Universidade de Lisboa Faculdade de Farmácia · TGL - Triglicéridos TIBC - Capacidade Total de Ligação do Ferro TnT - Troponina T TRH - Hormona Libertadora de Tireotrofina TSA

Universidade de Lisboa

Faculdade de Farmácia

O impacto da antibioterapia no tratamento de bactérias produtoras de

carbapenemases

Rita Emanuela Fernandes Gralha

Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Maria Aida da

Costa e Silva da Conceição Duarte e coorientada pela Doutora Fátima

Maria Madureira Vale

Mestrado em Análises Clínicas

2019

O impacto da antibioterapia no tratamento de bactérias produtoras de carbapenemases

2




carbapenemases


Relatório de estágio orientado pela Professora Doutora Maria Aida da

Costa e Silva da Conceição Duarte e coorientada pela Doutora Fátima

Maria Madureira Vale


2019


3

Resumo

O presente relatório refere-se ao estágio decorrido entre Novembro de 2018 e Maio de

2019 no Serviço de Patologia Clínica do Hospital Sousa Martins da Unidade Local de

Saúde da Guarda, no âmbito do curso de Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade

de Farmácia da Universidade de Lisboa.

O Serviço de Patologia Clínica desta Unidade Local de Saúde é um serviço constituído

por 6 unidades laboratoriais, Microbiologia, Micobacteriologia, Bioquímica,

Hematologia, Biologia Molecular e Imunologia, que prima pela competência técnica e

pela qualidade dos resultados.

Apesar das inúmeras áreas que compõem um laboratório de análises clínicas, este

relatório visa uma abordagem mais profunda sobre as áreas de Microbiologia,

Micobacteriologia e Bioquímica Clínica.

Na área de Microbiologia e Micobacteriologia tive a oportunidade de realizar técnicas

que permitiam isolar os microrganismos, tornando-os viáveis, e posteriormente semeá-

los em meios de cultura que permitam o crescimento desse mesmo agente patogénico.

Observei vários exames microscópicos diretos que permitem de forma rápida, através

das características morfológicas dos microrganismos, fazer um diagnóstico presuntivo

que pode ser dado ao clínico como provisório até ser obtido um diagnóstico final.

Na área da Bioquímica Clínica tive a oportunidade de proceder à determinação de

vários parâmetros químicos, em amostras de plasma, soro, urina e outros produtos

biológicos, com recurso a aparelhos automatizados e à realização de técnicas manuais.

Durante o presente estágio também foram observadas as fases pré e pós-analítica através

da assistência de colheitas de amostras biológicas e através da visualização, validação e

interpretação de boletins de resultados.

O relatório tem como objetivo descrever a organização e funcionamento, como as

tecnologias e metodologias analíticas aplicadas, evidenciando a utilidade de cada

parâmetro no diagnóstico clínico e monitorização da doença. Além disso, a necessidade

de trabalhar segundo um Sistema de Gestão de Qualidade (SGQ) interno e externo é um

fator diferenciador de um serviço de excelência e como forma de garantia de qualidade

analítica.

Palavras-chave: Microbiologia, Micobacteriologia, Bioquímica Clínica, Parâmetros

Bioquímicos, Microrganismos.


4

Abstract

This report refers to the internship that took place between November 2018 and May

2019 at the Clinical Pathology Service of Hospital Sousa Martins - ULS Guarda, within

the Master's degree course in Clinical Analysis, Faculty of Pharmacy, University of

Lisbon.

The Clinical Pathology Service of this Local Health Unit is a service consisting of 6

laboratory units, Microbiology, Mycobacteriology, Biochemistry, Hematology,

Molecular Biology and Immunology, that strives for technical competence and quality

of results. Despite the numerous areas that make up a clinical analysis laboratory, this

report aims at a deeper approach to the areas of Microbiology, Mycobacteriology, and

Clinical Biochemistry.

In the area of Microbiology and Mycobacteriology I had the opportunity to perform

techniques that allowed the isolation of microorganisms, making them viable, and

subsequently sowing them in culture media that allow the growth of the same pathogen.

I have observed several direct microscopic examinations that allow quickly, through the

morphological characteristics of microorganisms, to make a presumptive diagnosis that

can be given to the clinician as provisional until a final diagnosis is obtained.

In the area of Clinical Biochemistry I had the opportunity to determine various chemical

parameters in samples of plasma, serum, urine and other biological products, using

automated devices and performing manual techniques.

During the present stage, the pre and post-analytical phases were also observed through

the assistance of biological sample collections and through the visualization, validation

and interpretation of results bulletins.

The report aims to describe the organization and operation, as the applied technologies

and analytical methodologies, highlighting the usefulness of each parameter in the

clinical diagnosis and monitoring of the disease. In addition, the need to work according

to an internal and external Quality Management System is a differentiating factor of a

service of excellence and as a form of analytical quality assurance.

Keywords: Microbiology, Mycobacteriology, Clinical Biochemistry, Biochemical

Parameters, Microorganisms.


5

Lista de abreviaturas

ADA - Adenosina Desaminase

ALP - Fosfatase Alcalina

ALT - Alanina Aminotransferase

AST - Aspartato Aminotransferase

AVC - Acidente Vascular Cerebal

BAAR - Bacilos álcool-ácido resistentes

BNP - Peptídeo Natriurético

CA 125 - Antigénio 125 do Cancro

CA 15.3 - Antigénio 15.3 do Cancro

CA 19.99 - Antigénio Carbohidrato

CAM - Gelose Campylosel

CAN - Gelose de Candida

CEA - Antigénio Carcinoembrionário

CK - Creatinina - quinase

CK-MB - Creatinina-quinase - MB

CLED - Gelose Cystine Lactose Electrolyte Deficient

CMI - Concentração mínimas inibitórias

CUMITECH - Cumulative Techniques and Procedures Clinical Microbiology

DCO - Gelose D-coccosel

DHEA-S - Sulfato de Dehidroepiandrosterona

EAM - Enfarte agudo do miocárdio

EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELFA - Enzime Linked Fluorescent Assay

EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

FSH - Hormona Folículo-estimulante Humana

GAR - Gelose Gardnerella

GC - Gelose de Chocolate

GRAN - Gelose Granada

GS - Gelose de Sangue

HbA1c - Hemoglobina Glicada A1c

HDL-C - High Density Lipoprotein Cholesterol

IDL-C - Intermediate Density Lipoprotein Cholesterol

IgA - Imonoglobulina A

IgG - Imonoglobulina G

IgM - Imonoglobulina M

ISEs - Tecnologia de Elétrodos para Iões Específicos

LCR - Líquido cefalorraquidiano

LDH - Lactato Desidrogenase

LDL-C - Low Density Lipoprotein Cholesterol

LH - Hormona Luteinizante

MCK - Gelose MacConkey

MRSA - Gelose Staphylococccus aureus resistentes à meticilina

MSA - Gelose Manitol Salgado

PCP - Fenciclidina

PCR - Proteína C-reativa

PCT - Procalcitonina


6

PSA Total - Antigénio Total Específico da Próstata

PTGO - Prova de Tolerância à Glicose Oral

PTH - Hormona Paratiroideia

SACE - Enzima Conversora da Angiotensina

SGA - Streptococcus do grupo A

SGQ - Sistema de Gestão de Qualidade

SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Aquirida

SPC - Serviço de Patologia Clínica

T3 - Triodotironina

T4- Tiroxina

TFG - Taxa de Filtração Glomerular

TG -Tiroglobulina

TGL - Triglicéridos

TIBC - Capacidade Total de Ligação do Ferro

TnT - Troponina T

TRH - Hormona Libertadora de Tireotrofina

TSA - Teste de suscetibilidade antimicrobiana

TSH - Hormona Estimuladora da Tiroide

T3 – triodotironina

T4- tiroxina

UFC - Unidades formadoras de colónias

ULS - Unidade Local de Saúde

USF - Unidade de Saúde Familiar

VDRL - Venereal disease research laboratory

VLDL-C - Very Low Density Lipoprotein Cholesterol

XLD - Gelose Xilose-Lisina-Desoxicolato de sódio

YER - Yersinia agar

β-HCG - Gonadotropina Coriónica Humana

γGT - Gama-glutamil Transferase


7

Índice

Resumo .......................................................................................................................................... 3

Abstract ......................................................................................................................................... 4

Lista de abreviaturas ..................................................................................................................... 5

Lista de Figuras ............................................................................................................................. 9

Lista de Tabelas ........................................................................................................................... 10

1.Introdução ................................................................................................................................ 11

2. Microbiologia .......................................................................................................................... 12

2.1 Fase pré-analítica .................................................................................................................. 12

2.1.1 Colheitas de amostras biológicas ....................................................................................... 12

2.2 Equipamentos ........................................................................................................................ 13

2.3 Fase analítica - Métodos de diagnóstico................................................................................ 14

2.3.1 Técnicas de coloração ........................................................................................................ 15

2.3.2 Meios de Cultura ................................................................................................................ 15

2.3.3 Testes de identificação presuntiva ...................................................................................... 19

2.3.4 Identificação bacteriana e teste de suscetibilidade antimicrobiana (TSA) ......................... 21

2.4 Produtos biológicos ............................................................................................................... 24

2.4.1 Urina ................................................................................................................................... 24

2.4.2 Fezes ................................................................................................................................... 25

2.4.3 Exsudado vaginal e uretral ................................................................................................. 27

2.4.4 Líquido cefalorraquidiano (LCR) ....................................................................................... 28

2.4.5 Outros líquidos ................................................................................................................... 29

2.4.6 Hemoculturas ..................................................................................................................... 30

2.4.7 Produtos respiratórios ......................................................................................................... 31

2.4.8 Amostras de feridas, pus e tecidos ..................................................................................... 33

3. Micobacteriologia ................................................................................................................... 34

4. Bioquímica .............................................................................................................................. 36

4.1 Fase pré-analítica .................................................................................................................. 36

4.1.1 O paciente ........................................................................................................................... 36

4.1.2 A amostra ........................................................................................................................... 36

4.1.3 Receção e preparação de amostras ..................................................................................... 38

4.1.4. Sistema de triagem ............................................................................................................ 38

4.2- Fase analítica ........................................................................................................................ 39


8

4.2.1 Equipamentos ..................................................................................................................... 39

4.3 Parâmetros bioquímicos ........................................................................................................ 42

4.3.1 Ionograma .......................................................................................................................... 42

4.3.2 Perfil lipídico ...................................................................................................................... 43

4.3.3 Perfil pancreático................................................................................................................ 46

4.3.4 Perfil hepático .................................................................................................................... 48

4.3.5 Perfil renal .......................................................................................................................... 50

4.3.6 Perfil endócrino .................................................................................................................. 52

4.3.7 Metabolismo do ferro ......................................................................................................... 55

4.3.8 Proteínas séricas ................................................................................................................. 56

4.3.9 Marcadores cardíacos ......................................................................................................... 58

4.3.10 Marcadores tumorais ........................................................................................................ 59

4.3.11. Monitorização de drogas terapêuticas ............................................................................. 60

4.3.12. Controlo de drogas de abuso ........................................................................................... 61

4.3.13 Outros analitos sanguíneos ............................................................................................... 62

4.3.14 Análise de Urinas ............................................................................................................. 63

4.4 Fase Pós-analítica .................................................................................................................. 64

5. Controlo de Qualidade ............................................................................................................ 65

5.1 Controlo de Qualidade Interno .............................................................................................. 65

5.2 Controlo de Qualidade Externo ............................................................................................. 67

6- Conclusão ................................................................................................................................ 68

7. Bibliografia ............................................................................................................................. 69


9

Lista de Figuras

Figura 1 - Flora comensal do corpo humano. Fonte: Barroso, H. et al, 2014. ............... 14

Figura 2 - Sistema automático de identificação bacteriana - Vitek® 2 Compact e carta

de identificação. Fonte: SPC da ULS da Guarda............................................................ 22

Figura 3 - Esfregaço de uma cultura positiva para BAAR. Fonte: SPC da ULS da

Guarda. ........................................................................................................................... 35

Figura 4 - Diagrama do fluxo de trabalho do Aceleratorp540. Fonte: SPC da ULS da

Guarda. ........................................................................................................................... 38


10

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Meios de Cultura sólidos utilizados no SPC da ULS da Guarda. ................. 17

Tabela 2 - Meios de cultura Líquidos utilizados no SPC da ULS da Guarda. ............... 19

Tabela 3 - Testes de identificação presuntiva de microrganismos. ................................ 20

Tabela 4 - Tabela de Murray e Washington. Fonte: Procedimento dos produtos

respiratórios do SPC da ULS da Guarda. ....................................................................... 32

Tabela 5 - Equipamentos utilizados na fase analítica do setor da Bioquímica Clínica. . 41

Tabela 6- Ionograma ....................................................................................................... 42

Tabela 7 - Perfil Lipídico................................................................................................ 45

Tabela 8- Perfil Pancreático ........................................................................................... 47

Tabela 9- Perfil Hepático ................................................................................................ 49

Tabela 10 - Perfil renal ................................................................................................... 51

Tabela 11 - Perfil endócrino ........................................................................................... 53

Tabela 12 - Descrição das Regras de Westgard. Fonte: SPC da ULS da Guarda. ......... 66


11

1.Introdução

“(...) o Laboratório é o verdadeiro santuário da ciência médica; é apenas lá que o médico

procura explicações para a vida, no seu estado normal e patológico...”

Claude Bernard (1895)

Nos últimos anos cada vez mais é fundamental a contribuição dos laboratórios de

análises clínicas para uma eficaz monitorização, um rápido diagnóstico e um correto

prognóstico da doença. Para se conseguirem atingir níveis máximos de confiança, a

inovação, a qualidade e o rigor, têm que fazer parte do dia a dia num laboratório de

análises clínicas.

Apostar no diagnóstico precoce da doença é uma opção que traz numerosos benefícios,

não só, na melhoria da qualidade de vida dos utentes, mas também dos ganhos na

Saúde. Como tal, é importante a sensibilização da população no recurso às análises

clínicas como meio de diagnóstico precoce.

A Unidade Local de Saúde (ULS) da Guarda presta cuidados de saúde primários,

diferenciados e continuados. Esta unidade é formada por dois hospitais, o Hospital

Sousa Martins (localizado na Guarda) e o Hospital Nossa Senhora da Assunção

(localizado em Seia). O Serviço de Patologia Clínica (SPC), onde decorreu o presente

estágio, dirigido pela Drª Fátima Maria Madureira Vale, é um serviço de suporte à

prestação de cuidados numa vertente de apoio clínico e técnico, e está localizado no

Hospital Sousa Martins na Guarda, funcionando como laboratório central da ULS da

Guarda. Chegam a este laboratório, amostras dos dois hospitais, dos centros de saúde de

Almeida, de Celorico da Beira, de Figueira de Castelo Rodrigo, de Fornos de Algodres,

de Gouveia, da Guarda, de Manteigas, de Pinhel, da Meda, do Sabugal, de Seia, de

Trancoso e de Vila Nova de Foz Côa, da Unidade de Saúde Familiar da Ribeirinha

(USF) e do Centro de Diagnóstico Pneumológico da Guarda (1).

O Serviço de Patologia Clínica engloba 6 unidades laboratoriais: Laboratório de

Hematologia, Laboratório de Bioquímica, Laboratório de Biologia Molecular,

Laboratório de Imunologia, Laboratório de Microbiologia e Laboratório de

Micobacteriologia.


12

2. Microbiologia

A Microbiologia é a ciência que estuda os seres vivos de dimensões microscópicas, para

além de outros que podem ser vistos a olho nu, que têm durante a sua evolução ovos ou

formas larvares microscópicas. O seu nome deriva de três vocábulos gregos: mikros

(pequeno), bios (vida) e logos (ciência). Os microrganismos estão divididos em quatro

grupos: bactérias, vírus, fungos e parasitas.

O laboratório de microbiologia desempenha um papel de extrema importância no

diagnóstico e no controle das doenças infeciosas. As amostras biológicas quando

chegam ao laboratório são triadas e classificadas em função do nível de risco que lhe

está associado, são processadas de acordo com os procedimentos devidamente descritos

em protocolos, recorrendo, sempre que estiver indicado, à utilização das câmaras de

segurança biológica (câmara de fluxo laminar MSC-Advantage™). O laboratório

executa a análise de diversos produtos biológicos sendo os mais frequentes: urinas

assépticas, sangue, produtos respiratórios, fezes e exsudados vaginais.

2.1 Fase pré-analítica

A fase pré-analítica é considerada a fase mais importante dos laboratórios de análises

clínicas. Esta fase corresponde ao período entre a requisição do exame pelo clínico até à

realização do exame laboratorial (fase analítica).

Muitos das amostras que chegam ao laboratório de microbiologia requerem o

isolamento de microrganismos viáveis, o que significa que a amostra deve ser colhida,

entregue rapidamente ao laboratório num sistema de transporte adequado e semeada em

meios de cultura que permitam o crescimento desse mesmo agente patogénico. Por

outro lado, devem ser tomadas medidas que mantenham a amostra livre de

contaminação por microrganismos clinicamente insignificantes que estão presentes no

ambiente ou fazem parte da flora normal do paciente.

2.1.1 Colheitas de amostras biológicas

Ao SPC da ULS da Guarda chegam amostras biológicas dos dois hospitais, dos centros

de saúde, da Unidade de Saúde Familiar e do Centro de Diagnóstico Pneumológico

Guarda. Existem uma grande variedade de amostras biológicas que podem ser

analisadas.

Após a colheita as amostras biológicas são enviadas para o laboratório e procede-se à

triagem. Na triagem efetua-se a receção, verificação, processamento e manipulação

primária das amostras biológicas, bem como a avaliação das condições das mesmas. Os

critérios de rejeição das amostras são estabelecidos de acordo com os requisitos

definidos no Manual de Colheitas do SPC.

Quando as amostras dão entrada no SPC é colocado uma etiqueta com um código de

barras para a sua identificação, de forma a minimizar a possibilidade de trocas de

produtos biológicos. É efetuado um controlo dos dados do utente, o número de análises


13

que têm de ser efetuadas e após verificação da integridade da amostra, são

encaminhadas para as diferentes secções de análise de forma a dar início à fase

analítica. As amostras categorizadas como “urgentes” são sempre analisadas com

prioridade.

2.2 Equipamentos

Existem na secção de Microbiologia os seguintes equipamentos:

✓ BACTEC 9000MB da Becton Dickinson - sistema de deteção automatizada de

incubação, agitação e monitorização de hemoculturas que deteta a existência de

microrganismos na amostra testada pela produção de CO2, uma vez que os

microrganismos metabolizam os substratos existentes no meio de cultura. Se o nível

de CO2 não se altera significativamente após cinco dias, a amostra é considerada

negativa;

✓ VITEK® 2 Compact da Biomerieux® - sistema automatizado de identificação

de bactérias e de leveduras e testes de suscetibilidade aos antimicrobianos. A

identificação e os antibiogramas são executadas através da monitorização

contínua do crescimento e da atividade dos microrganismos no interior das

cartas (GN, GP, ANC, YST e NH);

✓ Aerospray® Gram e Aerospray® TB - aparelhos de corar lâminas, utilizados na

coloração de Gram e auramina, respectivamente.


14

2.3 Fase analítica - Métodos de diagnóstico

O diagnóstico microbiológico é o conjunto de procedimentos e técnicas complementares

utilizados para identificar o agente responsável por uma doença infeciosa.

Como todos os animais, o Homem suporta uma flora comensal microbiana muito

extensa. A maioria destes microrganismos são bactérias e coloniza a pele, as mucosas e

o aparelho respiratório, intestinal, reprodutor e urinário (Figura 1) (2).

A maioria dos microrganismos que constitui a flora comensal do corpo humano pode

ser causadora de doença, originado as chamadas infeções oportunistas. É exemplo disso

se um doente estiver imunodeprimido, se tiver sido submetido a terapêutica

antibacteriana, se tiver sofrido algum trauma acidental ou cirúrgico e no caso de

infeções nosocomiais (infeções associadas aos cuidados de saúde).

Na análise dos produtos biológicos que chegam ao laboratório é muito importante o

conhecimento da flora comensal, para que não sejam obtidos falsos positivos e para que

os verdadeiros agentes patogénicos possam ser identificados.

Figura 1 - Flora comensal do corpo humano. Fonte: Barroso, H. et al, 2014.


15

2.3.1 Técnicas de coloração

O exame microscópico das preparações coradas permite avaliar as características

morfológicas dos microrganismos (por exemplo a forma, o tamanho, o arranjo celular e

a afinidade para os corantes) e fazer um diagnóstico presuntivo que pode ser dado ao

clínico como provisório até ser obtido um diagnóstico final.

No Laboratório de Microbiologia as colorações mais utilizadas são:

✓ A Coloração de Gram, esta técnica cora diferencialmente as bactérias, algumas

coram de roxo – bactérias Gram positivo – e outras coram de vermelho –

bactérias Gram negativo. Esta coloração reflete a diferente constituição química

da parede celular bacteriana, nas bactérias Gram positivo e Gram negativo;

✓ A Coloração de Ziehl-Neelsen no caso das micobactérias. As bactérias dos

géneros Mycobacterium e Nocardia têm uma parede celular especial contendo

ácidos micólicos, o que não coram pela técnica de Gram, porque a parede é

impenetrável. Estas bactérias requerem coloração enérgica com fucsina

fenolada de Ziehl a quente e a descoloração do esfregaço faz-se com soluto de

Ebner (álcool – ácido clorídrico). As bactérias do género Mycobacterium

resistem a esta descoloração, por isso são designadas por bacilos álcool-ácido

resistentes (BAAR);

✓ A coloração de Leishman permite avaliar a qualidade das amostras (por exemplo

nos produtos respiratórios), a visualização de células epiteliais, leucócitos e

ainda alguns parasitas.

2.3.2 Meios de Cultura

As bactérias e os fungos são capazes de crescer in vitro em meios de cultura contendo

essencialmente fontes de carbono, azoto, fósforo e água.

Existem três tipos de meios:

✓ Meio de cultura enriquecido: meio suplementado com nutrientes que permite o

crescimento de microrganismos mais fastidiosos, para além dos pouco exigentes

(exemplo: gelose sangue e gelose chocolate);

✓ Meio seletivo: meio que contém substâncias que inibem o crescimento de

algumas bactérias, tornando possível o crescimento de outros grupos bacterianos

(exemplo: Manitol salt agar (MSA) e MacConkey agar (MCK));


16

✓ Meio diferencial: meio que permite a visualização das atividades metabólicas

das bactérias (exemplo: as fermentadoras e as não fermentadoras da lactose no

meio de CLED agar).

Os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos e semi-sólidos. Os meios líquidos são

usados para o enriquecimento de produtos biológicos de baixo inóculo. Os meios

sólidos tornam possível a sementeira de produtos biológicos complexos e isolar as

colónias dos microrganismos existentes. Com este isolamento torna-se possível

identificar os microrganismos de acordo com as suas características morfológicas e

bioquímicas. Os meios semi-sólidos são usados em estudos de mobilidade bacteriana.

Os meios utilizados dependem do tipo da amostra e do tipo de microrganismo

classicamente associado à patogénese/doença da nossa amostra. Na maior parte das

amostras são utilizados meios de enriquecimento para que haja um crescimento

generalizado de todos os microrganismos presentes. Estes meios são observados após 24

horas de incubação sob condições específicas de temperatura, O2 e CO2, e é feita uma

análise macroscópica das colónias que cresceram, ou seja, é avaliado essencialmente o

predomínio, a cor e morfologia das colónias e a presença ou não de hemólise. A

interpretação é feita tendo em conta o tipo de produto, o que pode ser patogénico e o

que é flora comensal. De seguida é feita ou não (caso seja necessário) a repicagem da(s)

bactéria(s) com significado clínico para meios seletivos e/ou diferenciais de maneira a

obter-se colónias isoladas para que possa ser feita a identificação e os testes de

sensibilidade aos antimicrobianos.

A tabela 1 e 2 mostra os principais meios de cultura utilizados para a análise de diversos

produtos biológicos com a respetiva composição e características.


17

Tabela 1 - Meios de Cultura sólidos utilizados no SPC da ULS da Guarda.

Meios de Cultura Sólidos Composição e Características

Gelose de sangue

(GS)

- Meio não seletivo;

- Permite o isolamento de microrganismos fastidiosos e não

fastidiosos;

- Possui sangue de carneiro que permite a expressão de hemólise

(α, β ou γ), devido à presença do fator X.

Gelose de

Chocolate

(GC)

- Meio não seletivo;

- Permite o isolamento de bactérias fastidiosas, como Neisseria

spp., Haemophilus spp. e Streptococcus pneumoniae;

- Composto por uma base nutritiva enriquecida em fatores X

(hemina) e V (NAD) provenientes da hemoglobina;

- Para crescimento de microrganismos fastidiosos, este meio

deve ser incubado numa estufa de atmosfera enriquecida em

CO2.

Cystine Lactose

Electrolyte

Deficient

(CLED)

- Meio diferencial e não seletivo;

- Utilizado no isolamento de microrganismos presentes na urina;

- Permite a diferenciação entre microrganismos fermentadores

da lactose (colónias amarelas), dos microrganismos não

fermentadores (colónias azuis, verdes ou incolores);

- Limita a invasão (“swarming”) pelo Proteus spp. pela sua

deficiência em eletrólitos.

Gelose

MacConkey

(MCK)

- Meio seletivo diferencial;

- Permite isolamento de bacilos Gram negativo

(Enterobacterales, Pseudomonas spp., entre outros);

- Os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento da

maioria das bactérias Gram positivo;

- A fermentação da lactose é evidenciada pela viragem do

vermelho neutro (microrganismos fermentadores da lactose

originam colónias rosas ou vermelhas; microrganismos não

fermentadores da lactose originam colónias incolores ou

ligeiramente bege).

Gelose Manitol

Salgado

(MSA)


- Permite o isolamento de Staphylococcus spp. e a identificação

presuntiva de S. aureus.;

- A elevada concentração de cloreto de sódio (NaCl) inibe a

maior parte dos Gram negativo permitindo o isolamento de

Staphylococcus spp.;

- A fermentação do manitol, evidenciada pelo vermelho de

fenol, permite a identificação presuntiva de S. aureus (colónias

amarelas).

Gelose

Staphylococcus

aureus Meticilina

Resistente

(MRSA)

- Meio seletivo diferencial e de identificação (cromogénico);

- Permite o isolamento e identificação de Staphylococcus aureus

resistente à meticilina, na presença de cefoxitina.

Gelose D-cocosel

(DCO)

(Bílis Esculina Agar)

- Meio seletivo e diferencial;

- Permite o isolamento de Enterococcus a partir de colheitas

polimicrobianas;

- A hidrólise da esculina dos Enterococcus provoca o

aparecimento de um halo negro à volta das colónias;

- A seletividade do meio em relação às bactérias Gram negativas

é assegurada pela azida sódica. A bílis inibe algumas bactérias

Gram positivas, excetuando os Enterococcus.


18

Candida

(CAN)


- Permite o isolamento de leveduras e a identificação da espécie

Candida albicans e a diferenciação presuntiva de um conjunto

de estirpes como a C. tropicalis, C. lusitaniae e C. kefyr;

- A hidrólise específica de um substrato cromogéneo de

hexosaminidase na presença de um indutor da enzima (patente

da bioMerieux) leva à coloração azul das colónias de C.

albicans;

- A mistura de inibidores permite inibir o crescimento da maior

parte das bactérias.

Sabouraud

Cloranfenicol

Gentamicina

(SGC)

- Meio de isolamento de fungos e leveduras;

- Os fungos e as leveduras são nutridos por glucose e a presença

de cloranfenicol e gentamicina inibe o crescimento bacteriano.

Gelose Xilose-

Lisinina-

Desoxicolato de

sódio

(XLD)


- Permite o isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. a

partir de fezes;

- As bactérias que produzem H2S originam colónias com centro

negro;

- A presença de colónias rosas ou vermelhas com ou sem centro

negro (colónias características) representa uma forte presunção

de Salmonella ou de Shigella.

Yersinia agar

(YER)

- Meio de isolamento seletivo e diferencial;

- A presença de manitol e vermelho neutro permite a

diferenciação da Yersinia spp. pela coloração das colónias (rosa

escuro e vermelhas).

Campylosel

(CAM)

- Meio seletivo para o isolamento de Campylobacter spp. a

partir de fezes;

- O meio é enriquecido com sangue de carneiro que facilita o

crescimento destes microrganismos, e possui antibióticos e

antifúngicos que inibem a maior parte dos contaminantes

bacterianos e fúngicos;

- A incubação deste meio de cultura deve ser feita em atmosfera

de microaerofilia

Granada

(GRAN)


- Permite o isolamento de Streptococcus do grupo B, utilizado

para sementeiras de zaragatoas vaginais e retais;

- O crescimento de Streptococcus do grupo B é evidenciado pela

presença de colónias cor de laranja.

Gelose chocolate

VCAT

(VCA)

- Meio seletivo para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e

Neisseria meningitidis em colheitas polimicrobianas;

- A seletividade é obtida por associação de antibióticos e

antifúngicos que permitem inibir a maioria das outras bactérias e

leveduras que não as espécies pesquisadas.

Gardnerella

(GAR)

- Meio seletivo destinado à deteção de Gardnerella vaginalis a

partir de colheitas genitais;

- A presença de sangue humano facilita o crescimento da espécie

procurada e permite a obtenção de uma β-hemólise à volta das

colónias;

- Os antibióticos presentes no meio inibem a maioria dos

microrganismos Gram negativos bem como das leveduras.

Mueller Hinton

e

Mueller Hinton

Sangue

- Meios não seletivo;

- Permitem a realização de antibiogramas de bactérias não

fastidiosas por difusão;

- O meio com sangue de carneiro, é utilizado para o mesmo fim,

mas para bactérias que requerem sangue para o seu crescimento

(Streptococcus spp.).


19

Tabela 2 - Meios de cultura Líquidos utilizados no SPC da ULS da Guarda.

Meios de Cultura Líquidos Composição e Características Caldo Tripticase

Soja

Composto por uma mistura de peptonas o que permite o crescimento da

maioria dos microrganismos não exigentes (bactérias e fungos).

Caldo Coração-cérebro

(BHI)

Composto por uma base nutritiva enriquecida, está especificamente

adaptado ao crescimento dos microrganismos aeróbios exigentes.

Caldo GN

- Utilizado para o enriquecimento seletivo de organismos gram-negativos,

especialmente a Salmonella spp. e Shigella spp.;

- A alta concentração de manitol acima da concentração de dextrose

favorece o crescimento de Salmonella spp. fermentadora de manitol e

Shigella spp. e desfavorece espécies que não fermentam manitol, como

Proteus.

Caldo Todd

Hewitt +

Antibióticos

(TODD H-T)

- É um caldo de enriquecimento seletivo destinado à deteção dos

Streptococcus do grupo B na mulher grávida;

- Os antibióticos presentes no meio (ácido nalidíxico e colistina) inibem a

maioria dos microrganismos Gram negativos;

- Após a etapa de enriquecimento, o caldo Todd-Hewitt + Antibióticos

deve ser repicado em meios destinados à deteção dos Streptococcus.

Hemoculturas

- Meio não seletivo de enriquecimento;

- Permite a multiplicação de bactérias fastidiosas e não fastidiosas, bem

como de fungos leveduriformes, em amostras de sangue.

2.3.3 Testes de identificação presuntiva

Após observação do crescimento dos microrganismos nos meios de cultura são

executados alguns testes de identificação que orientam e/ou ajudam a fazer uma

identificação presuntiva. Esta identificação permite ao profissional de laboratório

decidir qual o próximo passo na identificação do microrganismo e pode ajudar o clínico

a escolher atempadamente uma terapêutica empírica mais adequada.

A tabela 3 apresenta resumidamente uma breve descrição dos principais testes de

identificação de microrganismos realizados no laboratório de microbiologia.


20

Tabela 3 - Testes de identificação presuntiva de microrganismos.

