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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES MARIA GABRIELA DE BENEDICTIS DELPHINO
ANÁLISE DA COMUNIDADE BACTERIANA DE CECROPIA PACHYSTACHYA E O SEU POTENCIAL PARA PRODUÇÃO DE
ANTIBIÓTICOS
Mogi das Cruzes, SP
2010
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES MARIA GABRIELA DE BENEDICTIS DELPHINO
ANÁLISE DA COMUNIDADE BACTERIANA DE CECROPIA PACHYSTACHYA E O SEU POTENCIAL PARA PRODUÇÃO DE
ANTIBIÓTICOS
Dissertação apresentada do Programa de Pós-Graduação da UMC como parte dos requisitos para a obtenção do grau de mestre em Biotecnologia.
Profº Orientador. Dr. Welington Luiz de Araújo
Mogi das Cruzes, SP 2010
FICHA CATALOGRÁFICA Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Delphino, Maria Gabriela de Benedictis Análise da comunidade bacteriana de Cecropia
pachystachya e o seu potencial para produção de antibióticos / Maria Gabriela de Benedictis Delphino. – 2010. 63 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, 2009 Área de concentração: Genética e microbiologia Orientador: Profº Drº Welington Luiz de Araújo 1. Endofíticos 2. Embaúbas 3. Patógenos 4. Controle biológico I. Araújo, Welington Luiz de CDD 632.96
DEDICO À minha avó Maria Gagliardi De Benedictis
OFEREÇO
Aos meus pais, Sebastião e Fátima,
a meu namorado Everton,
e a meus irmãos Maurício, Rodrigo e Daniel.
AGRADECIMENTOS
Agradeço bastante a todos que tanto me auxiliaram na realização desta pesquisa:
À Universidade de Mogi das Cruzes e ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia,
Em especial ao Professor Dr. Welington Luiz Araújo pela confiança, pelo apoio e pela
mão segura que me guiou pela vielas da ciência,
A Professora Dra Kátia Mazzei que sempre me incentivou, ensinou e apoiou todos os
trabalhos de pesquisa no Parque Estadual da Cantareira,
A toda equipe de trabalho do Parque Estadual da Cantareira, que “me abriram as portas”
para todas as pesquisas no local,
A todos os professores da UMC que sempre compartilharam conhecimentos e orientações,
Ao grupo maravilhoso com o qual convivi no Laboratório de Biologia Molecular e
Ecologia Microbiana / NIB - Núcleo Integrado de Biotecnologia, que se tornaram grandes
amigos: Carol Bertini, Emy, Fernanda, Flávia, Luciana, Janaína, Maria Cristina, Marília,
Maristela e Roberta,
Com um grande beijo ao Almir, a Aline, a Juliana e à Fernanda Cristina que tanto me
guiaram e me colocaram no caminho certo,
A todos os meus amigos, tenho a agradecer a amizade, carinho, apoio, incentivo e
coragem que sempre me deram em todos os momentos;
Finalmente, agradeço à minha família, em especial aos meus Pais (minha mãe Fátima que
sempre me incentivou e me ajudou na realização deste trabalho), Irmãos, Cunhados e
principalmente meu namorado Everton, pelo estímulo, pela presença sempre atenta, amor,
carinho dedicado, compreensão, ajuda, apoio, incentivo, paciência e encorajamento que sempre
me deram ao longo de todos esses anos!
Maria Gabriela Delphino
RESUMO
Microrganismos endofíticos colonizam os espaços intercelulares dos tecidos vegetais, sem causar quaisquer danos a estes. Desta forma, este nicho ecológico ocupado pelos endófitos, os favorecem para o controle biológico de patógenos e pragas, pois neste local poderiam competir por nutrientes e espaço com os patógenos, bem como produzir substâncias tóxicas a estes organismos ou ainda, induzir a planta a desenvolver resistência às doenças. Estudos recentes têm mostrado que pelo menos 15 gêneros de bactérias são capazes de controlar doenças fúngicas ou bacterianas em culturas de interesse, destes, os gêneros Bacillus e Pseudomonas apresentam um maior potencial para o controle efetivo de fungos e bactérias. O objetivo geral deste projeto foi de avaliar a diversidade de bactérias endofíticas de plantas de Embaúbas (Cecropia pachystachya)
presentes no Parque Estadual da Cantareira, no município de São Paulo, bem como a capacidade destas bactérias em produzir antibióticos contra S.aureus, C. albicans, E.coli e F. oxysporum. Foram realizadas três coletas de Embaúba durante o período de 2008. Em cada coleta foram selecionadas três plantas em pontos distintos do Parque e para cada planta selecionada foram extraídos cinco ramos. Após a coleta foi avaliada a densidade bacteriana para cada ramo e feita a realização de testes de antagonismos com diferentes patógenos. Foi observado que a densidade bacteriana em Cecropia sp. variou entre as coletas, sendo observado uma densidade de 2,4 x103 UFC por grama de tecido vegetal. Pode-se concluir que a terceira coleta demonstrou maior densidade bacteriana. Os isolados encontrados com maior freqüência foram do gênero Bacillus e Pseudomonas. Estas bactérias podem estar inibindo a ação de inúmeros microrganismos patógenos presentes nos mesmos vegetais. Dentre os testes de antagonismos realizados, foi observado que 1% dos isolados foram capazes de inibir in vitro a bactéria patogênica Staphylococcus aureus. Já os testes realizados com a bactéria Escherichia coli mostraram que 1,01% dos isolados endofíticos avaliados foram capazes de inibir in vitro a bactéria. Houve uma inibição mais relevante ao fungo Fusarium oxysporum, onde 6,13% dos isolados foram capazes de inibir este fitopatógeno. Não houve inibição ao patógenos C.albicans. Dentre todas as inibições, pode-se perceber que Bacillus sp e Pseudomonas sp se mostraram muito eficazes aos patógenos testados, sugerindo portanto, um controle biológico destes patógenos em Cecropia sp. Palavras-chave: Endofíticos, Embaúbas, Patógenos e Controle Biológico.
ABSTRACT
Endophytic microorganisms colonize the intercellular spaces of plant tissues without causing any damage to them. Thus, this ecological niche occupied by the endophytes, the favor for the biological control of pathogens and pests, for this site could compete for nutrients and space with the pathogens and produce substances toxic to the organisms or even induce the plant to develop resistance to disease. Recent studies have shown that at least 15 genera of bacteria are able to control fungal diseases or bacterial cultures of interest, of the genera Bacillus and Pseudomonas have a greater potential for effective control of fungi and bacteria. The aim of this project was to assess the diversity of endophytic bacteria of plants trumpet trees (Cecropia pachystachya) present Cantareira State Park, in São Paulo, and the ability of these bacteria to produce antibiotics against S. aureus, C. albicans, E. coli and F. oxysporum. Were three collections Embauba during the period of 2008. At each harvest plants were selected from three different sites of the Park and for each selected plant were extracted five branches. After the collection was evaluated in bacterial density for each branch and made the testing of antagonism with different pathogens. Was observed that the bacterial density in Cecropia sp. varied among the samples, and observed a density of 2.4 x103 UFC per gram of plant tissue. It can be concluded that the third collection showed higher bacterial density. Isolates most frequently found were of the genus Bacillus and Pseudomonas. These bacteria may be inhibiting the action of many pathogenic microorganisms present in the same plant. Among the tests performed antagonism was observed that 1% of the isolates were able to inhibit in vitro the pathogenic bacterium Staphylococcus aureus. The tests performed with the bacterium Escherichia coli showed that 1.01% of the endophytic isolates evaluated were able to inhibit in vitro the bacterium. There was a disqualification most relevant to the fungus Fusarium oxysporum, where 6.13% of the isolates were able to inhibit this pathogen. There was no inhibition to the pathogen C.albicans. Among all inhibitions, can be seen that Bacillus sp and Pseudomonas sp were very effective against pathogens tested, suggesting therefore, a biological control of pathogens in Cecropia sp. Keywords: Endophytic, Embaubas, pathogens and Biological Control.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 01 Embaúbas (Cecropia pachystachya)..................................... 15 FIGURA 02 Parque Estadual da Cantareira............................................... 23 FIGURA 03 Média da densidade bacteriana das três coletas.................... 30 FIGURA 04 Presença de halos de inibição contra Staphylococcus
aureus produzido pelos isolados Bacillus sp (09), Pseudomonas sp (12) e Enterobacter sp (15) indicados pelas setas (dados obtidos pelo GenBank).............................
32 FIGURA 05 Presença de halos de inibição contra Escherichia coli
produzido pelos isolados Pseudomonas sp (12) e Enterobacter sp (15) indicados pelas setas (dados obtidos pelo GenBank)..........................................................
33 FIGURA 06 Observação de halos de inibição nos isolados selecionados:
A: Controle; B: Sem inibição; C: Formação de Halo de Inibição em 02 (Bacillus sp); D: Formação de Halo de Inibição em 01(Bacillus sp) e 02 (Bacillus sp) (Dados de identificação obtidos pelo GenBank).....................................
34 FIGURA 07 Porcentagem de bactérias endofíticas capazes de inibir
fungos e bactérias e patogênicas............................................
35
SUMÁRIO
1 APRESENTAÇÃO.......................................................................... 9 2 INTRODUÇÃO............................................................................... 10 2.1Aspectos Gerais............................................................................... 10 2.2 Revisão da Literatura...................................................................... 10 2.3 Microrganismos Endofíticos.......................................................... 11 2.4 Bactérias Endofíticas...................................................................... 13 2.5 As Embaúbas.................................................................................. 14 2.5.1 Estudos farmacológicos com as Embaúbas................................. 16 2.6 Infecções bacterianas causadas em animais herbívoros................. 17 2.7 Biologia Molecular no estudo de ecologia microbiana.................. 20 3 OBJETIVOS.................................................................................... 21 3.1 Objetivo Geral................................................................................ 21 3.2 Objetivos Específicos..................................................................... 21 4 MÉTODO......................................................................................... 22 4.1 Caracterização da área de estudo.................................................... 22 4.2 Coleta de amostras.......................................................................... 22 4.2.1 Isolamento de Bactérias Endofíticas........................................... 24 4.3 Teste de Antibiose.......................................................................... 25 4.3.1 Testes com bactérias e levedura patogências.............................. 25 4.3.2 Inibição do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum............. 26 4.4 Caracterização molecular das bactérias.......................................... 27 4.4.1 Extração do DNA bacteriano...................................................... 27 4.4.2 Amplificação do 16s Dna.......................................................... 27
4.4.3 Seqüenciamento do 16s Dna...................................................... 28 5 RESULTADOS................................................................................ 29 5.1 Densidade Bacteriana..................................................................... 29 5.2 Diversidade bacteriana associada à Cecropia sp............................ 30 5.2.1 Diversidade bacteriana associada à embaúba.............................. 31 5.3 Produção de Agentes antimicrobianos........................................... 32 6 DISCUSSÃO.................................................................................... 36 7 CONCLUSÕES............................................................................... 45 REFERÊNCIAS................................................................................. 46
9
1 APRESENTAÇÃO
A teoria de que bactérias não patogênicas residem em tecidos de plantas foi
formulada por Perotti em 1926 (HALLMANN et al., 1997). Porém, estudos sobre a
colonização de tecidos internos de plantas sadias por bactérias datam de 1870, com os
trabalhos de Pasteur e outros pesquisadores (HOLLIS, 1951). Os primeiros relatos
consideraram as bactérias endofíticas como contaminantes resultantes da desinfestação
superficial incompleta ou como patógenos fracamente virulentos (HOLLIS, 1951).
