Universidade de São Paulo

Escola de Engenharia de Lorena

MATHEUS AUGUSTO CÂNDIDO

Lorena

2015

MATHEUS AUGUSTO CÂNDIDO

Formação de acrilamida em alimentos processados e sua possível ação

carcinogênica

Trabalho de conclusão de curso para

obtenção do título de bacharel em

Engenharia Química

Área: Processos Bioquímicos;

Alimentos

Orientador: Prof. Dr. Sílvio Silvério

Da Silva

Lorena

2015

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Cândido, Matheus Augusto Formação de acrilamida em alimentos processados esua possível ação carcinogênica / Matheus AugustoCândido; orientador Sílvio Silvério da Silva. -Lorena, 2015. 44 p.

Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaQuímica - Escola de Engenharia de Lorena daUniversidade de São Paulo. 2015Orientador: Sílvio Silvério da Silva

1. Alimentos. 2. Processos bioquímicos. I. Título.II. da Silva, Sílvio Silvério, orient.

DEDICATÓRIA

À minha família, especialmente meus pais, minha base e sustentação, de

onde obtive meus princípios e valores, e que sempre me apoiou e incentivou nas

minhas horas mais felizes e tristes de vida.

Aos meus amigos da República Cevada, minha segunda casa, que sempre

lá estiveram para me dar um abraço amigo, uma palavra de sabedoria ou de

amizade sincera.

Aos meus amigos Robson, Thiago, Douglas e Tales, que estiveram me

aconselhando e partilhando de momentos únicos na minha vida e que me lembrarei

com carinho pelo resto da vida.

Ao Professor Doutor e amigo Antônio Sérgio Cobianchi, por quem tenho

grande apreço, pela amizade, horas e horas de conversas sobre a vida e conselhos

que me fizeram chegar mais adiante.

AGRADECIMENTOS

À Universidade de São Paulo, pelas oportunidades concedidas a mim e que

me fizeram ser um cidadão melhor para a sociedade, bem como tantos outros

estudantes que aqui estudam.

Ao Professor Doutor Silvio Silvério da Silva, que me orientou nesse trabalho

com muita paciência, humor e disposição para ensinar e que leciona de forma

diferente e interessante, sendo um exemplo a ser seguido.

Ao mestrando Matheus Soler que, mesmo nas horas mais difíceis de seu

mestrado, reservou tempo para me ajudar em pesquisas e sugestões sobre o

assunto aqui tratado nesta monografia.

À minha querida Bianca Maia, pela ajuda nas traduções de artigos e pela

paciência e dedicação que teve comigo nas minhas horas de estresse. Essa ajuda

foi deveras importante para a conclusão deste trabalho.

Aos professores Doutores Messias Borges, Marco Pereira, Domingos

Giordani e Marcos Barcza pelo conhecimento transmitido e a forma diferente de

fazê-lo, inovando o meio de ensino da Instituição. Isso é de grande valia à

universidade e seus estudantes, elevando o nível de ensino a outro patamar.

Também todo o corpo docente da Escola de Engenharia de Lorena que, de

uma forma ou de outra, sempre me ajudaram com o que precisei.

“A mente que se abre para uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original”.

Albert Einstein

“Do céu só „vem‟ o sol que queima e a água da chuva que molha. Se quisermos

algo nessa vida, temos que batalhar pra conseguir”.

Antônio Cândido Sobrinho, meu avô.

Resumo

CÂNDIDO, M. A. Formação de acrilamida em alimentos processados e sua

possível ação carcinogênica. Projeto de Monografia (Trabalho de Graduação em

Engenharia Química) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São

Paulo, Lorena, 2015.

A acrilamida é uma substância química usada na produção de poliacrilamida, de

colas, cosméticos e no tratamento de água. Contudo, é uma substância

classificada como potencialmente cancerígena para o ser humano. Ela é produzida

em alguns tipos de alimentos processados a elevadas temperaturas, devido à

reação entre o aminoácido asparagina e uma fonte de açúcar redutor. Essa

acrilamida reage nos tecidos de animais mamíferos e é biotransformada em outra

substância, a glicidamida, a qual pode desencadear a iniciação do processo

cancerígeno. No presente trabalho, procura-se apresentar informações de

interesse sobre a formação da acrilamida em uma determinada classe de alimentos

submetidos a tratamentos térmicos e uma possível solução para a eliminação total

ou parcial dessa substância e seu potencial carcinogênico. A principal solução

explorada foi a introdução da enzima asparaginase no preparo desses alimentos a

fim de eliminar o aminoácido asparagina neles presente. A asparaginase é obtida,

mais frequentemente, por processos bioquímicos que incorporam o uso de fungos

filamentosos e bactérias, embora, devido à facilidade de manipulação, à redução

relativa de efeitos colaterais e ao barateamento de custos, venham sendo

desenvolvidos estudos com o uso de leveduras para esse fim. A introdução da

asparaginase no processamento dos alimentos resultou em uma redução de 60 a

90% dos níveis de acrilamida nos produtos, de forma que as características

sensoriais não tenham sido alteradas, mostrando que se trata de uma opção

eficiente e promissora.

Palavras-chave: acrilamida, asparagina, asparaginase, alimentos processados

Abstract

CÂNDIDO, M. A. Formation of acrylamide in processed foods and its possible

carcinogenic action. Projeto de Monografia (Trabalho de Graduação em

Engenharia Química) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São

Paulo, Lorena, 2015.

Acrylamide is a chemical substance used in the production of polyacrylamide,

glues, cosmetics and in the treatment of water. However, this substance is taken as

a potential carcinogen for the human body. It is produced in high temperature food

processing, due to the reaction between the aminoacid asparagine and a reducing

sugar source. This acrylamide reacts with tissues and it is biotransformed into

another substance: glicidamida, which may trigger the initiation of the cancer

process. In this study, information of interest are shown about the production of

acrylamide in a particular class of foods subjected to heat treatment and a possible

solution for the total or partial elimination of the substance and its carcinogenic

potential. The main explored solution was the introduction of the enzyme

asparaginase to prepare such foods in order to eliminate the present aminoacid

asparagine. Asparaginase is obtained, most frequently by biochemical processes

that incorporate the use of filamentous fungi and bacteria, although, due to ease of

manipulation, the relative reduction of side effects and lower costs, current studies

using yeast for this purpose have been developed. The introduction of asparaginase

in food processing resulted in a reduction of 60 to 90% in acrylamide levels in

products, and since the sensory characteristics have not been changed, it was

concluded that it is a promising and efficient option.

