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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES DÉBORA MARTINS DE ANDRADE CASELLI
IMPORTÂNCIA DO RESÍDUO DE LISINA 79 NO PROCESSO
APOPTÓTICO INDUZIDO POR CITOCROMO C
Mogi das Cruzes, SP
2014
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES DÉBORA MARTINS DE ANDRADE CASELLI
IMPORTÂNCIA DO RESÍDUO DE LISINA 79 NO PROCESSO
APOPTÓTICO INDUZIDO POR CITOCROMO C
Orientadora: Profª. Dra. Kátia Cristina Ugolini Mugnol
Mogi das Cruzes, SP
2014
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação da
Universidade de Mogi das Cruzes
como parte dos requisitos para
obtenção do grau de mestre em
Biotecnologia.
Área de concentração:
Biotecnologia aplicada à saúde
FINANCIAMENTO
FICHA CATALOGRÁFICA Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central
Caselli, Débora Martins de Andrade
Importância do resíduo de Lisina 79 no processo apoptótico induzido por citocromo c / Débora Martins de Andrade Caselli. – 2014.
76 f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, 2014
Área de concentração: Biotecnologia Aplicada à Saúde Orientador: Profª Drª Kátia Cristina Ugolini Mugnol
1. Apoptose 2. Citocromo c 3. Mutagênese sítio-dirigida 4. Baixo spin alternativo I. Mugnol, Kátia Cristina Ugolini
CDD 660.6
MENSAGEM
Vencerás
Não desanimes.
Persiste mais um tanto.
Não cultives pessimismo.
Centraliza-te no bem a fazer.
Esquece as sugestões do medo destrutivo.
Segue adiante, mesmo varando a sombra dos próprios erros.
Avança ainda que seja por entre lágrimas.
Trabalha constantemente.
sempre.
Não consintas que o gelo do desencanto te entorpeça o coração.
Não te impressiones nas dificuldades.
Convence-te de que a vitória espiritual é construção para o dia-a-dia.
Não desistas da paciência.
Não creias em realizações sem esforço.
Silêncio para a injúria
Olvido para o mal.
Perdão às ofensas. Recorda que os agressores são doentes.
Não permitas que os irmãos desequilibrados te destruam o trabalho ou te
apaguem a esperança.
Não menosprezes o dever que a consciência te impõe.
Se te enganaste em algum trecho do caminho, reajusta a própria visão e
procura o rumo certo.
Não contes vantagens nem fracassos.
Não dramatizes provações ou problemas.
Conserva o hábito da oração para quem se te faz a luz na vida intima.
Resguarda-te em Deus e persevera no trabalho que Deus te confiou.
Ama sempre, fazendo pelos outros o melhor que possas realizar.
Age auxiliando.
Serve sem apego.
E assim vencerás.
Emmanuel
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e aos meus amigos da luz, pela proteção, orientação e pelas bênçãos
alcançadas durante toda minha vida, sem dúvida é o que me dá forças para superar cada
obstáculo e jamais pensar em desistir das coisas que desejo e acredito.
A minha família, meu maior amor, pelas alegrias durante os poucos momentos de
folga, mas os mais importantes, pois me fazem reforçar minha fé em Deus e saber que nossa
passagem aqui tem um motivo especial, que é saber amar sem limites. Em especial aos meus
sobrinhos, verdadeiros tesouros, Bruno, Maria Eduarda e Gabriely, que me fazem sentir uma
verdadeira criança quando estou com vocês, realmente Deus é muito generoso comigo.
Aos amigos e professores do Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica
(CIIB), sempre dispostos a me ajudar em todos os momentos, agradeço pela amizade e
respeito construídos ao longo dos anos de convivência, são pessoas muito especiais pra mim,
em especial professor Dr Wagner Judice pelos ensinamentos que tanto ajudaram no dia a dia,
na realização de experimentos e pela amizade acolhedora sempre com bom humor.
Agradeço as amigas do NIB (Nucleo integrado de biotecnologia), pela ajuda e
paciência que mantiveram durante os experimentos realizados, e por tudo que aprendi
quando tive a oportunidade de conviver um pouco com vocês.
Um agradecimento muito especial à orientadora deste trabalho, Dra Kátia Cristina
U. Mugnol, a qual respeito e admiro, por cada gesto generoso, por sua inteligência e
competência em tudo que realiza, pelos ensinamentos valiosos, por ser uma excelente
professora e profissional, a qual me espelho, obrigada pela oportunidade, paciência, e acima
de tudo, obrigada pela nossa amizade.
Agradeço a todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a
realização deste trabalho.
Algumas pessoas percorrem ao nosso lado vendo muitas luas passarem, mas outras
vemos apenas entre um passo e outro, alguns são parceiros de uma vida toda, outros
acabaram de chegar, a todas elas chamamos de amigos, pessoas que deixam um pouco de si e
levam um pouco de nós, pois jamais pessoas se encontram por acaso, por isso agradeço a
todos que contribuíram e contribuem ainda para que eu possa continuar tentando ser uma
pessoa melhor a cada dia. Desejo amor, paz e sucesso a todos vocês.
“Toda pesquisa é um permanente início-reinício em
ciclos convergentes que representam a expressão pessoal cada vez mais livre, produtiva e construtiva em prol do benefício de todos.”
Cerato SMM.
RESUMO
O citocromo c é uma hemoproteína localizada na membrana mitocondrial, tem papel
importante em eventos biológicos como o transporte de elétrons na cadeia respiratória
mitocondrial e no desencadeamento da apoptose. Sua efetividade como ativador da apoptose
depende de seu estado redox e de sua estrutura, que pode ser modificada com alterações na
coordenação do ferro hemínico, as quais podem ser desencadeadas por mudanças no
microambiente em que a proteína se encontra. Em contato com micelas de SDS, um sistema
biomimético de membrana, o citocromo c pode passar à forma baixo spin alternativo onde
permanece hexacoordenado, porém com simetria menos rômbica devido à substituição do
sexto ligante, a metionina 80, por outro também de campo forte, postulado como sendo a
lisina da posição 79. Dado que esta alteração de ligante pode estar envolvida em alguma etapa
do processo de release do citocromo c durante o processo de morte celular tornou-se objetivo
deste trabalho demonstrar o papel do resíduo de lisina 79 na estrutura e função de citocromo c
visando caracterizar sua influência no processo apoptótico. Para tanto foram construídas
formas mutantes de citocromo c de coração de cavalo, cuja sequência é similar à proteína
humana, com substituição de aminoácidos pontuais via expressão em cepas de Escherichia
coli de plasmídios submetidos a mutagênese sítio-dirigida, obtendo-se para comparação com a
forma nativa comercial os mutantes H26N/H33N (pwt) e H26N/H33N/K79A. Para análise
estrutural e funcional das três formas da proteína foram empregadas técnicas de eletroforese
em gel de poliacrilamida, espectroscopia de absorção UV-vis, espectroscopia de
fluorescência, dicroísmo circular no Far-UV, monitoramente de unfolding térmico e teste de
ativação de cadeia de caspase em extrato citosólico obtido de células em cultura. Os
resultados obtidos permitiram identificar alterações estruturais significativas nas formas pwt e
triplo mutante, induzidas mais provavelmente pela ausência dos resíduos de histidina 26 e 33
do que da lisina 79, demonstrando que as duas primeiras exercem um papel importante
durante a biogênese do citocromo c. Em relação à forma nativa, os dois mutantes tiveram
redução do conteúdo de alfa-hélice e diminuição da cinética e da temperatura média de
unfolding, sendo que as alterações promovidas impediram a conversão das duas formas
modificadas da proteína para a forma baixo spin alternativo induzida por micelas de SDS.
Tais eventos não causaram, entretanto, influência direta na propriedade óxido-redutora da
forma pwt de citocromo c ou de seu potencial em ativar caspase-3 e promover morte celular,
atuando nestes aspectos de forma similar à proteína nativa. Já a substituição adicional do
resíduo de lisina 79 por alanina comprometeu a capacidade do citocromo c em atuar como
aceptor e doador de elétrons bem como sua capacidade em ativar cadeia de caspases,
demonstrando que este resíduo tem, de fato, papel diferenciado nas propriedades desta
proteína como transportadora de elétrons na cadeia respiratória e como agente indutor de
morte celular por apoptose.
Palavras chaves: apoptose, citocromo c, mutagênese sítio-dirigida, baixo spin alternativo.
ABSTRACT
Cytochrome c is a heme protein located in the mitochondrial membrane , plays an important
role in biological events such as the electron transport in the mitochondrial respiratory chain
and the triggering of apoptosis . Its effectiveness as an activator of apoptosis depends on their
redox state and its structure can be modified with changes in the coordination of heme iron ,
which can be triggered by changes in the microenvironment in which the protein is . Contact
SDS micelles a biomimetic membrane system , cytochrome c can pass down to the way in
which alternative spin remains hexacoordenado , but with less rhombic symmetry due to the
replacement of the sixth ligand , methionine 80 , also by another strong field postulated as
lysine position 79. Since this change of binder may be involved in any stage of the process of
cytochrome C release during the process of cell death became purpose of this study
demonstrate the role of lysine residue 79 in the structure and function of cytochrome c to
characterize its influence on the apoptotic process . For such mutant forms of cytochrome c
from horse heart were constructed , whose sequence is similar to the human protein , with
substitution of specific amino acids via expression in Escherichia coli of plasmids subjected
to site-directed mutagenesis to yield compared to the commercial natively mutants
H26N/H33N ( pwt ) and H26N/H33N/K79A . Structural and functional analysis of the three
forms of the protein techniques polyacrylamide gel spectroscopy, UV -vis absorption,
fluorescence spectroscopy , circular dichroism in the Far- UV , monitor thermal unfolding and
activation of caspase -chain test were employed in cytosolic extract obtained from cultured
cells. The results allowed us to identify significant structural changes in pwt forms and triple
mutant , most likely induced by the absence of histidine residues 26 and 33 than the lysine 79
, demonstrating that the first two play an important role during the biogenesis of cytochrome c
. Regarding the native form , the two mutants had reduced the content of alpha -helix and a
decrease of the kinetic and the average temperature of unfolding , and the changes promoted
prevented the conversion of two modified forms of the protein to form alternative low spin
induced SDS micelles . Such events have not caused , however, a direct influence on the
oxide - reductive property of pwt of cytochrome c or its potential to activate caspase - 3 and
cell death promoting way, acting in these respects similar to the native protein forms . Have
additional substitution of lysine residue 79 with alanine compromised the ability of
cytochrome c to act as electron donor and acceptor as well as its ability to activate caspases
chain , demonstrating that this residue is indeed distinct role in the properties of this protein as
electron transport in the respiratory chain and as an inducer of cell death by apoptosis agent.
Keywords : apoptosis , cytochrome c , site-directed mutagenesis , alternative low spin .
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Mitocôndria com esquema de cadeia transportadora de elétrons........................
13
Figura 2. Estrutura do citocromo c de coração de cavalo na forma oxidada mostrando
lisina 22, lisina 27, histidina 33 (sítio L), lisina 73 e lisina 86 (sítio A) interagindo com
vesículas de bicamadas de lipídio.........................................................................................
14
Figura 3. Ligação com o grupo heme. Ligações com cisteína 14 (cys 14) e cisteína 17
(cys 17).................................................................................................................................
15
Figura 4. Estrutura secundária do citocromo c.................................................................... 16
Figura 5. Estrutura tridimensional do citocromo c de coração de cavalo-nativo................ 17
Figura 6. Espectro de absorbância UV-vis de citocromo c de coração de cavalo nos
estados de oxidação Fe3+
e Fe2+
............................................................................................
17
Figura 7. Esquema de localização do citocromo c na membrana ..................................... 19
Figura 8. Vias gerais do inicio da cascata apoptótica por ativação de caspases................. 20
Figura 9. Agregados lipídeos anfipáticos que se forma na água......................................... 25
Figura 10. Estrutura química do Dodecil Sulfato de sódio............................................... . 27
Figura 11. Ligação entre o grupo heme e a porção proteica do citocromo c...................... 28
Figura 12. Estrutura tridimensional do citocromo c............................................................ 29
Figura 13. Plasmídeo PJRhrsN2.......................................................................................... 33
Figura 14. Isolamento de DNA plasmídico......................................................................... 34
Figura 15. Sequenciamento da colônia 1............................................................................. 34
Figura 16. Meio Terrífic em shaker contendo cultivo de cepas de Escherichia coli.......... 36
Figura 17. Meio de cultura pós-centrifugação evidenciando pelet bacteriano.................... 36
Figura 18. Processo de sonicação para rompimento celular bacteriano e liberação de
citocromo c........................................................................................................................
37
Figura 19. Coluna de troca iônica contendo resina CM sepharose fast flow durante
processo de purificação do citocromo c.............................................................................
38
Figura 20. Estrutura do difenilacetaldeído DPAA (agente redutor) e estrutura do T-
butyl (agente oxidante)......................................................................................................
40
Figura 21. Células de aorta de coelho aderidas na garrafa de cultivo, em meio de cultivo
DMEM suplementado com albumina bovina.......................................................................
41
Figura 22. Células de aorta de coelho sob a ação da tripsina (deslocadas)......................... 43
Quadro 1. Doseamento de proteínas pelo método de Bradford....................................... 44
Figura 23. Eletroforese em gel de poliacrilamida (30%) onde correram amostras de
citocromo c nativo citocromo c pwt, citocromo c TM e o padrão de peso molecular......
47
Figura 24. Espectro em UV vis de citocromo c nativo em tampão fosfato de sódio........ 48
Figura 25. Espectros de fluorescência de citocromo c..................................................... 49
Figura 26. Conteúdo de alfa-hélice por CD no far – UV.................................................. 50
Figura 27. Perfil de desenovelamento térmico da forma nativa de citocromo c.............. 51
Figura 28. Perfil de desenovelamento térmico da forma pwt de citocromo.................... 51
Figura 29. Perfil de desenovelamento térmico da forma triplo mutante
(H26N/H33N/K79A) de citocromo c................................................................................
52
Figura 30. Perfil de desenovelamento térmico do citocromo c extraído de coração de
atum e tratado com DEPC.
Figura 31. Derivadas do perfil de desenovelamento térmico da forma triplo mutante
(H26N/H33N/K79A) de citocromo c................................................................................
54
Figura 32. Espectros em UV/vis de citocromo c nativo 100µM em tampão fosfato de
sódio......................................................................................................................................
55
Figura 33. Espectros em UV/vis de citocromo c nativo, citocromo c pwt e citocromo c
H26N/H33N/K79A em micela aquosa de SDS..................................................................
56
Figura 34. Espectros de redução do ferro hemínico do citocromo c nativo em presença
de DPAA. .............................................................................................................................
58
Figura 35. Espectros no Uv/vis de redução do ferro hemínico do citocromo c
H26N/H33N (pwt) em presença de DPAA...........................................................................
59
Figura 36. Espectros no Uv/vis de redução do ferro hemínico do citocromo c
H26N/H33N/K79A em presença de DPAA..........................................................................
60
Figura 37. Espectros de oxidação do ferro hemínico do citocromo c nativo em presença
de t-BuOOH. ........................................................................................................................
61
Figura 38. Espectros no Uv/vis de oxidação do ferro hemínico do citocromo c
H26N/H33N (pwt) em presença de t-BuOOH......................................................................
61
Figura 39. Espectros no Uv/vis de oxidação do ferro hemínico do citocromo c
H26N/H33N/K79A em presença de t-BuOOH.....................................................................
62
Figura 40. Espectros Uv/vis do ciclo catalítico de redução e oxidação do ferro hemínico
do citocromo c nativo em presença de DPAA e t-BuOOH. ................................................
63
Figura 41. Espectros no Uv/vis de redução por DPAA seguida de reoxidação por t-
BuOOH para ferro hemínico do citocromo c H26N/H33N (pwt)........................................
64
Figura 42. Espectros no Uv/vis de redução por DPAA seguida de reoxidação por t-
BuOOH para ferro hemínico do citocromo c H26N/H33N/K79A........................................
65
Figura 43. Teste de ativação de caspase-3 em extrato citosólico de células de músculo
liso de aorta de coelho. Extrato com citocromo c nativo, com citocromo c pwt e com
citocromo c triplo mutante H26N/H33N/K79A......................................................
66
Figura 44. Teste de ativação de caspase-3 em extrato citosólico de células de músculo
liso de aorta de coelho. Leituras após 40 horas de incubação de extrato com citocromo c
nativo, citocromo c pwt e citocromo c triplo mutante H26N/H33N/K79A..........................
67
Figura 45. Curva padrão de AMC livre................................................................................ 68
Figura 46. Concentração de AMC livre gerado após 16 e 40 horas de reação para cada
uma das formas de citocromo c (nativo, pwt e triplo mutante..............................................
