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Universidad de Colima
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO
LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS HSP EN LINFOCITOS CAPRINOS SUJETOS
A ESTRÉS CALÓRICO
TESIS
QUE PRESENTA:
Jesús Heraclio del Río Martínez
PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTOR EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN HERENCIA Y ADAPTACIÓN ANIMAL
TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO. SEPTIEMBRE DE 1999.
MC. JESUS HERACLIO DEL RIO MARTINEZ ALUMNO DEL POSGRADO DE LA FCBA PRESENTE
En base a los dictámenes emitidos por el cuerpo académico de la
Facultad y los asesores externos a su tesis titulada “SÍNTESIS DE PROTEÍNAS
HSP EN LINFOCITOS CAPRINOS SUJETOS A ESTRÉS CALÓRICO”, me
permito informar a usted, que habiendo cumplido el documento con los
requisitos académicos de forma y fondo, se autoriza la impresión de misma para
ser presentada ante un jurado, con el fin de obtener el título de DOCTOR EN
BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA, en la línea de investigación “Herencia y
Adaptación Animal”.
Dicho trabajo fue realizado bajo la dirección de los Doctores Miguel
Arenas Vargas, Fausto Sánchez y García Figueroa, Antonio Flores Díaz, Héctor
González Cereso, Judith Licea de Arenas y Luis Felipe Bojalil Jaber.
Carretera Jiquilpan-Manzanillo, km 260 / Tecomán, Colima, 28100, A.P. 35 / Telefax 01 (332) 4 42 37, 4 46 42 E-mail; [email protected].
Esta tesis fue realizada bajo la dirección de los Doctores Miguel Arenas Vargas, Fausto
Sánchez y García Figueroa, Antonio Flores Díaz, Héctor González Cereso, Judith Licea de
Arenas y Luis Felipe Bojalil Jaber, la cual ha sido aprobada y aceptada por los mismos para
presentarse como requisito parcial para obtener el grado de:
DOCTOR EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
i
AGRADECIMIENTOS
Durante el tiempo transcurrido en este posgrado hubo muchas personas e instituciones que me
brindaron su ayuda moral, material, económica e intelectual, por lo que deseo expresarles mi
agradecimiento infinito.
A la Universidad de Colima y la Universidad Autónoma Metropolitana por permitir la
existencia del programa de Posgrado de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias.
Particularmente al inmejorable cuerpo de asesores conformado por la Doctora Judith Licea de
Arenas, Dr. Miguel Arenas Vargas, Dr. Luis Felipe Bojalil Jaber, Dr. Antonio Flores Díaz, Dr.
Héctor González Cereso y Dr. Fausto Sánchez y García Figueroa, paradigmas de sabiduría,
respeto, prudencia, trabajo y honestidad, quienes con sus preguntas, comentarios y
observaciones estimularon en mí la necesidad de aprender a aprender.
Al Ingeniero Lorenzo Hernández Arreguín, Secretario de Desarrollo Rural del Estado de
Colima, por su amistad y constante apoyo al programa.
A la Universidad Autónoma Agraria “Antonio Narro”, por permitirme estudiar y continuar
con mi trabajo. Un reconocimiento especial al Ingeniero Eduardo Fuentes Rodríguez, al
Doctor Enrique Navarro, ex-Rector y Rector, al Ingeniero Héctor Manuel Estrada Flores al M.
en C. Jorge Iturbide Ramírez y a los Médicos Veterinarios Zootecnistas, Gilberto Jiménez
Frías y Alfonso Amaya González, por su apoyo incondicional como Director Regional,
Coordinador de División, ex-Jefe y Jefe del Departamento de Ciencias Médico Veterinarias.
A la Asociación Nacional de Universidades e Institutos de Educación Superior, por la beca
SUPERA que me otorgó durante un año.
ii
Al Centro Regional de Estudios Nucleares (CREN) de la Universidad Autónoma de Zacatecas,
por el apoyo logístico para el trabajo experimental. Un reconocimiento especial al Médico
Eduardo Manzanares Acuña, al Dr. Sergio Hugo Sánchez, al M. en C. Rómulo Bañuelos y a la
Q.F.B. Consuelo Letechipía de León.
Al Instituto Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey, Campus Laguna, por su apoyo
informático. En especial doy las gracias al Ingeniero Jesús Gilberto Sánchez Flores, Director
Administrativo del Campus y a la Maestra María Asunción del Río de Sánchez por su
invaluable orientación en la redacción del documento.
A los funcionarios y personal de campo del Centro Caprino de Tlahualilo Durango por las
facilidades otorgadas para el trabajo experimental.
Al Centro de Investigación Biomédica (CIB) de la Facultad de Medicina de la Universidad
Autónoma de Coahuila, especialmente al la M. en C. María Elena Cortéz de Pacheco, por su
valioso apoyo.
Al M. en C. Raúl Mejía Alfaro Jefe Centro de Investigaciones en Biología Molecular de la
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo y a su atento personal por su apoyo en el
proceso de medición.
A la Doctora Herminia Martínez Rodríguez y el personal del Centro de Investigación en
Ingeniería y Expresión Genética, de la Universidad Autónoma de Nuevo León, así como a la
Doctora Lourdes Garza Ocañas del Laboratorio de Toxicología y Farmacología de la Facultad
de Medicina de dicha universidad, por las facilidades que me brindaron para prepararme en la
obtención y cultivo especímenes celulares en laboratorio.
iii
Al Maestro Francisco Ponce Jefe de la Biblioteca de la FMVZ de la UNAM; a la Bióloga
Felisa Herrador de la Paz, Jefa de la Biblioteca del Instituto de Ecología A.C.; a Leticia y
Graciela de la Biblioteca del Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas; al personal
de la Biblio-hemeroteca del Hospital de Especialidades # 71 del IMSS, por su invaluable
apoyo.
A la familia Lemus Vergara: Martha, Sebastian, Tzitziki y Atziri, modelos de solidaridad y
compañerismo.
A mis compañeros y amigos del posgrado, quienes me enseñaron el valor de una masa crítica
y la necesidad de pedir y dar opiniones informadas: Carlos Morán Rodríguez, Raúl Villegas
Vizcaíno, Rafael Rodríguez Martínez, Pedro Antonio Robles Trillo, José Luis Corona Medina,
Gerardo Arellano Rodríguez, Alejandro Moreno Resendez, Ernesto Martínez Aranda, Eduardo
Blanco, Jesús Quezada Aguirre, Martín González, Jesús Gilberto Salmón, Martha Mendoza,
Martha Elba Gutiérrez, Mario Orozco, Augusta Trujillo, Ramiro Ruíz, Raymundo Díaz,
Ernestina Gutierrez, Aureliano Caratachea, Oneida, Reynalda Guzmán, Thomas Elton Ford,
Juan Manuel Miramontes, Javier Ibarra, José Luis López, Luis Román Castañeda V., Miguel
Ángel Salas, Pedro Moreno Zacarías, Ezequiel González y a quien mi ingarta memoria haya
omitido. En una palabra, a todos aquellos quienes, con una actitud de solidaridad,
contribuyeron a mi formación.
Gracias
iv
DEDICATORIA
“Cogitate humo ad eius potentiam non reditur”
Con amor y respeto a la memoria de mi padre, Luis Felipe del Río Rodríguez.
A mi tía Licha, quien ya se fue, no sin antes cultivar en mi el amor por la Biología.
A mi esposa Claudia Fidela y a mis hijas Claudia Lucía y Diana Cecilia por su amor y
paciencia.
A mi madre, doña Queta, mi tía Tota y mis hermanos por su confianza, cariño y constante
aliento.
A la familia Valdés Valdés por su apoyo incondicional.
Al Doctor Miguel Arenas Vargas, amigo y consejero, quien se ha dado todo en su lucha
incansable en pro de la educación científica de nuestro país.
v
LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS HSP EN LINFOCITOS CAPRINOS SUJETOS A ESTRÉS
CALÓRICO.
RESUMEN
En linfocitos caprinos se evaluó la respuesta celular al choque calórico inducida in vitro para
definir si esta tenía un componente genético o epigenético, y se determinó el tiempo de
respuesta así como el tipo particular de Hsp sintetizada. Los linfocitos se obtuvieron de cabras
de dos razas habitantes de una zona árida calurosa, con experiencia reciente en su historia de
vida a choque calórico ambiental; y de otras dos razas habitantes de una zona árida templada,
sin la experiencia citada. Después de marcarlos con 35S y de sujetarlos a estrés calórico (3 h, a
temperaturas 5, 10 y 15% superior a la temperatura fisiológica interna de la especie), se
determinó su termosensibilidad de acuerdo con su supervivencia, estimada con la tinción
citotóxica de exclusión con azul de tripano al 0.4%. Se obtuvieron extractos celulares de cada
tratamiento en los que se identificó la clase de Hsp sintetizada mediante inmunoidetección con
anticuerpos monoclonales (Western blot). Se obtuvieron autorradiografias y por
densintometría se compararon los grupos. Los resultados fueron analizados estadísticamente
con el Modelo Lineal General (GLM) que incluyó los efectos principales de la raza, la
temperatura del tratamiento y la interacción de ambos efectos. Hubo diferencias altamente
significativas atribuibles al tratamiento (P< 0.00l), no así entre las razas, tampoco hubo efecto
de la interacción de la raza con la temperatura de incubación (P>0.05). Los valores de
supervivencia fueron mayores en la condición árida templada en comparación con los de la
condición árida calurosa, pero el umbral de mortalidad fue menor en la primera (42°C)
respecto a la segunda (44°C). Solo resultó positiva la identificación de la Hsp70. La
vi
comparación densitométrica de las bandas de Hsp70 sintetizadas de novo, obtenidas a partir de
los extractos celulares marcados con 35S de los diferentes tratamientos, no resultó significativa.
Los resultados permitieron inferir que 1) la síntesis de Hsp70 fue inmediata, posiblemente
debido a la existencia de termotolerancia inducida naturalmente; 2) el factor genético de la
raza no influyó en la termosensibilidad o en la inducción diferencial de las Hsp; 3) cuando los
animales están expuestos a condiciones de adversidad térmica climática se puede inducir la
termotolerancia. 4) el linfocito caprino responde al estrés de mediana intensidad (42°C)
sintetizando Hsp70. 5) Al encontrar diferencias significativas en la termosensibilidad y no la
síntesis de Hsp debido a la temperatura de cultivo, se sugiere la intervención de otros factores
citoprotectores.
Palabras clave: aclimatación, adaptación, respuesta celular al estrés, termotolerancia
chaperonas moleculares, Hsp70, choque calórico, estrés calórico, resistencia a la temperatura.
vii
HSP PROTEIN SYNTHESIS IN LYMPHOCYTES UNDER HEAT SHOCK IN GOATS
SUMMARY
Cellular response of goat’s lymphocytes to induced in vitro heat shock, was studied to
differentiate between genetic and epigenetic factors. Response time as well as the particular
Hsp synthesized. Lymphocytes were obtained from two races from a hot-arid zone (HAZ), and
two from a warm-arid zone (WAZ). Only the first two had a recent life history of
environmental heat shock. Lymphocyte survival to heat shock was determined with Trypan
blue dye 0.4 % after adding 35S and exposing them to heat shock (3 h at temperatures 5,10, and
15% higher to normal body temperature ). Synthesized Hsp was identified by Western blot
immunodetection of monoclonal antibodies in cellular extract. Groups were compared by
using radiographic fílms and optical densitometry. Statistical analysis was done using GLM
including genotype, temperature regime and interaction effects. Only the temperature effect
was signifícative (P<0.00l). Survival was higher in WAZ, but the mortality threshold was
smaller in these zone (42°C) than in HAZ (44°C). Only Hsp 70 was identitied. There were no
differences in the leve1 of Hsp 70 synthesized between HAZ and WAZ groups. Results
suggest that 1) Hsp synthesis was immediate, 2) thermosensibility and Hsp synthesis was not
affected by race, 3) lymphocytes from HAZ animals showed termotolerance due to their life
history of heat exposition, 4) goats’ lymphocytes respond to middle heath-shock (42°C)
synthesizing Hsp70, 5) Differences in mortality but not in Hsp70 synthesis suggest other heat-
protecting factors.
Keywords: acclimation, adaptation, cellular response to stress, termotolerance, molecular
chaperones, Hsp70, heat shock, heat stress, temperature resistance.
viii
PREFACIO
La ciencia representa una parte importante de la infraestructura necesaria para el progreso
económico, tecnológico, educativo y cultural de la sociedad, y el contar con investigadores es
una condición básica para su realización y desarrollo.
Para John Ziman (1980, 1985) los científicos constituyen un personal de alto nivel cuya
formación tarda muchos años, tiempo durante el cual el aprendiz construye sus conceptos
siguiendo un proceso de búsqueda, selección, acopio y procesamiento de la información
científica necesaria para delimitar la frontera del conocimiento, en la que identifique las
preguntas científicas y juzgue críticamente su valor actual y potencial. Finalmente, para
transformar la realidad y ensanchar la frontera de tal conocimiento, debe de construir una
propia y abordarla experimentalmente.
En el proceso de la formación de científicos también es importante el contacto directo con la
investigación, su interacción con otros científicos a través de la discusión informada, las
condiciones sociales en que se realice la actividad científica y los aspectos de carácter
personal.
En el programa de posgrado en el que tuve el privilegio de formarme, al aprendiz:
l Se le exige que participe integralmente en su trabajo de investigación, desde su
planeación hasta la interpretación de los resultados generados.
l Se estimula su interacción con otros científicos, particularmente mediante el proceso
de identificación de los colegios invisibles y el contacto con sus pares, para que
adquieran una perspectiva específica de su campo y logren adentrarse en el
paradigma (conceptos, teorías y métodos) de la disciplina escogida.
ix
l Con el fin de proporcionarle una perspectiva científica global, el programa también
promueve el diálogo y la discusión de los problemas de disciplinas ajenas y de
aspectos genéricos de la ciencia.
l Admitiendo que la sociedad constituye el contexto donde se desarrolla y toma
sentido la actividad científica, y con el fin de ubicar los problemas científicos de
vanguardia internacional y vincularlos con el propio contexto, en las siempre
fructíferas reuniones de socialización, invariablemente se da un lugar a la discusión
de los problemas nacionales de competencia para las áreas del posgrado.
l En cuanto a los aspectos personales, el programa tiene un respeto absoluto por su
motivación y le estimula para que desarrolle los atributos de constancia, disciplina,
persistencia, planeación y verificación, además de cultivar los atributos que le
permitan alcanzar la madurez para resistir el fracaso y aceptar la critica, así como
para saber formularla con objetividad.
Finalmente, un atributo que se desarrolla en el programa y que merece mención especial es el
de la posición que se adquiere ante la información, ya que, para la formación y el ejercicio del
juicio crítico esencial en el científico, éste debe reconocer las fuentes de información y los
criterios que tasan su calidad, establecen sus categorías, formatos y usos, así como la ideología
que las soporta.
Esta tesis que se presenta como evidencia documental para evaluar el grado en que se
adquirieron estos atributos. Se tomó como objeto de estudio la adaptación animal a uno de los
problemas puntuales de la aridez: el calor extremo. En particular, se evaluó a escala molecular,
la respuesta celular al estrés por calor y su naturaleza. Para ello se midieron la
termosensibilidad celular expresada en la capacidad de supervivencia posterior al estrés y la
síntesis de las proteínas de estrés de 70 kDa, Hsp70. Se discutió desde los puntos de vista
fisiológico, evolutivo y ecológico, sobre el valor de la inducción de la síntesis de Hsp70 como
un mecanismo molecular de adaptación para soportar temperaturas ambientales por encima de
x
la zona termoneutral. Se discutió sobre el componente epigenético de esta respuesta en los
linfocitos caprinos
Este trabajo se fundamente en el hecho de que, entre los seres vivos los endotermos son
aquellos que han evolucionado de tal forma que consiguen mantener un equilibrio térmico con
su medio ambiente, ajustando la pérdida y la ganancia de calor, que se refleja en una
temperatura interna relativamente estable. Los animales domésticos y el hombre pertenecen a
esta categoría de organismos y sus cualidades endotérmicas han sido diseñadas de acuerdo al
contexto ecológico en el que han evolucionado, de modo que, mientras algunos organismos
que viven en un medio ambiente frío han afinado sus cualidades para conservar el calor en sus
cuerpos, los que viven en lugares tórridos han desarrollado estrategias que les permiten
deshacerse del calor excedente con un mínimo gasto de energía.
En ambos casos, estos atributos dan como resultado un medio interno relativamente estable,
casi independiente de las variaciones térmicas que tienen que soportar las células de un
organismo ectotermo primitivo evolutivamente. Sin embargo, surgen preguntas: ¿En que
medida se conserva en las células de los endotermos su capacidad de responder a las
variaciones térmicas en su ambiente inmediato?; ¿podrá el hábitat en donde vive el organismo
completo influir su respuesta celular al estrés por calor?; ¿podrá el linaje del organismo -que
se manifiesta en diferencias fenotípicas de importancia termorreguladora- influir la respuesta
celular al estrés calórico?
En el ámbito celular, la hipertermia tiene consecuencias que alteran la estructura
tridimensional de las proteínas, afectando sus funciones y comprometiendo la supervivencia
celular; sin embargo, durante el largo camino de la evolución, los seres vivos han desarrollado
xi
mecanismos de prevención y reparación de los daños estructurales ocasionados por factores
ambientales tales como la hipertermia.
Desde el inicio mismo de la vida, hace más de 3,800 millones de años, los primeros seres
vivos diseñaron un conjunto de proteínas que cumplen esta función y que se han conservado
hasta nuestros días en prácticamente todos sus descendientes: microorganismos, plantas y
animales, variando entre ellos solamente en el nivel de su síntesis. Estas proteínas reciben
colectivamente el nombre de chaperonas moleculares, proteínas de estrés o proteínas de
choque calórico (Hsp).
De las Hsp que se sintetizan para soportar la hipertermia, la familia de 70 kDa parece ser la
más importante. Consecuentemente, se espera que aquellos seres que vivan bajo condiciones
ambientales en las que el calor actúe continuamente como un factor estresante, sinteticen estas
proteínas protectoras con más prontitud y en mayor cantidad, que aquellos cuyo medio
ambiente no tenga al calor como uno de sus principales estresores.
xii
CONTENIDO
Agradecimientos I
Dedicatoria IV
Summary VII
Resumen V
Prefacio VIII
Lista de cuadros XIV
1 INTRODUCCIÓN 14
2 REVISIÓN DE LITERATURA 17
2.1 Adaptación, filogénesis y metabolismo en los seres vivos 17
2.2 La plasticidad como respuesta de adaptación al ambiente. 22
2.3 El estrés como respuesta a los cambios ambientales 30
2.3.1 El estrés en el ámbito celular 31
2.4 Efectos del estrés calórico sobre el metabolismo de las proteínas. 35
2.4.1 Proteínas, estructura y función 36
2.5 La respuesta celular al choque calórico y las chaperonas moleculares 42
2.5.1 Funciones generales de las chaperonas moleculares 43
2.5.2 Características esenciales de las chaperonas 45
2.5.3 Regulación de la síntesis de Hsp 46
2.5.4 Principales familias 48
2.5.5 Las acciones asistidas por las chaperonas 62
2.6 La termotolerancia como respuesta de aclimatación 74
3 MATERIALES Y MÉTODOS 79
3.1 El lugar de experimentación 79
xiii
3.2 Los especímenes y su ambiente 79
3.3 Equipo y materiales de laboratorio 81
3.4 Aislamiento de los linfocitos 85
3.5 Estimación de la viabilidad celular 88
3.6 Marca radioactiva 89
3.7 Incubación de los linfocitos testigos y bajo estrés calórico 90
3.8 Lisis de los linfocitos y recuperación de los extractos celulares 92
purificados
3.9 Cuantificación de proteínas totales usando el método de bradford 94
3.10 Electroforesis de las proteínas presentes en los extractos celulares 96
3.10.1 Procedimiento 98
3.11 Transferencia a papel de nitrocelulosa 106
3.12 Inmunodetección 109
3.12.1 Análisis de western blot 110
3.13 Tratamiento estadístico 115
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 117
4.1 Supervivencia celular 117
4.2 Densitometría 118
5 CONCLUSIONES 150
6 LITERATURA CITADA 152
xiv
LISTA DE CUADROS
1 Fenotipos de eucariotas multicelulares, y las células y tejidos que ellos 50
comprenden, para los cuales las Hsp son necesarias y/o suficientes.
2 Proteínas Hsp70, DnaJ homólogas identificadas en eucariotas. 57
3 Proteínas interactuantes con las de choque calórico requeridas para el 60
transporte y doblaje de proteínas en Sacharomyces spp.
4 Equipo usado en el laboratorio. 82
5 Accesorios, consumibles e instrumentos diversos. 83
6 Reactivos. 84
7 Formulación de la solución bufferada fosfatada PBS (1 L). 92
8 Procedimiento para hacer la curva de calibración. 96
9 Gel de poliacrilamida-bis (para ambas cámaras). 101
10 Fórmula del buffer de muestra 2X. 104
11 Buffer de corrida. 104
12 Materiales para el lavado de las membranas de nitrocelulosa. 113
13 Efecto de la temperatura de incubación (3 h) sobre el porcentaje de 117
supervivencia de los linfocitos de cuatro genotipos caprinos.
14 Efecto de la temperatura de incubación sobre la síntesis de proteínas de 70 119
kDa, inferida mediante Western blot en los especímenes de CAT.
14
1 INTRODUCCIÓN
Organismos tan diversos como las bacterias, los animales y las plantas responden a las
temperaturas elevadas y a otros estresores químicos y fisiológicos sintetizando un grupo de
polipéptidos referidos colectivamente como proteínas de choque calórico (Hsp). Estas
proteínas son ubicuas1, se expresan en una respuesta genéticamente programada y están muy
conservadas filogenéticamente2, lo que sugiere una función ancestral esencial para la
supervivencia a lo largo de la evolución (Pelham, 1986; Zeilstra-Ryalls et al., 1991; Gupta y
Golding, 1993; Parsell y Lindquist, 1993; Sanders, 1993; Hartl et al., 1994; Morimoto et al.,
1994; Parsell et al., 1994; Wu, 1995; Buchner, 1996).
Inicialmente las Hsp se reconocieron porque su síntesis se incrementa después de que las
células son expuestas a temperaturas elevadas, dilucidándose molecularmente, la naturaleza
del RNA y de las proteínas inducidas que condujeron al aislamiento y caracterización de los
genes hsp y de los factores de transcripción del choque calórico (HSF) (Ritossa, 1962;
Lindquist, 1986; Lindquist y Craig 1988;, Langer y Newpert, 1991).
En la célula, aun bajo las condiciones normales de crecimiento se sintetizan muchos de los
miembros de la familia de las Hsp, que se acumulan abundantemente como proteínas
constitutivas o cognates (Hsc). Se ha revelado que muchas de las Hsp tienen funciones
esenciales en el doblamiento de las proteínas, actuando como chaperonas moleculares (Ellis,
1987; Ellis y van der Vies, 1991; Gething y Sambrook, 1992; Hendrick y Hartl, 1993;
________________________ 1 Para este trabajo el término se refiere a la ubicuidad de las proteínas Hsp, es decir su omnipresencia en prácticamente todas las células conocidas. 2 Aunque las proteínas Hsp aparecieron con los albores de la vida. no han dejado de ser moléculas indispensables para la vida a través de la evolución. manteniendo actualmente su importancia.
15
Horwich et al., 1993; Parsell y Lindquist, 1993; Jakob y Buchner, 1994; Kelley y Landry,
1994; Glick, 1995). Estas moléculas apoyan numerosos aspectos de la homeostasis de las
proteínas, como el doblamiento y ensamblaje de las cadenas polipéptidas recientemente
sintetizadas, la reparación o degradación de las proteínas dañadas, la disolución de los
agregados insolubles; asimismo participan en el señalamiento intracelular mediante acciones
moleculares (Rutherford y Zuker, 1994; Waldmann et al., 1995).
La relación de los organismos con la temperatura ha sido históricamente una de las áreas de
estudio más activas en la fisiología comparativa y medioambiental. La experimentación ha
evolucionado, desde la descripción de los efectos de la temperatura sobre el organismo como
un todo, hacia el caracterizar los mecanismos bioquímicos y moleculares que ayudan a
establecer la sensibilidad térmica, los límites óptimos y de tolerancia de las diferentes especies
adaptadas, así como de las diversas poblaciones aclimatadas o aclimatizadas dentro de una
misma especie. Dentro de los diversos mecanismos estudiados, están los cambios evolutivos y
aclimatadores en las proteínas enzimáticas y estructurales de la célula (Somero, 1995).
Los organismos mesofilos mueren con rapidez si al estar creciendo a temperaturas normales
cambian súbitamente a temperaturas severas. Sin embargo, si previame nte se les da un
tratamiento breve a una temperatura más moderada que induzca la síntesis de Hsp, y
posteriormente experimentan las temperaturas severas, sobreviven por más tiempo, ya que las
Hsp conducen al desarrollo de un fenómeno denominado termotolerancia, en el cual, la
experiencia de una exposición primaria a temperaturas subletales, permite a los organismos
sobrevivir a una exposición posterior a temperaturas que de otra forma serían letales (Parsell et
al., 1993).
16
En las últimas dos décadas, el estudio de los diversos mecanismos moleculares de adaptación
de los seres vivos a las temperaturas elevadas ha sido un tópico de interés creciente en la
literatura científica. Sin embargo, la participación de científicos mexicanos en estos estudios
ha sido muy escasa, no obstante ser México un país predominantemente árido y caluroso, en
donde la adaptación de los animales al calor, a la radiación solar intensa y a la privación del
agua son elementos indispensables para aprovechar los recursos naturales disponibles para la
producción agropecuaria.
El propósito primordial de este trabajo fue el evaluar la respuesta celular al estrés calórico, el
grado en que en ella participan el componente genético y el epigenético, así como la síntesis
de las proteínas de choque calórico de 70 kDa (Hsp70) como posibles indicadores de
adaptación, en un modelo biológico particular: el linfocito, utilizando para ello los obtenidos
del caprino, una de las especies domésticas que exhibe mayor plasticidad fenotípica y que vive
en una condición de mayor contacto con la naturaleza, dada la mínima interferencia humana
en esta relación.
17
2 REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Adaptación, filogénesis y metabolismo en los seres vivos
La adaptación es un término técnico que aún permanece sin definirse y el hacerlo requiere de
una gran digresión. Para Brandon (1996) la palabra adaptación puede usarse para referirse a
un proceso y frecuentemente se usa en un contexto biológico. Este proceso puede identificarse
de manera sensible con la evolución y la selección natural y es por él que las poblaciones
cambian en respuesta a los cambios ambientales.
El concepto fundamental de la teoría neo-Daxwiniana es la adaptación relativa, en la cual un
organismo está mejor adaptado que otro (originario de la misma población que se entre cruza)
a un medio ambiente particular (Brandon, 1996).
El concepto de adaptación se encuentra inmerso en el proceso de evolución, que para Mayr
(1997) no se refiere tan sólo el cambio en la frecuencia génica, sino la conservación o el
mejoramiento de la capacidad de adaptación, y el origen de la diversidad. Los cambios en la
frecuencia génica son el resultado, no la causa de la evolución. El resultado de la continua
selección es la adaptación de los organismos.
Filogenesis
Los taxa nominan entidades, generalmente grupos de organismos. Bajo una interpretación
tradicional, los organismos que pertenecen a un taxón poseen ciertos caracteres o rasgos
organísmicos. En contraste, en la taxonomía filogenética, los taxa son entidades históricas que
resultan de un proceso evolutivo de descendencia común. Esto implica que los taxa son
composiciones completas o sistemas compuestos, a un nivel organizacional de organismos y
18
de sus partes componentes. Por lo tanto, los organismos son partes de un taxón, no porque
posean ciertos caracteres, sino por sus relaciones fílogenéticas particulares (de Queiroz y
Gauthier, 1992).
La biología evolutiva se fundamenta en el concepto de que los organismos comparten un
origen común y subsecuentemente han divergido a través del tiempo. La filogénesis por su
parte, representa los intentos por reconstruir esta historia evolutiva (Huelsenbeck y Rannala,
1997).
En 1866 Ernst Haeckel acuñó el término “fílogenia” y publicó una colección de árboles
filogenéticos detallados que representaban mucho de lo que se conocía de la historia evolutiva
de la vida (Hills, 1997). Actualmente, la acumulación de nuevos datos filogenéticos generados
gracias a la biología molecular, se ha visto favorecida por el desarrollo de métodos explícitos y
objetivos de inferencia filogenética y por el desarrollo de equipos y programas
computacionales en la tarea de aplicar estos métodos a los nuevos datos (Fink, 1986; Monson,
1996; Hills, 1997; Maley y Marshall, 1998).
Se ha propuesto que los organismos en este planeta descienden de ancestros comunes, tal vez,
incluso, de un mismo ancestro común, ya que las características biológicas generales, como
por ejemplo el uso del DNA como un material genético; la estructura química de las
membranas en las células eucariotas, y las respuestas dadas por los mamiferos a los cambios
en la temperatura medioambiental, parecen estar ocurriendo en un patrón filogenético,
estrictamente jerárquico (Garland y Carter, 1994).
En la evolución de los mecanismos del desarrollo, una vez que la naturaleza descubre un juego
de moléculas capaces de actuar como señales o enzimas, las conserva si éstas son eficientes
19
(Wolpert y Brown, 1995). Kobayashi (1980) ofrece un ejemplo claro al observar que, cuando
los animales desplegaron sus actividades locomotoras e incrementaron sus demandas
energéticas, no diseñaron rutas químicas completamente diferentes a las prevalecientes en las
formas ancestrales, las cuales conservaron; en cambio, para satisfacer las nuevas demandas,
desarrollaron sistemas que estimularon una producción de energía más activa. Este proceso
desarrolló el sistema endocrino metabólico y sus órganos blanco.
Para Brenner (1994) el rasgo característico de los sistemas biológicos contemporáneos es el
uso de dos lenguajes químicos:
1. La función está escrita en el “alfabeto” de veinte aminoácidos de las proteínas.
2. La información se inscribe utilizando sólo cuatro “letras” nucleótidas en secuencias
que integran juegos de tres letras, denominadas codones.
Además, nos indica que la traducción del lenguaje genético al funcional se realiza por una
maquinaria molecular compleja:
1. Se hace una transcripción del gen en RNA mensajero (mRNA).
2. Este mRNA se traduce en la proteína mediante moléculas complementarias de otro
tipo de RNA específico para cada codón, llamado RNA de transferencia (tRNA), que
transporta los aminoácidos correspondientes.
3. Los ribosomas unen a todos los componentes y catalizan la formación de enlaces
peptídicos.
Muchos virus contienen genomas de RNA, pueden ser replicados directamente y, en algunos
casos, a través de un ciclo que involucra su conversión en DNA (Brenner, 1994).
En los organismos superiores con genomas interrumpidos por intrones (DNA no codificado)
hay nuevamente una maquinaria elaborada para unir esas salidas del mensaje (Brenner, 1994).
20
En forma original, ¿cómo hicieron para surgir todos ellos? Por mucho tiempo se ha aceptado,
que el sistema contemporáneo de codificación probablemente no haya sido el primero, por lo
cual puede estar remplazando a un sistema preexistente que tuviera un lenguaje químico
unitario para permitir evolucionar en una sola molécula la catálisis y la replicación de la
información genética (Brenner, 1994)
De esta manera, existen distintas teorías: algunas plantean que las proteínas vinieron primero y
hubo alguna forma de copiar los aminoácidos; otras en cambio, señalan como las primeras
moléculas a los ácidos nucleicos, en particular al RNA quien debió de tener funciones
catalíticas (Brenner, 1994).
Black (1983), coincide con lo ya señalado por Kobayashi (1980) y posteriormente corroborado
por Wolpert y Brown (1995), al considerar que durante la evolución a partir de la célula
procariota, las vías bioquímicas básicas del metabolismo han permanecido esencialmente sin
cambio, y propone que la vida comenzó con la estabilización de tres sistemas interactuantes:
l Los ácidos nucleicos para la replicación,
l La fotosíntesis o la quimiosíntesis para atrapar energía, y
l Un sistema de proteínas especializadas: las enzimas, para catalizar los dos procesos y
formar estructuras.