Key-words: acrylamide. asparagine. asparaginase. processed food.

Lista de abreviações

AA Aminoácidos

ACL Acrilonitrila

ACM Acrilamida

IARC International Agency for Research on Cancer

GCM Glicidamida

kg Quilograma

µg Micrograma

ASNU Unidade de atividade da asparaginase

Lista de figuras

Figura 1 - Fórmula estrutural da acrilamida .......................................................... 15 Figura 2 - Fórmula estrutural de aminoácidos em diferentes condições de pH..... 16 Figura 3 - Fórmula estrutural da asparagina ......................................................... 16 Figura 4 - Reação genérica de Maillard ................................................................ 18 Figura 5 - Reação simplificada de formação de acrilamida em alimentos ............ 19 Figura 6 - Metabolismo de acrilamida em roedores in vivo ................................... 21 Figura 7 - Reação genérica da asparaginase ....................................................... 25 Figura 8 - Perfil de atividade em temperatura a pH=7........................................... 34

Lista de tabelas

Tabela 1 - Solubilidade de ACM em diversos solventes ....................................... 14 Tabela 2 - ACM produzida na reação entre açúcares e AA .................................. 20 Tabela 3 - Níveis de acrilamida em produtos comerciais.......................................32 Tabela 4 - Níveis de acrilamida em biscoito meio-amargo.....................................33

Tabela 5 - Níveis de acrilamida em biscoitos de gengibre......................................35

Sumário

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 12

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 14

2.1 A acrilamida e suas características ............................................................. 14

2.2 O aminoácido asparagina ........................................................................... 15

2.3 Desenvolvimento da Reação de Maillard .................................................... 17

2.4 Formação de acrilamida em alimentos processados à altas temperaturas 18

2.5 Formação de glicidamida em tecidos de mamíferos ................................... 21

2.6 Fatores que afetam a atividade enzimática ................................................. 22

2.6.1 Temperatura .......................................................................................... 22

2.6.2 pH – Acidez e alcalinidade .................................................................... 23

2.6.3 Concentração do substrato .................................................................... 24

2.7 A enzima asparaginase: uma solução promissora para redução dos níveis de ACM em alimentos ........................................................................................ 24

2.7.1 Utilização da L-asparaginase na indústria farmacêutica ........................ 26

2.7.2 Utilização na indústria alimentícia.......................................................... 27

2.7.3 Produção da enzima L-asparaginase .................................................... 28

3 METODOLOGIA ............................................................................................... 30

4 RESULTADO E DISCUSSÃO ............................................................................ 31

5 CONCLUSÃO .................................................................................................... 37

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 38

12

1 INTRODUÇÃO

Uma das maiores preocupações mundiais é a manutenção e preservação

da saúde populacional. O estilo de vida atual e moderno tem proporcionado

mudanças de hábitos e muitas vezes a ingestão de alimentos rápidos tem sido

priorizada. A indústria de alimentos evoluiu demasiadamente proporcionando à

população alimentos acessíveis e de preços competitivos.

Por meio de diversos estudos, vão se descobrindo novas substâncias que

tem a capacidade de prejudicar o organismo humano e novas técnicas para

minimizar e/ou eliminar esses problemas são necessárias e propostas.

A acrilamida (C3H5O) é uma substância química usada na produção de

poliacrilamida, produção de colas, cosméticos, tratamento de água e em alguns

alimentos preparados a altas temperaturas e tem sido usada comercialmente

desde meados dos anos 50 (CALLEMAN, 1996; WEISS, 2002).

Após um acidente ambiental na Escandinávia na década de 90 envolvendo

a construção de túneis para ferrovias de velocidade elevada, a ACM foi destacada

como uma fonte potencial de câncer em alimentos. Em tal acidente, houve a

exposição de trabalhadores que manipularam selantes contendo ACM.

(REYNOLDS; 2002).

Pesquisas apontam a acrilamida como sendo uma substância com ação

neurotóxica ao ser humano em especial a partir da exposição ocupacional. Esse

efeito já é conhecido há mais de trinta anos (FAO/WHO, 2002). Em 1994, a

acrilamida foi avaliada pela Agência Internacional de Pesquisa sobre Câncer

como “possivelmente cancerígeno para humanos” (IARC, 1994).

Pesquisadores da Universidade de Estocolmo, estudando o desastre da

Escandinávia, compararam bioindicadores sanguíneos de exposição à acrilamida

dos trabalhadores expostos e em trabalhadores não expostos (população

controle). Após análises, os resultados mostraram que não houve diferença

significativa entre os grupos analisados (HAGMAR, 2001).

13

Na busca pelo real motivo dos níveis de ACM, responsáveis pela ação

carcinogênica, estudos em animais com uma dieta feita com ACM foram feitos e

os níveis de bioindicadores sanguíneos desse grupo foram dados como altos se

comparados à população controle. Assim, o grupo de estudo demonstrou que

alimentos fontes de carboidratos, quando tratados em altas temperaturas de

processamento, continham níveis significativos de acrilamida (TAREKE, 2002), o

que potencialmente poderiam ser desencadeadores de câncer em animais de

laboratório.

Assim, em 2002, foi comunicado publicamente pela Agência Nacional de

Alimento da Suécia (SNFA) a presença de substância acrilamida em alimentos

ricos em carboidratos quando submetidos a tratamentos térmicos drásticos.

Desde então, foram organizados encontros públicos e um foco maior à ACM foi

dado devido à pressão da comunidade científica. No momento percebe-se um

interesse da comunidade científica em desvendar estas observações.