Teste Princípio do Teste

Teste da Catalase

- O peróxido de hidrogénio (H2O2) é decomposto em água (H2O) e O2. É

utilizado principalmente para diferenciar as colónias de Staphylococcus

spp. das de Streptococcus spp. isoladas em cultura pura (cocos Gram

positivos).;

- Catalase positiva: formação e libertação imediata e abundante de bolhas

de gás - O2;

- Catalase negativa: não há formação de bolhas de gás - O2.

Teste da Coagulase

- É utilizado para efetuar a identificação presuntiva dos Staphylococcus

aureus (produtores de coagulase) e diferenciá-los das outras espécies de

Staphylococcus (não produtores de coagulase) a partir de colónias isoladas

em cultura pura;

- Quando uma colónia de S. aureus é suspensa num tubo contendo plasma,

a coagulase liga-se ao fator (“clumping fator”) do soro, e este complexo

converte o fibrinogénio em fibrina. Outra forma de testar a presença de S.

aureus é através de kits comerciais que fazem a deteção simultânea do

“clumping fator”, da proteína A e dos polissacarídeos capsulares do S.

aureus. A vantagem do teste comercial é a sua maior sensibilidade e

rapidez.

Teste da Oxidase

- O teste utiliza o reagente de Kovac (dihidrocloreto de tetrametil-p-

fenilenediamina a 1%) que atua como um aceitador artificial de eletrões da

enzima citocromo oxidase que, em aerobiose, é uma enzima produzida por

todas as Pseudomonas, exceto a P. luteola e a P. oryzihabitans. Quando o

reagente é oxidado forma em cerca de 10 a 15 segundos um composto de

cor púrpura (azul de indofenol ou de Wurster);

- Oxidase positivo: Pseudomonas spp.;

- Oxidase negativo: Enterobacterales;

- As Neisseriaceae são também oxidase positivo.

Teste da Optoquina

- Permite testar a sensibilidade do Streptococcus à optoquina. O teste é

utilizado para efetuar a identificação presuntiva das colónias de S.

pneumoniae isoladas em cultura pura e diferenciá-los dos S. viridans (α-

hemolíticos);

- Um halo de inibição igual ou superior a 15 mm significa uma presença

eventual de S. pneumoniae.

Teste da Urease

- Identificação presuntiva de Salmonella spp. e Shigella spp. (negativa);

- A urease é uma enzima que hidrolisa a ureia com libertação de CO2, H2O

e NH3. A amónia em solução resulta numa alcalização do meio pois forma

carbonato de amónio. Uma solução contendo fenolftaleína a pH <8,1

(incolor) com a adição de amónia fica rosa avermelhada devido a

fenolftaleína mudar de cor a pH> 8,1. Proteus spp. (urease +) funciona

como controlo positivo, Klebsiella spp. (urease + fraco) Escherichia coli

(urease -) funciona como controlo negativo.

Testes de

grupagem para

identificação

de

Streptococcus

spp.

- Agrupar segundo a classificação de Lancefield as diferentes classes

de Streptococcus spp.;

- Classificação de Lancefield baseia-se nas características antigénicas de

um polissacarídeo de composição variável, chamado carbohidrato C,

localizado na parede da célula dos Streptococcus spp.. A composição

variável do carbohidrato C permite agrupar os Streptococcus spp. em

diferentes grupos designados por letras do alfabeto (A, B, C, F, G). Esta

prova baseia-se na pesquisa do carbohidrato C através de uma reação de

aglutinação, pelo que são utilizados reagentes compostos por anticorpos

específicos para cada um dos antigénios.


21

Testes

serológicos

para

classificação

em Grupos de

Salmonellas

De acordo com a espécie de Salmonella spp. em causa, podem ser

identificados diferentes tipos de antigénios, o que permite a sua

classificação em grupos:

- Antigénios somáticos (O) - são compostos por polissacarídeos,

designados por números e classificados como antigénios Major ou Minor;

- Antigénios flagelares (H) - são de natureza proteica, sendo que a cadeia

de aminoácidos é determinada pelos genes H1 e H2 e conferem a presença

e mobilidade dos flagelos;

- Antigénio de superfície (Vi) - só está presente em três serótipos:

Salmonella typhi, S. paratyphi C e S. dublim. Este antigénio permite

mascarar a presença do antigénio O, tornando-o inaglutinável.

Esta prova baseia-se numa reação de aglutinação pelo que são utilizados

reagentes compostos por anticorpos específicos para cada um dos

antigénios. A reação de aglutinação remete para a presença do antigénio

em questão em detrimento dos outros antigénios do mesmo tipo. A

ausência de aglutinação permite inferir a inexistência do antigénio testado.

2.3.4 Identificação bacteriana e teste de suscetibilidade antimicrobiana (TSA)

No SPC a maioria dos microrganismos são identificados e realizados os testes de

suscetibilidade antimicrobiana através do sistema automatizado VITEK® 2 Compact da

Biomerieux®.

Este sistema usa cartas de identificação, que contêm diferentes substratos bioquímicos

que permitem identificar fenotipicamente os diferentes microrganismos e cartas de

antibiogramas, baseados no método das diluições. São utilizadas as seguintes cartas:

✓ GP - Carta de identificação de bactérias Gram positivo;

✓ GN - Carta de identificação de bactérias Gram negativo;

✓ YST - Carta de identificação de leveduras;

✓ NH - Carta de identificação de Campylobacter spp., Neisseria spp.,

Haemophilus spp., entre outros;

✓ ANC - Carta de identificação de bactérias anaeróbicas e corineformes;

✓ N355 - Antibiograma para bacilos Gram negativo aeróbios com significado

clínico (maioria das bactérias isoladas em urinas);

✓ N373 - Antibiograma para bacilos Gram negativo aeróbios com significado

clínico não fermentadores, principalmente Pseudomonas spp. e Acinetobacter

spp;

✓ P648 - Antibiograma direcionado para Staphylococcus spp.;

✓ P586 - Antibiograma direcionado para Enterococcus spp.;

✓ ST03 - Antibiograma direcionado para Streptococcus spp..


22

Para a identificação são usadas colónias isoladas que são transferidas para uma solução

salina estéril, de modo a obter uma suspensão de acordo com a escala de MacFarland

dependendo das especificidades do microrganismo a identificar. A suspensão é colocada

nas cartas de identificação e estas inseridas no VITEK que aspira a suspensão para o

interior dos poços, sela as cartas e procede à sua incubação. De 15 em 15 minutos é feita

a monitorização automática da alteração da cor/turvação em cada um dos poços,

obtendo-se a identificação dos microrganismos ao fim de algumas horas (Figura 2).

Para a realização de testes de suscetibilidade antimicrobiana, recorre-se a métodos

automáticos ou utiliza-se discos ou tiras (E-tests) impregnados de antibiótico ou

métodos de micro-diluição.

O sistema automatizado utilizado neste serviço é o Sistema VITEK® 2 Compact da

Biomerieux®, como referido anteriormente, que usa as cartas de antibiograma

específicas para os diferentes microrganismos. A determinação da sensibilidade aos

antibióticos baseia-se no cálculo da concentração mínimas inibitórias (CMI) de

diferentes antibióticos presentes nas cartas. A partir da suspensão preparada para a

identificação, é preparada uma nova suspensão de concentração variável dependendo do

microrganismo em estudo, que é processada de forma semelhante à da identificação.

Nos poços destas cartas existem diferentes concentrações de antibióticos liofilizados. O

equipamento faz a leitura de 15 em 15 minutos e vai medindo a alteração da turvação

nos diferentes poços que é proporcional ao crescimento bacteriano. Posteriormente são

construídas curvas com os valores da CMI dos diferentes antibióticos. Os resultados,

facultados pelo equipamento, são reportados para cada fármaco, como “sensível”,

“intermédio” ou “resistente”.

Figura 2 - Sistema automático de identificação bacteriana - Vitek® 2 Compact e carta de

identificação. Fonte: SPC da ULS da Guarda.


23

Os resultados são depois analisados pelo equipamento, que reporta o padrão de

sensibilidade e de resistência dos microrganismos em estudo para os diferentes

antibióticos testados.

De seguida, os resultados do equipamento são analisados e os antibióticos são

comunicados ao clínico, tendo em conta o produto, o tipo de infeção e de acordo com as

normas da EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing).

Por vezes no sistema automatizado não é possível detetar a suscetibilidade aos

antimicrobianos porque o antibiótico que se pretende estudar não se encontra nas cartas.

Nestes casos pode-se realizar testes de suscetibilidade recorrendo a discos impregnados

de antibióticos ou a tiras com gradiente de concentração de antibiótico que permitem

determinar a CMI em placa, conhecidos como E-tests.

De acordo com o microrganismo a testar e dependendo das suas características de

crescimento, pode utilizar-se o meio de Muller-Hinton para a maioria dos

microrganismos, a GS para as estirpes de Streptococcus spp. e a GC para estirpes de

crescimento fastidioso, como é o caso dos Haemophilus spp..

O método das diluições baseia-se na rehidratação do antibiótico pela adição de uma

suspensão bacteriana padronizada em cada poço (por exemplo a galeria da colistina).

Após incubação durante 18-24 horas a 35-37ºC, o resultado pode ser lido visualmente e

interpretado. Um poço turvo denota crescimento bacteriano, um poço límpido significa

ausência de crescimento. A CMI é a concentração mais baixa de um antibiótico onde

não se deteta crescimento bacteriano.

Os diferentes métodos também são utilizados para confirmar alguns mecanismos de

resistência, por exemplo, produção de β-lactamases de espectro alargado, β-lactamases

AmpC, metalo-β-lactamases e carbapenemases.


24

2.4 Produtos biológicos

Os diferentes produtos biológicos quando chegam ao laboratório são processados

segundo procedimentos devidamente escritos, baseados na patogenia da infeção e o

local anatómico. Neste capítulo, para cada produto biológico, são abordados alguns

aspetos importantes relacionados com a colheita, o exame direto, o exame cultural e o

teste de suscetibilidade aos antimicrobianos.

2.4.1 Urina

A infeção urinária é geralmente causada por bactérias da flora intestinal comensal, que

entra no aparelho urinário por via ascendente através da uretra. Os agentes etiológicos

mais frequentes são as Enterobacterales, essencialmente a Escherichia coli, Proteus

spp. e Klebsiella spp. No entanto podem ser encontrados outros microrganismos, como

Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Staphylococcus aureus,

Staphylococcus coagulase negativos e fungos leveduriformes (por exemplo Candida

albicans).

Após desinfeção local, as amostras de urina podem ser obtidas por micção (jato médio),

saco de colheita (por exemplo em crianças que usam fralda), punção supra-púbica ou de

algália.

Quando chega ao laboratório é feita a observação do sedimento, de modo a avaliar a

existência de resposta inflamatória, como a presença de leucócitos, eritrócitos, e ainda

procurar a presença de bactérias, leveduras e células epiteliais escamosas. De seguida é

feito o Gram direto da amostra e semeada em meio de CLED com uma ansa calibrada

de 10 μL para permitir a análise quantitativa das colónias. O meio é incubado em

atmosfera de aerobiose a 35º C, durante 18 a 24 horas.

Na interpretação dos resultados são valorizadas todas as culturas com número de

unidades formadoras de colónias (UFC) ≥ 105 /mL e todas as culturas com número de

colónias entre 104 a 105 UFC/mL de uma ou duas espécies bacterianas. Se a urocultura

não estiver pura procedemos à repicagem das colónias ou sementeira para diferentes

meios, como MSA, DCO e MCK. De seguida, depois de se obter culturas puras ou se

no CLED já estiver pura, procede-se à preparação da suspensão para identificação e

determinação de teste de suscetibilidade aos antimicrobianos no VITEK.

Não são valorizadas culturas com crescimento de 3 espécies de microrganismos ou

mais, reportar como cultura polimicrobiana e recomenda-se repetição de colheira

asséptica.

Na urina podem ser realizados testes rápidos para a pesquisa de antigénios de

Legionella pneumophila Sg1 e Streptococcus pneumoniae que se baseiam em ensaios

imunocromatográficos e que visam a deteção rápida e qualitativa de antigénios solúveis

específicos na urina.


25

2.4.2 Fezes

As fezes são um produto biológico que têm uma flora comensal mista muito abundante.

Uma grande variedade de bactérias pode causar infeções gastrointestinais, como

Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Yersinia spp., Escherichia coli

enterohemorrágica, Clostridium spp. e Staphylococcus aureus. Para que estas bactérias

sejam isoladas deve ser recolhida uma amostra de fezes diarreicas ou fezes moldadas.

Quando as fezes chegam ao laboratório são semeadas nos seguintes meios de cultura:

✓ Meio XLD - para Salmonella spp. e Shigella spp. - incubar em aerofilia até 24

horas a 35ºC +/-1;

✓ Meio YER - para Yersinia spp. - incubar em aerofilia até 24 horas a 32ºC +/-1;

✓ Meio CAM - para Campylobacter spp. - incubar em capnofilia até 48 horas a

35ºC +/-1;

✓ Meio MSA - para Staphylococcus aureus - incubar em aerofilia até 24 horas a

35ºC +/-1;

✓ Meio MRSA - para Staphyloccus aureus meticilina resistente - incubar em

aerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1.

De seguida é feito um Leishman, onde se avalia a presença ou não de sangue e de

leucócitos polimorfonucleares (o seu número pode ser indicativo de doença infeciosa), e

um Gram.

As fezes são também semeadas num caldo de enriquecimento para microrganismos

Gram-negativos (caldo GN) e é incubado durante 6-8 horas a 35ºC e ao fim deste

período faz-se uma passagem para o meio XLD para isolamento de Salmonella spp. e

Shigella spp..

Ao fim do período de incubação, observam-se as placas dos diferentes meios para

pesquisa de colónias características. As colónias suspeitas devem ser identificadas e

realizado TSA no VITEK, nos casos que se aplica:

✓ No meio de Yersinia spp. (YER) - as colónias fermentadoras, de cor rosa escura

são consideradas suspeitas;

✓ Nos meios para pesquisa de Salmonella spp. e Shigella spp. (XLD) – as colónias

não fermentadoras da lactose e/ou de centro negro (resultante da produção de

H2S) são consideradas colónias suspeitas, uma vez que os principais agentes de

gastroenterite não têm a capacidade de fermentar a lactose presente no meio e

muitos são produtores de H2S. Há outras bactérias que fazem parte da flora

comensal do intestino, como o Proteus spp., que também originam colónias não

fermentadoras no meio de XLD, mas para distinguir estas bactérias é feito o

teste da urease, sendo que o Proteus spp. é urease positivo e a Salmonella spp. e

a Shigella spp. são urease negativo;

✓ No meio para Campylobacter spp. (CAM) – a presença desta bactéria é feita

pela morfologia das colónias após coloração de Gram;


26

✓ No meio para Staphylococcus aureus (MSA) – as colónias fermentadoras do

manitol são suspeitas de ser colónias de S. aureus, que se pode confirmar pelo

teste da catalase e coagulase;

✓ No meio para S. aureus meticilina resistente – as colónias suspeitas aparecem de

cor púrpura neste meio.

Testes rápidos nas fezes

Nas fezes são realizados testes de quimioluminescência para deteção de antigénios do

rotavírus, do adenovírus e do Clostridium dificille. A presença da estirpe toxigénica do

Clostridium dificille é confirmada por biologia molecular.

Pesquisa de sangue oculto nas fezes

A pesquisa de sangue oculto nas fezes é um exame muito importante na deteção precoce

de muitas patologias gastrointestinais, sendo o cancro do colon a mais relevante, devido

à sua alta taxa de mortalidade.

No SPC para a deteção de sangue oculto nas fezes, utiliza-se um teste rápido que

aproximadamente em 10 minutos permite determinar qualitativamente os níveis de

hemoglobina. Este teste baseia-se num método imunocromatográfico, no qual há

migração da amostra de fezes por capilaridade numa membrana, onde estão

impregnados anticorpos anti-hemoglobina. Assim, na presença de sangue nas fezes,

ocorre ligação das moléculas de hemoglobina aos anticorpos específicos anti-

hemoglobina, originando o aparecimento de duas linhas vermelhas na cassete, uma

correspondente ao controlo e outra correspondente ao teste. Na ausência de sangue

oculto nas fezes, na cassete apenas aparecerá uma linha vermelha correspondente à

linha do controlo. Pode ocorrer ainda casos em que o teste é considerado inválido, não

havendo o aparecimento de nenhuma linha na cassete.

Pesquisa de parasitas

Nas fezes, a pesquisa é feita após um método de concentração por sedimentação, sendo

o sedimento observado a fresco entre lâmina e lamela para observação de ovos, quistos

e formas adultas. São processadas três amostras de fezes colhidas em dias diferentes

para aumentar a sensibilidade da técnica.

Os parasitas de maior incidência clínica são Entamoeba histolytica, Giardia lamblia,

Fasciola hepatica, Schistosoma spp., Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura,

Enterobius vermicularis, Hymenolepis spp., Ancylostoma duodenale e Taenia spp.

Adicionalmente é realizada a pesquisa de Giardia lamblia e Cryptosporidium spp. por

um método imunocromatográfico.


27

2.4.3 Exsudado vaginal e uretral

A vagina e a uretra são os únicos locais do trato urogenital permanentemente

colonizados. A flora vaginal é bastante rica e sofre alterações relacionadas com a idade

e fatores hormonais, já a uretra é relativamente pouco colonizada.

Nos exsudados vaginais por norma pesquisa-se Trichomonas vaginalis, Gardnerella

vaginalis, S. aureus, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus agalactiae - grupo B

(mulheres grávidas entre a 35ª e 37ª semanas para despiste da colonização) e Candida

albicans. Nos exsudados uretrais pesquisa-se a presença de N. gonorrhoeae.

Quando amostra chega ao laboratório é feito um Gram onde se descreve a flora

existente. São avaliadas as células epiteliais, leucócitos, eritrócitos, leveduras e a

presença de T. vaginalis. De seguida é semeada nos seguintes meios:

✓ GS - incuba em aerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1;

✓ GC - incuba em microaerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1;

✓ Gelose VCA - para pesquisa de N. gonorrhoeae - incuba em microaerofilia até

às 24 horas a 35ºC +/-1;

✓ Gelose GAR - para isolamento seletivo de G. vaginalis - incuba em

microaerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1;

✓ Gelose CAN - para pesquisa e isolamento de diferentes espécies de Candida

spp.;

✓ Meio Todd Hewitt e posterior passagem para meio Granada - para pesquisa de

Streptocccus do grupo B - o meio Todd Hewitt incuba em aerofilia até às 24

horas a 35ºC +/-1 e depois é semeado meio de Granada e incubado em

anaerobiose até às 24 horas a 35ºC +/-1 (apenas em mulheres em idade fértil).

Pesquisa de Streptococcus do grupo B

O Streptococcus B (Streptococcus agalactiae) é uma bactéria que pode colonizar o trato

geniturinário ou o trato gastrintestinal da grávida podendo conduzir a infeção por

Streptococcus B no recém-nascido, causando pneumonia, sépsis, e até mesmo

meningite. Uma vez que a colonização por Streptococcus B pode ser transitória, o

“screening” deve ser feito nas grávidas com zaragatoa vaginal e/ou retal, entre as 35ª e

37ª semanas de gravidez para que possa ser feita a descolonização intraparto das

mulheres grávidas infetadas.

Quando as zaragatoas chegam ao laboratório são inseridas num tubo contendo meio de

Todd-Hewitt (meio líquido destinado ao enriquecimento das diferentes espécies de

Streptococcus spp.). Após 24 horas é feita uma passagem para meio de Granada (meio

cromogénico para isolamento de S. agalactiae) que é incubado em atmosfera de

anaerobiose a 35ºC. Após 24 horas as placas são observadas para pesquisa de colónias

alaranjadas que identificam presuntivamente o S. agalactiae. A identificação é

confirmada pelo teste de Lancefield e pela identificação e realização de TSA pelo

VITEK.


28

Pesquisa de Trichomonas vaginalis em exsudados vaginais

A tricomoníase é a infeção sexualmente transmissível mais comum no mundo. É

causada pelo parasita T. vaginalis e é na maioria dos casos, assintomática e afeta mais

frequentemente as mulheres.

A pesquisa de T. vaginalis em exsudados vaginais é feita através de um teste rápido

imunocromatográfico que deteta a presença de antigénios específicos do protozoário.

2.4.4 Líquido cefalorraquidiano (LCR)

A meningite é uma doença causada pela inflamação das meninges, que são as

membranas que protegem o cérebro e a medula espinal. Essa inflamação é normalmente

resultado de uma infeção do líquido cefalorraquidiano. As bactérias mais

frequentemente envolvidas são a Neisseria meningitidis, o Streptococcus pneumoniae e

o Haemophilus influenzae tipo b, são infeções graves que podem ser fatais. As amostras

de LCR devem ser processadas imediatamente após a colheita, pois estes agentes

patogénicos são pouco resistentes a condições ambientais.

Quando a amostra chega ao laboratório é centrifugada para concentração e o sedimento

é usado para preparar o esfregaço corado pelo método de Gram e é semeado nos

seguintes meios de cultura:


✓ GC - incuba em microaerofilia até às 48 horas a 35ºC +/-1.

O laboratório deve comunicar ao médico se foram observados microrganismos na

coloração de Gram ou se houve crescimento de colónias ao fim de 24 a 48h. Se houver

crescimento deve ser feito de imediato a sua identificação e TSA no VITEK.

Para que o diagnóstico seja feito com uma maior rapidez são realizados outros exames

como:

✓ Observação macroscópica do líquido para verificação da cor e turvação;

✓ Exame bioquímico do líquido com pesquisa de proteínas totais, glucose e cloro;

✓ Contagem celular por citometria de fluxo;

✓ Pesquisa de antigénios capsulares (teste rápido de aglutinação que pesquisa a

presença dos antigénios da cápsula das principais bactérias responsáveis por

meningite: E. coli K1, Streptococcus Grupo B, S. pneumoniae, N. meningitidis

A,B,C e Y/135, H. influenzae tipo b;

✓ Pesquisa por biologia molecular de um painel de bactérias que podem estar

associadas à meningite, nomeadamente H. influenza, Listeria monocytogenes, N.

meningitidis, S. agalactiae, S. pneumoniae, E. coli K1, dos vírus como

Cytomegalovírus, Enterovirus, Herpes simplex vírus 1, Herpes vírus 2, Human

herpes vírus 6, Human parechovirus, Vírus varicela zoster e de leveduras como

é o caso do Cryptococcus neoformans/gattii.


29

2.4.5 Outros líquidos

Outros líquidos podem ser colhidos para cultura bacteriológica, como líquido pleural,

sinovial, ascítico e pericárdico. Estes líquidos normalmente são estéreis e qualquer

microrganismo encontrado deve ser pesquisado. A interpretação final deve ter em conta

o estado clínico do doente e o microrganismo isolado.

Quando a amostra chega ao laboratório é realizado um Leishamn e um esfregaço para

corar pelo método de Gram para observação de presença de leucócitos

polimorfonucleares, de células epiteliais e a presença de microrganismos,

respectivamente. De seguida é semeado nos seguintes meios:



Se houver crescimento de colónias ao fim de 24 a 48h é feita a sua identificação e TSA

no VITEK.

Além disso, estes líquidos são sujeitos a contagem celular por citometria de fluxo e a

exame bioquímico para determinação de parâmetros como proteínas totais, glucose, pH

e densidade.


30

2.4.6 Hemoculturas

A maioria das doenças infeciosas podem decorrer com bacteriemia transitória,

intermitente ou persistente.

O sangue é um produto biológico estéril, como tal se for isolado um microrganismo a

partir de uma hemocultura é geralmente o agente etiológico da infeção. O volume de

sangue colhido deve ser sempre o volume requerido para o tipo de meio de hemocultura

em causa e a hora da colheita, uma vez que o sangue deve ser colhido durante a

ascensão da febre, pois o número de bactérias viáveis no sangue é maior (3). As garrafas de hemoculturas são colocadas num aparelho para incubação de

hemoculturas, o BACTEC 9000MB, durante pelo menos 5 dias ou até deteção de uma

amostra positiva. O aparelho deteta o crescimento bacteriano através da produção de

CO2. Quando o equipamento dá indicação de uma garrafa de hemocultura positiva esta é

retirada do equipamento e após a preparação de uma lâmina para coloração pelo método

de Gram são inoculados os seguintes meios:



Cultura de cateter

Um cateter deve chegar ao laboratório, sempre acompanhado de uma hemocultura, e

deve ser semeado por dois métodos, primeiro pela técnica de Maki que consiste no

rolamento do cateter em placa e segundo semeado quantitativamente após sonicação

para libertação das bactérias do biofilme que se forma no lúmen do catéter. Os meios

para cultura são:



Só deve ser valorizado o crescimento de microrganismos se o mesmo microrganismo

for isolado na hemocultura, caso contrário considera-se que o cateter está colonizado.


31

2.4.7 Produtos respiratórios

As infeções das vias respiratórias superiores são frequentes, sendo a maior parte de

etiologia viral. Quando a etiologia é bacteriana representa uma tentativa de identificar,

entre uma flora comensal abundante e/ou o(s) agente(s) implicados na infeção.

No aparelho respiratório superior existe uma flora mista abundante, constituída por

aeróbios e anaeróbios, tais como o S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae, N.

meningitidis, leveduras e membros das Enterobacterales, podem constituir uma flora

transitória ou estar presente em pequeno número na orofaringe de indivíduos saudáveis.

As principais infeções do trato respiratório superior podem envolver a faringite, a

epiglote e os seios nasais.

Na faringite bacteriana, que também pode ser viral, a principal causa é o Streptococcus

α-hemolítico do grupo A (S. pyogenes). Outras causas de faringite pode ser a N.

gonorrhoeae, Bordetella pertussis e Corynebacterium diphtheriae, devendo a pesquisa

destes agentes ser feita exclusivamente quando existe suspeita clínica e por solicitação

específica do médico.

A epiglotite geralmente é de etiologia bacteriana, sendo na sua maioria provocada pelo

H. influenzae tipo b. A colheita de amostras da epiglote está contra indicada pois pode

originar uma completa obstrução das vias aéreas. O diagnóstico é essencialmente clínico

e através de hemoculturas.

A sinusite é frequentemente de origem endógena, a partir de microrganismos presentes

nas vias aéreas superiores, como é o caso do S. pneumoniae e do H. influenzae (3).

A cultura dos microrganismos do trato respiratório superior faz-se após colheita de

amostra da orofaringe por zaragatoa e posterior sementeira nos seguintes meios:



O diagnóstico das infeções respiratórias inferiores muitas vezes é dificultado pela

contaminação das amostras por flora comensal da orofaringe durante a colheita. As

amostras do trato respiratório inferior incluem as expetorações, as secreções brônquicas,

os aspirados traqueais, os aspirados traqueo-brônquicos, os aspirados brônquicos e os

lavados bronco-alveolares.

O laboratório deve processar apenas as amostras de boa qualidade. De acordo com as

recomendações do Cumulative Techniques and Procedures Clinical Microbiology

(CUMITECH) e a Tabela de Murray e Washington, as amostras biológicas com células

epiteliais ≥ 25 por campo, são geralmente inaceitáveis para exame bacteriológico por

excessiva contaminação orofaríngea. Por isso, para as amostras suscetíveis de

contaminação (expetorações, secreções brônquicas e aspirados traqueais) deve ser feito,

primeiramente, um exame citológico, pela observação microscópica da amostra pela

coloração de Leishman, para que possa ser verificada a sua qualidade pela contagem de

células epiteliais e de leucócitos polimorfonucleares, de acordo com a tabela de Murray

e Washington (Tabela 4).


32

Após a observação da lâmina, as amostras dos grupos 4 e 5 da tabela 4 são semeadas

em:


✓ GC - incuba em microaerofilia até às 48 horas a 35ºC +/-1;

✓ SGC - incuba em aerofilia à temperatura ambiente até às 72 horas (apenas se

semeia neste meio para os aspirados traqueo-brônquicos, os aspirados

brônquicos e os lavados bronco-alveolares).

Após incubação de 24 a 48 horas, observa-se os meios de cultura, para a identificação

das colónias suspeitas. Devido à possibilidade de presença de flora comensal, deve-se

valorizar as colónias presentes em função das bactérias predominantes e das bactérias

visualizadas no Gram.

Os principais microrganismos patogénicos isolados nos produtos respiratórios são os

seguintes:

✓ Streptococcus pneumoniae – colónias α-hemoliticas no meio GS e observados

diplococos Gram-positivo na coloração de Gram. No caso de suspeita da

presença de S. pneumoniae procedemos ao isolamento das colónias suspeitas e à

identificação em sistema automatizado e presuntiva com base na sensibilidade

dos pneumococos à optoquina;

✓ Staphylococcus aureus – colónias β-hemolíticas no meio gelose de sangue e

cocos Gram-positivo em cacho na coloração de Gram. Na presença de colónias

suspeitas, após o isolamento das mesmas, faz-se o teste da catalase e da

coagulase e se forem os dois positivos faz-se a identificação e o antibiograma

em sistema automatizado;

✓ Moraxella catarrhalis - é um diplococo Gram-negativo. A catalase e oxidase são

positivas, faz-se identificação automática e antibiograma manual por E-test;

✓ Enterobacterales e Pseudomonas spp. – Além de crescerem no meio de GS e

GC, crescem também no meio de MCK. No Gram observa-se bacilos Gram-

negativo. Na presença de colónias suspeitas faz-se o teste da oxidase (no caso de

colónias não fermentadoras da lactose) para ajudar na seleção da carta a utilizar

no antibiograma automatizado;

Tabela 4 - Tabela de Murray e Washington. Fonte: Procedimento dos produtos

respiratórios do SPC da ULS da Guarda.


33

✓ Haemophilus influenzae – cresce apenas em GC. Na presença de colónias

suspeitas, acompanhadas da observação de cocobacilos pleomórficos Gram-

negativo na coloração de Gram, faz-se identificação automática e antibiograma

manual por E-test.

2.4.8 Amostras de feridas, pus e tecidos

Muitas são as situações clínicas e muitos são os respetivos microrganismos responsáveis

por infeções localizadas que conduzem à formação de exsudados purulentos. Assim,

devido às múltiplas variáveis envolvidas, a metodologia para o estudo microbiológico

de qualquer exsudado purulento tem de ter em consideração (3):

✓ Local da infeção;

✓ História clínica, nomeadamente dados epidemiológicos;

✓ Tipo de infeção;

✓ Modo de colheita.

Feridas abertas podem ser frequentemente colonizadas por microrganismos

potencialmente patogénicos não relacionados ao processo infecioso específico. Portanto,

é importante colher amostras na profundidade da ferida após a superfície ter sido bem

limpa. Sempre que possível deve-se evitar a colheita de amostra com zaragatoa, porque

é difícil obter uma amostra representativa sem contaminação com microrganismos que

colonizam a superfície. Da mesma forma, o aspirado de um abcesso fechado deve ser

colhido tanto do centro como das paredes do abcesso, uma vez que a maioria dos

microrganismos se multiplica ativamente na base do abcesso e não no centro.

Os tecidos devem ser obtidos de uma porção representativa do processo infecioso, com

múltiplas amostras colhidas preferencialmente (4).

Após a colheita destas amostras é feito duas lâminas pelo método de Gram e Leishman

e semeadas nos seguintes meios de cultura:

✓ GS - incuba em aerofilia até às 24-48 horas a 35ºC +/-1;

✓ GC - incuba em microaerofilia até às 24-48 horas a 35ºC +/-1;

✓ SGC - incuba em aerofilia à temperatura ambiente até às 72 horas;

✓ DCO - incuba em aerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1;

✓ MSA - incuba em aerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1 ;

✓ MRSA - incuba em aerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1;

✓ MCK - incuba em aerofilia até às 24 horas a 35ºC +/-1.


34

3. Micobacteriologia

A família das Mycobacteriaceae compreende apenas o género Mycobacterium. Trata-se

de bactérias aeróbias, imóveis, não capsuladas e não formadoras de esporos.

Habitualmente, a maioria das espécies, apresenta uma morfologia bacilar ou

cocobacilar. Caracteristicamente os bacilos são finos, rectos ou ligeiramente

encurvados, apresentando-se isolados, aos pares ou em pequenos agrupamentos de

bacilos paralelos (5).