68
LISTA DE ABREVIATURAS
(A) alanina
APAF Fator de ativação da protease apoptótica
ATP Adenosina Tri fosfato
BSA Albumina de soro bovino
Ca2+-
Calcio
CD dicroísmo circular
CMC Concentração micelar crítica
CMF Solução salina sem cálcio e magnésio
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Acido desoxirribonucleico
DEPC dietilpirocarbonato
DPAA Difenilacetaldeido
(E) glutamato
EDTA Àcido etilenodiamino tetra acético
EPR Ressonância Paramagnética Eletrônica
Fe2+
Ferro estado ferroso
Fe3+
Férro estado férrico
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IPTG Isopropylthio-β-galactoside
K+ Potássio
kDa Kilodalton
L litro
(L) leucina
LB Luria bertrani
MCD dicroísmo circular magnético
MLAC Músculo liso de aorta de coelho
mM milimolar
µM Micromolar
Na+
Sódio
NaCl Cloreto de sódio
nm Comprimento de onda em nanômetro
O2 Oxigênio
PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride)
PTP Poro de transição de permeabilidade
RPM Rotações por minuto
SDS Dodecil sulfato de Sódio
SFB Soro fetal bovino
ᶿ Tetamolar
t-BuOOH Tert-brutil hidroperóxido
TEMED (Tetramethyl-1,2-diaminomethane)
TPM Transição de permeabilidade mitocondrial
Try Triptofano
UV-vis Ultra violeta visível
W Triptofano
α Alfa
β Beta
γ Gama
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO........................................................................................................... 13
1.1 Estrutura do citocromo c................................................................................................. 15
1.2 Funções do citocromo..................................................................................................... 18
1.3.Apoptose.......................................................................................................................... 21
1.4. Os diferentes estados de Spin do citocromo c ............................................................... 23
1.5. Sistemas micelares e tensoativos.................................................................................... 24
2.OBJETIVOS................................................................................................. 31
2.1.Geral................................................................................................................................ 31
2.2. Objetivos específicos...................................................................................................... 31
3.MATERIAL E MÉTODO........................................................................... 32
3.1. Preparo das soluções de citocromo c Fe3+
em tampão fosfato de sódio........................ 32
3.2. Preparo das soluções de SDS ........................................................................................ 32
3.3. Preparo das soluções de citocromo c Fe3+
em SDS....................................................... 32
3.4. Preparo das soluções de DPAA (Diphenyl acetaldeydo)............................................... 32
3.5. Preparo das soluções de t-BuOOH (tert-butil hidroperóxido)....................................... 32
3.6. Obtenção das formas mutantes de citocromo c.............................................................. 33
3.7 Eletroforese..................................................................................................................... 35
3.8. Espectroscopia de absorção UV/vis na caracterização estrutural das formas mutantes
de citocromo c.......................................................................................................................
38
3.9. Espectroscopia de dicroísmo circular CD no far-UV para análise de citocromo c 39
3.10. Análise estrutural das formas mutantes e nativa de citocromo c por espectroscopia
de fluorescência.....................................................................................................................
40
3.11. Estudo da atividade catalítica do citocromo c.............................................................. 40
3.12. Análise da ativação de caspase-3 pelas formas mutantes de citocromo c.................... 41
3.13. Doseamento de proteínas pelo método de Bradford................................................... 44
4.RESULTADOS E DISCUSSÕES.......................................................................... 46
4.1. Eletroforese.................................................................................................................... 46
4.2. Características espectroscópicas das formas nativa e mutantes do citocromo c em
ambiente homogêneo.............................................................................................................
47
4.3 Características dos espectros UV/vis de formas mutantes de citocromo c em tampão
Fosfato de sódio e em micelas aquosas de SDS....................................................................
4.4. Atividade catalítica de formas nativa e mutantes de citocromo c frente a peróxidos e
aldeídos..................................................................................................................................
54
58
4.5. Ativação de cadeia de caspase pelas formas mutantes e nativa de citocromo c............ 65
5.CONCLUSÕES............................................................................................ 70
REFERÊNCIAS…………………………………………………………….. 71
13
1 INTRODUÇÃO
O citocromo c é uma hemoproteína encontrada associada à face externa da membrana
mitocondrial interna e tem papel importante em eventos biológicos como o transporte de
elétrons na cadeia respiratória mitocondrial dos organismos aeróbios e no desencadeamento
da apoptose (YANG et al. 1997; KLUCK et al. 1997).
A utilização do citocromo c em pesquisas como alvo de estudo a fim de elucidar alguns
dos mecanismos biológicos em que ele atua, vem crescendo de forma considerável, tendo em
vista as possibilidades que abre em diversas áreas de conhecimento.
Seu papel melhor esclarecido é o de transportador de elétrons na cadeia respiratória
mitocondrial, porém atualmente o estudo de sua participação no processo de morte celular
programada fornecem informações que podem ser úteis no desenvolvimento e aplicações de
novas ferramentas para diagnóstico e tratamento do câncer (PAULA, 20013).
Muitas atividades atribuídas a esta importante proteína estão diretamente relacionadas à
estrutura e função das mitocôndrias (figura 1), uma organela de extrema complexidade, que
no decorrer da evolução dos organismos mantiveram-se conservadas preservando as funções
respiratórias bem como suas características estruturais.
Figura 1 - Mitocôndria com esquema da cadeia transportadora de elétrons
Fonte: EBERLIN (2009)
14
A membrana interna da mitocôndria possui a face interna voltada para o lúmen e a face
externa voltada para o espaço intermembrana que faz divisa com a membrana externa, sendo
nesta face externa onde encontramos 85 a 97% do citocromo c ligado eletrostaticamente com
a citocromo c redutase e a citocromo c oxidase (GLOTTLIEB, 2000).
A interação do citocromo c com a membrana mitocondrial ocorre em sítios específicos por
diferentes formas de ligação. Até o presente foram definidos os sítios C, onde o citocromo se
liga à membrana mitocondrial interna por forças eletrostáticas, o sítio A, onde a ligação
envolve resíduos de lisina 72 e 73 através de ligação do tipo hidrofóbica e o sítio L com
interações pH dependente com participação de resíduos de lisina 22, 25 e 27 (figura 2)
(RYTÖMAA; KINNUNEN, 1992; KAWAI, 2005). Outros resíduos de aminoácidos vizinhos
aos sítios A, como a lisina 79, e ao sítio L, como as histidinas 26 e 33 exercem possível papel
de interferência nessa interação entre citocromo c e membrana.
Figura 2 - Estrutura do citocromo c de coração de cavalo na forma oxidada mostrando lisina 22, lisina 27,
histidina 33 (sítio L), lisina 72, lisina 73 (sítio A) interagindo com vesículas de bicamadas de lipídios
Fonte: KAWAI et al. (2005)
O citocromo c é codificado por um gene nuclear, sendo transcrito por um ribossomo
citosólico e recebe o nome de holocitocromo, que se refere à cadeia proteica do citocromo c
15
sem a presença do grupo heme e depois é translocado para o interior da mitocôndria ligando-
se ao grupo heme através de ligação covalente. Este processo de inserção do grupo heme ao
holocitocromo é dependente de heme-liase, uma enzima essencial inclusive para expressão de
citocromo c in vitro utilizando tecnologia de DNA recombinante (OLIVER; STUART, 2003;
RUMBLEY; ENGLANDER, 2002). O controle da produção desta proteína no citosol da
célula e sua migração para o interior da mitocôndria envolve processo não descrito que
engloba a entrada e o posicionamento da proteína dentro da organela (LEWIN, 2001;
MUGNOL, 2004; KAWAI et al. 2009).
1.1 Estrutura do citocromo c
Esta pequena proteína apresenta massa molecular em torno de 12 kDa e possui um único
grupo heme contendo ferro, grupo prostético este formado por uma porfirina contendo quatro
anéis de cinco átomos com nitrogênio dispostos em uma estrutura cíclica e coordenados com
um íon de ferro central, que pode estar na sua forma oxidada ou reduzida (figura 3). Este
grupo heme aparece inserido no core da cadeia proteica, composta esta por 103 a 107
aminoácidos, conforme o organismo em que se encontra.
Figura 3 - Ligação com o grupo heme. Ligações com cisteína 14 (cys 14) e cisteína 17 (cys17)
Fonte: MUGNOL (2004)
16
A ligação entre o grupo heme e a cadeia proteica é do tipo covalente, esta ligação no
citocromo c é estabelecida por ligações tioéster entre o grupo heme e dois aminoácidos da
cadeia proteica, a cisteína 14 e a cisteína 17. No seu estado nativo, o citocromo c contém o
ferro hemínico hexacoordenado, sendo a quinta e a sexta coordenações ocupadas por outros
dois aminoácidos da cadeia polipeptídica, a histidina 18 e a metionina 80, respectivamente
(TUOMINEN; WALLACE; KINNUNEM, 2002; RYTOMAA; KINNUNEM, 1995;
GEBICKA, 1999).
Inúmeros estudos demonstram o papel do grupo heme em mecanismos de controle da
estrutura de proteínas e a influência nas funções de tais proteínas considerando a natureza de
seus ligantes coordenados ao átomo de ferro bem como a natureza dos aminoácidos presentes
na cadeia, próximo ao sítio ativo. Estes estudos são de grande importância na determinação e
compreensão da estrutura e função de hemoproteínas (SHELNUTT, 1998).
O alto teor de lisinas presentes na cadeia de aminoácidos do citocromo c (figura 4) confere
a proteína um caráter básico e seu ponto isoelétrico fica próximo a dez (YANG et al. 1997;
KLUCK et al. 1997).
Figura 4 - Estrutura secundária do citocromo c
Fonte: MUGNOL (2004)
Devido à variabilidade na sequência de aminoácidos e na extensão da cadeia polipeptídica,
bem como sua estrutura (figura 5), o citocromo c está associado à detecção de respostas a
17
sinais específicos do interior da membrana mitocondrial, sinais ainda pouco conhecidos,
podendo desencadear processo apoptótico no citosol (RINALDI et al. 2004; ZUCHHI et al.
2003).
A literatura sugere que a efetividade do citocromo c como agente ativador do processo de
apoptose é dependente de seu estado redox e de sua estrutura, o que reforça ainda mais a
necessidade de compreender como o ferro hemínico se comporta em diferentes situações para
inferir estas observações no estudo e no controle da morte celular programada (YANG et al.
1997; KLUCK et al. 1997).
Figura 5 – Estrutura tridimensional do citocromo c de coração de cavalo – nativo
Fonte: MUGNOL (2004)
O citocromo c possui um espectro de absorção bem característico (figura 6), e suas
características são dependentes dos ligantes axiais do ferro hemínico e do microambiente em
que este se encontra. O íon metálico presente é, portanto, fator altamente importante na
determinação da geometria molecular e também da reatividade da proteína (DICKERSON;
TIMKOVICH, 1975).
Figura 6 – Espectro de absorbância UV-Vis de citocromo c de coração de cavalo nos estados de oxidação Fe3+
e
Fe2+
. Linha cheia: citocromo c Fe3+
; linha pontilhada: citocrmo c Fe2+
, Tampão HEPES 10 mM pH 7,4
.
Fonte: PAULA (2013)
18
As bandas α, γ e β representam a excitação dos elétrons do anel porfirínico. A banda γ,
também conhecida como Soret absorve radiação próxima da região violeta do espectro, 400-
415 nm, a banda β absorve na região do verde 520-546 nm e a banda α absorve na região do
amarelo 550-604 nm, na forma reduzida (Fe2+
), enquanto que na forma oxidada (Fe3+
)
apresenta uma única banda (banda Q) com pico máximo por volta de 530 nm (DICKERSON;
TIMKOVICH, 1975).
Em situações diversas, é possível ocorrer a perda da sexta posição ocupada pela metionina
80 ou a perda também da quinta coordenação, ocupada pela histidina 18, sendo substituídas
por outros ligantes ainda desconhecidos.
Tais alterações na coordenação distal do ferro hemínico e na estrutura do citocromo c
podem ser desencadeadas por mudanças no microambiente em que a proteína se encontra.
1.2 Funções do citocromo c
A função do citocromo c como transportador de elétrons na cadeia respiratória deve-se a
sua capacidade de oxidação e redução reversível do íon ferro presente no grupo heme inserido
no core da cadeia proteica, envolvendo o transporte de elétrons do complexo III para o IV
ocorrendo a redução de moléculas de O2, permitindo a formação de moléculas de água e, em
conjunto com os demais complexos, promove o bombeamento de prótons da matriz da
mitocôndria para o espaço intermembranas. Esse diferencial de prótons (H+) irá gerar um
potencial eletroquímico que será utilizado no processo de fosforilação oxidativa para síntese
de ATP (MITCHELL, 1997). A figura 7 mostra o esquema de localização do citocromo c na
cadeia transportadora de elétrons presente na membrana interna da mitocôndria.
Representação do fluxo de prótons nos complexos I, II e IV, e fosforilação oxidativa. O fluxo
de elétrons entre os complexos está representado por seta preta.
O citocromo c está também envolvido em processos de estresse oxidativo celular e perda
do potencial de membrana das mitocôndrias sendo que o stress oxidativo, bem como o estado
de oxidação do ferro, são também fatores envolvidos na capacidade apoptótica do citocromo c
(RODRIGUES et al. 2007).
19
Figura 7 – Esquema de localização de citocromo c na membrana. Cadeia transportadora de elétrons presente na
membrana interna da mitocôndria
Fonte: ALMARAZ et al. (2006)
Estudos de 1998 já afirmavam que é liberado citocromo c da mitocôndria para o citosol
durante a apoptose, fato hoje confirmado e descrito na literatura, e sugerem que esta versão
pode ser um passo crítico na ativação de caspases proapoptóticas que levam à morte celular
(GARLAND; RUDIN, 1998; SHARONOV et al. 2005).
O fato de que o citocromo c utiliza seus resíduos de lisinas para interagir com seus
parceiros de ligação na mitocôndria pode ser de extrema importância à via que conduz para
ativação de caspases no citoplasma da célula (HAMPTO et al. 1998).
Ao receber estímulos de morte, ocorre um colapso do potencial da membrana interna
mitocondrial, desestabilizando a membrana, promovendo alterações na concentração iônica
dentro da célula, esses sinais provocam também a transição de permeabilidade mitocondrial
(TPM), que se trata da permeabilização não seletiva da membrana interna prejudicando a
homeostasia celular. A transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) é um processo
caracterizado pela abertura de um canal na membrana mitocondrial interna, conhecido como
poro de transição de permeabilidade (PTP), que é dependente de cálcio (KOWALTOWSKI;
VERCESI; FISKUM, 1999; FADEEL; ORRENIUS, 2005).
20
A abertura do poro de transição da permeabilidade promove alterações na permeabilidade
da membrana mitocondrial interna, favorecendo a entrada de solutos e alguns íons e
ocorrendo assim a perda do potencial de membrana levando a um inchamento da organela
(DORTA et al. 2005).
Alguns estudos demonstram ainda a ocorrência do desacoplamento da cadeia respiratória,
além da passagem da água do espaço intermembrana para a matriz mitocondrial, levando a
ruptura da organela, promovendo a liberação de citocromo c para o citoplasma. Ao atingir o
citosol (esquema1) o citocromo c se liga a APAF (fator de ativação da protease apoptótica)
esses dois se ligam a pró-caspase-9 formando um complexo denominado apoptossomo, desta
maneira ocorre a clivagem da pró caspase -9 liberando a caspase-9 ativa que irá ativar a
caspase-3 causando a apoptose celular (figura 8) (BRAJUSKOVIC, 2005; GRIVICICH;
RENGER; ROCHA, 2007).
Figura 8 - Vias gerais do início da cascata apoptótica por ativação de caspases
Fonte: LORENZO; KLAS; GUIDO (2009)
Receptores
Estresse extracelular
Receptores de morte
Estresse intracelular
Apoptossomo
Efetores caspase-independente
Apoptose
21
1.3 Apoptose
Os organismos multicelulares dependem das funções realizadas por diversos tipos de
células para sua sobrevivência. Após o desenvolvimento, a viabilidades desses organismos é
determinada e mantida pela manutenção e renovação dessas células, através do equilíbrio
entre proliferação e morte celular. A apoptose é um tipo de morte celular essencial no
desenvolvimento e na homeostase dos tecidos vivos (THOMPSON, 1995; DESAGHER;
MARTINOU, 2000).
O termo apoptose refere-se a um evento de morte celular com características morfológicas
perfeitamente diferenciadas da necrose (DESAGHER; MARTINOU, 2000).
A necrose caracteriza-se pela condensação da cromatina e aumento de volume celular, as
mitocôndrias dilatam-se, juntamente com o retículo endoplasmático, e ocorre desagregação
dos ribossomos (UCHIYAMA, 1995).
Além disso, a necrose apresenta alteração na permeabilidade da membrana celular,
diminuição nos níveis de ATP, e tem como resultado, o comprometimento da bomba de
Na+/K
+ e de outros fenômenos que são ATP-dependentes (TRUMP et al. 1997).
Como resultado, temos o rompimento da membrana plasmática e liberação do material do
citoplasma, responsável por promover uma reação inflamatória local. Ainda que ocorra
22
remoção do material necrótico por fagócitos, a inflamação causa danos locais importantes
para o tecido (KERR et al. 1994).
Na apoptose observamos a redução exacerbada do volume celular, acompanhada de
dilatação do retículo endoplasmático, com retração da membrana plasmática. O núcleo
apresenta condensação da cromatina ao redor da periferia nuclear (WYLLIE et al. 1997).
Após eletroforese do DNA em gel, observa-se padrão característico “em escada”, opondo-se
ao arrastado visto na necrose. Isso se deve ao fato de que as quebras no DNA ocorrem entre
os nucleossomas, formando fragmentos múltiplos de 180-200 pares de bases (KERR et al.
1994).
A apoptose não apresenta rompimento da membrana plasmática, não ocorrendo a liberação
de componentes celulares para o meio extracelular (KERR et al. 1994).
Observamos o fosfolípide fosfatidilserina, exposta em sua porção externa, antes mantido
normalmente em seu folheto interno (DESAGHER; MARTINOU, 2000), servindo como sinal
para fagocitose da célula apoptótica por macrófagos e células adjacentes inibindo a reação
inflamatória, evitando o comprometimento de estruturas sadias dos tecidos (FRASER;
EVAN, 1996; GREEN; KROEMER, 1998; ISRAELS; ISRAELS, 1999; HENSON; HUME,
2006).
Por ser reconhecida como um mecanismo de defesa antineoplásica, existe uma intensa
investigação dos mecanismos moleculares de apoptose, a fim de desenvolver técnicas
aplicáveis na destruição de células tumorais (GRIVICICH; RENGER; ROCHA, 2007).
O mecanismo de liberação de citocromo c da membrana interna mitocondrial para o citosol
para o desencadeamento da cascata apoptótica não está elucidado e bem descrito na literatura.
