Universidade de Lisboa Faculdade de Farmáciarepositorio.ul.pt/bitstream/10451/33917/1/TM_Ana_Filipa... · 2018. 7. 31. · Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO), sendo que

Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

EPIDEMIOLOGIA, PATOGÉNESE, CLÍNICA, IMUNOLOGIA, TRATAMENTO E PREVENÇÃO DA DIFILOBOTRIOSE – NOVOS TEMPOS, “NOVA" DOENÇA

Ana Filipa Fangueiro Duarte

Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Quirina dos Santos Costa e coorientado pela Doutora Isabel Freire e pela Professora Doutora

Maria Cristina Marques

Mestrado em Análises Clínicas

2017

Parte I

Relatório de Estágio no Serviço de Patologia Clínica do CHLO

VIII MAC Prefácio

Ana Filipa Fangueiro Duarte v

Prefácio

O enquadramento do trabalho.

O meu percurso académico teve início com a Licenciatura em Ciências das Saúde,

que me proporcionou a formação necessária para o prosseguimento de estudos de ciclo

superior em diversas áreas científicas e relacionadas com a saúde. Ao longo da

Licenciatura, a Microbiologia Clínica foi uma das áreas que me despertou maior interesse

e, uma vez que esta constitui uma das valências das Análises Clínicas, decidi ingressar no

Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. No

âmbito do curso, foi realizado o estágio curricular, no Serviço de Patologia Clínica do

Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO), sendo que o presente relatório pretende

descrever as atividades acompanhadas no mesmo.

O relatório intitulado “Epidemiologia, patogénese, clínica, imunologia, tratamento

e prevenção da Difilobotriose – novos tempos, “nova" doença”, apresenta-se dividido em

quatro partes:

Na parte I, apresenta-se o prefácio, os resumos em Português e Inglês, a lista de

abreviaturas e os índices;

Na parte II, expõe-se o relatório sumário das atividades desenvolvidas nas valências

de Microbiologia, Imunologia, Hematologia e Química Clínica no Serviço de Patologia

Clínica do Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO);

Na parte III, apresenta-se a monografia desenvolvida dentro do âmbito da valência

de Microbiologia (Parasitologia Clínica), intitulada “Epidemiologia, patogénese, clínica,

imunologia, tratamento e prevenção da Difilobotriose – novos tempos, “nova" doença”.

E por fim, na parte IV, apresentam-se as conclusões gerais e perspetivas futuras.

Este relatório está de acordo com o disposto no Artigo 37.º do Regulamento Geral

do Ciclo de Estudos conducente ao Grau de Mestre da FFULisboa, nº 134/2016, DR, 2.ª

série — N.º 26, de 8 de fevereiro de 2016.


VIII MAC Resumo

vi Ana Filipa Fangueiro Duarte

Resumo

O presente relatório refere-se ao estágio realizado no âmbito do Mestrado em

Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. O estágio decorreu

no Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO) e

abrangeu as valências de Microbiologia, Imunologia, Hematologia e Química Clínica.

Este relatório tem como objetivo fazer a apresentação e caracterização do local de

estágio e descrever as atividades desenvolvidas. Para cada uma das valências mencionadas,

é feita uma descrição dos principais equipamentos e metodologias utilizados, e dos

parâmetros analíticos determinados, realçando o seu interesse e significado clínico.

Palavras-chave: Microbiologia, Imunologia, Hematologia, Química Clínica


VIII MAC Abstract

Ana Filipa Fangueiro Duarte vii

Abstract

This report refers to the internship carried out as part of the Master’s Degree in

Clinical Analysis of the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon. The internship

took place at the Clinical Pathology Service of the Lisboa Ocidental Hospital Center

(CHLO) and encompassed the areas of Microbiology, Immunology, Hematology and

Clinical Chemistry.

The aim of this report is to present and characterize the laboratory where the

internship took place and to describe the activities developed. For each one of the areas

mentioned, it is described the main equipment and methodologies used, and the analytical

parameters determined, emphasizing their clinical interest and significance.

Keywords: Microbiology, Immunology, Hematology, Clinical Chemistry


VIII MAC Lista de Abreviaturas

viii Ana Filipa Fangueiro Duarte

Lista de Abreviaturas

Parte II

Relatório de Estágio no Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar de

Lisboa Ocidental (CHLO)

AAT α1-Antitripsina

AEQ Avaliação Externa da Qualidade

AFP α-Fetoproteína

AGJ Anomalia da Glicemia de Jejum

AL Anticoagulante Lúpico

ALP Fosfatase Alcalina

ANA Anticorpos Antinucleares

APTT Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado

AR Artrite Reumatoide

BAAR Bacilos Álcool-Ácido Resistentes

COS Gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro

CDC Centers for Disease Control and Prevention

c-HDL Colesterol HDL

CHLO Centro Hospital de Lisboa Ocidental

CHGM Concentração de Hemoglobina Globular Média

CK Creatina Cinase

c-LDL Colesterol LDL

CLL Cadeias Leves Livres

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CMI Concentração Mínima Inibitória

CMV Citomegalovirus



Ana Filipa Fangueiro Duarte ix

CQI Controlo de Qualidade Interno

CT Colesterol Total

DAI Doenças Autoimunes

DCV Doenças Cardiovasculares

DGS Direção Geral de Saúde

DM Diabetes Mellitus

DPCA Diálise Peritoneal Contínua Ambulatória

dsDNA DNA de cadeia dupla

EAM Enfarte Agudo do Miocárdio

EBV Vírus de Epstein-Barr

EC Eletroforese Capilar

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ENA Antigénios Nucleares Extraíveis

EUCAST European Committee On Antimicrobial Susceptibility Testing

FR Fator Reumatoide

GGT γ-glutamiltransferase

HAE2 Gelose Chocolate Haemophilus 2

Hb Hemoglobina

Hb A1c Hemoglobina Glicada

Hb F Hemoglobina Fetal

HDL High Density Lipoprotein

HEKT Gelose Hektoen

HEM

Hospital de Egas Moniz

HGM Hemoglobina Globular Média

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

HSC Hospital de Santa Cruz



x Ana Filipa Fangueiro Duarte

HSFX Hospital de S. Francisco Xavier

Ht Hematócrito

IFI Imunofluorescência Indireta

Ig Imunoglobulina

INR Razão Normalizada Internacional

INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

ISE Ion Selective Electrode

ISI Índice de Sensibilidade Internacional

IUSTI International Union against Sexually Transmitted Infections

LBA Lavado Broncoalveolar

LCR Líquido Cefalorraquidiano

LDL Low Density Lipoprotein

LES Lúpus Eritematoso Sistémico

MAC Gelose Mac Conkey

MGUS Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance

MHC Major Histocompatibility Complex

MHE Gelose Mueller Hinton

MHF Gelose Mueller Hinton + 5% sangue de cavalo + NAD

MM Mieloma Múltiplo

MNPT Média Normal do Tempo de Protrombina

MRSA Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina

OMS Organização Mundial de Saúde

PBP2’ Penicillin-Binding Protein 2’

PCR Proteína C Reativa

PDF Produtos de Degradação do Fibrinogénio/Fibrina

PSA Antigénio Específico da Próstata



Ana Filipa Fangueiro Duarte xi

PTGO Prova De Tolerância à Glucose Oral

PTH Hormona Paratiroide

PVX Gelose Chocolate + PolyViteX

RDW Indice de Dispersão Eritrocitária

RIA Radioimunoensaio

RPR Rapid Plasma Reagin

SPC Serviço de Patologia Clínica

T3L Triiodotironina Livre

T4L Tiroxina Livre

TACSP Técnico de Análises Clínicas e Saúde Pública

TDG Tolerância Diminuída à Glucose

TFG Taxa de Filtração Glomerular

TG Triglicéridos

TP Tempo de Protrombina

TRH Hormona Libertadora de Tirotrofina

TSA Teste de Suscetibilidade aos Antibióticos

TSH Hormona Estimulante da Tiroide

TT Tempo de Trombina

UFC Unidades Formadoras de Colónias

VGM Volume Globular Médio

VLDL Very-Low-Density Lipoprotein

VS Velocidade de Sedimentação



xii Ana Filipa Fangueiro Duarte

Parte III

Epidemiologia, patogénese, clínica, imunologia, tratamento e prevenção da

Difilobotriose – novos tempos, “nova" doença

CDC Centers for Disease Control and Prevention

cob cytochrome b

cox1 cytochrome c oxidase subunit 1

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

INF- γ Interferão γ

ITS internal transcribed spacers

MEV Microscopia Eletrónica de Varrimento

nad3 NADH dehydrogenase subunit 3

OMS Organização Mundial de Saúde

PCR Polymerase Chain Reaction

PG Prostaglandina

PPi Pirofosfato

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

Th1 T helper 1

Th2 T helper 2

WHO World Health Organization


VIII MAC Índice Geral

Ana Filipa Fangueiro Duarte xiii

Índice Geral

Parte I ................................................................................................................................ i

Prefácio ............................................................................................................................ v

Resumo ............................................................................................................................ vi

Abstract .......................................................................................................................... vii

Lista de Abreviaturas .................................................................................................. viii

Índice Geral .................................................................................................................. xiii

Índice de Figuras ......................................................................................................... xvii

Índice de Tabelas........................................................................................................ xviii

Parte II ............................................................................................................................. 1

1. Introdução ................................................................................................................ 3

2. Caracterização do Laboratório de Estágio ............................................................ 5

3. Fase Pré-Analítica .................................................................................................... 8

4. Microbiologia ......................................................................................................... 10

4.1. Exame Cultural ................................................................................................. 11

4.2. Exame Microscópico ........................................................................................ 15

4.2.1. Exame a Fresco ......................................................................................... 15

4.2.2. Exame Após Coloração............................................................................. 16

4.3. Testes de Identificação de Microrganismos ..................................................... 17

4.3.1. Provas Bioquímicas .................................................................................. 17

4.3.2. Testes de Aglutinação ............................................................................... 18

4.3.3. Teste de Sensibilidade à Optoquina .......................................................... 19

4.3.4. Teste da Necessidade dos Fatores X e V .................................................. 19

4.4. Identificação de Microrganismos - Sistema Automatizado VITEK®2 ........... 20

4.5. Testes de Suscetibilidade aos Antibióticos (TSA) ........................................... 22

4.5.1. Método de Microdiluição – VITEK2 ........................................................ 23

4.5.2. Métodos Manuais ...................................................................................... 23

4.6. Processamento de Produtos Biológicos............................................................ 24

4.6.1. Urina ......................................................................................................... 24

4.6.2. Sangue (Hemocultura) .............................................................................. 25

4.6.3. Expetoração............................................................................................... 27

4.6.4. Fezes ......................................................................................................... 28



xiv Ana Filipa Fangueiro Duarte

4.6.5. Exsudado Vaginal/Retal – Pesquisa de Streptococcus agalactiae ........... 29

5. Imunologia .............................................................................................................. 31

5.1. Proteínas ........................................................................................................... 31

5.1.1. Nefelometria ............................................................................................. 31

5.1.1.1. Proteínas Doseadas ................................................................................ 32

5.1.2. Eletroforese de Proteínas Séricas .............................................................. 35

5.1.3. Imunofixação ............................................................................................ 37

5.1.3.1. Pesquisa da Proteína de Bence Jones .................................................... 38

5.2. Alergologia ....................................................................................................... 39

5.3. Autoimunidade ................................................................................................. 41

5.3.1. Imunofluorescência Indireta ..................................................................... 41

5.3.1.1. Anticorpos Antinucleares (ANA).......................................................... 42

5.3.2. Quimioluminescência ............................................................................... 43

5.3.3. Immunoblot ............................................................................................... 43

6. Hematologia ............................................................................................................ 45

6.1. Hemograma ...................................................................................................... 45

6.1.1. Contador Hematológico Beckman Coulter UniCel DxH 800................... 46

6.1.2. Eritrograma ............................................................................................... 47

6.1.3. Leucograma............................................................................................... 48

6.1.4. Plaquetograma........................................................................................... 49

6.1.5. Reticulócitos ............................................................................................. 50

6.2. Estudo Morfológico do Sangue Periférico – Esfregaço Sanguíneo ................. 50

6.3. Velocidade de Sedimentação ........................................................................... 52

6.4. Estudo das Hemoglobinopatias ........................................................................ 53

6.4.1. HPLC ........................................................................................................ 53

6.4.2. Eletroforese de Hemoglobinas .................................................................. 55

6.4.3. Teste da insolubilidade da Hb S................................................................ 55

6.5. Hemostase ........................................................................................................ 56

6.5.1. Equipamentos Automáticos ACL TOP 750/500....................................... 57

6.5.2. Testes de Screening/Rotina ....................................................................... 58

6.5.3. Testes de Diagnóstico ............................................................................... 60

7. Química Clínica...................................................................................................... 62

7.1. Equipamentos Automáticos e Metodologias Utilizadas................................... 63

7.1.1. Cobas 8000 modular analyzer series......................................................... 63



Ana Filipa Fangueiro Duarte xv

7.1.2. ARCHITECT i1000SR ............................................................................. 64

7.1.3. ADAMS A1C HA-8180T........................................................................... 65

7.1.4. Aution MAX AX-4030 e sediMAX ......................................................... 65

7.1.5. Radioimunoensaio (RIA) .......................................................................... 66

7.2. Proteínas ........................................................................................................... 67

7.3. Metabolismo dos Hidratos de Carbono ............................................................ 68

7.3.1. Diagnóstico e Monitorização de Diabetes Mellitus .................................. 69

7.4. Metabolismo dos Lípidos ................................................................................. 70

7.5. Função Renal .................................................................................................... 72

7.6. Função Hepática ............................................................................................... 73

7.7. Função Pancreática ........................................................................................... 75

7.8. Ionograma......................................................................................................... 76

7.9. Função Cardíaca ............................................................................................... 77

7.10. Marcadores de Anemia..................................................................................... 78

7.11. Metabolismo Ósseo e Mineral.......................................................................... 80

7.12. Função Tiroideia .............................................................................................. 81

7.13. Marcadores Tumorais ....................................................................................... 82

7.14. Serologia Infeciosa ........................................................................................... 84

7.14.1. Toxoplasmose, Rubéola e Citomegalovírus – Grupo TORCH ................. 84

7.14.2. Sífilis ......................................................................................................... 85

7.15. Exame Sumário de Urina ................................................................................. 87

7.15.1. Exame Físico-químico .............................................................................. 87

7.15.2. Análise do Sedimento Urinário ................................................................. 88

8. Controlo de Qualidade .......................................................................................... 90

8.1. Controlo de Qualidade Interno ......................................................................... 90

8.2. Avaliação Externa da Qualidade ...................................................................... 92

9. Bibliografia ............................................................................................................. 94

Parte III.......................................................................................................................... 99

Resumo ......................................................................................................................... 101

Abstract ........................................................................................................................ 102

Objetivos ...................................................................................................................... 103

Material e Métodos ..................................................................................................... 104

1. Introdução ............................................................................................................ 105

2. Género Diphyllobothrium .................................................................................... 107



xvi Ana Filipa Fangueiro Duarte

2.1. Perspetiva Histórica........................................................................................ 107

2.2. Taxonomia e Principais Espécies Causadoras de Infeção no Homem ........... 108

2.3. Morfologia ...................................................................................................... 110

2.3.1. Parasita Adulto ........................................................................................ 110

2.3.2. Ovo .......................................................................................................... 112

2.3.3. Formas Larvares...................................................................................... 113

3. Patogénese............................................................................................................. 115

3.1. Hospedeiro Definitivo .................................................................................... 117

3.2. Hospedeiros Intermediários............................................................................ 118

3.2.1. Primeiro Hospedeiro Intermediário ........................................................ 118

3.2.2. Segundo Hospedeiro Intermediário ........................................................ 119

4. Manifestações Clínicas ........................................................................................ 121

5. Epidemiologia ....................................................................................................... 123

5.1. Distribuição Mundial...................................................................................... 123

5.2. Parasitose Reemergente – a influência dos “novos” hábitos alimentares ...... 128

5.3. Outros Fatores que Contribuem para a Transmissão, Expansão e Perpetuação da

Difilobotriose ............................................................................................................ 130

6. Imunologia ............................................................................................................ 133

6.1. Resposta Imunitária nas Infeções Causadas por Helmintas ........................... 133

6.2. Mecanismos de Evasão ao Sistema Imunitário dos Hospedeiros .................. 134

6.2.1. Papel das Prostaglandinas Produzidas por Diphyllobothrium spp. na

Imunomodulação da Resposta Imunitária ............................................................. 135

7. Diagnóstico ........................................................................................................... 138

7.1. Diagnóstico Baseado na Morfologia .............................................................. 139

7.2. Diagnóstico Molecular ................................................................................... 142

8. Tratamento ........................................................................................................... 145

8.1. Praziquantel .................................................................................................... 145

8.2. Niclosamida .................................................................................................... 146

9. Prevenção e Controlo........................................................................................... 147

10. Conclusão .............................................................................................................. 149

11. Bibliografia ........................................................................................................... 151

Parte IV ........................................................................................................................ 155

Conclusões e Perspetivas Futuras.............................................................................. 157


VIII MAC Índice de Figuras

Ana Filipa Fangueiro Duarte xvii

Índice de Figuras

Parte II



Figura 1 - Organograma do SPC...................................................................................... 5

Figura 2 - Cadeia pré-analítica Cobas 8000 (p 671 e p 612) ........................................... 9

Figura 3 - Técnicas de sementeira por quadrantes (esquerda) e por estrias (direita)..... 12

Figura 4 - Componentes do sistema VITEK®2 ............................................................. 21

Figura 5 - Cartas de Identificação VITEK 2 .................................................................. 22

Figura 6 - Frascos de cultura BacT/ALERT® ............................................................... 26

Figura 7 - Sistema BacT/ALERT® 3D ......................................................................... 27

Figura 8 - Equipamento BN ProSpec ............................................................................ 31

Figura 9 - Equipamento V8 E-Class .............................................................................. 35

Figura 10 - Perfil eletroforético normal de proteínas séricas ......................................... 36

Figura 11 - Equipamento Hydrasys Focusing ................................................................ 37

Figura 12 - Imunofixação em amostras de soro ............................................................. 38

Figura 13 - Equipamento Phadia 100 ............................................................................ 40

Figura 14 - Equipamento Zenit SP ................................................................................ 41

Figura 15 - Exemplos de padrões nucleares em células HEp-2 ..................................... 42

Figura 16 - Equipamento Zenit RA ............................................................................... 43

Figura 17 - Equipamento EUROBlotMaster ................................................................. 44

Figura 18 - Representação esquemática da técnica de execução de um esfregaço de

sangue periférico ............................................................................................................. 51

Figura 19 - Representação esquemática de um bom esfregaço de sangue periférico .... 51

Figura 20 - Equipamento ADAMS A1C HA-8180T ..................................................... 54

Figura 21 - Cobas 8000 modular analyzer series ........................................................... 63

Figura 22 - Equipamento ARCHITECT i1000SR ......................................................... 65

Figura 23 - Equipamentos sediMAX e Aution MAX AX-4030 .................................... 65

Figura 24 - Interpretação dos resultados da serologia para Toxoplasmose, Rubéola e

CMV ............................................................................................................................... 85


VIII MAC Índice de Figuras

xviii Ana Filipa Fangueiro Duarte

Parte III



Figura 25 - Representação do parasita adulto de Diphyllobothrium spp. ....................... 110

Figura 26 - Escólex (esquerda) e estróbilo (direita) de Diphyllobothrium spp. ............. 111

Figura 27 - Proglótis de Diphyllobothrium spp. ............................................................. 112

Figura 28 - Estrutura do ovo de Diphyllobothrium spp. ................................................. 113

Figura 29 - Formas larvares de Diphyllobothrium spp. .................................................. 113

Figura 30 - Plerocercóides de D. latum, D. dendriticum e D. pacificum ........................ 114

Figura 31 - Ciclo de vida de Diphyllobothrium spp. no Homem ................................... 116

Figura 32 - Distribuição da difilobotriose na Europa desde 1980 .................................. 124

Figura 33 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. latum ..... 125

Figura 34 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. dendriticum

.......................................................................................................................................... 126

Figura 35 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. pacificum

.......................................................................................................................................... 127

Figura 36 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. nihonkaiense

.......................................................................................................................................... 128

Figura 37 – Observação Microscópica de ovos de Diphyllobothrium spp. em amostras de

fezes ................................................................................................................................. 139

Figura 38 - Proglótis de Diphyllobothrium spp. ............................................................. 140

Figura 39 - Fotografias de ovos de diferentes espécies de Diphyllobothrium, obtidas

através de MEV................................................................................................................ 141


VIII MAC Índice de Tabelas

Ana Filipa Fangueiro Duarte xix

Índice de Tabelas

Parte II



Tabela 1 - Principais meios de cultura utilizados no Laboratório de Microbiologia e

respetivas características ................................................................................................. 12

Tabela 2 - Frações proteicas e respetivas proteínas constituintes .................................. 36

Tabela 3 - Parâmetros determinados por RIA e amostras utilizadas ............................. 67

Tabela 4 - Marcadores tumorais determinados no laboratório, características, utilidade e

correlação clínicas ........................................................................................................... 83

Tabela 5 - Parâmetros determinados no exame físico-químico da urina e respetiva

correlação clínica ............................................................................................................ 88

Tabela 6 - Programas de AEQ em que o SPC participa................................................. 93

Parte III



Tabela 7 - Principais marcos na história da difilobotriose .............................................. 108

Tabela 8 - Espécies de Diphyllobothrium spp. válidas reportadas no Homem e respetivo

número de casos ............................................................................................................... 109

Tabela 9 - Hospedeiros definitivos de D. latum, D. nihonkaiense, D. dendriticum e D.

pacificum .......................................................................................................................... 118

Tabela 10 - Pratos de peixe cru/insuficientemente cozinhado consumidos mundialmente e

respetiva distribuição ....................................................................................................... 129

Parte II


VIII MAC Introdução

Ana Filipa Fangueiro Duarte 3

Relatório de estágio realizado no Seviço de Patologia Clínica do

Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO)

1. Introdução

Os exames laboratoriais, enquanto meio complementar de diagnóstico e terapêutica,

desempenham hoje em dia um papel essencial nos cuidados de saúde, contribuindo para o

diagnóstico, monitorização, prognóstico, tratamento e prevenção da doença. Assim, é

fundamental que os laboratórios de análises clínicas/patologia clínica garantam a qualidade

dos resultados fornecidos, que depende de todas as atividades executadas ao longo das três

fases que integram o processo analítico: pré-analítica, analítica e pós-analítica.

A fase pré-analítica inclui todos os procedimentos que precedem a análise

laboratorial das amostras. A fase analítica corresponde à execução da análise propriamente

dita, sendo que o controlo de qualidade e validação técnica dos resultados estão

compreendidos nesta fase. Por fim, a fase pós-analítica consiste na validação biopatológica

e emissão dos resultados.

Nos últimos anos, os laboratórios de análises clínicas têm vindo a tornar-se cada

vez mais automatizados, o que veio permitir uma diminuição do tempo de resposta perante

o elevado fluxo de amostras e uma diminuição dos erros laboratoriais. (1)

O presente relatório de estágio é referente ao estágio laboratorial realizado no

âmbito do Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de

Lisboa. O estágio foi efetuado no Serviço de Patologia Clínica (SPC) do Centro Hospitalar

de Lisboa Ocidental, EPE (CHLO), sob a orientação da Drª Isabel Freire, Farmacêutica

Especialista em Análises Clínicas (TSS – Técnico Superior de Saúde). Decorrido entre 1

de abril e 30 de novembro de 2016, num total de 1080 horas, o estágio abrangeu as áreas

da Microbiologia, Imunologia, Hematologia e Química Clínica. Cada uma destas valências

foi orientada, respetivamente, por Drª Teresa Baptista Fernandes, Drª Alexandra Mendes,

Drª Flora Meireles e Drª Conceição Cardoso. Teve início no Laboratório de Microbiologia

e Biologia Molecular, localizado no Hospital de Egas Moniz, prosseguindo depois no

Hospital de S. Francisco Xavier com as restantes valências.

Durante o período de estágio integrei a rotina laboratorial de cada uma das áreas por

onde passei, manuseando as diferentes amostras recebidas no SPC e os equipamentos



4 Ana Filipa Fangueiro Duarte

utilizados (tanto ao nível da sua manutenção como ao nível do processamento das

amostras), e executando diferentes técnicas manuais. Tive ainda a possibilidade de

acompanhar a validação biopatológica dos resultados.

Neste relatório será feita a caracterização e descrição do funcionamento do local de

estágio, uma abordagem à fase pré-analítica e, para cada uma das valências, serão descritos

os principais equipamentos, metodologias e técnicas utilizadas, abordando alguns dos testes

efetuados e parâmetros analíticos determinados, bem como o seu interesse e significado

clínico. Por fim, será também analisada sucintamente a área da gestão da qualidade, onde

serão abordados o controlo de qualidade interno e a avaliação externa da qualidade.

Face à grande variedade de técnicas executadas e parâmetros determinados no SPC,

o relatório centrar-se-á apenas naqueles que foram observados e/ou realizados mais

frequentemente em cada área.


VIII MAC Caracterização do Laboratório de Estágio


2. Caracterização do Laboratório de Estágio

O CHLO foi criado em 29 de dezembro de 2005, sendo resultante da fusão do

Hospital de Egas Moniz (HEM), do Hospital de Santa Cruz (HSC) e do Hospital de S.

Francisco Xavier (HSFX). O Centro Hospitalar tem como missão a prestação de cuidados

de saúde humanizados, de qualidade e em tempo oportuno a todos os cidadãos, dispondo

de todas as valências de cuidados de saúde diferenciados e beneficiando da reconhecida

qualidade assistencial das três unidades hospitalares que o compõem. (2)

O SPC está inserido no departamento de Patologia e Medicina Laboratorial, que

integra um dos muitos serviços do CHLO. A Direção do SPC está a cargo do Dr. João Faro

Viana, sendo que o serviço se encontra organizado de acordo com o organograma

representado na figura 1. A equipa de trabalho do SPC é constituída por Médicos

Patologistas Clínicos, Técnicos Superiores de Saúde, Técnicos de Análises Clínicas e

Saúde Pública (TACSP), Assistentes Técnicos e Assistentes Operacionais. (2)

O SPC resulta da fusão dos três serviços existentes nos hospitais que constituem o

CHLO, sendo composto pelos seguintes polos:

Laboratório Central, situado no HSFX - realiza todas as rotinas do CHLO.

Inclui os Laboratórios de Química Clínica, Hematologia, Hemostase,

Imunologia e Citometria de Fluxo e ainda o Laboratório de Urgência do

Figura 1 - Organograma do SPC (2)




HSFX, que partilha as mesmas instalações e assegura um apoio médico

presencial 24h/24h;

Laboratório de Microbiologia Clínica e Biologia Molecular, situado no

HEM;

Laboratórios de Urgência do HEM e do HSC.

O Laboratório Central encontra-se dividido em diferentes áreas de trabalho, sendo

constituído por 2 espaços principais: a central de colheitas e o laboratório “propriamente

dito” onde são efetuados os procedimentos analíticos.

No espaço da central de colheitas existe também uma sala de microscopia de

fluorescência e uma sala onde é realizada a técnica de radioimunoensaio. Por sua vez, o

espaço do laboratório é constituído por uma área de receção, um pequeno gabinete de

colheitas, uma área de receção de amostras e triagem, um open-space onde são efetuados

os procedimentos da fase pré-analítica e onde funcionam os Laboratórios de Química

Clínica, Hematologia, Hemostase e o Laboratório de Urgência, e ainda duas salas onde

funcionam o Laboratório de Imunologia e o Laboratório de Citometria de Fluxo.

O Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular é constituído pelos seguintes

espaços principais: uma área de receção/atendimento e de triagem das amostras recebidas,

sala de colorações e, no que diz respeito apenas ao espaço da Microbiologia, três salas

destinadas ao exame bacteriológico, os laboratórios de parasitologia, micologia e virologia

e um laboratório de acesso restrito (P3) onde é realizado o exame micobacteriológico.

Tanto no Laboratório Central como no Laboratório de Microbiologia são recebidas

amostras provenientes das diferentes áreas dos três hospitais (serviços de internamento,

consultas externas, serviços de urgência, entre outros), bem como amostras externas

provenientes de alguns centros de saúde. O transporte de amostras entre os vários polos do

SPC é efetuado por um serviço de transporte do CHLO. No Laboratório Central, as

amostras das diversas áreas do HSFX chegam através de um sistema de transporte

pneumático (ou sistema de vácuo) que permite realizar o transporte interno de amostras.

As amostras são colocadas numa cápsula, que é transportada através de uma rede de tubos

até ao laboratório e depois do laboratório até ao local (serviço) de proveniência.

No SPC, todo o circuito analítico encontra-se informatizado com o sistema

Clinidata®XXI, um sistema inteligente de gestão global de laboratórios de análises

clínicas. O ClinidataXXI permite gerir todo o processo analítico, desde a prescrição dos




exames laboratoriais até à validação final dos resultados, uma vez que abrange todas as

áreas da Patologia Clínica, a ligação de equipamentos e o controlo de qualidade. (3)

O SPC encontra-se a implementar um Sistema de Gestão da Qualidade de forma

gradual. O Laboratório de Biologia Molecular está já certificado (NP EN ISO 9001:2008),

sendo que o objetivo passa por conseguir ter todo o serviço certificado no final de 2017.(2)


VIII MAC Fase Pré-Analítica


3. Fase Pré-Analítica

A fase pré-analítica compreende todos os procedimentos que antecedem a análise

laboratorial das amostras. É a fase onde se verifica a maioria dos erros laboratoriais, que

poderão originar alterações nos resultados e, consequentemente, interpretações incorretas.

Entre os fatores pré-analíticos que podem afetar os resultados estão a preparação do doente

para a colheita, a colheita, identificação, transporte, tratamento e conservação das

amostras.(1)

Assim que os pedidos de análises laboratoriais são registados pelos clínicos no

sistema ClinidataXXI, é atribuído um número ao processo de cada doente e às amostras,

que são identificadas através de um código de barras. Quando as amostras chegam ao

Laboratório Central (receção/zona de triagem) e ao Laboratório de Microbiologia

(receção), procede-se à sua integração no sistema informático e à triagem, sendo impressas

as etiquetas de identificação necessárias. Neste processo de triagem é necessário confirmar

a correta identificação das amostras e verificar o cumprimento dos critérios para a aceitação

destas. Após a triagem, as amostras são distribuídas pelas diferentes áreas do laboratório.

Para algumas amostras é necessário um tratamento prévio (centrifugação) antes de

serem distribuídas e analisadas nas respetivas áreas, como é o caso das amostras de soro

(para a Química Clínica e Imunologia) e de plasma (para a Hemostase), e das amostras de

urina para a realização de doseamentos (Química Clínica).

No Laboratório Central é utilizado um equipamento de pré-analítica, o Cobas 8000,

que possibilita o processamento automático das amostras, otimizando o fluxo de trabalho e

o tempo no laboratório, e diminuindo os erros associados a esta fase. A cadeia pré-analítica

do Cobas 8000 é constituída pelos módulos p 671 e p 612, representados na figura 2. O

módulo p 671 é composto por duas centrífugas, onde são centrifugadas as amostras de

sangue total para a obtenção de soro e de plasma e as amostras de urina, de acordo com as

rpm (rotações por minuto) e o tempo definidos. O módulo p 612 permite identificar os

tubos, avaliar a qualidade e o volume das amostras, detetar eventuais problemas nos tubos,

fazer as alíquotas necessárias para tubos secundários identificados com código de barras, e

separar e agrupar as amostras por áreas. A avaliação da qualidade (índice de hemólise,

lipémia e icterícia) e volume das amostras é realizada através de fotografia, que é


VIII MAC Fase Pré-Analítica


comparada com uma base de fotografias existentes no software do equipamento,

permitindo assim aceitar ou rejeitar os tubos. (4)

Neste equipamento são separadas as amostras de soro para o laboratório de

Imunologia, as amostras de plasma para o laboratório de Hemostase e as amostras de

sangue total para o laboratório de Química Clínica. As restantes amostras de soro e urina

para a Química seguem diretamente para os outros módulos do Cobas 8000 (descritos no

capítulo 7.1.1), onde é efetuada a maior parte dos doseamentos, que se encontram ligados

à cadeia pré-analítica.

Figura 2 - Cadeia pré-analítica Cobas 8000 (p 671 e p 612)

Figura 2- Cadeia pré-analítica Cobas 8000 (p 671 e p 612)

Figura 2 - Cadeia pré-analítica Cobas 8000 (p 671 e p 612)


VIII MAC Microbiologia


4. Microbiologia

O Laboratório de Microbiologia tem um papel fundamental no diagnóstico,

tratamento e controlo das doenças infeciosas. (5) O laboratório está dividido nas áreas de

bacteriologia, micobacteriologia, micologia, parasitologia e virologia, nas quais é efetuada

a pesquisa, identificação e caracterização dos agentes etiológicos da infeção, e ainda os

testes de suscetibilidade aos antibióticos (TSA).

Ao laboratório de Microbiologia chegam diversos tipos de amostras: urina, sangue,

fezes, amostras respiratórias (expetoração, lavado broncoalveolar, secreções respiratórias e

brônquicas), exsudados (vaginal, retal, faríngeo, etc), exsudados purulentos profundos e

superficiais, LCR e outros líquidos biológicos (pleural, ascítico, pericárdico, etc), cabelos,

unhas, pele (escamas cutâneas), biópsias e pontas de cateter, entre outras.

Para um diagnóstico microbiológico com a máxima qualidade e sensibilidade, é

essencial que as amostras sejam de boa qualidade, que sejam colhidas corretamente e em

quantidade suficiente, transportadas de forma adequada para o laboratório e acompanhadas

de informação clínica relevante. (5,6) Após a receção dos produtos biológicos no

laboratório e triagem, estes são distribuídos pelas várias áreas acompanhados da requisição

em papel (com informação acerca da situação clínica do doente, terapêutica antomicrobiana

em curso, local anatómico da colheita e exames pretendidos), onde ao longo do processo

de identificação dos microrganismos são anotados os testes efetuados e os resultados

obtidos.

No laboratório de Microbiologia são utilizadas diferentes técnicas e metodologias

para a identificação e caracterização dos microrganismos e para o estudo da suscetibilidade

aos antimicrobianos. As metodologias utilizadas e a valorização dos resultados dependem

do produto biológico em estudo, dos microrganismos pesquisados, da informação clínica

fornecida e ainda do conhecimento da microbiota normal e dos microrganismos

patogénicos nos diferentes locais anatómicos.

Neste capítulo serão apenas descritos os procedimentos realizados na área da

bacteriologia, uma vez que é a área em que é processado um maior número de amostras e

onde decorreu a quase totalidade do estágio no laboratório de Microbiologia.

A área da bacteriologia destina-se ao diagnóstico de infeções bacterianas tendo por

base não só o exame cultural, mas também outras técnicas e metodologias como o exame




microscópico, provas bioquímicas, testes de aglutinação e imunocromatográficos, sistemas

automatizados, entre outras. Neste setor são também efetuados os TSA, quando aplicáveis.

Após a receção dos produtos biológicos neste setor, é feita uma nova triagem no

sistema informático e em seguida estes são processados de acordo com os procedimentos

do laboratório e com os pedidos efetuados, sendo que, para a maior parte das amostras, o

processamento tem início com o exame cultural.

4.1. Exame Cultural

O exame cultural consiste na inoculação dos produtos biológicos em meios de

cultura, de forma a promover o crescimento dos microrganismos presentes nas amostras. A

cultura de microrganismos tem como objetivos não só a obtenção de um crescimento

suficiente dos microrganismos de interesse, mas também o seu isolamento em culturas

puras, que é essencial para a identificação e caracterização, bem como para os TSA.

Os meios de cultura utilizados podem ser sólidos (gelose) ou líquidos (caldo). Os

meios sólidos permitem a observação de colónias de microrganismos, da sua morfologia e

de reações bioquímicas específicas. Os meios líquidos são meios de enriquecimento

utilizados para promover o crescimento de bactérias presentes em baixo número, sendo que

neste caso o crescimento é detetado através da turvação do meio. (6,7)

A inoculação das amostras nos meios de cultura sólidos pode ser realizada através

de diferentes técnicas, consoante o objetivo e o produto biológico. Para a maior parte dos

produtos biológicos, é realizada a técnica de sementeira por esgotamento, ou por quatro

quadrantes (figura 3), sendo para isso utilizada uma ansa de 10 μL. Esta técnica permite

obter colónias isoladas e fazer uma análise semi-quantitativa das colónias no meio de

cultura. Para as amostras de urina, é realizada a técnica de sementeira por estrias (figura 3),

para a qual é utilizada uma ansa de 1 μL. Esta técnica permite quantificar as colónias

existentes no meio, de forma a determinar o número de unidades formadoras de colónias

(UFC) por mililitro na amostra. Para além destas, é ainda utilizada a técnica de sementeira

por inundação para as amostras de LCR. (7)

O processamento das amostras e inoculação nos meios de cultura é sempre realizado

em câmara de fluxo laminar vertical, de forma a proteger o operador dos aerossóis,

minimizando a sua exposição, e também os produtos biológicos, protegendo-os de

contaminação microbiológica. (6)




Os meios de cultura são escolhidos com base no produto biológico que se pretende

semear e nos microrganismos possivelmente envolvidos no processo infecioso. Na tabela

seguinte são apresentados os principais meios de cultura utilizados no Laboratório de

Microbiologia, assim como as suas características.

Tabela 1 - Principais meios de cultura utilizados no Laboratório de Microbiologia e respetivas características (7,8)

Meio de Cultura Características

MEIOS SÓLIDOS

Gelose Columbia

+ 5% de sangue de

carneiro (COS)

- Meio de isolamento que permite o crescimento de microrganismos fastidiosos

e a deteção dos diferentes tipos de hemólise: α-hemólise (parcial) - coloração

esverdeada à volta das colónias; β-hemólise (total) - zona clara à volta ou por

baixo das colónias; γ-hemólise (ausência de hemólise) - sem alterações no meio.

- É altamente nutritivo devido à presença de sangue de carneiro e peptonas,

sendo adequado para a cultura da maior parte das espécies bacterianas

Gelose Columbia

ANC + 5% de

sangue de

carneiro (CNA)

- Meio de isolamento seletivo que permite o crescimento de bactérias Gram +.

- Contém uma mistura de peptonas adaptada à cultura de microrganismos

exigentes, bem como ácido nalidíxico e colimicina, que inibem a maioria das

bactérias Gram − e Bacillus. - O sangue de carneiro permite fazer a determinação do tipo de hemólise

Gelose

Chocolate +

PolyViteX (PVX)

- Meio de isolamento indicado para o crescimento de estirpes fastidiosas dos

géneros Neisseria e Haemophilus, e de Streptococcus pneumoniae.

- Composto por uma base nutritiva enriquecida com fatores X (hemina) e V

(NAD), que são fornecidos pela hemoglobina e pelo PolyViteX

Gelose Chocolate

+ PolyViteX

VCAT3 (VCA3)

- Meio seletivo para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria

meningitidis a partir de amostras polimicrobianas.

- Composto pela mesma base nutritiva do meio PVX.

- A seletividade do meio deve-se à combinação de antibióticos e antifúngicos,

que inibem a maior parte das bactérias e das leveduras que não as pesquisadas.

Figura 3 - Técnicas de sementeira por quadrantes (esquerda) e por estrias (direita)

Adaptado de: (7)




Tabela 1 - Principais meios de cultura utilizados no Laboratório de Microbiologia e respetivas características

(continuação) (7,8)


MEIOS SÓLIDOS

Gelose Chocolate

Haemophilus 2

(HAE2)

- Meio seletivo para o isolamento das diferentes espécies de Haemophilus.

- Composto pela mesma base nutritiva dos meios PVX e VCA3.

- A seletividade do meio deve-se à combinação de antibióticos e antifúngicos,

que inibem a maioria das bactérias Gram + e das leveduras.

Gelose Mac

Conkey (MAC)

- Meio de isolamento seletivo e diferencial para a deteção de

Enterobacteriaceae em amostras de origem diversa.

