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Universidade de
Aveiro
2014
Departamento de Biologia
Ana Lúcia da Silva
Gomes
Prevalência e resistência de Pseudomonas
aeruginosa em ambulatório
DECLARAÇÃO
Declaro que este relatório é integralmente da minha autoria, estando devidamente
referenciadas as fontes e obras consultadas, bem como identificadas de modo claro as
citações dessas obras. Não contém, por isso, qualquer tipo de plágio quer de textos
publicados, qualquer que seja o meio dessa publicação, incluindo meios eletrónicos, quer de
trabalhos académicos.
Universidade de Aveiro
2014
Departamento de Biologia
Ana Lúcia da Silva
Gomes
Prevalência e resistência de Pseudomonas
aeruginosa em ambulatório
Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Microbiologia, realizada sob a orientação científica do Dr. António Alberto Calisto Vicente Ferreira Neves, Farmacêutico Especialista em Análises Clínicas do Laboratório Médico de Análises Clínicas de Aveiro (AVELAB) e co-orientação da Professora Doutora Maria de Lourdes Pereira, Professora Associada com Agregação do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.
Dedico este trabalho aos meus pais.
o júri
presidente Prof. Doutor Henrique Manuel Apolónia Coutinho da Foneca Professor Auxiliar, Universidade de Aveiro
Prof. Doutor Artur Jorge da Costa Peixoto Alves Equiparado a Investigador Principal, Universidade de Aveiro
Licenciado António Alberto Calisto Vicente Ferreira Neves Técnico Superior Avelab
agradecimentos
Agradeço ao Dr. António Ferreira Neves e à Drª. Maria de Lourdes Pereira pela orientação prestada. Agradeço à Gisela Portugal pelos conhecimentos transmitidos. Agradeço à Elizabeth Vieira pelos conhecimentos transmitidos e orientação que me prestou. Agradeço também à Cláudia Pereira pela disponibilidade sempre que solicitava a sua ajuda nas tarefas laboratoriais. Agradeço ainda à Rosário pela ajuda facultando-me os dados estatísticos de que necessitei para a elaboração deste trabalho.
palavras-chave
Prevalência, Resistência, Pseudomonas aeruginosa, Antibióticos e Ambulatório.
resumo
Pseudomonas aeruginosa é responsável por infeções nosocomiais e na comunidade em geral. Em Portugal, as infeções da pele e dos tecidos moles são as afeções mais frequentes em instituições que prestam cuidados continuados, sendo a maioria gerida em ambulatório. No presente estudo determinou-se a prevalência bacteriana em ambulatório e em postos que prestam serviços de ambulatório e de cuidados continuados. Caracterizou-se a distribuição de P. aeruginosa segundo fatores como a idade, género e localização da infeção e determinou-se o perfil de resistência e multirresistência de P. aeruginosa em exsudados purulentos, no período de 2010 a 2013 no Laboratório Médico de Análises Clínicas de Aveiro (AVELAB). A espécie em estudo foi isolada em meio Levine. Efetuou-se também a coloração de Gram e testes de confirmação bioquímicos, para a correta identificação da espécie. Para avaliação do perfil de resistência realizou-se um antibiograma, pelo método de Kirby-Baüer, com antibióticos definidos pela Direção Geral de Saúde. Dos 652 isolados bacterianos determinou-se que o S. aureus, P. aeruginosa e Proteus spp, são as três principais bactérias responsáveis por infeções da pele e tecidos moles em ambulatório. Também se verificou que P. aeruginosa foi a terceira bactéria mais frequentemente responsável pela infeção em postos de ambulatório com cuidados continuados. Este tipo de infeção é mais frequente, segundo os dados obtidos, em indivíduos do género feminino, com uma média de idades de 77 anos, cujas lesões se localizam predominantemente abaixo do plano transversal à linha da cintura. Os antibióticos que apresentaram maiores percentagens de resistência foram a tetraciclina (88,6%), a ciprofloxacina (33,5%), a gentamicina (25%), a piperacilina±tazobactame (17,1%) e o imipenemo (12,2%). Verificou-se percentagens de resistência mais elevadas no ano de 2013. Futuramente, no plano preventivo deve ser adequada a prescrição e utilização dos antibióticos, assim como vigiar o perfil de resistência e de consumo dos mesmos. No plano científico a exploração de novos compostos, como a prata, iodo, mel, agentes anti-biofilme, novos antibióticos e outras fontes bactericidas como óleos essenciais, e ainda a terapia com recurso a péptidos antimicrobianos, anticorpos monoclonais ou mesmo a terapia fágica poderão servir de complemento ou alternativa para o tratamento de infeções causadas por P. aeruginosa.
Keywords
Prevalence, Resistance, Pseudomonas aeruginosa, Antibiotics and Ambulatory.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa is responsible for nosocomial and general community infections. In Portugal skin and soft tissue infections are more frequent in continued care institutions while most of these infections are managed by ambulatory healthcare. In this study it was determined the bacterial prevalence in stations that provide: i) ambulatory healthcare and ii) both continued and ambulatory healthcare. The work is based on the characterization of the distribution of P. aeruginosa according to factors such as age, gender, infection location and by determining the resistance and multiresistance profiles of the bacteria in purulent exudates, using the data provided by the Medical Laboratory of Clinical Analysis of Aveiro (AVELAB) pertaining the 2010-2013 timeframe. The studied specie were isolated in Levine’s formulation and used Gram staining to identify and other techniques like biochemical test for confirm the specie identification. The resistance profile evaluation was done using an antibiogram, applying the Kirbys-Baüer method using antibiotics defined by the Directorate-General of Health. As result of the developed work, it was determined that of the 652 bacterial isolates the top three bacteria responsible for skin and soft tissue infections are S. aureus, P. aeruginosa and Proteus spp. Furthermore, it was noted that P. aeruginosa was the third most frequent bacteria responsible for infections in ambulatory with a continuum of care. According to the provided data, it was also concluded that this type of infection is more frequent on 77 year old females with lesions are predominantly present below the waist line. The studied antibiotics present a wide range of results in terms of resistance, with tetracycline presenting the highest resistance percentage (88,6%), followed by ciprofloxin (33,5%), gentamicin (25%), piperacillin±tazobactam (17,1%), imipenem (12,2%). It was also verified that 2013 was the year with the more elevated resistance percentages. In the future, the preventive plan should considerate the appropriate prescription and utilization of antibiotics, as well as the continued monitoring of the bacterial resistance profile. The current scientific plan explores new compounds, such as silver, iodine, honey, anti-biofilm agents, new antibiotics, other bactericidal sources, like essential oils, and therapies resorting to antimicrobial peptides, monoclonal antibodies and even phage therapy that could be used as an alternative or a complement to the treatment of infections caused by P. aeruginosa.