Pesquisas recentes demonstraram que bactérias endofíticas podem promover o
crescimento das plantas e reduzir os sintomas de doenças causadas por diversos patógenos
(HALLMANN et al., 1997).
Os principais mecanismos pelos quais as bactérias endofíticas promovem o
crescimento de plantas são a fixação de nitrogênio (BODDEY e DOBEREINER, 1995) e
o controle biológico de fitopatógenos, seja este pelo antagonismo direto da microflora
deletéria ou pela indução de resistência sistêmica (HALLMANN et al., 1997). No
entanto, as bactérias endofíticas podem também promover o crescimento de plantas pela
produção de hormônios vegetais ou de substâncias análogas (ARSHAD e
FRANKENBERGER, 1991).
Com relação às doenças, as bactérias endofíticas mostraram-se eficientes agentes
de biocontrole de diversos patógenos, tanto de origem fúngica quanto bacteriana
(HALLMANN et al., 1997).
Diversos microrganismos estão presentes em plantas, tais como, em Cecropia sp,
causando inúmeros benefícios e/ou malefícios nestes vegetais, como também nos animais
que se alimentam dos mesmos.
10
2 INTRODUÇÃO
2.1 Aspectos Gerais Bactérias endofíticas estão presentes em todas as espécies vegetais, permanecendo em
estado de latência ou colonizando ativamente os tecidos de forma local ou sistêmica. Por
ocuparem um nicho ecológico semelhante àqueles ocupados por patógenos, as bactérias
endofíticas apresentam grande potencial para o controle biológico (HALLMANN et al., 1997).
Este controle pode ser resultante de diversos mecanismos: competição por espaço e
nutrientes na planta hospedeira; produção de compostos antimicrobianos (PLEBAN et al.,1997);
indução de resistência sistêmica (M'PIGA et al., 1997; BENHAMOU et al., 1998; DUIJFF et al.,
1997).
2.2 Revisão de Literatura
Endófitos são microrganismos que habitam o interior das plantas, sendo encontrados em
órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes sem causar doenças e sem produzir
estruturas externas visíveis (AZEVEDO et al., 2000).
A comunidade endofítica é constituída principalmente por fungos e bactérias que, ao
contrário dos microrganismos patogênicos, não causam prejuízo à planta hospedeira (PEIXOTO
NETO et al., 2002).
Trabalhos de pesquisa relatando a ocorrência de microrganismos endofíticos,
principalmente o isolamento e caracterização de fungos e bactérias, são relativamente recentes,
constatando-se sua existência em gramíneas (CLAY, 1988; SILVA et al., 1995), ericáceas
(PETRINI, 1984) araceas, bromeliaceas e orquidaceas (PETRINI et al., 1981), e em plantas
herbáceas e arbustivas (SCHULZ et al., 1993). A versatilidade bioquímica e diversidade de
endofíticos representam uma enorme variedade de genes que são ainda desconhecidos. Está se
descobrindo cada vez mais funções gênicas, particularmente para remediação ambiental e
propósitos industriais.
Assim, o uso de bactérias e fungos abre novas áreas de exploração biotecnológica, que
dita a necessidade de isolar, caracterizar e determinar a biodiversidade microbiana em diferentes
espécies de plantas (EMBRAPA, 2009).
11
A avaliação da diversidade de bactérias diazotróficas presentes nos tecidos, nos diferentes
estágios de desenvolvimento da planta, pode ajudar a compreender o papel desses
microrganismos em seu habitat natural (RODRIGUES et al.), 2006.
Endofíticos são usados para controle biológico, para características agronômicas
melhoradas e para agentes farmacológicos. Dentre os gêneros mais estudados como agentes de
controle biológico estão Bacillus e Pseudomonas (EMBRAPA, 2009).
A família Cecropiaceae é composta por espécies utilizadas para fins medicinais,
distribuídas em seis gêneros, sendo Cecropia o mais importante. Este gênero é conhecido
popularmente por embaúba e formado por 75 espécies tropicais encontradas ao redor de florestas
densas, lagos e áreas devastadas (TANAE et al., 2007).
Um grande número de microrganismos podem viver associados às plantas do gênero
Cecropia podendo trazer inúmeros benefícios ou também causando inúmeras doenças.
2.3 Microrganismos Endofíticos
Um grande número de microrganismos pode viver associado aos vegetais, tanto em sua
superfície como em seu interior. Entre eles, estão os que podem ser classificados como
microrganismos epifíticos ou simplesmente epífitos, os quais habitam a superfície dos órgãos e
tecidos vegetais e os microrganismos endofíticos ou simplesmente endófitos, os quais habitam o
interior das plantas hospedeiras e que se distinguem de outro grupo, os patógenos que são
capazes de causar doenças em plantas (MENDES e AZEVEDO, 2007).
Praticamente todos os principais grupos de microrganismos convivem com vegetais, mas
os fungos e bactérias são os mais comumente encontrados em interações microrganismos-plantas
(PROSSER, 2007)
Estima-se que o número de células microbianas que vivem em contato com vegetais é
bastante superior ao número de células que formam o próprio hospedeiro. São várias as razões
para que as investigações na área de endófitos sejam continuadas e ampliadas, como por
exemplo: a) os microrganismos compõem uma das maiores fontes de diversidade genética
disponível entre os seres vivos (PROSSER et al., 2007); b) faltam informações nos aspectos
ecológicos, genéticos e fisiológicos para elucidar a interação microrganismo-planta; c) vários
endófitos apresentam produção de antibióticos e outros metabólitos de interesse farmacológico
(ZHANG et al.,2006); d) eles podem ser utilizados como bioindicadores de alterações ecológicas
12
(HELANDER e RANTIO-LEHTIMÄKI, 1990); e) atuam como agentes no controle biológico de
pragas e doenças (WHITE JR e COLE, 1985; BUCHENAUER, 1998); f) produzem
microherbicidas para controle de ervas daninhas (CERKAUSKAS, 1988); g) podem funcionar
como vetores para a expressão de genes em plantas hospedeiras (HAAPALAINEN et al., 1998);
e h) vários endófitos são indicadores de deficiências nutricionais de plantas (BLODGETT et al.,
2007).
A grande maioria dos estudos com endófitos tem sido realizada em plantas de clima
temperado, entretanto, recentemente, plantas de clima tropical têm sido pesquisadas quanto à
presença, quantidade e diversidade de fungos endofíticos encontrados (AZEVEDO e ARAÚJO,
2007).
Os microrganismos endofíticos podem atuar na promoção do crescimento da planta por
meio da produção de substâncias, tais como auxinas, giberelinas e citocininas, as quais podem
melhorar a absorção de minerais e o aproveitamento hídrico pela planta (JAMES et al., 2002;
OLIVEIRA et al., 2002; BAZZICALUPO e OKON, 2000).
As interações endófito/planta, ainda não são muito bem compreendidas, mas podem ser
simbióticas, neutras ou antagônicas (neste caso, estudadas pela fitopatologia). Nas interações
simbióticas os microrganismos produzem ou induzem a produção de metabólitos primários e
secundários que podem conferir diversas vantagens à planta tais como: a diminuição da
herbivoria e do ataque de insetos, o aumento da tolerância a estresses abióticos e o controle de
outros microrganismos (ARAÚJO, 1996; RODRIGUES e DIAS FILHO, 1996; PEREIRA,
1993). Exemplo de metabólitos que podem ser induzidos pelos endófitos são as fitoalexinas,
substâncias de baixo peso molecular com atividades antimicrobianas, produzidas pelas plantas
ante a ação de microrganismos ou de agentes estressantes (CORDEIRO NETO e DIETRICH,
1992). Da parte dos fungos, pode-se citar a produção de micotoxinas, metabólitos secundários
que podem causar doenças em humanos e outros animais (CLAY, 1988; D'MELLO e
MACDONALD, 1997).
Ultimamente, tem sido investidos recursos em pesquisas, para disponibilizar fontes
alternativas de nutrientes às plantas, e em metodologias alternativas de controle de patógenos,
com enfoque no uso de microrganismos endofíticos (KUSS et al., 2007; BARROSO e NAHAS,
2008; RYAN et al., 2008; LUCON et al., 2009).
13
2.4 Bactérias Endofíticas
Os primeiros relatos consideraram as bactérias endofíticas como contaminantes
resultantes da desinfestação superficial incompleta ou como patógenos fracamente virulentos
(HOLLIS, 1951). Entretanto, pesquisas recentes demonstraram que bactérias endofíticas podem
promover o crescimento das plantas e reduzir os sintomas de doenças causadas por diversos
patógenos (HALLMANN et al., 1997).
A presença de bactérias endofíticas em tecidos de plantas saudáveis tem sido relatada para
muitas espécies cultivadas, em diferentes estágios de crescimento. As comunidades endofíticas
variam espacialmente na planta (FISHER et al., 1992) ou podem ser dependentes da interação
com outras bactérias endofíticas ou patogênicas (QUADT-HALLMANN et al., 1997).
Bactérias endofíticas têm mostrado efeitos benéficos na promoção do crescimento vegetal
e saúde em diversas culturas, sendo que os principais modos de ação descritos são: fixação de
nitrogênio, produção de fitormônios e compostos antifúngicos, ou ainda, indução de resistência
sistêmica (LODEWYCKX et al., 2002; SESSITSCH et al., 2002; INIGUEZ et al., 2004;
KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004; COMPANT et al., 2005; MEHNAZ e LAZAROVITS,
2006; ROSENBLUETH e MARTÍNEZ-ROMERO, 2006).