Además, advierte, una vez estabilizado el sistema, cualquier mutación que lo modificara
fuertemente debía ser letal y más aún, sostiene que las adaptaciones evolutivas se han dado en
la forma de adiciones al sistema y de modificaciones a su regulación.
Por consiguiente, si se pretende estudiar el proceso de la adaptación, es importante tomar en
consideración algunos eventos cruciales en la historia del planeta, que para los seres vivos, han
21
representado retos a los cuales tuvieron que adaptarse morfológica, fisiológica y
conductualmente para sobrevivir y así, mediante un proceso de selección natural, dar origen a
las especies actuales.
Análisis filogenéticos
Se ha intentado documentar la magnitud de las causas de la variación fisiológica entre los
individuos dentro de las poblaciones y si estas variaciones individuales tienen alguna
correlación con el comportamiento, con los rasgos de la historia de vida o la ecología (Garland
y Carter, 1994).
Para los estudios biológicos comparativos, los análisis filogenéticos moleculares juegan un
papel clave (Hills, 1997) ya que con ellos es posible:
Probar la importancia adaptativa de la variación enzimática y conducir el debate concerniente
al control del metabolismo (Pierce y Crawford, 1997).
Entender la organización y la evolución de los genes y los genomas, usando como herramienta
interpretativa el análisis filogenético de las secuencias moleculares (Hills, 1997).
Determinar la importancia macroevolutiva de la química de las plantas sobre los cambios en
los herbívoros huésped, para entender la evolución de las interacciones insecto-planta
(Becerra, 1997).
Interpretar cualquier sistema co-evolutivo, tal como las interacciones huésped-parásito y las
interacciones simbióticas a largo plazo (Hills, 1997).
Reconstruir el estudio de la evolución del comportamiento (Hills, 1997)
22
Morfología y función en los animales
Dos principios simplificadores de la biología son aquellos que podemos denominar “el
principio de la redundancia” y “el principio de la diversidad”. La madre naturaleza sigue el
principio de la redundancia para seleccionar un mecanismo o módulo simple, como un bloque
de construcción para un sistema complejo y entonces usar una y otra vez el módulo en otros
sistemas. Por otra parte, el principio de la diversidad utiliza el concepto de que hay muchas
maneras de alcanzar la misma meta (Koshland Jr., 1993)
Independientemente de cual estrategia se siga, el proceso de diseño jamás termina. La
naturaleza no inicia un diseño completamente nuevo, sino que siempre parte de uno anterior
exitoso, que modifica y refina en cada generación; trabaja con lentitud, pero con una infinita
creatividad, usando como laboratorio de pruebas la lucha por la supervivencia y teniendo
como premio que corona el éxito la reproducción, ya que no tendría caso alcanzar el mejor
diseño si éste no pudiera transmitirse a las generaciones futuras.
Consecuentemente, cada detalle estructural y funcional de un organismo, ha sido creado para
responder con la mayor eficiencia a algún reto ambiental particular, que haya presionado a sus
ascendientes durante su desarrollo filogenético.
2.2 La plasticidad como respuesta de adaptación al ambiente.
La extensión en la cual el medio ambiente modifica al fenotipo se denomina “plasticidad
fenotípica” (Via y Lande, 1985). Para Nylin y Gotthard (1998), el término plasticidad
fenotípica se refiere a los casos cuando, durante la ontogenia, un solo genotipo puede producir
genotipos alternativos, dependiendo del medio ambiente. Schlichting (1986) la describe como
una habilidad del individuo para alterar su morfología y/o fisiología en respuesta a los cambios
23
ambientales y dado que esta respuesta puede facilitar la explotación de algunos ambientes y el
protegerse de otros, el nivel de plasticidad en un rasgo dado se da a través del modelo de
selección (Via y Lande, 1985). Sin embargo, aunque la plasticidad puede ser adaptativa,
también puede ser no adaptativa (Nylin y Gotthard, 1998).
Aunque la respuesta de plasticidad fenotípica sea interesante en y de sí, estrictamente como un
fenómeno del desarrollo, su utilidad como una herramienta adaptativa puede enfocarse
claramente (Schlichting, 1986).
La plasticidad parece proveer de una maravillosa manera de adaptar el fenotipo (Nylin y
Gotthard, 1998). Las respuestas plásticas representan cambios en las secuencias ‘típicas’ de
desarrollo debido a la interacción del genotipo del organismo con su ambiente (Schlichting,
1986).
La adaptación fisiológica a los cambios ambientales de corta duración requiere, más que el
tiempo generacional de la especie, de respuestas plásticas, primariamente mediante su
capacidad de aclimatarse a las nuevas condiciones. La alternativa es la de tolerar el cambio
ecológico sin una respuesta fisiológica, lo cual, si las condiciones son extremas, puede ubicar
a los individuos bajo estrés (Krebs y Loeschcke, 1996).
La complejidad experimental y los problemas para medir las respuestas de plasticidad han
retardado el progreso, no obstante se han hecho muchas aproximaciones para medir la
plasticidad de un taxón dado en respuesta a la variación ambiental, y desafortunadamente, casi
todas tienen dificultades conceptuales u operacionales. Consecuentemente, es difícil hacer
comparaciones en la plasticidad aún entre taxa relacionados (Schlichting, 1986).
24
La plasticidad en la ontogenia
Se requiere de información con respecto a lo que ocurre con la plasticidad durante la
ontogenia, ya que es posible que la habilidad para responder y tal vez la naturaleza de la
respuesta cambie con una edad, estado fisiológico o estado de desarrollo, es decir, que en
función de esto, la respuesta plástica puede ser diferente a un mismo estresor durante el ciclo
de vida (Schlichting, 1986).
Todos los animales y plantas de nuestro rededor se han desarrollado a partir de una célula
simple, el huevo fertilizado, cuyo desarrollo se caracteriza por una serie de divisiones celulares
que resultan en una pequeña masa de células -cientos o miles-. De esta masa de células surge
una variedad de diferentes tipos celulares por un proceso denominado diferenciación. Este da a
las células patrones bien definidos (Wolpert, 1998).
Las diferencias entre las especies según Wolpert (1998) parten inicialmente de sus patrones
de formación -como las células son organizadas espacialmente, más que debido a diferencias
significativas en los tipos celulares que constituyen. De modo que la duplicación de los genes
y la segmentación involucran la duplicación de estructuras, junto con los patrones basados en
las identidades posicionales y las divisiones celulares asimétricas, lo cual abre caminos para el
desarrollo de patrones y estructuras celulares divergentes.
Como con estos mecanismos de desarrollo es posible generar una amplia variedad de
organismos diferentes, puede pensarse que fueron seleccionados porque pueden generar
variedad con relativa facilidad (Wolpert, 1998).
El desarrollo es central para la evolución de los organismos multicelulares según Wolpert
(1998) ya que la evolución procede mediante la modificación del programa de desarrollo del
25
embrión para producir células diferentes en el adulto. Esta modificación es debida a cambios
en los genes que controlan el comportamiento celular durante el desarrollo.
La clave de todo el desarrollo es la generación de diferencias entre las células; esto es, el que
no sean equivalentes, pues sólo si las células son diferentes el organismo será modelado. Hay
cambios organizados en el aspecto y las células de sitios específicos que se diferencian en
diferente tipos de células (Wolpert, 1998)
En la evolución desde un huevo hasta las distintas formas específicas de las células corporales
hay un proceso evolutivo que puede involucrar inicialmente a señales medioambientales, las
cuales se vuelven autónomas (Wolpert, 1998)
Gerhart y Krischner (1997) ofrecen dos claros ejemplos de la auto-organización de la
plasticidad fenotípica en la evolución del sistema nervioso y el proceso de vascularización, ya
que en estos procesos al establecer nuevos enlaces entre las células se utiliza un
comportamiento exploratorio sobre el ambiente local, interactuando con las señales químicas
de las células, quienes determinan la selección de las neuronas (en el caso del sistema
nervioso) que han de sobrevivir y cuales ramas axonales serán seleccionadas para el
mantenimiento de las sinápsis. De este modo, regiones del sistema nervioso inervadas por
neuronas que parten de diferentes locaciones se vuelven auto-organizadas.
Consecuentemente, la autorganización permite nuevas rutas de procesamiento neuronal. Las
células nerviosas son capaces de invadir nuevos territorios y pueden reorganizarse
respondiendo a los cambios anatómicos principales, como ocurre durante la metamorfosis.
Esta capacidad del sistema nervioso de reorganizarse localmente puede ser usada por las
neuronas durante los cambios adaptativos, en el desarrollo del embrión, en la fisiología normal
26
del aprendizaje o en la recuperación de una lesión. Esta respuesta adaptativa se da tanto en
respuesta a las condiciones del medio interno como a las generadas en el ambiente exterior
(Gerhart y Krischner, 1997).
Es muy probable que estas propiedades extraordinarias de auto-organización se usaran durante
la evolución (Gerhart y Krischner, 1997).
Genotipo, fenotipo y adaptación
Para las especies que se reproducen sexualmente, la capacidad de colonizar, o la habilidad de
una población para adaptarse a las condiciones cambiantes, puede estar asociada con altos
niveles de variación genética para la tole rancia al medio ambiente (Krebs y Loeschcke, 1997).
Ingold (1998), define al genotipo como aquello que cada individuo recibe de sus predecesores
en un contexto independiente de especificación de forma, el cual es entonces ‘expresado’ o
realizado, en el curso de su historia de vida, en la forma concreta de un fenotipo específico
ambientalmente.
Desde que la llamada teoría Lamarckiana de la herencia fue demolida por August Weisman al
final del siglo XIX, se ha asumido que sólo las características del genotipo, y no las del
fenotipo, transitan a través de las generaciones. Es decir, el objeto de la selección es el
fenotipo del individuo, sobre quien actúa directamente, más que sus genes sobre quienes actúa
de manera indirecta. Los nuevos fenotipos permiten a las especies seguir a los cambios del
medio (Mayr, 1997; Ingold, 1998).
Desde la perspectiva de Ingold (1998) cada organismo inicia su vida con un complemento de
DNA en su genoma que literalmente es pasado de una generación a otra. Sin embargo, éste,
27
por sí solo no especifica nada. Entonces, los organismos no comienzan su vida sólo con el
DNA, también está el ambiente y no hay lectura del código genético que no sea en sí misma
parte del desarrollo del organismo en su medio ambiente. Dicho de otra manera, el organismo
‘es un genoma y un segmento del mundo’, que juntos constituyen un sistema de desarrollo. En
el curso de la vida del organismo, es en el desdoblamiento de este sistema que las formas
emergen y se sustentan.
Como consecuencia de lo anterior, cualquier cálculo de la evolución de la forma tiene que
comprometerse centralmente con el proceso de auto organización dinámica, mediante el cual,
tales sistemas se constituyen y recostituyen a lo largo del tiempo (Ingold, 1998).
No es usual hablar de los fenotipos completos como adaptaciones. Si se está en lo correcto al
pensar que la selección natural ha sido la principal fuerza directriz de la evolución, entonces
todos los fenotipos son adaptaciones en una gran extensión (por ejemplo, productos del
proceso de adaptación) (Brandon, 1996).
Brandon (1996) sostiene que tanto la variación fenotípica como la genotípica son relevantes,
ya que la selección natural no actúa sobre una población de organismos fenotípicamente
idénticos, no importa que tan diversos sean genéticamente. Adicionalmente, sólo las
variaciones genéticamente transmisibles son de significancia (genética) evolutiva. Por
consiguiente, la variación genética es la condición sine qua non de la evolución genética. En
ambos niveles esta variación es relevante.
El perfil de fenotipos producidos en un rango de medio ambientes es referido como la ‘norma
de reacción’ del genotipo para ese conjunto específico de medio ambientes específicos (Via y
Lande, 1985, Nylin y Gotthard, 1998).
28
Según Nylin y Gotthard (1998) la diferenciación genética y la plasticidad fenotípica son dos
de los fenómenos que ligan al genotipo con el fenotipo. El tercero es la “canalización” (u
homesotasis del desarrollo), el caso en el cual el mismo fenotipo resulta independientemente
de la variación ambiental. Sin embargo, es razonable asumir que los rasgos que estén ligados
estrechamente con las aptitudes puedan canalizarse más fuertemente como un resultado de la
pasada selección estabilizante.
Historia de vida
En la biología evo lutiva, para Nylin y Gotthard (1998) la teoría de la historia de vida se
refiere a un cuerpo de teorías que trata del cómo la vida de los organismos -la manera en que
ellos se desarrollen, reproduzcan y mueran- han sido modelada por la selección natural. Ésta
es una teoría de los ciclos vitales, pero también puede ser más que eso: una teoría de las
aptitudes. Adecuarla es crucial para definir el cómo se enfoquen las aptitudes y, por
consiguiente, para dar poder predictivo a la biología, ya que una estructura de aptitudes
significa que son posibles algunas generalizaciones más allá de las especies estudiadas, sobre
aquellas que parezcan haber experimentado presiones selectivas similares.
La tolerancia a los medios ambientes extremos puede afectar la distribución y abundancia de
las especies (Krebs y Loeschcke, 1997). De modo que las modificaciones del fenotipo
atribuibles al medio ambiente son comunes en los caracteres cuantitativos (poligénicos) de los
organismos que habitan ambientes heterogéneos (Via y Lande, 1985). Por ejemplo, se espera
que exista una variación mayor para la resistencia al estrés térmico entre los individuos que
habitan medios ambientes heterogéneos en comparación con quienes habitan ambientes
estables climáticamente (Krebs y Loeschcke, 1996).
29
El estudio de la evolución in vitro
Los sistemas bioquímicos in vitro pueden dar una nueva dimensión a los estudios de los
problemas clásicos en la ecología y la evolución de los organismos (Pierce y Crawford, 1997).
Todos los métodos filogenéticos hacen suposiciones, explícitas o implícitas de los procesos de
sustitución del DNA (Huelsenbeck y Rannala, 1997). Actualmente los estudios sobre la
evolución se están realizando in vitro, gracias a que los principios de Darwin sobre la
evolución son aplicables a poblaciones de macromoléculas como el RNA, las cuales pueden
sujetarse a episodios repetidos de amplificación y maduración selectiva (Wright y Joyce,
1997).
Los estudios de comparación evolutiva in vitro, efectuados en los ribosomas, ofrecen la
posibilidad de realizar pruebas experimentales, y su aplicación va más allá de la evolución
molecular (Ellington et al., 1997).
Aunque el concepto darwiniano de la adaptación se estableció hace casi un siglo, hay
dificultades para demostrar rigurosamente que las diferencias de aminoácidos entre proteínas
homólogas de diferentes especies tengan una signiticancia adaptativa (Messier y Stewart,
1997).
Entre las especies, las diferencias en la concentración o en la actividad máxima de sus
enzimas, frecuentemente se interpretan como adaptativas, e importantes para regular el
metabolismo, aunque en muchos casos, estas diferencias simplemente pueden reflejar
divergencias filogenéticas (Pierce y Crawford, 1997).
30
2.3 El estrés como respuesta a los cambios ambientales
Los seres vivos, como parte de sus procesos fisiológicos, continuamente afrontan los retos que
representan los cambios en las condiciones ambientales internas y externas, los cuales generan
situaciones de estrés, agotamiento y adaptaciones que van desde el nivel sub-celular hasta el
del, organismo como un todo (Reeve, 1993).
Seyle (1936, 1955, 1973 y 1983) en una serie de publicaciones a lo largo de casi cincuenta
años concreta la siguiente defínición de estrés:
El estrés es una respuesta inespecífíca del cuerpo ante cualquier demanda hecha sobre él. Las
respuestas adaptativas inespecífícas del cuerpo a cualquier agente o situación son siempre las
mismas, independientemente del estímulo particular, lo que varía es el grado de la respuesta,
la cual, en cambio, depende sólo de la intensidad de la demanda para el ajuste.
Sin embargo, hay controversia sobre la específicidad o inespecífícidad del estrés. Dantzer y
Mormede (1983) consideran que la inespecificidad de la respuesta al estrés radica en la parte
aferente correspondiente a la percepción y conducción del estímulo sensitivo por el sistema
nervioso y no en la parte eferente que involucra a componentes de los sistemas endocrino y
nervioso somático y autónomo. Adicionalmente, Carbonaro et al. (1992) consideran que la
respuesta hipotálamo-hipofisiaria-adrenocortical puede considerarse más como una reacción
específica al estrés fisológico, que inespecifica para todos los estresores, tal y como Seyle lo
propuso inicialmente.
Aunque forme parte del vocabulario cotidiano y de entenderse rápidamente el concepto estrés,
una definición clara permanece elusiva (Seyle, 1973, 1983; Harbuz y Lightman, 1992).
31
Mientras para Stott (198l), el estrés incluye a aquellas fuerzas o estímulos del medio externo o
interno, que puedan inducir cambios y adaptaciones en el organismo para ayudarlo a ajustarse
al medio ambiente, otras definiciones lo consideran como la magnitud de las fuerzas externas
que actúan sobre el sistema corporal, tendiendo a desplazarlo de su estado basal o de reposo.
La amplitud del término abarca desde estados problemáticos hasta el colapso y los
involucrados en alteraciones del comportamiento o de las funciones físológicas (Seyle, 1955;
Fraser et al. 1975).
Dependiendo del campo particular de interés, actualmente el estrés congrega representaciones
muy variables que comprende a los estímulos físicos, químicos y emocionales capaces de
causar diestrés a una célula, tejido o al organismo como un todo (Holbrook y Udelsman,
1994).
En el contexto neuroendocrino, el estrés se limita a los eventos resultantes de la activación del
eje hipotalámico-hipofisiario-adrenal, cuyo estado final es la secreción de
glucocorticosteroides (Harbuz y Lightman, 1992).
Ante los retos complejos impuestos por los cambios ambientales, la naturaleza ha descubierto
muchas maneras diferentes para enfrentarlos (Parsell y Lindquist, 1993) en las cuales el éxito
depende de tener la capacidad para protegerse de una variedad inmensa de estresores y de
montar una respuesta “apropiada” a cada situación particular (Harbuz y Lightman, 1992;
Sanders, 1993).
2.3.1 El estrés en el ámbito celular
La respuesta celular al estrés está involucrada en la protección de los organismos contra el
32
daño ocasionado por la exposición a una amplia variedad de estresores, tales como las
temperaturas elevadas, la luz ultravioleta, los metales pesados y los xenobióticos (Sanders,
1993).
Las células responden claramente al estrés incrementando su catabolismo y por consiguiente,
es razonable esperar que esta actividad sea dirigida a la eliminación de las proteínas dañadas
por el estrés (Parsell y Lindquist, 1993). Esto es muy importante, pues en las modificaciones
postraduccionales de las proteínas, como la proteolisis y la fosforilación, se regulan muchos
procesos celulares esenciales. Por ejemplo, una proteólisis regula el proceso de apoptosis o
muerte celular programada (King et al., 1997).
Durante el estrés por condiciones extremas de temperatura, pH u osmolaridad, pueden operar
las enzimas extremofilicas (King et al., 1997).
En situaciones de estrés que incluyan a todo el organismo, en el hígado y el riñón se
incrementa la síntesis de las enzimas que participan en la gluconeogénesis y la activación del
sistema nervioso central puede hacer al organismo atender selectivamente los estímulos más
importantes para su supervivencia (Henry, 1993)
El calor afecta a una amplia variedad de estructuras celulares y de procesos metabólicos. La
cantidad de daño infligido depende tanto de la magnitud como de la duración del estrés, y las
células mueren cuando se rebasa el umbral de lesión. En los eucariotas superiores, uno de los
principales efectos del estrés calórico es la extensa ruptura del citoesqueleto, que afecta la red
de filamentos intermedios, los filamentos de actina y los microtúbulos. En la mitosis celular,
esta delicada red de microtúbulos organiza los cromosmas durante la división (Parsell y
Lindquist, 1994).
33
Otras estructuras citoplasmáticas dañadas por el calor incluyen la fragmentación del aparato de
Golgi, así como daños estructurales en la mitocondria que disminuyen la respiración celular y
la fosforilación oxidativa. Adicionalmente se perturba o interrumpe la síntesis de muchas
macromoléculas como las proteínas (Parsell y Lindquist, 1994).
En los ectotermos, las perturbaciones en la organización de la membrana celular, inducidas
por la temperatura son un reto serio para el mantenimiento de las funciones fisiológicas. Esto
se debe a que el comportamiento de fase y las propiedades físicas de los lípidos en las
membranas biológicas son muy sensibles a los cambios de temperatura. Tales estructuras:
l actúan como barreras físicas para la difusión de solutos,
l median el movimiento de solutos específicos a través de las membranas,
l regulan el uso de la energía almacenada en los gradientes iónicos transmembranales,
l proveen de una matriz organizada para el ensamble de múltiples componentes del
metabolismo y de las rutas de transducción de señales y
l suministran precursores para la generación de segundos mensajeros derivados de los
lípidos (Hazel, 1995).
Entre los microorganismos, los hongos, las plantas y los animales, que crecen bajo
condiciones de temperatura ideales, existen muchas similitudes con respecto a la difusión, las
funciones generales y la composición de los lípidos de sus membranas. Esto nos ofrece una
evidencia completa de algunos atributos de la organización de los lípidos en la membrana y de
que su ordenamiento es regulado fisiológicamente (Hazel, 1995).
Dentro del amplio repertorio de respuestas adaptativas que se dan ante las alteraciones
ocasionadas por cambios en la temperatura, se reconocen las modificaciones en la
composición de los lípidos de las membranas celulares. Por ejemplo, ante el frío, la
34
proliferación de las mitocondrias o de las membranas del retículo sarcoplásmico, son
respuestas aclimatadoras importantes de muchos ectotérmicos. Alternativamente, en algunos
casos, la alteración en la expresión de las proteínas parece contribuir a la adaptación térmica
de las funciones de la membrana (Hazel, 1995).
Las perturbaciones térmicas en el estado de fase de los lípidos de la membrana tienen un
impacto profundo sobre la estructura y función de aquella. Por ejemplo, la transición de una
fase fluida a una fase de gel induce:
a) el agrupamiento de las proteínas integrales de la membrana, las cuales son
grandemente excluidas de los dominios de los lípidos;
b) la reducción de la actividad de muchas enzimas asociadas a la membrana;
c) la disminución de la eficiencia en los procesos de difusión acoplada; y
d) un incremento notable de la permeabilidad para los cationes y el agua,
probablemente debido a defectos de empaque que forman los límites entre los
microdominios de los lípidos en fases flúida y los de fase en gel (Hazel, 1995).
La fluidez de las membranas, determinada por la temperatura, posiblemente esté
correlacionada con actividades tan diversas como la ATPasa Na+/K+ en el riñón, el transporte
de cloruro en los gránulos secretorios del páncreas, el enlace, la ingestión y la degradación de
lipoproteínas de baja densidad por los hepatocitos, la colisión y el acoplamiento entre los
componentes de las rutas de transducción de señales ? -adrenérgicas, la movilidad rotativa de
la ATPasa calcio del retículo sarcoplásmico y la permeabilidad pasiva de la fase fluida de las
membranas (Hazel, 1995).
35
2.4 Efectos del estrés calórico sobre el metabolismo de las proteínas.
La célula responde a una amplia variedad de señales tales como los factores de crecimiento,
las hormonas y las citocinas, pero también a estresores ambientales como el choque térmico, la
radiación, las toxinas y la hipoxia (Woodgett, et al., 1996).
Las altas temperaturas perturban profundamente la síntesis de muchas macromoléculas,
incluyendo a las proteínas. En muchos tipos de células los polisomas desaparecen con
rapidez, probablemente por la inactivación de factores que capturan a las proteínas y al
colapso de la red de filamentos intermedios a la que se fijan muchos mensajes del mRNA
(Parsell y Lindquist, 1994).
En las células de los mamíferos el tratamiento hipertérmico produce numerosas alteraciones,
como la inactivación del patrón “normal” de la expresión genética a varios niveles
(transcripción, fijación y traducción), la inhibición de la proliferación celular (síntesis del
DNA, división celular), las alteraciones en la morfología celular y en la adhesión celular, la
disminución en la respuesta a las hormonas, y el aumento de los efectos de varios fármacos y
de la radiación. Esto se atribuye a que después del calentamiento quedan dañadas muchas
estructuras celulares (Kampinga, 1993).
La temperatura y la concentración de proteínas tienen una fuerte influencia en el reparto de los
productos intermedios del doblamiento entre la agregación y el estado doblado original
(Zeilstra-Ryalls et al., 1991).
36
2.4.1 Proteínas, estructura y función
Para realizar sus tareas, las proteínas deben conservar su estructura tridimensional; sin
embargo, existen factores que modifican y alteran sus funciones e interacciones dentro del
sistema (Bukau et al., 1996). Además de los daños ocasionados por los estresores
medioambientales, las proteínas están sujetas a una variedad de procesos degradativos
espontáneos, tales como la oxidación, la desaminación, la glucosilación y la isomerización. De
hecho, el éxito para que un organismo pueda llegar a envejecer, depende de su capacidad para
mantener, a lo largo del tiempo, la integridad de su inestable maquinaria molecular (Kim, et
al., 1997).
Algunas proteínas son claves en la integración funcional de la célula y participan
constituyendo redes de comunicación intracelular, las cuales deben ser resistentes a los daños
que alteran su estructura tridimensional, ya que de lo contrario el flujo de información puede
modificarse o interrumpirse por completo (Bray, 1995).
Se ha examinado la estabilidad de las proteínas en la búsqueda de una respuesta al porqué
algunos organismos sobreviven a temperaturas cercanas a los 100°C mientras otros dejan de
vivir a los 40°C, y al porqué algunas proteínas son extremadamente termoestables mientras
otras se desnaturalizan a temperaturas relativamente bajas. Para ello se realizan esfuerzos
teóricos que comparan las secuencias y las estructuras terciarias de algunas proteínas
homólogas presentes en organismos termófilos, mesófilos y criófilos (Vogt et al., 1997).
No obstante su gran importancia, los fenómenos de la termoestabilidad de las proteínas están
entendidos sólo parcialmente. La comprensión del doblamiento de las proteínas y de los
37
mecanismos de interacción proteica indudablemente ayudará a entender los principios
fisicoquímicos relacionados con la estabilidad térmica (Vogt et al., 1997).
Algunas de las explicaciones fisicoquímicas dadas al aumento en la termoestabilidad, en orden
de prelación, son las siguientes (Vogt et al., 1997):
l Mejores enlaces de hidrógeno.
l Mejor empacamiento hidrofóbico interno.
l Mejoramiento en la tendencia estructural secundaria.
l Estabilización de la hélice diploide.
l Sustituciones Argos.
l Remoción de los residuos sensibles a la oxidación o a la desaminación.
l Ocultamiento de la accesibilidad al área hidrofóbica.
l Mejoramiento de las interacciones electrostáticas.
l Refuerzo de las asociaciones entre subunidades.
l Disminución de la tensión de sostén.
l Optimización de los puentes de sal.
l Mejores interacciones de sus enlaces van der Waals.
l Mejor afinidad al calcio.
l Mejora de la entalpía en la sustitución.
l Refuerzo en la estabilidad de las estructuras secundarias.
l Disminución de las glicinas y aumento en las prolinas en los doblamientos.
l Doblamientos más cortos.
l Puentes disulfuro adicionales o puentes de metal en los sitios de glucosilación.
l Disminución en el número y el volumen de las cavidades internas.
38
l Incremento en las interacciones aromáticas.
Por consiguiente, la estabilidad térmica se atribuye principalmente a la fortaleza de los
enlaces, por lo que los enlaces de hidrógeno adquieren una importancia particular en el
doblamiento de las proteínas (Vogt et al., 1997). Además, quienes dominan la estabilidad
estructural son las partes rígidas de la proteína, ya que las partes flexibles contribuyen poco a
este propósito. Otro factor importante en la estabilización es el efecto hidrófobo, en tanto que
las interacciones electrostáticas y los puentes de sal no juegan un papel dominante (Matthews,
1993).
Importancia funcional de la estructura tridimensional
El dogma central de la biología molecular define como la principal ruta para la transferencia
de la información genética la que va del DNA lineal genómico a las proteínas tridimensionales
quienes efectúan funciones o actúan como estructuras. Hasta hace poco parecía que tal
transferencia solamente requería de la maquinaria enzimática para la transcripción en RNA y
para el procesamiento y la traducción de proteínas (Anfinsen, 1973; Horwich et al., 1993;
Lewis et al., 1996). Recientemente, innumerables estudios indican la presencia de
componentes proteicos especializados en la célula: las chaperonas moleculares. Ellas juegan
papeles esenciales para habilitar a los polipéptidos, de modo que alcancen las formas activas
en una variedad de compartimentos celulares (Craig et al., 1993; Horwich et al., 1993; Hartl
et al., 1994; Lewis et al., 1996).
Por consiguiente, muchos aspectos de la homeostasis proteica, a partir del doblamiento y
ensamble de las proteínas recientemente sintetizadas hasta su reparación o degradación, están
apoyados por esta sofisticada maquinaria celular, la cual ha estado presente a través de toda la
evolución de los procariotas y los eucariotas (Craig et al., 1993; Rutherford y Zuker, 1994:
39
Hartl, 1996).
Tanto en el estado sólido como en solución, las proteínas están fuertemente empacadas. Este
estrecho empacamiento está relacionado con la función que les dá un núcleo rígido sobre el
cual se acomodan las cadenas laterales catalíticas en las enzimas. El empacado flojo se asocia
frecuentemente con cambios conformacionales, mientras que el empacado firme se
correlaciona con una mejor estabilidad. Sin embargo, este último limita el número posible de
acomodos de las cadenas laterales, restringiendo el número de estructuras posibles (Levitt et
al., 1997).
La conclusión del proceso de doblamiento, involucra al ordenamiento de las cadenas laterales
de aminoácidos en una configuración bien definida y empacada apretadamente,
considerándose que en este punto ha sido terminado por completo el proceso y las cadenas
laterales han asumido sus posiciones finales. Se considera que las interacciones hidrofóbicas
dictan en su mayoría, si no completamente, los pasos previos en el proceso de doblamiento,
especialmente aquéllos que determinan el aspecto de doblamiento completo (Levitt et al.,
1997).
Doblamiento
El doblamiento de las proteínas es el proceso mediante el cual, la información lineal contenida
en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido dado alcanza la conformación
tridimensional bien definida de la proteína funcional. El cómo se logra esto es uno de los
problemas centrales de la biología (Hendrick y Hartl, 199.5; Hartl, 1996).
Debido a que in vitro las proteínas desdobladas pueden alcanzar este estado espontáneamente,
se asumió que el doblamiento -adquisición de la estructura terciaria- y el ensamble
40
(formación de oligómeros de proteína) de los polipéptidos recientemente sintetizados in vivo
también podía ocurrir esencialmente sin catalizadores y sin gasto de energía metabólica. No
obstante, una extensa revisión de esta posibilidad llevó a descubrir que el doblamiento
correcto de muchas proteínas depende del funcionamiento de una maquinaria proteínica pre-
existente: las chaperonas moleculares (Hendrick y Hartl, 1995; Hartl, 1996).
La formación de las estructuras terciarias estables requiere de la presencia de un polipéptido
completo, o de al menos de un dominio proteínico completo (típicamente de 100 aminoácidos
de largo). Sin embargo, en las células las proteínas emergen de los ribosomas como cadenas
desdobladas primeramente con su porción amino-terminal, y por consiguiente no pueden
alcanzar la estabilidad hasta que haya sido sintetizado un dominio. Una situación similar
ocurre con las cadenas de polipéptidos que serán transportadas dentro de la célula a través de
las membranas de los organelos en una conformación extendida (Hartl et al., 1994).
Fallas en el doblamiento
La extensión completa o el doblamiento parcial de los polipéptidos expone las superficies
hidrofóbicas, normalmente ocultas en el interior de la proteína naturalizada, a los solventes
acuosos. En el estado desdoblado, los polipéptidos pueden potencialmente interactuar con
otros a través de sus superficies hidrofóbicas, formando agregados, aun a concentraciones
relativamente bajas. Estas reacciones aberrantes pueden ocurrir tanto a nivel intra como inter
molecular (Hartl, 1994).
Consecuentemente, desde los primeros eventos en la vida de las proteínas, en los ribosomas,
los polipéptidos nacientes son sometidos a un proceso complejo de desdoblamiento en un
medio ambiente atestado y peligroso, dado por la elevada concentración en los
41
compartimentos celulares, tanto de proteínas (20-30%), como de polipéptidos nacientes. Como
esto puede favorecer más a las reacciones improductivas que a la ruta del doblamiento
correcto, es posible la ocurrencia de reacciones de agregación3 o fallas en el doblamiento
(Sanders, 1993; Hartl et al., 1994; Hendrick y Hartl, 1995; Bukau et al., 1996).