Embora a toxicidade da acrilamida tenha sido comprovada, a sua formação

em certos tipos de alimentos ainda é motivo de grande discussão. Os trabalhos

evidenciam fortemente sua atuação em algumas classes de alimentos

processados. Observa-se que existe uma mitigação na discussão do real papel da

acrilamida, tendo em vista ser um tópico de grande importância na atualidade.

Assim, esse trabalho visa contribuir com informações para enriquecer o

entendimento e aumentar as discussões sobre a substância acrilamida

encontrada em alimentos ricos em carboidratos quando tratados com processos

térmicos drásticos, seu possível potencial cancerígeno e a solução da eliminação

parcial ou total dessa substância utilizando a inserção da enzima asparaginase no

meio de preparo dos alimentos processados, a qual é obtida por processos

bioquímicos industriais.

14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 A acrilamida e suas características

A acrilamida (C3H5O) é uma substância química, de massa molar de 71,08

g/mol, usada na produção de poliacrilamida, produção de colas, cosméticos,

tratamento de água e tem sido usada comercialmente desde meados dos anos 50

(CALLEMAN, 1996; WEISS, 2002).

Trata-se de um sólido branco cristalino (HABERMANN, 1991) solúvel em

água, metanol, etanol, acetona, acetato de etila, benzeno e heptano (BUDAVARI,

1989; LIDE, 1991). Sua solubilidade e fórmula estrutural estão apresentadas na

Tabela 1 e Figura 1.

Tabela 1 - Solubilidade de ACM em diversos solventes

Solvente Solubilidade

(g em 100 ml de solvente)

Acetona 63

Acetato de etila 12,6

Água (à 30ºC) 215

Benzeno 0,35

Etanol 86

Heptano 0,0068

Metanol 155

Fonte: UWSF (adaptado), 2002

15

Fonte: J. Mol. Struct. (2000), p. 69-85

A ACM, também conhecida como 2-propenamida, é uma molécula reativa

normalmente obtida a partir a hidratação da acrilonitrila (ACL). A preocupação das

indústrias com o possível risco à saúde humana fez com que a fabricação de

produtos selantes que contém acrilamida fosse diminuída na década de 70.

Companhias americanas chegaram a produzir quase 50.000 toneladas em 1992.

Em 2004, a produção foi estimada em 250.000 toneladas por ano (NERI, 2004).

2.2 O aminoácido asparagina

Aminoácidos (AA) são ácidos orgânicos que possuem um ou mais grupo

Amina em seus terminais. Qualquer molécula de AA tem um grupo carboxila

(COOH) e um grupo amina ligados a um átomo de carbono. Nesse carbono ficam

ligados ainda um átomo de hidrogênio e um radical (R). O aminoácido pode ser

diferenciado de acordo com o grupo R.

Devido ao efeito anfótero, o aminoácido pode estar em sua forma ionizada

ou não, dependendo do pH em que se encontra. A fórmula estrutural de um

aminoácido em diferentes condições de pH é apresentada na Figura 2.

Figura 1 - Fórmula estrutural da acrilamida

16

Figura 2 - Fórmula estrutural de aminoácidos em diferentes condições de pH

Fonte: http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/ponto_isoeletrico.htm

(adaptado)

A asparagina, cuja fórmula estrutural é mostrada na Figura 3, é um dos 20

aminoácidos mais comumente encontrados nos alimentos. É um aminoácido não-

essencial para humanos. Pode ser encontrada em fontes de origem animal, como

laticínios, aves, ovos, peixe, carne bovina, marisco e em fontes de origem vegetal,

como batatas, nozes, sementes, leguminosas e produtos vegetais.

Fonte: http://www.explicatorium.com/quimica/Aminoacido_Asparagina.php.

Acesso em 07.out.2014

Aminoácidos podem sofrer diferentes reações químicas, tanto dentro das

células através de catalisadores biológicos (enzimas), quanto de forma

Figura 3 - Fórmula estrutural da asparagina

17

extracelular. Um dos exemplos clássicos de reações ocorridas em alimentos entre

aminoácidos é a Reação de Maillard.

2.3 Desenvolvimento da Reação de Maillard

Em 1912, Louis Camille Maillard descreveu uma reação típica de

condensação entre o grupo amina de aminoácidos e carboidratos que ocorre

principalmente em alimentos processados à altas temperaturas (SHARP, 2003).

A pigmentação marrom nos alimentos processados causada pelo browning

químico (reação de Maillard) se dá pela formação de melanoidinas e tem grande

impacto na qualidade final do produto alimentício processado contribuindo pela

cor e odor característicos. A reação se dá quando o grupo amino do aminoácido e

compostos carbonilas de açúcares redutores reagem entre si quando tratados

termicamente (NERI, 2004). Desta forma, os alimentos têm suas qualidades

físicas e sensoriais modificadas.

A reação se inicia quando um açúcar redutor se condensa com um grupo

amino livre (geralmente de um aminoácido). A partir dessa reação, observa-se o

rearranjo conhecido como Amadori, que é a isomerização da glicosilamina; a

formação da base de Schiff; a degradação de Strecker e algumas reações

intermediárias, de onde forma-se o hidroximetil furfural ou furfural, cuja

polimerização dará origem à melanoidina, conforme esquema da figura 4.

(EVANGELISTA, 1992; CHEFTEL, 1992).

18

Fonte: SKOG, 2007 (adaptado).

2.4 Formação de acrilamida em alimentos processados à altas

temperaturas

A acrilamida é considerada um potencial agente carcinogênico desde a

década de 90, quando um acidente ambiental, na Escandinávia, envolvendo

trabalhadores indicou que essa molécula poderia ter causado câncer nessa

população. (REYNOLDS, 2002).

Em um estudo realizado por pesquisadores da Universidade de Estocolmo,

estudando o desastre da Escandinávia, bioindicadores sanguíneos de exposição

à acrilamida dos trabalhadores expostos e em trabalhadores não expostos

(população controle) foram comparados. Os resultados mostraram que não houve

diferença significativa entre os grupos analisados (HAGMAR, 2001).