I
ÍNDICE DE ABREVIATURAS ............................................................................................................ II
ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................... III
ÍNDICE DE TABELAS ....................................................................................................................... IV
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 1
1.1. PSEUDOMONAS AERUGINOSA .................................................................................................. 1
1.2. FATORES DE VIRULÊNCIA ........................................................................................................ 2
1.3. EPIDEMIOLOGIA ...................................................................................................................... 2
1.4. INFEÇÕES DA PELE E TECIDOS MOLES ...................................................................................... 3
1.5. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO ................................................................................................ 4
1.6. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS ............................................................................ 4
1.7. ANTIBIÓTICOS E MECANISMOS DE RESISTÊNICA ....................................................................... 5
1.7.1. Antibióticos β-lactâmicos ............................................................................................... 5
1.7.2. Aminoglicosídeos .......................................................................................................... 6
1.7.3. Fluoroquinolonas .......................................................................................................... 6
1.7.4. Tetraciclinas .................................................................................................................. 6
1.8. MULTIRRESISTÊNCIA EM PSEUDOMONAS AERUGINOSA ............................................................. 7
2. ENQUADRAMENTO ................................................................................................................... 8
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 8
4. MÉTODOS .................................................................................................................................. 9
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRAGEM ....................................................................................... 9
4.2. IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS BACTERIANOS .......................................................................... 9
4.3. TESTES BIOQUÍMICOS ........................................................................................................... 10
4.4. TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ............................................................. 11
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................ 12
5.1. DADOS EPIDEMIOLÓGICOS .................................................................................................... 12
5.2. ISOLADOS BACTERIANOS ....................................................................................................... 14
5.3. PERFIL DE RESISTÊNCIAS AOS ANTIBIÓTICOS ......................................................................... 15
5.4. MULTIRRESISTÊNCIA ............................................................................................................ 19
6. CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 21
7. PERSPETIVAS FUTURAS ....................................................................................................... 22
8. BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................... 23
II
Índice de Abreviaturas
AVELAB: Laboratório Médico de Análises Clínicas de Aveiro
DGS: Direção Geral de Saúde
ECDC: European Centre for Disease Prevention and Control
III
Índice de Figuras
Figura 1: Isolado de P. aeruginosa em meio Levine. ......................................................................... 9
Figura 2: Métodos bioquímicos de identificação de P. aeruginosa. (a) Testes da oxidase, com
produção de pigmento de cor roxa após contato da colónia com o disco. P. aeruginosa apresenta-
se oxidase positiva (b) Teste de Kligler, P. aeruginosa não fermenta os açúcares e por
conseguinte não provoca acidificação do meio não ocorrendo a viragem do vermelho de fenol para
a cor amarela. Este teste é negativo para a espécie (C) No teste de citrato de Simmons, não
ocorre a transição da cor do meio de verde escuro para azul escuro, uma vez que este teste é
nagativo para a bacteria em estudo (D) No teste da ureia como P. aeruginosa não possui a enzima
urease, não conseguem desdobrar a ureia, não ocorrendo viragem do amarelo para vermelho de
fenol. Este teste é negativo para P. aeruginosa (E) Teste do indol, na presença de P. aeruginosa,
a adição do regente de Kovacs não promove a formação de um anel de cor vermelha na superfície
do meio indol como é de esperar no teste positivo. Este teste é negativo para P. aeruginosa. ..... 10
Figura 3: Antibiograma para P. aeruginosa realizado pelo método de Kirby-Baüer em agar Müller-
Hinton. Visível a produção de pioverdina, pigmento hidrossolúvel e difundível no meio. ............... 11
Figura 4: Prevalência de microrganismos isolados de exsudados purulentos positivos, para
infeções da pele e tecidos moles no período de Janeiro de 2011 a Dezembro de 2013 em
ambulatório. ...................................................................................................................................... 12
Figura 5: Prevalência de microrganismos isolados de exsudados purulentos positivos para
infeções da pele e tecidos moles no período de Janeiro de 2011 a Dezembro de 2013 em postos
com serviços de ambulatório e cuidados continuados..................................................................... 13
Figura 6: (a) Média de idades dos indivíduos do género masculino e feminino e (b) Percentagem
de indivíduos do género masculino e feminino com exame bacteriológico positivo para infeções da
pele e tecidos moles, onde o agente etiológico é P. aeruginosa. .................................................... 14
Figura 7: Percentagem de distribuição anatómica das lesões em individuos com infeções da pele e
tecidos moles causadas por P. aeruginosa em ambulatório no período de 2011 a 2013. .............. 15
Figura 8: Perfil de resistência de P. aeruginosa ao longo dos 3 anos em ambulatório. (*)
Antibióticos não testados. ................................................................................................................ 16
Figura 9: Percentagem de isolados de P. aeruginosa multirresistentes responsáveis por infeções
da pele e dos tecidos moles em ambulatório entre 2010 e 2013. ................................................... 19
IV
Índice de Tabelas
Tabela 1: Perfil de resistência dos 18 isolados de P. aeruginosa responsáveis por infeções da pele
e tecidos moles em ambulatório no período de 2011 a 2013.
1
1. Introdução
A ampla utilização dos antibióticos na medicina humana, veterinária e na indústria de
produção animal com fins terapeuticos ou profiláticos tem favorecido o aparecimento de bactérias
resistentes. Essa resistência advém da utilização excessiva e inadequada dos antibióticos, que na
saúde humana é determinada pela forma de prescrição, pelo tipo de doentes e ainda pelo sistema
prestador dos serviços de saúde (Snary et al, 2004 e Ramalhinho et al, 2012).
A resistência aos antibióticos disponíveis continua a revelar-se uma preocupante realidade no
século XXI afetando não só o ambiente hospitalar e indivíduos imunocomprometidos, mas também
a comunidade em geral (Alanis, 2005). Essa resistência está intimamente associada a elevados
custos nas hospitalizações (Sipahi, 2008) e elevadas taxas de morbilidade e mortalidade (Villa et
al, 2013).
A prevenção da dispersão da resistência aos antibióticos passa pela optimização da sua
utilização, a adoção de tratamentos alternativos, introdução de medidas de controlo da
disseminação bacteriana (ex., lavagem das mãos e isolamento) e ainda pela promoção da
informação dos profissionais de saúde e comunidade em geral (Sipahi, 2008).
Em suma, a capacidade das bactérias em restringirem o uso de antibióticos, compromete as
opções disponíveis para o tratamento de infeções criando-se a necessidade de produção de novos
antibióticos que apresentem bons perfis farmacológicos e baixa toxicidade para o hospedeiro
(Ziemska et al, 2013).
No presente estudo são abordados conceitos introdutórios como, a biologia de Pseudomonas
aeruginosa, as metodologias utilizadas no seu isolamento e identificação, assim como os
mecanismos de ação e resistência aos antibióticos utilizados no tratamento de infeções da pele e
tecidos moles causadas por este microrganismo.
1.1. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria da família Pseudomonodaceae (Wu et al, 2011).
Apresenta-se como um bacilo de Gram-negativo, aeróbio estrito, oxidase positivo, não
fermentador de lactose. Esta espécie sobrevive com baixa disponibilidade de nutrientes (Spicer,
2000), apresentando um crescimento óptimo entre os 30ºC e os 37ºC (Fonseca et al, 2004).
A bactéria acima referida está presente nas fezes de indivíduos sadios e na flora conjuntival
(Andonova et al, 2013). Raramente provoca infeções em organismos saudáveis. Pseudomonas
aeruginosa está presente no solo e na água (Andonova et al, 2013) ocorrendo em soluções de
lentes de contato, canalizações domésticas, piscinas e em meio hospitalar (Fonseca et al, 2004).
É um microrganismo patogénico oportunista que cresce preferencialmente em ambientes húmidos
(Andonova et al, 2013). A sua transmissão pressupõe o contato com material e soluções
contaminadas, transmissão entre indivíduos ou ingestão de água ou alimentos contaminados
2
(Fonseca et al, 2004). Esta espécie apresenta uma diversidade de genes, excelente capacidade
de adaptação e a elevada variabilidade e capacidade de aquisição de genes de resistência. Estas
são razões que tem promovido o interesse no estudo da mesma (Andonova et al, 2013).
1.2. Fatores de virulência
Pseudomonas aeruginosa apresenta mecanismos de infeção que definem a sua virulência
para com o hospedeiro. A bactéria referida apresenta uma variedade de fatores de virulência,
como a cápsula que forma uma barreira física ao sistema imunitário (Govan et al, 1996), enzimas
como a elastase que promovem danos no endotélio vascular e inibem a atividade dos neutrófilos
(Spicer, 2000), a protease IV (Driscoll et al, 2007), a protease alcalina (Andanovo et al, 2013), as
exoenzimas como a exoenzima A, que facilitam a invasão bacteriana (Driscoll et al, 2007 ) e a
fosfolipase C que provoca hemólise e danos tecidulares (Spicer, 2000 e Wu et al, 2011). Possui
ainda o sistema de excreção tipo III, responsável por alterar a resposta imunitária provocando
lesões e morte celular (Driscoll et al, 2007). Contém também lípidos A, lipopolissacarídeos e
peptidoglicano que utiliza para contornar o sistema imunitário do hospedeiro (Andonova et al,
2013) e ainda flagelo (Andanovo et al, 2013), pili (Driscoll et al, 2007) e adesinas (Govan et al,
1996), que medeiam a interação com a superfície do hospedeiro. Apresenta também os
ramnolípidos que controlam o “quorum-sensing” (Andonova et al, 2013) e o alginato que confere o
aspeto mucóide às colónias (Driscoll et al, 2007).
O biofilme bacteriano consiste no crescimento de colónias numa matriz de biopolímeros,
fixadas à superfície do hospedeiro (Driscoll et al, 2007). Esta forma de crescimento permite a
nutrição, eliminação de produtos de excreção e comunicação entre as bactérias, para além de
funcionar como barreira a ação dos antibióticos (Siddiqui et al, 2010). O processo de comunicação
é designado por “quórum-sensing” permitindo a regulação da síntese proteica, metabolismo e
virulência bacteriana por ação da transcrição coletiva de genes (Driscoll et al, 2007). De acordo
com Andanovo et al (2013), a dificuldade no controlo da infeção causada por P. aeruginosa está
associada à dificuldade de diagnóstico, elevada variabilidade genética e rapidez de aquisição de
genes que dificultam a eficácia da antibioterapia e ainda nos múltiplos fatores de virulência de que
dispõe e a capacidade de mudança destes ao longo do processo infecioso.
1.3. Epidemiologia
As infeções nosocomiais por P. aeruginosa representam 11-13,8% de todas as infeções
hospitalares, sendo que, em unidades de cuidados intensivos a percentagem aumenta para taxas
de 13,2%-22,6% (Driscoll et al, 2007).
Pseudomonas aeruginosa é responsável por vários tipos de infeções, inclusive infeções
cutâneas. Cerca de 1 a 2% da população de países desenvolvidos tem probabilidade de
3
desenvolver uma ferida crónica durante a sua vida (Siddiqui et al, 2010), sendo a taxa de
prevalência de infeções da pele e tecidos moles de 24,6 por 1000 pessoas/ano (Tognetti et al,
2012). Em hospitais este tipo de infeções apresentam uma prevalência de 8-12%, sendo inferior a
17 % na comunidade (Benati et al, 2001).
