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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA EN GEOLOGÍA, MINAS, PETRÓLEOS Y
AMBIENTAL
INGENIERÍA AMBIENTAL
BIODIVERSIDAD MICROBIANA DE LAS AGUAS TERMALES “SANTAGUA DE
CHACHIMBIRO” EN LA PROVINCIA DE IMBABURA: BÚSQUEDA DE
MICROORGANISMOS CON PROPIEDADES BIOTECNOLÓGICAS.
TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO AMBIENTAL.
AUTOR: DIANA YOMAIRA IBAZA TABANGO
TUTOR: DR. FÉLIX ANDUEZA, MSc, PhD
QUITO
2018
i
© DERECHOS DE AUTOR
Yo Diana Yomaira Ibaza Tabango en calidad de autor del trabajo de investigación:
BIODIVERSIDAD MICROBIANA DE LAS AGUAS TERMALES “SANTAGUA DE
CHACHIMBIRO” EN LA PROVINCIA DE IMBABURA: BÚSQUEDA DE
MICROORGANISMOS CON PROPIEDADES BIOTECNOLÓGICAS autorizo a la
Universidad Central del Ecuador hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o
parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización
y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a
lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
En la ciudad de Quito, a los 19 días del mes de enero del 2018
-----------------------------------------------------
Diana Yomaira Ibaza Tabango
1724974967
ii
APROBACION DEL TUTOR
Yo, Félix Andueza en calidad de tutor del trabajo de titulación, modalidad proyecto de
investigación BIODIVERSIDAD MICROBIANA DE LAS AGUAS TERMALES
“SANTAGUA DE CHACHIMBIRO” EN LA PROVINCIA DE IMBABURA:
BÚSQUEDA DE MICROORGANISMOS CON PROPIEDADES
BIOTECNOLÓGICAS, elaborado por el estudiante Diana Yomaira Ibaza Tabango de la
Carrera de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería en Geología, Minas, Petróleos y
Ambiental, de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los
requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico,
para ser sometido a la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo
que APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de
titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 19 días del mes de enero del 2018
-------------------------------------
Dr. Félix Andueza MSc. PhD
C.C. 1757134646
iii
APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR PARTE DEL
TRIBUNAL
El delegado del Subdecano y los Miembros del tribunal calificador del trabajo de
titulación, modalidad proyecto de investigación: “BIODIVERSIDAD MICROBIANA
DE LAS AGUAS TERMALES “SANTAGUA DE CHACHIMBIRO” EN LA
PROVINCIA DE IMBABURA: BÚSQUEDA DE MICROORGANISMOS CON
PROPIEDADES BIOTECNOLÓGICAS, preparado por la señorita: DIANA YOMAIRA
IBAZA TABANGO, egresada de la Carrera de Ingeniería Ambiental, declaran que el
presente proyecto ha sido revisado, verificado y evaluado detenida legalmente,
calificándose como original y auténtico del autor.
En la ciudad de Quito DM a los días del mes de ----- del 2017
DELEGADO DEL
SUBDECANO
MIEMBRO
MIEMBRO
iv
DEDICATORIA
A Dios, por darme la fortaleza necesaria para seguir adelante a pesar de las adversidades,
por demostrarme su infinito amor cada día de mi vida.
A mis padres Cristina y Oswaldo por su apoyo constante, su amor incondicional, su
ejemplo impartido, ellos han sido mi mayor motivo de esfuerzo, sobre todo mi madre
quien ha sido mi mejor amiga, mi razón de existir, mi pilar fundamental para poder lograr
mis objetivos.
A mis hermanos Jeyson, Odalys y Camila por su ayuda y comprensión, cuando más lo he
necesitado, por brindarme su amor y alegría.
A mi familia en general, tíos, primos y abuelitos María, Enrique y Zoila por su apoyo, sus
consejos y porque son parte de este logro.
Diana
v
AGRADECIMIENTOS
Nuevamente a Dios porque sin Él, simplemente no existiría, su fidelidad y amor es notoria
en cada instante de mi vida.
A mis padres por su amor, su paciencia, dedicación, por su apoyo económico y su apoyo
emocional que fueron fundamentales para cumplir una de mis metas planteadas.
A mis amigos que han formado parte de mi vida estudiantil, Tere, Esther, Pao, Vivi, May,
Majo, Roberto, Karina con quienes he compartido gratos momentos, y hemos logrado una
firme amistad a pesar de todas las contrariedades de la Universidad y en especial a Alexis,
quien ha sido una excelente persona y un apoyo incondicional para mí.
A mi familia en general porque cada uno aportaron de una u otra manera en mi formación
como persona y ahora como profesional.
A mi tutor, Félix Andueza por impartir sus conocimientos y brindar su tiempo valioso
para guiarme en la ejecución del presente proyecto.
A Isabel Carrillo, que ha sido mi instructora en el laboratorio de Biología, por su apoyo,
paciencia y enseñanza al momento de realizar la parte experimental de mi investigación.
A la Empresa Pública “Santagua de Chachimbiro” por abrirme sus puertas y permitirme
realizar mi proyecto de investigación.
A la Universidad Central del Ecuador, a través de su Facultad FIGEMPA y el laboratorio
de Biología, por los conocimientos impartidos a lo largo de mi formación académica.
vi
TABLA DE CONTENIDO
CONTENIDO PÁGINAS
LISTA DE TABLAS ...................................................................................................... IX
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... XI
LISTA DE ANEXOS .................................................................................................... XII
ABREVIATURAS ....................................................................................................... XIII
RESUMEN .................................................................................................................. XIV
ABSTRACT .................................................................................................................. XV
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
1. MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 3
1.1. AGUA .................................................................................................................. 3
1.2. AGUA TERMAL .................................................................................................... 4
1.2.1. Clasificación de las aguas termales ............................................................ 5
1.3. MICROORGANISMO ............................................................................................. 6
1.3.1. Bacterias ..................................................................................................... 6
1.3.2. Morfología de las bacterias......................................................................... 7
1.3.3. Metabolismo ............................................................................................... 7
1.3.4. Crecimiento ................................................................................................ 8
1.4. MEDIOS DE CULTIVO ......................................................................................... 10
1.4.1. Componentes comunes de los medios de cultivo ..................................... 10
1.5. SIEMBRA ........................................................................................................... 12
1.5.1. Tipos de siembra ....................................................................................... 13
1.6. CONTEO VIABLE ................................................................................................ 13
1.7. IDENTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA ................................................................... 14
1.8. BIOTECNOLOGÍA ............................................................................................... 16
1.8.1. Biotecnología ambiental ........................................................................... 16
1.8.2. Enzimas .................................................................................................... 17
1.8.3. Propiedades biotecnológicas de las bacterias ........................................... 17
1.9. SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA ...................................................................... 19
1.9.1. Resistomas ambientales ............................................................................ 20
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL .................................................................... 21
2.1. ZONA DE INVESTIGACIÓN .................................................................................. 21
2.1.1. Historia del lugar ...................................................................................... 21
2.1.2. Descripción del lugar de la investigación ................................................. 21
2.2. MATERIALES, EQUIPOS MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS ............................... 23
2.3. FACTORES DE ESTUDIO ..................................................................................... 23
2.3.1. Población Muestral ................................................................................... 23
2.3.2. Muestra ..................................................................................................... 23
2.3.3. Periodo de investigación ........................................................................... 24
vii
2.4. MÉTODOS Y TÉCNICAS ...................................................................................... 24
2.4.1. Muestreo ................................................................................................... 24
2.4.2. Determinación de parámetros fisicoquímicos “in situ” en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” .................................................................................... 25
2.4.3. Análisis microbiológico de las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
25
2.4.4. Aislamiento de microrganismos ............................................................... 26
2.4.5. Caracterización biotecnológica................................................................. 31
2.4.6. Sensibilidad antimicrobiana ..................................................................... 35
2.4.7. Esquema de metodología utilizada en la investigación. ........................... 36
3. RESULTADOS ....................................................................................................... 37
3.1. PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS ......................................................................... 37
3.2. RESULTADOS DEL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO .................................................. 40
3.2.1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas. ........................... 40
3.2.2. Recuento de bacterias Pseudomonas ........................................................ 41
3.2.3. Recuento de bacterias coliformes totales y E. coli ................................... 42
3.2.4. Recuento de mohos y levaduras en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” .......................................................................................................... 43
3.2.5. Resultados del aislamiento microbiano: características macroscópicas ... 44
3.2.6. Resultados de la tinción Gram de cepas aisladas en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” .................................................................................... 46
3.2.7. Resultados de las pruebas bioquímicas .................................................... 48
3.2.8. Identificación de las especies aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” .......................................................................................................... 49
3.3. RESULTADOS DE LA CARACTERIZACIÓN BIOTECNOLÓGICA .............................. 51
3.4. ANTIBIOGRAMAS DE LAS BACTERIAS IDENTIFICADAS ....................................... 52
4. DISCUSION............................................................................................................ 54
4.1. PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS ......................................................................... 54
4.2. CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN LAS AGUAS TERMALES “SANTAGUA DE
CHACHIMBIRO” ............................................................................................................ 56
4.2.1. Recuento de bacterias aerobios mesófilas heterótrofos. ........................... 56
4.2.2. Recuento de bacterias Pseudomonas ........................................................ 57
4.2.3. Recuento de coliformes totales ................................................................. 59
4.2.4. Recuento de mohos y levaduras ............................................................... 62
4.3. AISLAMIENTO DE ESPECIES BACTERIANAS EN LAS AGUAS TERMALES “SANTAGUA
DE CHACHIMBIRO” ....................................................................................................... 63
4.4. IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES AISLADAS EN LAS AGUAS TERMALES
“SANTAGUA DE CHACHIMBIRO” .................................................................................. 66
4.5. CARACTERIZACIÓN BIOTECNOLÓGICA .............................................................. 72
4.6. RESISTENCIA BACTERIANA DE LAS ESPECIES IDENTIFICADAS ............................ 80
5. CONCLUSIONES .................................................................................................. 85
6. RECOMENDACIONES ......................................................................................... 87
viii
7. BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................... 88
ANEXOS ...................................................................................................................... 107
ix
LISTA DE TABLAS
CONTENIDO PÁGINAS
Tabla 1. Clasificación de las aguas termales en base a la conductividad eléctrica .......... 6
Tabla 2. Ubicación geográfica de las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” ....... 22
Tabla 3. Componentes del medio mínimo para aislar bacterias proteolíticas, amilolíticas,
celuloliticas, lipolíticas y degradadoras de derivados de petróleo.................................. 32
Tabla 4. Fuentes de carbono para el medio mínimo ...................................................... 32
Tabla 5. Composición química del medio mínimo para bacterias amilolíticas .............. 32
Tabla 6. Composición química del medio mínimo para bacterias lipolíticos ................ 33
Tabla 7. Composición química del medio mínimo para bacterias proteolíticos ............ 33
Tabla 8. Composición química del medio mínimo para bacterias degradadoras de
derivados de petróleo ...................................................................................................... 33
Tabla 9. Composición química del medio mínimo para bacterias celuloliticos ............. 34
Tabla 10. Interpretación de resultados obtenidos en la caracterización biotecnológica . 34
Tabla 11. Sensibilidad antimicrobiana ........................................................................... 35
Tabla 12. Parámetros fisicoquímicos del agua en la vertiente de las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”. .......................................................................................... 37
Tabla 13. Parámetros fisicoquímicos del agua en el tanque de almacenamiento de las
aguas termales “Santagua de Chachimbiro”. .................................................................. 38
Tabla 14. Parámetros fisicoquímicos en la piscina 1 de almacenamiento de las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro”. ............................................................................ 39
Tabla 15. Parámetros fisicoquímicos en la piscina 2 de almacenamiento de las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro”. ............................................................................ 40
Tabla 16. Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” ........................................................................................... 41
Tabla 17. Recuento de bacterias pseudomonas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” ................................................................................................................. 42
Tabla 18. Recuento de bacterias coliformes totales y e. coli en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” ........................................................................................... 43
Tabla 19. Recuento de mohos y levaduras en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” ................................................................................................................. 44
Tabla 20. Características macroscópicas de los cultivos bacterianos puros aislados en las
aguas termales “Santagua de Chachimbiro” ................................................................... 45
Tabla 21. Resultados de la tinción gram de cepas bacterianas aisladas en las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro” ............................................................................. 46
x
Tabla 22. Morfología de las colonias aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” ................................................................................................................. 47
Tabla 23. Resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas aisladas en las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro” ............................................................................. 48
Tabla 24. Especies bacterianas identificadas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” ................................................................................................................. 49
Tabla 25. Resultados de la caracterización biotecnológica de las especies bacterianas
identificadas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” ................................... 51
Tabla 26. resultados de las pruebas de resistencia a antibióticos de las especies aisladas
en las aguas termales “santagua de chachimbiro” .......................................................... 52
xi
LISTA DE FIGURAS
CONTENIDO PÁGINAS
Figura 1. Ubicación geográfica de las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” ...... 22
Figura 2. Parámetros físico-químicos del agua en la vertiente de las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”. .......................................................................................... 37
Figura 3. Parámetros fisicoquímicos del agua en el tanque de almacenamiento de las
aguas termales “Santagua de Chachimbiro”. .................................................................. 38
Figura 4. Parámetros fisicoquímicos del agua en la piscina 1 de almacenamiento de las
aguas termales “Santagua de Chachimbiro”. .................................................................. 39
Figura 5. Parámetros fisicoquímicos del agua en la piscina 2 de almacenamiento de las
aguas termales “Santagua de Chachimbiro”. .................................................................. 40
Figura 6. Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” ........................................................................................... 41
Figura 7. Recuento de bacterias pseudomonas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” ................................................................................................................. 42
Figura 8. Recuento de bacterias coliformes totales y e. coli en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” ........................................................................................... 43
Figura 9. Recuento de mohos y levaduras en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” ................................................................................................................. 44
Figura 10. Morfología de cultivos bacterianos puros aislados en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” ........................................................................................... 47
Figura 11. Porcentaje de las cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” ................................................................................................................. 50
Figura 12. Porcentaje de las cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” en función de sus propiedades biotecnológicas ...................................... 51
Figura 13. Porcentaje de las cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro en función de su resistencia o sensibilidad a diferentes antibióticos ........ 53
Figura 14. Porcentaje de cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro
que presentan multiresistencia a diferentes antibióticos................................................. 53
xii
LISTA DE ANEXOS
CONTENIDO PÁGINAS
Anexo A. Medios de cultivos ....................................................................................... 109
Anexo B. Fotografía sitios del muestreo ...................................................................... 110
Anexo C. Fotografía de la medición de parámetros “in situ” ....................................... 110
Anexo D. Dilución seriada (domingo, 2014) ............................................................... 111
Anexo E. Resultados de prueba en agar sangre (hemolisis beta) ................................. 111
Anexo F. Resultados de prueba catalasa ...................................................................... 111
Anexo G. Resultados de prueba oxidasa ...................................................................... 112
Anexo H. Resultados de la prueba o/f .......................................................................... 112
Anexo I. Agar maconkey .............................................................................................. 112
Anexo J. Resultados de la prueba de citrato ................................................................. 113
Anexo K. Prueba tsi ...................................................................................................... 113
Anexo L. Prueba sim .................................................................................................... 113
Anexo M. Prueba de coagulasa .................................................................................... 113
Anexo N. Prueba de ureasa........................................................................................... 114
Anexo O. Hidrolisis de gelatina ................................................................................... 114
xiii
ABREVIATURAS
km: kilómetros
mg: miligramos
m.s.n.m.: metros sobre el nivel del mar
ml: mililitro
L: litro
OD: oxígeno disuelto
SDT: sólidos totales disueltos
µg: microgramos
UFC: unidades formadoras de colonias
xiv
RESUMEN
Se realizó un estudio de la biodiversidad microbiana de las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” en la Provincia de Imbabura, cuyo objetivo fue determinar la biodiversidad
de microorganismos y sus propiedades biotecnológicas. Se tomaron muestras en cuatro
puntos del balneario: vertiente, tanque (sólida y liquida), piscina 1 y 2, cada 15 días,
durante un periodo de 45 días. Se realizaron mediciones de parámetros fisicoquímicos
(temperatura, pH, salinidad, conductividad, OD y SDT), la toma y transporte de muestras
se ejecutó en base a las normas NTE-INEN 2176 y 2169 respectivamente. La
cuantificación e identificación se realizó de acuerdo con los esquemas de pruebas
bioquímicas y fisiológicas propuestos por MacFaddin (2003) y Barrow y Feltan (2003).
La caracterización biotecnológica se hizo de acuerdo con lo señalado por Andueza (2007).
Los resultados indican que en el agua del balneario existe en promedio 1,02 x 103 UFC/ml
de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas; 3,40 x 102 UFC/ml de Pseudomonas; 2,42x
10 UFC/ml de Coliformes totales y 0,1 x 101 UFC/ml mohos y levaduras. Se logró aislar
29 cepas bacterianas de las cuales el 24% fueron Gram Positivas y 76% Gram Negativas,
prevaleciendo el género Aeromonas, se identificaron un total de 19 especies: Aeromonas
media, Aeromonas eucrenophila, Actinomyces turicensis, Yersinia bercovieri,
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida, Aeromonas hydróphila, Pseudomonas
aeruginosa, Alcaligenes latus, Micrococcus lylae, Bacillus mycoides, Pseudomonas
oryzihabitans, Aeromonas schubertii, Ewingella americana, Psychrobacter immobilis,
Haemophilus actinomycetemcomitans, Bacillus cereus, Aeromonas caviae, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus thuringiensisd, de las cuales el 89,47% mostraron
capacidad celulolítica; 73,68% proteolítica; 84,21% amilolítica; 73,68% lipolítica y
78,95% degradadoras de derivados de petróleo. En cuanto a sensibilidad antimicrobiana
el 57,9% fueron resistentes a la ampicilina; 42,1% a la eritromicina; 89,5% a la
fosfomicina y el 21,1% a sulfametoxazol trimetoprima. El balneario “Santagua de
Chachimbiro” presenta calidad sanitaria baja pero alta diversidad bacteriana que poseen
diversas propiedades biotecnológicas aprovechables.
PALABRAS CLAVES: BIODIVERSIDAD MICROBIANA, AGUA TERMAL,
CARACTERIZACIÓN BIOTECNOLÓGICA
xv
ABSTRACT
A study was made of the microbial biodiversity of the "Santagua de Chachimbiro"
thermal waters in the Province of Imbabura, whose objective was to determine the
biodiversity of microorganisms and their biotechnological properties. Samples were taken
at four points of the spa: slope, tank (solid and liquid), pools 1 and 2, every 15 days, for
a period of 45 days. Measurements of physico-chemical parameters (temperature, pH,
salinity, conductivity, OD and SDT) were made, the sampling and transportation of
samples was carried out based on the NTE-INEN 2176 and 2169 norms respectively. The
quantification and identification was carried out according to the biochemical and
physiological test schemes proposed by MacFaddin (2003) and Barrow and Feltan (2003).
The biotechnological characterization was made according to the point made by Andueza
(2007). The results indicate that in the spa water there is an average of 1,02 x 103 CFU/ml
of heterotrophic mesophilic aerobic bacteria; 3,40 x 102 CFU/ml of Pseudomonas; 2,42x
10 CFU/ml total coliforms and 0,1 x 101 CFU/ml molds and yeasts. It was possible to
isolate 29 bacterial strains of which 24% are Gram Positives and 76% are Gram Negatives
prevailing the genus Aeromona, 19 species were identified: Aeromonas media,
Aeromonas eucrenophila, Actinomyces turicensis, Yersinia bercovieri, Aeromonas
salmonicida subsp. Salmonicida, Aeromonas hydróphila, Pseudomonas aeruginosa,
Alcaligenes latus, Micrococcus lylae, Bacillus mycoides, Pseudomonas oryzihabitans,
Aeromonas schubertii, Ewingella americana, Psychrobacter immobilis, Haemophilus
actinomycetemcomitans, Bacillus cereus, Aeromonas caviae, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus thuringiensis of which 89,47 % are cellulolytic; 73,68%
proteolytic; 84,21% amylolitics; 73,68% lipolytic and 78,95% petroleum derivative
degraders. Regarding antimicrobial sensitivity; 57,9% were resistant to ampicillin; 42,1%
to erythromycin; 89,5% to fosfomycin and 21,1% to sulfamethoxazole trimethoprim. The
"Santagua de Chachimbiro" spa presents a low sanitary quality but high bacterial diversity
that possess several usable biotechnological properties.
KEYWORDS: MICROBIAL BIODIVERSITY, THERMAL WATER,
BIOTECHNOLOGICAL CHARACTERIZATION
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the
original document in Spanish.
………………………………………..
Dr. Félix Andueza
Tutor
C.C. 1757134646
1
INTRODUCCIÓN
El ambiente no es ajeno a la especie humana. Las características físicas, químicas y
biológicas del medio que nos rodea ofrecen el marco óptimo para nuestro desarrollo. Sin
embargo, el ser humano, ha adoptado un modelo de vida que supone un excesivo gasto
de recursos naturales y energéticos de manera creciente e insostenible, lo que genera la
alteración de las condiciones naturales y el deterioro del planeta.
El progreso tecnológico, por una parte y el acelerado crecimiento demográfico, por la
otra, producen la alteración del medio, llegando en algunos casos a atentar contra el
equilibrio biológico de la Tierra. Es necesario que se proteja los recursos renovables y no
renovables y se tome conciencia de que el saneamiento del ambiente es fundamental para
la vida sobre el planeta (Frers, 2010).
En la actualidad existen muchas alternativas que permiten mejorar la calidad ambiental,
en base a tratamientos físicos, químicos y microbiológicos pero que muchas veces
resultan de difícil acceso o aplicación, de aquí surge la idea de buscar una nueva opción
de remediación o descontaminación en base a bacterias con propiedades biotecnológicas.
Una de las técnicas más utilizadas y menos costosa para la transformación de
contaminantes en los diferentes ecosistemas es la biodegradación, tomando en cuenta que
existe una gran diversidad de bacterias que cuentan con la maquinaria enzimática para
transformar los compuestos xenobióticos persistentes que pueden ser aisladas de lugares
donde haya existido una exposición al contaminante (Narváez et al., 2008).
Los ecosistemas acuáticos por sus características específicas constituyen nichos
ecológicos de determinadas especies microbianas, el conocimiento de este micro hábitat
permite establecer la biología y la ecología de los mismos (Mosso et al., 2006), pudiendo
así aprovechar de las propiedades de estas especies y las condiciones de estos
ecosistemas, en procesos de biorremediación de ambientes contaminados.
La biodiversidad microbiana de las aguas termales no se conoce en la mayoría de los
casos, aunque se postula que debido a que son hábitats de condiciones extremas en
temperatura, pH y concentraciones iónicas (minerales) elevadas su diversidad debe ser
baja. Sin embargo, estos individuos microscópicos se han ido adaptando a las condiciones
2
de cada medio generando una microbiota autóctona de estas aguas, además de que existen
también microrganismos que derivan del ambiente que rodea a estas fuentes termales.
El Ecuador es un país que, al encontrarse en el Círculo de Fuego del Pacífico, cuenta con
varias fuentes de agua termal y mineral que por su composición química poseen
propiedades medicinales (INAMHI, 2013), pero existen pocos estudios microbiológicos
de estos ecosistemas y solo están direccionados a la investigación de la calidad sanitaria
de estas aguas, sin embargo, también se puede realizar investigaciones que enfoquen
puntos de vista como el medicinal, industrial, y biotecnológico.
La importancia de esta investigación radica en que los ecosistemas contaminados
presentan características desfavorables con propiedades físicas y químicas alteradas en
los que un tratamiento con microorganismos capaces de adaptarse a cualquier condición
extrema, beneficiaria y contribuiría con soluciones a los problemas ambientales actuales.
De igual forma, es necesario conocer la calidad sanitaria del agua del balneario ya que
pueden existir bacterias patógenas capaces de causar enfermedades al visitante, por eso
es importante realizar un estudio de resistencia bacteriana a ciertos antibióticos que
permitan determinar el riesgo al que se exponen las personas.
En base a esta premisa el objetivo de esta investigación fue realizar análisis
microbiológicos en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”, ubicadas en la
provincia de Imbabura con la finalidad de buscar microorganismos con propiedades
biotecnológicas, mediante la ejecución de los siguientes objetivos específicos:
- Realización de 3 muestreos en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
- Determinación de parámetros fisicoquímicos “in situ” del agua tales como: pH,
temperatura, conductividad, salinidad, oxígeno disuelto, y solidos totales disueltos.
- Cuantificación del número de microorganismos presentes en las aguas analizadas.
- Aislamiento e identificación de las principales cepas bacterianas presentes en las aguas
termales de “Santagua de Chachimbiro”.