El doblamiento asistido por chaperonas moleculares
Si bien la estructura tridimensional de una proteína está codificada en su secuencia de
aminoácidos, la cual contiene toda la información necesaria para que se doble una cadena
polipeptídica (Anfínsen, 1973) in vivo, el doblamiento es asistido por muchos factores
auxiliares que, aunque no doblan directamente las proteínas, si facilitan su doblamiento
“productivo” en el medio ambiente celular. Las chaperonas moleculares forman parte de estos
factores auxiliares (Hendrick y Hartl, 1993; Hartl et al., 1994; Dobson et al., 1994).
Los polipéptidos nacientes interactúan primeramente con los componentes ribosomales. Los
análisis estructurales de los ribosomas mediante microscopia electrónica han revelado un canal
para estos polipéptidos. Inicia en el centro peptidil- transferasa y termina en la subunidad
ribosómica mayor; además protege bioquímicamente de la proteolisis influida por el proceso
de doblamiento a los 30 o 40 residuos C-terminales de las cadenas nacientes. Después de
emerger del sitio de salida ribosomal, los polipéptidos nacientes interactúan con una variedad
de proteínas que coordinan, en el espacio y en el tiempo, la traducción, el doblamiento, la
objetivación4 y la translocación, asegurando la fidelidad y unidireccionalidad de este proceso
_________________________________ 3 En los primeros intentos de expresar en bacterias proteínas eucariotas recombinantes, se descubrió que los altos niveles de expresión intracelular frecuentemente se acompañaban de agregados de proteínas recombinantes inactivas -denominados cuerpos de inclusión- en el citoplasma de la célula bacteriana (Nilsson y Anderson. 1991). 4 Objetivación se ha traducido de “targeting”. que implica señalar un blanco u objetivo para la proteína que será translocada.
42
(Bukau et al., 1996).
2.5 La respuesta celular al choque calórico y las chaperonas
moleculares
No obstante lo anterior, se considera que la perturbación de la síntesis de proteínas no es sólo
un efecto tóxico de las temperaturas elevadas, pues en muchos tipos celulares es parte de una
respuesta reguladora, la cual facilita las expresión de las Hsp, cuya traducción adquiere
preferencia sobre los mensajes, ahora inactivados de las proteínas constitutivas, eliminandose
así la competencia por los ribosomas (Parsell y Lindquist, 1994).
La respuesta celular al estrés fue reportada primeramente por Ritossa (1962), quien la observó
como resultado de un choque calórico bastante severo (30°C por 30 minutos), dado a larvas de
Drosophila buski que crecían bajo una temperatura de 25°C.
La respuesta al choque calórico ocurre cuando las células en crecimiento a una temperatura
baja son cambiadas a una temperatura mayor de aquélla que les permita crecer o les sea letal.
Esto da como resultando la activación o el incremento en la transcripción de los genes de
choque calórico que codifican a las Hsp. Mientras que al aumentar la temperatura, la síntesis
de la mayoría de las proteínas celulares disminuye, en contraste la síntesis de las Hsp
aumenta al subir la temperatura y disminuye al volver ésta al nivel fisiológico. Entre los seres
vivos, incluyendo a los que viven bajo temperaturas extremadamente altas o bajas, esta
respuesta es casi universal (Craig y Jacobsen, 1984; Craig y Gross, 1991; Craig et al., 1993;
Dubois y Bensaude, 1993).
En el ámbito celular, las células eucariotas responden al estrés calórico produciendo proteínas
43
de estrés o Hsp, cuya síntesis puede inducirse por una variedad de factores que incluyen el
calor, los metales pesados, los análogos de aminoácidos, los inhibidores del metabolismo
energético, los agentes quelantes y ciertos agentes infecciosos como algunos virus (Lindquist,
1986; Pelham, 1986; Ellis, 1987; Guerreiro y Reynes, 1990; Craig y Gross, 1991; Ellis y van
der Vies, 1991; Zeilstra-Ryalls et al., 1991; Gething y Sambrook, 1992; Hendrick y Hartl,
1993; Parsell y Lindquist, 1993; Sanders, 1993; Cyr et al., 1994; Wolfe y Zatz, 1994;
Waldmann et al., 1995; Pennisi, 1996; Sparrer et al., 1997).
Durante la evolución, esta respuesta ha sido conservada, no sólo como un fenómeno
fisiológico, sino también considerando a las proteínas individuales, ya que las Hsp
comprenden algunas de las familias de proteínas más altamente conservadas que se conocen
(Lindquist, 1986; Pelham, 1986; Ellis, 1987; Craig y Gross, 1991; Ellis y van der Vies, 1991;
Zeilstra-Ryalls et al., 1991; Gething y Sambrook, 1992; Hendrick y Hartl, 1993; Parsell y
Lindquist, 1993; Sanders, 1993; Cyr et al., 1994; Wolfe y Zatz, 1994; Waldmann et al., 1995;
Pennisi, 1996; Sparrer et al., 1997).
2.5.1 Funciones generales de las chaperonas moleculares
Identificadas originalmente como unas proteínas especiales, involucradas en la protección
contra el estrés térmico, las chaperonas moleculares han emergido como uno de los grupos de
proteínas más abundantes. Bajo condiciones normales de crecimiento, sirven en varias
funciones biológicas básicas, desempeñando su función más prominente como mediadoras de
las reacciones de doblamiento de las proteínas, aunque están involucradas también en otros
procesos (Rassow et al., 1997)
44
Aunque el término “chaperonas moleculares” fue acuñado primeramente por Laskey et al.
(1978), quien sugirió su papel biológico fue Pelham (1986), al describir la función de la
nucleoplasmina, una proteína que interactúa con las histonas y que se requiere para el
ensamble de los nucleosomas del DNA o cromatina. Posteriormente, Ellis (1987) aplicó el
término de una manera más general a un grupo de proteínas, cuyo papel principal en las
reacciones de ensamblaje es el de unirse a las formas desdobladas o parcialmente dobladas de
otras proteínas, con el fin de asegurar que ocurra un doblamiento y ensamble correctos en las
estructuras oligoméricas de ciertas cadenas de polipéptidos (Ellis, 1987; Hendrick y Hartl,
1993).
Las chaperonas moleculares son proteínas de una familia de clases no relacionadas, que
median el ensamblaje correcto de otros polipéptidos y lo revierten si presenta fallas, pero en sí
mismas no son componentes de las estructuras funcionales finales. Su función se requiere,
porque en muchos procesos celulares donde se involucra el ensamble de las proteínas, hay un
riesgo inherente de malformaciones estructurales, existiendo un atributo de debilidad en las
numerosas, variadas y flexibles interacciones responsables de sostener a las proteínas en sus
conformaciones originales (Ellis y van der Vies, 1991; Hendrick y Hartl, 1993).
Consecuentemente, parece ser que el papel predominante de las chaperonas moleculares es el
de evitar las asociaciones intermolecula res incorrectas de las cadenas de polipéptidos
desdobladas, pues éstas dan como resultado la formación de agregados (Hartl et al., 1994).
Las Hsp promueven la degradación de las proteínas anormales o reactivan las proteínas
dañadas durante el estrés. También funcionan como chaperonas moleculares, previniendo la
formación de agregados y promoviendo el re-doblamiento de las proteínas desnaturalizadas
(Lindquist, 1986, Ellis, 1987; Ellis y van der Vies, 1991; Gething y Sambrook, 1992;
45
Hendrick y Hartl, 1993; Kampinga, 1993; Parse11 y Lindquist, 1993; Sanders, 1993; Dobson et
al., 1994; Parsell et al., 1994; Pennisi, 1996; Booth et al., 1997; Lam et al., 1997; Sparrer et
al., 1997).
Las Hsp constituyen varias familias de proteínas que fueron descubiertas en un principio por
su cualidad de ser muy inducibles durante el choque calórico. Aunque adicionalmente, algunas
proteínas de choque calórico son reguladas por otros factores distintos del estrés (Sparrer et
al., 1997). En verdad, recientemente se ha comprobado que la mayoría de los miembros de la
familia Hsp se sintetizan en las células aún bajo condiciones fisológicas normales, como
proteínas constitutivas abundantes (Mizuno et al., 1997; Sparrer et al., 1997).
Wolin (1994), señala que el estudio de las Hsp, se ha realizado principalmente en dos
organismos unicelulares: Escherichia coli y Sacharomyces cervesiae. Indica además que
aunque por lo general se asume que los mecanismos biológicos que se develan del estudio de
las células procariotas son aplicables a las eucariotas superiores, también la información fluye
en sentido inverso, si bien con menos frecuencia, de modo que los experimentos realizados en
organismos complejos proveen algunas veces de discernimientos para los procesos celulares
de los procariotes.
2.5.2 Características esenciales de las chaperonas
Hay cuatro propiedades que caracterizan a una chaperona molecular (Ellis y van der Vies,
199 1; Hartl et al., 1994; Jakob y Buchner, 1994):
l Impiden la agregación durante el doblamiento de las proteínas.
l Impiden la agregación durante el desdoblamiento de las proteínas
46
l Influyen sobre la producción y la cinética del doblamiento.
l Ejercen efectos a niveles estequiométricos5
El mecanismo básico de acción de las chaperonas moleculares es su capacidad de ligar y
liberar polipéptidos que estén en una conformación desnaturalizada, en una reacción
dependiente del ATP. Sin embargo, las chaperonas como la Hsp70 (DnaK), no actúan solas,
sino que tienen finas interrelaciones operacionales con otras proteínas de choque calórico
como la GrpE y la DnaJ, quienes actúan como factores reguladores modulando su actividad
(Cyr et al., 1994; Kelley y Landry, 1994; Sparrer et al., 1997).
2.5.3 Regulación de la síntesis de Hsp
Tan pronto la célula es estresada, para prevenir y contrarrestar los efectos del choque calórico
se activa o intensifica la transcripción de los genes de choque calórico hsp (Dubois y
Bensaude, 1993), que se encuentran en un estado de pronta disponibilidad (Duncan, 1997).
En los eucariotas, la regulación de la expresión del gen de choque calórico está mediada por el
factor de transcripción del choque calórico (HSF), evolutivamente muy conservado y presente
bajo condiciones normales en un estado latente monomérico. Sin embargo, al haber estrés
calórico, éste se activa y se induce su trimerización, ligándose entonces con una alta afinidad
en los dominios expuestos para la actividad de transcripción con el DNA que codifica a las
Hsp. Se asume que la señal de choque calórico es transducida a HSF, ya sea mediante
cambios en el medio ambiente físico, en la actividad de las enzimas modificadas por el HSF, o
por cambios a nivel intracelular en las proteínas de choque calórico (Fernandes et al., 1994;
wu, 1995).
47
En los cultivos celulares, la caída en las reservas de los fosfatos altos en energía como el ATP
se ha asociado con la inducción del HSF. Sin embargo no se descarta la existencia de otras
rutas alternas (Duncan, 1997). La síntesis de las Hsp es inducida por la acumulación de
proteínas extrañas, de proteínas desnaturalizadas o de proteínas que contengan sustituciones de
amionoácidos desestabilizados estructuralmente (Lindquist, 1986; Ellis, 1987; Ellis y van der
Vies, 1991; Gething y Sambrook, 1992; Hendrick y Hartl, 1993; Kampinga, 1993; Parsell y
Lindquist, 1993; Sanders, 1993; Dobson et al., 1994; Parsell et al., 1994; Pennisi, 1996;
Booth et al., 1997; Lam et al., 1997; Sparrer et al., 1997).
Las evidencias bioquímicas sugieren el siguiente modelo de regulación de la actividad del
HSF:
l Bajo condiciones normales el HSF se mantiene desligado del DNA a través de sus
interacciones con la Hsp70 que estabiliza su estructura monomérica.
l Durante el choque calórico se forman las proteínas mal dobladas o agregadas que
compiten con la asociación entre HSF y Hsp70.
l Así, el choque calórico inicia los eventos que llevan a remover la influencia
reguladora negativa sobre el HSF, que una vez liberado, se ensambla en trímeros y
se liga a una secuencia de elementos del DNA, denominada comunmente elementos
del choque calórico (HSE) que promueven específicamente la transcripción del gen
hsp (Fernandes et al., 1994; Mizuno et al., 1997).
La rápida unión del HSF a su HSE objetivo es el principal cambio que acompaña al choque
calórico (Fernandes et al., 1994).
________________________ 5 La estequiometría estudia las proporciones según las cuales los cuerpos se combinan entre sí.
48
2.5.4 Principales familias
Las diferentes chaperonas son claramente distintas de las otras en su función celular y
especificidad de sustrato. Por ejemplo, la Hsp70 reconoce preferentemente las conformaciones
extendidas y en la ruta del doblamiento actúa primero que la Hsp60. Asimismo, proteínas
similares que son dobladas en el lumen del retículo endoplásmico, interactúan con diferentes
chaperonas residentes durante etapas sucesivas de su biogénesis (Rutherford y Zuker, 1994).
Las cinco familias más destacadas de las proteínas de choque calórico son las de 104, 90, 70,
60 y las de 16 a 24 kDa, referidas como Hsp 104, Hsp90, Hsp70 (DnaK), Hsp60
(chaperonina/GRoEL/TCPl/TRiC) y sus componentes asociados (DnaJ, GroES, y GrpE) y las
Hsps de bajo peso molecular (LMWHsps) o Hsp pequeñas (sHsp), respectivamente. Sin
embargo, para evitar confusiones se sugieren los términos” stress104” “stress90” y “stress70”
para usarlos con las familias de 104, 90 y 70 kDa, respectivamente, y el de “chaperonin”, para
la familia de 60 kDa. Todas ellas son un subgrupo del grupo ubícuo de proteínas denominadas
chaperonas moleculares, las cuales dirigen el ensamble y doblamiento de otras proteínas
celulares, y se encuentran en modelos biológicos tan diversos que van desde Drosophila hasta
los mamíferos (Gething y Sambrook, 1992; Craig et al., 1993; Sanders, 1993; Parsell et al.,
1994; Rutherford y Zuker, 1994; Waldmann et al., 1995).
La diversidad de las Hsp empleadas puede reflejar la diferente sensibilidad para dañarse de los
sustratos proteicos en diversos organismos, ya que, al parecer, éstos logran balancear sus
actividades fisiológicas normales con el tipo de condiciones estresantes a los que se sometan,
mediante distintas combinaciones en los niveles de varios tipos de Hsp (Parsell y Lindquist,
1993).
49
De esta forma, las capacidades consecuentes a la expresión de las Hsp varían de una especie a
otra, de un organismo a otro y de un tipo celular, a otro dentro de un mismo organismo.
Entender las consecuencias de la variación en las Hsp y la respuesta al estrés para una aptitud
darwiniana requiere de una apreciación detallada de los mecanismos mediante los cuales las
Hsp mitigan el impacto del estrés sobre los individuos en las poblaciones naturales (Feder y
Hofmann, 1999).
Estos mecanismos comienzan a entenderse en el ámbito de las proteínas modelo con las cuales
pueden interactuar las Hsp, pero progresivamente se entienden menos los ámbitos celular,
tisular, orgánico y organísmico (Cuadro 1). Aun en los organismos completos o en las células
que los constituyen, la variación en simples Hsp puede tener consecuencias sobre las
aptitudes. Algunas implicaciones específicas son las siguientes:
1. Las Hsp individuales pueden tener efectos pleiotropicos, interactuando en diversas
formas con múltiples sistemas.
2. Los hallazgos a partir de manipulaciones de Hsp individuales, generalmente son
consistentes con los producidos en trabajos correlacionados.
3. Finalmente, a pesar del vasto cuerpo de trabajos sobre Hsp y el creciente uso de
técnicas de manipulación, se tienen muy pocos discernimientos fisiológicos de
cómo la actividad de las Hsp culmina en el incremento de la termotolerancia de los
eucariotas multicelulares y de las células y los tejidos que los constituyen (Feder y
Hofmann, 1999).
50
Cuadro 1 Fenotipos de eucariotas multicelulares, y las células y tejidos que ellos comprenden, para los cuales las Hsp son necesarias y/o suficientes* Proteína Fenotipo
Hsp10 Celular: tolerancia a la isquemia (nofenotípica); tolerancia de la isquemia cuando es co- expresada con Hsp60.
Hsp27 Celular: resistencia a las drogas quimioterapéuticas; resistencia al peróxido de hidrógeno; resistencia de la radiación ultravioleta (no fenotípica); resistencia de las células tumorales a los monocitos; sensibilidad para las células asesinas activadas por linfocinas (no fenotípica); tolerancia de la hipertermia; resistencia al factor de necrosis tumoral; tolerancia de la isquemia; resistencia de los polímeros de actina a la citocalacina; agregación acelerada de las proteínas nucleares; declinación de la aceleración de radiosensibilización térmica.
Cristalina Celular: tolerancia de la hipertermia; tolerancia de la isquemia; resistencia al factor de necrosis tumoral; resistencia al peróxido de hidrógeno.
Hps60 Celular: tolerancia de la hipertermia (no fenotípica); tolerancia de la isquemia (no fenotípica); tolerancia a la isquemia cuando se expresa con la Hsp10.
Hsp65 Celular: regresión de tumores; pérdida de tumorigenicidad. Tejidos/órganos: regresión de tumores malignos.
Hsp70 Celular: tolerancia de la hipertermia; tolerancia de la isquemia/hipoxia; recuperación de la inhibición transcripcional y traduccional que sigue al choque calórico; regulación de la respuesta al choque calórico; tolerancia de endotoxinas; reducción de la desnaturalización de proteínas al haber exposición al calor; tumorigenicidad; proliferaciópn celular; resistencia para el peróxido de hidrógeno; resistencia de las células tumorales a los monocitos; sensibilidad a las células asesinas activadas por linfocinas (no penotípica); escape del arresto del ciclo celular inducido por drogas; glucosilación de proteínas; tolerancia de la radiación ultravioleta; apoptosis; resistencia a la apoptosis (no fenotípica). Tejidos/órganos: recuperación de la contractilidad después de la isquemia; reducción del tamaño del infarto miocárdico; redicción del daño hipertérmico para el intestino; resistencia del corazón para el daño isquémico; resistencia del hipocampo para el daño isquémico. Organísmico: tolerancia de la hipertemia; crecimiento y desarrollo; regulación de la respuesta al choque calórico; persistencia en la naturaleza (no fenotípica).
Hsp70 Organísmico: tolerancia a la hipertermia. Hsp72 Celular: apoptosis (no fenotípica); protección contra la agregación de proteínas nucleares
inducida por calor; protección contra la hipoxia; protección contra la radiosensibilización térmica.
Grp78 Celular: secreción de proteínas. Grp90 Celular: tolerancia de la hipertermia; tolerancia de la isquemia; apoptosis; apoptosis (no
fenotípica); proliferación celular y control del ciclo celular; función de los receptores de glucocorticoides.
Hsp100 Organismico: infección del huésped en Leshmania Hsp101 Celular: tolerancia de la hipertennia. Muchas Hsp
Celular: recuperación de la proliferación celular después del choque calórico; recuperación del daño a los cromosomas después del choque calórico: tolerancia de la hipertermia; tolerancia de la isquemia.
HSF Organismico: oogéneis y desarrollo: termotolerancia.
* Feder y Hofmann (1999).
51
sHsp
Las proteínas de choque calórico pequeñas (sHsp), conforman una de las cuatro familias de las
chaperonas moleculares que se expresan en respuesta al choque calórico y a otras formas de
estrés (Parsell y Lindquist, 1993; Arrigo y Landry, 1994; Jakob y Buchner, 1994; Mchaourab
et al., 1997). Constituyen una diversidad de familias que parecen ser ubicuas en la naturaleza.
A pesar de su bajo peso molecular de 12 a 40 kDa, dependiendo del estado fisiológico de la
célula, pueden aislarse como grandes complejos oligoméricos de 12 a 40 subunidades. Aunque
sus funciones celulares bajo condiciones fisiológicas son desconocidas en gran medida, el
incremento en la expresión de las sHsp bajo el estrés calórico, se asocia con la supervivencia
celular (Jakob y Buchner, 1994; Mchaourab et al., 1997).
Entre las especies, las sHsp están menos conservadas que las proteínas de choque calórico de
mayor masa molecular. Las sHsp se expresan diferencialmente durante los ciclos de
crecimiento y desarrollo, y su expresión se ha correlacionado con la diferenciación y el estado
oncoogénico. Su elevada expresión confiere protección eficiente contra el choque calórico y
una variedad de sustancias químicas tóxicas, como las utilizadas en la quimioterapia contra el
cáncer. También se ha sugerido que desempeñan una función homeostática a nivel de la
transducción de señales y un papel en los procesos de crecimiento, diferenciación y
transformación (Arrigo y Landry, 1994).
Parece ser que el papel de las sHsp en la termotolerancia se debe a su capacidad de proteger
y/o reparar las proteínas desnaturalizadas, funcionando como chaperonas moleculares y
modulando la dinámica de los filamentos de actina (Jakob y Buchner, 1994; Mchaourab et al.,
1997).
52
Hsp60
La chaperonina Hsp60 es una de las principales chaperonas moleculares expresadas
constitutivamente. Está presente en procariotes y en eucariotas y tiene funciones tanto en el
doblamiento como en el ensamble de proteínas oligoméricas (Soltys y Gupta, 1997). Actúa en
conjunción con la co-chaperonina GroES una subunidad anular simple de 10 kDa que se liga a
GroEL y coordina su actividad ATPasa, facilitándole el doblamienmto de las proteínas (Lewis
et al., 1996).
La maquinaria GroEL se localiza en el extremo dista1 de la ruta de transferencia de la
información genética, asistiendo a un conjunto grande y específico de proteínas
citoplasmáticas recientemente traducidas para que alcancen sus estructuras terciarias
naturalizadas (Horwich et al., 1993).
El mecanismo mediante el cual el complejo GroEL/GroES facilita el doblamiento de las
proteínas involucra el “secuestro” de la proteína objetivo a la que se unen, ofreciéndole un
medio ambiente protegido en el cual pueda ocurrir el doblamiento espontáneo en ausencia de
interacciones intermoleculares que, de otra forma, pudieran conducir a la agregación (Lewis et
al., 1996)
De todas las proteínas accesorias involucradas en el doblamiento de las proteínas sustrato, la
chaperonina bacteriana GroEL probablemente sea la mejor estudiada. Es un miembro de las
proteínas de la clase Hsp60 y está compuesta de 14 subunidades idénticas acomodadas en dos
anillos heptaméricos, cada uno de los cuales contiene una gran cavidad dentro de la cual se
liga y se dobla subsecuentemente una proteína sustrato. Ya que sólo una o dos moléculas de
proteína pueden contenerse dentro de la cavidad, la oportunidad de que ocurra una agregación
53
es remota, consecuentemente, la chaperonina aumenta la posibilidad del doblamiento correcto
y disminuye la posibilidad de agregación, como ocurriría en el atestado y caótico ambiente
celular (Frieden y Clark, 1997).
El mecanismo y la constante de velocidad para el doblamiento de una proteína son los mismos
en presencia o en ausencia de GroEL. La proteína puede disociarse de GroEL en cualquier
punto a lo largo de la ruta de doblamiento, pero si esto sucede tempranamente puede darse
como resultado una agregación. La capacidad de GroEL para doblar las proteínas
correctamente sin agregación, es una consecuencia de la estabilidad del complejo formado
entre GroEL y la conformación proteica justo antes del paso final de doblamiento. De esta
manera, más que preguntarse si una proteína dada se ligará con GroEL, la cuestión relevante
parece ser en qué punto de la ruta de doblamiento se asocia o se disocia de GroEL una
proteína dada (Frieden y Clark, 1997).
Aunque en los eucariotas la Hsp60 se localiza primariamente dentro de la mitocondria y los
cloroplastos, una subpoblación de la Hsp60 está también presente en sitios
extramitocondriales, incluyendo a la superficie celular. Esta última, puede estar involucrada
con la función de transporte a través de la membrana plasmática, en concordancia con la
función bien establecida que tiene en las secreción bacteriana de proteínas, y con su
participación como un importante autoantígeno en numerosas enfermedades autoinmunes e
infecciones patogénicas (Soltys y Gupta, 1997).
El termosoma, descubierto originalmente como un complejo ATPasa de alto peso molecular,
que en el choque calórico se acumula selectivamente en el archaeon Pyrodictium occultatum,
se ha propuesto por sus características bioquímicas y microscópicas como un nuevo tipo de
54
chaperonina, cuya secuencia está relacionada con el complejo T polipéptido- l (TCP-1) de los
eucariotas, que es uno de ocho tipos diferentes de subunidades presentes en las chaperoninas
citosólicas eucariotas ahora conocidas como complejo anular TCP-1 o TriC, o chaperoninas
que contienen TCP-1, CCT. Para distinguirlas de las chaperoninas del grupo 1 o semejantes a
GroEL, que contienen siete subunidades y están presentes en las bacterias, las mitocondrias y
los cloroplastos, las subunidades de TriC/CCT y las subunidades del termosoma constituyen
ahora una familia de proteínas denominadas chaperoninas del grupo II que contienen ocho o
nueve subunidades (Nitsch et al., 1997).
Hsp70
Las proteínas Hsp70 funcionan en diversos conjuntos de procesos que incluyen el doblamiento
de proteínas, la asociación y disociación multimérica, la translocación de proteínas a través de
las membranas y la regulación de la respuesta al choque calórico (Morirnoto et al., 1994;
Rassow et al., 1995; Hartl, 1996).
La familia de las Hsp70 (DnaK en Escherichia coli) comprende varias proteínas
estrechamente relacionadas con un peso molecular cercano a los 70 kDa. Los miembros de
esta familia se encuentran en el citosol de los procariotes y de los eucariotas, y en los espacios
luminales de la mitocondria, el cloroplasto, y el retículo endoplásmico (Cuadro 2). En el
proceso de síntesis de las proteínas se ligan a las cadenas nacientes y a los polipéptidos
completos una vez que éstos son liberados del ribosoma (Craig et al., 1993; Kelley y Landry
1994; Cyr et al., 1994; Glick, 1995; Rassow et al., 1997).
Las chaperonas Hsp70 están implicadas en el doblamiento de las proteínas, el ensamble y
desensamble de compuestos oligoméricos, así como en la síntesis y la degradación de
55
proteínas. Adicionalmente, hay miembros de la familia Hsp70 localizados dentro de la
mitocondria y del retículo endoplásmico, que desempeñan un papel crítico en la translocación
de las proteínas desde el citosol hacia el interior de esos organelos, ligándolas durante las
etapas iniciales de este proceso (Craig et al., 1993; Kelley y Landry, 1994; Glick, 1995;
Rassow et al., 1997).
Las Hsp70 son las chaperonas evolutivamente más conservadas entre todas las especies, desde
las bacterias hasta los humanos (Craig y Gross 1991; Craig et al., 1993). Una excepción
notable es la archeabacterium Methanococcus jannaschii, de quien en 1996 se publicó la
secuencia completa de su genoma, donde aparentemente no hay señales de ningún gen hsp70,
lo cual hace pensar que probablemente en este organismo otra chaperona tome el papel de la
Hsp70 (Rassow et al., 1997)
Existen similitudes de un 50% entre el DnaK de E. coli y las Hsp70 de las células eucariotas.
Al interior de estas últimas, las similitudes van de un 50 a un 98%. Comparando las Hsp70
conocidas, la porción N-terminal está más conservada (66%) que la porción C-terminal (33%)
Debido a la gran conservación de su estructura primaria, las Hsp70 de diferentes orígenes
tienen propiedades bioquímicas similares, tales como una gran afinidad en los sitios de enlace
con ATP y con los péptidos (Gething y Sambrook, 1992). Las Hsp70 poseen un pico de
actividad ATPasa, el cual, al menos en algunos casos se estimula al enlazarse con el péptido.
Los sitos de enlace con el ATP y con el péptido están localizados en dos dominios separados
de la proteína (Craig et al., 1993).
En la acción de las proteínas Hsp70 es central su capacidad para ligarse con las estructuras
proteicas no naturalizadas. Su unión y liberación controlada al sustrato está acoplada a un
56
ciclo de reacción de ATPasa que involucra la acción concertada de proteínas co-chaperonas
específicas, quienes sirven con factores reguladores que modulan la actividad chaperona. En el
caso de la Hsp70 de E. coli, DnaK, las co-chaperonas incluyen a DnaJ, quien estimula la
actividad ATPasa de DnaK, y a GrpE, quien promueve el intercambio de nucleótidos, reacción
necesaria para la disociación de los complejos estables entre DnaK, DnaJ y los polipéptidos
(Cyr et al., 1994; Craven et al., 1997).
A pesar de trabajar coordinadamente, DnaK y DnaJ presentan una especificidad de sustrato
diferente: mientras DnaK se une a proteínas desdobladas, reconociendo porciones cortas de
aminoácidos que asumen una conformación extendida, DnaJ, en contraste, se une a sustratos
proteicos que exhiben una estructura secundaria o terciaria, mostrando muy poca afinidad por
los polipéptidos en conformaciones extendidas (Cyr et al., 1994).
Los mecanismos generales que se describen para las funciones de estas proteínas en E. coli
han sido notablemente conservados a lo largo de la evolución en los eucariotas (Cuadro 3). En
estos últimos, un aspecto emergente de la función de las proteínas análogas a DnaJ es el de
actuar como adaptadores para la conducción de sustratos específicos para diversas proteínas
Hsp70, incrementando sustancialmente la especificidad de su función (Cyr et al., 1994).
Las Hsp70 juegan un papel central en el crecimiento celular normal, pues se involucran en el
enlace y liberación de otros polipéptidos para facilitar o prevenir interacciones inter e intra
moleculares. Se considera que realizan esta misma función después de la exposición a
condiciones de estrés. Estas proteínas esenciales para la viabilidad celular, tienen su expresión
altamente regulada para alcanzar las concentraciones adecuadas bajo condiciones de
inducción. Un mecanismo homeostático involucrado en la detección del nivel de Hsp70 libre
57
en la célula, provee de un “termómetro” que reacciona a los cambios de temperatura (Craig y
Gross, 1991).
Cuadro 2 Proteínas Hsp70, DnaJ homólogas identificadas en eucariotas. Cyr et al., 1994.
Nombre Organismo Características notables YDJ1/MAS5 Saccharomyces cervesiae Citosol; mteractua con la Hsp 70; transporte de proteínas SCJ1 S, cervesiae Mitocondria/RE transporte de proteínas MDJ1 S. cervesiae Mitocondrial; doblaje de proteínas XDJ1 S. cervesiae No expresada LDJ1 Allium porrum Encontrada en células epidermales. ANJ1 A. nummularia Asociada con membranas. CSDNAJ Cucumis sativus Expresada en todos los tejidos. HDJ2 Horno sapiens Encontrada en tibrosarcoma y células epiteliales. TID56 Drosophila melanogaster Funciones en la supresión de tumores. SIS1 S. cervesiae Citosólica y nuclear, iniciación de la traducción. YDJ2 S. cervesiae ? HSJ1 H. sapiens Cerebro; enriquecida en neuronas. SCJ1 Caenorhabditis elegans ? SEC63 S cervesiae Proteína integrante de las membranas; translocación de
proteínas ZUO1 S. cervesiae Una proteína putativa hgadora Z-DNA CSP D. melanogaster Encontrada en cerebro y retina. RESA Plasmodium falciparum expresada como un antigeno de la superficie celular en los
glóbulos rojos HDJ1 H.sapiens Asociada al núcleo. HSP40 H. sapiens Concentrada en el nucléolo durante el choque calórico. DNAJ S. pombe ?
Ha sido algo común el identificar dentro de un mismo compartimento subcelular, tal como el
citosol, el retículo endoplásmico o la mitocondria, múltiples y diferentes Hsp70s, cuyas
acciones están íntimamente conectadas, pero no son equivalentes, y requieren de futuras
investigaciones (Craven et al., 1997)
En los humanos, la familia multigénica de las Hsp70 consiste de al menos cuatro miembros:
Hsc70, Hsp70, GRP78 (BiP) y Hsp75. Esa última tiene una masa molecular de -75 kDa, y ha
sido referida como PBP74, una proteína del ratón implicada en el procesamiento de péptidos
por las células B, mtHsp75 (o GRP75), una proteína mitocondrial de la rata y el humano, o
como mortalina, un producto de un gen relacionado con la senectud, y la pp75, la primera
58
proteína de choque calórico que se sabe es sometida a la fosforilación de la tirosina cuando las
células son sujetas a estrés oxidativo; esta fosforilación es un elemento regulador clave en
numerosas rutas de transducción de señales y procesos celulares (Hadari et al., 1997).