As unidades de cuidados continuados apresentam elevada taxas de infeção e de utilização de
antibióticos. Em 2012 as infeções da pele representaram quase 35% do total das infeções em
Portugal ao contrário do que se verifica no resto da Europa, onde as infeções urinárias e das vias
respiratórias predominam nestes serviços (Paiva et al, 2013).
De acordo com o European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) (ECDC, 2012),
em Portugal, P. aeruginosa apresentou valores de resistência de 19,8% de isolados resistentes à
piperacilina±tazobactame, 15,3% à ceftazidima, 25,6% às fluoroquinolonas, 14,7% aos
aminoglicosídeos, 20,4% aos carbapenemos, 61,0% de isolados susceptíveis aos antibióticos em
teste e uma multirresistência de 18,1%.
1.4. Infeções da pele e tecidos moles
As infeções cutâneas são lesões na qual ocorre invasão microbiana da pele e da camada
subjacente dos tecidos moles e que se apresentam de forma variável, com etiologias e graus de
severidade diversos (Ki et al, 2008).
Segundo a Food and Drug Administration, as infeções da pele são classificadas em não
complicadas como, os furúnculos, o impetigo, a celulite, as erisipelas, e os abcessos simples e
como complicadas as queimaduras infetadas, as infeções profundas dos tecidos, os grandes
abcessos, as úlceras e os abcessos peri-retais (Rajan, 2012).
As infeções são potenciadas por fatores de risco inerentes ao paciente como, predisposição
para a patologia, doença crítica, idade avançada e estado imunocomprometido e fatores
etiológicos como, o mecanismo de lesão ou de exposição que aumenta a probabilidade de infeção
da pele (Ki et al, 2008).
Um microrganismo torna-se patogénico para o hospedeiro quando o coloniza e desencadeia
um processo infecioso. A infeção está dependente da quantidade de micorganismos, da virulência,
da ação sinergética das espécies e da resposta inflamatória eficaz por parte do hospedeiro
(Siddiqui et al, 2010). Na presença de concentrações bacterianas superiores a 105 organismos/g
de tecido podem impedir a cicatrização e conduzir à persistência da lesão (Siddiqui et al, 2010). A
ocorrência de infeções da pele e tecidos moles pressupõe a adesão bacteriana, a invasão dos
tecidos com ausência de resposta imunitária eficiente e a produção de toxinas bacterianas. (Ki et
al, 2008).
As úlceras do decúbito (zona do trocânter e área sagrada) estão frequentemente expostas à
contaminação fecal, pela sua localização abaixo do plano transversal à linha da cintura. Estas
lesões são colonizadas por microrganismos como Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis,
4
Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., bactérias anaeróbias e microbiota residente (Siddiqui et
al, 2010). O diagnóstico deste tipo de infeções é baseado na observação da lesão, que associado
à sintomatologia do paciente como, sensibilidade, eritema, edema, ardor e febre, assim como, a
ocorrência de flictenas e hemorragia aumentam a suspeita e confirmam a presença de ferida (Ki et
al, 2008).
Posteriormente ao diagnóstico, a aplicação da terapia pode apresentar-se como monoterapia
ou terapia combinada. No tratamento das infeções da pele são utilizados antibióticos da classe
dos β-lactâmicos, quinolonas e aminoglicosídeos (Meletis et al, 2013). A terapia combinada de um
agente β-lactâmico como a piperacilina, piperacilina-tazobactame (β-lactâmico+inibidor de β-
lactamases), ceftazidima ou um carbapenemo com uma fluoroquinolona, como a ciprofloxacina
são alternativas de tratamento por combinação de antibióticos (Ki et al, 2008). No entanto, a fraca
capacidade de penetração e inibição do metabolismo das bactérias na remoção dos biofilmes
(Mota et al, 2012) torna necessário a pesquisa de outros métodos de tratamento em combinação
ou substituição com a antibioterapia. A utilização de biocidas seletivos como a prata (Andonova et
al, 2013), o mel (Camplin et al, 2014) e o iodo (Mota et al, 2012), assim como extratos de plantas
de Zataria multiflora, Macrozamia comunis e Eucalyptus camaldulensis (Andonova et al, 2013),
agentes anti-biofilme como a lactoferrina e ainda a técnica de remoção cirúrgica que permite a
diminuição da carga bacteriana e estimula a ação do sistema imunitário do hospedeiro são
tratamentos a serem explorados (Mota et al, 2012).
1.5. Isolamento e Identificação
Para o isolamento de P. aeruginosa é utilizado um meio seletivo como o de Levine (Gelose
Eosina azul de metileno), que após incubação em aerobiose, permite o crescimento de colónias
incolores ou ligeiramente rosa (Biomérieux, 2003). Estas colónias apresentam-se mucóides, com
odor adocicado e produtoras de um pigmento esverdeado (pioverdina) difundível em Müller-Hinton
(Spicer, 2000). A confirmação da sua identificação pressupõe a execução da coloração de Gram.
Para confirmação do isolado em termos bioquímicos recorre-se a testes como o teste da oxidase,
para o qual P. aeruginosa se apresenta positiva e ainda os testes de Kligler, citrato de Simmons,
indol e ureia, para o qual P. aeruginosa se apresenta negativa.
1.6. Teste de sensibilidade aos antibióticos
O teste de sensibilidade aos antibióticos é realizado pelo método de Kirby-Baüer, ou seja, por
difusão em meio sólido. Na placa com gelose de Müeller-Hinton inoculada depositam-se os discos
de antibiótico. A dimensão do halo formado em torno do disco de antibiótico é inversamente
proporcional à concentração mínima inibitória do microrganismo. O resultado é qualitativo,
classificado em sensível, intermédio ou resistente (Fonseca et al, 2004) de acordo com as
indicações da Clinical Laboratory Standards Institute.
5
1.7. Antibióticos e Mecanismos de Resistênica
Os antibióticos apresentam uma atividade bactericida quando há morte celular ou
bacteriostática quando ocorre inibição do crescimento bacteriano (Pankey et al, 2004).
Pseudomonas aeruginosa é intrinsecamente resistente a vários antibióticos como a ampicilina,
amoxicilina-ácido clavulâmico, cefazolina, cefotaxima, ceftriaxone, ertapenemo, cloranfenicol,
kanamicina, neomicina, trimetroprim, trimetropim-sulfametoxazol e às tetraciclinas. É ainda
considerada moderadamente susceptível às sulfanamidas (Leclercq et al, 2011).
O espetro de ação de um antibiótico é limitado pela ocorrência de resistências, pelo que, a
terapia combinada, apresenta vantagens como maior eficácia na inibição do crescimento de
agentes patogénicos sensíveis ao antibiótico aumentando-se a probabilidade do seu efeito (Hirsch
et al, 2010 e Torella et al 2010).
A resistência bacteriana é determinada por mecanismos de resistência. Na presença do
antibiótico, esta pode apresentar-se susceptível à sua ação ou ser resistente ao mesmo. Essa
resistência pode ser intrínseca ou adquirida (Harbottle et al, 2006). A obtenção de resistência
decorre por mutação e aquisição de genes de resistência por transferência horizontal ou vertical
(Alanis, 2005 e Ziemska et al, 2013). São três os mecanismos principais de resistência: destruição
ou alteração do antibiótico, as bombas de efluxo e modificação do alvo (Alanis, 2005 e Ziemska et
al, 2013). Por sua vez, a transmissão dessa resistência é conferida por processos de conjugação,
transformação e transdução (Alanis, 2005). A transmissão da informação genética que codifica
para os mecanimos de resistência é trocada através dos elementos genéticos móveis como os
plasmídeos, transposões e integrões. Estes tem contribuído para a ocrorrência de resistência em
vários géneros de bactérias de interesse clínico (Harbottle et al, 2006), como P. aeruginosa.
Segundo a Direção Geral de Saúde (DGS), os antibióticos a testar para P. aeruginosa em
regime de ambulatório pertencem às seguintes classes: penicilina anti-pseudomonas+inibidor das
β-lactamases, como a piperacilina-tazobactame, as cefalosporinas como a ceftazidina e cefepima,
os carbapenemos como o imipenemo, as fluoroquinolonas como a ciprofloxacina, os
aminoglicosídeos como a gentamicina ou tobramicina e polimixínas como a colistina (DGS, 2013).
1.7.1. Antibióticos β-lactâmicos
Os antibióticos β-lactâmicos apresentam seis grupos tais como as penicilinas, as
cefalosporinas, os carbapenemos, as cefamicinas, os inibidores de β-lactamases e os
monobactâmicos (Meletis et al, 2013). Os antibióticos deste grupo apresentam em comum um anel
β-lactâmico composto de um átomo de azoto com radicais livres substituintes e três átomos de
carbono (Sousa, 2005). Alguns β-lactâmicos como a piperacilina, a ceftazidima, o cefepime, o
aztreonamo e o imipenemo apresentam maior atividade contra P. aeruginosa (Meletis et al, 2013).
6
O modo de atuação dos antibióticos β-lactâmicos consiste na sua ligação a transpeptidases da
parede celular como as proteínas ligadoras de penicilinas inativando-as e desta forma afetando a
biossíntese de péptidoglicano (Morita et al, 2014).