Após os resultados do primeiro estudo, surgiram hipóteses para tentar

encontrar a origem da ACM em outras fontes, visto que a exposição ocupacional

não chegou a uma conclusão definitiva. Assim, os alimentos começaram a entrar

no foco dos pesquisadores como fonte principal da formação da acrilamida. Os

estudos prosseguiram e a hipótese da participação de ACM em alimentos foi

confirmada baseada em dois importantes experimentos. Em um deles, um grupo

de cobaias foi submetido a uma dieta com alimentos à base de fritura. O outro

Figura 4 - Reação genérica de Maillard

19

grupo foi alimentado com uma dieta livre de frituras. Os níveis mais elevados de

ACM foram encontrados nos animais que foram submetidos à dieta com frituras,

enquanto o grupo controle os níveis de ACM foram inferiores ao limite de

detecção de 10 μg/Kg (TAREKE, 2000). A possível reação da ACM nos alimentos

é mostrada na Figura 5.

Fonte: SKOG, 2007 (adaptado)

Ainda segundo Neri (2004), pesquisadores de uma indústria de uma

grande empresa alimentícia tentaram identificar a presença de ACM a partir do

aquecimento de variados aminoácidos com quantidade equimolar de açúcares

mono e dissacarídeos. As reações em tais açúcares com outros aminoácidos

formaram quantidades bem inferiores de ACM. Além disso, a acrilamida não foi

detectada quando os açúcares e/ou AA foram aquecidos separadamente

(STADLER, 2002). O resultado desse estudo é apresentado a seguir na Tabela 2.

Figura 5 - Reação simplificada de formação de acrilamida em alimentos

20

Tabela 2 - ACM produzida na reação entre açúcares e AA

Aminoácido

Acrilamida (mg/mol)

Com água Seco

Asparagina 221 25

Metionina Não detectado 5

Glicina Não detectado Não detectado

Cisteína Não detectado Não detectado

Glutamina Traços Traços

Ácido aspártico Traços Não detectado

Asparagina aquecida isoladamente Não detectado Não detectado

Fonte: STADLER (adaptado), 2002.

Acredita-se, assim, que os principais alimentos que contenham acrilamida

são snacks extrusados, batatas fritas, produtos de panificação e café.

Uma rota secundária proposta para a formação de acrilamida em alimentos

através da oxidação de lipídeos. O glicerol, formado a partir da hidrólise dos

triacilgliceróis, pode sofrer termodegradação à acroleína, um importante precursor

na síntese da ACM. Esta é uma rota secundária, mas com saliente importância

em alimentos gordurosos e/ou fritos (ARRIBAS-LORENZO et al., 2009;

KERAMAT et al., 2010).

21

2.5 Formação de glicidamida em tecidos de mamíferos

Em 1994, a acrilamida (ACM) foi avaliada pela Agência Internacional de

Pesquisa sobre Câncer como “potencialmente cancerígeno para humanos” (IARC,

1994) baseado em resultados com cobaias apoiados pela evidência de que a

ACM é biotransformada, nos tecidos de mamíferos, em um metabólito genotóxico

quimicamente reativo, a glicidamida. Segundo Neri (2004), “A glicidamida (GCM)

parece formar adutos estáveis com o DNA, provocando danos que, a princípio,

podem desencadear a iniciação do processo cancerígeno” (DIXIT, 1980; MILLER,

1982; CALLEMAN, 1990; SCF, 2002). O bioprocesso no qual a acrilamida é

convertida em GCM pode ser demonstrado ocorrendo em tecidos de humanos e

roedores conforme a Figura 6.

Fonte: IARC (adaptado), 1994, p. 405

Figura 6 - Metabolismo de acrilamida em roedores in vivo

22

Dentre as estratégias utilizadas para mitigação da formação de acrilamida

nos alimentos, encontram-se a adição da enzima L-asparaginase para

degradação da L-asparagina antes do aquecimento do alimento, adição de outros

aminoácidos como a glicina à massa, utilização de agentes complexantes para se

ligar à L-asparagina, como íons metálicos divalentes, e a redução da

concentração de agentes que aceleram a reação, como sais de amônio

(FRIEDMAN, 2008; KERAMAT et al., 2010; KUKUROVÁ et al., 2009;

PEDRESCHI et al., 2007). Dentre essas estratégias, a aplicação da enzima L-

asparaginase à massa do alimento previamente ao processamento é uma das

mais promissoras.

2.6 Fatores que afetam a atividade enzimática

2.6.1 Temperatura

Com o aumento da temperatura, aumenta-se a energia cinética das

moléculas. Em um fluido, isso significa que há mais colisões aleatórias por minuto

entre as moléculas.

Visto que as enzimas catalisam reações por colisões aleatórias com as

moléculas de substrato, aumentando a temperatura aumenta-se a taxa de reação,

formando mais produto.

No entanto, o aumento da temperatura também gera um aumento na

energia vibracional que as moléculas tem, especificamente neste caso moléculas

da enzima, o que coloca tensão sobre as ligações que os unem.

À medida que a temperatura aumenta, ligações fracas como pontes de

hidrogênio e dissulfeto vão quebrar como resultado desta tensão. A quebra de

ligações dentro da enzima fará com que o sítio ativo mude de forma, num

processo chamado desnaturação enzimática. Esta mudança na forma significa

23

que o sítio ativo é menos complementar à forma do substrato, de modo que é

menos suscetível de catalisar a reação.

Dessa forma, pode-se definir uma temperatura ótima de atividade

enzimática como sendo aquela em que se obtém a maior taxa de reação sem que

haja comprometimento da estrutura enzimática (COX; NELSON, 2000).

2.6.2 pH – Acidez e alcalinidade

Os íons H+ e OH- são carregados e, portanto, interferem em ligações de

hidrogênio e iônicas que mantêm a estrutura terciária e quaternária de uma

proteína. Dependendo do pH da solução e, consequentemente, a concentração

de H+ e OH- na mesma, as ligações internas da proteína podem ser modificadas

e, assim, pode haver mudanças de sua estrutura levando a uma maior ou menor

atividade catalítica. (COX; NELSON, 2000).