Cuadro 3 Proteínas interactuantes con las de choque calórico requeridas para el
transporte y doblaje de proteínas en Sacharomyces spp. (Brodsky, 1996)
Proteína Localización
Familia DnaK
Bip/Kar2p lumen del retículo endopásmico
Ssalp citosol.
MHsc70/Ssc1p matriz mitocondrial
Familia DnaJ
Sec63p membrana del retículo endoplásmico
Isp45/M144 matriz mitocondrial (asociado a la membrana)
Ydjlp citosol (asociado a la membrana por anclaje lípido)
Mdjlp matriz mitocondrial (proteína de la membrana periferica)
Scjlp lumen del retículo endoplásmico
Familia GrpE
Mgelp matriz mitocondrial
Mediante inmunocitoquímica se ha encontrado que un miembro de la familia Hsp70, la Hsp72
es un indicador de la respuesta cerebral al estrés. La expresión de esta proteína se ha
correlacionado como consecuencia a los daños ocasionados por la isquemia global o focal,
confirmando una fuerte asociación entre la respuesta al estrés y el daño celular (Nowak Jr. y
Abe, 1994).
59
Hsc70
Muchas proteínas chaperonas son sintetizadas constit utivamente (cognates) y juegan papeles
importantes en lo; procesos celulares normales. Estas proteínas afines son las Hsc (Bercovich
et al., 1997).
La Hsc70 bovina se considera una proteína chaperona de doblamiento, a un mínimo, se une a
los segmentos de polipéptidos nacientes o mal doblados, tal vez inhibiendo su agregación.
Entonces, el ATP induce la liberación de los péptidos dándoles la oportunidad de doblarse o
redoblarse correctamente. El enlace del ATP induce cambios conformacionales en la Hsc70
que transforma a la proteína, de un estado de alta afinidad por los péptidos a uno de baja
afinidad (O’Brien et al., 1996).
In vitro, la Hsc70 es requerida para la conjugación de la ubiquitina y la degradación
subsecuente de ciertos substratos proteolíticos. La chaperona se requiere en el paso de
conjugación y un complejo entre la Hsc70 y el sustrato proteico sirve, muy probablemente,
como un intermedio esencial en el proceso de proteólisis. No se sabe si la Hsc70 está
involucrada también en la degradación de los conjugados por el proteosoma 26S (Bercovich et
al., 1997).
Hsp90
Algunos receptores esteroideos pueden ser aislados en complejos con la Hsp90; éstos incluyen
al estrógeno, la progesterona, los andrógenos, los glucocorticoides y los mineralorticoides. En
la activación, los receptores esteroideos se disocian de las Hsp90 y se vuelven competentes
para ligarse al DNA. Esto es muy interesante, ya que los receptores pueden activarse en
ausencia del ligando en las condiciones de calor o salinidad que causan su disociación con la
60
Hsp90. Esta estrecha correlación entre disociación/actividad del receptor lleva a una
interpretación inicial: el papel de la Hsp90 es puramente inhibitorio y pasivo en el
mantenimiento de la inactividad del receptor. Sin embargo, esto es poco probable, pues
previamente a la activación de los complejos, las Hsp90 interactúan con los receptores
hormonales y con otras moléculas de señalamiento (Rutherford y Zuker, 1994).
Las Hsp90 interactúan con ciertas clases especializadas de proteínas, tales como los receptores
hormonales, las proteínas cinasas y las proteínas del citoesqueleto, regulando sus funciones
(Parselll et al., 1994; Vogel et al., 1995).
En los eucariotas, la Hsp90 es una de las proteínas más abundantes bajo condiciones
fisiológicas y su síntesis se incrementa considerablemente bajo condiciones de choque
calórico. Aunque está presente tanto en procariotes como en eucariotas, sus funciones han
sido demostradas principalmente en eucariotas superiores (Buchner, 1996).
En los eucariotas, las chaperonas Hsp90 se requieren para la activación de varias familias de
proteínas cinasas y varios receptores de hormonas en el núcleo, muchos de los cuales son
protoncogénicos y pueden desempeñar un papel importante en el cáncer (Stebbins et al.,
1997).
En contraste con las Hsp70, se sabe mucho menos de los mecanismos bioquímicos de la
familia de las proteínas Hsp90. Las funciones de estas proteínas se extienden más allá de las
propiedades generales de las chaperonas. Las Hsp90 están involucradas específicamente en el
doblamiento y regulación conformacional de numerosas moléculas de transducción de señales
médicamente relevantes, que incluyen los receptores de esteroides y varias cinasas pro-oncogénicas.
Adicionalmente, las Hsp90 participan en la renaturalización de algunas proteínas
61
que han sido desdobladas bajo condiciones de estrés celular (Obermann et al., 1998).
Recientemente Rutherford y Lindquist (1998) aportan la primera evidencia de un nuevo y
trascendental papel de las Hsp90. Se trata de un mecanismo molecular explícito que asiste el
proceso del cambio evolutivo en respuesta al medio ambiente. Sugieren que en la naturaleza,
ante una situación de estrés se produce un aumento en la concentración de proteínas dañadas
que cambia transitoriamente los niveles de Hsp90. Como esta proteína en condiciones
fisiológicas reprime la expresión de un grupo de genes mutagénicos, ante la competencia de
sustrato que se da entre los genes reprimidos y el incremento en la concentración de las
proteínas dañadas durante el estrés, como consecuencia la Hsp90 no puede cubrir a los
primeros quienes se expresan en variantes morfológicas, dejando actuar a la selección.
Así, algunos organismos tienen manera de incrementar su tasa de mutaciones en respuesta al
estrés, generando una mayor diversidad genética para que la selección natural actúe sobre ella
(Pennisi, 1998). De este modo, al permitir a los organismos albergar, bajo circunstancias
normales, una reserva de mutaciones sin que éstas los lesionen, las Hsp90 les dan la capacidad
de evolucionar más rápidamente cuando cambian las circunstancias (Rutherfor y Lindquist,
1998).
Hsp104
La Hspl04 bajo condiciones de crecimiento óptimo se expresa a niveles muy bajos,
considerándose dispensable. Sin embargo, es fuertemente inducida por el calor, y sin ella la
célula encuentra dificultades para sobrevivir bajo condiciones menos óptimas, tales como la
temperatura elevada. La termotolerancia puede inducirse en las levaduras, pero la inducción
fracasa en ausencia de las Hsp104. Se ha observado, por ejemplo, que las Hspl04 son
62
necesarias para la termotolerancia durante las fases celulares estacionarias de. las células y
esporas, así como para la tolerancia al etanol (Craig et al., 1993).
Los miembros inducibles por el calor de la familia de proteínas Hspl00 (ClpA homólogos en
E. coli) comparten una función común al ayudar a los organismos a sobrevivir al estrés
extremo, pero su mecanismo básico de acción no se ha entendido (Parsell et al., 1994).
En E. coli las proteínas Clp están involucradas en la degradación de las proteínas. Sin
embargo, se sugiere que la Hspl04 más que actuar como una proteasa, regula a una proteasa o,
por algún otro mecanismo, está involucrada en prevenir o resolver la agregación de estructuras
celulares vitales durante los tiempos de estrés. Es decir, parece ser que actúa como un
mediador de las interacciones entre las proteínas (Craig et al., 1993).
La Hspl04 no protege a las proteínas de la desnaturalización; su función consiste en promover
la proteolisis de las proteínas que forman agregados insolubles solubilizándolos (Parsell et al.,
1994). En los eucariotas, la proteolisis dependiente de ubiquitina es esencial para el recambio
de proteínas completas, así como para diversos procesos que incluyen el control del ciclo
celular, la diferenciación celular, la presentación de antígenos y la respuesta al estrés (Lam et
al., 1997).
2.5.5 Las acciones asistidas por las chaperonas.
Las chaperonas moleculares participan en diversas funciones celulares, tanto en la homesotasis
como durante el estrés. Además, mientras que algunas de ellas son proteínas constitutivas de la
célula, otras tienen el carácter de proteínas inducibles.
63
Doblamiento
El doblamiento de las proteínas in vivo, presenta varios incovenientes que no se presentan in
vitro. Primero, los polipéptidos nacientes pueden doblarse durante su síntesis en tanto emergen
de los ribosomas o son translocados a través de las membranas. Segundo, el doblamiento debe
completarse eficientemente en un ambiente muy congestionado; por ejemplo, sintetizar una
molécula de Inmunoglobulina (Ig) a una célula plasmática le lleva de 2 a 4 minutos, y cada
minuto son sintetizadas 200,000 moléculas de Ig. Tercero, en particular para los intermedios
del doblamiento, un medio ambiente muy concentrado en proteínas -tantas como 100 mg mL-1
en el lumen del retículo endoplásmico- tiene el peligro de la agregación (Melnick y Argon,
1995).
El doblamiento de las proteínas en la célula es facilitado por las chaperonas moleculares y las
enzimas. (Craig et al., 1993; Rutherford y Zuker, 1994).
Para prevenir las interacciones improductivas entre las cadenas de polipéptidos y para
promover su correcto doblamiento, parece que las chaperonas moleculares han desarrollado
durante la evolución dos mecanismos de acción distintos:
1. En un estado donde el doblamiento productivo de una cadena polipeptídica
incompleta no es posible, las superficies hidrofóbicas se escudan para evitar la
agregación, como ocurre durante la síntesis o la trans locación de las proteínas a
través de las membranas.
2. Para prevenir la agregación y al mismo tiempo para permitir el doblamiento hacia el
estado naturalizado, las proteínas completas pero desdobladas son secuestradas del
milieu celular.
Estas dos funciones, realizadas por las familias Hsp70/DnaJ y Hsp60, respectivamente, pueden
actuar juntas en una ruta secuencia1 de doblamiento asistido por las chaperonas (Craig et al.,
64
1993; Hartl et al., 1994).
En los organelos en particular, la regulación de las síntesis de proteínas se logra mediante
redes transcripcionales que responden a las variaciones en la demanda funcional de aquellos,
los cuales conducen a cambios en la expresión de los genes que codifican sus proteínas (Cox et
al., 1997).
En el retículo endoplásmico, la síntesis de las proteínas luminales es regulada mediante la
respuesta a las proteínas desdobladas (UPR), se trata de una cascada de señales de
transducción que le permiten a la célula eucariota responder a las condiciones cambiantes en el
retículo endoplásmico. La acumulación de proteínas desdobladas en el retículo conduce a un
incremento en la transcripción de los genes que codifican a las chaperonas localizadas ahí
(Cox et al., 1997).
El doblamiento de las proteínas en la célula se asegura por la interacción secuencial entre los
polipéptidos nacientes y recientemente sintetizados con las chaperonas específicas, para
formar productos intermedios más ordenados progresivamente en las rutas de doblamiento
(Hendrick y Hartl, 1993).
El doblamiento de los polipéptidos recientemente sintetizados en el atestado ambiente celular,
requiere de la asistencia de las Hsp70 y sus proteínas asociadas las cuales interactúan en los
ribosomas con las cadenas de los polipéptidos nacientes y previenen su doblamiento
prematuro o incorrecto, al menos hasta que sea sintetizado un dominio capaz de formar una
estructura estable (Hendrick y Hartl, 1993).
En ese ambiente de intensa actividad química, algunas chaperonas moleculares como las
65
Hsp60 y las Hsp90 aseguran un doblamiento sin contratiempos al brindar espacios o
microambientes protegidos a manera de “bolsillos” con un contenido hidrofóbico, al resguardo
de los solventes exteriores para ligar sustratos de unos cuantos cientos de Daltones. De este
modo permiten que la proteína sustrato, o más bien al segmento de la proteína, madurar su
conformación o ser redoblado por este sistema de chaperonas (Stebbins et al., 1997).
Las proteínas de choque calórico también hacen posible que ciertos componentes de las rutas
de señalamiento celular, incluyendo los receptores para las hormonas esteroides y las enzimas
cinasas, se doblen en la conformación correcta para responder rápidamente a las señales que
las activan. Este grupo de moléculas se denominan inmunofilinas o ciclofilinas, y se ha
sugerido que tienen una función esencial en la vida diaria de la célula (Lindquist, 1986).
Translocación
El citoplasma de las células eucariotas está subdividido en organelos - compartimentos
funcionalmente distintos y limitados por membranas- que le permiten realizar las múltiples
funciones especializadas que requiere. En respuesta a las necesidades cambiantes de la célula,
se modifica la cantidad y composición de las sustancias constituyentes o contenidas en cada
organelo (Cox et al., 1997).
La translocación de proteínas dentro del lumen del retículo endoplásmico es un paso esencial
en la biogénesis de las proteínas secretoras y para algunas proteínas que están destinadas para
residir en el interior de los organelos intracelulares. La translocación requiere de la hidrólisis
del ATP y la función de proteínas en el citosol, en la membrana y en el lumen del retículo
endoplásmico. Las proteínas destinadas para la translocación contienen una señal péptida que
objetiva a la cadena naciente para la cara citoplásmica de la membrana del retículo
66
endoplásmico (Brodsky y Schekman, 1994).
Muchas proteínas se sintetizan como moléculas precursoras en el citosol y subsecuentemente
son translocadas a través de unos canales de naturaleza proteíca de las membranas. Algunas de
estas precursoras se asocian con las chaperonas citosólicas hasta abordar la maquinaria de
translocación. De este modo, la importación de proteínas al interior de la mitocondria y del
retículo endoplásmico, depende de las chaperonas luminales Hsp70. Tanto la chaperona
mHsp70, localizada en la matríz mitocondrial, como la Kar2p del retículo endoplásmico, son
componentes esenciales del sistema de translocación en sus respectivos organelos (Glick,
1995).
La translocación y el transporte de proteínas desde su lugar de síntesis hasta su sitio de
operación funcional en cualquier parte de la célula, involucra una serie de pasos definidos
funcionalmente, lo que implica que durante el proceso de tránsito, la proteína o sus
componentes precursores deban modificar su estructura tridimensional (Pfanner y Neupert,
1990). También es necesario protegerlas de un doblamiento prematuro y dirigirlas
adecuadamente a sus maquinarias de translocación. Para asegurar que este proceso tenga
precisión y una velocidad alta, se integra un sistema citosólico consistente de una variedad de
chaperonas moleculares, catalizadores del doblamiento y factores de objetivación (Bukau et
al., 1996).
Se han estudiado las rutas de exportación de las proteínas usadas por los procariotes y los
eucariotas. En los eucariotas superiores, los estudios bioquímicos revelaron que el proceso de
objetivación de las proteínas secretoras nacientes para el retículo endoplásmico requería de
una partícula de ribonucleoproteína citoplásmica (RNP), de una partícula de reconocimiento
67
de señal (SRP) y de un receptor unido a la membrana. La caracterización de la SRP y de su
receptor en organismos mamíferos hizo posible la identificación de componentes relacionados
en varios procariotes (Wolin, 1994).
La SRP es una RNP de 1lS6 que se requiere para la objetivación cotraduccional de las
proteínas secretorias nacientes destinadas al retículo endoplásmico. (Wolin, 1994).
La traducción de las proteínas secretorias comienza en los ribosomas que están libres en el
citosol. Estas proteínas tienen como característica común una señal peptídica hidrofóbica
(péptido señal), generalmente con una extensión amino terminal de 15 a 30 aminoácidos.
Cuando emerge de la subunidad ribosómica mayor, la SRP se liga al péptido señal y detiene o
retrasa la traducción del péptido naciente. Entonces, la SRP objetiva al complejo ribosoma-cadena
naciente hacia la membrana del retículo endoplásmico, mediante una interacción con el
receptor de la SRP, que es una proteína heterodimérica de la membrana del retículo
endoplásmico. El complejo ribosoma-cadena naciente se libera de la SRP haciendo contacto
con el aparato de translocación en un proceso dependiente del GTP, ya que el desplazamiento
de la SRP del receptor requiere hidrólisis del GTP (Wolin, 1994).
Los componentes de la SRP y de su receptor se han identificado en una asombrosa diversidad
de organismos. En todos los organismos eucarióticos examinados, los homólogos de la SRP y
de su receptor funcionan en la objetivación de las proteínas hacia el retículo endoplásmico
(Wolin, 1994).
En S. cervesiae existen diversas Hsp70 involucradas en la translocación de proteínas en
_______________________ 6 S significa unidad Svedberg. Una unidad para expresar el coeficiente de sedimentación de macromoléculas biológicas 1S = l0-13 segundos.
68
diferentes situaciones y subcompartimentos, que incluyen a las citosólicas Ssalp y Ssa2p, las
cuales mantienen la translocación competente de precursores de proteínas, las Ssa3p y Ssa4p
quienes cumplen idéntica función pero cuya expresión solamente se da bajo condiciones de
estrés. En el retículo endoplásmico está la Kar2p (Ssdlp), quien unida a la Sec63p se
involucra en la importación de proteínas, de manera similar a la Lhslp (Ssilp; Cerlp). En la
mitocondria, la translocación de las proteínas a través de las membranas mitocondriales está
regulada por Ssclp (mtHsp70), formando un complejo con las subunidades de la endonucleasa
Scel Tim44 y Mgelp, una proteína de la membrana mitocondrial interna. Se sugiere que la
Hsp70 atrapa a los polipéptidos en translocación dentro de la matríz mitocondrial o puede
dirigir activamente la translocación mediante cambios en la conformación de aquellos
(Rassow et al., 1997).
La mitocondria y las Hsp
Una mitocondria consiste de dos subcompartimientos membranosos (la membrana externa y la
membrana interna) y de dos subcompartimientos acuosos (el espacio intermembranal y la
matriz). La mitocondria surge y crece por la división de otras preexistentes. El crecimiento
ocurre por la inserción de constituyentes recientemente sintetizados, que resultan en una
expansión de los diversos compartimentos mitocondriales (Pfanner y Neupert, 1990; Neupert,
1997).
La ingestión de los componentes proteicos al interior de la mitocondria ha sido objeto de
estudio. El aspecto fundamental de la objetivación de las proteínas para la mitocondria es la
transferencia de proteínas codificadas en el núcleo y sintetizadas en el citoplasma, a través y
entre las membranas mitocondriales. Muchos cientos de proteínas diferentes participan en este
proceso, contrastando con unos cuantos componentes proteicos codificados en el DNA
69
mitocondrial, sintetizados por los ribosomas mitocondriales e insertados en la membrana
interna del lado de la matríz. Exiten diferentes rutas de objetivación y acomodamiento que
conducen a las proteínas dentro de la membrana mitocondrial interna, en un proceso que por
su gran complejidad no está actualmente bien comprendido (Neupert, 1997).
Las señales de objetivación en las proteínas precursoras son reconocidas por los receptores
específicos de la superficie mitocondrial. Para la translocación al interior de las membranas, se
requiere una conformación de doblamiento laxa y un gasto de energía, usando ATP, para la
importación. El transporte de proteínas dentro o a través de la membrana interna, ocurre en
sitios de contacto entre ambas membranas mitocondriales. En la matriz mitocondrial, las
proteínas precursoras son procesadas proteolíticamente y sus cadenas de polipéptidos son
dobladas de nuevo. Finalmente, las proteínas se ubican en sus respectivos subcompartimientos
mitocondriales y, en muchos casos, son ensambladas en complejos de múltiples subunidades
(Pfanner y Neupert, 1990).
Objetivación
El tráfico de proteínas en el interior de los organelos y a través de la membrana plasmática de
los procariotes está mediado por la interacción de secuencias de señales en las proteínas
precursoras que discretamente las objetivan e involucran componentes específicos, tanto en el
citosol como en las membranas objetivo; de esta forma, las proteínas precursoras son dirigidas
eficientemente hacia membranas específicas en un estado extendido apropiado para la
translocación (Mihara y Omura, 1996).
Muchas proteínas mitocondriales son sintetizadas con secuencias extra amino-terminales de 20
a 80 residuos de aminoácidos, denominadas presecuencias, éstas llevan información como
70
señales de objetivación para dirigirlas al interior de la mitocondria mediante los aparatos
mitocondriales de importación (Pfanner y Neupert, 1990).
Al inicio de la síntesis de la mayoría de las proteínas secretoras y las de membrana, éstas se
acomodan mediante secuencias hidrofóbicas de señalamiento que las dirigen para su
translocación cotraduccional a través de la membrana del retículo endoplásmico. La
objetivación del complejo ribosoma-cadena naciente involucra la unión de la secuencia de
señalamiento de la cadena con SRP, lo que permite una interacción del complejo ligado a esta
partícula con el receptor de la partícula de reconocimiento de señal o proteína muelle, situado
en la membrana denominado complejo Sec61p. Se trata de un complejo de proteína
heterotrimérica que es el componente principal del canal conductor de proteínas, y la estrecha
asociación entre un ribosoma en traducción y este complejo asegura que la alargada cadena
naciente sea transferida directamente desde el canal del ribosoma al canal de la membrana y
entonces a través del lumen del retículo endoplásmico (Neuhof et al., 1998).
Desagregación
Consideremos el doblamiento de las proteínas como un proceso de reconocimiento
intramolecular, gobernado por la constante de velocidad intrínseca de los diversos pasos del
doblamiento y por la solubilidad intrínseca de las diferentes regiones de la cadena polipéptida;
de acuerdo con esta apreciación, si a una proteína se le da bastante tiempo y está en la
presencia de las otras partes del mismo dominio de doblamiento, podrá doblarse
espontáneamente. El doblamiento probablemente ocurra mediante colisiones de las partes de
la cadena para crear subdominios estructurales marginalmente estables, que persisten si
contienen suficientes interacciones estabilizantes y, eventualmente, se ensamblan dentro del
dominio completo (Nilsson y Anderson, 1991).
71
Si disminuye la velocidad del doblamiento, si disminuye la solubilidad de la cadena
desdoblada, o si se incrementa la concentración de las cadenas nacientes, llegará a ser un
problema el exceso de agregación, pues cualquiera de estos tres factores puede acentuar las
interacciones intermoleculares a expensas del doblamiento correcto (Nilsson y Anderson,
1991).
La función primaria de la mayoría de las moléculas chaperonas es la de evitar las fallas en el
ensamble y la agregación durante el proceso de doblamiento de las proteínas (Wetzel, 1996)
ya que el estrés medioambiental, tal como el calor excesivo, causa frecuentemente la
desnaturalización de las proteínas y la formación de agregados. Para protegerse del estrés, las
células acumulan chaperonas moleculares para prevenir la formación de tales agregados, al
inhibir las interacciones incorrectas que los causan y/o al deshacer los agregados ya formados
para permitir su ensamblaje correcto (Lindquist, 1986; Ellis y van der Vies, 1991; Sanders,
1993; Waldmann et al., 1995; Pennisi, 1996).
Proteolisis
Las células de los mamíferos poseen aparentemente dos rutas principales para la degradación
de las proteínas: las proteasas lisosomales y el complejo proteosomal. Las proteínas que entran
a la célula mediante la endocitosis, la pinocitosis o la fagocitosis, son fragmentadas dentro de
los lisosomas, quienes también juegan un papel en la degradación de proteínas de los
compartimientos intracelulares, tales como la mitocondria y los retículos endoplásmico y
sarcoplásmico. Sin embargo, la vía principal de recambio de las proteínas normales y
anormales del citosol y del núcleo se realiza por un sistema proteolítico soluble, no lisosomal:
el complejo proteosomal 20S y 26S (Grune et al., 1997).
72
Las Hsp previenen la acumulación de las proteínas aberrantes generadas como resultado de la
exposición al estrés. Para ello, además de prevenir la agregación y de restablecer la estructura
naturalizada y las cantidades de sus proteínas substrato, aumentan el flujo de sustratos a través
de las rutas proteolífticas que degradan a las proteínas estructuralmente aberrantes (Craig et
al., 1994).
En todos los eucariotas existe un sistema muy conservado, el de la ubiquitina, usado como una
ruta principal para la degradación de las proteínas y el cual se cree es responsable de la
degradación de proteínas anormales y de vida corta. En sí misma, la ubiquitina es una proteína
de 76 aminoácidos, la cual al unirse en una cadena multimérica a una proteína sustrato, la
marca para su degradación proteolítica subsecuente. La cadena de multi-ubiquitinas le permite
a la proteína sustrato ser reconocida y degradada por la proteasa 26S, un complejo proteolítico
citosólico de múltiples subunidades, en una reacción dependiente del ATP (Craig et al., 1994;
Bercovich et al., 1997; Young et al., 1998).
La ubiquitina también se liga a las histonas y puede regular la estructura de la cromatina
durante la transcripción. Ha sido detectada inmunoquímicamente tanto en el citoplasma como
en el núcleo. La sobrerregulación de la ubiquitina se ha asociado con la apoptosis, el
desarrollo programado de la muerte celular (Young et al., 1998)
La degradación de proteínas específicas da la dirección, el orden y el tiempo apropiado para
los eventos clave del ciclo cromosómico en la división celular de los eucariotas. Esta
degradación se requiere para múltiples procesos en la mitosis y también para desencadenar la
replicación del DNA; de esta forma, la irreversibilidad química de la proteolisis es explotada
por la célula para dar dirección a pasos críticos del ciclo celular. Por consiguiente, la
73
duplicación celular no debe verse como una simple cascada de cinasas; sino como un proceso
en el cual, la fosforilación y la proteolisis son socios interdependientes que colaboran para
efectuar los extraordinarios procesos de la división celular (King et al., 1996).
Chaperonas e inmunidad.
Aunque la mayoría de las interacciones moleculares de los linfocitos tienen lugar en la
membrana plasmática, el retículo endoplásmico juega un papel central, pues en él se
sintetizan, doblan y ensamblan las proteínas involucradas en el reconocimiento antigénico,
antes de ser transportadas a la superficie celular. Como la transducción de señales en la
membrana plasmática involucra el enlace cruzado de los receptores, la expresión superficial de
receptores afuncionales puede interferir dramáticamente con la función inmune. Además, el
retículo endoplásmico ejerce un “control de calidad” que asegura que sólo los receptores
funcionales sean transportados a la membrana (Melnick y Argon, 1995).
En el retículo endoplásmico las chaperonas separadas no realizan funciones redundantes, sino
que reconocen distintas características estructurales en los receptores antigénicos y en otras
proteínas itinerantes del retículo endoplásmico, conduciéndolas a un enlace selectivo. Mientras
que la BiP y la calnexina son más promiscuas al ligarse, GRP94 y posiblemente las
inmunofilinas tengan un pequeño juego de sustratos. Al igual que sus contrapartes
mitocondriales y citoplásmicas, se considera que estas proteínas trabajan concertadamente
facilitando las etapas sucesivas del doblamiento y el ensamble. Tales mecanismos pueden ser
regulados finamente, posibilitando a los linfocitos y a otros tipos de células el cubrir las
demandas metabólicas cambiantes durante la diferenciación y la circulación en el sistema
inmune periférico (Melnick y Argon, 1995).
74
2.6 La termotolerancia como respuesta de aclimatación
La respuesta al estrés y la adquisición de tolerancia al estrés se observa comúnmente en todos
los organismos, desde las bacterias hasta los vertebrados superiores y se considera como uno
de los mecanismos de defensa de la célula esenciales contra diversos estresores ambientales
(Parselll y Lindquist, 1993)
Los organismos responden a los diversos niveles de estrés, empleando las actividades de
diferentes proteínas de choque calórico. Las Hsp parecen estar especializadas de tal forma que
los organismos puedan responder apropiadamente a un nivel de estrés en particular. Sin
embargo, la tolerancia es uno de los aspectos más desconcertantes de las Hsp, ya que distintos
organismos emplean diferentes Hsp para responder a lo que parecieran niveles similares de
estrés (Parsell y Lindquist, 1993).
Las Hsp confieren protección contra el daño celular induc ido por el medio ambiente. La
acumulación de proteínas de estrés se correlaciona con la tolerancia adquirida, en la que un
régimen de estrés de mediana intensidad confiere la capacidad de sobrevivir a un estrés
subsecuente, pero más severo, que de otra manera sería letal (Sanders, 1993).
Al respecto se ha observado morir rápidamente a los organismos mesofilos cuando crecen a
temperaturas normales y súbitamente son cambiados a temperaturas más severas. Sin
embargo, si reciben previamente un tratamiento breve, a una temperatura más moderada para
inducir la síntesis de Hsp, y hasta entonces son cambiados a las temperaturas severas, se
observa que tardan mucho más tiempo en morir. Los efectos de estos pretratamientos pueden
ser notables, ya que en la supervivencia de los organismos condicionados con los no
75
condicionados, con frecuencia se encuentran diferencias en su resistencia de un orden 100 a
1000 veces mayor (Kampinga, 1993; Parsell et al., 1993; Parsell y Lindquist, 1994).
El condicionamiento por tratamiento de calor también provee de tolerancia transitoria para
muchos otros tipos subsecuentes de estrés, tales como la exposición al etanol, al arsenicato de
sodio y al peróxido de hidrógeno. Lo mismo sucede a la inversa, ya que todos estos estresores
tienen en común la síntesis de Hsp, postulándose que éstas son las responsables de la
termotolerancia (Kampinga, 1993; Parsell et al., 1993; Parsell y Lindquist, 1994).
A la termotolerancia contribuyen tanto las diferentes condiciones de crecimiento como los
aspectos genéticos. Mientras que las primeras han sido extensamente estudiadas, los segundos
apenas está comenzando a descifrarse (Parsell y Lindquist, 1994).
Una vez que las células se han hecho termotolerantes, las Hsp están presentes en cantidades
elevadas. Por otra parte, si se provoca una inhibición de las Hsp70 inducidas por el calor, la
termosensibilidad se incrementa (Kampinga, 1993).
Diversos investigadores han intentado encontrar índices adecuados para tasar el grado en que
el estrés calórico afecta la salud y la producción de los animales, estudiando la relación entre
la temperatura ambiental y distintos aspectos de la físología como la temperatura corporal
interna y la tasa respiratoria (Devendra, 1987; Gall, 1991; Liao y Veum, 1994).
Se han evaluado las respuestas al estrés relacionadas más directamente con el metabolismo
energético del animal, tales como el consumo de alimento y la producción de calor; sin
embargo, estos indicadores han resultado burdos, poco confiables y complicados. Por otra
parte, las mediciones endocrinas como los niveles del cortisol han sido indicadores más
76
precisos (Hahn, et al., 1992).
Actualmente, en el estudio del estrés calórico en los mamíferos, el conocimiento concerniente
al papel homeostático de las proteínas de choque calórico como indicadores de adaptación se
realiza en cultivos celulares (Holbrook y Udelsman, 1994).
Los linfocitos se han usado con éxito como un modelo biológico, debido a que son células
relativamente fáciles de colectar y conservar viables en el laboratorio. Además, los efectos del
choque calórico sobre su supervivencia y el nivel de síntesis de las chaperonas moleculares
está bien documentado (Kamwanja, et al., 1994).
Los linfocitos bovinos aislados y conservados in vitro, al ser sometidos a estrés por calor,
sintetizan proteínas de choque calórico Hsp70 y Hsp90. Éste es un mecanismo importante de
respuesta celular al estrés calórico (Guerrviro y Reynes, 1990).
En el fenómeno biológico de la adaptación confluyen aspectos genéticos y epigenéticos. Los
primeros, materializan en genes potencialmente expresables la experiencia filogenética que su
ascendencia ha legado al individuo y que ha sido mediada principalmente por la selección
natural y en menor medida por el azar y la intervención humana. Los aspectos epigenéticos,
por otra parte, reflejan la pasticidad del individuo para expresar los genes que mejor
convengan a la circunstancia en la que ha de operar su programa de desarrollo.
La potencialidad genética es mayor a las posibilidades de expresarla. Consecuentemente, los
individuos expresarán aquellas combinaciones de genes que los capaciten mejor para enfrentar
las particularidades de su medio ambiente y mejoren sus posibilidades de alcanzar la edad
adulta y la reproducción.
77
En México, la base genética de los caprinos tiene dos orígenes principales:
l Las razas de las zonas semiáridas de España, de los que descienden las razas criollos
existentes en el país.
l Las raza de las zonas templadas y frías de Europa, importados principalmente
durante la segunda mitad del presente siglo.
