Uma visão técnica para a compreensão e resolução de ... · e eficiente. Adiante, ... fundamentos básicos da teoria e técnica da HPLC são os requisitos que ... um manual de

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S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a

TROUBLESHOOTING (TS)

Uma visão técnica para acompreensão e resolução deproblemas em sistemas decromatografia líquida

Álvaro José dos Santos Neto

Universidade Federal de AlfenasDepartamento de Ciências Exatas37130-000 – Alfenas (MG)Brasilá[email protected]

ResumoComo apresentado na edição de lançamento da Scientia Chromatographica, esse espaço tratará do assunto

Troubleshooting em cromatografia – o entendimento e a resolução dos problemas mais comuns apresentados pelos

sistemas e métodos cromatográficos de análise. Nessa edição, uma introdução à técnica e às estratégias de

troubleshooting em sistemas e métodos cromatográficos será

apresentada. Na segunda parte do artigo haverá a descrição do sistema

de cromatografia líquida de alta eficiência, com uma visão voltada ao

entendimento e prevenção de problemas comumente encontrados.

AbstractAs presented in the release edition of the Scientia Chromatographica, this column will deal with

Troubleshooting in chromatography – addressing the comprehension and resolution of the usual problems depicted

by chromatographic systems and methods of analysis. In this edition, we will present an introduction to the

concepts and strategies of the troubleshooting technique, applied for

chromatographic systems and methods. In the second part, a description

of the high performance liquid chromatographic system will be

presented, focusing on the understanding and prevention of the most

usual problems that a chromatographist is used to deal with.

Palavras-chave

Técnica de troubleshooting;

cromatografia líquida; CLAE;

manutenção em cromatografia.

Keywords

Troubleshooting technique;

liquid chromatography; HPLC;

chromatography maintenance.

Álvaro José dos Santos NetoEditor

Como apresentado na edição de lançamento daScientia Chromatographica, esta coluna tratarádaquilo que em inglês chama-se Troubleshooting, ouseja, de maneira resumida, em português, pode-secompreender esse termo como a identificação eresolução de problemas em um sistema ou processo.Dessa forma, a abordagem de troubleshooting emcromatografia tem o objetivo de observar, isolar ecorrigir problemas, de maneira direta, simples, racional e eficiente. Adiante, estratégias para a sistematizaçãoda identificação e resolução dos problemas serãoapresentadas, servindo de guia para a abordagem dasfalhas que surgirem no decorrer do uso de um sistemacromatográfico ou relacionado. Pretende-se abordar asdiversas formas de cromatografia instrumental, porexemplo, cromatografia líquida, gasosa e com fluidosupercrítico, bem como os assuntos relacionados a ela(preparo de amostras, tratamento dos dados,acoplamento com outras técnicas). A cromatografialíquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE para aqueles que gostam do termo em português) está presente como ferramenta de análise nos mais diversos laboratórios e,dessa forma, será a primeira a receber a nossa atenção.

Para que o usuário da técnica torne-se umprofissional (cromatografista) mais capacitado eprontamente apto para atuar na identificação eresolução de problemas, uma compreensão dofuncionamento de cada parte do sistema decromatografia é imprescindível. Por essa razão, nesseprimeiro artigo, haverá uma discussão relativamentedetalhada dos princípios de funcionamento e operaçãode cada parte de um HPLC, bem como serão indicadosos problemas mais comuns que ocorrem em cada parte. Obviamente, seria praticamente impossível endereçarcada um dos eventuais problemas que podem ocorrerem cada parte de um sistema HPLC, da mesma forma,uma discussão detalhada de cada problemareconhecido resultaria em um livro sobre resolução deproblemas em HPLC. Nessa coluna, tentaremosabordar, ao longo do tempo, os aspectos maisrelevantes que forem considerados pelo editor,contando com a grande colaboração, sugestão e críticados leitores/colegas cromatografistas. Conformenecessário, um pouco da teoria da cromatografia seráapresentada como subsídio para a compreensão eresolução de problemas específicos que estiveremsendo discutidos. Acreditamos que a compreensão dosfundamentos básicos da teoria e técnica da HPLC sãoos requisitos que juntamente com a experiênciaadquirida habilitam um cromatografista para atuar com propriedade, tanto em análises de rotina quanto nasáreas de pesquisa.

Quando há um problema? O que fazer nesse caso?

Antes de adentrar ao assunto da técnica deHPLC, gostaria de destacar os fundamentos da técnicade Troubleshooting. O primeiro passo pararesolvermos um problema é sabermos que estamosdiante de um. Ou seja, precisamos da resposta para apergunta “Quando há um problema?”. Para isso,precisamos reconhecer o funcionamento normal donosso equipamento, de maneira a reconhecer quandoalgo de anormal vem a surgir. É prática recomendadaem qualquer laboratório, mesmo que não exigida pelarotina, manter um caderno com anotações sobre ofuncionamento do equipamento. Da mesma forma, éinteressante ter um conjunto de condições padrão deuso, sob o qual se obtém determinado resultado. Porexemplo, com uma determinada coluna e ao utilizar-secerto método, obtém-se um reconhecidocromatograma para a mistura teste, bem como oregistro de certo intervalo de pressão para a coluna. Ossentidos do cromatografista também são importantesferramentas no reconhecimento de problemas: ruídosou vibrações anormais podem ser indícios de peçasdesgastadas, mal lubrificadas, quebradas, malcolocadas etc.; vazamentos ou bolhas podem servisualmente detectados, bem como as anormalidadesreportadas pelo cromatograma; um eventualaquecimento ou liberação de odor característico podeindicar a ocorrência de queima ou superaquecimentode placas ou componentes eletrônicos.

Ao reconhecer o problema, “O que fazer nessecaso?”, primeiramente, é importante saber se ele podeser resolvido pelo próprio cromatografista ou se haverá a necessidade de assistência técnica especializada. Muitos procedimentos podem ser realizados pelo própriocromatografista e são inclusive listados e descritos nosmanuais de operação e manutenção rotineira dosequipamentos. Por outro lado, outros procedimentosfazem parte apenas dos “manuais de serviço” restritosaos técnicos especializados e treinados paramanutenções mais avançadas. O cromatografista devereconhecer até onde pode atuar e quando chega a hora de pedir socorro a um profissional habilitado para fazer amanutenção daquele equipamento.

As sugestões que serão apresentadas nessacoluna, serão de caráter genérico. Apesar deculturalmente as instruções de uso dificilmente seremlidas, deve ser entendido que as sugestões apresentadas aqui não se prestam a substituir os manuais de uso emanutenção dos equipamentos. Esses manuais contêminformações específicas e detalhadas para oequipamento, de uma determinada marca e modelo, em


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particular. Por exemplo, em um procedimento demanutenção, um manual de boa qualidade trazdiagramas com vista explodida e procedimento passo apasso para acessar um determinado problema.