Os gêneros mais comumente isolados incluem: Bacillus, Burkholderia, Enterobacter,
Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas (HALLMANN et al., 1997). Em plantas de citrus
cultivadas no estado de São Paulo e Minas Gerais, (ARAÚJO et al., 2001) isolaram-se as
seguintes espécies: Alcaligenes sp., Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Burkhloderia cepacia,
Curtobacterium flaccumfaciens, Enterobacter cloacae, Methylobacterium spp, Nocardia sp.,
Pantoea agglomerans, Streptomyces sp. e Xanthomonas campestris. Pantoea agglomerans e
Sphingomonas sanguinis foram isoladas como endófito de batata doce no Japão (ADACHI et al.,
2002). Zinniel et al., (2002) identificaram pela primeira vez a natureza endofítica da
Microbacterium testaceum em várias plantas hospedeiras. Krechel et al., (2002) encontraram em
batata (Solanum tuberosum cv. Cilena) os endófitos bacterianos, Pantoea agglomerans e
Stenotrophomonas maltophilia, os quais pertencem ao subgrupo das g-Proteobacteria, que foram
as espécies isoladas com maior freqüência. Pantoea agglomerans é também citada como bactéria
endofítica de milho e outras espécies de plantas (QUADT-HALLMANN et al., 1997), enquanto
S. maltophilia é um colonizador endofítico comum de batata (GARBEVA et al., 2001).
14
2.5 As Embaúbas (Cecropia pachystachya)
A Cecropia pachystachya (embaúba), também conhecida pelos nomes de umbaúba,
imbaúba, embaúva, umbaúba-do-brejo, árvore-da-preguiça, umbaubeira, pau-de-lixa, umbaúba-
branca, árvore-da-preguiça, entre outras (HIKAWCZUK et al.,1998; HASHIMOTO, 2002), é
característica de solos de maior umidade, típica da borda de matas, clareiras grandes e de estradas
e tem preferência pelos locais ensolarados, sendo rara sua presença no interior de matas fechadas.
Floresce de setembro a outubro e frutifica de maio a junho. O desenvolvimento das plantas no
campo é rápido. Os frutos são procurados pelas aves e servem de alimento a várias espécies de
peixes, como pacu, piracanjuba e outros (BALBACHA, 1960).
Essa planta se distribui desde o México até a Argentina. No Brasil, situa-se
principalmente no litoral do Nordeste, passando por Sudeste, Centro-Oeste e chegando até Santa
Catarina. Está presente tanto na área dos cerrados quanto na de florestas variadas e formações do
complexo atlântico (ESALQ, 2004).
Fazem parte da família Urticaceae, possuem de 5 a 10 m de altura. Seus troncos são de 15
a 20 cm de diâmetro e ramificados apenas na região superior. Possuem madeira fraca e
crescimento rápido. Apresentam folhas simples, palmatífidas, com incisões que às vezes atingem
o pecíolo, formando de 9 a 13 segmentos, com face superior áspera e a inferior com densa
camada de pêlos esbranquiçados. Seus pecíolos são pilosos e possuem de 10 a 55 cm de
comprimento (VIVATERRA, 2009) (Fig. 01).
São espécies dióicas, com inflorescências masculinas ramificadas, segmentos organizados
aos pares, mais ou menos pêndulas. As femininas, também aos pares, são pêndulas na
frutificação, com bráctea pilosa. O eixo da infrutescência apresenta-se carnoso, com numerosos
frutos oblongos embutidos (cerca de 2 mm de comprimento).
É a "embaúba" mais comum de terrenos úmidos e alagadiços, podendo, contudo ocorrer
também em terrenos mais drenados. Abriga formigas no interior de seu tronco oco. A preguiça
tem nas folhas jovens um dos seus alimentos preferidos. Por este motivo também é chamada de
“árvore-da-preguiça” ou “pau-de-lixa”.
15
Preferem locais sombreados e úmidos. A flor e as sementes aparecem como um pequeno
cacho no topo da árvore (VIVATERRA, 2009). Os frutos que aí se desenvolvem são ingeridos
por muitas aves, morcegos e macacos, que espalham suas sementes (WESTPHALEN, 2006).
De acordo com Ludwig et al. (2008), a Cecropia pachystachya é o vegetal menos
abundante nas regiões de mata ciliar insular e continental Alto Rio Paraná, no Sul do Brasil, e
mesmo assim é considerado o vegetal mais consumido durante todo o ano pelos primatas da
espécie Alouatta caraya que vivem em ambas regiões.
Figura 1: Embaúbas (Cecropia pachystachya) Fonte: MELO (2009).
Segundo Lorenzi (1998), a madeira de embaúba, em condições adversas, é extremamente
suscetível ao ataque de organismos xilófagos (bactérias, fungos etc.). É muito usada no
tratamento de diabetes, tosse, bronquite e apresenta poderoso efeito diurético.
As espécies do gênero Cecropia estão entre as plantas que oferecem alimento abundante
durante todo o ano, sendo utilizadas como recurso alimentar tanto por aves "frugívoras
oportunistas", que se alimentam principalmente de insetos (TREJO PÉREZ, 1976), como por um
grande número de espécies predominantemente frugívoras, ambos os grupos potencialmente
importantes para sua dispersão.
Como em todas as plantas, existem nas Embaúbas inúmeros microrganismos que podem
ser considerados como Endófitos, como também podem existir espécies patógenas que se
ingeridas por diversos animais podem causar inúmeras doenças.
16
2.5.1 Estudos farmacológicos com as Embaúbas
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), as espécies vegetais são a
melhor e maior fonte de fármacos para humanidade. Estudos etnobotânicos têm demonstrado o
uso popular de plantas no tratamento das leishmanioses tanto por via oral, como na aplicação
tópica sobre as lesões cutâneas (FRANÇA et al., 1993; 1996; MATHIAS e EMILY, 1993;
SILVA et al., 1995; MOREIRA et al., 2002). Muitos vegetais apresentam em sua composição
substâncias das classes dos alcalóides, terpenos, lignanas, chalconas, flavonóides e lactonas
sesquiterpênicas, compostos descritos na literatura como eficazes na atividade leishmanicida
e/ou anti-Leishmania (IWU et al., 1994; QUEIROZ et al., 1996; TORRES-SANTOS, 1999;
KAM et al., 1999; ROCHA et al., 2005).
Tribos indígenas na Amazônia utilizam a embaúba para propriedades antiinflamatórias,
geralmente para reumáticas, renais e inflamações pulmonares. Para isso, preparam uma infusão
com as folhas, podendo também ser usado para diabetes, asma e outros problemas respiratórios.
Os povos indígenas, Palikur, da Guiana embrulham as folhas grandes em torno de fraturas
ósseas, hematomas e feridas, além de utilizarem para desinfetar a genitália e aliviar a dor após o
parto (TAYLOR, 2005).
No Brasil, as Embaúbas são utilizadas para todos os tipos de queixas respiratórias (como
asma, bronquite, tosse, coqueluche e pneumonia). Também é usado para diabetes, doença de
Parkinson, distúrbios renais, pressão alta, e para aumentar a força de contração do músculo
cardíaco. É considerado eficaz contra a doença de Parkinson na Colômbia e para facilitar o parto
e a menstruação. A folha é usada na Guatemala para inúmeros tratamentos, tais como, asma,
edema, reumatismo, diabetes, febre, aterosclerose e gonorréia (TAYLOR, 2005).
A planta é muito popular no México, onde é usada para diabetes, tosse, inflamação,
diarréia, irritação da bexiga, asma, obesidade, distúrbios do fígado, pressão arterial elevada, e
verrugas (TAYLOR, 2005). Em Cuba, praticamente todas as partes da planta é empregada. O
látex é considerado corrosivo e adstringente, e é usado topicamente contra verrugas, calos, herpes
(e outras doenças venéreas), e úlceras cutâneas. A casca do caule da Embaúba é usada para
reduzir o muco; já o fruto é considerado emoliente (calmante e suaviza a pele) (TAYLOR, 2005).
As folhas são consideradas para reduzir a dor, e são usadas para a asma, doenças hepáticas,
17
edema e promover a menstruação Em outras partes da América Latina e da Amazônia, são
freqüentemente apresentados como uma "cura" para a asma após apenas uma semana depois de
tomar um chá feito a partir de suas folhas, entretanto, este resultando não foi confirmado com em
investigação clínica (TAYLOR, 2005).
Estudos realizados com Cecropia pachystachya em corações de ratos demonstraram
efeitos sedativos, sugerindo que esse efeito pode ser útil no tratamento contra a tosse
(CONSOLINI et al., 2005).
2.6 Infecções bacterianas causadas em animais herbívoros
Inúmeros animais alimentam-se de diversas espécies de vegetais, tais como Embaúbas.
Esses vegetais podem conter inúmeras bactérias consideradas como endófitos além de
microrganismos fitopatógenos. Dentre os animais que mais consomem folhas e frutos de
Embaúbas (Cecropia sp), podemos citar especialmente na região da Serra da Cantareira, as
espécies de primatas Alouatta fusca (Bugios).
É bem sabido que a saúde dos animais silvestres tem sido prejudicada pela fragmentação
e degradação de habitats, pelo isolamento de populações, e pela maior proximidade com humanos
e seus animais domésticos (DASZAK et al., 2000). É claro também que a semelhança
filogenética entre primatas não humanos e humanos permite a susceptibilidade a vários agentes
etiológicos em comum (BENNETT et al., 1995), sendo que aproximadamente 150 enfermidades
compartilhadas já foram reconhecidas e descritas (FIENNES,1967).
Animais mantidos em cativeiro ou transportados, mesmo que por um curto período, podem
ser expostos a uma variedade de patógenos, e se tornarem carreadores potenciais de doenças
infecciosas (BAKER e SORAE, 2002). Doenças virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias são
importantes causas de morbimortalidade em primatas cativos (DINIZ et al., 1994) e artigos sobre
zoonoses emergentes e reemergentes têm ressaltado a necessidade de vigilância a coleções
estáveis devido ao possível contágio humano (BENNETT et al., 1995 e DUBOIS, 1996).