- Caracterización las bacterias identificadas en base a sus características
biotecnológicas, tales como: Capacidad enzimática (proteolíticos, amilolíticos,
celulolíticos, lipolíticas y degradación de hidrocarburos).
- Determinación de la sensibilidad antimicrobiana frente a varios antibióticos.
3
1. MARCO TEÓRICO
1.1.Agua
El agua es el componente más abundante en la superficie terrestre y constituye una parte
esencial de todos los seres vivos; “es un líquido transparente, incoloro, inodoro e insípido
cuando se encuentra en estado puro, está formada por átomos pequeños, dos de hidrógeno
y uno de oxígeno” (Rae, 2015), unidos por 66 enlaces covalentes muy fuertes que hacen
que la molécula sea muy estable (Carbajal & Gonzales, 2012).
Según Estadísticas del agua en México (Conagua, 2011), la disponibilidad de agua
promedio anual en el mundo es de aproximadamente 1386 millones de km3, de los cuales
el 97,5% es agua salada es decir se encuentran en mares y océanos y solo el 2,5% es decir
35 millones de km3, es de agua dulce y de esta cantidad casi el 70% no está disponible
para consumo humano ya que sólo una pequeña porción se encuentra en lagos, ríos,
humedad del suelo y depósitos subterráneos relativamente poco profundos, cuya
renovación es producto de la infiltración.
Se puede referir a varios tipos de agua, que dependen de diversos factores como: la
cantidad de sales disueltas, la presencia de minerales y la procedencia u origen del agua.
Según el Igme (2017) el agua se puede clasificar en base a la cantidad de sales disueltas
en:
- aguas saladas: supera los 10000 mg/L (mares y océanos)
- aguas dulces: la concentración de sales es muy baja (ríos, lagos, pozos, etc.).
Por otro lado, de acuerdo con la concentración de minerales, existen aguas de tipo:
- Blandas: en estas aguas, la presencia de minerales es muy baja. Su máximo extremo
es la destilada, que carece de minerales en absoluto.
- Duras: importante presencia de minerales, entre ellos, magnesio y calcio. La presencia
de los minerales en la disolución y arrastre es lo que le da su carácter de dura (Conagua,
2010)
Y según Conagua en las Estadísticas del agua en México (2010) en base al lugar de
procedencia el agua se clasifica en:
- Superficiales: son provenientes del mar, pantanos, ríos o lagos. Debido a la presencia
de microorganismos patógenos, partículas en suspensión y los desechos provenientes
4
de las comunidades, se recurre a procedimientos físicos y químicos para eliminar sus
impurezas. Estos permiten volver a las aguas superficiales en potables.
- Subterráneas: procede de pozos o manantiales ubicados en el interior de la tierra. Si
bien deben sufrir ciertos tratamientos antes de ser aptas para el consumo humano, su
nivel de contaminación es bajo. Entre estas aguas subterráneas tenemos también a las
aguas minerales, aguas termales, etc.
1.2.Agua termal
Se definen como aguas termales a aquellas aguas subterráneas que emergen con una
temperatura mayor en 5oC a la temperatura media anual del ambiente. (Burbano et al.,
2013)
Además, según Mosqueira et al., (2009) las aguas termales, minerales y
mineromedicinales presentan las siguientes características:
Contienen minerales, oligoelementos u otros constituyentes que les proporcionan
sus efectos terapéuticos, y pureza en su origen. Están dotadas de un “dinamismo
fisicoquímico” y es importante destacar que este equilibrio químico y biológico se
pierde cuando se alejan de la surgencia, por lo que la cura termal debe ser
realizada siempre a pie del manantial
El origen más frecuente de las aguas termales es el origen geotérmico, que a su vez se
clasifica en:
Origen meteórico: son aquellas que se infiltran en el subsuelo, descendiendo
debido a la gravedad hacia las capas más profundas, y que elevan su temperatura
en el curso de su circulación subterránea por efecto del gradiente geotérmico, que
posteriormente pueden ascender a la superficie a través de fisuras y fracturas en
las rocas. Presentan menos cantidad de mineralización.
Origen magmático: son primitivas, proceden de la cristalización de las aguas
de los magmas que desprenden hidrogeno y vapor de agua en forma de fumarolas.
(Mosqueira et al., 2009).
San Miguel De La Cámara (1956) afirma que estas aguas surgen desde las
profundidades cercanas a las regiones volcánicas, se forman a altas temperaturas y
elevada presión estas aguas emergen a la superficie ya sea violentamente en estado de
vapor durante las erupciones volcánicas, o lentamente en forma de fuentes termales.
5
1.2.1. Clasificación de las aguas termales
Las aguas termales se clasifican en base a diversos parámetros como:
Temperatura
Con relación a la temperatura que presenta el agua termal esta se puede clasificar en:
- frías: menos de 20oC
- hipo termal: de 20 a 30oC
- termales o meso termales: de 30 a 40oC
- hipertermales: más de 40oC (Burbano et al. 2013)
Composición química
Burbano et al., (2013) cita la metodología de Kurlov para categorizar las aguas minerales,
el cual toma en consideración los aniones y cationes que exceden el 20% meq/L, es decir
basándose en el contenido de los iones más abundantes, y las clasifica de la siguiente
manera:
- en base a los aniones: Bicarbonatadas, sulfatadas, cloruradas, bicarbonatadas
sulfatadas, bicarbonatadas cloruradas, sulfatadas cloruradas, sulfatadas cloruradas
bicarbonatadas.
- En base a cationes: cálcicas, magnésicas, sódicas, cálcicas magnésicas, cálcicas
sódicas, magnésicas sódicas, cálcicas magnésicas sódicas
Mineralización
De acuerdo con el contenido mineral global o mineralización cuantitativa, es decir el total
de sólidos disueltos en las aguas termales se pueden clasificar según Mosqueira et al.,
(2009) en:
- Oligometálicas: que contienen sólidos disueltos (SD) no superiores a 100 mg/L
- De mineralización muy débil: que contienen SD entre 100 y 250 mg/L
- De mineralización débil: que contienen SD entre 250 y 500 mg/L
- De mineralización media: que contienen SD entre 500 y 1000 mg/L
- De mineralización fuerte: que contienen SD superior a 1000 mg/L
Salinidad
(Burbano et al., 2013) indica que el factor para conocer el grado de salinidad
(concentración de sales disueltas) del agua es la conductividad eléctrica que está
6
relacionada directamente con la cantidad de solidos disueltos totales; tomando en cuenta
que para una primera aproximación los STD en ppm, está dada por la siguiente ecuación:
STD (ppm) = CE (µS/cm) *0.64
En base a lo mencionado el agua termal se clasifica en:
Tabla 1. Clasificación de las aguas termales en base a la conductividad eléctrica
STD (mg/L) Clasificación Porcentaje
0 a 160 Baja salinidad 5
160 a 480 Salinidad media 23
480 a 1440 Salinidad alta 29
Mayor a 1440 Salinidad muy alta 43
Fuente: Burbano et al., (2013)
1.3.Microorganismo
Madigan et al., (2004) afirma que los microorganismos son un grupo amplio y diverso de
organismos microscópicos que se presentan como células aisladas o asociadas, incluyen
los virus que no son celulares; son incapaces de vivir aislados de la naturaleza, realizan
sus procesos vitales de crecimiento, generación de energía y reproducción.
Los microorganismos se agrupan en dos categorías: procarióticos y eucarióticos. Al
primer grupo pertenecen las archaeas y las bacterias, mientras que en el segundo se
encuentran hongos, algas y protozoarios (Montaño et al., 2010)
Para cumplir con el objetivo de la presente investigación, fue necesario enfatizar el
estudio de las bacterias existentes en aguas termales por las condiciones extremas que
presentan estos sitios, ya que surge la necesidad de determinar las características
distintivas que permiten el desarrollo de cada microorganismo y el papel que cumplen en
los ciclos de la naturaleza.
1.3.1. Bacterias
Granados y Villaverde (2003) determina que las bacterias son organismos unicelulares
muy pequeños y relativamente sencillos, cuyo material genético no está rodeado por una
membrana nuclear especial, por ello se llaman procariotas, están relacionadas
filogenéticamente. Asimismo, presentan mecanismos productores de energía y el material
genético necesarios para su desarrollo y crecimiento.
7
1.3.2. Morfología de las bacterias
De la misma forma Granados y Villaverde (2003) indican también que la forma de las
bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular y debido a
alteraciones morfológicas ocasionadas por la acción del medio ambiente se observan una
gran variedad de especies bacterianas.
Además, aseveran que las formas básicas de las bacterias son: esférica (coco), bastoncillo
o cilíndrica (bacilo), helicoidal (espirilo), en forma de coma (Vibrio), espiral
(espiroqueta), estrella y cuadrangular.
La morfología bacteriana debe ser observada con el microscopio óptico o el microscopio
electrónico, dado el tamaño pequeño de estos microorganismos. Así mismo, las bacterias
pueden observarse sin tinción si se las coloca en glicerol o soluciones no acuosas que
aumenten el índice de refracción o con tinción usando diferentes coloraciones que
mejoran su visualización. Dichas tinciones se basan en la afinidad que presentan los
colorantes por las estructuras bacterianas (Pirez y Mota, 2006).
- Gram positivas: tiene una pared celular compuesta básicamente por
peptidoglicano, carece de membrana externa según lo expuesto por Madigan et al.,
(2004); suelen presentar coloración azul violeta después de ser sometidos a tinción Gram
como medio de identificación.
- Gram negativas: posee pared celular que contiene poco peptidoglicano y presenta
una membrana externa compuesta por lipopolisacárido, lipoproteína y otras
macromoléculas complejas y captan un color rojo-rosado en la tinción (Madigan et al.,
2004).
1.3.3. Metabolismo
Andocilla, (2003) define al metabolismo bacteriano como el conjunto de los procesos
químicos que se desarrollan en la estructura de una bacteria a través de los que atrapan
materiales para transformarlos y adaptarlos a sus necesidades constructivas o también
para extraer energía de los compuestos directamente tomados del medio.
Singleton, (2003) señala que la mayoría de reacciones requieren de proteínas catalíticas
específicas denominadas enzimas, estas funcionan solo en un rango limitado de
condiciones fisicoquímicas. Una secuencia de reacciones metabólicas, en la cual una
sustancia se convierte en otra se denomina ruta metabólica; en dicha ruta el sustrato es
convertido, a menudo a través de uno o más intermediarios.
8
1.3.4. Crecimiento
El crecimiento de una célula bacteriana implica el aumento coordinado de la masa de sus
partes constituyentes; no es simplemente un incremento de la masa total, ya que esto
podría deberse, por ejemplo, a la acumulación de un compuesto de almacenamiento
dentro de la célula. Normalmente el crecimiento conlleva la división de una célula en dos
células similares o idénticas (Singleton, 2003).
Condiciones de crecimiento
Las bacterias solo crecen si el ambiente es adecuado; si no es óptimo, pueden no crecer o
crecer en una tasa baja, o la bacteria puede morir, dependiendo de la especie y de las
condiciones.
Por ello Singleton, (2003) determina que los requerimientos esenciales para el
crecimiento incluyen:
a) Nutrientes: las bacterias utilizan un alto rango de compuestos como nutrientes:
varios azucares, carbohidratos, aminoácidos, esteroles, alcoholes, hidrocarburos, metano,
sales inorgánicas y dióxido de carbono. En cualquier organismo las células necesitan
fuentes de carbono, nitrógeno, fosfato, sulfuro y otros materiales a partir de los cuales se
sintetiza la materia viviente.
b) Energía: la energía se necesita para la mayoría de reacciones químicas, para la
movilidad flagelar y para la importación de nutrientes. Toda esta energía se obtiene de
fuentes ambientales. Es especies fototrópicas se obtiene únicamente de la luz, mientras
que las especies quimiotróficas obtienen la energía mediante el procesamiento de
compuestos químicos tomados del ambiente.
c) Agua: un 80% o más de la masa de una bacteria es agua y durante el crecimiento,
los nutrientes y productos de desecho entran y salen de la célula, respectivamente, en
solución; por ello las bacterias pueden crecer sobre materiales que tengan la cantidad
adecuada de agua libre.
d) pH: la mayoría de las bacterias presentan un óptimo crecimiento a un pH de 7
(neutro), no pueden crecer en condiciones de fuerte acidez o alcalinidad. Sin embargo,
ciertas bacterias que se encuentran por ejemplo en desagües de minas o en ciertas fuentes
termales, no solamente toleran si no que prefieren condiciones acidas o altamente acidas.
e) Oxígeno: ciertas bacterias para su crecimiento requieren oxígeno (aerobias),
algunas crecen en ausencia de este (anaerobias) y otras pueden desarrollarse
9
independientemente de la presencia o ausencia de oxígeno (anaerobias y aerobias
facultativas).
f) Temperatura: par un tipo de bacteria dado, existe una temperatura optima de
crecimiento en la que el crecimiento es más rápido, la tasa de crecimiento disminuye a
medida que la temperatura se aleja respecto al óptimo.
Según Lopardo et al (2016), en su investigación indican que en temperaturas que están
entre los 20 y 30 ◦C se presenta la mayor diversidad de especies acuáticas y esta
disminuye drásticamente después de los 40 ◦C. Arriba de los 60 ◦C solo se presentan
organismos procariotas, y el único grupo que puede llevar a cabo la fotosíntesis oxigénica
en estas condiciones son las Cyanophyceae.
De esta manera, en función de la temperatura las bacterias se clasifican en:
Bacterias hipertermófilas: (Ramírez et al., 2006) indica que para estos
microorganismos la temperatura óptima de crecimiento está por encima de los 80o C y el
máximo crecimiento de cultivos puros se ha llegado a dar entre 110 y 113o C.
Podemos encontrarlos de forma habitual en los suelos y aguas que son calentados
constantemente por la actividad de diversos volcanes. Estos ambientes suelen ser ricos en
azufre y tienen un pH ácido, aunque también pueden encontrarse en zonas ligeramente
alcalinas. Estas sulfataras se encuentran repartidas por todo el planeta y de forma más
abundante en Islandia, Nueva Zelanda y el Parque Nacional de Yellowstone (Whitaker et
al., 2003).
Bacterias termófilas: temperatura óptima de crecimiento mayor a 45o C. Sus
enzimas tienen alta estabilidad térmica debido principalmente a redes de interacciones y
modificaciones de la membrana plasmática (Ramírez et al., 2006).
Singleton, (2003) indica que estos microorganismos se localizan en abonos, fuentes
termales, aberturas hidrotermales en el suelo oceánico; incluyendo especies
Thermobacteroides (temperatura optima 55–70o) y Thermomicrobium (temperatura
optima 70 -75o)
Bacterias mesófilas: Ramírez et al., (2006) menciona que la temperatura optima
de crecimiento es alrededor de 37oC. Frecuentemente son capaces de crecer en rangos
alrededor de 25 a 45o C.
Los mesófilos viven en un amplio rango de hábitats, e incluyen las bacterias patógenas
del hombre y otros animales (Singleton, 2003).
10
Bacterias psicrófilos: capaces de crecer por debajo de 5oC y con temperaturas
máximas de 20oC. Frecuentemente son capaces de crecer en rangos alrededor de 10oC.
Principalmente habitan son en las regiones polares, montañas altas, glaciares, el fondo de
los océanos, sistemas subterráneos bajos, la atmosfera superior y las superficies de las
plantas y de los animales que viven en los ambientes fríos (Ramírez et al., 2006).
Bacterias psicrófilos facultativos: Su temperatura optima es de 15oC llegando a
alcanzar los 20oC y también capaces de crecer hasta por debajo de 0oC (Ramírez et al.,
2006). Estos microorganismos son causantes de la descomposición de los alimentos
guardados en ambientes muy fríos como la heladera.
1.4.Medios de cultivo
En la investigación realizada por Varela (2008), se afirma que los medios de cultivo son
una mezcla equilibrada de nutrientes requeridos a concentraciones que permiten el
crecimiento de los microorganismos. Deben contener todos los nutrientes necesarios y en
cantidades apropiadas a los requerimientos de los microorganismos y en condiciones de
pH, presión osmótica, oxígeno disuelto, etc., adecuados para el crecimiento. Aunque los
diferentes microorganismos tienen distintas propiedades fisiológicas y requerimientos
nutricionales, la composición química de las células es constante en todo el mundo vivo.
1.4.1. Componentes comunes de los medios de cultivo
Un examen de las fórmulas de los medios de cultivo muestra comúnmente algunos
ingredientes nutrientes claves, y además varios componentes agregados para la selección
y/o la identificación de grupos separados o especies de bacterias. Toda la vida depende
de la presencia de agua y todos los nutrientes a partir de los cuales los microorganismos
sintetizan material celular y obtienen energía deben ser disueltos en agua. Un análisis
químico simple de células bacterianas revela 11 macro elementos C, H, O, N, S, P, K, Na,
Ca, Mg, Fe y muchos oligoelementos que a menudo se encuentran como impurezas en
los macro elementos como Mn, Mb, Zn, Cu, Co, Ni, V, B, Se, Si, W (Collins et al., 2004).
Gamazo, et al., (2005) describe como componentes principales de los medios de cultivo
los siguientes:
1 Fuente de carbono y sales: en muchos casos la glucosa, la lactosa u otras dextrosas se
emplean como fuente de carbono; algunos medios de cultivo se complementan con
sales como el NaCl o diversos fosfatos y/o sulfatos de potasio, magnesio, amonio, etc.
11
2 Agar: se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El
componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido, al que acompañan
algunas impurezas que se obtienen de ciertas algas marinas. A excepción de algunos
microorganismos marinos, el agar no se emplea como nutriente.
3 Extractos: para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales son
extraídos con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta
o polvo. Estos preparados deshidratados se emplean con frecuencia en la confección
de medios de cultivo.
4 Peptonas: son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales
minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o
vegetales.
5 Fluidos Corporales: sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo
se añade frecuentemente a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos.
6 Sistemas amortiguadores (soluciones tamponadas): algunos componentes son
incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo de
crecimiento bacteriano.
7 Indicadores de pH: indicadores acido - base se añaden a menudo a los medios de
cultivo para detectar variaciones del pH.
8 Agentes Reductores: cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden
a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de
microorganismos microaerófilos o anaerobios.
9 Agentes Selectivos: la adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede
convertirlo en selectivo.
1.4.2. Tipos de medios de cultivo
Según Sandle (2014) existe una amplia gama de medios de cultivo disponibles que se
dividen normalmente, en función del estado físico de los medios.
- Los medios de cultivo líquidos, comúnmente llamados "caldo"
- Los medios de cultivo sólidos y semisólidos, comúnmente denominados "agar"
Tales medios se pueden dividir posteriormente en categorías tales como medios de
crecimiento (diseñados para cultivar la mayoría de los microorganismos heterotróficos),
medios de transporte (para preservar microorganismos), medios de enriquecimiento
(medios diseñados para aumentar el número de microorganismos deseados) y medios de
crecimiento selectivos.
12
Los de medios de cultivo generalmente son agar nutritivo o caldo, y agar de triptona soja
o caldo. El agar de soja Triptona (equivalente al medio digestivo de caseína de soja), en
particular, se utiliza ampliamente para el monitoreo ambiental. Este medio se utiliza para
el aislamiento y el cultivo microorganismos delicados y no delicados. El caldo de soja
Triptona se utiliza para pruebas de esterilidad y como caldo de crecimiento general en
ensayos de enumeración microbiana, así como para ensayos de simulación de medios.
Para algunos ensayos de llenado de medios, el caldo de peptona vegetal se utiliza como
un sustituto ya que no contiene productos de origen animal (Sandle, 2014).
Además, Sandle (2014) menciona que existen otros tipos de medios utilizados incluyendo
al medio fluido tioglicolato, utilizado para el crecimiento de bacterias (aeróbicas y
anaeróbicas). Por otro lado, para realizar monitoreos ambientales, como el control de
hongos los medios de uso común son Sabouraud dextrosa agar o malta extra agar; en un
examen microbiológico del agua, se utiliza R2A, este es un agar nutritivo de bajo
contenido en nutrientes utilizado para el cultivo de microorganismos heterotróficos. Otros
medios se utilizan para la identificación microbiológica, como el agar de sangre (para la
detección de reacciones hemolíticas por Staphylococcus).
Asimismo existen más criterios de división para medios de cultivos, en un cuadro
resumiremos los descritos por Granados y Villaverde, (2003). (Ver anexo A, pág.103)
1.5.Siembra
Aquiahuatl et al., (2012) menciona que para el cultivo de microorganismos se requiere
del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos
de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar
diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad,
ecológicos, etc.
Existen diferentes técnicas de siembra: por suspensión de la muestra en medios líquidos;
extensión de diluciones de un cultivo en superficie de medios en caja de Petri; por estría
en caja de Petri y tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o
picadura en tubos con medios sólidos o semisólidos.
En la naturaleza, los microorganismos se encuentran en poblaciones, formando parte de
comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos más importantes en
microbiología es aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se
realiza, mediante la técnica de estría cruzada para producir colonias aisladas en cultivos
13
sólidos y así, obtener un cultivo puro o axénico, también conocido como cepa (Aquiahuatl
et al., 2012).
1.5.1. Tipos de siembra
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo con el medio utilizado y los requerimientos
del microorganismo a estudiar, así lo describe Santambrosio et al., (2009)
Medios sólidos:
a) Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre
el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido.
b) Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una
vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la
capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.).
c) Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de un
ansa de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo.
d) Siembra en estría: en una caja Petri con medio de cultivo fundido y solidificado,
se inocula sobre un extremo de la caja y con el ansa se extiende en forma de estría; existen
distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener colonias aisladas.
e) Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio
de cultivo fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar. El inóculo se siembra en
la profundidad picando con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce mediante punción
en el medio y en superficie con ansa de arco se pica y se esparce el mismo sobre la
superficie en bisel en forma de zigzag.
1.6.Conteo viable
Corral et al., (2012) asevera que la cuantificación de microorganismos es un elemento
crítico en los estudios microbiológicos. No solo es importante conocer al responsable de
un efecto benéfico o identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección
severa, sino también saber el número de microorganismos implicados, para establecer si
éstos serán capaces de desarrollar una función benéfica o número perjudicial.
Existen diferentes metodologías o estrategias para contabilizar a los microorganismos
cultivables en muestras ambientales y de laboratorio, así como conteo en caja mediante
diluciones, número más probable, placas petrifilm, etc.
14
El conteo en caja consiste la cuantificación de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
por ml o g de muestra, se realiza dilución debido a que la densidad microbiana suele ser
muy elevada o en muestras sólidas para facilitar la manipulación de las mismas, en la
mayoría de los casos se trabaja con diluciones decimales (Arana et al., 2012).
Cuando se realiza diferentes diluciones decimales y siembra más de una placa por
dilución, es recomendable seleccionar una única dilución, aquella que produce entre 30 y
300 colonias por placa y se calcula la media de colonias obtenidas para la dilución
seleccionada (Arana et al., 2012).
Otro de los métodos utilizados para determinar la presencia o ausencia de
microorganismos es el de Número más probable este se basa en la estadística debido a
que se aplica la teoría de la probabilidad, debe determinarse un número característico que
permite obtener el NMP en réplicas de diluciones y para ello se utiliza la Tabla de
MacGrady (Arana et al., 2012).
Y po ultimo el método de conteo en placas petrifilm como lo describe Alonso y Poveda,
(2008):
Placas Petrifilm: método microbiológico que consiste en placas listas para
usarse, ofrecen ahorro de tiempo, incremento de productividad, fiabilidad y
eficiencia. Presentan una película rehidratante cubierta con nutrientes y agentes
gelificantes, proporciona resultados en tres pasos: inoculación, incubación y
recuento. Se las utiliza para el recuento de: aerobios, coliformes, E.coli,
enterobacterias, Staphylococcus aureus, mohos y levaduras y Listeria.
1.7.Identificación microbiológica
Consiste en la asignación de una bacteria o microorganismo a un taxón según una
clasificación establecida, permitiendo llegar a determinar la especie, o incluso la cepa de
una bacteria aislada previamente en una muestra, para ello se determina las características
fenotípicas y/o genotípicas del microorganismo; se realiza a través de cultivos, pruebas
bioquímicas y tinciones para la adecuada identificación y caracterización del
microorganismo y su morfología (Fernández et al., 2010).
Características macroscópicas: según describe Fernández et al., (2010) el aspecto
de las colonias permiten la identificación de microorganismos, ya que cada bacteria crece
de manera diferente, formando colonias de distinto color, forma, textura, olor, superficie,
15
densidad brillo, etc.; existen colonias más o menos elevadas, con bordes enteros,
estrellados, etc. de igual manera ciertas bacterias producen pigmentos que tiñen el medio.
Para su observación es mejor examinar colonias de cultivos frescos crecidas en medios
no selectivos.