As bactérias do género Mycobacterium têm uma parede celular que é extremamente rica

em lípidos, que incluem ceras, tendo caracteristicamente ácidos micólicos com cadeias

longas e ramificadas, o que torna a superfície hidrofóbica e confere a estas bactérias

propriedades importantes, não só em termos taxonómicos, como também na patogenia

das respetivas infeções. Assim, estas bactérias são resistentes à coloração por variados

corantes utilizados comumente em bacteriologia, como por exemplo, o método de

Gram. Por outro lado, uma vez coradas, resistem à descoloração por soluções ácido-

alcoólicas, sendo-lhes por isso atribuída a designação de bactérias álcool-ácido-

resistentes (BAAR). Significa isto, que a coloração com um primeiro corante, se

mantém após descoloração com solução álcool-ácida, não adquirindo as bactérias a

coloração com um segundo corante administrado. Embora não seja patognomónica das

micobactérias, a ácido-resistência é talvez a sua característica mais importante em

termos de identificação laboratorial. A metodologia de coloração ácido-resistente mais

utilizada é a coloração de Ziehl-Neelsen (6).

Nas amostras em que é pedido a pesquisa de micobactérias, sendo a mais frequente a

expetoração, é preparado um esfregaço diretamente a partir do produto, para ser corado

pela técnica de auramina e corados pela técnica de Ziehl-Neelsen.

A coloração de auramina é o método de eleição e o recomendado para laboratórios com

microscópio de fluorescência, por se tratar de uma coloração mais sensível, que cora de

amarelo-esverdeado as micobactérias, que ficam fluorescentes num fundo negro, o que

permite distingui-las de outros microrganismos e estruturas celulares presentes na

amostra. Uma vantagem deste método é que permiti a observação numa ampliação de

20x e 40x, o que visualiza mais campos, num menor período de tempo, o que é muito

útil, tendo em conta que, cada esfregaço deve ser observado cuidadosamente para que

possa ser reportado como negativo, pois basta a visualização de um BAAR, para que a

amostra seja reportada como positiva.

Quando são observados num esfregaço BAAR, os resultados devem ser quantificados,

pela técnica de Ziehl-Neelsen para permitir saber qual a quantidade de bacilos

excretados, bem como a extensão da infeção, importante em termos clínicos e

epidemiológicos.

Apesar da elevada sensibilidade e especificidade da observação do esfregaço, a

ocorrência de artefactos durante o processo de coloração pode conduzir a resultados

falsos positivos, como tal em caso de dúvida, um resultado positivo deve ser

confirmado, com novo esfregaço corado por Zihel-Neelsen ou observação por outro

técnico superior/especialista.

A maioria das amostras processadas para a pesquisa de micobactérias contêm outros

microrganismos contaminantes, pelo que, o laboratório deve processar à sua

descontaminação (com hidróxido de sódio-citrato trissódico) e concentração de

amostras, pois permite aumentar a eficiência na recuperação das micobactérias


35

existentes na amostra, eliminando todos os outros microrganismos e fluidificando (com

N-acetil-L-cisteína) amostras como as expetorações para um melhor isolamento e

sedimentação.

As amostras depois de descontaminadas e tratadas são inoculadas em meio de

Löwenstein-Jensen e feito também a inoculação num tubo indicador de crescimento

micobacteriano BD BBL MGIT.

Os tubos de Löwenstein-Jensen são incubados até 60 dias na estufa a 37°C e são

observados todas as semanas. Sempre que se observe crescimento suspeito em algum

deles efetua-se uma lâmina corada segundo o protocolo da coloração de Ziehl-Neelsen

para avaliar e pesquisar BAAR. Se algum dos tubos tiver crescimento e for suficiente

procede-se à identificação da bactéria e respetivo antibiograma. Se os tubos não

apresentarem crescimento mantem-se na estufa até 60 dias, após o qual o resultado será

dado como negativo.

Os tubos de BD BBL MGIT contém um caldo de Middlebrook OADC (com albumina

bovina) suplementado com uma mistura de antibióticos, para suprimir a flora normal

das amostras e aumentar a recuperação das micobactérias. A amostra é incubada a 37ºC

no sistema BACTEC MGIT 960. A respiração dos microrganismos aeróbios viáveis

presentes no meio origina uma depleção de oxigénio que provoca um aumento da

fluorescência do sensor do meio. O sensor é monitorizado pelo instrumento

relativamente ao aumento de fluorescência. Uma leitura positiva indica a presença

presuntiva de micobactérias viáveis no meio.

O desenvolvimento das micobactérias é lento e por isso exige períodos de incubação

prolongados, cerca de 42 dias. Caso ocorra crescimento, o sistema notifica a presença de

culturas positivas. Nestes casos, os frascos das culturas são removidos do sistema e

efetuado um esfregaço para coloração pelo método de Ziehl Neelsen para verificar se a

amostra é positiva para BAAR ou se é uma amostra contaminada.

A visualização de BAAR é apenas uma evidência presuntiva de tuberculose. Nestes

casos é feita identificação e antibiograma.

As amostras que se revelem contaminadas, ou seja, se observe a presença de outros

microrganismos (bactérias/leveduras) são submetidas a um novo processo de

descontaminação e incubação.

Paralelamente a estes processos é feito no Laboratório de Biologia Molecular a pesquisa

de Mycobacterium tuberculosis no equipamente GeneXpert, que detecta o DNA

presente nas micobactérias, bem como testes de resistência ao antimicrobiano,

rifampicina.

Figura 3 - Esfregaço de uma cultura positiva para BAAR. Fonte: SPC da ULS da

Guarda.


36

4. Bioquímica

A bioquímica clínica é uma área das análises clínicas que tem como objetivo a

determinação de parâmetros bioquímicos e sua utilização no diagnóstico, tratamento,

monitorização ou prevenção da doença. É o setor que apresenta o maior fluxo de

amostras diariamente e é, provavelmente, o setor mais automatizado.

4.1 Fase pré-analítica

A fase pré-analítica representa um dos pontos mais importantes e críticos para a

obtenção de resultados fiáveis. Engloba os processos de marcação dos exames, recolha

de informação sobre a preparação e a inscrição do utente, a recolha e preparação das

amostras biológicas e o seu transporte para o laboratório. Nesta fase é onde ocorre a

maior percentagem de erros que afetam a fase analítica e dificultam a interpretação e

validação dos resultados. Os principais erros incluem a perda de amostras ou da

requisição médica, a má preparação do utente, a incorreta identificação da amostra, a má

conservação das amostras biológicas, o transporte incorreto das amostras, a recolha de

quantidade de amostra insuficiente, a contaminação de amostras e a obtenção de

amostras não conforme (como são exemplos as amostras hemolisadas ou contendo

coágulos).

Esta fase envolve cuidados a diferentes níveis, nomeadamente do paciente, da amostra e

da sua receção e triagem.

4.1.1 O paciente

O paciente deve receber todas as informações necessárias sobre os cuidados a ter nesta

fase de pré-colheita de amostras, tais como os tempos de jejum, a ingestão de bebidas

alcoólicas, os tipos de medicamentos que não devem ser consumidos, entre outras que

possam interferir diretamente na qualidade do material colhido.

Nesta fase o registo do utente é muito importante, pois os dados pessoais devem estar

corretos para diminuir qualquer erro, especialmente entre a identificação do paciente e a

amostra.

4.1.2 A amostra

A amostra fornecida deve ser apropriada para o teste solicitado e devem ser

corretamente identificadas e transportadas o mais rapidamente possível para o

laboratório e quando assim não for possível, ou quando a amostra tiver de ser enviada

para um laboratório de referência do exterior para ser analisada, devem ser cumpridos

os requisitos de armazenamento e transporte da amostra para os analitos/métodos em

causa.


37

Nesta etapa os erros mais comuns são a colheita de quantidade insuficiente de amostra,

amostra colhida em tubo incorreto, tipo de amostra colhida inadequada ao pedido e

identificação incorreta do paciente ou da amostra.

Na área da bioquímica os produtos frequentemente analisados são o sangue,

nomeadamente o soro, pois é o produto de eleição para a realização das análises,

seguido da urina.

Na colheita de sangue podem ser usados diferentes tubos de acordo com a análise que

irá ser processada:

✓ Tubo sem anticoagulante (tubo seco com gel separador – para maioria

das análises imunoquímicas) – SORO;

✓ Tubo com EDTA sódico (por exemplo na determinação de amónia e/ou

peptídeo natriurético (BNP)) – PLASMA;

✓ Tubo com Fluoreto de sódio + EDTA (por exemplo para determinação

de glucose e lactato) – PLASMA;

✓ Tubo de Homocisteína (por exemplo para determinação de homocisteína)

– PLASMA;

✓ Tubo com Heparina (por exemplo para determinações especiais de

bioquímica - Zinco, Chumbo, Cobre) – PLASMA.

O tipo de amostra de urina a ser colhido e o procedimento da colheita depende dos

testes a serem executados.

✓ Urina para Urina sumária e sedimento urinário:

A colheita de urina para urina sumária e sedimento urinário é geralmente

realizada pelo próprio utente. É feita a recolha da primeira urina da

manhã para um recipiente estéril e fechado que deverá ser entregue ao

laboratório o mais breve possível.

✓ Urina de 24 horas:

A colheita da urina de 24 horas implica a recolha de todas as micções

realizadas durante 24 horas. A primeira urina da manhã deve ser

rejeitada, seguido do armazenamento de todas as urinas daquele dia,

inclusive da primeira urina do dia seguinte. Esta urina é usada para

avaliar o funcionamento dos rins, pois é possível definir a taxa de

filtração glomerular, pesquisar a presença de proteínas na urina e

identificar as concentrações na urina de vários sais minerais, como sódio,

potássio, cálcio e fósforo. Permite determinar parâmetros bioquímicos

cujas concentrações sofram alterações ao longo do dia, como é o caso da

creatinina, do cortisol e do péptido C.


38

4.1.3 Receção e preparação de amostras

Após a colheita, as amostras são entregues no SPC da ULS da Guarda devidamente

acondicionadas e com as respetivas requisições, providas de uma etiqueta com um

número próprio, associado a um código de barras que acompanha a amostra em todo o

seu processamento. Seguidamente, as amostras são triadas e quando necessário

centrifugadas para obtenção do soro ou plasma. Sempre que possível, deve ser

verificado se a amostra se encontra hemolisada, lipémica ou ictérica, ou com qualquer

outro tipo de alteração. Posteriormente, as amostras são colocadas no Aceleratorp540

equipamento inicial que serve para automaticamente, separar, quer em alíquotas que

serão levadas até aos diferentes autoanalisadores, quer para armazenamento e

arquivamento automático.

4.1.4. Sistema de triagem

O sistema de triagem - Acceleratorp540 - separa as amostras de acordo com o pedido de

análise, faz alíquotas se a análise requerida assim necessitar e distribui-as em suportes

destinados aos diferentes equipamentos do laboratório. Terminado o processo analítico,

as amostras são novamente colocadas no Acceleratorp540 e, se todos os testes estiverem

realizados, as amostras são arquivadas automaticamente.

Caso contrário, as amostras são novamente distribuídas, tendo em conta as análises

pendentes. Assim, o Acceleratorp540 permite automatizar as tarefas pré e pós-

analíticas, com as suas funções de descapsulamento, avaliação da quantidade e

distribuição das amostras, realização de alíquotas que irão ser arquivadas e congeladas a

temperaturas de aproximadamente de -50°C e identificação destas por impressão de

novos códigos de barras e arquivamento pós análise.

Figura 4 - Diagrama do fluxo de trabalho do Aceleratorp540. Fonte: SPC da ULS

da Guarda.


39

4.2- Fase analítica

A fase analítica consiste na montagem e validação das técnicas, execução das análises e

controlo dos resultados e análise do controlo de qualidade interno e/ou externo. Esta

fase apesar de ser a mais automatizada, é importante que seja feita a verificação de

instrumentos e reagentes, a verificação do estado de controle dos sistemas e a

monitorização dos processos de análises.

Após a triagem das amostras, estas são direcionadas para os diferentes autoanalisadores

para o seu processamento.

4.2.1 Equipamentos

O laboratório dispõe de um vasto número de equipamentos automáticos, que permitem

trabalhar um número elevado de amostras que chegam dos vários serviços dos dois

hospitais e dos centros de saúde. Para o processamento das análises existem inúmeros

equipamentos, nomeadamente, o Architectci8200, o Architecti2000sr, o VIDAS 3, o

IMMAGE, o Urisys 2400 e o UF-1000i. Estes equipamentos permitem a análise das

amostras de forma rápida e eficaz, através de diferentes metodologias como a

potenciometria, a fotometria e a quimioluminescência (7).

A potenciometria baseia-se na medição do potencial dum elétrodo indicador em relação

a um elétrodo de referência, quando não passa corrente através da solução em que estão

mergulhados. Geralmente, na maior parte dos métodos eletroquímicos usa-se um

elétrodo indicador em cujo potencial estamos interessados e um elétrodo de referência

cuja função é manter um potencial pelo menos aproximadamente constante. Ambos os

elétrodos estão ligados a um voltímetro, que compara o potencial medido com o

potencial do elétrodo de referência. O potencial corresponde à atividade do ião e está

diretamente relacionado com a sua concentração na solução.

A fotometria é uma técnica que utiliza a luz como forma de energia caracterizada pelos

seus diferentes comprimentos de onda. O espectrofotómetro faz passar um feixe de luz

monocromática através de uma solução (resultante de uma reação enzimática,

colorimétrica ou turbidimétrica) medindo assim a quantidade de luz absorvida

(absorvância) por essa solução no comprimento de onda estabelecido. Esta técnica

relaciona a quantidade de luz absorvida e a fração transmitida e detetada pelo foto-

detetor, com a concentração de sustância a analisar permitindo a sua identificação e

quantificação (2).

A quimioluminescência é um tipo de luminescência em que o evento de excitação é

causado por uma reação química. O evento físico da emissão de luz ocorre num único

estado de excitação em que a luz é emitida quando o eletrão regressa de um nível

energético superior ao seu estado basal de energia. A excitação é causada por uma

reação química que envolve a oxidação de um composto orgânico por um agente

oxidante. A reação ocorre na presença de um catalisador, como as enzimas, iões

metálicos ou complexos metálicos. Este método ultra sensitivo é usado num vasto leque

de imunoensaios automatizados competitivos e não competitivos em “sandwich”, que

utilizam anticorpos ou antigénios ligados a um marcador luminescente. Os marcadores

quimioluminescentes, emitem luz quando combinados com um reagente trigger


40

(gatilho), sendo os derivados da acridina os mais usuais. Estes emitem grandes

quantidades de luz sendo mais fácil a sua medição, tornando o método mais sensível.

Todos os equipamentos do SPC são preparados e controlados no início de cada turno de

trabalho, ou seja, são verificados os níveis de reagentes e de consumíveis (pontas,

cuvetes de reação, soluções de lavagem) de cada equipamento e são processados pelo

menos dois níveis de controlo de qualidade interno, para cada parâmetro analisado.

Sempre que necessário (novo lote de reagente, término do prazo de calibração ou falhas

nas regras de controlo de qualidade interno) as diferentes técnicas são calibradas

recorrendo aos calibradores fornecidos pelas casas comerciais.


41

Tabela 5 - Equipamentos utilizados na fase analítica do setor da Bioquímica Clínica.

Equipamento Metodologia Parâmetros analisados

ArchitectCi8200 Potenciometria

Fotometria

Quimioluminescência

Ionograma, Perfil hepático

Perfil renal, Perfil pancreático

Perfil lipídico, Perfil endócrino

Metabolismo do ferro, Proteínas

séricas

Marcadores cardíacos

Marcadores tumorais

Drogas terapêuticas, Drogas de

abuso

Microbiologia serológica e

antigénica

Architecti2000sr Quimioluminescência Perfil endócrino

Doenças infeciosas

Vidas 3 ELFA (Enzyme Linked

Fluorescent Assay)

Vitamina D

Procalcitonina

Técnicas alternativas para testes

específicos de serologia (Vírus

da Imunodeficiência Humana

(HIV)), Rubéola, Toxoplasma,

Citomegalovirus

Immage Nefelometria

Turbidimetria

Alfa-1-antitripsina

Ceruloplasmina

Apolipoproteína A e B

Lipoproteína A, Haptoglobina

Imunoglobulina A, G e M

Cadeias Kappa e Lamda

Complemento C1q, C3 e C4

Urisys 2400 Fotometria e Reflectância

Sumária urina:

- Cor

- pH

- Densidade

- Bilirrubina

- Urobilinogénio

- Corpos cetónicos

- Glucose

- Proteínas

- Nitritos

- Leucócitos

- Eritrócitos

UF-1000i Citometria de fluxo

Fluorescente

Sedimento urinário:

- Células epiteliais escamosas e

do epitélio renal

- Leucócitos

- Eritrócitos

- Bactérias e leveduras

gemuladas

- Espermatozóides

- Cilindros e cilindros

patogénicos

- Cristais

- Muco


42

4.3 Parâmetros bioquímicos

Os parâmetros analíticos que podem ser analisados são imensos e através do seu

enquadramento global e clínico é possível fazer-se o estudo de diferentes patologias.

4.3.1 Ionograma

No organismo humano os eletrólitos desempenham funções diversas que incluem a

manutenção da pressão osmótica, a distribuição de água nos vários

compartimentos/líquidos do organismo, a manutenção do pH, a ativação de enzimas e o

auxílio na contractilidade do miocárdio e na excitabilidade neuromuscular (8).

O ionograma representa a quantificação do sódio, potássio e cloro por potenciometria

indireta realizada com recurso à tecnologia de elétrodos para iões específicos (ISEs),

que consiste na medição da diferença de potencial entre os três elétrodos

correspondentes a cada ião e um elétrodo de prata/cloreto de prata correspondente ao

elétrodo de referência (9).

Tabela 6- Ionograma

Parâmetro Descrição Importância clínica

Sódio

O principal catião

extracelular e é

responsável pela

manutenção do

equilíbrio

hidroeletrolítico do

compartimento

extracelular.

- Um aumento nos valores do sódio pode estar relacionado

com situações de hipovolémia, de desidratação, Síndrome

de Cushing, em que ocorre uma sobreprodução de

aldosterona, ou em situações de consumo elevado de sal

sem a respetiva compensação em água;

- O uso excessivo de diuréticos, vómitos, diminuição da

ingestão de sódio pela dieta ou situações de acidose

metabólica podem levar à hiponatrémia.

Potássio

O principal catião

intracelular envolvido

no balanço e

distribuição de água

no organismo.

- O aumento pode surgir por destruição celular,

insuficiência renal, diminuição da produção de aldosterona,

podendo conduzir a estados de confusão mental, paralisia

ou debilidade generalizada;

- A hipopotassemia, normalmente devido a um aumento da

excreção de potássio, pode estar associada a diurese

osmótica da hiperglicemia, ao hiperaldosteronismo, ao

Síndrome de Cushing, ao uso prolongado de diuréticos e

mineral corticoides, o que conduz a estados de debilidade

muscular, irritabilidade, paralisia, batimento cardíaco

acelerado e, eventualmente paragem cardíaca.

Cloro

O principal anião

extracelular

responsável pela

manutenção do

equilíbrio hídrico e

pressão osmótica.

- O cloro aumenta em situações de acidose associada à

diarreia, doenças dos túbulos renais, hiperparatiroidismo;

- Diminui em situações de vómitos em que há perda de

ácido clorídrico na doença de Addison por deficiente

produção de aldosterona.


43

Determinação laboratorial do ionograma (Na+, K+ E Cl-):

Amostras - Soro, plasma e urina. A hemólise é um interferente de grande

importância sobretudo no caso do K+.

4.3.2 Perfil lipídico

O perfil lipídico é considerado como potente preditor de doença coronária. No entanto,

alguns dos parâmetros do perfil de risco lipídico podem estar aumentados noutras

doenças como a diabetes, o hipotiroidismo ou a doença renal.

O doseamento dos lípidos, das apolipoproteínas, bem como o lipidograma permitem

caracterizar diferentes hiperlipidémias. A determinação destes analitos são indicados em

indivíduos com valores de colesterol plasmático elevados, indivíduos jovens com

história de enfarte agudo do miocárdio (EAM) e/ou acidente vascular cerebral (AVC) e

nos membros das famílias em que exista um diagnóstico de hipercolesterolémia

familiar, para identificação dos indivíduos com risco elevado de aterosclerose.

As lipoproteínas são partículas complexas de estrutura globular cuja camada externa

fosfolipídica é constituída por apoproteínas e colesterol livre e o seu interior hidrofóbico

constituído, principalmente, por colesterol esterificado e triglicéridos (TGL). As

lipoproteínas classificam-se segundo a sua densidade, nas quais, da menor para a maior

densidade estão os quilomicra, as lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL-C:

very low density lipoprotein cholesterol), lipoproteínas de densidade intermédia (IDL-

C: intermediate density lipoprotein cholesterol), lipoproteínas de baixa densidade (LDL-

C: low density lipoprotein cholesterol) e lipoproteínas de alta densidade (HDL-C: high

density lipoprotein cholesterol) (10).

As LDL-C são as lipoproteínas de maior importância do ponto de vista fisiopatológico,

uma vez que são as que transportam maior percentagem de colesterol. Estas

lipoproteínas são produtos do metabolismo das VLDL-C, que são produzidas no fígado

e que são ricas em TGL, mas uma vez que os ácidos gordos são usados pelo organismo

pela ação da lipoproteína lípase endotelial, as VLDL-C vão perdendo TGL e,

proporcionalmente aumenta a concentração de colesterol que se converte em LDL-C.

Algumas lipoproteínas são variáveis preditivas do risco cardiovascular, como é o caso

das HDL-C que tem a função de remover o colesterol dos tecidos periféricos e

transportá-lo até ao fígado para excreção e das LDL-C que pode depositar-se nos

tecidos periféricos e associar-se a um risco aumentado de doenças cardiovasculares

como aterosclerose, AVC ou EAM, para além dos valores de colesterol total.

O colesterol total é um lípido sintetizado pelo fígado usado para a produção de

hormonas esteroides e constituintes das membranas celulares. O seu doseamento é

importante para o diagnóstico e classificação das lipoproteinémias. Utilizado para

estabelecer o risco de coronariopatias, e na avaliação das hiperlipoproteinémias. A sua

quantificação é utilizada no diagnóstico da função hepática, biliar e funcionamento da

tiroide. O stress, a idade, o equilíbrio hormonal e a gravidez afetam os níveis de

colesterol.

Os triglicéridos são absorvidos através da dieta, ou produzidos por via endógena, a

partir de hidratos de carbono e ácidos gordos. Identificam o risco de desenvolver

coronariopatia, sendo que é determinada em doentes com suspeita de distúrbios do


44

metabolismo das gorduras, pois estas são armazenadas e transportadas pelos

triglicéridos.

Atualmente são conhecidas quinze apolipoproteínas diferentes. Na prática corrente

estudam-se apenas as apolipoproteínas A, que são as principais constituintes das HDL e

as apolipoproteínas B, constituintes das LDL, que são sintetizadas pelo fígado e

intestino. A apolipoproteína A é um dos constituintes dos quilomicra e o principal

componente das HDL. Ela ativa a lecitina colesterol acil-transferase, enzima que se

encontra relacionada com a esterificação do colesterol livre nas partículas de HDL,

funcionando como recetor do colesterol que é libertado pelas células, promovendo a sua

eliminação. O doseamento da apolipoproteína A é útil para a identificação de doenças

coronárias. Quanto à apolipoproteína B, existem dois tipos, a apo B-100 e a apo B-48. A

apo B-100 é sintetizada no fígado e é um constituinte estrutural das VLDL, das IDL e é

a proteína exclusiva presente nas LDL. A apolipoproteína B é responsável pelo

transporte e pela remoção das lipoproteínas referidas anteriormente. A apo B-48 é uma

proteína estrutural constituinte dos quilomicra, e é sintetizada no fígado, tendo a função

de ligar as lipoproteínas remanescentes ao seu recetor, removendo-as assim da

circulação. Pacientes que apresentam deficiência na ligação da apo B apresentam

hipercolesterolemia e níveis elevados de LDL. A medição desta é também útil na

identificação de doenças coronárias (10).

O estudo do perfil lipídico é feito neste laboratório por espetrofotometria.


45

Tabela 7 - Perfil Lipídico

Analito Importância clínica

Colesterol Total

↑ Risco de oclusão da artéria coronária;

↑ Risco de aterosclerose;

↑ Hipertensão arterial;

↑ Risco de enfarte do miocárdio;

↑ Risco cardiovascular generalizado;

↓ Desnutrição;

↓ Disfunções hepáticas.

HDL

(High Density Lipoprotein)

↑ Prevenção de desenvolvimento de doença coronária

(cardioprotetor);

↓ Risco de aterosclerose;

↓ Risco de AVC;

↓ Risco de enfarte do miocárdio.

LDL

(Low Density Lipoprotein)

↑ Risco de aterosclerose;

↑ Risco de AVC;

↑Risco de enfarte do miocárdio.

Triglicéridos

↑ Hipotiroidismo;

↑ Obesidade;

↑ Insuficiência renal;

↑Alimentação rica em hidratos de carbono;

↓ Hipertiroidismo.

Determinação laboratorial dos lípidos e lipoproteínas:

Amostras: Soro ou plasma colhidos em jejum (preferencialmente de 8-12h).


46

4.3.3 Perfil pancreático

O pâncreas é uma glândula endócrina e exócrina, desempenhando funções importantes

no processo digestivo. A porção endócrina é composta pelos ilhéus pancreáticos, os

quais produzem hormonas como a insulina e glucagon na corrente sanguínea que são

importantes para a regulação dos níveis plasmáticos de glicose. A porção exócrina

produz um fluido pancreático rico em enzimas digestivas (proteolíticas, amilolíticas e

lipolíticas) e entre outras, como a elastase. Em certas condições patológicas, incluindo

pancreatite, as enzimas pancreáticas começam a aumentar e a produção de hormonas a

diminuir (11).

O estudo da função pancreática faz-se através do doseamento por espetrofotometria, das

principais enzimas pancreáticas, a amílase e a lipase, e de uma forma indireta pelo

doseamento por fotometria, da glucose como resposta à produção ou não de insulina, e

pelo doseamento, por quimioluminescência, do peptídeo C, que é um aminoácido

importante na formação da estrutura da insulina e da pró-insulina, o que permite avaliar

a atividade da secreção das células β-pancreáticas (12).

O diagnóstico de Diabetes Mellitus é feito com base nos seguintes parâmetros e valores

para plasma venoso na população em geral:

✓ Glicemia de jejum ≥ 126 mg/dl (ou ≥ 7,0 mmol/l);

✓ Sintomas clássicos + glicemia ocasional ≥ 200 mg/dl (ou ≥ 11,1 mmol/l);

✓ Glicemia ≥ 200 mg/dl (ou ≥ 11,1 mmol/l) às 2 horas, na prova de tolerância à

glicose oral (PTGO) com 75 g de glicose;

✓ Hemoglobina glicada A1c (HbA1c) ≥ 6,5% (13).

A hemoglobina glicada (HbA1c), corresponde a uma molécula de hemoglobina ligada

covalentemente a uma molécula de glucose. Depende da quantidade de glicose livre em

circulação no sangue no tempo e semivida dos eritrócitos. Forma-se irreversivelmente

durante a vida média do eritrócito. A sua determinação é utilizada como auxiliar no

diagnóstico e monitorização da glicémia em indivíduos com Diabetes Mellitus.

O diagnóstico da diabetes gestacional envolve duas fases temporais distintas a glicemia

em jejum na primeira consulta de vigilância pré-natal e da prova de tolerância à glicose

oral (PTGO) às 24-28 semanas de gestação. Como tal (14):

✓ Um valor de glicemia plasmática em jejum <92 mg/dl (5,1 mmol/L) implica a

realização entre as 24-28 semanas de gestação, de PTGO com sobrecarga de 75

g de glicose;

✓ Um valor da glicemia plasmática em jejum ≥92 mg/dl (5,1 mmol/L) e <126

mg/dl /7,0 mmol/L) faz diagnóstico de diabetes gestacional, não sendo

necessária a realização de PTGO com 75 g de glicose às 24-28 semanas de

gestação;

✓ Um valor de glicemia plasmática em jejum ≥126 mg/dl (7 mmol/L) ou um valor

de glicemia plasmática ocasional >200 mg/dl (11,1 mmol/L) (este valor deve ser

confirmado numa segunda ocasião em dia diferente, com outra glicemia

ocasional ou uma glicemia em jejum) indicia a existência de uma diabetes

provavelmente anterior à gravidez, diagnosticada pela primeira vez na gestação

em curso.


47

Tabela 8- Perfil Pancreático

Analito Descrição Importância clínica

Amílase

É uma enzima produzida pelo fígado,

pâncreas, glândulas salivares e trompas

de Falópio, que transforma o amido em

açúcar. Associada também a síndromes

abdominais dolorosos sem lesão

pancreática pelo que a amílase, apesar

de sensível, não é especifica de doença

pancreática.

↑ Pancreatite aguda;

↑ Amiloidose;

↑ Doenças das glândulas

salivares;

↑ Inflamação pulmonar.

Lípase

É uma enzima secretada pelo pâncreas

no duodeno. Responsável pelo

processamento dos triglicéridos.

↑ Pancreatite aguda;

↑ Cancro do pâncreas;

↑Obstrução do ducto pancreático.

Glicose

É uma fonte de energia das células,

obtida na alimentação. Em excesso,

leva à produção de insulina através do

pâncreas. Se esta não for secretada, a

glicose fica em níveis elevados

podendo levar à Diabetes mellitus.

Utilizada no diagnóstico e

monitorização de distúrbios

relacionados com o metabolismo dos

hidratos de carbono.

↑ Diabetes mellitus;

↑ Obesidade;

↑ Hepatopatia grave;

↓ Insulinoma;

↓ Tumores pancreáticos;

↓ Insuficiência supra-renal

Determinação laboratorial da amílase e da lípase:

Amostras: Soro, plasma (amostras colhidas em jejum) e urina.


48

4.3.4 Perfil hepático

O fígado é o órgão do organismo humano que tem a seu cargo numerosas e importantes

funções. Este órgão recebe e processa o sangue venoso, que chega do trato

gastrointestinal, rico em nutrientes, armazena a glicose na forma de glicogénio e

converte-a em aminoácidos e degrada os lípidos. Tem também a função de sintetizar

todas as proteínas plasmáticas, à exceção das imunoglobulinas e liberta os sais biliares

da bílis. Por último, o fígado converte a amónia num metabolito menos tóxico, a ureia, e

é o local por excelência de desintoxicação de compostos exógenos, tais como fármacos,

toxinas e para o catabolismo de várias hormonas, para que possam ser excretadas na

urina e na bílis. Em resumo, o fígado exerce funções vasculares, metabólicas, excretoras

e de biotransformação (11).

O fígado é o único órgão que tem a capacidade de se libertar de produtos de degradação

do heme, a bilirrubina. A bilirrubina é o principal pigmento constituinte da bílis e

resulta da lise dos glóbulos vermelhos.

A sua solubilização no plasma é conseguida através da ligação à albumina, sendo

transportada do local de produção (no baço) ao hepatócito através do sangue sinusoidal.

É captada através da membrana basolateral, por difusão passiva ou por transporte

mediado por proteínas de membrana. Uma vez, no interior do hepatócito liga-se

reversivelmente a proteínas solúveis. Durante o processo metabólico da bilirrubina

existe a formação de dois tipos de bilirrubina que se denominam bilirrubina não

conjugada e bilirrubina conjugada. A bilirrubina não conjugada corresponde à

bilirrubina ligada à albumina e que é insolúvel, não podendo ser nesta forma eliminada

do nosso organismo. A bilirrubina conjugada é a forma solúvel, constituída por

moléculas de bilirrubina ligadas a moléculas de ácido glucorónico, que torna as

moléculas de bilirrubina mais hidrofílicas (11).

A monitorização das funções do fígado, através da determinação de parâmetros

hepáticos é um processo que permite não só identificar anormalidades na função

hepática, como identificar o tipo e o local da lesão.

