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i
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA - EEL/USP
Diego Oliveira Santos
“Estudo do crescimento da microalga Chlorella sp”
Declaro que esta monografia foi revisada e encontra-se apta
para avaliação e apresentação perante a banca avaliadora.
DATA:___/___/2014
_____________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
Lorena - SP
2014
ii
Diego Oliveira Santos
“Estudo do crescimento da microalga Chlorella sp”
Monografia apresentada junto ao curso de Engenharia Industrial Química da Escola
de Engenharia de Lorena (EEL) da Universidade de São Paulo (USP) como
requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Engenharia Química.
Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva
Lorena – SP, 2014
iii
Agradecimentos
Gostaria de agradecer primeiramente ao Prof. Dr. Messias Borges Silva, pela
oportunidade prestada de desenvolver este trabalho, pela orientação e conselhos dados
para me aperfeiçoar não só em relação ao trabalho mas também a carreira que pretendo
seguir.
Á Doutoranda Carla Loures, com conselhos e paciência me ajudou bastante na
condução deste trabalho, desde o começo do projeto até o seu final.
Ao Doutorando Matheus Amaral pelas sugestões em relação ao trabalho, pelas
conversas que apesar de rápidas sempre me ajudaram a melhorar a tese.
À minha família por todo o suporte que foi dado desde o ensino básico até chegar
ao final desta grande fase da minha vida que foi a universidade.
Aos amigos do laboratório, Guilherme, Larissa, Igor, Lucas, Junior pela ajuda e
apoio durante a realização deste trabalho.
iv
Resumo
A busca por combustíveis alternativos vem ganhando destaque nas últimas décadas. A
substituição dos combustíveis fósseis tem sido motivada por fatores ambientais,
econômicos e sociais, uma vez que toda a sociedade depende de seu uso. Nesse
contexto, uma alternativa que se tem destacado é o uso de biocombustíveis. Biodiesel de
microalgas se tornou uma evidente alternativa de biocombustível, devido seu poder de
capturar CO2 atmosférico, acumular altos teores de lipídeos em sua biomassa e por não
estarem envolvidas na indústria agrícola. Este trabalho teve como objetivo estudar os
efeitos dos fatores suplementação do meio (f/2 e f), da vazão de ar comprimido (4 /min e
10 /min) e temperatura (20ºC e 30ºC). Também estudar o crescimento da microalga
Chlorella sp, em um fotobioreator batelada, em triplicatas, utilizando o planejamento de
experimento Taguchi L4. Para a otimização da produção de biomassa para futuro uso em
biodiesel. No processo otimizado obtivemos a melhor condição quando a temperatura no
nível de 20ºC, suplementação no nível f/2 e vazão de ar comprimido de 4/min.
Palavra chave: Chorella sp, Cinética de crescimento, biodiesel, microalgas
v
ABSTRACT
The search for alternative fuels has gained prominence in recent decades. Replacing
fossil fuels has been driven by environmental, economic and social factors, since the
whole society is dependent on usage. In this context, an alternative that has been
highlighted is the use of biofuels. Biodiesel from microalgae became an obvious
alternative biofuel because its power to capture atmospheric CO2, accumulate high levels
of lipids in their biomass and are not involved in the agricultural industry. This work aims
to study the effects of supplementation of factors (f / f 2), the flow of compressed air (4 L /
min and 10 L / min) and temperature (20 ° C and 30 ° C) and growth kinetics the
microalgae Chlorella sp in one batch photo bioreactor, in triplicate, using the Taguchi
design of experiment L4. For the optimization of biomass production for future use in
biofuel. In the optimized process achieving the best condition when the temperature level
of 20 ° C supplementation in f/2 and compressed air flow of 4/ min.
Keyword: Chorella sp, Growth kinetics, biofuel, microalgae
vi
Listas de figuras
Figura 1. Evolução do PIB per capita e consumo total final de energia para
países selecionados..........................................................................................................14
Figura 2. Esquema do metabolismo de microalgas............................................18
Figura 3. Variação da biomassa numa cultura em modo batelada.....................20
Figura 4. Desenho esquemático de uma piscina raceway..................................24
Figura 5. Fotobiorreator airlift de placa plana.....................................................25
Figura 6. Desenho esquemático do sistema tubular...........................................26
Figura 7. Fotobioreator bubble column...............................................................27
Figura 8. Fatores influentes em um processo.....................................................35
Figura 9. Esquema do fotoreator de 500 ml........................................................ 38
Figura 10. Imagem do interior do autoclave 04 com o meio para estelizar..........39
Figura 11. Imagem do cepário..............................................................................40
Figura 12. Esquema de repicagem em erlenmeyers de 125ml...........................41
Figura 13. Soluções depois de esterilizadas e destampadas para adição da
vitaminas ...........................................................................................................................41
Figura 14. Fotobioreatores logo após a inoculação.............................................42
Figura 15. Simulação do Taguchi L4 no Minitab 17.............................................44
vii
Figura 16. Curva que relaciona absorbância e contagem celular........................46
Figura 17. Curva da absorbância x tempo do experimento 1..............................48
Figura 18. Curva da absorbância x tempo do experimento 2..............................49
Figura 19. Curva da absorbância x tempo do experimento 3..............................50
Figura 20. Curva da absorbância x tempo do experimento 4..............................51
Figura 21. Curva da absorbância x tempo dos experimentos..............................53
Figura 22. Curva da concentração celular x tempo experimento
1.........................................................................................................................................55
Figura 23. Analise das fases do crescimento de microrganismos.......................56
Figura 24. Main effect plot....................................................................................59
Figura 25. Interation plot......................................................................................61
viii
Listas de tabelas
Tabela 1. Produtividade em biodiesel de diferentes matérias-primas..............................15
Tabela 2. Comparativo entre sistema aberto e sistema fechado de cultivo de micro
alga....................................................................................................................................28
Tabela 3. Espécies produtoras de lipídeos e suas respectivas porcentagens em relação a massa seca.....................................................................................................................31
Tabela 4. Composição do meio de cultivo GUILLARD F/2 (suplementação)....................38
Tabela 5. Níveis das variáveis...........................................................................................43
Tabela 6. Planejamento de experimento Taguchi L4.........................................................47
Tabela 7. Comparação das médias das absorbâncias dos experimentos........................51
Tabela 8. Níveis das variáveis...........................................................................................57
Tabela 9. Planejamento de experimento Taguchi L4.........................................................57
ix
Lista de siglas e abreviações
PIB Produto interno bruto
TOEP Toneladas Equivalente de Petróleo per capita.
PIBP Produto interno bruto per capita.
Bra Brasil
Ind Índia
Ru Rússia
Ale Alemanha
Eua Estados Unidos da América
Chn China
%m.m-1 Massa/massa*100
L Liros
ha Hectar
a Ano
kg Kilograma
EPA Ácido eicosapentaenoico
DHA Ácido docosaexaenoico
B1 Tiamina
x
B7 Biotina
B12 Cianocobalamina
dt
dx Velocidade de crescimento microalga
x a concentração de microalgas
µ máx velocidade especifica de crescimento da microalga
ti tempo
ANOVA análise de variância
S/N relação sinal-ruído
Atm pressão medida em atmosfera
xi
Sumário
1. Introdução ................................................................................................................................... 13
1.1. Contextualização .................................................................................................................. 13
1.2. Justificativa ........................................................................................................................... 16
1.3. Objetivo ................................................................................................................................ 16
2. Revisão Bibliográfica .................................................................................................................... 17
2.1. Microalga .............................................................................................................................. 17
2.2. Metabolismo ........................................................................................................................ 18
2.3. Meio de cultivo ..................................................................................................................... 19
2.4. Regime de cultivo ................................................................................................................. 20
2.5. Sistema de cultivo................................................................................................................. 23
2.5.1. Sistema aberto............................................................................................................... 24
2.5.2. Sistema fechado ............................................................................................................ 25
2.6. Fatores que influenciam o crescimento celular ................................................................... 28
2.7. Síntese de lipídeos em microalgas ....................................................................................... 30
2.8. Monitoramento do crescimento celular .............................................................................. 32
2.9. Planejamento de experimentos ........................................................................................... 33
2.9.1. Método de Taguchi........................................................................................................ 34
3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................................. 37
xii
3.1. Materiais ............................................................................................................................... 37
3.1.1 Microalgas ...................................................................................................................... 37
3.1.2 Fotobioreatores .............................................................................................................. 37
3.1.3 Meio de cultivo ............................................................................................................... 38
3.2 Métodos ................................................................................................................................ 40
3.2.1. Manutenção da cepa ............................................................................................................. 40
3.2.2.Experimento ................................................................................................................... 41
3.2.3. Analise da resposta do processo ................................................................................... 44
4. Resultado e discussão.................................................................................................................. 45
4.1 Concentração de microalga inicial......................................................................................... 45
4.2 Determinação da relação entre contagem celular e absorbância ........................................ 45
4.3 Planejamento do experimento .............................................................................................. 46
4.4. Analise de fases do crescimento da microalga ................................................................. 54
4.5. Analise dos resultados Taguchi L4 .................................................................................... 57
4.5.1 Analise do gráfico dos efeitos principais (main effect) .................................................. 58
4.5.2 Analise do gráfico da interação das variáveis (interaction plot) .................................... 59
4.6. Discussão das melhores condições .................................................................................. 61
5. Conclusão .................................................................................................................................... 61
6. Referências .................................................................................................................................. 62
13
1. Introdução
1.1. Contextualização
As tendências atuais no fornecimento e uso da energia são insustentáveis
economicamente, ambientalmente e socialmente. Sem uma ação decisiva, a energia
relacionada aos gases de efeito estufa vai mais que dobrar até 2050 e a demanda
crescente por petróleo irá aumentar as preocupações sobre a segurança do
abastecimento. Podemos e devemos mudar o caminho em que estamos hoje. As
tecnologias de baixo teor de carbono de energia terão um papel crucial na revolução da
energia necessária para fazer esta mudança acontecer. (OECD/IEA 2011).
