma matriz
extremamente complexa necessitando realizar uma limpeza adequada do extrato
para remover substâncias como lipídeos e pigmentos presentes que possam
interferir na metodologia analítica, visando o alcance de limites de detecção mais
baixos (UEKANE et al., 2010).
A determinação da OTA foi realizada em um equipamento de CLAE com
detector por fluorescência (RF- 10 Axl-Shimadzu), para a separação
cromatográfica utilizou-se a coluna, Spherisorb, ODS, 5μm, 250 X 4.6mm, C18;
fase móvel: acetonitrila (Tedia Brasil®): água com 2% de ácido acético (1:1, v/v),
com fluxo de 1,0 ml/min; volume de injeção 20 µL; o comprimento de onda do
detector de fluorescência para excitação foi fixado em 336 nm e para emissão em
468 nm.
14
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
As amostras de café foram observadas através do MEV a fim de pesquisar
possíveis impurezas e sujidades. Através da utilização do MEV foi possível
verificar a qualidade do café, comercializado no varejo, com relação a materiais
biológicos e não biológicos. Verificando assim as condições de pureza e higiene
do café torrado e moído de consumo interno, quanto à análise microscópica das
amostras. Além disso, foi realizada uma pesquisa a fim de avaliar possíveis
fraudes amiláceas. A seguir apresentam-se algumas micrografias eletrônicas das
marcas de café analisadas:
Figura 5: Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca A’
(Barra=X330,50m)
15
Figura 6: Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca C’
(Barra=X330,50m)
Figura 7: Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Milho Torrado,
Grânulos de Amido (Barra=X330,50m)
Figura 8: Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Trigo Torrado,
Grânulos de Amido (Barra=X330,50m)
16
Figura 9: Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca A’ -
Sujidades (Barra=X330,50m)
Figura 10: Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca C’ -
Sujidades (Barra=X330,50m)
Figura 11: Micrografia Eletrônica de Varredura, Amostra de Café, Marca D’ -
Sujidades (Barra=X330,50m)
17
Apesar do MEV ter demonstrado ser uma excelente ferramenta no controle
de qualidade do café torrado e moído, podendo ser usada na detecção de fraude
no café, conforme foi demonstrado por AMBONI et al., (1999). Em nossas
imagens de fotomicrografias não foi possível perceber a presença de fraudes em
nossas amostras de café torrado e moído, no entanto podemos verificar a
presença de sujidades e que pode corroborar com a contaminação microbiana
dos grãos de café, e demonstra a não utilização das boas práticas de produção
agrícola.
5.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM
CAFÉ VERDE
Através da metodologia analítica proposta foi possível detectar a presença
de OTA nas amostras de café verde.
Tabela 1: Resultado da análise cromatográfica do café verde
Amostras de café verde da UEZO Code N° Xi sample Cálculo estatístico da amostra 1 ng/g ng/g
Média 0,1528 0,155 1,24 Desvio padrão 0,0042 0,156 1,25
Coeficiente de Variação 2,7 0,148 1,18
Nas análises realizadas encontrou-se como valores para OTA, 152,8 µg/kg
ou parte por milhão (ppm), os níveis encontrados estão muito acima do que
preconiza a ANVISA, que é de 10 µg/kg. Conforme foi exposto pela Resolução n°
7 de 18 de fevereiro de 2011, todo alimento deverá possuir boas práticas de
produção, manipulação, armazenamento, processamento devendo estar isento da
presença de micotoxinas. Assim sendo a metodologia empregada em nosso
trabalho mostrou-se bastante eficaz na determinação e identificação da OTA. A
seguir apresentam-se os cromatogramas realizados em nossas amostras:
18
Figura 12: Cromatograma do padrão de OTA
Figura 13: Cromatograma das amostras de Café verde
Segundo BATISTA et al., (2007) que realizaram uma pesquisa para
determinação de OTA em café de varrição (secado ao solo). Utilizando a mesma
OTA
OTA
19
metodologia analítica usada em nosso trabalho, os autores puderam confirmar a