Ao efetuar modificações no hardware doequipamento, tudo deve ser devidamente anotado esistematizado. Por exemplo, ao se suspeitar de maufuncionamento de uma check valve, a flutuação depressão deverá ser registrada, a válvula marcada,trocada e então a pressão aferida e comparada com aanteriormente registrada. Imagine a dor de cabeçacausada por não se marcar uma check valve defeituosa que foi substituída e posteriormente utilizá-la comopeça de reposição ao se fazer a manutençãopreventiva de outro HPLC. O registro dosprocedimentos de manutenção tem uma vantagemadicional, pois servem como referência quando umproblema similar voltar a ocorrer.

Em tempo, é importante destacar que, apesarde algumas pessoas associarem o acrônimo HPLCcom “High Problem Liquid Chromatography”, umsistema bem cuidado, com manutenções preventivasbem executadas e em dia, dificilmente terá problemasde hardware complicados de serem resolvidos.

Os fundamentos da Técnica de Troubleshooting

Dentre os objetivos da técnica detroubleshooting, estão incluídos: a identificação dosproblemas tão logo ocorram; a pronta localização da(s)causa(s); a solução rápida do problema. É importante,ainda, que o procedimento seja documentado para queuma nova ocorrência seja mais facilmente identificadae resolvida. Como comentado anteriormente, aobservação cuidadosa do bom funcionamento doequipamento é um excelente termômetro para saberquando algo de errado surge no sistema ou nosresultados esperados. Essa técnica de isolamento esolução de problemas baseia-se na sistematização, demaneira lógica, da busca pelo problema. As principaisestratégias adotadas seguem a seguir:

1. Uma mudança de cada vez

A abordagem do problema deve ser feita demaneira lógica e sequencial. Cada alteração ousubstituição de componente ou peça deve ser feitaindividualmente para que então outra possibilidadeseja avaliada. Apesar da realização de mudanças etestes individuais soar como uma perda de tempo, essa é a melhor maneira de se isolar o problema,

reconhecendo-o e resolvendo-o. Algumas vezes, umlaboratório não tem tempo para tal procedimento,nesse caso, uma revisão completa da parte sobsuspeição, no sistema, é realizada. Se o problemarealmente estiver localizado naquele módulo ou parte, provavelmente será resolvido, porém à custa de umdispêndio de recursos maior e sem a compreensão doque realmente causou o problema. Se a causa doproblema for sistemática, não se saberá comopreveni-la, correndo-se o risco de haver recorrência,obrigando a uma nova intervenção. Um exemploclássico é a troca da coluna ou pré-coluna quando seapresenta um aumento de pressão no sistema de LC.Nem sempre essa é a estratégia que surte efeito e não é a maneira mais eficiente de iniciar os testes detroubleshooting. O isolamento da linha do solvente,ponto a ponto e sequencial, entre a bomba e odetector, poderia rapidamente resolver o problema.Um filtro entupido após a bomba, ou mesmo umaválvula de injeção parcialmente obstruída poderiamser a causa do problema, evitando a substituiçãodesnecessária de uma coluna ou pré-coluna.

2. Confirme a presença do problema e a sua solução

Ao deparar com um problema, é importanteque este seja confirmado por uma segunda injeção,antes que mudanças no método ou sistema comecem a ser feitas na busca pela sua causa. Às vezes, umartefato cromatográfico causado por uma bolha de aresporádica pode levar à caça pelo problema, quandoele não mais está presente. Da mesma forma, éimportante confirmar se a mudança feita no sistemaou método, ao se abordar um problema, é realmenteefetiva, antes de se partir para um novo teste. Umexemplo que leva muitos cromatografistas em buscade problemas no método, preparo de amostras ousoluções de padrões é o aparecimento de picosinesperados em corridas cromatográficas comgradiente. Algumas vezes, esse(s) pico(s) pode(m) ser decorrentes de contaminante(s) presentes na água ousolventes orgânicos utilizados, e não aparece(m) emseparações isocráticas. No uso de gradiente, umcontaminante pode ser pré-concentrado no início dacorrida cromatográfica, quando a fase móvel não temforça suficiente para eluí-lo, e então, ao se iniciar arampa do gradiente, ele será eluído na forma de umpico cromatográfico inesperado. Para observar-se que o problema não é diretamente relacionado com ométodo aplicado às amostras ou padrões, bastariateste com uma corrida cromatográfica em que não sefaz injeção alguma.

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3. Substitua a parte sob suspeição por outra reconhecidamente boa

Um teste rápido e eficiente de ser feito emlaboratórios com mais de um equipamento (ou compeças de reposição disponíveis) é a substituição departe ou módulo por outro que sabidamente apresentabom funcionamento. A troca de um detector, em casos de problemas com a linha de base, por exemplo, é uma boa forma de indicar se o problema reside naquelaparte do sistema. Para essa estratégia, teria inúmerosexemplos pessoais interessantes, que ao longo dotempo, nessa coluna, serão abordados. Uma extensãodessa estratégia é a devolução da parte substituídaquando essa mudança não resultar na resolução doproblema. Digamos que a parte substituída seja umacheck valve ou lâmpada do detector. A parte usadadeverá ser retornada, para evitar um acúmulo de peças ou partes que ainda não esgotaram a sua vida útil.Exceções para esse caso são as partes que apresentamdano irreparável quando são substituídas (porexemplo, alguns selos) ou partes que já seaproximavam do momento da substituição emprocedimentos de manutenção preventiva.

4. Tenha condições de referência

Como mencionado anteriormente, tenhareferências para saber se o desempenho do LC estáadequado. Por exemplo, uma mistura teste conhecidaé geralmente adequada para avaliar se uma colunaestá funcionando apropriadamente ou se apresentaproblemas em sua eficiência de separação.

5. Mantenha anotações

Conforme recomendado anteriormente, asanotações dos procedimentos de troubleshootingfuncionam como referência para problemas quepossam surgir posteriormente. Recomendamos doistipos de anotação: anotações no formato de umrelatório simplificado de troubleshooting, em que ostestes realizados e suas observações são indicadas, até que o problema seja resolvido (sugere-se o esquema:sintoma, causa e solução, para esse tipo de anotação);anotações temporárias para cada mudança executada.As anotações no formato de relatório servem dereferência para todos os cromatografistas dolaboratório/empresa, agilizando os procedimentosfuturos. O objetivo desse último tipo de anotação émanter controle sobre as mudanças que estão sendofeitas em cada passo do procedimento de verificação

do problema. Por exemplo, as pressões devem seranotadas ao se eliminar cada parte da linhacromatográfica, entre a bomba e o detector, ao sebuscar a causa de um problema de elevação da pressão no sistema cromatográfico.