Ambientalmente, segundo as projeções, considerando apenas os atuais níveis de
concentração de poluentes na atmosfera, o aumento da temperatura no Brasil já será da
ordem de 2ºC a 3ºC, em 50 anos. (PBMC, 2013)
Economicamente, estão previstos que até o ano de 2035 os investimentos
cresçam anualmente para atender a demanda de energia do mundo em torno de para $ 2
trilhões de dólares, enquanto os gastos anuais em eficiência energética aumentam para
$ 550 bilhões de dólares. (OACD//IEA 2014)
O pilar social está fortemente ligado aos pilares ambiental e econômico, visto que
o ideal seria encontrar uma tecnologia que remova parte dos gases do efeito estufa e
economicamente viável para produção de energia.
A Figura 1 apresenta a evolução do PIB per capita (PIBP) e de consumo total
final de energia (TOEP) de alguns países selecionados que ilustra o crescimento
econômico por países desenvolvidos e subdesenvolvidos entre 1990 e 2009. (OACD//IEA
2014).
14
Figura 1. Evolução do PIB per capita e consumo total final de energia para
países selecionados. Nota: TOEP (Toneladas Equivalente de Petróleo per capita) PIBP
(Produto interno bruto per capita).
Fonte: (OACD//IEA 2014)
Dados revelam que os estoques globais de petróleo se esgotarão por completo
por volta de 2046, desconsiderando a tendência de crescimento no consumo. No entanto,
mesmo antes de seu esgotamento é possível que o preço de seus derivados atinja
patamares muito elevados, o que os tornaria economicamente inviáveis. Logo, a inserção
dos biocombustíveis na malha energética dos países poderia agir como regulador de
mercado, diminuindo a dependência dos combustíveis fósseis. (Lima-Filho et al., 2008)
Os biocombustíveis são tidos como ecologicamente favoráveis, toda vez que
liberam 50% menos material particulado, e 98% menos enxofre, além de serem
biodegradáveis e não tóxicos (Nass et al., 2007; Demirbas, 2010). O biodiesel tem as
seguintes características: (a) é virtualmente livre de enxofre e compostos aromáticos, (b)
tem um alto teor de cetanos e (c) um teor médio de oxigênio (em torno de 11%), (d)
possui maior viscosidade e maior ponto de fulgor que o diesel convencional, e (e) tem um
15
nicho de mercado específico diretamente associado a atividades agrícolas; (f) no caso do
biodiesel de óleo de fritura, ele se caracteriza por um grande apelo ambiental, e
finalmente, (g) tem preço de mercado relativamente superior ao diesel comercial (Ramos,
1999).
Para a produção do biodiesel é necessária a escolha da biomassa, seu teor de
óleo e os impactos nela envolvidos.
Tabela 1. Produtividade em biodiesel de diferentes matérias-primas (os valores
para as microalgas são calculados a partir do teor em óleo)
Fonte: (MATA et al., 2010)
Biodiesel de primeira geração usa uma matéria-prima o óleo de alimentos como
o óleo de milho e óleo de soja. A grande desvantagem de sua produção seria a
competição entre o uso do alimento para fonte de combustível, aumentando o preço do
alimento e seus derivados.
A segunda geração do biodiesel usa óleos de vegetais que não são comestíveis,
16
como o óleo da semente de tabaco, tem como principal problema a sazonalidade da
colheita da matéria prima e a falta de abundância da matéria prima.
A terceira geração de biodiesel é feita com óleo extraído de micro algas, como
mostra na tabela 1. A microalga tem maior produtividade em relação a outros óleos,
necessita de uma área menor para ser produzido e tem a vantagem de não ser um
alimento.
1.2. Justificativa
Nesse contexto, os biocombustíveis a partir de microalgas são uma alternativa
atrativa (ZHANG et al. 2010) devido a sua rápida razão de crescimento, alta
concentração de lipídeos, pouca ocupação territorial - em comparação com as demais
fontes de biocombustíveis - e elevada absorção de CO2. (JORQUERA et al. 2010; SINGH
2011)
Para a produção de biodiesel, muitas espécies de microalgas com diferentes
quantidades de lipídeos podem ser utilizadas, como a Isochrysis sp. (25-33% de
lipídeos), Nannochloris sp. (20-35% de lipídeos), Nannochloropsis sp. (31-68% de
lipídeos), Neochloris oleoabundans (35-54% de lipídeos), Tetraselmes sueica (15-23% de
lipídeos) e Chlorella sp. (28-32% de lipídeos) (CHISTI 2007; GOG et al., 2012).
A produção da biomassa de Chlorella sp ajudaria a fixar o CO2 da atmosfera e na
matriz energética para produção de combustíveis sem teor de SO2, diminuindo o efeito
da chuva ácida, poderia substituir alguns derivados de petróleo diminuindo assim nossa
dependência dessa matéria-prima não renovável.
1.3. Objetivo
Este trabalho teve como principal objetivo:
(a) o estudo do crescimento da microalga Chlorella sp para uma maior obtenção
de biomassa para posterior produção de biodiesel.
(b) Estudar o efeito da vazão volumétrica de ar, suplementação do meio para
17
crescimento de microalga e temperatura no cultivo das microalgas quanto a obtenção de
biomassa.
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Microalga
As microalgas fazem parte de grupo muito heterogêneo de organismos. São
predominantemente aquáticos e geralmente microscópicos unicelulares, podendo formar
colônias, e apresentar pouca ou nenhuma diferenciação celular. Sua coloração variada é
característica oportunizada pela presença de pigmentos e mecanismo fotoautotrófico.
Filogeneticamente, as microalgas são compostas de espécies procarióticas ou
eucarióticas, antigas ou mais recentes, conforme o período em que surgiram no planeta
(RAVEN et al., 2005). O termo “microalgas” não tem valor taxonômico, uma vez que
engloba micro-organismos algais com clorofila e outros pigmentos fotossintéticos
capazes de realizar a fotossíntese oxigênica (PÉREZ, 2007).
As microalgas apresentam mecanismo fotossintético comparável ao das plantas
terrestres, mas devido à sua estrutura simples, e ao meio líquido em que vivem,
apresentam trocas mais eficientes de água, CO2 e nutrientes do que as plantas
superiores, proporcionando taxas mais elevadas de conversão de energia solar em
biomassa. Sua composição contém cerca de 50% de carbono na sua biomassa seca, e
na maioria dos casos, todo este carbono é obtido a partir do dióxido de carbono
atmosférico (CHISTI, 2007; MATA et al., 2010).
Segundo Huntley e Redalje (2007), a espécie Chlorella é considerada uma
candidata promissora para a produção comercial de lipídeos devido ao seu rápido
crescimento e fácil cultivo, destacando a Chlorella sp. como uma das espécies mais
robustas para o cultivo em tanques abertos devido ao seu potencial de resistir a
contaminações.
18
2.2. Metabolismo
O metabolismo da microalga pode ser autotrófico, heterotrófico ou mixotrófico
(Figura 2). No primeiro, as funções são regidas pela fotossíntese. No heterotrófico são
disponibilizados nutrientes para que o metabolismo ocorra na ausência de luz. E por
último, no cultivo mixotrófico ocorre à atuação de ambos os metabolismos citados
anteriormente (MORAIS, 2011).