Existem vários processos de resistência aos β-lactâmicos. No entanto, a produção de β-
lactamases é o mecanismo de resistência principal (Tang et al, 2014), por quebra do anel anel β-
lactâmico que promove a inativação do antibiótico (Sousa et al, 2005) O imipenemo apresenta-se
relativamente resistente à ação hidrolítica da maioria das β-lactamases (Papp-wallace et al, 2011),
sendo a resistência a esta classe promovida por ação de carbapenemases (β-lactamases que
hidrolisam os carbapenemos) (Meletis et al, 2013), assim como através de mecanismos como
diminuição da permeabilidade de membrana externa e aumento da expressão de bombas de
efluxo (Meletis et al, 2013).
1.7.2. Aminoglicosídeos
Os aminoglicosídeos têm na sua estrutura um anel aminociclitol, unido por ligações
glicosídicas (Sousa, 2005). A ligação deste às subunidades ribossomais 30S e 50S promove a
inibição da síntese proteica (Meletis et al, 2013 e Morita et al, 2014). Estão frequentemente
relacionados com a toxicidade e por isso são usualmente prescritos em conjunto com outras
classes de antibióticos (Meletis et al, 2013), como os β-lactâmicos para tratamento de infeções por
P. aeruginosa. A resistência associada aos aminoglicosídeos surge pela ação de enzimas
modificadoras de aminoglicosídeos transferíveis, depressão do sistema de efluxo endógeno e
metilases de RNA (Meletis et al, 2013).
1.7.3. Fluoroquinolonas
As fluoroquinolonas apresentam na sua estrutura base um ácido carboxílico conservado e
ligações C=O (Sousa, 2005). Atuam por interação com o DNA e enzimas DNA girase e/ou
topoisomerase IV (Morita et al, 2014). O mecanismo de resistência é essencialmente por
mutações nas enzimas DNA girase e topoisomerase IV (Poole, 2011).
1.7.4. Tetraciclinas
As tetraciclinas são compostas por 4 anéis benzénicos fundidos que formam um anel
hidroxinaftaceno (Sousa, 2005). No mecanismo de ação, a ligação do aminoacil-t-RNA ao local A
do complexo ribossómico do RNA é impedido pela ligação da tetraciclina à subunidade 30S do
ribossoma bacteriano afetando o processo de síntese proteíca (Pereira-Maia et al, 2010).
Pseudomonas aeruginosa apresenta-se intrinsecamente resistente à tetraciclina através do
sistema de efluxo Mex AB/Mex XY (Morita et al, 2014).
7
1.8. Multirresistência em Pseudomonas aeruginosa
As taxas de P. aeruginosa resistente aos antibióticos tem vindo a aumentar em todo mundo.
Os mecanismos de resistência como sistemas de efluxo, perda das porinas da membrana externa,
produção de enzimas e mutações alvo constituem os perfis de multirresistência para esta bactéria
(Hirsch et al, 2010).
A bactéria do presente estudo é multirresistente quando apresenta resistência a pelo menos
três antibióticos de classes diferentes como os aminoglicosídeos, penicilinas/cefalosporinas,
carbapenemos e fluoroquinolonas (Hirsch et al, 2010 e Biswall et al 2014). Segundo a ECDC
(2012), em Portugal, os isolados de P. aeruginosa apresentaram uma percentagem de resistência
combinada ou multirresistência de 18,1%.
8
2. Enquadramento
De forma a garantir elevados níveis de saúde pública é necessária uma utilização racional de
antibióticos de modo a que o leque de antibióticos disponíveis se mantenha. Para isso é
necessário ter como base a prevenção e a formação dos profissionais de saúde e população em
geral (DGS, 2009).
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório Médico de Análises Clínicas (AVELAB),
no âmbito do Mestrado em Microbiologia. Os dados recolhidos correspondem ao período de
Janeiro de 2011 a Dezembro de 2013, com amostras de exsudados purulentos, que representam
as infeções na pele e tecidos moles provenientes de ambulatório.
A prevenção e controlo de resistências abordadas neste estudo assentam no conhecimento
da prevalência do agente etiológico responsável por infeções na pele e tecidos moles e no perfil
de resistência e multirresistência ao leque de antibióticos testados em ambulatório.
3. Objetivos
Pseudomonas aeruginosa é uma das cinco principais espécies responsáveis por infeções
associadas aos cuidados de saúde. As elevadas percentagens de resistência reportadas pela
ECDC (2012) mostram a necessidade de acompanhar o percurso de prevalência e perfil de
resistência aos antibióticos utilizados para o tratamento de infeções causadas pela mesma. Esta
vigilância epidemiológica deve considerar não só o ambiente hospitalar, mas também, o de
ambulatório, uma vez que cerca de 70%-75% dos casos de infeções da pele e tecidos moles são
geridos em ambulatório (Ki et al, 2008).
Os objetivos deste trabalho foram:
Determinar a prevalência bacteriana em ambulatório e em postos com serviço de
ambulatório e cuidados continuados, em indivíduos com infeções da pele e tecidos moles
a partir de amostras de exsudados purulentos.
Caracterizar a distribuição da prevalência de P. aeruginosa em regime de ambulatório,
segundo fatores como a idade, género e localização da infeção.
Determinar o perfil de resistência e multirresistência de P. aeruginosa aos antibióticos
testados em ambulatório.
9
4. Métodos
4.1. Caracterização da amostragem
O presente trabalho foi realizado no AVELAB com 393 amostras de exsudados purulentos
provenientes de postos distribuídos pelo distrito de Aveiro. Neste estudo retrospetivo, os dados
foram recolhidos do programa e-DeiaLab e tratados estatisticamente pelo software Microsoft Exel
2010. A análise dos resultados epidemiológicos é referente aos 3 anos (Janeiro de 2011 a
Dezembro de 2013). O presente estudo partiu de 652 isolados bacterianos causadores de
infeções da pele e tecidos moles. Destes 134 foram isolados de P. aeruginosa para o qual foi
determinado o antibiograma e analisado o perfil de resistência e multirresistência.
Foi também avaliada a prevalência bacteriana em 195 amostras de exsudados purulentos,
provenientes de postos que, para além de apresentarem cuidados de ambulatório, prestam
também cuidados continuados, como a Unidade de Cuidados Continuados de Ilhavo, Lar da
Misericórdia de Oliveirinha e a Clínica de Barrô, pertencentes ao distrito de Aveiro.
4.2. Identificação dos isolados bacterianos
O isolamento de P. aeruginosa foi efetuado em sementeira por esgotamento em meio Levine.
Meio seletivo que após inoculado, foi incubado a 37˚C durante 24 horas por forma a permitir o
crescimento das colónias de P. aeruginosa que se apresentam incolores ou ligeiramente rosa
(Biomerieux, 2013) (Figura 1).
Figura 1: Isolado de P. aeruginosa em meio Levine.
Posteriormente ao isolamento em meio Levine realizou-se a confirmação da identificação do
isolado, pela técnica de coloração de Gram. Nesta técnica após espalhar a amostra na lâmina e
fixar pelo calor, realiza-se a coloração da lâmina com corantes básicos (fucsina básica e cloridrato
de cristal violeta/safranina) a fim de distinguir as bactérias através da cor apresentada pelas suas
paredes celulares. Posteriormente procede-se à observação ao microscópio ótico com a objetiva
10
x1000 para distinção das bactérias que coram de Gram-negativo como P. aeruginosa que coram
de rosa, das de Gram-positivo que coram de violeta (Sousa et al, 2012 e Biomerieux, 2003).
4.3. Testes bioquímicos
Após isoladas as colónias de bacilos de P. aeruginosa em meio Levine e da execução da
coloração de Gram procedeu-se à confirmação da espécie bactériana pelos métodos de
confirmação bioquímicos (Figura 2) de modo a evidenciar as suas características. A incubação foi
efetuada na estufa a 37ºC durante 24h numa atmosfera aeróbia, com exceção do teste da oxidase
que é direto.
No teste da oxidase é utilizado um corante que substitui o oxigénio como aceitador de
hidrogénio levando ao aparecimento da cor roxa após 10 a 30 segundos do contato da colónia
com o disco (Figura 2a). O teste utilizado foi o BD BBL TM DrySlide TM, para o qual se apresenta
positiva (Fonseca et al, 2004). O inóculo dos meios de Kligler-D (Figura 2b), citrato de Simmons
(Figura 2b) ureia (Figura 2b) e ainda o teste do indol (Figura 2c) (Zimbro, 2003) resultam numa
reação negativa e que por conseguinte auxiliam na sua identificação.
Figura 2: Métodos bioquímicos de identificação de P. aeruginosa. (a) Testes da oxidase, com
produção de pigmento de cor roxa após contato da colónia com o disco. P. aeruginosa apresenta-
se oxidase positiva (b) Teste de Kligler, P. aeruginosa não fermenta os açúcares e não provoca
acidificação do meio, por isso não ocorre a viragem do vermelho de fenol para a cor amarela. Este
teste é negativo para a espécie (C) No teste de citrato de Simmons, não ocorre a transição da cor
do meio de verde escuro para azul escuro, uma vez que este teste é negativo para a bacteria em
estudo (D) No teste da ureia como P. aeruginosa não possui a enzima urease, não consegue
desdobrar a ureia, não ocorrendo viragem do amarelo para vermelho de fenol. Este teste é
negativo para P. aeruginosa (E) Teste do indol na presença de P. aeruginosa. A adição do regente
de Kovacs não promove a formação de um anel de cor vermelha na superfície do meio indol como
é de esperar no teste positivo. Este teste é negativo para P. aeruginosa.