- Permite evidenciar a fermentação da lactose através da mudança de cor para

vermelho. Colónias lactose (+): rosas a vermelhas, por vezes contornadas por

um halo de sais biliares. Colónias lactose (−): incolores ou ligeiramente beges.

- Contém cristal violeta e sais biliares, que inibem a maioria das bactérias

Gram+

Gelose Hektoen

(HEKT)

- Meio seletivo e diferencial para a deteção de espécies de Salmonella e

Shigella.

- Tem na sua composição 3 açúcares. Microrganismos fermentadores de pelo

menos um açúcar: colónias amarelas ou rosa-amareladas.

- Colónias de Salmonella e de Shigella (não fermentadoras): verdes ou verdes-

azuladas. As colónias de Salmonella poderão ou não apresentar um centro

negro, devido à produção de sulfureto de hidrogénio (H2S)

Gelose Sabouraud

Gentamicina

Cloranfenicol 2

(SGC2)

- Meio seletivo para o isolamento de leveduras e fungos a partir de amostras

polimicrobianas. A presença de peptonas, dextrose e o pH ligeiramente ácido

da gelose favorecem o crescimento dos fungos.

- A gentamicina inibe a maioria das bactérias Gram − e Gram +, e o

cloranfenicol melhora a seletividade para determinadas espécies que podem ser

resistentes à gentamicina (Streptococcus, Proteus)

Gelose Granada

(GRAN)

- Meio de isolamento seletivo utilizado para a identificação direta de

Streptococcus agalactiae em mulheres grávidas.

- Colónias de S. agalactiae: cor alaranjada, devido à produção de um pigmento

Gelose Candida

chromID (CAN2)

- Meio cromogénico para o isolamento seletivo de leveduras e para a

identificação direta de Candida albicans.

- C. albicans: colónias azuis, devido à hidrólise de um substrato cromogénico.

- Permite diferenciar culturas mistas onde estão presentes outras espécies de

Candida, cujas colónias apresentam cor rosa

Gelose BCYE

- Meio enriquecido utilizado para o isolamento de Legionella.

- Contém: L-cisteína, um aminoácido nutritivo essencial ao crescimento das

espécies de Legionella; carvão ativado, que decompõe o peróxido de

hidrogénio, um produto metabólico tóxico para estas espécies

Gelose

Campylosel

(CAM)

- Meio seletivo para o isolamento de Campylobacter (principalmente C. jejuni

e C. coli). As colónias de Campylobacter são pequenas e acinzentadas.

- Contém antibióticos e antifúngicos que inibem o crescimento da maior parte

das bactérias e fungos

Gelose Mueller

Hinton (MHE)

- Destina-se à realização de TSA por difusão em disco e por tiras E-test.

- A sua composição permite o crescimento de bactérias não exigentes como

Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Enterobacteriaceae, entre outros

Gelose Mueller

Hinton + 5%

sangue de cavalo +

NAD (MHF)

- Destina-se à realização de TSA pelos métodos de difusão em disco e de tiras

E-test, de microrganismos fastidiosos (Streptococcus pneumoniae e outras

espécies de Streptococcus, Haemophilus e Moraxella)




Tabela 1 - Principais meios de cultura utilizados no Laboratório de Microbiologia e respetivas características

(continuação) (7,8)


MEIOS LÍQUIDOS

Caldo Brain Heart

Infusion (BHI)

- Meio nutritivo que contém tecido cerebral e cardíaco, e peptonas para fornecer

proteínas e outros nutrientes necessários ao crescimento de microrganismos

exigentes e não exigentes

Caldo de Selenito

- Meio enriquecido para o isolamento de Salmonella spp. e de algumas espécies

de Shigella.

- O selenito de sódio inibe o crescimento de outras bactérias Gram + e Gram −

presentes em amostras fecais

Caldo Todd-

Hewitt

- Utilizado principalmente como meio de crescimento de Streptococcus β-

hemolíticos. Contém peptonas, dextrose e sais, sendo altamente nutritivo.

- A presença de antibióticos (gentamicina e ácido nalidíxico) inibe o

crescimento de bacilos Gram − presentes

Tioglicolato

- Meio de enriquecimento para o crescimento de diversas bactérias aeróbias e

anaeróbias.

- O tioglicolato de sódio e a cisteína presentes no meio atuam como agentes

redutores. A pequena quantidade de agar adicionada impede a difusão do O2

para o fundo do tubo, permitindo o crescimento de anaeróbios nessa zona

Para que ocorra crescimento de microrganismos, para além dos nutrientes

fornecidos pelo meio de cultura, é também necessário fornecer condições ambientais

ótimas, sendo a temperatura e a atmosfera de incubação (O2 e CO2) dois dos principais

fatores. Assim, após a inoculação das amostras nos meios de cultura, estes são colocados

numa estufa, sendo que as condições de incubação são determinadas pelo tipo de produto

biológico e pelos microrganismos que se pretende pesquisar e que poderão ser detetados.

A maior parte dos meios de cultura é colocada numa estufa a cerca de 35°C (a

temperatura ótima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos ronda os 35-

37°C, embora para alguns microrganismos a temperatura seja diferente, sendo necessário

colocar esses meios de cultura em estufas com temperaturas adequadas) e com uma

atmosfera que contém cerca de 5% de CO2, permitindo assim o crescimento dos

microrganismos aeróbios e dos capnofílicos. Para o crescimento dos microrganismos

anaeróbios e dos microaerófilos são necessárias atmosferas diferentes, criadas através da

utilização de jarras que contêm geradores que permitem criar as atmosferas adequadas.

O tempo de incubação necessário para o crescimento depende dos microrganismos,

sendo que, geralmente, os meios de cultura são incubados durante 24-48 horas. No caso

dos anaeróbios, o tempo de crescimento pode ser superior, sendo necessária a incubação

durante um maior período de tempo. (6–8)




Após a incubação, os meios de cultura são observados e é feita a análise da

morfologia das colónias, em que são avaliadas características como o tamanho, cor, forma,

aspeto, cheiro e alterações no meio de cultura provocadas pelo crescimento dos

microrganismos. A valorização clínica das colónias presentes no meio baseia-se na

compreensão da patogenia da infeção nos diferentes locais anatómicos.

Esta avaliação inicial das culturas tem grande importância, pois permite determinar

quais os testes e procedimentos necessários para a identificação e caracterização definitivas

dos microrganismos de interesse. Para a realização destes testes, assim como para os TSA,

são necessárias culturas puras (todas as colónias são idênticas e têm origem na mesma

célula parental) dos microrganismos que se pretende identificar. Os microrganismos

isolados inicialmente a partir do produto biológico encontram-se muitas vezes em culturas

mistas, sendo por isso necessário proceder ao seu reisolamento para outro(s) meio(s) de

cultura, de forma a obter culturas puras. (6,8)

4.2. Exame Microscópico

O exame microscópico constitui uma das etapas iniciais do processo de

identificação e caracterização de um microrganismo. Este pode ser utilizado para a deteção

de microrganismos diretamente a partir dos produtos biológicos e para a caracterização dos

microrganismos que cresceram nos meios de cultura.

A informação obtida através do exame microscópico permite fazer a identificação

presuntiva do possível agente infecioso, sendo por vezes utilizada para direcionar a

terapêutica inicial e também para determinar quais os testes de identificação subsequentes.

O exame microscópico abrange o exame a fresco e o exame após coloração.(6)

4.2.1. Exame a Fresco

O exame a fresco é realizado entre lâmina e lamela, diretamente a partir do produto

biológico. Este exame permite avaliar o número e tipo de células presentes na amostra, tais

como células epiteliais, leucócitos e os microrganismos. No Laboratório de Microbiologia,

a preparação de lâminas para exame a fresco é realizada para os exsudados endocervical,

uretral e vaginal. (6)




4.2.2. Exame Após Coloração

O exame microscópico de preparações coradas permite determinar várias

características das bactérias, tanto morfológicas como relativas ao modo de agrupamento e

à afinidade para os corantes. Os esfregaços podem ser realizados diretamente a partir das

amostras, ou das colónias obtidas nos meios de cultura (através da sua suspensão numa gota

de água destilada). Após a secagem dos esfregaços, estes são fixados com metanol e em

seguida procede-se à sua coloração, que é realizada num equipamento automático. As

colorações utilizadas no Laboratório de Microbiologia são a coloração de Gram e a de

Ziehl-Neelsen. (6,8)

Coloração de Gram

A coloração de Gram permite dividir as bactérias em Gram-positivo (Gram +) e

Gram-negativo (Gram −) com base na afinidade para os corantes utilizados, que é

determinada por diferenças na estrutura da parede celular das bactérias.

Nesta técnica, inicialmente é utilizado o corante cristal violeta (cor roxa), seguido

de uma solução de lugol (iodo) que aumenta a ligação do corante à parede celular das

bactérias, e depois uma solução descorante de álcool-acetona, que remove o corante. Por

último, é adicionado um segundo corante, a safranina (cor rosa), que cora os

microrganismos que não retiveram o cristal violeta. As bactérias Gram-positivo, devido a

possuírem uma camada espessa de peptidoglicano, retêm o cristal de violeta, corando de

violeta/roxo. As bactérias Gram-negativo, por outro lado, apresentam uma camada fina de

peptidoglicano e uma membrana celular externa, pelo que não retêm o cristal violeta e por

isso são coradas pela safranina, apresentando uma coloração rosa. (6,9)

A preparação de esfregaços para coloração de Gram diretamente a partir dos

produtos biológicos é realizada para a maior parte dos exsudados, para os líquidos

biológicos, amostras do aparelho respiratório, LCR e hemoculturas positivas.

Coloração de Ziehl-Neelsen

A coloração de Ziehl-Neelsen é utilizada na deteção de bactérias álcool-ácido

resistentes, nomeadamente as bactérias do género Mycobacterium, como o M. tuberculosis.

A parede celular das bactérias álcool-ácido resistentes contém ácidos micólicos, que as

tornam resistentes à descoloração por soluções álcool-ácidas. Assim, após a aplicação do

primeiro corante, a carbolfucsina (cora de vermelho), este é retido pelas bactérias álcool-

ácido resistentes e mantém-se após a aplicação da solução descorante. Em seguida é




adicionado um corante de contraste, o azul de metileno (cora de azul), que cora as células

e outros microrganismos que perdem a coloração pela carbolfucsina após a descoloração.

Desta forma, os bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) surgem corados de

vermelho, enquanto os restantes elementos observados no esfregaço coram de azul. (6) A

preparação de esfregaços diretamente a partir dos produtos biológicos é realizada para as

amostras do aparelho respiratório inferior como a expetoração, LBA, secreções brônquicas

e respiratórias, e ainda para o líquido pleural.

4.3. Testes de Identificação de Microrganismos

Após o isolamento dos microrganismos em culturas puras, procede-se à sua

identificação. No laboratório de Microbiologia são utilizados vários testes que auxiliam

este processo e que permitem fazer uma identificação presuntiva dos microrganismos em

estudo, com base nas características metabólicas e nutricionais desses microrganismos e

em reações antigénio-anticorpo (testes de aglutinação). Em seguida são apresentados

alguns dos principais testes de identificação presuntiva realizados no laboratório e que

foram observados e/ou realizados durante o estágio.

4.3.1. Provas Bioquímicas

Catalase

O teste da catalase é utilizado para distinguir dois géneros de bactérias Gram-

positivo, os Staphylococcus spp. (catalase positiva) e os Streptococcus spp. (catalase

negativa).

Esta prova baseia-se na deteção da presença da enzima catalase, que tem a

capacidade de converter o peróxido de hidrogénio em oxigénio e água. O procedimento

consiste em colocar uma gota de peróxido de hidrogénio numa lâmina e em seguida

transferir uma colónia isolada do meio de cultura para a lâmina. A reação positiva, que

indica a presença da catalase, é evidenciada pela rápida produção de bolhas de ar. (6)

Oxidase

O teste da oxidase permite detetar a presença da enzima citocromo oxidase, que

participa no transporte de eletrões de um dador para um aceitador (normalmente o

oxigénio). Esta prova é utilizada para a caracterização de bacilos Gram-negativo,

permitindo diferenciar microrganismos da família das Enterobacteriaceae (oxidase




negativa) de outros bacilos pertencentes aos géneros Pseudomonas spp. e Aeromonas spp.

(oxidase positiva).

Para a realização deste teste é utilizado o dihidrocloreto de tetrametil

p-fenilenodiamina (composto que atua como aceitador de eletrões), que é colocado num

disco fornecido com o kit, sobre o qual é seguidamente espalhada uma colónia isolada. Na

presença da enzima oxidase, este reagente sofre oxidação e origina um composto de cor

roxa. Na ausência de oxidase não ocorre mudança de cor, indicando uma reação

negativa.(6,8)

Urease

O teste da urease é útil na identificação de algumas espécies pertencentes à família

das Enterobacteriaceae, como o Proteus spp. (urease positiva), e também de outras

bactérias importantes como o Helicobacter pylori.

Esta prova permite detetar a presença da enzima urease, que tem a capacidade de

hidrolisar a ureia em amónia e CO2. Para este teste é utilizado o meio líquido ureia-indol

que tem na sua composição ureia e um indicador de pH (vermelho de fenol), no qual é

colocada uma colónia isolada. A produção de amónia alcaliniza o meio, dando origem a

uma mudança de cor do indicador de pH, de laranja para rosa, após incubação a 35-37°C

em atmosfera de aerobiose durante 24h. A ausência de alteração da cor do meio

corresponde a um resultado negativo, indicando assim a ausência da enzima urease. (6)

4.3.2. Testes de Aglutinação

Identificação Rápida de Staphylococcus aureus - SLIDEX® Staph Plus

O SLIDEX Staph Plus é um teste de aglutinação para a identificação de

Staphylococcus aureus. Neste teste são utilizadas partículas de látex sensibilizadas com

fibrinogénio humano e anticorpos monoclonais, para a deteção do fator de afinidade para

o fibrinogénio (clumping factor), da proteína A e de antigénios de superfície específicos de

S. aureus.

O procedimento consiste em colocar uma gota do reagente num dos círculos dos

cartões fornecidos com o kit, em seguida dissolver uma ou mais colónias e observar o

resultado 30 segundos após ligeira rotação. A observação de aglutinação significa que o

resultado é positivo, indicando assim a presença de Staphylococcus aureus.

Anteriormente era utilizada a prova da coagulase em tubo para diferenciar S. aureus

de outras espécies de Staphylococcus (coagulase negativa). Contudo, para a realização




desta prova são necessárias 4 a 24 horas de incubação, tendo por isso sido substituída pelo

teste rápido de aglutinação, embora em alguns casos possa ser utilizada uma vez que é o

método de referência. (9)

Deteção de Staphylococcus aureus Resistentes à Meticilina - SLIDEX® MRSA

Detection

O SLIDEX® MRSA Detection é um teste de aglutinação com partículas de látex

para a deteção de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), com base na

produção da proteína PBP2’. A resistência à meticilina é determinada pela aquisição de um

elemento genético móvel do qual faz parte o gene mecA, que codifica a PBP2’. Esta

proteína tem uma baixa afinidade para os antibióticos β-lactâmicos, nos quais se inclui a

meticilina, o que permite a sobrevivência do S. aureus quando exposto a estes antibióticos.

Neste teste, as partículas de látex encontram-se sensibilizadas com um anticorpo

monoclonal contra a PBP2’ e vão reagir de forma específica com os MRSA, observando-

se uma aglutinação que indica um resultado positivo. (7,9)

4.3.3. Teste de Sensibilidade à Optoquina

O teste de sensibilidade à optoquina permite fazer a identificação presuntiva de

Streptococcus pneumoniae, diferenciando-os de outros estreptococos α-hemolíticos,

nomeadamente os Streptococcus viridans. Este teste baseia-se no facto de o Streptococcus

pneumoniae ser sensível à optoquina, contrariamente aos restantes estreptococos α-

hemolíticos.

Para a realização desta prova é semeada uma gelose COS, com colónias isoladas

cuja morfologia seja sugestiva de S. pneumoniae. Em seguida é colocado um disco

impregnado com optoquina no centro da gelose e esta é incubada a 35°C em atmosfera com

5% CO2, durante 24h. Após a incubação, a presença de um halo de inbição de crescimento

à volta do disco, com um diâmetro igual ou superior a 14 mm ou 16 mm (dependendo do

tamanho do disco utilizado), permite fazer a identificação presuntiva de S.

pneumoniae.(6,7)

4.3.4. Teste da Necessidade dos Fatores X e V

O teste da necessidade dos fatores X e V é utilizado para diferenciar as espécies de

Haemophilus, com base na necessidade dos fatores de crescimento X e/ou V. As diferentes

espécies pertencentes ao género Haemophilus necessitam de componentes presentes no




sangue para poderem crescer nos meios de cultura, nomeadamente os fatores X e V.

Algumas espécies de Haemophilus necessitam apenas do fator X ou do fator V, enquanto

outras necessitam de ambos os fatores para se desenvolverem.

Nesta prova é preparada uma suspensão em NaCl a 0,85% das colónias sugestivas

de Haemophilus (isoladas em gelose de chocolate PVX ou HAE2), de 0,5 na escala de

McFarland. A suspensão é inoculada numa gelose MHE com uma zaragatoa, através da

técnica de espalhamento (distribuição uniforme da suspensão em toda a superfície da

gelose). Em seguida, são colocados os três discos (X, V e X+V) no meio de cultura, de

forma a ficarem o mais afastados possível, e este é incubado a 35°C em atmosfera com 5%

CO2, durante 24h. Após a incubação é feita a observação dos resultados: (6,7)

Crescimento à volta do disco com fator V e do disco X+V - bactéria

necessita apenas do fator V;

Crescimento à volta do disco com fator X e do disco X+V - bactéria requer

apenas o fator X;

Crescimento apenas à volta do disco X+V – bactéria necessita de ambos os

fatores em simultâneo.

Neste teste é ainda semeada uma gelose de chocolate PVX com a suspensão

preparada, de forma a verificar a pureza das colónias isoladas.

4.4. Identificação de Microrganismos - Sistema Automatizado

VITEK®2

A identificação definitiva dos microrganismos em estudo é realizada através do

sistema automatizado VITEK® 2. Este sistema é utilizado para a identificação de

microrganismos e para a realização dos TSA, através de cartas de teste (identificação e

antibiograma). Estas cartas têm vários poços, em que cada um contém um substrato

bioquímico (cartas de identificação) ou um agente antimicrobiano (cartas de antibiograma).

Este sistema é constituído por uma estação de carregamento das amostras

(VITEK®2 Smart Carrier Station™) e por um módulo principal onde é efetuada a

inoculação, incubação e leitura das cartas, que estão ligados através de um sistema

informático (figura 4).

Para a inoculação das cartas é necessário preparar uma suspensão a partir das

colónias que se pretende identificar e/ou para as quais se pretende realizar o antibiograma.




Esta suspensão é feita em 3 mL de NaCl a 0,50%, sendo a sua turvação ajustada a um

padrão da escala de McFarland, que varia consoante a carta de identificação utilizada. A

turvação da suspensão é medida através do dispositivo DensiCHEK™ (figura 4).

Após a preparação das suspensões, estas são colocadas na cassete Smart Carrier

Station, onde são associadas informaticamente às respetivas cartas de teste. Em seguida, a

cassete é colocada no módulo principal, onde é realizada a inoculação das suspensões nas

cartas (através de um sistema de vácuo), a incubação a 35,5°C ± 1°C, e por fim a leitura

dos resultados.

É também semeada uma gelose COS ou outro meio de cultura adequado ao

crescimento da estirpe em estudo, com a suspensão preparada, de forma a verificar a pureza

da mesma.

A tecnologia do VITEK 2 baseia-se na monitorização contínua do crescimento e da

atividade dos microrganismos em cada poço de teste, medidos através de um sistema ótico

de transmitância. A transmitância mede a intensidade da luz transmitida por um feixe que

atravessa uma solução que absorve luz a um determinado comprimento de onda. É realizada

uma leitura inicial da transmitância em cada poço e em seguida são efetuadas leituras com

intervalos de 15 minutos, até ao fim do tempo de incubação das cartas.

O sistema VITEK2 permite assim reduzir o tempo de resposta, que varia entre 2 e

18 horas. (9,10)

Para a identificação dos vários microrganismos, no Laboratório de Microbiologia

são utilizadas diferentes cartas de identificação (figura 5):

GP – Identificação de bactérias Gram-positivo (cocos e lactobacilos);

Figura 4 - Componentes do sistema VITEK®2




GN – Identificação de bactérias Gram-

negativo (bacilos);

YST – Identificação de leveduras;

NH – Identificação de bactérias fastidiosas

(Neisseria spp., Haemophilus spp., entre

outras);

ANC – Identificação de bactérias

anaeróbias

A identificação dos microrganismos é efetuada com base em ensaios colorimétricos,

nos quais ocorrem reações metabólicas que envolvem os substratos presentes nos diferentes

poços, originando produtos coloridos, que são depois medidos pelo sistema ótico. (9,10)

4.5. Testes de Suscetibilidade aos Antibióticos (TSA)

Após a identificação do microrganismo em estudo, é realizado TSA ou

antibiograma, que permite medir in vitro a suscetibilidade do microrganismo aos agentes

antimicrobianos, fornecendo informações essenciais para a escolha da terapêutica mais

adequada. Os TSA devem ser realizados para qualquer microrganismo responsável por um

processo infecioso e que necessite de terapêutica antimicrobiana, sempre que a

suscetibilidade aos antimicrobianos não puder ser previsível após a identificação do

microrganismo. (7,8)

Estes testes baseiam-se na determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI),

que corresponde à menor concentração de antibiótico que inibe o crescimento de um

microrganismo in vitro. O resultado dos antibiogramas é dado como sensível, resistente ou

intermédio. (7) A realização dos TSA e a interpretação dos resultados seguem as

recomendações do European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

(EUCAST) e também do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

No laboratório de Microbiologia, a determinação da suscetibilidade aos

antimicrobianos é realizada pelo método de microdiluição, através do sistema VITEK2, ou

por métodos manuais, nomeadamente o método de difusão em disco (Kirby-Bauer) e o

método de gradiente de difusão (Etest®). Os antibiogramas manuais são realizados para

microrganismos fastidiosos ou microrganismos que não possam ser testados através do

Figura 5 - Cartas de Identificação VITEK 2

Adaptado de: (9)




sistema VITEK2, e também quando os resultados obtidos com o equipamento VITEK2 não

são consistentes. (7)

Para além destes métodos manuais, no laboratório de Microbiologia são ainda

realizados outros testes manuais para a deteção de mecanismos de resistência, como a

deteção de β-lactamases de largo espetro (ESBL) e a deteção de resistência induzida à

clindamicina, entre outros.

Para todos os TSA é semeado um meio de cultura adequado ao crescimento do

microrganismo em estudo com a suspensão bacteriana preparada, para verificar a sua

pureza.

4.5.1. Método de Microdiluição – VITEK2

Tal como para os testes de identificação, nos TSA são também utilizadas cartas de

teste (AST). Estas cartas permitem ober resultados de TSA para vários microrganismos

clinicamente relevantes: cocos Gram-positivo, bacilos Gram-negativo e leveduras.

Os antibiogramas efetuados têm por base o princípio da turbidimetria, que é um

método ótico que mede a redução da intensidade de luz transmitida, devido ao efeito de

dispersão que resulta da interação de um feixe de luz com uma suspensão de partículas.

Após a incubação das cartas, são determinados os valores da CMI e a suscetibilidade

do microrganismo em relação a cada um dos antimicrobianos presentes nos poços da

carta.(7,9)

4.5.2. Métodos Manuais

Método de Difusão (Kirby-Bauer)

O método de difusão em disco, ou método de Kirby-Bauer, é utilizado para testar a

suscetibilidade das bactérias de crescimento rápido e de alguns microrganismos exigentes.

Neste método são utilizados discos impregnados com um determinado antibiótico, que são

colocados numa gelose MHE ou MHF, previamente inoculada com uma suspensão

padronizada (0,5 na escala de McFarland) do microrganismo a testar. A suspensão é

inoculada no meio de cultura com uma zaragatoa, através da técnica de espalhamento.

Após a aplicação dos discos, as geloses são incubadas a 35°C em aerobiose (as

geloses MHF são incubadas em atmosfera com 5% de CO2) durante 16 a 18 horas. Durante

o período de incubação, o antibiótico difunde-se radialmente e forma-se um halo de

inibição de crescimento, cujo diâmetro é inversamente proporcional à CMI. O diâmetro do




halo de inibição é medido (em milímetros) e os resultados são interpretados de acordo com

os critérios EUCAST e CLSI. (6,7)

Método de Gradiente de Difusão - Etest®

O método de gradiente de difusão (Etest®) combina o princípio do método de

Kirby-Bauer com o método de diluição. Neste método são utilizadas tiras de plástico com

um gradiente de concentrações do antibiótico, que permitem determinar a CMI.

A tira ou tiras Etest® que contêm o antibiótico de interesse são colocadas numa

gelose MHE ou MHF previamente inoculada com uma suspensão do microrganismo a

estudar. A preparação da suspensão e as condições de incubação das geloses são idênticas

ao método de Kirby-Bauer. Após a incubação, forma-se uma elipse que interseta a escala

de leitura da CMI (em µg/mL) na tira, onde a concentração do antibiótico testado inibe o

crescimento do microrganismo.

Este método permite complementar os TSA automatizados e os TSA realizados pelo

método de Kirby-Bauer, sendo útil para determinar a CMI de microrganismos fastidiosos

ou de crescimento lento, detetar baixos níveis de resistência e ainda detetar ou confirmar

mecanismos de resistência aos antimicrobianos. (8,9)

4.6. Processamento de Produtos Biológicos

Neste capítulo é abordado o processamento laboratorial de alguns dos produtos

biológicos mais frequentes no Laboratório de Microbiologia, no que diz respeito ao exame

cultural e ao exame microscópico. São também abordados alguns aspetos relevantes

relativos à colheita e transporte das amostras.

4.6.1. Urina

As infeções do trato urinário constituem uma das infeções bacterianas mais

frequentes no Homem. A infeção urinária é normalmente causada por bactérias da

microbiota intestinal saprófita, que invadem o trato urinário por via ascendente, através da

uretra.

Os agentes etiológicos mais comuns nas crianças e adultos sem outras doenças

associadas são as Enterobacteriaceae, principalmente a Escherichia coli. Já nos doentes

internados e com fatores de risco associados, existem outros agentes etiológicos que




poderão ser responsáveis pela infeção, como Pseudomonas spp, Staphylococcus aureus,

entre outros. (6,8)

As amostras de urina podem ser colhidas por micção (jato médio), sendo preferível

a primeira urina da manhã, por punção de cateter urinário (algália) ou por punção supra-

púbica, entre outras, devendo a colheita ser realizada após limpeza e desinfeção locais.

Após a triagem das amostras de urina, estas são semeadas (urocultura) nas geloses

COS e MAC, com uma ansa de 1 μL, através da técnica de sementeira por estrias. Como

referido anteriormente, esta técnica permite determinar o número de UFC por mililitro

(UFC/mL) na amostra. Após a inoculação das amostras, os meios de cultura são colocados

na estufa a 35°C com uma atmosfera de 5% de CO2, durante 24h.

No dia seguinte os meios de cultura são observados e é feita a contagem do número

de colónias, que é multiplicado por 103, obtendo-se assim o número de UFC/mL. De uma

maneira geral, um valor ≥105 UFC/mL é considerado positivo e significativo de infeção

urinária.

Nas culturas em que se observa um ou dois tipos de colónias predominantes (≥105

UFC/mL) é realizada a identificação (após reisolamento, quando necessário) e TSA do(s)

microrganismo(s) em questão. A presença de três ou mais tipos de colónias, sem

predomínio de um tipo de colónia, indica uma provável contaminação, sendo normalmente

pedida uma nova colheita. No entanto, a valorização dos resultados tem em conta uma série

de parâmetros como o método de colheita da urina, o tipo de doente e a sintomatologia,

entre outros. (7,8)

4.6.2. Sangue (Hemocultura)

O isolamento e deteção de microrganismos no sangue através de exame cultural

(hemocultura) é útil no diagnóstico de bacteriémia. Alguns dos microrganismos mais

frequentemente isolados a partir do sangue são: S. aureus, Staphylococcus coagulase-

negativa, Streptococcus pneumoniae, E. coli e Enterococcus spp., entre outros.

O sangue é um produto biológico estéril, pelo que o isolamento de um

microrganismo a partir de uma hemocultura é normalmente valorizado. No entanto, é

importante distinguir infeção de contaminação por microrganismos da microbiota cutânea,

com base no quadro clínico do doente e nos resultados das várias hemoculturas. Os

microrganismos da microbiota cutânea (Staphylococcus coagulase-negativa, Bacillus spp.,




entre outros) só são valorizados quando estão presentes em mais do que uma série de

hemoculturas. (6,8)

O sangue é colhido em frascos específicos que contêm um meio líquido, os frascos

de cultura BacT/ALERT®, que após a triagem são colocados no equipamento

BacT/ALERT® 3D. No laboratório de Microbiologia são recebidos frascos para a deteção

de microrganismos aeróbios (tampa verde), de microrganismos anaeróbios (tampa laranja)

e frascos pediátricos (tampa amarela) para a deteção de microrganismos aeróbios e

anaeróbios facultativos, representados na figura 6.

O BacT/ALERT® 3D (figura 7) é um sistema automático de deteção microbiana,

utilizado para determinar a presença de microrganismos em amostras de sangue e outros

líquidos biológicos. É composto por um módulo de controlo e por um ou mais módulos de

incubação, que permitem a incubação (cerca de 35°C), agitação e monitorização contínuas

dos frascos de cultura.

Este sistema utiliza um sensor colorimétrico e a reflexão da luz para detetar o

crescimento de microrganismos. A presença de microrganismos na amostra em estudo

resulta na produção de CO2, uma vez que estes metabolizam os substratos existentes no

meio de cultura. Os frascos de cultura, para além do meio de cultura líquido, contêm um

sensor colorimétrico no fundo, que muda de cinzento para amarelo devido à alteração do

pH resultante da produção de CO2. O equipamento monitoriza os frascos de cultura e faz a

leitura da refletância de 10 em 10 minutos.

Caso seja detetado crescimento de microrganismos, o sistema emite um alarme

sonoro e visual, para que o ou os frascos em questão sejam retirados do equipamento. Se

Figura 6 - Frascos de cultura BacT/ALERT®




após cinco dias de incubação não for detetado crescimento de microrganismos, os frascos

de cultura são retirados do equipamento e o resultado é dado como negativo. (9)

Se o equipamento detetar uma hemocultura positiva, é em seguida realizada a

passagem para meios sólidos (subcultura), nomeadamente os meios COS e MAC. Estes são

incubados a 35°C com uma atmosfera de 5% de CO2, durante 48h. Para além das

subculturas, é também realizado um esfregaço para coloração de Gram, que vai permitir

fazer a identificação presuntiva do microrganismo, com base nas suas características

mofológicas e tinturiais.

Após o fim da incubação dos meios sólidos, estes são observados e é feita a

interpretação dos resultados. Para os microrganismos valorizados, é efetuada a

identificação e o antibiograma.

4.6.3. Expetoração

As infeções do trato respiratório inferior constituem uma das principais causas de

morbilidade e mortalidade a nível mundial, sendo que alguns dos agentes bacterianos mais

comuns nestas infeções são: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae,

Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa e Acinetobacter baumannii.

As amostras do aparelho respiratório inferior recebidas no laboratório de

Microbiologia são a expetoração, lavado broncoalveolar (LBA), secreções respiratórias

(aspirado traqueal) e brônquicas (fibroscopia), sendo que a expetoração é a amostra mais

frequente, uma vez que é obtida facilmente e de forma não invasiva.

O trato respiratório inferior é normalmente estéril, no entanto o diagnóstico das

infeções respiratórias inferiores é muitas vezes dificultado pela contaminação das amostras

pela microbiota comensal da orofaringe, durante a colheita. Assim, é importante verificar

Figura 7 - Sistema BacT/ALERT® 3D




a qualidade das amostras, sendo que apenas as de boa qualidade devem ser processadas.

(6–8)

Desta forma, após a triagem das amostras de expetoração é realizado um screening

para avaliar a qualidade destas, que consiste na preparação de um esfregaço que é

posteriormente corado pelo método de Gram. O esfregaço é efetuado através da técnica de

estiramento ou esmagamento entre duas lâminas, sendo selecionada a porção mais

purulenta ou hemática da amostra.

Depois de corada, a lâmina é observada ao microscópio com a objetiva de 10x e é

feita uma avaliação semiquantitativa do número de células epiteliais pavimentosas e de

leucócitos, bem como a avaliação das características morfológicas e tinturiais dos

microrganismos predominantes. De acordo com os critérios seguidos, uma boa amostra

apresenta menos de 10 células epiteliais por campo. Um número de células inferior a 10,

em conjunto com a presença de 25 ou mais leucócitos é indicador de uma ótima amostra.

Caso as amostras apresentem 10 ou mais células epiteliais pavimentosas por campo, não

cumprindo assim o critério de qualidade, o exame microbiológico não prosseguirá, com

exceção dos casos em que é feita a pesquisa de Legionella spp. e Mycobacterium spp. (6,8)

Para além da coloração de Gram, é também realizado outro esfregaço que é corado

pelo método de Ziehl-Neelsen, para a pesquisa de BAAR.

Se a amostra for boa é em seguida realizado o exame cultural, em que a amostra de

expetoração é inoculada nos meios COS, MAC e HAE2. Estes são incubados a 35°C com

uma atmosfera de 5% de CO2, durante 48h. Após 24h de incubação as geloses são

observadas e, caso não haja crescimento de microrganismos, estas são incubadas mais 24h

e depois novamente observadas. Os microrganismos que se desenvolvem para além do 2º

quadrante da sementeira são valorizados de acordo com a informação clínica e com o Gram,

sendo em seguida realizada a sua identificação e o TSA.

4.6.4. Fezes

As infeções do trato gastrointestinal estão na origem da maioria dos episódios de

diarreia aguda, apresentando uma elevada incidência na população em geral. O trato

gastrointestinal possui uma microbiota vasta e diversa, constituída principalmente por

Enterobacteriaceae e microrganismos anaeróbios. (8,11)




No laboratório de Microbiologia, por rotina é feita a pesquisa e identificação de

Salmonella spp., Shigella spp. e Campylobacter jejuni/coli. Em situações clínicas especiais

poderá ser feita a pesquisa de Yersinia enterocolytica e Escherichia coli O157.

A pesquisa de Clostridium difficile só é efetuada quando solicitada pelo clínico,

sendo realizada através de um teste rápido (CerTest Clostridium difficile GDH+Toxin

A+B) que consiste num imunoensaio cromatográfico, para a deteção da enzima glutamato

desidrogenase (GDH) e das toxinas A e B do C. difficile. (12)

Relativamente à colheita das amostras, geralmente é aconselhada a colheita até um

total de 3 amostras em dias diferentes, no entanto nos casos agudos uma amostra é

normalmente suficiente. Após a colheita, as fezes devem ser colocadas num meio de

transporte (Cary-Blair), que permite manter a viabilidade dos patogéneos entéricos, e

enviadas para o laboratório. (6,8)

Após serem triadas, as amostras são inoculadas nos meios de cultura MAC e HEKT

e no meio líquido de selenito. É também efetuado um teste rápido para a deteção qualitativa

de Campylobacter spp. (CAMPYLOBACTER SPECIES Ag CARD), que consiste num

imunoensaio cromatográfico em que são utilizados anticorpos monoclonais anti-

Campylobacter. (13) Caso o resultado do teste seja positivo, a amostra de fezes é também

semeada na gelose Campylosel.

Os meios de cultura são incubados a 35°C com uma atmosfera de 5% de CO2,

durante 24h. Quando é semeado o meio Campylosel, este é incubado a 42°C em atmosfera

de microaerofilia, durante 72h.

Após as 24h de incubação, é observado o crescimento nos meios de cultura e a partir

do meio líquido de selenito é feita a passagem para os meios MAC e HEKT, que são

incubados nas mesmas condições dos outros meios e posteriormente observados. Para os

microrganismos valorizados, é efetuada a identificação e TSA.

4.6.5. Exsudado Vaginal/Retal – Pesquisa de Streptococcus agalactiae

O Streptococcus β-hemolítico do grupo B (SGB), ou Streptococcus agalactiae, é o

agente mais frequente de infeção bacteriana perinatal. Este microrganismo coloniza

habitualmente o trato gastrointestinal e o trato geniturinário, sendo que cerca de 10-30%

das mulheres grávidas são portadoras de S. agalactiae. Na mulher grávida, o S. agalactiae

pode causar infeção do trato urinário, endometrite e bacteriémia, enquanto no recém-

nascido pode ser responsável por septicémia, pneumonia e meningite. (5,14)




Atualmente, de acordo com a norma da DGS, está indicado o rastreio do SGB em

todas as grávidas entre as 35 e 37 semanas de gestação, com exceção daquelas a quem foi

isolado SGB na urina durante a gestação em curso, e naquelas com história anterior de

sépsis neonatal por SGB. (15) Para a realização do rastreio é colhida uma amostra de

exsudado vaginal e retal (zaragatoa do 1/3 externo da vagina e ano-retal) que é colocada no

meio de transporte de Amies/Stuart, embora possam também ser utilizadas duas zaragatoas

(uma para cada local) que são colocadas juntamente no mesmo meio de transporte. Os

meios de transporte de Amies/Stuart são meios não nutritivos que permitem manter a

viabilidade dos microrganismos, sem que haja uma multiplicação significativa. (6,14,15)

Para o exame cultural é utilizado o meio de Granada, que é inoculado com a

zaragatoa (se forem duas zaragatoas estas são processadas simultaneamente, como se

fossem uma só), sendo que o inóculo inicial é depois espalhado com uma ansa de 10μL. É

também inoculado o meio líquido de Todd-Hewitt, sendo que a zaragatoa (ou zaragatoas)

é deixada no meio líquido. Os meios são incubados a 35°C com uma atmosfera de 5% de

CO2, durante 24h. Terminado o tempo de incubação, é efetuada a passagem do meio líquido

para uma gelose Granada, que é incubada em atmosfera de anaerobiose durante 24-48h.

Após 24h a gelose é observada e, se não existir crescimento de microrganismos, a

incubação é prolongada por mais 24h, sendo depois observada novamente. Caso sejam

observadas colónias suspeitas (de cor laranja), é feito o reisolamento para uma gelose COS,

para posterior identificação e TSA.


VIII MAC Imunologia


5. Imunologia

No laboratório de Imunologia, é realizado um conjunto de procedimentos e estudos

que permitem fazer o diagnóstico e monitorização de doenças associadas ao sistema

imunitário através de várias metodologias, maioritariamente baseadas em reações

antigénio-anticorpo. O laboratório encontra-se dividido em três áreas funcionais:

Imunoquímica - onde é efetuado o doseamento e estudo de proteínas através

da técnicas de nefelometria, eletroforese e imunofixação, bem como a

pesquisa de crioglobulinas (técnica manual);

Alergologia;

Autoimunidade.

As amostras utilizadas para as várias determinações e estudos no laboratório de

Imunologia são: soro, urina, LCR e fezes (para a determinação da calprotectina).

5.1. Proteínas

5.1.1. Nefelometria

A nefelometria é um método utilizado na determinação imunoquímica da

concentração de proteínas do soro, urina e outros líquidos biológicos. Este método baseia-

se na medição da dispersão de luz que ocorre devido à presença de imunocomplexos em

solução, resultantes da interação entre os antigénios da amostra e o anti-soro (anticorpos)

correspondente. A distribuição da luz dispersa depende da relação entre o tamanho das

partículas dos imunocomplexos e o comprimento de onda do feixe de luz que incide sobre

a amostra. A luz dispersa é medida por um fotodetetor, a um determinado ângulo em relação

ao feixe de luz. A um nível constante de anticorpos, a intensidade da luz dispersa é

proporcional à concentração de antigénios

(proteínas). (1,16)

No laboratório de Imunologia, o

doseamento de proteínas por nefelometria

é realizado no nefelómetro BN ProSpec,

em amostras de soro, urina ou LCR. O BN

ProSpec (figura 8) é um equipamento Figura 8 - Equipamento BN ProSpec


VIII MAC Imunologia


automático em que a fonte de luz utilizada emite a um comprimento de onda de 840 nm (±

25 nm), e a intensidade da luz dispersa é medida a um ângulo de 13° a 24°. (17)

5.1.1.1. Proteínas Doseadas

Albumina

A albumina é a proteína mais abundante no plasma e a sua síntese ocorre no fígado.