Além dos lipídeos, as microalgas possuem outros metabólitos de valor agregado,
como por exemplo, carboidratos, proteínas e pigmentos que podem ser refinados e
comercializados com diferentes aplicações. Dentre as principais espécies de microalgas
cultivadas hoje no mundo, estão a Chlorella sp. e Spirulina sp., utilizadas com a
finalidade principal de suplementação alimentar; a Dunaliella salina, que é boa fonte de
caroteno e a Haematococus pluvialis, cultivada com o objetivo de produção de
astaxantina (AZEREDO, 2012)
Figura 2. Esquema do metabolismo de microalgas.
Fonte: (Mariano et al. 2010)
Os carboidratos são um dos compostos das microalgas com maior importância
(YEN et al., 2013). Nos dias de hoje, esses compostos possuem alto valor agregado,
19
com diversas aplicações nas indústrias alimentícias, cosméticas, têxteis, lubrificantes,
entre outras (ARAD e LEVY-ONTMAN, 2010).
Os lipídeos acumulados pelas microalgas são classificados de acordo com o
número de carbono. Ácidos graxos com cadeia de 14-20 carbonos são utilizados na
produção do biodiesel, enquanto aqueles com cadeias maiores são usados como
suplementos alimentares, como por exemplo, o ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido
docosaexaenoico (DHA) (YEN et al., 2013).
2.3. Meio de cultivo
Para o seu pleno desenvolvimento as microalgas necessitam dispor de:
Macronutrientes
Classificam-se como macronutrientes carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio,
fósforo, enxofre, potássio, magnésio, silício e ferro que apresentam funções de grande
importância, como constituir a estrutura de biomoléculas, membranas e do meio
intracelular, participar do processo de troca de energia, regular atividades metabólicas,
dentre outras (LOURENÇO, 2006).
Micronutrientes
Quanto aos micronutrientes, os principais são manganês, molibdênio, cobalto,
boro, vanádio, zinco, cobre e selênio que participam da estrutura e atividade de diversas
enzimas (LOURENÇO, 2006).
Vitaminas
De acordo com Lourenço (2006) as vitaminas que são usualmente adicionados
aos meios de cultivos são:
Tiamina (B1), que possui função geral de agir como coenzima;
Biotina (B7), que atua no transporte de CO2;
20
Cianocobalamina (B12) que não possui ainda um papel metabólico
suficientemente elucidado.
2.4. Regime de cultivo
Nos cultivos em batelada as células são inoculadas no meio fresco no início do
cultivo, não havendo nenhuma adição posterior de nutrientes (LOURENÇO, 2006).
Figura 3. Variação da biomassa numa cultura em modo batelada
Fonte: (Adaptado de Borzani, 2001).
Considere-se um meio de cultura líquido com uma fonte de energia adequada, os
nutrientes necessários, condições químicas e físicas favoráveis em sistema fechado
(exceto a troca de gases). Se nele inocularmos uma população de organismos e
seguirmos o seu crescimento ao longo do tempo conseguimos obter uma curva (Figura
3) que mostra as várias fases características do crescimento de populações microbianas
21
(Richmond, 2004).
1. Fase de adaptação (Fase Lag) (µ = µd, em que µd representa a taxa de
morte): trata-se de um período de adaptação das células extraídas de uma cultura em
fase exponencial ou estacionária para um meio fresco; esta fase é extensa na presença
de tóxicos, de nutrientes dificilmente metabolizáveis ou se o inóculo for de reduzida
dimensão ou inadequado. Também é a fase em que os microrganismos sintetizam as
enzimas necessárias ao metabolismo dos componentes presentes no meio (Borzani,
2001).
2. Fase de aceleração do crescimento (µ < µ máx): trata-se de um período
onde as células já estão adaptadas e começam a multiplicar-se; a taxa específica de
crescimento é inferior ao valor máximo. No início dessa fase nem todos os
microrganismos estão se multiplicando, porem o fim desta fase é marcado por todas as
células estarem se multiplicando (Borzani, 2001).
3. Fase de crescimento exponencial (µ = µ máx):fase de crescimento
acelerado onde o valor da taxa específica de crescimento se mantém constante,
atingindo o seu valor máximo. Nessas condições a equação abaixo permite concluir que
a velocidade de crescimento é diretamente proporcional a concentração x (de microalga),
isto é:
X .máx µ dx
dt
Onde: dt
dx é a velocidade do crescimento microalgal, x a concentração de
microalgas e µ máx velocidade especifica de crescimento da microalga
Integrando a equação anterior obteremos
) t- t (máx µ = X
Xln i
i
Sendo que Xi e ti são referentes a concentração e tempo no início desta fase.
22
Desse modo, pela expressão a cima uma representação semilogarítmica da
concentração celular com o tempo de cultivo deverá resultar em uma reta, valido até um
tc também denominado tempo crítico.
Ao lado da velocidade especifica µ máx, a fase exponencial também é
caracterizada frequentemente pelo tempo de geração tg, que é o intervalo de tempo
necessário para dobrar o valor da concentração celular. Aplicando X = 2 Xi e t – ti = tg
obtemos:
i
i
X
X.2ln µ máx . tg
Simplificando teremos que:
gt
693,0
t
2ln máx µ
g
Conclui-se que o tempo de geração é constante, pelo fato de µ máx ser
constante nesta fase. µ máx (Borzani, 2001).
4. Fase linear de crescimento por apresentar a velocidade de reprodução
constante, esta fase pode existe sem a previa da fase logarítmica, como é o caso de
microrganismo filamentosos onde há limitações no transporte de nutrientes do meio para
dentro da célula (Borzani, 2001). Considerando que Xc e tc são coordenadas do início da
fase linear e rk é a velocidade de reprodução constante nesta fase.
t
t
X
X
k
cc
dtrdX .
Trabalhando a equação obteremos:
ckckckc trXtrttrXX ..).(
Pela equação acima deduz-se que a concentração celular X é uma função linear
23
do tempo de cultivo t, justificando assim a denominação de crescimento linear. (Borzani,
2001).
A existência do crescimento linear indica, conforme mencionado, a presença de
certas limitações no transporte de nutrientes à interface microorganismo-meio como, por
exemplo, com respeito ao oxigênio dissolvido no meio.
5. Fase de desaceleração do crescimento (µ < µ máx):nesta fase a
concentração de um (ou mais) nutriente(s) no meio, tornar-se-á limitante, com o
consequente decréscimo da taxa específica de crescimento. Durante essa fase, o tempo
de geração tg aumenta no decurso do cultivo, pois nem todos os microorganismo se
reproduzem em intervalos regulares de tempo, as velocidades especificas e de
crescimento diminuem até se anularem no tempo tf. (Borzani, 2001).
6. Fase estacionária – As populações raramente conseguem manter um
crescimento exponencial a altas velocidades durante um largo período de tempo, visto
que o crescimento está limitado pelo esgotamento dos nutrientes ou pela acumulação de
produtos inibitórios do metabolismo. Como consequência a velocidade de crescimento
diminui e iguala a taxa de morte (µ = µd). A população de microrganismos mantém,
durante algum tempo, uma concentração aproximadamente constante de biomassa à
custa da utilização de reservas internas de nutrientes ou dos nutrientes que são
libertados para o meio devido à lise de outras células. Neste período a concentração X
atinge o valor máximo em Xm. (Borzani, 2001).
7. Fase de morte – A morte resulta do esgotamento de nutrientes da cultura de
microrganismos. Neste período acontece o chamado “lise”, autólise ou rompimento dos
microorganismo, provocado pela ação de enzimas intracelulares. (Borzani, 2001).
2.5. Sistema de cultivo
As microalgas podem ser cultivadas de diferentes formas, que são divididas
basicamente em dois grandes grupos: cultivos abertos e fechados. Os cultivos abertos
podem ser subdividos em águas naturais (lagos e lagoas) e lagos artificiais. Enquanto os
sistemas fechados são denominados fotobiorreatores.
24
2.5.1. Sistema aberto
As lagoas fotossintéticas são fotobiorreatores abertos, com profundidade
variando de 10 a 50 cm aproximadamente de modo que permita a difusão de dióxido de
carbono proveniente da atmosfera e a penetração da luz solar. São construídas em
cimento ou terra compactada impermeabilizada por plástico (CHISTI 2007). O tipo
raceway pond é o sistema mais comum, no qual a agitação da cultura é realizada por
agitação mecânica de pás, sendo utilizado para a produção industrial de microalgas das
espécies de Spirulina, Chlorella, Arthrospira platensis, Anabaena sp., Nannochloropsis e
Dunaliella ( JORQUERA et al., 2010; CHISTI, 2007).
