UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Medicina de ... · Rafael Rossi Valentin, te agradeço um monte por todos os nossos “embates” científicos extremamente enriquecedores,

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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

/

Buzelle, Samyra Lopes

Metabolismo de ácidos graxos e glicerol no tecido adiposo branco de camundongos com resistência à insulina induzida pela hiperlipídica. Ribeirão Preto, 2016.

125 p. il. ; 30 cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Bioquímica.

Orientador: Kettelhut, Isis do Carmo.

1. Tecido adiposo. 2. Ácido graxo. 3. Glicerol-3-fosfato. 4. Dieta hiperlipídica. 5. Metabolismo lipídico.

“Treine a si mesmo a deixar partir

tudo que teme perder” Mestre Yoda

Dedico aos meus pais Edineia e José Buzelle que iluminaram

meus caminhos com afeto e dedicação, que se doaram e

renunciaram aos seus sonhos muitas vezes para que os

filhos pudessem se realizar e que esperaram e compreenderam

as longas ausências. Quando procuro uma forma verbal de

exprimir minha gratidão, não encontro nada à altura. Mas

quero dizer que os amo e que sou grata a Deus por ter

nascido de vocês.

Ao meu irmão Junior José, que é um exemplo de fé, carinho e

perseverança. “Eis que quão bom e quão suave é que os

irmãos vivam em união!” Te amo meu irmão.

Para Anna Carolina H. Billek, “É melhor ter companhia do

que estar sozinho, porque maior é a recompensa do trabalho

de duas pessoas. Se um cair, o amigo pode ajudá-lo a

levantar-se. Mas pobre do homem que cai e não tem quem o

ajude a levantar-se!”. Sem você talvez eu tivesse conseguido,

mas com você o caminho foi muito mais alegre e ameno.

AGRADECIMENTOS

“O que Deus faz por nós, esta além do que podemos ver”. Agradeço a ELE

por toda a sua proteção e por colocar em minha vida seus filhos e meus

irmãos que me auxiliaram nesse caminho.

Profa. Dra. Isis do Carmo Kettelhut, que é um exemplo de força e

bondade. Eu agradeço não só pela impecável orientação, mas também por

sempre ouvir, compreender e aconselhar. O respeito que tem pelas

dificuldades e individualidades de seus alunos é admirável e algo que

levarei para sempre comigo. Obrigada pelo exemplo de amor ao ensino e

à pesquisa.

Profa. Dra. Valéria Ernestânia Chaves, agradeço pela amizade, pelas

valiosas orientações e por ser uma ótima companheira de viagem. Não é

de hoje que você me ajuda e acompanha e eu sou muito grata por ter seu

auxílio em todos os momentos.

Profa. Dra. Maria Emília Soares Martins, agradeço por ter me

presenteado com o modelo experimental utilizado nesse trabalho, você

foi a luz em um momento de indecisão.

Prof. Dr. Luiz Carlos de Carvalho Navegantes, por sua orientação e

pelos conselhos sempre valiosos. Obrigada por nos receber em San

Diego.

Prof. Dr. David Wright, por me receber em seu laboratório com tanto

carinho, respeito e entusiasmo. Obrigada pelo excelente projeto de

pesquisa e pela publicação do trabalho. Rebecca MacPherson, Laelie

Snook, Scott Frendo-Cumbo, Laura Castellani, Willem Pepper e Zachary

Anderson, agradeço por me acolherem e me fazerem tão bem quando eu

estava tão longe de casa.

Prof. Dra. Nair Honda Kawashita, meu eterno amor e admiração por ser

sempre tão solícita e por todo o carinho que sempre demonstrou por

mim. Agradeço por fazer parte da banca, por todos os anticorpos

emprestados, por todos os artigos em colaboração, e por sempre me dar

conselhos tão valiosos para a vida e para a ciência.

Aos membros da banca, Profa. Dra. Thais Martins de Lima, Profa. Dra.

Maria Cristina Foss e Profa. Dra. Lucila Leico Kagohara Elias pela

disponibilidade na correção do manuscrito e por aceitarem fazer parte

da banca.

Prof. Dr. Heraldo Possolo de Souza, (FM-USP) por permitir a realização

de experimentos em seu laboratório, e pelo excelente auxílio técnico

da Dra. Denise Frediani e Dr. Hermes Vieira Barbeiro.

Vani Maria Alves, pelo auxílio nos experimentos de histologia deste

trabalho. Agradeço pela ajuda com sua vasta experiência e dedicação na

realização das análises. Profa. Dra. Maria Célia Jamur e Profa. Dra.

Constance Oliver por disponibilizar o laboratório para a aquisição das

imagens histológicas e Anderson Roberto de Souza pelo apoio técnico.

Prof. Dr. José Antunes Rodrigues por permitir a realização de dosagens

hormonais em seu laboratório, e Dr. André Mecawi pelo auxílio nas

dosagens, e também por ter sido sempre um bom amigo e conselheiro, por

me ouvir, me ajudar e me proporcionar muitos momentos felizes.

Maria Antonieta Rissato Garófalo obrigada por estar comigo em todos os

experimentos, por sempre tornar tudo mais fácil e prático, por todos

os cálculos complicados que você sempre fez parecer fácil. Obrigada

por sempre se preocupar comigo e por cuidar de mim, por seu apoio

maternal e por todos os conselhos e conversas tão enriquecedoras.

Neusa Maria Zanon obrigada pela convivência sempre agradável, por

sempre ajudar em tudo que precisei e pelos momentos alegres dentro e

fora do laboratório. Elza Maria Filippin agradeço por sua presença

essencial em todos o experimentos, pela manipulação das dietas e por

estar sempre disposta a me ajudar. Lilian Zorzenon que com sua calma e

serenidade sempre auxiliou em tudo tornando-se essencial para todos

nós. Victor Galban pela disponibilidade em resolver nossos problemas

técnicos de maneira sempre gentil.

Aos funcionários do Departamento de Bioquímica, Maria Ivone Campos

Fonseca pela extrema competência e profissionalismo em resolver os

problemas da pós-graduação, por todo o auxílio e prontidão com os

processos do sanduíche e da tese, sem você tudo seria tão difícil...

Ronaldo Sordi Campanini por toda a ajuda e por sempre me receber com

alegria. Ao Marrom, que durante todo o tempo que esteve a frente do

nosso biotério sempre foi um exemplo de cordialidade e organização. Ao

Paulinho (in memorian) por sempre ajudar com os animais no biotério.

Aos amigos do LCM, “a amizade desenvolve a felicidade e reduz o

sofrimento, duplicando a alegria e dividindo a nossa dor”.

Aos amigos que seguiram: Priscila Cassola, tenho que te agradecer por

me levar para academia, eu perseverei (rs), pelos almoços no bandeijão

e por ser companheira em nunca deixar comida no prato! “Você é 10”.

Graziella Nascimento, muito obrigada pela ajuda em todos os

experimentos, essa tese não sairia sem você e por todas as conversas.

Nosso time de lipolíticos era pequeno, mas trabalhador! Flavia

Aparecida Graça, sua positividade e sua risada inconfundível sempre

fizeram o laboratório mais feliz. Leandro Manfredi, apesar de ser

“curintia” sempre te admirei por seu dom com a dialética, obrigada

pelos “temáticos”. Danilo Lustrino agradeço por ter sido um bom amigo,

por me apoiar em momentos de dificuldade e por ser sempre generoso.

Silvia de Paula Gomes, eu tenho uma divida de gratidão eterna com

você, que me acolheu antes mesmo de eu ser aluna do laboratório, e

também depois quando eu ainda não tinha onde morar. Agradeço-te também

pelo conselho que foi decisivo para que eu viesse para o LCM, e por

sempre estar lá quando eu precisei, você é uma pessoa rara nesse

mundo.

Franciele Przygodda, tenho tanto a te agradecer... Você foi uma grande

amiga e companheira! Meus experimentos com você não eram só muitos

mais rápidos e organizados, mas também muito mais alegres e

engraçados. Você foi a melhor companheira de viagem, de bandeijão e de

longos desabafos. Frannnnnnn obrigada por sempre me apoiar, ajudar e

compreender.

Juliano Machado, a pessoa mais esforçada que conheci nesse

laboratório, o mestre das vias de sinalização, meu companheiro de

Marcão, meu amigo tão especial. Obrigada por sempre estar lá e por me

dizer o que eu precisava ouvir, por todos os abraços e risadas. Isso

“sugere fortemente” que você é incrível.

Wilian Silveira, não adianta fazer essa pose de malvado-pessimista,

você tem um coração enorme e não sabe falar não. Muito obrigada por

todas as caronas, pizzas, subways, mas principalmente pelos temáticos.

Você é um ótimo vizinho mesmo batendo na janela.

Natalia Lauterbach, a sua sinceridade e personalidade são um exemplo a

ser seguido. Você não é tão brava quanto parece viu? Apesar de

discordarmos se é biscoito ou bolacha, sempre serei agradecida por ter

sua amizade, pelos vídeos engraçados, e pelas nossas músicas cultas e

profundas.

Rafael Rossi Valentin, te agradeço um monte por todos os nossos

“embates” científicos extremamente enriquecedores, você tem uma

inteligência admirável e um senso de humor espetacular! Obrigada por

toda a ajuda com essa tese, pelas piadas horríveis que sempre me

fizeram rir muito, e é claro pelas cervejas espetaculares.

Dawit Gonçalves, papi você é o cara. Agradeço muito por sempre ajudar

e por nunca julgar minhas dúvidas. Sua vontade de inovar e todo o seu

conhecimento são admiráveis, você para mim é um exemplo de cientista e

de professor.

Aos meus colegas de pós-graduação Bruno Gonzaga Teodoro, Eriston

Vieira Gomes, Wellington Ramos Pedersoli, Madla Adami Passos, Gabriela

Solano, Lilian dos Santos Castro pelos momentos de alegria e de

aprendizado nessa jornada.

Wermerson Assunção, meu filhote, agradeço pela ajuda na conexão com a

FM-USP, pela hospedagem garantida na sua casa, por todas as alegrias

que você sempre me deu, mas principalmente por ser esse amigo tão

querido.

A minha irmã Janaina de Olveira Inoui e meus sobrinhos João Guilherme,

Beatriz, Iago e Nana por fazerem minha vida mais feliz e cheia de

amor.

Ao apoio financeiro da CAPES nas bolsas de doutorado e doutorado-

sanduíche, CNPq e FAPESP nos projetos do laboratório.

A todos aqueles que direta ou indiretamente me ajudaram nessa jornada,

meu muito obrigada.

RESUMO

“METABOLISMO DE ÁCIDOS GRAXOS E GLICEROL NO TECIDO

ADIPOSO BRANCO DE CAMUNDONGOS COM RESISTÊNCIA À INSULINA

INDUZIDA PELA DIETA HIPERLIPÍDICA”

Camundongos Swiss, quando submetidos à dieta hiperlipídica (HL), apresentam

considerável ganho ponderal e de depósitos adiposos, tornando-se obesos e resistentes à

insulina. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da dieta HL por 8 semanas no

perfil inflamatório, síntese de triacilglicerol (TAG) com ênfase na vias de geração de

glicerol-3-fosfato (G3P) e lipólise nos tecidos adiposos brancos (TAB) retroperitoneal

(RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. Camundongos Swiss foram alimentados

com as dietas: controle (CT) - dieta purificada (AIN-93G); ou HL - dieta AIN-93G

modificada contendo 35% de lipídeos (4% de óleo de soja e 31% de gordura suína). Os

camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram uma maior massa corporal,

acompanhada pelo aumento nos tecidos RETRO e EPI, além de desenvolverem

resistência à insulina constatada no teste de tolerância à glicose (TTG), hiperglicemia e

hiperinsulinemia. O conteúdo protéico da pAKT, avaliado por western blot (WB), e a

adiponectina, dosada em homogenados dos tecidos adiposos, estão reduzidos apenas no

EPI. Houve aumento na expressão gênica de MCP-1 e PAI-1, e foi observada menor

área dos adipócitos no EPI, sem alteração no RETRO dos animais HL. A síntese de

novo de ácidos graxos (AG), avaliada pela incorporação de 3H de 3H2O em AG foi

maior em ambos os TAB, porém a captação de AG das lipoproteínas circulantes

avaliada pela atividade e expressão da lipase lipoproteica (LPL) aumentou no EPI e

reduziu no RETRO. A dieta HL induziu aumento na fosforilação do glicerol, avaliada

pela atividade e conteúdo da GK que aumentaram nos dois TAB, e maior incorporação

de 1-14C-glicerol em TAG no EPI. A captação de glicose in vitro e conteúdo do GLUT-

4, que indicam atividade da via glicolítica foram reduzidos no EPI e RETRO, assim

como a gliceroneogênese avaliada pela incorporação de 1-14C-piruvato em TAG, sem

alterações na atividade e conteúdo da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK). A

atividade lipolítica basal foi avaliada in vitro pela liberação de glicerol por adipócitos

isolados, e não foi alterada pela ingestão de dieta HL, porém quando estimulada por

noradrenalina a liberação de glicerol foi menor nos animais HL, assim como as

fosforilações da ATGL e HSL e conteúdo do receptor adrenérgico β3. A dieta HL levou

a uma redução no conteúdo de PPARγ e aumento de ATF3 em ambos os tecidos. No

EPI houve aumento de pCREB, pSTAT3 e RGS2 em relação aos controles enquanto no

RETRO a única diferença encontrada foi a menor pSTAT3. Nossos resultados

demonstram que o aumento nos TAB é resultado de maior síntese e captação de AG, e

que o G3P necessário para a esterificação a TAG é proveniente principalmente da

fosforilação direta do glicerol pela GK; além disso, a reduzida lipólise também parece

contribuir para esse quadro. Nos animais HL, o EPI parece ser mais propenso aos

efeitos da dieta do que o RETRO.

ABSTRACT

“FATTY ACID AND GLYCEROL METABOLISM IN WHITE ADIPOSE

TISSUE OF MICE WITH INSULIN RESISTANCE INDUCED BY HIGH FAT

DIET”

Swiss mice when subjected to high fat diet (HFD), shown considerable weight gain and

adipose depots, becoming obese and insulin resistant. The aim of this study was to

evaluate the effect of HFD diet for 8 weeks in the inflammatory profile, triacylglycerol

(TAG) synthesis with emphasis in glycerol-3-phosphate (G3P) generation pathways and

lipolysis in retroperitoneal (RETRO) and epididymal (EPI) white adipose tissue (WAT)

of mice. Swiss mice were fed with diets: control (CT) - purified diet (AIN-93G); or

HFD - purified diet (AIN-93G) plus 35% of fat (4% soybean oil and 31% of lard). Mice

fed a HFD diet had a higher body mass, accompanied by an increase in RETRO and EPI

tissues, in addition to developing insulin resistance, evidenced by glucose tolerance test

(GTT), hyperglycemia and hyperinsulinemia. The protein content of pAKT, accessed by

western blot, and adiponectin, measured in WAT homogenates, are reduced only in EPI.

There was an increase in gene expression of MCP-1 and PAI-1, and was observed

smaller area of adipocytes in EPI, with no change in RETRO of HFD fed animals. De

novo synthesis of fatty acids (FA), evaluated by incorporation of 3H from 3H2O in FA

was higher in both TAB, but the uptake of FA, from blood lipoproteins, evaluated by

the activity and expression of lipoprotein lipase (LPL) was increased in EPI and reduced

in RETRO. HFD induced increase in phosphorylation of glycerol, evaluated by the

activity and content of glycerolkinase (GyK) which increased in both TAB and greater

incorporation of 1-14C-glycerol in the TAG only in EPI. The in vitro glucose uptake and

GLUT-4 content, which indicates the activity of the glycolytic pathway were reduced in

EPI and RETRO, as well as glyceroneogenesis assessed by the incorporation of 1-14C-

pyruvate into TAG without changes in the activity and contents of phosphoenolpyruvate

carboxykinase (PEPCK). The basal lipolytic activity was evaluated in vitro by glycerol

releasing from isolated adipocytes, and was not altered by HFD intake, but when

stimulated by noradrenaline glycerol release was lower in HFD animals as well as the

phosphorylation of ATGL and HSL and β3 adrenergic receptor content. HFD led to a

reduction in the content of PPAR gamma and an increase in ATF3 in both tissues. In

EPI there was an increase in pCREB, pSTAT3 and RGS2 while in RETRO the only

difference was reduced pSTAT3. Our results shown that TAB increase is result of

increased FA synthesis and uptake, and G3P required for esterification TAG comes

mainly from direct phosphorylation of glycerol by GyK; Furthermore, reduced lipolysis

also seems to contribute to this scenario. HFD effects seem to be more prominent in EPI

than in RETRO.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACC – Acetil-CoA Carboxilase

AG – Ácidos Graxos

AGL – Ácido Graxo Livre

AGS – Ácido Graxo Sintase

Akt/PKB –Ak thymoma/Proteína Quinase B

Aqp – Aquagliceroporina

ATF3 - Activating Transcription Factor 3

ATGL – Lipase dos Triacilgliceróis dos Adipócitos

ATP – Adenosina Trifosfato

cAMP - Adenosina 3’,5’monofosfato cíclico

CBP – CREB binding protein

CGI-58 - Comparative Gene Identification 58

ChREBP – Carbohydrate Responsive Element Binding Protein

CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

CREB - cAMP-responsive Element Binding Protein

CREM - cAMP-responsive Element Modulator

CRTC - cAMP-regulated Transcriptional Co-activators

CT – Dieta Controle

DAG – Diacilglicerol

DM2 – Diabetes Melitus tipo 2

EPI – Tecido Adiposo Branco Epididimal

G3P – Glicerol-3-fosfato

G6PD – Glicose-6-fosfato Desidrogenase

GK – Gliceroquinase

GPCR – Receptor acoplado à proteína G

GPD2 – Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase

HCHL – Dieta Hiperglicídica e Hiperlipídica

HL – Dieta Hiperlipídica

HP – Dieta Hiperproteica livre de Carboidratos

IFNγ – Interferon γ

IL-6 – Interleucina 6

IR – Receptor de Insulina

IRE - Insulin Response Element

IRS - Insulin Receptor Substrate

JAK – Janus Kinase

LHS – Lipase Hormônio Sensível

LPHC – Dieta Hipoproteica Hiperglicídica

LPL – Lipase Lipoprotéica

MAG – Monoacilglicerol

MCP-1- Monocyte Chemoattractant Protein-1

NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato

PAI-1 - Plasminogen Activator Inhibitor-1

PDE – Fosfodiesterase

PDK - Proteína Quinase Dependente de Fosfatidilinositol

PDK4 – Piruvato Desidrogenase Quinase 4

PEPCK – Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase

PI3K - Fosfatidilinositol 3-quinase

PKA - Proteína Quinase Dependente de cAMP

PPARγ - Peroxisome Proliferator-activated Receptor γ

PPRE - PPAR response element

RETRO – Tecido Adiposo Branco Retroperitoneal

RGS2 - Regulator of G Protein Signaling 2

RIP140 - Receptor-Interacting Protein 140

RPL32 - Ribosomal protein L32

SNS – Sistema Nervoso Simpático

SREBP – Sterol Regulatory Element Binding Protein

STAT - Signal Transducers and Activators of Transcription

TAB – Tecido Adiposo Branco

TAG – Triacilglicerol

TAM – Tecido Adiposo Marrom

Th – Linfocito T-helper

TNFR – Receptor de TNF-α

TNF-α - Tumor Necrosis Factor α

TTG – Teste de Tolerância à Glicose

TZD – Tiazolinedinediona

Sumário 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1

1.2 Metabolismo do tecido adiposo branco .................................................................. 2

1.3 Obesidade induzida por dieta hiperlipídica .......................................................... 10

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 17

2.1 Objetivos gerais .................................................................................................... 17

2.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 17

3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 19

3.1 Animais e tratamento ............................................................................................ 19

3.2 Determinação dos níveis séricos de insulina, corticosterona, leptina, adiponectina, triacilglicerol, colesterol, ácidos graxos e glicose ...................................................... 21

3.3 Análise histológica ............................................................................................... 21

3.4 Teste de Tolerância à Glicose (TTG) ................................................................... 22

3.5 Determinação do conteúdo de citocinas no tecido adiposo branco ...................... 22

3.6 Isolamento de adipócitos ...................................................................................... 23

3.7 Síntese in vivo de ácidos graxos de novo .............................................................. 23

3.8 Síntese in vitro de ácidos graxos de novo ............................................................. 25

3.9 Atividade da enzima Lipase Lipoprotéica (LPL) ................................................. 26

3.10 Captação de Glicose in vitro ............................................................................... 28

3.11 Incorporação de 1-14C-piruvato e 1-14C-glicerol em lipídios totais ................... 28

3.12 Extração dos lipídios totais ................................................................................. 29

3.13 Atividade da Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase (PEPCK) ............................... 29

3.14 Atividade da Gliceroquinase (GK) ..................................................................... 31

3.15 Lipólise in vitro .................................................................................................. 32

3.16 Western Blot ....................................................................................................... 32

3.17 Real Time (RTqPCR) ......................................................................................... 34

3.18 Análise estatística ............................................................................................... 36

4. RESULTADOS .......................................................................................................... 37

4.1 Caracterização metabólica do modelo experimental ............................................ 37

4.1.1 Massa corporal ............................................................................................... 37

4.1.2 Parâmetros séricos ......................................................................................... 39

4.1.3 Massa do tecido adiposo ................................................................................ 41

4.1.4 Análise histológica do tecido adiposo ........................................................... 42

4.1.5 Avaliação da resistência insulínica ................................................................ 44

4.1.6 Perfil inflamatório ......................................................................................... 47

4.2. Síntese de triacilglicerol: origem dos ácidos graxos e geração do glicerol-3-fosfato ......................................................................................................................... 50

4.2.1 Fontes de ácidos graxos ................................................................................. 50

4.2.2. Vias de síntese de glicerol-3-fosfato ............................................................ 56

4.3. Degradação do TAG: Lipólise ............................................................................. 65

4.4. Vias de sinalização .............................................................................................. 69

5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 72

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 92

1

______________________________________________________________________ Introdução

1. INTRODUÇÃO

A obesidade é reconhecida hoje como um dos mais importantes problemas de

saúde pública no mundo, afetando pessoas de todas as idades. A Organização Mundial

da Saúde estimou que em 2014 cerca de 1,9 bilhões de adultos estavam com sobrepeso,

e destes, 600 milhões eram obesos, correspondendo a 39% da população mundial com

sobrepeso e 13% de obesos (WHO, 2015). Considerada uma epidemia global, a

obesidade está associada ao aumento no risco de incidência de várias doenças que

incluem: diabetes tipo 2 (DM2), dislipidemias, doenças cardiovasculares, hipertensão,

acidente vascular cerebral e diversos tipos de câncer (KOPELMAN, 2000).