Se considera la existencia de diferencias entre estos genotipos en la capacidad de soportar el
calor y en el hecho de que los primeros son más resistentes, aunque parte de esta variación sea
debida a diferencias anatomo-fisiológicas en la capacidad para minimizar la hipertermia o sus
efectos. Es posible que también existan diferencias genéticas en sus respuestas celulares al
incremento de temperatura, tales como la tasa de expresión de las proteínas de choque
calórico.
Por otra parte, el desarrollo de termotolerancia puede ser un componente epigenético
importante cuando los seres vivos han experimentado un choque calórico y logran sobrevivir.
En este caso, es más probable que los animales originarios de medios ambientes en los que las
temperaturas prevalecientes estén por encima del límite superior de la zona termoneutral
desarrollen la termotolerancia con mayor eficiencia, que aquéllos cuyo medio ambiente
térmico se mantiene dentro de esta zona.
Por consiguiente, puede considerarse que, ante una situación de estrés calórico in vitro, se
desarrolle una respuesta al choque calórico más eficiente:
l En las células de los animales cuya filogenia haya evolucionado en ambientes áridos
(componente genético en la respuesta).
l En las células de los animales cuya historia de vida transcurra en un medio ambiente
calurosamente estresante donde se haya inducido termotolerancia (componente
78
epigenético en la respuesta).
Para evaluar la respuesta de los linfocitos al estrés calórico y definir su naturaleza, se
utilizaron los obtenidos de caprinos con y sin experiencia a choque calórico ambiental,
habitantes de zonas áridas calurosas y de zonas áridas templadas. Después de sujetarlos a
estrés calórico se estimó su supervivencia, se identificó la clase de Hsp sintetizada y se estimó
la síntesis de la Hsp70.1
79
3 MATERIALES Y MÉTODOS
Para evaluar y definir la naturaleza de la respuesta celular al estrés calórico, se utilizaron los
linfocitos obtenidos de cabras de cuatro diferentes razasos, dos de ellas (Saanen y Granadino)
contaban con una historia de vida transcurrida en una condición árida calurosa (CAC) y
poseían experiencia inmediata de estrés calórico debido al medio ambiente, mientras que la
historia de vida de los dos restantes (Nubia y Criolla) transcurría en una condición árida
templada (CAT) sin contar con experiencia inmediata de estrés calórico ambiental. Después de
exponer a los linfocitos a estrés calórico durante tres horas a temperaturas de 5, 10 y 15% por
arriba del valor de la temperatura fisiológica interna de la especie (Schlesinger et al., 1997) se
determinó su supervivencia, se identificó la clase de Hsp sintetizada y se estimó la Hsp70
sintetizada a consecuencia del estrés calórico inmediatamente después de concluir el
tratamiento estresante.
3.1 El lugar de experimentación
El experimento se realizó en el Centro Regional de Estudios Nucleares (CREN) de la
Universidad Autónoma de Zacatecas, ubicado en Ciprés No. 10, Fraccionamiento La Peñuela
de la capital de ese estado.
3.2 Los especimenes y su ambiente
Se escogió como modelo biológico el linfocito periférico de la cabra (Capra hircus) en espera
de que, al evaluar la respuesta celular al estrés calórico, ésta sería más rápida en comparación
con la de otros mamíferos domésticos, al considerar que tiene un fondo genético que le ofrece
80
más posibilidades de desarrollar la tolerancia al calor, sea como animal completo o en el
ámbito celular, dado el origen evolutivo de esta especie quien surge en el medio ambiente
árido y caluroso del Asia Menor.
Se utilizaron linfocitos colectados de animales que habitaban dos áreas geográficas con
distinto grado de exposición natural al estrés calórico, una con alta exposición (CAC), y otra
con baja exposición (CAT), en meses del año de clima caluroso y frío respectivamente:
1. La CAC esta localizada en la parte sur de desierto de Chihuahua (26º06’ LN,
103º26’ LE y 1,092 msnm). Cuenta con un clima muy árido, semicálido, con lluvias
en verano y un invierno fresco (BWhw). Sus temperaturas medias fluctúan entre los
12.7ºC en enero y los 28.5ºC en junio, con extremas de 5°C y 41.5ºC. La
precipitación pluvial es de alrededor de 200 mm anuales (García 1988). Debido a la
elevada radiación solar, la evaporación es diez veces mayor que la precipitación. El
mes de mayo, cuando se realizó el experimento (1997) se considera como uno de los
más calurosos del año (Mazcorro et al., 1991). Los espécimenes correspondieron a
las razas saanen (n=5) y granadina (n=4).
2. La CAT se ubica a 22º52’ LN, 102º LO y a 2,153 msnm. Es una región con clima
semiárido templado y extremoso con verano cálido y lluvias durante el mismo
[BSlkw (e) w”] con una precipitación media anual de 448 mm y una temperatura
promedio de 15.4ºC, con extremos de -11°C mínima y 32°C máxima, así como un
período de heladas que se extiende de noviembre a-abril. El mes de enero durante el
cual se realizó el experimento (1998) se considera uno de los más fríos del año, con
una precipitación media de 13.2 mm y una temperatura media de 10.1 ºC (García,
1988). Los especimenes correspondieron a las razas nubia (n=4) y criolla (n=4).
Lo s especimenes para el estudio se escogieron acordes con un criterio que consideró la
homogeneidad en el sexo, la edad, el estado fisiológico y la condición física.
81
3.3 Equipo y materiales de laboratorio
Los equipos utilizados en el laboratorio se presentan en el Cuadro 4, los accesorios,
consumibles e instrumentos diversos en el Cuadro 5 y los reactivos en el Cuadro 6. Los
reactivos utilizados fueron de la mayor pureza disponible en el mercado correspondiente a los
grados electroforético y de cultivo celular. Las soluciones fueron preparadas el mismo día de
los experimentos. La 35S L-metionina se utilizó dentro del período recomendado por el
fabricante. Todos los materiales consumibles utilizados fueron desechables y de la mayor
calidad disponible. Los equipos de medición estaban debidamente calibrados antes de
utilizarlos.
82
Cuadro 4. Equipo usado en el laboratorio
Item # de catálogo Catálogo Agitador magnético con placa caliente Cole Palmer mod. 4809-00
Balanza analítica A&D mod. ER-180 A
Campana de flujo laminar Alder
Centrífuga Sorvall DuPont mod T6
Contador de radiación Radalert 50
17-985-412 Fisher
Espectrofotómetro Perkin Elmer
1 ? 1 uv visible
Fuente de poder Power Pac 1000
165-2990 Bio Rad
Incubadora bacteriológica Precision mod. 2EG
13-255-1 Fisher
Micro centrífuga Eppendorf mod. 5415C ve1 variable hasta 14,000 rpm (16,000 G)
22 36 280-l Brinckmann
Microscopio Carl Zeiss Standard KF2
12-070-273 Fisher
Plataforma de agitación orbital Bellco mod. 7744
7744-01010
Plataforma de agitación pendular Bellco mod. 7740
7740-10010
Scanner Bio Rad mod GS-670 (imaging denitometer)
Molecular Analyst/PC Bio Rad (software, Image Analysis system ver 2.0)
Sistema de transferencia electroforética semi-seca Bio Rad Mod. Trans Blot SD
170-3939 Bio Rad
Sistema para electrofóresis Mini-Protean II Cell, Bio Rad para dos placas de 10 carriles x 0.5, 0.75 o 1.0 Mm de espesor
165-2940 Bio Rad
Vortex Fisher Genie 2 12-812 Fisher
83
Cuadro 5. Accesorios, consumibles e instrumentos diversos.
Item #catálogo Catálogo Barra agitadora magnética octagonal Z 10 449-3 SIGMA Caja de lucita anti radiación ? Nalgene 14-293-62ª Fisher Cámara de Neubauer Bright-Line 02-67 l-5 Fisher Cassettes para autorradiografia Fisher Biotech para película 20 X 25 cm Fb-XC-8 10 Fisher Cassettes para autorradiografia FisherBiotech para película 35 X 43 cm Fb-XC-14 17 Fisher Contador manual 02-670-12 Fisher Escudo protector anti radiación ? Nalgene 14-293-45 Fisher Gradilla de lucita anti radiación ? Nalgene para viales de 1.5 mL 60984-597 Fisher Jeringa Hamilton Mod 8 10 100 ? L 14-815-226 Fisher Micopipetas de volumen ajustable Costar l-20; 20-200 y 1 00-1000 ? L Pinzas para manejo del papel de nitrocelulosa Fisherbrand Pipeta de repetición Eppendorf
09-753-50 22 26 060-0
Fisher Brinkman
n Pipeteador automático Pipet-Aid P 5225 SIGMA Pipeteador con bomba dual y unidad de filtración marca Drummond 53498-056 VWR Bolsas plasticas ‘Zipper” seal Fisherbrand 0l-816-1C Fisher Cojin de papel absorbente para transferencia electreoforética 170-3914 Bio Rad Papel de nitrocelulosa para transferencia elecrroforetica VWRbrand 238 8303-100 VWR Sci Papel parafilm “M” Ameritan National Can. Greenwich, CT. 06836 Pipetas de Pasteur con algodón en la boquilla. S 5893 SIGMA Pipetas de transferencia estériles desechables en envoltura individual marca Falcon (Transfer pipets)
52947-970 VWR
Pipetas serológicas estériles desechables en envoltura individual de 5 mL ee capacidad marca VWR (serologial desposable pipets, sterile, plugged glass, individually wrapped)
5328 l-702 VWR
Pipetas serológicas estériles desechables en envoltura individual de 10 mL de capacidad marca VWR (serological disponsable pipets, sterile, plugged glass, individually wrapped)
53281-724 VWR
Placa fotográfica Kodak BioMax Light Film 18 X 24 05-728-48 Fisher Placa fotográfica Kodak BioMax Light Film 20 X 25 cm 05-728-55 Fisher Placa radiográfica Kodak BioMax MR Film 20 X 25 05-728-24 Fisher Puntas de polipropileno para micropipeta Fisherbrand 2 a 200 mL 21-278-51 Fisher Puntillas universales para pipeta COSTAR, azules, no estériles 1000 ? l
l00- 4846 Corning
Puntillas universales para pipeta COSTAR natural, no estériles ? l
l-200 4844 Corning
Tubo de centrifuga Corning de 15 mL, de poliestireno, estéril, desechable fondo cónico
25311-15 Corning
Tubo de centrifuga Corning de 50 mL, de poliestireno, estéril, desechable fondo cónico
25339-50 Corning
Tubos para microcentrífuga (viales) Costar cap 0.65 mL color natural, no estéril, graduado
3208 Corning
Tubos para microcentrífuga (viales) Costar cap 1.7 mL color natural, no estéril, graduado
3620
Tubos Vacutainer heparinizados (143 USP de heparina sódica desecada)
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Cuadro 6. Reactivos
Item #catálogo Catálogo ? -Glicerofosfato G 6251 SIGMA 2-mercaptoetanol M 7154 SIGMA Acrilamida /bis-acrilamida solución al 30% relación 29: 1 A 3574 SIGMA Anfotericina B (antifungal) A 4888 SIGMA Anticuerpo monoclonal, huésped ratón, del clon no. AC-16, anti HSP90 H 1775 SIGMA Anticuerpo monoclonal, huésped ratón, del clon no. BRM-22, anti HSP70 H 5147 SIGMA Anticuerpo monoclonal, huésped ratón, del clon no. IAP -9, anti HSP25 H 0148 SIGMA Anticuerpo monoclonal, huésped ratón, del clon no. LK 1. anti HSP60 H 4149 SIGMA Azida de sodio S 8032 SIGMA Azul de bromofenol (tinción del bufer de muestra) B 8026 SIGMA Azul de triparto 0.4% T 8154 SIGMA BSA albúmina de suero bovino B 8894 SIGMA Cloruro de potasio P 9333 SIGMA Cloruro de sodio 5 M S 5150 SIGMA DTT Ditiotetriol (reactivo de Cleland) D 9163 SIGMA Desoxicolato de sodio D 5670 SIGMA ECL Reactivo para detección Western blotting Batch 55 RPN 2109 Amershan
Life Sci. EGTA (etilen glico-bis) E 0396 SIGMA EDTA 0.5 M E 7889 SIGMA Fosfato monopotásico P 0662 SIGMA Fosfato monosódico S 2524 SIGMA Estándar de marcadores de peso molecular preteñidos para SDS-PAGE y Westem blotting, Rango alto de 14.3 a 200 kD
2604 l-020 Gibco-BRL
Fracción de antisuero para IgG de ratón (molécula completa) conjugado a fluoreseína
F 9 137 SIGMA
Glicina G 8898 SIGMA Histopaque 1077 1077-l SIGMA L[35S] metionina Am Radiolabeled Chemicals 5.00 mCi actividad Marcador de peso molecular con proteínas preteñido GibcoBRL MW stds-highs 2604 l-020 life
technol. Metano1 absoluto 17-5 SIGMA Micro estándar 1 mg BSA/mL en 0.15 M NaCl P 0914 SIGMA PBS Fosfato buferado salino con Tween 20 pH 7.4 P 3563 SIGMA PBS fosfato buferado salino pH 7.2 P 0261 SIGMA PBS fosfato buferado salino pH 7.4 P 3813 SIGMA Pepstatina A (inhibidor proteasas) P 5318 SIGMA Persulfato de amonio A 3678 SIGMA PMSF(inhibidor de proteasas) P 7626 SIGMA Reactivo de Bradford B 6916 SIGMA RPMI medium 1640 con L-glutamina sin L-metionina Gibco 3RL. SFB 5% antibiótico
life technol
SDS (sulfato sódico de dodecilo) Lauril sulfato L 3771 SIGMA Solución fijadora Kodak GBX P 7147 SIGMA Solución reveladora Kodak GBX P 7042 SIGMA TEMED T 9281 SIGMA
85
Tris (trizma base ) T 8404 SIGMA Tris HCl T 8529 SIGMA TRITON X-100 1% T 8787 SIGMA
3.4 Aislamiento de los linfocitos
Para evaluar la respuesta celular al estrés, es necesario contar con células vivas y nucleadas,
capaces de realizar ajustes en su metabolismo en respuesta a cambios en su medio intracelular
como extracelular. Para obtener especimenes celulares animales actua lmente se puede seguir
alguno de los siguientes caminos:
1. Recuperar y asilar células libres, como es el caso de las células sanguíneas y de las
que pueden recuperarse del liquido amniótico.
2. Realizar cultivos primarios de tejidos, para lo cual el tejido escogido es fragmentado
y sometido a la acción de enzimas que rompan las uniones intercelulares y con el
material de sostén. Posteriormente mediante tamizados, lavados y centrifugación
pueden aislarse los especimenes.
3. Utilizar líneas celulares inmortales disponibles comercialmente. Estas células
generalmente tienen su origen en tejidos neoplásicos y han sido aisladas y
estandarizadas para su uso en el laboratorio.
En este trabajo se siguió la primera opción, debido a la corta duración de la fase experimental
que requiere de las células vivas (horas) ya que no se requirió valorar la multiplicación celular.
Obtención de sangre venosa completa, heparinizada y no hemolizada.
De acuerdo con las recomendaciones para el manejo y procesamiento de especimenes de
sangre descritas por Calama (1994), se usaron tubos vacutainter heparinizados (143 unidades
USP de heparina sódica desecada) para colectar 10 mL de sangre de cada animal mediante
venopunción yugular. La sangre se mezcló cuidadosamente con el anticoagulante. Los tubos
se colocaron en una gradilla dentro de un recipiente de poliestireno acojinado con hule
espuma, a temperatura ambiente para su transportación al laboratorio donde se inició su
procesamiento antes de transcurrir tres horas; Kamwanja et al. (1994) reportan que la sangre
86
puede permanecer hasta seis horas sin que los linfocitos pierdan su viabilidad.
En el experimento de CAC, realizado en mayo de 1997, la sangre se procesó en el laboratorio
del Centro de Investigación Biomédica de la Facultad de Medicina de la Universidad
Autónoma de Coahuila en la ciudad de Torreón, Coahuila, una hora y media después de la
obtención de la sangre, mientras que en el experimento de CAT, el mes de enero de 1998, la
sangre se procesó en el Centro Regional de Estudios Nucleares de la Universidad Autónoma
de Zacatecas, también a una hora y media después de su obtención.
Obtención de linfocitos mediante un gradiente de densidad.
Los linfocitos se aislaron generando un gradiente de densidad con Histopaque 1077 (Sigma
Aldrich St. Louis MO.), mediante la técnica de Freshney (1992), que brevemente se describe a
continuación:
Bajo condiciones estériles, en una campana de flujo laminar, se vacían 7.0 mL de Histopaque
1077 en un tubo para centrífuga de polipropileno de 15 mL de fondo cónico, dejándose a
temperatura ambiente, entonces, manteniendo el tubo inclinado en un ángulo de
aproximadamente 30°, se vacían 7 mL de sangre total deslizándola por la pared del tubo
receptor para que forme una capa sobre el Histopaque. Sin agitar su contenido, los tubos con la
bicapa Histopaque-sangre se colocan verticalmente y se tapan con papel parafilm.
Posteriormente se pesan para determinar su ubicación en la centrífuga. Las muestras se
centrifugan durante 80 minutos a 890 G.7
_________________________ 7 Debido a la variación en las dimensiones relativas al radio de las centrífugas disponibles en el mercado, la expresión de la fuerza centrífuga es más conveniente realizarla en gravedades (G) que en revoluciones por minuto, para lo cual: El cálculo de la G o fuerza centrífuga relativa, RCF, se realiza mediante la siguiente fórmula:
87
Al terminar la centrifugación y retirar los tubos de la centrífuga, debe evitarse agitarlos,
pudiendo observarse varios estratos en su interior, que corresponden de abajo hacia arriba a:
? glóbulos rojos
? células polimorfonucleares
? Histopaque 1.077
? células mononucleares (linfocitos) y plaquetas
? plasma sanguíneo.
Mientras se realiza la centrifugación, se colocan 2 mL de medio de cultivo RPMI 1640 en
tubos de fondo cónico de 15 mL, debidamente identificados para que igualen la temperatura
del laboratorio.
Los tubos se manipulan evitando alterar la interfase que contiene los linfocitos (1.5 mL) y que
tiene el aspecto de una nubecilla opaca, que se colecta aspirándola con una pipeta Pasteur
unida a una jeringa.
El material recuperado se coloca en los tubos con RPMI 1640 y se centrifugan durante 30
minutos a 400 G para eliminar las plaquetas, para ello se retira el sobrenadante dejando la
pastilla en aproximadamente 20 ? L de medio. Aforándose a 2 mL usando el mismo medio de
cultivo, los linfocitos se resuspenden mediante un pipeteo suave, hecho esto se toman 20 ? L
para determinar la viabilidad de la muestra.
________________________ RCF [G] = 0.00001118 * r * (rpm)² donde: 0.00001118 es una constante. r = radio de la centrífuga desde el eje hasta el fondo de la camisa rpm = revoluciones por minuto.
88
3.5 Estimación de la viabilidad celular Según la técnica propuesta por Winchester y Ross (1976), la viabilidad celular se determina
con base en la exclusión activa, por parte de la célula, del colorante citotóxico azul de tripano.
Por consiguiente, las células vivas no se tiñen, lo que las distingue de las muertas que sí lo
hacen.
En un vial con 20 ? L de azul de tripano al 0.4%, se mezclan 20 ?L de la muestra a evaluarse y
se dejan reposar de 5 a 15 minutos.
De la mezcla incubada se toman 15 ? L para cargar una cámara hematocitométrica de
Neubauer, que se observa al microscopio de acuerdo con la técnica descrita para contar
hematocitos (Sigma 1998). En síntesis:
La cámara hematocitométrica estándar (cámara de Neubauer), presenta una trama cuadriculada
de tres milímetros por lado, en la que se destacan:
? cuatro áreas ubicadas en cada esquina, denominadas cuadrados esquineros, cada una
con una superficie de 1mm², dividida en su interior en 16 cuadros (4 x 4) y
? un área central de 1 mm², denominado cuadrado central, que se subdivide en 25
cuadrados interiores (5 X 5), cada uno de los cuales tiene a su vez 16 divisiones (4 X
4).
En cada una de las orillas de cada cuadro esquinero y las de cada una de las veinticinco
divisiones interiores del cuadro central, se aprecia un rayado triple en lugar de uno sencillo. Al
contar, no se consideran aquellas células que ocupen el interior del rayado triple en los lados
inferior y derecho, mientras que si se cuentan las que estén en el interior del lado superior o
del izquierdo.
89
El porcentaje de viabilidad de las células se determinó al dividir el total de las células viables
(sin teñir) entre las células totales multiplicadas por 100 (teñidas y sin teñir X 100)
(Winchester y Ross 1976).
3.6 Marca radioactiva.
Una vez hecha la alícuota para determinar la viabilidad de los linfocitos, a los 2 mL restantes
de la suspensión de células en medio RPMI 1640 sin metionina, se les añaden 2 mL de medio
RPMI 1640 enriquecido con L-[35S] metionina con una actividad de 4 ?Ci/mL para obtener un
volumen total de 4 mL de suspensión celular.
Los isótopos radioactivos se usan ampliamente en biología y en química como “trazadores”
que permiten identificar cantidades muy pequeñas del material marcado. La utilidad de la
molécula marcada radioactivamente está limitada por la sensibilidad y exactitud del método
usado para detectar la radiactividad (Swanstrom y Shank 1978).
Ya que la síntesis de todas las proteínas se inicia con metionina, se usó este aminoácido
marcado con 35S para determinar si durante el estrés ocurre la síntesis de proteínas de choque
calórico.
Puesto que a partir de este paso se trabaja con materiales marcados radioactivamente, se
utilizan protecciones adicionales, como materiales de amberlita (lucita) para blindaje protector
contra radiaciones ? como pantallas, gradillas y cajas para resguardar el medio de cultivo y los
desechos marcados. Todos los materiales consumibles se colocan en bolsas de plástico
exprofeso para su concentración en contenedores especiales; los medios de cultivo y los
materiales de lavado de las muestras se concentran en un contenedor especialmente destinado
90
para su decaimiento. Durante todos estos pasos se utilizan protecciones radiológicas como
batas, dosímetros personales, contadores geiger, guantes de látex, lentes protectores y
tapabocas.
3.7 Incubación de los linfocitos testigos y bajo estrés calórico
Después de homogenizar suavemente la suspensión celular, se divide en cuatro alícuotas de
igual volumen que se colocan en tubos para microcentrífuga de 1.5 mL (viales). En este caso:
1 mL para cada tratamiento y 1 mL., para la muestra control.
Los viales usados para cada tratamiento, deben estar convenientemente identificados con la
raza, el número del animal y el tratamiento.
Por ejemplo NA38
donde:
N = Nubio
A = animal “A”
38 = tratamiento 38°C
Los viales con las alícuotas de cada espécimen se incuban durante tres horas en alguno de los
siguientes tratamientos:8
_______________________ 8 Tomando en cuenta los resultados obtenidos en el experimento realizado con los linfocitos procedentes de CAC. se realizaron cambios en el experimento de CAT consistentes en la sustitución del tratamiento de 44°C por el de 40°C, al quedar claro que a 44ºC la diferencia en la supervivencia atribuible al tratamiento es altamente significativa, independientemente de la raza. Además, se separó una alícuota control antes de los tratamientos. Estas decisiones se tomaron considerando la conveniencia de observar un tratamiento intermedio entre los 38 y 44 los 42°C. para determinar un posible umbral en caso de encontrase diferencias significativas.
91
Temperatura basal 38°C
Estrés 40°C ( CAT)
Estrés 42°C
Estrés 44°C (CAC)
En tres estufas para cultivo microbiológico, previamente esterilizadas, se calibran sus
termostatos al menos 24 horas antes de iniciar el experimento, de manera que tengan una
temperatura ± 0.25ºC de 38ºC, 40°C, 42°C y 44°C respectivamente.
Los viales conteniendo las muestras se colocan en gradillas de plástico colocadas una hora
antes en el interior de las estufas, y se incuban por tres horas en su respectivo tratamiento
térmico.
Pasado el período de incubación, se retiran las viales y la muestra es resuspendida usando una
micropipeta de 1000 ?L. Para estimar la viabilidad se toma una alícuota de 20 mL (Kamwanja,
et al., 1994) y el resto del material se centrifuga por 5 minutos a 400 G para recuperar el
sobrenadante que contiene medio radiomarcado, cuidando de no absorber la pastilla con las
células.
A partir de este momento todos los procedimientos siguientes se realizan en frío para
disminuir la actividad metabólica celular y la de las enzimas libres.
Para lavar el medio de cultivo radiomarcado residual, al vial con la pastilla de células se le
añaden 1.5 mL de PBS frío, pH 7.2 y nuevamente se centrifuga a 400 G por 5 minutos.
92
Cuadro 7. Formulación de la solución bufferada fosfatada PBS (1L)
Componente Volumen
Cloruro de potasio 0.2g
Cloruro de sodio 8.0g
Fosfato monopotásico 0.2g
Fosfato monosódico 1.15g A temperatura de la habitación, se adicionan todos los componentes a 900 mL de agua desionizada y se agitan hasta que se disuelvan por completo. Se ajusta el pH a 7.4 usando 1N HCl o 1N NaOH si fuera necesario. Aforar el volumen final a 1 litro. Si se almacena por largos períodos. fíltrar la solución a través de un filtro de 0.4? m y almacenar en un envase estéril bien cerrado.
3.8 Lisis de los linfocitos y recuperación de los extractos celulares
purificados
Para inhibir el metabolismo celular y posteriormente la autolisis, recipientes plásticos de poca
profundidad (4 cms) se preparan con hielo picado, en donde se colocan los viales con las
muestras con PBC frío mientras se completa el lote para la centrifugación.
Los viales con las células resuspendidas en 1 mL de PBS frío pH 7.2 se centrifugan a 400 G
por 5 minutos, se retira el sobrenadante que se elimina junto a los materiales radioactivos. El
procedimiento se repite por segunda vez.
A la pastilla lavada, se le añaden 200 ? L de buffer de ataque, el cual tiene la función de lisar
las membranas célulares, lo que libera a las proteínas contenidas en el interior de estas
estructuras. Por supuesto, es de esperarse una autolisis una vez que las membranas son lisadas,
pues las enzimas lisosómicas quedan libres, por ello, para evitar la autolisis el buffer contiene
un inhibidor de proteasas (PMSF).
93
El buffer de lisis contiene:
? Una solución altamente astringente (15 mM Tris HCl pH 7.5; 5 mM EDTA; 2 mM
EGTA; 1% Triton X-100; 1% desoxicolato de sodio; 0.1% SDS; 120 mM cloruro de
sodio; 25 mM cloruro de potasio y 0.1 mM DTT);
? BSA 0.25 mL/mL de la solución buffer y;
? PMSF Solución madre preparada a partir de 5 ?L/mL de la solución, de una mezcla
de 2 mg de PMSF en 35 ? L de alcohol isopropílico.
El buffer de ataque es una mezcla del buffer de lisis para extracto total y el PMSF a una
concentración 1 mM.
Es conveniente hacer la mezcla hasta que se vaya a utilizar, por lo que, antes de la preparación
debe de calcularse la cantidad requerida más un pequeño volumen como seguridad. Para cada
muestra contenida en un vial se utiliza un volumen de 200 ? l de la mezcla.
La fórmula para calcular el volumen de PMSF a utilizar es la siguiente:
(Concentración requerida) * (Volumen requerido)
---------------------------------------------------------------------------- = volumen de PMSF
(Concentración en existencia) a utilizarse
Conocido el volumen de PMSF a usarse, éste se vacía en un tubo de ensayo que se afora con el
buffer de lisis extracto total hasta el volumen final requerido.
Debido a su diferente densidad la mezcla forma una interfase, por lo que es necesario agitarla
vigorosamente. Para esto, la boca del tubo de ensayo se tapa con papel parafilm y el tubo ya
sellado, se sujeta con firmeza mientras se agita usando el vortex a su máxima velocidad (14)
durante un minuto.
94
La mezcla debe adquirir un aspecto opaco y no mostrar interfase
El lisado celular se centrifuga por 30 minutos a 16,000 G para recuperar exclusivamente la
fracción soluble, que se transfiere a viales nuevos adecuadamente etiquetados. Este extracto
celular se congela hasta que sea procesado.
3.9 Cuantificación de proteínas totales usando el método de Bradford
Para el procesamiento electroforético de los extractos celulares, primero se debe estandarizar
la concentración de proteínas de las muestras a analizar, por lo que es necesario estimar las
proteínas totales por microlitro.
Para la estimación de las proteínas totales en este trabajo, se escogió una modificación al
método de Bradford (1976) (microBradford) considerando su precisión, rapidez y sensibilidad,
ya que otros métodos como el procedimiento estándar de Lowry (195 1) están sujetos a la
interferencia por compuestos tales como el ion potasio, el ion magnesio, el EDTA, el Tris, los
reactivos tioles (DTT) y los carbohidratos; mientras que la reacción biuret es relativamente
insensible y está sujeta a la interferencia de Tris, amoniaco y glicerol. Inclusive los
procedimientos modificados para la estimación de los problemas con los ensayos de Lowry y
biuret, son problemáticos por las mayores complicaciones y tiempo que se involucran en las
modificaciones al procedimiento (Braford, 1976).
El ensayo de Bradford se basa en la observación de que el azul de Coomassie G-250 existe en
dos diferentes colores: rojo y azul. El rojo se convierte en azul a partir de la unión de la tinción
con la proteína. El complejo proteína-tinción tiene un alto coeficiente de extinción de modo
que tiende a incrementar la sensibilidad en la medición de la proteína. La unión de la tinción a
95
la proteína es un proceso muy rápido (aproximadamente de 2 minutos), y el complejo
proteína-tinción permanece disperso en la solución por un tiempo relativamente largo (1 hora
aproximadamente), de manera que hace al procedimiento muy rápido sin requerirse de un
tiempo crítico para el análisis. Además, el método permite determinar desde 1 ? g de proteína
en extractos crudos.
Procedimiento: en tubos de ensayo de 12 x 100 mm adecuadamente identificados, con una
micropipeta se vierte por triplicado la solución de proteína (albúmina de suero bovino 1
mg/mL en NaCI 0.15 M) conteniendo de 2.5 a 20 ? g de proteína (Cuadro 8) en un volumen
aforado con NaCl 0.15 M a 100 mL. Se añade 1 mL del reactivo de Bradford y el contenido de
los tubos se mezcla mediante el vortex. Los tubos para los extractos celulares contendrán 20
?L de éstos aforados a 100 ? L con NaCl 0.15 M. La absorbancia a 595 nm se mide en un
espectrofotómetro de luz visible, 2 minutos después y antes de 1 hora en cubetas de 3 mL
contra un reactivo blanco preparado a partir de 100 ?L con NaCl 0.15 M y 1 mL del reactivo
de Bradford.
El peso de la proteína testigo (0 a 20 ?g) se grafica contra el promedio de la absorbancia
correspondiente, resultando una curva estándar. Con estos valores se r-caliza un análisis de
regresión lineal, a partir del cual se ajusta la curva mediante una recta de mínimos cuadrados
usada para determinar la proteína en muestras desconocidas usando la siguiente fórmula:
?
?=a+bx
donde:
96
? = es el valor ? g de proteína) dentro de cualquier punto situado dentro del recorrido de
los valores de x.
a = es la constante de la regresión, que representa el intersecto de x.
b = es el coeficiente de x, que representa la pendiente de la recta de ajuste.
x = es el valor de la aborbancia en el caso dado.
Cuadro 8. Procedimiento para hacer la curva de calibración.
BSA ? g o ? L) NaCI 0.15 M Reactivo de Bradford 1X (mL)
0 (blanco) 100.0 1
2.5 97.5 1
5.0 95.0 1
7.5 92.5 1
10.0 90.0 1
12.5 87.5 1
15.0 85.0 1
17.5 82.5 1
20.0 80.0 1
3.10 Electroforesis de las proteínas presentes en los extractos celulares
La separación de proteínas presentes en los extractos celulares se realizó mediante un
corrimiento electroforético en gel de poliacrilamida con sulfato sodico de dodecilo bajo
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), usando la técnica desarrollada por Laemmli
(1970), que posee mayor sensibilidad para el análisis y detección de las proteínas y péptidos
(Hunkapiller et al., 1983).