As suas principais funções são a manutenção da pressão oncótica intravascular e a ligação

e transporte de diversos ligandos (cálcio, magnésio, entre outros).

Concentrações séricas diminuídas de albumina (hipoalbuminémia) podem resultar

de uma síntese hepática diminuída (doença hepática, má nutrição, má absorção), bem como

da perda de proteínas na urina, fezes ou através da pele (queimaduras graves). (1,16)

Proteínas do Complemento (C3c e C4)

O complemento é um sistema complexo de proteínas que consititui um dos

mecanismos inatos de defesa do organismo contra microrganismos e outros agentes

externos. As proteínas do complemento são sintetizadas no fígado e circulam na forma

inativa.

A ativação do sistema do complemento está associada ao consumo de C3 e C4. A

diminuição da concentração sérica destas proteínas observa-se principalmente no Lúpus

Eritematoso Sistémico (LES) e em formas de glomerulonefrite membranoproliferativa.

Valores aumentados de C3 e C4 podem ocorrer em doenças inflamatórias, uma vez que

ambas são proteínas de fase aguda. (1,16)

Imunoglobulinas

As imunoglobulinas (Igs) são proteínas produzidas pelos plasmócitos e constituem

as moléculas efetoras da resposta imunitária humoral. São compostas por duas cadeias

pesadas idênticas (γ, α, μ, δ, ε) e duas cadeias leves idênticas (κ, λ), ligadas entre si. A

cadeia pesada define o tipo de imunoglobulina, existindo 5 classes: IgG, IgA, IgM, IgD e

IgE.

No laboratório de Imunologia é efetuado o doseamento de IgG, IgA, IgM e IgE no

soro. A diminuição da concentração sérica das imunoglobulinas ocorre nas

imunodeficiências primárias e nas secundárias a tumores malignos ou infeções. O aumento

dos níveis de imunoglobulinas pode ocorrer de forma policlonal (doenças hepáticas,


VIII MAC Imunologia


infeções agudas e crónicas, doenças autoimunes) ou de forma monoclonal (Mieloma

Múltiplo, Macroglobulinemia de Waldënstrom, plasmocitoma, entre outros). (1,18)

A IgE está associada às reações de hipersensibilidade imediata, pelo que o seu

doseamento pode ser útil no diagnóstico de doenças alérgicas. Contudo, níveis aumentados

de IgE não estão apenas relacionados com doenças alérgicas, ocorrendo também em

infeções parasitárias e noutras doenças inflamatórias.(18)

Cadeias Leves e Cadeias Leves Livres κ e λ

As cadeias leves são normalmente produzidas em excesso relativamente às cadeias

pesadas, pelo que uma pequena quantidade é libertada na circulação como cadeias leves

livres (CLL). Nos indivíduos saudáveis, a maioria das cadeias leves existe na forma ligada

das Igs completas e só uma pequena parte como CLL, que são filtradas pelo rim.

A concentração sérica das cadeias leves é determinada pela concentração das Igs

completas. O aumento ou diminuição das cadeias leves pode ser devido a proliferação

monoclonal ou policlonal, ou à diminuição das Igs intactas, respetivamente. Enquanto as

Igs policlonais apresentam as cadeias κ e λ numa proporção de 2:1, as Igs monoclonais

apresentam apenas um tipo de cadeia (κ ou λ). Desta forma, o aumento da produção de Igs

monoclonais leva à alteração do quociente κ/λ, que quando se encontra fora dos valores de

referência indica a existência de uma gamapatia monoclonal. Nas gamapatias monoclonais

ocorre um aumento da produção de uma Ig específica e da respetiva CLL envolvida. Assim,

uma das CLL estará elevada e, consequentemente, a razão κ/λ de CLL estará aumentada ou

diminuída em relação ao intervalo de referência. (1,16)

No laboratório de Imunologia é feito o doseamento das cadeias leves κ e λ e das

CLL κ e λ no soro.

β2-Microglobulina

A β2-Microglobulina é um componente do MHC e está presente em todas a células

nucleadas. Devido ao seu baixo peso molecular é filtrada pelos rins, sendo depois

reabsorvida e metabolizada nos túbulos proximais. Níveis aumentados de β2-

Microglobulina no soro podem ocorrer em doenças inflamatórias (artrite reumatoide, LES),

HIV, mieloma múltiplo (MM), ou devido a lesão renal. A β2-Microglobulina sérica é um

marcador sensível da capacidade de filtração glomerular e um bom marcador de

prognóstico no MM. (16,18)


VIII MAC Imunologia


O doseamento de β2-Microglobulina na urina é útil no diagnóstico e monitorização

de lesão tubular renal, uma vez que concentrações elevadas estão associadas à presença

destas lesões. (16,18)

Fator Reumatoide

O fator reumatoide (FR) é um anticorpo dirigido contra a região Fc da IgG. A

deteção do FR faz parte dos critérios para o diagnóstico da Artrite Reumatoide (AR), uma

vez que a maioria dos doentes apresenta este anticorpo. Contudo, o FR não é específico da

AR, podendo também ser detetado noutras doenças inflamatórias sistémicas e em infeções

crónicas. (1)

α1-Antitripsina

A α1-Antitripsina (AAT) é uma glicoproteína sintetizada no fígado, cuja principal

função é a inibição da elastase libertada pelos neutrófilos.

Concentrações diminuídas de AAT no soro podem ser causadas por deficiências

genéticas desta glicoproteína. A deficiência de AAT está associada a um risco elevado de

desenvolver doença pulmonar (enfisema) e hepática. Níveis aumentados de AAT são

encontrados em reações inflamatórias, uma vez que esta é uma proteína de fase

aguda.(1,18)

Ceruloplasmina

A ceruloplasmina é uma glicoproteína produzida no fígado, que contém a maior

parte do cobre presente no plasma. A sua principal função é catalisar reações de oxidação-

redução. É uma proteína de fase aguda, pelo que a sua concentração sérica está aumentada

em infeções e processos inflamatórios. A diminuição da concentração da ceruloplasmina

verifica-se em situações de má nutrição ou má absorção de cobre, doença hepática grave,

doença de Wilson, entre outras. (1,18)

Título de Anticorpos Anti-estreptolisina O (TASO)

A estreptolisina O é uma enzima antigénica produzida pelo Streptococcus pyogenes.

Esta enzima provoca a lise dos eritrócitos, sendo responsável pela hemólise produzida nos

meios de cultura (agar de sangue). A determinação do TASO é útil no diagnóstico de febre

reumática e de glomerulonefrite aguda resultantes de uma infeção por Streptococcus

pyogenes. (1)


VIII MAC Imunologia


5.1.2. Eletroforese de Proteínas Séricas

A eletroforese de proteínas séricas é uma técnica que permite separar as proteínas

com base na diferença de mobilidade destas, quando submetidas a um campo elétrico. A

mobilidade eletroforética das proteínas depende fundamentalmente da sua carga e tamanho.

No laboratório de Imunologia, a separação das proteínas séricas é efetuada por

eletroforese capilar (EC). Na EC, a separação das proteínas é realizada em meio líquido

(tampão com pH alcalino) através de um capilar de pequeno diâmetro que é exposto a uma

alta voltagem. Quando a alta voltagem é aplicada, é gerado um fluxo eletroosmótico, no

qual as moléculas do tampão carregadas positivamente migram em direção ao cátodo (pólo

negativo). As proteínas presentes no soro têm carga negativa, pelo que quando a amostra é

injetada no capilar, estas apresentam uma mobilidade eletroforética na direção do ânodo

(pólo positivo). No entanto, o fluxo eletroosmótico é mais forte que a mobilidade

eletroforética das proteínas, pelo que estas vão migrar também na direção do cátodo, no

qual se encontra um detetor de luz UV/visível que mede a absorvância das proteínas,

permitindo a sua identificação e quantificação. (16,18,19)

No laboratório de Imunologia, as eletroforeses de proteínas séricas são executadas

no V8 E-Class (figura 9), um equipamento automático que permite também realizar

eletroforeses em amostras de urina, e ainda a técnica de imunosubtração.

A EC permite obter um perfil eletroforético no qual se distinguem 6 frações

proteicas (figura 10): albumina, α1-globulinas, α2-globulinas, β1-globulinas, β2-globulinas

e γ-globulinas. As diferentes frações podem ser constituídas por uma ou mais proteínas,

representadas na tabela 2.

Figura 9 - Equipamento V8 E-Class


VIII MAC Imunologia


Tabela 2 - Frações proteicas e respetivas proteínas constituintes (16,19)

A eletroforese de proteínas séricas permite assim detetar e avaliar alterações

qualitativas e quantitativas das várias frações proteicas, sendo que os resultados obtidos

para cada fração são expressos em g/L (concentração) e em percentagem (%).

Atualmente, a principal aplicação da eletroforese de proteínas séricas é a deteção e

monitorização de gamapatias monoclonais. As gamapatias monoclonais são um grupo de

doenças associadas à proliferação de um único clone de plasmócitos, que se caracterizam

pela produção de imunoglobulinas (intactas ou fragmentos) monoclonais, de estrutura

idêntica. Estas patologias podem ser malignas (como o Mieloma Múltiplo) ou podem

corresponder a uma situação benigna (como o MGUS). A presença de imunoglobulinas

Fração Proteínas

Albumina Albumina

α1

α1-antitripsina

α1-glicoproteína ácida

α1-fetoproteína

α2

α2-macroglobulina

Haptoglobina

Ceruloplasmina

β1 Transferrina

Hemopexina

β2

Proteínas do Complemento (C3 e C4)

β2-microglobulina

Subpopulações de IgA

γ Imunoblogulinas (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)

PCR

Figura 10 - Perfil eletroforético normal de proteínas séricas

Adaptado de: Sebia. 2015 - http://www.sebia.com/en-EN/produits/capi-3-proteine-6


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monoclonais é detetada através da visualização de um “pico” (banda estreita e homogénea),

geralmente na fração γ, mas que pode também surgir nas frações β ou α. (16,20)

5.1.3. Imunofixação

A imunofixação é uma técnica que permite detetar e identificar as imunoglobulinas

monoclonais detetadas na eletroforese de proteínas séricas, podendo ser realizada em

amostras de soro e urina.

Esta técnica baseia-se na separação das proteínas por eletroforese em gel de agarose,

seguida de uma imunoprecipitação com antissoros de especificidades diferentes. Após a

eletroforese são aplicados os diferentes antissoros nas pistas de migração, que precipitam

os antigénios correspondentes, e um fixador, que é aplicado na pista de referência e que

precipita todas as proteínas. As proteínas não precipitadas são removidas do gel por

lavagem e absorção com papel de filtro, enquanto as proteínas precipitadas ficam retidas

na matriz do gel. Por fim, as proteínas precipitadas são coradas e a interpretação é feita

através da observação das bandas coradas. (20,21)

No laboratório de Imunologia, as imunofixações são realizadas no Hydrasis

Focusing (figura 11), um equipamento semi-automático destinado à execução de

eletroforeses em gel de agarose. Neste equipamento, a aplicação da amostra, migração

electroforética, incubação com os reagentes, secagem, lavagem e coloração são feitas

automaticamente, sendo apenas necessário preparar as amostras e o gel, e aplicar os

reagentes manualmente.

Nas imunofixações em amostras de soro é necessário fazer uma diluição das

amostras, de forma a evitar fenómenos de zona por excesso de antigénio. Os antissoros

utilizados são anti-cadeias pesadas γ (IgG), α (IgA) e μ (IgM), e anti-cadeias leves κ e λ

Figura 11 - Equipamento Hydrasys Focusing


VIII MAC Imunologia


(livres e ligadas). Desta forma, as amostras são testadas simultaneamente em seis pistas: a

pista ELP que serve como referência, mostrando o perfil eletroforético das proteínas da

amostra, e as restantes cinco pistas, que permitem a caracterização das bandas monoclonais

devido aos antissoros específicos (figura 12). As proteínas precipitadas são coradas pelo

violeta ácido.

Uma amostra de soro normal irá apresentar uma zona corada difusa de

imunoglobulinas policlonais em todas as pistas. A presença de uma imunoglobulina

monoclonal é caracterizada pela visualização de uma banda estreita e bem visível, detetada

com um dos antissoros anti-cadeias pesadas (γ, α ou μ) e com um dos antissoros anti-

cadeias leves (κ ou λ). Caso ocorra reação com um dos antissoros anti-cadeias leves, mas

não com um dos antissoros anti-cadeias pesadas, podemos estar perante a presença de uma

CLL ou de uma gamapatia a IgD ou IgE (que deve ser confirmada com os antissoros anti-

cadeias pesadas δ e ε). (21)

5.1.3.1. Pesquisa da Proteína de Bence Jones

As proteínas de Bence Jones correspondem às CLL excretadas na urina. Como

referido anteriormente, as CLL são filtradas pelo rim, sendo depois reabsorvidas nos

túbulos renais. No entanto, nas gamapatias monoclonais, os plasmócitos monoclonais

poderão libertar quantidades elevadas de CLL, excedendo a capacidade de reabsorção

tubular e levando à excreção destas na urina. A deteção destas proteínas constitui, assim,

uma indicação importante da presença de uma gamapatia monoclonal, sendo utilizada no

diagnóstico e na monitorização da doença. (1)

Figura 12 - Imunofixação em amostras de soro

Adaptado de: Sebia. 2015 http://www.sebia.com/en-EN/produits/hydragel-if


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A deteção e identificação das proteínas de Bence Jones é realizada por

imunofixação em amostras de urina (1ª da manhã) concentradas (antes de realizar a

imunofixação são centrifugadas, colocadas num tubo concentrador que contém um filtro e

depois novamente centrifugadas). Os antissoros utilizados são: antissoro trivalente (anti-

cadeias pesadas γ, α e μ), anti-cadeias leves κ e λ (livres e ligadas), e anti-cadeias leves

livres κ e λ. As amostras são assim testadas simultaneamente em seis pistas: a pista de

referência ELP e as restantes cinco pistas, que permitem a caracterização das bandas

monoclonais devido aos antissoros específicos.

A deteção das proteínas de Bence Jones é feita através da observação de uma banda

monoclonal detetada com um dos antisoros anti-cadeias leves (livres e ligadas) κ ou λ, de

uma banda monoclonal (ao mesmo nivel da anterior) detetada com um dos antisoros anti-

CLL κ ou λ, e da ausência de banda na pista do antisoro trivalente. (22)

5.2. Alergologia

As alergias consistem em reações do sistema imunitário a antigénios ambientais

denominados alergénios, sendo mediadas por anticorpos IgE. No estudo das doenças

alérgicas é realizada a deteção quantitativa de IgE específicas para determinados

alergénios, o que permite avaliar a sensibilização a esses mesmos alergénios. (1,23)

No laboratório de Imunologia, o doseamento das IgE específicas é realizado no

equipamento Phadia 100 (figura 13), em amostras de soro. Este é um equipamento

automático destinado à realização de testes de alergia (testes ImmunoCAP) e de

autoimunidade. O Phadia 100 utiliza a técnica EliA (Enzyme-linked imunoassay), que

consiste num imunoensaio fluoroenzimático do tipo sandwich. Neste imunoensaio os

antigénios estão imobilizados numa fase sólida, que consiste num derivado de celulose

fechado numa cápsula. O alergénio liga-se à IgE específica na amostra do doente formando

imunocomplexos e, após a lavagem da IgE não específica, são adicionados anticorpos anti-

IgE marcados por uma enzima, que se vão ligar aos imunocomplexos formados. Em

seguida, é feita uma nova lavagem que remove os anticorpos anti-IgE não ligados e é

adicionado o substrato. Após a paragem da reação é medida a fluorescência emitida (a

enzima transforma o substrato num produto fluorescente), sendo que esta é diretamente

proporcional à concentração de IgE específica presente na amostra. (23)


VIII MAC Imunologia


O rastreio inicial da doença alérgica abrange todos os indivíduos (crianças, jovens

e adultos) que apresentem manifestações clínicas suspeitas de patologia alérgica. (15) No

laboratório de Imunologia, este screening é feito através do doseamento de IgE específica

para uma mistura de alergénios inalantes (Phadiatop) e/ou alimentares (Phadiatop

alimentar) de diferentes grupos, num único teste. Estes testes permitem distinguir os

doentes atópicos (predisposição genética para a produção de IgE específicas após exposição

a alergénios) dos não atópicos. (23,24)

Nos indivíduos adultos é realizado o Phadiatop, que permite avaliar a sensibilização

a alergénios inalantes, entre os quais os ácaros, gramíneas, ervas daninhas, árvores, fungos

e o pelo de animais. Se o resultado for positivo, em seguida é feito o doseamento isolado

de determinadas IgE específicas, de acordo com perfis definidos e com os pedidos do

clínico, de forma a identificar o alergénio potencialmente responsável pela reação alérgica.

Nas crianças, para além do Phadiatop é também feito o Phadiatop alimentar, uma

vez que a sensibilização alérgica está maioritariamente relacionada com alergénios

alimentares, particularmente nas crianças dos 0 aos 3 anos. O Phadiatop alimentar inclui 6

alergénios: clara de ovo, leite de vaca, bacalhau, amendoim, soja e trigo. Caso o resultado

do Phadiatop alimentar seja positivo, em seguida é feito o doseamento das IgE específicas

para estes 6 alergénios isoladamente, de forma a detetar o alergénio possivelmente

responsável. Nos adultos, a determinação de IgE específicas para alergénios alimentares só

é feita se houver uma suspeita específica.

O diagnóstico das doenças alérgicas é feito predominantemente pela história clínica,

sendo que os testes para as IgE específicas e/ou os testes cutâneos permitem fazer a sua

confirmação. (1,15)

Figura 13 - Equipamento Phadia 100


VIII MAC Imunologia


5.3. Autoimunidade

A autoimunidade consiste na resposta do sistema imunitário contra antigénios do

próprio organismo, resultante de uma falha nos mecanismos de tolerância. As doenças

autoimunes (DAI) caracterizam-se pela produção de autoanticorpos e pela presença de

linfócitos T autorreativos, que provocam danos a nível celular, dos tecidos ou dos órgãos.

Estas doenças são classificadas em específicas de órgão ou sistémicas. (1,25)

A deteção de autoanticorpos no soro é muito útil para o diagnóstico das doenças

autoimunes, sendo que alguns destes autoanticorpos constituem marcadores específicos de

determinadas doenças. No laboratório de Imunologia, a deteção serológica de

autoanticorpos é efetuada por imunofluorescência indireta, quimioluminescência, ELISA e

Immunoblot.

Neste capítulo serão descritas, de forma resumida, as técnicas utilizadas no

laboratório de Imunologia para a pesquisa de autoanticorpos, sendo principalmente

abordada a pequisa de anticorpos antinucleares (ANA).

5.3.1. Imunofluorescência Indireta

A imunofluorescência indireta (IFI) é a técnica utilizada para o screening inicial de

autoanticorpos no soro, nomeadamente para a pesquisa dos ANA. Nesta técnica são

utilizados substratos (células ou tecidos de animais) fixados em lâminas. O soro do doente

(após diluição) é adicionado e os autoanticorpos presentes ligam-se aos antigénios do

substrato. Após uma lavagem, são adicionados anticorpos marcados com um fluorocromo,

que vão reagir com os anticorpos ligados. As lâminas são observadas num microscópio de

fluorescência e os resultados baseiam-se na intensidade

da fluorescência e no padrão observado. Alguns destes

padrões estão associados a determinados

autoanticorpos, o que permite direcionar o estudo no que

diz respeito à pesquisa de autoanticorpos

específicos.(1,26)

No laboratório de Imunologia, a pesquisa de

autoanticorpos por IFI é realizada no equipamento Zenit

SP (figura 14). Este é um equipamento automático

concebido para o processamento de lâminas por IFI, e

Figura 14 - Equipamento Zenit SP


VIII MAC Imunologia


de microplacas por ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). (27)

A técnica de IFI tem como vantagens a sua elevada sensibilidade e o facto de

permitir detetar simultaneamente anticorpos dirigidos contra diferentes antigénios, num

único substrato. Existem diversos tipos de substrato e a sua escolha depende do tipo de

anticorpos que se pretende pesquisar. No laboratório de Imunologia são utilizados vários

substratos, como o substrato de células HEp-2 (pesquisa de ANA), substrato triplo (fígado,

rim e estômago de rato - pesquisa de AMA, ASMA, anti-LKM e APCA), neutrófilos

(pesquisa de ANCA), entre outros.

5.3.1.1. Anticorpos Antinucleares (ANA)

Os ANA são um grupo heterogéneo de autoanticorpos dirigidos contra vários

componentes do núcleo celular (DNA, histonas, proteínas não histónicas, nucléolo,

centrómero, entre outros) ou do citoplasma.

A deteção de ANA tem grande importância no diagnóstico laboratorial de doenças

autoimunes sistémicas, entre as quais LES, síndrome de Sjögren (SS), dermatomiosite,

polimiosite, AR e doença mista do tecido conjuntivo (DMTC). Assim, perante a suspeita

de uma patologia autoimune sistémica, a pesquisa de ANA é o primeiro teste efetuado.

(1,28)

A técnica utilizada para a pesquisa de ANA é a IFI em substrato de células HEp-2.

As HEp-2 são células epiteliais humanas, que possuem estruturas intracelulares grandes, o

que permite uma melhor visualização e

reconhecimento das várias estruturas. Os

padrões de fluorescência obtidos estão

associados à presença de diferentes ANA,

o que permite estabelecer uma correlação

com determinadas patologias autoimunes

sistémicas. Os vários padrões de

fluorescência estão divididos em três

grupos: nucleares (figura 15),

citoplasmáticos e mitóticos. (29,30)

Contudo, os padrões obtidos são meramente indicativos, uma vez que não permitem

identificar definitivamente a especificidade dos autoanticorpos presentes. Assim, a

identificação dos ANA específicos presentes numa amostra deve ser feita através de outras

Figura 15 - Exemplos de padrões nucleares em células

HEp-2

Adaptado de: (29)


VIII MAC Imunologia


técnicas. No laboratório de Imunologia é utilizada a quimioluminescência, sendo feita a

pesquisa dos autoanticorpos mais comuns e com maior significado clínico: os anti-ENA

(antigénios nucleares extraíveis) e os anti-dsDNA (DNA de cadeia dupla). (1,28)

5.3.2. Quimioluminescência

A deteção dos autoanticorpos anti-ENA (anti-SS-A/Ro, anti-SS-B/La, anti-Sm,

anti-RNP, anti-Scl70 e anti-Jo1) e anti-dsDNA é efetuada no equipamento automático Zenit

RA (figura 16), através de um imunoensaio por quimioluminescência.

A quimioluminescência

corresponde à emissão de luz como

resultado de uma reação química onde

ocorre a oxidação de um composto

orgânico. Neste imunoensaio, são

utilizadas partículas magnéticas (fase

sólida) revestidas com o antigénio

específico em estudo. No primeiro

passo, os autoanticorpos específicos presentes na amostra de soro ligam-se aos antigénios

da fase sólida. Após uma lavagem, são adicionados anticorpos marcados com éster dimetil

de acridina (DMAE), que se vão ligar aos imunocomplexos formados. Após nova lavagem,

são adicionadas soluções que levam à oxidação do DMAE, o que resulta na emissão de luz.

O sinal luminoso gerado é medido, sendo diretamente proporcional à concentração dos

autoanticorpos presentes na amostra. (31,32)

Os resultados positivos para um ou mais autoanticorpos específicos são depois

confirmados através da técnica de Immunoblot.

5.3.3. Immunoblot

O Immunoblot é o teste que permite confirmar os resultados obtidos por

quimioluminescência e IFI. Esta técnica consiste num imunoensaio enzimático, que

permite detetar e caracterizar os vários autoanticorpos.

Neste imunoensaio são utilizadas tiras de teste que contêm uma membrana revestida

com linhas paralelas de antigénios purificados. Numa primeira etapa, as amostras de soro

diluídas são incubadas com as tiras de teste e os autoanticorpos presentes ligam-se aos

antigénios específicos. Em seguida é realizada uma segunda incubação, na qual são

Figura 16 - Equipamento Zenit RA


VIII MAC Imunologia


utilizados anticorpos marcados com uma enzima (fosfatase alcalina), que se vão ligar aos

imunocomplexos formados. Por fim é adicionado um substrato cromogénico, que promove

uma reação colorimétrica, evidenciada pelo aparecimento de uma banda escura intensa na

linha do antigénio correspondente. (33)

No laboratório de Imunologia, a

técnica de Immunoblot é executada no

equipamento EUROBlotMaster (figura 17) e

existem várias tiras com diferentes perfis de

antigénios para a deteção e caracterização de

diferentes autoanticorpos: ANA,

autoanticorpos associados a DAI hepáticas,

à miosite, à esclerose sistémica, entre outros. Figura 17 - Equipamento EUROBlotMaster


VIII MAC Hematologia


6. Hematologia

A Hematologia é a área da medicina que estuda o sangue e os órgãos

hematopoiéticos em situações fisiológicas e patológicas, bem como os mecanismos da

hemostase. (1,34)

No laboratório de Hematologia são realizados hemogramas, é feita a determinação

da velocidade de sedimentação (VS), a observação microscópica de esfregaços de sangue

periférico e de aspirados de medula óssea (mielograma), o estudo das hemoglobinopatias,

da hemostase e ainda o estudo citológico de líquidos biológicos, DPCA e LBA. São

também realizadas algumas técnicas manuais como a execução de esfregaços de aspirados

de medula óssea e de esfregaços de sangue periférico, determinadas colorações

citoquímicas e ainda a contagem manual de reticulócitos.

As amostras utilizadas para a realização dos diferentes testes e estudos no

Laboratório de Hematologia são:

Sangue total colhido em tubo com K2 EDTA – utilizado no hemograma, VS

e no estudo das hemoglobinopatias. O EDTA remove o cálcio ionizado

(Ca2+) através de um processo de quelação, impedindo a coagulação;

Plasma obtido a partir de sangue total colhido em tubo com citrato trissódico

– utilizado nos testes de hemostase. O citrato trissódico impede a coagulação

do sangue por neutralização dos iões cálcio;

Líquidos biológicos (peritoneal, pleural, pericárdico), DPCA e LBA.

Um aspeto importante a ter em conta é a proporção de anticoagulante para a

proporção de sangue total, uma vez que um volume incorreto de sangue pode conduzir a

alterações nos resultados obtidos. Para a realização dos testes de hemostase é fundamental

que esta proporção seja de 9 volumes de sangue colhidos para 1 volume de citrato

trissódico. (35,36)

6.1. Hemograma

O hemograma permite quantificar e avaliar qualitativamente os eritrócitos,

leucócitos e plaquetas, sendo um dos exames laboratoriais mais frequentemente




requisitados. É, portanto, um exame fundamental para o estudo da função hematológica e

para o diagnóstico de doenças com esta relacionadas. (37)

O hemograma inclui o eritrograma, o leucograma e o plaquetograma. No laboratório

de Hematologia, o hemograma é realizado no equipamento automático Beckman Coulter

UniCel DxH 800 que, para além dos parâmetros acima referidos, permite também realizar

a contagem de reticulócitos e de outros parâmetros relacionados com estes, bem como a

contagem de eritroblastos.

6.1.1. Contador Hematológico Beckman Coulter UniCel DxH 800

O UniCel DxH 800 é um analisador hematológico automático que se baseia no

princípio de Coulter e na tecnologia VCS (Volume, Condutividade, Scatter). No laboratório

de Hematologia, existem dois analisadores UniCel DxH 800 que estão conectados e que

são utilizados pelo laboratório de Hematologia de rotina e pelo laboratório de Urgência.

O princípio de Coulter, ou princípio da impedância, permite fazer contagens

celulares através da medição de variações de impedância que ocorrem quando uma

partícula (como uma célula sanguínea), suspensa numa solução isotónica e boa condutora

de eletricidade, atravessa um pequeno orifício situado entre dois elétrodos. A passagem de

cada célula pelo orifício aumenta a impedância (resistência) da corrente elétrica entre os

dois elétrodos, gerando um pulso elétrico. O número de pulsos indica o número de células

e a amplitude de cada pulso é proporcional ao volume da célula.

A tecnologia VCS é aplicada na contagem diferencial de leucócitos. Após a adição

de um reagente que provoca a lise dos eritrócitos (necessário para realizar a contagem total

dos leucócitos), as células são submetidas a três medições: volume, condutividade e

dispersão de luz laser (scatter). Esta tecnologia é ainda utilizada para realizar a contagem

de eritroblastos e reticulócitos. Para a contagem de reticulócitos é utilizado Novo Azul de

Metileno, um reagente que precipita e cora o RNA citoplasmático presente nos

reticulócitos. (36,38)

A quantificação da hemoglobina é realizada após a lise dos eritrócitos. O reagente

que provoca a lise dos eritrócitos converte também a hemoglobina num pigmento estável

que é doseável espectrofotometricamente a 525nm, sendo que a absorvância do pigmento

é diretamente proporcional à concentração de hemoglobina na amostra. (36,38)

Os dois analisadores hematológicos estão acoplados a um equipamento de

preparação e coloração de lâminas totalmente automatizado, o DxH Slidemaker Stainer.




Este equipamento aspira uma amostra de sangue total e realiza um esfregaço numa lâmina

de microscópio, permitindo a adaptação do aspeto do esfregaço e metodologia de coloração

de acordo com as preferências do utilizador. (38)

6.1.2. Eritrograma

O eritrograma diz respeito ao estudo da série eritrocitária e inclui a determinação de

parâmetros quantitativos como a contagem de eritrócitos, a concentração de hemoglobina

e o hematócrito, e a determinação dos índices eritrocitários, como o Volume Globular

Médio (VGM), a Hemoglobina Globular Média (HGM) e a Concentração de Hemoglobina

Globular Média (CHGM). Os índices eritrocitários permitem avaliar as características

qualitativas dos eritrócitos, sendo utilizados na caracterização morfológica das

anemias.(1,34,39)

Contagem de eritrócitos

A contagem de eritrócitos diz respeito ao número de eritrócitos existentes num dado

volume de sangue. É expressa em número de células por litro e constitui um indicador de

disfunção da produção de eritrócitos e/ou do seu tempo de vida. (40)

Concentração de Hemoglobina

A hemoglobina (Hb) é uma proteína cuja principal função é ligar-se ao oxigénio

proveniente dos pulmões e transportá-lo para os tecidos. A quantificação da Hb tem grande

utilidade na deteção e avaliação do grau de anemias, uma vez que nestas ocorre uma

diminuição da concentração da Hb. Esta diminuição poderá ocorrer também associada a

uma redução do hematócrito e/ou da contagem de eritrócitos. A concentração de Hb é

normalmente expressa em g/dL. (40)

Hematócrito

O hematócrito (Ht) corresponde ao volume ocupado pelos eritrócitos em relação ao

volume de sangue total. É expresso em L/L e a sua determinação é feita pelo equipamento

através de um cálculo matemático.

O Ht pode indicar alterações no número de eritrócitos e no seu volume, ou no

volume do plasma, sendo útil na deteção de anemias e poliglobulias. (38,40)




Volume Globular Médio (VGM)

O volume globular médio indica o volume médio dos eritrócitos de um indivíduo.

Este parâmetro é determinado automaticamente pelo equipamento, sendo expresso em

fentolitros (fL). O VGM avalia o tamanho dos eritrócitos, sendo útil na classificação das

anemias em microcíticas, macrocíticas ou normocíticas. (37,38)

Hemogobina Globular média (HGM)

A hemoglobina globular média representa o peso médio da hemoglobina contida

num eritrócito, expressa em picogramas (pg). O HGM é determinado pelo equipamento

através de um cálculo matemático: (37)

𝐻𝐺𝑀 (𝑝𝑔) = (𝐻𝑏 (𝑔 𝑑𝐿)⁄

𝐺𝑉 (𝑥 1012 𝐿)⁄) 𝑥 10

Concentração de Hemoglobina Globular Média (CHGM)

A CHGM corresponde à concentração média de hemoglobina por unidade de

volume de eritrócitos. É expressa em g/dL e a sua determinação é feita pelo equipamento

através da seguinte fómula:

𝐶𝐻𝐺𝑀 (𝑔 𝑑𝐿⁄ ) = 𝐻𝑏 (𝑔 𝑑𝐿)⁄

𝐻𝑡 (𝐿 𝐿)⁄

Este parâmetro é utilizado para classificar as anemias em hipocrómicas ou

normocrómicas. (37)

Índice de dispersão eritrocitária (RDW)

O índice de dispersão eritrocitária corresponde ao coeficiente de variação da

distribuição do volume eritrocitário. O RDW é determinado automaticamente pelo

equipamento, sendo expresso em percentagem (%). Este parâmetro mede a variação do

tamanho dos eritrócitos, pelo que um valor de RDW aumentado é indicativo de

anisocitose.(37,38)

6.1.3. Leucograma

O estudo da série leucocitária é feito através do leucograma, que engloba a

contagem total de leucócitos e a fórmula leucocitária.




Contagem total de leucócitos

A contagem total de leucócitos diz respeito ao número de leucócitos existentes num

dado volume de sangue e é expressa em número de células por litro. Este parâmetro é útil

no diagnóstico de infeções e processos inflamatórios, bem como de outras doenças que

afetem os leucócitos. (1,37)

Fórmula Leucocitária

A fórmula leucocitária, ou contagem diferencial de leucócitos, consiste na

determinação de cada um dos tipos de leucócitos: neutrófilos, eosinófilos, basófilos,

monócitos e linfócitos. Os resultados são expressos em valor absoluto (número de células

por litro) e em percentagem (%).

A fórmula leucocitária permite identificar qual ou quais os leucocócitos que se

encontram em número alterado e permite também detetar e identificar células imaturas e

células anormais presentes no sangue, tendo por isso grande utilidade no diagnóstico e

monitorização de patologias que afetam os leucócitos. (34,40,41)

6.1.4. Plaquetograma

O estudo da série plaquetária é feito através do plaquetograma, que inclui a

contagem de plaquetas e a determinação do Volume Plaquetário Médio. (1,35,39,40)

Contagem de Plaquetas

A contagem de plaquetas diz respeito ao número de plaquetas existentes num dado

volume de sangue e é expressa em número de células por litro. A quantificação das

plaquetas é útil no rastreio e diagnóstico de doenças que afetem as plaquetas e a formação

do coágulo, bem como na monitorização do tratamento dessas doenças e de terapêuticas

que afetem as plaquetas.

Nos casos em que a contagem de plaquetas está muito diminuída e não se enquadra

na história clínica do doente, é importante verificar se existe um coágulo na amostra, uma

vez que estes poderão induzir um resultado falsamente diminuído. (34,42)

Volume Plaquetário Médio (VPM)

O volume plaquetário médio indica o volume médio das plaquetas de um indivíduo

e é expresso em fL. É determinado automaticamente pelo equipamento, sendo útil no

diagnóstico diferencial de trombocitopenias. Nos indivíduos saudáveis, existe uma relação




inversa entre o VPM e a contagem de plaquetas, pelo que estes dois parâmetros devem ser

analisados em conjunto. (35,36,41)

6.1.5. Reticulócitos

Os reticulócitos são eritrócitos imaturos, que não têm núcleo mas que ainda contêm

RNA no citoplasma. A contagem de reticulócitos indica o número de reticulócitos presentes

num determinado volume de sangue e é expressa preferencialmente em número de células

por litro de sangue, ou em percentagem (%). A quantificação dos reticulócitos reflete a

atividade eritropoiética da medula óssea, sendo por isso útil na avaliação de anemias, uma

vez que permite distinguir entre anemias regenerativas e arregenerativas, e na

monitorização do tratamento de anemias. (35,41)

6.2. Estudo Morfológico do Sangue Periférico – Esfregaço

Sanguíneo

O esfregaço de sangue periférico consiste na preparação de uma fina camada de

células sanguíneas sobre uma lâmina de vidro, para exame microscópico. A observação

microscópica do esfregaço de sangue tem um papel primordial no diagnóstico de muitas

doenças hematológicas, uma vez que permite observar e avaliar a morfologia dos

eritrócitos, leucócitos e plaquetas, e realizar a contagem diferencial de leucócitos

manualmente. (1,41,43)

O esfregaço de sangue periférico é realizado quando há um pedido do clínico,

quando o equipamento emite alarmes que resultam de anomalias detetadas no hemograma,

ou quando solicitado pelos médicos patologistas e TSS responsáveis pela validação dos

resultados do hemograma. (35,43)

No Laboratório de Hematologia, a maioria dos esfregaços é realizada

automaticamente pelo DxH Slidemaker Stainer, no entanto alguns esfregaços são

executados manualmente (figura 18) pelos TACSP.




Um bom esfregaço sanguíneo deve apresentar três zonas: cabeça, corpo e cauda (ou

franja), sendo que a espessura deve diminuir gradualmente da cabeça para a cauda (figura

19). Para além disso, deve ser liso, regular, homogéneo e deve ter bordos bem definidos.(1)

Os esfregaços executados manualmente são corados num equipamento automático

que fixa, cora e seca as lâminas, o Hema-Tek 2000. A coloração utilizada pelo Hema-Tek

2000 e pelo DxH Slidemaker Stainer é a coloração de Wright.

O corante de Wright é uma solução metanólica de eosina, azul de metileno e azur

de metileno (resulta da oxidação do azul de metileno). A eosina é um corante ácido que

cora os componentes básicos da célula (designados de acidófilos) de rosa-alaranjado. O

azul e azur de metileno são corantes básicos que coram os componentes celulares ácidos

(designados de basófilos), como o núcleo e as nucleoproteínas, de azul-arroxeado. O

metanol atua não só como solvente do corante, mas também como fixador do

esfregaço.(1,37,38,40)

Figura 19 - Representação esquemática de um bom esfregaço de sangue periférico

Adaptado de: (35)

Figura 18 - Representação esquemática da técnica de execução de um esfregaço de sangue periférico

Adaptado de: Cornell University College of Veterinary Medicine. 2014 Animal Health Diagnostic Center

(https://ahdc.vet.cornell.edu/sects/clinpath/test/cytol/collection.cfm)




Na análise microscópica do esfregaço de sangue periférico devem ser observadas

as três linhagens celulares: eritrocitária, leucocitária e plaquetária. A observação do

esfregaço permite detetar ou confirmar alterações quantitativas e qualitativas dos

eritrócitos, leucócitos e plaquetas, que ocorrem em várias patologias hematológicas.(34,37)

Na série eritrocitária podem ser observadas as seguintes alterações: (36,41)

Alterações do tamanho – anisocitose, microcitose, macrocitose;

Alterações da cor - anisocromia, hipocromia, policromatofilia;

Alterações da forma – poiquilocitose;

Inclusões eritrocitárias – corpos de Howell-Jolly, pontuado basófilo, corpos

de Pappenheimer, entre outros;

Alterações na distribuição dos eritrócitos – rouleaux, aglutinação;

Presença de eritroblastos (precursores dos eritrócitos).

Na série leucocitária podem ser observadas alterações morfológicas do núcleo e do

citoplasma dos leucócitos, como a presença de granulação tóxica ou de corpos de Döhle no

citoplasma dos neutrófilos, ou a hipersegmentação do núcleo dos neutrófilos. Podem

também ser observados precursores das linhagens mieloide e linfoide. (36,37)

Na linhagem plaquetária, para além de alterações morfológicas, podem também ser

observadas alterações quantitativas, alterações na distribuição das plaquetas (presença de

agregados plaquetários, satelitismo plaquetário) ou ainda a presença de precursores da

linhagem plaquetária. (36,37,41)

6.3. Velocidade de Sedimentação

A velocidade de Sedimentação (VS) mede a velocidade de deposição dos eritrócitos

em suspensão no plasma, sendo expressa em mm/hora. É um teste não específico, mas que

tem grande utilidade no diagnóstico e monitorização de estados inflamatórios e infeciosos,

onde a VS está aumentada.