Os principais testes de avaliação do funcionamento hepático incluem a determinação

por espetrofotometria de substâncias que são libertadas como resultado da ocorrência de

um dano tecidular, tais como a gama-glutamil transferase (γGT), a aspartato

aminotransferase (AST), a alanina aminotransferase (ALT), a fosfatase alcalina (ALP),

a lactato desidrogenase (LDH), a amónia e a bilirrubina total e direta.


49

Tabela 9- Perfil Hepático

A determinação laboratorial é feita a partir do plasma.


Gama-glutamil

transferase

(γ- GT)

É produzida pelo fígado, pâncreas e rins,

aparecendo na corrente sanguínea após lesão destes

órgãos.

↑ Alcoolismo crónico

↑ Drogas

↑ Doenças hepáticas

↑ Hepatocarcinoma

↑ Cancro do pâncreas

Aspartato

aminotransferase

(AST)

É encontrada nos tecidos altamente metabólicos,

como o músculo cardíaco, os hepatócitos, os

eritrócitos, o cérebro e o tecido músculo-

esquelético. Utilizado na determinação do progresso

e prognóstico de pacientes com enfarte do

miocárdio, e diagnóstico e monitorização de

doenças hepáticas.

↑ Embolia pulmonar

↑ Enfarte de miocárdio

↑ Cirrose alcoólica

Alanina

aminotransferase

(ALT)

É encontrada predominantemente no fígado. Não

sendo específica do fígado pode aparecer

aumentada, no enfarte agudo do miocárdio.

↑ Hepatites

↑ Cirrose hepática

↑ Tumores hepáticos

↑ Enfarte agudo do miocárdio

Fosfatase alcalina

(ALP)

É encontrada em grandes quantidades no fígado, no

epitélio do trato biliar e osso. Por ser pouco

específica do fígado aparece aumentada noutras

doenças.

↑ Aumento do metabolismo ósseo

↑ Hipertiroidismo

↑ Linfoma de Hodgkin

↑ Doenças hepáticas

↓ Hipotiroidismo

↓ Desnutrição

↓ Doença celíaca

Lactato desidrogenase

(LDH)

É uma enzima intracelular utilizada para confirmar

o diagnóstico de lesão ou doença que afete o

coração, o fígado, os eritrócitos, os rins, o músculo-

esquelético, o cérebro e os pulmões. É pouco

específico quando isolado e por isso aparece

aumentado em inúmeras doenças.

↑ Anemia Hemolítica

↑ Anemia Megaloblástica

↑ Cirrose hepática

↑ Doenças cardio-respiratórias

↑ Distrofia muscular

↑ Neoplasias

Amónia

É uma substância tóxica para o organismo que

resulta do catabolismo dos aminoácidos, sendo

convertida pelo ciclo da ureia no seu metabolito

menos tóxico, a ureia. A hiperamoniemia pode ser

primária quando ocorrem defeitos genéticos ou

congénitos na formação de enzimas do ciclo da

ureia ou secundária no caso de lesão hepática.

↑Hepatites

↑Neoplasias hepáticas

↑Cirrose hepática

Bilirrubina total

É formada por degradação dos eritrócitos no baço,

fígado e medula óssea. É utilizada na avaliação da

função hepática, na anemia hemolítica e na icterícia

do recém-nascido.

Hiperbilirrubinémia:

↑ Doenças hemolíticas;

↑ Doenças hepáticas;

↑ Obstrução hepática Bilirrubina direta

É a bilirrubina ligada ao ácido glucorónico, que é

excretada para a bílis de forma a ser eliminada pelo

intestino delgado.


50

4.3.5 Perfil renal

Os rins são como um sistema purificador do organismo, tornando-se o órgão de maior

importância nos mecanismos da homeostase do organismo. Este processo envolve a

filtragem do sangue, regulação do volume sanguíneo, regulação da concentração de

solutos no sangue e regulação do pH do líquido extracelular. Além disso, os rins

secretam a eritropoietina, hormona que regula a síntese dos glóbulos vermelhos na

medula óssea e têm um papel importante no controlo dos níveis de Ca2+ no sangue,

regulando a síntese da Vitamina D.

Existem quatro principais produtos de excreção, nomeadamente, a creatinina, a ureia, o

ácido úrico e a cistatina C, que por terem excreção exclusivamente renal permitem a

monitorização da função do rim (15).

Os três primeiros parâmetros referidos são determinados por espectrofotometria

imunoenzimática, enquanto a cistatina C é determinada com recurso a um ensaio

imunoturbidimétrico (9).


51

Tabela 10 - Perfil renal


Creatinina

É o produto final do metabolismo da

creatina e encontra-se essencialmente no

tecido músculo-esquelético. É filtrada no

glomérulo e secretada no túbulo proximal

do rim e só uma pequena parte é

reabsorvida sendo utilizado na avaliação da

função renal.

↑ Insuficiência renal crónica ou aguda;

↑ Toxicidade por fármacos;

↑ Exercício físico intenso;

↓ Redução da massa muscular;

↓ Distrofia muscular

Ureia

É um composto azotado intermediário do

metabolismo das proteínas e dos ácidos

nucleicos. Formada no fígado,

maioritariamente excretado pela urina por

filtração glomerular.

↑ Glomerulonefrite;

↑ Pielonefrite;

↑ Insuficiência renal aguda ou crónica;

↑ Dieta rica em proteínas;

↑ Desidratação;

↓ Insuficiência hepática aguda;

↓ Dieta pobre em proteínas

Ácido úrico

É o produto final do metabolismo das

purinas (adenina e guanina) durante a

síntese e degradação de RNA e de DNA.

↑ Insuficiência renal;

↑ Cálculos renais;

↑ Gota;

↑ Envenenamento por chumbo;

↑ Anemia Hemolítica;

↓ Defeitos tubulares renal;

↓ Défice em folatos;

↓ Doença de Wilson.

Cistatina C

A cistatina C é produzida por todas as

células nucleadas, numa taxa constante e é

praticamente toda eliminada da circulação

através da filtração glomerular.

Marcador precoce de dano renal.

A sua concentração sérica é independente da

massa muscular e do sexo no intervalo de 1

a 50 anos e, por isso, surge como um

marcador mais sensível para avaliação da

função renal.

Determinação laboratorial:

Amostras: Soro, plasma e urina


52

4.3.6 Perfil endócrino

A análise do perfil endócrino permite o estudo do funcionamento das hormonas no

organismo humano e o diagnóstico de doenças das glândulas endócrinas.

No SPC da ULS da Guarda, a determinação das diferentes hormonas é feita por

espetrofotometria e por imunoensaios de micropartículas por quimioluminescência.

➢ Hormonas sexuais

As hormonas do sistema reprodutor são segregadas principalmente pelos ovários,

testículos, placenta e lobo anterior da hipófise. Estas hormonas são fundamentais para o

desenvolvimento dos órgãos sexuais, bem como para a função sexual e reprodutora. O

estudo do perfil hormonal sexual tem em conta as seguintes hormonas: hormona

folículo-estimulante humana (FSH) e hormona luteinizante (LH), o estradiol, a

progesterona, a prolactina, a gonadotropina coriónica humana (β-HCG) e a testosterona.

A FSH e LH são segregadas pelas células gonadotróficas da hipófise anterior sob a

influência da LH-RH hipotalâmica e atuam em conjunto para provocar a estimulação

das gónadas (ovários e testículos). Na mulher, a FSH assegura a maturação folicular e

estimula as células da granulosa, que provoca a secreção dos estrogénios. A LH

desencadeia a ovulação no momento do seu pico secretório e mantém a secreção do

estradiol e da progesterona pelo corpo amarelo durante a fase luteínica. No homem, a

FSH contribui para a espermatogénese pela sua ação sobre os tubos seminíferos. A LH

atua sobre as células de Leydig que sintetizam a testosterona (16).

O estradiol é o principal estrogénio segregado durante o ciclo ovárico pelos folículos de

Graaf. É o estrogénio da mulher em período de atividade fértil.

A progesterona é produzida principalmente pelo corpo lúteo do ovário nas mulheres

com menstruação regular e em menor quantidade pelo córtex adrenal. As principais

funções da progesterona relacionam-se com a preparação do útero para a implantação

do embrião e manutenção da gravidez.

A prolactina é a hormona responsável pelo desenvolvimento e diferenciação das

glândulas mamárias e o seu aumento está associado à lactação pós-parto, mas também a

situações de hipogonadismo e infertilidade.

A β-HCG é produzida na placenta durante a gravidez e em mulheres não grávidas, o que

pode surgir aumentada em determinados tumores.

A testosterona é o principal androgénio segregado pelas células testiculares de Leydig.

A sua secreção é regulada pelas hormonas gonadotróficas hipofisárias sobre as quais a

testosterona exerce um retrocontrolo negativo.


53

Tabela 11 - Perfil endócrino

Analito Importância Clínica

Hormona folículo-estimulante humana

(FSH)

Hormona luteinizante

(LH)

Mulheres:

↑ Menopausa

↑ Hipofunção ovariana

↓ Hiperfunção ovariana.

Homens:

↑ Hipogonadismo primário

↓ Hipergonadismo.

Estradiol

O controlo dos níveis de estradiol é importante na

determinação da amenorreia, da puberdade

precoce e do início da menopausa, assim como da

infertilidade masculina e feminina.

Progesterona ↑Gravidez;

↓Infertilidade.

Prolactina

↑ Hiperprolactinémia (lactação pós-parto);

↑ Hipogonadismo;

↑ Infertilidade

Gonadotropina coriónica humana

(β-HCG)

↑ Aborto;

↑ Tumores trofoblásticos e não trofoblásticos;

↑ Tumores das células germinais com

componentes trofoblásticos.

Testosterona

↓ Hipogonadismo;

↓ Insuficiência testicular;

↓ Infertilidade;

↓ Hipopituitarismo.

➢ Hormonas da tiroide

A função tiroideia é regulada a dois níveis, pelo eixo hipotalâmico-hipofisário- tireóide,

onde intervêm a hormona libertadora de tireotrofina (TRH), a hormona estimuladora da

tiroide (TSH) e as hormonas tiroideias (T3 - triodotironina e T4- tiroxina), e pelo iodo

orgânico intraglandular, necessário à síntese das hormonas da tiroide. Em termos

laboratoriais, a análise do perfil tiroideio corresponde à determinação, por

quimioluminescência, dos valores de T3, T4, TSH e TG (tiroglobulina). A função da

hormona paratiroide é analisada tendo em conta a determinação da concentração sérica

da hormona paratiroideia (PTH) (17).

A determinação das concentrações séricas das hormonas T3 e T4 permite fazer o

diagnóstico de hipertiroidismo, com valores de T3 e T4 aumentados, e hipotiroidismo,

com hormonas da tiroide diminuídas. Como estas hormonas exercem um efeito de

“feedback” negativo no eixo hipotalâmico-hipofisário-tireóide, através dos valores de

TSH é possível fazer este diagnóstico diferencial, sendo que para esta hormona os

valores aparecem baixos no hipertiroidismo e altos no hipotiroidismo primário. Esta

hormona permite, ainda, fazer a monitorização da terapêutica com a hormona tiroideia.


54

A TG é o suporte da síntese, do armazenamento e da libertação das hormonas tiroideias

(T3 e T4). A sua concentração é proporcional à massa tiroideia, sendo útil no

diagnóstico do carcinoma da tiroide folicular metastático ou lesões inflamatórias (18).

A PTH é formada na glândula paratiroideia e tem o papel de regular a concentração de

cálcio ionizado no sangue e nos líquidos corporais, através do efluxo de cálcio dos

ossos, da reabsorção do cálcio urinário e da ativação da vitamina D, com consequente

aumento da reabsorção de cálcio nutricional pelo intestino (19).

➢ Outras hormonas de interesse clínico

O cortisol é a principal hormona glicocorticóide segregada pelo córtex suprarenal. As

suas funções incluem a regulação do metabolismo dos hidratos de carbono e a

distribuição de eletrólitos, tem um efeito imunossupressor e anti-inflamatório e é

indicador direto do estado da glândula suprarrenal e indicador indireto de hiper ou

hipofunção da hipófise (19).

A insulina é segregada pelas células dos ilhéus de Langerhans do pâncreas, é a única

hormona hipoglicemizante. Favorece o armazenamento e utilização da glicose pelo

fígado, a captação da glicose pelas células periféricas e estimula a lipogénese.

A hiperinsulinémia pode levar a hipoglicémia, que por sua vez, leva à diminuição de

insulina que está associada à diabetes, ao aumento da síntese de VLDL, à hipertensão e

a um risco aumentado de doença cardiovascular (19).

O sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) é o androgénio suprarrenal mais

abundante e funciona como neuroesteróide, produzido pelo córtex suprarrenal. As

concentrações séricas declinam com a idade e podem ser utilizadas como fator de

prognóstico em doenças graves e na progressão do cancro da mama. Aparece

aumentado no tumor suprarrenal, na hiperplasia suprarrenal congénita e na síndrome do

ovário poliquístico (19).


55

4.3.7 Metabolismo do ferro

O ferro que circula no sangue resulta de um equilíbrio entre as reservas do organismo

(essencialmente hepáticas), a absorção alimentar e a hemólise fisiológica. É um ião

presente em baixas quantidades no organismo humano, estando distribuído

maioritariamente nos eritrócitos e nos seus percursores medulares como parte

constituinte da hemoglobina, encontrando-se ligado a várias enzimas, como cofator, e

estando armazenado na forma de ferritina e hemossiderina.

O estudo do metabolismo do ferro é feito pela determinação da capacidade total de

ligação do ferro (TIBC), das concentrações do ferro, da ferritina, da transferrina, do

ácido fólico e da vitamina B12.

A TIBC é um analito que permite fazer um diagnóstico diferencial dos diferentes tipos

de anemia, pois reflete a concentração máxima de ferro que as proteínas séricas,

principalmente a transferrina, podem ligar nos seus locais de ligação ao ferro, quando

estão saturadas. Aumenta na deficiência de ferro e diminui nas desordens inflamatórias

crónicas.

O ferro é um dos constituintes da hemoglobina e está relacionado com o transporte do

oxigénio até aos tecidos, através dos eritrócitos. A determinação deste analito é útil no

diagnóstico e na monitorização de anemias ferropénicas e em situações de

hemocromatose, devendo ser acompanhada pelo estudo da ferritina e transferrina.

Aparece diminuído na anemia ferropénica, por perda crónica de sangue ou por absorção

inadequada de ferro. Já o seu aumento está associado a anemias sideroblásticas, anemias

hemolíticas, hemocromatose e talassémias.

A ferritina é uma proteína de armazenamento do ferro e abunda no fígado e nos

macrófagos. Por isso, é utilizada no diagnóstico e monitorização da anemia ferropénica

e sideroblástica, onde aparece diminuída, bem como na hemocromatose, onde esta

aparece aumentada. Por ser uma proteína de fase aguda, a ferritinia pode surgir

aumentada em processos inflamatórios agudos (20).

A transferrina é a principal proteína transportadora de ferro no soro e capta o ferro das

reservas (fígado, sistema dos macrófagos mononucleares). Como tal, aumenta nas

anemias por depleção de ferro e apresenta-se diminuída na hemocromatose.

O ácido fólico e a vitamina B12 são utilizados no diagnóstico e monitorização de

anemias megaloblásticas, sendo que o seu papel está relacionado com a síntese,

reparação e funcionamento do RNA, do DNA e de proteínas mitocondriais (21).

✓ Determinação laboratorial do ferro:

Amostras: Soro. Amostra colhida em jejum e preferencialmente pela manhã, pois sofre

variação circadiana.

Método: Espectrofotometria Visível – Ferene S + Ferro complexo corado.

✓ Determinação laboratorial da transferrina:

Amostras: Soro.

Método: Imunoturbidimetria.

✓ Determinação laboratorial da ferritina, folatos e vitamina B12:

Amostras: Soro.

Método: Quimioluminescência (CMIA).


56

4.3.8 Proteínas séricas

As proteínas séricas são parte integrante das células, fluídos e órgãos, estando

envolvidas em numerosos processos orgânicos. A avaliação da concentração de

determinadas proteínas séricas tem considerável valor diagnóstico em desordens agudas

e crónicas. Entre estas proteínas destacam-se a albumina, o valor de proteínas totais e a

proteína C-reativa (PCR), determinadas por fotometria, através de testes colorimétricos.

A albumina é a principal proteína do soro, sendo utilizada como marcador de alteração

do metabolismo proteico e no diagnóstico e na monitorização de doenças inflamatórias

crónicas e renais. Aparece aumentada em situações de hipovolémia como na

desidratação intensa e diminuída nas doenças hepáticas (diminuição da função de

síntese) e em situações de aumento do catabolismo ou baixa absorção (19).

As proteínas totais são sintetizadas no fígado e incluem a albumina e as globulinas α1,

α2, β e γ. A determinação destas é utilizada em diversos distúrbios hepáticos, renais,

metabólicos, nutricionais e relacionados com a medula óssea. São exemplos de

situações de hiperproteinémia o mieloma múltiplo, a cirrose hepática, inúmeras

situações inflamatórias, situações de hipoproteinémia, a gravidez, hepatopatias e

glomerulonefrite (19).

A PCR é uma proteína de fase aguda sintetizada no fígado numa fase precoce da reação

inflamatória sob a influência dos mediadores leucocitários dos quais o mais importante

é a interleucina I. Aparece aumentada em distúrbios inflamatórios, lesão tecidular,

infeções e situações de stress intenso (19).

Outras proteínas, de grande interesse clínico são a procalcitonia, a alfa I-antitripsina, a

ceruloplasmina, a lipoproteína A, a haptoglobina, as imunoglobulinas e as proteínas do

complemento. No SPC as determinações são feitas por turbidimetria e nefolometria.

A procalcitonina (PCT) é uma proteína produzida na tiroide, no fígado, pelos

macrófagos, no pulmão e no pâncreas. É um marcador de fase aguda para detetar

infeções, sobretudo de origem bacteriana, uma vez que nas infeções de outra origem, os

seus valores de concentração não se alteram significativamente e é um ótimo marcador

precoce de sépsis, pois possui uma rápida cinética. A PCT tem funções biológicas,

como mediador da resposta inflamatória (19).

A alfa 1-antitripsina é uma proteína sintetizada pelo fígado e está presente no plasma

numa taxa elevada. A principal função é a inibição de proteases, principalmente a

elastase. Esta protege os tecidos do corpo de serem danificados pela enzima elastase,

presente nos neutrófilos, monócitos e eosinófilos, quando estas entram em ação aquando

de uma inflamação em alguma parte do corpo. As suas pequenas dimensões permitem-

lhe que se difunda nos fluidos corporais facilmente (19).

A ceruloplasmina é uma glicoproteína de origem hepática que assegura o transporte do

cobre no plasma. É uma proteína de fase aguda e a sua principal utilização clínica é no

diagnóstico diferencial de várias doenças hepáticas e da doença de Wilson, a qual é

acompanhada pela diminuição dos níveis séricos de ceruloplasmina (19).

A lipoproteína A é uma lipoproteína funcional, que é considerada um fator de risco

independente para a doença coronária, cerebrovascular, vascular periférica e

tromboembolismo venoso. A sua função fisiológica não é ainda conhecida, no entanto

parece possuir uma função no sistema de coagulação, pois apresenta grande homologia

com o plasminogénio e com o fator ativador do plasminogénio tecidual. Pois esta

proteína compete com o plasminogénio pelas zonas de ligação, levando a uma

fibrinólise reduzida. Estimula também a secreção do inibidor do ativador do

plasminogénio, levando a tromboembolismos (19).


57

A haptoglobina é uma glicoproteína plasmática de fase aguda sintetizada no fígado, que

se liga à hemoglobina, quando esta é libertada por hemólise, formando um complexo

muito estável com a hemoglobina. É importante a nível do controlo de processos

inflamatórios locais, assim como para avaliar a severidade da patologia hemolítica.

Além disso, o complexo haptoglobina-hemoglobina age como uma peroxidase,

hidrolisando os peróxidos libertados durante a fagocitose e impedindo a peroxidação

lipídica. Tem também um papel bacteriostático ao impedir que as bactérias utilizem o

ferro da hemoglobina (19).

As imunoglobulinas são glicoproteínas produzidas pelos plasmócitos em resposta a um

antigénio e que funcionam como anticorpos. Encontram-se presentes nas membranas

dos linfócitos B, conferindo assim especificidade antigénica a estas células, que ao

circularem pelo sangue neutralizam antigénios ou marcam-nos para serem eliminados

(19). Existem três tipos de imunoglobulinas:

✓ A imunoglobulina A (IgA) é a imunoglobulina mais abundante a nível das

secreções externas, como o leite materno, saliva, lágrimas e secreções

gastrointestinais e brônquicas e apresenta uma função importante na proteção do

trato respiratório e do trato genito-urinário contra infeções;

✓ A imunoglobulina G (IgG) é a principal imunoglobulina presente no sangue,

sendo produzida em grandes quantidades durante a resposta imunitária,

desempenhando um papel importante na neutralização de toxinas bacterianas e

na fagocitose de microrganismos;

✓ A imunoglobulina M (IgM) é a primeira classe de imunoglobulinas a ser

produzida pelos recém-nascidos. A sua concentração nos fluídos intracelulares é

baixa devido às suas grandes dimensões. Sendo que esta imunoglobulina

participa na resposta imunitária primária e esta característica permite perceber se

a infeção é aguda ou crónica.

As imunoglobulinas são compostas por quatro cadeias peptídicas, duas cadeias leves

(Kappa e Lambda) e duas cadeias pesadas. A região amino-terminal das cadeias leves e

pesadas variam de anticorpo para anticorpo, conferindo assim diferentes especificidades

entre anticorpos, pois é nesta região que tem lugar a ligação antigénica. A produção de

cadeias leves Kappa é normalmente duas vezes maior do que a produção de cadeias

leves do tipo Lambda. Estes valores de cadeias Kappa e Lambda são importantes para o

diagnóstico e monitorização de algumas patologias, como hepatopatias e mieloma

múltiplo. A principal aplicação da quantificação das cadeias leves reside na

identificação do carácter monoclonal ou policlonal da proliferação de plasmócitos ou de

células linfoides (19).

As proteínas do Complemento C1q, C3, C4 e CH50 são um grupo de proteínas séricas

que identificam e destroem os agentes infeciosos por lise, por opsonização ou por

recrutamento de células fagocíticas e que promovem inflamação. Estas proteínas são

úteis no diagnóstico de inflamações crónicas não infeciosas, doenças sistémicas,

distúrbios necróticos, glomerulonefrite, pneumonia, meningite bacteriana e septicémia

(19).

✓ Determinação laboratorial:

Amostras: Soro e plasma.


58

4.3.9 Marcadores cardíacos

O enfarte do miocárdio é uma das várias manifestações clínicas associadas à falta de

oxigénio no miocárdio por insuficiência circulatória coronária. A falta de oxigénio

resultante pode causar danos nas células cardíacas e libertação de proteínas no sangue,

designados marcadores cardíacos.

Os biomarcadores cardíacos são um elemento fundamental para o diagnóstico das

síndromes coronárias agudas, uma vez que, a avaliação clínica é frequentemente

limitada em sintomas atípicos e, por vezes, o eletrocardiograma inicial não permite o

diagnóstico por si só. O conhecimento do padrão de subida destas substâncias no sangue

periférico e dos seus valores de referência é fundamental para uma utilização adequada

em contexto clínico, pois fornecem informação prognóstica e permitem uma melhor

orientação terapêutica (22). No laboratório do SPC a determinação destes marcadores é

feita com recurso a imunoensaios de micropartículas por quimioluminescência.

A creatinina-quinase (CK) é uma enzima inespecífica do músculo cardíaco que é

utilizada no diagnóstico e monitorização de doenças associadas ao músculo cardíaco,

músculo esquelético, sistema nervoso central e tiroide. Por sua vez, a creatinina-quinase

- MB (CKMB) é uma isoenzima da CK específica do músculo cardíaco e, por isso, o

aparecimento da CK-MB no soro, na ausência de traumatismo muscular grave, pode

indicar danos cardíacos e, por conseguinte, enfarte agudo do miocárdio.

O BNP é um peptídeo natriurético sintetizado e libertado na corrente sanguínea em

resposta a uma sobrecarga de volume ventricular ou a patologias causadoras de

dilatação ventricular, para controlar a homeostasia dos fluidos e eletrólitos. Níveis

plasmáticos de BNP fornecem informações úteis para o diagnóstico e tratamento da

disfunção do ventrículo esquerdo e insuficiência cardíaca, bem como para avaliar a

gravidade da insuficiência cardíaca (22).

A mioglobina é a proteína de ligação do oxigénio do músculo cardíaco e do músculo

esquelético. A sua determinação fornece um índice de lesão do miocárdio, sendo

utilizado para avaliação inicial de pacientes com suspeita de enfarte agudo do miocárdio

(22).

A troponina T (TnT) é uma proteína que pertence ao complexo do aparelho contráctil

miofibrilar do músculo estriado, que regula a força e rapidez da sua contração. A sua

libertação e elevação na circulação ocorre 4 a 6 horas após lesão cardíaca (22).

✓ Determinação laboratorial:

Amostras: Soro ou plasma


59

4.3.10 Marcadores tumorais

Marcadores tumorais são substâncias usadas como indicadores de malignidade, que

passam de células neoplásicas ao sangue, à urina e aos tecidos biológicos. A sua

presença é um indicador importante para o rastreio e diagnóstico de tumores,

monitorização da eficiência da terapêutica, deteção precoce de recidivas e

estabelecimento do prognóstico, quando utilizados com outros meios (23).

Os marcadores tumorais mais utilizados na clínica são a alfa-fetoproteína, o antigénio

125 do cancro (CA 125), o antigénio total específico da próstata (PSA Total), o

antigénio carbohidrato (CA 19.9), o antigénio carcinoembrionário (CEA), o antigénio

15.3 do cancro (CA 15.3) e o marcador CYFRA 21.1

No SPC a metodologia para o doseamento dos marcadores tumorais é feito por

imunoensaio de micropartículas por quimioluminescência (CMIA).

A alfa-fetoproteína é uma proteína fetal sintetizada pelo fígado, saco vitelino e trato

gastrointestinal, utilizada como marcador de defeitos do tubo neural no feto em

desenvolvimento, do carcinoma hepatocelular e do carcinoma das células germinativas.

O antigénio CA 125 é um antigénio glicoproteico de superfície da família das mucinas,

secretado a partir da superfície das células tumorais do ovário. É útil na avaliação da

terapia e monitorização do cancro dos ovários, bem como de neoplasias do pulmão,

mama, pâncreas e colón.

O antigénio PSA Total é uma glicoproteína sintetizada na glândula da próstata sendo

indicativa de patologias na mesma.

O antigénio CA 19.9 é uma glicoproteína do tipo mucina e de elevado peso molecular.

Permite a monitorização do tratamento e prognóstico do cancro do pâncreas, bem como

do cancro nos ductos biliares, do colón e do recto.

O antigénio CEA é uma glicoproteína pertencente ao grupo dos antigénios carcinofetais

que são produzidos durante o período embrionário. Encontra-se sobretudo no trato

gastrointestinal e no soro do feto. Também é indicativo de outros tumores, como é o

caso do cancro do pulmão, cancro da tiroide e cancro do colon.

O antigénio CA 15.3 é um antigénio tipo mucinoso. É um marcador específico do

cancro da mama, bem como do estômago e ovário. É reconhecido por dois anticorpos

monoclonais, um dirigido contra uma fração rica em antigénios membranares do cancro

da mama, o outro contra as lipoproteínas do leite humano.

O Antigénio CYFRA 21.1 é um antigénio de alta sensibilidade para o carcinoma de

células escamosas, sendo um fator de mau prognóstico no carcinoma do pulmão.


60

4.3.11. Monitorização de drogas terapêuticas

A monitorização de drogas terapêuticas é a medida do nível sérico de um fármaco de

forma a garantir uma concentração dentro do intervalo terapêutico. O intervalo

terapêutico sérico de um fármaco é o intervalo de concentrações no qual se sabe que a

droga é eficaz e não causa efeitos tóxicas no paciente. Atualmente defende-se que a

monitorização sérica da terapêutica por si só não é suficiente para um correto

acompanhamento do doente e que é necessário fazer em simultâneo o controlo clínico

de inúmeros biomarcadores de previsão que permitem verificar a ação tóxica do

fármaco ao nível dos órgãos. Esta monitorização é importante essencialmente em

fármacos que apresentam doses terapêuticas estreitas (24).

No SPC faz-se a monitorização por fotometria e por imunoensaio de micropartículas por

quimioluminescência, os seguintes fármacos:

✓ Carbamazepina – antiepiléptico;

✓ Valproato de sódio – antiepiléptico;

✓ Lítio – antidepressivo;

✓ Antidepressivos tricíclicos;

✓ Digoxina - glicosídeo cardíaco;

✓ Teofilina – broncodilatador;

✓ Vancomicina – antibiótico;

✓ Gentamicina – antibiótico;

✓ Tobramicina – antibiótico;

✓ Amicacina – antibiótico;

✓ Paracetamol – analgésico;

✓ Salicilatos - anti-inflamatório.


61

4.3.12. Controlo de drogas de abuso

Drogas de abuso são substâncias que modificam, aumentam, inibem ou reforçam as

funções fisiológicas, psicológicas ou imunológicas do organismo de maneira transitória

ou permanente (24). Inúmeras drogas de abuso podem ser determinadas no SPC da ULS

da Guarda, neste caso por fotometria com recurso a ensaios imunoenzimáticos:

✓ Canabinóides (Marijuana e/ou haxixe): produzem efeitos alucinogénios e

outros efeitos biológicos;

✓ Anfetamina/metanfetamina: em doses elevadas causam excitação no sistema

nervoso central, euforia, agilidade, apetite reduzido e uma sensação de energia e

potência elevadas;

✓ Metadona: narcótico utilizado para diminuir dores excessivas, sendo também

utilizada no tratamento do vício da heroína;

✓ Fenciclidina (PCP): conhecido como “pó de anjo”, produz sintomas clínicos

que vão desde a confusão, desorientação, estupor, coma e morte, em casos de

sobredosagem;

✓ Opiáceos: substâncias derivadas do ópio, produzem analgesia, e em doses

elevadas produzem euforia, estados hipnóticos e dependência;

✓ Benzodiazepinas: grupo de fármacos ansiolíticos, usados em caso de ansiedade,

insónias, convulsões e epilepsia. Doses elevadas levam a sonolência, tonturas,

letargia e coma;

✓ Cocaína: estimulante e anestésico, age diretamente no sistema nervoso central.

O seu uso provoca aumento de energia, inquietude e tremores;

✓ Álcool etílico: atua inicialmente como estimulante, tendo de seguida efeitos

depressivos sobre o sistema nervoso central. O consumo excessivo de álcool

leva a dependência física e psíquica.


62

4.3.13 Outros analitos sanguíneos

Um conjunto de outros analitos sanguíneos é analisado devido à sua importância clínica.

Exemplo disso são adenosina desaminase (ADA), enzima conversora da angiotensina

(SACE), lactato, homocisteína e vitamina D (19).

A adenosina desaminase (ADA) é a enzima conversora da adenosina em inosina, uma

enzima envolvida no metabolismo das purinas, e está distribuída em todo o organismo

apresentando um papel importante no sistema imune, pois possui alta atividade nos

linfócitos T e macrófagos. Útil no diagnóstico da tuberculose, da mononucleose

infeciosa, da febre tifoide, da sarcoidose crónica ativa e da Síndrome da

Imunodeficiência Adquirida (SIDA), situações em que esta enzima aparece aumentada.

A enzima conversora da angiotensina (SACE) é produzida principalmente nas células

epiteliais pulmonares, onde converte angiotensina I em angiotensina II que, por sua vez,

estimula a glândula adrenal para a produção de aldosterona. Muito útil no diagnóstico

de doenças vasculares, no diagnóstico e monitorização de sarcoidose, como auxiliar no

diagnóstico de lepra ou na doença de Gaucher.

O lactato é um dos produtos finais da glicólise anaeróbia, que ocorre em tecidos onde há

hipoxia, o que pode acontecer em doenças como pneumonia e insuficiência cardíaca

congestiva.