Para este trabajo, la técnica se aplicó usando un gel de separación al 10% (1.0 x 160 x 200
mm) con un gel concentrador de acrilamida al 4%. En cada carril del gel se cargó una muestra
97
de entre 20 y 30 ?L (20 ? g de proteína en la muestra 0-h) dejando uno para el estándar de
masa molecular que incluye lisosima (14.3 kDa), b- lactoglobulina (18.4 kDa), anhidrasa
carbónica (29 kDa), ovalbúmina (43 kDa), albúmina de suero bovino (68 kDa), fosforilasa B
(97.4 kDa) y miosina (200 kDa). La electrofóresis se realizó en un equipo Bio Rad Pr-otean II
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) a 25 mv/gel.
Principio de la técnica
La separación electroforética ha mostrado ser una técnica de separación extremadamente útil,
cuyos principios básicos pueden ser utilizados con éxito en muy diversas escalas (Towbin et
al., 1979; Harrison et al., 1993). En este procedimiento, la muestra a fraccionarse se
desnaturaliza y es cubierta con un detergente calentándola en presencia de un agente reductor:
SDS. La cubierta del SDS da a la proteína una carga neta altamente negativa, que es
proporcional a la longitud de la cadena del polipéptido. La muestra problema se carga en un
gel de poliacrilamida que se monta en una cámara cargada con un buffer electroconductor y se
aplica un voltaje, que provoca que los componentes proteicos emigren hacia el electrodo
positivo (ánodo).
Ya que todas las proteínas tienen una carga negativa proporcional a su tamaño, las proteínas
son separadas solamente con base en su masa molecular -como resultado de su paso por la
trama de la matriz del gel, que actúa como un tamiz- de modo que las menores se deslizan a
través del gel con mayor facilidad que las más pesadas, lo que establece una gradiente de
velocidad. Si la corriente eléctrica se interrumpe antes de que las primeras proteínas lleguen al
extremo del gel y salgan de él, se suspende la migración y las proteínas quedan “atrapadas” en
el gel a diferentes distancias del ánodo.
98
La masa molecular de la proteína puede estimarse comparando la movilidad de una banda de
proteína con estándares de proteínas conocidas. La apariencia de bandas de los componentes
proteicos se logra usando un sistema discontinuo de gel, teniendo dos capas: los geles
concentrador y separador, que difieren en su concentración de acrilamida, en su pH o en
ambos (Epstein, 1987)
En la electrofóresis, el éxito de la separación está directamente relacionado con el tiempo
requerido por el campo eléctrico externo para arrastrar la cadena a través de los obstáculos
fijos que caracterizan al gel (Burlatsky y Deutch, 1993)
Entre los muchos tipos de electrofóresis en geles de poliacrilamida (PAGE), el gel en placa es
la elección debido a su conveniencia y versatilidad (Juang et al., 1984).
Después de la electrofóresis, las bandas individuales pueden visualizarse o recuperarse del gel
mediante difusión pasiva o por electroelución. Los dos métodos más utilizados para la
visualización son el del azul de Commassie y el de la tinción de plata (Merril et al., 198 l), las
cuales permiten la detección de bandas de proteína con una sensibilidad de 50 ng y 5 ng
respectivamente. (Hunkapiller et al., 1983).
Por su sencillez y debido a que las bandas de proteína pueden visualizarse para análisis
posteriores, la técnica del azul de Commassie es la más frecuentemente usada (Hunkapiller et
al., 1983).
3.10.1 Procedimiento
La técnica del corrimiento electroforético considera los siguientes pasos principales:
99
1. La preparación de las cámaras
2. La preparación de los geles
3. Preparación de las muestras
4. La colocación de las muestras en el gel
5. La corrida electroforética
6. La recuperación del gel para su tinción o transferencia a papel de nitrocelulosa.
Preparación de las cámaras:
Al armar una cámara debe verificarse lo siguiente:
? Los vidrios deben estar limpios y libres de detergente, silicón o grasa, por lo que además
se lavarán con alcohol.
? Los separadores deben de ser los correspondientes de acuerdo al grosor del gel deseado,
según el volumen de la muestra que se pretenda manejar: Para volúmenes pequeños, se
usan separadores más delgados que para los grandes.
? Los vidrios deberán ensamblarse cuidando que queden bien almacenados, y que los
separadores estén en la posición correcta, tanto en sus bordes como en sus extremos
Si se corren simultáneamente dos geles, cada cámara deberá de identificarse.
? Al quedar armada la cámara no debe haber fugas, para lo cual se llena la cámara con agua
destilada, que se vacía terminada la verificación.
? La cámara debe colocarse en una superficie perfectamente nivelada.
? La separación entre los geles concentrador y separador deberá indicarse con una marca
situada en el vidrio frontal a 5.5 cm a partir de la base.
Preparación de los geles.
Como muchos de los materiales utilizados son tóxicos (la acrilamida es neurotóxica), durante
el procedimiento se usan guantes, lentes de seguridad y tapabocas, evitando en lo posible la
inhalación. Es recomendable que las pipetas y vasos utilizados para su medición sean
100
enjuagados inmediatamente después de usarlos.
Se usan dos vasos de precipitados claramente identificados, uno de 100 mL para el gel
separador y uno de 50 mL para el gel concentrador.
Todos los materiales se alinean en la mesa en el orden en que se utilizarán.
Al añadir los ingredientes, se mezclan con la misma pipeta mediante aspiración-expulsión,
cuidando de no generar burbujas. También es conveniente deslizar la mezcla por las paredes
para que se incorporen aquellas sustancias que estuviesen adheridas a las paredes del vidrio.
Considerando que el Tris que se utiliza para cada gel es diferente en su pH y fórmula deberá
usarse una pipeta o puntilla diferente para cada uno.
Como el persulfato de amonio inicia la polimerización, sólo deberá de agregarse al tenerse la
seguridad de que todo lo demás está listo. En el caso del gel concentrador, éste se termina de
preparar y se añade hasta que el separador está totalmente polimerizado y se haya retirado el
SDS 0.1% que se usa como linearizador.
Para el trabajo se utilizan dos equipos, uno con una sola cámara (grande) y otro con dos
cámaras (chico), la fórmula siguiente (ver Cuadro 9) considera las cantidades para preparar
una cantidad de solución suficiente para llenar las tres cámaras, considerando una carga de
hasta 30 mL por pozo. Los reactivos se mezclan en el orden que aparecen escritos en la tabla
de arriba hacia abajo.
101
Cuadro 9. Gel de poliacrilamida-bis. (para ambas cámaras)
Gel separador (capa inferior) 10%
Acrilamida al 30% Bis 0.8% 13.3 mL
Tris 1.5 M pH 8.8 10.0 mL
Agua destilada 16.7 mL
SDS 10% 700 ?L
Temed 30 ?L
Persulfato de amonio al 10% 300 ?L
Gel concentrador (capa superior con las cavidades para cargar de 20
a 30 ? L con 20 ? L de proteína
4%
a 30 ?L con 20 ?g de proteína)
Acrilamida 30% Bis 0.08% 4.0 ?L
Tris 0.5 M pH 6.8 7.5 ?L
Agua destilada 18.4 ?L
SDS 10% 300 ?L
Temed 20 ?L
Persulfato de amonio 250 ?L
Vaciado de las soluciones.
Teniendo la cámara en posición vertical, y perfectamente nivelada, se vacía a su interior la
solución del gel separador, deslizándola cuidadosamente entre los cristales vertiendo por la
pared del vidrio más alto hasta medio centímetro por arriba de la marca, ya que al polimerizar
el gel encoge.
Se añade el linearizador (SDS 0.2%) para que el borde superior del gel quede perfectamente
recto y se espera entre 20 y 30 minutos hasta que ocurra la polimerización a temperatura
ambiente.
El linearizador se retira y la cavidad se lava un par de veces con agua destilada y se seca por
102
inversión y/o por capilaridad introduciendo ligeramente la esquina de una toalla de papel.
Hecho esto, se termina de preparar la solución para el gel concentrador con las
concentraciones correspondientes (que varían de acuerdo al peso molecular de las proteínas
que se pretenda separar) añadiéndole el persulfato de amonio.
Se debe trabajar con rapidez para evitar que la solución polimerice antes de que se termine de
hacer el trabajo.
La solución para el gel concentrador se vierte directamente sobre el gel separador ya
polimerizado, llenando la cámara hasta los bordes. Entonces, por una esquina del borde
superior de la cámara, se introduce dentro de la solución -en un ángulo de 45º- el peine
apropiado de acuerdo al espesor del gel y el número de carriles deseado, comenzando con una
esquina para evitar que al hacerlo se formen burbujas. Debe asegurarse de que el peine quede
bien alineado con respecto de las orillas del vidrio y perfectamente sentado.
Una vez que el gel concentrador polimerizó, el peine se retira con mucho cuidado, y la
acrilamida no polimerizada se elimina utilizando una jeringa de Hamilton o una puntilla
especia l para micropipeta cuidando de no dejar burbujas. Los pozos se lavan con agua
destilada o buffer de corrida por 3 veces y se dejan llenos, vaciándose solo hasta que las
muestras vayan a colocarse en los pozos. Si esto no ocurre inmediatamente, hay que vigilar
que no se seque el gel, añadiendo buffer de corrida, operación que se repetirá tantas veces
como sea necesario antes de cargar las muestras.
Preparación de las muestras
Antes de correrse, las proteínas de la muestra deben desnaturalizarse para que puedan avanzar
sin dificultad a través de la trama de poliacrilamida, para lo cual son sujetas a condiciones
103
físicas y químicas desnaturalizantes, de manera que:
1. En viales claramente identificados se coloca la cantidad de muestra que contenga 20
mg de proteína, según los resultados calculados en la recta de ajuste hecha con los
valores obtenidos de la técnica de Bradford (1976).
2. Se añaden 7 ?L de buffer de muestra 2X (ver Cuadro 10).
3. Los viales se agitan en el vortex a máxima velocidad (14) durante 30 segundos.
4. Se colocan los viales con las muestras en una lámina de poliestireno con
perforaciones que permitan sujetarlos en posición vertical.
5. La lámina con los viales se coloca en baño María durante 5 minutos a partir de que el
agua entra en ebullición del agua.
La colocación de las muestras en el gel
Antes de cargar las muestras, los pozos se lavan tres veces con buffer de corrida (Cuadro 1l),
dejándose llenos con éste para evitar que se sequen y deformen hasta que se carguen las
muestras, momento cuando deberá de retirarse utilizando una jeringa Hamillton. Se eliminan
todas las burbujas y las muestras se colocan en los pozos usando la misma jeringa, que entre
cada muestra la jeringa debe enjuagarse tres veces con buffer de corrida. Al terminar de cargar
todos los pozos, el espacio restante se rellena con buffer de corrida.
El orden que se siga en la colocación de las muestras es muy importante, pues de él depende
que posteriormente puedan ser identificadas con exactitud. Para esto se sugiere utilizar el carril
izquierdo del gel para el marcador de peso molecular, y si no se usan todos los carriles, dejar
libre el que sigue al marcador para evitar confusiones.
Colocada la muestra el pozo se llena con buffer de corrida para permitirle sedimentarse y
evitar que se corran de un pozo a otro.
104
Cuadro 10. Fórmula del buffer de muestra 2X
Componente Volumen
Tnis-HCl. pH 6.8 250 mM
SDS 2%
Glicerol 10%
DTT 20 mM
Azul de bromofenol 0.01%
La corrida electroforética
Ya cargadas las muestras en los pozos, las placas se colocan en las cámaras, y se añade buffer
de corrida en los depósitos. Se verifica que no existan fugas en el depósito superior y que no
queden burbujas en la parte inferior de la placa, ya que interfieren con la conductividad
eléctrica, lo que puede ocasionar que algún o algunos de los carriles no corran al mismo ritmo
que los demás.
Cuadro ll. Buffer de corrida
Tris base 25 mM
Glicina 192 mM
SDS 0.1%
PH ajustado a 8.3
Para evitar la formación de burbujas, la placa se introduce en el líquido de la cámara de
manera semejante a como se introdujo el peine en el gel. Una vez que la cámara está fija en su
sitio, para inducir la salida de las burbujas se usa una pipeta o una varilla de vidrio para agitar
el agua por debajo del borde inferior de la placa.
Verificado lo anterior, se termina el llenado de los depósitos hasta los niveles recomendados:
105
el superior hasta el borde superior del vidrio más pequeño, el inferior, hasta un nivel que
ofrezca un margen tal, que posteriormente, al separar las placas, pueda también contener el
buffer del depósito superior.
Se realiza la conexión de los cables: rojo al cátodo y negro al ánodo de la cámara y de la
fuente de poder respectivamente, cuidando que ésta este desconectada.
La fuente de poder se conecta y se programa su voltaje y amperaje sin olvidar anotar lo
siguiente:
? hora de inicio de la corrida.
? Voltaje y amperaje empleado (120 volts cámara grande; 100 volts cámara chica).
? La corrida electroforética se comienza a 100 V. Una vez que el frente de corrida se
ha desplazado en el gel concentrador y comienza a entrar en el gel separador, se
puede incrementar el voltaje a 120 V.
? Hay que apagar la fuente de poder cuando el tinte que permite distinguir el frente de
la corrida, alcance la parte inferior del gel.
Recuperación del gel para su tinción o transferencia a papel de nitrocelulosa.
Las placas se desmontan, los cristales más pequeños se remueven y separan con cuidado.
Utilizando una espátula o un utensilio similar, se corta la esquina del gel correspondiente al
pozo del carril donde corrió la muestra con el marcador de peso molecular.
Acrilamida, bioseguridad.
La acrilamida es un monómero artificial que puede polimerizar en grandes cadenas en
presencia de radicales libres, generalmente suministrados por el persulfato de amonio y
estabilizados por TEMED. Cuando se incluye en la reacción de polimerización a la N,N'-
netilenbisacrilamida (bis-acrilamida), el polímero forma enlaces cruzados para formar un gel.
106
Tales geles son usados ampliamente para la separación electroforética de las proteínas y los
ácidos nucleicos (Phang, 1995).
La acrilamida es un neurotóxico potente y un promotor de tumores, por lo que es esencial
tomar precauciones tales como el uso de guantes y máscaras, así como conocer su
metabolismo y los efectos que tiene sobre animales y humanos, la exposición ocupacional y
los aspectos de seguridad de este químico (Phang, 1995).
El efecto tóxico más reconocido de la acrilamida es la polineuropatía, caracterizada
particularmente por debilidad dista1 y parestesia, ataxia, impedimento de los movimientos
tinos y reducción de la fuerza muscular. La ruta usual de abosrción es la exposición dérmica
repetida. Los signos tempranos pueden ser eritema, sudoración y escalofríos, cianosis de
manos y pies. Pueden ocurrir cambios en los potenciales de acción del sistema nervioso
sensitivo, en el umbral de percepción de la vibración y en la velocidad de conducción del
sistema nervioso periférico (Phang, 1995).
Los efectos de la exposición a la acrilamida son acumulativos; sin embargo su manifestación
puede retrasarse por un periodo de algunos años. Aunque no hay datos epidemiológicos para
evaluar el efecto carcinogénico de la acrilamida en los humanos, con base en estudios
experimentales con animales, ésta ha sido clasificada por la International Agency for Research
con Cancer (IARC) como “posible carcinogénica para los humanos” (Phang, 1995).
3.11 Transferencia a papel de nitrocelulosa
Towbin et al. (1979) describieron un procedimiento para transferir proteínas de un gel de
poliacrilamida a una hoja de nitrocelulosa, obteniendo una replica fiel del patrón existente en
107
el gel original, dando así al análisis de las proteínas el poder que la técnica de Southern dio al
análisis del DNA.
Así, una vez que la corrida electroforética del gel se ha completado, sus proteínas pueden ser
teñidas y el gel posteriormente secado, o transferidas a una membrana (papel) de nitrocleulosa,
que permite la realización de varios procedimientos analíticos como:
? La inmunodetección, que consiste en la identificación de proteínas particulares
mediante anticuerpos específicos.
? La densitometría, consistente en la cuantificación de proteínas mediante la
exposición de una placa radiográfica sobrepuesta a una membrana con máculas de
proteína radiomarcada, almacenadas dentro de un cartucho oscuro que se almacenan
a -15°C por un tiempo determinado de acuerdo a la vida media de la marca
radioactiva.
Procedimiento para Transferencia electroforetica semi-seca usando el equipo Bio Rad,
Trans-Blot Semi-dry
Para realizar la transferencia electroforética se surgen los pasos siguientes:
1. Quitar el gel de la placa de corrido y estabilizarlo durante 30 minutos en buffer de
transferencia.
2. Al realizar este paso, se corta el gel por la línea de demarcación entre el gel
separador y el gel concentrador, y se hace una marca, cortando la esquina superior
correspondiente al marcador de peso molecular.
3. Se mide el gel para cortar una pieza de membrana de nitrocelulosa que corresponda a
tales dimensiones.
4. Al cortar la membrana de nitrocelulosa debe usarse guantes, cuidando de no tocar
sus superficies, ya que esto puede afectar la sensibilidad del papel para aceptar las
proteínas.
5. Por el lado más brillante de la membrana y en la esquina que corresponderá a la
108
marca del peso molecular, se escribe con lápiz la fecha y el número del gel.
6. La membrana se humedece con buffer de transferencia y se estabiliza al menos
durante 10 minutos.
7. Estando desconectado el aparato de transferencia, sobre la placa que actúa como el
ánodo (+) se coloca una hoja de papel acojinado absorbente que se empapa con
buffer de transferencia.
8. Encima del cojín humedecido se coloca la membrana de nitrocelulosa de manera que
la cara con la identificación quede hacia arriba.
9. Sobre la membrana de nitrocelulosa se coloca el gel ya estabilizado, cuidando que
correspondan la esquina marcada del gel indicativa de la escala de masa molecular
con la identificación de la membrana.
10. El gel se humedece con buffer de transferencia evitando dejar burbujas de aire entre
el gel y el papel.
11. Encima del gel se coloca otro cojín de papel absorbente humedecido con buffer de
transferencia.
12. Se coloca la tapa que contiene la placa con el cátodo (-)
13. Encima de la tapa catódica se coloca la tapa de seguridad.
14. Se conectan los cables al equipo, verificando que el rojo corresponda al cátodo y el
negro al ánodo; se hace lo mismo con el otro extremo en la fuente de poder que
deberá estar desconectada durante el proceso.
15. Se revisa que no existan filtraciones antes de conectar y poner en operación la fuente
de poder, corriéndose la transferencia electroforética durante 30 minutos a 10 volts.9
16. Después de desconectar la corriente y los cables de la fuente de poder, se descubre
________________________________________
9 Rango guía de las condiciones óptimas que necesitan l a s diferentes proteínas: mini-gel 10 V por 30 min utos 0 15 V por 15 minutos. gel grande 25 V por 30 minutos o 15 V por 60 minutos. La corriente no debe de excederse los 25 V y 3 mA/cm2 en los geles grandes, o 5.5 mA/cm2 para los minigeles.
109
cuidadosamente el gel y se levanta la esquina correspondiente al peso molecular para
verificar si ocurrió la transferencia ; de ser así, se retira el gel, que se eliminará y con
unas pinzas se levanta cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa para ponerla a
secar sobre una hoja de papel bond.
17. Con el fin de que los anticuerpos tengan como único sitio para fijarse las
terminaciones antigénicas de aquellas proteínas para las que son específicos, la
membrana de nitrocelulosa se satura con una proteína (bloqueo). Para ello, una vez
seca, la membrana se coloca en una solución bloqueadora (BSA o leche descremada
en PBS) a 4°C durante tres horas.
18. Las membranas bloqueadas, se lavan dentro de contenedores colocados sobre placas
mezcladoras orbitales o pendulares usando dos soluciones: PBS y PBS Tween en
cinco ciclos de lavado (5 min c/u) dentro de cada solución.
3.12 Inmunodetección.
Los anticuerpos son utilizados para detectar antígenos en una variedad de mezclas complejas.
Los métodos de iumunodetección pueden dividirse en dos categorías generales:
Las técnicas basadas en soluciones, tales como el análisis de ELISA (enzyme-linked-
immunoabsorbent assays), la inmunoprecipitación y la inmunodifusión10.
Las técnicas que se basan en la detección de muestras que han sido inmovilizadas sobre un
soporte sólido, tal como una membrana, e incluyen al Western blot y al dot blot.
Estas técnicas pueden utilizar antisueros crudos, pero algunas aplicaciones requieren de
anticuerpos purificados.
_____________________________________________
10 Las actividades enzimáticas y de ligamiento pueden ser detectadas in situ permitiendo que los sustratos o ligandos se difundan dentro de un gel. En la inmunoelectrofóresis, se permite difundir al antígeno, o se le mueve electroforéticamente contra un anticuerpo, formándose un precipitado donde interactúan el antígeno y el anticuerpo (.Towbin et al., 1979).
110
Los anticuerpos se obtienen por diferentes métodos. Por ejemplo, la yema de los huevos
puestos por gallinas inmunizadas ofrece una excelente fuente de anticuerpos policlonales
(pAc), ya que las proteínas altamente conservadas de los mamíferos, algunas veces fallan en
elegir una respuesta inmune en los animales usados tradicionalmente como para generar pAc
(Danielpour, 1993). Las inmunoglobulinas purificadas de yema pueden utilizarse en
inmunobloting, ELISA y otros procedimientos imnunológicos como la investigación de la
estructura y función de receptores hormonales (Song et al., 1985).
3.12.1 Análisis de Western blot
Las proteínas inmovilizadas en la hoja de nitrocelulosa pueden detectarse con sus respectivos
anticuerpos marcados radiactivamente o conjugados con peroxidasa. El método es sencillo y
tan sensible que puede detectar cantidades muy pequeñas (100 pg) de los antígenos separados
electroforéticamente, aun en presencia de pocos anticuerpos en sueros de muy baja titulación
(Towbin et al., 1979).
La mayoría de las proteínas o de los complejos que contengan proteínas se adsorben rápido y
bien a los filtros de nitrocelulosa, mientras que las sales, muchas moléculas pequeñas y el
RNA usualmente no se retienen. Estas moléculas de proteína se retienen sobre los filtros
igualmente bien si son acarreadas a través del filtro por un campo eléctrico. Si éste es
perpendicular a una placa de gel que contenga proteínas separadas, se obtiene una réplica del
patrón de proteínas sobre la hoja de nitrocelulosa. Si después de esto se tiñe el gel, se
encontrará que no pueden detectarse proteínas, pues fueron removidas durante el proceso de
transferencia electroforética (Towbin et al., 1979).
111
Los antígenos pueden ser inmovilizados sobre membranas de nitrocelulosa o de fluoruro de
polivinilideno (polyvinylidene fuoride, PVDF). La capacidad para detectar un antígeno dado
depende de la cantidad de antígeno por unidad de área en la membrana y de las características
del anticuerpo primario.
Alternativamente, un segundo anticuerpo que reconoce las características generales de todas
las IgG (anti-IgG) en sí mismo puede ser conjugado con una enzima para una detección
subsecuente cuando el sustrato de la enzima se añada en el paso final. El conjugado
enzimático, y por lo tanto el antígeno, es detectado en un lector adecuado observando los
productos de la colorimetría, fluorescencia o quimiluninisencia.
Por lo general, los antígenos inmovilizados sobre membranas se detectan con anticuerpos en
un proceso de tres pasos:
1. La membrana se pone en contacto con el anticuerpo primario, —una IgG que actúa
directamente contra el antígeno en cuestión— para que se ligue a los sitios
antigénicos potenciales.
2. Se añade un conjugado anticuerpo-enzíma”, para encontrar los lugares donde el
anticuerpo primario se ha ligado a las proteínas antigénicas fijas a la membrana.
3. Se añade el sustrato para que la enzima conjugada al anticuerpo secundario catalice
una reacción observable.
Consideraciones generales para el análisis de Western blot.
Cuando es importante correlacionar una actividad de una proteína con una banda en un gel se
usan los sistema: de Western blot fosfatasa alcalina (AP) o peroxidass de rábano (HRP),
diseñados para la detección rápida y sensitiva de proteínas y otros antígenos macromolecula res
______________________ 11 La enzima o molécula reportera puede ser fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano
112
inmovilizados sobre membranas de nitrocelulosa o de PVDF transferidas a partir de geles
después de la electrofóresis (Western blot), o ligadas directamente a partir de la solución (dots
blot) (.Towbin et al., 1979).
Los antígenos se transfieren a partir de geles de poliacrilamida o agarosa a la membrana de
nitrocelulosa mediante difusión pasiva o electrofóresis. Generalmente los Western blots se
hacen mediante transferencia electroforética de las proteínas a partir de geles de
poliacrilamida-SDS (Towbin et al., 1979).
Cuando se desarrolla un análisis de máculas para una combinación dada antígeno: anticuerpo,
deben tomarse en cuenta varias consideraciones, Por ejemplo, algunos anticuerpos
(particularmente monoclonales) reconocen determinantes antigénicos que pudieran estar
ocultos o desnaturalizados cuando el antígeno se ligó a la superficie de la membrana de
nitrocelulosa o PVDF. Este efecto se intensifica cuando en las manchas de proteína, los
antígenos provienen de los geles que contienen SDS.
La sensibilidad del análisis con un anticuerpo bueno y uniforme puede ser varias veces menor
en los Western blots (que usan geles desnaturalizados) que en los “dot” blots donde las
proteínas naturalizadas son manchadas directamente sobre la membrana.
Inmunodetección de los antígenos Hsp ligados a la membrana.
Usando anticuerpos específicos contra las Hsp25 (dilución 1:500), Hsp60 (dilución LKl
1:400), Hsp70 (dilución 15,000) y Hsp90 (dilución 1:400), y un anticuerpo conjugado a
peroxidasa es posible caracterizar el tipo de proteína de choque calórico existente entre las
transferidas al papel de nitrocelulosa, ya que al añadir un sustrato quimiliminiscente que
reacciona con la peroxidasa, se emite una señal de luz que pude ser capturada en una película
113
fotosensible (Sharon et al., 1979)
Terminado el lavado de las membranas de nitrocelulosa, estas se colocan en una solución que
contiene un anticuerpo específico contra Hsp25 (Miron et al., 1988 y 1991) Hsp60 (Boog et
al., 1992), Hsp70 (Marchesi et al., 1993; Vélez-Granel1 et al., 1994) o Hsp90 Currie et al.,
1993; Tanguay et al., 1993).
Durante los pasos subsecuentes, las membranas deben mantenerse húmedas. Todos los pasos
del lavado y la incubación se realizan a temperatura de la habitación y con una agitación
suave. Se recomienda utilizar un recipiente poco profundo, ligeramente mayor que la
membrana.
Para las incubaciones con los anticuerpos y la reacción de desarrollo de quimiluminiscencia,
se usa sólo la cantidad de solución que sea suficiente para sumergir la membrana, con el lado
con las proteínas hacia arriba. Generalmente, este volumen es de 0.1-0.15mL/cm² de
superficie de membrana (15 mL para una membrana de 10 X 15 cm). Se usa al menos el doble
de este volumen para los pasos de bloqueo y lavado.
Protocolo estándar.
Los materiales que se requieren para el lavado de las membranas después de fijar los
anticuerpos se muestran en el Cuadro 12 y en seguida se detallan los procedimientos a seguir.
Cuadro 12. Materiales para el lavado de las membranas de nitrocelulosa.
PBS (1L) 20 mL 0.5 Tris-HCl, pH 8.0
8.8 g NaCl
PBST 0.05% Tween 20 en PBS.
114
1. Si la membrana de nitrocelulosa conteniendo los antígenos transferidos será
rehumedecida, hay que hacerla flotar en PBST hasta que se humedezca
uniformemente, sumergiéndola y enjuagándola por cinco minutos en el mismo
buffer.
2. Para ligar los anticuerpos primarios, hay que reemplazar la solución de bloqueo (que
puede reutilizarse varias veces) con 10 mL (membranas de minigel) o 25 mL
(membranas de gel grande) de PBST que contenga la dilución apropiada del
anticuerpo primario, e incubar por 60 minutos con agitación suave; a los 30 minutos
del proceso se da vuelta a la membrana.
3. Para remover el anticuerpo no ligado, la membrana se lava con PBS (primer, tercer y
quinto ciclo) y con PBST (segundo y cuarto ciclo), alternándolos en ciclos de 5
minutos c/u.12
4. Transferir la membrana a PBST que contenga la dilución adecuada de conjugado
anti-IgG-HRP e incubar por 60 minutos con suave agitación, volteando el papel a los
30 minutos.
5. Para remover el anticuerpo secundario, la membrana se lava diez veces en ciclos de
5 minutos c/u, alternando PBS (primer, tercer, quinto, séptimo, noveno y décimo) y
PBST segundo, cuarto, sexto y octavo). Nótese que los dos lavados finales son con
PBS, ya el Tween 20 residual puede afectar el depósito del substrato precipitado y
llevar a manchar las bandas. El agua desionizada puede sustituir al PBS si esta está a
pH neutro.
6. Terminado el lavado, los papeles secos se tratan durante 5 minutos (volteando a los
2.5 min) con el reactivo para Western blot ECL, mezclándose cantidades iguales de
los reactivos 1 y 2 para dar un volumen final equivalente a 0.125 mL/cm2 de
membrana. ECL es el sustrato de la peroxidasa (HRP).
7. La membrana de nitrocelulosa se seca sobre una hoja de papel bond y posteriormente
se envuelve en una hoja de plástico para llevarse al cuatro oscuro. _______________________________________________
12 Durante el lavado se aumenta la velocidad en el movimiento de las plataformas: Orbital a 3.5 y Pendular a 6.5. Cuando se haya realizado el segundo lavado del primer anticuerpo, se pone a descongelar el segundo anticuerpo.
115
8. Teniendo anticipadamente preparados liquido revelador, agua y líquido fijador, A los
papeles envueltos en la hoja de plástico, se les coloca encima una placa fotográfica y
juntos se guardan durante cinco minutos en una carpeta de cartón que se mantiene
inmóvil y uniformemente presionada.
9. La placa se procesa en el líquido revelador durante dos minutos. Si hubo reacción
Ag-Ac, se notan máculas en la película velada, por efecto de la señal de luz emitida
por la reacción del sustrato ECL con la enzima conjugada al anticuerpo, el cual a su
vez está unido a su proteína específica. La placa se enjuaga en la charola con agua
durante un minuto y luego se procesa en la charola con el líquido fijador durante dos
minutos Se enjuaga nuevamente en la charola de agua y se cuelga a secar.13
3.13 Tratamiento estadístico Los datos obtenidos sobre la supervivencia y la expresión de las proteínas Hsp70, fueron
valorados por separado para cada localidad mediante el análisis de varianza (SAS, 1988), que
incluyó los efectos principales de la raza, las temperaturas a las que fueron expuestos los
linfocitos y la interacción de ambos efectos de acuerdo al siguiente modelo:
YGT = ?+ Gi + Ti +(GT)ij , +eij
donde:
y = es la respuesta variable (supervivencia o expresión de Hsp70),.
?= a la media general,
G? = es el efecto fijado del itésimo genotipo (i = Saanen, Granadino, Nubio, Criollo),
Tj = es el efecto de la jotaésima temperatura (j = 38ºC, 40°C, 42ºC, 44ºC),
(GT)ij es el efecto fijado del itésimo genotipo y la jotaésima temperatura, y
eij = (es el error aleatorio residual).
________________________ 13 Las placas fotográficas deben guardarse en sus envases antes de encender la luz.
116
Para evaluar el nivel de significancia de las diferencias entre las medias, post hoc se realizó la
prueba de Tukey. En todos los casos, este nivel se situó a P<0.05.
117
4. Resultados y discusión
4.1 Supervivencia celular
Los resultados de la supervivencia de los linfocitos muestran que hubo diferencias altamente
significativas (P<0.00l), atribuibles a la temperatura de cultivo pero dentro de cada
experimento no se obtuvieron diferencias significativas (P>0.05) entre las razas, ni hubo
efecto de la interacción de la raza con la temperatura de incubación (Cuadro 13).
Cuadro 13. Efecto de la temperatura de incubación (3 h) sobre el porcentaje de
supervivencia de los linfocitos de cuatro genotipos caprinos.