Figura 4. Desenho esquemático de uma piscina raceway
Fonte: (CHISTI, 2007)
Sistema aberto temos grandes vantagens como o baixo custo de investimento e
operação, possibilidade de scale up, porem sua maior limitação está em não conseguir
controlar todo o processo, sistema não estéril causa alto risco de contaminação de outro
micro-organismo ou de um predador natural das microalgas diminuindo sua
produtividade. O clima tem um alto impacto no processo, a oscilação do clima causa em
uma mudança brusca na produtividade. O clima é responsável por fatores de extrema
importância no processo como CO2, tempo e quantidade de iluminação, evaporação. Por
ser um processo de difícil controle sua produtividade pode ser alterada podendo ter altas
e baixas produções sazonalmente.
25
2.5.2. Sistema fechado
Os sistemas fechados são chamados de fotobiorreatores, tem como principais
características o maior controle das variáveis de processo, são geralmente construídos
de acrílico ou vidro para uma melhor penetração da luz, há uma área maior de contato
com a luz, melhorando a eficiência da fotossíntese. Há controle da iluminação e da
intensidade da iluminação, seu meio é esterilizado o que evita contaminação de outros
microrganismos, controle da vazão de ar, CO2 permite uma maior produtividade
adaptando o meio de cultivo para otimizar o processo de acordo com a microalga
escolhida. Dentro os tipos de fotobioreatores os mais usados são flat-plate, em bubble
column ou tubulares.
Flate-plate
Fotobiorreatores de placa plana são usados para produção de biomassa de
microalgas tanto em sistema ao ar livre como sistemas indoor, pois apresentam
vantagens incluindo alta área superficial de iluminação, baixo acumulo de O2 dissolvido e
facilidade de escalonamento (Xi, Weathers et al., 2009).
Figura 5. Fotobiorreator airlift de placa plana
Fonte: (Xi, Weathers et al., 2009).
26
O controle da temperatura pode ser um problema neste tipo de reator geralmente
são usados sistema de asperção para refrigeração através da evaporação.
Tubular
Os fotobiorreatores tubulares consistem em conjuntos de tubos transparentes,
normalmente de vidro ou plástico, cujo diâmetro é inferior a 0,1 m, uma vez que é
necessária luz para que ocorra o processo de fotossíntese. Esse tipo de sistema está
sujeito ao acúmulo de altas concentrações de oxigênio, ao sobreaquecimento da cultura
e à formação de gradientes de pH (CHISTI, 2007; GRIMA et al., 1999). Dessa forma, um
desgaseificador é habitualmente acoplado aos tubos, tendo como propósito não só a
remoção do oxigênio mas também o arrefecimento da cultura. Como a estrutura tubular
aumenta a área iluminada, as produtividades são elevadas.
Figura 6. Desenho esquemático do sistema tubular
Fonte: (CHISTI, 2007)
27
Bubble column
O fotobioreatore bubble column tem um princípio parecido com o flat-plate, usam
um fluxo de ar distribuídos em bolhas que agitam o meio, tornando-o homogêneo. O
formato cilíndrico do reator permite altere a intensidade da luz conforme a distância da
fonte luminosa o que contribui para que as células residam em alta ou baixa intensidade
de luz. Embora apresentem altas produtividades, há uma possibilidade limitada de
aumentar a escala para instalações industriais devido à altura do reator e a profundidade
da cultura (GRIMA et al., 1999).
Figura 7. Fotobioreator bubble column
Fonte: (GRIMA et al., 1999)
Na tabela 2 está apresentado um comparativo de diferentes características entre
sistemas abertos e fotobiorreatores estimando uma produtividade anual de biomassa de
100.000 kg. Com base nessa estimativa, observa-se que os sistemas fechados se
destacam quanto a menor área necessária, o maior rendimento de óleo e a facilidade de
controle de parâmetros e processo quando comparado aos sistemas abertos.
28
Tabela 2. Comparativo entre sistema aberto e sistema fechado de cultivo de
micro alga.
Fonte: Adaptado Mariano e Vargas (2010)
2.6. Fatores que influenciam o crescimento celular
As microalgas no ambiente natural estão expostas a uma variedade de condições
ambientais. Estas condições sofrem variações segundos dois ciclos: o circadiano
(variações de luz e temperatura num ciclo de 24h) e o sazonal (variação anual que está
dependente da zona geográfica e climática). A capacidade de adaptação é a chave da
resiliência destes organismos. Por vezes as reações de aclimatação incluem mudanças
nos fenómenos de formação e degradação dos fotosistemas, em resposta às alterações
na qualidade e intensidade da luz. Estes fotosistemas são complexos proteicos (enzimas)
que utilizam a energia luminosa para reduzir as moléculas durante a fotossíntese
(Richmond, 2004). Estas mudanças permitem equilibrar a produção de adenosina
trifosfato (ATP) para evitar o aumento de stress celular.
As culturas de microalgas requerem o controlo rigoroso de todos os fatores de
crescimento: nutrientes, pH, temperatura, concentração de CO2, O2, e luz. Para otimizar
o crescimento é necessário compreender o comportamento dos microrganismos sob
diferentes condições ambientais.
Nutrientes (suplementação)
Segundo Lourenço (2006) os macronutrientes apresentam diversas funções em
29
algas marinhas por serem constituintes estruturais abundantes de biomoléculas, de
membranas e do meio intracelular, por participarem de processos de trocas de energia e
por regularem atividades metabólicas dentre outras funções relevantes.
Dentre os macronutrientes, o nitrogênio é extremamente importante para as
algas por ser componente fundamental de classes de substâncias estruturais das células,
como ácidos nucleicos e proteínas (LOURENÇO et al., 2004). A deficiência de nitrogênio
no meio de cultivo tende a afetar a síntese e acúmulo de lipídeos totais nas células
microalgais (VERMA et al., 2010).
Assim como o nitrogênio, o fósforo é considerado um dos principais elementos
limitantes às microalgas, estando associado em todos os processos que envolvem trocas
energéticas nas células, como síntese de ATP, açúcares fosfatados, ácidos nucléicos e
fosfoenzimas (LOURENÇO, 2006).
Luz
A luz é um fator importante no cultivo, visto que as microalgas são seres
fotossintetizantes. No cultivo de microalgas, a demanda por luz aumenta com o passar do
tempo. Dessa forma, uma correta suplementação de luz é necessária para um
crescimento adequado das microalgas. Uma alta suplementação luminosa na fase inicial
de crescimento pode causar foto-inibição. (Soares, 2010).
Aeração
A aeração dos cultivos, também é um fator limitante, pois impede que as células
sedimentem, mantendo-as em suspensão. Além disso, o sistema permanece homogêneo
e todas as células são expostas as mesmas condições de cultivo. Essa aeração pode ser
realizada por um sistema de agitação mecânico (pás) em sistemas abertos, sistema de
bombas, reciclo e distribuição de bolhas pelo reator fechado.
Com a aeração de um gás contendo CO2 podemos controlar as concentrações
de CO2 no reator fechado, assim como o pH visto que CO2 + H2o = H2CO3 acidificando o
meio.
30
A aeração também ajuda no processo de respiração microbiana, deixando o meio
homogêneo facilita a dissociação do O2 no meio facilitando a troca de gases do
microorganismo com o meio. (Borzani, 2001).
Temperatura
O crescimento celular e a porcentagem lipídica são fortemente afetados pela
temperatura, dependendo da espécie, ao aumentar a temperatura observa-se o aumento
no teor de lipídeos (VERMA et al, 2010).
Microalgas da espécie Chlorella são boas produtoras de lipídeos quando
cultivadas a temperaturas entre 25 a 30°C, embora sejam capazes de crescer em
temperaturas a partir de 16°C (SUALI; SARBATLY, 2012)..
2.7. Síntese de lipídeos em microalgas
Segundo Lourenço (2006) os lipídeos de algas são constituídos de glicerol,
açúcares ou bases esterificadas em ácidos graxos saturados (AGS) ou insaturados (AGI)
e desempenham inúmeras funções biológicas como, por exemplo, isolantes térmicos e
componentes de reservas de energia.
As microalgas sintetizam os lipídeos a partir da fonte de carbono, seja inorgânico
(CO2) ou orgânico (glicose, acetato, etc.). Os componentes e os teores de lipídeos nas
células das microalgas variam de espécie para espécie, sendo divididos basicamente em
lipídeos neutros (triglicerídeos e colesterol) e lipídeos polares como os fosfolipídeos. Os
lipídeos neutros como os triglicerídeos são considerados como o principal material para a
produção do biodiesel (HUANG et al., 2010).
O teor de óleo comumente encontrado nas microalgas situa-se na faixa de 20 a
50%, porém espécies de microalgas como a Botryococcus braunii podem produzir teores
de lipídeos em torno de 75%, assim como a espécie Schizochytrium sp. pode atingir
teores de lipídeos próximos a 77% conforme apresentado na Tabela 3, porém com baixa
produtividade de biomassa. Entretanto espécies como a Chlorella vulgaris, requerem
menor tempo de cultivo e apresentam alta produtividade celular, porém atingem
31
quantidades de lipídeos inferiores a 20% (CHISTHI, 2007; BRENNAN; OWENDE, 2010).