Características microscópicas: de la misma manera Fernández et al., (2010) nos
indica que mediante el estudio microscópico en fresco y tras tinción se revela la forma, la
manera de agruparse, la estructura de las células. Las tinciones son el primer paso, y
ocasionalmente el único, para la identificación bacteriana, las más utilizadas e
imprescindibles son la del azul de metileno y la de Gram. Las características
microscópicas que se pueden observar a través de tinciones son: tinción (uniforme,
irregular, unipolar, bipolar); forma (cocos, bacilos, cocobacilos, filamentosos, bacilos
curvos); capsula (presente o ausente); endosporas (ovales, esféricas, terminales,
subterminales); tamaño (cortos, largos); bordes laterales (abultados, paralelos, cóncavos,
irregulares); extremos (redondeados, puntiagudos); disposición (parejas, cadenas,
tétradas, racimos); formas irregulares (variación en forma y tamaño, ramificados,
fusiformes).
Tinción Gram: La tinción de Gram es, a menudo, la primera y única herramienta
de la que nos servimos para hacer un diagnóstico provisional en el proceso de
identificación de la mayoría de las bacterias (Fernández et al., 2010).
Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y Gram negativas. Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares (Santambrosio, 2009).
La pared celular de las bacterias Gram negativas está compuesta por una capa fina de
peptidoglicano y una membrana celular externa, en cambio las bacterias Gram positivas
tienen una pared celular gruesa compuesta por peptidoglicano, pero no poseen membrana
celular externa. (López, et al., 2014)
Pruebas bioquímicas: evalúan la capacidad metabólica de un microorganismo
relacionado con: los sustratos que puede utilizar la bacteria para crecer (hidratos de
carbono, aminoácidos, etc.); las enzimas que posee la bacteria (descarboxilasas, ureasas,
peroxidasas, etc.,); los productos metabólicos producidos por las bacterias (ácido fórmico,
succínico, butírico, etc.); la capacidad para metabolizar azúcares por oxidación o
fermentación; la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a férrico); la capacidad de
16
movilidad por la presencia de flagelos; la producción o no de hemolisinas; el
requerimiento o no de ciertos factores especiales para el crecimiento bacteriano (vitamina
K, isovitalex, factor V y/o X, etc.); la producción o no de algunas toxinas con capacidad
virulenta (Araque et al., 2011).
Algunas de estas pruebas son técnicamente rápidas, porque evalúan la presencia de una
enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras
pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación
previa de 18 a 48 horas; a este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan
componentes metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un
microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación. No
obstante, algunas de estas pruebas pueden realizarse de forma rápida tras incubación de
unas 2-6h; (Fernández et al., 2010).
Pruebas sistematizadas: existen métodos automatizados y semi-automatizados con
los mayores grados de confiabilidad, pero éstos no se utilizan universalmente por su
elevado costo, siendo una de las técnicas rápidas más usadas para la identificación de
bacterias son las galerías API de bioMerieuxMR, las cuales permiten identificar levaduras,
bacterias entéricas, no entéricas, especies de Listeria, Staphylococcus, Streptococcus,
Corynebacterium, Campylobacter, y otras más. (UNAM, 2014). La identificación se
realiza partiendo de un sistema de códigos que se introducen en una computadora cargada
con un software específico y que identifica la bacteria mediante un banco de datos
(Araque et al., 2011).
1.8.Biotecnología
La biotecnología es una amplia área del conocimiento moderno que combina de manera
innovadora la biología y la ingeniería en procesos que, aplicados sobre organismos vivos,
sus tejidos, células o partes generan bienes, servicios o conocimientos que promoverán el
bienestar de la humanidad (Hernández, 2010).
1.8.1. Biotecnología ambiental
La biotecnología ambiental está orientada a la búsqueda, uso y regulación de
microorganismos útiles para la biorremediación de entornos contaminados como: tierra,
aire y agua; además es útil para aplicaciones en procesos amigables con la naturaleza, tal
como el uso de tecnologías verdes. Los microrganismos nativos, aquellos que se
encuentran de forma natural son a menudo aislados, desarrollados y estudiados en
17
laboratorios y se vuelven a liberar más tarde en los entornos limpios en grandes
cantidades. Normalmente tales microorganismos son los más comunes y efectivos que
metabolizan en la biorremediación. Por ejemplo, diferentes tipos de bacterias llamadas
Pseudomonas, muy numerosas, en la mayoría de los suelos son famosas por degradar
cientos de sustancias químicas diferentes. Algunos tipos de Escherichia coli son también
bastante eficaces en la degradación de muchos contaminantes (Thieman et al., 2010).
Se han utilizado también un gran número de bacterias menos conocidas y hoy en día se
está estudiando su potencial papel en la biorremediación. Por ejemplo, la Deinococus
radiodurans, un microbio que muestra una capacidad extraordinaria para tolerar los
peligrosos efectos de la radiación. Recientemente, investigadores de la universidad de
Dublín descubrieron una cepa de Pseudomonas putida, un tipo de bacteria que puede
convertir el estireno, un componente toxico de muchos plásticos, en un plástico
biodegradable. (Thieman et al., 2010)
1.8.2. Enzimas
Son proteínas cuya acción biológica consiste en la catálisis que emplean los organismos
vivos de las reacciones del metabolismo, las cuales transcurrirían muy lentamente sin su
intervención. El concepto de catálisis implica la influencia del catalizador acelerándola
sin consumirse en dicho proceso (Montero, 1997) las enzimas son catalizadores mucho
más eficaces que cualquier catalizador químico.
El conocimiento de la fisiología y del metabolismo bacteriano tiene algunas aplicaciones
prácticas, como conocer el modo de vida, el hábitat de diferentes especies bacterianas,
puesto que el metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas
enzimáticamente y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la célula
bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo y resulta en la
producción de nuevo material celular y el conjunto de reacciones degradativas de los
nutrientes para obtener energía o para convertirlos en unidades precursoras de la
biosíntesis, se conoce como catabolismo (Varela & Gratiuz, 2008).
1.8.3. Propiedades biotecnológicas de las bacterias
Amilolíticos
Los microorganismos amilolíticos utilizan enzimas reductoras llamadas amilasas que son
capaces de hidrolizar los enlaces α-glucosídicos del almidón para producir azúcares
simples llamados α-glucanos. Dentro de estos se identifican bacterias como Bacillus sp.,
18
Pseudomonas sp., y Streptomyces sp. (Sánchez et al 2005), estas enzimas han sido
aisladas de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis
(Léveque et al, 2000) citado en (Gómez, 2008).
El almidón se encuentra en casi todas las plantas, está compuesto por amilosa, constituida
por 1.000 a 5.000 moléculas de glucosa y amilopectina, formada por 6.000 a 20.000
unidades de glucosa (Allinge et al., 1976) citado en (Buitrago et al., 2014).
Proteolíticos
Existen microrganismos que presentan enzimas proteolíticas o proteasas que catalizan la
hidrolisis de los enlaces péptidos de las proteínas, las proteasas se han convertido en la
principal enzima industrial y constituye más del 65% del mercado mundial de enzimas,
estas enzimas son ampliamente utilizadas en la industria alimenticia, farmacéutica, textil
y del cuero (Haki & Rakshit, 2003; Kumar & Takagi,1999)
Los principales microorganismos productores de proteasas son los géneros: Pyrococcus,
Thermococcu, y Staphylothermus, al igual que el Bacillus stearothermophilus y la
Archaea hipertermifilixa Desulfurococcus (Haki & Rakshit, 2003).
Lipolíticos
Algunas bacterias son capaces de producir enzimas lipolíticas llamadas lipasas que
hidrolizan los enlaces éster, generando un alcohol y un ácido carboxílico. Dentro de las
características fundamentales de las lipasas microbianas, se incluyen el no requerimiento
de cofactores, estabilidad a solventes orgánicos, amplia especificidad de sustrato, enantio,
estéreo y regio selectividad, que permiten la síntesis de enantiómeros puros, entre otros.
Además de la hidrólisis, las lipasas pueden llevar a cabo reacciones reversas como
esterificación, alcohólisis y acidólisis (Espitia, 2010)
Los principales microorganismos productores de lipasas son Bacillus y Pseudomonas
(Daniele et al., 2011), y de microorganismo termófilos como el Bacillus
thermocatenulatus, Bacillus stearothermophilus, Pyrococcus horikossi y Pyrococcus
calidifontis (Labrador, 2006).
Celulolíticos
Son bacterias que tienen la habilidad de producir enzimas llamadas celulasas que
hidrolizan la celulosa que es un polisacárido compuesto por cadenas de moléculas de
glucosa. En todas las plantas superiores la celulasa constituye el armazón de las paredes
celulares y se encuentra a manera de micro fibrillas (Valencia, 2009).
19
Las bacterias celulolíticas más abundantes y conocidas son las aerobias: Cellulomonas
sp., Micróspora bispora, Thermonospora sp., Cytophaga sp., Corynebacterium sp.,
Vibrio sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Thermobifida sp., y entre los anaerobios están:
Acetivibrio cellulolyticus, Butirivibrio, Bacteroides cellulosolvens, Bacteroides
succinogenes, Clostridium sp., Rruminococcus sp. (Gaitán & Pérez, 2007)
Degradadores de petróleo
Existen bacterias capaces de utilizar petróleo para su crecimiento y mantenimiento,
conocidas como bacterias degradadoras de hidrocarburos, dentro de las cuales se
encuentra el género Pseudomonas, que, por su versatilidad metabólica, son capaces de
convertir sustratos habitualmente no degradables, en metabolitos fácilmente asimilables
o susceptibles de ser catalizados enzimáticamente. Implicados en el ciclo biogeoquímico
del carbono se encuentran los microorganismos degradadores de hidrocarburos, los cuales
desempeñan un papel fundamental y exclusivo en la mineralización de este tipo de
compuestos (Echeverri et al., 2011).
El éxito de la biorremediación consiste en la selección de microorganismos que puedan
degradar materiales contaminados a diferentes temperaturas, pH, salinidad y
concentración de nutrientes. Muchos tipos de microorganismos han sido aislados para
mejorar procesos de biorremediación de ambientes contaminados con hidrocarburos de
petróleo por ejemplo Bacillus sp, Rhodococcus, Mycobacterias, levaduras, Micromycetes
y Pseudomonas (Echeverri et al., 2011).
1.9.Sensibilidad antimicrobiana
La resistencia antimicrobiana plantea una amenaza grave para la salud pública, que
involucra cada día, nuevas especies bacterianas y nuevos mecanismos de resistencia
(Junco et al., 2006).
Para comprender los mecanismos de resistencia hay que conocer los mecanismos de
acción de los antibióticos, éstos tienen varias maneras de prevenir el crecimiento o
interrumpir el ciclo de vida de una bacteria, así:
- Inhiben la formación de la pared celular
- Estimulan la liberación de auto lisinas
- Inhiben la síntesis de proteínas
- Interfieren con la síntesis de DNA
- Interrumpen la función de la membrana plasmática externa (Junco et al., 2006).
20
La resistencia a antibióticos es la capacidad de una célula bacteriana de resistir al daño
que desencadena el efecto del fármaco. Los principales mecanismos de resistencia
bacteriana son:
- Inactivación del antibiótico por medio de enzimas
- Fracaso de la llegada del antibiótico al punto diana
- Alteración en la unión con el receptor bacteriano (Muñoz et al., 2004).
1.9.1. Resistomas ambientales
Muy recientemente ha surgido el concepto del resistoma antibiótico que comprende el
conjunto de todos los genes que contribuyen directa o indirectamente a la resistencia a
los antibióticos (Torres, 2012).
Por lo que un resistoma ambiental estaría constituido por genes de resistencia de los
microorganismos ambientales, muchos de ellos procedentes del suelo, tanto productores
como no productores de antibióticos la importancia del estudio de estos resistomas radica
en que todos estos genes del resistoma ambiental pueden ser movilizados por mecanismos
de transferencia horizontal a bacterias (tanto patógenas como no patógenas) de otros
ecosistemas, incluyendo el compartimento humano, animal o el acuático entre otros
(Torres, 2012).
21
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
2.1.Zona de investigación
2.1.1. Historia del lugar
Las vertientes termales medicinales de Chachimbiro surgen a raíz de un terremoto en
agosto de 1868, las aguas termales de Chachimbiro son de origen volcánico; los
remanentes de este complejo se encuentran actualmente a 3 km. bajo la superficie de la
tierra, con la presencia de una fuente de calor constante proveniente de una cámara
magnética cuyo viento está cerrado hacia el exterior, (El Norte, 2016).
Desde el año 1965 el Sr. José Ignacio Cabrera propietario de los terrenos decidió donar
este espacio donde se encuentran actualmente las Termas “Santagua de Chachimbiro” al
Consejo Provincial de Imbabura. En ese momento, los pobladores de la comunidad de
Tumbabiro con sus manos abrieron el camino para acceder a los caudales y ponerlos al
alcance de la población (Rutas y destinos del Mundo, 2014).
“Santagua de Chachimbiro” está en un área del cráter del mítico volcán La Viuda y
rodeada de cerros como el Yanahurco con pendientes abruptas, (Termalia, 2014).
El clima del lugar es templado, con una temperatura promedio de 16o y 22o C en el día y
por la noche baja a 10o C; según los estudios realizados en la micro cuenca indican que
existe una gran diversidad vegetal, se ha logrado registrar más de 70 especies de plantas
y árboles entre medicinales, energéticas, frutales, ornamentales forestales, etc. igualmente
se ha identificado una gran diversidad de aves, mamíferos, anfibios e insectos (Termalia,
2014).
2.1.2. Descripción del lugar de la investigación
Esta investigación se llevó acabo en las Aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
ubicadas en el suroeste de la parroquia Tumbabiro, en el cantón Urcuqui, provincia
Imbabura, en la Cordillera Occidental Andina (lado oriental) a una altitud de 2672
m.s.n.m. y tiene una temperatura ambiente que varía entre los 16o y 22oC. (Ver Figura 1,
tabla 2)
Las aguas termo minerales de Chachimbiro en el complejo Santagua, provienen de un
acuífero hidrotermal profundo, el que se acumula de vapor natural. El agua termal es de
22
tipo clorurada sódica e hipertermal ya que la temperatura media del agua es de 55oC
(Borja, 2015).
c
Figura 1. Ubicación geográfica de las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
Tabla 2. Ubicación geográfica de las Aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
Ubicación
geográfica
Coordenadas (UTM)
ESTE 807320
NORTE 10050833
COTA 2672
Fuente: Burbano et al., (2013)
“Santagua de Chachimbiro”
23
2.2.Materiales, equipos medios de cultivo y reactivos
materiales y equipos Medios de cultivo y reactivos
en campo
Envases esterilizados
medidor multiparámetro
portátil
1 cooler
GPS
laboratorio
Placas Petrifilm
Agar Base Cetrimide
Agar Sangre
Caldo BHI
Agar SIM
Agar TSI
Agar MacConkey
Agar Simmons Citrato
Tiras para oxidasa
Agar urea
Agar gelatina
Agua destilada
Peróxido de Hidrógeno al
30%
Alcohol
Cristal violeta
Lugol
Safranina
Aceite de inmersión
alcohol cetona
azul de lactofenol
cloruro mercúrico
laboratorio
lámpara de alcohol
cajas Petri
asas bacteriológicas
balanza digital
pipetas automáticas
puntas para pipeta
piseta
gasas y algodón
papel encerado
material de vidrio
cámara de Bioseguridad Tipo
II
microscopio
autoclave
portaobjetos y cubreobjetos
hisopo
marcador
estufa
Refrigerador
2.3.Factores de estudio
2.3.1. Población Muestral
La población objeto del presente proyecto fueron las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” en la provincia de Imbabura.
2.3.2. Muestra
Los puntos de la toma de muestra fueron cuatro. El primero, fue en la vertiente u ojo de
agua en donde se tomaron 200 ml de muestra. El segundo, en el tanque de
almacenamiento donde se tomaron 200 ml de muestra y 5 gr de sedimento impregnado
24
en las paredes. El tercer y cuarto punto se tomó 200 ml del agua de las piscinas de 55oC
y 35oC, respectivamente.
Se realizaron tres muestreos en cada punto establecido, con una frecuencia de un muestreo
cada 15 días, durante un periodo de mes y medio.
2.3.3. Periodo de investigación
La investigación se realizó desde junio 2017 a noviembre 2017, es decir tuvo una duración
de 6 meses.
2.4.Métodos y técnicas
2.4.1. Muestreo
Para la toma de las muestras se utilizó dos tipos de recipientes, frascos plásticos estériles
de 100 ml (envases para muestras de orina) para las muestras líquidas y caja plástica
estéril (envase para muestras de heces) para la muestra sólida. Se cumplió con la
planificación de tres muestreos con una frecuencia de quince días entre sí, además se
establecieron cuatro puntos de muestreo (Ver anexo B, pág. 104).
Para evitar la contaminación de muestras se utilizó implementos de protección personal
como guantes y mandil y se procedió a tomar las muestras de la siguiente manera:
- Se enjuago por tres veces el recipiente con el agua a muestrear y se sumergió hasta
una profundidad apropiada de manera que al llenar por completo el frasco, no se
generen burbujas dentro de él.
- Se cerró el frasco hermética y rápidamente para evitar que el agua que toca la mano
del recolector entre en el envase.
- Se selló completamente el frasco para evitar derrames.
Una vez tomada las muestras estas se rotularon con etiqueta indeleble con datos relevantes
como lo especifica la NTE INEN 2176 – 2013.
Se realizó un informe de muestreo, el mismo contenido de datos como: fecha, hora,
descripción del lugar, tipo de muestra, número de muestra, coordenadas, nombre del
recolector, parámetros físicos – químicos y observaciones, en base a los descrito en la
norma NTE INEN 2176 – 2013.
Las muestras fueron trasladadas al laboratorio en la ciudad de Quito, en un cooler y con
hielo para detener el crecimiento microbiológico hasta realizar los análisis
25
correspondientes, además que para el manejo, transporte y conservación de las mismas
se consideró lo establecido en la norma NTE INEN 2169 – 2013. Todas las muestras se
manejaron en el laboratorio de Biología de la Universidad Central del Ecuador.
2.4.2. Determinación de parámetros fisicoquímicos “in situ” en las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro”
Los valores de los parámetros fisicoquímicos del agua termal fueron determinados
mediante la utilización de un medidor multiparámetro portátil calibrado previamente,
para ello en cada punto se recogió una muestra de agua representativa en un envase estéril
a parte y en condiciones de asepsia. Se introdujo la sonda respectiva para cada parámetro
y se visualizó la lectura de los valores de: temperatura (ambiente y de muestra), pH,
conductividad, resistividad eléctrica, salinidad, potencial de oxidación – reducción,
oxígeno disuelto y solidos totales disueltos. (Ver anexo C, pág. 105).
2.4.3. Análisis microbiológico de las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas
Para el recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas se procedió a utilizar la
metodología de cuantificación en caja por dilución.
Según Arana et al., (2012) para la enumeración de bacterias se utiliza un método sencillo
que se basa en la cuantificación de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por ml o g
de muestra; en el caso de las bacterias aerobias mesófilas heterótrofas se procedió
mediante conteo en caja, para ello se realizó dilución seriadas (base 10) de las muestras
concentradas, con un factor de dilución de hasta 10-3, la concentración inicial fue de 0,1
ml y la final fue de 0.01 ml. El volumen fijo fue de 9 ml de agua de peptona y 1 ml de
muestra transportados mediante una pipeta automática y puntas plásticas estériles (Ver
anexo D, pág. 105).
Se preparó la dilución en agua peptona en base a las indicaciones de la etiqueta del envase
de la misma y a la cantidad que se requiere por cada muestra, se distribuyó en tubos de
ensayo estériles y se realizó la dilución; se sembró tomando 1 ml para cada caja para
conteo de aerobios mesófilos.
Se seleccionó una única dilución, aquella que produce entre 30 y 300 colonias por placa
después de haber incubado por 24 horas a 37oC, se calculó la media de colonias obtenidas
26
para la dilución seleccionada, y se reportó los resultados en UFC/ml, metodología basada
en lo propuesto por Arana et al., (2012).
Recuento de bacterias Pseudomonas
En el caso de Pseudomonas se utilizó la misma metodología descrita para la
cuantificación de bacterias aerobias, es decir conteo en caja como lo indica la metodología
de Arana et al., (2012). Para la siembra se tomó solamente 0,5 ml de la dilución preparada,
y se sembró en Agar Cetrimide, luego se incubo durante 72 horas a 37oC, y de igual
manera, se calculó la media de colonias obtenidas para la dilución seleccionada, y se
reportó los resultados en UFC/ml.
Recuento de coliformes totales y mohos y levaduras en Petrifilm
Para la cuantificación de coliformes totales se utilizó la metodología de placas Petrifilm
3M, debido a que los resultados son más rápidos y precisos, además de que son métodos
estandarizados por la AOAC INTERNATIONAL como métodos oficiales de análisis
(AOAC, 2017).
Se procedió según lo indica la empresa 3M, (2009), se colocó la placa Petrifilm en una
superficie plana dentro de la cámara de bioseguridad, se agregó l ml de la muestra tomada
con una pipeta en el centro y se soltó la lámina lentamente para evitar la formación de
burbujas de gas, se colocó el dispersor sobre el Petrifilm y se presionó suavemente para
la distribución homogénea de la muestra. Se incubo a 37oC durante 24 h las placas para
la cuantificación de E. Coli/ Coliformes.
Para el contaje se observó las placas a luz directa y se reportaron resultados en UFC/ml
(3M, 2009).
Recuento de coliformes totales y mohos y levaduras en Petrifilm
De la misma manera para la cuantificación de mohos y levaduras se procedió igual que
lo descrito para la cuantificación de coliformes totales, utilizando la metodología descrita
por la empresa 3M, (2009) con la diferencia del tipo de placas Petrifilm y que estas se
incubaron a temperatura ambiente durante 3 a 5 días.
2.4.4. Aislamiento de microrganismos
Para el aislamiento de las bacterias del agua termal se procedió a utilizar el agar Tripticasa
Soya, debido a que este medio cuenta con los nutrientes necesarios para el crecimiento de
la mayoría de las bacterias, ya que permite el aislamiento y desarrollo de una gran
27
diversidad de microrganismos aerobios, anaerobios estrictos y facultativos. (Britanialab,
2015).
Para el aislamiento de bacterias de cada punto de muestreo en el balneario, se realizó
siembra en estría, y se incubo a la temperatura característica de estos puntos para
obtención de bacterias capaces de crecer a dichas temperaturas, se incubo durante 24 a 48
horas.
Una vez que se obtuvo crecimiento bacteriano se procedió a aislar a través de un examen
visual, en base a características macroscópicas como: tamaño, superficie, forma, borde y
color de los microorganismos (López et al., 2008).
Obtención de cultivos puros
Una vez aisladas las especies bacterianas, se procedió a realizar un subcultivo es decir se
inoculo cada especie aislada en un medio adecuado, para el crecimiento y
almacenamiento en condiciones favorables como lo menciona el Instituto de
Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia, (2016) en este caso se lo hizo en
caldo BHI (Brain Heart Infusión) ya que es un medio muy rico en nutrientes, que
proporciona un adecuado desarrollo microbiano incluso de los de difícil desarrollo
(Britanialab, 2015).
Para la preparación se siguió las instrucciones que se encuentran en cada frasco y se
procedió a sembrar tomando la colonia con un asa esterilizada y se pasó a los tubos con
al caldo BHI.
Se realizó repiques mensuales para que no expire el cultivo, como lo recomienda el
Instituto mencionado.
Tinción Gram
Antes de realizar la Tinción Gram, se pasó de cultivos puros en caldo a cultivos puros
sólidos en caja, para obtener colonias mucho más consistentes y que el proceso de tinción
sea más rápido y fácil. La tinción de Gram es un método de coloración rápida. Se procedió
a realizarlo de la siguiente manera:
- Se tomó una colonia solida de la caja con el asa estéril y se realizó un frotis en el
portaobjetos
- Se fijó la muestra con calor (mechero)
- Se cubrió el frotis con la cantidad suficiente de cristal violeta, se esperó un minuto
para que actúe, se lavó con agua destilada para eliminar el exceso, y se 6secó.
28
- Se agregó la cantidad suficiente de lugol, se esperó que actúe durante 1 minuto, se
lavó con agua destilada para eliminar el exceso, y seco.
- Se decoloró con alcohol cetona durante 30 segundos y enjuagó con agua destilada.
- Se colocó safranina en cantidad suficiente, se dejó durante 1 minuto, lavó y secó a
temperatura ambiente.
- Se observó en el microscopio con los objetivos de 4X, 10X, 40X Y 100X (este último
con aceite de inmersión), (Santambrosio et al., 2009).
En la investigación realizada al observar con el objetivo de mayor aumento (100X) se
pudo identificar que la mayoría eran bacilos Gram Negativos y una mínima cantidad
fueron cocos Gram Positivos.