Condición / Raza
Temperatura de
incubación
CAC
CAT
ºC
38
Saanen
81.03ª
Granadina
69.51ª
Criolla
92.28ª
Nubia
92.51ª
40 ND ND 87.26ª 92.33ª
42 73.06ª 63.54ª 75.82b 76.74b
44 27.74 b 30.76 b ND ND
Significancia
Genotipo NS NS
Temperatura **** ***
Interacción NS NS
Error estándar 4.00 3.04
ND = no se determinó.
NS = no hubo diferencias significativas (P>0.05).
valores de la media seguidos por letra diferente dentro de la misma columna son significativos estadísticamente (P < 0.05) de acuerdo a la prueba de Tukey.
*** P <0.00l
**** P <0.0001
118
Los porcentajes de supervivencia a 38°C tendieron a ser mayores y con menor variación en los
linfocitos obtenidos de las cabras de CAT que en los de las cabras de CAC.
En los linfocitos de CAC, las diferencias (P<0.05) en la supervivencia atribuible a la
temperatura de incubación se dieron a los 44ºC, mientras que en los de CAT ocurrieron a los
42 °C.
Mientras en los especimenes de CAT se observó una drástica disminución en la supervivencia
de los linfocitos entre los cultivados a 38°C y 42°C (P<0.05), en los de CAC esta disminución
se observó cuando la temperatura de cultivo cambió de 42°C a 44 ºC.
Al utilizar anticuerpos monoclonales específicos anti-Hsp para identificar el tipo de proteína
de choque calórico sintetizada durante el tratamiento, solo resultó positiva la identificación de
la Hsp70.
4.2 Densitometría.
El Cuadro 14 muestra los resultados de la densitometría óptica, como medida de la proteína
presente en las bandas separadas por electrofóresis, debida a la absorción por la placa
radiográfica de las emisiones radioactivas del 35S presente en ellas. Se considera que a mayor
absorción habrá mayor cantidad de proteína.
Al comparar la densidad óptica de las bandas de proteínas de 70 kDa sintetizadas de novo,
obtenidas a partir de los extractos celulares marcados con 35 S de los diferentes tratamientos, el
modelo no resultó significativo (P>0.05).
119
Cuadro 14. Efecto de la temperatura de incubación sobre la síntesis de proteínas de 70 kDa, inferida mediante Western blot en los especimenes de CAT.
Tratamiento Medias de la integral de Desviación estándar
Control 0.022 0.040
38 0.044 0.045
40 0.044 0.045
42 0.024 0.040
La adaptación es un fenómeno biológico que integra aspectos genéticos y epigenéticos que
interactúan estrechamente. Los primeros proveen al organismo de una morfología y tisiología
básicas para que enfrente a su entorno, con base en la experiencia acumulada por su
ascendencia y que ha sido ponderada por la selección natural para ajustarse a las
características particulares del hábitat de la especie.
Como consecuencia puede considerarse que las características de Clase, Orden, Familia,
Género y Especie son componentes genéticos de adaptación que han sido definidas para unas
condiciones medio ambientales particulares. Sin embargo, los cataclismos, los cambios
cíclicos del clima y la acción humana sobre el medio ambiente y sobre el desplazamiento de
las especies de sus hábitats originales (invasión biológica), han tenido un efecto que rebasa, o
al menos disminuye el potencial adaptativo de éstas, de modo que, la plasticidad del
organismo tiene que compensar los desajustes que surgen entre las cualidades básicas
derivadas de su genotipo y las condiciones circundantes que limitan su supervivencia.
La termotolerancia ofrece un claro ejemplo de esto, pues los organismos para incrementar su
supervivencia ante situaciones ambientales que no son las características del hábitat en que se
ha basado su diseño, hacen gala de plasticidad y modifican su programa de desarrollo para
120
ajustarse a tales condiciones, de manera tal que desarrollan, entre las alterantivas posibles, las
características fenotípicas más acordes para afrontar la circunstancia estresante, induciendo la
expresión de los genes disponibles más convenientes para lograrlo.
Sin embargo, como el potencial genético de un organismo es mayor a las posibilidades de
expresarlo, los individuos inducen preferentemente, si esto es posible, aquellas combinaciones
de genes que los capacitan mejor para enfrentar las particularidades de su medio ambiente y
mejoran sus posibilidades de alcanzar la edad adulta y la reproducción.
Con base en tales premisas se consideró que la respuesta celular al estrés pudiera manifestarse
de manera diferente entre los cuatro genotipos caprinos usados en este trabajo, cuyo origen
histórico corresponde a las zonas templadas en el caso de la nubia y la saanen, y a las zonas
semiáridas, en la granadina y la criolla.
Por otra parte, como el medio ambiente en el que transcurre el ciclo de vida de un animal es
determinante del curso que sigue su programa de desarrollo, los caprinos usados para obtener
los linfocitos, correspondieron a dos hábitats climáticamente diferentes en cuanto a la
temperatura y precipitación, una zona desértica (CAC) y una zona sub-desértica (CAT),
respectivamente, y los especimenes se obtuvieron de cada una de ellas cuando la temperatura
ambiental registro sus valores máximos para el calor y el frío respectivamente, esto con el
propósito de que la probabilidad de haberse inducido la termotolerancia mediante choque
calórico ambiental fuera alta y baja, respectivamente.
La termosensibilidad de los linfocitos se estimó con base en su supervivencia posterior al
estrés calórico, y como la respuesta celular al estrés es un fenómeno ubicuo y conservado en la
naturaleza, se decidió determinar si al término del período de estrés había síntesis de Hsp.
121
Además, mediante inmunodetección, especificar la familia de las proteínas inducidas durante
el estrés y estimar la relación entre la síntesis de Hsp y los tratamientos.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que el nivel de la temperatura tuvo un efecto
altamente significativo (P<0.00l) sobre la supervivencia celular de los linfocitos caprinos y
que ésta se manifestó diferencialmente. Los resultados sugieren una inducción de
termotolerancia atribuible al ambiente, dado que el efecto del choque calórico sobre la
supervivencia de los linfocitos colectados en CAC, cuyo entorno los expone a temperaturas
ambientales elevadas, se observo a 44ºC, mientras que en CAT, donde el clima es templado o
frío, este efecto fue significativo desde los 42°C (P<0.05).
También se observó que el estrés calórico medio (42°C) induce la respuesta de estrés, y que
ésta se manifiesta con la síntesis temprana de la Hsp70. Sin embargo, en contraste con la
viabilidad no hubo diferencias significativas (P>0.05) entre los tratamientos, con respecto de
la síntesis de Hsp70. Ello sugiere la participación de otros factores citoprotectores, como la
catalasa, la superóxido dismutasa y la taurina (Ealy et al., 1992; Malayer et al., 1992;
Kamwanja et al., 1994; Ealy et al., 1995).
Los resultados son insuficientes para evidenciar que el efecto genético influya en la respuesta
al estrés, ya que entre los linfocitos de las raza caprinas estudiadas no se encontraron
diferencias en su termosensibilidad, lo cual sugiere que la respuesta al estrés es una
característica común en la población de esta especie.
Lo anterior, apoya la hipótesis de que en la cabra el componente epigenético destaca en la
respuesta de termotolerancia y que ésta puede ser inducida en la naturaleza por las condiciones
climáticas del entorno.
122
Con respecto a la metodología utilizada para la separación de los linfocitos, fue necesario
modificar el tiempo y la fuerza de gravedad empleada en el proceso de centrifugación. La
recomendación de 400 G durante 15-30 min a temperatura ambiente (Freshney, 1992), resultó
insuficiente, en consecuencia, con base en la ley de Stoke se realizaron varios ensayos hasta
obtener los linfocitos libres de eritrocitos, centrifugando a 890 G por 80 min.
En cuanto al efecto de la raza sobre la supervivencia celular al choque calórico los resultados
difieren de los obtenidos de linfocitos bovinos (Kamwanja et al., 1994) donde se encontraron
diferencias entre razas, además de una interacción significativa raza x temperatura. Sin
embargo, como en ese trabajo los linfocitos fueron estresados a 45°C por 3 h, después
incubados a temperatura fisiológica por 21 h más y hasta pasado ese tiempo, se determinó su
viabilidad y la expresión de las Hsp, la mortalidad medida por ellos incluye además de la
inmediata al choque calórico, la consecuente de alteraciones subletales que se manifestaron
hasta horas después de concluido el estrés.
Con respecto a la síntesis de Hsp70, hay coincidencia entre los resultados obtenidos en esta
tesis y los reportados por Kamwanja et al. (1994), quienes tampoco encontraron diferencias
significativas entre razas.
La cinética de síntesis y acumulación de las Hsp70 varía entre los organismos. En el presente
trabajo, la síntesis de las Hsp70 pudo manifestarse mediante inmunodetección inmediatamente
después de concluida la exposición al estrés calórico, lo que puede considerarse como una
síntesis temprana, ya que en otros trabajos como el de Guzhova et al. (1997) en células
humanas del linfoma-T Molt4, sujetas a choque calórico (43°C 15 min), as Hsp70 empiezan a
detectarse hasta una hora después de concluido el estrés calórico, aumentando gradualmente
123
hasta alcanzar una meseta de expresión máxima a las 12 horas (800 veces más que la
expresión a la primera hora) disminuyendo gradualmente de modo que a la hora 72 aún los
valores son altos (400 más que a la primera hora).
Otros estudios sobre la cinética de la síntesis de Hsp70, a través de la expresión del gen hsp70
en cultivos celulares BSC-1 muestran que a las 96 h, la expresión iguala al nivel basal
(Kuhlmann et al., 1997).
En la cinética del gen hsp70 como lo que se mide es la concentración del mRNA y no la de la
proteína en sí, ha de asumirse que la síntesis de la proteína se suspende a las 96 h, pero no se
reporta cual es la concentración de la proteína a partir de ese momento.
Considerando la cinética del trabajo de Guzhova et al. (1997) en la cual las máximas
concentraciones se aprecian hasta las 12-24 horas después de finalizado el choque calórico, si
las determinaciones de Hsp en los linfocitos caprinos se realizan en esos tiempos
probablemente se observen mayores concentraciones que las encontradas en este trabajo.
Por otra parte, Kuhlmann et al. (1997) reportan que la concentración de la Hsc70 no cambia
significativamente a lo largo del período en que las células son sujetas al choque calórico, lo
que destaca su carácter constitutivo.
La respuesta celular al estrés es extraordinariamente compleja y puede enfocarse entre otras
perspectivas desde un punto de vista evolutivo, fisiológico o ecológico. Aunque el punto de
vista prevaleciente considera a las Hsp como una característica básica y común de los
organismos, a pesar de la variación de su entorno. (Krebs y Feder, 1997).
Sobre los aspectos genéticos asociados con la expresión de las Hsp70, la literatura reporta la
124
existencia de variaciones filogénicas, ontogénicas y asociadas al sexo. Sin embargo, por su
naturaleza no constitutiva sino inducida, la expresión de los genes hsp70 depende de
componentes epigenéticos que parecen ser de una gran relevancia en el proceso de selección
natural ya que determinan la inducción de diversos genes cuyos productos condicionan el
futuro del organismo, incluyendo su reproducción y por ende la preservación de su genoma.
Desde un punto de vista filogénico, aparentemente el problema del doblamiento de las
proteínas es antiguo y ubicuo y en cada uno de los diversos casos necesita de las chaperonas
moleculares. Sin embargo, a pesar de la secuencia codificadora notablemente conservada y al
origen primigenio de los genes hsp70, la expresión de las Hsp70 puede variar desde
organismos muy separados evolutivamente como los Archaea o archaeabacteria que son los
organismos más primitivos y más extremofílicos, cuyo genoma, sin embargo, codifica
homólogos de la mayoría de las Hsp representadas en otros procariotas o eucariotas (Phipps et
al., 1993 ), hasta dentro de una simple población de organismos salvajes de la misma especie
(Krebs et al., 1998).
La cantidad de Hsp varía de un organismo a otro y aún entre los tipos de células de un mismo
organismo (Kuhlmann et al., 1997). Sin embargo, es importante distinguir entre los miembros
de la familia de 70 kDa, la esencial y normalmente abundante Hsc70 y la Hsp70 inducible. La
Hsc70 esta más restringida evolutivamente que la Hsp70, lo que sugiere que son
funcionalmente distintas (Hightower, 1995). La Hsp70 es primordialmente una proteína
inducida por el estrés, sin embargo, muchas líneas celulares de los primates, incluyendo
algunas humanas, expresan niveles significativos de Hsp70 bajo condiciones fisiológicas,
expresándose a niveles aún más altos al inducirse con algún estresor. Sin embargo, aún no se
ha entendido la base reguladora y la significancia funcional de esta expresión constitutiva
125
especie-específica de las Hsp70 (Mangurten et al., 1997).
En estado salvaje, D. melanogaster puede estar expuesta a estrés térmico intenso, si no letal,
cuya frecuencia e intensidad varía con el clima y el hábitat. La variación de la resistencia a tal
estrés debe de tener consecuencias más grandes para sus aptitudes (Krebs y Feder. 1997).
Krebs y Feder (1997) demuestran la existencia de una variación genética intrapoblaciona l en la
termotolerancia dentro de poblaciones naturales de D. melanogaster, y que esta se
correlaciona directamente con la expresión de Hsp70. Además, sus hallazgos implican que en
la naturaleza, las proteínas Hsp contribuyen a la variación genética en la termotolerancia. Tal
variación dentro de una población no había sido reportada y es necesaria para que actúe la
selección una vez que se expresan las proteínas Hsp. Señalan además que la selección artificial
puede incrementar o disminuir la termotclerancia en D. melanogaster, lo cual puede atribuirse
a cambios en el número de loci mal caracterizados.
Puede existir una co-evolución molecular asociada a las Hsp70, como lo ilustra el caso del
virus del herpes-simplex tipo I (HSV-1), ya que su infección, en las células que permiten,
resulta en la expresión coordinada y secuencial de los 78 genes virales, que muy pronto
conduce a la inhibición “selectiva” de la síntesis de las proteínas celulares y a la síntesis de las
proteínas virales. La inhibición es selectiva, ya que continúan induciéndose hasta el fin de la
infección las Hsp y las proteínas ribosomales, que asisten el doblamiento adecuado de las
proteínas virales durante la replicación (Díaz-Latoud et al., 1997).
Las características fisiológicas de un organismo y de las células que lo constituyen cambian
durante su ontogenia, y están sujetas a cambios cíclicos como los consecuentes al perfil
hormonal prevaleciente en un momento dado.
126
La ontogenia se refiere al origen del ser, es decir, al curso de desarrollo de un organismo
individual; en el caso de los organismos animales pluricelulares, desde su concepción hasta su
muerte, dado el caso, por envejecimiento.
Es importante considerar que, durante las diversas etapas de la ontogenia, el organismo posee
atributos morfológicos y funcionales acordes a la circunstancia en que viva y a la etapa de
desarrollo en que se encuentre. Para cada una de estas etapas, es necesario modificar la
composición genética relativa, de modo que se expresen aquellos genes que mejor satisfagan
las necesidades particulares más urgentes y dejen de expresarse aquellos cuyos productos han
dejado de ser importantes o representan una competencia para los productos celulares
prioritarios en función de los recursos energéticos y materiales disponibles.
La expresión genética es un proceso fundamental para todas las células vivientes y las
alteraciones en uno o varios genes, puede tener un efecto profundo sobre la función de una
célula o tejido (Pahlavani et al., 1996). De este modo, el perfil genético que se expresa
activamente en proteínas puede variar considerablemente en un mismo individuo si este se
encuentra en una etapa de crecimiento, de desarrollo, de reproducción o senectud. Las
consecuencias de esto implican modificaciones fisiológicas importantes.
El estudio de la expresión de los genes hsp durante la ontogenia ha sido objeto de gran
atención, ya que los retos a los que enfrentan las células en cada etapa difieren en frecuencia y
magnitud, por consiguiente, la demanda de estas moléculas se espera que sea variable a través
del desarrollo. La expresión de las Hsp varía genéticamente y se conserva a través de las
etapas del ciclo de vida; sin embargo, el rango de expresión cambia entre los distintos estados
ontogenicos y se considera que esta variación puede tener consecuencias positivas y negativas
127
(Krebs et al., 1998).
En relación con lo anterior, pueden existir correlaciones entre rasgos cuya codificación
comparta genes comunes y en consecuencia manifiesten interdependencia. Si la expresión de
alguno de los genes involucrados en la correlación se modifica durante la ontogenia, cabe
esperar que ocurran cambios no siempre ventajosos para el organismo.
Se considera que dos rasgos fenotípicos están generalmente correlacionados o acoplados,
cuando la variación en uno o más genes afecta a ambos rasgos. Las correlaciones genéticas
pueden tener significancia evolutiva cuando los efectos pleiotrópicos sobre rasgos acoplados
antagónicos se oponen al incremento de un rasgo benéfico o mantienen un rasgo deletéreo que
de otro modo sería eliminado por la selección natural. Durante el desarrollo, tales rasgos
acoplados pueden actuar en diferentes tiempos (Krebs et al., 1998).
Krebs y Feder (1997ª) miden la supervivencia de las larvas de D. melanogaster en diversas
etapas de su desarrollo: larva 1 (embrión de 6 h), larva 3 y adulto, así como la expresión de
Hsp70 mediante ELISA, y observan que en la ontogenia temprana la respuesta al choque
calórico se reduce o está ausente (Krebs y Feder, 1997ª)
Krebs et al. (1998) caracterizan la variación en la expresión de las Hsp70 y sus consecuencias
en varios estados del ciclo de vida de D. melanogaster para dilucidar las bases genéticas y
funcionales de los rasgos acoplados a lo largo de su desarrollo. Encuent ran que la necesidad de
la termotolerancia inducible por las Hsp varía entre los distintos estados de desarrollo. Las
larvas y pupas son especialmente propensas a exponerse a las temperaturas elevadas, ya que
ellas ocupan los frutos necróticos, que por lo común alcanzan temperaturas que exceden los
35ºC, llegando a encontrase larvas vivas a más de 44°C y pupas a más de 41°C, mientras que
128
los adultos pueden reducir el estrés térmico a través de sus capacidades, bien desarrolladas, de
locomoción y selección de micro hábitat (Feder et al., 1997; Krebs et al., 1998).
Krebs et al. (1998) reportan que después del choque calórico, la concentración de Hsp70 varía
en los diversos estados de D. melanogaster (P<0.00l), donde una larva de primer estadio
produce más Hsp70 por unidad de proteína que los adultos jóvenes, y tanto las larvas de
primer estadio como los adultos jóvenes producen más Hsp70 que las larvas de tercer estadio
(etapa de migración). Además, las hembras adultas producen más (P<0.05) Hsp70 que los
machos adultos.
Esta variación puede explicarse con el tamaño de los órganos, ya que este difiere en las
distintas etapas de desarrollo. Por ejemplo, la grasa corporal, especialmente abundante en la
larva de tercer estadio, expresa más lentamente la Hsp70 que la mayoría de los otros tejidos.
De forma similar, las diferencias en la expresión de Hsp70 por los tejidos de la gónada de la
hembra y la del macho pueden tomarse en cuenta para explicar las concentraciones mayores
encontradas en la hembra que en el macho adultos (Krebs et al., 1998).
En cuanto a las líneas de D. melanogaster hay diferencias de más del doble en cuanto a la
concentración de Hsp70 en sus larvas, con rangos medios a partir de un 50% hasta más del
100% del estándar en las larvas de primer estadio (cuyo valor de expresión se usa como base
para realizar las comparaciones) y de un 20% a un 40% en las larvas de tercer estadio. Los
adultos difieren relativamente menos con rangos de un 40% a un 60%. La variación entre las
líneas es similar en todas las fases, lo cual indica que la selección para la expresión de las
Hsp70 a un estado de desarrollo, causará alteraciones en la expresión de las Hsp70 a través del
desarrollo. Además, los individuos de las líneas que se desarrollaron más rápidamente,
129
sobrevivieron mejor que los de desarrollo más lento en ausencia de estrés, pero su
supervivencia fue pobre si tuvieron que enfrentarlo (Krebs et al., 1998).
Tatar et al., 1997, consideran que durante el envejecimiento las chaperonas moleculares como
las Hsp combaten las disfunciones relacionadas con la senectud, y argumentan que la
capacidad de moderar el estrés interno y externo es una función que regula la senescencia del
animal íntegro al envejecer. Al respecto, determinan el efecto de la Hsp70 sobre la
supervivencia durante el envejecimiento a temperaturas normales usando cepas transgénicas
de D. melanogaster que varían en el número de copias del gen inducible hsp70. Dos semanas
después de ser inducidas por choque calórico durante 10 min, las cepas “copia-extra”
incrementaron un 7.9% su supervivencia en comparación con las normales.
Pahlavani et al. (1996) indican que la declinación en la capacidad de las células para responder
al estrés y expresar Hsp70 parece ser un fenómeno universal que ocurre con el envejecimiento.
En el ratón, la inducción de la Hsp70 y de su mRNA disminuye significativamente al
incrementarse el envejecimiento de la piel, el pulmón, el cerebro y el hígado, lo mismo sucede
en los linfocitos de la sangre periférica del mono rhesus y del humano, así como en los de la
sangre esplénica de la rata. Este decaimiento ocurre al nivel de la transcripción del gen hsp70.
Ya que la expresión de varios genes disminuye debido a los cambios consecuentes a la
restricción alimenticia relacionada con la edad, Pahlavani et al. (1996), investiga linfocitos
espénicos de la rata, el efecto de la restricción alimenticia sobre la declinación en la expresión
del gen hsp70 durante el envejecimiento, al exponer a ratas jóvenes y viejas sujetas o no a
restricción alimenticia a choque calórico medio de 42.5°C, 1 h + 37ºC, 3 h.) y chocarlos
subsecuentemente (45°C 1 h + 37°C 1 h) para determinar su termosensibilidad con azul de
130
tripano al 0.4%. Los incrementos en la Hsp70 se alcanzan 3 h después del choque calórico y se
observa que la inducción de la Hsp70 es un 70% menor en las ratas viejas, restringidas o no de
alimento, que en las ratas jóvenes.
Con respecto al mRNA de Hsp70, para las células incubadas a 37°C los transcriptos son
indetectables, no obstante éstos se inducen dramáticamente después del choque calórico (45°C
1 h; 37ºC, 1 h), sin embargo, se observa que la inducción en los linfocitos aislados de ratas
viejas es aproximadamente un 50% menor que en los de ratas jóvenes (P < 0.001). Con
respecto a la restricción alimenticia, no se observa ningún efecto sobre la termosensibilidad de
los linfocitos después de someterlos a choque calórico (Pahlavani et al., 1996).
De acuerdo con la etapa ontogénica del organismo también varía la participación de otros
citoprotectores en la respuesta celular al estrés, por ej., se ha probado la capacidad protectora
de diversos antioxidantes específicos para bloquear los efectos nocivos del choque calórico
sobre embriones preimplantados y linfocitos encontrándose grandes discrepancias, atribuibles
al diferente estado de desarrollo embrionario. Pues mientras que en los estados de mórula o en
los blastocistos de los embriones murinos y bovinos se observa un efecto termoprotector por la
taurina (Ealy et al., 1992; Malayer et al., 1992) la hipotaurina y la superóxido dismutasa
(Fujitani et al., 1997) el glutatión (Ealy et al., 1992; Aréchiga et al., 1994; Aréchiga y
Hanssen, 1995) y la vitamina E (Aréchiga et al., 1994), no sucede lo mismo con los embriones
de dos células (Ealy et al., 1995).
Así como en las distintas etapas del desarrollo pueden presentarse diferencias importantes en
la expresión de las Hsp, dentro de un mismo organismo hay una expresión diferencial entre los
tejidos que lo constituyen, y aún dentro de un mismo tipo de célula, la expresión varía durante
131
su equivalencia a la ontogenia, las diferentes etapas del ciclo celular.
Para probar si el umbral de activación de las Hsp es idéntico en todas las células de un mismo
animal, Sarge et al. (1995) cultivan células testiculares y hepáticas de ratón a diferentes
temperaturas. Con el conocimiento de que la temperatura testicular del ratón (30°C) es más
baja que la del interior de su cuerpo (37ºC), determinan el perfil de activación del HSF y
encuentran que las células hepáticas unen el HSF al DNA a 42ºC, como la mayoría de los
mamíferos, mientras que, en contraste, las células testiculares exhiben esta unión en niveles
bajos a los 36°C altos a los 38 y 40°C y diminuyen sus niveles a los 42 y 44°C. Con ello se
demuestra que las células testiculares tienen inducen la actividad de unión al DNA del HSF a
temperaturas significativamente menores que las hepáticas, demostrando que la temperatura
de activación no tiene un punto fijo en una especie dada, y que puede variar de una manera
dependiente del tipo celular.
De acuerdo con sus resultados, Sarge et al. (1995) sugieren la existencia de un estrecho
acoplamiento entre la temperatura de crecimiento celular y la temperatura de activación del
HSF. A pesar de sus 7°C de diferenc ia en la temperatura de crecimiento, tanto en las células
testiculares como en las hepáticas del ratón, la activación del HSF se presenta cuando la
temperatura esta 4-5°C por arriba de su respectiva temperatura de crecimiento. Esto plantea
la pregunta sobre si la existencia de diferencias entre las células podrá modular el punto de
activación del HSF, a 10 cual se propone que la temperatura de activación del HSF esta ligada
directamente al perfil de desnaturalización de proteínas características de cada célula,
particularmente al ocurrir las transiciones térmicas.
La baja temperatura de activación de las células testiculares puede relacionarse con la
132
estabilidad térmica reducida de una o más proteínas expresadas en ese órgano. Semejantes
candidatos son proteínas específicas del testículo, cuya sensibilidad a la desnaturalización
térmica pudo haber cambiado durante la evolución, durante la adaptación de las células del
testículo a su baja temperatura de crecimiento (Sarge et al., 1995).
Para la expresión inducida del gen de choque calórico que se observa durante estados
específicos del desarrollo y la diferenciación se encuentra una explicación en la existencia de
una familia de HSF. En la mayoría, pero no en todas las células, los HSF 1, 2 y 3 son
expresados al mismo tiempo, y la actividad de unión con el DNA de cada uno de ellos esta
regulada negativamente (Morimoto, 1993). Los vertebrados expresan distintos HSF cuyas
funciones aun no están bien comprendidas. HSFl y HSF3 son activados por exposiciones a
diferentes temperaturas de choque calórico, mientras que HSF2 parece ser regulado por
distintas señales medioambientales y del desarrollo (Kanei-Ischii et al., 1997).
La expresión de los genes de las proteínas de choque calórico y las chaperonas moleculares
están en si mismos regulados por el crecimiento, y tanto las Hsp como las chaperonas
moleculares son esenciales para las actividades de las proteínas involucradas en la
proliferación y la apoptosis (Kanei-Ishii et al., 1997).
Aunque los tejidos expresan Hsp70 en respuesta al calor, los diferentes tejidos varían en el
tiempo de su respuesta (Krebs y Feder, 1997). En los mamíferos la expresión de la Hsp70
puede variar dentro de tejidos específicos, por ejemplo, en el sistema nervioso central (SNC),
pero no se sabe si estos bajos niveles de expresión están o no correlacionados con la
susceptibilidad al calor. Es importante identificar el daño, debido a que una falla en el SNC
puede debilitar la función de un órgano, y que la causa se atribuya al órgano en sí. En una
133
prueba de desnaturalización de proteínas, las del intestino y el hígado se fueron más lábiles
que las del músculo o las lentes oculares (Krebs y Feder, 1997).
Krebs y Feder (1997) demuestran usando los resultados combinados de la técnica de tinción
citotóxica de exclusión con azul de tripano, y de la inmunocitoquímica, que hay variación en
la sensibilidad de los tejidos al choque calórico. Por ej., en D. melanogaster después del
choque calórico el tejido más lábil es el intestino. Lo que sienta las bases para examinar como
la sensibilidad diferencial de los tejidos resulta en la termotolerancia del organismo entero, de
modo que si se pudiera incrementar ésta en el tejido más sensible, pudiera esperase que un
incremento en la termotolerancia total del organismo. Al respecto, Tatar et al. (1997) plantean
la posibilidad de que la Hsp70 persista en concentraciones elevadas en algunos tejidos
específicos y críticos durante el período en que se incrementa la supervivencia.
Tatar et al. (1997) determinan el efecto de la Hsp70 sobre la supervivencia de D.
melanogaster durante el envejecimiento a temperaturas normales, usando cepas transgénicas
que varían en el número de copias del gen inducible hsp70. Encuentran que la concentración
de la Hsp70 inducida en la mosca completa es transitoria, pero que su efecto sobre la
supervivencia edad-específica es persistente. Esto pueden lograrlo mediante su capacidad de
renaturalizar, ensamblar y desensamblar muchas de las proteínas distintas a las Hsp, y para
interactuar con otros mecanismos de respuesta al estrés, tales como la superóxido dismutasa.
Aunque la Hsp70 esta estrechamente regulada, cuando se enfrenta rutinariamente al estrés,
pueden presentarse niveles transitorios pero efectivos de Hsp70, las cuales pueden reparar y
restablecer un elevado orden en las funciones celulares, que por sí mismas pudieran de otra
forma acelerar la senectud (Tatar et al., 1997).
134
Al comparar los datos obtenidos sobre la expresión de las Hsp70 cuando se usan tejidos
intactos y cuando se utilizan cultivos celulares no son raras las disparidades. Esto puede
reflejar, entre otras cosas, diferencias cuantitativas y cualitativas en las moléculas de
señalamiento extracelular y/o las influencias, frecuentemente profundas, que tienen sobre la
expresión de los genes, la matriz celular y la interacción célula-célula (Mangurten et al.,
1997).
Hofmann y Somero (1995) al estudiar la respuesta al estrés in situ, encuentran discrepancias
entre sus resultados y aquellos obtenidos in vitro en estudios realizados en células aisladas.
Sugieren que durante la exposición de los animales a temperaturas altas para afrontar el estrés,
incrementan su respuesta al choque calórico, mientras la presencia de concentraciones
elevadas puede ser insuficiente para prevenir la desnaturalización irreversible de las proteínas.
La discrepancia la explican con base a que in situ participan diversos factores que no están
presentes in vivo.
Las aproximaciones in vivo sobre el problema del estrés metabólico tienen implicaciones
como las señaladas por Hutter et al. (1996) en sus estudios sobre isquemia cradíaca, pues
señala que en un corazón per- fundido en sangre y no en buffer no se sabe si la lesión isquémica
pueda exacerbarse por el daño debido a la liberación de radicales libres mediada por los
neutrófílos sanguíneos.
En el endometrio y el ectocervix humano, mediante técnicas de inmunotinción, se encontró
que tanto la Hsc70 como la Hsp70 se encuentran consistentemente en concentraciones
mayores en las células epiteliales, en comparación con las células no-epiteliales que las
soportan o las rodean (Mangurten et al., 1997). los que demuestra que hay variación en la
135
sensibilidad de los tejidos al choque calórico. Esto se corrobora en D. melanogaster, donde el
tejido más termosensible es el intestino. La covariación entre, y tal vez aún dentro de los
tejidos con respecto a la expresión de Hsp70 o la tinción con azul de tripano, afirma que el
daño celular y la expresión de las Hsp70 están ligados, lo que fortalece la evidencia de usar a
las Hsp70 como un biomarcador de monitoreo ambiental (Krebs y Feder, 1997).
Los aspectos ecológicos de la respuesta al estrés incluyen la participación de factores
inductores como el clima, la periodicidad estacional y la disponibilidad de sustratos. De modo
que para poder sobrevivir en la naturaleza, cada planta y animal viviente debe de adaptarse
para, e interactuar con, el ecosistema de quien forma parte integral (Applin et al., 1987) ya que
es el medio ambiente determina, en última instancia, la distribución y abundancia de los
organismos (Safriel et al., 1989).
La manera en que los organismos utilizan su medio ambiente se entiende mejor en el contexto
de las escalas espacial y temporal (Crawford, 1991) ya que las actividades fisiológicas y
conductuales de un organismo son adaptadas temporalmente al ecosistema, mediadas a través
de sus biocronosistemas y entrenados por sus sincronizadores medioambientales, de manera
que el ritmo endógeno solo puede manifestarse por si mismo cuando las condiciones
ambientales son favorables (Applin et al., 1987).
Poco es lo que se sabe acerca de la manera en que se relacionan espacial y temporalmente la
expresión tejido-específica de las Hsp con la termotolerancia de los diversos tejidos y los
patrones de daño celular que sobrevienen durante y después del choque calórico (Krebs y
Feder, 1997a).