11
4.4. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos
A avaliação da sensibilidade aos antibióticos estipulados pela Norma 004/2013 da DGS para
P. aeruginosa foi executada pelo método de difusão por discos em meio sólido ou método de
Kirby-Baüer. A densidade do inóculo deve ter uma turvação de 0,5 unidades na escala de
McFarland semeado em Müller-Hinton destinado à execução de antibiogramas (Figura 3). Após
incubação a 37ºC por 18h, mediu-se os halos de inibição e registou-se o resultado qualitativo (R-
resistente, S-sensível e I-intermédio) (Sousa et al, 2012).
Figura 3: Antibiograma para P. aeruginosa realizado pelo método de Kirby-Baüer em agar Müller-
Hinton. Visível a produção de pioverdina, pigmento hidrossolúvel e difundível no meio.
12
5. Resultados e Discussão
5.1. Dados epidemiológicos
No período de Janeiro de 2011 a Dezembro de 2013 foram analisadas 393 amostras de
exsudados purulentos com exame bacteriológico positivo, obtendo-se 652 isolados bacterianos,
responsáveis por infeções da pele e tecidos moles. Tendo em conta os resultados obtidos
verificou-se que os microrganismos mais frequentemente responsáveis por este tipo de infeções
em ambulatório foram os Staphylococcus aureus (29,9%), a Pseudomonas aeruginosa (21,2%) e o
Proteus spp. (11,7%) (Figura 4).
Figura 4: Prevalência de microrganismos isolados de exsudados purulentos positivos, para
infeções da pele e tecidos moles no período de Janeiro de 2011 a Dezembro de 2013 em
ambulatório.
Para o estudo da prevalência dos microrganimos em postos com serviço de ambulatório
com cuidados continuados, foram considerados 195 isolados bacterianos obtidos de amostras de
exsudados purulentos. Os microrganismos mais frequentemente responsáveis por causar infeções
foram os Staphylococcus aureus (21,3%), seguido do Proteus spp. (18,8%) e Pseudomonas
aeruginosa (17,3%) (Figura 5).
13
Figura 5: Prevalência de microrganismos isolados de exsudados purulentos positivos para
infeções da pele e tecidos moles no período de Janeiro de 2011 a Dezembro de 2013 em postos
com serviços de ambulatório e cuidados continuados.
Segundo Rajan et al (2012), as infeções da pele e dos tecidos moles são comuns em
indivíduos internados e de ambulatório. No estudo da SENTRY Antimicrobial Surveillance Program
(1998-2004), citado em Moet et al, (2007) refere o Staphylococcus aureus (37,5%), como o
principal agente responsável por este tipo de infeção e P. aeruginosa (12,0%) a segunda bactéria
responsável por tais infeções na Europa. Os resultados recolhidos dos três anos, em ambulatório,
no distrito de Aveiro, confirmam as mesmas bactérias como as principais responsáveis por este
tipo de afeção. Contudo o estudo de Biswall et al (2014) indica P. aeruginosa como a bactéria com
maior relevância nas infeções cutâneas por queimaduras.
A patologia acima mencionada surge na população idosa, na comunidade e em lares (Mody,
2003). Em Portugal é a infeção mais comum em unidades de cuidados continuados, constituindo
aproximadamente 35% do total de infeções, contrariamente ao que acontece noutros países
europeus (Paiva et al, 2013). Os microrganismos que surgiram no presente estudo como
predominantemente responsáveis por este tipo de afeção em postos de ambulatório com cuidados
continuados foram S. aureus (21,3%), Proteus spp (18,8%), P. aeruginosa (17,3%) e E. coli
(12,2%) como sugere Smith et al (2000), com uma ligeira diferença na prevalência de P.
aeruginosa, que no presente estudo é a terceira bactéria mais frequentemente responsável pela
infeção em causa e no estudo referido encontra-se em quarto lugar.
As infeções da pele localizam-se frequentemente abaixo do plano transversal à linha da
cintura (Ki et al, 2008). As úlceras de pressão ou do decúbito (zona do trocânter e área sagrada)
estão sujeitas a contaminação fecal (Siddiqui et al, 2010). Em indivíduos, em lares, é frequente a
imobilidade, fricção por pressão, humidade corporal, incontinência urinária e fecal (Ricci et al,
2012) que podem contribuir para contaminação do ambiente por microrganismos que
posteriormente podem infetar essas lesões na pele. Os Enterococcus são indicadores de
14
contaminação fecal (Bohem et al, 2014), o que justificará a inversão de prevalência que indica o
Proteus spp como o segundo agente responsável por infeções da pele em postos com cuidados
de ambulatório e continuados.
5.2. Isolados bacterianos
A média de idades dos indivíduos com infeção da pele e tecidos moles, independentemente
do agente etiológico causador de infeção é de 67 anos. Dos 134 isolados bacterianos de
indivíduos com exame bacteriológico positivo, onde o agente etiológico é P. aeruginosa, a idade
média dos indivíduos do género masculino e feminino é de 66 e 76 anos de idade, respetivamente
(Figura 6a). Avaliou-se, também qual dos géneros apresentava maior predisposição para
desenvolver este tipo de infeções causadas por P. aeruginosa. A percentagem de indivíduos do
género masculino foi de 49% e do género feminino foi de 51% (Figura 6b).
Figura 6: (a) Média de idades dos indivíduos do género masculino e feminino e (b) Percentagem
de indivíduos do género masculino e feminino com exame bacteriológico positivo para infeções da
pele e tecidos moles, onde o agente etiológico é P. aeruginosa.
Avaliou-se também a distribuição anatómica das lesões acima e abaixo do plano
transversal à linha da cintura. A maioria das lesões localizam-se abaixo da linha da cintura (78%),
com apenas 8% localizadas acima da mesma (Figura 7).
15
Figura 7: Percentagem de distribuição anatómica das lesões em individuos com infeções da pele e
tecidos moles causadas por P. aeruginosa em ambulatório no período de 2011 a 2013.
As infeções da pele e tecidos moles apresentam uma prevalência superior em indivíduos com
uma média de idade de 67 anos, fato corroborado por Siddiqui et al (2008), que afirma que este
tipo de infeções é frequente em indivíduos com mais de 60 anos. Quanto à prevalência por
género, este tipo de infeções, segundo a literatura, prevalece no género masculino com 60 a 70%
dos casos (Ki et al, 2008), como demonstra também o estudo Šiširak et al (2013). No entanto, os
resultados obtidos contradizem a literatura. Neste estudo, os valores de prevalência (51% feminino
e 49% masculino), mostram uma predominância deste tipo de lesões no sexo feminino. Todavia,
estes não se encontram muito dispares, para além de que uma possível justificação para este
predomínio se prenda com o fato de que segundo o INE (2012) as mulheres apresentam uma
esperança média de vida superior à dos homens.
Segundo Ki et al (2008), a maioria das lesões ocorrem nos membros inferiores, fato
evidenciado no presente estudo que indica uma prevalência de 78% das lesões localizadas abaixo
do plano transversal à linha da cintura.
Em conclusão, os dados obtidos no presente estudo indicam um predomínio de infeções da
pele e tecidos moles causadas por P. aeruginosa, na população idosa com uma média de idade
de 71 anos, do género feminino e com as lesões predominantemente localizadas abaixo do plano
transversal à linha da cintura. Acresce ainda que Staphylococcus aureus é o principal agente e a
P. aeruginosa o segundo agente etiológico mais frequentemente causador deste tipo de afecção
em ambulatório
5.3. Perfil de resistências aos antibióticos
A importância em conhecer o agente etilógico responsável por uma infeção, assim como, o
seu perfil de resistência numa determinada área geográfica é crucial para uma intervenção
16
precoce e para o uso racional e direcionado dos antibióticos. Deste modo, o presente estudo
pretende elucidar sobre o perfil de resistência de P. aeruginosa em ambulatório face a um espetro
de antibióticos, de modo, a orientar a prescrição médica com vista a diminuir os índices de
resistência.
No ano de 2011 e 2012 foram testados antibióticos como a piperacilina±tazobactame, a
ceftazidima, a cefepima, o aztreonamo, o imipenemo, a tobramicina, a tetraciclina e a
ciprofloxacina. Em 2013 foram testados todos os antibióticos enunciados, à exceção da tetraciclina
e a tobramicina que foi substituida pela gentamicina, ambos aminoglicosídeos (Figura 8).
Figura 8: Perfil de resistência de P. aeruginosa ao longo dos 3 anos em ambulatório. (*)
Antibióticos não testados.