Enzimas diferentes têm diferentes valores de pH ideal. Este é o valor de pH

ao qual as ligações dentro delas são influenciados por íons H+ e OH-, de tal

maneira que a forma do seu sítio ativo é o mais complementar à forma do seu

substrato. Ao pH ótimo, a taxa de reação será ótima.

Qualquer alteração no pH acima ou abaixo do ótimo irá causar rapidamente

uma diminuição na taxa de reação, uma vez que mais das moléculas de enzima

terão sítios ativos cujas formas não são (ou pelo menos, são menos

complementares) à forma do seu substrato.

24

2.6.3 Concentração do substrato

As enzimas afetam a velocidade da reação, mas não seu equilíbrio

químico. A molécula que se liga ao sítio ativo e sofre a ação da enzima é

chamada substrato. O complexo enzima-substrato é fundamental para a ação das

enzimas.

A concentração do substrato afeta a velocidade das reações catalisadas

por enzimas. Um dos principais fatores que afetam a velocidade de uma reação,

catalisada por uma enzima purificada, é a concentração do substrato [S]. A [S]

varia durante o curso da reação à medida que o substrato é convertido em

produto. (COX; NELSON, 2000).

Quando [S] é muito maior que a concentração da enzima [E], pode-se

medir a velocidade inicial da reação, denominada V0. Desse modo, se o tempo de

reação for relativamente curto, as mudanças na concentração do substrato serão

desprezíveis e [S] pode ser considerada constante (COX; NELSON, 2000).

Ainda segundo Cox (2000), em [S] relativamente baixas, V0 aumenta de

forma quase linear com o aumento da concentração do substrato. Em altas

concentrações de substrato, V0 aumenta cada vez menos conforme a [S]

aumenta. Em certo ponto, o aumento de V0 é considerado insignificante em

relação aos aumentos da [S]. Esse patamar atingido para tais valores de V0 é

bem próximo da velocidade máxima, Vmáx.

2.7 A enzima asparaginase: uma solução promissora para

redução dos níveis de ACM em alimentos

A L-asparaginase (EC 3.5.1.1), também conhecida como L-asparagina

amino hidrolase, é a enzima responsável pela catalisação da hidrólise do grupo

amida da cadeia do aminoácido asparagina, resultando como produtos da reação

25

o ácido aspártico e amônia. (LINCOLN; MORE, 2014). Esta reação genérica

segue na Figura 7:

Figura 7 - Reação genérica da asparaginase

Fonte: http://www.worthington-biochem.com/aspr/images/reaction.jpg(adaptada)

A asparaginase é encontrada em organismos vivos, incluindo animais,

plantas e micróbios. (KORNBRUST et al., 2010).

Dentre as estratégias utilizadas para a redução da formação de acrilamida

durante o processamento de alimentos, encontra-se a adição da enzima L-

asparaginase para degradação da L-asparagina antes do processo de

aquecimento do alimento.

O foco de pesquisas atuais na mudança das condições de processamento

de pães para redução da formação de ACM é significativo também. Foram

identificados como principais fatores para formação de acrilamida em produtos de

panificação a temperatura de aquecimento do pão e umidade relativa do ar.

Entretanto, tais fatores são importantes para desenvolvimento da coloração e

sabor na crosta desses tipos de alimentos, importantes aspectos sensoriais de

pães. Logo, modificar esses fatores para redução da ACM pode causar alteração

nas propriedades sensoriais do produto final (AHRNÉ et al., 2007; FRIEDMAN;

LEVIN, 2008; KERAMAT et al., 2010).

Até o presente momento, o método com maior eficácia na redução da

acrilamida é o uso da L-asparaginase previamente ao processamento do

alimento, causando pouco ou nenhum impacto sensorial no produto final. O uso

26

da enzima L-asparaginase antes do processamento do alimento reduz os níveis

de L-asparagina na massa dos produtos. Logo, a reação de Maillard que produz a

acrilamida é inibida de maneira específica para a formação de acrilamida, não

atingindo as melanoidinas que dão características desejáveis ao produto.

Estudos tem apontado a necessidade de otimização e desenvolvimento de

novos processos para obtenção dessa enzima em larga escala visando atender

ao mercado e suas importantes aplicações.

Sabe-se que, durante o tratamento dos alimentos com L-asparaginase,

alguns fatores devem ser levados em consideração, como a concentração, tempo

e temperatura de incubação da enzima.

2.7.1 Utilização da L-asparaginase na indústria farmacêutica

Na área farmacêutica, a enzima tem sido utilizada para tratamento de

Leucemia Linfoide Aguda (LLA) ou leucemia linfoblástica em crianças, uma

neoplasia na linhagem linfoide do sangue caracterizada pela produção maligna de

linfócitos imaturos (linfoblastos) na medula óssea.

Na maioria dos casos, as células malignas de LLA se proliferam

rapidamente, tomando o sangue e inibindo a ação das células saudáveis. Além

disso, as células malignas acabam se espalhando para outras partes do corpo,

como gânglios linfáticos, fígado, baço, cérebro, medula espinhal e testículos.

BROOME (1968) foi um dos primeiros autores capazes de identificar a L-

asparaginase como sendo uma enzima com potencial anticarcinogênico. Também

identificou-se que enzimas provenientes de diferentes fontes tem diferentes

capacidades de inibição de crescimento de tumores, sendo a L-asparaginase

produzida pela bactéria Escherichia coli a enzima que com melhores resultados.

Deduziu-se, então, que essa alta capacidade de inibição tumoral tem como base

3 fatores: (i) a alta afinidade da enzima de E. coli pela L-asparagina,

27

demonstrada pelo baixo valor da constante de Michaelis-Menten (Km); (ii) a L-

asparaginase do E. coli continua altamente ativa mesmo após sua retirada do

sangue, eventualmente por sequestro pelas células hepáticas;(iii) e a meia vida

da L-asparaginase é aumentada quando células de linfoma são implantadas em

cobaias. Assim, diversos micro-organismos foram avaliados para obtenção de

uma L-asparaginase com maior atividade antitumoral em relação àquela

produzida por E. coli e que fosse produzida de forma economicamente viável.