Percebendo que embora exista um número significativo de informações sobre
enfermidade de primatas brasileiros, estas informações estão dispersas e acessíveis apenas pela
consulta em periódicos especializados, o Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos
Naturais Renováveis – IBAMA, através do Centro de Proteção de Primatas Brasileiros, órgão
18
executivo para ações de manejo com primatas da fauna brasileira, vem realizando mapeamento
das ocorrências de doenças em populações silvestres e cativas a fim de montar uma base
estruturada de dados (VALENÇA et al., 2005).
Entre os anos de 1933 e 1951, uma redução de 50% na população de bugios (Alouatta
palliata) da ilha de Barro Colorado no Panamá foi atribuída a epizootias de Febre Amarela
(COLLIAS e SOUTHWICK, 1952).
Leveduras do gênero Candida pertencem à microbiota de mucosas e pele de mamíferos,
sendo descritas, em todo o mundo, como agente etiológico de micoses oportunistas em diversas
espécies de animais domésticos e silvestres, tais como inúmeros primatas (RAPOSO et al., 1996;
SIERRA et al., 2000; LACAZ et al., 2002; MORETTI et al., 2004; CLEFF et al., 2005).
A cavidade bucal e os dentes dos macacos, de um modo geral, constituem meio
hiperséptico, associando floras saprófitas e patogênicas extremamente polimorfas, além de
enzimas e produtos de degradação biológica, muitas vezes tóxicos. Estes microrganismos são
conseqüência dos hábitos alimentares dos animais, que incluem desde frutas variadas até
pequenos roedores e insetos ou ao costume de levar constantemente as mãos contaminadas à
boca, mesmo com matéria fecal. Por outro lado, os microrganismos podem, também, fazer parte
da própria microbiota dos animais, tal como relatado por Kloos et al., (1976), que isolaram a
partir da superfície cutânea de primatas não humanos: Staphylococcus spp, Staphylococcus
aureus de narinas e abdômen e Staphylococcus sciuri ocasionalmente das narinas.
Rayan et al. (1987) verificaram para cepas de Staphylococcus aureus e Staphylococcus
epidermidis, entre outras bactérias isoladas a partir da cavidade oral de macacos Rhesus (Macaca
mulatta), sensibilidade de 100% frente ao cefoperazone, 96% ao cloranfenicol e 89% à
ampicilina.
A diarréia ocasionada por Escherichia coli compromete tanto a saúde humana como a dos
animais, como primatas. A enfermidade pode ser ocasionada por cepas enterotoxigênicas de
E.coli, as quais precisam se aderir à mucosa intestinal por meio de fímbrias e produzir uma ou
mais enterotoxinas, que levam ao desenvolvimento de diarréia e desidratação, podendo resultar
na morte dos animais (DEAN-NYSTROM et al.,1997).
As doenças nutricionais são as patologias não infecciosas mais comuns em primatas
mantidos em cativeiro. Doenças ósseo - metabólicas e deficiência de micro-nutrientes têm sido
19
descritas e ainda são questões de saúde importantes em primatas mantidos como animais de
estimação, em condições de manejo insatisfatórias (DINIZ, 1997) .
Inúmeras bactérias estão presentes nos vegetais. Esses microrganismos podem estar
relacionados com os vegetais que os primatas se alimentam, e podem causar diversas
intoxicações nos mesmos. Embora bactérias produtoras de toxinas também sejam usualmente
ingeridas, a patogenicidade não se expressa por meio de uma etapa infecciosa in vivo. A produção
de altas doses de toxinas depende do tipo de contaminação do alimento e das condições
oferecidas para a multiplicação dos microrganismos como, por exemplo, Clostridium botulinum,
Staphylococcus aureus e Bacillus cereus (TRÍBOLI,1995).
Um estudo sobre parasitos gastrointestinais em primatas mantidos em cativeiros é
importante para o manejo da colônia de primatas e para a manutenção da saúde das pessoas que
trabalham com esses animais, pois muitos destes parasitas são potentes causadores de zoonoses
(BRACK, 1987 apud MUNENE et al., 1998). Também é importante verificar se esses animais
podem estar se comportando como transmissores de parasitas para o meio ambiente por estarem
infectados. Vários estudos têm demonstrado que primatas não humanos são naturalmente
infectados por parasitas que são patogênicos para o homem (HIRA, 1963; HAREGURA, 1983;
MUCHENI, 1992; BURCE, 1993 apud MUNENE et al., 1998). No entanto, primatas não
humanos utilizados em pesquisa biomédica precisam ser estudados quanto à presença de
diferentes patógenos, pois estes podem comprometer as pesquisas para as quais eles são
utilizados (MUNENE et al., 1998).
Bactérias como Bacillus cereus são encontradas em brotos de vegetais e podem causar
grandes distúrbios em primatas, tais como a gastroenterite (TRÍBOLI, 1995). Grande parte desses
microrganismos, além de estarem alojados em diversos vegetais, podem estar também
disseminados em ambientes aquáticos. Bactérias como Listeria monocytogenes, Clostridium
botulinum, C. perfringens, Shigella sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae, S. boydii estão incluídas
neste caso e podem ser transmitidas além do ambiente aquático, por meio do contato via oral-
fecal e pelo contato dos animais. Estão associadas também as áreas densamente povoadas e sem
saneamento básico, condições higiênicas deficientes e moscas hospedeiras destes microrganismos
(TRÍBOLI, 1995).
Dentre os gêneros mais estudados como agentes de controle biológico estão Bacillus e
Pseudomonas. Entretanto, um grande número de bactérias apresenta antagonismo contra vários
20
tipos de fungos e bactérias patogênicas. Em batata (Solanum tuberosum) e trevo vermelho
(Trifolium pratense) foram isoladas 25 espécies de bactérias endofíticas, de 18 gêneros, das quais
74% apresentaram in vitro antibiose ao fungo patogênico Rhizoctonia solani (STURZ et al.,
1998). Em arroz, foram isoladas bactérias endofíticas que apresentaram forte atividade
antifúngica contra R. solani, Pythium myriotylum, Guamannomyces graminis e Heterobasidium
annosum (MUKHOPADHYAY et al.,1996).
Grande parte dessas bactérias pode causar diversos distúrbios gastrointestinais em animais
de sangue quente, podendo muitas vezes, causar a morte, se a doença não for tratada. Alem
dessas bactérias, outras que habitam o interior da planta utilizada como alimentos pelos animais
poderiam atuar no controle de espécies bacterianas patogênicas, diminuindo a incidência dessas
infecções em condições naturais.
2.7 Biologia Molecular no estudo de ecologia microbiana
A evolução das metodologias de biologia molecular aplicada ao estudo do meio ambiente
tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade
microbiana. Resultados de estudos independentes de isolamento e cultivo, baseados em
amplificação e sequenciamento de fragmentos do gene 16S rRNA (rDNA 16S), demonstraram
que a diversidade de microrganismos em amostras ambientais é vasta. Contudo, apenas uma
pequena fração destes (<10% em solos e <1% em ambientes aquáticos) é usualmente recuperada
em estudos baseados em isolamento e cultivo. A aplicação destas metodologias no estudo da
diversidade de bactérias tem permitido a descoberta de uma gama extensa de novas linhas
evolutivas neste grupo (Divisões). Como resultado destes estudos, o número de Divisões foi
ampliado de 12, em 1984, para 36, em 1991 (HUGENHOLTZ et al., 1998 a, b).
Metodologias moleculares que independem do cultivo, baseadas em extração direta de
ácidos nucléicos de amostras ambientais, associada às técnicas de hibridização com sondas
grupo-específicas e/ou PCR, clonagem e sequenciamento, vêm permitindo uma avaliação mais
precisa da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos de organismos,
nunca antes cultivados. Entretanto, estas metodologias não nos permitem ter acesso ao potencial
metabólico destes novos organismos, uma vez que as etapas de isolamento e cultivo são
suprimidas dos estudos (CANHOS e MANFIO, 2001).
21
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
O objetivo geral deste projeto foi avaliar a diversidade de bactérias endofíticas de plantas
de Embaúba (Cecropia pachystachya) do Parque Estadual da Cantareira, no município de São
Paulo, bem como a capacidade destas bactérias em produzir antibióticos contra microrganismos
patogênicos.
3.2 Objetivos específicos
Os objetivos específicos foram:
- isolar bactérias endofíticas de Embaúba (Cecropia sp.) presentes no Parque Estadual da
Cantareira;
- Avaliar a capacidade destas bactérias endofíticas em produzir antibióticos contra as
bactérias patógenas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, e fungos como Candida albicans e
Fusarium oxysporum.
- Relacionar essas bactérias que estão sendo identificadas com possíveis patologias que
acomete inúmeros vertebrados, tendo como destaque os primatas.
22
4 MÉTODO
4.1 Caracterização da área de estudo
O local de estudo é o Parque Estadual da Cantareira, Núcleo Pedra Grande, localizado no
Estado de São Paulo, nos Municípios de São Paulo, Caieiras, Mairiporã e Guarulhos. As coletas
foram realizadas no município de São Paulo, Núcleo Pedra Grande, localizado a 23º22' S e 46º36'
W (Fig. 02).
O Parque Estadual Turístico da Cantareira (criado pelo Decreto Estadual nº 41.626 de
1963) é uma Unidade de Conservação de Proteção Integral Paulista que abrange parte da Serra da
Cantareira (a maior floresta urbana nativa do mundo), tendo sido, como tal, tombado pela
UNESCO em 1994.
Este parque é um fragmento da Mata Atlântica com várias espécies de fauna e flora. A
Serra da Cantareira foi batizada pelos tropeiros que faziam o comércio entre São Paulo e outras
regiões do país, nos séculos XVI e XVII. A grande quantidade de nascentes e córregos ali
encontrados forneciam água, que era armazenada em cântaros (jarros para armazenar água) e,
depois de cheios, eram colocados em prateleiras, as chamadas cantareiras. O Parque compreende
parte da Serra, mas não toda ela.
Atualmente com 7.916,52 ha (79 milhões de metros quadrados de Mata Atlântica)
distribuídos por quatro municípios da Grande São Paulo, a área do Parque foi tombada no final
do século XIX, para garantir o abastecimento de água para a cidade de São Paulo. Possui quatro
núcleos de visitação: Pedra Grande, Águas Claras, Engordador e Cabuçu.
4.2 Coleta de Amostras
As bactérias endofíticas foram isoladas de Embaúbas presentes no Parque Estadual da
Cantareira, já que servem de alimento para inúmeros animais, principalmente primatas como os
bugios (Alouatta fusca).