A tetraciclina testada em 2011 e 2012 nos isolados de P. aeruginosa apresentou os valores de
resistência mais elevados de todos os antibióticos em teste, com um valor médio de 88,6% de
resistência. Este valor elevado deve-se provavelmente ao fato de que esta bactéria é
intrinsecamente resistente à tetraciclina como refere Leclercq et al (2011), por mecanismos de
resistência como bombas de efluxo MexAB/MexXY (Morita et al, 2014).
Segundo a Autoridade Nacional do Medicamento e dos Produtos de Saúde (INFARMED),
cerca de 20% das estirpes isoladas de P. aeruginosa são resistentes às quinolonas, resistência
essa que advém da dispersão da sua utilização. No entanto, estas são prescritas para o
tratamento de alguns casos clínicos, sendo essencialmente ministradas em situações de ausência
de eficácia dos antibióticos de primeira linha ou em situações de rejeição a estes (INFARMED,
2013).
A ciprofloxacina é o antibiótico pertencente à classe das quinolonas, que apresenta maior
atividade contra P. aeruginosa (INFARMED, 2013). Neste estudo a ciprofloxacina foi testada nos
três anos, apresentando em média 33,5% dos isolados resistentes. Na literatura os dados
reportados são provenientes de hospitais. A ECDC (2012) mostra valores de resistência de 25,6%
e define um intervalo de resistência de 25-50%, corroborando o valor obtido neste estudo que se
17
encontra dentro do intervalo defenido e próximo dos valores mencionados por esta e também por
Šiširak et al (2013) e Coetzee et al (2013).
A classe das quinolonas apresenta elevada prescrição em ambulatório, sendo Portugal o
segundo país da Europa com maior percentagem de utilização da mesma (Paiva et al, 2013). A
sua crescente prescrição está associada à sua eficácia refletindo surgimento de resistência,
justificando o fato deste antibiótico se apresentar como o antibiótico com maior percentagem de
resistência no presente estudo.
Os antibióticos β-lactâmicos utilizados no tratamento de infeções por P. aeruginosa são a
piperacilina, a ceftazidima, a cefepima, assim como, o aztreonamo e o imipenemo (Morita et al,
2014). Na Europa as penicilinas são os antibióticos mais prescritos com uma taxa de consumo de
53,35%. No entanto, houve uma redução da prescrição entre 2000 e 2009 das subclasses de
penicilinas em ambulatório. Todavia as sub-classes de penicilinas com inibidores de β-lactamases
mostraram um aumento de consumo no mesmo período (Ramalhinho et al, 2012). Um exemplo de
um antibiótico dessa sub-classe é a piperacilina±tazobactame que, no presente estudo apresentou
um valor médio de resistência dos três anos de 17,1% dos isolados. Este valor é corroborado pela
ECDC (2012) que indica valores de resistência de 15,3% e define um intervalo de resistência de
10-25%. O valor de resistência obtido no presente estudo encontra-se, todavia, díspar dos valor
apresentado por Šiširak et al (2013) e Coetzee et al (2013), Villa et al (2013) e Biswall et al (2014).
A razão na disparidade dos valores prender-se-á com o fato destes serem provenientes de dados
hospitalares, onde as resistências devem ser superiores. Sendo um dos antibióticos de maior
atividade no tratamento de infeções por P. aeruginosa, a piperacilina±tazobactame apresenta-se
como o segundo antibiótico com maior percentagem de resistência devido à sua eficácia e elevada
e taxa de prescrição.
A classe dos carbapenemos apresenta uma taxa de resistência crescente em hospitais (Paiva
et al, 2013). O imipenemo apresenta-se como o antibiótico pertencente à classe dos
carbapenemos com maior efeito no tratamento de infeções por P. aeruginosa (Meletis et al, 2013).
No presente estudo apresentou valores de resistência de 12,2%. Este valor apresenta-se
relativamente incluído no intervalo estipulado pela ECDC de 10-25% de resistência, assim como,
dos valores determinados nos estudos de Šiširak et al (2013) e Biswall et al (2014). No entanto,
outros estudos semelhantes como Coetzee et al (2013) Villa et al (2013) referiram valores de
resistência mais dispares em relação ao valor obtido.
Os aminoglicosídeos (tobramicina e gentamicina) apresentam elevada toxicidade e estreita
faixa terapêutica. São utilizados frequentemente em terapia combinada com outros antibióticos
(Meletis et al, 2013). No presente estudo foi utilizada a tobramicina nos dois primeiros anos e em
2013 passou a testar-se a gentamicina (25%), que apresentou no ano de 2013 maior percentagem
de resistência que a tobramicina (5,8%) testada anteriormente (2011 e 2012). Esta classe
apresentou valores médios de resistência de 12,2%, incluído no intervalo de 10%-25% de
resistência e próximo do valor de resistência de 14,7% determinados pela ECDC (2012). Por sua
vez o estudo de Coetzee et al (2013) demonstrou valores médios de resistência próximos de 50%,
18
muito superiores ao valor do presente estudo e que se justifica pelo fato de serem provenientes de
ambiente hospitalar.
Os monobactâmicos como o aztreonamo atuam sobre um espetro de ação limitado para
bactérias gram-negativo, sendo a sensibilidade de P. aeruginosa a este variável. Este apresenta-
se mais ativo do que as penicilinas de largo espetro e menos ativo do que a ceftazidima e
imipenemo (INFARMED, 2013). Os valores de resistência obtidos no presente trabalho
correspondem a 7,9%, inferiores ao referido por Villa et al (2013).
Segundo Ramalhinho et al (2012) as cefalosporinas apresentaram uma diminuição do
consumo entre 2000 e 2009, mais significativa nas cefalosporinas de terceira geração. No
presente estudo apresentaram valores de resistência de 3,5% e 1,7%, respetivamente e uma
média de resistência da classe de 2,6%. Os valores reportados em ECDC (2012), Šiširak et al
(2013), Coetzee et al (2013), Villa et al (2013) e Biswall et al (2014), apresentam-se superiores. No
entanto, é de salientar que a população em estudo no presente trabalho é proveniente de
ambulatório, onde o nível de resistência deve ser mais baixo.
A prescrição em ambulatório de cefalosporinas de terceira geração deve ser limitada
(Ramalhinho et al, 2012) e a sua utilização destinada essencialmente no tratamento de infeções
hospitalares graves (INFARMED, 2013). Por esta razão, poderão apresentar baixa prescrição e
daí as percentagens de resistência não se demonstrarem muito elevadas como evidenciado no
presente estudo. Contudo, a ceftazidima que se apresenta como a cefalosporina de terceira
geração com maior eficácia no tratamento de infeções para P. aeruginosa (INFARMED, 2013)
demonstrou percentagens de resistência superiores à cefepima. Por ser mais adequada, será
prescrita com maior frequência e consequentemente apresentará maiores percentagens de
resistência comparativamente à cefepima, como indica o presente estudo.
Em conclusão, nos três anos em estudo verificou-se maior percentagem de resistências no
ano de 2013. Os antibióticos com maior atividade e mais prescritos no tratamento de P.
aeruginosa foram os que apresentaram maiores percentagens de resistência como a
ciprofloxacina, piperacilina±tazobactame, impenemo e gentamicina. Verificou-se assim, a
associação entre a eficácia, prescrição e elevado consumo de uma classe de antibióticos e o
maior desenvolvimento de resistências à mesma. Não é adequada a utilização da tetraciclina, uma
vez que P. aeruginosa é intrinsecamente resistente. A gentamicina apresenta-se cerca de cinco
vezes menos ativa do que a tobramicina para tratamento de infeções por P. aeruginosa (Sousa,
2005), pelo que, seria eventualmente de preterir a prescrição da gentamicina em relação à
tobramicina não só pela eficácia mas também para a diminuição dos valores de resistência à
gentamicina. Os monobactâmnicos e as cefalosporinas foram as classes que apresentaram
valores de resistência mais baixos, inferiores a 10%. Os monobactâmicos por apresentarem uma
ação variável e as cefalosporinas, por estarem essencialmente reservadas ao ambiente hospitalar
e pelo seu foco de tratamento, justificam as baixas percentagens de resistência.
19
5.4. Multirresistência
No presente estudo pretendeu-se avaliar também os níveis de multirresistência em
ambulatório (Figura 9). Apesar da amostragem reduzida, dos 134 isolados de P. aeruginosa
apenas 18 apresentaram perfis de multirresistência, considerou-se importante salientar esses
resultados, para que em trabalhos futuros se aprofunde esta questão.
Figura 9: Percentagem de isolados de P. aeruginosa multirresistentes responsáveis por infeções
da pele e dos tecidos moles em ambulatório entre 2010 e 2013.
Segundo Hirsch et al (2010) e Biswal et al (2014) a bactéria em estudo apresenta
multirresistência quando é resistente a pelo menos três das diferentes classes de antibióticos anti-
pseudomonas, como as penicilinas ou cefalosporinas, os carbapenemos, as fluoroquinolonas e os
aminoglicosídeos. Neste estudo a bactéria foi considerada multirresistente quando apresentou um
perfil de resistência a três dos seguintes antibióticos: piperacilina±tazobactame ou ceftazidima ou
cefepima, imipenemo, ciprofloxacina e gentamicina ou tobramicina (Tabela 1).