A homocisteína é um aminoácido produzida pela desmetilação intracelular da metionina

que circula no plasma. A hiperhomocisteinémia é um fator de risco de trombose venosa

e arterial e pode ser agravada pela deficiência de cofatores do metabolismo da

metionina como a vitamina B6, a vitamina B12 e o ácido fólico. Também induz uma

disfunção endotelial (com perda das propriedades vasodilatadoras e antitrombóticas

dependentes do endotélio) e proliferação do músculo liso vascular, ambos processos-

chave nos modelos atuais de aterogénese e trombose (15).

A vitamina D é uma vitamina lipossolúvel, obtida a partir do colesterol, podendo ser

sintetizada na pele quando esta é exposta a radiação ultravioleta B. Tem funções ao

nível do desenvolvimento e manutenção do tecido ósseo, assim como na manutenção da

hemóstase normal do cálcio e do fósforo. Esta vitamina também estimula o papel dos

osteoclastos, induzindo a reabsorção óssea através destes, aquando da libertação de

cálcio, de modo a manter os níveis extracelulares de cálcio. O doseamento de vitamina

D é utilizado para avaliar potenciais insuficiências desta vitamina.


63

4.3.14 Análise de Urinas

A urianálise é um grupo de exames químicos e microscópicos à urina. É uma das provas

mais comuns nos laboratórios de análises clínicas, sendo muito útil no diagnóstico de

doenças renais e do trato urinário. Hoje em dia existem soluções completas de análises

da sumária de urina e do sedimento urinário que permitem trabalhar de forma

automatizada (19).

➢ Sumária de urina - Urina tipo II

A análise sumária de urina é feita por fotometria de refletância num aparelho totalmente

automatizado (Urisys 2400) para medições semi-quantitativas in vitro de tiras de teste

de urina. Um feixe de luz incide sobre a banda reativa e a luz é refletida com uma

intensidade que depende da cor da banda. Os resultados dos testes baseiam-se na leitura

da intensidade da luz refletida. Permite a determinação semi-quantitativa de pH,

leucócitos, nitritos, proteínas, glucose, corpos cetónicos, urobilinogénio, bilirrubina e

sangue na urina. Também permite a determinação da densidade específica (por

refratometria), cor e aspeto de cada amostra (por turbidimetria).

➢ Sedimento urinário

A análise do sedimento urinário é feita através de um equipamento totalmente

automatizado (UF-1000i) para quantificação do sedimento urinário. Utiliza a tecnologia

de citometria de fluxo fluorescente em dois canais de medição dedicados para a

contagem de partículas de urina e bactérias. Esta tecnologia permite diferenciar de

forma precisa partículas de uma amostra heterogénea através da projeção de um feixe de

luz sobre as partículas presentes que foram marcadas previamente com fluorocromos e

consequente medição da luz dispersa e da fluorescência característica de cada partícula.

O UF-1000i permite, desta forma, quantificar o número de células epiteliais escamosas,

células do epitélio renal, leucócitos, eritrócitos, bactérias, leveduras na forma de

gémula, espermatozóides, cilindros, cilindros patológicos, cristais e muco.


64

4.4 Fase Pós-analítica

A fase pós-analítica consiste na validação dos resultados, emissão do boletim dos

resultados e entrega dos resultados ao doente/médico. Esta fase é posterior ao

processamento de cada amostra e permite assegurar que o resultado foi obtido em

condições técnicas satisfatórias e é compatível com o processo do doente. Após uma

observação correta dos dados, e caso não se suspeite de nenhum erro, procede-se à

validação dos resultados anteriormente obtidos. Sempre que haja dúvidas relativamente

aos resultados obtidos deve-se repetir as análises.

O processo de validação biopatológica de resultados é realizado no software do SPC,

sendo da responsabilidade dos farmacêuticos especialistas do serviço.


65

5. Controlo de Qualidade

O laboratório tem implementado um Sistema de Controlo de Qualidade que monitoriza

as variáveis essenciais relativas aos ensaios, ou seja, ajuda a entender se existe algum

problema a nível técnico ou a nível do processamento da amostra, para que se proceda a

medidas corretivas, se necessário. Neste âmbito existem dois programas, o controlo de

qualidade interno e o controlo de qualidade externo.

5.1 Controlo de Qualidade Interno

O controlo de qualidade interno, tanto no laboratório de Bioquímica como no de

Microbiologia, deve ser realizado antes do início de cada sessão de trabalho e cada vez

que se proceda à alteração das condições de trabalho, como mudança de lote de

reagentes ou determinadas manutenções dos equipamentos. Para proceder a este

controlo utiliza-se amostras conhecidas que permite avaliar a precisão de todos os

procedimentos, ou seja, o desempenho diário dos equipamentos e se não existe algum

problema a nível técnico ou a nível do processamento da amostra. De modo a interpretar

os resultados obtidos aquando da realização do controlo interno, são construídos

gráficos de Levey-Jennings que são avaliadas de acordo com as regras de Westgard.

Os gráficos de Levey-Jennings representam a dispersão dos valores do controlo em

torno do seu valor alvo em função do seu desvio padrão e permitem de uma forma

rápida avaliar se o valor obtido se encontra dentro dos valores limites do controlo. Estes

gráficos são construídos por uma linha central correspondente ao valor médio do

analito, e por várias linhas respeitantes aos valores limite do controlo estabelecidos,

expressos na forma do valor médio mais ou menos o desvio padrão.

As regras de Westgard permitem interpretar os dados das amostras controlo presentes

nos gráficos de Levey-Jennings, e através da combinação de vários critérios de decisão,

julgar se os valores obtidos por um determinado método são confiáveis. Existem seis

regras de Westgard, divididas em regras de aviso e de rejeição (Tabela 12).


66

Tabela 12 - Descrição das Regras de Westgard. Fonte: SPC da ULS da Guarda.

Regra de Westgard Significado da regra

1:2s

Regra de aviso, indica a ocorrência de um erro aleatório e é quebrada quando o valor

da amostra controlo ultrapassa o intervalo delimitado pela média mais ou menos dois

desvios padrão.

1:3s

Regra de rejeição, indica a ocorrência de um erro aleatório grave ou o início de um

erro sistemático grave, e é quebrada quando o valor da amostra controlo ultrapassa o

intervalo delimitado pela média mais ou menos três desvios padrão.

2:2s

Regra de rejeição, indica a ocorrência de um erro sistemático e é quebrada quando os

valores de duas amostras de controlo ultrapassam o intervalo delimitado pela média

mais ou menos dois desvios padrão, do mesmo lado da média.

R:4s

Regra de rejeição, indica a ocorrência de um erro aleatório grave, e é quebrada

quando a diferença entre dois valores de duas amostras controlo consecutivas é

superior a quatro vezes o valor do desvio padrão.

4:1s

Regra de rejeição, indica a ocorrência de um erro sistemático, e é quebrada quando os

valores de quatro amostras controlo ultrapassam o intervalo delimitado pela média

mais ou menos um desvio padrão.

10:χ

Regra de rejeição, indica a ocorrência de um erro sistemático, e é quebrada quando os

valores de dez amostras controlo consecutivas se situam no mesmo lado da média.


67

5.2 Controlo de Qualidade Externo

O controlo de qualidade externo é feito por uma entidade exterior ao laboratório, a qual

envia amostras a vários e diferentes laboratórios, permitindo, deste modo, a avaliação

do desempenho de um laboratório em comparação com outros laboratórios. Existem

vários programas de avaliação externa disponíveis. No SPC da ULS da Guarda são

utilizados o UK NEQAS, o LabQuality e o INSTAND.

As amostras recebidas são processadas nas mesmas condições das amostras dos

pacientes, e os resultados são enviados posteriormente para a entidade referida. A

entidade externa, após realizar o tratamento dos dados provenientes de todos os

laboratórios participantes, transmite um relatório onde consta a apreciação dos

resultados obtidos pelo nosso laboratório. Dependendo dos resultados, caso se verifique

uma discrepância significativa dos nossos resultados em relação à média dos resultados

obtidos pelos outros laboratórios, é necessário a implementação de ações corretivas e/ou

preventivas de modo a melhorar o desempenho do nosso laboratório.

Este sistema de avaliação permite garantir a qualidade dos resultados obtidos pelo nosso

laboratório, promovendo a confiança dos utentes, do pessoal clínico e dos profissionais

de saúde que trabalham no SPC.


68

6- Conclusão

Este estágio como parte integrante do Mestrado de Análises Clínicas foi essencial para

consolidar os conhecimentos teóricos e aplicá-los na prática laboratorial de forma a

desenvolver recursos individuais e capacidades técnicas.

As análises clínicas são um dos mais importantes meios de diagnóstico complementares

pois através da recolha de materiais biológicos como urina, sangue, fezes, expetorações

ou outros produtos biológicos permite diagnosticar patologias ou doenças, visto que

estas se manifestam através de alterações analíticas que enquadradas com a clínica

permitem tirar conclusões acerca do estado de saúde do doente.

Os laboratórios de análises clínicas são estruturas muito complexas, cujo funcionamento

exige a aquisição de equipamentos muito dispendiosos, a contratação de pessoal

qualificado, o cumprimento de normas de instalação e funcionamento igualmente

complexas e a implementação de um sistema da qualidade específico.

Todo este percurso contribuiu de forma essencial para a articulação dos conhecimentos

teóricos com a sua aplicação prática, visando a compreensão da contextualização dos

vários achados laboratoriais, da importância dos mesmos e da necessidade de uma

observação crítica antes de validar um resultado e transmiti-lo ao clínico.


69

7. Bibliografia

1-Unidade Local de Saúde de Guarda - Página inicial. [Em linha]. Disponível em

<http://www.ulsguarda.min-saude.pt/> [Consultado em 10/06/2019].

2-Barroso, H., Silvestre, A. e Taveira, N. (2014). Microbiologia Médica – Volume 1.

Lisboa, Lidel – edições técnicas.

3 - Fonseca, A., et al (2004). Orientações para a Elaboração de um Manual de Boas

Práticas Laboratoriais em Bacteriologia. Programa Nacional de Controlo da Infecção

(PNCI) - Instituto Nacional de Saúde, Dr. Ricardo Jorge, Observatório Nacional da

Saúde (ONSA).

4 -Murray, P., Rosenthal, K. e Pfaller, M. (2006). Diagnóstico Laboratorial de Doenças

Bacterianas, in Microbiologia Médica, 5th ed., Eds. Elsevier Editora Ltda.

5 - Forbes, B., Sahm, D. e Weissfeld, A. (2007). Bailey & Scott's Diagnostic

Microbiology. 12Th Edition.

6 – Sousa, J., Cerqueira, F. e Abreu, C. (2005). Microbiologia protocolos laboratoriais.

Porto, Edições Universidade Fernando Pessoa.

7 – Boyd, D. e Hawker, C. (2012). “Automation in the Clinical Laboratory,” in Tietz

Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 5th ed., Eds. Elsevier.

8- Ayus, C. e Caramelo, C. (2006). Agua, electrolitos y equilibrio ácido-base:

aprendizaje mediante casos clínicos. Ed. Médica Panamericana.

9- Wallach, J. (2009). Analitos Sanguíneos Principais, in interpretaçao de Exames

Laboratoriais, 8th ed., Ed. Guanabara Koogan.

10 - Corcuera, R. et al (2017). Dislipidemias, in Manual de Medicina de Laratorio para

Atención Primária, Eds.

11- Pocock, G. e Richards, C. (2006). Sistema Digestório, in Fisiologia Humana, Eds.

Guanabara Koogan.

12 - Working Group IAP/APA Acute Pancreatitis Guidelines (2013). IAP/APA

evidence-based guidelines for the management of acute pancreatitis, Pancreatology,

vol. 13, no. 4.

13 -Direção-Geral da Saúde, Diagnóstico e Classificação da Diabetes Mellitus, Norma

da Direção Geral da Saúde, 2011.

14- Direção-Geral da Saúde, Diagnóstico e conduta na Diabetes Gestacional, Norma da

DGS, no. Diabetes, 2011.

15 – Pocock, G. e Richards, C. (2006). O Rim e a Regulação do Meio Interno, in

Fisiologia Humana, 2nd ed., Eds. Guanabara Koogan.


70

16 – Beatriz, M. e Latronico, A. (2001). O Papel dos Receptores das GN na Reprodução

Feminina, Arq Bras Endocrinol Metab, vol. 45.

17 – Ansoain, J. e Uche, A. (2017). Alterationes de la Functión Tiroidea, in Manual de

Medicina de Laratorio para Atención Primária, Eds. AEBM-ML.

18 – Wallach, J. (2007). Doenças Endócrinas, in Interpretação de Exames

Laboratoriais, 8th ed., Ed. Guanabara Koogan.

19 – Williamson, M. e Snyder, L. (2009). Interpretação de Exames Laboratoriais,

Oitava. Editora Guanabara Koogan S.A.

20- Wallach, J. (2007). Hematologia, in Interpretaçao de Exames Laboratoriais, 8th

ed., J. Wallach, Ed. Guanabara Koogan.

21 – Metz, J. (1963). Folates in megaloblastic anaemia., Bull. World Health Organ.,

vol. 28.

22 – Henriques, S. et al. Biomarcadores cardíacos nas síndromes coronárias agudas,

Med. Interna Rev. DA Soc. Port. Med. INTERNA, vol. 13.

23 – Sacher, R. e McPherson, R. (2001). Widmann - Interpretação Clínica dos Exames

Laboratoriais, Manole.

24- Snozeke, C., McMillin, G. e Moyer, T. (2012). Therapeutic Drugs and Their

Management, in Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 5th

ed., Eds. Elsevier.


71




carbapenemases


Dissertação orientada pela Professora Doutora Maria Aida da Costa e Silva

da Conceição Duarte e coorientada pela Doutora Fátima Maria Madureira

Vale


2019


72

Resumo

Nos últimos anos tem surgido bactérias altamente resistentes, em especial as resistentes

aos “antibióticos de última linha”, como os carbapenemos. Em primeiro plano temos a

as Enterobacterales, nomeadamente a espécie Klebsiella pneumoniae e Escherichia

coli,, seguida das estirpes de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp., como um

dos exemplos mais problemático de resistência aos carbapenemos. Estas resistências

constituem um problema grave para a saúde pública e uma ameaça às economias da

Europa e do mundo pondo em causa a segurança dos doentes.

Nenhum consenso ainda foi alcançado sobre o método de deteção ideal devido aos

diferentes mecanismos de resistência entre os diferentes tipos de carbapenemases. O uso

de métodos fenotípicos conjugados com métodos moleculares, a utilizar quando

possível, pode melhorar bastante a deteção de estirpes produtoras de carbapenemases

em comparação com o uso de um único método.

O tratamento mais apropriado para tratar estirpes resistentes aos carbapenemos ainda é

discutível. Na maioria dos estudos defende-se a terapia combinada em vez da

monoterapia.

É essencial a formação em boas práticas de prevenção e controlo da infeção,

nomeadamente aos profissionais de saúde, assim como sensibilizar as pessoas de modo

a usarem os antibióticos apenas quando estritamente necessário para diminuir a taxa de

resistências.

Uma implementação concertada de medidas em todo o mundo, incluindo melhorias no

controlo e na prevenção de infeções em hospitais e outras instituições de saúde e a

utilização mais prudente de antibióticos pode oferecer uma solução a longo prazo.

O objetivo da presente dissertação inclui uma revisão do grupo de carbapenemos e seus

mecanismos de resistência, analisar a situação epidemiológica e fatores de risco das

infeções por bactérias produtoras de carbapenemases em Portugal e na Unidade Local

de Saúde da Guarda e rever os métodos de deteção e os fármacos utilizados no

tratamento de bactérias produtoras de carbapenemases. Pretende-se também destacar

medidas de prevenção e uso racional de antibióticos.

Palavras-chave: Antibióticos; Bactérias; Carbapenemos; Carbapenemases;

Enterobacterales


73

Abstract

In recent years, highly resistant bacteria have emerged, especially those resistant to

"last-line antibiotics" such as carbapenems. In the foreground we have the

Enterobacterales, namely Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli, followed by the

strains of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp., as one of the most

problematic examples of resistance to carbapenems. Such resistance is a serious

problem for public health and a threat to the economies of Europe and the world and put

at risk patient safety.

No consensus has yet been reached on the optimal detection method due to the different

resistance mechanisms between carbapenemases. The use of phenotypic methods

combined with molecular methods, when possible, can greatly improve the detection of

carbapenemase producing strains compared to the use of a single method.

The most appropriate treatment for treating carbapenem resistant strains is still

debatable. In most studies it advocates combination therapy rather than monotherapy.

Training of good infection prevention and control practices, particularly for health

professionals, is essential, as well as sensitizing people to use antibiotics only when

necessary to reduce the rate of resistance.

A concerted implementation of measures around the world, including improvements in

the control and prevention of infections in hospitals and other health institutions, and the

more prudent use of antibiotics may offer a long-term solution.

The objective of the present monograph includes a review of the carbapenem group and

its resistance mechanisms, to analyze the epidemiological situation and risk factors of

the infections caused by carbapenemases bacteria in Portugal and the Guarda Local

Health Unit and to review the methods of detection and the drugs used in the treatment

of carbapenemase-producing bacteria. It is also intended to highlight measures of

prevention and rational use of antibiotics.

Keywords: Antibiotics; Bacteria; Carbapenems; Carbapenemases; Enterobacterales


74

Índice

Resumo ........................................................................................................................................ 72

Abstract ....................................................................................................................................... 73

Lista de Figuras ........................................................................................................................... 75

Lista de Tabelas ........................................................................................................................... 77

Lista de Abreviaturas, Acrónimos, Siglas e Símbolos ................................................................ 78

1.Introdução ................................................................................................................................ 80

2. Antibióticos β-lactâmicos ........................................................................................................ 81

2.1 Composição química ............................................................................................................. 81

2.2 Mecanismo de acção dos β-lactâmicos ................................................................................. 81

2.2.1 Carbapenemos .................................................................................................................... 82

2.3 Mecanismos de resistência .................................................................................................... 83

2.3.1Modificação dos alvos (PBPs) ............................................................................................ 83

2.3.2 Bombas de efluxo ............................................................................................................... 84

2.3.3 Impermeabilização da membrana externa .......................................................................... 84

2.3.4 Hidrólise enzimática dos β-lactâmicos por β-lactamases ................................................... 85

2.4 Classificação das β-lactamases.............................................................................................. 85

2.4.1 β-lactamases da Classe A ................................................................................................... 86

2.4.2 β-lactamases da classe B .................................................................................................... 86

2.4.3 β-lactamases da classe D .................................................................................................... 87

3. Epidemiologia ......................................................................................................................... 88

4. Factores de Risco .................................................................................................................... 95

5. Métodos de deteção ................................................................................................................. 96

6. Estirpes produtoras de Carbapenemases na ULS da Guarda ................................................ 101

7. Tratamento ............................................................................................................................ 115

8. Prevenção e perspetivas futuras ............................................................................................ 119

9. Conclusão .............................................................................................................................. 122

10. Bibliografia ......................................................................................................................... 123


75

Lista de Figuras

Figura 1 - Estrutura química de um antibiótico carbapenemo. Fonte: Adaptado de Sousa, J.,

2006. ............................................................................................................................................ 82

Figura 2 - Percentagem de isolados de Escherichia coli resistentes aos carbapenemos em

diversos países europeus, em 2017. Fonte: Surveillance of antimicrobial resistance in Europe,

2017. ............................................................................................................................................ 89

Figura 3 - Gráfico da evolução da taxa de resistência a carbapenemos da Escherichia coli em

Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas of Infectious Diseasesdo, ECDC. ........ 89

Figura 4 - Percentagem de isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenemos em


2017. ............................................................................................................................................ 90

Figura 5 - Gráfico da evolução da taxa de resistência a carbapenemos da Klebsiella pneumoniae

em Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas of Infectious Diseases, ECDC. ...... 91

Figura 6 - Percentagem de isolados de Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenemos

em diversos países europeus, em 2017. Fonte: Surveillance of antimicrobial resistance in

Europe, 2017. .............................................................................................................................. 91

Figura 7 - Gráfico da evolução da taxa de resistência a carbapenemos da Pseudomonas

aeruginosa em Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas of Infectious Diseases do

ECDC. ......................................................................................................................................... 92

Figura 8 - Percentagem de isolados de Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenemos em


2017. ............................................................................................................................................ 92

Figura 9 - Evolução da taxa de resistência a carbapenemos da Acinetobacter spp. aeruginosa em

Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas of Infectious Diseases, ECDC ............. 93

Figura 10 - Distribuição do uso de β- lactâmicos no setor hospitalar em Portugal, em 2017

Fonte: ESAC-Net, ECDC. ........................................................................................................... 93


76

Figura 11 - RAPIDEC® CARBA NP. Fonte: Adaptado de Tamma P. and Simner P., 2018 ..... 97

Figura 12 - CIM - Resultado positivo para a presença de carbapenemase e resultado negativo.

Fonte: Adaptado de Tamma, P. e Simner, P., 2018. ................................................................... 98

Figura 13 - Evolução do número de estirpes produtoras de carbapenemases na ULS de 2016 a

2018. Fonte: SPC da ULS da Guarda. ....................................................................................... 103

Figura 14 - Percentagem de estirpes produtoras de carbapenemases isoladas na ULS- Guarda, de

2016 a 2019 (Janeiro a Agosto). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ............................................ 105

Figura 15- Número de estirpes produtoras de carbapenemases nos diferentes produtos

biológicos, desde 2016 a 2019 (Janeiro a Agosto). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ................ 106

Figura 16 - Evolução da percentagem de resistência dos variados antibióticos, de 2016 a 2018.

Fonte: SPC da ULS da Guarda. ................................................................................................. 110

Figura 17 - Algoritmo sugerido para escolha de antibiótico em paciente com bacteremia de

Enterobacterales resistente a carbapenêmicos. Fonte: Alhashem, F. et al., 2017. .................... 117

Figura 18 - Evolução ao longo do tempo da taxa global de adesão à higiene das mãos nos 5

momentos de 2011 a 2016. Fonte: PPCIRA/DGS. Dados Globais Plataforma das PBCI, Higiene

das Mãos. 2016. ......................................................................................................................... 120

Figura 19 - Metas de Saúde para 2020. Fonte: DGS, Programa de prevenção e controlo de

infeções e de resistência aos antimicrobianos - 2017. ............................................................... 121


77

Lista de Tabelas

Tabela 1 -Consumo Global de antibacterianos para uso sistémico em Portugal e na Europa, entre

2012 e 2016. Fonte: ECDC: Summary of the latest data on antibiotic consumption in the

European Union- ESAC-Net Surveillance data, 2017. ............................................................... 94

Tabela 2 - Consumo de carbapenemos nos hospitais públicos portugueses entre 2012 e 2016.

Fonte: INFARMED, 2016. .......................................................................................................... 94

Tabela 3 - Número de isolados provenientes do Hospital Sousa Martins (HSM) e do Hospital

Nossa Senhora da Assunção (HNSA), nos anos 2016, 2017, 2018, 2019 (Janeiro a Agosto).

Fonte: SPC da ULS da Guarda. ................................................................................................. 102

Tabela 4 - Perfil fenotípico do doente (Caso clínico 1). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ........ 104

Tabela 5 - Perfil fenotípico do doente (Caso clínico 2). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ........ 107

Tabela 6 - Perfil fenotípico do doente (caso clínico 3). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ......... 107

Tabela 7 - Perfil do doente 1 (Caso clínico 4). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ....................... 109

Tabela 8 - Perfil fenotípico do doente 2 (caso clínico 4). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ...... 109

Tabela 9 - Perfil fenotípico do doente (caso clínico 5). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ......... 110

Tabela 10 - Perfil fenotípico do doente (caso clínico 6). Fonte: SPC da ULS da Guarda. ....... 111




78

Lista de abreviaturas

ABC – ATB -Binding cassete

AmpC - β-lactamases AmpC (cefalosporinases)

CIM - Método de inativação de carbapenemos

CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute

CMI -Concentração mínima inibitória

CSP - Cuidados de saúde primários

DGS - Direção Geral de Saúde

DHD - Doses diárias definidas por mil habitantes por dia

dNTPs - Trifosfatos de desoxinucleotídeos

ddNTPs - Trifosfatos de didesoxinucleotídeos

EARS-Net - Rede Europeia de Vigilância da Resistência Antimicrobiana

ECDC - Centro Europeu de Prevenção e Controlo das Doenças

EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético

EEA - Área Econômica Europeia

ESAC-Net - European Surveillance of Antimicrobial Consumption Network

ESBL- β-lactamases de largo espectro

EU - União Europeia

EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

GES - Guiana extended spectrum

GIM - German imipenemase

HNSA – Hospital Nossa Senhora da Assunção

HSM – Hospital Sousa Martins

IC - Ensaios imunocromatográficos

IMI - Imipenem hydrolyizing beta-lactamase

IMP – Imipenemase Metaloβlactamase

KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase


79

MALDI-TOF - Matrix-Assisted Laser Desorption⁄Ionisation Time-Of-Flight Mass

Spectrometry

MATE – Multidrug and toxic compound extrusion

MBL - metalo-β-lactamases

MFS – Major facilitator superfamily

NDM - New Delhi Metallo-β-lactamase

NMC - Non-metalloenzyme carbapenemase

OMPs - Outer membrane proteins

OXA-48 - Oxacilinase-48

PAPA - Programa de Apoio à Prescrição Antibiótica

PBPs- Penicillin-Binding-Proteins

PCR - Reação em cadeia da polimerase

PPCIRA – Programa de Prevenção e Controlo de Infeções e de Resistência aos

Antimicrobianos

RND – Resistance-nodulation-division

SIM - Seoul imipenemase metalo-beta-lactamase

SME - Serratia marcescens enzyme

SMR – Small multidrug resistance

SPM - São Paulo metalo-beta-lactamase

TSA - Testes de suscetibilidade antimicrobiana

UCI - Unidade de cuidados intensivos

UDP-NAG - uridinodifosfato N–acetilglucosamina

UDP-NAMA - uridinofosfato-ácido N-acetilmurâmico

ULS – Unidade local de saúde

VIM - Verona Integron-encoded Metallo-β-lactamase

WGS - Sequenciação do genoma completo


80

1.Introdução

Durante mais de setenta anos a era antimicrobiana foi marcada por sucessivas

descobertas de uma ampla gama de antibióticos e o subsequente surgimento de

resistência a antibióticos. A resistência bacteriana continua a aumentar, e nas indústrias

farmacêuticas não se verifica o desenvolvimento de novos antibióticos e é provável que

assim seja nos próximos anos (1).

Nos últimos anos, o surgimento e a propagação de bactérias altamente resistentes, em

especial as resistentes a antibióticos de última linha como, os carbapenemos e as

polimixinas, nomeadamente a colistina, constituem um problema grave para a saúde

pública e uma ameaça à segurança dos doentes. Até há bem pouco tempo, estes

antibióticos eram eficazes no tratamento adequado dos focos e tipos de infeção para os

quais estavam recomendados. Atualmente, esta certeza já não existe e a possibilidade de

resistência aos carbapenemos leva à procura de outras opções terapêuticas, incluindo a

utilização de antimicrobianos que praticamente foram abandonados da prática clínica

(2).

Os principais microrganismos responsáveis pela propagação da resistência a

carbapenemos, abrangem estirpes de Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. e as

Enterobacterales, destacando-se a espécie Klebsiella pneumoniae (3). Os doentes infetados com bactérias resistentes a antibióticos têm uma probabilidade

mais elevada de desenvolverem complicações, sendo até três vezes mais provável que

morram em resultado da infeção. Em 2050, estima-se que o número global de mortes

provocadas por este tipo de estirpes possa atingir os 10 milhões por ano se não forem

tomadas medidas (4). Na Europa, os hospitais gastam, em média, entre 10 000 a 40 000

euros adicionais no tratamento de cada doente infetado com uma bactéria

multirresistente (5).

Apenas uma implementação concertada de medidas em todo o mundo, incluindo

melhorias no controlo e na prevenção de infeções em hospitais e outras instituições de

saúde, e também a utilização mais prudente de antibióticos, pode oferecer uma solução

de longo prazo. Uma das medidas mais importantes seria a triagem ativa de doentes de

risco em relação a bactérias altamente resistentes que entram nos nossos hospitais.


81

2. Antibióticos β-lactâmicos

2.1 Composição química

Os antibióticos β-lactâmicos constituem o grupo de antibióticos mais usados em todo o

mundo e incluem as penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenemos.

Todos estes antibióticos têm um anel β-lactâmico comum e agem similarmente ligando

e inativando as proteínas de ligação à penicilina (PBPs), que são responsáveis pela

formação da parede celular da bactéria.

Nas penicilinas o anel beta-lactâmico encontra-se unido a um anel de tiazolidina,

enquanto nas cefalosporinas aquele anel existe associado a um anel de di-hidrotiazina.

Os antibióticos monobactâmicos têm a particularidade de possuírem na sua molécula

um grupo 2-oxoazetidina-1-sulfónico.

A classe dos carbapenemos é diferente dos outros beta-lactâmicos porque em vez de

possuir um átomo de enxofre (S) no anel tiazolidina, possui um carbono (C) e uma

dupla ligação (6).

2.2 Mecanismo de acção dos β-lactâmicos

Os antibióticos β-lactâmicos são classificados como antibióticos antiparietais e inibem a

biossíntese do peptidoglicano na sua fase terminal, impedindo a transpeptidação, ou

seja, inibem o estabelecimento de pontes interpeptídicas (cross-linking) entre cadeias

peptídicas vizinhas do peptidoglicano recém-sintetizado. O peptidoglicano faz parte da

parede celular bacteriana, conferindo rigidez à célula e protecção a alterações

osmóticas. A sua destruição torna as bactérias mais susceptíveis à lise quando presente

em ambientes hipotónicos.

A biossíntese do peptidoglicano passa por três fases: fase citoplasmática, fase

membranar e fase parietal. Na fase citoplasmática ocorre a síntese de UDP-NAG

(uridinodifosfato N–acetilglucosamina) e UDP-NAMA-pentapeptídeos (uridinofosfato-

ácido N-acetilmurâmico), pois são as unidades básicas formadoras do peptidoglicano.

Na fase membranar ocorre o transporte de UDP-NAG e UDP-NAMA-pentapeptídeos

através da membrana citoplasmática, com ajuda do lípido membranar – bactoprenol (-

álccol isoprenóide C55 fosforilado), formando o par NAG-NAMA-pentapeptídeo. Na

fase parietal, inicia-se a incorporação do precursor NAG-NAMA-pentapeptídeo no

peptidoglicano pré-formado, estabelecendo-se assim inicialmente ligações glicosídicas

β (1-4) com o peptidoglicano já existente e em seguida ligações peptídicas entre o

último resíduo de glicina e o 4º aminoácido da cadeia peptídica vizinha. Isto pressupõe a

intervenção das enzimas D-D-carboxipeptidases-transpeptidases, localizadas no folheto

externo da membrana citoplasmática. Estas enzimas envolvidas são denominadas PBPs

(Penicillin-Binding-Proteins) devido à sua grande afinidade para as penicilinas. Existem


82

também as autolisinas, que requerem a quebra de ligações covalentes no peptidoglicano

já existente, para se formar um novo peptidoglicano (6).

A entrada destes antibióticos na célula bacteriana está directamente relacionada com a

estrutura e composição da parede, a qual vai ser diferente nas bactérias Gram positivo e

Gram negativo.

Nas bactérias de Gram positivo o peptidoglicano é o principal constituinte da parede

celular. A membrana citoplasmática, neste caso encontra-se justaposta à parede e é nesta

estrutura que estão inseridos os alvos dos antibióticos beta-lactâmicos – PBPs no folheto

externo.

Nas bactérias de Gram negativo, a parede celular apresenta-se mais estratificada, sendo

constituída por camadas de lipopolissacarídeos e fosfolípidos, onde se inserem poros

constituídos por porinas (proteínas) sob as quais se encontra a camada de

peptidoglicano. E entre esta camada e a membrana citoplasmática existe o espaço

periplásmico. Neste tipo de bactérias é no folheto externo da membrana citoplasmática

que se localizam os PBP (6).