A VS é influenciada por vários fatores interligados, como a diferença de gravidade

específica existente entre os eritrócitos e o plasma, a concentração plasmática de

determinadas proteínas (fibrinogénio, imunoglobulinas e outras proteínas de fase aguda), e

também o número e a forma dos eritrócitos. (35–37)




No laboratório de Hematologia a VS é determinada num equipamento automático,

o Ves-Matic Cube 30. A análise da amostra é executada de forma totalmente automática e

os resultados, obtidos em 33 minutos, são perfeitamente correlacionados com os obtidos

pelo método de Westergren, que é o método de referência. As amostras são inicialmente

homogeneizadas durante 15 minutos e após mais 15 minutos de sedimentação é feita a

leitura do resultado, através de um sistema de leitura ótica. (44,45)

6.4. Estudo das Hemoglobinopatias

A hemoglobina é uma proteína tetramérica constituída por dois pares de cadeias

globínicas, estando cada uma ligada a um grupo heme, ao qual se liga o oxigénio. No

sangue de um adulto normal existem três tipos de hemoglobina: a Hb A (α2β2) que é a

hemoglobina predominante, constituindo cerca de 96-98% da hemoglobina total; a Hb A2

(α2δ2) que está presente em pequenas quantidades, cerca de 1,5-3,5%; e a Hb F (α2γ2), que

está presente em quantidades vestigiais (< 1%) no adulto, mas que é a principal

hemoglobina presente no feto e recém-nascido. (35,39)

As hemoglobinopatias são um grupo de doenças hereditárias que resultam de

mutações nos genes que codificam para a síntese das cadeias de globina da hemoglobina,

constituindo as doenças genéticas mais comuns a nível mundial. Estas podem ser

classificadas em hemoglobinopatias quantitativas, que resultam da ausência ou diminuição

da síntese de uma cadeia globínica e nas quais se incluem as talassémias (α e β-talassémia),

ou em hemoglobinopatias quantitativas, que resultam da alteração da estrutura de uma

cadeia globínica, dando origem a variantes da Hb, entre as quais se destacam a Hb S, a Hb

C e a Hb D. (1,39)

No laboratório de Hematologia, a deteção de hemoglobinopatias é feita com base

no hemograma, na observação do esfregaço de sangue periférico e no estudo das

hemoglobinas, através de metodologias como a cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC) e a eletroforese de hemoglobinas. Nos casos de suspeita da presença de uma Hb S,

pode também ser realizado o teste de insolubilidade da Hb S.

6.4.1. HPLC

A HPLC é a metodologia utilizada para a abordagem inicial ao estudo das

hemoglobinopatias. No laboratório é utilizado o ADAMS A1C HA-8180T (figura 20), um




equipamento automático para a determinação da hemoglobina glicada (Hb A1c), Hb A, Hb

A2 e Hb F, e que permite também detetar as principais variantes da hemoglobina (Hb S, Hb

C, Hb E e Hb D), por HPLC de troca catiónica em fase inversa.

A HPLC de troca catiónica permite

separar as diferentes hemoglobinas com base

nas suas características de carga. Através desta

técnica é possível separar uma mistura de

hemoglobinas, carregadas positivamente, nos

diferentes componentes de acordo com a sua

afinidade para uma fase estacionária (presente

numa coluna de cromatografia) carregada

negativamente, seguindo-se a sua eluição pela fase móvel. A fase móvel é uma solução

líquida com uma concentração crescente de catiões, que vão competir com as hemoglobinas

na ligação à fase estacionária. As frações de hemoglobina eluídas são detetadas por um

detetor de luz UV/visível e são identificadas com base no seu tempo de retenção e

quantificadas através da área dos picos obtidos no cromatograma. (1,35)

A quantificação da Hb A2 permite diagnosticar ou excluir a presença de uma β-

talassémia minor (traço β-talassémico), uma vez que um valor aumentado de Hb A2 (>

3,5%) constitui um indicador característico desta patologia. Na β-talassémia major

(homozigótica), verifica-se uma ausência total ou quase total de Hb A e uma percentagem

muito elevada de Hb F. O nível de Hb A2 pode estar normal ou ligeiramente

aumentado.(35,39)

A variante da hemoglobina mais comum é a Hb S, que está na origem da

drepanocitose, ou anemia das células falciformes. A deteção da Hb S permite fazer o

diagnóstico desta hemoglobinopatia, sendo que nos indivíduos homozigóticos a Hb A está

ausente, verificando-se uma percentagem muito elevada de Hb S (80-95%) e uma

percentagem variável de Hb F; nos indivíduos heterozigóticos (traço falciforme) a

percentagem de Hb S não é tão elevada, variando entre os 30-45%. (1,39,46)

Apesar de a HPLC permitir determinar a HbA, Hb A2, Hb F e identificar as

principais variantes da hemoglobina, quando existem resultados que indicam a presença de

uma hemoglobinopatia estes devem ser confirmados através de outras técnicas, uma vez

que as hemoglobinas E e Lepore podem co-eluir com a Hb A2, e que outras variantes de

hemoglobina podem co-eluir com as hemoglobinas A, S e F. (1,35)

Figura 20 - Equipamento ADAMS A1C HA-8180T




6.4.2. Eletroforese de Hemoglobinas

A eletroforese de hemoglobinas permite confirmar os resultados obtidos por HPLC

nas amostras em que se suspeita da existência de uma hemoglobinopatia. No laboratório de

Hematologia, são realizadas eletroforeses em gel de agarose em meio alcalino e em meio

ácido, no equipamento Hydrasys Focusing anteriormente descrito no capítulo 5.1.3.

Para a realização desta técnica é necessária uma preparação prévia das amostras de

sangue total, de forma a obter um hemolisado de glóbulos vermelhos. Para a obtenção do

hemolisado centrifugam-se as amostras de sangue total a 5000 rpm durante 5 minutos e

remove-se o plasma. Em seguida, procede-se à lavagem das células com soro fisiológico e

por fim adiciona-se uma solução hemolisante.

Na eletroforese em meio alcalino (pH 8,5), as moléculas de hemoglobina têm uma

carga total negativa, pelo que migram em direção ao ânodo (pólo positivo). Esta

eletroforese permite separar as hemoglobinas A e A2 e detetar as principais variantes da

hemoglobina (Hb S ou Hb D e Hb C ou Hb E). No entanto, não permite separar a Hb S da

Hb D nem a Hb C da Hb E, pelo que deve ser complementada com a eletroforese em meio

ácido, que permite diferenciar estas hemoglobinas, bem como separar ainda a Hb A e a Hb

F.

Em meio ácido (pH 6,0), as moléculas de hemoglobina estão carregadas

positivamente e a sua mobilidade vai depender da interação eletrostática com as moléculas

de agar, carregadas negativamente. (35,47,48)

6.4.3. Teste da insolubilidade da Hb S

O teste da insolubilidade da Hb S é um teste qualitativo em tubo para testar a

presença de Hb S em amostras de sangue. Em condições de baixa pressão de oxigénio

(desoxigenação) a Hb S tem uma solubilidade reduzida, ocorrendo polimerização.

Formam-se assim cristais que deformam os eritrócitos, fazendo com que estes adquiram a

forma de foice (drepanócitos ou células falciformes).

Este teste baseia-se no facto de a Hb S desoxigenada ser insolúvel numa solução

concentrada de tampão fosfato, formando uma suspensão turva. No laboratório de

Hematologia é utilizado o kit Sickledex, no qual se utiliza saponina para provocar a lise

dos eritrócitos e hidrosulfito de sódio, que vai reduzir a hemoglobina libertada, tornando-a

insolúvel no tampão fosfato. Um resultado positivo para a Hb S é indicado por uma

suspensão turva, através da qual as linhas do suporte de tubos de ensaio não são visíveis.




O teste da insolubilidade da Hb S é um teste qualitativo e por isso não diferencia

entre drepanocitose (indivíduos homozigóticos) e traço falciforme (indivíduos

heterozigóticos), no entanto quando é necessário transmitir rapidamente uma resposta ao

clínico e os resultados da eletroforese ainda não estão disponíveis, este teste permite fazer

um diagnóstico presuntivo.(1,35,49)

6.5. Hemostase

A hemostase é um processo fisiológico que permite manter a fluidez do sangue

dentro do sistema vascular e que previne a ocorrência de hemorragias resultantes de lesões

vasculares, através da formação de um coágulo. O sistema hemostático engloba vários

componentes fundamentais: os vasos sanguíneos, as plaquetas, os fatores da coagulação e

os seus inibidores, e o sistema fibrinolítico. A hemostase depende do equilíbrio existente

entre os mecanismos ativadores e inibidores da coagulação, pelo que a perturbação deste

equilíbrio pode levar à ocorrência de eventos trombóticos ou hemorrágicos. (35,36)

A hemostase pode ser dividida em três fases: hemostase primária, secundária e

terciária. A hemostase primária envolve a resposta do sistema vascular e das plaquetas à

lesão vascular. A hemostase secundária, ou coagulação sanguínea, é um processo que

engloba uma sequência de reações químicas (cascata da coagulação) que culminam na

formação de um coágulo de fibrina. Por fim, a hemostase terciária ou fibrinólise, é o

processo fisiológico que promove a dissolução do coágulo de fibrina. (35,36)

A avaliação laboratorial da hemostase permite detetar e diagnosticar distúrbios da

hemostase, bem como fazer a monitorização terapêutica desses doentes.

Os testes de screening constituem o primeiro passo na investigação de episódios

hemorrágicos, sendo também utilizados na avaliação do risco hemorrágico antes da

realização de uma cirurgia. Estes testes englobam a contagem de plaquetas, o tempo de

protrombina (TP), o tempo de tromboplastina parcial ativado (APTT), o tempo de trombina

(TT) e a concentração de fibrinogénio. O resultado destes testes permite determinar os

testes adicionais mais específicos que sejam necessários para obter um

diagnóstico.(35,36,50)

No Laboratório de Hemostase, para além dos testes de screening, são efetuados

vários outros testes específicos que auxiliam no diagnóstico de distúrbios da hemostase,

entre os quais: concentração de D-dímeros, pesquisa do anticoagulante lúpico, pesquisa dos




anticorpos anticardiolipina e anti-β2-glicoproteína 1, níveis dos fatores de coagulação (II,

V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII e fator de von Willebrand) e níveis de diversos inibidores

(antitrombina, proteína C, proteína S, plasminogénio, inibidor do ativador do

plasminogénio tipo 1, entre outros).

Como referido anteriormente, a amostra utilizada para os testes da hemostase é o

plasma, que é obtido após centrifugação de sangue total colhido em tubo com citrato

trissódico. No laboratório de Hemostase são utilizados dois equipamentos para a realização

dos vários testes, o ACL TOP 750 e o ACL TOP 500, sendo que o primeiro serve o

laboratório de Hemostase de rotina e o segundo serve o laboratório de Urgência.

6.5.1. Equipamentos Automáticos ACL TOP 750/500

O ACL TOP 750 e o ACL TOP 500 são equipamentos específicos para a

determinação dos parâmetros da hemostase. Estes equipamentos utilizam fotometria para

efetuar a leitura dos resultados e permitem realizar três tipos de testes: coagulométricos,

cromogénicos e imunológicos.

O método coagulométrico permite determinar o tempo de formação do coágulo

tendo por base o princípio da turbidimetria. À medida que se forma o coágulo e que o

fibrinogénio é convertido em fibrina, a luz que atravessa a amostra é absorvida pelas fibras

de fibrina. Consequentemente, a luz transmitida diminui continuamente, sendo medida a

um comprimento de onda de 405nm ou 671nm por um fotodetetor, que está posicionado a

180° em relação à fonte de luz.

No método cromogénico, é utilizado um substrato cromogénico sintético que ao ser

clivado liberta um cromóforo, a para-nitroanilina (pNA). A luz que atravessa a amostra é

absorvida de forma diretamente proporcional à concentração de pNA, a um comprimento

de onda de 405nm.

O método imunológico baseia-se na formação de complexos antigénio-anticorpo,

que afetam a transmissão da luz que atravessa a amostra. A luz é absorvida pela amostra de

forma diretamente proporcional à concentração dos complexos antigénio-anticorpo e a

quantidade de luz transmitida é depois medida pelo fotodetetor, podendo ser utilizado um

comprimento de onda de 405nm ou 671nm, dependendo do teste que se pretende

realizar.(51)




6.5.2. Testes de Screening/Rotina

Tempo de Protrombina (TP)

O tempo de protrombina permite avaliar a via extrínseca da cascata da coagulação

e a via comum. Reflete, assim, alterações no estado dos fatores VII, X e II (dependentes da

vitamina K), do fator V e do fibrinogénio. Este teste é também utilizado na monitorização

da terapêutica com anticoagulantes orais e ainda na avaliação da função hepática.

O TP mede o tempo de formação do coágulo de fibrina após a adição de

tromboplastina (mistura de fator tissular, fosfolípidos e iões cálcio) a uma amostra de

plasma citratado. As tromboplastinas são produzidas a partir de diferentes métodos e

origens, o que leva a que os resultados do TP em segundos sejam inconsistentes de

laboratório para laboratório, tornando-o inadequado para a monitorização da terapêutica

anticoagulante oral e para o estabelecimento de faixas terapêuticas. (35,36,52)

Assim, de forma a uniformizar os resultados obtidos nos diferentes laboratórios, a

Organização Mundial de Saúde (OMS) introduziu a Razão Normalizada Internacional

(INR). O INR é obtido a partir da seguinte fórmula:

𝐼𝑁𝑅 = (𝑇𝑃 𝑑𝑜 𝑑𝑜𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑀𝑁𝑃𝑇)

𝐼𝑆𝐼

Em que o ISI (Índice de Sensibilidade Internacional) é o índice que reflete a

sensibilidade da tromboplastina utilizada relativamente a uma preparação de referência

internacional, que por definição tem um ISI de 1,0. O ISI utilizado no laboratório é indicado

pelo fornecedor do reagente. O MNPT (Média Normal do Tempo de Protrombina) é a

média geométrica do valor de TP de pelo menos 20 indivíduos saudáveis de ambos os

sexos. (52–54)

Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (APTT)

O tempo de tromboplastina parcial ativado explora a via intrínseca da cascata da

coagulação, sendo sensível a deficiências nos fatores XII, XI, IX e VIII, e a via comum

(fatores X, V, II e fibrinogénio). É também utilizado na monitorização da terapêutica com

heparina e na deteção do anticoagulante lúpico, uma vez que é sensível à sua presença.

Para a determinação do APTT é necessária a adição de fosfolípidos, de um ativador

de superfície e de cloreto de cálcio ao plasma citratado. O ativador fornece uma superfície

com carga negativa (caulino, sílica, ácido elágico), que é necessária para a ativação do fator

XII, desencadeando assim a via intrínseca da cascata da coagulação, in vitro.




O APTT é então o tempo, em segundos, desde a adição do cálcio até à formação do

coágulo de fibrina. (35,36,52,54)

Tempo de Trombina (TT)

O tempo de trombina avalia a conversão do fibrinogénio em fibrina. Este teste

consiste em adicionar trombina ao plasma citratado, sendo depois medido o tempo de

coagulação em segundos.

O TT pode estar alongado devido a: uma anomalia quantitativa ou qualitativa do

fibrinogénio, uma vez que o TT é afetado pela concentração e atividade do fibrinogénio; à

presença de inibidores da trombina, como a heparina; à presença de substâncias que

interfiram na formação da fibrina, como os produtos de degradação da fibrina/fibrinogénio

(PDF).(36,52,54)

Fibrinogénio

O fibrinogénio é uma proteína plasmática sintetizada no fígado que, sob a ação da

trombina, é convertida em fibrina. A determinação da concentração de fibrinogénio é útil

na investigação de uma tendência hemorrágica ou de prolongamentos inexplicáveis de TP

ou APTT.

Existem vários métodos para a quantificação dos níveis de fibrinogénio no plasma,

sendo que os equipamentos ACL TOP existentes no laboratório utilizam o método derivado

do TP. Neste método, o fibrinogénio é determinado através da curva de calibração do TP,

sendo a sua concentração proporcional às diferenças de turvação obtidas no teste do TP.

Caso o valor de fibrinogénio obtido seja superior ao valor de referência, a

determinação do fibrinogénio é feita através do método de referência, o método de Clauss.

No método de Clauss é adicionada uma concentração elevada de trombina à amostra de

plasma diluído, sendo medido o tempo de formação do coágulo. A diluição do plasma tem

como objetivo diminuir o efeito de substâncias inibidoras que possam estar presentes, como

a heparina ou PDF. A utilização de uma concentração elevada de trombina permite que o

tempo de formação do coágulo seja independente da concentração de trombina.

Os níveis de fibrinogénio podem estar alterados devido a anomalias quantitativas

(hipo ou hiperfibrinogenémia) ou a anomalias qualitativas (disfribinogenémias). (35,52,54)




Testes de Mistura

Os testes de mistura são úteis na investigação das possíveis causas do

prolongamento do TP ou do APTT, uma vez que permitem fazer a distinção entre a

existência de um défice de fatores da coagulação e a presença de um inibidor.

Estes testes consistem em misturar o plasma do doente com uma pool de plasma

normal numa proporção 1:1 e em seguida repetir o TP ou o APTT, dependendo do teste

que está alongado. As amostras de plasma cujo valor de TP ou APTT corrige para um valor

normal sugerem um défice de fator, enquanto as amostras cujo valor não corrige sugerem

a presença de um inibidor. (52,54)

A pool de plasma é obtida diariamente, através da mistura de pelo menos 3 alíquotas

de plasmas normais do dia (TP ≤12,5 seg e APPT entre 25-30 seg, com VS e/ou PCR

normais), preferencialmente provenientes de doentes de ambulatório e não do internamento

(excluir os doentes oncológicos, do serviço de medicina, da infeciologia e da pediatria).

Para além dos testes de mistura, a pool é também utilizada para o controlo de qualidade

interno e para determinar o MNPT.

6.5.3. Testes de Diagnóstico

D-Dímeros

A formação do coágulo de fibrina desencadeia a ativação da fibrinólise, que é o

processo que permite dissolver os polímeros de fibrina insolúvel, através da ação da

plasmina. A degradação da fibrina pela plasmina resulta na formação de produtos de

degradação da fibrina, que consistem numa série de fragmentos entre os quais se encontram

os D-dímeros.

A determinação da concentração dos D-dímeros baseia-se numa reação de

aglutinação, em que é utilizada uma suspensão de partículas de látex de poliestireno

revestidas por um anticorpo monoclonal específico contra o D-dímero. Quando se mistura

uma amostra de plasma que contenha D-dímeros com a suspensão de partículas, estas

aglutinam, sendo o grau de aglutinação diretamente proporcional à concentração de D-

dímero presente no plasma.

A quantificação dos D-dímeros tem grande utilidade no auxílio ao diagnóstico da

coagulação intravascular disseminada (CID) e na exclusão de uma suspeita de

tromboembolismo venoso (TEV). Este teste tem, assim, um elevado valor preditivo




negativo para o diagnóstico de TEV, contudo apresenta um baixo valor preditivo positivo,

uma vez que os D-dímeros estão aumentados em várias situações clínicas. (35,36,54,55)

Pesquisa de Anticoagulante Lúpico

O anticoagulante lúpico (AL) pertence a um grupo heterogéneo de anticorpos

dirigidos contra proteínas que se encontram ligadas a fosfolípidos, os anticorpos

antifosfolípidos (AAF), que estão associados ao síndrome antifosfolipídico (SAF).

O AL interfere nos testes de coagulação dependentes de fosfolípidos e causa o

alongamento do tempo de coagulação, sendo uma das principais causas do prolongamento

do APTT. Assim, a pesquisa de AL deve ser realizada em doentes que apresentem uma

elevada probabilidade de ter SAF, ou um prolongamento inexplicável do APTT.

De acordo com guidelines internacionais (56), a deteção do AL deve ser feita a

partir de dois testes de screening baseados em princípios diferentes: o tempo de veneno de

víbora de Russel diluído (dRVVT), em que é utilizado o veneno de víbora de Russell, que

contém um ativador do fator X, levando à formação do coágulo de fibrina; e um APTT

sensível para o AL (APTT-LA), que utiliza a sílica como ativador. Em ambos os testes de

screening é utilizada uma baixa concentração de fosfolípidos, o que aumenta a

sensibilidade para o AL.

Se o tempo de coagulação dos testes de screening estiver prolongado, é feito em

seguida um teste de mistura. Caso o tempo de coagulação do teste de mistura não corrija,

são então realizados os testes confirmatórios (dRVVT e APTT-LA). No dRVVT e APTT-

LA confirmatórios são utilizadas elevadas concentrações de fosfolípidos, que permitem

neutralizar o AL, corrigindo assim o tempo de coagulação. Uma amostra é considerada

positiva para o AL se um dos dois testes der um resultado positivo. (35,36,52,54,55)

Para a realização da pesquisa de AL é necessário que as amostras de plasma sejam

pobres em plaquetas, pelo que estas são duplamente centrifugadas a 4500 rpm durante 10

minutos.


VIII MAC Química Clínica


7. Química Clínica

A Química Clínica é a área laboratorial que estuda as vias e processos metabólicos

do organismo e as alterações que neles ocorrem, com vista ao diagnóstico, monitorização

e prevenção da doença.

O laboratório de Química Clínica encontra-se praticamente automatizado, com

exceção de algumas técnicas manuais, e abrange a maior parte das análises de rotina, sendo

o setor que apresenta o maior fluxo de amostras diariamente. Para a realização dos vários

testes e estudos, neste setor são recebidos diferentes tipos de amostra: soro, urina (1ª da

manhã, amostras aleatórias, urina de 24 horas), sangue total em tubo com K2 EDTA, fezes,

LCR, LBA, DPCA e outros líquidos biológicos (pleural, ascítico, pericárdico, etc), e ainda

cálculos renais.

O laboratório de Química Clínica está organizado em várias áreas funcionais:

Bioquímica Geral – em que são determinados os parâmetros de bioquímica;

Endocrinologia – a maioria dos parâmetros é determinada nos equipamentos

automáticos e apenas alguns são determinados através da técnica manual de

radioimunoensaio (RIA);

Serologias Infeciosas;

Rastreio Pré-Natal;

Monitorização terapêutica de fármacos e pesquisa de drogas de abuso;

Análise de Urinas, líquidos biológicos e fezes – nesta secção é realizado o

exame sumário de urina (urina tipo II), o processamento e avaliação do perfil

citoquímico de vários líquidos biológicos, a pesquisa de sangue oculto e a

avaliação do grau de digestão das fezes, e ainda a análise físico-química de

cálculos renais. Nesta secção são também recebidas amostras de urina de 24

horas, cujo volume é medido, procedendo-se em seguida à sua centrifugação

e aos doseamentos pedidos. As amostras provenientes do HEM e do HSC

chegam já em tubos apropriados para os equipamentos automáticos e com a

indicação do volume total.

Para as amostras em que foi feita a determinação de marcadores tumorais e para

aquelas em que foram realizadas serologias, são realizadas serotecas (armazenamento e

conservação de amostras processadas) de três meses ou de um ano, respetivamente. A




existência destas serotecas permite, quando necessário, confirmar algum resultado de forma

a estudar a evolução de uma determinada patologia.

7.1. Equipamentos Automáticos e Metodologias Utilizadas

7.1.1. Cobas 8000 modular analyzer series

O Cobas 8000 (figura 21) é um equipamento composto por vários módulos ligados

em cadeia, no qual é realizado o doseamento da maior parte dos parâmetros de bioquímica

em amostras de soro e urina, bem como LCR e outros líquidos biológicos. No laboratório

de Química Clínica existem dois equipamentos Cobas 8000, um que serve o laboratório de

rotina e outro que serve o laboratório de Urgência. Cada um destes equipamentos é

constituído por: um módulo core, que permite a entrada e saída de amostras, reagentes e

controlos; um módulo ISE para a realização

do ionograma; um módulo de química clínica

– c 701; um módulo de imunoquímica – e 602

(no cobas da rotina existem dois módulos e

602). Os dois equipamentos Cobas 8000

estão ligados à cadeia pré-analítica (cobas p

671 e p 612) descrita anteriormente.

Os vários módulos do Cobas 8000 utilizam diferentes metodologias para a

determinação dos diversos parâmetros.

No módulo da química clínica (c 701) é utilizada a espectrofotometria, que mede a

capacidade de absorção de luz (absorvância) de uma substância em solução, através da

medição da intensidade da luz de um feixe que atravessa a amostra, a um determinado

comprimento de onda. A absorvância de uma determinada substância é diretamente

proporcional à sua concentração.

A determinação dos vários parâmetros baseia-se em diferentes tipos de ensaio,

consoante o analito que se pretende dosear:

Ensaio enzimático;

Ensaio colorimétrico;

Ensaio enzimático colorimétrico;

Ensaio cinético;

Ensaio cinético colorimétrico;

Ensaio imunoturbidimétrico

Figura 21 - Cobas 8000 modular analyzer series




No módulo de imunoquímica (e 602), a metodologia utilizada é a

eletroquimioluminescência (ECLIA), que consiste na emissão de luz como resultado de

uma reação eletroquímica que ocorre à superfície de um elétrodo.

Neste imunoensaio inicialmente são adicionados dois anticorpos específicos, um

marcado com biotina e outro com ruténio, que se ligam ao antigénio presente na amostra,

formando um complexo (imunoensaio do tipo sandwich). Em seguida são adicionadas

micropartículas paramagnéticas (fase sólida) revestidas com estreptavidina, que se liga à

biotina. As micropartículas são fixadas magneticamente à superfície do elétrodo e a

aplicação de uma corrente elétrica dá início à reação quimioluminescente, que resulta de

reações de oxidação-redução entre o ruténio e um composto orgânico adicionado à solução,

o TPA (tripropilamina). A luz medida é diretamente proporcional à concentração do analito

na amostra.

Através desta técnica são também realizados imunoensaios do tipo competitivo, no

qual é adicionado o antigénio em estudo marcado com ruténio, que vai competir com o

antigénio presente na amostra (não marcado) pela ligação ao anticorpo marcado com

biotina. Neste caso, a luz medida é inversamente proporcional à concentração do analito na

amostra. (4,16)

No módulo ISE, a metodologia utilizada é a potenciometria, que mede a diferença

de potencial elétrico entre dois elétrodos numa célula eletroquímica. A célula eletroquímica

é constituída por um elétrodo de referência (mantém um potencial constante) e um elétrodo

indicador (cujo potencial se pretende medir), mergulhados numa solução. Neste caso, o

elétrodo indicador utilizado é um elétrodo seletivo de iões (ISE – Ion Selective Electrode),

que tem uma membrana seletiva para o ião que se pretende dosear. A membrana está em

contacto com a amostra e com uma solução eletrolítica interna, que contém uma

concentração conhecida do ião em estudo. Os iões específicos vão interagir com a

membrana de cada um dos lados, gerando um potencial, a partir do qual é possível calcular

a concentração do ião em estudo. (1,16)

7.1.2. ARCHITECT i1000SR

O ARCHITECT i1000SR (figura 22) é um equipamento automático destinado à

realização de imunoensaios em amostras de sangue total, soro e urina. Este equipamento

permite realizar uma grande variedade de testes, sendo que no laboratório de Química

Clínica é principalmente utilizado para a determinação quantitativa de imunossupressores




e para testes de serologia infeciosa, entre

outros. A técnica utilizada é o

imunoensaio de micropartículas por

quimioluminescência (CMIA),

anteriormente descrita no capítulo 5.3.2.

(57)

7.1.3. ADAMS A1C HA-8180T

O ADAMS A1C HA-8180T, descrito no capítulo 6.4.1, é utilizado para a

determinação da hemoglobina glicada (Hb A1c) em amostras de sangue total colhidas em

tubo com K2 EDTA.

7.1.4. Aution MAX AX-4030 e sediMAX

O Aution MAX AX-4030 e o sediMAX são dois equipamentos automáticos

utilizados no exame sumário de urina. O Aution MAX realiza o exame físico-químico e o

sediMAX a análise do sedimento urinário. No laboratório de Química Clínica estes dois

equipamentos encontram-se ligados em cadeia (figura 23), o que permite combinar os

resultados obtidos em cada um deles e visualizá-los simultaneamente.

No Aution MAX são utilizadas diferentes técnicas fotométricas para a realização

dos testes físicos e químicos. Para a determinação dos parâmetros químicos, utilizam-se

tiras de teste cujos resultados são lidos por refletância em bicromatismo (um feixe de luz

incide sobre as áreas sólidas de reagentes das tiras e a intensidade da luz refletida é medida

Figura 22 - Equipamento ARCHITECT i1000SR

Figura 23 - Equipamentos sediMAX e Aution MAX AX-4030




a um duplo comprimento de onda). Relativamente às características físicas, a cor é

igualmente determinada por refletância (em quatro comprimentos de onda), a densidade é

determinada através do índice de refração (calculado através da medição do ângulo de

desvio que a luz sofre ao incidir na amostra - ângulo de refração), e a turvação da amostra

é medida através da dispersão da luz. (16,58)

Para a realização da análise do sedimento, o sediMAX contém um microscópio e

uma câmara incorporados. Este equipamento homogeneiza e dispensa a amostra num slide,

procedendo depois à sua centrifugação. Após a centrifugação, a câmara fotografa vários

campos microscópicos do sedimento e as imagens são depois transmitidas e observáveis

através do software do equipamento. Este sistema ótico do sediMAX consegue detetar uma

grande variedade de elementos que possam estar presentes no sedimento urinário. (59)

7.1.5. Radioimunoensaio (RIA)

A técnica de RIA consiste num imunoensaio no qual são utilizados isótopos

radioativos como marcadores, sendo que o mais utilizado é o 125I (Iodo 125). Consoante o

analito que se pretende dosear, são realizados diferentes tipos de imunoensaio: imunoensaio

competitivo ou imunoensaio do tipo sandwich (não competitivo). Nesta técnica são

utilizados vários calibradores com concentrações conhecidas e crescentes, de forma a

construir uma curva de calibração, a partir da qual é possível determinar a concentração do

analito em estudo.

A deteção e leitura da radiação emitida pelo 125I é feita num contador de radiação

gama, o Gamma-C12. Nos imunoensaios competitivos, o sinal obtido é inversamente

propocional à quantidade do analito presente na amostra, enquanto nos imunoensaios do

tipo sandwich o sinal é diretamente proporcional à concentração.

A técnica de radioimunoensaio tem vindo a ser cada vez menos utilizada uma vez

que, sendo uma técnica manual, está sujeita a um maior número de erros, apresenta algum

risco para o operador devido à manipulação de substâncias radioativas e, para além disso,

são necessárias incubações de várias horas. No entanto, as interações antigénio-anticorpo

que ocorrem nestes imunoensaios são muito específicas e é uma técnica que apresenta uma

elevada sensibilidade, o que permite determinar baixas concentrações de analitos. (1,16)

No laboratório de Química Clínica, a técnica de RIA é utilizada para a determinação

dos parâmetros apresentados tabela 3.




Tabela 3 - Parâmetros determinados por RIA e amostras utilizadas

Parâmetro Amostra

Aldosterona Soro

Urina

Androstenediona Soro

Cortisol Urina

Cromogranina Soro

Fator de crescimento insulin-like tipo I (IGF-I) Soro

17α-Hidroxiprogesterona Soro

Metanefrinas Soro

Renina Plasma EDTA

7.2. Proteínas

Proteínas Totais

A maior parte das proteínas plasmáticas é sintetizada no fígado, sendo que as

imunoglobulinas constituem a principal exceção. As proteínas plasmáticas dividem-se em

dois grupos: a albumina, que é a principal proteína do plasma, e as globulinas.

A concentração sérica das proteínas totais reflete o estado nutricional do doente e

permite também obter informações acerca de eventuais patologias hepáticas e renais, entre

outras. Níveis séricos de proteínas totais diminuídos em relação ao valor de referência

(hipoproteinemia) podem resultar de uma perda acentuada de proteínas (doença renal,

enteropatia) ou de uma síntese diminuída (doença hepática, má nutrição, má absorção

intestinal). Por outro lado, a hiperproteinemia pode ocorrer em situações de desidratação

ou devido a um aumento da síntese de proteínas, nomeadamente proteínas monoclonais,

como no MM. (1,18)

O doseamento das proteínas é também efetuado na urina (1ª da manhã, urina

ocasional, ou urina de 24 horas), sendo muito útil na avaliação da função renal. O rim tem

um papel crucial na manutenção da homeostase proteica no organismo, filtrando as

proteínas plasmáticas ao nível do glomérulo e reabsorvendo a maior parte ao nível dos

túbulos renais.

Um valor elevado de proteínas na urina (proteinúria) pode resultar de danos ao nível

dos glomérulos ou dos túbulos renais, ou ainda de um aumento da concentração plasmática

de proteínas livremente filtradas pelo rim, como a proteína de Bence-Jones. (1,16)




Albumina

A albumina é sintetizada no fígado e constitui a proteína mais abundante no plasma.

A determinação da concentração da albumina no soro foi anteriormente abordada no

capítulo 5.1.1.1.

O doseamento da albumina é também efetuado na urina (microalbumina). Quando

a função renal está normal, apenas uma pequena quantidade de albumina é filtrada pelo

glomérulo e excretada na urina (< 30 mg/24h).

Um valor aumentado da excreção urinária de albumina (> 30 mg/24h e ≤ 300

mg/24h) designa-se microalbuminúria. A microalbuminúria constitui um indicador inicial

de lesão glomerular, que pode ocorrer na diabetes e em várias formas de glomerulonefrite,

entre outras patologias. Assim, a determinação da concentração da albumina na urina tem

grande importância no acompanhamento de doentes com Diabetes Mellitus, uma vez que a

deteção de microalbuminúria constitui um sinal precoce de nefropatia diabética, uma das

principais complicações da diabetes. (1,16,60)

Proteína C Reativa (PCR)

A proteína C reativa é sintetizada no fígado e é uma das primeiras proteínas de fase

aguda a aumentar em resposta a um processo inflamatório. A determinação da concentração

sérica da PCR é utilizada como marcador de inflamação ou infeção agudas, estando

aumentada em infeções bacterianas, após um enfarte agudo do miocárdio (EAM) e em

situações de trauma ou stress, entre outras. (16,18)

7.3. Metabolismo dos Hidratos de Carbono

Glucose

A glucose é a principal fonte de energia do organismo e a sua concentração no

sangue é regulada através da ação de várias hormonas, como a insulina, o glucagon e a

epinefrina, entre outras.

Alterações no metabolismo da glucose podem dar origem a situações de

hiperglicemia, cuja causa mais comum é a diabetes mellitus, ou de hipoglicemia,

principalmente causada pela terapêutica com insulina ou outros fármacos que aumentam a

sua secreção, nos doentes diabéticos. (1,16)




7.3.1. Diagnóstico e Monitorização de Diabetes Mellitus

A diabetes mellitus (DM) consiste num grupo de desordens metabólicas que se

caracterizam por hiperglicemia, resultante de deficiências na secreção e/ou ação da

insulina.

De acordo com a norma emitida pela DGS, o diagnóstico de diabetes é feito com

base nos seguintes critérios: (18,61)

Glicemia de jejum ≥ 126 mg/dl (ou ≥ 7,0 mmol/L); ou

Sintomas clássicos + glicemia ocasional ≥ 200 mg/dL (ou ≥ 11,1 mmol/L);

ou

Glicemia ≥ 200 mg/dL (ou ≥ 11,1 mmol/L) às 2 horas, na prova de

tolerância à glicose oral (PTGO) com 75g de glicose; ou

Hemoglobina glicada A1c (HbA1c) ≥ 6,5%.

Existem ainda dois estadios intermédios de homeostase da glucose: a anomalia da

glicemia de jejum (AGJ) e a tolerância diminuída à glucose após sobrecarga oral com 75 g

de glucose (TDG). Estes dois estadios identificam indivíduos para os quais existe um risco

aumentado de desenvolver diabetes e doença cardiovascular. (61)

Prova de Tolerância à Glucose Oral (PTGO)

A PTGO consiste na determinação da concentração da glucose no soro antes e após

a ingestão de uma sobrecarga de 75g de glucose. As colheitas de sangue e respetivos

doseamentos da glucose são feitos às 0 horas (antes da sobrecarga de glucose) e às 2 horas

após a ingestão da glucose. Nas mulheres grávidas, o doseamento é feito às 0, 1 e 2 horas.

Esta prova deve ser realizada de manhã e após um jejum de 8 a 14 horas.

A PTGO é principalmente utilizada para o diagnóstico de TDG (glicemia às

2h ≥ 140 e <200 mg/dL) e de diabetes gestacional. No caso da diabetes gestacional, a

PTGO é realizada entre as 24 e 28 semanas de gestação, quando se verifica uma glicemia

de jejum inferior a 92 mg/dL. (1,61)

Hemoglobina Glicada (Hb A1c)

A hemoglobina glicada resulta de uma reação não enzimática entre a glucose e os

grupos amina da hemoglobina. Os níveis de Hb A1c dependem da concentração de glucose

no sangue e do tempo de vida dos eritrócitos. A formação da Hb A1c é diretamente

proporcional à concentração de glucose no sangue e, uma vez que o tempo médio de vida




dos eritrócitos é de 120 dias, a Hb A1c reflete o nível médio de glucose no sangue dos

últimos 2 a 3 meses que antecedem a determinação.

Assim, a determinação da Hb A1c é utilizada não só para o diagnóstico de diabetes,

mas também para a monitorização dos doentes diabéticos, uma vez que permite obter

informações acerca dos níveis de glucose no sangue a longo prazo. No laboratório de

Química Clínica, o doseamento da Hb A1c é realizado no equipamento ADAMS A1C HA-

8180T em amostras de sangue total. (16,18)

7.4. Metabolismo dos Lípidos

Os lípidos possuem gande importância biológica devido às funções que

desempenham a diversos níveis: atuam como hormonas, são fonte de energia, auxiliam na

digestão e são componentes estruturais das membranas celulares.

A avaliação dos lípidos e lipoproteínas é fundamental para o diagnóstico de

dislipidémias. As dislipidémias são um dos principais fatores de risco da aterosclerose, que

está na base de diversas doenças cardiovasculares (DCV). Assim, a determinação dos

lípidos e lipoproteínas permite avaliar o risco cardiovascular de um indivíduo, sendo

avaliado o seguinte perfil lipídico: colesterol total (CT), triglicéridos (TG), colesterol HDL

(c‐HDL) e colesterol LDL (c‐LDL). (16,18,62)

Colesterol Total

O colesterol participa em vários processos metabólicos do organismo, sendo

fundamental como: componente da estrutura das membranas celulares, precursor das

hormonas esteróides e também dos ácidos biliares. Embora uma pequena parte do colesterol

seja proveniente da alimentação (via exógena), a maior parte é sintetizada principalmente

no fígado e também no intestino.

A determinação do colesterol total no soro é útil no diagnóstico e caraterização das

dislipidémias, e também na avaliação do risco cardiovascular. Um valor aumentado de CT

está associado a um maior risco cardiovascular, contudo estes valores devem ser

interpretados em conjunto com os outros parâmetros determinados no perfil lipídico,

principalmente com o c-LDL. (18,62)




Triglicéridos

Os triglicéridos são ésteres do glicerol que podem ser obtidos a partir da dieta, ou

podem ser sintetizados no fígado. Constituem cerca de 95% do armazenamento tecidular

de gorduras e são uma importante fonte de energia para as células.

O doseamento dos TG tem interesse clínico no diagnóstico das dislipidémias e na

escolha da terapêutica e, para além disso, acrescenta informação sobre o risco

cardiovascular. (16,62)

Lipoproteínas

As lipoproteínas são macromoléculas que transportam os lípidos no plasma. São

constituídas por colesterol esterificado e triglicéridos no núcleo, e por colesterol livre,

fosfolípidos e uma ou mais proteínas (apolipoproteínas) à superfície. As proporções de

proteínas e lípidos determinam a densidade das lipoproteínas, que permite classificá-las em

cinco principais classes: quilomicras, VLDL (very-low density lipoprotein), IDL

(intermediate-density lipoprotein), LDL (low-density lipoprotein) e HDL (high-density

lipoprotein). (1,16)

Colesterol HDL

As HDL são responsáveis pelo transporte reverso do colesterol dos tecidos para o

fígado. As concentrações séricas de c-HDL correlacionam-se inversamente com o risco de

DCV, pelo que concentrações elevadas têm um efeito protetor, estando assim associadas a

um menor risco cardiovascular. Contrariamente, valores diminuídos de c-HDL estão

associados a um aumento do risco cardiovascular. (1,16)

Colesterol LDL

As LDL são constituídas por cerca de 50% de colesterol e são responsáveis pelo seu

transporte até aos tecidos. O colesterol das LDL é aquele que se deposita nas paredes das

artérias, contribuindo para a formação de placas de aterosclerose.