Considera-se que a L-asparaginase a ser utilizada como medicamento deve

possuir atividade farmacológica com o mínimo de efeitos colaterais. Assim,

espera-se que apresentem: alta afinidade pelo substrato, baixa imunogenicidade

e alta estabilidade (NAGARETHINAM et al., 2012).

As enzimas produzidas pelas enterobactérias Escherichia coli e Erwinia

chrysanthemi são as únicas empregadas atualmente nas terapias de tratamento

de leucemia com L-asparaginase. Durante os primeiros estudos sobre micro-

organismos produtores de L-asparaginase, foram identificadas como produtoras

as bactérias Mycobacterium phlei, Pseudomonas fluorescens, bactérias do gênero

Staphylococcus, Tetrahymena pyriformis e Thermus aquaticus, uma bactéria

termofílica, entretanto nenhuma apresentou potencial anticancerígeno comparável

às enzimas atualmente empregadas (VERMA et al., 2007).

2.7.2 Utilização na indústria alimentícia

Após a descoberta da substância potencialmente cancerígena acrilamida,

presente na produção de certa classe de alimentos bastante comuns na

alimentação humana, buscou-se uma alternativa para eliminar o problema.

Sendo praticamente impossível eliminar a ACM do produto final, a solução

foi introduzir a enzima L-asparaginase no meio de produção para assim reduzir a

concentração do precursor da ACM: o aminoácido asparagina. Com a enzima

reagindo com a asparagina, evita-se a reação de Maillard e obtêm-se os produtos

ácido aspártico e amônia, sendo estes facilmente eliminados pelo organismo

28

humano e não causando nenhuma mudança indesejável no produto final, como

alteração de sabor e textura. Para este fim alimentício, a L-asparaginase é

produzida através de fungos filamentosos. É nesse ramo de aplicação que está

fundado o trabalho presente: o ramo alimentício.

2.7.3 Produção da enzima L-asparaginase

Apesar de atualmente todas as formulações de L-asparaginase comerciais

para fins clínicos terem sua origem bacteriana, existem diversas vantagens ao se

aplicar a L-asparaginase de origem fúngica, tanto aquelas obtidas por cultivo de

fungos filamentosos quanto de leveduras, colocando-as em foco de grande

interesse de pesquisa para fins terapêuticos e alimentícios. Por ser produzida por

um microrganismo eucariótico, a L-asparaginase vinda de fungos tem menor

imunogenicidade devido a sua maior semelhança com o organismo humano.

Também, ao contrário das bactérias que produzem as enzimas de maior afinidade

de forma intracelular e periplasmática, os fungos são capazes de produzir

enzimas de alta afinidade e com alta produtividade de forma extracelular,

facilitando os processos de purificação que vem a seguir (HOSAMANI; KALIWAL,

2011; VAN DEN BERG, 2011; VERMA et al., 2007; SOLER, 2014).

Mesmo sendo micro-organismos de difícil cultivo e de características GRAS

(Generally Recognized as Safe), a L-asparaginase de fungos (leveduras e fungos

filamentosos) podem ser aplicadas sem restrições na indústria de alimentos.

Durante os primeiros estudos para se obter L-asparaginase microbiana,

Imada et al. (1973) realizaram uma pesquisa de fungos filamentosos dentre outros

micro-organismos, detectando-se a produção de L-asparaginase nos fungos dos

gêneros Fusarium, Penicillium, Tilachlidum, Verticillium, Hypomyces e Nectria.

Foram testadas trezentas cepas isoladas de diversas frutas e vegetais, obtendo-

29

se uma cepa de Fusarium sp., isolada de pimentões verdes, com produtividade de

L-asparaginase de 273 U.mg-1.

A fermentação em estado sólido (FES) é uma promissora estratégia para

cultivo de fungos filamentosos, visto que é capaz de produzir a enzima em alta

concentração, meios de fermentação simples, com baixo custo e emprego de

água.

Em seus estudos, Mohan Kumar, Ramasamy e Manonmani (2013)

empregaram o fungo filamentoso Cladosporium sp. sob fermentação em estado

sólido com farelo de trigo como substrato, obtendo-se o rendimento de 3,74 U/g

de substrato seco. Em outro estudo realizado por Rani, Sundaram e Vasantha

(2012), obteve-se uma cepa de Penicillium sp. como melhor produtora de L-

asparaginase. Os autores conseguiram obter rendimento de 70,67 U/g de

substrato seco ao empregar essa cepa em FES utilizando a casca de laranja

como substrato.

Apesar de importantes candidatas à produção de novas L-asparaginase,

poucas enzimas de leveduras foram estudadas e caracterizadas detalhadamente

(VERMA et al., 2007). Durante os primeiros estudos da inibição de tumores por L-

asparaginase de micróbios, a enzima de Saccharomyces cerevisiae foi testada

juntamente com enzimas de outros micro-organismos. Entretanto, verificou-se que

as enzimas de S. cerevisiae foram incapazes de inibir o crescimento de linfomas

em cobaias. O autor justificou a ineficácia dessa enzima devido a rápida

eliminação hepática que sofre, ao contrário da enzima de E. coli, que permanece

ativa no sangue da cobaia por certo tempo (BROOME, 1965). Imada et al. (1973)

realizaram uma ampla pesquisa de bactérias, fungos e leveduras para determinar

quais micro-organismos seriam aptos de fornecer uma alta produtividade de L-

asparaginase. Entre as 1326 leveduras testadas, aproximadamente 12%

demonstraram atividade asparaginolítica extracelular. Sabe-se que a levedura

Saccharomyces cerevisiae é capaz de produzir L-asparaginase periplasmática,

mas neste estudo identificou-se produção extracelular da enzima em somente

uma de 57 cepas testadas.