A percentagem de isolados multirresistentes correspondeu a 13%. A ECDC (2012) reporta
valores de multirresistência ligeiramente superiores. No entanto, é de salientar que os dados são
recolhidos do estudo da ECDC, onde as amostras são provenientes de hospitais e laboratórios e
não de ambulatório como é o caso do presente estudo e que por conseguinte deve apresentar
valores de resistência inferiores.
Os mecanismos de resistência mais frequentes correspondem aos antibióticos que mostraram
maior percentagem de resistência neste estudo. Todos os fenótipos de P. aeruginosa que
apresentaram perfis de multirresistência apresentaram-se resistentes às fluoroquinolonas como a
ciprofloxacina para a qual existem mecanismos como a mutação de alvos antibacterianos como as
topoisomerases ou regulação mutacional do sistema de efluxo que confere resistência às
fluoroquinolonas, e também aos β-lactâmicos e aminoglicosídeos (ECDC, 2012).
20
A bactéria apresentou resistência a outras classes como as penicilinas combinadas com
inibidores de β-lactamases (piperacilina±tazobactame), carbapenemos (imipenemo)
aminoglicosídeos (gentamicina) e cefalosporinas (ceftazidima). Para o imipenemo, os mecanismos
consistem no impedimento da entrada do antibiótico na célula bacteriana por mutação de
proteínas da membrana externa ou por aquisição de plamideos que transportam genes que
codificam para enzimas aminoglicosídicas modificadoras do local alvo e β–lactamases e finalmente
para a gentamicina, cujo o mecanismo passa pela mutação de proteínas ribossomais (ECDC,
2012).
Tabela 1: Perfil de resistência dos 18 isolados de P. aeruginosa responsáveis por infeções da pele
e tecidos moles em ambulatório no período de 2011 e 2013.
Espécie Pip±tazo Cefta Cefe Azt Imip Tobra Genta Tetra Cipro
1 R R S S S S - R R
2 R R S S S S - R R
3 R R S R R S - - R
4 S S S S R R - R R
5 R S S S S - R - R
6 R S S S S - R - R
7 S S S S R - R - R
8 R S S S S - R - R
9 R R R R R - R - R
10 - R S S R - R - R
11 - R S S S - R - R
12 - R S S R - R - R
13 R R S S R - R - R
14 S S S S R - R - R
15 R R S S R - R - R
16 R S S R R - S - R
17 R R R R R - S - R
18 R S S R R - R - R Pip±tazo: Piperacilina±tazobactame; Cefta:Ceftazidima; Cefe: Cefepima; Azt: Aztreonamo; Imip: Imipenemo; Tobra: Tobramicina; Genta: Gentamicina; Tetra: Tetraciclina; Cipro: Ciprofloxacina; (-): Antibióticos não testados no antibiograma.
21
6. Conclusão
A utilização inadequada de antibióticos tem contribuído para um aumento das taxas de
resistência bacteriana. Este fato por sua vez tem levado à redução do leque de antibióticos
disponíveis para tratar infeções por organismos resistentes ou multirresistentes. A criação de
protocolos que visem orientar o uso adequado dos antibióticos é de extrema importância a fim de
preservar os antibióticos atualmente disponíveis.
O conhecimento do agente etiológico da infeção, assim como, do seu perfil de resistência
auxilia na terapêutica empírica mais adequada, acente no conhecimento da dispersão destes
agentes. O presente trabalho permitiu avaliar a frequência de Pseudomonas aeruginosa em
infeções da pele e tecidos moles, na região de Aveiro durante o período de 3 anos e conhecer o
perfil de resistência e multirresistência de P. aeruginosa relativo ao padrão de antibióticos testados
em ambulatório.
Após a realização deste estudo, concluiu-se que:
Os principais agentes responsáveis por infeções da pele e tecidos moles em
ambulatório são o Staphylococcus aureus e a Pseudomonas aeruginosa e Proteus
spp.
A patologia frequente em indivíduos do género feminino, com uma média de idade de
77 anos com lesões localizadas abaixo da linha da cintura.
Verificou-se maior percentagem de resistências no ano de 2013.
Os antibióticos que apresentaram maiores taxas de resistência foram a tetraciclina,
ciprofloxacina, piperacilina±tazobactame, gentamicina e o imipenemo.
Evidenciou-se que os antibióticos mais adequados e por conseguinte mais prescritos
para o tratamento deste tipo de infeções apresentam maiores percentagens de
resistência como a ciprofloxacina, piperacilna±tazobactame, e imipenemo.
Seria eventualmente de peterir a prescrição da gentamicina à tobramicina, uma vez
que esta é cerca de cinco vezes menos ativa que a tobramicina e também para
diminuir os valores de resistência.
Os monobactâmicos e as cefalosporinas foram as classes que apresentaram menor
percentagem de resistência.
Os mecanismos de resistência mais frequentes correspondem aos antibióticos que
apresentaram maior percentagem de resistência neste estudo. A taxa de
multirresistência em ambulatório para P. aeruginosa é de 13%.
22
7. Perspetivas futuras
Para a diminuição a nível nacional das resistências aos antibióticos deve-se efetuar esforços
na implementação de medidas de adequação da prescrição, utilização de antibióticos, conhecer
de forma continuada os padrões de consumo dos antibióticos, o perfil de resistências bateriana e
continuar a informar os profissionais de súde e o público em geral. De um modo preventivo, o
acesso aos meios complementares de diagnóstico e a redução da utilização generalizada e
precoce de antibioterapia de largo espetro irá favorecer o crescimento e seleção de
microrganismos com perfis de sensibilidade, com consequente diminuição das taxas de
resistência.
No plano da investigação, a utilização dos antibióticos de forma combinada, assim como a
exploração de novos compostos, como a prata, iodo, mel, agentes anti-biofilme, novos antibióticos
e outras fontes bactericidas como óleos essenciais, podem representar um potencial alternativo ao
tratamento de infeções bacterianas. O recurso a péptidos antimicrobianos, anticorpos monoclonais
ou mesmo a terapia fágica utilizada para profilaxia no tratamento de infeções bacterianas, são
outras alternativas a serem exploradas e que surgem como possíveis complementos ou alternativa
no campo do combate a infeções da pele causadas por P. aeruginosa.
23
8. Bibliografia
Alanis, A. J. (2005). "Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?" Arch Med
Res 36(6): 697-705.
Andonova, M. and V. Urumova (2013). "Immune surveillance mechanisms of the skin
against the stealth infection strategy of Pseudomonas aeruginosa-review." Comp Immunol
Microbiol Infect Dis 36(5): 433-448.
Benati, G., S. Delvecchio, D. Cilla and V. Pedone (2001). "Impact on pressure ulcer
healing of an arginine-enriched nutritional solution in patients with severe cognitive
impairment." Arch Gerontol Geriatr Suppl 7: 43-47.
BIOMÉRIEUX. Manual de meios de cultura e suplementos. 2003.
Biswal, I., B. S. Arora, D. Kasana and Neetushree (2014). "Incidence of multidrug resistant
Pseudomonas aeruginosa isolated from burn patients and environment of teaching
institution." J Clin Diagn Res 8(5): 15.
Boehm, A. B. and L. M. Sassoubre. Enterococci: From Commensals to Leading Causes of
Drug Resistant Infection. Boston: Gilmore MS, Clewell DB, Ike Y, et al., editors; 2014
[Consulta a 20/09/2014]. Disponível na internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK190421/.
Camplin, A. L. and S. E. Maddocks (2014). "Manuka honey treatment of biofilms of
Pseudomonas aeruginosa results in the emergence of isolates with increased honey
resistance." Ann Clin Microbiol Antimicrob 13(19): 1476-0711.
Coetzee, E., H. Rode and D. Kahn. (2013). "Pseudomonas aeruginosa burn wound
infection in a dedicated paediatric burns unit." S Afr J Surg 51(2): 50-53.
DGS. Programa Nacional de Prevenção das Resistências aos Antimicrobianos. Portugal:
Ministério da saúde (Departamento da Qualidade da Saúde); 2009 [Consulta a
12/05/2014]. Disponível na internet:
https://www.google.pt/search?q=Programa+Nacional+de+Preven%C3%A7%C3%A3o+das
+Resist%C3%AAncias+aos+Antimicrobianos&rlz=1C1AVSA_enPT421PT423&oq=Progra
ma+Nacional+de+Preven%C3%A7%C3%A3o+das+Resist%C3%AAncias+aos+Antimicrob
ianos&aqs=chrome..69i57.546j0j9&sourceid=chrome&es_sm=122&ie=UTF-8.
DGS. Vigilância epidemiológica das resistências aos antimicrobianos. Portugal. Governo
da Direção Geral de Saúde; 2013 [Consulta a 30/09/2013]. Disponível na internet:
http://www.dgs.pt/upload/membro.id/ficheiros/i018609.pdf.
Driscoll, J. A., S. L. Brody and M. H. Kollef (2007). "The epidemiology, pathogenesis and
treatment of Pseudomonas aeruginosa infections." Drugs 67(3): 351-368.