Alguns trabalhos sugerem que a liberação de citocromo c para o citosol provavelmente
envolvem duas vias, sendo uma Ca2+
dependente e outra Ca2+
independente. Na primeira via,
o aumento da concentração de Ca2+
mitocondrial promove a abertura de poros de transição de
permeabilidade, resultando na perda da matriz mitocondrial, ruptura da membrana
mitocondrial externa e liberação de citocromo c. A segunda é regulada por proteínas da
família Bcl-2 constituída de membros proapoptóticos que promovem a liberação de proteínas
mitocondriais para o citosol, como por exemplo, Bid, Bax e citocromo c, e, membros
antiapoptóticos, que pode atuar inibindo a liberação de proteína mitocondriais, como Bcl-2 e
Bcl-xL ( KOWALTOWSKI; VERCESI; FISKUM, 2000).
A literatura atual apresenta evidências indicando que a forma oxidada do citocromo c é
importante para o envolvimento da cascata de caspases na ausência de qualquer outro indutor
de apoptose. Estes estudos demonstraram que o citocromo c Fe3+
regula a formação de H2O2
23
ao nível celular por mecanismos ainda desconhecidos que necessitam de estudos pra
compreender a bioquímica neste evento (MIN; WANG; JIAN, 2008).
A associação do citocromo c com diferentes interfaces carregadas modifica sua atividade
devido ao maior ou menor relaxamento desta sexta posição de coordenação e pode favorecer a
atividade peroxidatica da proteína. A habilidade do citocromo c como carreador na cadeia
respiratória ou como ativador de caspase no processo de apoptose é dependente da sua
associação com membranas e complexos proteicos. Esta modulação na ação do citocromo c é
importante para desencadear e controlar eventos biológicos onde esta proteína está envolvida,
estudos revelam inclusive que existe uma estreita relação entre a natureza da cadeia lipídica e
o estado de spin do citocromo c. A interação do citocromo c com interfaces carregadas
interferem diretamente no spin do ferro hemínico.
1.4 Os diferentes estados de Spin do citocromo c
Dentro dos processos biológicos, o ferro desempenha o papel de transportador de elétrons,
o que leva a produção de energia para as células. Este transporte é realizado através do íon
ferro que muda sua valência perdendo ou ganhando elétrons.
O íon ferro apresenta-se em três estados de oxidação: Fe 2+
com configuração eletrônica d6
(ferroso), Fe 3+
com configuração eletrônica d5
(férrico) e Fe4+
com configuração eletrônica d4
(ferril). A camada 3D é formada por cinco orbitais que podem ser ocupados por no máximo
10 elétrons, estando 2 em cada orbital. Os orbitais não são idênticos entre si, no íon livre os
cinco orbitais possuem a mesma energia, porém, considerando a ligação com ferro em seis
ligantes, o efeito do campo cristalino de cada ligante não é o mesmo em todos os orbitais.
A teoria do campo cristalino considera ligantes como cargas pontuais negativas que irão
originar um campo elétrico que atua sobre o íon paramagnético. Dependendo da intensidade
do campo cristalino poderá ter configuração que variam de alto spin a baixo spin, desta
maneira, ligantes fortes fornecem uma configuração baixo spin e ligantes fracos fornecem
uma configuração alto spin (PRIETO, 2004).
É conhecido como spin o giro do elétron em torno de si mesmo, sendo uma propriedade
quântica relacionada ao magnetismo. Esta quantidade de movimento angular presente nos
elétrons que gira em torno de si mesmo é representado por um vetor que pode estar voltado
para cima indicando rotação de oeste para leste (sentido anti-horário) ou para baixo, indicando
rotação leste para oeste (sentido-horário), ocasionando energias diferentes dentro de um
campo magnético (AWSCHALOM; FLATT; SAMARTH, 2002).
24
O átomo de ferro presente no citocromo c pode apresentar-se Fe3+
ou Fe2+
com
configurações 3d5 e 3d
6, estando seus elétrons distribuídos conforme tabela 1.
O citocromo c apresenta três estados de spin, a condição de baixo spin alternativo está
relacionado à interação do citocromo c com modelos de membrana mitocondrial carregados
negativamente e tensoativos. Esta interação do citocromo c com membranas e sistemas
micelares pode definir alterações no estado de spin do ferro hemínico, as quais têm influência
direta sobre a estrutura da proteína e suas propriedades.
Os diferentes estados de spin podem ocorrer em uma mistura de estruturas lipídicas e
citocromo c. Em presença de diferentes interfaces carregadas negativamente, tem-se
diferentes estados de spin e variam também de acordo com o lipídeo envolvido e a proporção
em que se encontra a mistura (ZUCHHI et al. 2003).
1.5 Sistemas micelares e tensoativos
A habilidade do citocromo c como carreador de elétrons na cadeia respiratória ou como
ativador das caspases no processo de apoptose é dependente de sua associação com
membranas e complexos proteicos. Esta modulação na ação do citocromo c é importante para
desencadear e controlar eventos biológicos onde esta proteína está envolvida. A interação
entre o citocromo c e uma membrana lipídica inicia-se por uma interação eletrostática com a
superfície da membrana seguida por uma interação hidrofóbica entre a cadeia carbônica do
lipídio no interior da membrana (MUGNOL, 2004).
Membranas são estruturas dinâmicas que permitem às células ajustarem sua forma e
mudarem sua posição, além de organizar sequências de reações complexas essenciais para
25
conservação da energia e para comunicação entre células e modularem a estrutura e função de
várias proteínas. Os componentes lipídicos, proteicos e carboidratos são adequados a esse
papel dinâmico. A característica estrutural básica das membranas está relacionada às
propriedades físico-química dos glicerofosfolipídios (lipídios mais abundantes na membrana),
que possuem estrutura anfipática. Os compostos que possuem uma cabeça hidrofílica e uma
cauda hidrofóbica são chamados anfipáticos, e interagem em sistemas aquosos in vitro
formando estruturas conhecidas como micelas. As cabeças polares ficam expostas para o lado
de fora interagindo com a água, enquanto que as caudas hidrofóbicas interagem excluindo a
água. Esses agregados moleculares possuindo ambas as regiões estruturais, hidrofílicas e
hidrofóbicas, se associam em solução aquosa a partir de certa concentração, o que é dita
concentração micelar crítica (CMC) (DEVLIN, 2007).
A formação de micelas ocorre quando a área transversal dos grupos carregados (cabeça)
for maior que a cadeia acila lateral (cauda) como ocorre nos ácidos graxos livres, nos
lisofosfolipídios (fosfolipídeos sem um ácido graxo) e nos detergentes (LEHNINGER, 2006).
A estrutura das micelas é estável devido à interação hidrofóbica entre as cadeias
hidrocarbônicas e a atração dos grupos polares pela água (DEVLIN, 2007).
Diferente das micelas que são formadas quando a área transversal dos grupos carregados
for maior que a cadeia acila lateral, quando estas duas regiões são semelhantes, ocorre a
formação de bicamadas lipídicas. Estas, ao dobrar-se sobre si mesma, irão compor uma
estrutura dita lipossomo. As três estruturas possíveis estão à mostra na figura 9.
Figura 9- Agregados lipídicos anfipáticos que se formam na água
(a) Nas micelas, as cadeias anfipáticas dos ácidos graxos estão seqüestradas no interior hidrofóbico da esfera
onde, praticamente, não há água. (b) Na bicamada aberta, todas as cadeias acila laterais, exceto aquelas nas
margens da lâmina, estão protegidas da interação com água. (c) Quando uma bicamada bidimensional se
dobra, ela forma uma bicamada fechada, uma vesícula tridimensional oca (lipossomo) envolvendo uma
cavidade contendo água.
Fonte: LEHNINGER (2006)
26
Os lipídios da membrana celular e da membrana de organelas por si só são tensoativos que
conferem à membrana sua estrutura. Sendo assim, a construção de modelos utilizando
tensoativos visa mimetizar condições presentes nas membranas biológicas (BRANDÃO,
1997).
Os agentes tensoativos são também classificados como anfifílicos ou anfipáticos, pois
apresentam na mesma molécula uma porção hidrofílica polar (cabeça) e uma porção
hidrofóbica apolar (cauda). A cabeça da molécula pode ser carregada ou não, de acordo com o
tensoativo. Quando carregado pode ser aniônico, catiônico ou zwiteriônico, contendo grupos
fosfato, amino, sulfato e carboxila, enquanto que os não carregados são representados por
grupos hidroxila, carbonila, éter e carboxila protonada (ROCHA, 1997).
Os tensoativos, também chamados de detergentes ou surfactantes, são compostos solúveis
em meio aquoso e formam micelas de tamanhos e formas variadas de acordo com a
concentração utilizada e da estrutura do tensoativo (tamanho da cadeia de hidrocarbonetos),
alem das condições do ambiente (força iônica, contra íons, temperatura, pH etc.) (MUGNOL,
2004).
Abaixo da CMC, o tensoativo está predominantemente na forma de monômeros. Quando a
concentração está abaixo, porém próxima da CMC, existe um equilíbrio dinâmico entre
monômeros e micelas e, em concentrações acima da CMC, as micelas possuem um diâmetro
entre 3-6 nm o que representa de 30-200 monômeros (PRIETO, 2004).
Do ponto de vista analítico, uma das mais importantes propriedades dessas estruturas
organizadas é a sua capacidade de solubilizar solutos de diferentes características. Esses
solutos podem interagir eletrostaticamente, hidrofobicamente e pela combinação de ambos os
efeitos (MORAES, 2011).
Estudos de purificação de produtos biotecnológicos como enzimas e proteínas através do
uso de micelas reversas demonstram o interesse científico nesta técnica. Micelas reversas são
formações espontâneas e reversíveis de agregados esféricos de moléculas anfifílicas em
solução apolar. Na presença de água solubilizada, os centros aquosos presentes nesses
agregados são capazes de solubilizar proteínas, enzimas e outras substâncias (HASMANN,
2007).
Para realizar estudos com proteínas é necessário um detergente que promova a estabilidade
da proteína e que formem micelas pequenas. A interação do citocromo c com interfaces
carregadas interferem diretamente no spin do ferro hemínico
No caso do uso de interfaces carregadas negativamente estas alterações são ainda mais
evidentes. Sendo assim, para esta pesquisa o tensoativo de escolha foi o dodecil sulfato de
27
sódio (SDS), mais conhecido como lauril sulfato de sódio (figura 10), a fim de mimetizar
membranas biológicas e induzir o citocromo c ao estado de baixo spin alternativo, sendo
relevante saber algumas características desse surfactante. Sua fórmula molecular é
C12H25NaO4S e seu peso molecular é aproximadamente 288,38 g/mol. É um tensoativo de
caráter aniônico facilmente solúvel em água, sua CMC é em torno de 7,0 mM, e possui uma
efetiva interação com citocromo c, que possui carga positiva (MUGNOL, 2004).
Figura 10 - Estrutura Química Dodecil Sulfato de Sódio - Lauril Sulfato de Sódio
Em estudos realizados com micelas de SDS, a concentração do surfactante também tem
influência direta sobre o estado de spin. Altas concentrações de SDS levam o citocromo c a
um estado alto-spin, enquanto que concentrações próximas à CMC promovem alterações
compatíveis com um estado dito baixo spin alternativo. Acredita-se que tais alterações tenham
relação direta com o sexto ligante do ferro hemínico (TUOMINEN; WALLACE;
KINNUNEM, 2002; RYTOMAA; KINNUNEM, 1995; GEBICKA, 1999).
Como a metionina é um ligante de campo forte, o ferro hemínico do citocromo c em seu
estado nativo apresenta-se na forma baixo spin (figura 11). Entretanto, esta ligação entre o
enxofre da metionina e o ferro hemínico pode ser enfraquecida e/ou rompida em função de
alterações no ambiente em que a proteína se encontra e as mudanças decorrentes deste fato
afetam a estrutura e consequentemente função do citocromo c. Estando pentacoordenado ou
hexacoordenado, porém com um ligante de campo fraco, o ferro hemínico passa ao status de
forma alto spin. Estas alterações favorecem ao citocromo c exercer suas funções (NANTES
et al. 2000; NANTES et al. 2001).
28
Figura 11 – Ligação entre o grupo heme e a porção proteica do citocromo c
Fonte: MUGNOL (2004)
O papel do sexto ligante do ferro hemínico na estrutura e na reatividade do citocromo c
tem sido bastante discutido. O estado referido e descrito por Zucchi et al (2013) como baixo
spin alternativo, refere-se a condição onde o citocromo c apresenta-se ainda no estado baixo
spin, isto é, hexacoordenado, porém mais simétrico, assumindo uma forma dita menos
rômbica em relação ao citocromo c nativo. Nesta condição, acredita-se que tenha ocorrido
uma alteração de ligante no ferro hemínico na sexta posição de coordenação, de metionina
para lisina (ZUCHHI et al. 2003).
Mugnol et al (2008) comprovaram que esta forma baixo spin alternativo pode ser induzida
pela interação do citocromo c Fe3+
e Fe2+
com micelas de SDS e também com micelas
reversas de AOT/hexano. Nestes microambientes, foi possível por meio de técnicas como a
Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR), a espectroscopia no UV-vis, o dicroísmo
circular (CD), o dicroísmo circular magnético (MCD), a espectroscopia de fluorescência e a
ressonância Raman obter resultados consistentes com a substituição da metionina 80 como
sexto ligante do ferro hemínico por outro ligante de campo forte, com a maior simetria da
proteína e com manutenção do enovelamento proteico. Os resultados reforçam outra
suposição, a de que a Lisina 79 (figura 12) seja a ocupante da sexta coordenação do ferro
hemínico neste estado de baixo spin alternativo, substituindo a metionina 80 da forma nativa.
29
Figura 12 - Estrutura tridimensional do citocromo c
Fonte: MUGNOL (2004)
A fim de compreender as alterações promovidas na estrutura do citocromo c devido a
alterações ocorridas em seus ligantes e a influência deste evento na indução da morte celular
induzida por citocromo c a utilização de formas mutantes desta proteína com mutações sítio
dirigidas que permitem a troca de resíduos específicos podem, por exemplo, determinar
alterações decorrentes da ausência da lisina na posição 79 e assim fornecer informações
importantes sobre a atuação deste aminoácido nesta posição na estrutura e função da proteína.
Ferramentas que empregam técnicas de biologia molecular e mutagênese sítio-dirigida vêm
sendo empregadas em estudos envolvendo citocromo c e se tornaram importantes para a
elucidação não somente do papel da proteína como um todo, mas de diferentes e específicos
resíduos de aminoácidos (RUMBLEY; HOAND; ENGLANDER, 2002; KAWAI et al.
2009).
Trabalhos anteriores comprovaram a efetividade do citocromo c como agente indutor de
morte celular através da utilização de técnicas de microinjeção e eletroporação, e mostraram
também que estes procedimentos são ferramentas promissoras e altamente eficientes na
transferência de citocromo c exógeno para o citoplasma de células. Através do
acompanhamento das reações utilizando técnicas de imagens digitais de fluorescência e
microscopia ópticas e também eletrônica é possível avaliar as alterações e caracterização
morfológica das células utilizadas para a aplicação de citocromo c, os resultados obtidos
30
nestes trabalhos demonstraram início de apoptose celular aproximadamente 30 minutos após a
microinjeção de citocromo c, permanecendo sob monitoramento durante um período de 5
horas, sendo que, após três horas foi observado o índice de 80% de células apoptóticas
(SEUNG et al. 2000).
Sharonov et al (2005) utilizaram das mesmas técnicas para avaliar a capacidade de indução
de morte celular do citocromo c, utilizando formas mutantes da proteína afim de investigar o
papel dos resíduos de aminoácidos, obtendo mutações em resíduos individuais na lisina da
posição 72 , sendo substituídas por alanina (A), glutamato (E), leucina (L) e triptofano (W),
a capacidade de indução de morte celular dos mutantes foram comparadas a atividade do
citocromo c nativo, sendo que este último apresentou 97% de morte celular, os resultados
mostram que a substituição da lisina na posição 72 por alanina apresentou redução da
atividade apoptótica cinco vezes menor, quando comparada a forma nativa, enquanto que as
formas mutantes K72E, K72L apresentaram visível diminuição da atividade apoptótica
mesmo em altas concentrações de citocromo c diferentemente do mutante K72W, que não
apresentou atividade de indução de morte celular, no entanto esta forma mutante não
apresentou alterações na capacidade de transportar elétrons na cadeia respiratória, os autores
sugerem que esta forma mutante do citocromo c ao se ligar a APAF-1 forma um complexo
inativo não tendo capacidade de induzir a morte celular.
Considerando o papel do citocromo c no disparo da apoptose, a provável influência de
alguns resíduos específicos de aminoácidos nesse processo e a capacidade desta proteína de
sofrer alterações em seu potencial redox e no estado de spin face a diferentes interfaces, faz-se
interessante investigar, utilizando-se de formas com mutações em sítios específicos, as
modificações estruturais e funcionais promovidas pela substituição de aminoácidos
potencialmente envolvidos na interação do citocromo c com membranas biológicas, no
processo apoptótico e na mudança para um estado de baixo spin alternativo.
Visando determinar se especificamente o resíduo de lisina 79, aminoácido potencialmente
envolvido no estado de baixo spin alternativo, afeta a estrutura e funções do citocromo c,
neste trabalho propusemos a obtenção de forma mutante de citocromo c com troca deste
resíduo por alanina seguido de análises estruturais e funcionais que possam caracterizar sua
importância no desenvolvimento do processo apoptótico induzido por citocromo.
31
2 OBJETIVO
Geral
Demonstrar o papel do resíduo de lisina 79 na estrutura e função de citocromo c visando
caracterizar sua influência no processo apoptótico.