6. Preveja as falhas e atue antecipadamente na manutenção

Algumas pessoas têm a impressão de que amanutenção preventiva é perda de dinheiro, poisantecipa a troca de peças que poderiam durar umtempo a mais. Esse pensamento é certamente falho em laboratórios de rotina/prestação de serviços, e muitasvezes também em laboratórios de pesquisa.Primeiramente, ao se adotar a técnica detroubleshooting, as falhas no sistema tornam-se muito mais previsíveis. Além disso, a própria rotina demanutenção sugerida pelo fabricante do equipamentoé um indicativo dos pontos que mais merecematenção. O esquema de manutenção para oequipamento pode ser baseado no tempo de uso de um determinado componente, ou em outro indicativoqualquer (por exemplo, relação sinal/ruídoapresentado pelo cromatograma de um padrãoanalítico, redução na energia da lâmpada, elevação dointervalo de flutuação da pressão das bombas etc.). Ao se estabelecer a manutenção preventiva, ela pode seragendada para um período mais adequado dentro deuma faixa de alerta/indicativa de manutenção. Esseúltimo aspecto é o que faz a diferença nos custosfinais desse procedimento. Imagine um projeto emexecução, o qual envolva a análise de centenas oumilhares de amostras. Uma falha no decorrer doprojeto, exigindo a manutenção imediata do sistema,poderia implicar na perda dos resultados até entãoprocessados, causando prejuízo muito maior do queos gastos com a manutenção preventiva que teriaevitado o problema. Em última instância, amanutenção preventiva também evita gastosadicionais desnecessários, decorrentes de falhassecundárias ocasionadas pela falta de manutenção.Por exemplo, pedaços de um rotor (peça do interior de uma válvula injetora) desgastado poderiam serarrastados pela fase móvel e causar o entupimento deuma coluna; ou o vazamento de fase móvel por umselo desgastado poderia comprometer o sistemaeletrônico de um cromatógrafo. Felizmente, existemoutros meios de prevenir esses problemas, mas amelhor maneira de se evitar “dores de cabeça” ainda éa manutenção preventiva.

7. Cuidado com as soluções tampão

De tão importante e recorrente, resolvemos daratenção a um caso concreto nesse último item. O uso desoluções tampão ou contendo eletrólitos (nem sempre asolução preparada é um “tampão” – revejam o conceitode tampão antes de reportarem o uso de um em seusmétodos…) é muito comum, especialmente emcromatografia em fase reversa e de troca iônica. Aremoção da solução tampão do sistema, quando fora deuso, ou na troca por outro método, não deixa de ser umitem preventivo. Algumas dessas soluções podemcausar corrosão, abrasão ou mesmo cristalização(levando ao bloqueio das linhas). Outra preocupação é odesenvolvimento de microrganismos devido a soluçõestampão em condições fisiológicas, acarretandoproblemas secundários. A regra nesse caso é a remoçãoda solução tampão, do sistema e da coluna, quando forade uso. A solução ideal para esse procedimento deveconter uma composição similar àquela da fase móvel,substituindo a solução tampão por água pura. Deve-seevitar a lavagem do sistema e coluna, previamenteusados com soluções salinas, diretamente com 100% desolvente orgânico (principalmente se este foracetonitrila). Um procedimento desse tipo pode levar àprecipitação do sal, causando problemas desde a bombaaté o detector. Um último cuidado ao se deixar o sistemacromatográfico parado é evitar o preenchimento dastubulações com água pura. O emprego de água nastubulações também permite o desenvolvimento demicro-organismos, os quais requererão um extensivoprocedimento de limpeza e substituições de peças, casovenha a acontecer. Uma forma simples e segura deacondicionar o sistema é a utilização de uma misturaaquoso-alcoólica nas tubulações e linhas do sistema;uma solução contendo mais do que 20% de metanol já éadequada para prevenir esse problema.

A lógica da Técnica de Troubleshootingna localização do problema

O uso de procedimentos lógicos na resoluçãode problemas é a chave do troubleshooting. Algumasfalhas, como o vazamento de uma conexão, são fáceisde localizar e corrigir. Por outro lado, distorções nospicos cromatográficos podem ser causadas pordiversas razões, necessitando-se de procedimentosmais cuidadosos para o isolamento do problema. Paraos problemas que não são de óbvia solução, umaabordagem sistemática é importante para que sechegue ao isolamento e correção do real causador dofato por meio de um caminho mais curto do que asimples procura aleatória pela causa do problema.

A. Examine todo o sistema

A primeira etapa ao deparar com um problemaé fazer uma varredura rápida de todo o sistema(hardware e método). Inicie a observação doreservatório da fase móvel, seguindo até o descarte dodetector, verificando se há alguma causa óbvia quepossa ser identificada visualmente ou que possa serinferida devido às características do método. Procurepor vazamentos, bolhas, trocas nas linhas das fasesmóveis, excesso de pressão, falta de controle detemperatura, rack de vials mal posicionado, vials comvolume insuficiente, equívoco na seleção da colunaetc. Com relação ao método observe o uso equivocado de um método errado, ou falhas na digitação daproporção ou vazão da fase móvel, limites ajustadospara as pressões (inferior e superior), erro no ajuste do comprimento de onda do detector ou nas condições de detecção para outros tipos de detectores. Esse deve ser um procedimento rápido, porém muitas falhas dosistema ou do operador são, felizmente, solucionadasdiretamente nessa primeira avaliação.

B. Observe as alterações que foram feitas no sistema ou método

Se a falha ou problema não for localizadoseguindo o item anterior, determine as mudançasrealizadas no sistema ou método e que podem ter dadocausa ao fato. Por exemplo, houve algum procedimentode manutenção, houve a reposição de alguma parte oumódulo do sistema, houve mudança no método,trocou-se a fase móvel, ou injetou-se alguma amostraincomum? Nesse item a sugestão de manter-se o registro das alterações e procedimentos realizados no sistema émuito útil. As mudanças realizadas, sob uma análisecuidadosa, podem indicar a causa do problema surgidono sistema. Mesmo que essas mudanças não indiquem acausa do problema, o seu conhecimento pode ajudar naposterior investigação do caso.

C. Teste as condições de referência

Para problemas que causam mudanças noperfil cromatográfico, a injeção de uma mistura dereferência pode solucionar o problema. Dessa forma,pode-se relacionar o problema com uma característica da amostra ou do sistema. Se o cromatograma dereferência está adequado, o problema estárelacionado, de alguma forma, com os procedimentosdependentes da amostra. Por exemplo, a injeção depadrões diluídos em 100% de solvente orgânico, pode apresentar picos duplos ou com ombros; uma injeção

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de solução-teste previamente conhecida, e nessascondições conhecidas, resultará em umcromatograma adequado, indicando que a causa dospicos anômalos esta relacionada à amostra, e não como sistema cromatográfico/coluna. Porém, se ambos oscromatogramas apresentam-se inadequados, algorelacionado ao sistema cromatográfico está causandoo problema. Nesse caso, focalize a atenção nalocalização, passo a passo, da causa do problema