Tabela 3. Espécies produtoras de lipídeos e suas respectivas porcentagens em
relação a massa seca.
Espécies Conteúdo
de óleo (% em massa seca)
Botryococcus braunii 25 – 75
Chlorella sp. 28 – 32
Crypthecodinuim cohnii 20
Cylindrotheca sp. 16 – 37
Dunaliella primolecta 23
Isochysis sp. 25 – 33
Monallanthus salina >20
Nannochloris sp. 20 – 35
Nannochloropsis sp. 31 – 68
Neochloris oleoabundans 35 – 54
Nitzschia sp. 45 – 47
Phaeodactylum tricornutum
20 – 30
Schizochytrium sp. 50 – 77
Tetraselmis sueica 15 – 23
Fonte: (CHISTHI, 2007).
Além do teor lipídico, deve-se atentar ao perfil dos ácidos graxos presentes no
32
material lipídico, uma vez que, características estruturais das moléculas de ácidos graxos
como o comprimento da cadeia, o grau de instauração e a presença de ramificações
refletem propriedades finais ao biodiesel, determinando assim a sua qualidade (KNOTHE
et al., 2003).
De um modo geral, biodiesel oriundo de lipídeos que possuem em sua
composição elevadas quantidades de ácidos graxos de cadeia insaturada, com destaque
para os ácidos linoleico (C18:2) e linolênico (C18:3) provocam problemas na ignição do
combustível, auto-oxidação e entupimentos de filtros no motor que implicam em falhas no
funcionamento do motor. Entretanto composições lipídicas ricas em ácidos graxos
saturados, em especial os ácidos palmíticos (C16:0) e esteárico (C18:0) conferem ao
biodiesel uma boa qualidade como uma ignição adequada e estabilidade de operação.
(KNOTHE et al., 2005; RAMOS et al., 2005).
2.8. Monitoramento do crescimento celular
Em um cultivo descontínuo de microalgas, o tempo de crescimento pode variar
de acordo com as condições impostas, sendo que o acompanhamento do
desenvolvimento celular faz-se essencial para determinar o momento ótimo para coleta
da biomassa formada. Os principais métodos utilizados para acompanhar o crescimento
celular é a contagem de células por microscopia e a medida da densidade óptica por
espectrofotometria (LOURENÇO, 2006).
A Contagem direta por microscopia é a técnica mais simples e tradicional para
monitorar o crescimento de microalgas, por intermédio de uma câmara de contagem,
como por exemplo, uma câmara de Neubauer, um número de células algáceas presentes
em um determinado volume é contado com o auxílio de um microscópio ótico com
capacidade de aumento de pelo menos 400 vezes. Nas contagens em microscópio, a
densidade de indivíduos é geralmente expressa como o número de células por mililitro de
cultivo (LOURENÇO, 2006).
O crescimento de microalgas pelo uso da densidade óptica se baseia na
obstrução física da luz pelas células, quanto mais células estiverem presentes na
amostra maior será a absorção de luz e menor será a passagem da luz pela amostra.
33
Utiliza-se um espectrofotômetro para realizar as medições de um cultivo de microalgas
num comprimento de onda de 690nm (LOURENÇO, 2006).
2.9. Planejamento de experimentos
Planejamento de experimentos é definido como um conjunto de técnicas
estatísticas aplicadas ao planejamento, condução, análise e interpretação de testes
controlados, buscando encontrar e definir fatores que influenciam os valores de um
parâmetro ou um grupo de parâmetros (BRUNS et al., 2003). Seu princípio básico
permite variar de uma só vez todos os níveis de todas as variáveis, discretas ou
contínuas, de maneira programada e racional, diminuindo o número de experimentos
sem que ocorra a limitação do número de fatores a ser analisados.
Coleman & Montgomery (1993) propõem as seguintes etapas para o
desenvolvimento de um Planejamento de Experimentos na Indústria:
Caracterização do problema
Escolha dos fatores de influência e níveis
Seleção das variáveis de resposta
Determinação de um modelo de planejamento de experimento
Condução do experimento
Análise dos dados
Conclusões e recomendações
Um experimento planejado é um teste, ou série de testes, no qual são feitas
mudanças propositais nas variáveis de entrada de um processo, de modo a podermos
observar e identificar mudanças correspondentes na resposta. O processo pode ser
visualizado como uma combinação de máquinas, métodos e pessoas, que transforma um
material de entrada em um produto.
34
Este produto de pode ter uma ou mais características de qualidade observáveis.
Algumas das variáveis do processo são controláveis, enquanto outras são não
controláveis. Algumas vezes, esses fatores não controláveis são chamados fatores ruído.
Todas essas características devem ser analisadas para o planejamento do experimento,
incluindo ainda a especificação do objetivo do estudo.
Há muitos poucos trabalhos que utilizaram o planejamento de experimento com o
método Taguchi aplicados a análise do crescimento de micro-organismo, dentro os
trabalhos pesquisados, vale a pena destacar: a dissertação de mestrado do Mateus de
Souza Amaral e a tese de doutorado de Patrícia Caroline Molgero da Rós. Onde
demostraram a importância do planejamento de experimento na redução de quantidade
de experimento e na melhor qualidade de análise das variáveis em níveis.
2.9.1. Método de Taguchi
O método de Taguchi é uma aplicação sistemática de planejamento de
experimentos. Esta técnica de Genichi Taguchi, que foi projetada visando
especificamente aperfeiçoar a qualidade dos manufaturados japoneses no período pós-
guerra, em conjunto com a análise de variância (ANOVA), tem sido extremamente bem
sucedida. Pode ser utilizada para otimizar qualquer processo complexo (ROSA, et al.,
2009).
De acordo com Barrado et al. (1996), a aplicação do Método de Taguchi consiste
em:
Selecionar as variáveis resposta, a serem otimizadas;
Identificar os fatores (variáveis de entrada) e escolher os seus níveis;
Selecionar o arranjo ortogonal apropriado conforme literatura (TAGUCHI; KONISH,
1987);
Executar os experimentos de maneira aleatória para evitar a incorporação de erros
sistemáticos;
Analisar os resultados utilizando a relação sinal-ruído (S/N) e análise de variância
(ANOVA);
35
Determinar o melhor ajuste dos parâmetros
Quando são utilizados os recursos estatísticos num planejamento de
experimentos, torna-se necessário ter uma ideia clara do objetivo do estudo, de forma a
realizar uma coleta de dados apropriados para posterior análise. O cumprimento de 4
etapas é de fundamental importância: planejamento; execução dos experimentos; análise
dos dados e conclusão.
Em um processo o desempenho pode ser comprometido por fatores controláveis
e não controláveis. As variáveis controláveis são os parâmetros do processo, enquanto
que variáveis não controláveis são os sinais-ruído, ou seja, fatores que interferem na
variabilidade experimental (YANG; HWANG; LEE, 2002). A Figura 8 apresenta ilustra um
diagrama de processo.
Figura 8. Fatores influentes em um processo
Fonte: (YANG; HWANG; LEE, 2002).
Identificação do problema: Estudo de variáveis resposta específicas num
processo analítico e a análise dos efeitos principais e das interações das variáveis mais
importantes.
Escolha dos fatores e dos níveis.
Seleção da Variável Resposta.
Na etapa da execução do experimento, faz-se a aplicação de todos os
36
procedimentos e premissas propostas, monitorando a sua aplicação para verificar se não
estão ocorrendo erros que invalidarão o experimento. Na análise dos dados são
utilizados métodos estatísticos que permitirão maior objetividade à tomada de decisão.
Na conclusão, a utilização de gráficos permite uma melhor apresentação dos resultados.
Os fatores de controle que contribuem na redução de variação (aperfeiçoamento
da qualidade) podem ser rapidamente identificados, observando o quanto de variação
aparece como resposta. Taguchi idealizou uma transformação dos dados da repetição
em outro valor, que representa a medição da variação existente. A transformação é
designada como razão sinal-ruído (S/R). A razão S/R combina diversas repetições
(exigem-se no mínimo, dois valores observados) em um valor que reflete o quanto de
variação está presente. Existem diversas razões S/R disponíveis, de acordo com o tipo
de característica; menor-é-melhor (meM), nominal-é-melhor (noM) e maior-é-melhor
(MeM).