2.1 Objetivos específicos:
2.1.1. Obter as proteínas citocromo c mutantes a partir da expressão de plasmídeos contendo
gene para citocromo c de coração de cavalo, com substituição dos aminoácidos de interesse
pela técnica de mutagênese sítio-dirigida.
2.1.2. Caracterizar a estrutura das proteínas mutantes visando determinar possíveis alterações
de ligantes do ferro hemínico, por espectroscopia no UV-vis, e alterações de enovelamento da
cadeia proteica ao redor do grupo heme, por espectroscopia de fluorescência.
2.1.3. Determinar as possíveis diferenças na estrutura secundária e no conteúdo de alfa-hélice
das proteínas citocromo c mutantes decorrentes da substituição dos aminoácidos em questão
por meio de técnica de dicroísmo circular no far-UV.
2.1.4. Determinar o comportamento e a temperatura média de desenovelamento das proteínas
mutantes frente a variações de temperatura utilizando técnica de dicroísmo circular.
2.1.5. Determinar possíveis diferenças na capacidade de óxido-redução das proteínas
citocromo c mutantes empregando aldeídos e peróxidos como agentes redutor e oxidante.
2.1.6. Determinar o potencial em induzir as proteinas citocromo c mutantes ao estado de baixo
spin alternativo pela interação de citocromo c com micelas aquosas de SDS visando
determinar o papel do resíduo de lisina 79 como potencial ligante alternativo do ferro
hemínico neste microambiente.
2.1.7. Avaliar a capacidade das formas mutantes do citocromo c na ativação de cadeia de
caspases em extrato citosólico.
32
3 MATERIAL E MÉTODO
Para o atendimento aos objetivos, foram empregados reagentes de qualidade analítica,
adquiridos da Sigma Aldrich, Merck e Synth. Os plasmídios utilizados para expressão das
formas mutantes de citocromo c testadas foram produzidos na Faculdade de Medicina e na
Faculdade de Ciências da Universidad de La Republica – UDELAR, em Montevidéu, Uruguai
por técnica de mutagênese sítio-dirigida em período anterior ao do desenvolvimento deste
projeto.
3.1 Preparo das soluções de citocromo c Fe3+
em tampão fosfato de sódio
A solução estoque de citocromo c Fe3+
foi preparada a partir da dissolução completa da
proteína adquirida comercialmente na forma liofilizada (Sigma) em tampão fosfato de sódio 5
mM pH 7,4. A concentração da solução estoque foi confirmada com a utilização de
espectroscopia no UV-vis utilizando espectrofotômetro fotodiodo Multispec 1501 (Shimadzu)
considerando coeficiente de extinção molar a 549 nm igual a 0,89 x 104 M
-1.cm
-1.
3.2 Preparo das soluções de SDS
Quantidades necessárias de SDS, Dodecil-sulfato de sódio (Sigma), para as concentrações
selecionadas, foram dissolvidas diretamente em solução tampão fosfato de sódio 5 mM pH
7,4 preparado com fosfato de sódio monobásico e dibásico e pH ajustado com NaOH e HCl.
3.3 Preparo das soluções de citocromo c Fe3+
em SDS
A partir da solução estoque de citocromo c Fe3+
dissolvido em tampão fosfato de sódio 5
mM pH 7,4 foram preparadas soluções de trabalho a 100 µM empregando como diluente as
soluções de SDS preparadas no mesmo tampão.
3.4 Preparo das soluções de DPAA (Diphenyl acetaldeydo)
Quantidades necessárias de DPAA em gramas, para as concentrações selecionadas, foram
dissolvidas diretamente em etanol e a solução foi armazenada em -20ºC.
3.5 Preparo das soluções de t-BuOOH (tert-butil hidroperóxido)
Quantidades necessárias de t-BuOOH em mililitros, para as concentrações selecionadas,
foram diluídas em H2O deionizada e a solução foi armazenada em eppendorf a -20ºC.
33
3.6 Obtenção das formas mutantes de citocromo c
Foram obtidas formas mutantes de citocromo c a partir de mutação sítio-dirigida realizada
sobre plasmídio PJRhrsN2 desenhado por Rumbley, Hoand e Englander e cedido pelo Prof.
Dr Rafael Radi, da Universidad de la Republica, em Montevidéu. A forma original do
plasmídio possui duas mutações pontuais nas histidinas 26 e 33, que foram substituídas por
asparagina. Tais substituições foram realizadas pelo fato destes resíduos de histidina agirem
como uma barreira cinética ao enovelamento proteico, participando do enovelamento
proteico em sua biogênese, atuando como ligante em substituição a metionina 80 em
determinada etapa deste processo. Sua substituição, portanto, permitiu um aumento no
rendimento da expressão de modo que sua expressão direta resulta no citocromo c
H26N/H33N denominado pseudo-wild-type (pwt). (RUMBLEY; HOAND; ENGLANDER,
2002; KAWAI et al. 2009).
Mutação adicional a esta foi inserida para substituição do resíduo de lisina na posição 79
por alanina, produzindo a forma H26N/H33N/K79A. O plasmídio desenhado por Rumbley,
Hoand e Englander, chamado PJRhrsN2 (figura 13) contém o gene para expressão de
citocromo c e o gene que codifica a heme-liase, promovendo a obtenção da proteína
funcional, apresentando grupo heme unido por ligação covalente à cadeia polipeptídica. O
plasmídio, o PJRhrsN2 possui também o gene para β-lactamase (Ampr) que confere
resistência à ampicilina, e que atua como forma de seleção de colônias transformadas.
Figura 13– Plasmídio PJRhrsN2
Fonte: RUMBLEY; HOAND; ENGLANDER (2002)
34
No intuito de produzir formas mutantes com substituição nos resíduo de aminoácido da
posição 79, e também nos resíduos de histidina 26 e 33 utilizando o plasmídio PJRhrsN2.
Para tanto, foi empregado kit Invitrogen e oligonucleotídeos :
AR- 5’- GAA GTA CAT TCC TGG TAC TGC GAT GAT TTT CGC TGG TAT TAA G -3’
AF 5’-CTT AAT ACC AGC GAA AAT CAT CGC AGT ACC AGG AAT GTA CTT C -3’
A partir desta etapa foi dada sequência aos procedimentos de isolamento plasmidial,
eletroforese (figura 14) e sequenciamento do DNA (figura 15).
Figura14 - Isolamento de DNA plasmídico realizado em a partir de 6 colônias selecionadas de LB Ágar com
Ampicilina obtido da primeira transformação pós-mutagênese seguido de eletroforese em gel de agarose
Figura 15 - Sequenciamento da Colônia 1 – As sequencias apresentam as mutações desejadas e não
apresentam substituições, deleções ou inserções quando comparadas à seqüência do plasmídeo wt.
Colônias 1,2,3,4,5 e 6
35
3.7 Eletroforese
Após obtenção das proteínas citocromo c mutantes, as amostras foram submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida (acrilamida e metil bisacrilamida) em presença de SDS.
O gel foi constituído de uma solução de acrilamida- bisacrilamida a 30% em H2O deionizada
e tampão tris- HCl pH 8,8 contendo SDS a 10%. Foi acrescentada uma solução de persulfato
de amônio a 1% e TEMED 0,04%. As amostras foram solubilizadas em tampão de amostra e
H2O e aquecidas a 95º por 5 minutos e então aplicadas no gel. Após corrida eletroforética por
2 horas a 80 V o gel foi corado utilizando solução de comassie blue 0,5%. O perfil
eletroforético dos citocromos c H26N/H33N (pwt) e H26N/H33N/K79A foram comparados
com o padrão de peso molecular na faixa de 12kDa de massa e citocromo c nativo 20µM.
A expressão das proteínas foi realizada por transformação em Escherichia coli BL21 Star e
pré-cultivo posterior em LB Ágar contendo ampicilina como agente de seleção.
O plasmídio PJRhrsN2 foi inserido em bactérias do tipo Escherichia coli BL21 Star por
choque térmico, que consiste em deixar o DNA plasmidial em banho de gelo por 30 minutos,
em seguida colocar em banho-maria a 42ºC por 30 segundos, retornar ao banho de gelo para
resfriar, adicionar o meio S.O.C. e incubar a 37ºC, sob agitação a 225 rpm por 1 hora. Em
seguida, plaquar 20 µl do contéudo em placas de LB Ágar contendo 1 mg/mL de ampicilina e
incubar a 37ºC até o dia seguinte. Observar se houve crescimento de colônias.
Para a expressão, em um tubo falcon contendo 25 ml de LB Broth + Ampicilina, foram
adicionadas colônias de Escherichia coli contendo os plasmídeos de interesse. Este tubo é
denominado pré-cultivo. Manteve-se a temperatura de 37°C até o dia seguinte, sob agitação
contínua a 220 rpm. Cada pré-cultivo foi transferido para erlenmeyers contendo 1 litro de
meio Terrific ao qual foi adicionado também 1,0 ml da solução de ampicilina a 100mg/ml
visando manter a seleção das cepas contendo o plasmídio de interesse. Na sequência, os
cultivos foram incubados a 37ºC, sob agitação a 220 rpm, por 7 horas (figura 16).
A expressão do citocromo c foi induzida adicionando-se 0,8 mM de IPTG ao meio após as
horas iniciais de incubação (7 horas). Em seguida, ocorreu a incubação em shaker, a 30°C,
200 rpm por 50 horas. Durante essa fase foram retiradas alíquotas para acompanhamento da
expressão da proteína, percebido pela coloração avermelhada característica do citocromo c.
36
Figura 16 - Meio terrific em shacker contendo cultivo de cepas de Escherichia coli transformadas com
plasmídio de interesse em período de indução por PTG.
Após incubação, as células foram precipitadas por centrifugação a 6000 g por 20 minutos e
4°C (figura 17). Desprezou-se o sobrenadante e as células foram ressuspensas com tampão de
lise (Tris HCl 50mM em pH 8,0) sendo 3 ml de tampão por grama de célula. Cristais de
DNAse assim como PMSF 1 mM, 30 mg de lisozima e 2% de Tween 20, foram
acrescentados ao material ressuspenso seguido de homogeneização.
Figura 17- Meio de cultura pós-centrifugação evidenciando pelet bacteriano
37
A lise celular foi realizada através de sonicação com aparelho sonicador Sonics, Vibra-
Cell, modelo VC50 (figura 18), em 5 ciclos de 10 segundos cada usando as regulagens Duty
Cycle 20% e Output control em nível 5, sempre em banho de gelo, sendo os restos celulares
removidos por centrifugação a 10000 g, a 4° C por 10 minutos.
Figura 18- Processo de sonicação para rompimento celular bacteriano e liberação de citocromo c
Ao volume obtido de sobrenadante foi adicionado sulfato de amônio na proporção de 351g
de sulfato de amônio por litro de sobrenadante. A solução foi mantida a 4°C sob agitação por
10 minutos com auxilio de agitador magnético. Procedeu-se à diálise do sobrenadante até o
dia seguinte utilizando 2 litros de tampão fosfato de potássio 10 mM, pH 7,5 e temperatura de
4°C, sob agitação, com troca de tampão após as primeiras 6 horas de diálise. A diálise foi
realizada com membrana Spectra/Por Membrane da Spectrum com poros de 3,500 kDa.
Para a oxidação do citocromo c, foi adicionado ferrocianeto de potássio 100 µM. A
purificação final foi realizada por cromatografia de troca iônica utilizando resina CM
Sepharose Fast Flow (figura 19), previamente equilibrada com tampão fosfato de potássio 25
mM e pH 7,5. O citocromo ficou retido na coluna enquanto as demais proteínas passaram
livremente. A eluição do citocromo foi realizada utilizando-se um gradiente de 40 a 250 mM
de NaCl, preparados no mesmo tampão de equilíbrio da coluna. Alíquotas de 3 a 5 ml cada
foram coletadas e analisadas em espectrofotômetro, sendo consideradas adequadas aquelas
com relação Abs410nm/Abs280nm superior a 3,2. Estas foram reunidas e submetidas ao processo
38
de dessalinização por novo ciclo de diálises em seguida foram concentradas amostras do
citocromo c em filtros Amicon.
O rendimento final do processo foi determinado utilizando-se medida de concentração por
espectrofotometria no UV-vis sendo o 410nm = 106,1 mM-1
.cm-1
.
Figura 19 –Coluna de troca iônica contendo resina CM Sepharose Fast Flow durante processo de purificação
do citocromo c e aliquotas recolhidas na eluição da coluna de troca.
3.8 Espectroscopia de absorção UV/vis na caracterização estrutural das formas
mutantes de citocromo c.
As análises espectroscópicas no UV-vis foram realizadas empregando o espectrofotômetro
fotodiodo Multispec 1501 (Shimadzu) e cubetas de cristal de quartzo de caminho ótico 0,1
cm. Todas as análises foram realizadas à temperatura ambiente e os dados coletados pelo
software Hyper-UV (Shimadzu) e analisados com auxílio do software Origin 6.0 (Microcal)
A caracterização espectroscópica no UV-vis das formas mutantes obtidas foram realizadas
em ambiente homogêneo constituído por tampão fosfato de sódio 5mM pH 7,4 e também em
ambiente heterogêneo constituído de micelas de SDS.
Na espectroscopia UV-vis na a região entre 350 e 490 nm nos é permitido avaliar as
formas mutantes de citocromo c quanto ao estado de spin do ferro hemínico em comparação
à forma nativa, e a preservação da identidade dos seus ligantes axiais e sua forma geométrica.
39
No estado nativo, o citocromo c apresenta o ferro hemínico Fe3+
com a presença dos dois
ligantes axiais, histidina 18 e metionina 80, revelando pico de absorção máxima (banda soret)
ao redor de 409 nm e uma banda de absorção em 695nm (banda de transferência de carga) que
permite o monitoramento da presença de ligação entre o ferro hemínico e a metionina 80.
Quando ocorre perda deste ligante, o ferro hemínico é convertido ao estado de alto-spin,
apresentando deslocamento da banda soret para o azul (desvio hipsocrômico) de cerca de 10
nm, chegando a 399 nm e desaparecimento da banda de transferência de carga. O estado
redox do ferro hemínico na forma nativa é determinado por análise das bandas Q que é
visualizada na região entre 500 e 600nm, e que apresenta-se dividida em situações onde o
ferro hemínico encontra-se reduzido (DICKERSON; TIMKOVICH, 1998).
3.9 Espectroscopia de dicroísmo circular CD no far-UV para análise de citocromo c
O dicroísmo circular (CD) é uma técnica que permite análise estrutural de proteínas na
região que traz informações sobre a estrutura secundária da proteína (190 a 260 nm, dita far-
UV) e também informações sobre estado do do grupo heme (de 350 a 700 nm).
Experimentos na região do far-UV permitem inferir diferenças no conteúdo de alfa-hélice
entre diferentes formas de uma mesma hemoproteína, além de avaliar diferenças na
temperatura média de desenovelamento proteico (unfolding) das formas mutantes de
citocromo c em comparação com a forma nativa comercial obtida de coração de cavalo
(RAMOS, 2005)
As análises por espectroscopia de dicroísmo circular foram realizadas empregando
espectropolarímetro JASCO-825 e cubeta de quartzo de caminho ótico de 0,1 cm. Foram
ajustados parâmetros para velocidade de escaneamento em 50 nm/min, modo contínuo, tempo
de resposta de 0,25 segundos, intervalo de leitura em 1,0 nm e total de 8 acumulações por
amostra. Para os experimentos envolvendo desenovelamento foi empregado sistema peltier de
controle de temperatura e medidas de Ɵ molar da amostra em 222nm a cada 2ºC de variação
de temperatura.
As leituras obtidas foram automaticamente transferidas pelo espectropolarímetro para o
software Spectra Viewer, sendo as leituras apresentadas em grau de elipticidade molar ([] em
mdeg.cm2.dmol
-1) e representam a medida da absorbância diferencial entre as duas rotações
de luz circularmente polarizada por uma molécula assimétrica (PAULA, 2013).
As leituras foram obtidas em [] em mdeg.cm2.dmol
-1 e convertidas utilizando-se a equação:
[Ɵ] = (mdeg)/ (C (molar). L (mm).
40
3.10 Análise estrutural das formas mutantes e nativa de citocromo c por espectroscopia
de fluorescência
A espectroscopia de fluorescência utilizada para análise estrutural de proteínas permite
avaliar o enovelamento da proteína de acordo com a proximidade do ferro hemínico com
aminoácidos aromáticos presentes na cadeia proteica do citocromo c. são eles os aminoácidos
triptofano e tirosina que emitem fluorescência no comprimento de onda 280 e 274
respectivamente.
A interação entre o ferro hemínico e esses aminoácidos é do tipo Foster, promovendo
transferência de energia levando a supressão da fluorescência pelos aminoácidos. O grau de
supressão está relacionado a proximidade do ferro hemínico e os aminoácidos aromáticos,
uma vez que ocorra afastamento ocorrera aumento de fluorescência.
As análises por espectroscopia de fluorescência foram realizadas empregando
espectrofluorímetro Hitachi F-2500 (Hitachi) e cubetas de cristal de quartzo de quatro faces
livres e caminho ótico 1,0 cm. Foram empregados comprimentos de onda de excitação em
282 nm (excitação do triptofano) e fendas (slits) de 5 nm.
3.11 Estudo da atividade catalítica do citocromo c
Com a utilização de peróxidos e aldeídos, atuando respectivamente como receptores e
doadores de elétrons, é possível estudar a atividade catalítica do citocromo c. Estes estudos
foram realizados com a utilização de aldeídos (DPAA) e peróxidos (t-BuOOH) através do
acompanhamento de cinéticas de óxido-redução por espectroscopia no UV-vis. Na figura 20
estão apresentadas as estruturas dos agentes redutores e oxidantes. Foram utilizadas
quantidades equimolares de citocromo c e DPAA nos testes de redução e concentrações dez
vezes superiores de t-BuOOH nos testes de oxidação.