Dentre as causas principais da obesidade encontram-se a ingestão de dietas

hiperlipídicas (HL), vida sedentária, fatores genéticos e desordens do sistema endócrino

(SWINBURN et al., 2011). A obesidade é decorrente de um desequilíbrio entre o

consumo e o gasto energético, levando a um aumento no armazenamento de nutrientes

em forma de triacilglicerol (TAG) no tecido adiposo branco (TAB). Os adipócitos são

capazes de sintetizar TAG através da esterificação de ácidos graxos (AG) com o

glicerol-3-fosfato (G3P) e o armazenamento de lipídios ocorre quando a taxa de

esterificação é maior que a da lipólise (BALLARD; HANSON, 1967; NYE et al., 2008)

Além disso o aumento no armazenamento de TAG na expansão da massa

adiposa está intimamente associado com o desenvolvimento de resistência à insulina em

tecidos periféricos como o músculo esquelético e fígado (GALIC; OAKHILL;

STEINBERG, 2010) e o DM2 é a co-morbidade mais prevalente nesta condição (GUH

et al., 2009). A resistência à insulina está entre os primeiros distúrbios relacionados ao

desenvolvimento do DM2 e é fator determinante para a instalação da síndrome

metabólica, desordem definida por obesidade, hipertensão, intolerância à glicose e

2

______________________________________________________________________ Introdução

dislipidemia (WIESER; MOSCHEN; TILG, 2013). A resistência à insulina se deve a

uma condição na qual o excesso de ingestão alimentar desencadeia inflamação,

alterações no metabolismo lipídico e na microbiota intestinal (JOHNSON; OLEFSKY,

2013).

As abordagens nutricionais no combate à obesidade vêm no sentido de prevenir

e tratar, porém esses efeitos não são permanentes, e o crescente interesse na regulação

do metabolismo em modelos de obesidade se torna fundamental para a identificação de

alvos moleculares do armazenamento lipídico e desenvolvimento de estratégias para o

controle da redução de depósitos adiposos.

1.2 Metabolismo do tecido adiposo branco

O aumento na massa adiposa observada na obesidade ocorre em consequência de

hipertrofia e hiperplasia de adipócitos em resposta a uma situação prolongada de

desequilíbrio entre consumo e gasto energético. Este aumento dos depósitos adiposos

requer processos metabólicos que envolvem o ciclo de armazenamento e degradação de

TAG (WATT; STEINBERG, 2008). A formação dos TAG demanda o fornecimento de

AG, o que se dá por meio de três processos: a síntese de novo, a captação de AG pré-

formados provenientes das lipoproteínas circulantes e a reesterificação de AG oriundos

da lipólise e degradação dos TAG armazenados no próprio adipócito. No estado

alimentado, com dieta balanceada, a síntese de AG utiliza predominantemente a glicose

como substrato. A glicose é captada no adipócito através do transportador de glicose

GLUT-4, e é convertida a piruvato, que entra no ciclo do ácido tricarboxílico. O citrato

formado no ciclo é lançado ao citoplasma, onde é convertido em acetil-CoA e

oxaloacetato pela ATP-citrato liase. A acetil-CoA carboxilase-1 (ACC1) converte parte

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______________________________________________________________________ Introdução

A síntese de G3P a partir da glicose é a via classicamente conhecida tanto no

TAB como no tecido adiposo marrom (TAM), sendo a glicose degradada pela via

glicolítica até diidroxiacetona fosfato, seguido de redução a G3P pela glicerol-3-fosfato

desidrogenase (GPD2) (Figura 1). O G3P pode ser sintetizado também a partir de

precursores não glicídicos de 3 carbonos pela gliceroneogênese. As primeiras

observações sobre esta via foram feitas ao final da década de 60 e início da década de

70 (BALLARD; HANSON, 1967; GORIN; TAL-OR; SHAFRIR, 1969; HOPGOOD;

BALLARD, 1973; RESHEF; HANSON; BALLARD, 1970), com a constatação de que

o TAB epididimal (EPI) de ratos era capaz de converter in vitro lactato, piruvato e

aminoácidos glicogênicos em glicerol de TAG. O fato destas observações terem sido

feitas no tecido adiposo de animais jejuados e diabéticos foi interpretado por Reshef et

al., (1970) como um mecanismo de redução na liberação de AG-TAG com a finalidade

de prevenir a formação de corpos cetônicos e, consequentemente a acidose característica

destas duas condições metabólicas. Posteriormente, estudos do nosso laboratório

publicados por Botion et al., (1998) utilizando técnica de dupla marcação (3H2O e

glicose-U-14C) refutaram a hipótese de Reshef, ao constatarem que ratos adaptados à

dieta hiperprotéica livre de carboidratos (HP) e que apresentavam reduzida lipólise,

mostravam aumentada atividade da via gliceroneogênica. O aumento desta via foi

interpretada pelos autores, como um mecanismo compensatório para garantir a geração

de G3P numa situação de baixa disponibilidade de glicose, assegurando assim, a

esterificação dos AG e manutenção dos depósitos de TAG. Outro aspecto importante

destes estudos foi a constatação de que mesmo em animais com dieta balanceada, a

contribuição da gliceroneogênese era maior (56%) do que a contribuição da glicose

(44%) na formação de G3P no TAB, TAM e fígado (BOTION et al., 1998). Estudos

mais aprofundados desta via identificaram a fosfoenolpiruvato carboxiquinase

5

______________________________________________________________________ Introdução

(PEPCK), considerada inicialmente uma enzima exclusivamente gliconeogênica, como

enzima chave também da gliceroneogênese e que catalisa a conversão de oxaloacetato,

um intermediário do ciclo de Krebs, a fosfoenolpiruvato. A relevância da PEPCK no

metabolismo lipídico do TAB foi evidenciada por trabalhos utilizando animais

transgênicos. Camundongos com deleção gênica da PEPCK apresentam redução da

gordura e aumento da mobilização de AG-TAG do TAB (OLSWANG et al., 2002),

enquanto camundongos que superexpressam esta proteína no TAB apresentam alta

atividade gliceroneogênica e acúmulo de gordura nesse tecido (FRANCKHAUSER et

al., 2002).

Achados do nosso laboratório sugerem que a gliceroneogênese é regulada pela

disponibilidade de glicose, parecendo ser inibida pelo aumento da utilização de glicose

e estimulada pela falta dela, assim sendo essa via parece ser estimulada para compensar

a reduzida síntese de G3P a partir desta hexose. Animais alimentados com dieta

hipercalórica e hiperlipídica do tipo cafeteria (HCHL) apresentam níveis plasmáticos

elevados de insulina, com redução da gliceroneogênese e ativação da via glicolítica e da

gliceroquinase nos TAB epididimal e retroperitoneal (CHAVES et al., 2006). Já em

uma situação onde há redução da insulina plasmática e consequentemente da

disponibilidade de glicose, como a administração de dieta HP observa-se aumento na

atividade da via gliceroneogênica (BOTION et al., 1998).

A geração de G3P pela fosforilação do glicerol pela GK, por bastante tempo, foi

considerada desprezível no TAB, tendo em vista a reduzida atividade desta enzima

neste tecido quando comparado ao fígado e TAM. A GK tem o importante papel de

reciclar o glicerol gerado pela hidrólise do TAG no interior do adipócito, e crescentes

evidências apontam que a sua atividade pode ser modulada em diversas condições no

TAB. Estudos do nosso laboratório demonstraram que tanto a atividade quanto a

6

______________________________________________________________________ Introdução

expressão da GK estão sob controle direto do sistema nervoso simpático no TAM. A

exposição ao frio, situação conhecida de aumento da atividade simpática para o TAM,

promove aumento na expressão e atividade da GK. Após a desnervação simpática

cirúrgica desse tecido nos animais expostos ao frio, a atividade da enzima é reduzida e

volta aos valores normais (KAWASHITA et al., 2002). A infusão constante de

noradrenalina por bombas osmóticas por 72 horas foi capaz de aumentar a atividade da

GK em 83% no EPI e 55% no retroperitoneal (RETRO) (VALENTIM, 2012).

Corroborando estes achados, foi demonstrado que a ativação crônica de receptores β3

adrenérgicos pelo agonista CL 316,243 causa aumento da expressão de GK no TAB a

níveis que excedem os observados no TAM (MOTTILLO et al., 2014). Outro conhecido

ativador da GK são as tiazolidineadionas (TZDs), agonistas do PPARγ (Peroxisome

proliferator-activated receptor gamma), que induzem consideravelmente a expressão de

GK em adipócitos isolados em cultura (GUAN et al., 2002). Recentemente também foi

descrita a influência da RIP140 (Receptor-Interacting Protein 140) na expressão da GK

em adipócitos. Em células primárias de animais nocautes para RIP140, a expressão da

GK foi aumentada em 5x, por uma regulação pré-transcricional onde o fator se liga

diretamente à região PPAR response element (PPRE) na região promotora do gene da

GK inibindo sua transcrição (KISKINIS et al., 2014).

Outro fator que possivelmente contribui para o aumento no tamanho do TAB e

que influencia na atividade da GK é a regulação no transporte de glicerol através da

membrana do adipócito. Estudos sugerem que a hipertrofia de adipócitos pode ser, em

parte, consequência da redução da permeabilidade da membrana plasmática ao glicerol,

resultando no aumento de glicerol intracelular. O transporte de glicerol pelas

membranas é realizado pelas aquagliceroporinas (Aqp), que têm sido descritas como um

novo ponto de regulação do acúmulo intracelular de lipídios, já que a modulação da

7

______________________________________________________________________ Introdução

expressão e função das Aqps pode alterar a massa adiposa. No tecido adiposo, a Aqp7 é

a isoforma mais expressa e é reconhecida como principal canal de transporte de glicerol

presente. Os níveis de mRNA da Aqp7 são regulados por fatores nutricionais. Em jejum

esses níveis aumentam e no estado alimentado diminuem no TAB, levando a um

aumento nos níveis plasmáticos de glicerol no jejum e redução no estado alimentado

(KISHIDA et al., 2001). A ausência de Aqp7, estudada em animais nocautes e em

adipócitos 3T3-L1 knockdown, promove aumento do conteúdo intracelular de glicerol,

aumento na atividade da GK e na captação de ácido oléico levando a um maior acúmulo

de TAG (HIBUSE et al., 2005).

Já é conhecido que a insulina regula negativamente a expressão do gene da Aqp7

por meio do IRE (Insulin Response Element) existente em sua região promotora

(KISHIDA et al., 2001). Em camundongos, a deficiência de Aqp7 é associada com

deficiência na ação da insulina, redução na tolerância à glicose e redução na fosforilação

da AKT no TAB e fígado, além de prejuízos na ativação da PI3K (fosfatidilinositol 3-

quinase) pelo IRS-1 (Insulin Receptor Substrate 1) no TAB (HIBUSE et al., 2005).

Além da síntese de TAG, outro processo importante que determina o tamanho da

massa adiposa é a lipólise que é regulada por fatores hormonais, nutricionais e neurais.

A lipólise envolve uma classe de enzimas classificadas como hidrolases, sendo as mais

conhecidas a lipase dos triacilgliceróis dos adipócitos (ATGL), que tem alta

especificidade para TAG, e a lipase hormônio sensível (LHS), que atua principalmente

como hidrolase de diacilglicerol (DAG) no TAB. As lipases de monoacilglicerol

(MAG) finalizam a degradação dos TAG, liberando o último AG e uma molécula de

glicerol (AHMADIAN; DUNCAN; SUL, 2009). Animais que superexpressam ATGL

possuem altas taxas lipolíticas tanto em condições basais quanto estimulada por

diferentes agentes lipolíticos, e quando alimentados com dieta HL estes animais são

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______________________________________________________________________ Introdução

adenosina 3’,5’monofosfato cíclico (cAMP) que leva à ativação da proteína quinase

dependente de cAMP (PKA). A PKA é responsável pela fosforilação da LHS e

perilipina A, a principal proteína estrutural localizada na superfície da gota lipídica. A

perilipina A quando fosforilada facilita o acesso da LHS à gota lipídica e expõe a

superfície da gota para a ação das enzimas que vão promover a hidrólise dos TAG em

AG e glicerol (Figura 2) (ZIMMERMANN et al., 2004). Além disso, a perilipina que

encontra-se ligada ao CGI-58 (Comparative Gene Identification 58) e ao ser fosforilada

estimula a liberação deste que é um potente ativador da ATGL (NIELSEN et al., 2014).

Ao contrário das catecolaminas a insulina inibe a lipólise pela fosforilação e

ativação da fosfodiesterase (PDE) específica do cAMP, a PDE-3, que catalisa a

hidrólise do cAMP em AMP, reduzindo os níveis de cAMP e como conseqüência

impedindo a fosforilação da LHS. A sinalização intracelular da insulina inicia-se pela

ligação do hormônio ao seu receptor específico de membrana, o IR (receptor de

insulina), uma proteína com atividade tirosina quinase intrínseca. Essa ligação leva a

autofosforilação e ativação de IR com consequente fosforilação dos substratos do

receptor de insulina (IRS), permitindo a interação destes com várias proteínas com

domínio SH2, entre elas a subunidade p85 da proteína PI3K. Em seguida, a PI3K

promove a fosforilação do fosfolipídio de membrana fosfatidilinositol 4,5-bifosfato,

convertendo-o em fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato. Este, por sua vez, ancora as

proteínas PDK (proteína quinase dependente de fosfatidilinositol) e Akt/PKB (proteína

quinase B). Após ancoramento na membrana, a PDK promove a fosforilação da Akt em

resíduos de serina e/ou treonina que, uma vez ativada, se desloca para o citosol e passa a

fosforilar diversas proteínas-alvo reguladas pela insulina (DUNCAN et al., 2007).

A lipólise pode também ser influenciada por uma regulação autócrina, induzida

por substâncias produzidas pelas próprias células adiposas ou do estroma vascular,

10

______________________________________________________________________ Introdução

como a IL-6, leptina e o TNF- α (Tumor Necrosis Factor α) (LAFONTAN; LANGIN,

2009). A ativação da lipólise por TNF-α é tempo e dose dependente e quando ocorre no

TAB é através de sua ligação ao receptor de TNF do tipo 1 (TNFR-1) (FERES et al.,

2013). Os efeitos no TNF-α na lipólise são controversos, a injeção de TNF-α por 5 dias

em ratos não teve efeito na atividade lipolítica do TAB (KETTELHUT; GOLDBERG,

1988), já na dieta LPHC onde há aumento plasmático dessa citocina a atividade

lipolítica está reduzida no RETRO e EPI (BUZELLE et al., 2010; SANTOS et al.,

2012). Quando os adipócitos isolados dos TAB de animais LPHC são incubados com

TNF-α a atividade lipolítica é menor do que nos animais controles (FERES et al., 2013)

1.3 Obesidade induzida por dieta hiperlipídica

A obesidade decorre de uma combinação de fatores individuais e sociais,

entretanto é frequentemente atribuída a fatores alimentares, como ingestão de dietas

com alta densidade energética (NIKOLIC et al., 2012). Diferenças individuais e a

vulnerabilidade ao desenvolvimento da obesidade são fenômenos que podem ser

observados em diferentes espécies animais como determinadas linhagens de ratos e

camundongos que podem reagir de maneira diferente a estímulos alimentares, porém, o

ganho de peso, acúmulo de gordura corporal e a inflamação no TAB são achados

comuns (MONTGOMERY et al., 2013).

Camundongos ob/ob, deficientes em leptina, por exemplo, tem sobrepeso e

hiperfagia e desenvolvem severa resistência à insulina, podendo ser utilizados tanto nos

estudos de obesidade quanto de diabetes (LINDSTRÖM, 2007). Já os camundongos da

linhagem C57BL/6J podem ser facilmente induzidos à obesidade utilizando uma dieta

HL (Surwit, et al.1988). Camundongos da linhagem Swiss quando submetidos à dieta

11

______________________________________________________________________ Introdução

HL apresentam considerável ganho ponderal e de depósitos adiposos, aumentando até

30% do seu peso quando comparado aos animais que receberam uma dieta controle.

Após oito semanas de tratamento, esses animais se tornam obesos, hiperinsulinêmicos e

resistentes à insulina, bem como intolerantes à glicose (DE SOUZA et al., 2005;

PITOMBO et al., 2006). Não faltam evidências de que fatores genéticos exercem um

papel importante no desenvolvimento desta patologia, entretanto, mesmo que

predisposto geneticamente, sem um excesso na ingestão calórica, dificilmente um

organismo se torna obeso (NING et al., 2011).

A ingestão de dieta HL está relacionada com maior concentração de TAG no

TAB, indução de estresse metabólico, alterações na lipólise e ativação das vias de

sinalização de algumas adipocinas. Apesar de fatores nutricionais e hormonais como

ácidos graxos, catecolaminas e insulina estarem alterados na obesidade, substâncias

liberadas pelo próprio adipócito têm sido apontadas como causadoras da resistência

insulínica. As adipocinas secretadas pelo TAB, que incluem a adiponectina, resistina,

interleucina 6 (IL-6) e TNF-α parecem ter função primordial na regulação de vias

metabólicas tanto em situações fisiológicas quanto patológicas (HOTAMISLIGIL;

SHARGILL; SPIEGELMAN, 1993; SEWTER et al., 1999; STEPPAN et al., 2001)

Em modelos de ingestão de dieta HL, há aumento no infiltrado de macrófagos

no TAB. Tanto os adipócitos quanto os macrófagos tem papel na patogênese da

obesidade e resistência à insulina. Esses dois tipos celulares tem a mesma origem

embrionária e são capazes de produzir e liberar moléculas semelhantes dependendo das

condições às quais estão expostos. Os adipócitos são especializados em armazenar

lipídios, enquanto que os macrófagos são especializados em resposta inflamatória, mas

na obesidade a função metabólica e a inflamação se sobrepõem, e a expressão gênica

nas duas linhagens se torna semelhante. Dessa maneira, citocinas inflamatórias podem

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13

______________________________________________________________________ Introdução

frequentemente associada à inflamação no TAB (OSBORN; OLEFSKY, 2012;

YAMAUCHI et al., 2001).

Há diferenças fenotípicas fundamentais nos macrófagos presentes no tecido

adiposo de animais magros e obesos. Na obesidade, há a predominância do tipo M1, que

é produzido pelo contato com linfócitos T-helper 1 (Th1) ou mediadores inflamatórios

como INFγ (Interferon γ). Após a ativação os macrófagos liberam citocinas

inflamatórias, principalmente TNF-α e IL-6. O tipo M2 é produzido pela exposição às

citocinas dos linfócitos Th2 como IL-4 e IL-13, e expressam fatores como IL-10 que

atuam em processos imunossupressores como o reparo tecidual (HILL; REID BOLUS;

HASTY, 2014). Interessantemente, no TAB de animais obesos os macrófagos

frequentemente se localizam em arranjos denominados Crow like structure, e não

difusos como no TAB de animais magros (CINTI, 2005).

Frequentemente, fatores de transcrição que atuam na diferenciação dos

adipócitos possuem papel fundamental na regulação da expressão gênica em modelos de

obesidade. Um dos fatores de transcrição mais bem estudados do TAB é o PPARγ. Esse

fator existe em duas isoformas: PPARγ1 e PPARγ2, formadas por splicing alternativo.

O PPARγ1 é expresso em baixos níveis em vários tecidos, enquanto que o PPARγ2 é

especificamente expresso no TAB, atuando como regulador principal da diferenciação

de adipócitos e metabolismo de glicose (TONTONOZ et al., 1994). Porém, o papel

desse fator de transcrição em modelos de obesidade é controverso. Yamauchi e

colaboradores (2001) verificaram que no TAB a ativação suprafisiológica do PPARγ

pelas TZDs estimulou a adipogênese o acúmulo de TAG, além de aumentar o transporte

de AG do fígado e músculo para o TAB reduzindo o conteúdo de TAG nesses tecidos.

Os autores observaram também que a redução na liberação de AGL e TNF-α, e o

aumento na expressão de adiponectina levou a uma melhora na sensibilidade à insulina.

14

______________________________________________________________________ Introdução

No mesmo estudo o tratamento com TZD em animais com obesidade induzida por dieta

melhorou a hiperglicemia e hiperinsulinemia (YAMAUCHI et al., 2001). Por outro

lado, Miles et al (2003) demonstraram que o PPAR parece não influenciar nos efeitos da

ingestão de dieta HL. Animais PPARγ+/- alimentados com dieta HL não se tornam

obesos nem resistentes à insulina, e não apresentam diferenças na massa adiposa,

tamanho dos adipócitos, níveis circulantes de AGL e leptina quando comparados com

os animais normais (MILES et al., 2003).