A razão S/R é tratada como resultado do experimento, que constitui uma medida
da variação dentro de um ensaio quando os fatores de ruído estão presentes. Se um
arranjo externo é empregado, a variação de ruído é estimulada num experimento; porém,
com repetições simples (sem arranjo externo), a variação de ruído não sofre estímulo. A
relação S/R consiste num resultado que concentra as repetições e o efeito dos níveis de
ruído em um único valor observado. A ANOVA padrão pode ser realizada de acordo com
a relação S/R, que identificará fatores significativos para aumento do valor médio de S/R
e, subsequentemente, redução da variação.
No estudo estatístico do método de Taguchi é aplicada a análise de variância
(ANOVA), a fim de avaliar a significância dos parâmetros utilizados no processo (ROSA
et al., 2009).
37
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
3.1.1 Microalgas
Todos os experimentos foram realizados com a linhagem da microalga marinha
Chlorella sp, (chlor-CF) isolada em Cabo Frio, pertencente ao Banco de Algas Marinhas
do Instituto Oceanográfico da USP, gentilmente doada pelo Departamento de
Oceanografia Biológica do Instituto Oceanográfico da USP, São Paulo.
3.1.2 Fotobioreatores
Os experimentos foram realizados em fotobioreator composto por três
Erlenmeyer de 500 ml, sistema batelada dispostos em uma bancada. Com uma fonte de
luz de 6 lâmpadas fluorescentes de 40 w ligada 24 horas por dia. Sistema de aeração foi
realizado por uma bomba com ar filtrado (retirada de sólidos presentes no ar) sua vazão
foi controlada por difusores de ar, distribuídos igualmente nos três elenmeyer afim de
homogeneizar o meio e promover a fixação do CO2 atmosférico e retirada do excesso de
O2 produzidos na fotossíntese. Este fotobioreator foi instalado em uma sala com controle
de temperatura realizado por um ar condicionado/ aquecedor mantendo a temperatura
constante. A distribuição do ar é feita por pedra porosa que está dentro do fotobioreator a
fim de distribuir uniformemente o fluxo de ar e formar bolhas de um tamanho especifico
para melhor absorção de CO2 para as microalgas.
38
Figura 9. Esquema do fotoreator de 500 ml
Fonte: Autoria própria
3.1.3 Meio de cultivo
Os experimentos foram realizados em Erlenmeyer de 500 ml, sistema batelada
onde não será alterada a concentração de nutrientes durante o experimento. Antes de
inoculo é preparado o meio de cultivo GUILLARD F/2 MODIFICADO seguindo a tabela 4.
Tabela 4. Composição do meio de cultivo GUILLARD F/2 (suplementação)
Reagentes Concentração
Sal marinho 33,3 g/l
NaNO3 75g/l
NaH2PO4. H2O 5g/l
FeCl3.6H2O 3,15g/l
Na2EDTA 4,3g/l
ZnSO4. 7H2O 22,2mg/l
MnCl2. 4H2O 180mg/l
39
Na2MoO4. 2H2O 6,3mg/l
CoCl2. 6H2O 10mg/l
CuSO4.5H2O 9,8mg/l
Tiamina(B1) 100mg/l
Cianocobalamina (B12) 0,5mg/l
Biotina (B7) 0,5mg/l
Fonte: (GUILLARD 1975)
No preparo do meio de cultivo foram adicionados o sal marinho, solução de
nitrato, fosfato e traços de metais (compostas pelos sais de metais citado na tabela 4.).
Esse meio foi esterilizado em uma autoclave há 120º C e 0,5 atmosfera (pressão) por 20
minutos, a solução de vitamina foi adicionada após a esterilização devido a degradação
das vitaminas na temperatura da autoclave (120ºC), após a adição das vitaminas no meio
podemos inocular.
O meio f é considerado o dobro da concentração dos nutrientes da tabela 4.
Figura 10. Imagem do interior do autoclave 04 com o meio para estelizar.
40
Fonte: Autoria própria
As soluções estoque utilizadas na preparação do meio de cultivo foram
autoclavadas a 0,5 atm de pressão e 120˚C de temperatura, com exceção da solução de
vitaminas, que foi esterilizada por meio de filtros com poros de 0,22µm para evitar
degradação térmica (HARRISON; BERGES, 2005).
As soluções estoque foram preparadas com auxílio de uma balança analítica e
armazenadas em uma geladeira a fim de evitar contaminações ou degradação das
soluções.
3.2 Métodos
3.2.1. Manutenção da cepa
Para a manutenção da cepa foi confeccionado uma caixa de madeira provida com
uma lâmpada fluorescente de 15W ligada a um temporizador que controlou o fotoperíodo
em 12 h: 12 h luz/escuro, na qual pequenos volumes da cepa microalgal foram mantidas
a fim de fornecer células durante todo o período de experimentos. A Figura 11. Ilustra o
aparato utilizado para a manutenção da cepa.
Figura 11. Imagem do cepário
Fonte: (AMARAL2014)
Para a manutenção de um banco de células independentemente dos inóculos
preparados para os experimentos, foram adotados os seguintes procedimentos:
41
Repicagens em erlenmeyers de 125 mL (volume útil de 100mL): temperatura de
22 ±1 ˚C, fotoperíodo de 12 h: 12 h luz/escuro e luminosidade média de 4,8 klux,
dependendo da localização dos frascos na incubadora. Foram mantidos sempre quatro
erlenmeyers, gerados por repicagens com intervalos entre 10 a 15 dias. Cada repicagem
foi realizada na proporção de 1:10 (10mL da cultura antecessora para 90mL de meio de
cultura novo). Os tubos foram agitados suavemente de forma manual uma vez ao dia.
Figura 12. Esquema de repicagem em erlenmeyers de 125ml
Fonte: (AMARAL2014)
3.2.2.Experimento
A solução, para o inóculo do elenmeyer de 500ml, foi retirado de um repique
recente de 125ml, onde as algas se encontram na fase exponencial, entre 3 e 5 dias
após a inoculação. Esta fase é muito importante para o crescimento das algas, também
para melhor controle do processo será utilizado a mesma solução de repique na triplicata.
Figura 13. Soluções depois de esterilizadas e destampadas para adição da
vitaminas.
42
Fonte: Autoria própria
Após a esterilização do meio de cultivo e adição da solução de vitaminas, o
inoculo é realizado a uma proporção de 1:10 (volume do inoculo: volume do reator),
realizado em triplicatas no fotobioreator descrito 3.1.2.
Figura 14. Fotobioreatores logo após a inoculação.
Fonte: Autoria própria
O experimento foi realizado em uma sala fechada e climatizada por um
condicionador de ar tipo Split com refrigeração e aquecimento mantido por 24h ligado.
O intuito deste trabalho foi estudar as variáveis no crescimento das microalgas,
sendo otimizadas pelo metodo taguchi L4, sendo as variáveis de entrada:
1. Suplementação do meio: composta pela adição de nitratos, fosfatos,
solução de vitaminas e solução de traços de metais conforme 4.1.3.
43
2. Vazão de ar comprimido (VVM): realizado por uma bomba de aquário,
com vazão controlada por uma válvula de vazão de ar.
3. Temperatura: Controlada através de um condicionador de ar tipo split
marca LG eletronics modelo snh072ynw0 tensão 220v Refrigeração +
aquecimento.
Níveis das variáveis
As condições de operação foram baseadas em pesquisas bibliográficas e
montado um sistema para estudar os fatores de interesse em 2 níveis, na Tabela 5.
Tabela 5. níveis das variáveis
Fatores Níveis 1 2
Suplementação (A) f/2 f
VVM (B) 4/min 10/min
Temperatura (C) 20ºC 30ºC
Fonte: Autoria própria
Foi utilizado um planejamento fatorial L4 em triplicata, na qual os conjuntos de
dados serão obtidos através de uma matriz ortogonal de Taguchi L4, conforme, com as
variáveis de entrada, como: Suplementação, VVM e temperatura.
44
Figura 15. Simulação do Taguchi L4 no Minitab 17.
Fonte: Autoria própria
3.2.3. Analise da resposta do processo
Para analisar os dados obtidos no processo foi utilizado o software Minitab 17,
utilizando a funções: Taguchi, Main Efect Plot e Interation Plot.
A função Taguchi simula a quantidades de fatores a serem analisados e quantos
níveis sera trabalhado, no caso desta tese com base na bibliografia 3 fatores (A, B e C) e
cada fator em 2 niveis diferentes. Nesta função você adequa a quantidade de fatores por
quantidade de níveis que foram abordados, no caso desta tese o ideal foi a L4.
O gráfico Main efect plot mostra qual foi a diferença das médias de cada nível em
relação à média do processo, demostrando para cada fator os 2 niveis podemos analisar
por ele quem estava acima da média do processo e quem estava abaixo.