Figura 20 - Estrutura do Difenilacetaldeido DPAA (agente redutor) e t –butyl hidroperóxido (agente oxidante)
41
As cinéticas foram realizadas isoladamente com DPAA ou com t-BuOOH. As medidas
foram realizadas com intervalo de leitura de 1 segundo, em cubetas de cristal de quartzo de
caminho óptico de 0,1 cm e acompanhamento visual de alterações em 409 nm, ponto de maior
absorção do citocromo c, e também alterações em 549 nm, ponto de indicação do estado
redox do íon ferro.
A adição do t-BuOOH ou do DPAA nas reações isoladas ocorreu aos 30 segundos de
reação e foram adicionados com auxílio de uma micro-seringa (volume 10 µl) e a própria foi
utilizada para homogeneizar a solução. As cinéticas isoladas foram acompanhadas por 3600
segundos (1 hora), sendo registrados os espectros no intervalo de 200 a 800 nm.
3.12 Análise da ativação de caspase-3 pelas formas mutantes de citocromo c
Visando verificar se as formas mutantes de citocromo c selecionadas para este tudo são
capazes de ativar caspase-3 da mesma maneira que a forma nativa da proteína foram
empregados neste experimento extrato citosólico obtido de células de músculo liso e kit
comercial EnzCheck Caspase-3 da Molecular Probes (USA) contendo o peptídeo
fluorogênico, Z-DEVD-AMC.
As células de músculo liso de aorta de coelho (MLAC) são células aderentes, que foram
mantidas em nitrogênio líquido em meio criopreservador composto por 10% de Dimetil
sulfóxido (DMSO) + 90% de albumina bovina até o momento de sua utilização.
Figura 21 – Células de aorta de coelho aderidas na garrafa de cultivo, em meio de cultivo DMEM suplementado
com albumina bovina. Vista em microscópio ótico invertido. Esquerda: 10X Direita: 40X
42
Para a primeira semeadura as células foram previamente descongeladas em banho-maria a
37º C sob leve agitação, transferidas para um tubo falcon estéril com 10 mL de DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) suplementado com soro fetal bovino e pool de
antibióticos (10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina por mL em 0,9% de
NaCl) e submetidas à centrifugação por 10 minutos a 10.000g O pellet obtido foi
ressuspendido com 1 mL de DMEM suplementado e transferido para uma garrafa de cultivo
contendo o mesmo meio. Esta foi mantida a 37º C em estufa para cultivo celular com
atmosfera em 5% de CO2.
A densidade celular foi observada a cada 24 horas em microscópio ótico. Atingida
confluência de 70% foi realizado repique, com descarte do meio presente e lavagens
sequenciais com meio CMF (8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 0,1 g de Na2SO4, 0,4 g de
Na2HPO4.12 H2O, 0,15 g de KH2PO4, 1,1 de glicose, 0,0025 g de phenol red e quantidade
suficiente de água deionizada estéril para completar 1000 ml. Meio filtrado em membrana de
0,22 micrômetros sob vácuo após ajuste do pH para 7,4 com NaOH e HCl). Após descarte de
todo CMF, foram adicionados 3 mL de solução de tripsina + EDTA e a garrafa mantida em
estufa por 2 minutos a 37º C, para favorecer o desprendimento das células ( figura 22).
Comprovado o desprendimento das células em microscópio ótico invertido, a tripsina foi
neutralizada por adição de 6 mL de DMEM suplementado. Todo o conteúdo foi transferido
para um tubo falcon estéril e centrifugado por 10 minutos a 10.000g. O sobrenadante foi
descartado e o pellet ressuspendido com 1 mL de DMEM suplementado. A contagem das
células totais foi realizada em câmara de Neubauer pela técnica de azul de tripan na proporção
de 10 µl da solução com as células para 90 µl do corante. Calculada a concentração de células
viáveis (não coradas pelo azul de tripan), volume suficiente para concentração de 1 x 106
células no novo cultivo foi transferido para garrafa contendo DMEM suplementado.
Utilizando microscópio ótico invertido a presença de células foi confirmada e a garrafa
retornou a estufa a 37º C e 5% de CO2 por três dias, sendo o crescimento observado a cada 24
horas.
43
Figura 22 – Células de músculo liso de aorta de coelho sob a ação da trispina. Vista em microscópio ótico
invertido utilizando aumento de 400X.
Como ambiente de reação fornecedor de pró-caspases, foi empregado extrato citosólico
obtido pela lise de células MLAC induzida por diferença de temperatura, segundo técnica
descrita por ABMAYR, (2006). As células cultivadas foram desprendidas por tripsina em
processo similar ao do repique e então centrifugadas com ressuspensão posterior do pellet em
1 ml de tampão isotônico (sacarose 250 mM, HEPES 10 mM, KCl 10 mM, MgCl2 1,5 mM,
EDTA 1mM, EGTA 1 mM e pH 6,3) e repetidas as centrifugações para que sobrassem
somente as células, ressupendendo por último na solução de lise oferecido pelo próprio kit (50
µL tampão 20X concentrado + 950µL de água deionizada). Após homogeneização suave a
solução foi deixada em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, promoveu-se um
processo de congelamento e descongelamento rápido visando o rompimento das células e
liberação do citosol. Para o congelamento o material foi colocado em freezer a -80ºC por 30
minutos e descongelado à temperatura ambiente, sendo o ciclo repetido por 3 vezes. Em
seguida o material foi centrifugado por 10 minutos a 10.000g sendo o sobrenadante reservado
em banho de gelo até o momento do uso.
A quantidade de proteínas presentes no extrato citosólico foi determinada pelo método de
Bradford, descrito a seguir.
A atividade de caspase foi medida através da reação enzimática utilizando como o kit
EnzCheck Caspase-3 da Molecular Probes (USA), que tem como componente sinalizador de
ativação de caspases o peptídeo fluorogênico, Z-DEVD-AMC.
Para o teste de ativação de caspases, a 25 μl do lisado, foram adicionadas a cada tubo de
teste quantidade suficiente das formas mutantes e nativa de citocromo c para concentração
final de 25 μM. Foram adicionados então a cada tubo dATP 1 mM, MgCl2 10 mM e substrato
44
fluorogênico 100 μM. Tubos adicionais de controle negativo foram montados na presença dos
mesmos elementos com adição de 20 µM de inibidor de caspase (Ac-DEVD-CHO).
Medidas de fluorescência de cada amostra, diluídas 20 vezes, foram realizadas 10 minutos
e após 24 horas do início da reação empregando Espectrofluorímetro Hitachi F2500 com os
seguintes ajustes: fendas de excitação e emissão em 10 nm, comprimento de onda de
excitação em 342 nm e de emissão no intervalo 360 – 500 nm. Foi empregada cubeta de
caminho ótico de 1 cm e manuseio das amostras realizado em ambiente com baixa incidência
de luz. O delta-fluorescência obtido para cada amostra foi normalizado para a quantidade de
proteína total presente no lisado celular.
3.13 Doseamento de proteínas pelo método de Bradford
O doseamento de proteínas pelo método de Bradford foi utilizado para determinar a
concentração de proteínas totais e citocromo c para a realização dos experimentos de
dicroísmo circular e ativação de caspase-3.
O princípio do método baseia-se na ligação do corante comassie blue G250 em proteínas.
Para a construção da curva padrão de proteínas preparou-se uma solução estoque de albumina
bovina na concentração de 1mg/ml sendo esta diluída a 0,01 mg/ml para soluções de trabalho.
Preparou-se o reagente de Bradford dissolvendo-se 100mg de comassie Blue G250 em 50
ml de etanol 95%. Adicionou-se 100ml de ácido fosfórico (H3PO4) 85% e completou-se o
volume com H2O destilada com quantidade suficiente para um litro.
A solução foi filtrada em filtro whatman numero 1 e armazenada em temperatura ambiente
ao abrigo da luz.
O quadro 1 traz o preparo das amostras para leitura e construção da curva padrão.
Quadro 1 - Amostras para leitura e construção da curva padrão
Branco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
BSA - 20 µL 40 µL 60 µL 80 µL 100 µL
H20 100 µL 80 µL 60 µL 40 µL 20 µL -
Reativo de Bradford 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
[Proteína] mg/ml - 20 40 60 80 100
45
As leituras foram realizadas em espectrofotômetro em 595nm utilizando cubeta de quartzo
de caminho óptico de 1 cm. Após leitura foi construída curva padrão com auxílio do software
Origin 6.0
46
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Todos os experimentos desenvolvidos neste trabalho utilizaram tanto a forma nativa de
citocromo c quanto a forma pseudo-wild-type (pwt – H26N/H33N) como comparativos às
análises com a forma (H26N/H33N/K79A), alvo principal de nosso estudo. Tal fato é
decorrente da necessidade de comparação com a forma selvagem da proteína, cujas
características são bem definidas sob vários aspectos na literatura atual, como com a forma
modificada decorrente da expressão do plasmídio original, isto é, a proteína com troca das
histidinas 26 e 33 por asparagina. Desta forma, torna-se possível evidenciar o papel
isoladamente do resíduo de lisina 79 na estrutura e funções do citocromo c bem como obter
quantidade suficiente para o trabalho, já que a forma pwt foi assim construída justamente para
aumentar o rendimento durante a expressão do citocromo c em bactérias.
A expressão das formas pwt (H26N/H33N) e triplo mutante (H26N/H33N/K79A) se deu
conforme protocolo descrito anteriormente, em metodologia, tendo-se realizado análises
espectroscópicas e eletroforéticas visando confirmar a identidade do produto obtido, possíveis
alterações estruturais e rendimento geral do processo. Os resultados obtidos nesta primeira
etapa estão descritos a seguir.
4.1 Eletroforese
O gel obtido após corrida eletroforética (figura 23), demonstrou rendimento satisfatório na
obtenção das formas mutantes de citocromo c. Nota-se a presença de bandas intensas no
citocromo c H26N/H33N (pwt) assim como no citocromo c H26N/H33N/K79A (apresentado
na figura 23 como TM) coincidindo com a banda do citocromo c nativo, este de origem
comercial (Sigma-Aldrich) e com padrão de peso molecular na região de 12 KDa. Em
experimentos realizados anteriormente (não mostrados aqui), quando da obtenção dos
primeiros produtos de expressão a partir dos plasmídios pwt e deste triplo mutante, foi
utilizada técnica de western-blotting empregando anticorpo anti-citocromo c como anticorpo
primário e os resultados demonstraram a correta identidade da proteína obtida.
47
Figura 23 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (30%) onde correram amostras de citocromo c nativo,
citocromo c pwt, citocromo c TM (forma triplo mutante H26N/H33N/K79A) e o padrão de peso molecular.
4.2 Características espectroscópicas das formas nativa e mutantes de citocromo c em
ambiente homogêneo
Confirmada a identidade da proteína pelo método eletroforético, procedeu-se à
caracterização estrutural das formas mutantes obtidas em comparação com a forma nativa
através de técnica de espectroscopia no UV-vis e dicroísmo circular.
Para a análise por espectroscopia no UV-vis, foram analisadas as três amostras (nativa, pwt
e triplo mutante) em tampão fosfato de sódio 5 mM, pH 7,4 o qual oferece um ambiente
homogêneo tradicional para o estudo de citocromo c. Foram realizadas leituras no intervalo de
250 a 750 nm utilizando concentração de 100 M para todas elas. A Figura 24 mostra o
espectro do citocromo c nativo Fe3+
e destas duas formas mutantes analisadas.
48
Figura 24 – Espectros em UV/vis de citocromo c nativo (linha preta), citocromo c pwt (linha azul) e citocromo
c H26N/H33N/K79A (linha vermelha), todos a 100 µM em tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4. Leituras em
cubeta de cristal de quartzo de l = 0,1 cm.
250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
500 550 600 650 700 750
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda nm
Os resultados demonstrados na figura 24 permitem observar que as formas mutantes não
exibem alterações espectroscópicas no Uv-vis que demonstrem mudanças na conformação do
grupo heme quando em tampão fosfato de sódio. Apresentam a banda soret com λmax em 409
nm para as três formas de citocromo c analisadas e a banda de transferência de carga em 695
nm permanece, indicando que também não ocorreram mudanças quanto ao sexto ligante do
ferro hemínico (MUGNOL, 2004). Em função de características específicas do processo de
purificação, ambas as formas mutantes apresentam um índice de formas reduzidas (forma
Fe2+
), superior à do citocromo c nativo observável na figura 24 pela divisão das bandas Q,
encontradas na região entre 500 e 600 nm.
O espectro de fluorescência do citocromo c é um recurso interessante para o estudo da
conformação desta proteína, uma vez que, tendo o citocromo c um único triptofano (Try 59) e
este estando ligado por um hidrogênio a um dos grupos propionato do grupo heme, quando de
sua excitação espera-se uma eficiente transferência da energia emitida para o anel porfirínico
da proteína, o que acarreta em supressão completa da fluorescência do triptofano na forma
nativa de citocromo c (FISHE; TANIUCHI; ANFINSEN, 1973). Como foi constatado e pode
ser observado na Figura 25, a forma nativa não apresenta de fato emissão de fluorescência
após excitação em 282 nm, faixa para excitação do triptofano, enquanto que ambas as formas
mutantes estudadas têm emissão de fluorescência. Tal fato representa o afastamento deste
49
resíduo de aminoácido do ferro hemínico, o que pressupõe um menor grau de enovelamento
da proteína.
Os resultados obtidos para os perfis de fluorescência dos mutantes confirmam que a
eficiência do quenching (supressão) é dependente da dinâmina da cadeia proteica ao redor do
grupo heme, podendo a intensidade da fluorescência variar em condições em que a estrutura
terciária esteja comprometida. Os estudos demonstram que a intensidade de fluorescência
emitida pelo triptofano diminui à medida que o processo de enovelamento do citocromo c
ocorre, fenômeno este acompanhado pela aproximação deste resíduo de aminoácido ao grupo
heme. Desta forma, a fluorescência é tão menor quanto mais próximo este aminoácido se
encontra do ferro hemínico (SCHLAMADINGER; KATIS, 2010)
Figura 25 – Espectros de fluorescência de citocromo c nativo 100 µM (linha preta), citocromo c pwt 100 µM
(linha azul) e citocromo c H26N/H33N/ K79A 100 µM (linha vermelha) em tampão fosfato de sódio 5,0 mM
pH 7,4. Cubeta de cristal de quartzo de l = 1,0 cm. Comprimentos de onda de excitação em 282 nm e fendas de
5,0 nm.
325 350 375 400 425 450 475 500
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Absorb
ância
Comprimento de onda em nm
Experimentos empregando a técnica de dicroísmo circular (CD) na região do far-UV
corroboram estas observações, uma vez que demonstram um menor grau de conteúdo de alfa-
hélice nas formas mutantes (Figura 26). As formas mutantes de citocromo c apresentam-se
menos enoveladas, característica atribuída à ausência dos resíduos de histina 26 e 33 em
ambos os mutantes, aminoácidos estes envolvidos no enovelamento durante a biogênese do
citocromo c. Sua troca por asparagina deu origem a proteínas com menor conteúdo de alfa
hélice. A partir do acompanhamento do valor do molar em 222 nm demonstra-se que a
forma H26N/H33N teve uma redução de 61% no conteúdo de alfa-hélice em relação ao
citocromo c nativo. A forma H26N/H33N/K79A, por sua vez, teve uma redução de apenas
30% no conteúdo de alfa-hélice, o que demonstra que apesar da redução do conteúdo de alfa-
50
hélice estar relacionado à substituição dos resíduos de histidina 26 e 33 por asparagina, a
substituição da lisina 79 por alanina também afeta diretamente o processo de enovelamento.
Figura 26- Conteúdo de alfa-hélice por CD no far-UV de citocromo c nativo
(linha preta), mutante H26N/H33N
(pwt) (linha azul) e mutante H26N/H33N/K79A (linha vermelha). Equipamento JASCO-825, cubeta de cristal de
quartzo de l = 0,1 cm, velocidade de scanner 50 nm/min e 8 acumulações. Todas as amostras a 0,1 mg/dl em
H2O.
190 200 210 220 230 240 250 260
-2x108
-1x108
0
1x108
2x108
[
] deg
.cm
2.d
mol
-1
Comprimento de onda (nm)
Os resultados obtidos por espectroscopia de fluorescência e por dicroísmo circular
revelam, portanto, que as modificações nos resíduos de aminoácidos histidina 26 e 33 já
afetam tanto a estrutura secundária quanto a terciária do citocromo c, diminuindo o conteúdo
de alfa-hélices e alterando a disposição da cadeia proteica ao redor do grupo heme.
Resultados complementares obtidos em experimentos de desenovelamento (unfolding)
térmico monitorado por dicroísmo circular revelaram que estas alterações também
modificaram a cinética e a temperatura média de desenovelamento de ambos os mutantes.
A figura 27 traz o perfil apresentado pelo citocromo c nativo cuja temperatura média de
desenovelamento © foi de 84,98 oC, sendo que o desenovelamento teve início aos 85
oC.
51
Figura 27 – Perfil de desenovelamento térmico da forma nativa de citocromo c. Acompanhamento em 222 nm
utilizando dicroísmo circular e controle de temperatura por sistema peltier. Equipamento JASCO-825, cubeta de
cristal de quartzo de l = 0,1 cm, velocidade de scanner 50 nm/min, amostras a 0,1 mg/dl (10 M) em H2O
20 30 40 50 60 70 80 90 100
-13000
-12000
-11000
-10000
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
Data: CITCNATIVORETESTE_B
Model: Boltzmann
Chi^2 = 97143.65852
R^2 = 0.98058
A1 -11885.56653 ±60.66227
A2 -5723.58853 ±207.39514
x0 84.98412 ±0.46675
dx 3.37549 ±0.38575Tm = 84.98
oC
Unfolding - citocromo c nativo 10M em لgua
[] (d
eg
.cm
2.d
mo
l-1)
Temperatura (graus Celsius)
Já as formas mutantes pwt (H26N/H33N) e triplo mutante (H26N/H33N/K79A)
apresentaram menores temperaturas médias de desenovelamento do que a forma nativa, sendo
de 80,75 oC para o pwt (Figura 28) e de 78
oC para o triplo mutante (Figura 29), além de um
perfil diferenciado, com início de desenovelamento já aos 60oC. Estes resultados fazem
sentido frente às alterações na estrutura secundária e terciária constatadas nos experimentos
apresentados anteriormente.