O c-LDL constitui o principal parâmetro na avaliação lipídica, sendo que níveis

séricos elevados estão associados a um alto risco cardiovascular. A determinação do c-LDL

sérico é realizada indiretamente, através da fórmula de Friedewald:

𝑐𝐿𝐷𝐿 = 𝐶𝑇 − (𝑐𝐻𝐷𝐿 + 𝑇𝐺

5)




No entanto, quando o valor de TG é superior a 400 mg/dL, o c-LDL não deve ser

calculado através desta fórmula, uma vez que o fator TG/5 não permite obter um valor

correto do colesterol VLDL, induzindo erros no valor do c-LDL calculado. Assim, nestes

casos, o colesterol LDL é determinado através de um método direto, no equipamento Cobas

8000. (16,18,62)

7.5. Função Renal

Creatinina

A creatinina é maioritariamente resultante do metabolismo da creatina e da

fosfocreatina no músculo, embora uma pequena parte possa também ser obtida a partir da

carne ingerida na alimentação. É libertada para o plasma a uma taxa constante, que é

proporcional à massa muscular, e é excretada na urina.

A determinação da creatinina é o parâmetro mais utilizado na avaliação da função

renal uma vez que, para além de ser sintetizada a uma taxa constante, é livremente filtrada

pelo glomérulo e não é reabsorvida nos túbulos renais, sendo que apenas uma pequena parte

é secretada por estes. Assim, o doseamento da creatinina no soro é utilizado para avaliar a

função renal tanto no que se refere à severidade da lesão como à progressão da doença

renal, dado que a sua concentração é inversamente proporcional à taxa de filtração

glomerular (TFG).

No entanto, a concentração da creatinina é afetada pela massa muscular, pela

alimentação (ingestão de carne) e por determinados fármacos, entre outros fatores e, para

além disso, os seus níveis não aumentam de forma detetável até que haja uma lesão

significativa da função renal. Desta forma, a creatinina é um marcador de lesão renal pouco

sensível, pelo que deve ser determinada a clearance da creatinina, que é um indicador mais

sensível da TFG. (1,16,18)

A clearance da creatinina mede a velocidade a que a creatinina é removida do

sangue pelos rins (normalmente expressa em mL/min) e a sua determinação é utilizada para

calcular a TFG. Para a determinação da clearance da creatinina, para além da amostra de

soro, é necessária uma amostra de urina de 24 horas. Esta é calculada a partir da seguinte

fómula: (18)




Clearance creatinina (mL/min) = Ucreatinina (mg dL⁄ ) x Vurina (ml)

Pcreatinina (mg dL)⁄ x 1440 (min)

Ucreatinina – concentração da creatinina na urina

Vurina – volume excretado durante as 24h

Pcreatinina – concentração da creatinina no soro

Ureia

A ureia resulta do catabolismo das proteínas e aminoácidos. É sintetizada no fígado

e é predominantemente eliminada pelos rins. A determinação da concentração da ureia no

soro é utilizada para avaliar a função renal, sendo útil no diagnóstico de doença renal e na

monitorização da eficácia da diálise.

Um valor aumentado de ureia no soro designa-se azotemia e pode resultar de causas

pré-renais, renais e pós-renais. A análise da ureia é feita normalmente em conjunto com a

creatinina sérica, o que permite diferenciar a causa de azotemia em pré-renal, renal ou pós-

renal. (16,18)

Ácido Úrico

O ácido úrico é o principal produto do catabolismo das purinas (adenosina e

guanina), que ocorre no fígado. É maioritariamente eliminado pelos rins, embora após a

filtração no glomérulo seja reabsorvido quase na totalidade nos túbulos proximais.

A determinação da concentração do ácido úrico no soro é utilizada no diagnóstico

de doenças hereditárias do metabolismo das purinas, no diagnóstico e monitorização do

tratamento de gota, como auxiliar no diagnóstico de cálculos renais e ainda na avaliação da

função renal. (16,18)

7.6. Função Hepática

Aminotransferases – AST e ALT

As aminotransferases aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase

(ALT) são enzimas amplamente distribuídas no organismo, sendo que a AST está presente

no coração, fígado, músculo esquelético e rins, enquanto a ALT está principalmente

presente no fígado e também nos rins. A AST e a ALT são enzimas celulares, pelo que

quando ocorrem danos nos tecidos onde elas se encontram, estas são libertadas para o

plasma, verificando-se um aumento da sua concentração.




O doseamento destas duas enzimas no soro é utilizado na avaliação da função

hepática, sendo que a ALT é a mais específica do fígado e níveis elevados da sua atividade

raramente são encontrados noutras patologias que não as hepáticas. Na maior parte das

patologias hepáticas a atividade da ALT é superior à da AST, nomeadamente nas patologias

agudas. No entanto, em patologias como a hepatite alcoólica, cirrose hepática e ainda em

neoplasias do fígado, os níveis da atividade da AST são superiores aos da ALT. (16,18)

Fosfatase Alcalina

A fosfatase alcalina (ALP) é uma enzima que está presente na maior parte dos

tecidos do organismo, encontrando-se em concentrações particularmente elevadas no

fígado, osso, rim e intestino. A determinação da ALP no soro tem particular valor clínico

no estudo de patologias hepatobiliares e ósseas.

No que diz respeito às patologias hepatobiliares, verificam-se valores de ALP mais

elevados nas patologias obstrutivas do que nas hepatocelulares. As patologias obstrutivas

podem ser intra ou extra-hepáticas, sendo que nestas últimas os valores de ALP estão

normalmente mais aumentados. (16,18)

γ-glutamiltransferase

A γ-glutamiltransferase (GGT) é uma enzima que está presente principalmente no

rim, fígado, pâncreas e intestino. Embora o rim apresente a concentração mais elevada de

GGT, a enzima que está presente no soro tem origem essencialmente no sistema

hepatobiliar, pelo que o doseamento da GGT no soro é utilizado no estudo das patologias

hepatobiliares, constituindo um indicador sensível das mesmas.

À semelhança da ALP, a atividade da GGT é mais elevada em situações de

obstrução biliar intra ou extra-hepática, do que nas patologias hepatocelulares. Para além

destas patologias, valores aumentados de GGT podem também ser encontrados em casos

de alcoolismo. (16,18)

Bilirrubina Total e Direta

A bilirrubina é um pigmento da bílis que deriva maioritariamente (cerca de 85%)

do metabolismo do heme da hemoglobina libertada pela destruição dos eritrócitos

senescentes. Os restantes 15% da bilirrubina produzida resultam do catabolismo de outras

proteínas que contêm grupos heme. Uma vez produzida, a bilirrubina é transportada para o




fígado ligada à albumina, dado que é insolúvel em água - bilirrubina não conjugada. No

fígado, a bilirrubina é conjugada com ácido glucorónico – bilirrubina conjugada – e é

excretada na bílis e lançada no intestino onde é hidrolisada.

No laboratório é feito o doseamento da bilirrubina direta (conjugada) e da

bilirrubina total, que corresponde à soma da bilirrubina direta e da indireta (não conjugada).

Os níveis de bilirrubina direta estão aumentados principalmente em situações de obstrução

biliar devido a cálculos biliares ou a tumores, mas também em patologias nas quais ocorre

lesão hepatocelular, como por exemplo a hepatite (viral, tóxica). Por sua vez, concentrações

aumentadas de bilirrubina indireta podem ser encontradas nas anemias hemolíticas, em

patologias do metabolismo da bilirrubina como a síndrome de Gilbert e também em

situações de lesão hepatocelular. (1,16,18)

7.7. Função Pancreática

Amilase

A amílase é uma enzima que catalisa a hidrólise do amido e do glicogénio. Está

presente em vários órgãos e tecidos, embora se encontre em maior concentração no

pâncreas e nas glândulas salivares. A determinação da amilase no soro é útil no diagnóstico

de pancreatite aguda, onde se verificam concentrações aumentadas. Contudo, valores

elevados de amílase podem também ocorrer noutras patologias intra-abdominais e em

lesões das glândulas salivares, pelo que a determinação desta enzima não é um teste

específico de pancreatitie aguda. (16,18)

Lipase

A lipase é uma enzima que hidrolisa os ésteres de glicerol dos ácidos gordos de

cadeia longa. Encontra-se em maior concentração no pâncreas e o seu doseamento no soro

é utilizado no diagnóstico de pancreatite aguda. À semelhança da amílase, concentrações

aumentadas de lipase podem também ser encontradas noutras patologias intra-abdominais,

no entanto, e apesar de os níveis de ambas as enzimas aumentarem rapidamente, a lipase

permanece elevada durante mais tempo, pelo que é considerada um indicador mais

específico de pancreatite aguda do que a amilase. (16,18)




7.8. Ionograma

Os eletrólitos estão envolvidos em vários processos biológicos essenciais, tendo

como funções a manutenção da pressão osmótica, a regulação da distribuição da água no

organismo e a regulação da função muscular, entre outras.

O ionograma consiste na avaliação de três dos principais eletrólitos, o sódio (Na+),

o potássio (K+) e o cloro (Cl-), uma vez que a determinação da sua concentração permite

obter informações mais relevantes acerca do equilíbrio eletrolítico do organismo. (16)

Sódio

O sódio é o principal catião do líquido extracelular e os seus níveis sanguíneos são

regulados pelo sistema renal, sendo que cerca de 60 a 75% do Na+ é reabsorvido nos

túbulos proximais e o restante é excretado na urina.

Concentrações séricas diminuídas de Na+ (hiponatremia) podem ocorrer devido a

uma perda aumentada (diminuição da produção de aldosterona, uso de determinados

diuréticos, nefropatia, vómito prolongado), à retenção de água (insuficiência renal,

cardíaca) ou a uma ingestão excessiva de água. Por outro lado, situações de hipernatremia

podem resultar de uma perda aumentada de água em relação à perda de Na+ (diabetes

insipidus, patologia tubular renal, queimaduras severas), de uma ingestão diminuída de

água, ou ainda de uma ingestão ou retenção excessivas de Na+ (administração de soluções

de sódio hipertónicas, hiperaldosteronismo). (16,18)

Potássio

O potássio (K+) é o principal catião intracelular e desempenha funções essenciais

na contração do músculo esquelético e cardíaco, bem como na regulação do volume do

líquido intracelular. A sua concentração no plasma é regulada pela função renal e pela ação

da aldosterona.

Concentrações séricas diminuídas de K+ (hipocaliemia) podem ser causadas por

perdas gastrointestinais (vómitos, diarreia), perdas urinárias (patologias renais), por uma

redistribuição do K+ extracelular para o líquido intracelular, ou por uma ingestão

insuficiente de potássio. A hipercaliemia pode ocorrer devido a uma excreção de K+

diminuída (insuficiência renal aguda ou crónica, diuréticos), a uma redistribuição do K+

ou a uma ingestão aumentada. (16,18)




Cloro

O cloro (Cl-) é o principal anião extracelular e, tal como o sódio, está envolvido na

manutenção da distribuição da água, da pressão osmótica e do balanço de aniões e catiões

no líquido extracelular. O Cl- é filtrado pelo glomérulo e depois reabsorvido passivamente

nos túbulos proximais, sendo que o excesso é excretado na urina e também no suor.

A concentração de Cl- no plasma normalmente acompanha a do Na+ pelo que, de

uma maneira geral, as causas de hipocloremia e hipercloremia são as mesmas da

hiponatremia e hipernatremia, respetivamente. Contudo, a hipocloremia pode também

resultar de situações de alcalose metabólica. Por sua vez, a hipercloremia pode também

ocorrer na acidose metabólica. (16,18)

7.9. Função Cardíaca

Creatina Cinase (CK)

A creatina cinase é uma enzima que está presente em diversos tecidos do organismo,

principalmente no músculo esquelético, músculo cardíaco e no cérebro. Esta enzima

apresenta três isoenzimas: a CK-MM, que se encontra sobretudo no músculo esquelético e

no coração; a CK-MB, encontrada principalmente no miocárdio; e a CK-BB, a isoenzima

predominante no cérebro. Em indivíduos saudáveis, a atividade da CK no soro deve-se

quase na totalidade à CK-MM.

Assim, valores séricos elevados de CK verificam-se quando ocorre lesão do

músculo esquelético, particularmente em casos de distrofia muscular, ou do músculo

cardíaco, constituindo um indicador de EAM. Contudo, a CK é um marcador de EAM

pouco específico, uma vez que a sua atividade está aumentada noutras patologias, pelo que

é necessário realizar a determinação de outros marcadores cardíacos. (16,18)

Mioglobina

A mioglobina é uma proteína transportadora de oxigénio que se encontra presente

no músculo esquelético e cardíaco. A determinação da sua concentração no soro é utilizada

no diagnóstico ou na exclusão de EAM. A mioglobina constitui um marcador precoce de

EAM, uma vez que os seus níveis séricos são os primeiros a aumentar, cerca de 2 a 3 horas

após o início dos sintomas. No entanto, a mioglobina não é um marcador cardíaco




específico, dado que também está aumentada em determinadas patologias musculares, pelo

que deve ser avaliada em conjunto com outros marcadores cardíacos. (16,18)

Troponina T

A troponina é um complexo de três proteínas (troponina T, I e C) que se encontram

ligadas à actina do músculo cardíaco e do músculo esquelético, e que têm como função

regular a contração muscular. A determinação sérica das troponinas é utilizada no

diagnóstico de EAM, sendo que apenas a troponina T e a troponina I são específicas do

músculo cardíaco. As troponinas constituem o marcador cardíaco de eleição para o

diagnóstico de EAM, uma vez que apresentam uma elevada sensibilidade e especificidade

para a deteção de lesão do miocárdio e, para além disso, os seus níveis mantêm-se elevados

durante vários dias. (16,18)

No laboratório de Química Clínica é feito o doseamento da Troponina T, cuja

concentração no soro começa a aumentar poucas horas após o início dos sintomas,

permanecendo elevada durante 7 a 10 dias.

7.10. Marcadores de Anemia

Ferro

O ferro é um elemento essencial para o organismo, uma vez que participa em

diversos processos vitais, como o transporte de oxigénio e as reações oxidação-redução. É

obtido através da alimentação na forma férrica (Fe3+), sendo reduzido à forma ferrosa

(Fe2+) para que possa ser absorvido no intestino. Após ser absorvido, é transportado no

plasma pela transferrina. A maior parte do ferro do organismo está incorporado na

hemoglobina e também na mioglobina, sendo que o restante se encontra armazenado na

forma de ferritina e de hemossiderina.

A determinação da concentração sérica do ferro é utilizada no estudo das alterações

do metabolismo do ferro, sendo principalmente útil no diagnóstico diferencial e

monitorização de anemias. Valores diminuídos de ferro ocorrem em situações de

ferropenia, com ou sem anemia associada, e em patologias inflamatórias crónicas.

Concentrações séricas de ferro aumentadas podem ser observadas em patologias nas quais

há um excesso de ferro, como a hemocromatose, em patologias hepáticas agudas e ainda

em situações de ingestão aumentada de ferro. (16,18)




Ferritina

A ferritina é uma proteína que está presente na maior parte das células e constitui a

reserva de ferro rapidamente mobilizável do organismo. O doseamento da ferritina no soro

permite avaliar a quantidade de ferro armazenado no organismo. Níveis de ferritina

diminuídos constituem um indicador sensível de deficiência de ferro, uma vez que a sua

concentração começa a diminuir numa fase inical do desenvolvimento deste estado. Por

outro lado, valores elevados podem ser observados em doentes com hemocromatose, bem

como em diversas patologias inflamatórias e infeciosas agudas, dado que a ferritina é uma

proteína de fase aguda. (16,18)

Vitamina B12

A vitamina B12 (ou cobalamina) é essencial para a hematopoiese, participando na

síntese de DNA. É obtida através da alimentação e é absorvida no íleo, através do complexo

formado pela ligação ao fator intrínseco, sendo depois armazenada no fígado.

O principal interesse clínico da determinação da vitamina B12 no soro está

relacionado com o estudo de alterações hematológicas associadas à deficiência desta

vitamina, como a anemia megaloblástica. O défice de vitamina B12 pode resultar de uma

absorção diminuída, principalmente devida a uma produção deficiente de fator intrínseco

(anemia perniciosa), mas também à má absorção intestinal causada por outras patologias,

ou pode resultar de uma ingestão alimentar insuficiente desta vitamina. (16,18)

Folatos (Ácido Fólico)

Os folatos, nos quais se inclui o ácido fólico, são uma família de compostos que

atuam como coenzimas em diversas reações metabólicas. Estes intervêm na síntese do

DNA, sendo por isso importantes na eritropoiese. São obtidos através da alimentação e

absorvidos no intestino.

À semelhança da vitamina B12, défices de ácido fólico estão também na origem de

anemias megaloblásticas. Concentrações séricas diminuídas de folatos podem resultar de

uma má absorção intestinal, de uma ingestão insuficiente ou de uma necessidade acrescida

de folatos como na gravidez, entre outros. (16,18)




7.11. Metabolismo Ósseo e Mineral

Cálcio

O cálcio é um elemento essencial para o organismo, desempenhando um papel

fundamental em vários processos fisiológicos, como a contração muscular, mineralização

óssea, coagulação sanguínea e secreção de hormonas, entre outros. Cerca de 99% do cálcio

está presente no osso e o restante encontra-se em circulação no plasma. A concentração do

cálcio no plasma é regulada essencialmente pela hormona paratiroide (PTH) e pela

vitamina D.

O doseamento do cálcio no soro é utilizado no diagnóstico e monitorização de várias

patologias, entre as quais patologias das glândulas paratiroides, patologias ósseas e renais,

nas quais se verificam alterações do metabolismo do cálcio que se traduzem em

hipocalcemia ou hipercalcemia. A hipocalcemia tem como principais causas o

hipoparatiroidismo, a insuficiência renal crónica e a deficiência de vitamina D. Por sua vez,

as principais causas de hipercalcemia são o hiperparatiroidismo e também algumas

neoplasias. (16,18)

Fósforo

O fósforo é um elemento amplamente distribuído no organismo, sendo que a maior

parte se encontra no osso (hidroxiapatite), na forma inorgânica. O restante encontra-se nos

tecidos na forma orgânica e cerca de 1% está em circulação no plasma, na forma inorgânica.

O fósforo é fundamental em vários processos bioquímicos como a mineralização óssea e o

transporte e armazenamento de energia (ATP).

A determinação da concentração sérica do fósforo é utilizada no estudo das

alterações do metabolismo do cálcio e do fósforo, que resultam em hipofosfatemia ou

hiperfosfatemia. A hipofosfatemia pode resultar de uma excreção renal aumentada

(principalmente associada ao hiperparatiroidismo), de uma absorção intestinal de fósforo

diminuída, ou de uma redistribuição do fósforo dos espaços extracelulares para os

intracelulares. A hiperfosfatemia deve-se normalmente a uma excreção renal de fósforo

diminuída, principalmente causada por insuficiência renal ou por

hipoparatiroidismo.(16,18)




Hormona Paratiroide (PTH)

A PTH é sintetizada e secretada pelas glândulas paratiroides, sendo responsável pela

regulação da concentração do cálcio no sangue. A PTH atua diretamente no osso, rim e,

indiretamente, no intestino, aumentando a concentração de cálcio no sangue e promovendo

também a diminuição da concentração de fósforo. O cálcio é assim o principal regulador

da secreção da PTH, uma vez que quando a concentração de cálcio está diminuída, a

secreção da PTH é estimulada, e quando está aumentada, a secreção da PTH é inibida.

O doseamento da PTH no soro é útil no diagnóstico diferencial de hipercalcemia e

hipocalcemia, bem como na avaliação da função das glândulas paratiroides em patologias

ósseas e na insuficiência renal. (16,18)

7.12. Função Tiroideia

A tiroide é responsável pela produção das hormonas tiroideias, a tiroxina (T4) e a

triiodotironina (T3), que desempenham um papel fundamental na regulação do

metabolismo do organismo e em diversas outras funções. A síntese e secreção das

hormonas tiroideias é controlada por um mecanismo de feedback negativo que envolve a

hormona libertadora de tirotrofina (TRH), libertada pelo hipotálamo, a hormona

estimulante da tiroide (TSH), produzida pela hipófise anterior, e as hormonas

tiroideias.(18,63)

No laboratório de Química Clínica, a avaliação da função tiroideia é realizada

através do doseamento da TSH e das hormonas tiroideias T4 e T3 livres, embora a TSH e a

T4 livre sejam os dois parâmetros que melhor permitem fazer o diagnóstico das disfunções

da tiroide, nomeadamente o hipotiroidismo e o hipertiroidismo.

TSH

A TSH é uma glicoproteína cuja função é estimular a tiroide a produzir e libertar as

hormonas tiroideias. A síntese e libertação da TSH são estimuladas pela TRH e reguladas

pelo feedback negativo das hormonas tiroideias. Assim, um aumento de T3 ou T4 inibe a

secreção de TSH e TRH, enquanto a sua diminuição estimula a libertação da TRH e TSH.

A determinação da TSH no soro é o teste mais útil para o estudo da função tiroideia,

uma vez que apresenta uma maior sensibilidade para a deteção de hipotiroidismo,

hipertiroidismo e também de hipo ou hipertiroidismo subclínico. Para além disso, o




doseamento da TSH é também utilizado na monitorização da terapêutica de substituição

hormonal. (1,18)

T4 Livre

A T4 é a principal hormona tiroideia e em circulação encontra-se ligada quase na

totalidade a proteínas de transporte, constituindo a fração biologicamente inativa.

Apenas uma pequena fração se encontra livre, sendo esta a fração biologicamente

ativa. Uma vez que a maior parte da T4 está ligada a proteínas, alterações nestas proteínas

irão assim afetar os níveis de T4, pelo que o doseamento da T4 livre (T4L) constitui um

melhor parâmetro para avaliar a função tiroideia do que a T4 total.

A determinação da concentração sérica da T4L, em conjunto com a TSH, é também

de grande importância para o diagnóstico e monitorização do hipotiroidismo e

hipertiroidismo. Valores diminuídos de T4L associados a uma TSH aumentada são

indicativos de hipotiroidismo, enquanto níveis aumentados de T4L combinados com uma

TSH diminuída indicam hipertiroidismo. (16,18)

T3 Livre

Tal como a T4, a T3 encontra-se maioritariamente ligada a proteínas e apenas uma

pequena parte na forma livre. A determinação da T3 livre (T3L) é útil no diagnóstico de

hipertiroidismo, especialmente em determinados casos em que se verificam valores

elevados de T3L mas em que os valores de T4L são normais. (1,16)

7.13. Marcadores Tumorais

Os marcadores tumorais englobam um conjunto de diversas moléculas (proteínas,

enzimas, hormonas, etc) que são produzidas diretamente pelas células tumorais ou por

outras células do organismo em resposta a estas células.

Idealmente, um marcador tumoral deveria ser específico para um determinado tipo

de neoplasia, não deveria estar presente em indivíduos saudáveis ou noutras patologias

benignas e deveria ser suficientemente sensível para o diagnóstico precoce ou para o

rastreio de uma determinada neoplasia. No entanto, os marcadores atualmente disponíveis

não satisfazem todas estas condições, pelo que a sua utilidade no diagnóstico de neoplasias

é limitada, com excepção do PSA, que apresenta utilidade no diagnóstico precoce do

carcinoma da próstata em indivíduos de risco elevado, em conjunto com outros exames




complementares. Assim, de uma forma geral, os marcadores tumorais são

fundamentalmente utilizados na monitorização do tratamento e da progressão das

neoplasias, no prognóstico, estadiamento e/ou na deteção de recidivas. (16,18,64)

Na tabela seguinte, são apresentados os marcadores tumorais determinados no

laboratório de Química Clínica e as suas características, bem como a sua aplicação e

correlação clínicas. O doseamento destes marcadores é feito em amostras de soro no

equipamento Cobas 8000 (e 602), à excepção do Cyfra 21.1, que é doseado no equipamento

Architect i1000SR.

Tabela 4 - Marcadores tumorais determinados no laboratório, características, utilidade e correlação clínicas (1,16,18)

Marcador Tumoral Características Utilidade e Correlação Clínicas

α-Fetoproteína (AFP)

Glicoproteína sintetizada

durante o desenvolvimento

embrionário pelo saco

vitelino e pelo fígado fetal.

- Monitorização do tratamento e

determinação do prognóstico do carcinoma

hepatocelular, mas também de tumores das

células germinativas (testículo)

CA 15.3 Antigénio glicoproteico de

superfície celular - Monitorização do tratamento e da

progressão do carcinoma da mama

CA 19.9 Antigénio glicoproteico

- Monitorização e determinação do

prognóstico do carcinoma do pâncreas.

- Monitorização de outros carcinomas

gastrointestinais (colorretal e gástrico)

CA 125 Antigénio glicoproteico

- Monitorização da resposta ao tratamento e

deteção de recidivas do carcinoma do ovário.

- Determinação do prognóstico do carcinoma

do endométrio.

Antigénio

Carcinoembrionário

(CEA)

Glicoproteína expressa

durante o desenvolvimento

fetal.

- Monitorização do tratamento e progressão,

e estadiamento do carcinoma colorretal.

- Monitorização de carcinomas da mama,

pulmão e gastrointestinais.

Cyfra 21.1

Proteína presente no

citoesqueleto de células

epiteliais

Monitorização da evolução do carcinoma do

pulmão

Enolase Neuro-

específica (NSE)

Enzima glicolítica que se

encontra no tecido nervoso

e nas células do sistema

neuroendócrino

Indicador de prognóstico da evolução de

tumores de origem neuroendócrina

Antigénio Específico

da Próstata (PSA)

Total e Livre

- Proteína sintetizada pela

próstata. É secretada no

líquido seminal e tem uma

função fluidificante.

- Circula ligado a proteínas

(AAT e α2-

macroglobulina) e uma

pequena parte na forma

livre.

PSA Total

- Monitorização de doentes com carcinoma

da próstata após tratamento.

- É também útil na deteção precoce de

carcinoma da próstata.

PSA Livre

- Determinado quando o valor de PSA total

está entre 4-10 ng/mL, para o cálculo da razão

PSA livre/PSA total.

- Esta razão permite discriminar aumentos de

PSA devidos a carcinoma da próstata ou a

hiperplasia benigna da próstata.




7.14. Serologia Infeciosa

A serologia infeciosa diz respeito ao estudo de doenças infeciosas causadas por

diversos microrganismos, através da deteção qualitativa e/ou quantitativa de anticorpos IgG

e IgM específicos contra o agente infecioso, embora em alguns casos possa também basear-

se na determinação de antigénios específicos destes microrganismos. Estes testes permitem

assim detetar a existência de infeção, avaliar o risco de transmissão e monitorizar a

evolução da doença e a resposta ao tratamento.

No laboratório de Química Clínica são realizadas serologias para os seguintes

microrganismos: Toxoplasma gondii, Vírus da Rubéola, Citomegalovírus (CMV), Vírus

Epstein-Barr (EBV), Vírus das Hepatites A, B e C, HIV, Treponema pallidum, Brucella,

Mycoplasma pneumoniae e Chlamydia pneumoniae. Todos os ensaios são realizados em

amostras de soro no equipamento Cobas 8000, com exceção das repetições de resultados

duvidosos de alguns testes e também dos testes de avidez das IgG, que são realizados no

Architect i1000SR.

7.14.1. Toxoplasmose, Rubéola e Citomegalovírus – Grupo TORCH

O diagnóstico de infeções por Toxoplasma gondii, pelo vírus da rubéola e por

citomegalovírus assume particular importância nas mulheres grávidas, principalmente

quando se tratam de infeções primárias, uma vez que estas são suscetíveis de transmissão

vertical, podendo conduzir a anomalias severas ou mesmo à morte fetal. Estes três

microrganismos fazem parte do grupo TORCH (Toxoplasma, Outros agentes, Rubéola,

CMV e Herpes Simplex), que designa um grupo de infeções congénitas/perinatais de

etiologia parasitária, viral e bacteriana, que podem resultar em consequências graves para

o feto. (1,65,66)

Assim, o rastreio das doenças infeciosas de transmissão vertical nas grávidas é de

extrema importância. O diagnóstico da toxoplasmose, rubéola e CMV é realizado através

da determinação dos anticorpos IgM e IgG específicos para cada um destes microrganismos

– anti-toxoplasma, anti-rubéola e anti-CMV, respetivamente. A interpretação dos

resultados é semelhante para estas três infeções e encontra-se resumida no esquema da

figura 24. (66)




A avidez das IgG (apenas realizada no casos de toxoplasmose e de infeção por

CMV) diz respeito à força da ligação dos anticorpos IgG no soro ao seu antigénio

específico. Este teste permite datar a infeção, de forma a diferenciar uma infeção recente

de uma infeção antiga. Assim, uma avidez forte é encontrada em infeções com mais de 4

meses de evolução, enquanto uma avidez fraca está associada a quadros infeciosos mais

recentes (< 4 meses). O estudo da avidez das IgG tem grande importância porque, no caso

de se tratar de uma infeção primária, permite averiguar se esta ocorreu durante a gravidez

o que, como referido anteriormente, pode levar a anomalias fetais graves, e também porque

a gravidade clínica da doença depende da data da infeção, sendo que quando esta se verifica

no 1º trimestre de gravidez, as consequências são mais graves. (1,66,67)

7.14.2. Sífilis

A sífilis é uma infeção sexualmente transmissível cujo agente etiológico é a bactéria

Treponema pallidum. Pode ser transmitida por via sexual, por transmissão vertical ou por

via sanguínea. A sífilis pode ser dividida em sífilis inicial e em sífilis tardia. (68)

O diagnóstico laboratorial da sífilis é feito com base em testes serológicos, que

incluem testes treponémicos e não-treponémicos. Os testes não-treponémicos detetam

anticorpos IgG e IgM dirigidos contra fosfolípidos da superfície do Treponema pallidum,

IgM e IgG específicas

Toxoplasmose, Rubéola e CMV

IgG −

IgM −

Sem evidência serológica de

infeção anterior

IgG +

IgM −

Imunidade:

- Provável infeção passada; ou

- Vacinação (Rubéola)

IgG −

IgM +

Provável infeção aguda

Repetir após cerca de 3 semanas

IgG +

IgM +

Infeção aguda ou reativação

Estudo da avidez das IgG

Figura 24 - Interpretação dos resultados da serologia para Toxoplasmose, Rubéola e CMV




denominados reaginas, através da utilização de um antigénio composto por cardiolipina,

lecitina e colesterol. Estes anticorpos podem também ser detetados noutras patologias, pelo

que estes testes são pouco específicos para a sífilis, podendo dar origem a resultados falsos

positivos. Os testes não-treponémicos podem ser qualitativos ou quantitativos, sendo que

os quantitativos permitem determinar o título de anticorpos através de diluições seriadas do

soro, tornando-os úteis na monitorização da resposta ao tratamento. Os testes não-

treponémicos mais utilizados são o VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory) e o

RPR (Rapid Plasma Reagin), que constituem técnicas manuais. (68,69) Os testes

treponémicos, por sua vez, detetam anticorpos específicos dirigidos contra antigénios do

Treponema pallidum, pelo que apresentam uma elevada especificidade.

De acordo com guidelines internacionais (OMS, CDC, IUSTI), o screening da sífilis

deve ser realizado através de um teste não treponémico e, caso o resultado seja positivo,

este deve ser confirmado através de um teste treponémico. Contudo, a abordagem ao

diagnóstico laboratorial da sífilis pode ser feita de diferentes formas, sendo que em alguns

laboratórios foi adotado o “algoritmo reverso”, no qual o screening é realizado através de

um teste treponémico automatizado, seguido de um teste não treponémico quantitativo.

Esta abordagem pode ser útil em laboratórios nos quais existe um grande volume de

amostras pois possibilita a automatização do processo. (69,70)

No laboratório de Química Clínica foi adotado este “algoritmo reverso”, sendo

realizado inicialmente um imunoensaio no equipamento Cobas 8000 (teste treponémico)

para o screening da sífilis. Este teste tem uma maior sensibilidade para a deteção da sífilis

inicial do que os testes não-treponémicos. Contudo, o teste treponémico geralmente

permanece positivo para o resto da vida do doente, não permitindo por isso distinguir uma

infeção ativa de uma infeção passada que já foi tratada.

Assim, perante um resultado positivo, no laboratório de Química Clínica é realizado

o RPR para confirmar o resultado e detetar a existência de uma infeção ativa, uma vez que

os títulos de anticorpos se correlacionam com a atividade da infeção. Este é também

utilizado para a monitorização do tratamento. (68) Para a realização do RPR é utilizado o

kit Macro-Vue RPR Card Tests. Neste teste é utilizada uma suspensão de um antigénio em

partículas de carvão, que é colocada no cartão de teste juntamente com a amostra de soro.

As reaginas eventualmente presentes na amostra vão ligar-se ao antigénio, originando

floculação macroscópica com uma co-aglutinação das partículas de carbono, que aparecem

como aglomerações negras, após rotação do cartão durante 8 minutos. Caso o resultado seja

negativo, observa-se apenas uma cor cinzenta clara. (71)




7.15. Exame Sumário de Urina

O exame sumário de urina, também denominado de urina tipo II, permite obter uma

ampla variedade de informações clínicas úteis no que diz respeito não só ao sistema

urinário, mas também a outros processos patológicos, nomeadamente metabólicos e

endócrinos.

A análise de urina tipo II inclui o exame físico-químico e a análise do sedimento

urinário. Preferencialmente, a amostra utilizada deve ser a primeira urina da manhã uma

vez que esta é mais concentrada, embora possam também ser utilizadas amostras de urina

aleatórias. (1)

Como referido anteriormente, o exame sumário de urina é realizado nos

equipamentos Aution MAX AX-4030 e sediMAX, ligados em cadeia.

7.15.1. Exame Físico-químico

O exame físico-químico é realizado no Aution MAX AX-4030. No exame químico

são utilizadas tiras de teste com várias áreas de reagentes, que permitem a determinação

quantitativa ou semi-quantitativa dos seguintes analitos: glucose, proteínas, bilirrubina,

urobilinogénio, pH, sangue, corpos cetónicos, nitritos e leucócitos. Por sua vez, o exame

físico inclui a avaliação da cor, densidade e turvação.

Na tabela seguinte é descrita, de uma forma resumida, a correlação clínica de cada

um dos parâmetros avaliados nos exames físico e químico.




Tabela 5 - Parâmetros determinados no exame físico-químico da urina e respetiva correlação clínica (16,18)

7.15.2. Análise do Sedimento Urinário

A análise do sedimento urinário é útil na deteção e avaliação de alterações renais e

do trato urinário, uma vez que permite detetar vários elementos presentes na urina que o

exame físico-químico não permite. A deteção destes elementos no sedimento urinário não

corresponde necessariamente a uma situação patológica, uma vez que muitos deles estão

normalmente presentes em pequenas quantidades. (1)

Como referido anteriormente, a avaliação do sedimento urinário é realizada no

equipamento sediMAX, que permite detetar e identificar os seguintes elementos: (16,18)

Células epiteliais – a presença de células epiteliais em baixo número na

urina é normal, uma vez que reflete a descamação normal do epitélio. Estas

Parâmetro Correlação Clínica

EXAME FÍSICO

Cor Depende da concentração da urina ou da presença de outros pigmentos

(hemoglobina, eritrócitos, mioglobina, pigmentos biliares…)

Densidade - Permite avaliar o estado de hidratação do organismo;

- Indicador da capacidade de concentração dos rins

Turvação A existência de turvação pode dever-se à precipitação de cristais ou à presença

de bactérias, leucócitos ou eritrócitos

EXAME QUÍMICO

Glucose - A glicosúria ocorre quando o limiar de reabsorção renal é ultrapassado.

- Está principalmente associada à DM, mas também a outras patologias

endócrinas e a disfunção tubular renal

Proteínas - Valores elevados de proteinúria são indicadores de lesão renal.

- Para valores >100 mg/dL, é realizado o doseamento das proteínas na urina

Bilirrubina Um resultado positivo pode indicar a existência de patologia hepatocelular ou

de obstrução biliar

Urobilinogénio Um resultado positivo pode dever-se a patologia hepatocelular ou a distúrbios

hemolíticos

pH O pH normal da urina é de cerca de 6,0. Variações do valor do pH podem

estar associadas a distúrbios no equilíbrio ácido-base, bem como a infeções

urinárias ou litíase renal

Sangue

- Um resultado positivo indica a presença de hemoglobina, eritrócitos ou

mioglobina.

- Associado a alterações a nível renal ou do trato urinário, e também a

hemólise intravascular, entre outros.

Corpos Cetónicos A cetonúria está principalmente associada à DM

Nitritos A presença de nitritos é indicadora de uma possível infeção urinária, uma vez

que muitas das bactérias patogénicas do trato urinário têm a capacidade de

reduzir o nitato a nitrito

Leucócitos - A presença de leucócitos é detetada com base na actividade da enzima

esterase dos leucócitos.

- Um resultado positivo pode indicar infeção do trato urinário




células podem ser de três tipos: escamosas, do epitélio de transição e

tubulares renais;

Eritrócitos – estão presentes em pequenas quantidades na urina. A presença

de um número elevado pode estar associada a diversas patologias do trato

urinário ou outras;

Leucócitos – estão também presentes em baixo número no sedimento

urinário. Um número elevado é indicador de infeção ou inflamação do trato

urinário;

Cilindros – são os únicos elementos encontrados no sedimento urinário cuja

origem é exclusivamente renal. Existem vários tipos de cilindros, os hialinos

são os mais frequentes e a sua presença em baixo número é normal. Nos

indivíduos com patologias renais, podem ser observados cilindros em

grande número, dos quais se podem destacar os eritrocitários e leucocitários;

Cristais – são formados pela precipitação de sais urinários, cuja

solubilidade é afetada por alterações do pH, temperatura ou concentração.

Os cristais mais frequentemente encontrados no sedimento urinário, como

os de oxalato de cálcio e os de ácido úrico, têm um significado clínico

limitado, exceto quando estão presentes em grande número. Contudo,

existem alguns cristais, como os de cistina ou de leucina, cuja presença na

urina está associada a processos patológicos.

Bactérias e leveduras.


VIII MAC Controlo de Qualidade


8. Controlo de Qualidade

Um dos principais objetivos prosseguidos pelos laboratórios de análises

clínicas/patologia clínica é a prestação de serviços de saúde de qualidade, com segurança e

profissionalismo, tendo em vista a satisfação das necessidades dos doentes. Nesse sentido,

e como referido anteriormente, o SPC do CHLO tem implementado um Sistema de Gestão

da Qualidade, que atua como promotor de excelentes práticas e de melhoria contínua. (2,72)

Para garantir a qualidade dos resultados fornecidos, é necessário controlar as três

fases do processo analítico. Na fase analítica, a garantia da qualidade é assegurada pelo

Controlo de Qualidade Interno (CQI) e pela Avaliação Externa da Qualidade (AEQ).

8.1. Controlo de Qualidade Interno

O CQI consiste no conjunto de procedimentos utilizados no laboratório para

monitorizar e avaliar os sistemas analíticos, com vista a garantir a fiabilidade e

reprodutibilidade dos resultados obtidos. Este processo permite validar os métodos

analíticos utilizados no laboratório e monitorizar a sua precisão, bem como detetar a

ocorrência de desvios e erros aleatórios, para que possam ser desenvolvidas ações

corretivas. (1,16)

No SPC, o CQI dos equipamentos utilizados é efetuado diariamente, antes do início

do processamento das amostras dos doentes. Nos Laboratórios de Hematologia, Hemostase

e Química, o controlo de alguns equipamentos é também efetuado no período da tarde, uma

vez que estes servem também o Laboratório de Urgência, que funciona 24h por dia.