Pruebas Bioquímicas: Agar sangre
Una característica importante de este medio es que permite verificar la capacidad de
algunas bacterias de producir enzimas llamadas hemolisinas que actúan sobre los
glóbulos rojos, generando lisis parcial o completa. Existen tres tipos de hemólisis: alfa,
beta y gamma (Cifarelli, 2016).
Se preparó en base a las instrucciones que se encuentran en el envase añadiendo sangre
humana (metodología modificada por el autor) al 5%, se sembró con hisopo estéril y se
incubo a 37oC, durante 24 horas. Los resultados se reportaron en base a la hemolisis y si
hubo crecimiento o no (Ver Anexo E, pág. 105).
Prueba de Catalasa
Esta prueba nos permitió comprobar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra
en casi en todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo.
La catalasa es una enzima que si se sintetiza hidroliza el peróxido de hidrógeno, en
oxígeno y agua (Pérez y Morales, 2012).
Para la ejecución de la prueba se colocó una gota de agua oxigenada (H2O2), sobre la
colonia ubicada con el asa estéril sobre el portaobjetos. Si se producía burbujeo la
reacción se tomó como positiva porque existe liberación de O2, caso contrario la reacción
se tomó como negativo, (MacFaddin, 2003) (Ver anexo F, pág. 106).
Prueba oxidasa
Esta prueba se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular,
debido a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido
por el oxígeno molecular, que también actúa como un aceptor de electrones en la fase
terminal del sistema de transferencia de electrones (Fernández et al., 2010).
29
En una colonia ubicada en la caja de cultivo puro se colocó la tira y se esperó unos
segundos; la prueba positiva se observó por la oxidación del reactivo incoloro formándose
un producto de color azul violeta (Fernández et al., 2010). (Ver anexo G, pág. 106).
Prueba oxidación – fermentación de glucosa
Algunas bacterias son capaces de metabolizar un carbohidrato solo en condiciones
aeróbicas, mientras que otras producen ácido tanto aeróbica como anaeróbicamente. La
diferencia principal entre el metabolismo fermentativo y oxidativo depende de los
requerimientos de oxígeno atmosférico y de la fosforilación inicial (Bailón et al., 2003).
Se preparó el Agar O/F en base a las indicaciones que contiene el frasco, tomando en
cuenta que debían ser dos tubos con medio básico de Hugh Leifson para cada cultivo
puro, se sembró en picadura y uno de ellos se cubrió con aceite mineral para generar un
medio anaerobio, se incubo a 37oC por 24 horas. La prueba se dio por positiva, si se
obtuviera crecimiento y cambio de color, caso contrario la prueba se toma como negativa
(Fernández et al., 2010) (Ver anexo H, pág. 106).
Prueba de Citrato
Esta prueba permite comprobar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como
única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno para
el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad (Fernández et al., 2010).
Para la realización de la prueba, la preparación del medio fue en base a lo descrito en las
instrucciones del frasco, el tubo con el medio se lo inclino para tener pico de flauta, para
sembrar se utilizó para tomar la colonia un asa estéril y se inocula como estría en la
superficie del pico de flauta, se incubó a 37oC durante 48 horas, los resultados se
registraron como positivo si el medio cambiaba de color y si no ocurría esto, se tomó
como negativo (Bailón et al., 2003: pág. 44) (Ver anexo J, pág. 107).
Prueba de TSI (Triple Azúcar Hierro)
La prueba TSI se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa
(hidratos de carbono), con formación de ácido, gas, y producción de ácido sulfhídrico. La
degradación del azúcar da lugar a la formación de ácido que se revela por un cambio de
color del rojo de fenol que pasa de anaranjado a amarillo, pero si el medio sufre una
alcalinización pasa de anaranjado a rojo/púrpura (Cultimed, 2017).
La preparación dependió de las indicaciones de frasco, se colocó el medio en pico de
flauta, se sembró la colonia con el asa estéril sobre la superficie del pico. Se consideró
30
como reacción positiva para la utilización de lactosa, glucosa y sacarosa, la presencia de
coloración naranja o amarilla, caso contrario si se mantuvo el color rojizo la prueba es
negativa. (Eur, 2008; citado en Cultimed, 2017) la incubación se realizó a 37oC durante
24 a 48 horas (Ver anexo K, pág. 107).
Prueba de SIM
Se sembró por punción en el centro del tubo con el medio semisólido preparado en base
a las instrucciones del envase, utilizando una aguja estéril, se incubó a 37oC durante 24
horas (Ver anexo L, pág. 108).
Este medio de cultivo contiene tripteína y peptona; el triptófano es un aminoácido que
puede ser metabolizado por algunas bacterias para formar indol, el mismo que con el
reactivo de Kovács forma un compuesto de color rojo; por otro lado el tiosulfato de sodio
puede hacer que los microorganismos generen ácido sulfhídrico que reacciona con el
hierro presente, dando un compuesto de color negro; y debido a que el agar tiene la
propiedad de ser semisólido, este permite detectar la movilidad que se evidencia por el
enturbiamiento del medio o por el crecimiento más allá de la línea de siembra de la
bacteria (Britanialab, 2015).
Prueba de Coagulasa
Esta prueba se puede realizar de dos formas diferente: en portaobjetos y en tubo. En el
presente trabajo se efectuó la metodología en tubo que consistió en la adición de
Staphylococcus aureus de una placa de agar a un tubo con plasma de coagulasa
rehidratado y se incubó a 37°C. (Scientífica, 2008)
La primera lectura de resultados se realizó a las 4 horas de haber incubado a 37o y la
segunda para confirmar se la realizo a las 24 horas (Fernández et al., 2010) (Ver anexo
M, pág. 108). La coagulación se consideró como prueba positiva, caso contrario se
consideró como negativo.
Prueba de ureasa
La ureasa es una enzima que tienen algunas bacterias estas hidrolizan la urea con
producción de amoniaco, el mismo que reacciona en solución para formar carbonato de
amonio, produciendo alcalinización y aumento del pH del medio que se detecta por la
presencia de un indicador de pH en el medio y un viraje del indicador color (Fernández
et al., 2010).
31
La prueba se realizó, preparando el medio en base a las indicaciones descritas en el frasco,
se inoculó tomando el cultivo puro con un asa estéril y transportándolo al medio líquido,
se incubo a 35°C durante 48 horas. El resultado fue positivo cuando el medio cambió de
amarillo a color rosado-rojizo, mientras que fue negativo cuando el medio de cultivo
permaneció de color amarillo. (MacFaddin, 2003) (Ver anexo N, pág. 108).
Prueba de hidrolisis de gelatina
Esta prueba indica la capacidad de ciertos microorganismos para hidrolizar la gelatina a
péptidos y aminoácidos, mediante la acción de enzimas proteolíticas específicas
denominadas gelatinasas (Fernández et al., 2010).
Para la ejecución de la prueba se inoculó el microorganismo en el centro de la caja con
agar gelatina (este medio contenía: peptona, cloruro de sodio, extracto de carne, gelatina
y agar), se incubó a 37oC durante 7 días (modificado por autor). Cuando la colonia se
desarrolló lo suficiente, se recubrió la superficie del medio con unas gotas de cloruro
mercúrico. Se consideró positiva la prueba al observarse una zona clara alrededor de la
colonia, es decir la formación de un halo transparente, caso contrario se consideró
negativo (MacFaddin, 2003) (Ver anexo O, pág. 109).
2.4.5. Caracterización biotecnológica
Para conocer las propiedades biotecnológicas en base a las enzimas que pueden producir
cada cepa bacteriana identificada se procedió a generar un medio de cultivo mínimo
solido con cinco diferentes fuentes de carbono para cada cepa, respectivamente.
Debido a que los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes en concentraciones
adecuadas y en condiciones físicas óptimas, para que haya un crecimiento adecuado de
microorganismos, debe contener como mínimo: Carbono, Nitrógeno, Azufre, Fósforo y
sales orgánicas (K, Mg, Fe, Ca, etc.). En este caso como fuente de carbono se utilizó:
almidón, leche, mantequilla, celulosa y diésel (Mondino, 2009).
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar
el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos (Casado, 2012).
Para preparar el medio mínimo base se realizó de la misma manera que se hace con otros
medios, añadiendo los componentes necesarios y esterilizando antes de su utilización, ver
la tabla 3.
32
Tabla 3. Componentes del medio mínimo para aislar bacterias proteolíticas,
amilolíticas, celulolíticas, lipolíticas y degradadoras de derivados de petróleo
Reactivo Concentración
Fosfato de Sodio Monohidratado 1M 40 ml/L
Oxalato de Amonio 10 % 10 ml/L
Sulfato de Magnesio 5% 10 ml/L
*Se esterilizó y agregó de manera separada 1 ml de Citrato Hidroclorhídrico
1% y ml de Cloruro de Calcio 0,1% por cada 20 ml del medio.
Fuente: Gavilánez, (2009)
La cantidad necesaria de cada fuente de carbono se calculó en base a la cantidad de medio
que se requiere para las 19 cepas identificadas. Ver tabla 4.
Tabla 4. Fuentes de carbono para el medio mínimo
Fuentes de carbono Cantidad Tipo de microorganismo
Almidón 0,24 Amilolíticos
Mantequilla 2,4 ml Lipolíticos
Celulosa 5 gr Celulolíticos
Leche 24 ml Proteolíticos
Derivado de Petróleo (Diésel) 6 ml Degradadores de derivados de Petróleo
Fuente: Gavilánez, (2009)
Para preparar el medio mínimo con las diferentes fuentes de carbono para 120 ml de agar
por cada tipo de caracterización de cada una de las 19 cepas identificadas, se procedió de
la siguiente manera, ver tablas 5, 6, 7 y 8:
Tabla 5. Composición química del medio mínimo para bacterias amilolíticas
Reactivo Concentración
Fosfato de Sodio Monohidratado 1M 4,8 ml
Oxalato de Amonio 10 % 1,2 ml/L
Sulfato de Magnesio 5% 1,2 ml/L
Citrato Hidroclorhídrico 1% 6 ml
Cloruro de Calcio 0,1% 6 ml
Almidón 0,24 gr
Agar – agar 3 gr
*Se esterilizó y agregó de manera separada Citrato Hidroclorhídrico 1%,
Cloruro de Calcio 0,1% y Fosfato de Sodio Monohidratado 1M.
Fuente: Gavilánez, (2009)
33
Tabla 6. Composición química del medio mínimo para bacterias lipolíticos
Reactivo Concentración
Fosfato de Sodio Monohidratado 1M 4,8 ml
Oxalato de Amonio 10 % 1,2 ml/L
Sulfato de Magnesio 5% 1,2 ml/L
Citrato Hidroclorhídrico 1% 6 ml
Cloruro de Calcio 0,1% 6 ml
Mantequilla liquida 2,4 ml
Agar – agar 3 gr
*Se esterilizó y agregó de manera separada Citrato Hidroclorhídrico 1%,
Cloruro de Calcio 0,1% y Fosfato de Sodio Monohidratado 1M.
Fuente: Gavilánez, (2009)
Tabla 7. Composición química del medio mínimo para bacterias proteolíticos
Reactivo Concentración
Fosfato de Sodio Monohidratado 1M 4,8 ml
Oxalato de Amonio 10 % 1,2 ml/L
Sulfato de Magnesio 5% 1,2 ml/L
Citrato Hidroclorhídrico 1% 6 ml
Cloruro de Calcio 0,1% 6 ml
Leche 24 ml
Agar – agar 3 gr
*Se esterilizó y agregó de manera separada Citrato Hidroclorhídrico 1%, Cloruro
de Calcio 0,1% y Fosfato de Sodio Monohidratado 1M.
Fuente: Gavilánez, (2009)
Tabla 8. Composición química del medio mínimo para bacterias degradadoras de
derivados de petróleo
Reactivo Concentración
Fosfato de Sodio Monohidratado 1M 4,8 ml
Oxalato de Amonio 10 % 1,2 ml/L
Sulfato de Magnesio 5% 1,2 ml/L
Citrato Hidroclorhídrico 1% 6 ml
Cloruro de Calcio 0,1% 6 ml
Diésel 6 ml
Agar – agar 3 gr
*Se esterilizó y agregó de manera separada Citrato Hidroclorhídrico 1%,
Cloruro de Calcio 0,1% y Fosfato de Sodio Monohidratado 1M.
Fuente: Gavilánez, (2009)
34
El medio de cultivo para las bacterias celulolíticas se realizó en base a lo descrito por
Gaitán & Pérez (2007) y se modificó con respecto a las cantidades necesarias para cada
una de las 19 cepas identificadas (180 ml de agar CMC 1% (p/v)), ver tabla 9.
Tabla 9. Composición química del medio mínimo para bacterias celulolíticos
Reactivo Concentración
Carboximetilcelulosa 1,8 gr
Extracto de levadura 0,45 gr
Peptona universal 0,45 gr
Sulfato de amonio 0,090 gr
Cloruro de calcio 0,090 gr
Fosfato monobásico de potasio 0,018 gr
Fosfato di básico de potasio 0,018 gr
Agar – agar 3 gr
Ajustar pH 7 +/-2
Fuente: Gaitán & Pérez, (2007)
Una vez preparados los medios, se procedió a sembrar cada una de las 19 cepas
bacterianas identificadas en cada uno de los medios, se incubó a 37oC, durante 24 a 48
horas, y para observar e interpretar los resultados se utilizó reactivos, que permitieron el
revelado para cada tipo de bacteria, como se define en la tabla 10:
Tabla 10. Interpretación de resultados obtenidos en la caracterización
biotecnológica
Reactivo Interpretación Tipo de bacteria
Lugol al 5% El medio se pone de color azul
y se observa presencia de halo
trasparente o brillante
alrededor de la colonia.
Amilolíticos
Rojo Congo al 2%,
HCl, e iones de Ca+2 Presencia de halo transparente Lipolíticos
Ácido acético Cambio de color del medio y
halo en la colonia
Proteolíticos
Se observó
crecimiento
Presencia de colonias Degradadores de derivados
de petróleo
Rojo Congo al 1% Presencia de halo alrededor de
la colonia
Celulolíticos
35
2.4.6. Sensibilidad antimicrobiana
Para conocer la resistencia a los antibióticos de cada una de las 19 cepas bacterianas
aisladas se procedió a seguir la metodología de Picazo (2000) que indica que el
antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de
Petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados
con los diferentes antibióticos a concentraciones específicas. Tan pronto el disco
impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro
absorbe agua y el antibiótico difunde al agar (Picazo, 2000)
Se utilizó cinco antibióticos en discos: ampicilina de 10 µg, eritromicina de 15 µg,
suphamethoxazole/trimetoprim de 25 µg, netromicina de 30 µg y fosfomicina de 50 µg.
El agar en el que se sembró cada una de las 19 cepas identificas fue el Mueller-Hinton
que la misma metodología indica que este es el adecuado para realizar este tipo de pruebas
y además es recomendado por NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory
Standards, 2017) citado en (Picazo, 2000).
El antibiótico se difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco
formándose una gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación a
37oC los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición (Picazo, 2000).
Para la interpretación de resultados se procedió a medir el diámetro del halo de inhibición
y comparar con la tabla 11:
Tabla 11. Sensibilidad antimicrobiana
Método Susceptible Intermedio Resistente
Difusión de disco (mm) ≥ 21 17 – 20 ≤ 16
CIM (µg/L) ≤ 2 4 ≥ 8
Fuente: Cavalieri, (2005)
36
2.4.7. Esquema de metodología utilizada en la investigación.
Toma de muestras de agua termal
Toma de muestra 1
(Vertiente) Toma de muestra 2
(Tanque)
Toma de muestra 3
(Piscina de 55oC) Toma de muestra 4
(Piscina de 35oC)
Trasporte de
muestras de agua
(Periodo máximo
de 48 horas)
Mediciones
fisicoquímicas “in situ”
(Medidor
multiparámetro)
Cuantificación del
número de
bacterias (aerobias
mesófilas,
coliformes totales,
Pseudomonas y
mohos y
levaduras)
Aislamiento
microorganismos en
medios de cultivo
Identificación de
microorganismos
Caracterización de
propiedades
biotecnológicas
MU
ESTR
EO
AN
ÁLI
SIS
MIC
RO
BIO
LÓG
ICO
TR
AN
SPO
RTE
CA
RA
CTE
RIZ
AC
IÓN
B
IOTE
CN
OLÓ
GIC
A
Pruebas bioquímicas: Catalasa,
Citocromo-oxidasa, oxidación-
fermentación, Citrato, urea,
coagulasa, SIM, TSI, hidrolisis
de gelatina.
Clasificación
taxonómica
Determinación
de sensibilidad
antimicrobiana
SEN
SIB
ILID
AD
A
NTI
MIC
RO
BIA
NA
37
3. RESULTADOS
Los resultados desplegados a continuación, son valores que se obtuvieron del promedio
de tres muestreos en los diferentes puntos establecidos dentro de las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” en la provincia de Imbabura.
3.1.Parámetros fisicoquímicos
Los resultados de los parámetros fisicoquímicos del agua de la vertiente indican que no
existe mayor variación en los tres muestreos realizados, con excepción de la temperatura
ambiente y el oxígeno disuelto. (Ver tabla 12, figura 2)
Tabla 12. Parámetros fisicoquímicos del agua en la vertiente de las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”.
Muestreo
1
Muestreo
2
Muestreo
3 Promedio
Desviación
Estándar Variación
Temperatura
Ambiente (o C) 25 31 23 26,33 4,16 11,56
Temperatura de
la muestra (o C) 54 54 56,1 54,70 1,21 0,98
Ph 6,4 6,41 6,07 6,29 0,19 0,02
Salinidad 3,8 4 3,7 3,83 0,15 0,02
Conductividad
(µS/cm) 6,71 7,01 6,65 6,79 0,19 0,02
Oxígeno Disuelto
(mg/L; %)
1,98 1,77 2,15 1,97 0,19 0,02
45,65 37,2 47,2 43,35 5,38 19,31
TDS (g/L) 6,83 7,25 6,56 6,88 0,35 0,08
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 2. Parámetros físico-químicos del agua en la vertiente de las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”.
38
Los resultados de los parámetros fisicoquímicos del agua del tanque de almacenamiento,
indican que no existe mayor variación en los tres muestreos realizados, con excepción de
la temperatura ambiente y el oxígeno disuelto. (Ver tabla 13, figura 3)
Tabla 13. Parámetros fisicoquímicos del agua en el tanque de almacenamiento de
las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
Tanque de Almacenamiento
Muestreo
1
Muestreo
2
Muestreo
3 Promedio
Desviación
Estándar Variación
Temperatura
Ambiente (o C) 25 31 20,5 25,50 5,27 18,50
Temperatura de
la muestra (oC) 49,1 50,5 50 49,87 0,71 0,34
Ph 7,51 7,63 7,24 7,46 0,20 0,03
Salinidad 3,6 3,8 3,7 3,70 0,10 0,01
Conductividad
(µS/cm) 6,73 6,61 6,75 6,70 0,08 0,00
Oxígeno Disuelto
(mg/L; %)
3,93 5,01 3,94 4,29 0,62 0,26
90,6 96 91,2 92,60 2,96 5,84
TDS (g/L) 6,56 6,63 6,65 6,61 0,05 0,00
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 3. Parámetros fisicoquímicos del agua en el tanque de almacenamiento de
las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
Los resultados de los parámetros fisicoquímicos del agua de la piscina 1, indican que no
existe mayor variación en los tres muestreos realizados, con excepción de la temperatura
ambiente y el oxígeno disuelto. (Ver tabla 14, figura 4)
39
Tabla 14. Parámetros fisicoquímicos en la piscina 1 de almacenamiento de las
aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
Piscina 1
Muestreo
1
Muestreo
2
Muestreo
3 Promedio
Desviación
Estándar Variación
Temperatura
Ambiente (o C) 25 31 19,7 25,23 5,65 21,31
Temperatura de
la muestra (o C) 47,3 47 47,8 47,37 0,40 0,11
pH 7,12 7,36 6,66 7,05 0,36 0,08
Salinidad 3,8 3,5 3,5 3,60 0,17 0,02
Conductividad
(µS/cm) 6,33 6,6 6,29 6,41 0,17 0,02
Oxígeno Disuelto
(mg/L; %)
4,5 4,08 3,65 4,08 0,43 0,12
86,4 86,79 79,4 84,20 4,16 11,53
TDS (g/L) 6,33 6,19 6,21 6,24 0,08 0,00
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 4. Parámetros fisicoquímicos del agua en la piscina 1 de almacenamiento de
las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
Los resultados de los parámetros fisicoquímicos del agua de la piscina 2, indican que no
existe mayor variación en los tres muestreos realizados, con excepción de la temperatura
ambiente y el oxígeno disuelto. (Ver tabla 15, figura 5)
40
Tabla 15. Parámetros fisicoquímicos en la piscina 2 de almacenamiento de las
aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
Piscina 2
Muestreo
1
Muestreo
2
Muestreo
3 Promedio
Desviación
Estándar Variación
Temperatura
Ambiente (o C) 25 31 25 27,00 3,46 8,00
Temperatura de
la muestra (o C) 36 35 35,3 35,43 0,51 0,18
pH 8,02 8,23 7,99 8,08 0,13 0,01
Salinidad 3,6 3,6 3,6 3,60 0,00 0,00
Conductividad
(µS/cm) 6,54 6,55 6,65 6,58 0,06 0,00
Oxígeno Disuelto
(mg/L; %)
4,76 4,45 4,68 4,63 0,16 0,02
97,8 85,1 94,3 92,40 6,56 28,69
TDS (g/L) 6,55 6,45 6,57 6,52 0,06 0,00
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 5. Parámetros fisicoquímicos del agua en la piscina 2 de almacenamiento de
las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
3.2.Resultados del análisis microbiológico
3.2.1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas.
Los datos obtenidos en el recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas en el
balneario indican que en la vertiente existe una mayor concentración de microorganismos,
a diferencia de lo que ocurre en la muestra liquida del tanque de almacenamiento que
presenta un valor menor, además se determina un promedio total de 1,018 x 103 UFC/ml
en todo el balneario. (Ver tabla 16, figura 6)
41
Tabla 16. Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas en las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro”
Puntos de muestreo Recuento
(UFC/ml)
Media
(UFC/ml)
Vertiente M1 3,01 x 103 2,0633 x 103
M7 3,01 x 103
M13 0,17 x 103
Tanque
(líquido)
M2 0,16 x 103 1,733 x 102
M8 0,03 x 103
M14 0,33 x 103
piscina 1 M3 3,01 x 103 1,13 x 103
M9 0,12 x 103
M15 0,26 x 103
piscina 2 M4 0,12 x 103 1,36 x 103
M10 0,02 x 103
M16 3,94 x 103
Tanque
(sólido)
M6 0,95 x 103 3,633 x 102
M12 0
M18 0,14 x 103
TOTAL 15,27 x 103 5,09 x 103
PROMEDIO TOTAL 1,018 x 103
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 6. Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas en las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro”
3.2.2. Recuento de bacterias Pseudomonas
Los datos obtenidos en el recuento de bacterias Pseudomonas en el balneario indican que
en la vertiente y en la piscina 2 hay ausencia de este tipo de microorganismos, a diferencia
de lo que ocurre en la muestra liquida del tanque de almacenamiento que presenta una
mayor concentración, además se determina un promedio total de 3,40 x 102 UFC/ml en
todo el balneario. (Ver tabla 17, figura 7)
42
Tabla 17. Recuento de bacterias Pseudomonas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
Puntos de muestreo Recuento
(UFC/ml)
Media
(UFC/ml)
Vertiente M1 0,00 0,0
M7 0,00
M13 0,00
Tanque (líquido) M2 3,8 x 103 1,6 x 103
M8 1 x 103
M14 0,00
piscina 1 M3 1 x 102 6,67 x 101
M9 0,00
M15 1 x 102
piscina 2 M4 0,00 0,0
M10 0,00
M16 0,00
Tanque (sólido) M6 0,00 3,33 x 101
M12 1 x 102
M18 0,00
TOTAL 5,1 x 103 1,7 x 103
PROMEDIO TOTAL 3,40 x 102
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 7. Recuento de bacterias Pseudomona en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
3.2.3. Recuento de bacterias coliformes totales y E. coli
Los datos obtenidos en el recuento de bacterias E. coli indican que existe ausencia en todo
el balneario y de bacterias coliformes totales hay ausencia en la vertiente, a diferencia de
lo que ocurre en la piscina 2 que presenta una mayor concentración de estos
43
microorganismos, además se determina un promedio total de 2,42 x 101 UFC/ml en todo el
balneario. (Ver tabla 18, figura 8)
Tabla 18. Recuento de bacterias coliformes totales y E. coli en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”
Puntos de muestreo Recuento
(UFC/ml)
Media
(UFC/ml)
Vertiente M1 0,00 0
M7 0,00
M13 0,00
Tanque
(líquido)
M2 1,5 x 101 1,5 x 101
M8 0,00
M14 3 x 101
piscina 1 M3 3,00 3,83 x 101
M9 5,4 x 101
M15 5,8 x 101
piscina 2 M4 4 x 101 5 x 101
M10 8 x 101
M16 3 x 101
Tanque de
Almacenamiento
sólido
M6 1,1 x 101 1,77 x 101
M12 0,00
M18 4,2 x 101
TOTAL 3,63 x 102 1,21 x 102
PROMEDIO TOTAL 2,42 x 101
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 8. Recuento de bacterias coliformes totales y E. coli en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”
3.2.4. Recuento de mohos y levaduras en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
Los datos obtenidos en el recuento mohos y levaduras en el balneario indican que existe
ausencia en la vertiente, a diferencia de lo que ocurre en la muestra solida del tanque de
almacenamiento que presenta una mayor concentración de estos microorganismos,
44
además se determina un promedio total de 9,9 UFC/ml en todo el balneario. (Ver tabla
19, figura 9)
Tabla 19. Recuento de mohos y levaduras en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
Puntos de muestreo Recuento
(UFC/ml)
Media
(UFC/ml)
Vertiente M1 0 0
M7 0
M13 0
Tanque
(líquido)
M2 1 1,3
M8 0
M14 3
piscina 1 M3 22 7,3
M9 0
M15 0
piscina 2 M4 1 5,3
M10 3
M16 12
Tanque
(sólido)
M6 31 35,3
M12 19
M18 56
TOTAL 1,48 x 102 49
PROMEDIO TOTAL 9,9
Fuente: elaboración propia, (2017)
Figura 9. Recuento de mohos y levaduras en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
3.2.5. Resultados del aislamiento microbiano: características macroscópicas
Para la obtención de las cepas puras se procedió a clasificarlas en base a sus características
macroscópicas como se describe en la tabla 20.