A levedura Saccharomyces cerevisiae possui dois tipos de enzima: uma

intracelular (L-asparaginase I) e outra periplasmática (L-asparaginse-II). A L-

asparaginase II é codificada pelo gene ASP3 e sua produção é estimulada pela

ausência de nitrogênio e não pela adição do AA L-asparagina. A produção de L-

30

asparaginase II de S. cerevisiae obteve somente 0,265 U.mL-1. Realizou-se então

a clonagem do gene ASP3 em Pichia pastoris para uma maior produção

enzimática. Nesse caso alcançou-se a 865 U.mL-1 em cultivo de alta densidade

celular. (FERRARA et al., 2004, 2006, 2010).

3 METODOLOGIA

Com o intuito de verificar a melhor solução encontrada até o presente

momento, foi realizada uma pesquisa bibliográfica através de artigos científicos e

reviews publicados em revistas internacionais. A busca se deu principalmente em

bancos de dados de artigos científicos (Scopus) e em sites de pesquisas e

revistas científicas, além de livros e pesquisadores das áreas envolvidas

Com a pesquisa nos meios científicos, foi explorado no presente trabalho o

estado-da-arte da questão analisada: a possível eliminação parcial ou total da

acrilamida em certos alimentos, enfatizando a utilização da enzima asparaginase

como principal solução.

O mecanismo mais aceito de formação da acrilamida em alimentos foi

tratado nesta monografia. Tal mecanismo foi retirado de artigos já publicados em

meios científicos internacionais. Além dos possíveis mecanismos, foram

considerados os fatores externos que interferem na eficiência da reação

(temperatura, pH, concentração e tempo) no momento do preparo dos alimentos.

Como base de caso, utilizaram-se países onde a ingestão diária de

alimentos com acrilamida possui certa significância e já há levantamento do

consumo desses alimentos e a contribuição percentual destes alimentos fontes de

ACM na alimentação.

31

4 RESULTADO E DISCUSSÃO

Os estudos apresentados nesse trabalho sobre a influência da enzima

asparaginase em alimentos processados se basearam especificamente em

batatas fritas, biscoitos meio amargos, biscoitos de gengibre, biscoitos cream

craker, batatas chips e pão de forma.

Foram identificados como parâmetros críticos para uma boa atividade

enzimática: a dose utilizada da enzima, teor de água e tempo de repouso da

massa. Devido à natureza sólida das batatas fritas e batatas chips, é necessário

branqueamento prévio à aplicação da enzima para redução dos níveis de

acrilamida. Mesmo assim o tecido da batata impede uma boa difusão da L-

asparaginase, resultando em uma redução de acrilamida acima de 70%

(PEDRESCHI et al, 2011).

Tempo e temperatura são fatores controlados que podem reduzir a

formação de acrilamida nos alimentos processados derivados de cereais. Para

produtos que são feitos em fatias de batata, as estratégias de redução focaram-se

em controlar o nível de açúcares redutores, dado que isto é um fator crucial para

a formação da ACM nesse tipo de alimento. (HENDRIKSEN, 2009).

Porém, processos que alternam a formulação do produto tendem a alterar

suas características sensoriais finais, algo indesejável na maior parte dos casos.

O estudo consultado neste trabalho, com mais dados sobre o uso de

asparaginase nessa classe de alimentos, utilizou a enzima derivada do fungo

Aspergillus oryzae Nesse estudo, foi feita a clonagem do gene de A. oryzae em

um sistema que permite excreção extracelular da enzima, antes periplasmática.

Esse estudo foi realizado previamente à comercialização da L-asparaginase de A.

oryzae pela empresa Novozymes, como Acrylaway, pelo mesmo grupo de

cientistas (HENDRIKSEN, 2009).

Para avaliar o potencial de asparaginase de A. oryzae como uma

ferramenta para a mitigação geral da acrilamida em alimentos, foram realizadas

32

uma série de ensaios de aplicação de produtos alimentares com bases cereais ou

batata. Para a alimentos com base de cereais foram escolhidos como sistemas

modelo: biscoitos meio-amargo (base em farinha de trigo); biscoitos cream craker

(base em farinha de centeio, com alto teor de água e baixa temperatura de massa

cozida); e, finalmente, biscoitos de gengibre como um produto de massa

caracterizado por um nível muito elevado de acrilamida em comparação com

outros tipos de biscoitos (HENDRIKSEN, 2009). Ainda segundo o mesmo estudo,

o banco de dados da Comissão Europeia de níveis de acrilamida em produtos

comerciais relata níveis máximos e médios da substância conforme a Tabela 3:

Tabela 3 – Níveis de acrilamida em produtos comerciais

ALIMENTO

ACRILAMIDA (μg/kg)

MÉDIA MÁXIMO

Batata frita 186 4653

Biscoito meio-amargo 145 3324

Biscoitos de gengibre 303 7834

Biscoitos cream cracker 244 2838

Batata chips 528 5215

Fonte: HENDRIKSEN, 2009.

A unidade utilizada de dosagem de enzima é denominada ASNU, que é

definida como a quantidade de asparaginase que produz um micromol de amônia

por minuto nas condições de pH=7,0 e temperatura de 37,0±0.50°C (FAO, 2007).

Para as amostras de biscoitos meio-amargo, nas amostras controle obteve-

se níveis de acrilamida na ordem de 370 a 460 μg/kg em tempos de descanso de

massa de 15 e 30 minutos, respectivamente. Nas amostras tratadas com a

33

enzima asparaginase, o efeito de redução de acrilamida se deu com o aumento

da quantidade de enzima utilizada (HENDRIKSEN, 2009). O resultado com esse

tipo de biscoito, com tempo de descanso de massa de 15 minutos, é mostrado na

Tabela 4:

Tabela 4 – Nível de acrilamida em biscoito meio-amargo

Fonte: HENDRIKEN, 2009

A produção de biscoitos cream craker, por sua vez, apresenta uma

temperatura de massa baixa durante a preparação. Assim, será necessária uma

maior quantidade de enzima para atingir o mesmo patamar de redução de

acrilamida observada para biscoitos meio amargos. Através do estudo da curva

de atividade de temperatura da asparaginase, encontrada em estudos anteriores

e mostrada na Figura 8, foi estimado que, em aproximadamente 10ºC, a enzima

teria somente 30% da atividade que teria em 37ºC, sugerindo que será necessária

3 vezes a quantidade de enzima utilizada para biscoitos meio-amargo na massa

do biscoitos cream craker. Além disso, a farinha utilizada no biscoito cream craker

é a de centeio, que contém mais asparagina livre que a farinha de trigo, o que

também requer uma maior quantidade de enzima. Dessa forma, utilizou-se 2100

ASNU/(kg de farinha) no tratamento.(HENDRIKSEN, 2009).