presença de OTA em grande maioria das amostras analisadas (77,36%), sendo
que em duas amostras apresentaram níveis superiores a 100μg/ Kg de grãos de
café, o que corrobora com os resultados do nosso estudo. Outra pesquisa que
corrobora com os nossos estudos é a de MORAES, LUCHECE, (2003) que
encontrou em umas amostras de café verde analisadas um valor para OTA de
160μg/ Kg, como ilustrado na Tabela 2:
Tabela 2: Níveis encontrados para OTA em café verde
OTA (µg/Kg) Resultados Obtidos
MORAES, LUCHESE (2003)
BATISTA, CHALFOUN (2007)
Valor máximo 152,8 160,0 >100
5.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE OCRATOXINA A EM
CAFÉ TORRADO E MOÍDO
Todas as 26 marcas comerciais adquiridas em supermercados na cidade
do Rio de Janeiro foram positivas para OTA e a faixa de concentração detectada
foi de 0,34-3,1 µg/Kg, com média entre os valores de 0,81 µg/Kg, os nossos
resultados corroboram com os resultados de PRADO, (2000), na qual os autores
avaliaram diferentes marcas de café torrado e moído e em café solúvel
consumidos na cidade de Belo Horizonte-MG, para café solúvel os valores de
OTA foram de 0,31-1,178 µg/Kg e com média entre os valores positivos de 0,73
µg/Kg, enquanto para o café torrado e moído foram de 0,99-5,87 µg/Kg e média
de 1,75 µg/Kg. CORONEL et al., (2011) avaliaram amostras comerciais de café
torrado e moído adquiridos em supermercados de cidades espanholas, usando
coluna de imunoafinidade e detecção por CLAE acoplada por detector de
fluorescência. Os autores encontraram como valores para OTA, 1,21-4,21 µg/Kg e
média de 2,17 ± 0,79 µg/Kg (n=72). Como é possível visualizar na Tabela 3:
20
Tabela 3: Níveis encontrados para OTA em café torrado e moído
OTA (µg/Kg) Resultados Obtidos
PRADO et al. (2000)
CORONEL et al. (2011)
Valor máximo 3,11 5,87 4,21 Valor mínimo 0,34 0,99 1,21
Média 0,81 1,75 2,17 N amostral 26 47 72
A seguir apresentam-se na Figura 14 os cromatogramas de duas marcas
comerciais de café:
A: Marca C
B: Marca U
Figura 14: Cromatogramas de duas marcas comerciais de Café torrado e moído.
OTA
OTA
21
SABINO et al., (2007) analisaram 82 amostras de café instantâneo, 81
(98,8%) das amostras foram positivas para OTA, alcançando níveis na faixa de
0,17-6,29 µg/Kg, usando a mesma metodologia para determinação e
quantificação de OTA usada neste trabalho. A seguir apresenta-se na Figura 15
um gráfico contendo as concentrações de OTA de todas as marcas analisadas
neste trabalho.
Figura 15: Concentrações de OTA de todas as marcas analisadas.
22
6. CONCLUSÃO
A partir da metodologia proposta para avaliar os padrões de qualidade das
amostras de café por meio do MEV, foi possível visualizar a presença de
sujidades nas amostras encontrando-se dentro do limite tolerado pela legislação
vigente.
E, com a CLAE foi possível detectar a presença de OTA, onde todas as
amostras de café investigadas em nosso trabalho apresentaram valores positivos
para OTA, o que denota a importância de um efetivo controle deste produto por
parte das indústrias e autoridades governamentais, já que o Brasil é o maior
produtor e consumidor de café, onde deveriam ser implementadas as Boas
Práticas Agrícolas e ações de vigilância sanitária no que tange ao controle da
OTA.
23
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, A. P. et al. Ochratoxin A in Brazilian instant coffee. Braz. J. Micro, v.
38, p. 300-303, 2007.
AMBONI, R.D.M.C; de FRANCISCO, A.; TEIXEIRA, E.; Utilização de microscopia
eletrônica de varredura para detecção de fraudes em café torrado e moído
Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.19, p 3, 1999.
BATISTA, L.R. & CHALFOUN, S.R.; Incidence of ochratoxin A in fraction diferents
coffee beans (Coffea Arabica L): “boia”, mixes and “varrição”; Ciênc. Agrotec.,
Lavras, v. 31, n. 3, p. 804-813, 2007.
BATISTA, L. R.; CHALFOUN, S. M.; PRADO, G. Ocratoxina A em grãos de café
beneficiado e sua relação com o padrão da bebida. Simpósio de pesquisa dos
cafés do Brasil, Vitória, v. 2, 2001.