45
Tabla 20. Características macroscópicas de los cultivos bacterianos puros aislados en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
CEPA ORIGEN CARACTERISTICAS
Superficie Forma Borde Color Tamaño
CP1 Vertiente Papilada circular redondeado crema - amarillo pequeña
CP2 Vertiente Convexa circular redondeado crema - blanco Pequeña
CP3 tanque (líquido) Convexa circular redondeado crema - amarillo Pequeña
CP4 tanque (líquido) Plano irregular rizoide amarillo - transparente Pequeña
CP5 tanque (líquido) plano irregular ondulado verde Mediana
CP6 tanque (líquido) Plano irregular rizoide rosado Mediana
CP7 Piscina 1 plano convexo circular redondeado crema - amarillo Pequeña
CP8 Piscina 2 Umbilicada rizoide rizoide crema - amarillo grande
CP9 Vertiente umbilicada rizoide rizoide crema - blanco grande
CP10 tanque (líquido) plano convexo filamentosa rizoide crema - blanco Mediana
CP11 Piscina 1 convexa circular redondeado crema - blanco Pequeña
CP12 Piscina 1 Plano irregular rizoide crema - amarillo Mediana
CP13 Piscina 1 acuminada circular redondeado amarillo Pequeña
CP14 Piscina 1 plano convexo circular redondeado amarillo Pequeña
CP15 Piscina 2 Plano irregular ondulado amarillo Pequeña
CP16 Vertiente plano convexo circular redondeado crema - blanco Pequeña
CP17 tanque (líquido) acuminada rizoide rizoide crema - blanco Mediana
CP18 tanque (líquido) convexa circular redondeado crema - blanco Pequeña
CP19 tanque (líquido) plano irregular ondulado amarillo - transparente pequeña
CP20 Piscina 1 Plano irregular rizoide crema - amarillo mediana
CP21 Piscina 1 Plano filamentosa filamentoso blanco - transparente mediana
CP22 Piscina 2 convexa circular redondeado crema - amarillo pequeña
CP23 tanque (sólido) umbilicada irregular lobulado crema - blanco mediana
CP24 tanque (sólido) plano convexo irregular ondulado crema - amarillo mediana
CP25 Piscina 1 plano convexo rizoide ondulado crema - blanco mediana
CP26 Piscina 2 convexa circular redondeado verde mediana
CP27 tanque (sólido) plano convexo fusiforme ondulado crema - blanco pequeña
CP28 tanque (líquido) Convexa circular redondeado crema - blanco mediana
CP29 tanque (líquido) umbilicada irregular lobulado crema - amarillo grande
46
3.2.6. Resultados de la tinción Gram de cepas aisladas en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”
Tabla 21. Resultados de la tinción Gram de cepas bacterianas aisladas en las aguas
termales “Santagua de Chachimbiro”
No CEPAS MORFOLOGÍA BACTERIANA ORIGEN
CP1 bacilos Gram - BACILOS GRAM
NEGTIVOS
Vertiente
CP2 bacilos Gram - Vertiente
CP4 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (líquido)
CP5 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (líquido)
CP6 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (líquido)
CP7 bacilos Gram - Piscina 1
CP8 bacilos Gram - Piscina 2
CP11 bacilos Gram - Piscina 1
CP12 bacilos Gram - Piscina 1
CP13 bacilos Gram - Piscina 1
CP15 bacilos Gram - Piscina 2
CP16 bacilos Gram - Vertiente
CP18 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (líquido)
CP19 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (líquido)
CP20 bacilos Gram - Piscina 1
CP26 bacilos Gram - Piscina 2
CP27 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (sólido)
CP28 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (líquido)
CP29 bacilos Gram - tanque de almacenamiento (líquido)
CP3 cocos Gram - COCOS GRAM
NEGTIVOS
tanque de almacenamiento (líquido)
CP14 cocos Gram - Piscina 1
CP21 cocos Gram - Piscina 1
CP9 bacilos Gram + BACILOS GRAM
POSITIVOS
Vertiente
CP17 bacilos Gram + tanque de almacenamiento (líquido)
CP22 bacilos Gram + Piscina 2
CP23 bacilos Gram + tanque de almacenamiento (sólido)
CP24 bacilos Gram + tanque de almacenamiento (sólido)
CP25 bacilos Gram + Piscina 1
CP10 cocos Gram + COCOS GRAM
POSITIVOS
tanque de almacenamiento (líquido)
47
Tabla 22. Morfología de las colonias aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
TINCIÓN GRAM
Tinción Morfología Total
bacilos Cocos
Gram + 6 1 7
Gram - 19 3 22
Total 25 4 29
Fuente: elaboración propia, (2017)
La tinción Gram de las cepas aisladas en el balneario de las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” dio como resultado que el 66% presentan una morfología de bacilos Gram
negativos, el 21% son bacilos Gram positivos, el 10% son cocos Gram negativos y 3%
restante son cocos Gram positivos.
Figura 10. Morfología de cultivos bacterianos puros aislados en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”
48
3.2.7. Resultados de las pruebas bioquímicas
Tabla 23. Resultados de las pruebas bioquímicas de las cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
+: Prueba positiva; -: prueba negativa; A/A: ácido/acido; K/K: alcalino/alcalino; G: crecimiento; NG: no hay crecimiento.
No CEPAS
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Hemólisis
SBA Catalasa Oxidasa
Mac-
conkey
Lactosa
Mac-
conkey
Citrato TSI
SIM
Coagulasa Ureasa Hidrólisis de
gelatina
O/F
M H2S I Oxidación Fermentación
CP1 gama + + G - - A/A - - - + - + + +
CP2 gama + - G - - A/A - - - + + + + +
CP3 beta + + G - + K/A + - - + - + + +
CP4 alfa + + G - + K/A - - - + - + + +
CP5 alfa + + G - - A/A gas + - - - - + + +
CP6 alfa + - G - + K/A H2S + - - + - - + +
CP7 gama + + G - - K/A gas + - - + - + + +
CP8 beta + + G - - A/A gas + - - - - + + +
CP9 beta - + G - - A/A + - - - + - + +
CP10 - + + G - - A/A - - - - + - + +
CP11 beta + + G + + A/A gas + - - - + + + +
CP12 alfa + - G - + K/A - - - - + - + -
CP13 beta + + G - - A/A gas + - - - - + + +
CP14 alfa + + G - + A/A gas - - - - + + + +
CP15 alfa + + G + + A/A - - - - - + + +
CP16 alfa + + G - + K/A gas + - - + - + + +
CP17 gama + + G - - A/A gas - - - - + + + +
CP18 gama + + G - + K/A - - - + - + + +
CP19 beta + + G - - K/A - - - - - + + +
CP20 alfa + + G + + A/A - - - + - + + +
CP21 gama + + G - + K/K + - - - - - + +
CP22 gama + + NG - A/A gas + - - - + + + +
CP23 gama + + G - - A/A gas + - - - - + + +
CP24 alfa + + G - + A/A + - - - - + + +
CP25 gama + + G - + A/A gas + - - + - + + +
CP26 alfa + + G + + A/A gas + - - - + + + +
CP27 gama + + G + - A/A gas + - - - - + + +
CP28 gama + + G + - A/A gas + + + - - + + +
CP29 alfa + + G + - A/A + - - - - + + +
49
3.2.8. Identificación de las especies aisladas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
Tabla 24. Especies bacterianas identificadas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
Origen Cepa Familia identificada Género Especie identificada % de especies
en cada punto
%
Total, en las
aguas termales
vertiente 1 Aeromonadaceae Aeromonas
Aeromonas media 25 3,45 13,79
vertiente 16 Aeromonas eucrenophila 25 3,45
vertiente 2 Actinomycetaceae Actinomyces Actinomyces turicensis 25 3,45
vertiente 9 Enterobacteriaceae Yersinia Yersinia bercovieri 25 3,45
tanque (liquido) 4, 18 y 19 Aeromonadaceae Aeromonas
Aeromonas salmonicida subsp.
Salmonicida 30 10,34
34,48
tanque (liquido) 28 Aeromonas hydrophila 10 3,45
tanque (liquido) 5 Pseudomonadaceae Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa 10 3,45
tanque (liquido) y Piscina 1 3 y 21 Alcaligenaceae Alcaligenes Alcaligenes latus 20 6,89
tanque (liquido) 10 Micrococcaceae Micrococcus Micrococcus lylae 10 3,45
tanque (liquido) 17 Bacillaceae Bacillus Bacillus mycoides 10 3,45
tanque (liquido) 6 Enterobacteriaceae Pragia Fortium Pseudomonas oryzihabitans 10 3,45
piscina 1 7 Aeromonadaceae Aeromonas Aeromonas schubertii 14,285 3,45
24,14
piscina 1 12 Enterobacteriaceae Ewingella Ewingella americana 14,285 3,45
piscina 1 14 Moraxellaceae Psychrobacter Psychrobacter immobilis 14,285 3,45
piscina2, piscina 1 y tanque
(liquido) 15, 20 y 29 Pasteurellaceae Haemophilus Haemophilus actinomycetemcomitans 42,855 10,34
piscina 1 25 Bacillaceae Bacillus Bacillus cereus 14,285 3,45
piscina1, piscina 2 y tanque
de (sólido)
11, 13, 26,
8 y 27 Aeromonadaceae Aeromonas Aeromonas caviae 83,333 17,24
20,69
piscina 2 22 Bacillaceae Bacillus Bacillus stearothermophilus 17 3,45
tanque (sólido) 23 y 24 Bacillaceae Bacillus Bacillus thuringiensis 100 6,89 6,90
50
Figura 11. Porcentaje de las cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
En el agua de la vertiente del balneario se encontró cuatro especies: Aeromonas media,
Aeromonas eucrenophila, Actinomyces turicensis, Yersinia bercovieri lo que representa
un 13,79% de las bacterias encontradas en todo el balneario, en la muestra liquida del
tanque de almacenamiento se encontró ocho especies: Aeromonas salmonicida subsp.
Salmonicida, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes latus,
Micrococcus lylae, Bacillus mycoides, Pseudomonas oryzihabitans y Haemophilus
actinomycetemcomitans, representando un 34,48% del total de la población bacteriana
del balneario; en la muestra solida del tanque de almacenamiento se encontró dos
especies: Aeromonas caviae, Bacillus thuringiensis, representando el 12,64% del total;
en la piscina 1 se identificó seis especies: Aeromonas schubertii, Ewingella americana,
Psychrobacter immobilis, Haemophilus actinomycetemcomitans, Bacillus cereus,
Aeromonas caviae con un porcentaje de 22,99% del total; y en la piscina 2 se encontró
tres especies: Haemophilus actinomycetemcomitans, Aeromonas caviae y Bacillus
thuringiensis, con un porcentaje de 12,64%.
3,4483,448
3,448
3,448
10,344
3,448
3,4486,896
3,448
3,4483,4483,4483,4483,448
10,3443,448
17,24
3,448
6,896
Porcentaje de las cepas aisladas en las aguas termales "Santagua de Chachimbiro"
Aeromonas media
Aeromonas eucrenophila
Actinomyces turicensis
Yersinia bercovieri
Aermonas salmonicida subsp. Salmonicida
Aeromonas hydrophila
Pseudomonas aeruginosa
Alcaligenes latus
Micrococcus lylae
Bacillus mycoides
Pseudomonas oryzihabitans
Aermonas schubertii
Ewingella americana
Psychrobacter immobilis
Haemophilus actinomycetemcomitans
Bacillus cereus
Aeromonas caviae
Bacillus stearothermophilus
Bacillus thuringiensis
51
3.3.Resultados de la caracterización Biotecnológica
Tabla 25. Resultados de la caracterización biotecnológica de las especies
bacterianas identificadas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
CARACTERIZACION BIOTECNOLÓGICA
Especie C P A L DP
Aeromonas media + + + - +
Actinomyces turicensis + + + + -
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida + - - + +
Pseudomonas aeruginosa + + - + +
Pseudomonas oryzihabitans + + + + -
Aeromonas schubertii + + + - +
Yersinia bercovieri - - + + +
Micrococcus lylae + + + + -
Aeromonas caviae + - + - +
Ewingella americana + + + + +
Psychrobacter immobilis + + + - +
Aeromonas eucrenophila + - - - +
Bacillus mycoides + + + + +
Haemophilus actinomycetemcomitans + + + + +
Alcaligenes latus + + + + -
Bacillus stearothermophilus + + + + +
Bacillus thuringiensis + + + + +
Bacillus cereus - - + + +
Aeromonas hydrophila - - + + +
C: celulolíticos; P: proteolíticos; A: amilolíticos; L: lipolíticos; DP: degradadores de petróleo
Figura 12. Porcentaje de las cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” en función de sus propiedades biotecnológicas
89,47%
73,68%84,21%
73,68%78,95%
CARACTERIZACIÓN BIOTECNOLÓGICA
52
En el balneario “Santagua de Chachimbiro” se determinó que cada una de las 19 cepas
aisladas presentan diferentes propiedades biotecnológicas a la vez, teniendo así un
84,21% de bacterias celulolíticas; 73,68% de bacterias proteolíticas; 84,21% son
amilolíticas; 73,68% son lipolíticas y un 73,68% son degradadoras de derivados de
petróleo.
3.4.Antibiogramas de las bacterias identificadas
Tabla 26. Resultados de las pruebas de resistencia a antibióticos de las especies
aisladas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” Sensibilidad antimicrobiana
ESPECIE ANTIBIÓTICO
A E F N S
Aeromonas media S S S I S
Actinomyces turicensis S S R S S
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida R R R S R
Pseudomonas aeruginosa R R S S R
Pseudomonas oryzihabitans S S R S S
Aeromonas schubertii R R R I R
Yersinia bercovieri S S R I S
Micrococcus lylae R S R S S
Aeromonas caviae R R R S S
Ewingella americana R S R I S
Psychrobacter immobilis R R R I R
Aeromonas eucrenophila R S R S S
Bacillus mycoides S S R I S
Haemophilus actinomycetemcomitans S S R I S
Alcaligenes latus S R R S S
Bacillus stearothermophilus R S R S S
Bacillus thuringiensis S S R S S
Bacillus cereus R R R S S
Aeromonas hydrophila R R R I S
A: ampicilina (10 µg); E: eritromicina (15 µg); F: fosfomicina (50 µg); N: netromicina (30 µg); S:
sulfametoxazol trimetoprim (25 µg)
S: Susceptible; I: Intermedio; R: Resistente
53
Figura 13. Porcentaje de las cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro en función de su resistencia o sensibilidad a diferentes antibióticos
Figura 14. Porcentaje de cepas aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro que presentan multirresistencia a diferentes antibióticos
Se puede observar que en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” un 63% de las
bacterias aisladas presentan multirresistencia a los antibióticos estudiados.
42%58%
11%
58%
79%
58%42%
89%
0%
21%
0% 0% 0%
42%
0%
PORCENTAJE DE RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD DE LAS CEPAS AISLADAS
Sensible Resistente Intermedia
63%
37%
Porcentaje de cepas multirresistentes
Multiresistencia Resistentes- Sensibles- Intermediamente resistentes
54
4. DISCUSION
4.1.Parámetros fisicoquímicos
La medición de parámetros fisicoquímicos se realizó en los cuatro puntos de muestreo
(vertiente, tanque, piscina 1 y piscina 2). El valor de la temperatura del agua de la vertiente
fue de 54,9oC, del tanque fue de 49,9oC, de la piscina 1 fue de 47,4oC y de la piscina 2 es
de 35,6oC, dando así un valor promedio de todo el balneario de 46,9oC, todas estas
temperaturas cumplen con la diferencia de 5oC con respecto a la temperatura ambiente del
lugar que dio un valor promedio de 26,1oC para ser clasificadas como aguas termales como
lo indica Burbano et al., (2013).
Este valor de la temperatura indica que estas aguas son de tipo hipertermal según la
clasificación de Fagundo et al., (2007), otros autores como Zevallos (2016) en su estudio
de Clasificación de aguas termales también establece que la temperatura de 46,9oC está
dentro del rango de aguas hipertermales.
A nivel Nacional el estudio de Aguas termo minerales en el Ecuador realizado por INAMHI
en el 2013 menciona que las aguas termales de “Santagua de Chachimbiro” tienen una
temperatura de 55oC, es decir 8,1oC de diferencia con respecto al valor dado en el presente
estudio, sin embargo siguen siendo estas, aguas hipertermales. La variación entre estos
valores puede deberse a diversos factores como: que los datos han sido tomados en
diferentes épocas del año, o también a que ha transcurrido ya cuatro años desde que
realizaron el estudio mencionado o pudo haber influenciado el equipo utilizado por cada
investigador, así como una consecuencia del cambio climático que se produce en todos los
ecosistemas.
El valor promedio del pH registrado es de 7,2 es decir las aguas de este lugar son
relativamente neutras según lo descrito por Fagundo et al., (2007) y en el estudio realizado
por el INAMHI (2013), se obtuvo un valor de 7,6 es decir no hay mayor variación, aunque
estas según Karakolev tendrían un mínimo grado de alcalinidad. Sin embargo, según la
Tabla 7 “Criterios de calidad de aguas con fines recreativos mediante contacto primario”
del Anexo 1 del Libro VI del TULSMA este se encuentra dentro del rango permitido.
Moreno et al., (2007) indica que altos valores en la escala de pH, están estrechamente
relacionados con la naturaleza química de las fuentes de aguas, así como “Santagua de
55
Chachimbiro” que son termas de tipo Clorurada sódica (INAMHI, 2013), están compuestos
por cloruros y sulfuros de hierro, magnesio, cobre, flúor, cloro, bromo, yodo.
En cuanto a la salinidad se obtuvo un dato promedio de 3,7 lo que indica según la
clasificación del INAMHI que estas son de baja salinidad.
La conductividad eléctrica dio un valor de 6600 µS/cm, que comparado con el estudio
realizado por el INAMHI no existe mayor variación porque el valor que determina este es
de 6655 µS/cm, además este dato indica que la concentración de sales disueltas en esta
agua es elevada, a diferencia del estudio realizado en Guayllabamba – Chimborazo
(Veintimilla, 2015) que reporta un valor de 1354 µS/cm es decir que este balneario tiene
menos concentración de iones, el IGEPN (2015) indica que existen fuentes con
conductividades más altas, que pueden estar relacionadas a procesos de evaporación en
superficie.
El oxígeno disuelto medido en el balneario es de 3,7 mg/L es decir el porcentaje de
saturación es de 78,1 %, que comparado con lo que indica el Anexo 1 del Libro VI del
TULSMA, Tabla 7 “Criterios de calidad de aguas con fines recreativos mediante contacto
primario” no cumple el criterio establecido ya que no es mayor al 80%, el valor obtenido
de la medición en la vertiente es muy bajo en comparación al resto de datos, haciendo que
el promedio general del balneario disminuya, esto puede ser debido a las altas temperaturas
y las altas concentraciones de minerales y residuos orgánicos en este lugar, además, si
existe decaimiento de los residuos orgánicos hay mayor consumo oxígeno y
frecuentemente este fenómeno se concentra en el verano, aunque en el Ecuador no existe
la estación “verano” la muestra fue tomada en época seca (mes de julio y agosto) y es ahí
cuando los animales o microorganismos acuáticos requieren más oxígeno para soportar
altos metabolismos. La temperatura, la salinidad y la presión afectan también la capacidad
del agua para disolver el oxígeno (Cimcool, 2004); siendo los valores de temperatura y
salinidad los más altos en este punto de muestreo.
Por último, se analizó la concentración de solidos totales disueltos. Se registró un dato
promedio de 6,57 g/L es decir 6570 ppm de sólidos totales disueltos, valor superior al valor
determinado por el INAMHI en el 2013, que fue de 4256 ppm, esto nos indica que el
contenido de sales, minerales, metales, cationes o aniones es elevado, ya que es una
característica propia de estas aguas al surgir del suelo y estar en contacto con rocas
56
(Panachlor, 2015); la diferencia es grande pero se debe a la diferencia del tiempo de
muestreo de ambas investigaciones.
4.2.Cuantificación de bacterias en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
4.2.1. Recuento de bacterias aerobios mesófilas heterótrofos.
La cuantificación de microorganismos aerobios mesófilos heterótrofos se realizó mediante
la metodología de conteo en caja, teniendo como valor promedio del balneario 1,018 x 103
UFC/ml; tomando en cuenta que en la vertiente se obtuvo un valor de 2,06 x 103 UFC/ml,
en el tanque (líquido) el valor promedio fue de 1,733 x 102 UFC/ml, mientras que en la piscina
1 y 2 se reportó 1,13 x 103 UFC/ml y 1,36 x 103 UFC/ml respectivamente y por último en
el tanque (sólido) se obtuvo un valor de 3,63 x 102, se puede observar que el mayor valor
registrado fue en la vertiente con un 41% del total de bacterias mesófilas en el balneario
“Santagua de Chachimbiro”.
Según Andueza, (2014) la cantidad de bacterias aerobias mesófilas son indicadores de
calidad sanitaria, los resultados obtenidos en esta investigación son muy altos y aunque no
existe normativa nacional que controle este tipo de microorganismo en aguas de uso
recreativos, se ha tomado de referencia a la normativa Española, en donde Bernabé Sanz
Pérez menciona que los resultados menores a 100 UFC/ml no representan un riesgo
sanitario, pero se podría decir que en Chachimbiro existe una mala protección del
balneario, sin embargo este valor puede deberse a que hay bacterias mesófilas que a pesar
de tener un rango óptimo de crecimiento de 37ºC, existen algunas que se adaptan a
condiciones de elevada temperatura de más de 45ºC.
A nivel Nacional en el estudio microbiológico de las aguas termo mineromedicinales del
balneario “El Salado” de Baños de Agua Santa - Tungurahua” realizado por Núñez, (2015)
y del estudio de las termas de la Virgen ubicado en la parroquia Matriz perteneciente al
cantón Baños de Agua Santa – Tungurahua realizado por Soria, (2015), presentan valores
inferiores a las 100 UFC/ml, determinando que estos balnearios tienen una calidad sanitaria
adecuada, sin contaminación, a diferencia de este estudio que presenta datos que
demuestran que el lugar está contaminado, que puede ser debido a la alta concentración de
turistas, además de que las vertientes que alimentan estas piscinas están en lugares alejados
y rodeados por vegetación y fauna de sangre caliente que son huéspedes de estos
microorganismos, que se han adaptado a las condiciones del balneario.
57
Por otra parte, el estudio realizado por Guailla, (2015) en el agua termal de Urauco en la
provincia de Pichincha, obtuvo valores de 5,3 x 102 UFC/ml; el estudio de Cruz, (2015)
en las aguas termales de Guapante en la provincia de Tungurahua determinó un número de
1,41 x 103 UFC/ml en el balneario; también la investigación hecha por Naranjo, (2015) en
el Manantial termal “Termas La Merced” en la provincia de Pichincha establece un valor
promedio de 1,00 x 103 UFC/ml en todo el balneario, todos estos estudios y la presente
investigación indican de manera general que las aguas termas ubicadas en el Ecuador
presentan una alta concentración microbiana.