Figura 28 – Perfil de desenovelamento térmico da forma pwt de citocromo c. Acompanhamento em 222 nm
utilizando dicroísmo circular e controle de temperatura por sistema peltier. Equipamento JASCO-825, cubeta de
cristal de quartzo de l = 0,1 cm, velocidade de scanner 50 nm/min, amostras a 0,1 mg/dl (10 µM) em H2O
20 30 40 50 60 70 80 90 100
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
-4000
Data: CITCPWT_B
Model: Boltzmann
Chi^2 = 89765.61078
R^2 = 0.95893
A1 -8122.82079 ±69.39443
A2 -4090.48883 ±255.50168
x0 80.75017 ±1.22498
dx 6.01108 ±0.95284 Tm = 80,75oC
Unfolding - citocromo c PWT (H26N/H33N) 10M em لgua
[] (
de
g.c
m2.d
mo
l-1)
Temperatura (graus Celsius)
52
Figura 29 – Perfil de desenovelamento térmico da forma triplo mutante (H26N/H33N/K79A) de citocromo c.
Acompanhamento em 222 nm utilizando dicroísmo circular e controle de temperatura por sistema peltier.
Equipamento JASCO-825, cubeta de cristal de quartzo de l = 0,1 cm, velocidade de scanner 50 nm/min,
amostras a 0,1 mg/dl (10 µM) em H2O
20 30 40 50 60 70 80 90 100
-12000
-11000
-10000
-9000
-8000
-7000
-6000
Data: CITCK79A_B
Model: Boltzmann
Chi^2 = 105655.25117
R^2 = 0.96112
A1 -10997.55193 ±77.4487
A2 -6761.75802 ±223.33265
x0 78.00592 ±1.10286
dx 5.9505 ±0.91004
Tm = 78,00oC
Unfolding - citocromo c H26N/H33N/K79A 10M em لgua
[] (
deg.
cm2.d
mol
-1)
Temperatura (graus Celsius)
Experimentos realizados anteriormente pela orientadora deste projeto (ainda não
publicado) com formas de citocromo c obtidos de coração de atum (que naturalmente não
possui histidina 33 em sua estrutura) e modificadas quimicamente com DEPC
(dietilpirocarbonato), que tem capacidade de bloquear os resíduos de histidina, demonstraram
temperaturas médias de desenovelamento similares aos obtidos para as duas formas mutantes
trabalhadas aqui, ficando em 72,66 oC para o citocromo c de atum e em 69,34
oC para a
proteína nativa tratada com DEPC. Da mesma forma, o início do processo de
desenovelamento se deu próximo a 60 oC (Figura 30).
Figura 30 – Perfil de desenovelamento térmico citocromo c extraído de coração de atum (à esquerda) e tratado
com DEPC (à direita). Acompanhamento em 222 nm utilizando dicroísmo circular e controle de temperatura por
sistema peltier. Equipamento JASCO-825, cubeta de cristal de quartzo de l = 0,1 cm, velocidade de scanner 50
nm/min, amostras a 0,1 mg/dl (10 M) em H2O
20 30 40 50 60 70 80 90
-13000
-12000
-11000
-10000
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
Tm = 72,66oC
Unfolding - citocromo c de atum 10M em لgua
Data: CITOCROMOCATU_B
Model: Boltzmann
Chi^2 = 77176.54424
R^2 = 0.98871
A1 -12496.26715 ±59.72681
A2 -6205.52502 ±135.68359
x0 72.66216 ±0.31436
dx 2.73702 ±0.27015
[] (d
eg
.cm
2.d
mo
l-1)
Temperatura (graus Celsius)
20 30 40 50 60 70 80 90 100
-13000
-12000
-11000
-10000
-9000
-8000
-7000
-6000
-5000
Data: CITCMODIFICADOCOMDEP_B
Model: Boltzmann
Chi^2 = 76913.17309
R^2 = 0.98986
A1 -12004.33488 ±62.17484
A2 -6219.93551 ±85.22106
x0 69.34608 ±0.31752
dx 2.83589 ±0.27568
Tm = 69,34oC
Unfolding - citocromo c modificado com DEPC 1:15 10M em لgua
[] (d
eg
.cm
2.d
mo
l-1)
Temperatura (graus Celsius)
53
Ao se comparar, entretanto, os derivados dos perfis de desenovelamento das formas pwt
(sem histidinas nas posições 26 e 33) e triplo mutantes (sem histidinas nas posições 26 e 33 e
sem lisina na posição 79) com a forma nativa de citocromo c (de coração de cavalo, que
possui histidinas nas posições 26 e 33 e lisina na posição 79), com citocromo c de coração de
atum (que possui histina na posição 26 mas asparagina na posição 33 e lisina na posição 79) e
com a forma tratada com DEPC (com histidinas 26 e 33 bloqueadas quimicamente) notam-se
diferenças na velocidade com que o desenovelamento ocorre (Figura 31). Apesar de todas as
formas não-nativas terem início de desenovelamento ao redor de 60 oC, as formas mutantes
pwt e H26N/H33N/K79A têm um desenovelamento com perfil cinético diferente da forma
nativa e do citocromo c de atum e do nativo tratado com DEPC, mais gradual. Este fato
permite inferir que os resíduos de histidina 26 e 33 por si só afetam a temperatura média de
desenovelamento do citocromo c independentemente do resíduo de lisina 79 (temperatura
média é menor do que para a proteína nativa, que contém histidinas nessas posições),
eximindo este resíduo nesta posição da responsabilidade por tal fato. Vale ressaltar também
que se ambos os resíduos de histidina, 26 e 33, já estão ausentes desde a biogênese da
proteína, como ocorre nas formas que expressamos, o comportamento observado foi diferente
daqueles que têm ausência de apenas um deles (o resíduo 33 no citocromo c de atum, ausente
também desde a biogênese) ou que tiverem os resíduos bloqueados quimicamente após sua
estruturação completa (a forma tratada com DEPC). Isso reforça as teorias de que as histidinas
26 e 33 são essenciais para a forma como ocorre o enovelamento do citocromo c durante sua
biogênese e permite inferir que possivelmente o resíduo de histidina 26 seja, dentre os dois, o
que exerce maior influência. Já a lisina 79, alvo principal deste trabalho, teria influência na
estrutura secundária e terciária do citocromo c, como evidenciado pelos resultados
apresentados, porém sem sobrepujar os efeitos dos resíduos de histidina 26 e 33 no que
concerne à sensibilidade da proteína ao aumento da temperatura.
54
Figura 31 – Derivadas dos perfis de desenovelamento térmico da forma triplo mutante (H26N/H33N/K79A) de
citocromo c. Acompanhamento em 222 nm utilizando dicroísmo circular e controle de temperatura por sistema
peltier. Equipamento JASCO-825, cubeta de cristal de quartzo de l = 0,1 cm, velocidade de scanner 50 nm/min,
amostras a 0,1mg/dl (10 M) em H2O
4.3 Características dos espectros UV/vis de proteínas citocromo c mutantes em micelas
aquosas de SDS
Relatos anteriores referem que citocromo c Fe3+
na presença de interfaces aniônicas, como
a fornecida pelas micelas de SDS, sofre mudanças conformacionais no grupo heme tornando
sua simetria menos rômbica por alteração do sexto ligante do ferro porfirínico. Estas
alterações foram caracterizadas por diversas técnicas espectroscópicas por outros autores e a
forma de citocromo c nesta condição foi denominada baixo spin alternativo (ZUCCHI, 2003)
A Figura 32, mostra os espectros UV/vis de citocromo c Fe3+
em tampão fosfato de sódio
5,0 mM pH 7,4 e em micelas aquosas de SDS 7,0 mM , em condições similares às
apresentadas por Mugnol et al. (2004).
40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
0
100
200
300
400
500
600
U.A
.
Temperatura (graus Celsius)
nat
pwt
K79A
atum
modif
55
Figura 32 – Espectros em UV/vis de citocromo c nativo 100 µM em tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4
(linha preta) e citocromo c nativo 100 µM, em micela aquosa de SDS 7,0 mM em tampão fosfato de sódio 5,0
mM pH 7,4 (linha magenta). Cubetas de cristal de quartzo l = 0,1 cm.
O espectro obtido exibe um desvio hipsocrômico da banda soret, que passa de λmax de 409
nm para λmax de 407nm, o que corrobora as observações destes autores no que concerne à
forma baixo spin alternativo do citocromo c, o que por sua vez indica alteração na
conformação do grupo heme, sugestivo de alteração no sexto ligante do ferro hemínico e
consesequente modificação para menor o grau de rombicidade do grupo heme.
A banda espectroscópica observada em 695 nm, chamada (banda de transferência de
carga), indica a coordenação do sexto ligante com o ferro hemínico, no caso do citocromo c, a
metionina 80. A ausência desta banda, conforme se pode observar na figura 32 para a
condição em que o citocromo c está na presença de 7,0 mM de micelas de SDS, portanto, é
característica de alterações no sexto ligante de coordenação do ferro hemínico. Esta alteração
pode representar desde o afastamento da metionina 80 até a troca deste ligante por outro
resíduo de aminoácido de campo forte presente na cadeia proteica e acessível ao ferro. O
trabalho de Mugnol et al. (2004) refere a alta probabilidade de que nesta condição de baixo
spin alternativo este ligante seja a lisina 79.
Alterações na estrutura do citocromo c e possivelmente de seus estados de spin podem ser
eventos importantes para o desencadeamento do processo apoptótico induzido por esta
proteína, já que são propriedades que postulamos serem importante na interação do citocromo
c com a membrana mitocondrial interna e consequentemente envolvidos de alguma forma no
250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
500 550 600 650 700 750
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda nm
56
processo de desligamento, sua liberação para o citosol com consequente ativação da cadeia de
caspases e morte celular.
Visando assim associar as alterações estruturais observadas na forma triplo mutante
H26N/H33N/K79A com a hipótese de que este resíduo possa estar de alguma forma
envolvido no processo de apoptose e que esta associação possa ter relações com o fato da
lisina 79 poder ser o sexto ligante do ferro hemínico quando este se encontra na forma baixo
spin alternativo, análises espectroscópicas no UV/vis foram realizadas empregando os
mutantes H26N/H33N e H26N/H33N/K79A na presença de micelas de SDS (Figura 33).
Figura 33 – Espectros em UV/vis de citocromo c nativo 100 µM (linha preta), citocromo c pwt 100 µM (linha
azul) e citocromo c H26N/H33N/K79A 100 µM (linha vermelha) em micela aquosa de SDS 7,0 mM em tampão
fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4. Cubeta de cristal de quartzo de l = 0,1 cm.
300 400 500
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
500 600 700
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda nm
Mesmo mantidas as condições empregadas para o citocromo c nativo, as características
espectroscópicas apresentadas pelas duas formas mutantes diferem daquelas identificadas para
a forma baixo spin alternativo. É possível verificar que ocorre um desvio hipsocrômico da
banda soret de λmax em 409 nm para λmax em 407 nm na forma de citocromo c nativo, bem
como no mutante da lisina 79 (H26N/H33N/K79A). Entretanto, a forma mutante H26N/H33N
exibe um desvio maior, sendo que a banda soret passa a um λmax de 400 nm. As três formas,
nativa e mutantes, não apresentam a banda de transferência de carga em 695 nm, o que indica
mudanças no ligante.
O que se esperava encontrar é que a forma H26N/H33N apresentasse características
espectroscópicas condizentes com a forma baixo spin alternativo induzido por micelas de
57
SDS a 7,0 mM, uma vez que a hipótese formulada é de que nesta condição a sexta posição de
coordenação seja ocupada pela lisina 79. Como este resíduo de aminoácido se encontra
presente neste mutante, nenhuma alteração significativa deveria ter sido encontrada em
comparação com a forma nativa do citocromo c. Por sua vez, esperava-se que o mutante com
substituição adicional no resíduo de lisina 79 (H26N/H33N/K79A), quando em presença de
micelas de SDS, não demonstrasse as características espectroscópicas do baixo spin
alternativo, justamente pela ausência do ligante alvo do estudo.
O que se obteve, entretanto, e que é possível observar na Figura 33, é que nenhuma das
formas mutantes apresentou as características espectroscópicas no UV-vis condizentes com o
estado de baixo spin alternativo. Apesar da forma H26N/H33N/K79A ter demonstrado desvio
da banda Soret condizente, as demais características, como discreto desvio da banda N, não
foram respeitados. Houve, da mesma forma que para o pwt, perda desta banda N, o que é
característico da forma pentacoordenada, onde o ferro hemínico tem a sexta posição de
coordenação ocupada por água (MUGNOL, 2004).
Postula-se aqui que tal resultado deve ser decorrente do papel primordial dos resíduos de
histidina 26 e 33 no enovelamento proteico durante o processo de biogênese da proteína. O
enovelamento do citocromo c é caracterizado por várias etapas intermediárias, das quais uma
importante envolve as histidinas 26 e 33. Em pH neutro, um intermediário surge tendo a
histidina 26 ou a histidina 33 como ligante axial na sexta posição de coordenação do ferro
hemínico, em substituição à metionina 80 (DE SANCTIS et al. 2004). Esta condição é,
inclusive, referida como sendo uma barreira cinética para o enovelamento do citocromo c,
motivo, inclusive, pelo qual os mutantes com os quais trabalhamos têm estas histidinas
substituídas. Em pH ácido, estando portanto estas histidinas protonadas, o enovelamento do
citocromo c ocorre muito mais rapidamente (YEH; ROUSSEAU, 1998). Estando, porém,
presentes nas formas nativas do citocromo c é de se supor que este papel regulador exerça
atividade efetiva na forma como o enovelamento ocorre, o que explica que na ausência desta
regulação, alterações na estrutura secundária final tendem ocorrer, como comprovamos pela
determinação do conteúdo de alfa-hélice (Figura 26) e espectro de fluorescência (Figura 25).
Por sua vez, estas alterações na estrutura devem comprometer a interação do citocromo c com
interfaces negativas como a oferecida pelas micelas de SDS o que inviabiliza a conversão
para a forma baixo spin alternativo com consequente simetria menos rômbica do grupo heme.
Para a elucidação deste impasse, o que se pretende fazer no futuro para complementar o
estudo e comprovar ou descartar definitivamente a hipótese da lisina 79 como ligante do ferro
hemínico na condição de baixo spin alternativo é produzir formas mutantes com substituição
58
exclusivamente neste resíduo de aminoácido e então realizar experimentos por EPR e MCD,
de formas reduzidas e oxidadas na presença e ausência de micelas de SDS, para comprovar a
hipótese.
4.4 Atividade catalítica de formas nativa e mutantes de citocromo c frente a peróxidos e
aldeídos
Visando determinar se a ausência do resíduo de lisina 79 compromete o potencial
apoptogênico da forma triplo mutante de citocromo c e assim definir se este resíduo tem de
fato um papel definido na ativação da cadeia de caspases, torna-se importante avaliar uma das
propriedades mais bem conhecidas desta proteína, que é a de transportadora de elétrons.
Torna-se assim importante verificar se nas formas mutantes testadas permanece a capacidade
do citocromo c em receber e doar elétrons, o que foi feito mediante interação das formas
mutantes com peróxido (tert-butyl hidroperóxido – t-BuOOH) e aldeído (difenilacetaldeído –
DPAA) em comparação com resultados obtidos para a forma nativa.
A Figura 34 traz o espectro obtido do citocromo c nativo em diferentes momentos após
adição de DPAA, um agente redutor que viabiliza o estudo do potencial do citocromo c como
agente aceptor de elétrons. Percebe-se na figura um desvio batocrômico da banda soret com
desvio da banda soret para 413 (seta verde), visível aumento de intensidade com divisão das
banda Q (seta azul) em 549nm, característico da redução do ferro hemínico, e aparecimento
de ponto isosbéstico indicativo de reação com formação de produtos (seta vermelha)
Figura 34 – Espectros no UV/vis de redução do ferro hemínico do citocromo c nativo em presença de DPAA.
As condições experimentais foram: citocromo c nativo 100 µM em tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4 com
adição de 100 µM de DPAA e leituras em função do tempo. Cubeta de cristal de quartzo de l = 0,1 cm.
300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero seg
Tempo 120 seg
Tempo 360 seg
Tempo 100 seg
Tempo 2000 seg
Tempo 3600 seg
600 700
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
59
Mudanças espectrais semelhantes foram obtidas em experimentos realizados nas mesmas
condições utilizando desta vez o citocromo c com mutações nas histidinas 26 e 33 (pwt),
conforme mostrado na Figura 35.
Figura 35 – Espectros no Uv/visde redução do ferro hemínico do citocromo c H26N/H33N (pwt) a 100 µM em
tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4 após adição de DPAA 100 µM. Tempo zero representa espectro sem
DPAA e os demais o tempo decorrente após adição deste. Cubeta de cristal de quartzo de caminho ótico 0,1 cm.