Essa discussão apresentada acerca da técnicade troubleshooting deve ser usada em conjunto com oentendimento das fontes/causas de problemas quepodem ocorrer em um sistema ou métodocromatográfico. A discussão pontual do entendimento e resolução desses problemas específicos emcromatografia será o tema mais recorrente nessacoluna, todavia entendemos que o seu emprego, sebaseado nas técnicas e estratégias apresentadas acima, tornará o sucesso mais facilmente alcançável. Emadição a essa coluna, muitos manuais deequipamentos apresentam uma descrição dosproblemas mais comuns e suas possíveis causas esoluções. Além disso, alguns catálogos de empresasespecializadas em suprimentos para cromatografiaapresentam listas resumidas de troubleshooting emsuas especialidades. Alguns livros em inglês tambémapresentam uma discussão mais ampla sobre oassunto.1,2 Em síntese, siga os seguintes passos:mantenha anotações sobre os procedimentosrealizados no sistema cromatográfico, amostrasinjetadas no sistema e na coluna cromatográfica;quando estiver em busca da solução de um problemano sistema cromatográfico, faça apenas uma mudança de cada vez; se a mudança não resolver o problema,via de regra, retorne à configuração original; rotule(como peças usadas) ou descarte as peçassubstituídas, e identifique a posição correta quandoforem removidas temporariamente para algum teste;quando o problema for corrigido e a causaidentificada, crie uma pequena nota no caderno detroubleshooting relacionando sintoma, causa esolução; requisite peças em substituição às peças doestoque de manutenção que forem usadas; troqueinformações com seus colegas de laboratório ougrupos de discussão, faça buscas nos registros docaderno de troubleshooting do equipamento econsulte a literatura, geralmente outras pessoas jápassaram pelos problemas que você está encontrandono momento; ao reconhecer um problema, faça umavarredura em busca da causa, mas não se afaste dasregras de troubleshooting; não se esqueça de injetarsoluções ou testes anteriores que permitam comparar

com um cromatograma de referência (idealmenteregistrado nos cadernos de controle referentes aoequipamento ou à coluna); se necessário, comoestratégia para isolamento do problema, substituamódulos ou partes destes, por equivalentesprovenientes de equipamentos que estão em adequado funcionamento.

Como a compreensão dofuncionamento do sistema de HPLCpode ajudar na solução dos problemas?

A solução de problemas envolvendocromatografia é mais bem executada quando secompreende o funcionamento do sistemacromatográfico e os princípios que regem a separação.Como visto anteriormente, o sistema cromatográfico, o cromatograma, ou ambos, indicam quando umproblema surge. Da mesma forma, a solução doproblema é obtida por meio da investigação dosindícios apresentado pelo sistema ou cromatograma.Obviamente, um conhecimento sobre o sistema e sobrea teoria por trás da separação cromatográfica éimprescindível. Do contrário, qualquer mudança feitano sistema, em busca de solução para o problema, nãopassará de mero procedimento, infundado, de“tentativa e erro”, levando à perda de tempo e dinheiro.Nessa parte do artigo, trataremos de fazer umaapresentação sobre cada parte que geralmente estápresente em um sistema de HPLC, apresentandoinformações necessárias para uma boa compreensãodos procedimentos de troubleshooting. Uma visãoainda mais detalhada da instrumentação em HPLCpode ser obtida na referência 1 ou em outros livrosespecializados.

Para aqueles que não estão familiarizados commuitas marcas e modelos de cromatógrafos líquidos,existem basicamente dois tipos de sistemas, quanto ao arranjo. Há sistema modulares, que podem seridentificados pela presença de módulos distintos paraas bombas, desgaseificador, injetor, compartimentopara a coluna, detectores etc.; e há sistemascompactos ou monoblocos. Os primeiros geralmenteapresentam maior versatilidade de configuração epodem sofrer atualizações/incrementos maisfacilmente, dependendo da configuração, ocupam umespaço maior que os equipamentos monoblocos e sãocaracterizados pelo empilhamento dos módulos. Osúltimos costumam ser vendidos para finalidades maisespecíficas e tem atualização (upgrade) relativamente mais difícil, estes encontram boa aplicação emlaboratórios com rotina bem definida. Em ambos os



tipos de equipamento os componentes/partes sãopraticamente os mesmo, mudando apenas o tipo deintegração/agrupamento entre eles.

Um trabalho envolvendo separaçãocromatográfica por HPLC começa antes mesmo dechegar-se à frente do equipamento. A escolha desolventes orgânicos adequados (geralmente descritoscomo grau HPLC), de água ultrapurificada e dereagentes com alto grau de pureza, é imprescindível,especialmente nos casos de análise em gradiente. Nopreparo da fase móvel a filtração de soluções obtidas a partir da solubilização de solutos sólidos (geralmentesoluções tampão) é necessária para evitar quemateriais particulados sejam introduzidos no sistemacromatográfico (membranas de 0,22 ou 0,45 µm,compatíveis com a fase móvel, são adequadas a esseprocedimento). Além disso, caso o cromatógrafo nãopossua sistema de desgaseificação integrado, esseprocedimento deve ser executado antes da fase móvelser introduzida no sistema.

A aspersão de um gás inerte (geralmente hélio)na fase móvel é um dos métodos mais eficientes pararemoção dos gases dissolvidos na solução.1 Algunsequipamentos possuem inclusive um sistema deaspersão de hélio integrado. Mais práticos epopularizados atualmente são os sistemas online a vácuo integrados ao cromatógrafo e que se baseiam emmembranas semipermeáveis ao gás (Fig. 1). Problemasrelacionados a uma insuficiente desgaseificação sãomais comuns do que se pode imaginar. A tolerância aosgases na fase móvel vai depender sobretudo dasensibilidade da bomba e do detector. O aparecimentode bolhas é mais crítico em misturas orgânico-aquosas(geralmente acetonitrila-água ou metanol-água, em fasereversa, por exemplo), pois a solubilidade dos gasesnesse tipo de mistura é menor do que nas soluçõesorgânica e aquosa separadas. Com esse tipo de misturapodem persistir bolhas na fase móvel após a purga pelosdesgaseificadores online. Em razão do tamanho dasbolhas formadas, algumas delas podem não sercompletamente permeadas pelo desgaseificador avácuo. Nesse caso, uma solução simples é a sonicaçãoda fase móvel por 5 a 10 minutos, antes da introdução no sistema cromatográfico. Apesar da sonicação, por si só,não ser um método de desgaseificação tão eficientequanto a aspersão de hélio ou a aplicação de vácuo, elaserve para a rápida remoção do excesso de gásinsolubilizado no momento da mistura entre o solventeaquoso e o orgânico, auxiliando a etapa online posterior.A filtração a vácuo dessa mistura, por membranafiltrante, algumas vezes também resolve o problema doexcesso de bolhas de gás.

As fases móveis são geralmente acondicionas emfrascos de vidro apropriados (Fig. 2) e colocadas emcompartimento adequado, sobre o cromatógrafo. Casonão haja compartimento adequado (geralmente supridocom o cromatógrafo), recomenda-se o emprego de umabacia retangular que se adapte sobre o equipamento. Acolocação de frascos diretamente sobre o equipamentopode levar a acidentes, ocasionando o derramamento delíquido sobre componentes sensíveis do equipamento. Osfrascos devem ser tampados para evitar a entrada dematerial particulado e a contaminação, bem como evitar aevaporação de solventes. Alguns frascos comerciaispossuem tampas com filtros de ar, porém essas tampaspodem ser facilmente adaptadas no laboratório. Atravésda tampa deve existir orifício para a entrada do tubocoletor da fase móvel, e em caso de sistema de aspersãode hélio, também para esse. Na entrada do tubo coletor écomum a utilização de um filtro de 10 µm (geralmente deaço inoxidável 316 ou polietileno de altíssima densidade), enquanto na saída do tubo de aspersão de hélio usa-se um“filtro” de 2 µm para a dispersão do gás (Fig. 3).