Para realização do projeto foram realizadas três coletas, nos períodos de março, julho e
agosto de 2008. Durante principalmente o período de junho e julho, muitos animais se alimentam
23
com maior freqüência das Embaúbas, já que faz parte da época de frutificação. Por este motivo,
foram realizadas duas coletas em épocas mais próximas, julho e agosto.
Figura 2. Parque Estadual da Cantareira (Núcleo Pedra Grande) com os três pontos de coleta (legenda) realizadas em 2008 (Coordenadas 23º 26’ S e 46º 38’ W) (Google Earth versão 5.0).
1ª coleta
2ª coleta
3ª coleta
24
Em cada coleta, foram retirados cinco caules com folhas de cada indivíduo, sendo
utilizadas três plantas por época de amostragem, ou seja, três locais de coleta. A coleta abrange
uma boa parte dos caules de plantas jovens e sadias. A quantidade de caules jovens coletados e os
locais de coleta diferenciados permitem maior ocorrência e diferenciação de microrganismos.
Além disso, por meio de observações, pôde-se perceber a preferência de primatas como os
Bugios (principalmente os indivíduos adultos), pelas plantas mais jovens e localizadas na mata
mais fechada do que em trilhas abertas.
Os caules possuíam aproximadamente 1cm de diâmetro. Os materiais foram guardados
em sacos plásticos devidamente identificados com o número da amostra e o ponto de onde foram
retirados por meio da localização do GPS (Sistema de Posicionamento Global).
Em todas as coletas realizadas, os cinco caules retirados dos indivíduos número 1, 2 e 3
estavam localizados nas coordenadas aproximadas 23º 26’ S e 46º 38’ W (Fig.02).
Ao final de cada coleta, as amostras vegetais foram transportadas ao Laboratório de
Biologia Molecular e Ecologia Microbiana (LABMEM) do Núcleo Integrado de Biotecnologia
(NIB), localizado na Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), onde foram processadas em
menos de 24 horas.
4.2.1 Isolamento de Bactérias Endofíticas
Para o isolamento de bactérias endofíticas, as folhas presentes nos caules foram
descartadas. Os caules de Embaúbas foram desinfetados superficialmente por meio de uma série
de lavagens: etanol 70% por 1 min, solução de hipoclorito de sódio 2% por 5 min, etanol 70%
por 30 segundos e dois enxágües em água destilada esterilizada (ARAÚJO et al., 2001).
Alíquotas da água utilizada na última lavagem foram semeadas sobre meio TSB (Trypic
Soy Broth suplementado com 1,5% de ágar) 5% para avaliar a eficiência do processo de
desinfecção. Após desinfecção superficial, o fragmento vegetal foi macerado em tampão PBS (5
mL de PBS para cada 1 g de tecido vegetal) e posteriormente 100 µL de diluições apropriadas
foram semeadas sobre meio TSB 5% suplementados com benomyl (50 µg mL-) para inibição do
crescimento fúngico e incubadas a 28°C por até 21 dias para observação do crescimento
bacteriano.
Após crescimento bacteriano, o número de colônias foi contado e o resultado foi expresso
em unidades formadoras de colônia por grama de tecido vegetal (UFC. g-1). Posteriormente,
25
colônias representativas da diversidade bacteriana foram coletadas aleatoriamente, purificadas
por meio de estrias de esgotamento e estocadas em glicerol 20% a -70oC.
4.3 Teste de Antibiose
Este experimento foi realizado de acordo com o protocolo de Lima et al., (2003), com
algumas adaptações. Todos os patógenos desafiantes utilizados pertencem à coleção de microrganismos do
Laboratório de Biologia Molecular e Ecologia Microbiana (LABMEM) do Núcleo Integrado de
Biotecnologia (NIB), localizado na Universidade de Mogi das Cruzes (UMC).
Os testes de antibiose foram realizados com os seguintes patógenos:
a) Staphylococcus aureus – bactéria Gram-positiva, patogênica, causadora de doenças
respiratórias e cardíacas; principal causadora de infecções hospitalares.
b) Escherichia coli - bactéria Gram-negativa, patogênica para humanos e animais.
c) Candida albicans - fungo leveduriforme, patogênico, responsável pela candidíase no
trato vaginal e oral.
d) Fusarium oxysporum – fungo patogênico para animais e vegetais.
4.3.1 Testes com bactérias e levedura patogênicas
Este experimento foi realizado com os seguintes patógenos: Staphylococcus aureus,
Escherichia coli e a levedura Candida albicans.
Primeiramente foram selecionadas bactérias das três coletas para realização deste
experimento (120 bactérias da primeira coleta; 66 bactérias da segunda coleta e 222 bactérias da
terceira coleta). Essa variação no número de isolados por época se deve ao fato das densidades
variarem de acordo com as coletas.
Os isolados foram colocados em placas de Petri, em meio de cultura sólido TSB (Meio
caseína de soja) 5% a 28°C para crescimento durante 48 horas. Foram feitas três repetições por
placa e os isolados foram colocados aleatoriamente de acordo com a posição, devido ao controle
de patogenicidade em relação ao sistema quorum sensing, pois algumas bactérias podem inibir a
patogênica, ou não quando interagem com outros isolados.
26
Foram colocados 16 isolados por placa, e apenas uma placa com 8 isolados no total,
foram 25 placas com 16 isolados, e 1 placa com 8. As bactérias patogênicas foram crescidas em
meio líquido apropriado (TSB) por 24 horas.
Após o crescimento de cada bactéria patogênica, foi feita uma diluição de 10-2 do meio
líquido com a bactéria patogênica, em meio semi-sólido (com metade do ágar, em torno de 6,5 g)
do mesmo tipo, ou seja, 2ml de meio líquido + bactérias em 98ml de meio semi sólido. Para a
realização da diluição a temperatura do meio estava a aproximadamente 40°C.
Após crescimento, as bactérias endofíticas foram inativadas com vapor de clorofórmio, e
posteriormente as placas foram invertidas, com a tampa semi-aberta, para que todo o clorofórmio
evaporasse e secasse a tampa. No fluxo, foi derramado o meio semi-sólido com a bactéria
patogênica (em torno de 100ml) sobre os isolados mortos. Após isso, os isolados foram
incubados a 28°C, e observados no dia seguinte a presença ou não de halos.
4.3.2 Inibição do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum
Para a realização deste experimento foi utilizada a técnica de cultura pareada. Para isso,
foram colocados dois isolados bacterianos endofíticos por placa de Petri, com meio BDA (Batata,
dextrose, Ágar). Os isolados foram colocados nas extremidades das placas e o fungo Fusarium
oxysporum colocado no centro da placa.
Foram feitas placas de controle, ou seja, com o patógeno e sem nenhum isolado, para
verificação do tempo de crescimento.
Os isolados e os patógenos foram incubados a 28°C, e observados após cinco dias,
conforme o crescimento da placa de controle, para verificação da inibição ou crescimento dos
isolados em relação ao patógeno.
Foram selecionadas bactérias das três coletas para realização deste experimento (80
bactérias da primeira coleta; 50 bactérias da segunda coleta e 120 bactérias da terceira coleta).
Para cada resultado obtido que demonstrasse reação de inibição ou crescimento ao
patógeno, foi feita uma segunda repetição e para os que deram resultados diferenciados da
primeira e da segunda repetição, foi feito um terceiro teste para a confirmação dos resultados.
27
4.4 Caracterização molecular das bactérias
4.4.1 Extração do DNA bacteriano
As bactérias foram crescidas em 5 mL de meio TSB 5% por 24 horas a 150 rpm. Dois mL
da cultura foram centrifugados e lavados em 500 µL tampão TE (1M de Tris-HCl pH 8 e 10M de
EDTA), novamente ressuspendidas em 500 µL tampão TE, e adicionados 30µL de SDS 10% e
pérolas de vidro (0,1mm, Sigma). As células foram rompidas por meio de agitação em
homogeneizador de células (mini bead beater, Biospect) e em seguida, foi adicionado 1 volume
de fenol, homogeneizado por inversão e centrifugado a 14000 X g por 5min. O sobrenadante foi
coletado, acrescido um volume de clorofane (fenol 1:1 Clorofórmio) e centrifugado novamente a
14000 X g por 5min. O sobrenadante foi novamente coletado e adicionado um volume de
clorofórmio e novamente centrifugado a 14000 X g por 5min. Por fim, a fase aquosa foi coletada,
adicionado 0,6 volumes de isopropanol e 20 µL de cloreto de sódio 5M, incubado a temperatura
ambiente por 5min. A suspensão foi centrifugada a 14000 X g por 5min, o sobrenadante
descartado, e o DNA lavado com etanol 70% gelado e secado a 37°C por 40 minutos. A
qualidade e quantidade do DNA foram avaliadas em gel de agarose (1%).
4.4.2 Amplificação do 16s rDNA
A técnica de PCR foi utilizada para amplificação do 16s do rDNA das bactérias endofíticas
de Cecropia sp. Para realização da técnica foram utilizados os primers R1387 (5´-
CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3´) e P027F (5´-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -
3´), os quais são específicos para o domínio Bactéria. A PCR foi realizada em um volume final de
50 µL contendo tampão da enzima 1 X, 3,75 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTPs, 0,2 µM de
cada primer, 0,1U/µL de Taq DNA Polimerase. A reação da amplificação foi realizada em
termociclador, programado para realizar uma desnaturação inicial a 94°C por 4 minutos, 35
ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 62,5°C por 1 minuto e extensão de
primers 72°C por 1 minuto, seguida de extensão final a 72°C por 10 minutos. Após a
amplificação, 5µL da reação de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de agarose (1%)
28
4.4.3 Seqüenciamento do 16s rDNA
As amostras purificadas foram seqüenciadas no Laboratório de Genômica, NIB/UMC sob
responsabilidade da Profª. Dra. Regina L. C. B. de Oliveira. Para a identificação dos isolados
bacterianos, as sequências foram submetidas à consulta de similaridade de nucleotídeos por meio
do programa Blastn ("Basic Local Alignment Search Tool") (ALTSCHUL et al., 1997), para
comparação com sequências homólogas depositadas no banco de dados público mundial
GenBank (National Center for Biotechnology Information – NCBI) (BLAST, 2009). Dessa forma
foram consideradas as seqüências que apresentaram os maiores valores de similaridade.