A Figura 36, por sua vez, exibe o espectro do citocromo c mutante H26N/H33N/K79A em
reação com DPAA. É possível observar que houve redução do ferro hemínico a Fe2+
, nota-se
um deslocamento da banda soret que passa a apresentar um λmax em 413 nm, a banda Q em
549 nm apresenta divisão indicativa de redução do ferro hemínico, porém, não na mesma
intensidade quando comparada as formas nativa e mutante H26N/H33N (pwt). Isso pode ser
explicado pelas alterações estruturais inerentes a cada forma mutante em função das
substituições de aminoácidos a que foi submetido. Esse fato pode levar à dedução de que a
ausência do resíduo de lisina 79 afeta, portanto, de alguma forma o potencial do citocromo c
como aceptor de elétrons na cadeia respiratória.
300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
500 600 700
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero seg
Tempo 120 seg
Tempo 360 seg
Tempo 1000seg
Tempo 2000 seg
Tempo 3600 seg
60
Figura 36 – Espectros no Uv/vis de redução do ferro hemínico do citocromo c H26N/H33N/K79A a 100µM em
tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4 após adição de DPAA 100 µM. Tempo zero representa espectro sem
DPAA e os demais o tempo decorrente após adição deste. Cubeta de cristal de quartzo de caminho ótico 0,1 cm.
Os mesmos experimentos foram realizados para as três formas de citocromo c em presença
de micelas aquosas de SDS. Os resultados revelam que neste microambiente, o DPAA não
tem ação redutora sobre o ferro hemínico (Figura não mostrada), provavelmente em função da
pouca acessibilidade do aldeído ao core do heme pela interação da proteína com o sistema
micelar.
As reações do citocromo c nativo com peróxidos, agentes que possibilitam o estudo do
potencial desta proteína como doadora de elétrons, levam à oxidação do ferro hemínico, ao
aparecimento de radicais alquil e a alquilação do anel porfirínico leva a queda na intensidade
da banda soret, fenômeno observado na figura 37, onde comprova-se que a adição de
peróxido t-BuOOH promoveu a oxidação do ferro hemínico do citocromo c. É possível
observar a partir da banda presente na região das bandas Q que ao tempo zero da reação (linha
preta) o citocromo c nativo apresenta uma pequena população na forma reduzida. No entanto,
aos 3600 segundos após adição do peróxido, esta banda, em 549 nm, agora se apresenta com
uma única banda, que caracteriza a oxidação do ferro hemínico desta população anteriormente
reduzida. Isso é mais um indicativo, além da queda na intensidade da banda soret, de que o
ferro hemínico foi oxidado, agiu como doador de elétrons.
300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
500 600 700
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero seg
Tempo 120 seg
Tempo 360 seg
Tempo 1000 seg
Tempo 2000 seg
Tempo 3600 seg
61
Figura 37 – Espectros no UV/vis de oxidação do ferro hemínico do citocromo c nativo em presença de t-
BuOOH. As condições experimentais foram: citocromo c nativo 100 µM em tampão fosfato de sódio 5,0 mM
pH 7,4. T-BuOOH na concentração de 1 mM. Cubeta de cristal de quartzo de l = 0,1 cm.
300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
600 700
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
A
bsor
bânc
ia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero
Tempo 120 seg
Tempo 360 seg
Tempo 1000 seg
Tempo 2000 seg
Tempo 3600 seg
Cit c Nativo
Tampمo fosfato de sَ dio
Resultados semelhantes foram observados para as reações das formas mutantes
H26N/H33N (pwt) e H26N/H33N/K79A (Figuras 38 e 39, respectivamente) com o t-BuOOH,
mostrando que a ausência do resíduo de lisina 79 não afetou o potencial do citocromo c como
doador de elétrons, diferente do que foi observado na reação com DPAA. Tanto com peróxido
quanto com aldeído observou-se na análise dos resultados da forma pwt que a ausência dos
resíduos de histidina 26 e 33 não promoveram efeitos deletérios na capacidade óxido-redutora
do citocromo c.
Figura 38- Espectros no Uv/vis de oxidação do ferro hemínico do citocromo c H26N/H33N (pwt) a 100 µM em
tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4 após adição de t-BuOOH 1,0 mM. Tempo zero representa espectro sem
t-BuOOH e os demais o tempo decorrente após adição deste. Cubeta de cristal de quartzo de 1 = 0,1 cm
300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
500 600 700
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Cit c pwt
Tampão fosfato de sódio
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero seg
Tempo 120 seg
Tempo 360 seg
Tempo 1000 seg
Tempo 2000 seg
Tempo 3000 seg
62
Figura 39 - Espectros no Uv/vis de reoxidação do ferro hemínico do citocromo c H26N/H33N/K79A a 100 µM
em tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4 após adição de t-BuOOH 1,0 mM. Tempo zero representa espectro
sem t-BuOOH e os demais o tempo decorrente após adição deste. Cubeta de cristal de quartzo 1= 0,1 cm
Apesar dos resultados obtidos isoladamente com DPAA e t-BuOOH, foram realizados
experimentos para validar a capacidade das formas mutantes de doarem e receberem elétrons
em um mesmo ciclo de reações, propriedade já conhecida para o citocromo c nativo. A figura
40 apresenta o espectro do ciclo catalítico do citocromo c nativo mediante adição de DPAA
aos 30 segundos de monitoramento seguido de adição de t-BuOOH aos 300 segundos.
Observa-se que o citocromo c aos 310 segundos de monitoramento (linha vermelha),
apresenta-se na forma reduzida induzida pelo DPAA, com divisão da banda Q em 549 nm.
Aos 400 segundos (linha magenta), portanto já com o peróxido, o citocromo c apresenta uma
pequena população que permanece na forma reduzida, porém ao final do ciclo aos 2000
segundos, o que se observa é a total reoxidação do ferro hemínico do citocromo c,
confirmando sua capacidade não somente em doar como também receber elétrons em uma
reação simultânea com aldeídos e peróxidos. Pequena queda na intensidade da banda soret
ocorre durante o processo.
63
Figura 40 – Espectros UV-vis do ciclo catalítico de redução e oxidação do ferro hemínico do citocromo c nativo
em presença de DPAA e t-BuOOH. As condições experimentais foram: citocromo c nativo 100 µM em tampão
fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4. Adição de 100 µM de DPAA com adição de 1,0 mM de t-BuOOH. Cubeta de
cristal de quartzo de l = 0,1 cm.
Ao submeter o citocromo c mutante H26N/H33N (pwt) a experimentos utilizando aldeídos
e peróxidos, o mesmo apresentou características semelhantes aos resultados apresentados para
a forma nativa no que diz respeito à capacidade de receber e doar elétrons, como mostra a
figura 41, porém observa-se que aos 310 segundos, apenas 10 segundos após a adição do
peróxido, o citocromo c com mutação nas histidinas 26 e 33 apresentou características de
citocromo c Fe3+,
o que indica que a reação ocorreu em um período de tempo menor do que o
tempo de reação apresentado pela forma nativa do citocromo c, possivelmente em função da
maior exposição do ferro hemínico devido às alterações estruturais constatadas nos
experimentos anteriores.
300 400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
500 600 700
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Cit c nativo
Tampão fosfato de sódio
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero seg
Tempo 50 seg
Tempo 310 seg
Tempo 400 seg
Tempo 500 seg
Tempo 2000 seg
64
Figura 41 – Espectros no UV-vis de redução por DPAA seguida de reoxidação por t-BuOOH para ferro
hemínico do citocromo c H26N/H33N (pwt) a 100 µM em tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4. Adição de
DPPA 100 µM após 30 segundos de monitoramento seguida de adição de t-BuOOH 1,0 mM aos 300 segundos.
Tempo zero representa espectro sem DPAA e os demais o tempo decorrente após adição de cada reagente.
Cubeta de cristal de quartzo de caminho ótico 1=0,1 cm.
A Figura 41, por sua vez, exibe o espectro do citocromo c H26N/H33N/K79A, onde se
pode constatar que ocorreu redução do ferro hemínico após adição do DPAA. Porém,
diferentemente das formas nativa e H26N/H33N, 2000 segundos após adição do t-BuOOH, o
citocromo c H26N/H33N/K79A não foi reoxidado. Tal evento pode ser decorrente das
alterações estruturais observadas que podem vir a favorecer a coordenação do DPAA com o
ferro hemínico, tornando-o menos acessível à ação do peróxido e à consequente reoxidação,
fato decorrente de alterações estruturais devidas aos aminoácidos substituídos, mais
especificamente da retirada da lisina 79.
300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
500 600 700
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Cit c pwt
Tampão fosfato de sódio
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero seg
Tempo 50 seg
Tempo 310 seg
Tempo 400 seg
Tempo 500 seg
Tempo 2000 seg
65
Figura 42 – Espectros no UV-vis de redução por DPAA seguida de reoxidação por t-BuOOH para ferro
hemínico do citocromo c H26N/H33N/K79A ambos a 100 µM em tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4.
Adição de DPPA 100 µM após 30 segundos de monitoramento seguida de adição de t-BuOOH 1,0 mM aos 300
segundos. Tempo zero representa espectro sem DPAA e os demais o tempo decorrente após adição de cada
reagente. Cubeta de cristal de quartzo de caminho ótico 1= 0,1 cm.
4.5 Ativação de cadeia de caspases pelas formas mutantes e nativa de citocromo c
A capacidade apoptótica do citocromo c já é bem descrita na literatura, havendo vários
trabalhos que tratam do potencial de formas modificadas de citocromo c em induzir este
processo (YU et al. 2001; OLTEANU et al. 2003). Como testes in vivo e diretamente em
células em cultura requerem metodologias e protocolos de maior complexidade e que
envolvem aspectos éticos para sua manipulação, a utilização de testes em sistemas-livre de
células, como o constituído por extrato citosólico empregando métodos fluorimétricos para
detecção de ativação de cadeia de caspases, é uma alternativa eficaz para avaliar o potencial
apoptogênico do citocromo c (PRIETO, 2009).
Conforme descrito anteriormente em metodologias, foi obtido extrato citosólico de células
de músculo liso de aorta de coelho seguido de dosagem de proteínas totais pelo método de
Bradford visando validar o processo de obtenção do substrato de reação. Foi então realizado
teste de ativação de caspase-3 colocando em contato com o extrato as duas formas mutantes e
a forma nativa de citocromo c.
300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
500 600 700
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
Tempo zero seg
Tempo 50 seg
Tempo 310 seg
Tempo 400 seg
Tempo 500 seg
Tempo 2000 seg
Cit c K79A
Tampão fosfato de sódio
66
Figura 43 – Teste de ativação de caspase-3 em extrato citosólico de células de músculo liso de aorta de coelho.
(A) extrato com citocromo c nativo, (B) com citocromo c pwt e (C) com citocromo c triplo mutante
H26N/H33N/K79A. Leituras em espectrofluorímetro com excitação em 342 nm e leituras em cubeta de cristal de
quartzo de l = 1,0 cm, em tempo zero (basal) e depois de 16 e 40 horas de reação.
Os resultados obtidos e mostrados na figura 43 demonstram que todas as formas de
citocromo c promoveram ativação de caspase-3, como o que foi descrito anteriormente por
Kluck e colaboradores (KLUCK, 1997). Nesse trabalho Kluck comprovou a ativação de
caspase-3 pela combinação de fração citosólica e citocromo c purificado de diferentes
espécies.
A ativação de caspase-3 nestes experimento é possível de ser visualizada dado a
diminuição progressiva da banda em 395 nm, característica da forma Z-DEVC-AMC
(peptídico fluorogênico) quanto excitada em 342 nm, e aumento progressivo da banda em 442
nm, que representa a forma AMC livre proveniente da clivagem da ligação peptídica do
380 400 420 440 460 480 500
0
50
100
150
200
250
Basal
Depois 16 hs
Depois 40 hs
U.F
.
Comprimento de onda (nm)
A
380 400 420 440 460 480 500
0
50
100
150
200
250
Basal
Depois 16 hs
Depois 40 hs
U.F
.Comprimento de onda (nm)
B
380 400 420 440 460 480 500
0
50
100
150
200
250
Basal
Depois 16 hs
Depois 40 hs
U.F
.
Comprimento de onda (nm)
C
67
peptídeo fluorogênico. Assim, havendo ativação de caspase-3 o peptídeo é clivado, a fração
AMC é liberada e esta emite fluorescência em 442 nm.
Pode-se observar, entretanto, que mesmo que todas as formas tenham ativado caspase-3 os
níveis de ativação após 40 horas foram diferentes, menores para a forma triplo mutante do que
para as formas nativa e pwt, indicando que a ausência das histidinas 26 e 33 não interferiram
no processo, mas que a ausência de lisina 79 afetou sim a ativação de caspase, esta mutação
levou a alterações na estrutura da proteína, que possivelmente alterou a interação da proteína
com a APAF-1 e (Figura 44).
Figura 44 – Teste de ativação de caspase-3 em extrato citosólico de células de músculo liso de aorta de coelho.
Leituras após 40 horas de incubação de extrato com citocromo c nativo (linha vermelha), com citocromo c pwt
(linha verde) e com citocromo c triplo mutante H26N/H33N/K79A (linha azul). Leituras em espectrofluorímetro
com excitação em 342 nm e leituras em cubeta de cristal de quartzo de l = 1,0 cm.No inserto, níveis de
fluorescência em 442 nm nos tempo basal, 16 e 40 horas.
Visando quantificar essa diferença na ativação de caspase, procedeu-se à construção de
curva padrão utilizando AMC livre em concentrações crescentes e nas mesmas condições de
comprimento de onda de excitação (342 nm), fenda (10 nm) e caminho ótico de cubeta de
cristal de quartzo (Figura 45).
68
Figura 45 – Curva padrão de AMC livre. Espectros de fluorescência de solução tampão fosfato de sódio 5 mM
pH 7,4 usado como diluente do AMC (linha preta), AMC 20 µM (linha vermelha), 40 µM (linha verde), 60 µM
(linha azul), 80 µM (linha azul claro) e 100 µM (linha magenta). No inserto, curva padrão em 342 nm.
380 400 420 440 460 480 500
0
100
200
300
400
500
600
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
0
100
200
300
400
500
600
Linear Regression for CPAMCdil20X_B:
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 11,147 12,43182
B 4,88345 0,2053
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99648 17,17702 6 <0.0001
------------------------------------------------------------
U.F
.
AMC concentration (M)
Buffer kit
AMC 20M
AMC 40M
AMC 60M
AMC 80M
AMC 100M
U.F
.
Comprimento de onda (nm)
A partir da curva padrão (figura 45) foram calculadas as concentrações de AMC livre em
cada uma das condições de tempo e agentes de ativação de caspase-3 (as três formas de
citocromo c). A figura 46 traz os resultados obtidos em concentração de AMC por M para
cada citocromo em cada um dos tempos testados.
Figura 46 – Concentração de AMC livre gerado após 16 e 40 horas de reação para cada uma das formas de
citocromo c (nativo, pwt e triplo mutante).
Os resultados obtidos permitem inferir que o resíduo de lisina 79 tem influência sobre o
processo de ativação de caspase-3, evento intermediário da morte celular por apoptose. Na
troca deste resíduo por alanina ocorreu diminuição da capacidade de ativação de caspase-3
pela forma modificado de citocromo, de forma qualitativa e quantitativa, conforme
demonstrado nas figuras 43 e 44. Para a forma pwt, tem-se que a troca exclusivamente dos
69
resíduos de histidina 26 e 33 quantitativamente afetam a velocidade para ativação de caspase,
demonstrado na figura 46. Após 16 horas a concentração de AMC livre é menor do que na
presença de citocromo c nativo, o que pode ser explicado pelas alterações estruturais do
citocromo pwt. Após 40 horas, entretanto, os valores praticamente se sobrepõem, não há
diferença significativa. Já para a forma triplo mutante, com troca adicional do resíduo de
lisina 79, mesmo após 40 horas os níveis de ativação de caspase-3 são significativamente
menores do que para a forma nativa, indicando que este aminoácido especificamente tem sim
influência no processo.
Experimentos adicionais, que fizeram parte de projeto de pesquisa da orientadora deste
trabalho e que virão a ser desenvolvidos em continuidade a este trabalho nesta e sobre outras
condições, corroboram estas observações. Utilizando-se de técnica de microinjeção, células de
músculo liso de aorta de coelho foram microinjetadas com as três formas de citocromo c,
sendo que tanto a forma nativa quanto a pwt (H26N/H33N) apresentaram um índice de
apoptose entre 85 e 90%. Já as células microinjetadas com o triplo mutante
H26N/H33N/K79A apresentaram um índice de apoptose inferior a 15%, similar ao obtido
para células que foram microinjetadas com tampão fosfato de sódio 5,0 mM pH 7,4,
selecionado como controle positivo da microinjeção e negativo da apoptose.
Resultados similares foram obtidos por Sharonov e colaboradores em estudos realizados
com formas mutantes de citocromo c K72W, K72A e K72E (SHARONOV et al.. 2005).
Neste estudo os autores referem que estas formas mutantes perderam a capacidade de induzir
a morte celular, fato que foi atribuído por sua menor afinidade à APAF-1 em decorrência da
ausência de lisina na posição 72, formando com a APAF-1 um complexo inativo incapaz de
iniciar o processo apoptótico. Esta mutação, entretanto, segundo os autores, não comprometeu
a atividade da proteína como carreador de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial. Nossos
resultados, com provável mesma interpretação quanto à influência da lisina 79 no processo
apoptótico, demonstram, ao contrário, que a forma com troca da lisina 79 por alanina tem
menor capacidade como aceptora de elétrons (menor redução com DPAA do que as formas
nativa e pwt) e não consegue ser reoxidada por peróxido após redução com DPAA (também
diferentemente das formas nativa e pwt). Isso permite inferir que a lisina 79 afeta outras
propriedades do citocromo c que não somente a apoptogênica.