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Figura 1. Desgaseificador online a vácuo, o solvente entrano sistema por uma das portas, passa por fina tubulaçãocomposta por membrana semipermeável aos gases e sai dosistema em direção à bomba ou válvula seletora dogradiente de baixa pressão.

Figura 2. Exemplo de frasco para acondicionamento dafase móvel.

Na maior parte das bombas, a troca desolventes pode ser feita por um processo de purga,comandada por meio de software ou no painel daprópria bomba cromatográfica. Esse procedimentofaz com que a fase móvel passe através do tubo deentrada (geralmente um tubo de Teflon® –politetrafluoroetileno – de 1/8”), pelo sistema dedesgaseificação online, se presente, fluindo até abomba cromatográfica e sendo desviado, pela válvulade purga, para o descarte. Esse procedimento tambémpode ser feito manualmente por meio de aspiraçãocom uma seringa comum, adaptada na saída daválvula de purga. Geralmente esse procedimento énecessário e recomendado quando o tubo de entrada ea bomba encontram-se sem fase móvel. A não ser quea bomba seja extremamente robusta, a sucção degrande volume de ar pelo tubo de entrada impede abomba de realizar a purga automática da fase móvel,requerendo a purga manual. Apesar de esse problemaser de fácil observação, já foi testemunhada, inúmeras vezes, essa ocorrência em laboratórios. Geralmente,esse problema ocorre pela falta de constatação, pelooperador, de que o tubo de entrada está seco. Nessecaso, o operador solicita uma purga automática e nãoobserva se a fase móvel está fluindo pelo tubo deentrada até o descarte. Após esse procedimento depurga, o operador tenta estabelecer um fluxo de fasemóvel pela coluna, mas constata que não há elevaçãoda pressão (no caso de utilizar fase móvel compostapor apenas um tipo de solvente) ou que háinstabilidade da pressão, com repetidas quedasbruscas, (geralmente no caso de utilização de fasemóvel binária, ternária ou quaternária). Umprocedimento prático para constatar o bomfuncionamento das bombas é permitir a entrada de um pequenino segmento de ar através do filtro de entradano início da purga e acompanhar o seu caminhar pelotubo até ser eliminado pelo desgaseificador ou serremetido ao descarte pela válvula de purga.

Apesar de existirem outros tipos de bomba, asmais utilizadas atualmente são aquelas baseadas na

combinação de dois pistões reciprocantes (em série(tandem) ou em paralelo). Em ambas as bombas ofuncionamento do pistão é o mesmo. Movido por umsistema mecânico controlado eletronicamente, opistão exerce um movimento cíclico de avanço erecuo promovendo o enchimento e esvaziamento dasua câmara. Para a vedação do espaço existente entrea parede da câmara e o pistão, utiliza-se um selo dematerial elastomérico. Esse selo, para melhorvedação, possui uma mola no seu interior (Fig. 4). Adiferença entre as duas bombas está no tamanho dospistões, no caminho feito pelo solvente e no númerode check valves. Primeiramente, check valves sãoválvulas de retenção, ou seja, válvulas que permitem o fluxo de solventes em apenas um sentido.Basicamente são válvulas, ativas ou passivas, comuma ou mais esferas em seu interior, e que bloqueiama passagem da fase móvel quando esta é pressionadano sentido contrário ao fluxo permitido. Na bombacom dois pistões reciprocantes em paralelo, para cadapistão há duas check valves uma de entrada e outra desaída. Bem como os pistões, as check valvesfuncionam alternadamente. Enquanto um pistãoimpulsiona a fase móvel da sua câmara para o sistemacromatográfico, tendo a check valve de saída aberta ea de entrada fechada; o outro admite a fase móvel,proveniente do reservatório, em sua câmara, tendo aválvula de entrada aberta e a de saída fechada. Aochegar ao fim dos seus cursos, os pistões e as válvulasinvertem os seus papéis, garantindo umimpulsionamento quase contínuo da fase móvel para o sistema. A Figura 5 esquematiza esse tipo de bomba.Nas bombas com pistões em série há apenas um par de check valves localizadas na entrada e saída da câmarado primeiro pistão. Esse primeiro pistão geralmentetem o dobro do volume do segundo. Na primeirametade do ciclo, esse primeiro pistão impulsiona afase móvel do interior da câmara para o sistemacromatográfico, tendo a válvula de saída aberta e a deentrada fechada. Todavia, metade do volume da fasemóvel impulsionada, em vez de ser direcionada aosistema cromatográfico, ocupa-se de preencher oespaço de admissão gerado pelo segundo pistão dasérie. Ao fim da primeira metade do ciclo defuncionamento, a câmara do segundo pistão estácompletamente cheia e a do primeiro, vazia; nessemomento ocorre a inversão dos movimentos e dascheck valves. O primeiro, pistão inicia a admissão denova fase móvel, proveniente do reservatório,enquanto o segundo pistão incumbe-se deimpulsionar a fase móvel contida em sua câmara parao restante do sistema. A Figura 6 ilustra esse tipo debomba.



Figura 3. Exemplos de filtros de admissão de fase móvel.

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Figura 4. Exemplos de selo de vedação (vista ampliada) epistões de safira, usados em bombas de HPLC.

Figura 5. Esquema de bomba do tipo reciprocante de duplo pistão em paralelo. Figura cedida como cortesia pelo Dr.Lincoln F. M. Coutinho3.

Figura 6. Esquema de bomba do tipo reciprocante de duplo pistão em série. Figura cedida como cortesia pelo Dr.Lincoln F. M. Coutinho3.

As bombas de pistões seriais são mais baratas erobustas do que aquelas de pistões em paralelo, noentanto, tem inferior qualidade na alimentação dosolvente. Geralmente sob um mesmo regime de vazão, apulsação das bombas com pistões em paralelo é menordo que aquela das bombas seriais. Em vazõesconvencionais, superiores a 1,0 mL/min, geralmente asduas bombas apresentam desempenhos bastantesatisfatórios. Para vazões mais baixas, recomenda-se oemprego de bombas com pistões em paralelo, uma vezque possuem um inferior limite de trabalho, com menornível de pulsação, esse é o caso comum de sistemasHPLC que alimentam espectrômetros de massas cominterfaces do tipo electrospray. A manutenção e osproblemas mais comuns em uma bomba de HPLCenvolvem os selos e as check valves. Ambos têm umavida útil e implicam na estabilidade da pressão exercidapela bomba. Enquanto os selos podem apresentar falhasestruturais e gerar vazamentos, as check valves podemapresentar dificuldade na abertura e fechamento,também perturbando a pressão e vazão da fase móvel.Os maiores cuidados exigidos por essas partes da bomba envolvem a limpeza, quanto a materiais particuladospresentes na fase móvel. A cristalização dos sais de umasolução tampão pode levar ao desgaste (ranhuras) doselo, a travamentos e desgaste da check valve e, emúltima instância, a quebra dos pistões e danos em suacâmara. Algumas bombas apresentam uma segundacâmara, posterior à câmara de admissão da fase móvel, aqual permite a lavagem do corpo do pistão. Ela é deespecial uso quando se faz o emprego contínuo desoluções tampão em altas concentrações. Recomenda-se a utilização de solução aquosa contendo entre 10 e 20 %de metanol para evitar, por um lado, a cristalização dossais no solvente orgânico, e por outro o crescimento demicroorganismos. O principal sintoma indicativo deproblemas com selos é a incapacidade de manter apressão no interior da bomba. Como isso se dá com ovazamento da fase móvel, dependendo do caso pode-seobservar esse vazamento. Os problemas com seloscostumam ser resolvidos com a sua substituição, éimportante escolher o tipo de selo adequado à fasemóvel que se utiliza no sistema. No caso das checkvalves, também há manifestação de instabilidade napressão. Com um exame detalhado é possível identificarqual a válvula problemática e proceder com o seuconserto ou substituição. As check valves em caso demau funcionamento, algumas vezes, podem serrecuperadas por meio da lavagem em banho deultrassom. Geralmente utiliza-se primeiramente água(podendo estar acidificada com ácido nítrico), umasegunda lavagem com água pura, no caso da lavagemcom ácido, e posteriormente um solvente orgânico