Outra família de fatores de transcrição que é influenciada pela obesidade são as

STATs (Signal Transducers and Activators of Transcription), que podem ser

primariamente ativados por hormônios e citocinas, como leptina, prolactina, IL-6 e

IFNγ. Após a ativação do receptor por seus respectivos ligantes se inicia a sinalização

que envolve a fosforilação em tirosina das STATs pelas JAks (Janus Kinase), ocorrendo

sua dimerização e translocação para o núcleo, onde podem modular a transcrição

gênica. Existem sete subtipos de STATs dos quais o 1, 3, 5A, 5B e 6 são expressos no

TAB (DARNELL, 1997; ZHAO; STEPHENS, 2013). A sinalização JAK-STAT no

TAB exerce papel importante na comunicação parácrina entre os adipócitos e

macrófagos, influencia no fenótipo da obesidade e regula a expressão de enzimas

chaves do metabolismo lipídico como a LPL, AGS e PDK 4 (Piruvato desidrogenase

quinase 4) (RICHARD; STEPHENS, 2014)

Além destes, outro fator importante no desenvolvimento da obesidade e

resistência à insulina é a família dos CREBs (cAMP-responsive Element Binding

Proteins) que inclui os fatores de transcrição CREB, ATF (Activating Transcription

Factor) e CREM (cAMP-responsive Element Modulator). Após fosforilação na serina

133 por proteínas quinase como a PKA ou Cálcio Calmodulina o CREB estimula a

transcrição de vários genes pelo recrutamento da histona deacetilase CBP e os

15

______________________________________________________________________ Introdução

coativadores transcricionais CRTC (cAMP-regulated Transcriptional Co-activators)

(CHRIVIA et al., 1993; RAVNSKJAER et al., 2007). Na obesidade induzida por dieta

HL o CREB é ativado no TAB onde reduz a ação local da insulina e contribui para a

resistência à insulina sistêmica. Quando a atividade de CREB é inibida, a sensibilidade

à insulina no TAB é sistemicamente preservada nos animais obesos. Esse

comprometimento na função do adipócito mediada por CREB ocorre por uma maior

expressão de ATF3, um repressor que se liga e inibe a transcrição de adiponectina e

GLUT-4 (QI et al., 2009b). Adicionalmente, o CRTC3 está aumentado na obesidade

induzida por dieta HL, sendo capaz de atenuar a sinalização adrenérgica no TAB.

Animais CRTC3-/- são resistentes à obesidade e esteatose hepática induzida por dieta

HL, e a ativação do CTCR3 está relacionada com a superexpressão do RGS2 (Regulator

of G Protein Signaling 2), um gene alvo de CREB conhecido por sua co-relação com a

síndrome metabólica (SONG et al., 2010)

Apesar de haverem diversos trabalhos na área, o metabolismo na obesidade e as

disfunções associadas ainda não estão totalmente claros. Nesse panorama, estudos que

avaliam o metabolismo in vivo e in vitro são de fundamental importância. Para a

compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações metabólicas decorrentes da

obesidade, a utilização de modelos animais que reproduzam essa condição é primordial.

Mesmo sendo a ingestão de dieta HL ser um modelo utilizado para estudos em

diferentes áreas da pesquisa, ainda são poucos os trabalhos que demonstram como

ocorre o acúmulo de TAG no TAB de animais que se alimentam com esse tipo de dieta.

Apesar de ser bastante conhecida a fisiopatologia, o desenvolvimento e as

consequências de DM2, o mesmo não ocorre com a obesidade, que por bastante tempo

foi considerada um problema apenas estético. Recentemente, devido à sua associação

16

______________________________________________________________________ Introdução

com diversas co-morbidades, há um extenso esforço para a compreensão da anatomia,

distribuição e o papel fisiológico e patológico do TAB.

Neste sentido, o nosso laboratório tem investigado durante os últimos 20 anos as

vias geração de G3P e a formação dos TAG no TAB de animais submetidos a diferentes

situações experimentais. Animais diabéticos, submetidos ao jejum ou alimentados com

a dieta HP apresentam redução nos níveis plasmáticos de insulina e redução na massa

do TAB, enquanto que animais alimentados com a diea HCHL apresentam aumento dos

níveis de insulina e aumento do TAB ocorrendo nesses estudos um controle recíproco

entre a captação de glicose e via glicolítica e a via gliceroneogênica. No primeiro grupo,

a redução da captação de glicose era acompanhada do aumento da gliceroneogênese e

no segundo grupo ocorria um aumento da glicólise e reduzida gliceroneogênese para a

formação do G3P, parecendo evidente o envolvimento da insulina no controle recíproco

dessas duas vias para a geração do G3P e formação de TAG no TAB. Entretanto, até

hoje, ainda não haviam sido estudadas as atividades das vias de formação de G3P em

uma situação que houvesse resistência à insulina. Assim sendo escolhemos o modelo de

obesidade induzida pela dieta HL em camundongos para investigarmos a regulação das

vias de síntese de G3P em uma situação em que há aumento no armazenamento de

TAG no TAB e uma estabelecida resistência à insulina. O fornecimento de AG pela

síntese de novo e a atividade da lipase lipoproteica, assim como a atividade lipolítica e o

perfil inflamatório foram também investigados.

17

______________________________________________________________________ Objetivos

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

Este trabalho teve como objetivo principal investigar o efeito da ingestão de

dieta hiperlipídica por 8 semanas no metabolismo de ácidos graxos e glicerol nos TAB

RETRO e EPI de camundongos resistentes à insulina

2.2 Objetivos específicos

1. Obter dados ponderais e de massa adiposa em animais submetidos à dieta HL,

modelo experimental utilizado neste trabalho.

Acompanhamento da evolução do peso corporal

Determinar o peso dos TAB e TAM

2. Avaliar o perfil plasmático lipídico e hormonal

Dosagens séricas de AGL, glicerol, TAG e colesterol

Dosagens hormonais de adiponectina, corticosterona, insulina e

leptina

3. Verificar a estrutura histológica dos TAB RETRO e EPI

4. Constatar a instalação da resistência à insulina, confirmando a reprodução do modelo

experimental

Dosagens de glicemia e insulina

Teste de tolerância à glicose

Determinar o conteúdo AKT fosforilada (ser-473)

5. Determinar o perfil inflamatório dos TAB RETRO e EPI

Dosagens de TNF-α, IL-6, IL-10 e adiponectina

18

______________________________________________________________________ Objetivos

Expressão gênica de IL-6, MCP-1 e PAI-1

6. Avaliar a origem dos AG esterificados em TAG nos TAB RETRO e EPI

Determinação da velocidade de síntese de AG total in vivo e in vitro

pela incorporação de 3H de 3H2O

Conteúdo proteico de ácido AGS e ACC

Determinação da expressão gênica e atividade da LPL

8. Avaliar as vias de geração de G3P

Determinação do índice de captação de 2-desoxi-1-[14C]-D-glicose in

vitro e conteúdo proteico do GLUT-4 para avaliar a via glicolítica

Determinação da velocidade de incorporação de 1-[14C]-piruvato em

TAG, atividade e conteúdo proteico da PEPCK para avaliar a via da

gliceroneogênese

Determinação da velocidade de incorporação de glicerol-U-[14C] em

TAG, atividade e conteúdo da GK para avaliar a geração de G3P pela

fosforilação direta do glicerol, além do conteúdo da GPD2 e Aqp 7.

9. Avaliar a atividade lipolítica

Determinar a lipólise basal e estimulada por noradrenalina in vitro

Determinar os níveis de fosforilação da ATGL e LHS e o conteúdo

dos receptores β3 e α2 adrenérgicos no TAB

10. Investigar fatores de transcrição envolvidos no metabolismo lipídico

Conteúdo proteico de PPARγ e ATF3

Conteúdo de CREB e STAT3 fosforiladas

Expressão gênica da RGS2

19

______________________________________________________________________ Materiais e métodos

3. MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Endocrinologia e

Controle do Metabolismo do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). Todos os procedimentos experimentais

foram conduzidos de acordo com os Princípios Éticos em Experimentação Animal

adotado pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA)

com base nos princípios de boas práticas de laboratório e procedimentos científicos, e

com a aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP,

protocolo nº 047/2013.

3.1 Animais e tratamento

Foram utilizados camundongos machos (Mus musculus) da linhagem Swiss,

provenientes do Biotério da Prefeitura do Campus Administrativo da USP de Ribeirão

Preto (PCARP). Os camundongos com peso inicial entre 15-20g e quatro semanas de

vida foram mantidos em microisoladores em rack ventilado com ciclo claro/escuro de

12 horas, à temperatura de 24 ± 2ºC e umidade de ± 55%, sendo acondicionados dois ou

três camundongos por caixa no biotério Setorial do Departamento de Bioquímica e

Imunologia da FMRP-USP. Antes do início dos experimentos, os animais passaram por

uma ambientação de quatro dias recebendo água e ração padrão para roedores Labina

(Purina) ad libitum.

Após o período de ambientação, os animais iniciaram o período experimental

recebendo as respectivas dietas que seguiram as recomendações do Instituto Americano

20


de Nutrição (AIN-93G) para roedores (REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1993). O grupo

controle (CT) recebeu dieta controle normolipídica de acordo com o AIN-93G durante

oito semanas. O grupo hiperlipídica (HL) recebeu também durante 8 semanas uma dieta

purificada AIN-93G modificada contendo 35% de lipídios, sendo 4% de origem vegetal

(óleo de soja) e 31% de origem animal (gordura suína Sadia) caracterizando uma dieta

hiperlipídica (Tabela I). A quantidade total de calorias da dieta HL foi de 24,5 kJ/g e da

dieta controle foi de 15,8 kJ/g (CINTRA et al., 2008). A dieta e a água foram oferecidas

ad libitum. Ambas as ditas foram homogeneizadas manualmente e armazenadas em

forma de pó a 5º C em recipientes de polipropileno

Tabela 1 – Composição das dietas Controle (CT) e hiperlipídica (HL) (g/100g).

Ingredientes Dieta CT

g/100g

Dieta HL

g/100g

Amido 39,8 11,8

Dextrina 13,2 13,2

Sacarose 10,0 10,0

Caseína 20,0 20,0

Óleo de Soja 7,0 4,0

Banha de porco - 31,0

Celulose microfina(fibra) 5,0 5,0

Mistura de Minerais (AIN – 93G)* 3,5 3,5

Mistura de Vitaminas (AIN – 93G)* 1,0 1,0

L – cistina 0,30 0,30

Bitartarato de Colina 0,25 0,25

* Composição detalhada por (REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1993).

Todos os experimentos foram realizados com animais alimentados e iniciados

em torno de 8:00 horas. Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e os

TAB e TAM coletados e pesados após laparotomia mediana. Os tecidos foram

utilizados frescos ou congelados em nitrogênio líquido e armazenamento a -80ºC para

21


uso posterior. A coleta de sangue foi realizada por punção cardíaca com os animais

anestesiados com isoflurano (BioChimico).

3.2 Determinação dos níveis séricos de insulina, corticosterona, leptina,

adiponectina, triacilglicerol, colesterol, ácidos graxos e glicose

Para as dosagens séricas, o sangue dos camundongos alimentados foi coletado

em tubos eppendorf de 1,5 ml e centrifugado a 1.300g por 10 minutos para a obtenção

do soro. A dosagem dos ácidos graxos livres foi feita pelo método colorimétrico

enzimático utilizando kit comercial (NEFA Randox), assim como triacilglicerol

(Labtest), colesterol (Doles) e glicerol (Bioclin-Quibasa). As dosagens de adiponectina

(R&D Systems Inc.), leptina e insulina (Millipore) foram realizadas por ELISA. A

corticosterona foi dosada por radioimunoensaio. A glicemia foi determinada no sangue

total utilizando glicosímetro (Accu-Chek Performa; Roche).

3.3 Análise histológica

Fragmentos dos TAB retroperitoneal e epididimal foram retirados para

histologia e imediatamente colocados em um frasco contendo formalina tamponada a

10%. Posteriormente, os fragmentos foram processados com álcool em concentrações

crescentes (70%, 80%, 95% e 100%), xilol e parafina. Posteriormente foram incluídos

em blocos de parafina, de onde foram seccionados em cortes de 5,0 μm e fixados em

lâminas de microscopia. A coloração utilizada para visualização estrutural foi realizada

com os corantes de Eosina e Hematoxilina. As imagens de campo claro foram

22


capturadas em um aumento de 40x com o microscópio Olympus BX50F4 acoplado a

um sistema de detecção. A mensuração do tamanho dos adipócitos foi feita com auxílio

do software MATLAB (R2011b, MathWorks) conforme descrito por (OSMAN et al.,

2013).

3.4 Teste de Tolerância a Glicose (TTG)

Camundongos jejuados por 8 horas receberam 2 g/kg de peso corporal de glicose

por via intraperitoneal (i.p.). A concentração de glicose foi determinada nos tempos de

0, 10, 20, 30, 45, 50, 90 e 120 minutos, possibilitando o traçado da curva de decaimento

da glicemia. A glicemia foi determinada no sangue coletado da veia caudal utilizando

um medidor de glicose (Accu-Chek Performa; Roche).

3.5 Determinação do conteúdo de citocinas no tecido adiposo branco

Para a determinação do conteúdo de IL-6, IL-10, TNF-α e adiponectina por

ELISA os TAB retroperitoneal e epididimal foram homogeneizados no TissueLyser II

(Quiagen) em tampão Tris 20 mM acrescido de NaCl 135 mM, 1% de NP40 e 10% de

glicerol, na proporção de 2:1. O homogenado foi centrifugado a 10.000 g por 30

minutos a 4ºC e o sobrenadante foi separado para a realização do ensaio. As proteínas

foram dosadas pelo método BCA – Bicinchoninic Acid, Pierce, USA (SMITH et al.,

1985). Essas dosagens foram realizadas no Laboratório de Emergências Médicas 51 do

Prof. Heraldo Possolo de Souza no Departamento de Clínica Médica da FMUSP de São

Paulo utilizando kits comerciais (R&D Systems Inc.).

23


3.6 Isolamento de adipócitos

A técnica do isolamento de adipócitos foi baseada no método de Rodbell, 1964.

Um pool de 5g dos TAB retroperitoneal e epididimal foi pesado e mantido em tampão

Krebs-Henseleit (137 mM de NaCl, 4,2 mM NaHCO3, 0,4 mM de MgSO4.7 H2O, 0,5

mM de MgCl2. 6H2O, 0,4 mM de KH2PO4; 5,4 mM de KCl), acrescido de 3% de

albumina bovina livre de ácidos graxos, 27 mM de HEPES e 0,55 mM de glicose, pH

7,4. Após a fragmentação dos tecidos com auxílio de tesoura, o meio foi aspirado com

uma seringa sem agulha. Os fragmentos de tecido foram transferidos para um frasco

plástico contendo tampão na proporção de 1 g de tecido: 1,5 ml de tampão contendo

0,55 mM de glicose e 1,0 mg de colagenase tipo I (Worthington 128 U/mg). Os frascos

foram incubados em banho maria a 37ºC sob agitação constante por 30 minutos. Os

adipócitos isolados foram filtrados em meia de “nylon” e em seguida lavados três vezes

com o tampão Krebs-Henseleit sem glicose para a remoção da colagenase e estromas

vasculares. As células foram separadas do tampão por flotação. Para a contagem dos

adipócitos utilizamos um frasco para cada TAB com a mesma quantidade de tampão e

de células que foi mantido fora do banho durante o período de incubação e contado ao

final em câmara de Neubauer em microscópio óptico (Bioval).

3.7 Síntese in vivo de ácidos graxos de novo

A síntese de AG de novo de todas as possíveis fontes foi avaliada in vivo pela

incorporação de trítio (3H) da água tritiada (3H2O) em ácidos graxos. A metodologia se

baseia na premissa de que a 3H2O se distribui pelo organismo juntamente com a água

corporal e mantém sua atividade específica constante por longos períodos de tempo,

24


tanto no plasma quanto nos tecidos. Durante a síntese de ácidos graxos, o 3H é

incorporado em ligações estáveis C-H, por meio da troca de 3H com os H dos

nucleotídeos de piridina reduzidos (NADPH), que são utilizados nas reações de redução

(WINDMUELLER; SPAETH, 1966).

Para a determinação da síntese de ácidos graxos in vivo, foi administrado 1 mCi

de água tritiada (Amersham) por animal por via intraperitoneal. Uma hora após a

injeção os animais foram anestesiados com isoflurano (BioChimico). O sangue foi

coletado por punção cardíaca em tubos heparinizados e centrifugado a 1.000 g por 15

minutos a 4ºC para a obtenção do plasma. Os TAB foram retirados, pesados e

homogeneizados em mistura clorofórmio: metanol (2:1) para a extração dos lipídios,

transferidos para provetas de vidro e o volume foi completado para 10 ml com a mesma

mistura (FOLCH; LEES; SLOANE STANLEY, 1957). Após a extração, o material foi

filtrado em lã de vidro, e ao filtrado foi adicionada água deionizada na proporção 1:5. A

fase superior foi descartada, e a fase clorofórmica inferior foi lavada três vezes com

mistura de fase superior composta de clorofórmio, metanol e mistura de sais (0,528 g de

CaCl2.H20; 0,732 g de MgCl2.6H2O; 5,8 g de NaCl em 940 ml de H2O) nas proporções

21,1: 337: 330. Para o isolamento dos AG, foi retirada uma alíquota de 4 ml, de onde foi

evaporado todo o clorofórmio em banho maria a 50ºC. Após a adição de 20 ml de KOH

etanólico (1 ml de KOH 14,5 M + 20 ml de álcool etílico), os tubos foram tampados e

levados ao banho maria a 80ºC por duas horas para a saponificação dos lipídios. Após

esse período, os tubos foram mantidos destampados no banho a 50ºC para a evaporação

do álcool etílico. O material saponificado foi então lavado três vezes com 8 ml de éter

de petróleo para a remoção dos lipídios não saponificáveis. Posteriormente a amostra foi

acidificada com ácido perclórico a 6%. Os AG foram extraídos com éter de petróleo e

transferidos para frascos de cintilação, de onde o éter foi evaporado. Após a evaporação,

25


foram adicionados 10 ml de coquetel de cintilação. Para a determinação da atividade

específica do trítio no plasma, o mesmo foi diluído 20 vezes em água deionizada e uma

alíquota de 10 µl da diluição foi transferida para frasco de cintilação com 10 ml de

coquetel de cintilação. A radioatividade no plasma e a incorporada na fração dos AG

teciduais foram medidas em contador de cintilação Tri Carb 2100 TR.

A velocidade da síntese de ácidos graxos de novo foi calculada pela seguinte

fórmula:

μ / hora incorporadoemAG

H á á ⁄∙ 1013,3

∙1

2 1

O cálculo se baseia nos trabalhos de Windmueller & Spaeth, (1966). A atividade

específica da água tritiada (DPM de 3H ml de H2O) é obtida a partir da radioatividade

plasmática, considerando que cada mL de plasma contém 0,94 ml de água. O fator 109

13,3 corrige a discriminação isotópica e converte átomo-grama de hidrogênio em nmol

de AG com 16 átomos de carbono sintetizados. O cálculo pressupõe que metade de

todos os átomos de hidrogênio são provenientes da água. Esta técnica estima a síntese

de ácidos graxos a partir de todas as unidades de dois carbonos, independente do tipo de

substrato utilizado.

3.8 Síntese in vitro de ácidos graxos de novo

Para a avaliação da síntese de AG de novo in vitro foram utilizados adipócitos

isolados conforme descrito no item 3.6. Foram incubados 400 µl da suspensão de

adipócitos em 1000 µl de tampão Krebs-Henseleit-Hepes pH 7,4 com 5 mM de glicose

e 3% de albumina, acrescido de 1,5 mCi de 3H2O por 1 hora. Ao término da incubação a

26


reação foi interrompida acrescentando-se 1 ml de clorofórmio:metanol (2:1) para a

extração dos TAG e posterior saponificação conforme descrito no item 3.8. O cálculo da

velocidade de incorporação de 3H2O em AG-TAG e GLI-TAG foi feito conforme o item

3.8 considerando a atividade específica da 3H2O no tampão de incubação, a qual foi

calculada dividindo-se o DPM de 3H/ml de H2O do tampão pelo átomo-grama do

hidrogênio da H2O.

3.9 Atividade da Lipase Lipoprotéica (LPL)

A determinação da atividade da lipase lipoprotéica (LPL) foi baseada no método

de Nilsson-Ehle & Schotz, (1976), fundamentada na reação:

TAG (glicerol tri[1-14C]oleato) LPL glicerol + 3(14C-oleato)

Os TAB epididimal e retroperitoneal foram homogeneizados em sacarose 250

mM, EDTA 1 mM e heparina 20 U/ml (pH 7,4) na proporção de 100 mg de tecido:1 ml

de tampão. O homogenado foi centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4°C e o

sobrenadante, abaixo da camada gordurosa, foi utilizado para determinação da atividade

da LPL (HIETANEN; GREENWOOD, 1977).

O substrato, contendo 78 µmol de trioleína, 4 mg de lisolecitina em clorofórmio

e 12,5 µCi de glicerol tri[1-14C]oleato em tolueno (Amersham, Sunnyvale, CA, USA)

foi preparado no dia anterior ao ensaio. Os solventes orgânicos foram evaporados sob

corrente de nitrogênio à temperatura ambiente. Após a adição de 5 ml de glicerol a

mistura foi homogeneizada vigorosamente em vórtex.

27


Para o ensaio, a mistura de reação foi preparada contendo duas partes de

substrato, duas partes de tampão para LPL (Tris 0,2 M, pH 8,8, albumina bovina livre

de ácidos graxos 6% e NaCl 0,15 M) e uma parte de soro de rato jejuado por 36 horas.