BATISTA, L. R.; CHALFOUN, S. M.; PRADO, G.; SCHWAN, R. F.; WHEALS, A.
E. Toxigenic fungi associated with processed (green) coffee beans (Coffea arabica
L.). International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 85, n. 3, p. 293-
300, 2003.
BRASIL, Resolução RDC n° 7, de 18 de fevereiro de 2011, ANVISA, Dispõe sobre
os limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos. Diário Oficial
da Republica Federativa do Brasil, Brasília DF (2011) - disponível em:
http://ww.anvisa.gov.br acessado em 17 de abril de 2012.
BRASIL, Resolução RDC n° 175, de 08 de julho de 2003, ANVISA, Aprova o
regulamento técnico de Avaliação de Matérias Macroscópicas e Microscópicas
Prejudiciais à Saúde Humana em Alimentos Embalados. Diário Oficial da
Republica Federativa do Brasil, Brasília DF (2003) – disponível em:
http://ww.anvisa.gov.br acessado em 20 de março de 2012.
24
CHALFOUN, S. M.; BATISTA, L. R. Fungos associados a frutos e grãos de café
Aspergillus&Penicillium. Brasília, DF: Embrapa,p. 69, 2003.
CLARKE, R.J; MACRAE, R. Coffee Chemistry. London: Elsevier Applied
Science Publishers, v.1, p. 42, 1985.
CORONEL, M.B.; MARIAN, S.; CANO, G.; RAMOS, A.J.; SANCHIS; V.
Ocharatoxin A in Spanish retail ground roasted coffee: Occurrence and
assessment of the exposure in Catalonia. London: Elsevier Applied Science
Publishers, v 22, p. 414-419, 2011.
FILTENBORG, O.; FRISVAD, J. C.; THRANE, U. Moulds in food spoilage.
International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 33, p. 85-102, 1996.
FINK-GREMMELS, J.; JAHN, A.; BLOM, M. J. Toxicity and Metabolism of
Ochratoxin A. Natural Toxins, New York, v.3, p. 214-220, 1995.
FUJI, S.; ONO, E.Y.S.; HIROOKA, O E. Ocratoxina A em café: controle e
metodologia analítica com ênfase a inovação no contexto de segurança alimentar.
Semina: Ciências Agrárias, v. 23, n. 2, p. 273-292, 2002.
HOHLER, D. Ochratoxin A in food and feed: occurrence, legislation and mode of
action. Z. Ernahrungswiss, v.37, n.1, p. 2-12, 1998.
HOYLAND, D. et al. Assessmt by Nestlé UK of Ochrascan® a screening test for
ochratoxin A in coffee. International IUPAC Symposium on Mycotoxins and
Phycotoxins, v. 10, p.27, 2000.
IARC - International Agency for Research on Cancer. Ochratoxin A. Some
naturally occurring substances: Food items and constituents, heterocyclic aromatic
amines and micotoxins. Monographs on the evaluation of carcinogenic risk to
humans. v. 56, Lyon: IARC, p. 489-452, 1993.
25
LARSEN, T. O.; SVENDSEN, A.; SMEDSGAARD, J. Biochemical characterization
of ochratoxin A producing strains of the genus Penicillium. Applied
Environmental Microbiology, Washington, v.67, n.8, p.3630-3635, 2001.
LEONI, L. A. B.; VALENTE SOARES, L. M.; OLIVEIRA, P. L. C. Ochratoxin A in
Brazilian roasted and instant coffees. Food Additives and Contaminant, London,
v.17, n.10, p. 867-870, 2000.
LEONI, L.A.B.; FURLANI, R.P.Z.; VALENTE SOARES, L.M.; OLIVEIRA, P.L.C.;
“Ochratoxin A in Brazilian green coffe”. Ciência & Tecnologia de Alimentos,
Campinas, v. 21, p. 105-107, 2001.
MORAES, M.H.P.; LUCHESE, R.H. Ochratoxin A on Green Coffee: Influence of
Harvest and Drying Processing Proceedures. Journal of Agricultural Food
Chemistry, v.51, n. 19, p. 5824-5828, 2003.