(metanol ou acetonitrila). Um cuidado adicional é amontagem correta das check valves, evitando-se a suainversão ou troca entre as portas de entrada e saída.Geralmente, na saída da bomba encontra-se mais umfiltro, convém observar se há obstrução dele,principalmente quando um problema de elevação depressão ocorrer exclusivamente em uma das bombas dosistema. Esse tipo de entupimento costuma decorrer dafalta de manutenção do sistema de vedação da válvulade purga, o material elastomérico de vedação podefragmentar-se e obstruir o primeiro obstáculo à suapassagem, no caso, o filtro de saída da bomba. Outrasmanutenções requeridas pelas bombas são de maislongo prazo e podem envolver a substituição de pistõesou diafragmas, e a limpeza e lubrificação da partemecânica do acionamento dos pistões. A substituição depistões e diafragmas pode constar dos manuais demanutenção do usuário, enquanto geralmente a limpezae lubrificação das partes mecânicas requerem a aberturada bomba e costumam ser feitas por técnicoespecializado ou com maiores conhecimentos.Eventualmente sensores eletrônicos da posição dospistões podem falhar e gerar problemas difíceis de serem detectados sob uma primeira inspeção. Nesse caso, aestratégia de substituição dos componentes funcionamuito bem para o isolamento do problema. Para maiores detalhes sobre o funcionamento e partes dos diferentestipos de bombas, sugerimos uma consulta à referência 3, a qual pode ser obtida pela web.

Ainda sobre o sistema de bombeamento dossolventes, alguns realizam separações baseadas em fasemóvel com composição invariável, ou seja, separaçõeschamadas isocráticas. Enquanto outros utilizam degradientes entre diferentes fases móveis, as quais podem ser binárias, ternárias ou quaternárias. Os sistemasisocráticos dependem de apenas uma bomba e a misturaadequada para a fase móvel pode ser feita diretamenteno recipiente de fase móvel. É evidente que sistemaspara gradiente podem também fazer uma misturaisocrática apropriada. Os sistemas para gradiente podem ser de dois tipos (baixa e alta pressão), e seuentendimento é importante para a compreensão deproblemas que podem ocorrer. Nos sistemas de baixapressão, apenas uma bomba é utilizada, porém esta éprecedida por uma válvula seletora de fase móvel(composta por válvulas solenoides). A composição finalda fase móvel é obtida pela segmentação proporcionaldos diferentes solventes, os quais passam pela bomba etem o término da homogeneização realizada por ummisturador. O gradiente é controlado pelo sistemaeletrônico, o qual calcula os tempos que cada uma dasválvulas solenoides ficam abertas, permitindo que acorreta proporção da mistura seja obtida. Os sistemas



com gradiente de alta pressão possuem uma bomba paracada uma das fases móveis misturadas. A proporçãoentre os solvente é ajustada pela fração da vazão de cadabomba que constitui a vazão total utilizada. As saídas decada uma das bombas confluem para um misturador quehomogeneíza a fase móvel que é destinada para orestante do sistema. Os sistemas com gradientes de baixa pressão são mais baratos, uma vez que utilizam apenasuma bomba e um seletor de solventes, em contraste como gradiente de alta pressão que precisa de uma bombapara cada solvente da mistura. Por outro lado, aplicações que necessitem de vazões mais baixas e que sejam muito sensíveis a inomogeneidades da fase móvel nãoapresentam bons resultados com gradiente de baixapressão. Sob baixas vazões, causa atrasos no gradiente(em razão do volume morto do sistema) podendoinviabilizar a separação e sua repetibilidade, e, alémdisso, a insuficiente homogeneização causa aumento noruído da linha de base do cromatograma. Em sistemas de baixa pressão, uma estimativa do volume morto docromatógrafo deve estar bem clara para evitar problemas de seleção incorreta das condições do gradiente. Muitasvezes, gradientes com colunas de 2,1 mm de diâmetrointerno, sob vazão de aproximadamente 0,2 ml/min,acopladas a espectrômetros de massas com detecção porelectrospray são incompatíveis com sistemas de baixapressão. Um cuidado adicional com o gradiente de baixa pressão é a correta desgaseificação da fase móvel, comoa mistura inicia-se ainda sob baixa pressão, eventuaisbolhas de gás podem ser formadas pela menorsolubilidade dos gases na mistura orgânico-aquosa, emrelação aos solventes não misturados. Uma válvulaseletora de solventes composta por quatro válvulassolenoides é representada na Figura 7.

Após o sistema de pressurização da fasemóvel, encontra-se, nos sistemas capazes de elaborargradientes, um misturador. Esse misturador costumater um volume de mistura regulável que deve serajustado de acordo com as características de uso dosistema. Um exemplo de ajuste inadequado é aseleção do maior volume de mistura para análises sobgradiente em vazões reduzidas. Atrasos superiores adez minutos podem ser constatados dependendo dacombinação inadequada que for realizada,especialmente em sistemas com gradiente de baixapressão.

A fase móvel, após deixar a câmara de mistura, é destinada ao sistema de injeção. Convém ressaltarque toda a linha da fase móvel, após a bomba, deve ser resistente às pressões utilizadas para a obtenção deadequada vazão pela coluna cromatográfica. Alémdisso, os diâmetros internos desses tubos devem seradequados às vazões utilizadas. Tubos com diâmetrointerno muito reduzido levam a um desnecessárioaumento de pressão, além de maiores riscos deentupimento. Por outro lado, um diâmetro internorelativamente exagerado causa atraso do gradiente e,se depois do sistema de injeção, alargamentoindesejado dos picos cromatográficos. Os tubos maisempregados nos sistemas convencionais são de açoinoxidável e têm 1/16” de diâmetro externo. Outromaterial muito utilizado para as tubulações deequipamentos em que se deseja maior inércia química(geralmente para biomoléculas) é o polieteretercetona (PEEK) também de 1/16” de diâmetro externo.Alguns sistemas de nano-HPLC e HPLC capilarapresentam tubulações mais finas com diâmetroexterno de 1/32”, geralmente de PEEK revestidointernamente por sílica fundida e podem apresentardiâmetros internos de poucos micrômetros. Umcuidado adicional refere-se aos conectores usado emHPLC. Nem todas as portas de conexões dasdiferentes marcas de cromatógrafos, válvulas ecolunas apresentam as mesmas características. Aescolha cuidadosa pode evitar desde o emperramentode conectores inadequados, até distorçõescromatográficas como picos duplos, com cauda(tailing) ou com frontes (fronting) em virtude doexcesso de volume morto entre o injetor e a coluna ouentre a coluna e o detector. Muitos conectores atuaispodem e são suficientemente atarraxados com ospróprios dedos. Em caso do emprego de chaves nasconexões, recomenda-se que a força utilizada não seja em demasia, geralmente ¼ de volta após a conexão ser atarraxada manualmente já é suficiente para evitarvazamentos. Um vazamento persistente costuma sercausado por incompatibilidade entre os conectores ou

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Figura 7. Exemplo de válvula para seleção de solventes emgradiente de baixa pressão.

conectores danificados. Um excesso de força podecausar a quebra de um conector e levar a necessidadede assistência técnica do fabricante.