Neste processo são utilizadas amostras de controlo com uma matriz biológica

semelhante às amostras dos doentes e com concentrações conhecidas. Geralmente são

utilizados 2 ou 3 níveis de controlo (um normal e um patológico ou, no caso de serem 3,

um normal e dois patológicos / um nível alto, um médio e um baixo), consoante o

equipamento ou os parâmetros determinados em cada equipamento. Os diferentes níveis de

controlo são normalmente testados em conjunto diariamente, no entanto, dependendo dos

equipamentos e dos parâmetros analíticos, estes poderão ser utilizados intercaladamente ou

apenas quando é necessário fazer a determinação dos respetivos parâmetros. Os controlos

são testados nas mesmas condições das amostras dos doentes e os resultados obtidos são

depois analisados estatisticamente.




Uma das principais ferramentas estatísticas utilizadas são as cartas de controlo

(gráficos de Levey-Jennings), que consistem numa representação gráfica da dispersão dos

resultados (desvio-padrão) em torno da média, em função do tempo (dias). A elaboração

de cartas de controlo permite assim, visualizar a evolução e controlar continuamente os

resultados obtidos para cada parâmetro analítico. (1,16) A interpretação das cartas de

controlo é feita com base nos limites e regras (regras de Westgard) de aceitação de

resultados definidos pelo SPC. De modo geral, os limites de aceitação definidos são de ± 2

SD (desvios-padrão) em relação à média.

No entanto, no laboratório de Química Clínica é utilizado um software específico

para a monitorização do controlo de qualidade, o InterQC. Este programa permite fazer a

gestão estatística interna e externa (comparação de resultados com outros laboratórios que

utilizam os mesmos métodos analíticos e os mesmos equipamentos) da qualidade analítica

do laboratório em tempo real, o que possibilita a avaliação da qualidade dos resultados do

laboratório a qualquer altura. O InterQC possui um módulo de objetivos que se baseia na

seleção, para cada ensaio, de um de vários objetivos definidos por diferentes associações.

Após a seleção do objetivo pretendido, o programa calcula automaticamente a regra

estatística mais adequada a adotar como critério de aceitação. (73)

Se os resultados dos controlos estiverem dentro dos limites de aceitação, é dado

início à análise das amostras. Caso os resultados dos controlos estejam fora dos limites

definidos, significa que o desempenho do sistema analítico não é adequado e que os

resultados obtidos não serão válidos, pelo que devem ser aplicadas medidas corretivas para

eliminar a fonte do erro. Uma das medidas que pode ser aplicada é a calibração analítica

do equipamento, que estabelece a relação entre o sinal medido pelo equipamento e o valor

quantitativo (concentração) do analito. Para isso são utilizados materiais de referência de

concentração conhecida e bem definida, que permitem obter uma reta de calibração a partir

da qual é possível determinar a concentração do analito que está a ser doseado. (1)

Sempre que ocorram alterações no sistema analítico, como a mudança de lote dos

reagentes ou alterações nos procedimentos e equipamentos, é efetuada a calibração e o

controlo de qualidade dos equipamentos, de forma a verificar o seu desempenho.

No Laboratório de Microbiologia, o CQI processa-se de forma diferente. No setor

da Bacteriologia, semanalmente é efetuado o controlo das cartas de identificação e de TSA

utilizadas no equipamento VITEK 2 e o controlo dos discos impregnados com antibióticos




utilizados nos TSA manuais, através da utilização de estirpes ATCC: Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis e Pseudomonas

aeruginosa.

Semanalmente é também realizado o controlo das atmosferas das jarras de

microaerofilia e de anaerobiose, sendo para isso utilizadas estirpes de Campylobacter jejuni

ATCC e de Pseudomonas aeruginosa ATCC, respetivamente.

Diariamente, é feito o controlo de esterilidade das soluções salinas utilizadas para

as suspensões e para os vários testes realizados. Por fim, é também efetuado o controlo dos

reagentes, meios de cultura e kits, sempre que é aberto um novo lote.

8.2. Avaliação Externa da Qualidade

A AEQ constitui um método de avaliação do desempenho do Laboratório, através

da participação em ensaios interlaboratoriais organizados por entidades externas. Estas

entidades enviam periodicamente amostras, cujo conteúdo é conhecido mas não é revelado

ao laboratório. As amostras são processadas e testadas nas mesmas condições que as

amostras dos doentes e os resultados são depois enviados à respetiva entidade, que os

analisa e elabora um relatório de avaliação, onde estes são comparados aos resultados

esperados e aos resultados obtidos pelos outros laboratórios participantes no programa de

AEQ. (1,8)

Desta forma, a AEQ permite, para cada parâmetro determinado no laboratório,

comparar os resultados obtidos com os resultados de outros laboratórios que utilizam os

mesmos métodos analíticos, avaliar a exatidão dos resultados e garantir a sua

reprodutibilidade, bem como detetar a ocorrência de não conformidades e de tendências

(erros sistemáticos), para que possam ser desenvolvidas ações corretivas. A participação

em programas de AEQ permite assim melhorar a performance do laboratório, aumentando

o nível da qualidade laboratorial. (1,74)

Os vários laboratórios do SPC participam em diversos programas de AEQ nacionais

e internacionais, que estão representados na tabela 6. A periodicidade dos ensaios varia

consoante os programas e os parâmetros analíticos (mensal, bimestral, trimestral,

semestral…).




Tabela 6 - Programas de AEQ em que o SPC participa

Laboratório Programas de AEQ

Microbiologia - UK NEQAS (United Kingdom National External Quality

Assessment Service);

Imunologia

- UK NEQAS;

- EUROIMMUN Institute for Quality Assurance;

- MBL Quality Control of Autoantibodies

Hematologia - UK NEQAS;

- INSA - Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade

Hemostase - WHO IEQAS (International External Quality Assessment

Schemes)

Química Clínica

- UK NEQAS;

- Reference Institute for Bioanalytics;

- LGC Standards

De salientar ainda, que o SPC colabora com o INSA (Instituto Nacional de Saúde

Doutor Ricardo Jorge) no Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade

(PNAEQ), nomeadamente os Laboratórios de Química Clínica e de Hematologia, que são

peritos (o Laboratório de Hematologia é também co-organizador) em diferentes programas.


VIII MAC Bibliografia


9. Bibliografia

1. McPherson RA, Pincus MR. Henry’s Clinical Diagnosis and Management By

Laboratory Methods. 23rd ed. ELSEVIER; 2017. 1823 p.

2. Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO) [Internet]. Available from:

http://www.chlo.min-saude.pt/

3. Maxdata. ClinidataXXI Patologia Clínica [Internet]. Available from:

http://www.maxdata.pt/pt/produto/3/clinidataxxi-patologia-clinica/

4. Roche. Products and Solutions 2016 Roche Diagnostics. 2016.

5. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical Microbiology. 8th ed. Medical

Microbiology 4th edition. Elsevier; 2016. 932 p.

6. Tille PM. Diagnostic Microbiology. 13th ed. Mosby; 2014. 1193 p.

7. Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G. Textbook of Diagnostic Microbiology. 5th

ed. Saunders; 2015. 1097 p.

8. Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) - Programa Nacional de

Controlo da Infecção (PNCI). Orientações para a Elaboração de um Manual de Boas

Práticas em Bacteriologia. 2004.

9. Biomérieux [Internet]. Available from: http://www.biomerieux.com/

10. Pincus DH. Microbial identification using the bioMérieux VITEK® 2 system.

Encycl Rapid Microbiol Methods. 2006;1–32.

11. Sociedade Portuguesa de Gastrenterologia (SPG). Diarreia: Avaliação e Tratamento

- Normas de Orientação Clínica. 2015.

12. CerTest BIOTEC. CERTEST Clostridium difficile GDH+Toxin A+B. 2013.

13. Mascia Brunelli S.p.a. Campylobacter Species Ag Card. 2010.

14. Sociedade Portuguesa de Neonatologia (SPP) - Secção de Neonatologia. Consenso

Clínico - Rastreio e Prevenção da Doença Perinatal causada pelo Streptococcus

agalactiae. 2013.

15. DGS - Direção Geral de Saúde. Norma da Direção Geral de Saúde - Exames

laboratoriais na Gravidez de Baixo Risco. 2013.

16. Burtis CA, Bruns DE. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry and Molecular

Diagnostics. 7th ed. Saunders; 2015. 1103 p.

17. SIEMENS Healthineers. BN ProSpec System [Internet]. Available from:

https://www.healthcare.siemens.pt/plasma-protein/systems/bn-prospec-

system/assays




18. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical Chemistry Techniques, Principles,

Correlations. 6th ed. Wolters Kluwer, Lippincott -Williams & Wilkins; 2010. 788 p.

19. Surribas DP, Fernandez MCC, Muñiz EZ. Recomendaciones sobre la separación

electroforética de las proteínas plasmáticas en el suero. Soc Española Bioquímica

Clin y Patol Mol. 2014;

20. Brú CM-, Sanz RG, Lopez JM-. Recomendaciones para el estudio de las

gammapatías monoclonales. Soc Española Bioquímica Clínica y Patol Mol. 2009;

21. Sebia. Hydragel 1 IF, 2 IF, 4 IF e 9 IF. 2014.

22. Sebia. Hydragel Bence Jones. 2014.

23. Thermo SCIENTIFIC. ImmunoCAP Specific IgE [Internet]. Available from:

http://www.phadia.com/pt-pt/5/products/ensaios/1/

24. Direcção Geral da Saúde (DGS). Norma DGS - Prescrição de Exames Laboratoriais

para Avaliação de Doença Alérgica. 2015.

25. Turgeon ML. Immunology and Serology in Laboratory Medicine. 5th ed. Mosby;

2014.

26. Wieslander J, Olsson M. Wieslab AB - Guide to Autoimmune Testing. 2010.

27. A.MENARINI diagnostics. Zenit UP - Autoimmunity [Internet]. Available from:

http://www.menarinidiag.pt/Produtos/Autoimunidade2/Zenit-UP

28. A.MENARINI diagnostics. ZENIT Ra ANA Screen. 2010;

29. Chan EKL, Damoiseaux J, Carballo OG, Conrad K, de Melo Cruvinel W,

Francescantonio PLC, et al. Report of the First International Consensus on

Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-

2015. Front Immunol. 2015;

30. Chan EKL, Cruvinel WDM, Andrade LEC. The international consensus on

standardized nomenclature of antinuclear antibody HEp-2 Cell patterns ( ICAP )

initiative - Current state and perspectives. Autoantibody Research to Standardzed

Diagnostic Assays in the Management of Human Diseases series - Report on the

12th Dresden Symposium on Autoantibodies. 2015.

31. A. Menarini Diagnostics. ZENIT RA ENA Screen. 2010.

32. A.MENARINI diagnostics. Zenit RA - autoimmunity [Internet]. Available from:

http://www.menarinidiag.pt/Produtos/Autoimunidade2/Zenit-RA

33. EUROIMMUN. The EUROLINE: a new technique for extensive antibody profiles

[Internet]. Available from:

https://www.euroimmun.com/products/techniken/euroline/euroline-




beschreibung.html

34. Bain BJ. A Beginner’s Guide to Blood Cells. 2nd ed. Blackwell Publishing Ltd;

2004. 128 p.

35. Bain BJ, Bates I, Laffan MA, Lewis MS. Dacie and Lewis Pratical Haematology.

11th ed. Churchill Livingstone; 2011. 1-650 p.

36. Turgeon ML. Clinical Hematology Theory & Procedures. 5th ed. Williams &

Wilkins, a Wolters Kluwer business; 2012. 628 p.

37. Greer JP, Arber DA, Glader B, List AF, Jr. Means RT, Paraskevas F, et al.

Wintrobe’s Clinical Hematology. 13th ed. Lippincott Williams & Wilkins; 2014.

2312 p.

38. Beckman Coulter. UniCel DxH Series with System Manager Software - Coulter

Cellular Analysis System. 2015.

39. Hoffbrand AV, Moss PAH. Hoffbrand’s Essential Haematology. 7th ed. Wiley

Blackwell; 2016. 382 p.

40. Bain BJ. Blood Cells A Pratical Guid. 5th ed. Wiley Blackwell; 2015. 504 p.

41. Kaushansky K, Prchal JT, Press OW, Lichman MA, Levi M, Burns LJ, et al.

Williams Hematology. 9th ed. McGraw-Hill Education; 2016.

42. Hematocell - Laboratoire d’Hématologie du CHU d’Angers. Physiologie de la

mégacaryopoïèse [Internet]. Available from:

http://www.hematocell.fr/index.php/enseignement-de-lhematologie-

cellulaire/plaquettes-sanguines-et-leur-pathologie/24-physiologie-de-la-

megacaryopoiese

43. Bain BJ. Diagnosis from the Blood Smear. N Engl J Med. 2005;(353):498–507.

44. A.MENARINI diagnostics. A FAMÍLIA DIESSE VES-MATIC CUBE [Internet].

Available from: http://www.menarinidiag.pt/Produtos/hematologia/Velocidade-de-

sedimentacao-globular/DIESSE-VES-MATIC-CUBE-FAMILY

45. DIESSE. VES-MATIC CUBE 30.

46. Hematocell - Laboratoire d’Hématologie du CHU d’Angers. Drépanocytose

[Internet]. Available from: http://www.hematocell.fr/index.php/enseignement-de-

lhematologie-cellulaire/globules-rouges-et-leur-pathologie/88-drepanocytose

47. Sebia. Hydragel Acid Hemoglobin (E). 2006.

48. Sebia. Hydragel Hemoglobin (E). 2006.

49. Streck. Sickledex ®. 2016.

50. DeLoughery TG. Tests of Hemostasis and Thrombosis. In: Hemostasis and




Thrombosis. Cham: Springer International Publishing; 2015.

51. Instrumentation Laboratory. ACL-TOP Service Manual. 2006.

52. Bennett ST, Lehman CM, Rodgers GM. Laboratory Hemostasis. Springer; 2015.

53. Poller L. International Normalized Ratios (INR): The first 20 years. J Thromb

Haemost. 2004;2(6):849–60.

54. Practical Haemostasis - A Practical Guide of Laboratory Haemostasis [Internet].

Available from: http://practical-haemostasis.com/index.html

55. Hoffman R, Edward J. Benz J, Silberstein LE, Heslop H, Weitz J, Anastasi J.

Hematology Basic Principles and Practice. 6th ed. Saunders; 2013. 2679 p.

56. Keeling D, Mackie I, Moore GW, Greer IA, Greaves M. Guidelines on the

investigation and management of antiphospholipid syndrome. Br J Haematol.

2012;157(1):47–58.

57. Abbott. ARCHITECT i1000SR [Internet]. Available from:

https://www.corelaboratory.abbott/us/en/offerings/brands/architect/architect-

i1000SR

58. A.MENARINI diagnostics. Aution MAX [Internet]. Available from:

http://www.menarinidiag.pt/Produtos/urianalise/new_aution_max

59. A.MENARINI diagnostics. sediMAX 2 [Internet]. Available from:

http://www.menarinidiag.pt/Produtos/Sedimento-urinario/sediMAX2

60. Direção Geral da Saúde (DGS). Orientação da DGS - Prevenção e Avaliação da

Nefropatia Diabética. 2011.

61. Direção-Geral da Saúde (DGS). Norma DGS - Diagnóstico e Classificação da

Diabetes Mellitus. 2011.

62. Direção Geral da Saúde (DGS). Norma DGS - Prescrição de Exames Laboratoriais

para Avaliação de Dislipidemias no Adulto. 2015.

63. Direção Geral da Saúde (DGS). Norma DGS - Prescrição de Exames laboratoriais

para Avaliação e Monitorização da Função Tiroideia. 2012.

64. Direção Geral da Saúde (DGS). Norma DGS - Prescrição e determinação de

Antigénio Específico da Próstata livre. 2014.

65. Adams Waldorf KM, McAdams RM. Influence of Infection During Pregnancy on

Fetal Development. Reproduction. 2013;146(5):R151-62.

66. Direcção Geral da Saúde (DGS). Saúde Reprodutiva - DOENÇAS INFECCIOSAS

E GRAVIDEZ. Orientações Técnicas - Direcção-Geral da Saúde. 2000;48.

67. Graça A, Silvério C, Ferreira JP, Brito A, Almeida S, Paixão P, et al.




Cytomegalovirus Infecção congénita ou neonatal? Acta Med Port. 2004;17:335–40.

68. World Health Organization (WHO). WHO Guidelines for the Treatment of

Treponema pallidum (Syphilis). 2016.

69. Janier M, Hegyi V, Dupin N, Unemo M, Tiplica GS, Potočnik M, et al. 2014

European guideline on the management of syphilis. J Eur Acad Dermatology

Venereol. 2014;

70. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 2015 Sexually Transmitted

Diseases Treatment Guidelines [Internet]. Available from:

https://www.cdc.gov/std/tg2015/syphilis.htm

71. BD Diagnostic Systems. Macro-Vue RPR. BD Diagnostic Systems Technical

Services; 2002.

72. Ordem dos Farmacêuticos e Associação Portuguesa de Analistas Clínicos. Normas

para o Laboratório Clínico. 2016.

73. InterQC. InterQC Funcionalities [Internet]. Available from:

http://www.interqc.com/index.php?option=com_content&view=article&id=76:inte

rqc-functionalities&catid=79&Itemid=853

74. Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA). Informação e

Apresentação do PNAEQ. 2016.

Parte III

Epidemiologia, patogénese, clínica, imunologia, tratamento

e prevenção da Difilobotriose – novos tempos, “nova doença”

VIII MAC Resumo


Epidemiologia, patogénese, clínica, imunologia, tratamento e

prevenção da Difilobotriose – novos tempos, “nova" doença

Resumo

A difilobotriose é uma zoonose causada pelo parasita adulto do género

Diphyllobothrium. A infeção é transmitida ao Homem através da ingestão de peixe cru ou

insuficientemente cozinhado infetado com plerocercóides (forma larvar) de

Diphyllobothrium spp.

As manifestações clínicas da difilobotriose são ligeiras, sendo que na maioria dos

casos os indivíduos infetados são assintomáticos, pelo que esta infeção parasitária tem sido

negligenciada ao longo dos anos. No entanto, recentemente tem sido verificada uma

reemergência da difilobotriose em diversas regiões a nível mundial, contrariando o declínio

do número de casos existente nas últimas décadas em áreas historicamente endémicas. Esta

reemergência deve-se, principalmente, à crescente popularidade do consumo de peixe cru

que se verifica atualmente, sobretudo nos países desenvolvidos.

O diagnóstico da difilobotriose baseia-se na observação microscópica de

características morfológicas do parasita, contudo este não permite distinguir de forma fiável

as diferentes espécies de Diphyllobothrium spp. O desenvolvimento de métodos

moleculares veio permitir ultrapassar as dificuldades existentes na identificação das

espécies e obter mais informações relativas à epidemiologia e patogénese deste parasita, no

entanto existem ainda muitos aspetos por compreender.

A difilobotriose representa atualmente um problema de saúde pública, pelo que é

fundamental adotar medidas de prevenção e controlo eficazes.

Palavras-chave: Difilobotriose, Diphyllobothrium spp., Reemergência, Peixe cru



VIII MAC Abstract


Abstract

Diphyllobothriosis is a zoonosis caused by the adult parasite (tapeworm) of the

genus Diphyllobothrium. Humans are infected through the ingestion of raw or undercooked

fish meat infested with plerocercoids (larvae stage) of Diphyllobothrium spp.

The clinical manifestations of diphyllobothriosis are mild and in most cases the

infected individuals are asymptomatic, so this parasitic infection has been neglected over

the years. However, recently there has been a reemergence of diphyllobothriosis in several

regions worldwide, contrasting with the decline that occured in the last decades in

historically endemic areas. This reemergence is mainly due to the growing popularity of

raw fish consumption, especially in the developed countries.

The diagnosis of diphyllobothriosis is based mainly on the microscopic observation

of morphological characteristics of the parasite, although it does not allow a reliable

identification of the different species of Diphyllobothrium spp. The development of

molecular methods has made it possible to overcome the difficulties in the identification of

species and has provided more data on the epidemiology and pathogenesis of this parasite,

nevertheless there are still many aspects to be understood.

Diphyllobothriosis currently represents a public health problem, thus the

improvement of effective prevention and control measures is therefore crutial.

Keywords: Diphyllobothriosis, Diphyllobothrium spp., Reemergence, Raw fish



VIII MAC Objetivos


Objetivos

O presente trabalho tem como objetivo fazer uma revisão e avaliação da situação

epidemiológica das infeções por Diphyllobothrium spp. a nível mundial, procurando

entender como a patogénese e imunologia vão influenciar a clínica dos indivíduos

infetados.

São ainda objetivos do trabalho analisar os métodos de diagnóstico e os fármacos

utilizados no tratamento desta parasitose, bem como destacar abordagens eficazes de

prevenção e controlo da infeção.



VIII MAC Material e Métodos


Material e Métodos

A elaboração do presente trabalho teve como base a análise, interpretação e síntese

de vários artigos científicos originais e de revisão, bem como a consulta de páginas na

internet, publicados no período compreendido entre 1977 e 2017.

Para o ato de pesquisa foram utilizadas palavras-chave como, Diphyllobothriosis,

Diphyllobothrium Review, Diphyllobothrium latum, Diphyllobothrium nihonkaiense,

Diphyllobothrium dendriticum e Diphyllobothrium pacificum.

As fontes para a obtenção de bibliografia foram a plataforma Pubmed

(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) e ainda as páginas referentes ao CDC (www.cdc.gov) e

WHO (http://www.who.int/en/). A pesquisa foi realizada no período compreendido entre o

dia 15 de Março de 2016 e 2 de Outubro de 2017.





1. Introdução

A difilobotriose é uma zoonose1 causada pelo parasita adulto do género

Diphyllobothrium. (1) O género Diphyllobothrium pertence à classe dos cestodes, parasitas

segmentados com o corpo achatado em forma de fita, frequentemente designados de ténias.

Atualmente existem mais de 50 espécies de Diphyllobothrium spp. consideradas válidas,

mas destas apenas 15 foram reportadas em humanos, sendo a principal o D. latum. Apesar

de durante muitos anos a maioria dos casos de difilobotriose no Homem ter sido atribuída

ao D. latum, hoje sabe-se que existem três outras espécies importantes: D. nihonkaiense,

D. dendriticum e D. pacificum. (1,2)

As espécies do género Diphyllobothrium possuem um ciclo de vida complexo,

envolvendo copépodes e peixes como hospedeiros intermediários e o Homem, outros

mamíferos e aves como hospedeiro definitivo. A infeção no Homem resulta da ingestão de

peixe cru ou insuficientemente cozinhado infetado com plerocercóides (forma larvar) de

Diphyllobothrium spp., pelo que este parasita é vulgarmente denominado de ténia do peixe.

Após a ingestão do peixe infetado, os plerocercóides fixam-se no intestino delgado e

transformam-se rapidamente em parasitas adultos, que podem atingir até 25 metros de

comprimento. (1,3,4) Apesar da grande dimensão que este parasita pode atingir, geralmente

a infeção por Diphyllobothrium spp. provoca apenas sintomas ligeiros (diarreia,

desconforto abdominal), sendo que na maior parte dos casos os indivíduos infetados são

assintomáticos, razão pela qual a difilobotriose tem sido negligenciada ao longo dos

anos.(1,3)

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), no início da década de 70

existiam aproximadamente 9 milhões de casos de difilobotriose em todo o mundo (5).

Dados mais recentes indicam que atualmente cerca de 20 milhões de pessoas poderão estar

infetadas com Diphyllobothrium spp., contudo esta estimativa não é exata, uma vez que a

difilobotriose é considerada uma doença ligeira e por isso não é sistematicamente

reportada.(1,3)

Nas últimas décadas vinha a ser verificado um declínio acentuado dos casos de

difilobotriose em diversas áreas endémicas. No entanto, contrariamente a essa tendência, o

número de casos tem vindo a aumentar noutras regiões, verificando-se assim uma recente

1 Doença transmitida naturalmente entre animais vertebrados e o Homem





reemergência da difilobotriose. A crescente popularidade do consumo peixe cru em pratos

como sushi, sashimi, ceviche ou carpaccio, que se verifica principalmente nos países

desenvolvidos, é apontada como o principal fator para esta reemergência. (1,3,6)

A crescente utilização e aplicação de métodos moleculares veio facilitar o

diagnóstico da difilobotriose e permitir a obtenção de informação valiosa acerca deste

parasita. Contudo, existem ainda muitos aspetos da taxonomia, patogénese e epidemiologia

de Diphyllobothrium spp. que continuam por compreender.

A recente reemergência da difilobotriose vem assim realçar a importância desta

doença que, apesar de considerada ligeira, constitui um problema de saúde pública que não

deve ser negligenciado. (1,3)



VIII MAC Género Diphyllobothrium


2. Género Diphyllobothrium

2.1. Perspetiva Histórica

A difilobotriose é uma parasitose que acompanha o Homem desde a antiguidade,

sendo vários os estudos publicados que mostram que o Diphyllobothrium spp. coevoluiu

com o ser humano por muitos milhares de anos, influenciado pelos seus hábitos

alimentares, pelas diferenças culturais e, por vezes, por alterações climáticas. (7)

O conhecimento atual acerca do género Diphyllobothrium indica que este parasita

tem coabitado com o Homem ao longo de milhares de anos, pelo menos desde a fase inicial

do período Neolítico. A evidência da existência de Diphyllobothrium spp. no passado

baseia-se na recuperação de ovos preservados deste parasita em amostras arqueológicas de

fezes humanas e de animais. (7)

A primeira descoberta arqueológica de Diphyllobothrium spp. ocorreu na Prússia

em 1944 e remonta ao século V depois de Cristo (d.C.). Desde então, foram recuperados

ovos de Diphyllobothrium spp. em amostras provenientes de inúmeros locais

arqueológicos, tanto no Velho Mundo2 como no Novo Mundo3. (6,7) Atualmente, a

ocorrência mais antiga de Diphyllobothrium spp. no Velho Mundo da qual existe

conhecimento, data do período de 7600-7500 antes de Cristo (a.C.), no Chipre. Já no

continente Americano, a descoberta da presença deste parasita em amostras que datam de

aproximadamente 8000 a.C., no Peru, constitui a evidência mais antiga. (7)

Um dos principais marcos na história da difilobotriose ocorreu em 1758, quando C.

Linnaeus descreveu a ténia do peixe em humanos e designou esta espécie de Taenia lata

(hoje em dia reconhecida como Diphyllobothrium latum). No entanto, a descrição deste

parasita tinha já sido feita pela primeira vez por Dunus e Wolpius, em 1592 (2,3,6). Apesar

disso, o ciclo de vida do Diphyllobothrium latum só veio a ser esclarecido em 1917 por

Janicki e Rosen, após a descoberta do papel dos copépodes como primeiro hospedeiro

intermediário. (1,3) Na tabela seguinte estão representados alguns dos marcos mais

importantes na história da difilobotriose.

2 Termo utilizado em contexto histórico para designar os continentes Europeu, Asiático e Africano,

a parte do mundo conhecida antes da descoberta da América. 3 Termo utilizado para designar o continente Americano.





Tabela 7 - Principais marcos na história da difilobotriose

Adaptado de: (3,6)

Ano / Período Acontecimento

1592 Primeira descrição reconhecível de D. latum, por Dunus e Wolpius

1747 Reconhecimento da ligação entre o parasita e o peixe, por Spöring

1758 Descrição do parasita e atribuição do nome Taenia lata à espécie, por

Linnaeus

1819 Primeira descrição científica de D. latum (como Bothriocephalus latus)

Final do século

XIX

Elucidação da transmissão ao Homem através do consumo de peixe

infetado

1917 Elucidação do ciclo de vida de D. latum (descoberta do papel dos copépodes

como primeiro hospedeiro intermediário), por Janicki e Rosen

1944 Primeira descoberta arqueológica de Diphyllobothrium spp., por Szidat

Embora a ténia do peixe seja reconhecida desde há muito tempo como um parasita

causador de infeção no Homem, a sua história ainda não é totalmente conhecida. Assim,

são necessários mais estudos, nomeadamente estudos moleculares, para que seja possível

esclarecer a evolução do Diphyllobothrium spp. (7)

2.2. Taxonomia e Principais Espécies Causadoras de Infeção no

Homem

Desde que Linnaeus atribuiu o nome Taenia lata a este parasita, muitas espécies do

género Diphyllobothrium foram descritas. No entanto, a taxonomia deste grupo de parasitas

constituiu desde sempre um problema, uma vez que as relações filogenéticas entre as várias

espécies ainda não são bem conhecidas. A composição taxonómica do género

Diphyllobothrium tem, por isso, sofrido várias alterações ao longo dos anos, assim como

as opiniões acerca da validade das diferentes espécies descritas. (1,3)

O género Diphyllobothrium pertence ao Filo Platyhelminthes, Classe Cestoda,

Ordem Diphyllobothriidea e Família Diphyllobothriidae. (8,9) Durante muito tempo, este

cestode pertenceu à ordem Pseudophyllidea, no entanto dados recentes mostram que esta

ordem era composta por dois grupos que não estavam filogeneticamente relacionados, pelo

que em 2008 foi eliminada, tendo sido propostas duas novas ordens que são atualmente

aceites: Diphylobothriidea e Bothriocephalidea. (1,10)





Atualmente existem mais de 50 espécies de Diphyllobothrium spp. consideradas

válidas, mas destas apenas 15 foram reportadas em humanos. (2,3) A crescente utilização

de métodos moleculares para a caracterização genética deste parasita tem permitido

ultrapassar as dificuldades que existiam na identificação e distinção das diferentes espécies,

causadas pelas semelhanças morfológicas entre estas, uma vez que estes métodos permitem

identificar as espécies de forma fiável e correta, facilitando assim o diagnóstico. (1,3)

Na tabela 8 são apresentadas as 15 espécies válidas de Diphyllobothrium spp.

atualmente descritas em humanos, bem como uma estimativa do número de casos existentes

para cada uma delas, de acordo com um artigo de revisão realizado por Scholz e Kuchta

em 2016. (2)

Tabela 8 - Espécies de Diphyllobothrium spp. válidas reportadas no Homem e respetivo número de casos

Adaptado de: (2)

Espécie Número de Casos

Diphyllobothrium alascense

1

Diphyllobothrium cameroni 1 (incerto)

Diphyllobothrium cordatum 1

Diphyllobothrium dalliae “Frequentes”

Diphyllobothrium dendriticum ≈1000

Diphyllobothrium elegans 1 (incerto)

Diphyllobothrium hians 2 (incerto)

Diphyllobothrium lanceolatum 1 (incerto)

Diphyllobothrium latum ≈20 Milhões

Diphyllobothrium nihonkaiense ≈2000

Diphyllobothrium orcini 2

Diphyllobothrium pacificum 1000

Diphyllobothrium scoticum 1 (incerto)

Diphyllobothrium stemmacephalum 24

Diphyllobothrium ursi 11

Os problemas existentes na identificação das espécies de Diphyllobothrium spp.,

bem como o facto de a composição taxonómica deste género não se encontrar totalmente

definida, resultaram num elevado número de registos duvidosos e de outros provavelmente

incorretos, dado que durante muito tempo a maior parte dos casos de difilobotriose no

Homem foi atribuída ao Diphyllobothrium latum. (2,3,11)

O Diphyllobothrium latum é a principal espécie causadora de infeção no Homem,

contudo existem três outras espécies importantes e que estão na origem de um grande

número de casos de difilobotriose: Diphyllobothrium nihonkaiense, Diphyllobothrium





dendriticum e Diphyllobothrium pacificum (também denominado Adenocephalus

pacificus). (1,2) Uma vez que estas são as espécies de Diphyllobothrium com maior

relevância no Homem, o presente trabalho centrar-se-á apenas nelas.

2.3. Morfologia

Os cestodes, classe na qual se insere o Diphyllobothrium spp., são parasitas de corpo

segmentado e achatado, em forma de fita. Estes parasitas são hermafroditas, pelo que cada

um dos seus segmentos possui órgãos reprodutores masculinos e femininos. Por outro lado,

apresentam um sistema excretor primitivo, absorvendo os nutrientes e excretando os

produtos de degradação através da sua membrana externa, o tegumento. (8,12)

O ciclo de vida normal dos cestodes engloba três formas morfológicas: ovo, formas

larvares e parasita adulto. (12)

2.3.1. Parasita Adulto

As ténias do género Diphyllobothrium estão entre os maiores parasitas que infetam

o Homem, medindo desde vários centímetros até 15 metros de comprimento consoante a

espécie, mas podendo atingir até 25m. À semelhança dos restantes cestodes, o corpo do

parasita adulto de Diphyllobothrium spp. (figura 25)

é composto por três partes distintas: escólex, colo e

estróbilo. (1,3,8)

O escólex (figura 26) consiste na terminação

anterior do parasita, que permite que este se fixe à

parede intestinal do hospedeiro. Apresenta uma

forma alongada e possui dois sulcos, um na

superfície dorsal e outro na ventral, que se

denominam bótrios e que atuam como ventosas,

permitindo a fixação do parasita. (1,8)

O colo (ou pescoço), a zona imediatamente

posterior ao escólex, é geralmente a parte mais

estreita do parasita. Corresponde a uma região germinativa, a partir da qual são gerados

novos segmentos que se denominam proglótis. À medida que vão sendo formadas novas

proglótis, estas “empurram” as mais velhas para uma zona posterior, formando assim uma

cadeia de proglótis, que se designa estróbilo (figura 26). O estróbilo dos parasitas do género

Figura 25 - Representação do parasita adulto

de Diphyllobothrium spp.

Adaptado de: (8)





Diphyllobothrium é constituído por um grande número de proglótis, geralmente entre 2000

e 4000. (1,13)

Como referido, cada proglótis possui órgãos reprodutores masculinos e femininos,

que se vão desenvolvendo progressivamente à medida que estas se encontram em zonas

posteriores do estróbilo. Assim, é possível dividir o estróbilo em três regiões, de acordo

com a maturidade do sistema reprodutor das proglótis: proglótis imaturas, maduras e

grávidas. (13)

As proglótis maduras e grávidas têm uma maior dimensão em largura do que em

comprimento, com os principais órgãos reprodutores localizados na região central. (14) O

sistema reprodutor masculino é composto por inúmeros testículos (figura 27) com uma

forma redonda a oval, que se localizam lateralmente. De cada testículo surge um vaso

eferente que se liga a um ducto comum (vaso deferente), que forma na sua extremidade

distal uma vesícula seminal. Esta vesícula seminal termina na bolsa do cirro (figura 27), a

estrutura muscular que contém o cirro, o órgão copulatório. (1) O sistema reprodutor

feminino tem como principais órgãos um ovário bilobado localizado na porção posterior

da proglótis, e o útero, que abre para o exterior através do poro uterino (figura 27). Na zona

lateral da proglótis existem ainda as glândulas vitelinas, que são compostas por diversos

folículos. (1,13)

As proglótis grávidas encontram-se na terminação posterior do estróbilo e

apresentam um útero bem desenvolvido, que assume uma configuração característica em

roseta (figura 27). Nestas proglótis, o útero encontra-se repleto de ovos, que são depois

libertados através do poro uterino. (14)

Figura 26 - Escólex (esquerda) e estróbilo (direita) de Diphyllobothrium spp.

Adaptado de: (4)





2.3.2. Ovo

O ovo dos cestodes consiste num embrião que se denomina oncosfera ou embrião

hexacanto, uma vez que possui seis ganchos ou acúleos (agrupados aos pares). A oncosfera

encontra-se envolvida por três membranas, o invólucro interior, o embrióforo e o invólucro

exterior. Por fim, a casca (ou cápsula) constitui a camada mais externa do ovo. (8,13)

No caso particular do ovo de Diphyllobothrium spp., a oncosfera é envolvida por

um embrióforo ciliado, sendo que a este embrião ciliado é dado o nome de coracídio (figura

28b). (13) Os ovos de Diphyllobothrium spp. têm uma forma oval, possuem um opérculo

numa das extremidades e, na extremidade oposta, apresentam uma pequena protuberância

(figura 28a). As suas dimensões são variáveis, podendo medir entre 55-75 μm de

comprimento e 40-55 μm de largura, de acordo com a espécie. (12) Contudo, mesmo dentro

da mesma espécie existe uma grande variabilidade de dimensões, dependendo das espécies

dos hospedeiros e da intensidade da infeção. (1,3)

Quando os ovos de Diphyllobothrium spp. são libertados contêm um embrião

imaturo rodeado de células vitelinas (figura 28a), e não um embrião hexacanto, que só se

forma mais tarde. (1,8)

Figura 27 - Proglótis de Diphyllobothrium spp.

Legenda: cs – saco do cirro; ov – ovário; t – testículos; u – útero; up – poro uterino; v – glândulas vitelinas.

Adaptado de: (1)





2.3.3. Formas Larvares

No ciclo de vida do Diphyllobothrium spp. existem três formas larvares: coracídio,

procercóide e plerocercóide, representadas na figura 29. (8)

O coracídio constitui o primeiro estado larvar e, como referido, consiste num

embrião ciliado que eclode a partir do ovo. Quanto aos procercóides (segundo estado

larvar) e plerocercóides (terceiro estado larvar), a informação relativa à sua morfologia é

limitada, uma vez que estas formas larvares se desenvolvem nos hospedeiros intermediários

do ciclo de vida do Diphyllobothrium spp. (copépodes e peixes de água doce,

respetivamente), tal como será explicado posteriormente no capítulo referente à

patogénese.

Os procercóides medem aproximadamente 500 μm de comprimento e apresentam

uma forma alongada e globular. Estas formas larvares possuem um apêndice na região

posterior, denominado cercómero, que contém os seis ganchos ou acúleos. (8,13) Nesta

fase do desenvolvimento, ainda não apresentam na sua terminação anterior um escólex

totalmente formado. (1)

Figura 28 - Estrutura do ovo de Diphyllobothrium spp. (a) Ovo com embrião imaturo. (b) Ovo

embrionado.

Adaptado de: (12,13)

Figura 29 - Formas larvares de Diphyllobothrium spp.