O soro é fonte de apolipoproteina C-II, um co-fator requerido para a ativação da enzima.

Além dos ensaios contendo a amostra, foram realizados ensaios sem a adição da

amostra (Branco) e tubos contendo além da amostra, NaCl 5M, um inibidor da LPL

(Inibido). Em todos os tubos foram adicionados 100 µl da mistura de reação. No tubo

branco foram acrescentados 150 µl de água destilada, no tubo inibido 50 µl de NaCl 5

M e no desconhecido 50 µl de água destilada. Após agitação em vórtex e pré-incubação

a 37ºC por 15 minutos sob agitação, foram acrescentados 100 μl da amostra nos tubos

inibidos e nos tubos experimentais. A incubação foi mantida por 60 minutos a 37ºC sob

agitação (80 ciclos por min) em banho maria. A reação foi interrompida com a adição

de 3,25 ml da mistura de extração de VAUGHAN [(BELFRAGE; VAUGHAN, 1969)

(clorofórmio-heptano-metanol 1,25:1,1:1,41)] seguido de agitação em vórtex. Em

seguida, foi adicionado 1 ml de tampão carbonato-borato 0,1 M (carbonato de potássio

0,05 M e ácido bórico 0,05 M) pH 10,5 e o tubo de reação foi novamente agitado em

vórtex seguido de centrifugação a 1.000 g por 15 min. Alíquotas de 0,8 ml da fase

aquosa superior foram transferidas para frascos de cintilação contendo 9 ml de líquido

de cintilação (SX20-5, Fisher Scientific) para contagem da radioatividade em contador

de cintilação Tri Carb 2100 TR (Packard). Para o cálculo da atividade da enzima, o

DPM da amostra foi subtraído pelo DPM do inibido. A atividade enzimática da LPL foi

expressa em nmol de ácido oléico liberado por minuto por miligrama de proteína. A

dosagem de proteína foi realizada pelo método BCA – Bicinchoninic Acid, Pierce, USA

(SMITH et al., 1985).

28


3.10 Captação de Glicose in vitro

Os adipócitos (200 µl por frasco) isolados foram incubados em 800 µl de tampão

Krebs-Henseleit-Hepes pH 7,4, contendo 3% de albumina e acrescido de 2-desoxi-1-

[14C]-glicose (0,5 µCi) e glicose 1mM (FOLEY et al., 1980). Após incubação de 3

minutos a 37º C sob agitação constante, a captação da hexose foi interrompida

retirando-se uma alíquota de 200 µl e transferindo-se para tubo de microcentrífuga

contendo o óleo dinonilftalato (0,98 g/l). Como o óleo apresenta densidade

intermediária entre as células e o meio de incubação, obteve-se após uma rápida

centrifugação (30 segundos), uma solução trifásica: na parte inferior do tubo se

encontrava o meio de incubação contendo a 2-desoxi-1-[14C]-glicose não captada pelos

adipócitos, na fase intermediária o óleo e na fase superior os adipócitos. O tubo foi

cortado no meio da fase oleosa e os adipócitos foram dissolvidos em líquido de

cintilação SX20-5 (Fisher Scientific) para contagem da radioatividade em cintilador

Packard Tri-Carb 2100 TR. Os adipócitos foram contados conforme descrito no item

3.6 e o cálculo foi corrigido para 106 células.

3.11 Incorporação de 1-14C-piruvato e 1-14C-glicerol em lipídios totais

Os adipócitos (200 µl por frasco) isolados foram incubados em 800 µl de tampão

Krebs-Henseleit-Hepes pH 7,4 sem glicose e contendo 3% de albumina, acrescido de 1-

[14C]-piruvato (1 mM, 0.5 μCi) ou 1-[14C]-glicerol (1 mM, 1 μCi). Após incubação por

1 hora a 37ºC sob agitação constante, a incorporação dos radioisótopos em lipídios

totais foi interrompida por choque térmico (~ 2ºC) em gelo. As células foram lavadas

com salina para retirar o restante de radioativo não utilizado e posteriormente

29


adicionou-se clorofórmio:metanol (2:1). A extração dos lipídios totais foi realizada

conforme detalhado no item 3.12.

3.12 Extração dos lipídios totais

A extração dos lipídios totais das células foi realizada segundo o método de

Folch, Lees, & Sloane Stanley, 1957. Após incubação as células foram transferidas para

provetas e foi adicionado clorofórmio:metanol (2:1), as amostras foram então mantidas

em repouso overnight a 4°C. Após este período, a fase superior foi aspirada, deixando

um pequeno filme que foi lavado 3 vezes com a mistura de fase superior (clorofórmio,

metanol e mistura salina na proporção 21,1:337:330). A mistura salina continha CaCl2

0,04%; MgCl2 0,034% e NaCl 0,58%. Para determinação da incorporação dos

substratos marcados com 14C em lipídios totais, uma alíquota do extrato clorofórmico

foi evaporada e o resíduo dissolvido em líquido de cintilação SX20-5 (FISHER

SCIENTIFIC) para posterior contagem da radioatividade em contador de cintilação Tri

Carb 2100 TR.

3.13 Atividade da Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase (PEPCK)

Para a medida da atividade da PEPCK, 0,5 g dos TAB foram homogeneizados

em 1 ml de tampão, contendo 0,2 M de sacarose, 20 mM de trietanolamina, 5 mM de 2-

β-mercaptoetanol, 1mM de EDTA, com pH 7,5. O homogenado foi centrifugado a

10.000 g à 4º C durante 15 minutos. A camada lipídica superior foi descartada e o

sobrenadante novamente centrifugado a 100.000 g (4º C) durante 30 minutos para

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3.14 Atividade da Gliceroquinase (GK)

O método utilizado para a medida da atividade da enzima gliceroquinase, se

baseia na fosforilação de glicerol-14C a glicerol fosfato-14C, determinado conforme o

trabalho de Newsholme, Robinson, & Taylor, (1967).

Para a preparação do homogenado foram utilizados 500 mg de TAB em 1 ml de

tampão contendo KCl 1% e EDTA 1 mM, seguido de centrifugação de 4.000 g por 10

minutos a 4ºC. O infranadante obtido da centrifugação e os tubos contendo 100 µl da

mistura de reação foram pré-incubados a 37º C durante 5 minutos. O meio de reação

continha TRIS 100 mM pH 7,5, ATP 6 mM, MgCl2 4 mM, EDTA 1 mM, NaF 25 mM,

2-β-mercaptoetanol 20 mM, glicerol-U-14C, 10 μCi/mL, glicerol 1 mM, fosfocreatina 10

mM, creatina quinase 26,4 U/ml e albumina 1%. Após a pré-incubação, foram

adicionados 20 µl de amostra nos tubos de reação e 100 µl de etanol 98% e 20 µl de

amostra nos tubos “branco”, que foram mantidos em banho maria a 37ºC por 30

minutos. Após o tempo de incubação, o ensaio foi interrompido pela adição de etanol

98% em todos os tubos (menos o branco), que em seguida foram centrifugados a 2.000

g durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante obtido da centrifugação foi utilizado para a

separação do glicerol-14C do glicerol fosfato-14C por cromatografia de papel ascendente

utilizando como solventes: etanol, amônia e água nas proporções 80:4:16

respectivamente, aplicando-se 20 µl do sobrenadante da mistura de reação em papel de

cromatografia Whatman nº 1. Neste sistema, o glicerol não fosforilado move-se à frente

com o solvente e o glicerol fosfato move-se até 5 cm do ponto de aplicação da amostra

quando o solvente se encontra a 30 cm da origem. Ao final da corrida e após a

evaporação do solvente, o papel foi cortado em tiras de 5 cm a partir do ponto de

aplicação da amostra, e as tiras colocadas em frascos contendo líquido de cintilação. A

32


contagem de radioatividade se deu em contador de cintilação Tri Carb 2100 TR. O

resultado foi expresso em nmol.mg de proteína-1.min-1, sendo a dosagem de proteína

realizada pelo método de LOWRY et al., (1951).

3.15 Lipólise in vitro

Para determinar a lipólise basal e a resposta lipolítica à noradrenalina, alíquotas

de 200 µl da suspensão de adipócitos isolados foram incubados com 800 µl de tampão

Krebs-Henseleit suplementado com 3% de albumina bovina livre de ácidos graxos, 27

mM de HEPES e 5 mM de glicose, pH 7,4, por 60 minutos na presença de 10-6 M de

noradrenalina (Sigma). Para a determinação da lipólise basal, foram incubados frascos

sem noradrenalina, contendo apenas o tampão.

A reação foi interrompida pela imersão dos frascos em gelo, e o meio de

incubação foi aspirado com auxílio de seringas. Após a flotação dos adipócitos

remanescentes, o meio de incubação ausente de adipócitos foi utilizado para

determinação da concentração de glicerol. A taxa lipolítica foi estimada pela liberação

de glicerol no meio de incubação expressa em µmol.106 células-1.h-1. A concentração de

glicerol foi determinada enzimaticamente, com kit comercial (Bioclin-Quibasa).

3.16 Western Blot

Para a determinação do conteúdo de proteínas por western blot os tecidos foram

homogeneizados em tampão RIPA 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4) contendo 150 mM de

NaCl; 1 mM de EDTA; 1% de Triton X-100; 0,1% de SDS; 5 µg/ml de aprotinina;

33


1mM de PMSF; 10 mM de ortovanadato de sódio; 100 mM de NaF; 10 mM de

pirofosfofato de sódio na proporção de 2:1. O homogenado foi centrifugado a 17.000 g

por 20 minutos à 4ºC, para a remoção dos debris celulares e o sobrenadante foi separado

para a realização da eletroforese e dosagem de proteínas pelo método de Lowry

(LOWRY et al., 1951). Aos homogenados foi adicionado tampão da amostra (20% de

glicerol, 125 mM de Tris-HCl, 4% de SDS, 100mM de ditiotreitol, 0,02% de azul de

bromofenol, pH 6,8) na proporção 1:4. Antes da realização da eletroforese, as amostras

foram fervidas a 100ºC por 5 minutos para a desnaturação das proteínas.

Após a corrida eletroforética, o gel foi preparado para a transferência (BioRad

Trans-Blot SD Cell, EUA) de acordo com o método descrito por Towbin, Staehelin, &

Gordon, (1979). Inicialmente, o gel e a membrana de nitrocelulose foram colocados na

solução de transferência contendo 48 mM de Tris, 39 mM de glicina, SDS 10% e 0,2 M

de metanol. Após a montagem do sistema de transferência, as proteínas presentes no gel

de poliacrilamida foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, sendo o

processo de transferência realizado durante 30 minutos sob a voltagem fixa de 20 volts,

à temperatura ambiente. Após o término da transferência, a membrana foi submetida a

immunoblot, sendo incubada por 1 hora, sob agitação, à temperatura ambiente em

solução de leite desnatado em pó 10%, diluído em solução TBS-T contendo 0,02 M de

Tris-HCl, 0,16 M de NaCl e 0,1% Tween 20. Após o bloqueio, a membrana foi

incubada overnight a 4ºC com anticorpos primários Os anticorpos primários foram

diluídos em solução de TBS-T contendo 2,5% de albumina bovina e 0,01% de azida

sódica. As membranas foram lavadas com solução de TBS-T, e posteriormente

incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário. Após a

lavagem das membranas para remoção do excesso de anticorpo, a membrana foi

revelada em fotodocumentador (BioRad) utilizando kit de quimiluminescência

34


amplificada (ECL, Amersham). As bandas reveladas foram fotografadas e quantificadas

por densitometria utilizando o software Image Lab (BioRad). Após a quantificação

densitométrica das proteínas, o valor obtido na análise foi dividido pela densitometria

das proteínas constitutivas ß-actina ou α-tubulina.

Os anticorpos primários utilizados foram acetil-CoA carboxilase (ACC,

#3676), ácido graxo sintase (#3189), AKT (#9272), fosfo-AKTSer473 (#9271),

ATGL (#2138), CREB (#9197), fosfo-CREBSer133 (#9198), GLUT-4 (#2213), HSL

(#4107), fosfo-HSLSer660 (#4126), PPARγ (#2340), STAT3 alpha (#8768), fosfo-

STAT3Tyr705 (#9138) da Cell Signaling; α-tubulina (SC-32293), β-actina (SC-81178),

β3-AR (SC-50436), aquaporina 7 (SC-28625), GPD2 (SC-161682), PEPCK (SC-

32879) e TNF-R1 (SC-1070) da Santa Cruz Biotechnology; gliceroquinase (ab126599)

e fosfo ATGLSer406.(ab135093) da Abcam e ATF3 (HPA001562) e α-2A-AR

(SAB4500548) da Sigma Aldrich.

Os anticorpos secundários utilizados foram: IgG goat anti-mouse da KPL, IgG

anti-rabbit (#7074) da Cell Signaling e IgG anti-goat (A-5420) da Sigma, todos

conjugados à peroxidase.

3.17 Real Time (RTqPCR)

O RNA das amostras dos diferentes tecidos foi extraído pelo método do TrizolTM

(Invitrogen, EUA) e quantificado por densidade óptica em espectrofotômetro (260 nm).

Após tratamento de 1µg de RNA total com DNase, foi adicionado o primer de oligo

(dT) (20 pmol; Invitrogen, EUA) em volume total de 11µl, sendo as misturas preparadas

em água DEPC (água milli-Q tratada com dietil-pirocarbonato 0,01% e autoclavada).

35


Após o aquecimento a 70ºC por 5 minutos e posterior resfriamento a 4oC, seguiu-se a

adição da enzima transcriptase reversa e demais reagentes (tampão de reação, dNTP,

água, MgCl2 e 1µl de ImProm-IITM Reverse T recombinante) e assim, a submissão ao

ciclo 25ºC - 42ºC e interrompida por aquecimento a 70ºC por 15 minutos. Os cDNAs

foram posteriormente submetidos ao PCR em tempo real utilizando-se Platinum®

SYBR® Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen) com sequencias de primers

específicos descritas na Tabela II. Os resultados foram adquiridos em sistema de

detecção Perkin-Elmer ABI Prism 7500 com os seguintes parâmetros: 50oC (2 minutos),

95oC (2 minutos), 40 ciclos de 95oC (15 segundos), 57oC (30 segundos), 60oC (30

segundos), seguido pelo ciclo de dissociação para verificação de um produto através de

análise pela curva melting. Para a análise do RNAm, o nível relativo de expressão do

gene de interesse foi calculado em referência à expressão de RPL32 (ribosomal protein

L32), que representam o controle interno endógeno (housekeeper gene), utilizando-se o

método de 2−ΔΔCT (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).

Tabela II - Sequências dos primers utilizados para as reações de PCR em tempo real. Gene Forward Reverse

PAI-1 CCTCTTCATGGGCCAAGT GGTAAGGAGGAGTTGCCTTC

MCP-1 CTGGATCGGAACCAAATGAG AAGGCATCACAGTCCGAGTC

L32 TCTGGTGAAGCCCAAGATCG CTCTGGGTTTCCGCCAGTT

IL-6 AGTTGCCTTCTTGGGACTGA CCTCCGACTTGTGAAGTGGT

LPL GACGTGTCTAACTGCACATTCA CCCGTTACCGTCCATCCAT

RGS-2 AGAAAATGAAGCGGACACTCTT TTGCCAGTTTTGGGCTTC

36


3.18 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A

análise estatística utilizou o teste “t de Student”. A área sob a curva para o cálculo do

TTG foi calculado utilizando o método trapezoide (GraphPad Prism 5). Para a análise

da frequência de tamanho dos adipócitos e da atividade lipolítica foi utilizada a análise

de variância em duas vias (ANOVA two way) e o teste de Bonferroni para determinar a

diferença entre as faixas de tamanho. Adotou-se nível de significância de 5% em todos

os testes. Para a análise dos resultados utilizou-se o programa SigmaPlot for Windows

versão 11.0 (Systat Software INC.).

37

______________________________________________________________________ Resultados

4. RESULTADOS

Os resultados do presente estudo serão apresentados em quatro subitens, sendo:

1) caracterização metabólica do modelo de obesidade induzida por dieta HL, incluindo

os parâmetros gerais, a resistência à insulina e o perfil inflamatório dos camundongos;

2) síntese de TAG, incluindo a origem dos ácidos graxos e a geração do G3P; 3)

degradação do triacilglicerol (lipólise) e, por fim, 4) as vias de sinalização envolvidas

no fenótipo observado.

4.1 Caracterização metabólica do modelo experimental

4.1.1 Massa corporal

A massa corporal foi avaliada a cada três dias (Figura 4) e teve como finalidade

a padronização do modelo em nosso laboratório e o acompanhamento da instalação do

fenótipo da obesidade. Desde a primeira semana, os camundongos alimentados com a

dieta HL apresentaram maior massa corporal (15%) quando comparados aos

camundongos alimentados com a dieta controle. Até a sexta semana de ingestão, o

ganho de massa corporal foi maior nos camundongos alimentados com a dieta HL, no

entanto, o ganho de massa corporal foi similar entre os grupos na sétima e oitava

semana experimental. Os camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram ao

final das 8 semanas experimentais um aumento de 27% na massa corporal quando

comparados aos controles (Figura 5A). O ganho de massa total, calculado pela diferença

entre a massa corporal final e inicial, foi em média 50% maior nos animais alimentados

com a dieta HL quando comparados aos controles (Figura 5B). Ao final das 8 semanas

38

______________________________________________________________________ Resultados

experimentais, a maior massa corporal pode ser facilmente observada nos animais HL,

conforme demonstrado na Figura 6.

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1015

25

35

45

55

Controle Hiperlipídica

**

**

**

* *

Semanas

Pes

o co

rpor

al (

g)

Figura 4 - Efeito da dieta hiperlipídica no ganho de massa corporal de camundongos alimentados durante 8 semanas. Cada ponto representa a média±EPM (n=30). *P<0,05.

0

20

40

60

*

Mas

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orpo

ral (

g)

0

10

20

30

40

*

Gan

ho d

e m

assa

tota

l (g)


A B

Figura 5 - Efeito da dieta hiperlipídica administrada por 8 semanas na massa corporal final (A) e ganho de massa corporal total (B) em camundongos. As colunas e barras representam a média±EPM (n=30). *P< 0,05.

___

Figucavid

meta

com

sem

coles

(Tab

de co

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__________

ura 6 - Imagdade abdom

4.1.2 Par

Foi anali

abólico dos

a dieta HL

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ela 2 e Figu

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__________

gens de camminal após 8

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isado o perf

animais al

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ura 8).

__________

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__________

controle e e dieta

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mento de 37,

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duziu uma r

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__________

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camundon

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40% na con

s de adipon

__________Resul

al e ventral

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nectina e le

39

_____ ltados

l e da

adrão

ntados

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erol e

ntrole

sérica

eptina

40

______________________________________________________________________ Resultados

Tabela 2 – Concentrações séricas de ácidos graxos livres, glicerol, triacilglicerol, colesterol, corticosterona, leptina e adiponectina em camundongos alimentados após 8 semanas com dieta controle ou hiperlipídica.


Ácidos graxos livres (µmol.ml-1) 0,63 ± 0,07 0,74 ± 0,08

Glicerol (µmol.ml-1) 0,13 ± 0,01 0,18 ± 0,01*

Triacilglicerol (mg.ml-1) 1,56 ± 0,12 1,90 ± 0,23

Colesterol (mg.ml-1) 1,02 ± 0,03 0,96 ± 0,05

Corticosterona (µg.ml-1) 0,10 ± 0,01 0,07 ± 0,01*

Leptina (ng.ml-1) 29,67 ± 1,27 29,52 ± 1,86

Adiponectina (µg.ml-1) 2,54 ± 0,15 2,29 ± 0,20

Os valores representam média±EPM (n=10). *P< 0,05.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Tri

aci

lglic

ero

l (m

g.m

l-1)

0.0

0.5

1.0

1.5

Co

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ero

l (m

g.m

l-1)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

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do

s g

raxo

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res

(µm

ol.m

l-1)

0.0

0.0

0.1

0.1

0.2 *

Glic

ero

l ( m

ol.m

l-1)


A B

DC

Figura 7 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração sérica de triacilglicerol (A), colesterol (B), ácidos graxos livres (C) e glicerol (D) em camundongos. As barras e colunas representam a média±EPM (n=7). *P< 0,05.

41

______________________________________________________________________ Resultados

0

1000

2000

3000A

dip

on

ect

ina

(p

g.m

l-1)

0

10

20

30

40

Le

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a (

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)

0.00

0.05

0.10

0.15

*

Co

rtic

ost

ero

na

( g

.ml-1

)


A B C

Figura 8 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração sérica de adiponectina (A), leptina (B) e corticosterona (C) em camundongos. As barras e colunas representam a média±EPM (n=10). *P< 0,05.

4.1.3 Massa do tecido adiposo

A dieta HL, após 8 semanas, induziu um aumento na massa do RETRO (12%),

EPI (38%) e mesentérico (78%), mas promoveu uma redução de 17% na massa do

TAM, quando comparado aos camundongos alimentados com a dieta controle (Tabela

3, Figura 9).

Tabela 3 - Massa dos tecidos adiposos brancos (TAB) retroperitoneal (RETRO), epididimal (EPI) e mesentérico (Mes) e do tecido adiposo marrom (TAM) de camundongos alimentados com dieta controle ou hiperlipídica por 8 semanas.

g de tecido.100g de PC-1 Controle Hiperlipídica

RETRO 1,17 ± 0,03 1,32 ± 0,05*

EPI 3,75 ± 0,10 5,20 ± 0,18*

Mes 1,72 ± 0,07 3,07 ± 0,09*

TAM 0,46 ± 0,03 0,38 ± 0,02*


42

______________________________________________________________________ Resultados

0

2

4

6

RETRO EPI Mes TAM

*

*

*

*

Pe

so (

g.1

00

g d

e P

C-1

)

Figura 9 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na massa dos tecidos adiposos brancos RETRO (RETRO), epididimal (EPI) e mesentérico (Mes) e marrom (TAM) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=30). *P< 0,05.