Los datos que se obtuvo en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” son elevados a
diferencia de los valores reportados por De la Rosa et al., (2007) en el Manantial
mineromedicinal del Balneario Puente Viesgo, España, los cuales fueron menores a 1 x
102 UFC/ml, también los valores determinado por Mosso et al., (2008) en el balneario de
Valdeteja en Burgos España, fueron inferiores a 1 x 102 UFC/ml y por último el estudio
hecho por De la Rosa et al., (2009) en el Balneario Alicún de la Torres España,
determinaron de igual manera valores menores a 1 x 102 UFC/ml, indicando que España
cumple con lo establecido en la norma, es decir sus aguas termales son de buena calidad
sanitaria .
4.2.2. Recuento de bacterias Pseudomonas
La cuantificación del género Pseudomonas se realizó mediante la metodología de conteo
en caja y dilución en serie, como resultado promedio del balneario dio un total de 3,40 x
102 UFC/ml, tomando en cuenta que en la vertiente no existió registro de Pseudomonas en
ninguno de los muestreos. En el tanque (liquido) se reportó un valor de 1,6 x 103 UFC/ml,
en la piscina 1 dio un valor de 0,667 x 102 UFC/ml, en la piscina 2 se reportó inexistencia
de este microorganismo y por último en la muestra solida del tanque existió 0,333 x 102
UFC/ml.
Se puede observar que el mayor valor reportado está en el tanque en la muestra liquida,
con un total de 94%, seguido de la piscina 1 con un 4%. Esta especie se encuentra en
cualquier parte del medio ambiente y según lo que menciona Andueza, (2014) son
indicadores de calidad del agua y además son bacterias patógenas en el agua, sin embargo,
la patogenicidad de la mayor parte de las Pseudomonas depende del oportunismo ya que
atacan a pacientes inmunocomprometidos (Kasper et al., 2016).
58
Dugarte, (2014) indica que las aguas termales, debido a su temperatura y otras condiciones
no son estériles, es decir que va a existir siempre población bacteriana, que determinarán
si estas se encuentran contaminadas o cumplen con los estándares de calidad higiénica.
Además, menciona que debido a investigaciones anteriores se ha podido determinar que en
los balnearios de aguas termales, hay una gran diversidad de microrganismos autóctonos
característicos de cada tipo de agua prevaleciendo las bacterias heterótrofas de los géneros,
Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Enterobacter, también puede haber en ellas
microorganismos coliformes por agentes contaminantes externos.
En el estudio realizado por De la Rosa, et al., (2007), Microbiología del manantial
mineromedicinal del Balneario Puente Viesgo España, al realizar un análisis de
microorganismos de interés sanitario determinaron que, en una muestra de 250 ml de agua,
hay ausencia de bacterias patógenas como: Salmonella, Pseudomonas aeruginosa,
Legionella Pneumophila y Staphylococcus aureus, lo que indica que estas aguas son aptas
para el consumo humano según lo establecido en la norma española.
Al comparar los resultados anteriores con lo obtenido en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro” se puede decir que estas aguas presentan una calidad sanitaria deficiente, es
decir presentan un grado medio de contaminación al tener presencia se Pseudomonas,
aunque estas bacterias son muy comunes en ambientes húmedos y no son exigentes
nutricionalmente, no causan infecciones a menos de que la persona este
inmunocomprometida.
De la Rosa. et al., (2004) en su estudio, determinó que en el manantial San José y Pilas del
Balneario la Virgen en Jaraba España, la existencia de Pseudomonas aeruginosa en un total
de 4 UFC/250ml, siendo esta una bacteria muy ubicua, que se encuentra en aguas
superficiales contaminadas con aguas residuales y en los suelos, y es capaz de vivir en
aguas minerales naturales porque tiene la capacidad de sobrevivir en ambientes
oligotróficos, en la presente investigación si se identificó esta especie como parte del
género Pseudomonas.
La presencia de estos microorganismos en el tanque tanto en muestra liquida como en
sólida y en la piscina 1, nos demuestra que es capaz de sobrevivir al cambio de condiciones
de temperatura, pH, sales y minerales disueltas, a pesar de que la existencia en la piscina 1
puede ser a causa de una contaminación propia de un balneario ocupada por un sinnúmero
de bañistas.
59
En los estudios de aguas mineromedicinales del Balneario Cervantes en España según
Mosso et al., (2006), se analizaron tanto los puntos de emergencia de los manantiales como
en los baños y agua de bebida de la fuente de San Camilo, no encontrándose en ninguno de
ellos la presencia de bacterias patógenas.
En la investigación realizada en el Balneario “El Paraíso” de Manzanera (Teruel) por De
la Rosa et al., en el 2001, tampoco se encontró ninguna bacteria patógena como Salmonella,
Pseudomonas aeruginosa, Legionella Pneumophila y Staphylococcus aureus,
considerando de esta manera que la mayoría de las aguas termales de España son de buena
calidad sanitaria, que al comparar solo con los resultados de la vertiente de “Santagua de
Chachimbiro” podemos decir que este punto cumple con un nivel alto de calidad sanitaria
al presentar ausencia de Pseudomonas en los tres muestreos.
Sin embargo, en los estudios realizados por De la Rosa et al., (2007) en el Balneario del
Puente Viesgo España; De la Rosa et al., (2004) en el estudio realizado en el Balneario la
Virgen y en el Balneario Cervantes estudiado por Mosso et al., (2006), existen en baja
proporción otras especies de Pseudomonas que no son patógenas, al igual que sucede con
el presente estudio, indicando que se requiere de un tratamiento previo o medidas de
prevención para evitar posibles enfermedades en los turistas que visitan el balneario.
4.2.3. Recuento de coliformes totales
Para la cuantificación de coliformes totales y E. coli se utilizó placas Petrifilm 3M de E.
coli/ Coliformes (EC), sin dilución, que dio como resultado promedio del balneario 2,42 x
10 UFC/ml, teniendo en la vertiente un valor de 0 UFC/ml de coliformes totales y E. coli,
en la muestra liquida del tanque tenemos un valor de 1,5 x 10 UFC/ml de coliformes totales
y 0 UFC/ml de E. coli, en la piscina 1 se reportó una cantidad de 3,83 x 10 UFC/ml de
coliformes totales y 0 UFC/ml de E. coli, en la piscina 2 el valor aumento a 5 x 10 UFC/ml
de coliformes totales y 0 UFC/ml de E. coli, por último en la muestra solida del tanque se
evidenció un valor de 1,77 x 10 UFC/ml de coliformes totales y 0 UFC/ml de E. coli.
Se puede observar según la figura 8 que la mayor presencia de coliformes totales se
encuentra en la piscina 2 con un 41%, seguido de la piscina 1 con un 32%, pero sin reporte
de E. coli es decir no hay presencia de contaminación fecal en el balneario “Santagua de
Chachimbiro”.
60
Según Andueza, (2014) la existencia de coliformes totales es también un indicador de
calidad sanitaria del agua, es decir la presencia de estos indica que el agua puede estar
contaminada con patógenos y tener malas condiciones higiénicas y en cuanto a coliformes
fecales indican la presencia de E. coli.
En las aguas termales de “Santagua de Chachimbiro” no hay reportes de E. coli, pero sí de
coliformes totales, siendo posible que estas estén contaminadas con microorganismos
patógenos, pero como la mayor cantidad se encuentran en las piscinas y en menor número
en el tanque puede deberse a que estas son habitantes comunes del tracto intestinal, tanto
de las personas como de los animales de sangre caliente que pueden encontrarse en los
alrededores (Dugarte, 2014).
Existen también coliformes totales que están presentes en el suelo y de ahí pueden pasar a
las aguas dulces como lo indica Soria, (2015) en su estudio realizado en las termas de La
Virgen ubicado en el cantón Baños de Agua Santa en Tungurahua, donde se reportó valores
para coliformes fecales de 1,7 x 10 UFC/ml y de coliformes totales de 1,09 x 102 UFC/ml,
siendo estos mucho mayores a los encontrados en la presente investigación.
En el estudio realizado por De la Rosa (2012) et al., en las aguas mineromedicinales del
Balneario El Raposo en Badajoz – España, se reportó ausencia de coliformes fecales
indicando que según la normativa están dentro de los límites permisibles para que estas
aguas puedan ser consumidas por el ser humano, estos resultados son muy similares a lo
que se obtuvo en “Santagua de Chachimbiro” citado en Soria, (2015).
De la Rosa et al., (2009) en el estudio de Microbiología de los manantiales del Balneario
Alicún de las Torres España, no presentan indicadores de contaminación fecal es decir E.
coli, Enterococos, Clostridium sulfito – reductores y C. perfringens en 100 ml de agua,
además de que no existen ninguna bacteria patógena.
En los manantiales mineromedicinales del Balneario Cervantes estudiado por Mosso et al.,
(2006), al realizar análisis microbiológicos en 100 ml de agua, se determinó la inexistencia
de coliformes fecales como E. coli, enterococos y Clostridium perfringens es decir cumplen
con lo establecido en la norma Española de aguas de consumo humano, por otro lado si se
detectaron coliformes totales en un número muy bajo, menos de 10/100 ml de agua en los
puntos de emergencia de los manantiales , de los baños y de San Camilo, la investigación
presente es de situación similar, pudiendo ser estas bacterias procedentes del suelo y de ahí
pasar las aguas subterráneas.
61
Según Wellcare, (2009) a partir del año 2006, la Agencia de Protección Ambiental de EE.
UU. (EPA) fijó en 5 % el límite legal para los coliformes totales, lo que significa que, para
un suministro de agua público, proveniente de aguas subterráneas, los coliformes totales
no deben estar presentes en más de 5 % de las muestras de agua. La EPA también fijó en
cero el objetivo máximo para contaminantes de coliformes. Además, algunos
departamentos de salud, estatales y locales establecieron en cero los límites para los
coliformes totales en pozos privados.
Según San Martin, (2017) en su trabajo de Piscinas de tratamiento: Higiene y Control,
menciona que varios estudios experimentales confirman que la contaminación aportada al
agua de una piscina por una sola persona es, de promedio, unos diez millones de gérmenes
totales, un millón de coliformes y cien mil coliformes fecales. Cierto tipo de pacientes,
después de una sesión en la piscina, pueden aportar de 15000 a 40000 gérmenes por ml de
agua. Estos gérmenes provenientes principalmente de la orina son Escherichia coli,
Proteus, Bacillus piocianico, Staphylococcus, etc., esto también puede explicar el alto
porcentaje de coliformes totales en las piscinas de “Santagua de Chachimbiro”.
En el estudio de microorganismo patógenos en la fuente termal de O Tinteiro en Ourense
España, realizado por Vendrell et al., (2009) indica que de los 6 puntos analizados, el 66,7%
tiene presencia de coliformes totales y el 50% tiene coliformes fecales, estos valores son
mayores a los determinados en las aguas termales estudiadas en esta investigación.
Mosso et al., (2008) en la investigación de los manantiales mineromedicinales del
Balneario de Valdeteja España, encontraron 0,18 UFC/ml coliformes totales y 0,08
UFC/ml termo tolerantes pertenecientes a las especies Citrobacter freundii y Enterobacter
amnigenus y ausencia de coliformes fecales, cumpliendo con la norma de agua de consumo
humano, de la misma manera son resultados similares a los del estudio realizado en
Santagua de Chachimbiro” aunque estas aguas analizadas no tengan las mismas
características físico químicas.
En base al Reglamento del régimen Técnico-Sanitario de Piscinas, Boletín Oficial de
Canarias España No 38, donde se aduce que los valores de coliformes fecales deben ser
nulos y el de los coliformes totales 0,10 UFC/ml, citado en Naranjo, (2015) los resultados
para coliformes fecales obtenidos en los puntos de muestreo de “Santagua de Chachimbiro”
cumplen con lo establecido, por el contrario en cuanto a coliformes totales los valores
registrados son muy altos.
62
No se pudo comparar con lo establecido en la Tabla 7 del Anexo 1 del Libro VI del
TULSMA, debido a que en esta se establece un valor en NPM (número más probable), y
para llegar a obtener una cuantificación con estas unidades es necesario realizar una
metodología diferente a la realizada en esta investigación.
4.2.4. Recuento de mohos y levaduras
Para la cuantificación de mohos y levaduras se realizó mediante la utilización de placas
Petrifilm 3M de Mohos y Levaduras, sin dilución, reportando los siguientes resultados: 0
UFC/ml de mohos y levaduras en la vertiente; 1,3 UFC/ml de mohos y levaduras en la
muestra de agua en el tanque; en la piscina 1 se obtuvo 7,3 UFC/ml de mohos y levaduras;
5,3 UFC/ml de mohos y levaduras en la piscina 2 y por último en el sedimento del tanque
se encontró 35,3 UFC/ml de mohos y levaduras.
El valor con mayor porcentaje de mohos y levaduras se encuentra en la muestra sólida del
tanque con un 71%, este valor puede deberse a que la muestra fue tomada en la pared del
tanque donde hay mayor humedad, existe material orgánico y además de que la temperatura
de este lugar es alta siendo estas condiciones favorables para su desarrollo, seguida de la
piscina 1 con un 15%, donde su presencia puede ser debido a que estos microorganismo
están ampliamente distribuidos en la naturaleza abundando en el suelo, vegetación, en la
materia orgánica existente en el agua y en general en cualquier ambiente húmedo inclusive
en el cuerpo humano (pies, manos, uñas, etc.) como lo menciona García, (2012).
Debido a que no se realizó identificación de cada moho y levadura, dado a que no era uno
de los objetivos del trabajo, no se puede saber a ciencia cierta si son o no patógenos pero
debido a lo que menciona Uribarren (2011) además de ser ubicuos, estos cumplen con una
de las funciones más importantes en el ecosistema que es la degradación de materia
orgánica a formas más simples, por lo que se podría decir que este tipo de microorganismos
no son del todo malos en el medio ambiente.
Pero por otro lado, existen también un grupo importante que crecen como parásitos en el
hombre, produciendo infecciones, principalmente de tipo superficial o cutáneo, llamadas
micosis superficiales y más excepcionalmente de forma sistémica, como micosis profunda,
García, (2012) que podrían ser un riesgo, en este caso para el bañista.
63
Para Andueza, (2014) los mohos y levaduras también están dentro del grupo de indicadores
de calidad sanitaria del agua, valores altos de estos, señalan problemas de higiene, limpieza
y contaminación ambiental.
En el estudio microbiológico de las aguas mineromedicinales de los balnearios de Jaraba
realizado por De la Rosa, et al., (2004) indican que aislaron hongos filamentosos (mohos)
en un número menor a 10/100 ml y dos grupos de levaduras en los manantiales del
Balneario La Virgen, además se menciona que los hongos son microorganismos muy
ubicuos y diversos autores también han encontrado mohos y levaduras en manantiales de
aguas termales y en aguas minerales envasadas.
Comparando estos resultados podemos observar que la cantidad de mohos y levaduras en
“Santagua de Chachimbiro” son relativamente elevados tanto en el tanque como en las
piscinas.
En los manantiales del balneario Cervantes en España, también se pudo observar un
número muy pequeño de mohos (Mosso et al., 2006), con respecto a los registrados en la
presente investigación.
En el estudio de las “Termas La Merced” realizada por Naranjo, (2015) no se detectó la
presencia de mohos y levaduras en el pozo del balneario, al igual que en la vertiente del
balneario de “Santagua de Chachimbiro”, pero si se registraron valores de lavaduras en la
piscina (70/100ml), que comparados con los valores determinados en las piscinas en
estudio son mucho menores.
4.3.Aislamiento de especies bacterianas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
De los 29 cultivos puros, 4 se encontraron en la vertiente, 10 fueron aislados de la muestra
liquida tomada en el tanque, 3 proceden de la muestra solida del tanque, 8 fueron
encontradas en la piscina 1 y 4 en la piscina 2.
De las 29 cepas puras aisladas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” se
determinó que el 76% son bacterias Gram negativas es decir 22 microorganismos
pertenecientes a este grupo y el 24% restantes o sea 7 bacterias son Gram Positivas, y en
base a su morfología se reportó que el 21% son bacilos Gram positivos, el 66% son bacilos
Gram negativos, el 10% son cocos Gram negativos y el 3% restante son cocos Gram
positivos.
64
Además de las 29 cepas aisladas se han identificado 19 especies, predominando la familia
Aeromonadaceae del grupo de los Gram negativos con un 41,38% y la familia Bacillaceae
del grupo de las Gram positivas con un 20, 69%, teniendo como mayoría a los Gram
negativos que son los que prevalecen en este balneario “Santagua de Chachimbiro”.
En el estudio realizado por De la Rosa & Mosso en el que se habla de la “Diversidad
microbiana de las aguas minerales termales” de forma general, se indica que en manantiales
hipertermales existe un predominio de bacterias Gram positivas mientras que en las aguas
meso termales la mayoría son los bacilos Gram Negativos y cocos Gram positivos, afirma
así mismo, que esto se debe a que las bacterias Gram positivas son más resistentes al calor
es decir a las elevadas temperaturas de las aguas hipertermales, sin embargo esto difiere a
los resultados obtenidos en esta investigación donde se determinaron mayor cantidad de
Gram negativos, esto puede ser debido a que el primer estudio mencionado es en España y
las condiciones fisicoquímicas y ambientales son diferentes a las del Ecuador. Además, se
ha postulado que cada manantial termal tiene una microbiota única y característica,
resultados de sus condiciones ambientales, ecológicas y climáticas.
Borja et al., (2012) en su estudio de “Bacterias halo tolerantes productoras de hidrolasas
aisladas de aguas termales de Tarapoto – Perú”, indica que logró aislar 14 especies y de
estas encontró que un 79% son Gram negativas y el 21% restantes son bacterias Gram
positivas, menciona también que tener estos resultados es muy común en aguas termales y
haciendo una comparación con las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”, se observa
que los resultados en cuanto a morfología bacteriana son muy similares.
En Perú se realizó un estudio acerca del “Aislamiento de microorganismos productores de
celulasas alcalinas de aguas termales y suelos de bosques de Contamana” en donde Cortez
(2015) obtuvo en esta investigación un predominio de bacilos Gram Positivos a una
temperatura de 70oC y pH neutro, con especies como Genobacillus, Bacillus, Aspergillus,
estos datos al compararlos con los de “Santagua de Chachimbiro”, son diferentes ya que
aquí la mayoría de las cepas aisladas son de morfología Gram negativa y las especies
predominantes pertenecen a las familias Aeromonadaceae y Bacillaceae.
Núñez, (2015) realizó un estudio microbiológico de la aguas termo mineromedicinales del
balneario “El Salado” de Baños de Agua Santa – Tungurahua en Ecuador, donde se aisló
un total de 26 cepas bacterianas puras, de estas, 11 (42%) fueron Gram positivos y 15
(58%) Gram negativos, predominando los bacilos Gram negativos con un 52,63%, las
65
especies identificadas con mayor frecuencia fueron las Pseudomonas, Bacillus y
Staphylococcus, en relación con los datos registrados en el presente estudio muestran
similitud en el predominio de las bacilos Gram negativos con un 66% (19 cepas puras) y
las especies predominantes encontradas fueron Aeromonas, Pseudomonas y Bacillus,
coincidiendo en que estas son propias de la microbiota del agua y de seres humanos
(bañistas).
El estudio microbiológico de las termas de La Virgen ubicado en la parroquia Matriz
perteneciente al cantón Baños de Agua Santa en Tungurahua – Ecuador, realizado por
Soria, (2015) reporta 240 colonias aisladas pero identificadas solamente 172, donde existe
mayor cantidad de bacilos Gram negativos con un (45%), en cambio los Gram positivos se
encuentran en un porcentaje mínimo (9,6%) y con un valor intermedio tienen cocos Gram
positivos (16,7%), resultado similar al encontrado en el presente trabajo
Se puede observar que, a nivel nacional en las aguas termales estudiadas por Cruz, (2015);
Vinueza, (2015); Naranjo, (2015); Guailla, (2015); Veintimilla, (2015); entre otras, se
obtiene resultados similares en los que predominan las bacterias Gram negativas y estos
datos sirven como referencia y comprobación de lo que se obtuvo en el balneario “Santagua
de Chachimbiro”.
De la Rosa et al., (2004) realizaron el estudio de la “Microbiología de las aguas
mineromedicinales de los balnearios de Jaraba” donde determinaron que existe un número
pequeño de bacterias heterótrofas (254 cepas), menor a 10 UFC/ml en donde la mayoría
son bacilos Gram negativos (65%) y en menor proporción están los cocos Gram positivos
(17,3%) y bacilos Gram positivos no esporulados (13,8%), con un notorio predominio en
bacilos Gram negativos. Entre las especies identificadas con mayor frecuencia esta la
Enterobacter Cloacae que está ampliamente distribuida en la naturaleza aislándose con
frecuencia en aguas minerales naturales y mineromedicinales y las especies del género
Pseudomonas que presentan una versatilidad enzimática que les permite sobrevivir y
proliferar en ambientes oligotróficos.
En las termas de “Santagua de Chachimbiro” también se encontró una cantidad importante
de bacterias del género Pseudomonas esto puede deberse a que estos microorganismos no
son exigentes y se adaptan a cualquier tipo de medio (agua, suelo, en áreas húmedas) y se
las puede encontrar en cualquier parte del planeta (Bush, 2017).
66
En el estudio de “Microbiología de los manantiales mineromedicinales del Balneario de
Alicún de las Torres España” realizado por De la Rosa et al., (2009) se encontró que la
mayoría de las bacterias tienen morfología de bacilos Gram negativos fermentadores y no
fermentadores con un 54,5% y en menor proporción los bacilos Gram positivos con un
29,1% y por último con una mínima cantidad que representa el 16,4% cocos Gram
positivos. Las principales especies han sido: Aeromonas hydrophila y Pseudomonas
putida, presentando un grado de similitud con lo reportado en “Santagua de Chachimbiro”
en donde se encontró una gran cantidad especies del género Aeromonas.
Mosso et al., (2011), estudiaron la “Microbiología de los manantiales mineromedicinales
del Balneario de Baños de la Concepción de Villatoya España” en donde han aislado 135
cepas bacterianas puras viables heterótrofas y oligotrofias, que corresponden a los tipos
morfológicos de bacilos Gram negativos (60%), bacilos Gram positivos (29,6%) y cocos
Gram positivos (10,4%). Estos datos son similares a los que se obtienen en el estudio
presente, en donde se obtuvo el 66% de bacilos Gram negativos, 21% de bacilos Gram
positivos, el 10% de cocos Gram negativos y el 3% de cocos Gram positivos.
Muchos de los bacilos Gram negativos son ubicuos y están difundidos entre los animales
y la naturaleza (suelos, plantas, cuerpos de agua) pudiendo causar enfermedad en el hombre
y los animales (Algorta, 2006), características que justifican su presencia en el balneario
“Santagua de Chachimbiro”, en la fuente y en el tanque donde pueden proceder del suelo
por infiltraciones o ser parte del agua, y en las piscinas puede estar relacionada con los
bañistas.
Se puede observar que tanto en los estudios realizados en aguas termales en España como
en el Ecuador, pueden predominar las bacterias Gram negativas, es especial los bacilos con
altos porcentajes de concentración en las fuentes y piscinas, sin embargo existe un número
mínimo de balnearios donde también predominan las bacterias Gram positivas esto se debe
a que cada sitio presenta diferentes características ambientales, climáticas, ecológicas y
fisicoquímicas a las cuales se han ido adaptando los microorganismos existentes.
4.4.Identificación de las especies aisladas en las aguas termales “Santagua de
Chachimbiro”
En la tabla 23 se describe los resultados de las pruebas bioquímicas a las que fueron
sometidas las 29 cepas aisladas en el balneario “Santagua de Chachimbiro”, cada una de
67
estas se realizó de acuerdo con lo descrito en la metodología y con esto se logró identificar
tanto a la familia, al género y a la especie a la que pertenece cada cepa pura.
Las pruebas bioquímicas realizadas permitieron identificar con un alto grado de precisión,
determinando características metabólicas, la mayoría de las cepas bacterianas, muchas de
estas pruebas son técnicas rápidas, que evalúan la presencia de una enzima preformada y
su lectura varía entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para
su lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h
(Fernández et al., 2010).
Se procedió a comparar los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas realizadas a
cada cepa, con los esquemas de identificación establecidos en el libro de MacFaddin,
(2003), y se logró identificar un total de 19 especies de bacterias.
En la tabla 24 se describen la familia, el género y la especie identificada, teniendo un total
de 9 familias, 11 géneros y 19 especies encontradas en las muestras tomadas de la fuente,
tanque (líquido y sólido) y piscinas 1 y 2.
Entre las especies identificadas tenemos: Aeromonas media, Aeromonas eucrenophila,
Actinomyces turicensis, Yersinia bercovieri, Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida,
Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes latus, Micrococcus lylae,
Bacillus mycoides, Pseudomonas oryzihabitans, Aeromonas schubertii, Ewingella
americana, Psychrobacter immobilis, Haemophilus actinomycetemcomitans, Bacillus
cereus, Aeromonas caviae, Bacillus stearothermophilus, Bacillus thuringiensis.