Cuando cualquier célula viva es expuesta a una elevación subletal de la temperatura
136
medioambiental, ocurren una serie de cambios adaptativos que sirven para protegerla de
incrementos de temperatura subsecuentes (Hightower, 1991). Para sobrevivir es necesaria la
evolución de redes de respuesta al estrés que vigilen, detecten y respoudan a los cambios del
medio ambiente (Morimoto, 1998). Ciertas Hsp ayudan a las células a enfrentarse con
temperaturas en el límite superior de su rango natura1 de crecimiento (SSA1, SSA2 y SSA3), o
para sobrevivir a exposiciones prolongadas a temperaturas que están justo por encima de
rango de crecimiento (Sánchez y Lindquist, 1990).
En la célula, la exposición prolongada al estrés interfiere con sus operaciones eficientes, con
consecuencias negativas para las propiedades bioquímicas de las proteínas que, bajo
condiciones ideales, existen en estados termodinámicamente estables. En los medios
ambientes estresantes, las proteínas pueden desdoblarse, doblarse mal o agregarse. Por lo
tanto, cambian lar demandas sobre el control de calidad en la biogénesis de las proteínas. Ante
este reto para la homesostasis de las proteínas se produce la respuesta al choque calórico a
través de la elevación en la síntesis de chaperonas moleculares y las proteasas, quienes reparan
el daño a las proteínas y asisten en la recuperación de la célula (Morimoto, 1998).
Los efectos nocivos del choque calórico probablemente estén relacionados, al menos en parte,
con el incremento en la generación de radicales libres y peróxidos dado en respuesta a las
temperaturas elevadas (Aréchiga et al., 1994).
La mayor parte de la expresión de Hsp70 activada por el choque calórico severo ocurre
después de que se retorna a las temperaturas fisiológicas normales, lo cual sugiere que la
expresión de la Hsp70 responde al daño inducido por el calor más que al calor en si mismo, o
que la expresión de las Hsp70 en si misma también es dañada por el calor. Por consiguiente,
137
no queda claro si la expresión de la Hsp70 sea más un síntoma de daño celular que un sistema
de reparación en si mismo. Por otra parte, la supervivencia se aumenta claramente con la
expresión de Hsp70 después del choque caló rico (Krebs y Feder, 1997).
Los cambios estacionales en las concentraciones endógenas de las proteínas de estrés pueden
contribuir al desarrollo de una termotolerancia estacional. Además, descubren que el estrés
subletal tiene implicaciones para los patrones de ecología energética y de distribución de las
especies, al llevar a una elevación en el nivel de Hsp e incrementar la cantidad de proteínas
dañadas irreversiblemente (Hofmann y Somero 1995).
La respuesta al estrés está asociada con la alimentación, ya que, existen evidencias de que la
respuesta puede modificarse cuantitativamente. (Williams et al. (1993) estudian la función
citoprotectora de las Hsp70 durante el estrés metabólico resultante de la privación de glucosa y
el bloqueo de la respiración mitocondrial (medio de cultivo DME libre de glucosa que
contiene 2 X 10-4 M rotenona) durante 2 h, condición metabólica que evoca una acidosis
intracelular severa y una disminución del ATP. Para lo anterior usan ratas transfectadas con el
gen humano hsp70, y encuentran que la expresión transitoria de este gen puede extender el
período requerido para comprometer la viabilidad de las células de mamífero sujetas a un
estrés similar al inducido en los tejidos durante la isquemia. Sin embargo, esta evidencia no
deja de ser circunstancial.
Marber et al. (1994) usan tejido cardíaco (músculo papilar) que previamente ha sido
suplementado con glucosa, con piruvato o no ha tenido suplemento alguno, y al que se ha
inducido la síntesis de Hsp70 mediante choque calórico, para después someterlo a un período
de hipoxia con privación de sustratos (30 min). Observan que la actividad contráctil de los
138
músculos papilares fue mayor en aquellos que fueron suplementados con piruvato antes del
tratamiento, y postulan que esto refleja un incremento en la resistencia mitocondrial a la
hipoxia y a la reoxigenación.
El hecho de que en la mayoría de los casos las Hsp son proteínas inducibles puede explicarse
por el alto costo de materiales, energía y oportunidad que representan para la célula.
En las hembras de D. melanogaster la síntesis de Hsp reduce la fecundidad y la inducción
específica de Hsp70 reduce in vitro la proliferación de las células de este insecto (Krebs y
Feder 1 997ª).
La Hsp70 pueden inhibir el crecimiento, reducir la termotolerancia y en (altas concentraciones
ser tóxicas (Krebs et al., 1998).
En las larvas de D. melanogaster, sujetas a estrés calórico, la sobreexpresión de las Hsp70
tiene consecuencias a posteriori, ya que las larvas que producen una cantidad de Hsp mayor a
la requerida en la naturaleza, reducen significativamente su supervivencia ( 34.0% P< 0.001) y
no alcanzan la edad adulta en comparación de los controles que expresan las Hsp en
cantidades normales (82.6%). Por otra parte, en los adultos sujetos a estrés calórico (38°C lh)
la supervivencia de quienes sobre expresan las Hsp es menor (40.3 ± 1.7, P<0.01) que en
aquellos con una expresión normal (49.5% ±2.2%) (Krebs y Feder, 1997ª).
Durante y después del estrés, las Hsp se asocian con una diversidad de estructuras
intracelulares que incluyen las relacionadas con la división celular, incluyendo al centrosoma,
al núcleo en general y a los cromosomas en particular; cada una de las cuales puede ser un
sitio para el efecto tóxico de las Hsp70 si están presentes en exceso (Krebs y Feder, 1997ª).
139
El balance entre los efectos positivos y negativos de la síntesis de Hsp, sugiere una
conveniencia evolutiva o antagonismo pleiotrópico. La conveniencia ocurre cuando un rasgo
que incrementa una aptitud esta ligado a otro que la disminuye (Krebs y Feder, 1 997ª).
El costo metabólico del daño a las proteínas puede tener un impacto considerable en el
presupuesto energético de un animal, pues la célula tiene un gasto energético significativo en la
degradación habitua l de sus proteínas. Por ej. en un hepatocito de rata, la duración promedio
de una proteína es de tres días (Beynon y Bond, 1986) y si estas condiciones del medio
ambiente incrementan la velocidad de pérdida de proteínas, estos costos metabólicos
adicionales para su reemplazo pueden incrementarse significativamente. También las
actividades propias de lasw Hsp implican altos costos metabólicos. Por ej. se estima que para
rescatar una sola molécula de rodanasa, E. coli requiere de 100 moléculas de ATP (Martin et
al., 1991).
Además, puede suceder que algunas proteínas se desnaturalicen irreversiblemente, lo que
obliga que sean degradadas en péptidos y aminoácidos a través de la vía proteolítica de la
ubiquitina, la cual involucra varios pasos dependientes del ATP, asociados con la activación y
unión de la proteína a la ubiquitina, así como con su hidrólisis por las proteasas citoplásmicas
(Hofmann y Somero, 1995).
La presión a que son sometidas las especies por el estrés medio ambiental tiene consecuencias
evolutivas importantes.
El costo metabólico de la respuesta al estrés puede ser uno de los componentes que influya en
el corto plazo sobre la fisiología del organismo y determine si éste pueda sobrevivir y
reproducirse bajo las condiciones medio ambientales que han inducido la expresión de las
140
Hsp. Del mismo modo, estos costos también pueden contribuir a determinar la adaptabilidad
de un organismo a su hábitat y, en consecuencia, participar como una fuerza selectiva para éste
(Krebs et al., 1998).
La degradación de proteínas inducida por el medio ambiente puede contribuir a determinar los
patrones de distribución de las especies, tanto a escala de micro hábitat como de latitud, dada
la interacción entre el estrés medio ambiental, el costo metabólico y la capacidad fisiológica de
un organismo para sobrevivir en un hábitat térmico particular. (Krebs et al., 1998).
Parte de las consecuencias que la temperatura de un hábitat puede tener sobre la economía de
un organismo, corresponden al costo energético de mantener la integridad del fondo de
proteínas, lo cual requiere de las actividades de degradación de las proteínas dañadas
irreversiblemente, el rescate de las proteínas desnaturalizadas por el calor mediante las
chaperonas moleculares o la síntesis de novo de las proteínas perdidas.
Entre los opuestos que representan las funciones fisiológicas de las Hsp en cuanto a la
protección, reparación y transporte de proteínas dentro de la célula, y el alto costo metabólico
que implican estas actividades, puede constituir una conveniencia evolutiva (Krebs et al.,
1998).
En un sentido amplio, la heredabilidad de la expresión de las Hsp70 es moderada o alta y
dada esta estimación, la expresión de las Hsp70 puede responder rápidamente a la selección.
Tal respuesta puede ser benéfica o deletérea, como se hace evidente en las líneas modificadas
mediante ingeniería genética en las cuales la variación en la Hsp70 excede a la naturaleza. Si
bien en esas líneas la termotolerancia es mayor, tal beneficio se paga con una reducción en
lavelocidad de desarrollo y un reducción en la supervivencia de las larvas en crecimiento
141
(Krebs et al., 1998)
Debido a que la expresión relativa de Hsp70 en un momento dado esta fuertemente acoplada a
la expresión en otras etapas, la selección sobre cualquier etapa alterará de manera similar la
expresión a través del ciclo de vida. En otras palabras, cuando la selección incrementa la
síntesis de Hsp70 en una etapa particular, en la cual se hace necesaria, la expresión de hsp70
también podrá incrementarse en otras etapas en las que puede llegar a tener efectos deletéreos
(Krebs et al., 1998).
Los mecanismos celulares de respuesta al estrés implican la percepción del insulto a la célula,
la activación de los mecanismos de defensa, incluyendo a las Hsp, y el restablecimiento de las
funciones normales.
A las Hsp probablemente las precedan en sus funciones citoprotectivas como factores que
limitan el daño isquémico otros mecanismos, como los mediados por la adenosina o las
proteinas cinasas; también pueden ser importantes las respuestas de inducción de defensas
antioxidantes (Sanders, 1997).
La respuesta transcripcional al choque calórico se atenúa una vez que se prolonga la
exposición de las células a un estrés calórico medio (42°C) o una vez que se retorna a la
temperatura fisiológica (37°C); esta atenuación se acompaña por la conversión del factor de
transcripción HSF a su forma activa como trímero a partir del monómero que no esta unido al
DNA, retornando a su distribución subcelular normal. En contraste, la exposición prolongada
a una temperatura extrema (43°C) resulta en una transcripción (Morimoto, 1993).
La evidencia biológica ha sugerido como modelo para la regulación de la actividad del HSF,
142
que bajo condiciones normales la magnitud de la termotolerancia depende de la dosis del
primer tratamiento de choque calórico (Mizuno et al., 1997).
Los niveles naturales de expresión de las Hsp70 se aproximan o son los máximos para una
función efectiva de defensa contra el estrés (Krebs y Feder, 1997).
Los ajustes fisiológicos a las condiciones medio ambientales están estrechamente entrelazados
con le comportamiento, la ecología y la evolución (Dawson et al., 1989).
El estrés representa la reacción del cuerpo a los estímulos que perturban su equilibrio
fisiológico normal u homeostasis, frecuentemente con efectos detrimentales (Hicks et al.,
1998). Las dos respuestas más comunes de las células vivientes a los estímulos externos son
la amplificación y la adaptación. La primera capacita a la célula para transformar estímulos
débiles y efímeros en cambios bioquímicos sustantivos; la adaptación en cambio, la capacita
para medir los cambios relativos más que los absolutos y por lo tanto responder a un amplio
rango de estímulos (Bray, 1995).
El cuerpo responde a las demandas físicas o psicológicas incrementadas mediante la liberación
de hormonas como la adrenocorticotropina (ACTH) a partir de la pituitaria anterior, los
glucocorticoides de la corteza adrenal, la epinefrina de la médula adrenal y la norepinefrina de
los nervios simpáticos. Estas hormonas sirven para adaptar al cuerpo a los estresores, que van
desde los psicológicos ligeros, hasta los fisicos intensos, mediante la afectación de los
sistemas cardiovasculares, productor de energía e inmune (Axelrod y Reisine, 1984). Se
presume que, durante los períodos de estrés la respuesta de estos sistemas principales tiene
valor adaptativo y homeostático (Minton, 1994).
143
Termorregulación: El incremento en la temperatura corporal es causado por un desbalance
entre la pérdida de calor por medios sensibles y evaporativos y la producción de calor causada
por la digestión, el mantenimiento, la producción, la actividad y el jadeo (Brown-Bradl et al.,
1997). Por otra parte, hay varios mecanismos mediante los cuales los animales horneotermos
incrementan su producción de calor, incluyendo el escalofrío, la activación del sistema
nervioso simpático y la estimulación de la secreción de hormona tiroidea (Silva y Larsen,
1983).
La zona termoneutral dentro del rango horneotérmico es muy difícil de definir; en ella los
vasos sanguíneos en la piel no están ni totalmente dilatados ni totalmente contraídos, la
evaporación de humedad a partir de la superficie de la piel o del tracto respiratorio es mínima,
el pelo o las plumas no están erectos (piloerección) y no ocurren respuestas de conducta al frío
o al calor (Brown-Brandl et al., 1997).
Un incremento en la temperatura corporal también causa un incremento en la producción de
calor a partir del efecto de van Hoff, que establece que la velocidad de las reacciones en el
cuerpo se incrementa logarítmicamente con la temperatura corporal (Brown-Brandl et al.,
1997).
Los mecanismos termorreguladores físicos incluyen la vasodilatación, un incremento en las
pérdidas evaporativas a partir de la superficie de la piel y del tracto respiratorio y una
disminución en el consumo de alimento y los niveles de producción para reducir,
respectivamente, el calor de la digestión y de la producción metabólica (Brown-Brandl et al.,
1997).
La piel es la principal estructura termorreguladora del cuerpo animal. Contribuye con
144
alrededor de un 84% del total de las pérdidas evaporativas, por lo cual el número de glándulas
sudoríparas por unidad de área, su tamaño, forma y profundidad, juegan un papel importante
en la adaptación de los animales a sus medios (Bhayani y Vyas, 1990).
La tolerancia al calor se manifiesta por la capacidad para mantener constante la temperatura
corporal en un medio ambiente caluroso (Hammond et al., 1996). Sin embargo, existen límites
para el rango de temperaturas dentro del cual pueden mantener la homeotermicidad los
animales vertebrados. Por encima de la zona termoneutral, el rango de temperaturas que
pueden tolerar los animales es bastante estrecho, sobre todo para aquellos que cuentan más en
defensas físicas que químicas para enfrentar los cambios en su temperatura corporal (Brown-
Brandl et al., 1997).
El estudio de la respuesta al estrés tiene un futuro promisorio en lo que corresponde al estudio
del estrés isquémico y sus posibilidades de conocer y controlar sus consecuencias, en
beneficio de la prevención y tratamiento de afecciones miocárdicas y en el campo de los
transplantes de órganos.
Aunque la incidencia de infartos al miocardio ha disminuido significativamente a partir de
mediados de la década 80, no obstante se realice la reperfusión temprana, la pérdida de
miocardio funcional predispone a fallas cardíacas severas subsecuentes, lo que aún representa
un problema médico significativo (Mestril et al., 1994). Otro importante problema se presenta
en los transplantes de órganos, donde se necesita desarrollar estrategias que los protejan de la
isquemia. En el riñón por ejemplo, es necesario disminuir la incidencia de la falla renal aguda
e incrementar la tasa de supervivencia a largo plazo de este órgano (Kuhlmann et al., 1997).
Mestril et al. (1994) exploran el efecto protector conferido contra el estímulo isquémico in
145
vitro por un tratamiento calórico previo a las células H9c2. Sus estudios muestran este choque
calórico previo mejora la supervivencia celular.
Morris et al. (1996) destacan que la posibilidad de inducir en el miocardio un estado
prolongado de resistencia a la isquemia puede ser benéfica en situaciones tales como la angina
inestable, la angioplastía coronaria de alto riesgo, la cirugía que involucre derivaciones
cardiopulmonares, así como en corazones explantados antes de su transplante; en todas estas
condiciones el corazón se mantiene en isquemia transitoria.
Ante condiciones fisiopatológicas, la expresión de las Hsp representa la respuesta aguda de la
célula en su intento por adaptarse a un estado particular de enfermedad (Maulik et al., 1995).
En los tejidos cardíacos, una amplia variedad de insultos, como la isquemia, inducen la
síntesis de las proteínas Hsp lo que sugiere que estas proteínas puedan estar involucradas en la
reparación de procesos celulares, tanto durante como después del insulto (Marber et al., 1994).
En la angina inestable pueden ocurrir episodios cortos de isquemia, que inducen
significativamente la síntesis de Hsp en un período de 24 h, lo que ofrece la posibilidad teórica
de un cambio adaptativo, retardado pero de larga duración, que puede hacer al corazón
resistente a una isquemia subsecuente (Marber et al., 1994).
Esta respuesta endógena al estrés es fundamental para el mantenimiento de la homeostasis
tisular del corazón. Sin embargo, disminuye durante el envejecimiento, y puede volver al
corazón más vulnerable al estrés medio ambiental (Nakano et al., 1997).
Cabe destacar que los mecanismos de lesión hipoxica no se han entendido completamente
146
(Kuhlmann et al., 1997) pero desde un punto de vista celular, la isquemia al miocadio esta
compuesta de una diversidad de factores que contribuyen al estrés severo. Entre estos
estresores se encuentra la privación de oxígeno, el agotamiento del ATP, la privación de
glucosa, la acumulación de metabolitos tóxicos, la disminución del pH en la célula (Mestril et
al., 1994) la inactivación de las enzimas antioxidantes naturales supeóxido dismutasa y
catalasa (Maulik et al., 1995) y un incremento súbito en los niveles intracelulares de calcio
que puede romper estructuras del citoesqueleto y activar a las fosfolipasas, proteasas y
nucleasas (Kuhlmann et al., 1997).
Hutter et al. (1996) ha propuesto que los cambios patológicos que ocurren en la célula durante
la isquemia incluyen alteraciones en el balance ionico, el pH y los niveles de ATP. La
reperfusión subsecuente resulta en influjo de calcio y estrés por radicales libres. Este medio
probablemente desnaturalice a las proteínas existentes y altere la posterior traducción. Es
probable que las proteínas de la familia Hsp70 estabilicen a las proteínas desnaturalizadas o
parcialmente desnaturalizadas hasta su reparación o exclusión de la célula, disminuyendo la
lesión isquémica irreversible.
La década 90 ha sido testigo del desarrollo de un nuevo concepto para la preservación del
miocardio, basado en el hecho de que mejorando los sistemas endógenos de defensa puede
proveerse a cada célula con una síntesis de nuevas proteínas y de este modo, de los medios
para protegerse a si mismas cuando sean más susceptibles de dañarse (Maultik et al., 1995).
Al respecto han sido propuestas distintas aproximaciones. Williams et al. (1993) formularon la
hipótesis de que las células cargadas con altas concentraciones de Hsp70 antes del inicio de un
estrés metabólico severo, podrían extender el período de tiempo antes del cual se suscitara un
147
daño celular irreversible. Los resultados obtenidos desde entonces han confirmado su
predicción.
Con base en el fenómeno de termotolerancia, que se presenta cuando cualquier célula viva es
expuesta a una elevación subletal de la temperatura medioambiental, ante lo cual ocurren una
serie de cambios adaptativos que sirven para protegerla de incrementos de temperatura
subsecuentes (Hightower, 1991), se diseñaron diversos experimentos encaminados a generar
un choque calórico en el tejido cardíaco para posteriormente observar su comportamiento ante
la isquemia.
Al respecto, Hutter et al. (1994) probaron la hipótesis de que el grado de protección contra el
daño isquémico (35 min) y la reperfusión (120 min) en ratas chocadas por calor (40, 41 o 42°C
X 20 min) se correlaciona con el grado de inducción previa de las Hsp72, encontrando una
correlación inversa entre la cantidad de Hsp72 expresada y el grado de daño producido por la
isquemia prolongada. Marber et al. (1094) usando ratas que 24 horas antes recibieron un
choque calórico al cuerpo completo, de diferentes grados de severidad, encontraron que el
grado de reducción en el tamaño del infarto miocárdico se correlacionó con el contenido
miocardial de Hsp72.
Maulik et al. (1995) señalan que el choque calórico in vivo generalmente se logra calentando
al animal por medios físicos (inmersión). Sin embargo, es extremadamente difícil aumentar la
temperatura de un órgano interno como el corazón a 42°C o 43ºC sin causar severas
quemaduras en el espécimen. Esto no solo se debe a que el corazón esta protegido por la piel,
el músculo y otros tejidos, así como a la capacidad del organismo para controlar su
temperatura interna defendiéndose de la hipertermia o de la hipotermia. En consecuencia, ellos
148
proponen seguir un camino alternativo: estimular el metabolismo celular acelerando la
lipolisis endógena, para lo cual usan anfetaminas, una droga simpáticomimética que puede
elevar la temperatura corporal.
La anfetamina causa una inducción en la expresión de los genes hsp en todos los órganos
vitales, incluyendo corazón, pulmones, hígado, cerebro, riñón e intestino, lo que indica que
esta droga provoca una respuesta al choque calórico en todo el cuerpo. Para estudiar la
preservación miocardica, se seleccionó específicamente un período 40 h posterior al
tratamiento para eliminar cualquier efecto simpáticomimético o de preacondicionamiento por
la droga (Maulik et al., 1995).
El uso de fármacos para inducir hipertermia en un órgano interno, vence los límites impuestos
por el tamaño corporal al calentamiento por medios físicos. En consecuencia se da la
posibilidad de trabajar en modelos biológicos de mucho mayor tamaño que las ratas o los
conejos.
Maulik et al. (1995) examinan los efectos del choque calórico inducido por anfetaminas sobre
la recuperación postisquémica del miocardio del cerdo en una situación de revascularización
coronaria por infarto agudo al miocardio (60 min de isquemia regional, seguidos de 60 min de
paro cardioplégico hipotérmico). Se demuestra que la anfetamina puede inducir un choque
calórico al cuerpo entero que puede precondicionar al corazón, produciendo un aumento en la
tolerancia al daño por isquemia-reperfusión, por lo cual sugieren la posibilidad de usar a la
anfetamina como una droga preacondicionadora.
Mestril et al. (1994) abordan el problema del daño isquémico en el ámbito de los cultivos
celulares y encuentran que las células miogénicas previamiente chocadas por calor para
149
inducir la síntesis de Hsp70, fueron más resistentes que los controles al estímulo subsecuente
de estrés isquémico. Marber et al. (1994) obtienen resultados similares. Consideran a la Hsp72
como la variable inducida después del estrés calórico y la correlacionan con la variable
resistencia del músculo papilar miocardico a la hipoxia y reoxigenación.
En el trabajo de Marber et al. (1994) se destaca que, los músculos papilares que responden al
estrés calórico con una mayor cantidad de Hsp, también lo hacen con un incremento mayor en
su actividad antioxidante endógena. Esto plantea un problema, la inducción mediante choque
calórico produce daño celular. Se crea así la necesidad de buscar un incremento en la síntesis
de Hsp mediante estímulos diferentes al choque calórico. Al respecto Mestril et al. (1994) para
responder a la cuestión de que tanto contribuye la presencia de Hsp70 en la protección contra
el daño isquémico, generan una línea celular transgénica (H9c2 derivada del corazón de rata)
que sobreexpresa la Hsp70 inducible en humanos y resiste significativamente más al estrés
isquémico que las células control.
Hutter et al. (1996) para establecer un papel directo a la sobrexpresión de Hsp72 y la
protección del daño isquémico, usan un modelo de oclusión y reperfusión arterial coronaria in
vivo, en ratones transgénicos que sobreexpresan la Hsp72 y encuentran que éstos muestran una
reducción significativa en el tamaño de los infartos en comparación con los ratones control.
Kuhlmann et al. (1997) encuentran que el preacondicionamiento con calor protege a las
células epiteliales tubulares renales del daño en su membrana plasmática inducido por el
ionóforo calcio ionomicina, y sugieren que la protección depende del nivel de expresión de la
proteína de choque calórico Hsp70.
150
5. Conclusiones
Se obtuvieron evidencias de que la síntesis de Hsp70 en el linfocito caprino ocurre después de
exponerse durante 3 horas a estrés calórico medio (42ºC).
Se aportan evidencias de que en este modelo biológico el factor genético de la raza no influye
en su termosensibilidad ni en la inducción diferencial de las Hsp.
Se observó que, independientemente de su raza, los linfocitos obtenidos de animales expuestos
naturalmente a condiciones de estrés calórico tuvieron un umbral mayor de termosensibilidad
(44°C) que aquellos que en su medio ambiente no están expuestos a condiciones de estrés
calórico, cuyo valor umbral de termosens ibilidad fue menor (42ºC), lo cual confirma que la
naturaleza induce la termotolerancia cuando los animales están expuestos a condiciones de
adversidad climática.
Se prueba que ante el estrés de mediana intensidad el linfocito caprino sintetiza Hsp70, pero
sin presentar diferencias significativas entre los tratamientos, lo que sugiere la intervención de
otros factores citoprotectores diferentes a las Hsp.
El punto de vista prevaleciente en la literatura consultada considera que las Hsp son una
característica común y básica de todos los organismos y la variación que exista en su
importancia relativa y sus umbrales de inducción se atribuyen al medio ambiente.
La respuesta celular al estrés calórico es un fenómeno ubicuo, conservado y universal,
integrado por múltiples factores citoprotectores que incluyen a los agentes antioxidantes,
enzímas como catalasa y la superóxido dismutasa, osmolitos orgánicos como la taurina y a las
diversas familias de proteínas de estrés, entre las que destaca la Hsp70.
151
La expresión de las Hsp varía genéticamente y se conserva a través de las etapas del ciclo de
vida, variando su rango de expresión entre los distintos estados ontogénicos.
Se considera que la variación en la expresión de las Hsp70 puede tener consecuencias
positivas, al permitir sobrevivir a las células al ser sometidas a situaciones de estrés de una
intensidad tal, que de otra forma sería letal, pero también negativas, al consumir una elevada
proporción de los recursos materiales y energéticos de la célula que pueden ser críticos para la
supervivencia o reproducción celular en el futuro mediato.
En Drosophila, uno de los principales sistemas usados como modelo biológico, se ha
demostrado que la síntesis de Hsp70 es un fenómeno transitorio, no inmediato y que confiere
mayor protección a consecuencia del incremento del nivel de Hsp70 disponible dentro de la
célula, hasta después de transcurridas de 12 a 24 h de concluido el estímulo inductor.
En la literatura consultada se da evidencia de que mediante fármacos es posible inducir la
respuesta celular al estrés y la síntesis de las Hsp. Esto abre la posibilidad de usar estos
recursos para generar termotolerancia en las especies animales domésticas, y así prepararlas
para la producción y la reproducción bajo las condiciones de adversidad climática como las de
las zonas áridas.
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MC. ARNOLDO MICHEL ROSALES DIRECTOR DE LA F.C.B.A. PRESENTE En atención a que el C. Jesús Heraclio del Río Martínez, estudiante-egresado del Doctorado en Biotecnología Microbiana, con número de cuenta de la Universidad de Colima: 93-3597, efectuó las correcciones y acató las sugerencias que los integrantes del Cuerpo de revisión de tesis del Colegiado de este posgrado, le habían indicado; le solicito atentamente la autorización de impresión de la tesis titulada: “La síntesis de proteínas Hsp en linfocitos caprinos sujetos a estrés calórico”, misma que ha sido dirigida por los Dr. Miguel Arenas Vargas, Dr. Fausto Sánchez y García Figueroa, Dr. Antonio Flores Díaz, Dr. Héctor González Cereso, Dra. Judith Licea de Arenas y Dr. Luis Felipe Bojalil Jáber. Dicho documento reúne todas las características apropiadas como requisito parcial para obtener el grado de Doctor en Biotecnología Microbiana y línea de investigación Herencia y Adaptación Animal, y fue revisada en cuanto a forma y contenido por los Dres: José Gerardo López Aguirre, Sergio Aguilar Espinosa, Francisco Radillo Juárez, Javier Farías Larios, Miguel Huerta Viera y Jaime Molina Ochoa, todos de la Universidad de Colima. Además, fue revisado y aprobado por los Dres. Avedis aznavurian Apagian y Fernando Mora Carrasco de la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Por la atención que destine a la presente, reciba mi agradecimiento y consideración más distinguida.
ATENTAMENTE c.c.p. Dr. Francisco I. Lepe Aguayo. Coor. Gral, de Docencia. c.c.p. Dra. Sara Griselda Martínez Covarrubias. Dir. Gral. Posgrado. c.c.p. Dr. Carlos E. Izquierdo Espinal. Del. Reg. No. 2 c.c.p. Ing. Rodolfo Valentino Morentín Delgado. Srio. Admvo. FCBA. c.c.p. Archivo. c.c.p. Interesado.
Carretera Jiquilpan-Manzanillo, km 260 / Tecoman Colima, 28100. A P 36 / Telefax 01 (332) 4 42 37, 4 46 42E-mail dtcba@tecoman ucol mx
UAM-X, A 28 DE JULIO DE 1999.
M.C. Arnoldo Michel Rosales Director de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Universidad de Colima Los que suscriben, profesores de la Universidad Autónoma Metropolitana, tenemos el agrado de manifestar a usted que de nuestra dirección del trabajo de Jesus Heraclio Del Río Martínez, resultó el documento “La síntesis de proteínas Hsp70 en linfocitos caprinos Sujetos a estrés calórico”, Y que después de haberlo revisado en diversas ocasiones consideramos reúne todos los requisitos de una tesis a nivel dé Doctorado. Por tanto hacemos votos porque a la brevedad posible el Sr. Del Río pueda merecer el grado de Doctor en Biotecnología Microbiana de la
ATENTAMENTE
Casa abierta al tiempo
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
ia
Universidad de Colima.
Dr. Hector Gonzalez Cerezo
rcla F i g u e r o a
UNIDAD XOCHIMILCOCalz. del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, 04960 México, D.F., Tel.: 724-5000
México, D. F., 13 de Mayo de 1999 DR. JAIME MOLINA OCHOA Coordinador del Posgrado Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Universidad de Colima Presente. Sirva este medio para saludarlo, además de informarle que he revisado el documento de JESUS HERACLIO DEL RIO MARTINEZ, intitulado “La síntesis de proteínas Hsp70 en linfocitos caprinos sujetos a estrés calórico” y en mi opinión, reúne las características exigidas para una tesis doctoral. Sin otro particular, me despido agradeciendo las atenciones que se sirva otorgar al presente. Atentamente. “CASA ABIERTA AL TIEMPO” DR. FERNANDO MORA CARRASCO
Casa abierta al tiempo
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UNIDAD XOCHIMILCOCalz. del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, 04960 México D. F. Tel: 724-5000
México, D. F., 7 de mayo de 1999. DR. JAIME MOLINA OCHOA. Coordinador del Posgrado de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias en la Universidad d e Colima. P r e s e n t e. Sirva este medio para saludarlo, además de informante que he revisado el documento de JESUS HERACLIO DEL RIO MARTINEZ, intitulado “La síntesis de proteínas Hsp70 en linfocitos caprinos sujetos a estrés calórico" y en mi opinión, reúne las características exigidas para una tesis docto-- ral. Sin otro particular me despido agradeciendo las atenciones que se sirva otorgar al presente.
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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANADIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
UNIDAD XOCHIMILCOCalz. del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, 04960 México D. F. Tel: 724-5000
Colima, Col., 30 de junio de 1999 DR. JAIME MOLINA OCHOA, COORDINADOR DEL POSGRADO DE BIOLOGIA Y PRODUCCION AGROPECUARIA DEL AREA DE BIOTECNOLOGIA, P R E S E N T E . Después de haber revisado la tesis titulada “LA SINTESIS DE
PROTEINAS HSP70 EN LINFOCITOS CAPRINOS SUJETOS A ESTRÉS
CALORICO” presentada por el M. en C. Jesús Heraclio del Río Martínez,
para obtener el grado de Doctor en Biotecnología Microbiana, en mi calidad
de tutor la doy por aprobada
A t e n t a m e n t e .
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C U I B
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICASAPDO. POSTAL 199 TEL. (91-331) 2-58-18
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