4.1.4 Análise histológica do tecido adiposo

A dieta HL não induziu alteração no tamanho dos adipócitos (Figura 10A) do

RETRO ou na frequência de distribuição das células em diferentes intervalos de áreas

(Figuras 10B). No entanto, no EPI é possível observar uma redução de 23% no diâmetro

médio das células nos camundongos alimentados com a dieta HL (Figura 10A). Esta

redução se mostra evidente por uma maior concentração de células na faixa de 240-

1000 µm2 (Figura 10C).

43

______________________________________________________________________ Resultados

0

500

1000

1500

2000


*

RETRO EPI

Áre

a ( m

2)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 110

10

20

30

RETRO

Fre

quên

cia

(%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 110

10

20

30

40

*

*

EPI

Fre

quên

cia

(%)

Faixas de frequencia de

áreas (M2)1 - <2392 - 240-4993 - 500-9994 - 1000-14995 - 1500-19996 - 2000-24997 - 2500-29998 - 3000-34999 - 3500-399910- 4000-449911- 4500-499912 - >5000

A

B C

Figura 10 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na área (A) e na frequência de distribuição do diametro dos adipócitos dos TAB retroperitoneal (RETRO, B) e epididimal (EPI, C) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05, teste t de Student, frequências ANOVA two-way com Bonferroni.

Nas imagens capturadas no aumento de 100X foi observado um maior infiltrado

inflamatório nos TAB dos camundongos alimentados com a dieta HL quando

comparado aos controles. Em relação ao RETRO, os camundongos alimentados com a

dieta HL parecem não ter um efeito inflamatório tão pronunciado quanto ao EPI. As

estruturas “crown-like”, apontadas pelas setas, são visualizadas no TAB dos

camundongos alimentados com a dieta HL, contudo a presença dessas estruturas é

menos frequente no TAB RETRO (Figura 11).

___

FiguEpidsemamacr

veze

comp

Tais

hiper

__________

ura 11 - Secdidimal de anas. As serófagos. Co

4.1.5 Ava

Os camu

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__________

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__________

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, respectiva

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ela 4, Figura

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44

_____ ltados

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% e 5

uando

a 12).

mia e

45

______________________________________________________________________ Resultados

Tabela 4 - Concentração sérica de glicose e insulina em camundongos alimentados após 8 semanas com dieta controle ou hiperlipídica.


Glicemia (mg.dl-1) 177,25 ± 12,16 251,3 ± 17,59*

Insulina (mUI.ml-1) 35,18 ± 5,54 195,76 ± 60,26*


0

100

200

300

*

Glic

ose

(m

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0

100

200

300

*In

sulin

a (

mU

I.ml-1

)


A B

Figura 12 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração sérica de glicose (A) e insulina (B) em camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=10). *P< 0,05.

A dieta HL induziu uma notável intolerância à glicose nos camundongos. Após

45, 60, 90 e 120 minutos da sobrecarga de glicose a glicemia foi maior nos

camundongos alimentados com a dieta HL quando comparada aos alimentados com a

dieta controle (Figura 13A). O pico de glicemia é maior após 120 minutos nos animais

que receberam dieta HL, e após este tempo, a glicemia retorna ao valor normal nos

controles, mas não nos animais HL. Observa-se um reduzido clearance de glicose,

representado por um aumento de mais de 55% da área sob a curva dos valores

glicêmicos após sobrecarga dessa hexose nos animais alimentados com a dieta HL

quando comparados aos controles (Figura 13B).

46

______________________________________________________________________ Resultados

0 15 30 45 60 75 90 105 1200

200

400

600

CT HL

*

**

*

Tempo (minutos)

Glic

em

ia (

mg

.dl-1

)

Controle Hiperlipídica0

20000

40000

60000*

Glic

emia

(m

g.dl

-1X

120

min

)

A

B

Figura 13 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na glicemia nos tempos 0, 10, 20, 30, 45, 60, 90, e 120 min (A) e na área sob a curva (B) do teste de tolerância à glicose em camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05.

Os camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram uma redução de

50% na fosforilação de AKT em serina 473 (Ser473) no EPI, mas não apresentaram

alteração nesta sinalização no RETRO quando comparados aos camundongos

alimentados com a dieta controle (Figura 14).

47

______________________________________________________________________ Resultados

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

*


pAKTSer473

CT HL CT HL

RETRO EPI

AKT (62 kDa)

pA

KT

Se

r47

3 /AK

T(%

do

s co

ntr

ole

s)

Figura 14 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico da AKT fosforilada em serina 473 (pAKTSer473) nos tecidos adiposos branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) em camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05.

4.1.6 Perfil inflamatório

A dieta hiperlipídica induziu uma redução de 40% na concentração de

adiponectina apenas no EPI (Figura 15B). Esta dieta não promoveu mudanças na

concentração de TNF-α, IL-6 e IL-10 tanto no RETRO (Figura 15A) quanto no EPI

após 8 semanas de ingestão (Figura 15B).

0

20

40

60

80

100

TNF IL-6 IL-10 Adipo

RETRO

Cito

cin

as

(pg

.mg

de

pro

teín

a-1

)

0

20

40

60

80

TNF IL-6 IL-10 Adipo

*

EPI

Cito

cin

as

(pg

.mg

de

pro

teín

a-1

)


A B

Figura 15 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na concentração do TNFα, IL-6, IL-10 e adiponectina (Adipo) em homogenados do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO, A) e epididimal (EPI, B) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05.

48

______________________________________________________________________ Resultados

Assim como não houve alteração nas concentrações de TNF-α nos tecidos

adiposos, também não foi observada alteração no conteúdo proteico do receptor de

membrana de TNF-α nos TAB RETRO e EPI de camundongos alimentados com a dieta

HL quando comparados aos alimentados com a dieta controle (Figura 16).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


RETRO EPI

TNF R (55 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

Re

cep

tor

de

TN

F-

1/

-tu

bu

lina

(% d

os

con

tro

les)

Figura 16 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico do TNF R1 nos tecidos adiposos retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.

A ingestão de dieta HL também não alterou a expressão gênica de IL-6, MCP-1

e PAI-1 no RETRO (Figura 17A). Contudo no EPI há aumento de quatro vezes no

mRNA da MCP-1 e de 2,5 vezes no do PAI-1 (Figura 17B) nos camundongos HL

quando comparados aos controles, sem alteração na expressão gênica de IL-6.

49

______________________________________________________________________ Resultados

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Il-6 MCP-1 PAI-1

RETROm

RN

A

(% L

32

)

0

1

2

3

4

5

Il-6 MCP-1 PAI-1

*

*

EPI

mR

NA

(%

L3

2)


A B

Figura 17 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no mRNA da IL-6, MCP-1 e PAI-1 nos tecidos adiposos retroperitoneal (RETRO, A) e epididimal (EPI, B) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.

50

______________________________________________________________________ Resultados

4.2. Síntese de triacilglicerol: origem dos ácidos graxos e geração do

glicerol-3-fosfato

Para avaliar a síntese de TAG no RETRO e EPI dos camundongos alimentados

com a dieta HL, foram avaliadas as vias de síntese de ácidos graxos (síntese de novo e

captação da circulação) (4.2.1) e as de glicerol-3-fosfato (via glicolítica,

gliceroneogênese e fosforilação direta do glicerol) (4.2.2).

4.2.1 Fontes de ácidos graxos

Os ácidos graxos utilizados na síntese da molécula de TAG podem ser

provenientes da síntese de novo, avaliada in vivo pela administração de 3H2O e in vitro

em adipócitos isolados; ou da captação de AG pré-formados provenientes de

lipoproteínas circulantes pela ação da LPL; ou da reciclagem de AG endógenos

provenientes da hidrólise do TAG.

4.2.1.1SíntesedeAGdenovo

A dieta HL induziu um aumento na síntese de ácidos graxos tanto in vivo (52%)

quanto in vitro (254%) no tecido adiposo EPI (Tabela 5 e Figura 18). Contudo, no

RETRO a dieta HL induziu um aumento somente na síntese de ácidos graxos avaliada

in vitro (57%) (Tabela 5 e Figura 18B).

51

______________________________________________________________________ Resultados

Tabela 5 – Velocidade de síntese de ácidos graxos de novo avaliada in vivo e in vitro no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados com a dieta controle ou hiperlipídica por 8 semanas.

TAB Controle Hiperlipídica

in vivo(µmol.g-1.h-1)

RETRO 5,30 ± 1,13 6,48 ± 0,40

EPI 4,30 ± 0,25 6,53 ± 0,34*

in vitro(nmol.106 cél-1.h-1)

RETRO 3,99 ± 0,19 6,24 ± 0,70*

EPI 1,17 ± 0,13 4,15 ± 0,18*

Os valores representam média±EPM (n=5 ou 6). *P <0,05.

52

______________________________________________________________________ Resultados

0

2

4

6

8

RETRO EPI


*S

ínte

sed

e n

ovo

de

AG

in v

ivo

(µm

ol.g

te

cid

o-1

.ho

ra-1

)

0

2

4

6

8

RETRO EPI

*

*

Sín

tese

de

no

vo d

e A

Gin

vitr

o(n

mo

l.10

6 c

éls

-1.h

ora

-1)

A

B

Figura 18 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na velocidade de síntese in vivo (A) e in vitro (B) de ácidos graxos de novo no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.

No RETRO dos camundongos alimentados com a dieta HL houve redução de

aproximadamente 60% no conteúdo da ACC quando comparado aos camundongos

53

______________________________________________________________________ Resultados

controles, já o EPI não apresentou alteração no conteúdo desta enzima (Figura 19A). A

dieta HL não alterou o conteúdo proteico da AGS no RETRO e EPI (Figura 19B).

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

AGS (281 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

AG

S/

-tu

bu

lina

(% d

os

con

tro

les)

0.0

0.5

1.0

1.5

*

ACC (265 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

RETRO EPI

AC

C/

-tu

bu

lina

(% d

os

con

tro

les)

A

B


Figura 19 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico das enzimas acetil-CoA carboxilase (ACC) (A) e ácido graxo sintase (AGS) (B) nos tecidos adiposos branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-7). *P< 0,05.

4.2.1.2Lipaselipoproteica

A captação de AG pré-formados provenientes da circulação, avaliada pela

atividade e expressão gênica da LPL foi diferencialmente regulada pela dieta HL nos

tecidos avaliados.

A dieta HL induziu uma redução de 80% na atividade da LPL no RETRO, mas

induziu um aumento de 100% na atividade desta enzima no EPI (Tabela 6, Figura 20A).

A expressão gênica da LPL não foi alterada pela dieta HL no RETRO, mas foi

54

______________________________________________________________________ Resultados

aumentada em 7 vezes no EPI dos camundongos alimentados com a dieta HL quando

comparados aos controles (Figura 20B).

Tabela 6 - Atividade da lípase lipoproteica no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas.

nmol de ácido oléico. min-1 . mg prot-1 Controle Hiperlipídica

RETRO 6,62 ± 1,48 1,34 ± 0,54*

EPI 4,87 ± 0,74 10,08 ± 1,79*

Os valores apresentam média±EPM (n=8). *P< 0,05.

0

5

10

15

RETRO EPI

*

*

Ativ

ida

de

da

LP

L(n

Mo

l AG

.mg

pro

t-1.m

in-1

)

0

2

4

6

8

10

*

RETRO EPI

mR

NA

LP

L/L

32

(%

do

s co

ntr

ole

s)

A B


Figura 20 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade (A) e expressão gênica (B) da lipase lipoproteica (LPL) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=7-8). *P< 0,05.

55

______________________________________________________________________ Resultados

Tabela 7 – Resumo dos efeitos da dieta HL sobre as fontes de ácido graxo no TAB retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados com dieta por 8 semanas.

RETRO EPI

Síntese de AG in vivo ≈

Síntese de AG in vitro

Acetil CoA Carboxilase ≈

Ácido Graxo Sintase ≈ ≈

Lipase lipoprotéica (atividade)

Lipase lipoprotéica (mRNA) ≈

Os símbolos representam não alteração (≈), aumento () ou redução () observada nos animais que ingeriram dieta HL em relação aos controles.

56

______________________________________________________________________ Resultados

4.2.2. Vias de síntese de glicerol-3-fosfato

Foram avaliadas as três vias de geração de G3P: via glicolítica; via

gliceroneogênica e fosforilação direta do glicerol no RETRO e EPI de camundongos

controles e alimentados com dieta HL por 8 semanas.

4.2.2.1Avaliaçãodaviaglicolítica

O índice de captação de glicose pelo RETRO e EPI foi avaliado em adipócitos

isolados de camundongos controles e alimentados com a dieta HL após incubação com

2-desoxi-1-[14C]-D-glicose. A dieta HL induziu uma marcante redução (3,5 e 6 vezes)

na captação de glicose em adipócitos do RETRO e EPI respectivamente (Tabela 8,

Figura 21).

Tabela 8 - Índice de captação de 2-desoxi-1-[14C]-D-glicose in vitro no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica.

nmol.106 células-1.min-1 Controle Hiperlipídica

RETRO 2,45 ± 0,48 0,696 ± 0,18*

EPI 2,16 ± 0,06 0,365 ± 0,11*

Os valores apresentam média±EPM (n=5 ou 6) *P < 0,05.

57

______________________________________________________________________ Resultados

0

1

2

3

4


RETRO EPI

**

Ca

pta

ção

de

2-d

eso

xi-1

-[1

4 C]-

D-g

lico

se(n

mo

l.10

6 c

élu

las-1

.min

-1)

Figura 21 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no índice de captação de 2-desoxi-1-[14C]-D-glicose in vitro em adipócitos isolados dos tecidos adiposos retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.

O conteúdo proteico do transportador de glicose GLUT-4 também foi utilizado

para a avaliação indireta da via glicolítica. A dieta HL induziu uma redução de

aproximadamente 50% do conteúdo proteico de GLUT-4 tanto no RETRO quanto no

EPI quando comparados aos TAB de camundongos alimentados com a dieta controle

(Figura 22).

0.0

0.5

1.0

1.5


*

RETRO EPI

*

Glut-4 (55 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

Glu

t-4

/-t

ub

ulin

a(%

do

s co

ntr

ole

s)

Figura 22 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico de GLUT-4 nos tecidos adiposos branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.

58

______________________________________________________________________ Resultados

4.2.2.2Avaliaçãodaviagliceroneogênica

A via gliceroneogênica foi avaliada em animais controles e tratados com dieta

HL através da velocidade de incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais e da

atividade e conteúdo da PEPCK, enzima chave desta via.

A velocidade de incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais em células

isoladas dos TAB foi reduzida em 4 vezes no RETRO e 3,5 vezes no EPI de animais

alimentados com dieta HL quando comparados aos animais controles (Tabela 9 e Figura

23).

Tabela 9 - Incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com a dieta hiperlipídica.


RETRO 41,55 ± 4,52 14,76 ± 1,40*

EPI 50,91 ± 2,19 4,75 ± 0,39*

Os valores representam média±EPM (n=6). *P < 0,05.

0

20

40

60

RETRO EPI


**

Inco

rpo

raçã

o d

e 1

-[1

4 C]-

piru

vato

(nm

ol.1

06 c

élu

las-1

.min

-1)

Figura 23 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na incorporação de 1-[14C]-piruvato em lipídios totais em adipócitos isolados do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6). *P< 0,05.

59

______________________________________________________________________ Resultados

A atividade e conteúdo da PEPCK, enzima chave da via gliceroneogenica, não

foram alterados no RETRO e EPI de camundongos alimentados com a dieta HL quando

comparados aos camundongos controles (Tabela 10, Figura 24).

Tabela 10 - Atividade da PEPCK no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com a dieta hiperlipídica.

nmol de malato. minuto-1 . mg prot-1 Controle Hiperlipídica

RETRO 11,41 ± 1,46 12,50 ± 1,24

EPI 6,56 ± 1,37 8,50 ± 0,96


0

5

10

15

RETRO EPI


Ativ

ida

de

da

PE

PC

K(n

mo

l de

ma

lato

. m

inu

to-1

.mg

pro

t-1)

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

PEPCK (62 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

PE

PC

K/

-tu

bu

lina

(% d

os

con

tro

les)

A

B

Figura 24 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade (A) e conteúdo proteico (B) da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-8). *P< 0,05.

60

______________________________________________________________________ Resultados

4.2.2.3Avaliaçãodafosforilaçãodiretadoglicerol

O processo de fosforilação direta do glicerol foi estimado pela velocidade de

incorporação de gicerol-U-[14C] em lipídos totais em adipócitos isolados e pela

atividade e conteúdo proteico da GK no TAB de animais controles e alimentados com a

dieta HL.

A velocidade de incorporação de glicerol-U-[14C] em lipídios totais nos

adipócitos isolados do RETRO foi reduzida em 44% nos camundongos alimentados

com a dieta HL quando comparados aos controles (Tabela 11 e Figura 25). No entanto,

a ingestão de dieta HL induziu um aumento de 83% na velocidade de incorporação de

glicerol-U-[14C] em lipídios totais nos adipócitos isolados do EPI quando comparados

aos controles.

Tabela 11 - Incorporação de glicerol-U-[14C] em lipídios totais em adipócitos isolados do tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica.


RETRO 8,81 ± 1,54 4,87 ± 1,46*

EPI 5,26 ± 0,17 9,66 ± 0,81*

Os valores representam média±EPM (n=10 ou 11). *P < 0,05.

61

______________________________________________________________________ Resultados

0

5

10

15


RETRO EPI

*

*

Inco

rpo

raçã

o d

e G

lice

rol-

U-[

14 C

](n

mo

l.10

6 c

élu

las-1

.min

-1)

Figura 25 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na incorporação de glicerol-U-[14C] em lipídios totais em adipócitos isolados do tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=10-11). *P< 0,05.

A dieta hiperlipídica induziu um aumento na atividade da GK, enzima que

fosforila o glicerol a glicerol-3-fosfato, tanto no RETRO (3,4 vezes) quanto no EPI (2,5

vezes) quando comparado aos camundongos controles (Tabela 12 e Figura 26A). Da

mesma forma, a administração da dieta HL induziu um aumento no conteúdo proteico

da GK tanto no RETRO (40%) quanto no EPI (90%) quando comparados aos

camundongos alimentados com a dieta controle (Figura 26B).

Tabela 12 - Atividade da gliceroquinase no tecido adiposo branco (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos controles e alimentados com dieta hiperlipídica.

nmol . minuto-1 . mg prot-1 Controle Hiperlipídica

RETRO 3,73 ± 1,20 12,89 ± 2,13*

EPI 6,60 ± 1,47 16,28 ± 3,38*


62

______________________________________________________________________ Resultados

0

10

20

30

*

*

RETRO EPI


Ativ

ida

de

da

glic

ero

qu

ina

se(n

mo

l . m

inu

to-1

.mg

pro

t-1)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

RETRO EPI

*

* GK (61 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

Glic

ero

qu

ina

se/

-tu

bu

lina

(% d

os

con

tro

les)

A

B

Figura 26 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade (A) e conteúdo proteico (B) da gliceroquinase (GK) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI). As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05.

A dieta HL não induziu alterações no conteúdo da enzima glicerol-3-fosfato

desidrogenase (GPD2), responsável por catalisar a redução de diidroxiacetona fosfato a

G3P (Figura 27A). Adicionalmente, a dieta hiperlipídica não promoveu alteração no

conteúdo proteico da Aqp7 no EPI, um canal de membrana que promove o transporte de

glicerol pela membrana no TAB, mas induziu uma redução de cerca de 50% neste

parâmetro no RETRO quando comparado aos animais controles (Figura 27B).

63

______________________________________________________________________ Resultados

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

GPD2 (83 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPIG

3P

de

sid

rog

en

ase

2/

-tu

bu

lina

(% d

os

con

tro

les)

A

B

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

*

Aqp 7 (37 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

Aq

ua

po

rin

a 7

/-T

ub

ulin

a(%

do

s co

ntr

ole

s)


Figura 27 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo da enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD2) (A) e da aquaporina 7 (Aqp7) (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-12). *P< 0,05.

64

______________________________________________________________________ Resultados

Tabela 13 – Resumo dos efeitos da dieta HL sobre as vias de síntese de G3P no TAB retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados com dieta por 8 semanas.

Retro Epi

Captação de glicose

GLUT-4

Incorporação de piruvato

PEPCK (atividade e conteúdo) ≈ ≈

Incorporação de glicerol

GK (atividade e conteúdo)

GPD2 ≈ ≈

Aquaporina 7 ≈

Os símbolos representam não alteração (≈), aumento () ou redução () observada nos animais que ingeriram dieta HL em relação aos controles.

65

______________________________________________________________________ Resultados

4.3. Degradação do TAG: Lipólise

Foram realizados ensaios para avaliar a lipólise basal e estimulada pela presença

do agente lipolítico noradrenalina (10-6 M) no meio de incubação. Os resultados

mostram que no estado basal, sem estimulação noradrenérgica, a atividade lipolítica foi

semelhante entre os adipócitos de camundongos controles e HL (Figura 28). Quando

incubadas com noradrenalina, tanto as células isoladas dos animais controles quanto dos

animais HL tiveram aumento da atividade lipolítica (RETRO 5,4 e EPI 6,7 vezes),

porém a lipólise estimulada por noradrenalina foi atenuada nos animais HL em ambos

os tecidos (RETRO 57% e EPI 25%) quando comparadas com os adipócitos dos

animais controle (tabela 9 e figura 15). Na comparação da resposta dos dois TAB

estudados ao estímulo com noradrenalina, é interessante notar que o EPI é 2 vezes mais

responsivo ao agente lipolítico do que o retro nos animais controles, e 4x nos animais

HL (Figura 29).