El género predominante en el balneario “Santagua de Chachimbiro” fue Aeromonas, con
un 41,38%, estos son bacilos Gram negativos no formadores de esporas, catalasa positiva,
movilidad variable, oxidasa positivo, O/F de la glucosa: Fermentativos y Oxidativos, con
temperatura óptima de crecimiento de 22 – 28oC, sin embargo la mayoría de las cepas
crecen bien a 37oC (MacFaddin, 2003); seguido del género Bacillus con un 20,69% cuyas
características son: bacilos Gram positivos o Gram variables, catalasa variables, movilidad
por lo común positiva, oxidasa variable, O/F de la glucosa: Fermentativos u Oxidativos o
ambos, con temperatura óptima de crecimiento de 35oC (MacFaddin, 2003).
En el estudio realizado por Macas, (2015), en las aguas termo minerales del Balneario
“Santa Ana” de Baños de Agua Santa de Tungurahua se identificó las siguientes bacterias:
Flavobacterium aquatilis, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas media, Shewanella
68
putrefaciens, Aeromonas schubertii, Aeromonas caviae, Bacillus spp., y Staphylococcus
aureus, se puede observar que los resultados son similares a los obtenidos en “Santagua de
Chachimbiro”, incluso con el género de mayor frecuencia que fue Aeromonas en los dos
estudios.
En el estudio de Diversidad microbiana de las aguas minerales termales en España
realizado por De la Rosa & Mosso, predominan las bacterias heterótrofas oligotróficas de
los géneros: Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Enterobacter,
Acinetobacter y Arthrobacter, los mismos que coinciden con la mayoría de las especies
identificadas en este estudio, debido a que son características de aguas termales.
Dugarte, (2014) en su estudio de calidad bacteriológica de las aguas termales de Tabay,
Municipio Santos Marquina Mérida Estado Mérida, identifico los géneros Staphylococcus
y Enterobacter, resultados poco diferentes a los obtenidos en el presente trabajo.
En el estudio de Microbiología del agua mineromedicinal de los Balnearios de Alhama de
Granada España, se determinó como géneros predominantes a Bacillus, Kurthia,
Corynebacterium, Arthrobacter, Cellulomonas, Micrococcus, Staphylococcus,
Pseudomonas, Stenotrophomonas, Alcaligenes, Acinetobacter y Burkholderia, estos
microorganismos son ubicuos, algunos forman parte de la población autóctona y otros se
encuentran en el suelo y aguas superficiales y desde estos hábitats pueden llegar al
manantial (Mosso et al., 2002), estos resultados son similares a los obtenidos en la presente
investigación, puede ser debido a que ambas son aguas hipertermales que contienen alta
concentración de sales a las que se han adaptado esta microbiota bacteriana.
Cortes, (2016) en su estudio microbiológico de las aguas termales del Balneario El Cachaco
ubicado en la parroquia Calacalí de la provincia de Pichincha, identificó las siguientes
especies: Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans,
Streptococcus agalactiae, Staphylococcus saprophyticus y los géneros Corynebacterium,
Campylobacter y Pseudomonas, que comparando con los resultados obtenidos en el
balneario “Santagua de Chachimbiro” difieren significativamente.
En el manantial San Camilo del Balneario Cervantes España, han predominado las especies
fermentadoras, Aeromonas hydrophila y Serratia marcescens, la primera forma parte de la
micro población autóctona de las aguas y se aísla con frecuencia en manantiales de aguas
minerales (Mosso et al., 2006), en el balneario “Santagua de Chachimbiro” también se aíslo
e identificó a la especie Aeromonas hydrophila.
69
Guailla, (2015) y Naranjo (2015); en sus estudios microbiológicos en aguas termales
ecuatorianas también identificaron el género Aeromonas como las especies Aeromonas
caviae, Aeromonas hydrophila y Aeromonas schubertii que son las mismas especies del
género Aeromonas identificados en “Santagua de Chachimbiro”.
A continuación, describiremos las principales características biológicas de las especies
predominantes identificadas:
Aeromonas media: se encuentran ampliamente distribuidas en el suelo y el agua, son de
movilidad negativa, fermentadores de glucosa, no productores de la enzima ureasa,
anaerobios facultativos, crece a temperaturas de 37,5oC y es capaz de causar infecciones
clínicas en el hombre con mayor frecuencia que en peces marinos, además se puede
encontrar en agua potable. (Zepeda, 2015)
Algunos autores consideran que la presencia de estas en agua potable podría ser un
indicador de la necesidad de optimizar el sistema de tratamiento y potabilización del agua
(Szewzyk et al., 2000) citado por Jiménez, (2005).
Aeromonas hydrophila: son bacilos Gram negativos de movilidad positiva, fermentan
glucosa, son habitantes omnipresentes de agua dulce y ambientes estuarinos, comprende
un componente dominante de la microbiota natural de los peces, además ha sido implicado
como oportunista y patógeno primario de una amplia gama de especies acuáticas y
animales terrestres incluido peces (Allen et al., 1983), al ser una bacteria que actúa como
oportunista no es muy común que pueda causar algún tipo de enfermedad en los bañistas a
menos que se encuentren con sus defensas bajas.
Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida: es un bacilo Gram negativo, anaerobio
facultativo, inmóvil, no esporulado ni encapsulado, crecen y se mantienen óptimamente en
medios nutritivos con 0.85% de sal y temperaturas entre 22 a 28ºC, no creciendo a
temperatura mayores de 37ºC (Paterson et al., 1980; Austin & Austin, 1987; Roberts, 1989;
Inglis et al., 1993; Bernoth, 1997; Hiney & Olivier, 1999) citado en González, (2002).
Esta especie es el agente causante de la forunculosis, una septicemia bacteriana de peces
salmónidos, salmonicida subsp. salmonicida causa enfermedad en peces sanos (Reith,
2008).
Aeromonas schubertii: es un bacilo Gram negativo, con movilidad positiva, no
fermentador de glucosa, presenta mayor implicación clínica en casos de diarrea pues son
70
patógenos humanos, causan infecciones extra intestinales(Bravo, 2012), se la puede
encontrar en cualquier ambiente acuático del mundo, incluso agua dulce, agua contaminada
o clorada, agua salobre y en ocasiones el agua de mar, puede colonizar el tubo digestivo en
forma temporaria, a menudo infectan diversas especies de animales de sangre fría y caliente
(Forbes et al., 2009).
Aeromonas caviae: es un bacilo Gram negativo, móvil, fermentador de glucosa, variable
en lactosa, habita en los mismos medios que la Aeromonas Schubertii como suelo o agua
con cierto grado de contaminación (Forbes et al., 2009), y en el ser humano pueden causar
también enteritis o septicemia en las personas inmunodeficientes o en aquellas que sufran
alguna enfermedad (Morales, & González, 2013).
Aeromonas eucrenophila: es un bacilo Gram negativo, con movilidad positiva,
fermentador de glucosa, pero no de lactosa, muchas es veces es aislado en ser humano,
pero no es patógeno (Janda & Abbott, 2010; Winn et al., 2006) y como todo el género
Aeromonas está también se encuentra en el suelo y medios acuáticos.
Yersinia bercovieri: pertenecen a la familia de Enterobacteriaceae, es bioquímicamente
similar a Y. enterocolitica, se aísla en heces humanas, agua, suelo y vegetales crudos (Winn
et al., 2006).
Pseudomonas aeruginosa: es un bacilo Gram negativo aerobio, muy versátil
metabólicamente llegando a ser problemáticos en los ambientes hospitalarios, pueden
utilizar más de 80 compuestos orgánicos como fuentes de carbono y energía, crecen a
temperaturas superiores a 42oC, se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza,
tienen habilidad para sobrevivir en ambientes acuosos con nutrientes mínimos, también
podemos encontrarla en piscinas, suelos, tubos de agua caliente, soluciones de lentes de
contacto, cosméticos, uñas artificiales, e inclusive en drogas inyectables. Solo causa
enfermedades en personas inmunodeprimidas y actúa como oportunista en plantas y
animales (Ruiz, 2007).
Se menciona también de un alto valor ecológico para Pseudomonas aeruginosa, al menos
para algunas cepas de esta bacteria. (Bano & Musarrat, 2003; Hasanuzzaman et al., 2004;
Szoboszlay et al., 2003). En algunos casos se demostró que las cepas son buenas
degradantes del petróleo (Hasanuzzaman et al., 2004; Szoboszlay et al., 2003). Se sugirió
que otros representantes de P. aeruginosa actuarán como estimulante del crecimiento de la
planta, realizando una promoción y biocontrol de las rizobacterias (Anjaiah et al., 2003;
71
Bano & Musarrat, 2003), además, produce moléculas glicolipídicas de superficie activa
(ramnolípidos) que puede tener potenciales aplicaciones biotecnológicas (Pham et al.,
2004; Soberón & Chávez et al., 2005) citado en (Selezska, 2010)
Alcaligenes latus: son bacilos Gram negativos, aerobios estrictos, catalasa positiva,
movilidad y oxidasa positiva, fueron identificadas como bacterias fijadoras de nitrógeno
por Malik et al., (1981) citado en (Hui & Yokota, 2005). Son capaces de crecimiento
autotrófico mediante el uso de moléculas orgánicas como fuente de energía (Palleroni &
Palleroni, 1978).
Se han realizado varios estudios con cepas de Alcaligenes latus en los que han sido
probados para producción de polihidroxibutirato (PHB) utilizando jugo de remolacha
azucarera como medio de cultivo (Wang et al., 2013) y como floculante microbiano de
residuos, emulsión de líquidos y aceite por un biofloculante con Alcaligenes latus. (Kurane
& Nohata, 1990).
Genero Bacillus: son bacilos Gram positivos o Gram variables, producen endosporas, son
resistentes al calor, aerobios a anaerobios facultativos, son catalasa variable por lo común
son positivos, motilidad por lo general positivas, oxidasa variable, O/F de la glucosa:
Fermentativos u Oxidativos o ambos, temperatura óptima de crecimiento de 35oC, excepto
Bacillus stearothermophilus (MacFaddin, 2003).
Este género es uno de los más grandes en especies que existen, y ha ganado popularidad
con taxonomistas por su extrema diversidad fenotípica y heterogeneidad. Se encuentran
comúnmente en el medio ambiente (agua y suelo) y como contaminantes de laboratorio,
pero en su mayoría no son patógenos, se sabe que algunas de las especies causan
infecciones en humanos tales como Bacillus anthracis que causa ántrax y Bacillus cereus
que causa enfermedad por los alimentos (Standards for Microbiology Investigations,
2015).
La gama de estilos de vida fisiológicos de los Bacillus es impresionante: pueden ser
degradadores de la mayoría de todos los sustratos derivados de origen vegetal y animal,
incluida la celulosa, almidón, proteínas, agar, hidrocarburos y otros; productores de
antibióticos; desnitrificadores; fijadores de nitrógeno; precipitadores de hierro; oxidantes
de selenio; oxidantes y reductores de manganeso; quimilitotrofos facultativos; acidófilos;
alcalófilos; psicrófilos, termófilos y otros (Slepecky, 1972; Norris et al., 1981; Claus &
Berkeley, 1986) citado en (Slepecky & Hemphill, 2006)
72
4.5.Caracterización biotecnológica
Los microorganismos colonizan todo ambiente: suelo, agua y aire, participan de forma vital
en todos los ecosistemas y están en interacción continua con las plantas, los animales y el
hombre, estos microorganismos junto a los productores, permiten la existencia del ciclo
de la materia en la biosfera, ya que son la clave para el funcionamiento de los sistemas
biológicos y el mantenimiento de la vida sobre el planeta, pues participan en procesos
metabólicos, ecológicos y biotecnológicos (Montaño et al., 2010).
Los microorganismos son los principales responsables de la descomposición de la materia
orgánica y del reciclaje de los nutrientes (carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, etc.)
permitiendo que la materia se transforme y no se disperse en las sucesivas transferencias,
estos seres microscópicos hacen que la materia permanezca constante, pero sufre
permanentes cambios en su estado químico (Hernández, 2013).
En base a que los microorganismos tienen la capacidad de vivir en todo tipo de ambientes,
su diversidad es muy amplia, tienen una gran capacidad para disgregarse y presentan
una gran diversidad metabólica, estos pueden transformar diferentes compuestos nocivos
en otros de menor impacto ambiental y más aun los que tienen la capacidad de adaptarse a
ambientes extremos como las aguas termales, siendo el principal propósito de esta
investigación.
Una aplicación tecnológica que utiliza el potencial metabólico de los microorganismos es
la biorremediación ya que los microorganismos son utilizados para transformar la materia
orgánica y compuestos tóxicos en compuestos más simples poco o nada contaminantes,
teniendo un alto nivel de aceptación y de aplicabilidad técnica y económica (Roldán, 2006).
Es por esto que se ha sometido a las bacterias aisladas e identificadas en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” a una caracterización biotecnológica proporcionando varias
fuentes de carbono al medio en el que se desarrollan, para observar su capacidad de
biodegradación o consumo de las mismas, debido a que los microorganismos con
características enzimáticas brindan una opción en la obtención de metabolitos que puedan
ser usados a nivel industrial (Buitrago et al., 2014).
A través de la metodología utilizada se ha podido determinar que las bacterias identificadas,
al consumir la fuente de carbono proporcionada en cada medio, es decir los polisacáridos
como son las grasas, proteína, celulosa, almidón y derivados del petróleo, siendo estos los
73
principales compuestos que se encuentran en abundancia en la naturaleza que al presentarse
en grandes proporciones actúan como contaminantes para el ambiente, estas tendrán
propiedades proteolíticas, amilolíticas, lipolíticas, celulolíticos o si son degradadoras de
compuestos derivados del petróleo (Buitrago et al., 2014).
El almidón es abundante en el mundo natural, es un carbohidrato que se almacena y es
utilizado como fuente de energía por las plantas, animales y humanos, el almidón es
insoluble y está presente en las células de las plantas en gránulos microscópicos que son
desarrollados como macromoléculas de dos polímeros de glucosa: amilasa y amilopectina,
ambos polímeros se diferencian por la complejidad de su estructura y según la extensión
de las ramificaciones de los polímeros, las enzimas amilolíticas de los microorganismos
hidrolizan con diferente especificidad (Arellano & Olmos, 1999).
Los microorganismos amilolíticos que utilizan enzimas reductoras producen azucares
simples y entre ellos tenemos a las bacterias como Bacillus sp., Pseudomonas sp., y
Streptomyces sp. (Sánchez et al., 2005) citado en (Buitrago et al., 2014).
En el estudio de las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” se encontró que las
bacterias amilolíticas capaces de producir estas enzimas son: Aeromonas media,
Actinomyces turicensis, Pseudomonas oryzihabitans, Aeromonas schubertii, Yersinia
bercovieri, Micrococcus lylae, Aeromonas caviae, Ewingella americana, Psychrobacter
immobilis, Bacillus mycoides, Haemophilus actinomycetemcomitans, Alcaligenes latus,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus y Aeromonas
hydrophila que comparando con lo citado anteriormente coinciden los resultados y además
se ha encontrado otras bacterias con estas características.
De la Rosa et al., (2004) han determinado que en las aguas mineromedicinales de los
Balnearios de Jaraba en España, existen cantidades bajas de bacterias proteolíticas y
amilolíticas, identificando entre ellas, los géneros Pseudomonas y Micrococcus, estas
comunidades microbianas desempeñan un papel fundamental en los ciclos biogeoquímicos
del carbón.
En los manantiales mineromedicinales del Balneario Cervantes España, Mosso et al.,
(2006), obtuvieron valores altos de bacterias proteolíticas y amilolíticas en el punto de
emergencia del manantial Cervantes, pero en el manantial San Camilo las bacterias
amilolíticas se encontraron en un número medio, siendo principalmente los géneros de
Burkholderia, Serratia, Aeromonas y Bacillus. Las bacterias amilolíticas están
74
ampliamente distribuidas en la naturaleza y corresponden a especies mesófilas y termófilas
muy diversas.
Comparando con los resultados observados en el presente estudio, se tiene mayor similitud
en cuanto a los géneros Aeromonas y Bacillus.
En un estudio de cepas nativas amilolíticas aisladas de diferentes nichos ecológicos
realizado por (Sánchez et al., 2005) se determinó que los géneros Bacillus sp., Clostridium
sp., y Kurthia sp., son amilolíticas siendo el más predominante el género Bacillus sp, estos
resultados son similares en menor proporción debido a que solo coinciden con uno de los
géneros.
La celulosa es el carbohidrato más abundante en la biomasa vegetal, forma el 40 – 60% de
la pared celular de las plantas. Los organismos no pueden obtener energía directamente del
polisacárido celulosa, solo pueden usar monómeros (azucares reductores), para ello
necesitan desprenderlos de la misma celulosa por medio de la reacción de hidrolisis a través
de un complejo enzimático, estas enzimas hidrolíticas llamadas celulasas son producidas
por bacterias celulolíticas que cortan los enlaces de la celulosa siendo las aerobias las más
abundantes y conocidas y entre ellas están: Cellulomonas sp., Vibrio sp., Bacillus sp.,
Pseudomonas sp., y Cytophaga sp., (Rodríguez, 2015), coincidiendo solo con los géneros
Bacillus sp., y Pseudomonas sp encontrados en el agua termal analizada en la presente
investigación.
Los microorganismos celulolíticos son mesofílicos, termofílicos, aerobios y anaerobios de
los géneros Bacillus sp., Clostridium sp., Streptomyces (Gaitán & Pérez, 2007) citado en
Buitrago et al., (2014).
Bacillus sp., es reconocido industrialmente atractivo por sus altas tasas de crecimiento, gran
capacidad para la secreción de enzimas extracelulares, así como su desarrollo bajo
condiciones ambientales extremas (Rodríguez, 2015), en “Santagua de Chachimbiro”
existe un alto porcentaje de esta bacteria que podría ser de gran utilidad económica y
ambiental si se aprovecha sus propiedades degradantes.
La degradación de celulosa a monómeros de glucosa se puede realizar de dos maneras:
mediante la hidrólisis química, con la aplicación de ácidos inorgánicos que generan
contaminación y toxinas, o por medio de hidrólisis biológica, con aplicación de enzimas
75
como parte de las tecnologías limpias que no contaminan (Juturu & Wu, 2014) citado en
(Tamariz, 2014).
Se han registrado como bacterias celulolíticas en “Santagua de Chachimbiro” a las
siguientes bacterias: Aeromonas media, Actinomyces turicensis, Aeromonas salmonicida
subsp. Salmonicida, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas
schubertii, Micrococcus lylae, Aeromonas caviae, Ewingella americana, Psychrobacter
immobilis, Aeromonas eucrenophila, Bacillus mycoides, Haemophilus
actinomycetemcomitans, Alcaligenes latus, Bacillus stearothermophilus y Bacillus
thuringiensis, coincidiendo solo en los géneros Bacillus sp., y Pseudomonas sp., con los
estudios citados anteriormente.
Según Mosso et al., (2008), en su estudio microbiológico de los manantiales
mineromedicinales del Balneario de Valdeteja España, se registraron bacterias con
propiedades celulolíticas en dos de sus manantiales y las bacterias identificadas con esta
actividad son Cellvibrio, las mismas que no coinciden con las bacterias determinadas como
celulolíticas en el presente trabajo.
La comunidad microbiana asociada con el ciclo del nitrógeno (N) representa una ventaja
evolutiva al fijar N2 atmosférico y convertirlo en formas asimilables para otros organismos.
El N está presente en varias formas, las cuales son transformadas a lo largo del ciclo por la
acción de microorganismos amonificantes (AMO), proteolíticos (PRO), oxidantes de
amonio (BOA), oxidantes de nitrito (BON) y desnitrificantes (DEN), entre otros (Loomis
& Connor, 2002) citado en Cañón et al., (2012)
Todas las formas de vida dependen del nitrógeno ya que es un componente esencial de
proteínas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas fundamentales del metabolismo (Iñón,
2017), la degradación de materia orgánica es un proceso en donde intervienen una amplia
variedad de microrganismos con actividades enzimáticas diversas y específicas para cada
sustrato, en el caso de los microorganismos proteolíticos fragmentan las proteínas
(proporcionados por el nitrógeno en su ciclo biogeoquímico) en unidades menores hasta
aminoácidos libres (Anderson, 1978) citado en (Pozuelo, 1991).
La microbiota proteolítica actúa en las etapas iniciales de la mineralización de los
compuestos orgánicos nitrogenados y a continuación participan los microorganismos
amonificantes que rinden amonio como producto final del proceso degradativo (Anderson,
1978) citado en (Pozuelo, 1991).
76
Estos procesos naturales de interacción entre la materia orgánica y los microorganismos
proteolíticos son beneficiosos para las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” y para
otros cuerpos de agua debido a que estas bacterias evitan el proceso de eutrofización por la
acumulación de materia orgánica (algas, plantas propias del medio) que impidan el paso de
oxigeno; entre las bacterias identificadas con estas propiedades en este estudio tenemos:
Aeromonas media, Actinomyces turicensis, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas
aeruginosa, Aeromonas schubertii, Micrococcus lylae, Ewingella americana,
Psychrobacter immobilis, Bacillus mycoides, Haemophilus actinomycetemcomitans,
Alcaligenes latus, Bacillus stearothermophilus, y Bacillus thuringiensis.
En el estudio microbiológico realizado por De la Rosa et al., (2007) en el manantial
mineromedicinal del Balneario Puente Viesgo España, se registró un número medio de
bacterias proteolíticas, entre las aisladas están: las especies Bacillus licheniformis,
Burkholderia cepacia y Pseudomonas fluorescens, no presentan mayor similitud con las
bacterias proteolíticas registradas en “Santagua de Chachimbiro” en cuanto a las especies,
pero si con referencia al género al que pertenecen estas.
Las bacterias con actividad proteolítica y amilolítica están abundantemente distribuidas en
los hábitats acuáticos y se han encontrado en manantiales termales extranjeros (Chen et al.,
2005; Chen, et al., 2006) y españoles (De la Rosa et al., 2004; Mosso et al., 1998; Mosso
et al., 2002) citado en De la Rosa et al (2007).
Los ciclos biogeoquímicos contribuyen a mantener el equilibrio del ecosistema y a
autodepuración de los posibles contaminantes orgánicos, especialmente a través de la
fijación del nitrógeno en su ciclo biogeoquímico, ya que es el proceso bioquímico más
importante después de la fotosíntesis.
En especies de los géneros de Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Serratia y Micrococcus
hay bacterias que degradan fácilmente proteínas puras (Alexander, 1980) citado en
(Pozuelo, 1991) comparando con los datos registrados en el presente trabajo se puede decir
que no hay mayor similitud, sin embargo, esto indica que existe mayor diversidad
bacteriana proteolítica en el balneario estudiado actualmente.
Por otro lado, los lípidos se encuentran en todos los microorganismos vivos y desempeñan
un papel indispensable en el mantenimiento de la vida, y a diferencia de las proteínas y los
carbohidratos, los lípidos son en extremo polimórficos y difíciles de definir
estructuralmente (Horton, 2003), además ciertos microorganismos para sobrevivir a
77
temperaturas elevadas comprenden, entre otras gran proporción de lípidos saturados en las
membranas, lo cual impiden la fusión a esas temperaturas (Atlas & Bartha, 2001),
permitiendo la adaptación de estos seres a temperaturas elevadas como en las aguas
hipertermales.
Las enzimas lipolíticas producidas por los microorganismos se denominan lipasas que se
utilizan para eliminar depósitos de grasa procedentes de diversas industrias, como
embutidos o láctea, entre otras (Cepeda & Valencia, 2007).
Las lipasas se han aislado de una gran variedad de microrganismos pero una de las primeras
fuentes ha sido la especie Bacillus, sin embargo ahora hay lipasas que son fuentes
tradicionales para la producción comercial, producidas por bacterias como: Pseudomonas
sp., y Serratia sp., y el productor de enzimas lipasas termofílicas más destacada es la
especie Bacillus thermocatenulatus (Cepeda & Valencia, 2007).
Las bacterias lipolíticas identificadas en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”
fueron: Actinomyces turicensis, Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida,
Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia bercovieri, Micrococcus
lylae, Ewingella americana, Bacillus mycoides, Haemophilus actinomycetemcomitans,
Alcaligenes latus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, y
Aeromonas eucrenophila.
En un estudio realizado por González et al., (2012) acerca de la biodegradación de residuo
graso industrial empleando bacterias endógenas, se utilizó bacterias aisladas del residuo
graso industrial el mismo que era el problema a tratar, predominaron los géneros
Pseudomonas, Bacillus y Enterobacter, estos datos coinciden con los resultados obtenidos
en el presente estudio, por lo que estos microorganismos identificados podrían ser útiles en
aplicaciones en las industrias ecuatorianas con el mismo problema.