Há diversos sistemas de injeção para HPLC, os mais encontrados atualmente são as válvulas manuais(em sistemas de menor custo) ou os injetoresautomáticos. No injetor manual, uma válvula de 6 vias e 2 posições permite que, com o auxílio de umaseringa, a alça de amostragem (loop) seja preenchida(totalmente ou parcialmente) pela amostra. Após essaetapa de carregamento da amostra (load), a válvula écomutada (girada) de maneira a introduzir a alça deamostragem na linha cromatográfica, posicionando-aentre o sistema de bombeamento e a colunacromatográfica. Os maiores cuidados com relação aoprocedimento de injeção manual concernem a umaadequada limpeza da válvula, entre as injeções, paraevitar que efeitos de memória (carry over) sejamobservados. Como todas peças móveis, oscomponentes da válvula têm uma vida útil e devemsofrer manutenção após um certo número de injeções.Um último cuidado consiste em não esquecersoluções corrosivas ou salinas no interior da válvula,uma vez que essas podem danificá-la seriamente. Ossistemas de injeção automática podem apresentardiferentes arranjos, cada qual com suaspeculiaridades. Dentre os mais usados, algunssimplesmente mecanizam as mesmas funções que ooperador executa na injeção manual, preenchendo aalça por meio do impulsionamento da amostra comuma seringa; outros preenchem a alça por meio dasucção da amostra até a alça; e um terceiro tipo tem aagulha de amostragem integrada à alça deamostragem. As velocidades de injeção e demaiscaracterísticas dependem do tipo de sistema deinjeção empregado pelo amostrador automático.Dentre os três tipos apresentados, o último é o maismoderno e o que geralmente apresenta maioresvelocidades de injeção, bem como redução do efeitode memória. Obviamente, costumam ser os mais caros e com mais componentes para manutenção e fonte deproblemas. Para um troubleshooting mais detalhadorelacionado aos sistemas de injeção, uma melhorcompreensão do funcionamento de cada um se faznecessária. Infelizmente, nesse momento, umdetalhamento maior estenderia em demasia estadiscussão. Material bem detalhado sobre os diversossistemas de injeção pode ser encontrado na web.4

O injetor, como visto anteriormente, é oresponsável pela inserção da amostra no sistemacromatográfico, permitindo que esta chegue até acoluna e tenha, idealmente, todos os seuscomponentes separados. Entretanto, a amostra, na

maioria dos casos, só pode ser injetada depois de tersido adequadamente preparada. O adequadotratamento da amostra envolve o emprego de diversastécnicas de preparo de amostras. Esses procedimentos são bastante especializados e merecem atençãodetalhada desse periódico, podendo ser consultadosna seção “Preparo de amostras”. Eventualmente,problemas que tenham relação com o preparo deamostras serão discutidos nessa coluna. Para omomento, o mais importante acerca da forma que aamostra deve encontrar-se para ser introduzida,refere-se a sua compatibilidade com a fase móvelempregada no início da corrida cromatográfica. Apósadequadamente tratada, via de regra, a amostra deveestar solubilizada na fase móvel empregada no inícioda corrida. Como nem sempre isso é possível, algunscuidados devem ser tomados, pois muitos problemasde distorção dos picos cromatográficos são causadospor erros na introdução da amostra. Primeiramente, aamostra deve estar completamente solubilizada nasolução de injeção, devendo ser preferencialmentefiltrada, ou centrifugada, para a remoção de qualquermaterial particulado em suspensão. Caso a fase móvelseja muito diferente da solução a ser injetada, éimportante verificar se a amostra não precipitará aoser introduzida no sistema. De preferência,especialmente nos casos de grande volume de injeção, a força de eluição do solvente da amostra deverá sermenor do que aquele da fase móvel do início dacorrida. Por exemplo, em injeções em fase reversa, aporcentagem de solvente orgânico da solução daamostra não deve superar, em muito, aquela da fasemóvel. Um caso clássico de incompatibilidade é ainjeção de soluções contendo 100% de acetonitrila oumetanol, em corridas em fase reversa iniciando combaixos teores de solvente orgânico na fase móvel.Todavia, as distorções nos picos cromatográficos sãodependentes do método e dos analitos a seremseparados, e podem estar ausentes em alguns casos.

Após ser adequadamente introduzida nosistema cromatográfico, deseja-se que a amostraatinja a coluna cromatográfica com o formato de umabanda o mais estreita possível. Esse formato depende,entre outras, da qualidade da injeção e daminimização do volume morto entre o injetor e acoluna. A coluna cromatográfica em HPLC, via deregra, é um tubo de aço inoxidável preenchido com afase estacionária adequada. A diversidade de colunascromatográficas é incalculável. Há colunas quevariam em escala, desde diâmetros de poucosmicrômetros até alguns centímetros, isso emequipamentos que podemos classificar como HPLCde bancada. Daí surge classificações que vão desde o