29
5 RESULTADOS
5.1 Densidade Bacteriana
Foram realizadas três coletas de Embaúba (Cecropia sp.) durante o ano de 2008. Em cada
coleta foram selecionadas três plantas em pontos distintos do Parque e para planta selecionada
foram extraídos cinco ramos. A densidade bacteriana foi estimada em cada amostra de Cecropia
sp. coletada no parque da Serra da Cantareira. Na primeira coleta, realizada no período de março
de 2008, foi observado que a densidade bacteriana foi de aproximadamente 102 UFC por grama
de tecido vegetal fresco, e que esta densidade não variou entre as plantas amostradas. O número
de bactérias nestas amostras foi muito baixo sugerindo que esta planta hospeda um número
pequeno de bactérias cultiváveis nas condições utilizadas.
Foi observado que a densidade bacteriana em Cecropia sp. demonstrou grandes variações
entre as coletas, sendo observado uma densidade de 2,4 x103 UFC por grama de tecido vegetal.
Embora não tenha sido observada diferença significativa entre os valores de densidade
bacteriana, pode ser sugerido que a densidade bacteriana apresentou uma tendência de aumentar
nas épocas seguintes (Fig. 03), sugerindo que possa ocorrer uma pequena variação na densidade
bacteriana de acordo com a época amostrada.
30
Figura 3: Média da densidade bacteriana com os respectivos desvios-padrão em três épocas de coletas: coleta 1: março de 2008, coleta 2: julho de 2008 e coleta 3: agosto de 2008, respectivamente.
5.2 Diversidade bacteriana associada à Cecropia sp. Foi observado por meio do seqüenciamento parcial do 16S rDNA que a comunidade
bacteriana endofítica de Cecropia sp é composta por bactérias de pelo menos 5 famílias, sendo
elas Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Bacillaceae e Paenibacillaceae
(Tabela 01).
Da família Pseudomonadaceae foram identificadas seis bactérias do gênero Pseudomonas.
Já da família Enterobacteriaceae foram identificados dois gêneros: Enterobacter (duas bactérias)
e Erwinia (uma bactéria). Da família Xanthomonadaceae foram identificados os gêneros
Stenotrophomonas e Dyella (apenas uma bactéria de cada), da família Bacillaceae seis isolados
de Bacillus sp e, por fim, da família Paenibacillaceae foi identificado um isolado do gênero
Paenibacillus sp (Tabela 01).
31
5.2.1 Diversidade bacteriana associada à embaúba
Ao nível molecular, a similaridade de seqüência pode indicar uma origem comum de
genes, ou seja, seqüências similares podem indicar relação filogenética. As análises moleculares
foram submetidas ao programa BLASTn ("Basic Local Alignment Search Tool") (ALTSCHUL
et al., 1997) para comparação com seqüências similares depositadas no banco de dados público
mundial GenBank (National Center for Biotechnology Information – NCBI) (BLAST, 2009)
(Tabela 01).
Por meio dessas comparações moleculares pode-se perceber que a comunidade bacteriana
isolada de Cecropia é composta por grupos distintos de bactérias, sendo as famílias Bacillaceae e
Pseudomonadaceae as dominantes (Tabela 01).
Tabela 1: Identificação dos isolados bacterianos endofíticos. a Família Gênero CP01 Bacillaceae Bacillus
CP02 Bacillaceae Bacillus
CP03 Pseudomonadaceae Pseudomonas
CP04 Pseudomonadaceae Pseudomonas
CP05 Enterobacteriaceae Enterobacter
CP06 Xanthomonadaceae Stenotrophomonas
CP07 Bacillaceae Bacillus
CP08 Bacillaceae Bacillus
CP09 Pseudomonadaceae Pseudomonas
CP11 Enterobacteriaceae Erwinia
CP12 Pseudomonadaceae Pseudomonas
CP14 Xanthomonadaceae Dyella
CP15 Enterobacteriaceae Enterobacter
CP32 Pseudomonadaceae Pseudomonas
CP33 Bacillaceae Bacillus
CP34 Bacillaceae Bacillus
CP35 Pseudomonadaceae Pseudomonas
CP36 Paenibacillaceae Paenibacillus
As identificações foram obtidas pelo banco de dados genético GenBank (BLAST, 2009) (CP:Cecropia
pachystachya).
Os isolados foram classificados até gênero, e com isso, foi observado, que os gêneros
Pseudomonas e Bacillus estão em maior freqüência no interior de Cecropia sp., sugerindo que
podem desempenhar um papel ecológico no desenvolvimento desta planta.
32
5.3 Produção de agentes antimicrobianos
Para caracterização da comunidade bacteriana endofítica de Cecropia sp., 408 isolados
foram coletados aleatoriamente e testados quanto à capacidade de inibir in vitro Candida
albicans, Staphylococcus aureus e Escherichia coli.
Foi observado que nenhum isolado endofítico de Cecropia sp. foi capaz de produzir
composto antimicrobiano contra C. albicans, fato este caracterizado pela ausência de halo de
inibição. Entretanto, foi observado que 1% (408 isolados no total) dos isolados foram capazes de
inibir in vitro a bactéria patogênica Staphylococcus aureus, mostrando que esta comunidade
bacteriana é capaz de inibir este importante patógeno de primatas (Fig.05). Foi observado que os
isolados capazes de inibir S. aureus foram obtidos da terceira coleta (agosto de 2008), mostrando
também que ocorreu uma variação fisiológica da população bacteriana entre as épocas
amostradas.
Figura 04. Presença de halos de inibição contra Staphylococcus aureus produzido pelos isolados Pseudomonas sp (CP09), Pseudomonas sp (CP12) e Enterobacter sp (CP15) indicados pelas setas (dados obtidos pelo GenBank).
Também foi observado que 1,01% (408 isolados no total) dos isolados endofíticos
avaliados foram capazes de inibir in vitro a bactéria Escherichia coli, mostrando que esta
comunidade bacteriana também é capaz de inibir esta Enterobacteriaceae patogênica à primatas
(Fig. 06). Estes isolados foram obtidos na segunda (66 isolados) e terceira (222 isolados) coletas.
Nenhum isolado foi capaz de inibir S. aureus e E. coli simultaneamente.
33
Figura 05. Presença de halos de inibição contra Escherichia coli produzido pelos isolados Pseudomonas sp (CP12) e Enterobacter sp (CP15) indicados pelas setas (dados obtidos pelo GenBank).
A capacidade destas bactérias endofíticas em inibir o fungo fitopatogênico Fusarium
oxysporum também foi avaliada. Para esta análise foram selecionados 250 isolados, sendo 80 da
primeira coleta, 50 da segunda coleta e 120 da terceira coleta (valores distintos devido à variação
bacteriana ter sido diferenciada em cada coleta). Foi observado por meio da formação de halo de
inibição (Fig. 06), que 6,13% dos isolados foram capazes de inibir este importante fitopatógeno.
A primeira imagem da Figura 06 (A) mostra somente o crescimento do Fusarium
oxysporum, no qual denominamos como controle. Já a imagem B da mesma figura mostra que
não houve inibição dos dois isolados bacterianos selecionados que foram adicionados juntamente
com o fungo. A imagem C da Figura 06 nos mostra que o isolado bacteriano número 02 inibiu o
crescimento do fungo próximo a ele, formando assim, um halo de inibição. O isolado CP01 não
mostrou o mesmo resultado de CP02. Já a imagem D da mesma figura mostra que os dois
isolados bacterianos selecionados formaram halos de inibição do fitopatógeno (isolados CP01 e
CP02), mostrando que podem apresentar potencial para utilização em campo para o controle
biológico deste fitopatógeno.
34
Figura 06. Observação de halos de inibição nos isolados selecionados: A: Controle; B: Sem inibição; C: Formação de Halo de Inibição em CP02 (Bacillus sp); D: Formação de Halo de Inibição em CP01(Bacillus sp) e CP02 (Bacillus sp) (Dados de identificação obtidos pelo GenBank).
As inibições contra o fungo Fusarium sp aconteceram principalmente com os isolados
identificados como Bacillus sp (Fig.06) e Pseudomonas sp (os isolados CP03 e CP08 também
demonstraram inibição ao Fusarium sp). Esta freqüência de inibição ao fitopatógeno Fusarium
oxysporum variou de acordo com a época amostrada, visto que na população obtida da primeira,
segunda e terceira coletas, a freqüência foi de 5,83%, 13,33% e 3,33%, respectivamente.
A B
C D
35
Figura 07. Porcentagem de bactérias endofíticas capazes de inibir fungos e bactérias e patogênicas, em cada coleta (1ªcoleta: 03/2008; 2ªcoleta: 07/2008 e 3ªcoleta: 08/2008).
36
6 DISCUSSÃO
Vários mecanismos estão envolvidos na promoção de crescimento das plantas por
bactérias endofíticas. Estes, porém, podem ser divididos em diretos e indiretos. Quando o
estímulo do crescimento das plantas é direto, o endófito produz fitormônios ou substâncias
análogas destes reguladores de crescimento capazes de estimular o desenvolvimento das plantas
(BASHAN e HOLGUIN,1997). Quando o estímulo é indireto, o crescimento é estimulado pela
redução da população de microrganismos deletérios ou patogênicos às plantas, ou seja, pelo
controle biológico de fitopatógenos, sendo este pelo antagonismo direto ou pela indução de
resistência sistêmica (HALLMANN et al., 1997).
Foram encontradas em plantas de Embaúba (Cecropia pachystachya) um total de
bactérias endofíticas de 2,4 x103 UFC .g-1 de tecido vegetal. Não houve grandes variações de
densidades bacterianas ao longo das três coletas, embora essa densidade apresentou uma
tendência de aumentar nas épocas seguintes, sugerindo que possa ocorrer uma variação na
densidade bacteriana de acordo com a época amostrada.
Esse número foi obtido após o agrupamento das bactérias, levando-se em consideração
suas características macroscópicas e microscópicas. Este isolamento, provavelmente, subestima a
população total daqueles microrganismos, em termos de diversidade, uma vez que somente foram
selecionadas as bactérias capazes de se desenvolverem nos meios de cultura utilizados. Tais
limitações se aplicam à maioria dos estudos baseados em métodos baseados no cultivo, embora
estas técnicas forneçam indicações relativas da estrutura da população microbiana.
Em relação à densidade bacteriana, foi observado na primeira e na segunda coleta que foi
relativamente baixa. Esses valores, a princípio, mostraram que provavelmente essa planta
hospeda um número pequeno de bactérias cultivadas nas condições utilizadas.
Mas, na terceira coleta, pode-se perceber um valor muito mais elevado de bactérias
isoladas. Esse aumento considerável de isolados pode ter relação ao local de coleta, já que esta
última foi realizada em mata mais fechada, ou seja, sem a presença de trilhas, do que as outras.