45
A variável resposta do processo foi o crescimento celular da microalga. O
controle do desenvolvimento da cultura foi realizado por:
Análise no Espectrofotômetro
O crescimento microalgal foi acompanhado por análise de absorbância em
espectrofotômetro UV-Vis modelo Bel Photonics, selecionando o comprimento de onda
de 570nm na qual uma alíquota de 4ml será coletada de formar a caracterizar as fases
de crescimento, descrito no 3.5, para a realização das leituras em triplicata.
(LOURENÇO, 2006).
4. Resultado e discussão
4.1 Concentração de microalga inicial
Para determinar a concentração de microalga no início do experimento tomamos
por base a literatura. De acordo com a literatura constatou que a concentração ideal de
microalga de 3 x 106 células de microalga para inocular (Amaral,2014).
Portanto no experimento realizado mantivemos uma diluição de 1:10 mantendo a
mesma concentração de células no inoculo dos experimentos. Para evitar gerar
condições diferentes no fotobioreatores.
4.2 Determinação da relação entre contagem celular e absorbância
Para acompanhar o crescimento celular de cada cultivo foi realizada a
comparação do método de contagem em câmara de Neubauer com o método de
Espectrofotômetro UV/Visível. (Amaral,2014).
A partir dos dados obtidos pelas análises microscópicas e espectrofotométricas
de cada solução de diferente concentração, foi possível plotar a curva analítica
relacionando a absorbância e a contagem celular apresentada na Figura 16
(Amaral,2014).
46
Figura 16. Curva que relaciona absorbância e contagem celular
Fonte: (Amaral,2014).
Segundo o gráfico a relação de absorbância e contagem celular é uma relação
linear com o coeficiente de reta muito próximo de 1, o que nos mostra a linearidade do
sistema.
Plotado no gráfico o valor de 4 x 106 células de microalga obtivemos o valor de
aproximadamente 0,155 de absorbância. Utilizado este valor como referência para
inocular os fotobioreatores.
4.3 Planejamento do experimento
Conforme planejado foi realizado os experimentos com o objetivo de estudar o
crescimento da microalga Chorella sp, para isto utilizamos o método Taguchi (L4) para
analisar as três principais variáveis (Temperatura, Suplementação e Vvm) em dois níveis
diferentes (para cada variável) segundo a literatura eram os níveis mais importantes de
serem utilizados.
O cultivo foi realizado em triplicatas para reduzir os erros, em fotobioreatores
idênticos com de mesmo volume, formato e material. Mantido constante durante cada
experimento: a fonte de luz, a temperatura, a vazão de ar.
47
O início do experimento foi realizado após a esterilização dos fotobiareatores já
com a suplementação sem as vitaminas para evitar a degradação. Cada fotobioreator foi
tratado como uma batelada. E suas triplicatas foram somadas e dividas por 3 para
resultar em uma média.
O fim de cada um dos experimentos foi dado após a caracterização das fases da
curva do crescimento de microrganismos, quando chega na fase morte onde houve a
perder de uma pequena parte de células microalgal.
O seu crescimento foi acompanhado diariamente, onde foram feitas três leituras
diárias da absorbância e traçado a curva de absorbância x tempo, a fim de caracterizar
as fases do crescimento da microalga.
Tabela 6. Planejamento de experimento Taguchi L4
Experimento Suplementação Vvm Temperatura
1 Nivel 1 (f/2) Nivel 1 (4/min) Nivel 1 (20ºC)
2 Nivel 1 (f/2) Nivel 2 (10/min) Nivel 2 (30ºC)
3 Nivel 2 (f) Nivel 1 (4/min) Nivel 2 (30ºC)
4 Nivel 2 (f) Nivel 2 (10/min) Nivel 1 (20ºC)
Fonte: Autoria própria
48
O experimento 1 foi realizado com a temperatura em 20ºC, a vvm de 4 /min e a
suplementação do meio em f/2. Lida as absorbâncias e traçada a curva abaixo.
Figura 17. Curva da absorbância x tempo do experimento 1.
Fonte: Autoria própria
O experimento 2 foi realizado com a temperatura em 30ºC, a vvm de 10 /min e a
49
suplementação do meio em f/2. Lida as absorbâncias e traçada a curva abaixo.
Figura 18. Curva da absorbância x tempo do experimento 2.
Fonte: Autoria própria
O experimento 3 foi realizado com a temperatura em 30ºC, a vvm de 4 /min e a
suplementação do meio em f. Lida as absorbâncias e traçada a curva abaixo.
50
Figura 19. Curva da absorbância x tempo do experimento 3.
Fonte: Autoria própria
O experimento 4 foi realizado com a temperatura em 20ºC, a vvm de 10 /min e a
suplementação do meio em f. Lida as absorbâncias e traçada a curva abaixo.
51
Figura 20. Curva da absorbância x tempo do experimento 4.
Fonte: Autoria própria
As médias de cada experimento foram ordenadas e tabeladas abaixo:
Tabela 7. Comparação das médias das absorbâncias dos experimentos
Dias Horas Exp1 Exp2 Exp3 Exp4
0 0 0,180 0,154 0,151 0,189
1 8 0,184 0,150 0,152 0,192
16 0,202 0,167 0,158 0,193
24 0,227 0,225 0,162 0,195
2 32 0,280 0,300 0,175 0,203
40 0,404 0,403 0,212 0,233
48 0,552 0,458 0,261 0,241
3 56 0,636 0,482 0,302 0,270
64 0,697 0,533 0,388 0,332
52
72 0,744 0,538 0,547 0,362
4 80 0,776 0,552 0,628 0,463
88 0,789 0,560 0,643 0,502
96 0,789 0,573 0,673 0,618
5 104 0,746 0,590 0,740 0,627
112 0,812 0,601 0,761 0,731
120 0,822 0,590 0,768 0,809
6 128 0,839 0,615 0,777 0,845
136 0,823 0,630 0,790 0,856
144 0,841 0,640 0,807 0,868
7 152 0,860 0,650 0,820 0,900
160 0,889 0,680 0,840 0,930
168 0,925 0,690 0,850 1,008
8 176 0,920 0,670 0,868 0,973
184 0,911 0,672 0,866 0,969
192 0,930 0,676 0,869 0,983
9 200 0,946 0,680 0,861 1,004
208 0,940 0,690 0,852 1,033
216 0,955 0,695 0,852 1,015
10 224 0,967 0,700 0,866 1,027
232 0,970 0,710 0,862 1,067
240 0,950 0,720 0,876 1,063
11 248 0,980 0,737 0,883 1,067
256 0,990 0,740 0,903 1,083
264 1,000 0,745 0,899 1,100
12 272 1,050 0,750 0,907 1,133
280 1,079 0,770 0,922 1,146
288 1,080 0,760 0,920 1,167
13 296 1,150 0,765 0,930 1,198
304 1,160 0,777 0,933 1,231
312 1,130 0,780 0,941 1,234
14 320 1,128 0,787 0,944 1,248
328 1,120 0,780 0,960 1,256
336 1,127 0,790 0,950 1,262
15 344 1,113 0,800 0,970 1,262
352 1,110 0,820 0,980 1,244
360 1,110 0,815 0,975 1,207
16 368 1,110 0,831 0,990 1,223
376 1,100 0,830 0,980 1,217
53
384 1,086 0,840 0,986 1,193
17 392 1,076 0,845 0,992 1,200
400 1,083 0,840 0,990 1,190
408 1,076 0,838 0,982 1,213
18 416 1,073 0,834 0,969 1,207
424 1,066 0,833 0,965 1,197
432 1,063 0,830 0,960 1,183
Fonte: Autoria própria
Para uma melhor visualização dos gráficos, foi realizado um comparativo entres
os 4 experimentos em um gráfico de absorbancia x tempo.
Figura 21. Curva da absorbância x tempo dos experimentos
Fonte: Autoria própria
Com base no gráfico comparativo podemos dizer que uma ótima opção de
crescimento de cultivo foi o realizado no experimento 4 que alcançou seu máximo em
336 h ou 14 dias, com uma absorbância média de 1,262. O experimento 4 foi o que mais
produziu biomassa de microalga devido sua maior absorbância.
Porém o experimento 1 foi o mais rápido a alcançar uma absorbância média
54
considerável de 0,789 em 96h. O experimento alcançou a fase exponencial mais
rapidamente do que os outros.
A diferença entre eles, o mais rápido e a melhor absorbância, foram a vazão de
ar (Q/vm vazão de ar por volume do meio) e a suplementação, neste caso podemos notar
que o excesso de substrato causa uma inibição no crescimento da microalga, e podemos
observar isto nos experimentos 4 e 3 onde tínhamos a suplementação em dobro o
esperado seria considerar o dobro de concentração celular o que não foi observado.
Portanto há outros limitantes no transporte desse substrato para a microalga.