A dieta HL induziu uma redução de 52% no conteúdo do receptor β3 no RETRO

e de 50% no EPI quando comparados aos animais controles (Figura 30A). Já o conteúdo

dos receptores α2 não foi alterado pela ingestão de dieta HL em nenhum dos tecidos

estudados (Figura 30B).

A dieta HL induziu uma redução de 80% no conteúdo da LHS fosforilada no

EPI e de 77% no RETRO quando comparados aos camundongos controles (Figura

31A). De maneira semelhante, o conteúdo da ATGL fosforilada foi reduzido em 62%

no TAB EPI e em 61% no RETRO de camundongos alimentados com a dieta HL

quando comparados aos controles (Figura 31B).

66

______________________________________________________________________ Resultados

0

1

2

3

*

Basal Nor (10-6 M)

RETRO

*

#

Glic

ero

l (M

ol.1

06 C

els

-1)

0

2

4

6

8

10

Basal Nor (10-6 M)

*

EPI

#*

Glic

ero

l (M

ol.1

06 C

els

-1)


A B

Figura 28 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade lipolítica basal e estimulada por 10-6 M de noradrenalina (NOR) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO, A) e epididimal (EPI, B) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05 vs. basal, #P< 0,05 vs. controle, ANOVA two-way com Bonferroni.

0

2

4

6

8

10


RETRO EPI

*

*

#

#

Glic

ero

l (M

ol.1

06 C

els

-1)

Figura 29 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na atividade lipolítica estimulada por 10-6 M de noradrenalina no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5). *P< 0,05 vs. controle, #P< 0,05 vs. retro, ANOVA two-way com Bonferroni.

67

______________________________________________________________________ Resultados

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

* *

3-R (44 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

-Tubulina (55 kDa)


3-R

/-t

ub

ulin

a(%

do

s co

ntr

ole

s)

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

2-R (48 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

-Tubulina (55 kDa)

2

-R/

-tu

bu

lina

(% d

os

con

tro

les)

A

B

Figura 30 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo dos receptores adrenérgicos β3 (A) e α2 (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos alimentados. As barras e colunas representam média±EPM (n=7). *P< 0,05.

68

______________________________________________________________________ Resultados

0.0

0.5

1.0

1.5


RETRO EPI

pLHSSer660

CT HL CT HL

RETRO EPI

LHS (81 kDa)

* *

pL

HS

Se

r66

0/L

HS

(% d

os

con

tro

les)

0.0

0.5

1.0

1.5

RETRO EPI

* *

pA

TG

LS

er4

06/A

TG

L(%

do

s co

ntr

ole

s)

pATGLSer406

CT HL CT HL

RETRO EPI

ATGL (55 kDa)

A

B

Figura 31 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo da lipase hormônio sensível fosforilada em serina 660 (pLHSSer660) (A) e lipase de triacilglicerol do adipócito fosforilada em serina 406 (pATGLSer406) (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=7). *P< 0,05.

69

______________________________________________________________________ Resultados

4.4. Vias de sinalização

Para elucidar os possíveis mecanismos envolvidos na regulação dos processos

metabólicos no TAB de camundongos alimentados com a dieta HL, foram avaliados os

conteúdos do PPARγ, ATF3, pCREB, e pSTAT3, e além da expressão do mRNA do

RGS2.

A dieta HL induziu uma redução de 48% no conteúdo proteico de PPARγ no

RETRO e de 64% no EPI quando comparados a dieta controle (Figura 32).

O conteúdo total de ATF3 teve um acentuado aumento no TAB de camundongos

alimentados com a dieta HL em ambos os tecidos avaliados, o aumento foi de

aproximadamente 5 vezes em ambos os tecidos (Figura 33A). Nestes mesmos animais,

o conteúdo de CREB fosforilado em serina 133 teve um aumento de 60% apenas no

EPI, permanecendo inalterado no RETRO quando comparados aos controles (Figura

33B).

A expressão gênica do RGS2 está aumentada em 70% no EPI de camundongos

alimentados com a dieta HL quando comparados aos controles. No RETRO não houve

alteração na expressão desse gene (Figura 34).

A fosforilação de STAT3 em tirosina 705 foi alterada pela ingestão de dieta HL

de forma diferente nos dois tecidos estudados. Enquanto que no RETRO a forma

fosforilada da STAT3 foi reduzida em aproximadamente 60%, no EPI houve um

aumento de 85% nos animais alimentados com a dieta HL quando comparados aos

alimentados com a dieta controle (Figura 35).

70

______________________________________________________________________ Resultados

0.0

0.5

1.0

1.5


**

PPAR (53,57 kDa)

-Tubulina (55 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

RETRO EPI

PP

AR -

tub

ulin

a(%

do

s co

ntr

ole

s)

Figura 32 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico do PPARγ no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=7). *P< 0,05.

0

2

4

6

ATF3 (23 kDa)

CT HL CT HL

RETRO EPI

RETRO EPI

-Tubulina (55 kDa)


* *

AT

F3

/-t

ub

ulin

a(%

do

s co

ntr

ole

s)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

RETRO EPI

* pCREBSer133

CT HL CT HL

RETRO EPI

CREB (43 kDa)

pC

RE

BS

er1

33 /C

RE

B(%

do

s co

ntr

ole

s)

A

B

Figura 33 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico do ATF3 (A) e no conteúdo proteico do CREB fosforilado em serina 133 (pCREBSer133) (B) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.

71

______________________________________________________________________ Resultados

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


RETRO EPI

*m

RN

A R

GS

2/L

32

(% d

os

con

tro

les)

Figura 34 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas na expressão gênica do RGS2 no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=5-6). *P< 0,05.

0

50

100

150

200

250

RETRO EPI

*

*


pSTAT3Tyr705

CT HL CT HL

RETRO EPI

STAT3 (62 kDa)

pS

TA

T3

Ty

r70

5 /tS

TA

T3

(% d

os

con

tro

les)

Figura 35 - Efeito da dieta hiperlipídica após 8 semanas no conteúdo proteico de STAT3 fosforilado em tirosina 705 (pSTAT3Tyr705) no tecido adiposo branco retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. As barras e colunas representam média±EPM (n=6-7). *P< 0,05.

72

______________________________________________________________________ Discussão

5. DISCUSSÃO

No presente trabalho a ingestão de dieta HL por 8 semanas induziu obesidade,

resistência à insulina e intolerância à glicose em camundongos Swiss, favorecendo uma

ampla investigação do controle do metabolismo lipídico no TAB, e essa é a primeira

vez que investigamos os efeitos de uma dieta HL no metabolismo de lipídios no TAB de

camundongos que apresentam resistência insulínica. Nossas observações sugerem

interessantes mecanismos para o acúmulo de TAG no TAB desses animais, e nos

trazem novas perspectivas sobre o desenvolvimento da obesidade. O consumo de dietas

ricas em lipídios conhecidamente induz tais efeitos em roedores, sendo um modelo

bastante utilizado para o estudo da obesidade induzida pela dieta e suas co-morbidades

(CINTRA et al., 2008; DE SOUZA et al., 2005; PITOMBO et al., 2006). Há vários

anos, o nosso grupo vem estudando o efeito de diferentes dietas, tais como hiperproteica

e livre de carboidratos (HP), hiperglicidica e hiperlipídica (HCHL) e hipoproteica

hiperglicídica (LPHC) no funcionamento do TAB e na manutenção dos estoques do

TAG, bem como o balanço entre a lipogênese e a lipólise nestes diferentes modelos

(BOTION et al., 1998; BUZELLE et al., 2010; CHAVES et al., 2006; SCHMID;

KETTELHUT; MIGLIORINI, 1984).

No presente estudo, a oferta da dieta HL aos camundongos induziu um quadro

de resistência à insulina sistêmica, caracterizado por hiperglicemia, hiperinsulinemia e

intolerância à glicose. Além disto, a dieta HL promoveu um maior ganho de massa

corporal, acompanhado de um aumento na massa dos depósitos de TAB e resistência

deste tecido à ação da insulina, avaliada pela captação de glicose. Tais achados

corroboram os de outros autores que utilizaram um modelo semelhante ao nosso, com a

mesma linhagem animal, semelhante composição dietética e o mesmo período

73

______________________________________________________________________ Discussão

experimental de consumo da dieta (CINTRA et al., 2008; DE SOUZA et al., 2005;

PITOMBO et al., 2006).

Nesse estudo demonstramos que o RETRO e EPI estão maiores nos animais que

ingeriram a dieta HL. Apesar de ser um resultado esperado, pouco se sabe sobre como

isso ocorre, já que tamanho do depósito de TAG é resultado da interação de diversos

processos que podem ser influenciados por alterações hormonais, metabólicas e neurais

estabelecido para diferentes situações nutricionais. O armazenamento de AG-TAG no

TAB tem sido apontado como mecanismo protetor contra a lipotoxicidade dos AG para

outros órgãos em modelos de dieta HL, isso porque os AG derivados do TAB,

principalmente na obesidade, podem prejudicar o funcionamento de tecidos periféricos,

resultando em resistência à insulina muscular e esteatose hepática (CAO et al., 2008).

Nesse estudo os animais são acometidos pela esteatose hepática que é visível (Figura 6)

e que foi descrita previamente por CINTRA et al. (2008), porém o tecido muscular,

apesar de ter peso menor, parece não estar resistente à insulina, uma vez que não há

redução na fosforilação de AKT nos músculos soleus e EDL (dados não mostrados),

sugerindo que os efeitos da dieta HL parecem ser menores no tecido muscular. Outro

fato interessante é que em nosso estudo a ingestão da dieta HL por 8 semanas não

causou alterações no perfil lipídico plasmático dos animais: as concentrações de AGL,

TAG e colesterol não foram diferentes, o que pode indicar que o fígado e TAB são

capazes de captar os AG provenientes da dieta na tentativa de evitar a deposição

ectópica. Kwon e colaboradores (2012) estudaram o efeito temporal da dieta HL em

camundongos C57BL/6J e observaram resultados semelhantes aos nossos, não havendo

diferenças nos níveis plasmáticos de TAG e AGL em nenhum tempo até 24 semanas de

dieta.

74

______________________________________________________________________ Discussão

Os ácidos graxos depositados nos TAB, como descrito previamente, podem ser

provenientes ou da captação de AG pré-formados pela atividade da LPL ou da síntese

de novo. No EPI os dois processos estão aumentados, há maior síntese de AG de novo e

também maior atividade da LPL, sinalizando uma maior captação de AG de

lipoproteínas circulantes, enquanto que no RETRO apenas a síntese está aumentada,

enquanto que a atividade desta enzima está reduzida nos animais HL (Figura 36). A

magnitude no ganho de massa nos dois depósitos não é uniforme, no EPI há um ganho

de massa superior ao do RETRO e a atividade da LPL parece ser um ponto importante

nessa diferença entre os dois tecidos. Corroborando nossos achados, em camundongos

C57BL/6J tratados por cinco meses com uma dieta do tipo HL foi observada maior

atividade da LPL nos TAB inguinal e mesentérico associada ao maior peso destes

tecidos e tamanhos dos adipócitos quando comparados aos animais tratados com dieta

controle (Rebuffé-Scrive, et al., 1993). Também em humanos foi demonstrado que a

maior parte dos AG armazenados em TAG no TAB é proveniente da captação da

corrente sanguínea, sendo apenas uma pequena fração sintetizada pelo tecido, mesmo

após a ingestão de uma dieta hiperglicídica (OSMAN et al., 2013). Além disso, o

aumento da expressão de RGS2 somente no EPI nesse estudo parece indicar que esse

fator de transcrição pode estar envolvido também na regulação diferencial da expressão

e atividade de LPL, uma vez que em um estudo com animais nocautes para RGS2 os

autores demonstraram, em adipócitos isolados desses animais, que os níveis basais de

LPL são significantemente menores do que nas células dos animais selvagens, e quando

submetidos a estímulo para diferenciação o mRNA da LPL aumenta nas células

selvagens mas não nas RGS2-/- (NUNN et al., 2011). Assim, a maior atividade da LPL

no EPI pode ser correlacionada com o maior ganho de peso deste tecido (38%) assim

75

______________________________________________________________________ Discussão

como maior expressão de RGS2, enquanto que no RETRO a captação de AG pré-

formado parece não ter sido necessária para o ganho de apenas 12% na massa.

Nesse trabalho, tanto no EPI quanto no RETRO foi observado aumento na

síntese de AG de novo (Figura 36). A síntese de AG de novo é a via que produz AG a

partir de intermediários não lipídicos, e utiliza principalmente a glicose como substrato.

A técnica utilizada nesse estudo avalia a síntese de AG a partir de todas as fontes de

carbono, dessa maneira não podemos afirmar qual o substrato utilizado pelo TAB dos

animais que ingeriram dieta HL. O fluxo de intermediários de carbonos para os AG é

coordenado por uma série de reações enzimáticas: o primeiro passo é a conversão do

citrato a acetil-CoA e oxaloacetato pela ATP citrato liase. O acetil-CoA é então

carboxilado a malonil-CoA pela ACC e a AGS, que é a enzima que regula a velocidade

da via, converte o malonil-CoA a palmitato (AMEER et al., 2014). Nossos resultados

demonstram que não há alteração no conteúdo protéico da AGS em nenhum dos tecidos

e que no RETRO a ACC está até com o conteúdo reduzido. Considerando que ambas as

enzimas são reguladas por fosforilações e também alostericamente, a medida do

conteúdo protéico total não pode ser conclusiva sobre o fluxo da via, diferentemente dos

experimentos com a 3H2O.

Assim como no presente estudo, alguns trabalhos têm demonstrado que mesmo

na resistência insulínica é possível ocorrer um aumento na síntese de AG de novo (LIN

et al., 2005; SAMPATH et al., 2007). Entre os possíveis mecanismos que explicam o

aumento da síntese de novo de AG está a ativação dos dois maiores reguladores das

enzimas da síntese: o SREBP-1c (Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c) e o

ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein). SREBP-1c e ChREBP

regulam a expressão de genes chaves da lipogênese: Acetil-CoA sintetase, ACC, AGS e

ATP citrato liase (DENTIN et al., 2004; SHIMANO et al., 1999). O principal ativador

76

______________________________________________________________________ Discussão

de SREBP-1 é a insulina que regula esse fator tanto a nível transcricional quando pós-

traducional (KERSTEN, 2001). Porém, em ratos Sprague Dawley resistentes à insulina

que receberam dieta HL por 8 semanas a expressão tanto de SREBP-1 quanto de

ChREBP estão aumentadas (SUN et al., 2013). Tem sido observada também maior

ativação de SREBP-1c em situações de resistência insulínica induzida pela a ingestão de

dieta HL. Em camundongos resistentes à insulina tratados por 18 semanas com dieta HL

há aumento na expressão de AGS, enzima málica e ATP citrato liase no fígado

(BIDDINGER et al., 2005). Sugere-se que os próprios ácidos graxos saturados são

capazes de ativar o SREBP-1c e induzir a síntese hepática de novo (LIN et al., 2005;

SAMPATH et al., 2007), porém parece que o SREBP-1c é muito mais ativo no fígado

do que no TAB, e não há estudos que descrevem sua ativação por AG no TAB.

Já o ChREBP é transativado pela própria glicose, que quando convertida a

xilulose-5P no shunt das pentoses, ativa a proteína fosfatase 2A que defosforila e ativa o

ChREBP (IIZUKA; HORIKAWA, 2008). A glicose-6P desidrogenase (G6PD), enzima

limitante do shunt das pentoses regula a produção de NADPH e pentoses, incluindo a

xilulose-5P. A G6PD está aumentada em modelos de obesidade e o próprio aumento de

NAPDH pode elevar a síntese de AG e TAG (WANG et al., 2012; WU et al., 2013). O

aumento no fluxo do shunt das pentoses poderia fornecer tanto NADPH para estimular a

síntese de AG quanto aumentar a atividade do ChREBP pela maior produção de

xilulose-5P e maior expressão de genes de enzimas lipogênicas. A menor captação de

glicose não parece ser limitante para a maior atividade lipogênica. Em ratos que

ingerem dieta balanceada ou HP, substratos não glicídicos são mais importantes para

síntese de novo do que a glicose (BOTION et al., 1998). Herman e colaboradores (2012)

demonstraram que em animais que ingerem dieta normal a expressão do ChREBP no

TAB está correlacionada com a expressão de GLUT-4, indicando que em condições

77

______________________________________________________________________ Discussão

normais o transporte da glicose é necessário para a ativação do ChREBP. Porém, em

animais que ingeriram dieta HL e em humanos obesos essa correlação é perdida

(HERMAN et al., 2012). Foi demonstrado também que em camundongos com deleção

seletiva do GLUT-4 nos adipócitos a massa do TAB é preservada, o que sugere que a

síntese de lipídios no TAB não é dependente exclusivamente do transporte de glicose

estimulado por insulina (ABEL et al., 2001). Adicionalmente, foi demonstrado que a

superexpressão de GLUT-4 no TAB em animais que ingeriram dieta HL leva a uma

menor expressão do ChREBP apesar de terem mais GLUT-4 (HERMAN et al., 2012).

Outra interessante possibilidade é de que o próprio glicerol poderia servir de substrato

para síntese de AG. A contribuição do glicerol para a síntese de AG foi avaliada in vitro

pela incorporação de 14C de [U-14C]glicerol em AG em fatias de fígado de ratos tratados

com a dieta LPHC por 15 dias, e foi observado que no fígado o glicerol, mais do que a

glicose, é um importante substrato para a esterificação e síntese de AG, uma vez que

pela conversão a diidroxiacetona fosfato pode entrar na via glicolítica e ser convertido

acetil-CoA (MENEZES et al., 2013). Uma vez que nossos resultados demonstram que

tanto a sinalização da insulina quanto a captação de glicose estão reduzidas, podemos

sugerir que tanto um aumento na atividade do SREBP-1c induzido pelos próprios AG

saturados da dieta quanto do ChREBP pela maior atividade da G6PD produzindo mais

NADPH e Xilulose-5P poderiam contribuir para maior síntese de AG de novo. Também

devemos considerar que o maior fornecimento de glicerol para o TAB poderia estimular

a síntese de novo, uma vez que tanto o conteúdo e atividade da GK quanto o glicerol

plasmático estão aumentados. A ocorrência desse cross-talk no TAB necessita de mais

investigações.

Além dos AG, é necessário um adequado fornecimento de G3P para a

esterificação a TAG. Como já descrito previamente, o G3P pode ser proveniente da

78

______________________________________________________________________ Discussão

glicólise, gliceroneogênese ou fosforilação direta do glicerol pela GK. Dados prévios do

nosso laboratório tem sugerido uma regulação inversa entre a utilização de glicose e a

gliceroneogênese para a formação de G3P no TAB. A dieta HP, o jejum e o diabetes

induzido por estreptozotocina, situações que reduzem a concentração sérica de insulina,

induzem uma redução na glicólise e um aumento na gliceroneogênese no tecido adiposo

(BOTION et al., 1998; BRITO et al., 2001; FRASSON et al., 2012), enquanto a dieta

HCHL, uma situação que eleva a insulina sérica, há um aumento na glicólise e uma

redução na gliceroneogênese (CHAVES et al., 2006) tanto no RETRO quanto no EPI.

Recentemente, foi demonstrado que o tratamento com dexametasona por 7 dias, uma

situação que provoca resistência à insulina, causa um aumento na gliceroneogênese

acompanhado de redução na captação de glicose no RETRO. No entanto, no EPI dos

mesmos animais não foi observada a reciprocidade entre estas duas vias metabólicas,

uma vez que ambas encontram-se reduzidas (FERREIRA-SODRE, 2015). Da mesma

forma, previamente nós demonstramos que a oferta da dieta LPHC durante 14 dias,

apesar de induzir uma redução na concentração de insulina (aproximadamente 2 vezes),

também promove um aumento na concentração sérica de corticosterona (2 vezes)

culminando na redução da incorporação de glicose marcada em lipídios e redução no

conteúdo de PEPCK no TAB RETRO (APARECIDA DE FRANÇA et al., 2014;

SANTOS et al., 2012). No presente trabalho também foi observada a perda da

reciprocidade entre as vias glicolítica e gliceroneogênica, uma vez que ambas estão

reduzidas, e apesar da corticosterona sérica estar reduzida nos animais HL, observamos

resposta semelhante ao efeito do tratamento com dexametasona no EPI desses animais.

O que observamos em comum entre essas duas situações é que a perda da reciprocidade

é acompanhada pela resistência insulínica no RETRO e EPI dos camundongos HL e no

79

______________________________________________________________________ Discussão

EPI dos ratos que receberam dexametasona. Dessa maneira, parece sugestivo que a

resistência à insulina seja um fator importante na perda da reciprocidade.