Adaptado de: (13)





Os plerocercóides (figura 30) têm cerca de 1 a 2 cm de comprimento, possuem um

escólex totalmente desenvolvido e apresentam vilosidades especializadas à superfície do

tegumento. (8,13) A identificação morfológica dos plerocercóides é complicada, no entanto

existem características morfológicas que diferem de espécie para espécie e que podem ser

utilizadas para identificar algumas espécies de Diphyllobothrium. Entre estas

características estão o tamanho e forma do corpo destas formas larvares, a presença ou

ausência de pregas no corpo, o grau de retração do escólex e o comprimento e densidade

das vilosidades. (1,3)

Figura 30 - Plerocercóides de D. latum, D. dendriticum e D. pacificum, respetivamente

Adaptado de: (1,3)



VIII MAC Patogénese


3. Patogénese

O ciclo de vida do Diphyllobothrium spp. foi esclarecido em 1917 por Janicki e

Rosen, após infetarem experimentalmente copépodes com coracídios de Diphyllobothrium

latum. (2) Este ciclo de vida é relativamente complexo, uma vez que envolve três

hospedeiros, um definitivo e dois intermediários. (1,12)

O hospedeiro definitivo corresponde ao organismo onde a forma adulta do parasite

vive, atinge a maturidade sexual e se reproduz. As espécies do género Diphyllobothrium

apresentam uma grande variedade de hospedeiros definitivos, entre os quais o Homem e

muitos outros mamíferos terrestres, mamíferos marinhos e ainda aves que se alimentam de

peixes. (3,8)

O hospedeiro intermediário é o organismo no qual a forma larvar do parasita vive,

sendo fundamental para o desenvolvimento deste. No ciclo de vida do Diphyllobothrium

spp., são necessários dois hospedeiros intermediários para o desenvolvimento das suas

formas larvares. Os copépodes (pequenos crustáceos) constituem o primeiro hospedeiro

intermediário, enquanto diversas espécies de peixes atuam como segundo hospedeiro

intermediário. (8,13)

O ciclo de vida do Diphyllobothrium spp. no Homem encontra-se representado na

figura 31. O parasita adulto vive no intestino delgado do hospedeiro definitivo e liberta

ovos imaturos para o lúmen intestinal deste através do poro uterino, ovos esses que saem

para o ambiente externo juntamente com as fezes. Ao entrarem em contacto com a água,

os ovos continuam a sua maturação durante cerca de 18 a 20 dias, dando origem a uma

oncosfera ciliada, o coracídio, que constitui o primeiro estado larvar do Diphyllobothrium

spp. (1,4,8)

O coracídio eclode através do opérculo do ovo e nada na água, atraindo os primeiros

hospedeiros intermediários, os copépodes. Após ser ingerido por um copépode, o coracídio

liberta-se do embrióforo ciliado e penetra a parede intestinal do crustáceo, alojando-se na

sua cavidade corporal (hemocélio). O coracídio continua o seu crescimento e em cerca de

2 a 3 semanas transforma-se numa larva procercóide, que constitui o segundo estado larvar

deste ciclo de vida. (1,8,13)

Quando o copépode infetado é ingerido por um segundo hospedeiro intermediário

adequado, normalmente pequenos peixes de água doce, peixes anádromos (vivem no mar





e migram para os rios com o objetivo de se reproduzirem) e, nalguns casos, peixes

marinhos, a larva procercóide penetra na parede intestinal do hospedeiro e migra para o

tecido muscular, continuando o seu desenvolvimento e transformando-se numa larva

plerocercóide (terceiro estado larvar). O local de desenvolvimento destas larvas pode ser

diferente consoante a espécie do peixe sendo que, para além do tecido muscular, os

plerocercóides podem estar localizados em praticamente qualquer órgão ou à superfície

destes, ou ainda livres na cavidade abdominal. Num único peixe podem estar presentes

vários plerocercóides. (1,3,4)

As larvas plerocercóides constituem a fase infeciosa para o Homem e para os

restantes hospedeiros definitivos. No entanto, habitualmente o Homem não consome os

pequenos peixes que atuam como segundo hospedeiro intermediário, pelo que estes não

representam uma fonte importante de infeção. Contudo, estes pequenos peixes podem ser

ingeridos por outras espécies de peixes de maiores dimensões, que ficam assim infetados

devido à migração das larvas plerocercóides para o seu tecido muscular. Ao consumir estes

peixes crus ou mal cozinhados, o Homem pode adquirir a infeção, uma vez que ocorre a

libertação dos plerocercóides, que se irão desenvolver e continuar o ciclo de vida. (4,12)

Figura 31 - Ciclo de vida de Diphyllobothrium spp. no Homem

Adaptado de: (4)





Após a ingestão do peixe infetado, as larvas plerocercóides fixam-se na mucosa

intestinal (geralmente no íleo, mas por vezes no jejuno) do hospedeiro definitivo através

dos bótrios existentes no escólex, e transformam-se rapidamente em parasitas adultos. O

parasita atinge a maturidade cerca de 5 a 6 semanas após a infeção e as proglótis começam

a libertar ovos imaturos que saem depois juntamente com as fezes do hospedeiro, dando

assim início a um novo ciclo de vida. A longevidade do parasita adulto no intestino do

hospedeiro definitivo é variável, sendo que este pode viver durante 10 ou mais

anos.(4,8,13)

3.1. Hospedeiro Definitivo

As espécies do género Diphyllobothrium apresentam um vasto espectro de

hospedeiros definitivos, entre os quais se incluem: o Homem; mamíferos terrestres como o

cão, animais selvagens pertencentes à família dos canídeos e dos felídeos, e o urso;

mamíferos marinhos, como o lobo-marinho e o leão-marinho; e ainda aves que se

alimentam de peixes. (1,2)

No que diz respeito às espécies Diphyllobothrium latum e Diphyllobothrium

nihonkaiense, o Homem constitui o seu hospedeiro definitivo principal. Já no caso do

Diphyllobothrium dendriticum, esta espécie é normalmente encontrada em aves que se

alimentam de peixes, sendo que o hospedeiro definitivo principal é a gaivota. Quanto ao

Diphyllobothrium pacificum, os hospedeiros definitivos mais comuns são os lobos-

marinhos e leões-marinhos, sendo que o Homem surge como um hospedeiro definitivo

acidental. (2,11,15,16) Na tabela seguinte são apresentados os hospedeiros definitivos

conhecidos para cada uma das quatro principais espécies causadoras de difilobotriose no

Homem.





Tabela 9 - Hospedeiros definitivos de D. latum, D. nihonkaiense, D. dendriticum e D. pacificum

Adaptado de: (2,16)

Espécie

Hospedeiros Definitivos

Hospedeiro

Principal Hospedeiros Comuns

Hospedeiros

Acidentais

D. latum Homem

- Cão

- Espécies selvagens das

famílias dos canídeos e

felídeos

-

D. nihonkaiense Homem

- Urso

- Cão

- Raposa

- Porco

-

D. dendriticum Gaivota

- Outras aves que se

alimentam de peixes

- Homem

- Espécies da família dos

canídeos

- Urso

-

D. pacificum Lobo-marinho das

Ilhas Juan Fernández

- Outras espécies de lobos-

marinhos e leões-marinhos

- Homem

- Cão e outras espécies da

família dos canídeos

Esta baixa especificidade das espécies de Diphyllobothrium relativamente ao

hospedeiro definitivo leva a que, ocasionalmente, ocorram infeções no Homem causadas

por espécies de Diphyllobothrium que por natureza têm como hospedeiro definitivo outros

animais (mamíferos terrestres, aves que se alimentam de peixes, ou mamíferos marinhos).

O Homem surge assim como um hospedeiro definitivo acidental destas espécies, como

acontece com o D. pacificum. Para além disso, a grande variedade de hospedeiros pode

constituir um dos fatores que contribui para a perpetuação de uma ou mais espécies de

Diphyllobothrium numa determinada população ou região. (1)

3.2. Hospedeiros Intermediários

3.2.1. Primeiro Hospedeiro Intermediário

Os copépodes são um grupo de crustáceos que se encontra largamente distribuído

por águas doces e salgadas, constituindo a base de muitas cadeias alimentares marinhas.

Atualmente são conhecidas cerca de 40 espécies de copépodes, principalmente

pertencentes aos géneros Cyclops e Diaptomus, que atuam como primeiro hospedeiro

intermediário de diferentes espécies de Diphyllobothrium. Estas espécies pertencem a





diferentes famílias (Diaptomidae, Centropagidae, Cyclopidae e Temoridae) e são

copépodes de água doce. (1,3)

Contudo, até à data ainda não existem dados acerca dos primeiros hospedeiros

intermediários de D. pacificum. Dado que os seus principais hospedeiros definitivos são

mamíferos marinhos, o seu ciclo de vida é seguramente completado no mar, contrariamente

ao que acontece com as outras três principais espécies de Diphyllobothrium no Homem.

Assim, é possível presumir que o D. pacificum utiliza copépodes marinhos como primeiro

hospedeiro intermediário. (17)

3.2.2. Segundo Hospedeiro Intermediário

Existem diversas espécies de peixes que atuam como segundo hospedeiro

intermediário de Diphyllobothrium spp. e que, quando ingeridas cruas ou mal cozinhadas,

podem provocar infeção no Homem. Estas espécies são essencialmente peixes de água

doce, mas também peixes anádromos.

O Diphyllobothrium latum utiliza como segundo hospedeiro intermediário vários

peixes de água doce, sendo que as principais fontes de infeção para o Homem são a perca

europeia (Perca fluviatilis), o lúcio (Esox lucius) e a lota-do-rio (Lota lota) e, menos

frequentemente, o picão-verde (Sander vitreus), a perca-americana (Perca flavescens) e a

perca “goujonnière” (Gymnocephalus cernuus). (2)

Já no caso das espécies D. nihonkaiense e D. dendriticum, os principais segundos

hospedeiros intermediários são peixes anádromos da família dos salmonídeos. O D.

nihonkaiense é principalmente transmitido ao Homem pelos salmões do género

Oncorhynchus spp., designados de salmões do Pacífico (salmão japonês – O. masou;

salmão-cão - O. keta; salmão rosa - O. gorbuscha; salmão vermelho – O. nerka) e pela

espécie Hucho perryi, pertencente à família dos salmonídeos. Embora mais raramente, o

D. nihonkaiense pode também ser transmitido por outras espécies da família dos

salmonídeos (Salvelinus leucomaenis e Hucho taimen). (1,2) O D. dendriticum, por sua

vez, foi já reportado em mais de 50 espécies pertencentes a 12 famílias de peixes de água

doce e peixes anádromos, no entanto os seus principais segundos hospedeiros

intermediários são os salmonídeos, de entre os quais se destacam os coregonos (Coregonus

spp.). (2,11)

Embora atualmente exista já muita informação acerca da importância dos peixes de

água doce e dos peixes anádromos no ciclo de vida de muitas espécies de





Diphyllobothrium, ainda pouco se sabe acerca do papel das espécies de peixes marinhos na

transmissão da difilobotriose ao Homem. Como referido anteriormente, o

Diphyllobothrium pacificum completa o seu ciclo de vida no mar e, apesar de diversas

espécies de peixes marinhos terem já sido reportadas como potenciais segundos

hospedeiros intermediários de D. pacificum, o seu espectro completo de hospedeiros ainda

não é totalmente conhecido. (1,2,17) De acordo com um artigo realizado por Kuchta et. al

em 2015, até à data foram encontrados plerocercóides de D. pacificum em 21 espécies de

peixes marinhos pertencentes a 12 famílias filogeneticamente não relacionadas. (17)



VIII MAC Manifestações Clínicas


4. Manifestações Clínicas

Como referido anteriormente, a forma adulta de Diphyllobothrium spp. vive no

intestino delgado do Homem, geralmente no íleo. Este parasita pode atingir grandes

dimensões, pelo que a sua presença no intestino do hospedeiro provoca efeitos de natureza

mecânica. Contudo, na maior parte dos casos a infeção causada por Diphyllobothrium spp.

é assintomática. (1,3)

A patogenicidade da difilobotriose depende assim de vários fatores, como o número

de parasitas presente no intestino, o tipo e a quantidade de subprodutos produzidos pelo

parasita bem como a reação do hospedeiro a esses mesmos subprodutos, e ainda a privação

de alguns metabolitos essenciais para o hospedeiro que são absorvidos pelo parasita. (8,14)

As manifestações clínicas da difilobotriose ocorrem em apenas cerca de 20% dos

casos, tendo como principais sintomas diarreia e dor ou desconforto abdominal. Outros

sintomas como fadiga, obstipação, cefaleias, astenia, perda de peso e por vezes reações

alérgicas podem também surgir. (1,3,12)

Em casos mais raros poderá ocorrer obstrução intestinal, que resulta normalmente

de infeções de grande intensidade, e ainda colecistite ou colangite, causadas pela migração

de proglótis que se libertam do estróbilo. (1,3)

Quando as infeções são prolongadas ou de grande intensidade, pode desenvolver-

se uma anemia megaloblástica causada pela dissociação do complexo vitamina B12-fator

intrínseco mediada pelo parasita, o que torna a vitamina B12 indisponível para ser absorvida

pelo hospedeiro. (1,3) A vitamina B12 é essencial para a hematopoiese, pelo que o défice

desta vitamina está na origem de alterações hematológicas, como a anemia megaloblástica.

Este tipo de anemia tem como principal mecanismo fisiopatológico a diminuição da

absorção intestinal da vitamina B12, que na maior parte das vezes se deve a uma produção

deficiente de fator intrínseco, sendo que nestes casos a anemia é designada de anemia

perniciosa. O fator intrínseco é essencial para a absorção da vitamina B12, uma vez que

forma um complexo estável com esta vitamina, o que permite que a mesma seja absorvida

ao nível do íleo. Na infeção por Diphyllobothrium spp., a dissociação do complexo

vitamina B12-fator intrínseco faz com que a vitamina B12 não possa ser absorvida, podendo

assim desenvolver-se uma anemia que simula a anemia perniciosa. (18) Um outro fator que

parece contribuir para o desenvolvimento de anemia megaloblástica é a localização do



VIII MAC Manifestações Clínicas


parasita no intestino. O parasita adulto de Diphyllobothrium spp. vive normalmente no íleo,

mas quando se fixa no jejuno compete de forma mais eficaz pela vitamina B12, aumentando

assim a probabilidade de o indivíduo infetado desenvolver uma anemia

megaloblástica.(13,18)

Este quadro clínico de anemia megaloblástica era frequentemente encontrado na

região da Finlândia após a Segunda Guerra Mundial, onde alguns dos seus habitantes

parecem ter uma predisposição genética para desenvolver anemia perniciosa. Contudo,

atualmente estes casos são raros, o que se deve em grande parte à melhor nutrição da

população e à melhoria no tratamento da infeção. (1,14,18)

Cerca de 40% dos indivíduos infetados com D. latum apresenta valores diminuídos

de vitamina B12, mas apenas 2% desenvolve anemia megaloblástica. Contrariamente, nas

infeções causadas por D. pacificum não existe normalmente uma associação a défices de

vitamina B12 ou ao desenvolvimento de anemia megaloblástica. (1,3,18) Num estudo

realizado por Jimenez et. al em 2012 (18) que incluiu 20 indivíduos infetados com D.

pacificum, apenas 1 apresentou níveis diminuídos de vitamina B12 e desenvolveu uma

anemia megaloblástica moderada. Segundo os autores deste estudo, a maior dimensão do

D. latum relativamente ao D. pacificum (parasita adulto normalmente inferior a 1 metro de

comprimento) pode constituir um dos fatores que contribuem para o facto de os indivíduos

infetados com D. pacificum raramente apresentarem défice de vitamina B12 ou anemia

megaloblástica, uma vez que existe uma maior competição do parasita com o hospedeiro

pelos nutrientes, nomeadamente a vitamina B12. (18)

Em casos de anemia severa os doentes podem apresentar sinais e sintomas de danos

neurológicos, como astenia, parestesias e dificuldade de movimento e coordenação motora.

Estas manifestações clínicas são revertidas com o tratamento da anemia e não reaparecem

após o tratamento da infeção. (1,14)

Como referido, na maior parte dos casos de difilobotriose os indivíduos são

assintomáticos. Assim, muitas vezes a única evidência da ocorrência de infeção é a

evacuação de proglótis. À medida que se soltam do estróbilo, as proglótis são expelidas em

cadeia juntamente com as fezes, o que pode causar um impacto emocional significativo nos

indivíduos infetados, já que estas cadeias de proglótis são normalmente evacuadas durante

um longo período de tempo. (1,3)



VIII MAC Epidemiologia


5. Epidemiologia

Segundo a OMS, num relatório publicado em 1979, no início dos anos 70 o número

de casos de difilobotriose no Homem a nível mundial era de aproximadamente 9 milhões,

com 5 desses milhões a ocorrerem na Europa, 4 milhoes na Ásia e 100 mil na América.

(3,5) Dados mais recentes indicam que atualmente cerca de 20 milhões de pessoas estão

infetadas com Diphyllobothrium spp., porém esta estimativa não é exata, dado que não

existem estudos recentes acerca da prevalência global da difilobotriose, o que se deve em

grande parte ao facto de esta patologia ser considerada ligeira e por isso não ser

sistematicamente reportada. (1,3,19)

Apesar da escassez de dados referentes à prevalência da difilobotriose, alguns

estudos mostram que nas últimas décadas houve uma diminuição do número de casos em

diversas áreas endémicas, sobretudo na América do Norte e no norte da Europa. Este

declínio do número de casos resulta, possivelmente, de uma maior sensibilização das

populações para o risco do consumo de peixe cru ou mal cozinhado, e da melhoria das

condições de higiene e saneamento básico. (1,3,6,20,21) Por outro lado, e contrariamente

a esta tendência, tem sido verificada uma reemergência da difilobotriose noutras regiões,

nomeadamente na Rússia, Japão, Coreia do Sul, regiões subalpinas e na América do Sul,

como resultado do aumento do consumo de peixe cru/mal cozinhado que se verifica

atualmente um pouco por todo o mundo, mas principalmente nos países

desenvolvidos.(1,3)

A recente reemergência da difilobotriose em diversas regiões do mundo vem, assim,

enfatizar a importância da correta identificação das espécies de Diphyllobothrium

causadoras de infeção no ser humano e a necessidade de realizar estudos epidemiológicos,

de forma a que seja possível compreender melhor a distribuição geográfica da

difilobotriose e a epidemiologia da infeção. (1,3)

5.1. Distribuição Mundial

A difilobotriose apresenta uma ampla distribuição a nível mundial, no entanto as

infeções no Homem estão geralmente associadas a regiões de águas frias, dado que a maior

parte dos casos foram registados na região paleoártica (abrange a Europa, a Ásia a norte

dos Himalaias, o norte da Península Arábica e o norte de África) e em algumas zonas da





América do Norte. A difilobotriose é endémica em algumas regiões da Europa, Ásia e

América do Norte, embora novos focos de infeção estejam a emergir na América do Sul,

em particular no Brasil. (1,3,6,21)

Na Europa, os casos de difilobotriose diminuíram significativamente nas últimas

décadas em áreas historicamente endémicas, como os países Bálticos (Estónia, Letónia,

Lituânia), os países nórdicos e a Polónia. Contrariamente, tem-se verificado uma

reemergência nas regiões supalpinas da França, Itália e Suiça, especialmente nas zonas em

redor de grandes lagos, onde mais de 200 casos foram reportados desde 1987. (1,3,22)

Um estudo realizado por Dupouy-Camet e Peduzzi em 2004 (22) avaliou a situação

da difilobotriose na Europa desde 1980. De acordo com este estudo, países como a Suíça,

Suécia, Finlândia e Estónia registam mais de 10 casos por ano, enquanto noutros países

como a França, Itália e Polónia são reportados entre 2 e 10 casos por ano, como evidenciado

na figura 32. Alguns casos esporádicos foram reportados em países que se considerava não

serem afetados pela difilobotriose, como a Espanha, Áustria e Noruega. (1,3,6,21,22)

Relativamente à situação da difilobotriose em Portugal, não foram encontrados

quaisquer dados na bibliografia disponível. No mapa da figura 32, que representa a

distribuição da difilobotriose na Europa desde 1980 de acordo com o estudo realizado por

Dupouy-Camet e Peduzzi em 2004, Portugal surge como um dos países nos quais não

foram observados ou reportados casos de difilobotriose. (22)

Figura 32 - Distribuição da difilobotriose na Europa desde 1980

Adaptado de: (22)





O D. latum é considerado a principal espécie causadora de difilobotriose humana

no continente Europeu, embora o D. dendriticum esteja também presente no norte da

Europa. Apesar de o D. dendriticum se encontrar largamente distribuído nos países do norte

da Europa, não existe registo de casos de difilobotriose humana com origem nesses países,

causados por esta espécie. (1–3) No entanto, recentemente foram reportados casos de

difilobotriose causada por D. dendriticum e também por D. nihonkaiense em países como

a França, Suiça e República Checa. Estes constituem casos de espécies importadas,

atribuídos ao consumo de peixe cru importado de regiões onde estas espécies são

endémicas, já que anteriormente não existiam registos de infeções causadas por D.

dendriticum e D. nihonkaiense nestes países. (1,3,11,23,24)

Existem ainda registos de casos recentes de difilobotriose em Espanha, cujo

diagnóstico molecular confirmou serem causados por D. pacificum. Nestes casos, a fonte

de infeção mais provável é o consumo de algumas espécies de peixe importadas de países

como o Chile ou Equador. (17,25)

A distribuição mundial dos casos de diflobotriose no Homem causada por D. latum

encontra-se representada na figura 33.

Na América do Norte, a principal espécie causadora de difilobotriose é o D. latum,

à semelhança do que acontece na Europa. No período entre 1977 e 1981, as estimativas

apontam para que tenham ocorrido entre 125 e 200 casos, sobretudo na região dos Grandes

Figura 33 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. latum. Legenda: círculos

pretos - casos confirmados por métodos moleculares; círculos brancos – casos não confirmados por

métodos moleculares; asteriscos – casos esporádicos.

Adaptado de: (1)





Lagos da América do Norte, na região central do Canadá e no Alasca. (1,3) Contudo, nas

últimas décadas tem sido verificada uma diminuição drástica do número de casos nestas

zonas endémicas. Porém, o facto de a difilobotriose não ser uma doença de declaração

obrigatória nos EUA e no Canadá, faz com que seja difícil perceber se este declínio se deve

realmente a uma diminuição do número de casos, ou apenas a uma diminuição dos

registos.(6,20)

Outra espécie encontrada na América do Norte é o D. dendriticum e, embora até à

data apenas 10 casos tenham sido confirmados, é provável que alguns dos casos atribuídos

ao D. latum tenham na realidade sido causados por D. dendriticum. (2,3,20) Na figura 34

encontra-se representada a distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D.

dendriticum.

Na América do Sul, a principal espécie de Diphyllobothrium é o D. pacificum. A

difilobotriose causada por esta espécie é endémica na costa do Pacífico, principalmente no

Peru, mas também noutros países como o Chile e o Equador. A história de D. pacificum

neste continente é muito antiga, tendo este sido descoberto em amostras arqueológicas que

datam aproximadamente de 8000 a.C. (1,3,7,17) A distribuição mundial dos casos de

difilobotriose no Homem causada por D. pacificum está representada na figura 35.

Para além do D. pacificum, existem registos de infeções causadas por outras

espécies de Diphyllobothrium, nomeadamente D. latum e D. dendriticum, no Chile,

Argentina e Brasil. (17) Nos últimos anos têm sido reportados surtos de difilobotriose no

Figura 34 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. dendriticum. Legenda:

círculos pretos - casos autóctones; círculos brancos – casos importados.

Adaptado de: (1)





Brasil, um país onde até 2005 não havia registos de casos desta infeção. Estes casos foram

atribuídos ao D. latum, tendo sido proposta como fonte de infeção mais provável o consumo

de salmão importado do Chile. (6,26,27)

Na Ásia, a difilobotriose encontra-se amplamente distribuída nas regiões norte e

leste do continente. A difilobotriose é frequentemente reportada no Japão, onde a média de

casos por ano é de aproximadamente 100 desde os anos 70. (1,3,21) Até 1986, a maioria

dos casos era atribuída ao D. latum. No entanto, nesse ano, Yamane et. al demonstraram

que existiam diferenças morfológicas entre os exemplares de D. latum encontrados na

Finlândia e os encontrados no Japão, propondo assim uma nova espécie, o D. nihonkaiense.

Posteriormente, estudos moleculares vieram confirmar que se tratavam efetivamente de

duas espécies diferentes e que a maior parte dos casos no Japão era causada por D.

nihonkaiense. (1,2,21)

Durante muito tempo os casos de difilobotriose estavam limitados ao Japão, mas

recentemente começaram também a ser reportados na Coreia do Sul e na China. A maior

parte destes casos era igualmente atribuída ao D. latum, no entanto, atualmente os estudos

moleculares indicam que o D. nihonkaiense é a espécie dominante nestes países. (1,2,28)

Na figura 36 está representada a distribuição mundial da difilobotriose causada por D.

nihonkaiense.

Figura 35 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. pacificum. Legenda: círculos

pretos - casos autóctones; círculos brancos – casos importados.

Adaptado de: (1)





Os casos de difilobotriose são também frequentes na Rússia, particularmente na

região mais oriental, junto aos grandes Lagos, onde o D. latum e D. dendriticum se

encontram difundidos. (1,3,21) Estas duas espécies apresentam uma distribuição mundial

semelhante, que se sobrepõe parcialmente. No entanto, o D. dendriticum encontra-se mais

amplamente distribuído e tende a predominar nas regiões do Ártico, enquanto as infeções

causadas por D. latum são características das zonas subárticas e mais temperadas, como

demonstrado nas figuras 34 e 35, respetivamente. (2,11)

Ainda na Rússia, na região do rio Amur, o D. nihonkaiense (reportado como D.

klebanovskii, embora estudos moleculares tenham confirmado que estas duas espécies são

sinónimas), é considerado uma espécie importante. (2,3)

5.2. Parasitose Reemergente – a influência dos “novos” hábitos

alimentares

O consumo de peixe cru ou mal/pouco cozinhado faz parte dos hábitos alimentares

de várias populações a nível mundial desde a antiguidade. Em todo o mundo, são vários os

pratos que têm por base peixe cru, marinado ou fumado e que estão na origem de infeções

por Diphyllobothrium spp., como é o caso do sushi e sashimi no Japão e noutros países

asiáticos, do carpaccio (fatias muito finas de peixe cru) e tártaros (peixe cru marinado) de

diversos peixes em várias regiões da Europa, ou ainda do ceviche (pedaços de peixe cru

Figura 36 - Distribuição mundial dos casos de difilobotriose causada por D. nihonkaiense. Legenda:

círculos pretos - casos autóctones; círculos brancos – casos importados.

Adaptado de: (1)





marinado) na América Latina. (1,3) Na tabela 10 estão representados alguns dos principais

pratos de peixe consumidos mundialmente e que estão na origem de casos de difilobotriose,

bem como a sua distribuição geográfica.

Nas regiões onde este tipo de pratos faz parte da alimentação habitual das

populações e onde existem todas as condições para o parasita completar o seu ciclo de vida,

a difilobotriose ocorre, evidentemente, com maior frequência. Contudo, como referido, nas

últimas décadas verificou-se um declínio dos casos de difilobotriose em muitas destas áreas

endémicas, o que se deve provavelmente a melhores condições de higiene e a uma maior

consciencialização das populações dessas regiões acerca do risco do consumo de peixe cru

ou mal cozinhado.

Contrariamente a esta tendência, recentemente tem-se verificado um aumento

exponencial da popularidade do consumo de peixe cru, sobretudo de sushi e sashimi, um

pouco por todo o mundo, mas essencialmente nos países desenvolvidos. Esta nova

tendência é, assim, apontada como o fator chave da recente reemergência da difilobotriose

nas regiões anteriormente descritas, e também da emergência de novos focos em países

onde anteriormente existiam poucos ou nenhum caso registado, como o Brasil ou a

China.(1,29)

Esta alteração dos hábitos alimentares em grande parte dos países desenvolvidos

deve-se a uma multiplicidade de fatores, como sejam os fenómenos de migração humana,

a globalização dos costumes e tradições, e a crescente preocupação com a saúde e com a

adoção de um estilo de vida saudável, que resultam num maior conhecimento e

Tabela 10 - Pratos de peixe cru/insuficientemente cozinhado consumidos mundialmente e respetiva distribuição

Adaptado de: (1)





consciencialização dos benefícios do consumo de peixe e produtos derivados do peixe,

assim como do consumo de alimentos crus ou cozinhados de forma ligeira. Efetivamente,

esta preferência das sociedades modernas pelo consumo de peixe cru faz com que a

necessidade e procura futuras de peixe e produtos derivados destes sejam cada vez maiores,

levando a um aumento da pressão para a exploração dos ecossistemas marinhos e,

consequentemente, a um maior risco de contrair infeções por Diphyllobothrium spp.,

devido ao aumento da produção e exportação de peixe proveniente de áreas

endémicas.(2,21)

O salmão é provavelmente o peixe que mais frequentemente está na origem de

infeções por Diphyllobothrium spp., dado que é um dos peixes mais consumidos e

utilizados nos pratos de sushi, sashimi ou tártaro. (3,29) No entanto, e como referido

anteriormente, existem muitas outras espécies responsáveis pela transmissão deste parasita

ao Homem.

5.3. Outros Fatores que Contribuem para a Transmissão,

Expansão e Perpetuação da Difilobotriose

Embora a recente tendência de consumo de peixe cru ou pouco cozinhado constitua

o principal fator na reemergência e no aparecimento de novos focos de difilobotriose, existe

uma série de outros fatores que contribuem para a transmissão, introdução em novas áreas

geográficas e perpetuação de Diphyllobothrium spp.

Entre os principais fatores que contribuem para a expansão global da difilobotriose

estão a crescente mobilidade e migração das populações, que normalmente mantêm as suas

tradições e hábitos alimentares, e o comércio e transporte global de peixe fresco refrigerado

ou insuficientemente congelado. (1–3,17)

O mercado global de exportação e importação de peixe tem vindo a crescer

largamente, devido ao aumento da procura de peixe que se tem verificado nos últimos anos.

Esta maior procura tem como consequência o aumento da produção de peixes através de

aquacultura, o que pode constituir um fator de risco para a transmissão da difilobotriose,

uma vez que existe uma relação comprovada entre os peixes de aquacultura e a transmissão

de parasitoses ao Homem. (15,21,30,31)

Um fator que é cada vez mais importante na introdução ou manutenção da

difilobotriose nas populações é a contaminação do ecossistema aquático local com fezes.





A descarga de resíduos e esgotos, quer sejam provenientes das casas e edifícios da região

ou de barcos, é uma importante fonte de contaminação das águas locais com ovos de

Diphyllobothrium spp. Os animais domésticos, particularmente o cão, constituem outra

fonte importante de contaminação, podendo contribuir para a manutenção do ciclo de vida

de D. latum. (21,22)

A manutenção de Diphyllobothrium spp. no meio ambiente e a existência de infeção

dependem igualmente de vários fatores, como a fertilidade dos parasitas adultos, o vasto

espectro de hospedeiros definitivos e o tempo de sobrevivência dos plerocercóides no

organismo dos peixes. (1,3)

Os parasitas adultos de Diphyllobothrium spp. possuem uma capacidade de

reprodução extremamente elevada, podendo produzir até um milhão de ovos por dia. Este

facto significa que os meios aquáticos podem ser facilmente contaminados em locais com

condições de higiene e saneamento básico precárias, ou então através de um pequeno

número de hospedeiros definitivos. (1,3)

Este problema da contaminação das águas é ainda intensificado pelo facto de as

espécies de Diphyllobothrium apresentarem uma grande diversidade de hospedeiros

definitivos, o que faz com que os seus ciclos de vida se mantenham na natureza

independentemente do Homem. Desta forma, o tratamento da infeção na população

humana não elimina necessariamente o parasita das áreas afetadas. Estes animais atuam

assim como reservatórios de Diphyllobothrium spp. e têm um papel fundamental na

manutenção deste parasita no meio ambiente, provavelmente mesmo em regiões não

habitadas por humanos. O facto de estes animais terem uma grande capacidade de

movimentação e dispersão nos seus meios, contribui ainda para a disseminação das

espécies de Diphyllobothrium para novas áreas geográficas. (1,3)

Para além disso, os plerocercóides de Diphyllobothrium spp. podem sobreviver no

organismo dos peixes durante um longo período de tempo que pode ir de vários meses até

alguns anos, pelo que os peixes constituem um reservatório fundamental deste parasita,

contribuindo para a perpetuação do seu ciclo de vida. (1,3)

A localização dos plerocercóides nos peixes infetados é também um fator

importante na transmissão da difilobotriose ao Homem. Os plerocercóides da espécies que

se localizam normalmente no tecido muscular, como é o caso do D. latum e D.

nihonkaiense, representam uma fonte de infeção mais importante do que as espécies cujos





plerocercóides se localizam na cavidade corporal ou nas vísceras, como o D. dendriticum

e D. pacificum. (1,2)

Por fim, existe ainda um risco ocupacional associado às infeções por

Diphyllobothrium spp. As taxas de infeção são frequentemente elevadas nos pescadores,

que muitas vezes têm o hábito de ingerir as ovas e o fígado do peixe fresco. (3,21,22)



VIII MAC Imunologia


6. Imunologia

A imunologia das infeções parasitárias tem sido alvo de estudo desde há muitos

anos, com o objetivo de compreender melhor a interação parasita-hospedeiro e a forma

como os parasitas modificam a resposta imunitária dos hospedeiros, e de identificar, isolar

e caracterizar antigénios dos parasitas. A compreensão de todos estes fatores é essencial

para que possam ser desenvolvidos novos testes de imunodiagnóstico e vacinas eficazes

que permitam controlar estas infeções. (6,14,32,33)

A resposta imunitária desencadeada por Diphyllobothrium spp. nos seus

hospedeiros é semelhante à que se verifica nas infeções pelos restantes helmintas, apesar

de estes incluírem uma grande diversidade de parasitas pertencentes a diferentes classes

(cestodes, nematodes e trematodes) que apresentam uma relação filogenética distante. (6)

As infeções causadas por helmintas e as correspondentes respostas imunitárias

desencadeadas nos hospedeiros, são resultado de uma longa e dinâmica coevolução entre

os hospedeiros e os parasitas. Para o parasita, é vantajoso ludibriar o hospedeiro para que

este desenvolva uma resposta imunitária ineficaz, de forma a poder continuar a sua

maturação e propagação, mas sem prejudicar excessivamente ou causar a morte do

hospedeiro. Por outro lado, o hospedeiro tem a necessidade de desenvolver uma resposta

imunitária eficaz para expulsar o parasita e minimizar os seus efeitos adversos, no entanto

sem comprometer a sua capacidade de responder eficazmente a outros patogéneos. (33)

No Homem, a resposta imunitária às infeções por helmintas abrange uma grande

variedade de mecanismos, que envolvem tanto o sistema imunitário inato como o

adaptativo.

6.1. Resposta Imunitária nas Infeções Causadas por Helmintas

A ativação e desenvolvimento da resposta imunitária dependem de uma interação

contínua entre os componentes do sistema imunitário inato e do sistema imunitário

adaptativo. As células do sistema imunitário inato, como as células epiteliais, fagócitos

(neutrófilos, macrófagos) e células dendríticas, reconhecem a entrada do parasita e dão

início à resposta adaptativa, através da libertação de citocinas e da apresentação de



VIII MAC Imunologia


antigénios do parasita aos linfócitos T por células apresentadoras de antigénios, como são

as células dendríticas. (6,32,33)

A resposta adaptativa nas infeções por helmintas é essencialmente mediada por

células T helper 2 (Th2) CD4+, que se diferenciam após a apresentação dos antigénios pelas

células dendríticas, e começam a produzir uma grande variedade de citocinas denominadas

interleucinas (IL), como a IL-4, IL-9, IL-13 e IL-21. Estes sinais químicos medeiam o

switching de classe das imunoglobulinas (Ig) para IgE principalmente, mas também para

IgA e IgG. Estas imunoglobulinas ligam-se em seguida a receptores presentes em células

efetoras como os eosinófilos, basófilos e mastócitos, ativando-as. Ao serem ativadas, estas

células libertam diversas moléculas (como a histamina e as triptases, que derivam dos

mastócitos, e a proteína catiónica do eosinófilo), que interferem com a estrutura da

membrana superficial do helminta ou que, por outro lado, alteram o ambiente em que este

vive tornando-o mais adverso. (6,32,33) Assim, a resposta imunitária às infeções por

helmintas no ser humano é multicelular, sendo orquestrada pelas células Th2 e por diversas

citocinas, mas dependendo sempre da interação permanente entre as células efetoras da

imunidade inata e da imunidade adaptativa. (32,33)

Embora as infeções por helmintas desencadeiem respostas imunitárias nos

hospedeiros, em muitos casos parece existir uma interação harmoniosa entre o parasita e o

hospedeiro. (6,34) De facto, nas infeções humanas causadas por Diphyllobothrium spp., os

indivíduos são na maior parte dos casos assintomáticos, e quando apresentam

manifestações clínicas estas são normalmente ligeiras.

No entanto, isto não se deve ao facto de o sistema imunitário do hospedeiro não

detetar ou reconhecer a presença do parasita no organismo, mas sim à capacidade que os

helmintas têm de regular e controlar a resposta imunitária do hospedeiro através de diversos

mecanismos, evitando assim que este os elimine e minimizando a severidade da infeção

que provocam. (34)

6.2. Mecanismos de Evasão ao Sistema Imunitário dos Hospedeiros

Como parte da evolução e adaptação dos helmintas, estes desenvolveram diversos

mecanismos de evasão ao sistema imunitário dos seus hospedeiros. Estes mecanismos

asseguram a proliferação, sobrevivência e persistência do parasita no hospedeiro e,

simultaneamente, evitam a morte do hospedeiro como consequência dos efeitos que as



VIII MAC Imunologia


respostas imunitárias desencadeadas podem provocar, contribuindo assim para a elevada

longevidade dos parasitas no hospedeiro e para a cronicidade das infeções. (35,36)

Os mecanismos básicos de evasão dos parasitas ao sistema imunitário do

hospedeiro incluem a mímica de antigénios do hospedeiro, a imunossupressão e a

imunomodulação, entre outros. (35,37)

Nos últimos anos tem surgido um interesse crescente na compreensão da base

molecular da imunomodulação realizada pelos helmintas. Estes parasitas têm a capacidade

de sintetizar uma grande variedade de moléculas que são idênticas às que funcionam no

organismo do hospedeiro e que são designadas de produtos ou antigénios de

excreção/secreção. Estes produtos de excreção/secreção consistem em moléculas solúveis

que se ligam a células e moléculas imunocompetentes e as destroem ou que, por outro lado,

interagem com as mesmas, regulando assim a resposta imunitária do hospedeiro. (6,37,38)

Atualmente foi já identificada e estudada uma vasta diversidade de substâncias

produzidas por helmintas que infetam mamíferos, que atuam como imunomoduladoras da

resposta imunitária no hospedeiro. No entanto, existem ainda poucos estudos acerca das

moléculas imunomoduladoras produzidas pelos parasitas que infetam os peixes, como é o

caso de Diphyllobothrium spp., pelo que o espetro destas moléculas ainda não é bem

compreendido. (37–39)

6.2.1. Papel das Prostaglandinas Produzidas por Diphyllobothrium spp. na

Imunomodulação da Resposta Imunitária

O papel das prostaglandinas enquanto moléculas imunomoduladoras tem sido

estudado ao longo dos últimos 20 anos. (38) As prostaglandinas (PGs) são pequenas

moléculas lipídicas que derivam do ácido araquidónico e que regulam um grande número

processos no organismo, como a função renal, a agregação plaquetária, a libertação de

neurotransmissores e a modulação da função imunológica. Existem diversos tipos de PGs

– PGI2, PGF2α, PGD2 e PGE2 – sendo que a PGE2 é uma das melhores estudadas e acerca

da qual existe mais informação. Estas moléculas são sintetizadas em todo o género de

tecidos e cada tipo de prostaglandina pode desempenhar um papel distinto em diferentes

tipos de tecidos. (38,40,41)



VIII MAC Imunologia


Os parasitas também têm a capacidade de sintetizar PGs, contudo não conseguem

produzir o ácido araquidónico necessário à síntese destas moléculas, pelo que o adquirem

através do hospedeiro. (38)

Atualmente sabe-se que as PGs produzidas pelos parasitas, principalmente a PGE2,

atuam como moléculas imunomoduladoras nas infeções parasitárias em mamíferos. (38)

Enquanto molécula imunomoduladora, a PGE2 afeta elementos celulares fundamentais.

Nas infeções parasitárias em mamíferos, a PGE2 modula a resposta inflamatória e a ativação

subsequente do sistema imunitário adaptativo. Esta prostaglandina tem diversos efeitos na

regulação e atividade dos linfócitos T, suprimindo a sua ativação e proliferação. Para além

disso, inibe a produção de diversas citocinas pró-inflamatórias como o interferão γ (INF-

γ) e a IL-2, produzidas pelas células Th1, promovendo assim a alteração do padrão das

respostas mediadas por células T CD4+ do hospedeiro, de uma resposta do tipo Th1 para

uma do tipo Th2. (38,40,41) Desta forma, através da PGE2 os parasitas alteram o tipo de

resposta imunitária do hospedeiro, o que constitui uma vantagem para a sua sobrevivência,

já que a resposta do tipo Th1 promove uma forma inflamatória/citotóxica de

imunidade.(38,40)

Moléculas de PGE2 foram já detetadas em protozoários, nematodes e trematodes

mas, até há pouco tempo, não havia evidência da produção de PGs nos cestodes, em

particular nos parasitas do género Diphyllobothrium. Contudo, estudos recentes

evidenciaram a produção de PGE2 e também de PGD2 pelos plerocercoides de D.

dendriticum encontrados em peixes das espécies Coregonus autumnalis e Coregonus

migratorius. (37–39)

No estudo realizado por Kutyrev et. al em 2017 (38), que teve como um dos

objetivos a deteção e quantificação das PGs E2 e D2 em plerocercoides de D. dendriticum

encontrados na espécie Coregonus autumnalis, foi evidenciada a presença destas duas PGs

no D. dendriticum e demonstrada a sua excreção em resposta ao soro de C. autumnalis.