PETRACCO, M. Melhoramento da Qualidade do Café pela Redução do
Crescimento de Fungos. Encontro Nacional de Micotoxinas. v. 9, 1998.
PITT, J. I. Toxigenic fungi: which are important. Medical Mycology, Oxford, v. 38,
p. 17-22, 2000.
PLESTINA, R. Nephrotoxicity of ochratoxin A. Food Additives and
Contaminants, London, v. 13, p. 49-50, 1996.
POP- Procedimento Operacional Padrão, Determinação de Ocratoxina A, por
CLAE, em Arroz Integral, Parboilizado, Feijão Preto, Azuki e Cevada em grão, In:
Manual da Qualidade. Rio de Janeiro, INCQS/FIOCRUZ, Seção n°10,
(65.3120.058); Elaborado por Maria Heloísa P. Moraes em 24/08/2001.
PRADO, G. Incidência de ocratoxina A em café torrado e moído e em café solúvel
consumido na cidade de Belo Horizonte, MG. Ciência & Tecnologia de
Alimentos, v 20, p. 2, 2000.
26
PRADO, E; MARÍN, S.; RAMOS, A. J.; SANCHIS, V. Occurrence of
ochratoxigenic fungi and ochratoxina A in green coffee from different origins. Food
Science and Technology International, London, v. 10, n. 1, p. 45-49, 2004.
RINGOT, Diana, et al. Toxicokinetics and toxicodynamics of ochratoxin A, an
update. Chemico-Biological Interactions, v. 159, p. 18–46, 2006.
SABINO, Myrna; ALMEIDA, A.P.; SHUNDO, L.; ALABURDA, J.; RUVIERI, V.;
NAVAS, S.A.; LAMADO, L.C.A. Ochratoxin A in Brazilian Instant Coffee. Brazilian
Journal of Microbiology, v 38, p 300-303, 2007.
STOEV, S. D. The role of ochratoxin A as a possible cause of Balkan endemic
nephropathy and its risk evaluation. Veterinary and Human Toxicoogyl,
Manhatan, v.40, n.6, p.352-360, 1998.
STUDER-ROHR, J.; DIETRICH, D. R.; SCHLATTER, J.; SCHLATTER, C. The
occurence of ochratoxin A in coffe. Food and chemical toxicology, Zurich, v. 33,
n. 5, p. 341-355, 1995.
TANIWAKI, M. H.; PITT, J. I.; TEIXEIRA, A. A.; IAMANAKA, B. T. The source of
ochratoxin A in Brazilian coffee and its formation in relation to processing
methods. International Journal of Food Microbiology, v. 82, n. 2, p. 173-179,
2003.
TOLEDO, J.L.B., BARBOSA, A.T., Classificação e degustação de café. Brasília:
Ed Sebrae, ABIC, p. 27-34, 1998.
TRUCKSESS, M.W. Determination and Survey of Ochratoxin A in Wheat, Barley
and Coffee. Journal of the Association of Official Analytical Chemists,
Arlington, v.82, n.1, p.85-89, 1999.
27
UEKANE, T.M.; BANDEIRA, R.D.C.; SILVA, M.C.; “Comparação de Métodos de
Análise para Ocratoxina A no Café: uma revisão” Perspectivas da Ciência e
Tecnologia, v.2, n.1/2, 2010.
VAN EGMOND, H. P. Analytical Methodology and regulations for ochratoxin A.
Food Additives and Contaminants, London, v.13, p.11-13, 1996.
VARGAS, E.A., SANTOS, E.A. E PITTET, A. Determination of ochratoxin A in
green coffee by immunoaffinity column cleanup and liquid chromatography:
collaborative study. Journal of AOAC International, v.88, n.3, p.773-779, 2005.
VEGA, F.E.; POSADA, F.; PETERSON, S.W.; GIANFAGNA, T., CHAVES, F.
Penicillium species endophytic in coffee plants and ochratoxin A production.
Mycologia, n.98, p.31, 2006.
WHO/FAO, Ochratoxin A. Safety Evaluation of Certain Mycotoxins in Food, v. 47,
p. 281- 415, 2001.
XIAO, H.et al. Toxicity of ochratoxin A, its opened lactone form and several of its
analogs: estructure-activity relationships. Toxicology and Applied
Pharmacology, Orlando, v.137, n.2, p.182-192, 1996.