Em ambos os tecidos, RETRO e EPI, a resistência insulínica foi demonstrada

pela redução na captação de glicose e no conteúdo de GLUT-4, acompanhado de um

aumento do ATF3. No entanto, apenas no EPI foi observado uma redução do conteúdo

de adiponectina, além da menor fosforilação de AKT, maior fosforilação de CREB e

aumentada expressão do RNAm de RGS-2, fatores que contribuem para uma menor

translocação do GLUT-4 para a membrana plasmática. No RETRO, a redução da

captação de glicose ocorreu independente de alterações na adiponectina, fosforilação de

Akt e CREB e expressão de RGS-2. Tanto ATF3 quanto RGS-2 são alvos de CREB,

que compromete a função do tecido adiposo na obesidade. QI e colaboradores (2009)

demonstraram que a expressão e conteúdo proteico de ATF3 estão aumentados em

aproximadamente 10 vezes em animais tratados com a dieta HL, e que a sinalização do

ATF3 envolve a ativação de CREB, que por sua vez inibe a transcrição gênica de

adiponectina e GLUT-4 (QI et al., 2009a). O RGS-2 também pode regular a

translocação do GLUT-4 por uma via não-canônica da insulina. Em adipócitos 3T3-L1

que receberam uma microinjeção de RGS2 houve redução drástica na translocação de

GLUT-4 induzida por insulina. O receptor da insulina ativado pode fosforilar Gαq em

tirosina, que forma um complexo molecular com a subunidade P110α da PI3K ativando-

a, e aumentando a translocação do GLUT-4 e o transporte de glicose. O RGS2 por sua

vez, hidrolisa a ligação da Gαq com o GTP tornando-a inativa e reduzindo a ativação da

PI3K e a translocação do GLUT-4 (IMAMURA et al., 1999). Diante disso, parece

razoável sugerir que além da redução na sinalização da insulina, a inibição da

translocação do GLUT-4 pelo aumento da expressão de RGS2 e do conteúdo de ATF3

80

______________________________________________________________________ Discussão

também poderia constituir um mecanismo de redução da captação de glicose observada

em nossos animais resistentes à insulina.

Além de funções na ação da insulina, o RGS2 parece estar envolvido no

armazenamento de TAG. Durante o processo de diferenciação de células 3T3-L1 o

RGS-2 é regulado positivamente e quando expresso ectopicamente em pré-adipócitos

NIH-3T3 promove a diferenciação dessas células e a expressão de marcadores

adipogenicos (IMAGAWA; TSUCHIYA; NISHIHARA, 1999). Em camundongos

alimentados com dieta HL por 25 semanas há aumento na expressão de RGS2 tanto no

TAB, quanto no fígado, sugerindo que esta proteína pode regular o armazenamento de

lipídios nestes órgãos (NUNN et al., 2011). No mesmo estudo, os autores demonstraram

que camundongos RGS2-/- são resistentes ao ganho de peso relacionado ao

envelhecimento quando comparados aos selvagens C57BL/6. O peso corporal reduzido

foi acompanhado também de melhor sensibilidade à insulina e menores depósitos

adiposos (NUNN et al., 2011).

Tendo em vista que a síntese de novo e a captação de AG pré-formados estão

aumentadas no EPI, seria razoável supor que uma ativação da gliceroneogênese seria

necessária para fornecer G3P para a esterificação, já que a reduzida sinalização da

insulina e conteúdo de GLUT-4 impossibilitaria o fornecimento de G3P pela via

glicolítica. Ainda, a própria redução na sinalização da insulina favorece a

gliceroneogênese, porém neste estudo o que se observa é uma redução desta via. A

redução tanto na via glicolítica quanto da gliceroneogenica parece inconsistente, tendo

em vista que o tecido parece ser capaz de sustentar a síntese de G3P em ritmo adequado

para a eficiente esterificação dos AG, formação de TAG e seu acúmulo no TAB. Porém,

a maior velocidade de incorporação de 1-[14C]-glicerol em TAG no EPI, e o

considerável aumento na atividade da GK em ambos os tecidos, sugerem que o G3P

81

______________________________________________________________________ Discussão

necessário para a adequada esterificação dos AG é proveniente principalmente da

fosforilação direta do glicerol captado da circulação, e os aumentados níveis

plasmáticos do glicerol nos animais que ingeriram a dieta HL corroboram esta hipótese.

O aumento na atividade da GK é suficiente para garantir o fornecimento de G3P ao

TAB e promover o desenvolvimento da obesidade. Ainda que no RETRO dos

camundongos alimentados com a dieta HL a velocidade de incorporação de 1-[14C]-

glicerol em lipídios esteja reduzida podemos estimar que este fornecimento de G3P,

representando 5 nmol.106 células-1.min-1, é capaz de esterificar todo AG sintetizado de

novo ou préformado, proveniente da circulação ou reciclagem endógena, considerando-

se que cada molécula de glicerol pode esterificar 3 AG. Nossos resultados sugerem que

no RETRO a ingestão da dieta HL por 8 semanas pode ser capaz de aumentar a taxa de

reesterificação de AG em TAG, já que a aumentada atividade da GK e o menor

conteúdo de Aqp7 podem sugerir que o tecido limita a liberação de glicerol e de AG

para a circulação, o que pode indicar uma menor atividade metabólica nesse tecido

(Figura 36).

É clássico o aumento da atividade da GK em animais obesos (KOSCHINSKY;

GRIES; HERBERG, 1971; TREBLE; MAYER, 1963) Stern e colaboradores (1983)

estudaram a atividade da GK em ratos Zucker e camundongos ob/ob obesos, e

demonstraram que a atividade da enzima está aumentada em todos os animais obesos

estudados quando comparados aos seus controles, e correlacionaram esse aumento com

o peso corporal, tamanho do adipócito e dieta ingerida, sendo que os maiores níveis de

atividade desta enzima foram observados nos que ingeriram dieta HL (STERN et al.,

1983). A ativação do PPARγ também tem sido relacionada à maior expressão de GK.

Foi demonstrado que em adipócitos 3T3-L1 tratados com TZDs há um aumento na

expressão e indução na atividade da GK, acompanhada de aumento na incorporação de

82

______________________________________________________________________ Discussão

glicerol em TAG, e os autores postulam que isso leva a uma maior reciclagem do

glicerol proveniente da hidrólise endógena de TAG (GUAN et al., 2002). Em humanos,

foi apontado que o do gene desta enzima é alvo de regulação pelo PGC1-α, não sendo

influenciado por rosiglitazona e ácido retinoico o que demonstra que a regulação da GK

pode se dar de forma independente de PPARγ (MAZZUCOTELLI et al., 2007). Em

nosso modelo experimental, o controle da GK parece não se dar pelo PPARγ, uma vez

que o conteúdo proteico deste está reduzido em ambos os tecidos nos quais a GK está

aumentada.

O impacto da fosforilação do glicerol e da gliceroneogênese na re-esterificação

de AG foi avaliado em explantes de TAB subcutâneo humano de indivíduos magros e

obesos. Para isso avaliou-se a atividade da PEPCK e GK e a incorporação de piruvato e

glicerol marcados em TAG, e os resultados demonstraram que nos magros a PEPCK

contribui 6 vezes mais para a re-esterificação, enquanto que nos obesos a GK foi mais

eficiente (LEROYER et al., 2006). Mottillo e colaboradores (2014), em trabalho que

avaliou o turnover de AG no TAB, demonstraram que o tratamento por 1 dia com o

agonista β3 CL 316,243 aumenta a re-esterificação de AG em TAG, eleva

consideravelmente o mRNA da GK e reduz o da PEPCK, e com isso sugerem que o

papel da GK é importante para a reciclagem de AG, enquanto que a PEPCK parece ser

mais importante no acoplamento da síntese de novo com a síntese de TAG nessa

situação experimental. PEPCK e GK são ambas alvos de PPAR e CREB (MOTTILLO

et al., 2014), porém o que observamos no presente estudo é que com a redução do

conteúdo de PPARγ este parece não influenciar nas atividades de GK e PEPCK. A

atividade da GK por outro lado, parece ser influenciada pela maior atividade de CREB

no EPI, e pela maior disponibilidade de G3P intracelular no RETRO, já que não há

alteração na fosforilação de CREB neste tecido.

83

______________________________________________________________________ Discussão

No presente trabalho, a oferta da dieta HL durante 8 semanas parece representar

o primeiro modelo capaz de induzir uma redução no fluxo da gliceroneogênese,

avaliado pela velocidade de incorporação de 1-14C-piruvato em lipídios, sem alterar o

conteúdo e atividade da PEPCK no RETRO e EPI. Deve-se considerar que a medida in

vitro da atividade enzimática é a atividade máxima em condições ideais o que nem

sempre acompanha o fenômeno in vivo que é dependente de outros fatores. Além disso,

apesar de a PEPCK ser a enzima chave da gliceroneogênese, o piruvato é um metabólito

importante em outras vias. Diversos trabalhos ilustram que o transporte de piruvato

tanto na membrana plasmática quanto na mitocôndria pode ser regulado por diferentes

fatores (PATTERSON et al., 2014; SCHELL; RUTTER, 2013; SHEARMAN;

HALESTRAP, 1984) e a regulação do fluxo do piruvato no TAB ainda necessita de

outros estudos que possam esclarecer estes fatores.

Outro ponto importante na manutenção dos estoques de TAG é a atividade

lipolítica do TAB, uma vez que estes estoques são resultado do balanço entre síntese e

degradação de TAG. Evidencias sugerem que a desregulação da lipólise e do

metabolismo lipídico em adipócitos de animais alimentados com dieta HL é mediado

em parte por defeitos na sinalização adrenérgica no tecido. Ratos alimentados com dieta

HL por 6 semanas possuem reduzida resposta lipolítica (liberação de glicerol) no TAB

quando incubados com 0,5 µM de adrenalina (SUSINI; LAVAU; HERZOG, 1979). O

mesmo acontece quando células do EPI de ratos são estimuladas com adrenalina,

forskolina e dibutiril AMP cíclico (TEPPERMAN; DEWITT; TEPPERMAN, 1986).

Seguindo o mesmo padrão, em camundongos alimentados com dieta HL por 8 semanas

houve redução na fosforilação da LHS e no conteúdo de perilipinas, além de prejuízo na

lipólise estimulada por adrenalina (GAIDHU et al., 2010). Corroborando esses estudos,

nossos resultados demonstraram que tanto em adipócitos isolados tanto do EPI quanto

84

______________________________________________________________________ Discussão

RETRO dos animais que ingeriram dieta HL, quando incubados com noradrenalina (10-

6 M), liberam menos glicerol para o meio de incubação do que os dos animais controles,

indicando menor atividade lipolítica estimulada por noradrenalina. O conteúdo dos

receptores adrenérgicos β3 e os níveis de fosforilação da LHS se encontram reduzidos

em ambos os tecidos. Além disso, a menor fosforilação da ATGL também contribui

para a menor resposta lipolítica. A menor atividade lipolítica no RETRO e EPI, além de

contribuir para o aumento dos TAB, favorece nossa hipótese de que o TAB atua no

sentido de evitar a liberação de AGL para a circulação (Figura 36).

Um aspecto interessante observado nesse trabalho foi a diferença de resposta

entre os depósitos RETRO e EPI. O RETRO parece ser menos afetado pela dieta do que

o EPI, já que este último exibe um fenótipo bastante semelhante ao observado em outros

modelos de obesidade. Estudos têm enfatizado propriedades depósito-específicas do

TAB, que apresenta distribuição heterogênea no organismo. Entre os diversos coxins há

diferenças na captação de ácidos graxos, lipólise, secreção de adipocinas, quantidade de

mitocondrias e expressão de receptores (BJØRNDAL et al., 2011; CAESAR et al.,

2010; LEMONNIER, 1972; LI; YANG; BJÖRNTORP, 1993; PALOU et al., 2009). A

distribuição da gordura corporal parece ser ainda mais importante do que o conteúdo

total de gordura, e as diferenças metabólicas entre os depósitos são provavelmente

resultado da diferente expressão de genes relacionados com a funcionalidade dos

diferentes TABs (CAESAR et al., 2010; PALOU et al., 2009). Genes envolvidos com a

lipogênese (PPARγ2, SREBP1c, ACC1 e GPAT), captação de ácidos graxos (LPL e

CD36), lipólise (LHS e ATGL) e transporte de glicose (GLUT-4) estão aumentados no

RETRO de ratos alimentados com dieta comercial balanceada quando comparados aos

depósitos inguinal e mesentérico (PALOU et al., 2009). Em camundongos obesogênicos

APOE3Leiden foi avaliado o efeito da ingestão de dieta HL por 12 semanas nos tecidos

85

______________________________________________________________________ Discussão

adiposos EPI, subcutâneo e mesentérico. O estudo demonstrou que mais de 3000 genes

são regulados pela dieta, porém apenas 62 são comuns aos três tecidos e cerca de 2400

são regulados em apenas um dos depósitos. Genes relacionados ao metabolismo do

piruvato e síntese de acetil-CoA estão reduzidos no EPI e aumentados no subcutâneo e

mesentérico dos animais que ingeriram dieta HL, demonstrando uma menor atividade

lipogênica no EPI (CAESAR et al., 2010). Para explicar diferenças regionais no

metabolismo dos tecidos EPI, RETRO, inguinal e mesentérico de ratos, LI e

colaboradores (1993) administraram [U-14C]ácido oleico por gavagem e mediram o

acúmulo e o turnover de AG nos diferentes tecidos. Nos TAB inguinal e mesentérico, a

radioatividade reduz rapidamente após 16 horas da ingestão, enquanto que no RETRO e

EPI a redução ocorre somente após 1 mês. A meia-vida do [U-14C]ácido oleico foi

menor nos tecidos inguinal e mesentérico quando comparados aos EPI. Já no RETRO a

meia vida deste AG parece ser prolongada além do tempo de observação de 1 mês,

indicando que o turnover de TAG é menor no retro do que nos outros tecidos. Nossos

resultados ressaltam a importância das diferenças morfológicas e metabólicas entre os

vários depósitos lipídicos, mesmo quando apenas os viscerais são comparados.

Além de adipócitos, o tecido adiposo é constituído por outros tipos celulares,

incluindo células endoteliais, pré-adipócitos, macrófagos e outras células inflamatórias,

sendo que todas elas são capazes de produzir citocinas inflamatórias. A resposta

inflamatória pode ser iniciada nos adipócitos, que são as primeiras células a serem

afetadas no desenvolvimento da obesidade, ou potencialmente em células vizinhas que

podem ser afetadas pelo crescimento do TAB (WELLEN; HOTAMISLIGIL, 2005).

Assim, geralmente a inflamação é caracterizada por aumento local dos níveis de

citocinas juntamente com infiltrado de células do sistema imunes para o tecido. A

inflamação na dieta HL ocorre como uma resposta exagerada do organismo frente a

86

______________________________________________________________________ Discussão

uma sobrecarga nutricional em células que armazenam lipídios. A ativação de genes

relacionados ao processo inflamatório é um dos eventos iniciais e permanentes em

resposta à dieta HL. Os TAB mesentérico e EPI de camundongos que ingeriram dieta

HL por 24 semanas tem regulação positiva destes genes entre 2-4 semanas de dieta

(KWON et al., 2012). O mecanismo inflamatório induzido pela obesidade visa o reparo

tecidual e envolve inicialmente a regulação positiva de genes que transcrevem citocinas,

quimiocinas e outros mediadores inflamatórios através da ativação de fatores de

transcrição como o NF-κβ (nuclear factor-kB) e STAT3 (DEBNATH et al., 2015). O

conceito de obesidade como condição inflamatória já está bem estabelecido, porém, a

expressão e conteúdo de marcadores inflamatórios são controversos. Montgomery et al.,

(2013) demonstraram em seu estudo que a expressão de TNF-α, MCP-1 e IL-6 não foi

alterada após 8 semanas de ingestão da dieta HL. DOS SANTOS e colaboradores

(2013) estudaram o efeito de dietas com diferentes composições lipídicas por 8 semanas

no TAB de camundongos Swiss. Os animais que receberam dieta rica em gordura

animal não tiveram diferenças nas concentrações de TNF-α e IL-6 no EPI e RETRO e a

IL-10 foi reduzida apenas no RETRO. TURNER et al., (2013) realizaram um estudo

que avaliou o efeito temporal da dieta na expressão de citocinas, e observaram que com

uma e três semanas de dieta não há aumento de marcadores inflamatórios no TAB,

fígado ou músculo e que no TAB só houve aumento dos marcadores após 16 semanas

de dieta. Nossos resultados demonstraram que as concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-10

não foram alteradas nos TAB estudados, e isso pode ser atribuído ao tempo de dieta,

que não foi longo o suficiente para provocar alterações nesses parâmetros.

Diante disso, investigamos a expressão de PAI-1 e MCP-1, e observamos

aumento no mRNA dessas proteínas apenas no EPI. Há uma contribuição direta de PAI-

1 com as complicações da obesidade como a resistência à insulina e trombose, bem

87

______________________________________________________________________ Discussão

como acumulo de TAB visceral (DE TAEYE; SMITH; VAUGHAN, 2005). O PAI-1

tem sido considerado um fator preditor do diabetes tipo II e atua como estimulador da

diferenciação de adipócitos mediada por redução na atividade do PPARγ (CORREIA;

HAYNES, 2006). O PAI-1 é considerado uma proteína de fase aguda, com níveis

aumentados nos estágios iniciais da resposta inflamatória (GABAY; KUSHNER, 1999).

Durante a expansão da massa adiposa há regiões do tecido que entram em hipóxia, o

tecido expande e a vasculatura é insuficiente para manter a normoxia, os adipócitos

secretam então fatores angiogênicos em resposta á hipóxia, que incluem VEGF e PAI-1

(TRAYHURN; WOOD, 2004). O MCP-1 está aumentado no TAB em diversos estudos

com dieta HL (DEBNATH et al., 2015; KWON et al., 2012) e em células tratadas com

AGL (TAKAHASHI et al., 2008). O gene da MCP-1 é expresso tanto em células 3T3-

L1, quanto em adipócitos de camundongos obesos. Em camundongos que

superexpressam MCP-1 nos adipócitos, o infiltrado de macrófagos é maior do que nos

selvagens, e em animais nocautes para MCP-1 que são alimentados com dieta HL o

acúmulo de macrófagos foi inibido; sugerindo que a secreção de MCP-1 pelos

adipócitos ativa diretamente o recrutamento de macrófagos para o TAB (KANDA et al.,

2006). Os nossos achados vão ao encontro desses trabalhos, e demonstram que em

nosso modelo de obesidade o EPI, mas não o RETRO, é sítio de um processo

inflamatório agudo, sinalizado pelo aumento na expressão de PAI-1 e que o infiltrado

observado no corte histológico pode ser desencadeado pela maior expressão de MCP-1.

O infiltrado do TAB ocasionado pela dieta HL é causada por monócitos que

migram para o TAB, e se tornam macrófagos, que uma vez acumulados secretam mais

citocinas levando a uma reação em cadeia. Uma vez que macrófagos ativados estão

presentes no tecido, eles ativam o processo inflamatório (OSBORN; OLEFSKY, 2012).

A ativação da inflamação com acúmulo de macrófagos no tecido, leva à formação

88

______________________________________________________________________ Discussão

estruturas crown-like em torno dos adipócitos, que consiste em macrófagos que

circulam e fagocitam os adipócitos “mortos” para evitar lipotoxicidade (STRISSEL et

al., 2007). Em camundongos C57BL/6 que ingeriram dieta HL por 20 semanas a

apoptose dos adipócitos foi caracterizada como um evento inicial, progressivo e

depósito-dependente relacionado positivamente com a expansão do TAB, mudança de

fenótipo dos macrófagos, inflamação e desenvolvimento da resistência à insulina.

(STRISSEL et al., 2007). O EPI desses animais reestabelece a quantidade de células

mortas com adipócitos pequenos, sugerindo que essa morte celular é um pré-requisito

para a transição de um tecido hipertrófico para hiperplásico na obesidade. (Faust et al.,

1978). Foi demonstrado que não há aumento do tamanho das células adiposas nas

primeiras nove semanas de ingestão de dieta HL nos TAB inguinal, mesentérico e EPI e

os autores demonstraram que a hiperplasia surge apenas na 12ª semana (CAESAR et al.,

2010). Outro fator que parece regular o infiltrado de células imunes no TAB é o CREB.

Em camundongos alimentados com dieta HL que expressam o dominante negativo para

CREB especificamente no TAB (F-ACREB) o infiltrado de células imunes esta

relativamente ausente, bem como houve redução de genes relacionados com as vias

inflamatórias em comparação aos animais selvagens tratados com a mesma dieta (QI et

al., 2009a). Em camundongos que ingeriram dieta HL a severidade na hiperplasia e

hipertrofia são dependentes do TAB estudado (LEMONNIER, 1972). Juntamente com o

aumento de genes inflamatórios, nossos achados histológicos sugerem que no EPI, mas

não no RETRO, o processo inflamatório está ativado e relacionado à apoptose dos

adipócitos, dado a presença de estruturas “crown-like”, a menor área dos adipócitos e

maior frequência de adipócitos pequenos, indicando que o tecido está possivelmente em

processo de hiperplasia, dado o maior peso do TAB e o menor tamanho celular. Além

89

______________________________________________________________________ Discussão

disso, a maior fosforilação de CREB neste tecido parece ser um fator adicional no

aumento do infiltrado e dos genes inflamatórios.

Nosso estudo reforça a idéia de que a obesidade pode induzir alterações em

múltiplos tecidos, porém ressalta a importância de se distinguir uma reação local do

tecido de uma resposta sistêmica. Em nossos animais, o grau de inflamação sistêmica

parece mínimo, uma vez que não observamos alterações nos níveis plasmáticos de

citocinas, porém, quando analisamos o EPI, as características histológicas e a expressão

de citocinas sugerem fortemente que há uma reação inflamatória local.

Em resumo, os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que o

aumento nos depósitos de TAG no RETRO e EPI é decorrente de uma combinação de

fatores: aumento da atividade da LPL, aumento da síntese de novo de AG, aumento da

atividade da GK e redução da atividade lipolítica estimulada por noradrenalina. É

interessante notar que em nosso modelo de obesidade com resistência à insulina a

reciprocidade entre as vias glicolítica e gliceroneogênica é perdida na medida em que as

duas vias estão reduzidas em ambos os tecidos estudados. Além disso, esse estudo

demonstrou que a maior atividade da GK é suficiente para fornecer todo o G3P

necessário para a esterificação dos AG provenientes da síntese de novo. Outro aspecto

interessante observado em nosso estudo é que nos dois tecidos estudados o acúmulo de

TAB ocorre de maneira depósito-dependente. O RETRO parecer ser menos suscetível

aos efeitos da dieta HL, já que o aumento neste tecido é menos pronunciado, somado a

isso temos menor atividade da LPL, o que indica que os AG necessários para a síntese

de TAG são provenientes principalmente da síntese de novo e da reciclagem endógena.