70
5 CONCLUSÃO
Face aos resultados obtidos e aqui apresentados, pode-se concluir que as formas mutantes
H26N/H33N (pwt) e H26N/H33N/K79A apresentam alterações estruturais representadas pela
redução no conteúdo de alfa-hélice, maior na forma pwt, e mudanças na temperatura média e
na cinética de desenovelamento. Tais alterações estruturais podem ser atribuídas aos efeitos
decorrentes da ausência das histidinas 26 e 33, importantes no processo de biogênese e na
capacidade do citocromo c de interagir com interfaces negativas. Tais evidências podem
justificar que, diferentemente da forma nativa de citocromo c, as formas pwt e triplo mutante
não são capazes de assumir a forma baixo spin alternativo em presença de micelas de SDS.
Tal fato, entretanto, não afetou o potencial apoptogênico da forma pwt que, similar à forma
nativa, ativou caspase-3 de forma igualmente eficiente e também não interferiu na
propriedade óxido-redutora da proteína, que teve igual desempenho como aceptor e doador de
elétrons nos testes de atividade catalítica utilizando aldeídos e peróxidos.
Estas conclusões para a forma pwt permitiram responder aos objetivos traçados para este
trabalho, que envolvem especificamente o resíduo de lisina na posição 79 da cadeia proteica
do citocromo c. Como a forma mutante obtida neste resíduo é também modificada nos
resíduos de histidina 26 e 33, como o pwt, as diferenças estruturais, de reatividade e de
potencial apoptogênico mensurado por capacidade de ativação de caspase-3 entre a forma
triplo mutante e o pwt e destes com o citocromo c nativo permitiram atribuir importância de
fato e isoladamente à lisina 79.
Como a forma mutante que não possui lisina nesta posição promove menor ativação de
caspase-3 in vitro, não ativa apoptose em células em cultura e possui menor potencial como
aceptor de elétrons e incapacidade de reoxidação, propriedades não observadas para a forma
pwt, conclui-se que o resíduo de lisina 79 tem papel diferenciado no processo apoptótico.
71
REFERÊNCIAS
ABMAYR, S. M. Y; TINGTING. P. T; WORKMAN, J. L. Preparation of Nuclear and
Cytoplasmic Extracts from Mammalian Cells. Current Protocols in Molecular Biology, n
12, August. 2006. Disponível em:http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-
mb1201.html. Acesso em novembro de 2012.
ALMARAZ, C.C; PINILLA, P.J.G; POZO, M.J; CAMELLO, P.J. Mitochondrial reactive
oxygen species na Ca2+ signaling. American Journal of Physiology, v. 291, p. 1082-1086,
November. 2.006
AWSCHALOM, D.D; FLATTÉ, M.E; SAMARTH, N. Spintronica. Scientific American
Brasil, São Paulo, n. 2, p.41-47, julho. 2002.
BRAJUSKOVIC, G.R. Apoptosis in malignant diseases. Archive of oncology, Sérvia v.13,
n.1, p.19-23, April. 2005.
BRANDÃO, M.S.B. Substâncias tensoativas- os fenômenos de autoconstrução e auto
organização de substâncias tensoativas e sua importância na agricultura e em biotecnologia.
1997. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, n.5, p. 30-34. Disponível em
http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio08/substâncias.pdf.acesso em agosto de 2011.
CURTIN, J.A.; FRIDLYAND, J.; KAGESHITA, T.; PATEL, H.N.; BUSAM, K.J.;
KUTZNER, H.; CHO, K.H.; AIBA, S.; BRÖCKER, E.B.; LEBOIT , P.E.; PINKEL, D.;
BASTIAN, B.C. Distinct Sets of Genetic Alterations in Melanoma. New England Journal of
Medicine, Waltham, v.353, p. 2135-2147. 2005.
DEVASAGAYAM, T.P.A; BOLLOR, K.K; RAMASARMA, T. Methods for estimating
peroxidation: an analysis of merits and demerits. Journal of Biochemistry & Biophysics. v.
40. n.52, p. 300-308, October. 2003.
DEVLIN, T.M. Manual de bioquímica com correlações clínicas. 6. ed. São Paulo: Edgard
Blucher, 2007. p. 437- 446.
DESAGHER, S; MARTINOU, J. C. Mitochondria as the central control point of apoptosis.
Trends in Cell Biology, v.10, p.369-377, September. 2000
DICKERSON, R. E.; TIMKOVICH, R. Cytochrome c. The enzymes, Boyer.P.D. Academic
Press, part A, v.11, New York, p. 397-547. 1975.
DORTA, D.J.; PIGOSO, A.A.; MINGATTO, F.E.; RODRIGUES,T.; PRADO,I.M.R.;
HELENA A.F.C.; .UYEMURA, S.A.; SANTOS, A.C.; CURTI, C. Theinteraction of
flavonoids with mitochondria: effects on energetic processes. Chemico-Biological
Interactions, v.152, p. 67-78. 2005.
EBERLIN, M. Fomos planejados.Disponível em:
http://www.fomosplanejados.com.br/capitulos/assuntos/assunto.asp?codcapitulo=24&codassu
nto=145&numero=9. Acesso em novembro 2013.
72
FADEEL, B; ORRENIUS, S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging
implications in human disease. Journal of Internal Medicine, v.258, p.479-517. 2005.
FISHER, W.R; TANIUCHI, H; ANFINSEN, C.B. On the role of heme in the formation of the
structure of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v .248, n.9,
p.3188-3195, May. 1973.
FRASER, A.; EVAN, G. A license to kill. Cell, Chicago, v.85, n.6, p.781-784, June. 1996.
GARLAND, J.M; RUDIN.C. Cytochrome c induces caspase-dependent apoptosis in intact
hematopoietic cells and overrides apoptosis suppression mediated by bcl-2, growth factor
signaling, MAP-kinase-kinase, and malignant change. American society of hematology,
Washington, v.92, n.4, p.1235-1246, August.1998.
GEBICKA, L; GEBICKI, J.L. Kinetic studies in the interaction of ferricytochrome c with
anionic surfactants. Journal Protein Chemistry, Lodz, v.18, n.2, p.65–172. January. 1999.
GLOTTLIEB, RA. Mitochondria: execution central. FEBS Letters, n. 482, p. 6-12,
September, 2000.
GREEN, D.; KROEMER, G. The central executioners of apoptosis: caspases or
mitochondria? Trends in Cell Biology, v.8, p.267-271, 1998.
GREVICICH, I; REGNER, A; ROCHA, A.B. Morte celular por apoptose. Revista Brasileira
de Cancerologia, Rio de Janeiro, v.53, n.3, p. 335-343. 2007
HAMPTON, M.B; ZHIVOTOVSKY, B; SALTER, A. F. G; BURGESS, D.H; ORRENIUS,
S. Importance of the redox state of cytochrome c during caspase activation in cytosolic
extracts. Biochemistry Journal, v.329, n1, p.95-99. 1998.
HENSON, P. M; HUME, D.A. Apoptotic cell removal in development and tissue
homeostases. Trends in immunology, v.27, p.244-250. May, 2006
HASMANN, F.A; CORTEZ, D.V; GURPILHARES, D.B; ROBERTO, I.C; JUNIOR, A.P.
Micelas reversas de leticina de soja: uma alternativa para purificação de proteínas. Revista
Brasileira de Ciências Farmacêuticas, São Paulo.v.43, n.3, p. 481-487. Jul/set. 2007
ISRAELS, L.G; ISRAELS, E.D. Apoptosis. The Oncologist, v.17, n.4, p.332-339. August,
1999.
KAWAI, C; PESSOTO, F.S; RODRIGUES, T, MUGNOL, K.C. U; TORTORA, V;
CASTRO, L; MILICCHIO, V.A; TERSARIOL, I.L.S; DI MASCIO, P; RADI, R;
CARMONA-RIBEIRO, A.M; NANTES, I.L. pH-Sensitive binding of cytochrome c to the
inner mitochondrial membrane. Implications for the participation of the protein in cell
respiration and apoptosis. The Journal of Biological Chemistry, v. 48, n.35, p.8335–8342.
August. 2009.
KAWAI, C., F. M. PRADO, G. L. C. NUNES, P. DI MASCIO, A. M. CARMONA-
RIBEIRO, AND I. L. NANTES. pH-dependent interaction of cytochrome c with
73
mitochondrial mimetic membranes. The Journal of Biological Chemistry, v.280, p. 34709–
34717, October. 2005.
KERR, J.F.R; WINTERFORD, C.M; HARMON, B.V. Apoptosis. Its significance in cancer
and cancer Therapy. Cancer, v.73, p.2013-2026. April, 1994.
KLUCK, R. M; BOSSY-WETZEL. E; GREEN, D.R; NEWMEYER, D.D. The release of
cytochrome c from mitochondria: a primary site for Blc-2 regulation of apoptosis. Science,
San Diego, v.275, n.21, p.1132–1136. February. 1997.
KOWALTOWSKI, A. J; VERCESI, A. E; FISKUM, G. Bcl-2 prevents mitochondrial
permeability transition and cytochrome c release via maintenance of reduced pyridine
nucleotides. Cell Death & Differentiation, v. 7, n. 10, p. 903-910. October. 2000.
KOWALTOWSKI, A. J; VERCESI, A.E. Mitochondrial damage induced by conditions of
oxidative stress. Free Radical Biology & Medicine, New York, v. 26, n.3, p. 463-471,
February. 1999.
LEHNINGER, A.L. Princípios de Bioquímica. 4 ed. São Paulo: Sarvier, 2006. p. 368-372.
LEWIN, B. Genes VII. 7.ed. Porto Alegre: Artmed, 2001. 955 p.
LORENZO G; KLAS B; GUIDO K. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal
injury. Nature Reviews Neuroscience, v. 10, p. 481-494, July. 2009.
MIN, L; WANG, A.J; JIAN, X.X. Redox State of Cytochrome c Regulates Cellular ROS and
Caspase Cascade in Permeablized Cell Model. Protein and peptide letters. Netherlands. v.
15, n.2, p.200-205. 2008
Mitchell, P. A commentary on alternative hypotheses of protonic coupling in the membrane
systems catalysing oxidative photosynthetic phosphorylation. FEBS Lett, v. 78, n° 1, p. 1-20,
1977.
MORAES, S.L; REZENDE, M.O.O. Determinação da concentração micelar crítica de ácidos
húmicos por medidas de condutividade e espectroscopia. Química Nova. São Paulo, v.27,
n.5. setembro. 2004. Disponível em www.scielo.br.phppid=so100. Acesso em agosto 2011.
MUGNOL, K.C; ANDO, R.A; NAGAYASU, R.Y; FALJONI-ALARIO, A;
BROCHSZTAIN, S; SANTOS, P.S; NASCIMENTO, O.R; NANTES, I.L.Spectroscopic,
Structural, and Functional Characterization. Of the Biophysical Journal, New York, v.94,
n.10, p.4066–4077. maio. 2008.
MUGNOL, K.C. Caracterização espectroscópica de citocromo c baixo spin com baixo
grau de rombicidade através do uso de micelas reversas de AOT/hexano e micelas
aquosas de SDS. 2004. 93f. dissertação (mestrado em Biotecnologia) – Universidade de
Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, 2004.
NANTES, I. L; FALJONI-ALA´RIO, A; NASCIMENTO, O.R; BANDY, B; GATTI, R;
BECHARA, E.J.H. Modifications in heme iron of free and vesicle bound cytochrome c by
74
tert-butyl hydroperoxide: a magnetic circular dichroism and electron paramagnetic resonance
investigation. Free Radical. Biology & Medicine, v.28, n.5, p.786–796.March. 2000.
NANTES, I. L; Zuchhi, M.R; Nascimento, O.R; FALJONI-ALARIO, A. Effect of heme iron
valence state on the conformation of cytochrome c and its association with membrane
interfaces. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore .v.276, n.01 p.153–158.janeiro.
2001.
OLIVER, D. STUART, J. F. Cytochrome c Maturation the in vitro reactions of horse heart
apocytochrome c and paracoccus denitrificans apocytochrome c550 with heme. The journal
of biological chemistry. vol. 278, No. 7. February 14, pp. 4404–4409, 2003.
OLTEANU, A; PATEC, C.N; DEDMON, M.M; KENNEDY, S; LINHOFF, M.W;
MINDER, C.M; POTTS, P.R; DESHMUKH, M; PIELAK, G.J. Stability and apoptotic
activity of recombinante human cytochrome c. Biochemical and Biophysical Research
Communication, v. 312, p.733-740, 2003.
PAULA, I.M. Caracterização estrutural e functional de formas mutantes de citocromo c.
2013.116 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia). Universidade de Mogi das Cruzes,
2013.
PRIETO, T. Microperoxidases associadas a micelas de CTAB: uma lipoenzima com
atividades de peroxidase. 2004. 97 f. Dissertação (mestrado em Biotecnologia).
Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, 2004.
PRIETO, T. Hemoproteínas e hemopeptídeos como agentes indutores de morte celular:
estudo comparativo de entrega por lipossomos de dodab e microinjeção. 2009. 150 f. Tese
(Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, 2009.
RAMOS, C.H.I., FERREIRA, S.T. Protein folding, misfolding and aggregation: evolving
concepts and conformational diseases. Protein & Peptide Letters, v.12, n.3, 213-222, abril,
2005.
RINALDI, T.A.; TERSARIOL, I.L.S.; DYSZY, F.H.; PRADO, F.M.; NASCIMENTO, O.R.;
DI MASCIO, P.; NANTES, I.L. Protonation of two adjacent tyrosine residues influences the
reduction of cytochrome c by diphenylacetaldehyde : a possible mechanism to select the
reducer agent of heme iron. Free Radical Biology & Medicine, v. 36, n. 6, p. 802-810, 2004.
ROCHA, J.M.S. Aplicações de agentes tensoativos em biotecnologia. 1997. Boletim de
Biotecnologia. Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia
da Universidade de Coimbra. Disponível em: http:
www.deqb.ist.utl.pt/bbio/64/pdf/agentes_tensoativos.pdf. Acesso em agosto de 2011
RODRIGUES, T., de FRANÇA, L.P, KAWAI, C., de FARIA, P.A., MUGNOL, K.C.U.,
BRAGA, F.M., TERSARIOL, I.L., SMAILI, S.S., NANTES, I.L. Protective role of
mitochondrial unsaturated lipids on the preservation of the apoptotic ability of cytochrome C
exposed to singlet oxygen. The Journal of Biological Chemistry. v. 282(35), p. 25577-87,
2007.
75
RUMBLEY, J. N; HOAND, L; ENGLANDER, W. Recombinant equine cytochrome c in
Escherichia coli: High-level expression, characterization, and folding and assembly mutants.
Biochemistry Journal, Pennsylvania, v.41, n.47, p.13894–13901. outubro.2002.
RYTOMAA, M; KINNUNEN, P.K.J. Reversibility of the binding of cytochrome c to
liposomes. The Journal of Biological Chemistry. Baltimore, v.270, n.17, p.3197–
3202.fevereiro. 1995.
RYTÖMAA, M., KINNUNEN, P.K.J. Evidence for two distinct acidic phospholipid-binding
sites in cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. v. 269, p. 1770-1774. 1992
SCHLAMADINGER, D.E; KATIS, D.I; KIN, J.E. Quenching of TryptophanFluorescence in
Unfolded Cytochrome c: A Biophysics Experiment for Physical Chemistry Students. Journal
Chemical. Education., v.87, n.9, p. 961-964, 2010
SEUNG, H; CHANG, P.C; PHELPS, I. K. BEREZESKY, M; EBERSBERGER, l.J;
BENJAMIN, F.T. Studies on the Mechanisms and Kinetics of Apoptosis Induced by
Microinjection of Cytochrome c in Rat Kidney Tubule Epithelial Cells (NRK-52E).
American Journal of Pathology.v.156, n.2, p.637-649. February 2000.
SHARONOV, G.V; FEOFANOV, A.V ; BOCHAROVA,O.V; ASTAPOVA, M.V;
DEDUKHOVA,V.I; CHERNYAK, B.V; DOLGIKH,D.A; ARSENIEV,A.S; SKULACHEV,
V.P; KIRPICHNIKOV, M.P. Comparative analysis of proapoptotic activityof cytochrome c
mutants in living cells. Springer.v.10, n.4, p.797-808. 2005.
THOMPSON, C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science,
v. 267, n.5203. p.1456-1462, março, 1995
TRUMP, B.F.L. The pathways of cell death: oncosis, apoptosis, and necrosis.Toxicologic
Pathology, v.25, p.82-88. Janeiro, 1997.
TUOMINEN, E. K. J; WALLACE, C.J.A; KINNUNEN, P.K.J. Phospholipid-cytochrome c
interaction. The Journal of Biological Chemistry, New York, v.277, n.11, p.8822–
8826.janeiro. 2002
UCHIYAMA, Y. Apoptosis: The history and trends of its studies. Archives of Histology
and cytology, v.58, n.2 p.127-137. março, 1995.
YANG, J; LIU, X.S; BHALLA, K; KIM,C.N; IBRADO, A.M; CAI, J PENG,T; JONES, D.P;
WANG, X. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria
blocked. Science, New York. v.275, n.5303 p.1129–1132.fevereiro.1997.
YU, T; WANG, X; PURRING, C; WEI, J; MCLENDON, G.L. A mutational epitope for
cytochrome c binding to the apoptosis protease activation factor-1. The Journal of Biological
Chemistry, v.276, p. 13034- 13038, 2001
WYLLIE, A.H. Apoptosis and carcinogenesis. European. Journal of Cell Biology, v.73, n.3,
p.189-197, 1997.
76
ZUCCHI, M. R; NASCIMENTO, O.R; FALJONI-ALA´RIO, A; PRIETO, T; NANTES I.L.
Modulation of cytochrome c spin states by lipid acyl chains: a continuous-wave electron
paramagnetic resonance (CW-EPR) study of haem iron.The Journal of Biological
Chemistry, London, v.370, n.2, p.671–678.março. 2003.