Huané & Rivera, (2014) señalan en su trabajo de “Evaluación de la adición de un inóculo
para estimular a escala de laboratorio la biodegradación de efluentes grasos” que para
biodegradar desechos de grasa de diversas fuentes, se han utilizado en varios estudios,
microorganismos como: Pseudomonas (aeruginosa), Bacillus, Acinetobacter,
Enterobacter (aerogenes), Arthrobacter sp., Burkholderia sp., Klebsiella, y
Staphylococcus, estos datos son similares a los registrados en “Santagua de Chachimbiro”.
78
Y por último, para solucionar uno de los problemas de contaminación más común a nivel
mundial como lo es el derrame de hidrocarburos en el suelo o en agua, que al final provoca
una amplia variedad de problemas ambientales, tanto a la flora como a la fauna, con una
intensidad que depende de la cantidad y del tipo de hidrocarburo derramado, se ha
propuesto y perfeccionado técnicas físicas, químicas y biológicas para remover el mayor
porcentaje del contaminante y disminuir el impacto generado tras un derrame o
acumulación progresiva (Narváez et al., 2008).
La biodegradación es considerada actualmente como la alternativa menos costosa para
transformar contaminantes presentes en diversos ecosistemas, teniendo en cuenta que gran
variedad de bacterias cuentan con la maquinaria enzimática y una gran capacidad
metabólica para transformar los compuestos xenobióticos persistentes, además de que estas
pueden ser aisladas de lugares donde haya existido una previa exposición al contaminante
(Márquez et al., 2001).
Las bacterias degradadoras de hidrocarburos son aquellas capaces de utilizar como única
fuente de carbono al hidrocarburo o derivados para realizar su proceso de biodegradación
de ambientes acuáticos o terrestres, es decir transformar una gran cantidad de hidrocarburos
en compuestos menos tóxicos al ambiente (Salleh et al., 2003; Das & Chandran, 2011)
citado en García & Aguirre (2014).
La variabilidad de especies y géneros que puedan biodegradar el petróleo, se debe a que
diferentes bacterias tienen afinidad por ciertos hidrocarburos como se ha observado en
Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., y Mycobacterium sp., las cuales degradan alcanos,
mono-aromáticos y poli-aromáticos respectivamente (Salleh et al., 2003) citado en García
& Aguirre (2014).
García & Aguirre (2014) indican que los compuestos alcanos son biodegradados por
bacterias como Acinetobacter sp., Actinomycetes., Arthrobacter, Pseudomonas sp.,
Bacillus sp., Micrococcus sp., Planococcus, Rhodococcus sp., compuestos Poli-aromáticos
en cambio por Alteromonas sp., Arthrobacter sp., Bacillus sp., Mycobacterium y
Pseudomonas sp., y por último los Mono-aromáticos son biodegradados por Ralstonia sp.,
Rhodococcus sp., y Pseudomonas sp.
En el presente trabajo, se procedió a utilizar como fuente de carbón al diésel y estas fueron
las bacterias que crecieron en el medio preparado: Aeromonas media, Aeromonas
salmonicida subsp. Salmonicida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas schubertii,
79
Yersinia bercovieri, Aeromonas caviae, Ewingella americana, Psychrobacter immobilis,
Aeromonas hydrophila, Bacillus mycoides, Haemophilus actinomycetemcomitans,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Aeromonas
eucrenophila. Coincidiendo en ciertos géneros de las bacterias identificadas en los estudios
citados anteriormente.
En el estudio de “Selección de bacterias con capacidad degradadora de hidrocarburos
aisladas a partir de sedimentos del Caribe colombiano” realizado por Narváez et al., (2008)
identificaron como bacterias degradadoras de petróleo a las siguientes: Klebsiella sp.,
Chromobacterium sp., Flavimonas oryzihabitans, Enterobacter cloacae, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus brevis, B. pumillus y B. cereus, estos resultados son similares en
cuanto a géneros de bacterias identificadas como degradadoras de derivados de petróleo
(diésel) en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”.
Tállez & Valderrama (2000) mencionan que en Long Beach (California), se aplicó
biorremediación in situ en suelos contaminados con aceite diésel mediante el uso de
microorganismos autóctonos complementada con la adición de nutrientes y oxígeno en el
suelo, bioestimulación e inoculación de una mezcla enriquecida de consorcios bacterianos
previamente extraída del mismo suelo. Esto permitió encontrar consorcios bacterianos
degradadores de hidrocarburos identificados por secuenciación de genes 16S-RNA,
demostrando la presencia de Bacillus cereus, Bacillus sphaericus, Bacillus fusiformis,
Bacillus pumilis, Acinetobacter junii, y Pseudomonas sp.
Comparando con el presente estudio se encontró similitud en especies como Bacillus
cereus y Pseudomonas sp. que son capaces de biodegradar diésel, lo que indica que las
bacterias encontradas en el balneario “Santagua de Chachimbiro” podrían ser utilizadas en
proyectos a gran escala de procesos de biorremediacion de lugares contaminados con este
derivado del petróleo.
Guzmán et al., (2016) en su trabajo realizado acerca de ensayos de biodegradación de
mezclas comerciales de diésel y biodiesel empleando bacterias degradadoras aisladas de
suelos contaminados con hidrocarburos de la Región Santa Fe, aislaron e identificaron
especies como Pseudomonas, Acinetobacter y Bacillus, las cuales son capaces de procesar,
integrar y reaccionar a una amplia variedad de condiciones cambiantes en el medio
ambiente mostrando una alta capacidad de reacción a señales físico-químicas y biológicas,
en donde los mayores porcentajes de degradación lo presentaron Pseudomonas (95,82%)
80
y Bacillus (91,83%), coincidiendo con el presente estudio realizado en ciertas bacterias
como Pseudomonas y Bacillus que tienen la propiedad enzimática de biodegradar
derivados de petróleos como lo es el diésel
En el estudio realizado en las aguas Minerales y Mineromedicinales de España realizado
por De la Rosa & Mosso, se determinaron que la mayor cantidad de bacterias identificadas
son heterótrofas oligotróficas, las mismas que no suelen fermentar los azucares pero son
proteolíticas, amilolíticas, amonificantes y en menor número celulolíticas.
Borja et al., (2012) afirman que la presencia de microorganismos con actividad amilolítica
y proteolítica en ambientes termales es alta, por eso en su estudio determinaron que el 86%
de las bacterias aisladas e identificas degradan almidón y el 43% degradan gelatina, pero
con diferentes grados de actividad.
Muchas de estas bacterias presentan un alto interés ambiental en base a sus propiedades y
más aun las que cumplen varias de estas, como es el caso de la Pseudomona aeruginosa
que según el presente estudio realizado, esta bacteria es proteolítica, celulolítica, lipolítica
y creció en un medio adaptado con diésel como fuente de carbono, así mismo pasó con
Bacillus thuringiensis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus mycoides, Ewingella
americana, Haemophilus actinomycetemcomitans, además de que estas también son
celulolíticas, estas bacterias teniendo múltiples propiedades biodegradadoras podrían ser
utilizadas en la remediación de ambientes contaminados por las múltiples industrias del
país, incluida la industria petrolera; de igual manera el género Aeromonas presentan varias
de estas propiedades.
4.6.Resistencia bacteriana de las especies identificadas
La resistencia a los antimicrobianos plantea una amenaza grave en la actualidad para la
salud pública, además de la aparición de cepas resistentes de origen ambiental, siendo un
problema creciente en el mundo, que involucra cada día nuevas especies bacterianas y
nuevos mecanismos de resistencia, aunque la vigilancia de la resistencia bacteriana se ha
realizado por lo general con microorganismos aislados de muestras clínicas, es importante
también estudiar a las bacterias aisladas de muestras ambientales a fin de conocer su posible
papel como depósito de genes codificadores de resistencia y su capacidad para transferirlas
horizontalmente a los microorganismos patógenos humanos (Junco et al., 2006).
81
El estudio de la resistencia a ciertos antibióticos de cepas aisladas de origen ambiental es
importante debido a que las consecuencias del amplio consumo de productos farmacéuticos
en la sociedad moderna, las podemos observar en las aguas residuales de las industrias, de
los hospitales y en los efluentes albañales, ya que aunque sean tratadas, los fármacos no
son removidas en su totalidad con los sistemas actuales de tratamiento, por lo que pueden
estar presentes en los efluentes de las plantas de tratamiento, en distintos cuerpos de agua
e incluso en el agua potable a muy bajas concentraciones, y además se las puede encontrar
en lodos donde han sido adsorbidos (Quesada, 2009).
Los antibióticos en el medio ambiente pueden inducir el desarrollo de resistencia
antibacteriana, lo que afectaría a la salud pública, pero sería una buena opción de
tratamiento microbiológico para las aguas contaminadas con farmacéuticos, siendo este un
tema de estudio a largo plazo.
Así lo cita Li et al., (2009) indicando que el uso de los sistemas biológicos para el
tratamiento de aguas residuales de producción de antibióticos crea un ecosistema único que
contiene muchas más concentraciones de antibióticos de lo normal en ambientes acuáticos
(Li et al., 2008), y por lo tanto puede ser un reservorio importante de bacterias resistentes
a los antibióticos.
En las aguas termales “Santagua de Chachimbiro”, se realizó un estudio de resistencia
antimicrobiana con cinco diferentes antibióticos para cada cepa aislada e identificada.
Los resultados obtenidos indican que: el 57,9% de las cepas identificadas son resistentes a
la ampicilina de 10 µg; el 42,1% es resistente a la eritromicina de 15 µg; el 89,5% de las
19 bacterias identificadas muestran resistencia a la fosfomicina de 50 µg; para la
netromicina de 30 µg ninguna bacteria revela resistencia, pero sí un 42,1% del total refleja
valor intermedio es decir un efecto terapéutico incierto; y por último se determina que tan
solo un 21,1% es resistente a sulfametoxazol trimetoprim de 25 µg.
En un estudio realizado por Romeu et al., (2010) se evaluaron tres ecosistemas de aguas
residuales provenientes de comunidades e instituciones de salud cercanas, y las cepas
encontradas presentaron mayor resistencia al antibiótico trimetoprim-sulfametoxazol con
un 22,22 % y el otro antibiótico con mayor porcentaje de resistencia es la ampicilina con
un 14%, en el presente estudio la mayor resistencia de las 19 bacterias identificadas fue a
la ampicilina de 10 µg.
82
Andersen, (1993) en el estudio de “Efectos del tratamiento de aguas residuales en la
composición de especies y resistencia a antibióticos de bacterias coliformes” registró
resistencia a la ampicilina con los niveles más altos en el sistema de tratamiento de
efluentes urbanos en Copenhague, resultados similares a los determinados en “Santagua de
Chachimbiro”.
(Li et al., 2009) en su estudio acerca del “Perfil de resistencia a antibióticos en bacterias
ambientales aisladas de aguas residuales de producción de penicilina, planta de tratamiento
y el río receptor” determinan su mayor prevalencia en la resistencia a la ampicilina de las
bacterias aisladas en ese estudio.
En la investigación del “Efecto de las aguas residuales hospitalarias sobre los patrones de
resistencia a antibióticos de Escherichia coli y Aeromonas sp.” realizada por Tzoc et al.,
(2004) se determinó que el género Aeromonas sp., es mayormente resistente a la ampicilina
con un porcentaje de 91%, pero a la eritromicina es resistente en un 100% para este género;
para la gentamicina que es similar a la netromicina por ser un derivado de esta, presenta
una resistencia del 11%; y la sulfametoxazol trimetoprim presenta una resistencia del 44%.
Comparando estos resultados con los obtenidos en el análisis de las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”, podemos observar que de las especies del género Aeromonas
también son resistentes a la Ampicilina pero un porcentaje del 83,3%, para la eritromicina
presenta una resistencia del 66,7%; en cuanto a la netromicina no presenta resistencia; y
para la sulfametoxazol trimetoprim se tiene un 33,3% de resistencia, se puede decir que no
son resultados similares pero si son valores considerables en ambos estudios.
En el estudio de “La resistencia a los antimicrobianos de especies de Bacillus asilados de
leche cruda” se aislaron 9 cepas del género Bacillus, entre ellos esta Bacillus cereus que
presento resistencia del 67% a la eritromicina, además de presentar un alto porcentaje de
susceptibilidad para la netromicina es decir no presentan resistencia a este antibiótico; con
respecto a la fosfomicina presenta una resistencia del 33% de las cepas de Bacillus cereus
aisladas; (Faria et al., 2001), mientras que en el presente estudio se encontró que la única
cepa de Bacillus cereus aislada e identificada es también resistente a la eritromicina y
fosfomicina y susceptible a la netromicina.
Gamero et al., (2007), en su estudio acerca de “Sensibilidad y resistencia de Pseudomonas
aeruginosa a los antimicrobianos”, sabiendo que la mayoría de cepas aisladas fueron de
muestras respiratorias, indican que la media de sensibilidad para fosfomicina de
83
Pseudomonas aeruginosa es de 41,4% y del 75,8% para gentamicina; en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro” la Pseudomonas aeruginosa aislada es resistente a la
ampicilina, eritromicina y sulfametoxazol trimetoprim pero susceptible para fosfomicina.
Otro estudio realizado en el Hospital general de Culiacán acerca del “Patrón de resistencia
antimicrobiana de Pseudomonas Aeruginosa” concluyó que esta bacteria fue más resistente
a sulfametoxazol con un valor de 96,3%, (Llanes et al., 2009) y en el presente estudio
Pseudomonas Aeruginosa fue resistente en un 100%.
Moraga et al., (2003) realizaron un estudio acerca de la “Resistencia a metales pesados en
bacterias aisladas de la bahía de Iquique” en donde también se analizó la resistencia a
antibióticos de 43 cepas bacterianas que la mayoría pertenecía al género Pseudomonas y
algunas al género Alcaligenes, en donde determinaron que la mayor resistencia se presentó
para la ampicilina con un 90,9%, mientras que en “Santagua de Chachimbiro” se observó
que Pseudomonas aeruginosa es resistente a la ampicilina, pero Pseudomonas
oryzihabitans y Alcaligenes latus que también fueron aisladas en el balneario son
susceptibles a este antibiótico.
Estos resultados con respecto a la cepa Pseudomonas aeruginosa aislada en el balneario en
estudio, demuestra que este al ser un lugar de uso recreativo, presenta un alto riesgo de que
sus visitantes se expongan a enfermarse por esta bacteria que ya es resistente a varios
antibióticos.
En base a que la resistencia a un antibiótico es la capacidad de una célula bacteriana de
resistir al daño que desencadena el efecto del fármaco, se puede decir que en el balneario
de “Santagua de Chachimbiro” se presenta casi un 50% de resistencia a los antibióticos
estudiados por parte de las bacterias aisladas, lo que implica que este lugar sea una reserva
de genes resistentes.
Aunque se conoce poco respecto al mecanismo y origen de los genes resistentes a los
antibióticos (GRAs) en el ambiente, el rápido ritmo de aumento de la resistencia a los
antibióticos en el entorno clínico sugiere una reserva preexistente de GRAs en los
reservorios naturales medioambientales del mundo (Nesme & Simonet, 2014).
En la actualidad es común encontrar aislamientos bacterianos tanto en el entorno clínico
como en el ambiente con diferentes niveles de resistencia tales como los multirresistentes
(MR; resistente a 2 o más antibióticos), extremadamente resistentes (XDR; resistente a 3 o
84
más antibióticos), y aún más perturbador, aislamientos pan resistentes, los cuales son
literalmente intratables con los regímenes farmacológicos actuales, incluyendo terapias
combinadas (Rocha et al., 2015).
Entonces se puede decir que Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus lylae, Aeromonas
caviae, Ewingella americana, Aeromonas eucrenophila, Alcaligenes latus, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila son multiresistentes, y
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida, Aeromonas schubertii, Psychrobacter
immobilis son extremadamente resistentes.
En cuanto a la conservación de la calidad sanitaria del lugar en estudio, se deberá realizar
un tratamiento antes de la descarga de estas aguas al rio, ya que esta puede ser fuente de
agua para consumo humano de las comunidades cercanas al balneario.
85
5. CONCLUSIONES
Se registró resultados de los parámetros medidos in situ que cumplen con lo
establecido en la Tabla 7 “Criterios de calidad de aguas con fines recreativos
mediante contacto primario” del Anexo 1 del Libro VI del TULSMA en cuanto a
pH, pero no es así para el oxígeno disuelto porque se obtuvo un valor de 3,7 mg/L
con un porcentaje de saturación de 78,1% cuando la norma establece que debe ser
mayor al 80%, la temperatura promedio del balneario es de 46,9oC cumpliendo
con lo establecido para que sea un agua termal con respecto a la temperatura
ambiente que fue de 26,1oC.
Se determinó en las aguas termales “Santagua de Chachimbiro” la presencia de
bacterias aerobias mesófilas heterótrofas, Pseudomonas, coliformes totales y
mohos y levaduras, lo que indica que la calidad sanitaria de estas aguas es baja,
pero al mismo tiempo presenta una alta diversidad microbiana con propiedades
biotecnológicas.
Se obtuvo valores promedios de bacterias aerobias mesófilas de 2,06 x 103
UFC/ml en la vertiente; de 1,73 x 102 UFC/ml en el tanque (muestra líquida); 1,13
x 103 UFC/ml en la piscina 1; en la piscina 2 se obtuvo 1,36 x 103 UFC/ml; y en
el tanque (muestra sólida) 3,63 x 102 UFC/ml, con un promedio en el balneario de
1,02 x 103 UFC/ml.
Se alcanzó valores promedios de Pseudomonas con ausencia en la vertiente y
piscina 2; 1,6 x 103 UFC/ml en el tanque (muestra líquida); 6,67 x 10 UFC/ml en
la piscina 1; y de 3,33 x 10 UFC/ml en el tanque (muestra sólida), con un promedio
en el balneario de 3,40 x 10ˆ2 UFC/ml
Se consiguió valores promedios de coliformes totales y E. coli con ausencia de E.
coli en todo el balneario y ausencia de coliformes en la vertiente; de 15 UFC/ml
en el tanque (muestra líquida); 3,83 x 10 UFC/ml en la piscina 1; 5 x 10 UFC/ml
en la piscina 2; y 1,7 x 10 UFC/ml en el tanque (muestra sólida) con un promedio
en el balneario de 2,42 x 10 UFC/ml.
Se obtuvo valores promedios de mohos y levaduras con ausencia en la vertiente;
de 1,3 UFC/ml en el tanque (muestra líquida); 7,3 UFC/ml en la piscina 1; 5,3
UFC/ml en la piscina 2; y 3,53 x 10 UFC/ml en el tanque (muestra sólida) con un
promedio en el balneario de 0,1 x 102 UFC/ml.
86
Se aisló un total de 29 cepas bacterianas de estas el 24% son Gram positivas siendo
el género Bacillus el predominante y el 76% son Gram negativas con el género
Aeromonas el de mayor predominancia.
Se identificó 19 especies bacterianas: Aeromonas media, Actinomyces turicensis,
Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida, Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas oryzihabitans, Aeromonas schubertii, Yersinia bercovieri,
Micrococcus lylae, Aeromonas caviae, Ewingella americana, Psychrobacter
immobilis, Aeromonas eucrenophila, Bacillus mycoides, Haemophilus
actinomycetemcomitans, Alcaligenes latus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus
thuringiensis, Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila.
Se registró del total de bacterias identificadas que el 89,47% son celulolíticas; el
73,68% son proteolíticas; el 84,21% son amilolíticas; el 73,68% son lipolíticas y
el 78,95 % son degradadoras de derivados de petróleo, determinando así que todas
las cepas bacterianas presentan más de dos propiedades biotecnológicas.
Se alcanzó resultados en cuanto a sensibilidad antimicrobiana que son resistentes
a la ampicilina el 57,9%; a la eritromicina el 42,1%; a la fosfomicina el 89,5% y
el 21,1% a sulfametoxazol trimetoprim.
Se comprobó que para la netromicina de 30 µg ninguna bacteria revela resistencia,
pero sí un 42,1% del total refleja valor intermedio es decir un efecto terapéutico
incierto.
Se concluye que las aguas termales de “Santagua de Chachimbiro”, presenta un
elevado contenido de bacterias multirresistentes (63%) y extremadamente
resistentes, es decir estas aguas son una reserva de genes resistentes a la mayoría
de los antibióticos estudiados, lo que pone en riesgo a los visitantes de este lugar,
sin embargo, son bacterias que pueden ocasionar enfermedades con más
frecuencia a las personas inmunodeprimidas y en el peor de los casos a personas
sanas.
87
6. RECOMENDACIONES
Tomar el presente trabajo como referencia para realizar más investigaciones
acerca del porcentaje de biodegradación de las cepas aisladas en las aguas termales
“Santagua de Chachimbiro”, para medir el grado de aplicabilidad en tratamientos
microbiológicos para la remediación de ambientes contaminados.
Las autoridades ambientales deben realizar una norma más concreta acerca de
parámetros de calidad de agua con fines recreativos, que deben cumplir
específicamente los balnearios de aguas termales, ya que presentan características
físico-químicas y microbiológicas diferentes a las piscinas de agua normal.
Realizar análisis microbiológicos con mayor frecuencia sobre todo en las piscinas
determinar el tratamiento que se les puede dar a estas antes de que sean ocupadas
por los visitantes.
En virtud de que, parte de las bacterias identificadas se encuentran en el ser
humano, establecer más normas de aseo a los visitantes antes de entrar a las
piscinas y durante el baño en la piscina y después.
Realizar un análisis tanto físico - químico como microbiológico de las aguas que
salen del balneario antes de la descarga al rio y si es necesario dar un tratamiento
para evitar posibles afectaciones a las comunidades cercanas.
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ANEXOS
108
109
Anexo A. Medios de cultivos
Medio de cultivo Características
Según su uso o utilización
Medios para aislamiento Se obtiene a partir de ellos colonias
aisladas; se dividen en: medios
enriquecidos, medios selectivos, medios
diferenciales.
Medios para crecimiento en general Está compuesto por una fuente de C, N,
sales y agua; sirven para el cultivo de la
mayor parte de las bacterias
Medios para identificación Pueden estar enriquecidos con peptona,
urea, glucosa, etc., que servirán para la
visualización del metabolismo
microbiano.
Medios para mantenimiento de cepas Suelen tener los nutrientes necesarios para
mantener la cepas vivas durante periodos
relativamente largos a temperaturas lo
suficientemente bajas
Según la composición que presenten
Medios naturales Presentan componentes orgánicos e
inorgánicos que se encuentran en la
naturaleza además pueden estar
constituidos por tejidos, líquidos
orgánicos, etc.
Medios sintéticos y semisintéticos Semisintéticos: Parte de su composición
corresponden a extractos naturales como
levadura, malta, etc., a los que se añaden
constituyentes sintéticos o químicamente
definidos.
Sintéticos: son utilizados para
aislamiento, identificación, crecimiento,
determinación, ensayo, etc.
Medios complejos Se preparan a partir de tejidos animales y
a veces de vegetal, es utilizado para
virología y parasitología.
Según su presentación
Medios deshidratados o liofilizados Se comercializan tal cual y en el
laboratorio se añade la cantidad de agua
necesaria en condiciones asépticas.
Medios sólidos en placas Petri Se utilizan para obtener cultivos puros,
ocupan una superficie lo suficientemente
grande para la visualización de colonias.
Medios sólidos en tubo Corresponden a tubos con agar inclinado
y solidificado, las siembras en este medio
110
puede ser por estrías (crecimiento aerobio)
o por picaduras (crecimiento anaerobio).
Medios líquidos en tubo No permiten visualizar colonias pero
tienen aplicaciones en pruebas
bioquímicas, realizar inóculos, etc.
Además no contienen agar.
Medios semisólidos en tubo Se siembra por picadura y se utilizan en
ciertas pruebas bioquímicas como la
prueba de movilidad, prueba de oxidación
– fermentación.
Medios de doble fase en frasco o tubo Son dos frascos constituidos por una fase
sólida y otra liquida en un mismo medio,
pueden tener un carácter aerobio o
anaerobio.
Fuente: Granados & Villaverde, (2003)
Anexo B. Fotografía sitios del muestreo
Anexo C. Fotografía de la medición de parámetros “in situ”
111
Anexo D. Dilución seriada (Domingo, 2014)
Anexo E. Resultados de prueba en Agar sangre (Hemolisis beta)
Anexo F. Resultados de prueba catalasa
112
Anexo G. Resultados de prueba oxidasa
Anexo H. Resultados de la prueba O/F
Anexo I. Agar MacConkey
113
Anexo J. Resultados de la prueba de Citrato
Anexo K. Prueba TSI
Anexo L. Prueba SIM
Anexo M. Prueba de Coagulasa
114
Anexo N. Prueba de ureasa
Anexo O. Hidrolisis de gelatina