Por ser uma região mais preservada, este último local com Embaúbas apresenta menor impacto
ambiental e, por conseguinte poderia apresentar uma maior diversidade.
37
As plantas constituem um complexo ecossistema onde comunidades bacterianas
interagem continuamente, competindo por nutrientes e água nos diferentes tecidos do hospedeiro.
O número de diferentes espécies e a população de uma determinada espécie dentro da
comunidade são parâmetros essenciais para definir a sua estrutura e diversidade (LIU et al.,
1997). Portanto, o conhecimento da diversidade endofítica é importante para a compreensão da
ecologia da comunidade bacteriana na planta. Este conhecimento pode ser aplicado para melhorar
a produtividade e facilitar o manejo de culturas de interesse agronômico.
No controle biológico exercido por antibiose, geralmente existe relação entre densidade
de inóculo dos biocontroladores e efetividade do controle por eles proporcionado, tanto quando
se avalia a severidade quanto a incidência da doença. Modelos linear, logístico e loglogístico já
foram utilizados para descrever tais relações (WANG et al., 2005; KIEWNICK e SIKORA,
2006), quer o controle seja exercido por fungos ou por bactérias. A não existência de correlação
positiva entre maiores quantidades do biocontrolador e a efetividade de controle é um atributo
geralmente associado à indução de resistência, quando ativada por compostos químicos
(GODARD et al.,1999; TROTEL-AZIZ et al., 2006) ou por microrganismos (LARKIN e
FRAVEL, 1999; KILIC-EKICI e YUE, 2003).
Os microrganismos podem produzir uma variedade muito grande de metabólitos tanto
primários quanto secundários, incluindo enzimas (STAMFORD et al., 1998), aminoácidos
(KLEINKAUF e VON DOHREN, 1990), vitaminas, antibióticos, pigmentos (DEMAIN, 1992),
agentes moduladores de respostas imunológicas (TRILLI et al., 1978), toxinas (BACH e
KIMATI, 1999), agentes anti-tumorais (WANG et al., 2000), fatores de crescimento de plantas
(ALEXOPOULOS e MIMS, 1996), anti-helmínticos (RODRIGUES et al., 2000) e anti-micóticos
(LI et al., 2001; LI e STROBEL, 2001).
Diversos trabalhos têm objetivado obter agentes de controle biológico potencialmente
eficientes e, para isso, um grande número de antagonistas tem sido pré-selecionado em testes de
antagonismo in vitro, em razão das dificuldades apresentadas pelos métodos de seleção realizados
em campo, como: custo, mão de obra, tempo e espaço (AMORIM e MELO, 2002; SHIOMI et
al., 2008; LUCON et al., 2009).
Dos sobrenadantes de cultura dos 658 isolados bacterianos endofíticos, selecionados para
os ensaios de antagonismo in vitro, apenas 30 (4,56%) apresentaram atividades antagônicas
38
contra um ou mais microrganismo-teste utilizados nestes ensaios (Figs. 05, 06 e 07), mostrando
que a freqüência deste grupo de microrganismos parece ser baixa.
A análise da produção de compostos antimicrobianos contra Candida albicans, mostrou
que independente do local e época de amostragem, nenhuma bactéria endofítica foi capaz de
inibir in vitro este patógeno humano. Entretanto, foi observado que 1,01% desta comunidade
endofítica foi capaz de inibir a bactéria Staphylococcus aureus e na mesma porcentagem essa
comunidade inibiu a bactéria Escherichia coli.
No teste de antagonismo in vitro com Fusarium oxysporum das 250 bactérias
selecionadas, 23 inibiram significativamente o crescimento micelial deste fungo. Houve inibição
ao crescimento do fungo em inúmeras placas, tanto no primeiro teste realizado como também na
repetição. Isso mostra que muitos isolados apresentaram um grau de reação maior ao fungo
Fusarium oxysporum do que com os outros patógenos.
A colônia fúngica nas proximidades das colônias bacterianas apresentou duas formas de
crescimento: numa delas havia competição entre as colônias dos microrganismos, com o fungo
evitando crescer sobre a colônia bacteriana; na outra forma, não houve qualquer inibição do
crescimento, tendo ocorrido crescimento fúngico sobre a colônia bacteriana.
De acordo com os dados obtidos, pode-se perceber que Pseudomonas sp e Bacillus sp
mostraram apresentar grandes inibições contra o fungo Fusarium sp. Segundo Melo e Valarini
(1995), Bacillus subtilis isolada do rizoplano de feijoeiro na região de Guaíra, SP, tem
demonstrado como potente antagonista contra alguns patógenos de raízes de feijoeiro, como F.
solani f. sp. phaseoli, Sclerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia solani.
Em alguns casos os metabólitos ao invés de inibirem o crescimento das bactérias
ocasionaram sua maior propagação, fato também observado por Araújo (1996) ao realizar ensaios
de culturas pareadas entre bactérias endofíticas, isoladas de citrus, com diferentes fungos.
O antagonismo microbiano é um fenômeno complexo e a seleção de antagonistas com
base apenas em resultados in vitro não deve ser a única estratégica de seleção, por não
demonstrar boa correlação com os trabalhos de campo (GAVA, 1998). Entretanto, a detecção de
populações bacterianas capazes de produzir compostos antimicrobianos pode indicar estratégias
de interação microbiana na planta, bem como potencial aplicação biotecnológica destes
microrganismos.
39
O melhor conhecimento da atividade antimicrobiana das plantas, certamente propiciaria
um impulso, tanto direto como indireto, para a melhora nas condições de vida de populações de
países em desenvolvimento, considerando-se a importância das plantas medicinais, não apenas
como recurso terapêutico, mas também como fonte de recursos econômicos (DI STASI et
al.,1996).
Os gêneros Pseudomonas e Bacillus foram os mais freqüentes na comunidade bacteriana
cultivável de Cecropia sp.. Estes gêneros têm sido constantemente descritos como agentes
produtores de compostos antimicrobianos (RAAIJMAKERS et al., 2002).
De acordo com Zavala, et al. (1997), as Embaúbas possuem atividade antibacteriana in
vitro contra Staphylococcus aureus, E. coli, Pseudomonas sp, Salmonella sp e Shigella sp.
Bacillus cereus é amplamente distribuído na natureza e comumente encontrado no solo e
produz substâncias nematicidas que inativam ovos de nematóides (OKA et al., 1993). Esta
bactéria produz uma enzima colagenolítica/ proteolítica capaz de degradar as proteínas
cuticulares de estádios pré e pós-parasíticos de Meloidogyne javanica, interrompendo seu ciclo de
vida (SELA et al., 1998). Já Peer e Schippers (1989) observaram que plântulas de tomate tratadas
com o isolado de Pseudomonas sp. aumentaram tanto o crescimento das plantas quanto a
população do antagonista. Segundo os autores, a densa colonização deste isolado deslocou os
organismos deletérios ao crescimento das plantas.
Pseudomonas spp. fluorescentes são bactérias Gram-negativas e produzem um pigmento
verde-amarelado fluorescente em meio B de King et al., (1954), observado sob luz com
comprimento de onda próximo do ultravioleta. De acordo com Stanier (1969), esses organismos
podem ser encontrados na água e no solo. As espécies mais importantes desse grupo são
Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida, geralmente estudadas com o objetivo de avaliar
a promoção de crescimento em plantas, e Pseudomonas aeruginosa, considerada patogênica a
animais.
A diversidade metabólica de bactérias do grupo fluorescente do gênero Pseudomonas dá a
essas bactérias uma grande habilidade para adaptação a vários ambientes, tais como solo e
rizosfera.
Bactérias do gênero Bacillus são Gram-positivas e podem ser aeróbias, facultativas ou
anaeróbias. São resistentes ao calor e a outros agentes destrutivos (STANIER, 1969). Podem
oxidar uma ampla faixa de compostos orgânicos e em alguns casos são fermentativas. A maioria
40
delas tem exigências nutricionais simples, requerendo no máximo alguns aminoácidos ou
vitaminas B como fatores de crescimento (STANIER, 1969). Formam endósporos – característica
que as coloca entre os esporulados – e apresentam a habilidade de produzir antibiótico (FREITAS
e PIZZINATTO, 1997). A formação de endósporos aumenta a resistência aos fatores adversos.
Dessa forma, podem ser armazenados, como inoculantes, por um período mais longo, e possuem
maior tempo de permanência no solo, além da facilidade de aplicação.
De forma semelhante, Shishido et al., (1995) verificaram que isolados endofíticos de
Bacillus sp. e Streptomyces sp. estimularam o crescimento de mudas de coníferas, controlando os
patógenos responsáveis pela inibição do crescimento destas plantas.
Alguns trabalhos relatam o gênero Bacillus como a principal bactéria endofítica de
determinadas plantas (HALLMANN et al., 1997). As espécies de Bacillus mais frequentemente
citadas como endófitos são: Bacillus cereus (ARAÚJO et al., 2001), Bacillus subtilis (BAI et al.,
2002), Bacillus megaterium, Bacillus insolitus, Bacillus brevis (STURZ et al., 1998), Bacillus
pumilus e Bacillus lentus (Araújo et al., 2001), sendo encontradas nas mais diversas espécies
vegetais tais como: Zea mays L. (LALANDE et al., 1989), Gossypium hirsutum L. (MISAGHI e
DONNDELINGER, 1990), Beta vulgaris (JACOBS et al., 1985), e Solanum tuberosum
(HOLLIS, 1951).
Chanway (1997) obteve aumentos de 33% e 57% na biomassa de plântulas de pinheiro
tratadas com os isolados PW2 e SM3-RN de Bacillus polymyxa e Pseudomonas chloroaphis,
respectivamente. O autor também relatou aumentos na altura e no comprimento de raízes das
plântulas inoculadas com estes isolados variando entre 23% e 132%.
Guo et al., (1996, 2001) selecionaram os isolados de rizobactérias promotoras de
crescimento como promissores agentes de biocontrole pela combinação do halo de inibição
formado e a capacidade de crescimento nas raízes.
Os isolados Serratia sp., Pseudomonas e Bacillus sp., produtores de halo de inibição,
foram testados por Guo et al., (2004) no controle da murcha bacteriana causada por Ralstonia
solanacearum, chegando a atingir de 63,3% a 94,1% de controle e aumento da produtividade de
46,3% a 78,5%.