ECDC. Antimicrobial resistance survaillance in Europe. Annual report of the European
Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net). Estocolmo: EUCAST; 2012
[Consulta em 18/02/2014]. Disponível na Internet:
24
http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/antimicrobial-resistance-surveillance-
europe-2012.pdf.
Fonseca, A. B., C. Sebastião, F. J. Martins, M. G. Ribeiro, I. Calheiros, et al. Orientações
para a elaboração de um Manual de boas práticas em microbiologia. Portugal: PNCI &
ONSA; 2004 [Consulta em 10/11/13]. Disponível na Internet:
http://www.dgs.pt/upload/membro.id/ficheiros/i008546.pdf.
Govan, J. R. and V. Deretic (1996). "Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid
Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia." Microbiol Rev 60(3): 539-574.
Harbottle, H., S. Thakur, S. Zhao and D. G. White (2006). "Genetics of antimicrobial
resistance." Anim Biotechnol 17(2): 111-124.
Hirsch, E. B. and V. H. Tam (2010). "Impact of multidrug-resistant Pseudomonas
aeruginosa infection on patient outcomes." Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res
10(4): 441-451.
INFARMED. Prontuário terapêutico. Portugal: Governo de Portugal-Ministério da Saúde;
2013. [Consulta em 3/03/2013]. Disponível na internet:
http://www.infarmed.pt/portal/pls/portal/!PORTAL.wwpob_page.show?_docname=8944263
.PDF.
Instituto Nacional de Estatística (INE). Estatísticas demográficas 2012. Portugal: INE; 2013
[Consulta a 2/04/2014]. Disponível na internet:
http://www.ine.pt/xportal/xmain?xpid=INE&xpgid=ine_publicacoes&PUBLICACOESpub_bo
ui=151772777&PUBLICACOESmodo=2.
Ki, V. and C. Rotstein (2008). "Bacterial skin and soft tissue infections in adults: A review of
their epidemiology, pathogenesis, diagnosis, treatment and site of care." Can J Infect Dis
Med Microbiol 19(2): 173-184.
Leclercq, R., R. Canton, D. F. Brown, C. G. Giske, P. Heisig and A. P. MacGowan (2011).
"EUCAST expert rules in antimicrobial susceptibility testing." Clin Microbiol Infect 19(2):
141-160.
Meletis, G. and M. Bagkeri. Pseudomonas aeruginosa: Multi-Drug-Resistance
Development and Treatment Options. Grécia: INTECH; 2013 [Consulta em 21/02/2014].
Disponível na internet: http://www.intechopen.com/books/infection-control/pseudomonas-
aeruginosa-multi-drug-resistance-development-and-treatment-options.
Mody, L. (2003). “Skin and Soft Tissue Infections in Older Adults.” Geriat & Ag 6(9): 40-43.
Moet, G. J., R. N. Jones, D. J. Biedenbach, M. G. Stilwell and T. R. Fritsche (2007).
"Contemporary causes of skin and soft tissue infections in North America, Latin America,
and Europe: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1998-2004)."
Diagn Microbiol Infect Dis 57(1): 7-13.
Morita, Y., J. Tomida and Y. Kawamura (2014). “Responses of Pseudomonas aeruginosa
to antimicrobial.” Front Microbiol 8(4): 422.
25
Mota, M., S. Melo and T. Costa. Estratégia de gestão de biofilmes em feridas crónicas:
uma revisão de literatura. Journal of tissue regeneration and Healing [Revista em linha].
2012 [Consulta a 11/04/2014]; 20(5): 220-6. Disponível na internet: http://www.trh-
journal.com/gestao-de-biofilmes/.
Paiva, J.A., E. Pina, M.G. Silva, P. J. Nogueira, A. J. Silva et al. PORTUGAL - Controlo da
infeção e resistências aos antimicrobianos em números - Programa de prevenção e
controlo de infeções e de resistência aos antimicrobianos. Portugal: Governo de Portugal;
2013 [Consulta a 12/03/2014]. Disponível na internet: http://www.dgs.pt/estatisticas-de-
saude/estatisticas-de-saude/publicacoes/portugal-controlo-da-infecao-e-resistencia-aos-
antimicrobianos-em-numeros-2013.aspx.
Pankey, G. A. and L. D. Sabath (2004). "Clinical relevance of bacteriostatic versus
bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections."
Clin Infect Dis 38(6): 864-870.
Papp-Wallace, K. M., A. Endimiani, M. A. Taracila and R. A. Bonomo (2011).
"Carbapenems: past, present, and future." Antimicrob Agents Chemother 55(11): 4943-
4960.
Pasta, A. A., F. H. Fração, G. L. Magalhães and R. M. Quessada (2008). “Prevalência e
Perfil de Susceptibilidade antimicrobiana em cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras
de β-lactamases de espectro estendido (ESBL), isoladas de pacientes do Hospital
Universitário/UEL.” Rev Bras Anal Clín 40(2): 137-141.
Pereira-Maia, E. C., P. P. Silva, W. B. Almeida, H. F. Santos, B- L. Marcial et al (2010).
"Tetraciclinas e glicilciclinas: uma visão geral." Quím Nova 33: 700-706.
Poole, K. (2011). “Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max.” Front Microbiol 2(65):
1-38
Rajan, S. (2012). "Skin and soft-tissue infections: classifying and treating a spectrum."
Cleve Clin J Med 79(1): 57-66.
Ramalhinho, I., M. Ribeirinho, I. Vieira and J. Cabrita (2012). "Evolution of outpatient
antibiotic use in Portugal mainland 2000-2009." Acta Med Port 25(1): 20-28.
Ricci, G., L. M. Barrionuevo, C. Paola, P. Pagliari and A. B. Inanes. Antibiotic Resistant
Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium. Croatia: INTECH; 2012
[Consulta em 13/01/2014]. Disponível na internet:
http://cdn.intechopen.com/pdfs/34686/InTechAntibiotic_resistance_in_nursing_homes.pdf.
Siddiqui, A. R. and J. M. Bernstein (2010). "Chronic wound infection: facts and
controversies." Clin Dermatol 28(5): 519-526.
Sipahi, O. R. (2008). "Economics of antibiotic resistance." Expert Rev Anti Infect Ther 6(4):
523-539.
26
Šiširak, M., M. Hukić, A. Zvizdić and D. Bekić (2013). “Prevalance and antimicrobial
resistance of Pseudomonas aeruginosa in the wound swabs”. Medic Journal 19(4): 292-
297.
Smith, P. W., C. W. Seip, S. C. Schaefer, C. Bell-Dixon and O. Nebraska (2000).
"Microbiologic survey of long-term care facilities." Am J Infect Control 28(1): 8-13.
Snary, E. L., L. A. Kelly, H. C Davison, C. J. Teale and M. Wooldridge (2004).
"Antimicrobial resistance: a microbial risk assessment perspective." J Anticrob Chemother
53(6): 906-917.
Sousa, J., F. Cerqueira e C. Abreu. Microbiologia- Protocolos laboratoriais. 2ed. Portugal:
Edições Universidade Fernando Pessoa; 2012, p.15, 52-79.
Sousa, J. C. Manual de Antibióticos Antibacterianos. 1ed. Porto: Universidade Fernando
Pessoa, 2005, p.107-470.
Spicer, W. J. Clinical Bacteriology, Mycology and Parasitology: An Ilustrated Colour Text.
1ed. London: Churchill Livingston; 2000, p.46.
Tang, S. S., A. Apisarnthanarak and L. H. Hsu (2014). ”Mechanisms of beta-lactam
antimicrobial resistance and epidemiology of major community- and healthcare-associated
multidrug-resistant bactéria.” Adv Drug Deliv Ver, in press. doi:
10.1016/j.addr.2014.08.003.
Tognetti, L., C. Martinelli, S. Berti, J. Hercogova, T. Lotti, et al. (2012). "Bacterial skin and
soft tissue infections: review of the epidemiology, microbiology, aetiopathogenesis and
treatment: a collaboration between dermatologists and infectivologists." J Eur Acad
Dermatol Venereol 26(8): 931-941.
Torella, J. P., Chait, R., and Kishony, R. (2010). “Optimal Drug Synergy in Antimicrobial
Treatments.” PLoS Computational Biology 6(6),e1000796.
doi:10.1371/journal.pcbi.1000796.
Villa, L. M., J. A. Cortés, A. L. Leal, A. M. Martha and P. Meléndez (2013). "Pseudomonas
aeruginosa resistente a antimicrobianos en hospitales colombianos." Rev chil infect 30:
605-610.
Wu, D. C., W. W. Chan, A. I. Metelitsa, L. Fiorillo and A. N. Lin (2011). "Pseudomonas skin
infection: clinical features, epidemiology, and management." Am J Clin Dermatol 12(3):
157-169.
Ziemska, J., A. Rajnisz and J. Solecka (2013). "New perspectives on antibacterial drug
research." Cent Eur J Biol 8(10): 943-957.
Zimbro, M. and A. David. DifcoTM & BBLTM Manual- Manual of Microbiological Culture
Media. 1 ed. EUA: Becton, Dickinson and Company; 2003, p. 514-515