2.2.1 Carbapenemos

Entre os β-lactâmicos, os carbapenemos são os mais eficazes, ao ponto de lhe chamarem

“gorilamicina”, contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo

anaeróbios. Apresentam um amplo espectro de atividade antibacteriana, dada a sua

facilidade de difusão através dos canais de porina da membrana externa (o carbapenemo

é uma moléculta zwitteriónica) e elevada estabilidade à hidrólise por β-lactamases

(TEM-1, SHV-1, ESBLs, IRT). Possuem uma estrutura única que é definida por um

carbapenemo acoplado ao anel β-lactâmico que confere protecção contra a maioria das

β-lactamases (Figura 1) (6).

Figura 1 - Estrutura química de um antibiótico carbapenemo. Fonte: Adaptado de

Sousa, J., 2006.


83

A resistência aos carbapenemos em Enterobacterales pode ser causada pela presença de

Carbapenemases, ESBL ou Oxacilinases combinadas com a diminuição de

permeabilidade devida à alteração dos canais de porina (por mutações ou expressão

diminuída). Estas enzimas hidrolisam quase todos os β-lactâmicos, conferindo

concentrações mínimas inibitórias (CMIs) elevadas ao carbapenemo codificadas por

genes que são transferíveis por plasmídeos ou transposons e associados a genes que

codificam para outras resistências (7). Além disso, apresentam menos efeitos adversos,

são mais seguros de usar do que outros fármacos de última linha, como as polimixinas.

Por estas razões, o surgimento e disseminação rápida através de todos os continentes de

resistência aos carbapenemos, principalmente entre bactérias Gram-negativas, como K.

pneumoniae, P. aeruginosa e Acinetobacter spp., constitui um problema de saúde

pública importante e contínuo em todo o mundo. (8)

2.3 Mecanismos de resistência

A resistência aos antibióticos β-lactâmicos tem vindo aumentar devido às más práticas a

eles associados e constituem um problema grave para a saúde pública. É preocupante as

bactérias patogénicas adquirirem essas resistências.

As bactérias escapam ao efeito bacteriolítico dos antibióticos beta-lactâmicos por quatro

mecanismos diferentes: modificação dos alvos (PBPs), bombas de efluxo,

impermeabilização da membrana externa e por fim hidrólise enzimática dos beta-

lactâmicos por beta-lactamases (6).

2.3.1Modificação dos alvos (PBPs)

Este tipo de mecanismo de resistência surge através de substituições aminoacídicas na

proteína que constitui o alvo do antibiótico, as PBPs. Na maioria das situações, a

proteína torna-se menos susceptível à ligação com o agente antimicrobiano. Apesar de

este facto ter sido observado em bactérias de Gram negativo, este mecanismo de

resistência é encontrado essencialmente em bactérias de Gram positivo, nomeadamente

nas estirpes MRSA (Staphylococcus aureus resistente à meticilina). Esta resistência

aparece por mutação do gene mecA, que se encontra no cromossoma e codifica a síntese

de PBP2.

A modificação destas proteínas (transpeptidases) pode ser conseguida por um dos

quatro mecanismos: substituição aminoacídica, que promove a diminuição da afinidade

entre antibiótico e PBP; aquisição de novas PBPs; existência de proteínas resultantes da

recombinação entre genes que codificam PBPs associadas à expressão de

suscetibilidade e PBPs que conduzem à resistência ao antibiótico e por fim a

hiperprodução da proteína com consequente aumento do nível de resistência aos

antibióticos beta-lactâmicos (6).


84

2.3.2 Bombas de efluxo

Este tipo de mecanismo pode não ser suficiente para expressar resistência clínica,

porém, em conjunto com outros mecanismos pode originar falências terapêuticas. A

resistência é frequentemente causada pelo aumento da síntese das proteínas, que

constituem a bomba, devido por exemplo, a mutações que ocorrem nos repressores

transcricionais destas proteínas. As mutações que podem ocorrer nestes genes podem

levar a um aumento da eficiência do transporte dos antibióticos para o exterior da

célula.

As bombas de efluxo podem ter afinidade para diversos antibióticos, pelo que são

frequentemente associadas a multirresistência.

As bombas de efluxo têm sido agrupadas em cinco famílias, de acordo com a sua

sequência em aminoácidos, a família ABC (ATB-binding cassete), família MFS (Major

facilitator superfamily), família RND (Resistance-nodulation-division), família SMR

(Small multidrug resistance) e a família MATE (Multidrug and toxic compound

extrusion). Os sistemas de transporte tipo MFS predominam nas bactérias Gram

positivo e os sistemas RND e MATE nas bactérias Gram negativo (6).

2.3.3 Impermeabilização da membrana externa

A resistência aos antibióticos está também relacionada com a diminuição da

permeabilidade que ocorre na membrana exterior das bactérias de Gram negativo. O

fluxo de moléculas para o interior da célula é assegurado através de complexos de

proteínas da membrana, denominadas OMPs (Outer membrane proteins), os quais

formam canais de porina. A carga, estrutura e dimensão influenciam a passagem de

moléculas para o interior da célula. Algumas das moléculas que utilizam este percurso

são os antibióticos para atingirem o interior da célula bacteriana ou no caso dos

antibióticos beta-lactâmicos, o espaço periplásmico.

As porinas clássicas são trímeros estáveis que produzem grande permeabilidade a

moléculas neutras, hidrofílicas e de baixo peso molecular (até 600Da). Além destas,

ainda existem as porinas monoméricas que permitem uma difusão lenta e não específica

(por exemplo OmpA de Escherichia coli e OprF de P. aeruginosa).

Por exemplo, em E. coli as proteínas OmpF, OmpC e OmpE são vulgarmente

associadas a resistência aos antibióticos. A perda destas, por mutação dos genes, pode

verdadeiramente causar a diminuição da suscetibilidade a vários antibióticos. A

Pseudomonas aeruginosa não possui porinas clássicas na membrana externa, como tal,

os canais de porina específicos (por exemplo OprD-canal de aminoácidos básicos) têm

um papel importante na entrada de nutrientes. Os antibióticos carbapenemos também

atravessam a membrana externa através dos canais OprD, por isso a modificação da

expressão das OprD2 ou a ausência que ocorre em algumas estirpes de P. aeruginosa

justificam a sua resistência aos carbapenemos (6).


85

2.3.4 Hidrólise enzimática dos β-lactâmicos por β-lactamases

O principal mecanismo de resistência aos antibióticos β-lactâmicos consiste na

degradação de antibióticos por enzimas, β-lactamases, que promovem a clivagem do

anel β-lactâmico (ligação CO-N) no espaço periplásmico.

As β-lactamases podem actuar por dois mecanismos: utilização de serina e iões de zinco

capazes de desencadear a ruptura do anel β-lactâmico e utilização da via éster-serina, no

caso das restantes classes de β-lactamases.

As serino-β-lactamases (têm serina no centro activo) associam-se ao antibiótico de uma

forma não-covalente e quebram a ligação amida do anel β-lactâmico, por parte do grupo

hidróxilo da cadeia lateral de um resíduo serina do sítio activo da enzima, originando

um acil-éster covalente. A hidrólise deste éster vai por fim libertar a enzima, que se

encontra activa e disponível para hidrolisar outras moléculas de antibiótico, enquanto o

antibiótico se encontra hidrolisado e inactivo.

As metalo-β-lactamases têm iões zinco no centro activo e têm um largo espectro

degradando os carbapenemos, sendo conhecidas por carbapenemases. Diferem das

serino-β-lactamases porque não há a formação do intermediário peniciloilenzima,

fazendo o ataque directo ao anel beta-lactâmico.

As β-lactamases dependendo da sua especificidade são muitas vezes chamadas

penicilinases, cefalosporinases e carbapenemases. As β-lactamases são os principais

determinantes da resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos.

Os mecanismos de resistência aos carbapenemos podem estar dependentes de

carbapenemases, enzimas que hidrolisam os carbapenemos e outros antibióticos β-

lactâmicos (β-lactamases), e os que não dependem da presença de carbapenemases.

Dentro do segundo grupo, encontram-se outros tipos de β-lactamases, as β-lactamases

AmpC (cefalosporinases), Oxacilinases, β-lactamases de largo espectro (ESBLs), e

mecanismos não enzimáticos, como a perda de porinas da membrana externa e o

aumento da expressão de bombas de efluxo (6,10).

2.4 Classificação das β-lactamases

As carbapenemases são β-lactamases que tem a capacidade de hidrolisar quase todos os

antibióticos β-lactâmicos manifestando ainda resistência à acção dos inibidores das β-

lactamases (por exemplo ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam).

As β-lactamases podem ser agrupadas de acordo com as características funcionais ou de

acordo com as características moleculares.

A classificação funcional classifica estas enzimas em quatro grupos fundamentais, de 1

a 4, com vários subgrupos dentro do grupo 2, baseando-se nas propriedades

bioquímicas, na estrutura molecular e na sequência de nucleotídeos. As maiorias das

carbapenemases encontram-se nos grupos 2f e 3 (9).


86

A classificação molecular de Ambler classifica as β-lactamases em quatro classes de A

a D, baseando-se na sequência dos nucleotídeos que se reflete na homologia dos

aminoácidos nestas enzimas. As classes A, C e D possuem um centro activo enzimático

que é constituído pelo aminoácido serina. Na classe B, também conhecida pelas metalo-

β-lactamases (MBL), o centro activo é composto por um ião zinco (Zn2+). Pela sua

frequência, pode-se realçar a KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) na classe A,

a NDM-1 (New Delhi Metallo-β-lactamase-1), a VIM (Verona Integron-encoded

Metallo-β-lactamase) e a IMP (Imipenemase) na classe B, família das metalo-β-

lactamases (MBL), e a OXA-48 (oxacilinase-48) na classe D, família das oxacilinases

ou enzimas tipo OXA (6).

As classes A, B e D são as que têm uma importância clínica maior quando presentes em

microrganismos associados a infecções a cuidados de saúde.

2.4.1 β-lactamases da Classe A

As β-lactamases da classe A caracterizam-se pelo facto do seu mecanismo hidrolítico

necessitar de uma serina na posição 70. Esta classe inclui as penicilinases e

cefalosporinases dos grupos TEM, SHV e CTX-M (que não hidrolisam carbapenemos)

e também as ESBL e carbapenemases. Estas β-lactamases podem ser cromossómicas ou

plasmídicas.

Em geral, as enzimas cromossómicas conferem resistência aos carbapenemos, mas, por

vezes, algum grau de suscetibilidade às cefalosporinas de terceira e quarta gerações,

enquanto que as enzimas codificadas em plasmídeos geralmente conferem resistência a

todos os β-lactâmicos (9).

As enzimas SME (Serratia marcescens enzyme), NMC (non-metalloenzyme

carbapenemase) e IMI (imipenem hydrolyizing beta-lactamase) são codificadas por

genes cromossomais. As enzimas codificadas por genes plasmídicos como exemplo as

GES (Guiana extended spectrum) identificada na P. aeruginosa e na K. pneumoniae a

KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase).

A carbapenemase da classe A, a mais importante, na prática clínica, é a KPC que

confere resistência à maioria dos β-lactâmicos. A KPC pode ser transmitida da K.

pneumoniae a outros géneros como Salmonella spp., Citrobacter spp., Serratia spp. e

Enterobacter spp. e a espécie E. coli (9, 15).

2.4.2 β-lactamases da classe B

As carbapenemases da classe B ou metalo-β-lactamases (MBL) caracterizam-se pela

capacidade de hidrolisar todos os β-lactâmicos excepto o aztreonam, pela resistência a

todos os inibidores de β-lactamases e pela suscetibilidade à inibição pelo ácido

etilenodiaminotetracético (EDTA), um quelante de catiões metálicos.

As famílias mais comuns das MBL inclui IMP (Imipenemase Metaloβlactamase), VIM

(Verona integron-encoded metalo-beta-lactamase), SPM (São Paulo metalo-beta-


87

lactamase), GIM (German imipenemase), SIM (Seoul imipenemase metalo-beta-

lactamase), NDM (New Deli metalo-beta-lactamase) que foram encontradas em

diversos géneros de Enterobacterales, nomeadamente Klebsiella spp., Escherichia spp.,

Citrobacter spp., Serratia spp. e Enterobacter spp. As MBL podem ser cromossómicas

ou plasmídicas (adquiridas). As adquiridas estão codificadas em integrões localizados

em plasmídeos e são transferíveis entre géneros (9).

2.4.3 β-lactamases da classe D

As carbapenemases da classe D também referidas como enzimas tipo OXA,

caracterizam-se pela capacidade preferencial de hidrolisar a oxacilina. Estas enzimas

apresentam uma suscetibilidade variável aos carbapenemos e aos inibidores das β-

lactamases. O mecanismo de hidrólise é semelhante as carbapenemases da classe A,

sendo mediado pelo aminoácido serina no centro activo da enzima (9).

Esta classe é constituída por cinco subfamílias principais com actividade hidrolítica

sobre os carbapenemos, a OXA-23, OXA24/OXA-40, OXA-48, OXA-58, OXA-143, e

OXA-51, sendo as cinco primeiras codificadas em plasmídeos e a última é

cromossómica. A maioria das estirpes de A. baumannii resistentes aos carbapenemos

são produtoras de OXA-23, -24, -40 ou -58. Enquanto, as Enterobacterales com OXA-

48 tem suscetibilidade variada aos carbapenemos (9,15).


88

3. Epidemiologia

A colonização ou infeção por estirpes produtoras de carbapenemases é um problema

frequente e relevante no contexto dos cuidados de saúde, em meio hospitalar ou na

comunidade nos casos de doentes com história de exposição frequente a cuidados de

saúde (16). Neste sentido, os hospitais, mas principalmente os lares e as unidades de

cuidados continuados parecem ser reservatórios importantes deste tipo de agentes,

contribuindo através das múltiplas transferências de doentes entre instituições de saúde

para a disseminação destas estirpes (17).

Em todo o mundo, os primeiros relatos de carbapenemases ocorreram na década de

1980. A sua propagação levantou uma série de preocupações, o que coincidiram com

anos em que não foi desenvolvido nenhum novo antibiótico contra bactérias Gram-

negativas. O Japão relatou a primeira carbapenemase de um isolado de Aeromonas

hydrophila nos anos 80. Seguiu-se Londres (1982) com a SME-1, a IMI-1 na Califórnia

(1984) e NMC-A na França (1990), ambos em estirpes de Enterobacter cloacae. Em

1996, nos Estados Unidos foi identificada a KPC, alertando assim para o controlo de

propagação da resistência aos carbapenemos (18).

Em Portugal, foram reportadas pela primeira vez em 1998 estirpes produtoras de

carbapenemases, numa estirpe de P. aeruginosa produtora de VIM-2 e numa estirpe de

A. baumannii produtora de IMP-5 (19,20). A primeira estirpe resistente foi reportada

num estudo de 2005, tratando-se duma K. oxytoca produtora de VIM-2 (21). Em 2009,

foi identificada a primeira carbapenemase do tipo KPC, numa estirpe de K. pneumoniae

produtora de KPC-3 (22). Entre 1998 e 2003, foram identificadas as primeiras

carbapenemases do tipo OXA em A. baumannii (23).

O ECDC (Centro Europeu de Prevenção e Controlo das Doenças) emitiu em 2018 um

relatório onde apresenta resultados baseados em dados de resistência antimicrobiana de

bactérias, que causam infecções graves, comunicados à Rede Europeia de Vigilância da

Resistência Antimicrobiana (EARS-Net) por 30 países da União Europeia (UE) e da

Área Econômica Europeia (EEA). Os dados referem-se a 2017 e a análise de tendências

de dados reportados pelos países participantes no período de 2014 a 2017.


89

Neste relatório o ECDC concluiu que a resistência aos carbapenemos era rara em E.

coli. Sendo, mais elevada a prevalência na Grécia (1,6%) e Chipre (1,3%) e inferior a

0,4% na maioria dos países (Figura 2) (11). No entanto, a monitorização contínua e

rigorosa continua a ser essencial, uma vez que a E. coli resistente aos carbapenemos

facilmente se propaga nos locais de saúde e na comunidade.

Em Portugal, verifica-se uma taxa oscilante entre 2006 e 2016, um aumento a partir de

2016, e valores relativamente baixos em 2017(0,3%) (Figura 3) (11, 25).

Figura 2 - Percentagem de isolados de Escherichia coli resistentes aos carbapenemos

em diversos países europeus, em 2017. Fonte: Surveillance of antimicrobial resistance

in Europe, 2017.

Figura 3 - Gráfico da evolução da taxa de resistência a carbapenemos da Escherichia

coli em Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas of Infectious

Diseasesdo, ECDC.


90

Em relação à K. pneumoniae, o relatório do ECDC de 2017, mostrou que a taxa de

resistência a carbapenemos, nesta estirpe, era particularmente elevada na Grécia, onde

registou, dados impressionantes de 64,7%, seguida de Itália com 29,7% e Roménia com

22,5% (Figura 4) (11).

Em Portugal, num estudo de 2012, num hospital universitário de Lisboa, mostrou uma

produção de carbapenemases que ocorre em apenas 5,3% das estirpes de K. pneumoniae

estudadas (24). No entanto, a análise da base de dados Surveillance Atlas of Infectious

Diseases da EARS-Net permite verificar uma tendência crescente da taxa de resistência

aos carbapenemos da K. pneumoniae, a nível nacional, com uma percentagem de 8,6%

em 2017 (Figura 5) (25).

O Surveillance Atlas of Infectious Diseases da EARS-Net é uma ferramenta que

interage com os últimos dados disponíveis sobre várias doenças infeciosas. A interface

permite que os utilizadores interajam e manipulem os dados para produzir uma

variedade de tabelas e mapas. A informação contida no conjunto de dados fornecido

através do atlas é disponibilizada pelo ECDC agrupando dados dos Estados Membros

recolhidos através do Sistema Europeu de Vigilância.

Figura 4 - Percentagem de isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes aos

carbapenemos em diversos países europeus, em 2017. Fonte: Surveillance of

antimicrobial resistance in Europe, 2017.


91

Em 2017, a taxa de resistência da P. aeruginosa aos carbapenemos tem maior

incidência nos países do sudeste europeu, sobretudo na Roménia com uma percentagem

de 63,4%, seguida da Letónia com 57,1% e por fim Eslováquia com 47%. Estas

percentagens diminuiram significativamente entre 2014 e 2017 (Figura 6) (11).

Figura 5 - Gráfico da evolução da taxa de resistência a carbapenemos da

Klebsiella pneumoniae em Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas

of Infectious Diseases, ECDC.

Figura 6 - Percentagem de isolados de Pseudomonas aeruginosa resistentes

aos carbapenemos em diversos países europeus, em 2017. Fonte: Surveillance

of antimicrobial resistance in Europe, 2017.


92

Em Portugal, a taxa de resistência manteve-se aproximadamente constante e estável,

tendo vindo a diminuir a partir de 2014, apresentando assim uma percentagem de 18,3%

em 2017 (Figura 7) (11, 25).

Em 2017, a taxa de resistência da Acinetobacter spp. aos carbapenemos tem maior

incidência nos países bálticos e do sul e sudeste Europa, sobretudo na Croácia com uma

percentagem de 96,2%, seguida da Grécia com 94,8% e por fim Lituânia com 88,5%

(Figura 8) (11).

Figura 7 - Gráfico da evolução da taxa de resistência a carbapenemos da Pseudomonas

aeruginosa em Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas of Infectious

Diseases do ECDC.

Figura 8 - Percentagem de isolados de Acinetobacter spp. resistentes aos

carbapenemos em diversos países europeus, em 2017. Fonte: Surveillance of

antimicrobial resistance in Europe, 2017.


93

Figura 9 - Evolução da taxa de resistência a carbapenemos da Acinetobacter spp. em

Portugal, entre 2006 e 2017. Fonte: Surveillance Atlas of Infectious Diseases, ECDC.

Em Portugal a taxa de resistência aos carbapenemos foi de 40,7% em 2017, de 51,9%

em 2016, 57,7% em 2015 e de 53,1 em 2014, tendo vindo a diminuir (Figura 9) (11,

25).

A tendência para o desenvolvimento da resistência parece acompanhar um consumo

exagerado de antimicrobianos, nomeadamente de carbapenemos. A European

Surveillance of Antimicrobial Consumption Network (ESAC-Net), um sistema europeu

de vigilância epidemiológica do consumo de antimicrobianos do ECDC, mostra um

gráfico do consumo de antibióticos no setor hospitalar na Europa em 2017, no qual 41%

corresponde ao consumo de cefalosporinas de terceira geração, seguido de 20,9% de

carbapenemos, uma situação anormal, dado que os carbapenemos são considerados

antibióticos de última linha (Figura 10) (26).

Figura 10 - Distribuição do uso de β- lactâmicos no setor hospitalar em

Portugal, em 2017 Fonte: ESAC-Net, ECDC.


94

Na tabela 1 indica-se os dados do consumo global de antibióticos em Portugal, expresso

em DHD (doses diárias definidas por mil habitantes por dia). Desde 2012 a 2016, este

consumo quer nos cuidados de saúde primários (CSP), quer nos hospitais têm se

mantido abaixo da média na União Europeia. No entanto, nos CSP mantém-se, num

nível elevado (21,6), ligeiramente menor que da média Europeia (21,9) (98).

Entre 2012-2016, o consumo de carbapenemos nos Hospitais públicos portugueses

sofreu uma diminuição (em 13,3%) (Tabela 2) (98).

Tabela 2 - Consumo de carbapenemos nos hospitais públicos portugueses entre

2012 e 2016. Fonte: INFARMED, 2016.

Figura 5- RAPIDEC® CARBA NP. Fonte: Adaptado de Tamma P. and Simner P.,

2018Tabela 13 - Consumo de carbapenemos nos hospitais públicos portugueses

entre 2012 e 2016. Fonte: INFARMED, 2016.

Tabela 1 - Consumo Global de antibacterianos para uso sistémico em Portugal e na

Europa, entre 2012 e 2016. Fonte: ECDC: Summary of the latest data on antibiotic

consumption in the European Union- ESAC-Net Surveillance data, 2017.


95

4. Factores de Risco

Os factores de risco que estão associados à colonização ou infecção por bactérias

resistentes aos carbapenemos e/ou produtoras de carbapenemases são variados, sendo os

mais relevantes a exposição a cuidados de saúde e a utilização de antimicrobianos (27).

Nomeadamente no que diz respeito às estirpes de K. pneumoniae resistentes aos

carbapenemos e/ou produtoras de KPC, um dos factores mais importante é a história de

tratamento anterior com alguns antibióticos como os carbapenemos, cefalosporinas,

fluoroquinolonas, algumas penicilinas de espectro alargado, inibidores das beta-

lactamases, vancomicina e metronidazol (28).

Outros factores como a imunossupressão, a gravidade da doença, a história de múltiplos

procedimentos invasivos, a idade avançada, a existência de comorbilidades, bem como a

história de internamento hospitalar anterior, tempo de internamento prolongado,

internamento em unidade de cuidados intensivos, ventilação mecânica, feridas abertas

ou transplantação recente são também importantes, nomeadamente para a aquisição de

Enterobacter spp. ou K. pneumoniae produtora de KPC (29,30, 31).

Ainda a presença de cateter biliar é um factor de risco para a aquisição de E. coli

resistentes aos carbapenemos (30).

Por vezes, encontram-se associações epidemiológicas curiosas entre os fatores de risco e

os tipos de carbapenemases. Por exemplo, um estudo espanhol encontrou uma maior

associação de estirpes produtoras de OXA-48 em lares e enfermarias e de estirpes

produtoras de MBL com internamento em unidade de cuidados intensivos (UCI) (32).

Portanto, a emergência rápida da resistência a carbapenemos por toda a Europa também

se deve provavelmente, e sobretudo, à sua utilização excessiva, muito pela disseminação

de microrganismos produtores de ESBL, nos quais os carbapenemos são uma alternativa

terapêutica (11). Pode-se concluir que qualquer antibiótico de largo espetro pode

contribuir, por pressão seletiva, para a resistência a carbapenemos (31,33). Esta é uma

noção crucial, com implicações profundas nos programas de contenção na prescrição de

antibióticos.

Em novembro de 2013, a Direção Geral de Saúde (DGS) determinou a criação e

implementação do Programa de Apoio à Prescrição Antibiótica (PAPA) em todas as

instituições de prestação de cuidados do Serviço Nacional de Saúde com o objetivo de

anular a utilização de antibióticos em situações onde são empregues sem indicação ou

por tempo superior ao indicado (34).


96

5. Métodos de deteção

A identificação rápida de estirpes produtoras de carbapenemases é crucial para melhorar

as medidas de controlo de infeção, na decisão terapêutica adequada e para minimizar a

disseminação desses microrganismos resistentes. O espectro variável da hidrólise das

carbapenemases, bem como o seu perfil fenotípico variável de suscetibilidade aos

antimicrobianos e a presença simultânea de outros mecanismos, geralmente de

resistência aos β-lactâmicos, dificultam a sua identificação (35). Como tal a sua deteção

representa um desafio substancial para muitos laboratórios clínicos. Logo, o

desenvolvimento de métodos de deteção mais rápidos tem grande importância, pois

torna possível a introdução precoce da terapêutica mais adequada, já que o tratamento

empírico inicial pode ter consequências (36).

Os métodos utilizados para detetar as carbapenemases incluem métodos fenótipos e

métodos moleculares. Ambos os métodos apresentam diferentes técnicas para detetar

estas enzimas. Os métodos fenotípicos detetam a atividade das enzimas, com ensaios

baseados em crescimento, métodos colorimétricos rápidos e ensaios

imunocromatográficos. Os métodos moleculares oferecem informação adicional através

da deteção do gene responsável pela resistência (37).

Nos dias de hoje, a maioria dos laboratórios de análises clínicas, após identificação e

análise do perfil de resistência característico, realiza testes de suscetibilidade

antimicrobiana (TSA), métodos colorimétricos (por exemplo CarbaNP) e moleculares

(por PCR). Estes métodos permitem fornecer informações acerca da estirpe causadora

da infeção, assim como a sua suscetibilidade a diversos antimicrobianos e detetar

diferentes mecanismos de resistências (38).

O padrão de suscetibilidade por difusão de disco é considerado um método de primeira

linha para deteção de carbapenemases. O ertapenem foi descrito como o indicador mais

sensível para a atividade de carbapenemases (39). As concentrações mínimas inibitórias

(CMI) dos antibióticos determinadas de acordo com as normas definidas pela European

Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ou o Clinical Laboratory

Standards Institute (CLSI) podem ser usados como método confirmatório de resistência.

A CMI pode ser determinada por métodos de diluição em meio de cultura sólido ou

líquido que estão na base dos métodos simplificados e automatizados, E-test e Vitek,

respectivamente. Os breakpoints devem ser interpretados de acordo com EUCAST ou

CLSI (37).

Associado à determinação da CMI podem ser feitos testes de sinergia com os inibidores

de β-lactamases, nomeadamente ácido borónico para detecção de KPC, ácido

dipicolínico ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para as MBLs, ácido

clavulânico para as ESBLs, cloxacilina para as AmpC e avibactam para testes multi-

disco OXA-48 (40).

Os meios cromogénicos são considerados entre os melhores métodos de triagem para

deteção rápida de bactérias com elevada resistência aos carbapenemos (41). Eles são

baseados em um substrato enzimático cromogénico e antimicrobianos específicos que

os tornam seletivos para uma resistência específica. Existem vários tipos de meios


97

suplementados com carbapenemos que são usados para detetar estirpes produtoras de

carbapenemases (por exemplo CHROMagar KPC) (42).

O CarbaNP é um teste fenotípico colorimétrico utilizado para detetar bacilos gram

negativos produtores de carbapenemases. O teste baseia-se na deteção da hidrólise do

carbapenemo (imipenemo) por estirpes produtoras de carbapenemases. A hidrólise

acidifica o meio, resultando na mudança de cor do indicador de pH (vermelho de fenol).

Após a incubação por um período máximo de 2 horas a leitura realiza-se visualmente,

através da comparação de um poço de controlo sem imipenemo com um poço de reação

com imipenemo (Figura 11) (43). O Carba NP tem sido recomendado pelo CLSI e pelo

EUCAST como teste confirmatório para estirpes produtoras de carbapenemases (44).

Algumas publicações referem problemas de sensibilidade em isolados com fenótipo

mucoide e para algumas Enterobacterales produtoras de OXA-48 (45).

O método de inativação de carbapenemos (CIM) é um método fenotípico que deteta in

vitro a inativação do carbapenemo por estirpes resistentes aos carbapenemos. Consiste

numa suspensão de colónias bacterianas em água contendo discos de carbapenemos

(geralmente 10μg meropenem) e incubada por 2 h. O disco de meropenem é

posicionado em Mueller-Hinton agar (MHA) inoculado com uma estirpe de E. coli

sensível ao carbapenemo. Após pelo menos 6 horas de incubação, é medida a zona de

inibição. Se não existir um halo em torno do disco, significa que há produção de

carbapenemase, caso contrário, o microrganismo não é produtor de carbapenemases

Figura 11 - RAPIDEC® CARBA NP. Fonte: Adaptado de Tamma P. and Simner P.,

2018


98

(Figura 12) (46). Alguns estudos demonstram que o CIM é mais preciso do que o Carba

NP na deteção de estirpes produtoras de carbapenemases (47).

Os ensaios imunocromatográficos (IC) foram recentemente desenvolvidos e

comercializados para a deteção precisa de carbapenemases em culturas bacterianas.

Esses testes usam tecnologia baseada em ligação anticorpo-antígeno para capturar

antígenos específicos de carbapenemases (37).

Dentro dos métodos não fenotípicos encontra-se o MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser

Desorption⁄Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry) e ensaios de fluxo lateral. O

MALDI-TOF é amplamente usado para identificar muitas estirpes com base no peso

molecular de diferentes compostos químicos das células bacterianas e fúngicas. A

identificação é feita por espectrometria de massa capaz de identificar rapidamente os

produtos de degradação do carbapenemo quando as proteínas extraídas das bactérias são

incubadas (normalmente por 2-4 horas) com um substrato de carbapenemo. Também

permite a deteção de um pico proteico conhecido associado ao plasmídeo que possui a

carbapenemase (45, 48). Semelhante ao teste CarbaNP, o MALDI-TOF tem dificuldade

em detetar enzimas do tipo OXA-48.

Um novo ensaio de fluxo lateral imunocromatográfico foi recentemente descrito. O teste

é baseado na captura imunológica de epítopos de OXA-48, usando nanopartículas

coloidais ligadas a uma membrana de nitrocelulose dentro de um dispositivo de fluxo

lateral. Os anticorpos monoclonais anti-OXA-48 são selecionados como reagentes de

captura específicos para identificação direta de enzimas do tipo OXA-48 (42). O ensaio

leva cerca de quatro minutos e foi avaliado tanto em colónias como em garrafas de

hemoculturas (49).

As técnicas moleculares são mais seguras para a deteção de estirpes produtoras de

carbapenemases do que os métodos fenotípicos (50). Estas técnicas incluem métodos

baseados em reação em cadeia da polimerase (PCR), técnicas de hibridação

(microarrays) e sequenciação do genoma completo (WGS).

A maioria das técnicas moleculares para detetar a resistência aos carbapenemos são

métodos baseados em PCR. Um exemplo é o ensaio comercial Xpert Carba-R, que

detecta KPC, NDM, IMP, VIM e OXA-48. O PCR permite a identificação rápida de

genes específicos de carbapenemases usando primers e sondas para ensaios em tempo

real, para regiões conservadas no gene alvo. Este teste é muito específico para um dado

gene e pode ser adaptado para detetar subgrupos específicos de uma família de genes

(51,52).

Figura 12 - CIM - Resultado positivo para a presença de carbapenemase e resultado

negativo. Fonte: Adaptado de Tamma, P. e Simner, P., 2018.


99

A microarray é uma técnica baseada em hibridização que permite a deteção de um

grande número de genes dentro de uma única reação. O DNA das bactérias é

hibridizado com pares de bases complementares de sondas e, em seguida, digitalizados

para ver a hibridização sonda-alvo. Esta técnica tem sido usada para a identificação de

espécies bacterianas e para identificar genes de resistência (53,54).