Medeiros et al. (2002), testando 50 isolados de bactérias endofíticas e epifíticas obtidas
de melão e outras culturas, através da bacterização de sementes, selecionou o isolado Bacillus
sp. como eficiente no controle dessa doença em condições de casa de vegetação. Visando a
41
proteção de plantas de melão contra a infecção no campo, plantas de meloeiro com sete dias
foram pulverizadas com isolados de Bacillus, com potencial para utilização no controle da
mancha-aquosa (MEDEIROS et al., 2003). Gaing e Gaur (1991), trabalhando com feijão,
observaram que uma estirpe de Bacillus subtilis aumentou a produção de grãos, biomassa,
absorção de P e N, em solo deficiente de P suplementado com fosfato de rocha.
A família Enterobacteriaceae também estava presente nos isolados identificados em
Cecropia sp. Foram identificados dessa família o gênero Enterobacter e Erwinia. A espécie
Enterobacter cloacae é considerada um patógeno de importantes culturas. Na década de 70 esta
espécie foi isolada de sementes de arroz sem que o seu envolvimento no processo de doenças
fosse constatado (TANII et al., 1974). Na década de 80, Coother e Dowing (1986) noticiaram a
patogenicidade da E. cloacae em cebolas armazenadas. No Brasil, a fitopatogenicidade desta
bactéria foi primeiramente observada em melões coletados na região nordeste do país (ROBBS et
al., 1995). Enterobacter cloacae é também descrita como um antagonista de Pythium sp., que
causa podridão das raizes de pepino e também aumenta a supressão do solo, em solos infectados
com Fusarium oxysporum.
Bactérias do gênero Enterobacter são também citadas como endófitos em plantas de
Citrus jambhiri (GARDNER et al., 1982), Zea mays L. (FISHER et al.,1992), Gossypium
hirsutum (MCINROY e KLOEPPER, 1995), Citrus sinensis (LACAVA et al., 2004), Citrus
reticulata (LACAVA et al., 2004), dentre outras. Entre as diferentes espécies pertencentes à
família Enterobacteriaceae, o gênero Erwinia constitui se num dos mais importantes e tem sido
relatado por diferentes autores como um dos principais contaminantes na cultura de tecidos
(LEIFERT et al., 1989; CASSELLS E TAHMATSIDOU, 1996; TANPRASERT e REED, 1998).
O gênero Erwinia foi originalmente proposto por Winslow et al, (1917) baseado na
patogenicidade das estirpes e pertence a família Enterobacteriaceae. Contêm células em forma de
bastonete, peritríquias, anaeróbias facultativas, não esporulantes, Gram-negativas, fitopatogênicas
e estão associadas às plantas causando doenças de murcha ou podem viver como saprófitas sendo
constituintes da flora epifítica do solo. Também podem causar doenças em seres humanos
(PÉROMBELON, 1992). Na última edição do Krieg e Holt, 1984, foram descritas quinze
espécies resultando numa nomenclatura bastante confusa.
Atualmente, o gênero foi renomeado para Pantoae e inclui as antigas espécies Erwinia
herbicola, Enterobacter agglomerans e Erwinia milletiae (BEJI et al., 1988) sendo que as duas
42
primeiras fixam nitrogênio. Os isolados clínicos são classificados como pertencentes ao gênero
Enterobacter e os isolados de plantas no gênero Pantoae (LELLIOTT e DICKEY, 1984).
A espécie Pantoea herbicola inclui várias estirpes que podem ocorrer na superfície da
planta ou em lesões. Nas lesões causadas por outras bactérias fitopatogênicas, é considerada
como um organismo secundário. Esta espécie não tem sido descrita como agente causal primário
de qualquer doença. Desta forma, é considerada como uma bactéria oportunista, podendo estar
presente também em animais, solo, água e ar (LELLIOTT e DICKEY, 1984).
Existem relatos que esta espécie poderia estar associada ao raquitismo da soqueira de
cana-de-açúcar. Testes de patogenicidade causaram, em cana inoculadas, uma descoloração
vascular semelhante àquela causada pela bactéria do raquitismo da soqueira. Desta forma, foi
considerada como integrante do complexo bacteriano associado ao raquitismo juntamente com
Xanthomonas albilineans e Pseudomonas (GALLI et al., 1980).
Segundo Krieg e Holt (1984), todas as espécies do gênero Erwinia estão associadas a
plantas, quer como patógenos (causadoras de podridão), saprófitas ou ainda constituintes da flora
epifítica. Os gêneros Xanthomonas e Pseudomonas talvez sejam os mais relatados na literatura
como contaminantes de cultivos in vitro (DUHEM et al., 1988; REED et al., 1998;
TANPRASERT e REED, 1998). O gênero Pseudomonas engloba grande número de espécies,
tanto saprófitas como patogênicas às plantas. Normalmente as bactérias pertencentes a este grupo
são móveis, aeróbicas estritas, não esporogênicas e apresentam catalase positiva (KRIEG e
HOLT, 1984).
O gênero Stenotrophomonas é citado como endófito em plantas de cana-de-açúcar e em
plantas de trigo e tem também sido relacionado com o melhor crescimento de girassóis em estufa
(FAGES e ARSAC, 1991).
Dentre os isolados identificados, foi observado que alguns isolados apresentam potencial
para o controle biológico de agentes patogênicos. Como mostrado nas figuras 06 e 07, os isolados
CP09 (Figura 06), CP12 e CP15 (Figuras 06 e 07) foram capazes de inibir os patógenos E.coli e
S.aureus.
De acordo com os dados obtidos pelo GenBank, o isolados CP09e CP12 foram
identificados como Pseudomonas sp, enquanto o isolado CP15 foi identificado como Enterobacter
sp. Os isolados CP01 e CP02 classificados como Bacillus sp demonstraram grande capacidade de
inibição ao fitopatógeno Fusarim oxysporum.
43
A atuação do Fusarium é bem estudada em plantas de campo, pois este é um fungo
agressivo, responsável pela síndrome da queda dos frutos, assim como outras espécies, tais como:
Ceratocystis paradoxa, Colletotrichum gloeosporioides, Cladosporium sp., Aspergillus sp.,
Verticillium sp., Penicillium sp., Alternaria alternata e Rhizopus sp. (MOTA e GASPAROTTO,
1998).
Um experimento realizado com 62 isolados de Pseudomonas spp. fluorescentes obtidos de
diversas culturas mostrou que alguns isolados apresentaram antagonismo contra Pythium spp.,
Botrytis cinerea, Phytophthora nicotianae e Fusarium oxysporum in vitro. Os isolados de
rizosfera de morango, alface, beterraba e limão foram os que tiveram maior porcentagem de
antagonismo (SARATHCHANDRA et al., 1993).
Ainda que os testes de antagonismo in vitro nem sempre apresentem o mesmo resultado in
vivo (FREITAS e PIZZINATTO, 1991), há que defenda o seu uso, com base no fato de que a
detecção de isolados com características antagônicas eficientes poderiam facilitar uma primeira
seleção, já que freqüentemente se trabalha com um grande número de isolados (LUCON e
MELO, 1999).
Djordjevic et al. (1987) sugerem que através de um longo período de evolução, muitos
fitopatógenos tornaram-se tão compatíveis com a planta hospedeira e que, com o passar do
tempo, foram causando cada vez menos danos e possivelmente promovendo algum benefício.
Desta forma, uma bactéria pode ser fitopatogênica por um lado e benéfica por outro como, por
exemplo, por meio da fixação biológica de nitrogênio (FBN).
Os efeitos benéficos da inoculação de bactérias em plantas e sementes, com vistas à
promoção de crescimento vegetal, já estão bem discutidos e documentados (NAIK et al., 2008;
RYAN et al., 2008), embora o processo de bacterização de tecidos vegetais possa gerar efeitos
deletérios ou nulos, em relação ao desenvolvimento da planta, como mostrado por PROBANZA
et al. (1996), sobre o efeito negativo de Bacillus subtilis no comprimento da parte aérea e de
raízes de pínus (Pinus taeda L.), e de Pseudomonas fluorescens sobre o crescimento de amieiro
(Alnus glutinosa).
As bactérias endofíticas presentes em diversos vegetais, tais como a Cecropia sp podem
estar inibindo a manifestação de diversos agentes patogênicos em animais tais como os primatas,
que possuem seu hábitat natural no Parque Estadual da Cantareira, e com isso, impedindo a
manifestação de inúmeras doenças.
44
Na natureza, os primatas não-humanos, apresentam comportamento gregário, vivem em
bandos e alimentam-se, principalmente, de frutos, brotos, flores e insetos. Adaptam-se bem a
cativeiros, porém, em alguns casos, apresentam comportamento estereotipado, em virtude do
estresse causado pela remoção de seu hábitat, transporte, convívio com humanos, manejos e
carências alimentares. Esses fatores favorecem a ocorrência de enfermidades oportunistas, como
micoses, principalmente causadas por dermatófitos, Candida spp., Aspergillus spp. e
Cryptococcus spp. (EMMONS, 1990; KINDLOVITS, 1999).
Animais como os bugios são conhecidos como animais de difícil manutenção em cativeiro
por não adaptação a dietas e conseqüente susceptibilidade a doenças (MILTON, 1980). A
escassez de informações sobre parâmetros fisiológicos destas espécies (PORTER, 1971) acaba
limitando a possibilidade de se determinar o perfil sanitário destes animais.
O contato com o homem, com animais domésticos e sinantrópicos, e a contaminação de
alimentos têm sido relatadas como as principais fontes de infecção para primatas não-humanos
cativos (CORRÊA e PASSOS, 2001). Além disso, a mudança na dieta destes animais em
cativeiro poderia resultar em um desequilíbrio nas populações microbianas do trato intestinal,
visto que na mata, o alimento obtido pode ser uma fonte de uma diversidade microbiana mais
ampla.
As interações solo-planta-microrganismos são complexas e seus efeitos individuais são
difíceis de ser estudados. As bactérias observadas neste trabalho, nas condições em que elas
foram isoladas, podem representar um componente importante no crescimento das Embaúbas do
Parque Estadual da Cantareira, além de provavelmente estarem inibindo a ação de alguns
microrganismos patógenos.
45
7 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que:
- As bactérias do gênero Bacillus, Enterobacter e Pseudomonas são espécies dominantes
no interior de Embaúba (Cecropia sp.) presentes no Parque Estadual da Cantareira;
- A densidade destas bactérias não mostrou grandes variações entre as épocas amostradas.
- A freqüência de bactérias endofíticas de embaúba capazes de inibir as bactérias
patógenas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, e os fungos Candida albicans e
Fusarium oxysporum é baixa.
46
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