34

Figura 8 - Perfil de atividade em temperatura a pH=7

Fonte: HENDRIKSEN, 2009. p. 4. (Adaptado)

Nas amostras controle, os níveis de acrilamida eram de 910 e 740 μg/kg. O

resultado foi de redução de 84 a 92% de acrilamida nas amostras tratadas,

independentemente da temperatura de massa e do tempo de descanso.

Para os biscoitos de gengibre, a importância da quantidade de água na

massa foi mais bastante estudada, uma vez que são comumente preparados com

baixa quantidade de água.

A dose de enzima utilizada foi de 1000 ASNU/(kg de farinha), para níveis de

acrilamida que variaram entre 530 e 640 μg/kg nas amostras controle. Encontrou-

se assim uma relação entre a quantidade de água na massa e a quantidade de

acrilamida no produto, mostrada na Tabela 5:

35

Tabela 5 – Redução de ACM em biscoitos de gengibre

Fonte: HENDRIKSEN et al., 2009.

Os valores obtidos mostram que o contato entre a enzima e o substrato é

limitado pela difusão, o que pode indicar que a baixa mobilidade da enzima e

substrato nas massas causa hidrólise incompleta da asparagina e redução parcial

da formação da acrilamida. (HENDRIKSEN et al, 2009).

Batatas fritas são importantes fontes para a exposição humana à ACM,

visto o alto consumo desse alimento pela população mundial. PEDRESCHI et al.

(2008) estudaram diferentes estratégias para redução dos precursores da reação

de Maillard que formam acrilamida em batatas fritas. Para tal, a técnica de

branqueamento térmico e o uso de L-asparaginase foram empregados. A técnica

de branqueamento térmico é eficaz ao reduzir em 50% a concentração de ACM

após a fritura do alimento, porém o uso de L-asparaginase é o método mais eficaz

para redução deste composto, reduzindo em até 75% sua concentração. Os

mesmos autores, em estudo posterior, Pedreschi et al. (2011) confirmaram que a

associação das técnicas de branqueamento térmico e o emprego da L-

asparaginase é capaz de reduzir a concentração de acrilamida em batatas fritas

em até 90%.

No caso das batatas chips, como processo de branqueamento é opcional no

processo de produção desse tipo de alimento e, portanto, fizeram-se os testes

nas duas modalidades: com e sem branqueamento. Sem a asparaginase, o

36

tratamento com as fatias cortadas branqueadas mostraram um nível de acrilamida

de 1750 μg/kg, o qual foi reduzido para 710 μg/kg após a utilização da enzima,

tendo assim uma redução de 59%. Quando as fatias não são branqueadas antes

do tratamento com asparaginase, não há redução considerável nos níveis da

substância acrilamida. O branqueamento reduz a integridade estrutural dos

pedaços de batata, enfraquecendo a parede celular e membrana, promovendo

assim a o contato da enzima com substrato. (HENDRIKSEN, 2009).

Após o tratamento da massa de pão de forma com a enzima L-

asparaginase, foram avaliadas as propriedades reológicas da massa,

características fisico-químicas e sensoriais e o conteúdo de ACM no produto final.

Identificou-se a formação 5 vezes superior de acrilamida na crosta do pão em

relação a massa, visto que a crosta, onde há a formação da coloração desejada,

é a área onde a reação de Maillard, ou browning químico, ocorre com maior

efetividade. A adição da enzima L-asparaginase não causou nenhuma alteração

significativa nos parâmetros sensoriais do pão de forma. Quanto à concentração

de ACM no produto final, observou-se redução de até 97% ao se empregar a

enzima L-asparaginase, obtida da clonagem do gene do fungo Cladosporium

(MOHAN KUMAR et al., 2013).

37

5 CONCLUSÃO

Com este trabalho é possível determinar a natureza da acrilamida, seus

efeitos tóxicos em humanos, sua origem, sua ocorrência e a possível solução

para os problemas causados por ela, utilizando uma enzima previamente

conhecida para outras funções: a L-asparaginase.

Durante as pesquisas realizadas, percebeu-se que leveduras e fungos

filamentosos estão entre as melhores candidatas a novos produtores da enzima

L-asparaginase, porém são poucos os estudos que objetivam empregar tais

micro-organismos como fontes de produção dessa enzima. Logo, torna-se

essencial encontrar novas leveduras capazes de produzir a L-asparaginase em

quantidades suficientes e com propriedades bioquímicas que permitam sua

aplicação tanto na área farmacêutica quanto na indústria alimentícia.

Com os resultados apresentados, pode-se observar a significante redução

dos níveis finais da ACM nos produtos processados termicamente com base em

açúcares redutores utilizando a enzima L-asparaginase no meio de preparo, sem

alterar as propriedades sensoriais finais, que são desejadas pelos produtores e

consumidores.

A presença da enzima no mercado internacional vem crescendo, inclusive

para fins alimentícios. A Novozymes, uma empresa mundial com sede na

Dinamarca, vem comercializando a Acrylaway, que tem alcançado níveis

elevados de redução de acrilamida nos alimentos.

A capacidade de mitigação da ACM pode chegar próximo dos 100% em

alguns casos, sendo assim uma boa alternativa para evitar a exposição da

população à acrilamida, um composto tóxico e potencialmente carcinogênico.

38

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