A técnica de WGS baseia-se na amplificação do DNA por uma enzima DNA polimerase

usando trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs) e trifosfatos de didesoxinucleotídeos

(ddNTPs) que são marcados com 4 fluoróforos diferentes. Os fragmentos resultantes

podem ser analisados por espectrometria de massa ou eletroforese capilar (55,56). Esta

técnica tem sido usada em alguns laboratórios para analisar a sequência de genes de

resistência a antimicrobianos e também fornece informações sobre o tipo de plasmídeo

portador do gene de resistência (57).

Atualmente, a deteção e caracterização de estirpes produtoras de carbapenemases

representam um verdadeiro desafio para muitos laboratórios clínicos em todo o mundo.

Nenhum consenso ainda foi alcançado sobre o método ideal. Ao selecionar um método

de deteção para fins de diagnóstico ou triagem, é importante considerar muitas

características, como rapidez, custo, acessibilidade, facilidade de uso e grau de precisão.

Além disso, os tipos de resistência, a prevalência de bactérias resistentes, a região

geográfica e a população de utentes são fatores importantes a considerar ao selecionar e

implementar um método. Métodos fenotípicos, como métodos baseados em cultura e

meios de triagem, são simples e acessíveis, e são mais atraentes para o uso rotineiro em

laboratoriais clínicos. No entanto, a sensibilidade e especificidade ainda são

inconclusivas e exigem longos períodos de incubação (37).

Embora alguns testes bioquímicos, como o teste de CarbaNP, exibam baixa

sensibilidade a algumas carbapenemases, como OXA-48, estes testes são às vezes

preferíveis, devido à sua rapidez e simplicidade. Ensaios imunocromatográficos têm

ganho mais atenção recentemente porque podem detetar rapidamente estirpes

produtoras de carbapenemases diretamente de amostras clínicas com um alto nível de

precisão. Devido às diferenças na atividade de resistência aos carbapenemos entre as

carbapenemases que podem ser detetadas por diferentes métodos, o uso de dois ou mais

métodos de deteção fenotípica pode melhorar a deteção de estirpes produtoras de

carbapenemases em comparação com o uso de uma única técnica (37).

Os métodos moleculares tornaram-se o método de escolha, porque a maioria pode ser

realizada rapidamente com um alto nível de sensibilidade e especificidade. Estes

métodos também possuem outras vantagens sobre os métodos fenotípicos, como

permitir a deteção direta de estirpes produtoras de carbapenemases a partir das amostras

clínicas e permitir a identificação do mecanismo de resistência a carbapenemos (58).

Estas vantagens são particularmente úteis não apenas para fins epidemiológicos e de

vigilância, mas também para investigações de surtos (59). No entanto, algumas destas

técnicas moleculares são incapazes de detetar novos genes de resistência. Estes métodos

são considerados de referência para confirmação e caracterização de carbapenemases

conhecidas.

A técnica de WGS pode-se tornar uma ferramenta altamente poderosa tanto para

investigações de surtos como para a caracterização molecular de genes de resistência a


100

antimicrobianos em laboratórios clínicos de rotina. No entanto, ainda é relativamente

cara, demorada e requer um sistema automatizado de interpretação de dados e um banco

de dados disponível publicamente (37).


101

6. Estirpes produtoras de Carbapenemases na ULS da Guarda

No decorrer do meu estágio foi possível analisar a situação epidemiológica das infeções

por estirpes produtoras de carbapenemases da ULS da Guarda, podendo fazer um estudo

comparativo com a realidade de Portugal e outros estudos.

A ULS da Guarda é formada por dois hospitais, o Hospital Sousa Martins na Guarda

(HSM), e o Hospital Nossa Senhora da Assunção em Seia (HNSA) e por 13 centros de

saúde.

Os dados que se seguem foram obtidos no Serviço de Patologia Clínica (nomeadamente

no laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular) provenientes dos dois hospitais e

englobou os dados de Janeiro de 2016 a Agosto de 2019 (Tabela 3).

As amostras recebidas pelo laboratório são processadas tendo em conta a natureza do

produto e segundo procedimentos devidamente estabelecidos, sendo cultivadas em

meios de cultura que possibilitem o crescimento dos microrganismos. Após a

identificação e TSA pelo sistema VITEK® 2 Compact da Biomerieux®, a partir do

perfil de resistência aos antibióticos, são identificadas estirpes suspeitas de ser

produtoras de carbapenemases para posterior confirmação. De forma a confirmar a

suspeita de estirpes produtoras de carbapenemases, determinou-se a CMI dos

carbapenemos (ertapenem e meropenem), que foram interpretadas segundo as normas

definidas pela EUCAST. Em simultâneo foram efetuados testes para a pesquisa de

carbapenemases por um método fenotípico (RAPIDEC® CARBA NP) e um método

molecular baseada em PCR em tempo real (Xpert Carba-R). Em situações em que as

bactérias apresentam múltiplas resistências, determinou-se a CMI por E-teste da

ceftazidima-avibactam, a CMI da colistina por microdiluição e nalgumas situações

específicas a CMI da tigeciclina por E-teste, de modo a obter alternativas terapêuticas.


102

Após analisar a tabela 3 verificou-se um total de 136 estirpes isoladas na ULS da

Guarda, foram identificadas K. pneumoniae (n=123), P. aeruginosa (n=6), Enterobacter

cloacae (n=3), Pseudomona putida (n=1), Proteus mirabilis (n=1), E. coli (n=1) e

Citrobacter freundii (n=1).

Tabela 3 - Número de isolados provenientes do Hospital Sousa Martins (HSM) e do

Hospital Nossa Senhora da Assunção (HNSA), nos anos 2016, 2017, 2018, 2019

(Janeiro a Agosto). Fonte: SPC da ULS da Guarda.

2016 2017 2018 2019 (Janeiro a

Agosto)

Total (n=)

Total (%)

HSM HNSA HSM HNSA HSM HNSA HSM HNSA

C.freundii

VIM 1 1 0.74

E. cloacae 1 1 2

2,2 E. cloacae

VIM 1 1

E. coli

KPC 1 1 0.74

K. pneumoniae 13 13

90,4 K. pneumoniae

KPC 1 3 14 11 30 21 13 14 107

K. pneumoniae

OXA-48 2 1 3

P. putida 1 1 0.74

P. mirabilis 1 1 0.74

P. aeruginosa 1 1 4 6 4,4

Total 20 27 56 33 136


103

Caso Clínico 1

Um doente de 58 anos, internado na ULS da Guarda em Outubro

de 2018 foi identificada na urina uma estirpe de E. coli produtora

de KPC, e em Novembro do mesmo ano foi identificada na urina

uma estirpe de K. pneumoniae produtora de KPC. Poderemos

inferir que este doente estava colonizado com estirpes produtoras

de carbapenemases, havendo uma facilidade de transmissão de

genes entre estirpes.

20

27

56

2016 2017 2018

0

10

20

30

40

50

60

Ano

Nú

mer

o d

e es

tirp

es p

rod

uto

ras

de

Ca

rba

pen

ema

ses

Ao observar a Figura 13 verificou-se um aumento significativo de estirpes produtoras de

carbapenemases desde 2016 a 2018.

Segundo o relatório do ECDC de 2017, em Portugal, verifica-se esse mesmo aumento

para estirpes K. pneumoniae e de E. coli e uma ligeira diminuição para P. aeruginosa e

Acinetobacter spp., de 2014 a 2017. Este aumento pode dever-se à facilidade de

transmissão entre estirpes, do gene blakpc em plasmídeos transmissíveis a outros

géneros, e à capacidade inata de adaptação das bactérias (ver caso clínico 1).

Figura 13 - Evolução do número de estirpes produtoras de carbapenemases na

ULS de 2016 a 2018. Fonte: SPC da ULS da Guarda.


104

Após analisar a tabela 4 pode-se observar que a suscetibilidade do meropenem e da

fosfomicina da estirpe de K. pneumoniae produtora de carbapenemases passou de

sensível para resistente, provavelmente pela pressão seletiva exercida pelo uso de

antibióticos.

Tabela 4 - Perfil fenotípico do doente (Caso clínico 1). Fonte: SPC da ULS da Guarda.

E. coli

(Outubro 2018)

K. pneumoniae

(Novembro 2018)

K.pneumoniae

(Dezembro 2018)

Ampicilina R R R

Amoxicilina/

Ácido clavulânico R R R

Cefuroxima R R R

Cefuroxima Axetil R R R

Cefotaxima R R R

Ceftazidima R R R

Meropenem S S R

Ertapenem S R R

Piperacilina/tazobactam R R R

Trimetoprim/Sulfametazol R R R

Ciprofloxacina R R R

Colistina S S S

Fosfomicina S S R

Tendo em conta a figura 14 verificou-se que 90,4% das estirpes isolados correspondem

à K. pneumoniae, 4,4% à P. aeruginosa, 2,2% ao E. cloacae, e 0,74% às estirpes P.

putida, P. mirabilis, E. coli e C. freundii.

Em 136 estirpes isoladas na ULS da Guarda, 113 foram pesquisadas por PCR em tempo

real, as sequências de genes blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaOXA-48 e blaIMP. Do total de 123

K. pneumoniae foram identificadas KPC (n=107) e OXA-48 (n=3), de E. coli KPC

(n=1), de Citrobacter freundii VIM (n=1) e do total de 3 E. cloacae foi identificado

VIM (n=1). Nas restantes 23 estirpes apenas se efetuou o teste RAPIDEC® CARBA NP

com resultado positivo, visto que os testes moleculares são muito dispendiosos e por

isso eram realizados unicamente a pedido do médico. Face aos resultados obtidos,

verifica-se que estão de acordo com outros estudos já realizados, pois indicam que as

Enterobacterales, nomeadamente K. pneumoniae são as principais portadoras de

carbapenemases (2).

Figura 6 - Percentagem de estirpes

produtoras de carbapenemases

isoladas na ULS- Guarda, de 2016 a

2019 (Janeiro a Agosto).


105

0 20 40 60 80 100

Pseudomona aerugionsa

Pseudomona putida

Klebsiella pneumoniae

Proteus mirabilis

Enterobacter cloacae

Escherichia coli

Citrobacter freundii

4,4

0,74

90,4

0,74

2,2

0,74

0,74

Percentagem (%)

Esti

rpe

s is

ola

das

Relativamente aos produtos biológicos nos quais foram isoladas as estirpes produtoras

de carbapenemases e tendo como base o figura 15, observou-se que a maioria são

detetados na urina (n=84) seguida das expetorações (n=21), hemoculturas (n=13),

exsudados de ferida não cirúrgica (n=5), aspirados brônquicos (n=4), pus (n=3),

cateteres (n=2), exsudados de ferida cirúrgica (n=2), biópsia (n=1) e de bílis (n=1).

Alguns factores de risco como a utilização de cateteres podem facilitar a entrada destas

estirpes na urina (60) (ver caso clínico 2 e 3).

Figura 14 - Percentagem de estirpes produtoras de carbapenemases isoladas na ULS-

Guarda, de 2016 a 2019 (Janeiro a Agosto). Fonte: SPC da ULS da Guarda.


106

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Produto biológico

Nú

mer

o d

e es

tirp

es

pro

du

tora

de

carb

ap

enem

ase

s

2016 2017 2018 2019

Caso clínico 2

O doente de 68 anos tinha uma neoplasia da

bexiga o que levou ao uso de saco de

urostomia. Em 2017, foi identificada na urina

uma estirpe de K. pneumoiae produtora de

carbapenemase.

Caso clínico 2

O doente de 68 anos do sexo masculino tinha

uma neoplasia da bexiga o que levou ao uso

de saco de urostomia. Em 2017, foi

identificada na urina uma estirpe de K.

pneumoiae produtora de carbapenemase.

Caso clínico 3

A doente de 92 anos apresentava uma úlcera de

pressão na região sacrococcígea com bordo

necrosado. Em 2017, foi identificada em uma K.

pneumoniae (KPC) na urina.

Figura 15- Número de estirpes produtoras de carbapenemases nos diferentes produtos

biológicos, desde 2016 a 2019 (Janeiro a Agosto). Fonte: SPC da ULS da Guarda.


107

Após analisar a tabela 5 pode-se verificar que a suscetibilidade ao imepenem da estirpe

de K. pneumoniae produtora de carbapenemase passou de intermédio para resistente de

Fevereiro para Março.

Do mesmo modo, no caso clínico 3, a suscetibilidade ao ertapenem da estirpe de K.

pneumoniae também se alterou de sensível para intermédio, tabela 6. Nos dois casos a

alteração da suscetibilidade pode dever-se a uma pressão seletiva exercida pelo uso de

antibióticos.

Tabela 5 - Perfil fenotípico do doente (Caso clínico 2). Fonte: SPC da ULS da Guarda.

K. pneumoniae

(Fevereiro 2017)

K. pneumoniae

(Março 2017)

Ampicilina R R

Amoxicilina/

Ácido clavulânico R R

Cefuroxima R R

Cefuroxima Axetil R R

Cefotaxima R R

Ceftazidima R R

Imipenem I R

Ertapenem R R

Trimetoprim/Sulfametazol R R

Ciprofloxacina R R

Colistina S S

Fosfomicina S R

Tabela 6 - Perfil fenotípico do doente (caso clínico 3). Fonte: SPC da ULS da Guarda.

K. pneumoniae

(Agosto 2017)

K. pneumoniae

(Setembro 2017)

Ampicilina R R

Amoxicilina/


Cefuroxima R R


Cefotaxima R R

Ceftazidima R R

Meropenem S S

Ertapenem S I


Ciprofloxacina R R

Colistina S S

Fosfomicina S S


108

Caso clínico 4

Dois doentes, doente 1 de 81 anos e doente 2 de 91 anos que estiveram os dois

internados no mesmo serviço, Medicina Homens, no Hospital Nossa Senhora da

Assunção. Em Agosto de 2019 foi identificado na urina dos dois doentes uma estirpe de

K. pneumoniae KPC com o mesmo perfil fenótipo de resistência. Provavelmente esta

estirpe foi transmitida do doente 1 para o doente 2, visto que o doente 1 já apresentava

esta estirpe em Abril de 2019. Provavelmente as medidas de isolamento necessárias não

foram eficazes.

Caso clínico 4

Dois doentes, doente 1 de 81 anos e doente 2 de 91 anos que estiveram os dois

internados no mesmo serviço, Medicina Homens, no Hospital Nossa Senhora da

Assunção. Em Agosto de 2019 foi identificado na urina dos dois doentes uma estirpe de

K. pneumoniae KPC com o mesmo perfil fenótipo de resistência. Provavelmente esta

estirpe foi transmitida do doente 1 para o doente 2, visto que o doente 1 já apresentava

esta estirpe em Abril de 2019. Provavelmente as medidas de isolamento necessárias não

foram eficazes.

Além do cateterismo, existem outros factores que podem facilitar aquisição de estirpes

multiresistentes, nomeadamente a transferência destas estirpes entre doentes quando não

são observados os cuidados necessários de isolamento como se pode deduzir do caso

clínico 4.

Também neste caso clínico se verificou alteração da susceptibilidade aos antibióticos

por pressão selectiva à ciprofloxacina no doente 1 (tabela 7).

No doente 2 (tabela 8) foi identificada uma estirpe de E. coli em Julho com um perfil de

susceptibilidade aos antibióticos, diferente do apresentdo pela K. pneumoniae em

Agosto. No entanto o perfil de resistênciaa desta estirpe é igual à K. pneumoniae em

encontrada no doente 1 na mesma data. Embora não tenha sido efectuada a

caracterização molecular das estirpes produtoras de KPC, tudo indica que, pode estar a

acontecer um surto endémico por K. pneumoniae no SPC da ULS da Guarda.


109

Tabela 7- Perfil do doente 1 (Caso clínico 4). Fonte: SPC da ULS da Guarda.

K. pneumoniae

(Abril 2019)

K. pneumoniae

(Agosto 2019)

Ampicilina R R

Amoxicilina/


Cefuroxima R R


Cefotaxima R R

Ceftazidima R R

Meropenem R R

Ertapenem R R


Ciprofloxacina S R

Colistina S S

Fosfomicina S S

Ceftazidima/Avibactam -- S

Tabela 8- Perfil fenotípico do doente 2 (caso clínico 4). Fonte: SPC da ULS da Guarda.

E. coli

(Julho 2017)

K. pneumoniae

(Agosto 2019)

Ampicilina R R

Amoxicilina/

Ácido clavulânico S R

Cefuroxima R R


Cefotaxima I R

Ceftazidima S R

Cefepima S R

Meropenem S R

Ertapenem S R


Ciprofloxacina R R

Colistina S S

Fosfomicina S S

Ceftazidima/Avibactam -- S

Figura 7 - Evolução da percentagem de

resistência dos variados antibióticos,

de 2016 a 2018.


110

0

20

40

60

80

100

120

Antibióticos

Per

cen

tage

m d

e re

sist

ênci

a (%

)

2016 2017 2018

Na figura 16 verifica-se que em 2016 as estirpes produtoras de carbapenemases

apresentavam um perfil fenótipo de resistência não só aos antibióticos β-lactâmicos

como à maioria dos outros grupos de antibióticos, nomeadamente aos aminoglicosídeos,

quinolonas, antimetabolitos.

No entanto, em 2017 e 2018 já se verifica a diminuição das resistências a outras famílias

de antibióticos, o que pode resultar da crescente consciencialização por parte dos

médicos na salvaguarda de alguns antibióticos. A resistência pode ter origens diferentes

podendo actualmente ser atribuída à transferência por plasmídeos entre espécies

bacterianas diferentes, no entanto uma vez que a estirpe prevalente na instituição é a K.

pneumoniae produtora de KPC, pode ser explicado pela disseminação generalizada

destasespécie entre doentes, superficies e também pelas práticas invasivas que os

doentes estão sujeitos.

Tendo em conta os carbapenemos estudados, ertapenem e meropenem, verifica-se

também a diminuição da percentagem de resistência desde 2016 a 2018. Também em

Portugal se tem verificado essa diminuição (98) em que a percentagem de resistência ao

ertapenem é maior do que a do meropenem, o que se pode dever ao facto deste último

carbapenemo ter um espectro de ação mais alargado e ser reservado para as infecções

por P. aeruginosa, o que contribui para que seja menos prescrito (61). Quanto à

colistina, tanto em 2016 como em 2017 foram isoladas 2 estirpes com resistência à

colistina e em 2018 apenas uma estirpe com resistência à colistina. O número de

estirpes isoladas com resistência à colistina não permite tirar conclusões.

Figura 16 - Evolução da percentagem de resistência dos variados antibióticos, de

2016 a 2018. Fonte: SPC da ULS da Guarda.


111

Entre 2009 e 2013, segundo a Rede Europeia de Vigilância do Consumo de

Antimicrobianos (ESAC-Net), o consumo de polimixinas quase duplicou na Europa,

quando o perfil de resistência in vitro revela a colistina como única opção terapêutica

para este tipo de Enterobacterales (2, 62). O aumento da resistência a este antibiótico

constitui uma grande preocupação dado que em determinadas situações é o último

recurso na terapêutica de estirpes multirresistentes (ver caso clínico 5).


K. pneumoniae

(12 de Agosto 2019)

K . pneumoniae

(29 de Agosto 2019)

Ampicilina R R

Amoxicilina/


Cefuroxima R R


Cefotaxima I R

Ceftazidima R R

Cefepima I I

Meropenem S R

Ertapenem R R


Ciprofloxacina R R

Colistina S R

Fosfomicina R R

Ceftazidima/Avibactam S S

Caso clínico 5

Na urina do doente de 88 anos foi identificado em 12 de Agosto de 2019 uma

estirpe de K. pneumoniae do tipo KPC apenas sensível ao meropenem,

ceftazidma/avibactam e à colistina. Em 29 de Agosto de 2019 foi identificada a

mesma estirpe na urina, mas já resistente ao meropenem e à colistina.


112

Apresento outros casos clínicos, em que nalguns dele até à data não foi possível saber

qual a terapêutica antibiótica instituída (caso clínico 6,7 e 8).

Após analisar a tabela 10 pode-se observar que a suscetibilidade da cefuroxima,

cefuroxima axetil, cefotaxima, ceftazidima, cefepima, meropenem, ertapenem e

trimetoprim/sulfametazol da estirpe de K. pneumoniae passou de sensível para resistente

e intermédio no caso da cefepima. Dado que, a estirpe isolada em Setembro apresenta

susceptibilidade à ciprofloxacina e susceptibilidade intermédia à cefepima pode ser

considerada a hipótese de o doente ter sido contaminado com duas estirpes clonais

diferentes.


K. pneumoniae

(Julho 2019)

K .pneumoniae

(Setembro 2019)

Ampicilina R R

Amoxicilina/


Cefuroxima S R

Cefuroxima Axetil S R

Cefotaxima S R

Ceftazidima S R

Cefepima S I

Meropenem S R

Ertapenem S R

Trimetoprim/Sulfametazol S R

Ciprofloxacina S S

Colistina S S

Fosfomicina S S

Caso clínico 6

Na expectoração do doente de 59 anos, com esclerose lateral aminotrófica, foi

identificado em Julho de 2019 uma estirpe de K. pneumoniae sensível à

maioria dos antibióticos testados e em Setembro do mesmo ano foi identificada

na expectoração uma estirpe de K. pneumoniae produtora de KPC. Em Julho

foi feita antibioterapia empírica com amoxicilina/ácido clavulânico durante 7

dias,ao fim de 3 dias apresentou agravamento clínico e foi iniciada

levofloxacina empiricamente durante 7 dias. Após se obter o perfil fenotípico

do exame cultural de Julho foi administrado cefuroxima durante 7 dias. Até à

data não foi ainda possível obter informação da terapêutica instituída após

identificação da estirpe KPC de Setembro.


113

Caso clínico 7

Na urina do doente de 84 anos foi identificado em Fevereiro de 2018 uma estirpe

de K. pneumoniae produtora de carbapenemases, apresentando em Abril a

mesma bactériacom suscetibilidade diferentes ao meropenem e ertapenem,

passando de sensível a resistente e de intermédio a resistente, respectivamente.

Caso clínico 7

Na urina do doente de 84 anos foi identificado em Fevereiro de 2018 uma estirpe

de K. pneumoniae produtora de carbapenemases, apresentando em Abril a

mesma bactéria mas com susceptibilidade diferentes no meropenem e ertapenem,

passando de sensível a resistente e de intermédio a resistente, respectivamente.


K. pneumoniae

(Fevereiro

2019)

K. pneumoniae

(16 de Abril

2019)

K. pneumoniae

(23 de Abril

2019)

Ampicilina R R R

Amoxicilina/

Ácido clavulânico R R R

Cefuroxima R R R

Cefuroxima Axetil R R R

Cefotaxima R R R

Ceftazidima R R R

Cefepima I I I

Meropenem S I R

Ertapenem I R R

Trimetoprim/Sulfametazol R R R

Ciprofloxacina S S S

Colistina S S S

Fosfomicina S S S


114


Após analisar os oito casos clínicos pode-se concluir o tempo de hospitalização pode ter

sido uma das causas primárias da contaminação com estirpes resistentes endémicas no

hospital; associada ao consumo de antibióticos, que se traduziu por um aumento das

resistências ao meropenem, ertapenem, ciprofloxacina, fosfomicina e colistina e

consequentemente à diminuição de alternativas terapêuticas.

K. pneumoniae

(Julho 2019)

K. pneumoniae

(Setembro 2019)

Ampicilina R R

Amoxicilina/


Cefuroxima R R


Cefotaxima R R

Ceftazidima R R

Cefepima I I

Meropenem R R

Ertapenem R R


Ciprofloxacina R S

Colistina S S

Fosfomicina S R

Caso clínico 8

Na urina da doente de 70 anos foi identificado em Julho e Setembro de 2019 uma

estirpe de K. pneumoniae produtora de carbapenemases, KPC, apresentando uma

suscetibilidade à ciprofloxacina de resistente em Julho e passando a sensível em

Setembro. Atè à data não foi possível concluir qual o factor que desencadeou esta

alteração de suscepibilidade. A suscetibilidade da fosfomicina em Julho era sensível e

em Setembro já era resistente, provavelmente pela pressão seletiva exercida pelo uso

de antibióticos.

Caso clínico 8

Na urina da doente MESM de 70 anos foi identificado em Julho e Setembro de 2019

uma estirpe de K. pneumoniae produtora de carbapenemases, KPC, apresentando uma

susceptibilidade à ciprofloxacina de resistente em Julho e passando a sensível em

Setembro. Atè à data não foi possível concluir qual o factor que desencadeou esta

alteração de suscepibilidade. A susceptibilidade da fosfomicina em Julho era sensível e

em Setembro já era resistente, provavelmente pela pressão seletiva exercida pelo uso

de antibióticos.

Figura 8 - Algoritmo sugerido para

escolha de antibiótico em paciente com

bacteremia de Enterobacteriaceae

resistente a carbapenêmicos. Fonte:

Alhashem F et al ., 2017.


115

7. Tratamento

Até há bem pouco tempo, os carbapenemos eram antibióticos cuja utilização transmitia

um grau de certeza significativo quanto à eficácia do tratamento. No entanto, com o

aumento de resistências aos carbapenemos, o tratamento das infeções torna-se um

desafio. Para evitar o desenvolvimento de mais resistências, é crucial ser seletivo na

escolha dos antimicrobianos. A escolha do antibiótico adequado deve basear-se em

dados clínicos apoiados por um diagnóstico feito o mais rápido possível (63).

O tratamento deve ser iniciado assim que se suspeite de uma infeção provocada por uma

estirpe suspeita de ser produtora de carbapenemases, para prevenir o desenvolvimento

de novas complicações e progressão a uma septicemia e/ou falência de múltiplos

órgãos. Para reduzir a taxa de mortalidade, tem sido defendido o início da antibioterapia

empírica a partir da primeira hora após a infeção. Isto leva a uma redução da taxa de

mortalidade de 13,7% (64).

Embora as infeções provocadas por bactérias de Gram-positivo (especialmente

Staphylococcus) são as mais prevalentes em ambiente hospitalar (62,2%), a maior taxa

de mortalidade está associada a bactérias de Gram-negativo, nomeadamente do grupo

das Enterobacterales resistentes aos carbapenemos, o que implicou o “resgate” de

antibióticos antigos, como a colistina (polimixina E) e aminoglicosídeos, muitos já

praticamente abandonados da prática clínica (65,66). A colistina é uma polimixina com

atividade bactericida contra infeções bacterianas por Gram-negativos, no entanto o uso

deste antibiótico foi proibido por muitos anos devido à sua nefrotoxicidade e

neurotoxicidade (67, 68). A colistina parece ser uma boa alternativa em doentes

vulneráveis (sem qualquer evidência de insuficiência renal) especialmente quando

combinado com outros antibióticos como os carbapenemos. Um estudo feito nos

Estados Unidos verificou uma redução da taxa de mortalidade dos doentes tratados com

carbapenemo/colistina ou carbapenemo/tigeciclina em relação aos tratados com um

único antibiótico (2 em cada 15 doentes, que foram tratados com mais que um

antibiótico morreram em comparação com 11 de 19 doentes tratados só com um

antibiótico), devido a uma associação sinérgica entre a colistina ou tigecilina e os

carbapenemos. (69)

Infelizmente nos últimos anos, surgiram na China, Estados Unidos e em diferentes

países europeus, Enterobacterales resistentes à colistina que já eram resistentes aos

carbapenemos. É mais frequente em Enterobacterales que possuem o gene mcr-1

juntamente com o gene de resistência das carbapenemases (70,71).

Em alternativa à colistina a terapia combinada com ertapenem e meropenem, foi

iniciada num doente idoso com E. coli produtora de KPC com uma contraindicação ao

uso de colistina, devido a um transplante renal tendo apresentado melhorias. (72) Em

conclusão, nestes casos com resistência à colistina, onde as opções terapêuticas são

limitadas, uma combinação de dois carbapenemos poderá ser benéfico (73).

A tigeciclina é uma glicilciclina, que é um derivado da minociclina (tetraciclina) e exibe

amplo espectro de atividade incluindo os microrganismos multiresistentes (74). Muitos

estudos foram realizados para avaliar a eficácia da tigeciclina, no tratamento de infeções


116

por Enterobacterales resistentes aos carbapenemos. Em mais que um estudo,

demonstrou que o tratamento com tigeciclina foi associado a uma alta taxa de

mortalidade (72). Enquanto se for combinada particularmente com um aminoglicosídeo

ou a colistina, a taxa de mortalidade diminui, particularmente nas infeções que

envolvem bactérias produtoras de carbapenemases do tipo KPC (75,76).

Os aminoglicosídeos, como a gentamicina, amicacina e tobramicina, têm diferentes

atividades in vitro. Em infeções do trato urinário por Enterobacterales resistentes aos

carbapenemos, a atividade da gentamicina em estirpes sensíveis tem resultados

positivos. A amicacina, neste tipo de infeções, parece ser mais ativa comparado com a

gentamicina ou tobramicina (77). Noutro estudo, a amicacina e a tobramicina mostrou

suscetibilidade baixa em infeções causadas por bactérias Gram-negativas

multirresistentes, o que poderá ser explicado pela presença de enzimas que alteram a

estrutura dos aminoglicosídeos em particular às que têm capacidade de modificar

diferentes estruturas em simultâneo que são frequentes em bactérias multiresistentes. O

uso de aminoglicosídeos em monoterapia em infeções por K. pneumoniae produtoras de

carbapenemases são considerados ineficazes e, portanto, não são recomendados para o

uso clínico (78,79).

A fosfomicina é um antibiótico bactericida que inibe a biossíntese da parede celular

bacteriana, é usado para tratar infeções do trato urinário e tem baixas taxas de

resistência (80,81 e 82).

Para infeções causadas por isolados produtores de metalo-beta-lactamases (MBL), é

sugerido um regime de combinação à base de polimixina, se o isolado for suscetível.

Para estirpes que são altamente resistentes (inclusive às polimixinas), a combinação de

ceftazidima-avibactam mais aztreonam pode ser uma opção possível. As MBLs

conferem resistência a todos os antibióticos do tipo beta-lactâmico, exceto o aztreonam,

mas os isolados produtores de MBL geralmente produzem outras beta-lactamases de

largo espectro que conferem resistência ao aztreonam (83). Embora as MBLs não sejam

inibidas por nenhum dos inibidores de beta-lactamases disponíveis, a combinação de

ceftazidima-avibactam e aztreonam pode ter um efeito sinérgico, já que o avibactam

pode inativar as outras beta-lactamases para tornar o aztreonam ativo. Essa combinação

tem sido usada para tratar com sucesso doentes com estirpes produtoras de MBL

extremamente resistentes (84, 85). As polimixinas são os pilares da terapia para A.

baumannii e P. aeruginosa resistentes aos carbapenemos e são geralmente usadas em

combinação com outros antimicrobianos (86, 87).

Num estudo recente, dois doentes com Enterobacterales resistentes aos carbapenemos

(um doente com uma septicemia e um o outro com suspeita de endocardite) foram

tratados com ceftazidima-avibactam, tendo havido resultados positivos (88). Esta

combinação é eficaz em estirpes produtoras de carbapenemases do tipo KPC e OXA-48

(89).

Outra opção poderá ser a adição de vaborbactam a meropenem. Vaborbactam é um

inibidor potente das carbapenemases de classe A que quando combinado com o

meropenem, restaura a atividade do meropenem e tem mostrado eficácia no tratamento


117

de infecções do trato urinário complicadas, incluindo aquelas causadas por

Enterobacterales produtoras de carbapenemases do tipo KPC (90).

A plazomicina que pertence ao grupo dos aminoglicosídeos, entrou recentemente em

ensaio clínico de fase 3 e foi demonstrado que a plazomicina reduziu significativamente

a taxa de mortalidade em doentes com pneumonias associadas à ventilação e a

pneumonias adquiridas nos hospitais por Enterobacterales resistentes aos

carbapenemos. Em comparação com a utilização de colistina, a taxa de mortalidade foi

de 11,4% no grupo tratado com palzomicina, enquanto que com a colistina foi de 40%.

Em infeções do trato urinário, a plazomicina tem a mesma eficácia quando é utilizado o

ertapenem (91).