4.4. Analise de fases do crescimento da microalga
Após o plotar o gráfico de crescimento celular x tempo podemos analisar o
crescimento do microorganismo pelas fases descritas no item 2.4.
Figura 22. Curva de concentração celular do experimento 1
Fonte: Autoria própria
Traçada através da curva de de concentração celular x absorbância descrita no
item 4.2
55
Figura 23. Analise das fases do crescimento de microorganismos
Fonte: Autoria própria
O experimento 1 foi um gráfico onde podemos observar todas as fases do
crescimento de um microrganismo, assim podemos descrever mais sobre o que cada
fase que representou em seu crescimento.
Fase Lag: representado pelo número 1 na Figura 23 foi uma fase de adaptação
das microalgas ao novo cultivo, que possuía condições diferentes da solução original,
nesta fase as microalgas sintetizam as enzimas necessárias ao metabolismo dos
componentes presentes no meio.
Fase aceleramento do crescimento: representado pelo número 2 na Figura 23
foi o início do crescimento das microalgas, no início desta fase as células estão
56
adaptadas ao meio e começam a se multiplicar, o fim desta fase é marcado por todos os
microrganismos estarem se multiplicando.
Fase de crescimento exponencial: representado pelo número 3 na Figura 23,
podemos descrever esta fase como a fase onde há a máxima taxa especifica de
crescimento que se mantem constante até o fim desta fase, uma reta inclinada
representa bem esta fase. O fim desta fase é determinado pelo fim da velocidade máxima
de crescimento. Nesta fase não há falta ou deficiência de nenhum nutriente ou do
transporte dele para a microalga.
Fase linear de crescimento: representado pelo número 4 na Figura 23, a
velocidade de reprodução é constante e menor que a máxima, graficamente
representada por uma reta menos inclinada que a fase anterior devido sua menor taxa de
crescimento. Esta fase indica a presença de certas limitações no transporte de nutrientes
a interface microrganismos – meio, podendo citar por exemplo o oxigênio e dióxido de
carbono dissolvido no meio.
Fase de desaceleramento do crescimento: representado pelo número 5 na
Figura 23, nesta fase a concentração de um ou mais nutrientes no meio se torna o
limitante do crescimento, com isso temos um decréscimo do crescimento.
Fase estacionaria: representado pelo número 6 na Figura 23, um ponto
marcante desta fase é o esgotamento de um ou mais nutrientes, como consequência a
taxa de crescimento iguala a taxa de morte isto é a concentração de microalgas se
manteve praticamente constante. Para se nutrir as microalgas utilizam de reservas de
nutrientes ou algumas células podem sofrer de lise, liberando no meio os nutrientes dela
no meio para as necessidades das outras.
Fase morte: representado pelo número 7 na Figura 23, A morte resulta do
esgotamento de nutrientes da cultura de microrganismos. Neste período acontece o
chamado “lise”, autólise ou rompimento dos microorganismo, provocado pela ação de
enzimas intracelulares
57
4.5. Analise dos resultados Taguchi L4
A análise dos dados, obtidos na matriz L4 Taguchi, foram analisadas usando o
programa minitab 17, onde foi gerado um modelo matemático, sendo feita a comparação
dos dados, o efeito de cada variável e sua importância. Neste caso a resposta do
processo foi a concentração celular máxima de cada experimento (absorbância) antes da
fase de morte em torno de 336h.
Tabela 8. Níveis das variáveis
Fatores Níveis 1 2
Suplementação (A) f/2 f
VVM (B) 4/min 10/min
Temperatura (C) 20ºC 30ºC
Fonte: Autoria própria
Tabela 9. Planejamento de experimento Taguchi L4
Experimento A B C Absorbância
1 Nivel 1 Nivel 1 Nivel 1 1,127
2 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 2 0,830
3 Nivel 2 Nivel 1 Nivel 2 0,960
4 Nivel 2 Nivel 2 Nivel 1 1,267
Fonte: Autoria própria
58
4.5.1 Analise do gráfico dos efeitos principais (main effect)
Para analisarmos o fator resposta do Taguchi utilizei a ferramenta main effects
plot do minitab 17, essa ferramenta analisa os fatores em relação as absorbâncias e a
média entre as absorbâncias.
Figura 24. Main effect plot
Fonte: Autoria própria
Analisando a relação dos fatores e seus níveis em relação à média das
absorbâncias podemos ver que o fator C tem uma relação grande de diferenças entre
médias, isto é, neste estudo e nessas condições a temperatura foi o fator separadamente
que mais alterou o crescimento das microalgas. Notamos isso pela inclinação da reta
entre o nível 1 e nível 2, quanto maior inclinação maior a diferença entre as médias,
buscamos a melhor condição para aumentar a absorbância, neste caso o fator c na
condição 1 seria melhor a opção.
O fator A de suplementação percebemos que possui uma grande importância
59
também, um pouco menos que a temperatura mas seu destaque é grande, a reta está
inclinada, o nível ideia seria o 2 para maximizar a produção.
Já o fator B tem uma ligeira importância mas não altera muito das médias o nível
1 ou 2, mesmo assim o nível 2 seria o melhor pelo gráfico. A diferença entre eles não é
significativamente suficiente considerado sozinho.
Só que não podemos considerar os níveis separados precisamos ver qual é a
interação entre os fatores, as vezes a interação entre os fatores gera uma resposta bem
diferente no processo.
4.5.2 Analise do gráfico da interação das variáveis (interaction plot)
Para analisar a interação entre os fatores, utilize o interaction plot do minitab 17,
a função desse gráfico é comparar a interação entre 2 ou mais fatores em 2 ou mais
níveis, neste caso serão 3 fatores em 2 níveis para cada.
No gráfico se a relação for paralela entre os fatores não há interação entre eles,
ou seja, um não interage com o outro, já se for cruzado as retas há interação e precisa
analisar caso por caso.
60
Figura 25. Interation plot
Fonte: Autoria própria
Analisando o gráfico de interação entre fatores observamos que a interação A x B
foi uma interação importante as retas se cruzam e o melhor resultado foi A no nível 2 e B
no nível 2, com uma média de 1,267.
O fator A x C percebemos uma ligeira paralelismo, mas ao analisar a diferença
dos pontos no nível 2 e pontos no nível 1 percebemos a diferença no valor, isto é, mesmo
que a reta não se cruze no gráfico se você expandir as retas elas vão se encontrar em
algum ponto, revelando uma interação fraca, neste caso o A no nível 2 e C no nível 1 foi
o melhor resultado também com 1,267 de média.
Já no fator B x C podemos analisar que suas retas se cruzam demostrando
assim uma interação importante para o objetivo que é o crescimento de microalga, neste
caso observamos que o b no nível 1 e o c no nível 2 foi a melhor opção com 1,267 de
média.
61
4.6. Discussão das melhores condições
Se voltarmos um pouco e compararmos os resultados do gráfico de absorbância
x tempo, main effect plot e interation plot percebemos que o experimento 4 com fator A
no nível 2 (suplementação no nível f), fator B no nível 2 (vvm no nível 10/min) e fator C
no nível 1 (temperatura no nível 20ºC) obtivemos o melhor resultado. Confirmados por
três métodos diferentes.
Porem se formos analisar todo o contexto, o experimento 1 e 4 tem de diferente a
maior vazão do meio e a suplementação, em termos de resultados não obtiveram uma
diferença tão grande na resposta final 1,262 experimento 4 e 1,127 experimento 1.
Se considerarmos o custo maior do experimento 4 poderíamos concluir que o
experimento 1 produziu mais por um custo menor, sendo assim o melhor custo benefício.
5. Conclusão
Concluímos que o objetivo deste trabalho foi realizado, o qual foi estudar o
crescimento da microalga Chorella sp pelo desenho de experimento (DOE), podemos
utilizar o método Taguchi para reduzir a quantidade de experimentos e obter a
importância das variáveis como temperatura, vazão de ar/ volume do meio (vvm) e
suplementação do meio para um melhor crescimento da microalga.
Percebemos que não há uma variável nula no processo, ou seja, todas têm efeito
significativo no crescimento das microalgas Chorella sp, sendo no experimento 4 o
melhor resultado obtido, devido seu maior crescimento celular observado. Porem devido
seu maior custo de produção, dobro de suplementação e um vvm maior, eleva seu custo.
Assim o experimento 1 foi o melhor resultado se levarmos em conta o custo benefício, a
melhor performance na fase exponencial. E a ausência de inibição causada por excesso
de substrato.
Com a otimização da produção de biomassa de uma fonte que não compete com
alimentos, terceira geração de biomassa, podemos chegar cada vez mais perto de uma
futura independência do petróleo na matrix energética do mundo. Para isto precisamos
62
viabilizar e ter o scale up do processo para atender a demanda crescente de energia sem
prejudicar o meio ambiente.
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