Neste artigo, os autores levantam a hipótese de que o D. dendriticum produz

quantidades elevadas de PGE2 nos tecidos do hospedeiro, induzindo um forte efeito

imunossupressor na viabilidade dos leucócitos e na produção de espécies reativas de

oxigénio. Para além disso, presumem que a PGE2 produzida por D. dendriticum também

pode promover a alteração da resposta imunitária do hospedeiro do tipo Th1 para o tipo



VIII MAC Imunologia


Th2. No que diz respeito à PGD2, as informações acerca do seu papel específico nas

interações parasita-hospedeiro são muito escassas. (38)

Os autores do estudo concluem que a PGE2 e PGD2 produzidas pelos plerocercoides

de D. dendriticum desempenham, muito provavelmente, dois papéis. Por um lado,

modulam presumivelmente a resposta imunitária do hospedeiro (C. autumnalis) contra os

parasitas, através da alteração da resposta do tipo Th1 para uma do tipo Th2. Por outro

lado, estas PGs podem ser utilizadas pelo D. dendriticum para a regulação de processos

fisiológicos internos do parasita. A PGE2 é presumivelmente necessária para o

desenvolvimento e funcionamento corretos do sistema nervoso, enquanto a PGD2 pode ser

utilizada como um antagonista dos mediadores que causam a contração muscular. (38)



VIII MAC Diagnóstico


7. Diagnóstico

O diagnóstico laboratorial das infeções causadas por Diphyllobothrium spp. é

realizado através do exame parasitológico das fezes, que se baseia na deteção e

identificação microscópica de ovos e/ou de proglótis característicos deste parasita em

amostras fecais dos indivíduos infetados. A deteção destas estruturas permite fazer o

diagnóstico ao nível do género, mas não permite identificar e distinguir de forma fiável as

diferentes espécies de Diphyllobothrium spp., uma vez que estas são muito semelhantes

entre si. (1,11,42)

Por esta razão, foram desenvolvidos vários métodos moleculares rápidos e

específicos para o diagnóstico de rotina de infeções por Diphyllobothrium spp. nos

laboratórios, uma vez que só através destes métodos é possível fazer um diagnóstico

diferencial fiável das espécies de Diphyllobothrium. (3,43) No entanto, estes métodos ainda

são pouco utilizados nos laboratórios de análises clínicas por motivos económicos e

técnicos, uma vez que são necessários vários equipamentos, reagentes e técnicos

especializados, e que os procedimentos são complexos e longos. (42) Para além disso, todas

as espécies de Diphyllobothrium spp. que infetam o Homem causam sintomas semelhantes

e, uma vez que são facilmente tratadas com a administração do mesmo fármaco

(praziquantel), como será explicado no capítulo referente ao tratamento, a identificação do

parasita ao nível do género é suficiente para os clínicos, não sendo necessário um

diagnóstico diferencial. (3,42,44)

No entanto, do ponto de vista epidemiológico a identificação correta das espécies

de Diphyllobothrium é essencial, por um lado devido à reemergência da difilobotriose que

se tem verificado em várias regiões e, por outro, devido ao facto de possivelmente existir

um grande número de registos incorretos resultante das dificuldades existentes na

identificação e distinção morfológica das espécies. A identificação exata das espécies de

Diphyllobothrium é, por isso, necessária para uma melhor compreensão da distribuição

mundial das várias espécies que infetam o Homem, do seu ciclo de vida e de quais as

principais fontes de infeção, bem como para prevenir a introdução destes parasitas em

sistemas aquáticos onde estes não existem. (1,3,42,44)





7.1. Diagnóstico Baseado na Morfologia

O diagnóstico laboratorial da difilobotriose baseia-se essencialmente na deteção e

identificação microscópica dos ovos característicos de Diphyllobothrium spp., que medem

entre 55-75 μm de comprimento e 40-55 μm de largura e que apresentam uma forma oval

e casca espessa, com um opérculo numa das extremidades e uma pequena protuberância na

extremidade oposta (figura 37). (3,12,44) A observação microscópica de ovos de

Diphyllobothrium spp. é efetuada numa preparação em lâmina, após a realização da técnica

de concentração da amostra de fezes.

A deteção de proglótis em que é possível visualizar o útero com a configuração

característica em roseta e os poros genitais (poros comuns masculino e feminino e poro

uterino) ambos localizados na zona central (figura 38), permite igualmente fazer o

diagnóstico de difilobotriose. Estas proglótis são características de Diphyllobothrium spp.

e, embora sejam parecidas às proglótis de Taenia spp., distinguem-se facilmente destas,

uma vez que as últimas têm uma forma diferente e apresentam os poros genitais na zona

lateral da proglótis. (1,2,14) Para a observação das estruturas morfológicas das proglótis de

Diphyllobothrium spp., estas são fixadas com formalina a 10% ou etanol a 70% e é

realizada uma preparação entre lâminas, que em seguida é corada com uma coloração de

carmim. (28,45,46)

A principal vantagem do diagnóstico baseado na morfologia é o facto de ser pouco

dispendioso e relativamente fácil de executar. No entanto, na maior parte dos casos este

método não permite identificar e distinguir as diferentes espécies de

Diphyllobothrium.(1,3)

Figura 37 – Observação Microscópica de ovos de Diphyllobothrium spp. em amostras de fezes

Adaptado de: (3,26,60)





Os ovos de Diphyllobothrium spp. têm dimensões variáveis, sendo que estas

sobrepõem-se muitas vezes entre as diferentes espécies, e mesmo dentro da mesma espécie

existe uma grande variabilidade, que depende principalmente do tipo de hospedeiro

definitivo e da intensidade da infeção, o que faz com que seja praticamente impossível

identificar a espécie causadora da infeção. (1,3,44)

No que diz respeito às proglótis, as de D. dendriticum e D. pacificum possuem

algumas diferenças relativamente às proglótis de D. latum e D. nihonkaiense, o que pode

permitir identificar as primeiras duas espécies. As proglótis grávidas de D. dendriticum

apresentam bordos laterais mais côncavos e uma vesícula seminal localizada mais

posteriormente em relação ao saco do cirro. (11) Por sua vez, as proglótis de D. pacificum

possuem protuberâncias que se assemelham a papilas, separadas por depressões

semicirculares estreitas na superfície ventral da proglótis, entre o bordo anterior e o poro

genital masculino. (16,17)

Apesar destas diferenças morfológicas entre as proglótis de algumas espécies, a

identificação e distinção das espécies de Dipyllobothrium é mais facilmente realizada

através do tamanho e forma do escólex e do colo/pescoço, no entanto estas duas estruturas

raramente são encontradas. Um outro fator que contribui para a dificuldade em identificar

as espécies de Diphyllobothrium com base na morfologia, é o facto de as amostras de

proglótis obtidas após o tratamento da infeção se encontrarem deformadas e danificadas,

não sendo por isso adequadas para avaliação morfológica. (1,3,11,42)

Figura 38 - Proglótis de Diphyllobothrium spp. (a) D. latum. (b) D. dendriticum. (c) D. pacificum. (d) D.

nihonkaiense.

Legenda: cs – saco do cirro; ov – ovário; t – testículos; u – útero; up – poro uterino; v – glândulas vitelinas.

Adaptado de: (3,14,24,61)





Recentemente, um estudo realizado por Leštinová et. al (44) teve como objetivo

estudar as dimensões e a superfície dos ovos de 8 espécies de parasitas pertencentes à

ordem Diphyllobothriidea, entre os quais o D. latum, D. nihonkaiense, D. dendriticum e D.

pacificum, através de microscopia ótica e microscopia eletrónica de varrimento (MEV). Os

resultados do estudo mostraram que a combinação de características morfológicas e

morfométricas dos ovos permitiu distinguir todas as espécies em estudo, incluindo as

quatro principais espécies de Diphyllobothrium no Homem, apesar da elevada variabilidade

intraespecífica existente. (44)

Os ovos de D. pacificum são identificados mais facilmente porque apresentam

menores dimensões e porque a sua superfície encontra-se coberta de um grande número de

pequenas depressões (à semelhança do que se verifica noutras espécies que como o D.

pacificum têm um ciclo de vida marinho), enquanto os ovos de D. latum, D. nihonkaiense

e D. dendriticum apresentam uma superfície lisa (figura 39). (44)

Apesar dos resultados obtidos, os autores salientam que uma análise morfométrica

e morfológica tão detalhada, que recorre à microscopia eletrónica de varrimento, não é

adequada para o diagnóstico de rotina de amostras de fezes, pelo que deverão ser utilizados

métodos moleculares para a identificação exata das diferentes espécies de

Diphyllobothrium. (44)

Figura 39 - Fotografias de ovos de diferentes espécies de Diphyllobothrium, obtidas através de MEV. (a) D.

pacificum. (b) D. latum. (c) D. dendriticum. (d) D. nihonkaiense.

Adaptado de: (44)





7.2. Diagnóstico Molecular

Atualmente os métodos moleculares, nomeadamente a técnica de amplificação de

DNA por PCR (Polymerase Chain Reaction) e a técnica de sequenciação, constituem as

ferramentas mais fiáveis para a identificação das diferentes espécies de Diphyllobothrium.

A aplicação destes métodos permitiu melhorar a especificidade do diagnóstico e tornou

possível analisar um grande número de amostras num curto período de tempo. (1,3)

Anteriormente eram utilizadas técnicas bioquímicas (ensaios enzimáticos ou

imunoeletroforese) como métodos alternativos para a identificação das espécies de

Diphyllobothrium. Um outro método utilizado para distinguir principalmente as espécies

D. latum e D. nihonkaiense era a técnica de RFLP (restriction fragment length

polymorphism), no entanto os resultados obtidos eram muitas vezes difíceis de interpretar

e a técnica era mais adequada para discriminar um pequeno número de sequências de

DNA.(1,3,42)

A partir do final dos anos 90, foram caracterizadas as primeiras sequências de DNA

ribossomal (rDNA) e de DNA mitocondrial (mtDNA), que começaram em seguida a ser

utilizadas na identificação das espécies de Diphyllobothrium, o que contribuiu para uma

melhor compreensão da filogenia do género. (1,3,42) Contudo, as sequências de genes

ribossomais (18S rDNA, 5.8S rDNA, 28S rDNA) e das regiões ITS (internal transcribed

spacers) ribossomais, não permitem distinguir as espécies D. latum, D. nihonkaiense e D.

dendriticum. (1,3,47)

A caracterização completa dos genomas de D. latum por Park et. al (48) e de D.

nihonkaiense por Kim et. al (49), veio fornecer informação crucial acerca da utilidade de

diversas regiões codificantes e não codificantes na identificação das espécies de

Diphyllobothrium. Em particular, a sequência do gene cox1 (cytochrome c oxidase subunit

1) do mtDNA surgiu como um alvo apropriado, sendo que atualmente é o alvo mais

utilizado para o diagnóstico específico das espécies de Diphyllobothrium que causam

infeção no Homem, juntamente com outros genes mitocondriais como o cob (cytochrome

b) e o nad3 (NADH dehydrogenase subunit 3). (1,3)

As técnicas de PCR e sequenciação, embora altamente precisas, são bastante

complicadas, longas e dispendiosas para serem aplicadas no diagnóstico de rotina nos

laboratórios de análises clínicas. Nesse sentido, Wicht et. al (42) desenvolveram, em 2010,

uma técnica molecular simples, rápida e económica para o diagnóstico diferencial das





quatro principais espécies de Diphyllobothrium causadoras de infeção no Homem. Este

teste baseia-se na técnica de PCR multiplex (uma variante da técnica de PCR que permite

amplificar mais do que uma sequência alvo numa única reação, através da utilização de

múltiplos primers), com o gene cox1 do mtDNA a ser utilizado como alvo.

Os resultados do estudo indicam que este é um método promissor para a

identificação de rotina de D. latum, D. nihonkaiense, D. dendriticum e D. pacificum,

representando uma alternativa adequada às técnicas de PCR e sequenciação. A utilização

da técnica de PCR multiplex permite fazer a distinção das espécies a partir de proglótis e

ovos de Diphyllobothrium spp. e, para além disso, pode também ser utilizada na

identificação das formas larvares deste parasita, contribuindo assim para a compreensão do

ciclo de vida das diversas espécies. (42)

Uma das maiores dificuldades existentes na identificação das espécies de

Diphyllobothrium através de métodos moleculares, incluindo a técnica de PCR multiplex,

é o facto de as amostras não se encontrarem conservadas/fixadas de forma correta. Para a

análise molecular, estas apenas devem ser fixadas com etanol e não com outros fixadores

como a formalina, AFA (mistura de etanol, formalina e ácido acético) ou etanol

desnaturado, uma vez que estes afetam irreversivelmente a qualidade do DNA e as reações

químicas que ocorrem nas técnicas moleculares. (1,42)

Mais recentemente, Thanchomnang et. al (43) desenvolveram um outro método

para a identificação das espécies de Diphyllobothrium, com base na técnica de

pirosequenciação. A pirosequenciação é uma técnica de sequenciação de DNA que utiliza

reações enzimáticas e bioluminescência para detetar a libertação de pirofosfato (PPi) que

ocorre durante a síntese do DNA. Quando um novo nucleótico é incorporado, a libertação

de PPi gera um sinal luminoso que é detetado e medido. A intensidade da luz gerada é

proporcional ao número de nucleótidos incorporados. (43)

Neste estudo, o método de pirosequenciação foi utilizado para distinguir 9 espécies

de parasitas pertencentes à ordem Diphyllobothriidea, entre as quais o D. latum, D.

nihonkaiense, D. dendriticum e D. pacificum, utilizando o gene cox1 como marcador

molecular. Foi demonstrado que este método constitui uma ferramenta fiável para a rápida

identificação das 9 espécies estudadas, constituindo por isso mais uma alternativa

promissora aos métodos tradicionais de PCR e sequenciação. Para além da sua aplicação

clínica, esta técnica pode também ser utilizada para estudos epidemiológicos,





nomeadamente através da identificação de formas larvares encontradas nos hospedeiros

intermediários de Diphyllobothrium spp. (43)

Uma outra vantagem deste método é que, para a análise molecular, são suficientes

produtos de PCR pequenos, pelo que amostras que foram fixadas com formalina e cujo

DNA sofreu degradação podem ser utilizadas neste teste. (43)



VIII MAC Tratamento


8. Tratamento

O tratamento da difilobotriose é efetuado através da administração oral de fármacos

pertencentes à classe dos anti-helmínticos, o praziquantel ou, em alternativa, a niclosamida.

Os anti-helmínticos são um grupo de fármacos utilizados em infeções causadas por

helmintas, atuando localmente no lúmen intestinal de forma a provocar a expulsão dos

parasitas que vivem no intestino, ou a nível sistémico contra helmintas que se localizam

fora do trato gastrointestinal. (50)

Para que o tratamento da difilobotriose seja considerado eficaz, é necessário que

ocorra a expulsão completa do estróbilo e também do escólex, uma vez que o parasita pode

voltar a crescer se o escólex se mantiver no lúmen intestinal. Caso o escólex não seja

expulso, é necessário verificar que não surgem mais ovos de Diphyllobothrium nas fezes

dos indivíduos infetados para que este seja considerado curado. (51)

8.1. Praziquantel

O praziquantel é um anti-helmíntico utilizado no tratamento de diversas infeções

causadas por cestodes e trematodes (sobretudo por Schistosoma spp.), constituindo o

fármaco recomendado para o tratamento da difilobotriose. (52,53) Este fármaco é um

derivado da pirazino-isoquinolina e o seu modo de ação baseia-se em alterações estruturais

no tegumento dos parasitas. O praziquantel aumenta a permeabilidade da membrana aos

iões cálcio (Ca2+), dando assim origem a espasmos severos e causando paralisia dos

músculos do parasita. A atuação do praziquantel resulta na expulsão do parasita juntamente

com as fezes, ou na morte e destruição do mesmo no lúmen intestinal. (14)

A administração de praziquantel para o tratamento da difilobotriose é feita por via

oral e em dose única, sendo que a dose recomendada a nível mundial é de 5-10 mg/kg para

adultos e crianças. (53,54) Contudo, a dose a ser utilizada pode variar consoante a espécie

de Diphyllobothrium em questão. No que diz respeito ao D. nihonkaiense, a dose de 5-10

mg/kg tem sido reportada como eficaz em diversos casos (1,3,51), sendo que o mesmo

acontece com o D. pacificum, em que uma dose de 10 mg/kg foi eficaz no tratamento de

vários indivíduos infetados. (1,3,55) Já nas infeções causadas por D. latum, estudos

experimentais realizados por Bylund et. al em 1977 e por Groll em 1980, indicaram que

apenas uma dose de 25 mg/kg era clinicamente eficaz no tratamento da difilobotriose.



VIII MAC Tratamento


(1,55,56) No entanto, artigos mais recentes reportam casos de difilobotriose causada por

D. latum em que todos os indivíduos foram tratados com sucesso através da administração

de uma dose de praziquantel de 15 mg/kg. (45,57,58)

Assim, o D. nihonkaiense parece ser mais sensível ao praziquantel do que o D.

latum, e igualmente ou mais sensível que o D. pacificum. (1,3,51)

De um modo geral o praziquantel é bem tolerado pelos indivíduos infetados, sendo

que os efeitos secundários, quando presentes, são normalmente ligeiros. Os efeitos

secundários deste fármaco incluem dor abdominal, náuseas, diarreia, cefaleias, tonturas e

sonolência. Efeitos secundários indiretos como febre, prurido, urticária, artralgias e

mialgias poderão também ser observados ocasionalmente. (14,50) Habitualmente os efeitos

secundários do tratamento com praziquantel não requerem tratamento, no entanto nos

indivíduos que se encontram infetados com um maior número de parasitas, estas reações

podem ser de maior gravidade e podem surgir mais frequentemente. (1,3)

8.2. Niclosamida

Em alternativa ao praziquantel, pode também ser utilizado outro anti-helmíntico no

tratamento da difilobotriose, a niclosamida. A niclosamida é um derivado da salicilanilida

e começou a ser utilizada nos anos 60 para o tratamento de infeções no Homem causadas

por Taenia saginata, Diphyllobothrium latum e Hymenolepis nana. Este fármaco era

utilizado como alternativa ao praziquantel, uma vez que era eficaz, tinha um baixo custo e

era facilmente obtido em muitas partes do mundo. (50) Para além disso, os seus efeitos

secundários (náuseas, vómitos e dor abdominal) são pouco frequentes, dado que este

fármaco não é absorvido no trato gastrointestinal. (3,14)

No entanto, a niclosamida já não se encontra disponível para ser utilizada no

tratamento de infeções no Homem em vários países, como é o caso dos EUA. Noutros

países continua a ser utilizada como alternativa ao praziquantel, sendo administrada por via

oral e em dose única. A dose recomendada é de 2 g para os adultos e de 50 mg/kg para as

crianças. (3,53,54)



VIII MAC Prevenção e Controlo


9. Prevenção e Controlo

As medidas de prevenção e controlo da difilobotriose devem ter como principal

objetivo a interrupção do ciclo de vida de Diphyllobothrium spp. Na prática, para um

controlo eficaz da difilobotriose a larga escala, mas principalmente nas áreas endémicas,

estas medidas devem focar-se em três pontos principais: prevenção da contaminação dos

ecossistemas aquáticos; tratamento dos indivíduos infetados; prevenção da transmissão dos

plerocercóides presentes nos peixes ao Homem. (1,3)

O tratamento adequado das águas residuais e a melhoria do saneamento básico

representam medidas eficazes para evitar a contaminação das águas. No entanto, estas

medidas têm um impacto limitado se existirem outros hospedeiros definitivos de

Diphyllobothrium spp. nessa área pois, como referido anteriormente, estes constituem

reservatórios deste parasita, contribuindo para a manutenção do seu ciclo de vida. Pela

mesma razão, o tratamento dos indivíduos infetados com Diphyllobothrium spp., embora

eficaz, não contribui para a eliminação do parasita. A existência de reservatórios de

Diphyllobothrium spp. representa assim um sério obstáculo para os programas de controlo

da difilobotriose. (1,3)

Assim, a forma mais simples e eficaz de prevenir a infeção por Diphyllobothrium

spp. no Homem é evitar o consumo de peixe cru, mal cozinhado, fumado ou em pickle.

Contudo, os hábitos alimentares tradicionais das populações e a crescente popularidade do

consumo de peixe cru em todo o mundo, dificultam grandemente esta medida.

Desta forma, para evitar a infeção o peixe deve ser bem cozinhado ou, em

alternativa, adequadamente congelado antes de ser consumido, o que permite eliminar os

plerocercóides presentes no tecido muscular ou nas vísceras dos peixes. A cozedura do

peixe a uma temperatura de 55°C durante cerca de 5 minutos é suficiente para eliminar o

parasita. (1,3) Relativamente à congelação do peixe, as recomendações da U.S. Food &

Drug Administration (FDA) (59) são as seguintes:

Congelar e conservar a -20°C ou a uma temperatura inferior, durante 7 dias;

ou

Congelar a -35°C ou a uma temperatura inferior até o peixe ficar firme e

conservar à mesma temperatura, durante durante 15 horas; ou



VIII MAC Prevenção e Controlo


Congelar a -35°C ou a uma temperatura inferior até o peixe ficar firme e

conservar a -20°C (ou menos), durante 24 horas.

Desta forma, se não tiver sido previamente congelado de forma adequada, o peixe

não deve ser consumido cru ou mal cozinhado. Contudo, o salmão, peixe que mais

frequentemente está associado a infeções por Diphyllobothrium spp., é atualmente

transportado fresco e apenas conservado em gelo. Este é principalmente exportado de zonas

endémicas como o Chile e o noroeste do Pacífico (Canadá e EUA), sendo esta a via que

leva à introdução de Diphyllobothrium spp. em novas áreas geográficas. (1,3)

Assim, a inspeção do peixe para venda ao público e do peixe utilizado na

restauração, em particular nos restaurantes de sushi, onde devem ser cumpridas as

recomendações de congelação já indicadas, e a inspeção da proveniência, condições de

transporte e conservação do peixe, constitui uma importante medida de prevenção e

controlo de infeções por Diphyllobothrium spp. (3,6,29)

Por fim, é fundamental informar, educar e sensibilizar os consumidores acerca dos

riscos que o consumo de peixe cru ou mal cozinhado acarreta. (1,3,6) Para além disso, é

também importante que estes tenham conhecimento de que o peixe fumado a baixas

temperaturas pode também constituir uma fonte de infeção, já que o parasita não é

eliminado. Já no caso do peixe salgado, esta técnica resulta numa infeciosidade diminuída

dos plerocercóides de Diphyllobothrium spp., porém esta diminuição pode demorar vários

dias ou semanas, dependendo do tamanho do peixe e do volume de sal utilizado. (1)

Neste sentido, as organizações de saúde locais e mundiais devem promover

campanhas de sensibilização junto das populações, sendo que os meios de comunicação

social têm um papel fundamental na divulgação da informação.



VIII MAC Conclusão


10. Conclusão

Apesar de o Diphyllobothrium spp. ser conhecido desde há muito tempo como um

parasita causador de infeção no ser humano, atualmente existem ainda muitas lacunas no

conhecimento da epidemiologia, distribuição mundial e ciclo de vida das diferentes

espécies que infetam o Homem. Este facto deve-se principalmente às dificuldades

existentes na identificação e distinção das várias espécies com base na sua morfologia, uma

vez que, tanto os ovos como as proglótis das diferentes espécies são muito semelhantes.

Para além disso, o facto de o tratamento da difilobotriose ser o mesmo independemente da

espécie causadora de infeção, leva a que a identificação do parasita ao nível do género seja

suficiente para os clínicos.

O desenvolvimento de métodos moleculares veio, entretanto, permitir a obtenção

de um diagnóstico diferencial fiável e, consequentemente, a obtenção de mais informação

acerca das diversas espécies de Diphyllobothrium. No entanto, por motivos económicos e

técnicos, estes métodos (PCR e sequenciação) não são ainda aplicados na rotina dos

laboratórios. Recentemente foram desenvolvidos novos métodos mais simples, rápidos e

económicos (PCR multiplex e pirosequenciação), contudo estes carecem ainda de mais

estudos para que possam ser implementados nos laboratórios de análises clínicas. Para além

disso, é ainda fundamental que seja apenas utilizado etanol para fixar todas as amostras

para análise molecular, uma vez que a utilização de outras substâncias impede geralmente

o sucesso destas técnicas.

A utilização de métodos moleculares assume ainda maior importância tendo em

conta a recente reemergência da difilobotriose que se verifica em diversas regiões a nível

mundial, e que representa atualmente um crescente problema de saúde pública.

Esta reemergência deve-se essencialmente à crescente popularidade do consumo de

peixe cru ou insuficientemente cozinhado que se verifica em todo o mundo, mas

principalmente nos países desenvolvidos, e também ao aumento da produção (aquacultura)

e exportação de peixe, em particular de salmão do Pacífico proveniente de zonas endémicas

como o Chile. A previsão é de que o consumo de peixe continue a aumentar nos próximos

anos e que, consequentemente, a produção de peixe através de aquacultura aumente

também, o que pode resultar num aumento exponencial do número de casos de

difilobotriose num futuro próximo.



VIII MAC Conclusão


Assim, torna-se fundamental adotar medidas de prevenção e controlo eficazes, quer

ao nível da inspeção rigorosa do peixe produzido em aquacultura e das condições em que

este é transportado e conservado, quer ao nível da informação e educação dos consumidores

acerca do risco do consumo de peixe cru ou mal cozinhado.





11. Bibliografia

1. Kuchta R, Scholz T, Brabec J, Narduzzi-wicht B. Diphyllobothrium,

Diplogonoporus, and Spirometra. In: Biology of Foodborne Parasites. CRC Press;

2015. p. 299–326.

2. Scholz T, Kuchta R. Fish-borne, zoonotic cestodes (Diphyllobothrium and relatives)

in cold climates: A never-ending story of neglected and (re)-emergent parasites.

Food Waterborne Parasitol. 2016;4:23–38.

3. Scholz T, Garcia HH, Kuchta R, Wicht B. Update on the Human Broad Tapeworm

(Genus Diphyllobothrium), Including Clinical Relevance. Clin Microbiol Rev.

2009;22(1):146–60.

4. Centers for Disease Control (CDC). Parasites - Diphyllobothrium Infection Biology

[Internet]. [cited 2017 Aug 1]. Available from:

https://www.cdc.gov/parasites/diphyllobothrium/biology.html

5. World Health Organization (WHO). Parasitic Zoonoses: report of a WHO expert

committee with the participation of FAO. WHO Technical Report Series. 1979.

6. Murrell KD, Fried B. World Class Parasites: Volume 11. Food-Borne Parasitic

Zoonoses: Fish and Plant-Borne Parasites. Springer; 2007. 560 p.

7. Le Bailly M, Bouchet F. Diphyllobothrium in the past: Review and new records. Int

J Paleopathol. 2013;

8. Paniker CKJ, Ghosh S. Paniker’s Textbook of Medical Parasitology. 7th ed. Jaypee

Brothers Medical Publishers (P) Ltd; 2013. 276 p.

9. National Center for Biotechnology Information (NCBI). Taxonomy Browser -

Diphyllobothrium [Internet]. [cited 2017 Jul 8]. Available from:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=28

844&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock&lin=f&log_op=lineage_toggle

10. Kuchta R, Scholz T, Brabec J, Bray RA. Suppression of the tapeworm order

Pseudophyllidea (Platyhelminthes: Eucestoda) and the proposal of two new orders,

Bothriocephalidea and Diphyllobothriidea. Int J Parasitol. 2008;38:49–55.

11. Kuchta R, Brabec J, Kubáckova P, Scholz T. Tapeworm Diphyllobothrium

dendriticum (Cestoda )— Neglected or Emerging Human Parasite ? PLoS Negl Trop

Dis. 2013;7(12).

12. Zeibig EA. Clinical Parasitology - A Practical Approach. 2nd ed. Saunders; 2013.

385 p.

13. Bogitsh BJ, Carter CE, Oeltmann TN. Human Parasitology. 4th ed. Academic Press;

2013. 447 p.

14. Garcia LS. Diagnostic Medical Parasitology. 5th ed. ASM Press; 2007. 1224 p.

15. Waeschenbach A, Brabec J, Scholz T, Littlewood DTJ, Kuchta R. The catholic taste

of broad tapeworms – multiple routes to human infection. Int J Parasitol. 2017;





16. Hernández-Orts JS, Scholz T, Brabec J, Kuzmina T, Kuchta R. High morphological

plasticity and global geographical distribution of the Pacific broad tapeworm

Adenocephalus pacificus (syn. Diphyllobothrium pacificum): Molecular and

morphological survey. Acta Trop. 2015;149:168–78.

17. Kuchta R, Serrano-martínez ME, Scholz T. Pacific Broad Tapeworm

Adenocephalus pacificus as a Causative Agent of Globally Reemerging

Diphyllobothriosis. Emerg Infect Dis. 2015;21(10):1697–703.

18. Jimenez JA, Rodriguez S, Gamboa R, Rodriguez L, Garcia HH. Diphyllobothrium

pacificum Infection is Seldom Associated with Megaloblastic Anemia. Am J Trop

Med Hyg. 2012;87(5):897–901.

19. Muller R. Worms and Human Disease. 2nd ed. Worms an Human Disease. CABI

Publishing; 2002. 310 p.

20. Dick TA, Nelson PA, Choudhury A. Diphyllobothriasis: Update on human cases,

foci, patterns and sources of human infections and future considerations. Southeast

Asian J Trop Med Public Health. 2001;32(SUPPL. 2):59–76.

21. Chai JY, Murrell KD, Lymbery AJ. Fish-borne parasitic zoonoses: Status and issues.

Int J Parasitol. 2005;35:1233–54.

22. Dupouy-Camet J, Peduzzi R. Current situation of human diphyllobothriasis in

Europe. Eurosurveillance. 2004;9(5).

23. Kuchta R, Esteban JG, Brabec J, Scholz T. Misidentification of Diphyllobothrium

species related to global fish trade, Europe. Emerg Infect Dis. 2014;20(11):1955–7.

24. de Marval F, Gottstein B, Weber M, Wicht B. Imported diphyllobothriasis in

Switzerland: Molecular methods to define a clinical case of Diphyllobothrium

infection as Diphyllobothrium dendriticum, August 2010. Eurosurveillance.

2013;18(3).

25. Pastor-Valle J, González LM, Martín-Clemente JP, Merino FJ, Gottstein B, Gárate

T. Molecular diagnosis of diphyllobothriasis in Spain, most presumably acquired via

imported fish, or sojourn abroad. New Microbes New Infect. 2014;2(1):1–6.

26. Santos FLN, De Faro LB. The first confirmed case of Diphyllobothrium latum in

Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100(6):585–6.

27. Sampaio JL, De Andrade V, Lucas MDC, Fung L, Gagliardi SM, Santos SR, et al.

Diphyllobothriasis, Brazil. Emerg Infect Dis. 2005;11(10):1598–600.

28. Jeon HK, Kim KH, Huh S, Chai JY, Min DY, Rim HJ, et al. Morphologic and

genetic identification of Diphyllobothrium nihonkaiense in Korea. Korean J

Parasitol. 2009;47(4):369–75.

29. Craig N. Fish tapeworm and sushi. Can Fam Physician. 2012;58(6):654–8.

30. Gordon CA, McManus DP, Jones MK, Gray DJ, Gobert GN. The Increase of Exotic

Zoonotic Helminth Infections: The Impact of Urbanization, Climate Change and

Globalization [Internet]. Vol. 91, Advances in Parasitology. Elsevier Ltd; 2016.

Available from: http://dx.doi.org/10.1016/bs.apar.2015.12.002

31. Lima dos Santos CAM, Howgate P. Fishborne zoonotic parasites and aquaculture:





A review. Aquaculture. 2011;318:253–61.

32. Johnston MJG, MacDonald JA, McKay DM. Parasitic helminths: a pharmacopeia of

anti-inflammatory molecules. Parasitology. 2009;136:125–47.

33. Anthony RM, Rutitzky LI, Urban Jr JF, Stadecker MJ, Gause WC. Protective

immune mechanisms in helminth infection. Nat Rev Immunol. 2007;7(12):975–87.

34. Maizels RM, Yazdanbakhsh M. Immune Regulation by Helminth Parasites: Cellular

and Molecular Mechanisms. Nat Rev Immunol. 2003;3(September):733–44.

35. Sitjà-Bobadilla A. Living off a fish: A trade-off between parasites and the immune

system. Fish Shellfish Immunol. 2008;25:358–72.

36. Kamal SM, Khalifa KELS. Immune modulation by helminthic infections: worms

and viral infections. Parasite Immunol. 2006;28:483–96.

37. Biserova NM, Kutyrev IA, Malakhov V V. The Tapeworm Diphyllobothrium

dendriticum (Cestoda ) Produces Prostaglandin E2, a Regulator of Host Immunity.

Dokl Biol Sci. 2011;441(1):367–9.

38. Kutyrev IA, Biserova NM, Olennikov DN, Korneva J V, Mazur OE. Prostaglandins

E2 and D2-regulators of host immunity in the model parasite Diphyllobothrium

dendriticum: An immunocytochemical and biochemical study. Mol Biochem

Parasitol. 2017;212:33–45.

39. Biserova NM, Kutyrev I. Localization of Prostaglandin E2 , γ-Aminobutyric Acid,

and Other Potential Immunomodulators in the Plerocercoid Diphyllobothrium

dendriticum (Cestoda). Biol Bull. 2014;41(3):271–80.

40. Kalinski P. Regulation of Immune Responses by Prostaglandin E2. J Immunol.

2012;188(1):21–8.

41. Harris SG, Padilla J, Koumas L, Ray D, Phipps RP. Prostaglandins as modulators of

immunity. TRENDS Immunol. 2002;23(3):144–50.

42. Wicht B, Yanagida T, Scholz T, Ito A, Jiménez JA, Brabec J. Multiplex PCR for

Differential Identification of Broad Tapeworms (Cestoda: Diphyllobothrium)

Infecting Humans. J Clin Microbiol. 2010;48(9):3111–6.

43. Thanchomnang T, Tantrawatpan C, Intapan PM, Sanpool O, Lulitanond V, Tourtip

S, et al. Rapid identification of nine species of diphyllobothriidean tapeworms by

pyrosequencing. Sci Rep [Internet]. 2016;6(37228):1–8. Available from:

http://dx.doi.org/10.1038/srep37228

44. Leštinová K, Soldánová M, Scholz T, Kuchta R. Eggs as a Suitable Tool for Species

Diagnosis of Causative Agents of Human Diphyllobothriosis (Cestoda). PLOS

Neglected Trop Dis. 2016;10(5).

45. Choi H, Lee J, Yang H. Four Human Cases of Diphyllobothrium latum Infection.

Korean J Parasitol. 2012;50(2):143–6.

46. Yamasaki H, Kumazawa H, Sekikawa Y, Oda R, Hongo I, Tsuchida T, et al. First

confirmed human case of Diphyllobothrium stemmacephalum infection and

molecular verification of the synonymy of Diphyllobothrium yonagoense with D.

stemmacephalum (Cestoda: Diphyllobothriidea). Parasitol Int. 2016;65:412–21.





47. Guo A-J, Liu K, Gong W, Luo X-N, Yan H-B, Zhao S-B, et al. Molecular

identification of Diphyllobothrium latum and a brief review of diphyllobothriosis in

China. Acta Parasitol [Internet]. 2012;57(3):293–6. Available from:

http://www.degruyter.com/view/j/ap.2012.57.issue-3/s11686-012-0036-3/s11686-

012-0036-3.xml

48. Park J-K, Kim K-H, Kang S, Jeon HK, Kim J-H, Littlewood DTJ, et al.

Characterization of the mitochondrial genome of Diphyllobothrium latum (Cestoda:

Pseudophyllidea) - implications for the phylogeny of eucestodes. Parasitology.

2007;134:749–59.

49. Kim K-H, Jeon H-K, Kang S, Sultana T, Kim GJ, Eom K, et al. Characterization of

the Complete Mitochondrial Genome of Diphyllobothrium nihonkaiense

(Diphyllobothriidae: Cestoda), and Development of Molecular Markers for

Differentiating Fish Tapeworms. Mol Cells. 2007;23(3):379–90.

50. McCarth J, Loukas A, Hotez PJ. Chemotherapy of Helminth Infections. In:

Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics. 12th ed.

McGraw-Hill Companies, Inc; 2011. p. 1443–61.

51. Ohnishi K, Kato Y. Single Low-Dose Treatment with Praziquantel for

Diphyllobothrium nihonkaiense Infections. Intern Med. 2003;42(1):41–3.

52. INFARMED - Autoridade Nacional do Medicamento e Produto de Saúde IP /

Ministério da Saúde. Prontuário Terapêutico - 11. 2012.

53. CDC - Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Diphyllobothrium

Infection. Resources for Health Professionals [Internet]. [cited 2017 Sep 20].

Available from:

https://www.cdc.gov/parasites/diphyllobothrium/health_professionals/index.html

54. The Medical Letter. Drugs for Parasitic Infections. Treatment Guidelines from The

Medical Letter. 2013;11:1–31.

55. Groll E. Praziquantel for cestode infections in man. Acta Trop. 1980;37:293–6.

56. Bylund G, Bang B, Wikgren K. Tests with a new compound (Praziquantel) against

Diphyllobothrium latum. J Helminthol. 1977;51:115–9.

57. Lee SH, Park H, Yu ST. Diphyllobothrium latum infection in a child with recurrent

abdominal pain. Korean J Pediatr. 2015;58(11):451–3.

58. Lee E Bin, Song JH, Park NS, Kang BK, Lee HS, Han YJ, et al. A case of

Diphyllobothrium latum infection with a brief review of diphyllobothriasis in the

Republic of. Korean J Parasitol. 2007;45(3):219–23.

59. U.S. Food & Drug Administration (FDA). Fish and Fishery Products Hazards and

Controls Guidance. 2011.

60. Fang FC, Billman ZP, Wallis CK, Abbott AN, Olson JC, Dhanireddy S, et al. Human

Diphyllobothrium nihonkaiense Infection in Washington State. J Clin Microbiol.

2015;53(4):1355–7.

61. Song S-M, Yang H-W, Jung MK, Heo J, Cho CM, Goo Y-K, et al. Two Human

Cases of Diphyllobothrium nihonkaiense Infection in Korea. Korean J Parasitol.

2014;52(2):197–9.

Parte IV


VIII MAC Conclusões e Perspetivas Futuras


Conclusões e Perspetivas Futuras

A realização deste estágio laboratorial foi fundamental para a aquisição de

competências práticas e para a consolidação dos conhecimentos teóricos adquiridos ao

longo do Mestrado em Análises Clínicas.

A oportunidade de realizar o estágio no SPC de um grande Centro Hospitalar como

o CHLO, onde é recebido um elevado número de amostras e onde são realizadas diversas

análises e efetuadas diferentes técnicas, permitiu-me adquirir uma visão global da rotina

diária de um laboratório de análises clínicas, num contexto real de trabalho. Durante o

estágio tive a possibilidade de acompanhar e participar em todas as fases do processo

analítico, desde a receção e preparação das amostras, manuseamento dos vários

equipamentos automáticos e realização de diferentes técnicas manuais, até à validação final

dos resultados.

Desta forma, esta foi uma experiência muito enriquecedora tanto a nível profissional

como pessoal, uma vez que permitiu a integração no meio profissional e possibilitou o

desenvolvimento de competências como o trabalho em equipa, a autonomia na execução

de tarefas e na resolução de problemas, e o desenvolvimento de sentido crítico na análise

dos resultados.

Assim, considero que os objetivos propostos para este estágio foram atingidos,

sendo que a experiência e conhecimentos adquiridos ao longo destes meses serão

fundamentais para o futuro profissional que pretendo efetuar na área das Análises Clínicas.

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Universidade de Lisboa Faculdade de Farmáciarepositorio.ul.pt/bitstream/10451/33917/1/TM_Ana_Filipa... · 2018. 7. 31. · Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (CHLO), sendo que