nano-HPLC até o HPLC preparativo. Quanto ao tipode material de empacotamento é comum o empregoatual de partículas de sílica desde superiores a 10 µmde diâmetro em colunas preparativas até sub-2 µmpara separações de altíssima eficiência; materiaispoliméricos particulados ainda continuam sendoutilizados; bem como tem sido ampliado o uso decolunas monolíticas a base de sílica ou orgânicas,tanto em escala capilar quanto na convencional.Muitos problemas encontrados em separaçõescromatográficas têm causas que, de alguma forma,relacionam-se com a coluna cromatográfica. Operfeito entendimento de seu funcionamento dependetambém de conceitos teóricos que em momentoadequado serão abordados. Para o momento, convémdestacar que a coluna cromatográfica, exceto no casode amostras muito limpas, merece algum tipo deproteção. Uma das causas mais comuns de perdasprecoces de colunas cromatográficas, problemas deeficiência e distorção de picos cromatográficosrelaciona-se com a obstrução do filtro de entrada,posicionado justapostamente no início da coluna.Esse filtro é referido como frit, em inglês, outraduzido livremente como ‘frita’, em português.Algumas vezes, a sua obstrução pode ser resolvidacom procedimentos de lavagem da coluna, e emcolunas antigas, permitia-se inclusive a suasubstituição; de qualquer maneira, a melhor forma deevitar-se esse tipo de problema é a prevenção. É muito divulgada a utilização de pré-colunas, as quais sãoposicionadas precedendo a coluna cromatográficapropriamente dita. Apesar de ser a forma deprevenção de problemas mais popularizada, emmuitos casos, o uso de um filtro de linha, em vez dapré-coluna, surte os mesmos efeitos, ou ainda permiteresultados superiores, em termos de menoralargamento dos picos. Maiores discussões sobre asvantagens e desvantagens de filtros de linhas oupré-colunas ficam para outro momento, o fato é queao menos um deles é recomendado para prolongar avida da coluna. Um filtro de linha obstruído éfacilmente substituído e tem um preço módico,enquanto colunas caras podem ser perdidas se estesnão forem utilizados. Finalmente, as colunas,idealmente, são mantidas em um forno, para controlede temperatura. Apesar de variações na temperaturaimplicarem em diferentes tempos de retenção eseletividades, ao menos em escala convencional, nãoé viável a separação por programação de temperatura(como ocorre na cromatografia em fase gasosa).Outros dispositivos que podem requerer e apresentarcontrole de temperatura são os injetores automáticos e alguns detectores. O resfriamento das amostras é

desejado para prolongar a sua conservação no interiordo amostrador automático, enquanto o controle detemperatura de detectores, por exemplo, UV/Vis oueletroquímico, é importante para aumentar aestabilidade da linha de base do cromatograma.

Sob condições ótimas, os componentes daamostra apresentam desiguais taxas de interação coma fase estacionária da coluna e são eluídos comdiferentes tempos de retenção. Para que essescompostos sejam observados, há a necessidade de umsistema de detecção, que possibilite o registro naforma de picos em um cromatograma. Os picosregistrados em um cromatograma fornecem uma ideia com relação à identidade dos compostos separados, ea área dos picos relaciona-se com a quantidade decada composto. Atualmente, há uma gama muitogrande de detectores que podem ser usados em umHPLC. O mais popular detector para HPLC é oUV/Vis, o qual pode ser encontrado também na forma mais sofisticada que emprega um arranjo defotodiodos (comumente referido como DAD ou PDA, do inglês, diode array detector ou photodiode array),para detecção simultânea de todos os comprimentosde onda em um determinado intervalo do espectroUV/Vis. Outros detectores que podem serencontrados, dependendo da especialidade dolaboratório, são detectores de fluorescência, de índicede refração, de espalhamento de luz por evaporação(evaporative light scattering detector), de dicroísmocircular, eletroquímico e de condutividade.Equipamentos mais sofisticados e que constituemanalisadores espectrométricos, em vez de merosdetectores para cromatografia, são os espectrômetrosde massas (MS) e os espectrômetros de ressonânciamagnética nuclear (NMR). Evidentemente, oprimeiro grupo atualmente encontra um grau dedivulgação muito maior do que o segundo, eequipamentos do tipo LC-MS/MS têm ganhado muito espaço e atenção nos laboratórios. Apesar de customuito mais elevado do que o de um HPLC-UV, umLC-MS/MS, em todos os seus modos de análise,expande significativamente as fronteiras de atuaçãodas técnicas cromatográficas. Detalhes sobre oscuidados e particularidades referentes aoacoplamento LC-MS fogem ao escopo deste artigo,mas eventualmente serão retomados em momentosmais oportunos. De maneira geral, todos os detectores requerem um certo tempo de estabilização, essetempo pode ir de alguns minutos (detectores UV) atéalgumas horas (detectores eletroquímicos). Uma dicaé aproveitar o tempo de estabilização para realizar opreparo das amostras a serem injetadas. Um detalheque evita problemas em alguns detectores, geralmente

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UV/Vis e de fluorescência, é a utilização de um tubode descarte que gere certa pressão após a cela dedetecção. Algumas vezes, o encurtamento do tubo dedescarte, ou a simples eliminação dele para coleta defrações imediatamente após o detector, pode levar aosurgimento de bolhas que atrapalharão ocromatograma. A súbita despressurização após acoluna pode levar à insolubilização do gás dissolvidona amostra e o aparecimento de bolhas, que, emúltima instância, podem ficar retidas no detectorcausando artefatos no cromatograma. Um últimoalerta quanto a esse procedimento é a observação dapressão máxima suportada pela cela de detecção, docontrário esta pode apresentar vazamentos ou mesmoser danificada.

Os sistemas cromatográficos atuais sãocontrolados eletronicamente. Apesar de poder-seexecutar a grande maioria das funções pelo módulo ou interface de controle do equipamento, o meio maisutilizado é o controle via software, instalado em umcomputador. Além do controle do equipamento, osoftware comumente apresenta um pacote defuncionalidades para facilitar o tratamento e ainterpretação dos dados, bem como a geração derelatórios e a exportação dos resultados. Dessa forma,um conhecimento rudimentar da eletrônica einformática relacionada ao sistema cromatográfico édesejado, uma vez que alguns problemas são aílocalizados.

Atualmente, os sistemas cromatográficospermitem que injeções sejam programadas e o sistemamonitorado à distância, tal facilidade permite quecromatógrafos trabalhem 24 horas processando asamostras. No caso de deixar o sistema em esperadurante a noite, para que o mesmo método sejaretomado no dia seguinte, recomenda-se deixar umapequena vazão de fase móvel fluindo pelo sistema.

Algo em torno de 10% da vazão normal já é suficiente,e para maior economia de fase móvel pode operar-seem modo de reciclagem de fase móvel. O detector e orestante dos módulos devem ficar desligados até o diaseguinte. Quando o sistema for desligardefinitivamente, é importante fazer a limpeza de todasas linhas utilizadas e acondicioná-lo com solventeapropriado, bem como a coluna cromatográfica.

Concluindo, ao se adquirir experiência naoperação rotineira de um sistema de cromatografialíquida de alta eficiência, bem como ao se adquirirconhecimento técnico e teórico a respeito da HPLC,muitos desses procedimentos e observações tendem atornarem-se intuitivos. O mais importante nasanálises de rotina, por mais experiência que se tenha, é fazer tudo da mesma maneira e na mesma sequência,para que se obtenham resultados comparáveis.

Referências Bibliográficas1. Dolan, J.W. and Snyder, L.R. Troubleshooting LC

systems – A comprehensive approach to troubleshooting

LC equipment and separation. Totowa, New Jersey:

Humana Press. (1989) 500p.

2. Kromidas, S. Practical problem solving in HPLC.

Weinhein: Wiley-VCH. (2000) 178p.

3. Coutinho, L.F.M. Desenvolvimento de Instrumentação

Dedicada a Cromatografia Líquida Capilar (cLC).

2008. 219 f. Tese de Doutorado – Instituto de Química de

São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2008.

Disponível em: <http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/

75/75132/tde-05122008-171742/> Acesso em: 27 abr. 2009.

4. CHROMacademy. HPLC Autosamplers. Disponível

em: <http://www.chromacademy.com/HPLC-Autosamplers/

index.html> Acesso em: 27 abr. 2009.

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