Ainda é discutível quais os antibióticos mais apropriados para tratar Enterobacterales

resistentes aos carbapenemos. A terapia combinada é preferida à monoterapia na

maioria dos estudos devido ao seu amplo espectro, pois exerce um efeito sinérgico e

impede o desenvolvimento de novas resistências (92,93).

Em doentes gravemente doentes com diferentes comorbilidades, uma combinação de

dois ou mais antibióticos é preferida. Um dos melhores tratamentos até agora tem sido a

combinação de meropenem, tigeciclina e colistina. Uma segunda opção pode ser a

terapia combinada com tigeciclina, gentamicina e meropenem.

Em doentes com doença moderada, recomenda-se administrar tigeciclina e gentamicina.

Se a CMI do meropenem é inferior a 8 μg/mL, é aconselhável mudar para uma terapia

combinada contendo um carbapenemo. No caso de resistência à colistina, uma

combinação de dois carbapenemos pode ser usada (por exemplo, ertapenem com

meropenem) além das combinações mostradas no algoritmo da Figura 17 (94).

Figura 17 - Algoritmo sugerido para escolha de antibiótico em paciente com

bacteremia de Enterobacterales resistente a carbapenêmicos. Fonte: Alhashem, F. et

al., 2017.


118

Muitos antibióticos promissores estão atualmente sob investigação e serão necessários

mais estudos para perceber o papel destes novos antibióticos no tratamento de infeções

por bactérias resistentes a carbapenemos. O tratamento ideal ainda precisa ser

determinado para vencer a batalha contra as resistências.


119

8. Prevenção e perspetivas futuras

As infeções associadas a cuidados de saúde e o aumento da resistência das bactérias aos

antibióticos são problemas de elevada importância à escala mundial. Nenhuma ins-

tituição prestadora de cuidados de saúde e nenhum país pode ignorar as implicações

destas infeções e o seu impacto nos doentes, nas unidades de saúde e na comunidade.

Estas infeções aumentam a morbilidade e a mortalidade, prolongam os internamentos e

aumentam os custos em saúde. Acentuam a pressão seletiva geradora de resistências

pelo maior uso de antimicrobianos, inviabilizam a qualidade dos cuidados e são a

principal ameaça à segurança dos cidadãos (95).

Neste sentido, torna-se essencial a implementação de medidas para o controlo deste tipo

de estirpes e para a sua prevenção.

Numa primeira abordagem é importante que cada serviço de saúde esteja informado

sobre as estirpes resistentes aos carbapenemos isoladas nessa instituição, se existe

evidência de transmissão dentro da mesma e que serviços/enfermarias são mais afetados

(96,97). É essencial o estudo dos doentes e portadores assintomáticos relativamente a

fatores de risco, como dados demográficos, história de hospitalização anterior,

procedimentos invasivos ou doença crónica, terapêutica com antimicrobianos, recurso a

cuidados continuados com elevada incidência de estirpes resistentes aos carbapenemos

ou viagens para países endémicos (97,98).

Os ambientes de assistência médica devem ter um programa de gestão antimicrobiana

formalmente definido para assegurar o uso apropriado de antimicrobianos. Os serviços

de saúde devem ter recomendações específicas de tratamento e profilaxia, com base em

diretrizes nacionais e suscetibilidade microbiana local, para auxiliar na seleção

antimicrobiana empírica (99). Os hospitais/instituições de saúde devem rever os

processos de limpeza e reprocessamento de equipamentos, seguir instruções dos

fabricantes e realizar triagem ou auditoria para garantir a qualidade dos processos. Estes

processos devem ser bem definidos e descritos em procedimentos internos em cada

instituição.

As instalações sanitárias devem estar disponíveis para todos os tipos de doentes.

Quando os doentes são incontinentes ou têm diarreia, podem ser indicadas arrastadeiras

ou cadeiras sanitárias para evitar disseminação de estirpes multirresistentes (100).

A higiene das mãos por parte dos profissionais e dos doentes é a medida mais eficaz,

mais simples e mais económica de prevenir as infeções (101). A adesão das unidades de

saúde à monitorização das práticas de higiene das mãos tem vindo a aumentar de forma

gradual, tendo-se registado em 2016 um aumento desta adesão, sobretudo a nível dos

agrupamentos de centros de saúde e das unidades de cuidados continuados integrados.

A taxa de adesão dos profissionais à higiene das mãos foi de 73% (Figura 18) (102).


120

A implementação de uma vigilância ativa através de uma triagem de um exsudado retal

ou cultura de amostras de fezes de possíveis portadores de estirpes produtoras de

carbapenemases, à admissão ou após transferência de outra instituição de saúde, deve

ser recomendada, sobretudo em enfermarias com doentes de alto risco (por exemplo

crianças neutropénicas ou doentes hemato-oncológicos). A sua deteção precoce permite

a tomada atempada de medidas de controlo de infeção, visto que os indivíduos

colonizados se encontram em risco de desenvolver uma infeção e têm o potencial de

disseminar estas estirpes (103). Em doentes com dispositivos médicos devem ser

efectuadas amostras do local onde este se encontra implantado para análise

microbiológica (104).

Os gestores de saúde devem garantir que a ocupação da enfermaria não exceda a

capacidade para a qual foi projetada e garantir que as recomendações de construção e

prevenção de infeção são seguidas (105).

Os serviços de saúde devem ter acesso a laboratórios de microbiologia com capacidade

para detetar estirpes produtoras de carbapenemases e ter sistemas implementados para

garantir que os resultados são comunicados pelo laboratório de uma forma atempada aos

profissionais de saúde (100).

Os profissionais de saúde que estejam em contato com utentes portadores de estirpes

produtoras de carbapenemases devem ter formação continuada sobre estas estirpes e

quais os cuidados a ter (100).

Os lares e instituições de cuidados continuados constituem possíveis reservatórios de

estirpes produtoras de carbapenemases, como tal devem ser elaborados estudos de

prevalência e adotadas medidas de prevenção (104).

Figura 18 - Evolução ao longo do tempo da taxa global de adesão à higiene das mãos

nos 5 momentos de 2011 a 2016. Fonte: PPCIRA/DGS. Dados Globais Plataforma das

PBCI, Higiene das Mãos. 2016.


121

O programa nacional de prevenção e controlo de infeções e das resistências aos

antimicrobianos (PPCIRA) promove a redução das taxas de infeção associadas aos

cuidados de saúde, através da prevenção da sua transmissão, e a criação de condições

para uma redução das resistências aos antimicrobianos, principalmente promovendo o

uso correto destes fármacos. Tem ainda como missão promover ou incentivar e

coordenar a nível nacional, a vigilância epidemiológica de infeções associadas aos

cuidados de saúde, do consumo e das resistências aos antimicrobianos. As metas de

Saúde para 2020 será reduzir o consumo de antibióticos na comunidade, reduzir a taxa

de K. pneumoniae resistente aos carbapenemos e reduzir a prevalência de infeção

adquirida em hospitais e cuidados continuados (Figura 19) (101).

Figura 19 - Metas de Saúde para 2020. Fonte: DGS, Programa de prevenção e

controlo de infeções e de resistência aos antimicrobianos - 2017.


122

9. Conclusão

A rápida disseminação global de bactérias altamente resistentes, em especial as

resistentes aos carbapenemos, tem evoluído de uma forma descontrolada devido

maioritariamente a uma utilização abusiva dos antibióticos. O que constitui uma ameaça

grave aos doentes pois aumenta a taxa de mortalidade, aumenta os custos do sistema de

saúde e reduz a disponibilidade de terapêuticas alternativas.

A ordem das Enterobacterales é a que apresenta maior impacto epidemiológico,

principalmente a K. pneumoniae. Este tipo de estirpes apresenta vários mecanismos de

resistência, o que torna fundamental a sua deteção, pois permite atuar rapidamente,

decidir o melhor tratamento e implementar medidas de isolamento e prevenção.

Nenhum consenso ainda foi alcançado sobre o método de deteção ideal. Mas devido aos

diferentes mecanismos de resistência entre as carbapenemases podem ser detetadas por

métodos fenotípicos ou moleculares. O uso de dois ou mais métodos de deteção

fenotípica conjugado com métodos moleculares, quando possível, pode melhorar

bastante a deteção de estirpes produtoras de carbapenemases em comparação com o uso

de um único método.

O tratamento mais apropriado para tratar estirpes resistentes aos carbapenemos ainda é

discutível. Na maioria dos estudos defende a terapia combinada em vez da monoterapia,

devido ao seu amplo espectro, pois exerce um efeito sinérgico e impede o

desenvolvimento de novas resistências. Um dos melhores tratamentos até agora tem

sido a combinação de meropenem, colistina e tigeciclina. Uma segunda opção pode ser

a terapia combinada com tigeciclina, gentamicina e meropenem.

Muitos antibióticos estão atualmente sob investigação e serão necessários mais estudos

para perceber os seus mecanismos de acção.

Deve-se promover ações de formação de boas práticas de prevenção e controlo de

infeções, nomeadamente formação dos profissionais de saúde, triagem ativa de doentes

“de risco” na admissão hospitalar, assim como a higiene das mãos que se torna a medida

verdadeiramente mais importante para a prevenção da transmissão de bactérias em

hospitais e instituições de saúde.

É essencial sensibilizar as pessoas de modo a usarem os antibióticos apenas quando

necessário, evitar a sua eliminação para o ambiente e restringir a sua utilização na

pecuária.

A diversidade de uso de antibióticos pode levar à diminuição da taxa de resistências, as

quaisconstituem um grande desafio, mas certamente serão superadas com o uso racional

de antibióticos e com a implementação correta de medidas de prevenção.

Dos casos clínicos apresentados neste estudo conclui-se que os factores de risco

nomeadamente: colonização com estirpes multiressistentes; pressão seletiva exercida

pelos antibióticos; transmissão horizontal de genes de resistência por elementos

genéticos móveis (plasmídeos, transposões e integrões) entre diferentes espécies e

géneros bacterianos, assim como a transmissão subsequente dessas bactérias entre

vários hospedeiros e reservatórios ambientais, podem desempenhar um papel importante

na emergência e disseminação da resistência bacteriana aos antibióticos.


123

10. Bibliografia

1- Centro Europeu de Prevenção e Controlo das Doenças. Antibióticos de última linha

estão a falhar: opções para lidar com esta ameaça urgente aos doentes e sistemas de

saúde. Estocolmo: ECDC,2016.

2- Albiger, B., et al (2015). European Survey of Carbapenemase-Producing

Enterobacteriaceae working group. Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in

Europe: assessment by national experts from 38 countries, May 2015. Euro Surveill.

3 – Ruppé, E. et al (2015). Mechanisms of antimicrobial resistance in Gram-negative

bacilli. Ann. Intensive Care.

4 - O’Neill, J. (2016). Tackling drug-resistant infections globally: Final report and

recommendations. London: The Review on Antimicrobial Resistance.

5 - Organisation for Economic Co-operation and Development. Antimicrobial

Resistance in G7 Countries and Beyond: Economic Issues, Policies and Options for

Action. Paris: OECD, 2015.

6 – Sousa, J. (2006). Manual de Antibióticos Antibacterianos, Porto, Edições

Universidade Fernando Pessoa.

7- Walsh, T. (2010). Emerging carbapenemases: a global perspective. Int J Antimicrob

Agents 36, pp - S8-S14.

8 – Georgios, M., (2016). Carbapenem resistance: overview of the problem and future

perspectives, Ther Adv Infect Dis 3(1), pp. 15-21.

9- Queenan, A. e Bush K. (2007). Carbapenemases: the versatile beta-lactamases.

Clinical Microbiology Reviews 20, pp. 440-58.

10 – Huang, T. et al (2013). On behalf of a multicentre study group, Caddrobi J, et al.

Prevalence and mechanisms of resistance to carbapenems in Enterobacteriaceae

isolates from 24 hospitals in Belgium. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 68(8),

pp. 1832–7.

11 - European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance of antimicrobial

resistance in Europe 2017: Annual report of the European Antimicrobial Resistance

Surveillance Network (EARS-Net). Estocolmo: ECDC; 2018.

12 - Ruiz-Garbajosa, P., et al (2013). Canton R. Multiclonal dispersal of KPC genes

following the emergence of non-ST258 KPC-producing Klebsiella pneumoniae clones

in Madrid, Spain. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 68(11), pp - 2487–92.


124

13 – Meletis, G., et al (2014). Accumulation of carbapenem resistance mechanisms in

VIM-2-producing Pseudomonas aeruginosa under selective pressure. European Journal

of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33(2), pp. 253–8.

14- Grundmann, H., et al (2010). Carbapenem-non-susceptible Enterobacteriaceae in

Europe: conclusions from a meeting of national experts. Euro Surveillance 15.

15 – Uptodate Overview of carbapenemase-producing gram-negative bacilli. [Em

linha]. Disponível em < https://www.uptodate.com/contents/overview-of-

carbapenemase-producing-gram-negative-bacilli> [Consultado em 13/01/2019].

16- Munoz-Price, L., et al (2013). Clinical epidemiology of the global expansion of

Klebsiella pneumoniae carbapenemases. The Lancet Infectious Diseases 13, pp. 785-96.

17 – Won, S. et al (2011) Emergence and rapid regional spread of Klebsiella

pneumoniae carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Clinical Infectious

Diseases 53, pp. 532-40.

18- Garcia, M. (2013). Carbapenemases: A real threat. APUA Newsl, 31, pp. 4–6.

19 – Cardoso, O., et al (2002). Metallo-beta-lactamase VIM-2 in clinical isolates of

Pseudomonas aeruginosa from Portugal. Microbial Drug Resistance, 8, pp.93-7.

20- Silva, G., et al (2002). Molecular characterization of bla (IMP-5), a new integron-

borne metallo-beta-lactamase gene from an Acinetobacter baumannii nosocomial isolate

in Portugal. FEMS Microbiology Letters, 215, pp -33-9.

21- Conceicao, T., et al (2005). First isolation of bla (VIM-2) in Klebsiella oxytoca

clinical isolates from Portugal. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49, pp. 476.

22- Calisto, F., et al (2012). Carbapenemase KPC-3 em estirpes de Klebsiella

pneumoniae numa unidade hospitalar. Revista Portuguesa de Doenças Infecciosas, 8,

pp -127-34.

23- Silva, G., et al (2004). Quinteira S, Bertolo E, et al. Long-term dissemination of an

OXA-40 carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii clone in the Iberian

Peninsula. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 54, pp - 255-8.

24 – Pires, D. et al (2016). Evolving epidemiology of carbapenemase-producing

Enterobacteriaceae in Portugal: 2012 retrospective cohort at a tertiary hospital in

Lisbon. Journal of Hospital Infection, 92(1), pp.82–5.


125

25 - European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance Atlas of

Infectious Diseases [Em linha]. Disponível em <http://ecdc.europa.eu/en/data-

tools/atlas/Pages/atlas.aspx> [Consultado em 12/12/2018].

26 - European Centre for Disease Prevention and Control. Surveillance and disease data

for antimicrobial consumption [Em linha]. Disponível em

<https://ecdc.europa.eu/en/antimicrobial-consumption/database/distribution-by-

antimicrobial-group> [Consultado em 10/11/2018].

27 – Gupta, N. et al (2011). Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: epidemiology

and prevention. Clinical Infectious Diseases, 53, pp -60-7.

28 – Orsi, G. et al (2013). Patient risk factors for outer membrane permeability and

KPC-producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolation: results of a

double case-control study. Infection, 41, pp. 61-7.

29 – Gasink, L. et al (2009). Risk factors and clinical impact of Klebsiella pneumoniae

carbapenemase-producing K. pneumoniae. Infection Control and Hospital

Epidemiology, 30, pp.1180-5.

30 - European Centre for Disease Prevention and Control. Risk assessment on the

spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae (CPE) through patient transfer

between healthcare facilities, with special emphasis on cross-border transfer.

Estocolmo: ECDC, 2011.

31 – Ting, S. et al (2018). Risk factors and outcomes for the acquisition of carbapenem-

resistant Gram-negative bacillus bacteremia: A retrospective propensity-matched case

control study. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 51, pp. 621-628.

32- Palacios-Baena, Z. et al (2016). Comprehensive clinical and epidemiological

assessment of colonisation and infection due to carbapenemase-producing

Enterobacteriaceae in Spain. J Infect, 72(2), pp.152–60.

33- Marchenay, P. et al (2015). Acquisition of carbapenem-resistant Gram-negative

bacilli in intensive care unit: Predictors and molecular epidemiology. Médecine et

Maladies Infectieuses, 45(1–2), pp. 34–40.

34 – Direção geral de saúde [Em linha]. Disponível em <https://www.dgs.pt/estatisticas-

de-saude/estatisticas-de-saude/publicacoes/portugal-controlo-da-infecao-e-resistencia-

aos-antimicrobianos-em-numeros-2015-pdf.aspx> [Consultado em 5/2/2019].

35 – Bonomo, R. et al (2018). Carbapenemase-Producing Organisms: A Global

Scourge. Clin Infect Dis, 66(8), pp.1290-1297.


126

36 – Satlin, M. et al (2013). Emergence of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae as

causes of bloodstream infections in patients with hematologic malignancies. Leukemia

& Lymphoma, 54(4), pp.799–806.

37 - Al-Zahrani, I. (2018). Routine detection of carbapenem-resistant gram-negative

bacilli in clinical laboratories. Saudi Med J, Vol. 39 (9), pp.861-872.

38 - Singh-Moodley, A. e Perovic, O. (2018). Phenotypic and genotypic correlation of

carbapenememase-producing Enterobacteriaceae and problems experienced in routine

screening. S Afr Med J, 108(6), pp.495-501.

39 - Kruse, E., Aurbach, U. e Wisplinghoff, H. (2013) Carbapenem-Resistant

Enterobacteriaceae: Laboratory Detection and Infection Control Practices. Curr Infect

Dis Rep.

40 - Miriagou, V. et al (2013). Combined disc methods for the detection of KPC- and/or

VIM-positive Klebsiella pneumoniae: improving reliability for the double

carbapenemase producers. Clin Microbiol Infect, 19, pp. 412-415.

41 - Simner, P. et al (2016). Evaluation of Multiple Methods for Detection of

Gastrointestinal Colonization of Carbapenem-Resistant Organisms from Rectal Swabs.

J Clin Microbiol, 54, pp.1664-1667.

42 - Viau, R. et al (2016). Intestinal Carriage of Carbapenemase-Producing Organisms:

Current Status of Surveillance Methods. Clin Microbiol Rev, 29, pp.1-27.

43 - Lutgring, J. e Limbago, B. (2016). The Problem of Carbapenemase- Producing-

Carbapenem-Resistant-Enterobacteriaceae Detection. J Clin Microbiol, 54, pp.529-534.

44 - Shinde, S. et al (2017). Carba NP as a simpler, rapid, cost-effective, and a more

sensitive alternative to other phenotypic tests for detection of carbapenem resistance in

routine diagnostic laboratories. J Lab Physicians, 9, pp.100-103.

45 - Tamma, P. e Simner, P. (2018). Phenotypic Detection of Carbapenemase-

Producing Organisms from Clinical Isolates. J ClinMicrobiol, 56(11), pp.1-13.

46 - Van der Zwaluw, K. et al (2015). The carbapenem inactivation method (CIM), a

simple and low-cost alternative for the Carba NP test to assess phenotypic

carbapenemase activity in gram-negative rods. PloS one, 10.

47 – Yamada, K. et al (2016). Comparison of the Modified-Hodge test, Carba NP test,

and carbapenem inactivation method as screening methods for carbapenemase-

producing Enterobacteriaceae. J. Microbiol Methods, 128, pp.48-51.


127

48 - Hoyos-Mallecot, Y. et al (2014). Rapid detection and identification of strains

carrying carbapenemases directly from positive blood cultures using MALDI-TOF MS.

J Microbiol Methods, 105, pp.98-101.

49 - Papagiannitsis, C. et al (2015). Matrix-assisted laser desorption ionizationtime of

flight mass spectrometry meropenem hydrolysis assay with NH4HCO3, a reliable tool

for direct detection of carbapenemase activity. J Clin Microbiol, 53, pp.1731–1735.

50 - Hrabak, J., Chudackova, E. e Papagiannitsis, C. (2014). Detection of

carbapenemases in Enterobacteriaceae: a challenge for diagnostic microbiological

laboratories. Clin Microbiol Infect, 20, pp.839-853.

51 - Anandan, S. et al (2015). Rapid screening for carbapenem resistant organisms:

current results and future approaches. J Clin Diagn Res, 9, pp.1–3.

52 - Kaase, M. et al (2012). Detection of carbapenemases in Enterobacteriaceae by a

commercial multiplex PCR. J Clin Microbiol, 50, pp.3115–3118.

53 - McNicholas, S. et al (2011). DNA microarray genotyping and virulence and

antimicrobial resistance gene profiling of methicillin-resistant Staphylococcus aureus

bloodstream isolates from renal patients. J Clin Microbiol, 49, pp.4349-4351.

54 - Miller, M. e Tang, Y. (2009). Basic concepts of microarrays and potential

applications in clinical microbiology. Clin Microbiol Rev, 22, pp.611-633.

55 - Lupo, A. et al (2013). Non-phenotypic tests to detect and characterize antibiotic

resistance mechanisms in Enterobacteriaceae. Diagn Microbiol Infect Dis, 77, pp.179-

194.

56 - Sanger, F., Nicklen, S. e Coulson, A. (1977). DNA sequencing with chain-

terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci, 74, pp.5463- 5467.

57 - Mathers, A. et al (2015). Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)-producing

K. pneumoniae at a single institution: insights into endemicity from wholegenome

sequencing. Antimicrob Agents Chemother, 59, pp.1656–1663.

58 - Banerjee, R. e Humphries, R. (2017). Clinical and laboratory considerations for the

rapid detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Virulence, 8, pp.427-439.

59 - Lutgring, J. e Limbago, B. (2016). The Problem of Carbapenemase- Producing-

Carbapenem-Resistant-Enterobacteriaceae Detection. J Clin Microbiol, 54, pp.529-534.


128

60 – Senchyna, F. et al (2019). Diversity of resistance mechanisms in carbapenem-

resistant Enterobacteriaceae at a health care system in Northern California, from 2013

to 2016. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 93(3), pp.250-257.

61 – Dortet, L., Poirel, L. e Nordmann, P. (2012). Rapid Identification of

carbapenemase types in Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp. by using a

biochemical test. Antimicrob Agents Chemother, 56(12), pp.6437-6440.

62 – Dandachi, I. et al (2018). Prevalence and Emergence of Extended-Spectrum

Cephalosporin, Carbapenem and Colistin-Resistant Gram Negative Bacteria of Animal

Origin in the Mediterranean Basin. Front Microbiol, 9, pp.2299.

63 - Nordmann, P., Naas, T. e Poirel, L. (2011) Global Spread of

Carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis, 17, pp.1791-1798.

64 - Ferrer, R. et al (2014). Empiric antibiotic treatment reduces mortality in severe

sepsis and septic shock from the first hour: results from a guideline-based performance

improvement program. Crit Care Med, 42, pp.1749-1755.

65 - Wilson, J. et al (2011). Trends among pathogensreported as causing bacteraemia in

England, 2004-2008. Clin Microbiol Infect, 17, pp.451-458.

66 - Theuretzbacher, U. et al (2015). Reviving old antibiotics. J Antimicrob Chemother,

70, pp -2177-2181.

67 – Uptodate. Colistin: An overview [Em linha]. Disponível em

<https://www.uptodate.com/contents/colistinanoverview> [Consultado em 12/03/2019].

68 - Falagas, M. e Kasiakou, S. (2005). Colistin: the revival of polymyxins for the

management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections. Clin Infect Dis,

40, pp.1333-1341.

69 – Qureshi, Z. et al (2012). Treatment outcome of bacteremia due to KPC-producing

Klebsiella pneumoniae: superiority of combination antimicrobial regimens. Antimicrob

Agents Chemother,56, pp.2108-2113.

70 - Mediavilla, J. et al (2016). Colistin- and Carbapenem- Resistant Escherichia coli

Harboring mcr-1 and blaNDM-5, Causing a Complicated Urinary Tract Infection in a

Patient from the United States. MBio, 7, pp.01191-16.

71 - Yu, H. et al (2016). Detection of the mcr-1 Colistin Resistance Gene in

Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae from Different Hospitals in China.

Antimicrob Agents Chemother, 60, pp.5033-5035.


129

72 - Oliva, A. et al (2016). Severe Bloodstream Infection due to KPC-Producer E. coli

in a Renal Transplant Recipient Treated with the Double- Carbapenem Regimen and

Analysis of In Vitro Synergy Testing: A Case Report. Medicine (Baltimore), 95,

pp.2243.

73 – Oliva, A. et al (2014). Synergistic activity and effectiveness of a double-

carbapenem regimen in pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream

infections. J Antimicrob Chemother, 69, pp.1718-1720.

74 - Greer, N. (2006). Tigecycline (Tygacil): the first in the glycylcycline class of

antibiotics. Proc (Bayl Univ Med Cent), 19, pp.155-161.

75 - Ni, W. et al (2016). Tigecycline Treatment for Carbapenem-Resistant

Enterobacteriaceae Infections: A Systematic Review and Meta-Analysis. Medicine

(Baltimore), 95, pp.3126.

76 - Tumbarello, M. et al (2012). Predictors of mortality in bloodstream infections

caused by Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae:

importance of combination therapy. Clin Infect Dis, 55, pp.943-950.

77- Abbott, I. et al (2013). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii:

Laboratory challenges, mechanistic insights and therapeutic strategies. Expert Rev. Anti-

Infect. Ther., 11, pp.395–409.

78 - Hara, G. et al (2013). Detection, treatment, and prevention of carbapenemase-

producing Enterobacteriaceae: Recommendations from an International Working

Group. J. Chemother., 25, pp.129–140.

79 - Satlin, M. et al (2011). Comparative effectiveness of aminoglycosides, polymyxin

B, and tigecycline for clearance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae from

urine. Antimicrob. Agents Chemother, 55, pp.5893–5899.

80 - Falagas, M. et al (2008). Fosfomycin: Use beyond urinary tract and gastrointestinal

infections. Clin. Infect. Dis., 46, pp.1069–1077.

81 - Neuner, E. et al (2012). Experience with fosfomycin for treatment of urinary tract

infections due to multidrug-resistant organisms. Antimicrob. Agents Chemother., 56,

pp.5744–5748.

82 - Van Duin, D. et al (2013). Carbapenemresistant Enterobacteriaceae: a review of

treatment and outcomes. Diagn Microbiol Infect Dis, 75, pp.115-120.


130

83 – Bellais, S. et al (2002). Efficacy of beta-lactams for treating experimentally

induced pneumonia due to a carbapenem-hydrolyzing metallo-beta-lactamase-producing

strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother, 46, pp. 2032.

84 - Jayol, A. et al (2018). Ceftazidime/avibactam alone or in combination with

aztreonam against colistin-resistant and carbapenemase-producing Klebsiella

pneumoniae. J Antimicrob Chemother, 73, pp. 542.

85 – Shaw, E. et al (2018). Clinical outcomes after combination treatment with

ceftazidime/avibactam and aztreonam for NDM-1/OXA-48/CTX-M-15-producing

Klebsiella pneumoniae infection. J Antimicrob Chemother, 73, pp. 1104.

86 – Hujer, K. et al (2006). Analysis of antibiotic resistance genes in multidrug-resistant

Acinetobacter spp. isolates from military and civilian patients treated at the Walter Reed

Army Medical Center. Antimicrob Agents Chemother, 50, pp. 4114.

87 – Lolans, K. et al (2006). Multicity outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter

baumannii isolates producing the carbapenemase OXA-40. Antimicrob Agents

Chemother, 50, pp. 2941.

88 - Wu, G., Abraham, T. e Lee, S. (2016). Ceftazidime-Avibactam for Treatment of

Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Bacteremia. Clin Infect Dis, 63, pp. 1147-

1148.

89 - Metan, G. e Akova, M. (2016). Reducing the impact of carbapenem-resistant

Enterobacteriaceae on vulnerable patient groups: what can be done? Curr Opin Infect

Dis, 29, pp. 555-560.

90 – Business Wire. FDA Grants Fast Track Status for Investigational Antibiotic

CARBAVANCE® (meropenem-vaborbactam) [Em linha]. Disponível em

<http://www.businesswire.com/news/home/20160 411005581/en/> [Consultado em

5/4/2019].

91 – Nasdaq. Achaogen Announces Positive Results in Phase 3 cUTI and CRE Clinical

Trials of Plazomicin [Em linha]. Disponível em <http://www.nasdaq.com/press-

release/achaogenannounces-positive-results-in-phase-3-cuti-and-cre-clinical-trialsof-

plazomicin-20161212-00195> [Consultado em 20/5/2019].

92- Qureshi, Z. et al (2012). Treatment outcome of bacteremia due to KPC-producing

Klebsiella pneumoniae: Superiority of combination antimicrobial regimens. Antimicrob.

Agents Chemother, 56, pp. 2108–2113.

https://www.uptodate.com/contents/overview-of-carbapenemase-producing-gram-negative-bacilli/abstract/119

















131

93- Lee, G. e Burgess, D. (2012). Treatment of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase

(KPC) infections: A review of published case series and case reports. Ann. Clin.

Microbiol. Antimicrob.,11, pp. 32.

94 – Alhashem, F. et al (2017). Treatment of sepsis: What is the antibiotic choice in

bacteremia due to carbapenem resistant Enterobacteriaceae? World J Clin Cases, 5(8),

pp. 324-332.

95 - WHO. First global report on antibiotic resistance [Em linha] Disponível em

<http://www.who.int/mediacentre/news/ releases/2014/amr-report/en/> [Consultado em

25/5/2019].

96 – Gupta, N. et al (2011). Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: epidemiology

and prevention. Clinical Infectious Diseases, 53, pp. 60-7.

97 - Centers for Disease Control and Prevention. Guidance for Control of Carbapenem-

resistant Enterobacteriaceae (CRE) - 2012 CRE Toolkit. CDC; 2012.

98 – Miriagou, V. et al. (2010). Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterial

pathogens: detection and surveillance issues. Clinical Microbiology and Infection, 16,

pp. 112-22.

99 – Pollack, L. et al (2016). A Concise Set of Structure and Process Indicators to

Assess and Compare Antimicrobial Stewardship Programs Among EU and US

Hospitals: Results From a Multinational Expert Panel. Infect Control Hosp Epidemiol.,

37(10), pp. 1201–11.

100 – Magiorakos, A. et all (2017). Infection prevention and control measures and tools

for the prevention of entry of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae into healthcare

settings: guidance from the European Centre for D sease Prevention and Control.

Magiorakos et al. Antimicrobial Resistance and Infection Control, 6:113, pp. 1186.

101 - Direção geral de saúde [Em linha]. Disponível em <https://www.dgs.pt/programa-

nacional-de-controlo-da-infeccao/relatorios/programa-de-prevencao-e-controlo-de-

infecoes-e-de-resistencia-aos-antimicrobianos-relatorio-2017.aspx> [Consultado em

10/6/2019].

102 - World Health Organization. Evidence of hand hygiene to reduce transmission and

infections by multidrug resistant organisms in health-care settings [Em linha].

Disponível em <http://www.who.int/gpsc/5may/MDRO_ literature-review.pdf >

[Consultado em 5/7/2019].


132

103 - European Centre for Disease Prevention and Control. Systematic review of the

effectiveness of infection control measures to prevent the transmission of

carbapenemase-producing Enterobacteriaceae through cross-border transfer of patients.

Estocolmo: ECDC; 2014.

104 – Carmeli, Y. et al (2010). Controlling the spread of carbapenemase-producing

Gram-negatives: therapeutic approach and infection control. Clinical Microbiology and

Infection, 16, pp. 102-11.

105 – Zingg, W. et al (2014). Hospital organisation, management, and structure for

prevention of healthcare- associated infection: a systematic review and expert

consensus. Lancet Infect Dis., 15(2), pp. 212–24.

Documents

Universidade de Lisboa Faculdade de Farmácia · TGL - Triglicéridos TIBC - Capacidade Total de Ligação do Ferro TnT - Troponina T TRH - Hormona Libertadora de Tireotrofina TSA