Observamos também no RETRO que o G3P necessário para esterificar esses AG é

proveniente da maior atividade da GK sem aumento na velocidade de incorporação de

14C-glicerol em TAG, e apesar de ter menor atividade lipolítica estimulada por

90

______________________________________________________________________ Discussão

noradrenalina, o reduzido conteúdo de Aqp7 sugere que há maior re-esterificação neste

tecido. No EPI é mais evidente o fenótipo da obesidade, com redução no conteúdo de

adiponectina e fosforilação de AKT indicando um evidente prejuízo na ação da insulina

neste tecido. Os AG necessários para a esterificação em TAG no EPI são provenientes

tanto da maior atividade da LPL quanto da síntese de novo, o que demonstra maior

disponibilidade de AG neste tecido. O G3P necessário para esterificar os AG vem da

maior atividade da GK e maior velocidade de incorporação de 14C-glicerol em TAG,

demonstrando que também no EPI a fosforilação direta do glicerol é a via que mais

contribui para a síntese de G3P. O perfil inflamatório no EPI pode ter papel importante

na instalação da obesidade uma vez que o aumento deste tecido é mais pronunciado do

que no RETRO. Nossos dados demonstram que a obesidade induzida por dieta HL

altera de maneira depósito-dependente o funcionamento dos TAB e as vias de formação

de G3P e AG para a síntese e armazenamento de TAG.

___

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__________

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91

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92

______________________________________________________________________ Referências bibliográficas

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABEL, E. D. et al. Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin

action in muscle and liver. Nature, v. 409, n. 6821, p. 729–33, 8 fev. 2001.

AHMADIAN, M.; DUNCAN, R. E.; SUL, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty

acid utilization in adipocytes. Trends in endocrinology and metabolism: TEM, v. 20,

n. 9, p. 424–8, nov. 2009.

AMEER, F. et al. De novo lipogenesis in health and disease. Metabolism: clinical and

experimental, v. 63, n. 7, p. 895–902, jul. 2014.

APARECIDA DE FRANÇA, S. et al. Low-protein, high-carbohydrate diet increases

glucose uptake and fatty acid synthesis in brown adipose tissue of rats. Nutrition

(Burbank, Los Angeles County, Calif.), v. 30, n. 4, p. 473–80, abr. 2014.

BALLARD, F. J.; HANSON, R. W. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and pyruvate

carboxylase in developing rat liver. The Biochemical journal, v. 104, n. 3, p. 866–71,

set. 1967.

BELFRAGE, P.; VAUGHAN, M. Simple liquid-liquid partition system for isolation of

labeled oleic acid from mixtures with glycerides. Journal of lipid research, v. 10, n. 3,

p. 341–4, maio 1969.

BIDDINGER, S. B. et al. Effects of diet and genetic background on sterol regulatory

element-binding protein-1c, stearoyl-CoA desaturase 1, and the development of the

metabolic syndrome. Diabetes, v. 54, n. 5, p. 1314–23, maio 2005.

BJØRNDAL, B. et al. Different adipose depots: their role in the development of

metabolic syndrome and mitochondrial response to hypolipidemic agents. Journal of

93


obesity, v. 2011, p. 490650, jan. 2011.

BODEN, G.; SHULMAN, G. I. Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes: defining

their role in the development of insulin resistance and beta-cell dysfunction. European

Journal of Clinical Investigation, v. 32, n. s3, p. 14–23, jun. 2002.

BOTION, L. M. et al. Glucose contribution to in vivo synthesis of glyceride-glycerol

and fatty acids in rats adapted to a high-protein, carbohydrate-free diet. Metabolism:

clinical and experimental, v. 47, n. 10, p. 1217–21, out. 1998.

BRITO, S. R. et al. Glucose uptake and glycolytic flux in adipose tissue from rats

adapted to a high-protein, carbohydrate-free diet. Metabolism: clinical and

experimental, v. 50, n. 10, p. 1208–12, out. 2001.

BUZELLE, S. L. et al. A low-protein, high-carbohydrate diet increases the adipose lipid

content without increasing the glycerol-3-phosphate or fatty acid content in growing

rats. Canadian journal of physiology and pharmacology, v. 88, n. 12, p. 1157–65,

dez. 2010.

CAESAR, R. et al. A combined transcriptomics and lipidomics analysis of

subcutaneous, epididymal and mesenteric adipose tissue reveals marked functional

differences. PloS one, v. 5, n. 7, p. e11525, jan. 2010.

CAO, H. et al. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to

systemic metabolism. Cell, v. 134, n. 6, p. 933–44, 19 set. 2008.

CHAVES, V. E. et al. Glyceroneogenesis Is Reduced and Glucose Uptake Is Increased

in Adipose Tissue from Cafeteria Diet-Fed Rats Independently of Tissue Sympathetic

Innervation. J. Nutr., v. 136, n. 10, p. 2475–2480, 1 out. 2006.

94


CHRIVIA, J. C. et al. Phosphorylated CREB binds specifically to the nuclear protein

CBP. Nature, v. 365, n. 6449, p. 855–859, 28 out. 1993.

CINTI, S. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose

tissue of obese mice and humans. The Journal of Lipid Research, v. 46, n. 11, p.

2347–2355, 8 set. 2005.

CINTRA, D. E. et al. Interleukin-10 is a protective factor against diet-induced insulin

resistance in liver. Journal of hepatology, v. 48, n. 4, p. 628–37, abr. 2008.

CORREIA, M. L. G.; HAYNES, W. G. A role for plasminogen activator inhibitor-1 in

obesity: from pie to PAI? Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, v. 26,

n. 10, p. 2183–5, out. 2006.

DARNELL, J. E. STATs and gene regulation. Science (New York, N.Y.), v. 277, n.

5332, p. 1630–5, 12 set. 1997.

DE SOUZA, C. T. et al. Short-term inhibition of peroxisome proliferator-activated

receptor-gamma coactivator-1alpha expression reverses diet-induced diabetes mellitus

and hepatic steatosis in mice. Diabetologia, v. 48, n. 9, p. 1860–71, set. 2005.

DE TAEYE, B.; SMITH, L. H.; VAUGHAN, D. E. Plasminogen activator inhibitor-1: a

common denominator in obesity, diabetes and cardiovascular disease. Current opinion

in pharmacology, v. 5, n. 2, p. 149–54, abr. 2005.

DEBNATH, M. et al. Metaflammatory responses during obesity: Pathomechanism and

treatment. Obesity research & clinical practice, 21 nov. 2015.

DENTIN, R. et al. Hepatic glucokinase is required for the synergistic action of ChREBP

and SREBP-1c on glycolytic and lipogenic gene expression. The Journal of biological

95


chemistry, v. 279, n. 19, p. 20314–26, 7 maio 2004.

DOS SANTOS, B. et al. Effects of a diet enriched with polyunsaturated, saturated, or

trans fatty acids on cytokine content in the liver, white adipose tissue, and skeletal

muscle of adult mice. Mediators of inflammation, v. 2013, p. 594958, jan. 2013.

DUNCAN, R. E. et al. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annual review of

nutrition, v. 27, p. 79–101, jan. 2007.

FAUST, I. M. et al. Diet-induced adipocyte number increase in adult rats: a new model

of obesity. The American journal of physiology, v. 235, n. 3, p. E279–86, out. 1978.

FERES, D. D. S. et al. In vitro TNF-α- and noradrenaline-stimulated lipolysis is

impaired in adipocytes from growing rats fed a low-protein, high-carbohydrate diet.

Lipids, v. 48, n. 8, p. 779–86, ago. 2013.

FERREIRA-SODRE, G. N. Papel dos glicocorticóides na regulação das vias de

geração de glicerol-3-fosfato no tecido adiposo branco de ratos. [s.l: s.n.].

FOLCH, J.; LEES, M.; SLOANE STANLEY, G. H. A simple method for the isolation

and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of biological

chemistry, v. 226, n. 1, p. 497–509, maio 1957.

FOLEY, J. E. et al. Insulin binding and hexose transport in rat adipocytes. Relation to

cell size. Diabetologia, v. 19, n. 3, p. 234–41, set. 1980.

FRANCKHAUSER, S. et al. Increased fatty acid re-esterification by PEPCK

overexpression in adipose tissue leads to obesity without insulin resistance. Diabetes, v.

51, n. 3, p. 624–30, mar. 2002.

FRASSON, D. et al. The sympathetic nervous system regulates the three glycerol-3P

96


generation pathways in white adipose tissue of fasted, diabetic and high-protein diet-fed

rats. Metabolism: clinical and experimental, v. 61, n. 10, p. 1473–85, out. 2012.

GABAY, C.; KUSHNER, I. Acute-phase proteins and other systemic responses to

inflammation. The New England journal of medicine, v. 340, n. 6, p. 448–54, 11 fev.

1999.

GAIDHU, M. P. et al. Dysregulation of lipolysis and lipid metabolism in visceral and

subcutaneous adipocytes by high-fat diet: role of ATGL, HSL, and AMPK. American

journal of physiology. Cell physiology, v. 298, n. 4, p. C961–71, abr. 2010.

GALIC, S.; OAKHILL, J. S.; STEINBERG, G. R. Adipose tissue as an endocrine

organ. Molecular and cellular endocrinology, v. 316, n. 2, p. 129–39, 25 mar. 2010.

GORIN, E.; TAL-OR, Z.; SHAFRIR, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted,

diabetic and triamcinolone treated rats. European journal of biochemistry / FEBS, v.

8, n. 3, p. 370–5, abr. 1969.

GUAN, H.-P. et al. A futile metabolic cycle activated in adipocytes by antidiabetic

agents. Nature medicine, v. 8, n. 10, p. 1122–8, out. 2002.

GUH, D. P. et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a

systematic review and meta-analysis. BMC public health, v. 9, p. 88, jan. 2009.

HERMAN, M. A. et al. A novel ChREBP isoform in adipose tissue regulates systemic

glucose metabolism. Nature, v. 484, n. 7394, p. 333–8, 19 abr. 2012.

HIBUSE, T. et al. From The Cover: Aquaporin 7 deficiency is associated with

development of obesity through activation of adipose glycerol kinase. Proceedings of

the National Academy of Sciences, v. 102, n. 31, p. 10993–10998, 11 jul. 2005.

97


HIETANEN, E.; GREENWOOD, M. R. A comparison of lipoprotein lipase activity and

adipocyte differentiation in growing male rats. Journal of lipid research, v. 18, n. 4, p.

480–90, jul. 1977.

HILL, A. A.; REID BOLUS, W.; HASTY, A. H. A decade of progress in adipose tissue

macrophage biology. Immunological reviews, v. 262, n. 1, p. 134–52, nov. 2014.

HOPGOOD, M. F.; BALLARD, F. J. Synthesis and degradation of

phosphoenolpyruvate carboxylase in rat liver and adipose tissue. Changes during a

starvation-re-feeding cycle. The Biochemical journal, v. 134, n. 2, p. 445–53, jun.

1973.

HOTAMISLIGIL, G. S.; SHARGILL, N. S.; SPIEGELMAN, B. M. Adipose

expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin

resistance. Science (New York, N.Y.), v. 259, n. 5091, p. 87–91, 1 jan. 1993.

IIZUKA, K.; HORIKAWA, Y. ChREBP: a glucose-activated transcription factor

involved in the development of metabolic syndrome. Endocrine journal, v. 55, n. 4, p.

617–24, ago. 2008.

IMAGAWA, M.; TSUCHIYA, T.; NISHIHARA, T. Identification of inducible genes at

the early stage of adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells. Biochemical and

biophysical research communications, v. 254, n. 2, p. 299–305, 19 jan. 1999.

IMAMURA, T. et al. G alpha-q/11 protein plays a key role in insulin-induced glucose

transport in 3T3-L1 adipocytes. Molecular and cellular biology, v. 19, n. 10, p. 6765–

74, out. 1999.

JAWORSKI, K. et al. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation

of lipolysis in adipose tissue. American journal of physiology. Gastrointestinal and

98


liver physiology, v. 293, n. 1, p. G1–4, jul. 2007.

JOHNSON, A. M. F.; OLEFSKY, J. M. The origins and drivers of insulin resistance.

Cell, v. 152, n. 4, p. 673–84, 14 fev. 2013.

KANDA, H. et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue,

insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. The Journal of clinical

investigation, v. 116, n. 6, p. 1494–505, jun. 2006.

KAWASHITA, N. H. et al. Glycerokinase activity in brown adipose tissue: a

sympathetic regulation? American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative

and Comparative Physiology, v. 282, n. 4, p. R1185–R1190, 1 abr. 2002.

KERSTEN, S. Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis.

EMBO reports, v. 2, n. 4, p. 282–6, abr. 2001.

KETTELHUT, I. C.; GOLDBERG, A. L. Tumor necrosis factor can induce fever in rats

without activating protein breakdown in muscle or lipolysis in adipose tissue. The

Journal of clinical investigation, v. 81, n. 5, p. 1384–9, maio 1988.

KISHIDA, K. et al. Genomic structure and insulin-mediated repression of the aquaporin

adipose (AQPap), adipose-specific glycerol channel. The Journal of biological

chemistry, v. 276, n. 39, p. 36251–60, 28 set. 2001.

KISKINIS, E. et al. RIP140 represses the “brown-in-white” adipocyte program

including a futile cycle of triacylglycerol breakdown and synthesis. Molecular

endocrinology (Baltimore, Md.), v. 28, n. 3, p. 344–56, mar. 2014.

KOPELMAN, P. G. Obesity as a medical problem. Nature, v. 404, n. 6778, p. 635–43,

6 abr. 2000.

99


KOSCHINSKY, T.; GRIES, F. A.; HERBERG, L. Regulation of glycerol kinase by

insulin in isolated fat cells and liver of Bar Harbor obese mice. Diabetologia, v. 7, n. 5,

p. 316–22, out. 1971.

KWON, E.-Y. et al. Time-course microarrays reveal early activation of the immune

transcriptome and adipokine dysregulation leads to fibrosis in visceral adipose depots

during diet-induced obesity. BMC genomics, v. 13, p. 450, jan. 2012.

LAFONTAN, M.; LANGIN, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose

tissue. Progress in lipid research, v. 48, n. 5, p. 275–97, set. 2009.

LEMONNIER, D. Effect of age, sex, and sites on the cellularity of the adipose tissue in

mice and rats rendered obese by a high-fat diet. The Journal of clinical investigation,

v. 51, n. 11, p. 2907–15, nov. 1972.

LEROYER, S. N. et al. Rosiglitazone controls fatty acid cycling in human adipose

tissue by means of glyceroneogenesis and glycerol phosphorylation. The Journal of

biological chemistry, v. 281, n. 19, p. 13141–9, 12 maio 2006.

LI, M.; YANG, S.; BJÖRNTORP, P. Metabolism of different adipose tissues in vivo in

the rat. Obesity research, v. 1, n. 6, p. 459–68, nov. 1993.

LIN, J. et al. Hyperlipidemic effects of dietary saturated fats mediated through PGC-

1beta coactivation of SREBP. Cell, v. 120, n. 2, p. 261–73, 28 jan. 2005.

LINDSTRÖM, P. The physiology of obese-hyperglycemic mice [ob/ob mice].

TheScientificWorldJournal, v. 7, p. 666–85, jan. 2007.

LIVAK, K. J.; SCHMITTGEN, T. D. Analysis of relative gene expression data using

real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods (San Diego,

100


Calif.), v. 25, n. 4, p. 402–8, dez. 2001.

LOWRY, O. H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal

of biological chemistry, v. 193, n. 1, p. 265–75, nov. 1951.

MAZZUCOTELLI, A. et al. The Transcriptional Coactivator Peroxisome Proliferator

Activated Receptor (PPAR) Coactivator-1 and the Nuclear Receptor PPAR Control

the Expression of Glycerol Kinase and Metabolism Genes Independently of

PPAR Activation in Human White Adipocytes. Diabetes, v. 56, n. 10, p. 2467–2475,

23 jul. 2007.

MENEZES, A. L. et al. A low-protein, high-carbohydrate diet increases de novo fatty

acid synthesis from glycerol and glycerokinase content in the liver of growing rats.

Nutrition research (New York, N.Y.), v. 33, n. 6, p. 494–502, jun. 2013.

MILES, P. D. G. et al. Effect of heterozygous PPARgamma deficiency and TZD

treatment on insulin resistance associated with age and high-fat feeding. American

journal of physiology. Endocrinology and metabolism, v. 284, n. 3, p. E618–26, mar.

2003.

MONTGOMERY, M. K. et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose

homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia, v. 56, n. 5, p. 1129–39, maio

2013.

MOTTILLO, E. P. et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown , beige

, and white adipose tissues during chronic ␤ 3-adrenergic receptor activation. Journal

of lipid research, v. 55, n. 11, p. 2276–86, dez. 2014.

NEWSHOLME, E. A.; ROBINSON, J.; TAYLOR, K. A radiochemical enzymatic

101


activity assay for glycerol kinase and hexokinase. Biochimica et Biophysica Acta

(BBA) - Enzymology, v. 132, n. 2, p. 338–346, mar. 1967.

NIELSEN, T. S. et al. Dissecting adipose tissue lipolysis: molecular regulation and

implications for metabolic disease. Journal of molecular endocrinology, v. 52, n. 3, p.

R199–222, 1 jun. 2014.

NIKOLIC, D. et al. Population genetic analyses of susceptibility to increased body

weight. Archives of medical science : AMS, v. 8, n. 6, p. 998–1002, 20 dez. 2012.

NILSSON-EHLE, P.; SCHOTZ, M. C. A stable, radioactive substrate emulsion for

assay of lipoprotein lipase. Journal of lipid research, v. 17, n. 5, p. 536–41, 1 set.

1976.

NING, J. et al. Insulin and insulin signaling play a critical role in fat induction of insulin

resistance in mouse. American journal of physiology. Endocrinology and

metabolism, v. 301, n. 2, p. E391–401, ago. 2011.

NUNN, C. et al. Resistance to age-related, normal body weight gain in RGS2 deficient

mice. Cellular signalling, v. 23, n. 8, p. 1375–86, ago. 2011.

NYE, C. et al. Reassessing triglyceride synthesis in adipose tissue. Trends in

endocrinology and metabolism: TEM, v. 19, n. 10, p. 356–61, dez. 2008.

OLSWANG, Y. et al. A mutation in the peroxisome proliferator-activated receptor

gamma-binding site in the gene for the cytosolic form of phosphoenolpyruvate

carboxykinase reduces adipose tissue size and fat content in mice. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, v. 99, n. 2, p. 625–

30, 22 jan. 2002.

102


OSBORN, O.; OLEFSKY, J. M. The cellular and signaling networks linking the

immune system and metabolism in disease. Nature medicine, v. 18, n. 3, p. 363–74,

mar. 2012.

OSMAN, O. S. et al. A novel automated image analysis method for accurate adipocyte

quantification. Adipocyte, v. 2, n. 3, p. 160–4, 2013.

PALOU, M. et al. Gene expression patterns in visceral and subcutaneous adipose depots

in rats are linked to their morphologic features. Cellular physiology and

biochemistry : international journal of experimental cellular physiology,

biochemistry, and pharmacology, v. 24, n. 5-6, p. 547–56, jan. 2009.

PATTERSON, J. N. et al. Mitochondrial metabolism of pyruvate is essential for

regulating glucose-stimulated insulin secretion. The Journal of biological chemistry,

v. 289, n. 19, p. 13335–46, 9 maio 2014.

PITOMBO, C. et al. Amelioration of diet-induced diabetes mellitus by removal of

visceral fat. The Journal of endocrinology, v. 191, n. 3, p. 699–706, dez. 2006.

PORTER, M. H. et al. Effects of TNF-alpha on glucose metabolism and lipolysis in

adipose tissue and isolated fat-cell preparations. The Journal of laboratory and

clinical medicine, v. 139, n. 3, p. 140–6, mar. 2002.

QI, L. et al. Adipocyte CREB promotes insulin resistance in obesity. Cell metabolism,

v. 9, n. 3, p. 277–86, mar. 2009a.

QI, L. et al. Adipocyte CREB promotes insulin resistance in obesity. Cell metabolism,

v. 9, n. 3, p. 277–86, 3 mar. 2009b.

RAVNSKJAER, K. et al. Cooperative interactions between CBP and TORC2 confer

103


selectivity to CREB target gene expression. The EMBO journal, v. 26, n. 12, p. 2880–

9, 20 jun. 2007.

REBUFFÉ-SCRIVE, M. et al. Regional fat distribution and metabolism in a new mouse

model (C57BL/6J) of non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism: clinical

and experimental, v. 42, n. 11, p. 1405–9, nov. 1993.

REEVES, P. G.; NIELSEN, F. H.; FAHEY, G. C. AIN-93 purified diets for laboratory

rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on

the reformulation of the AIN-76A rodent diet. The Journal of nutrition, v. 123, n. 11,

p. 1939–51, nov. 1993.

RESHEF, L.; HANSON, R. W.; BALLARD, F. J. A possible physiological role for

glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of biological chemistry, v. 245,

n. 22, p. 5979–84, 25 nov. 1970.

RICHARD, A. J.; STEPHENS, J. M. The role of JAK-STAT signaling in adipose tissue

function. Biochimica et biophysica acta, v. 1842, n. 3, p. 431–9, mar. 2014.

RODBELL, M. METABOLISM OF ISOLATED FAT CELLS. I. EFFECTS OF

HORMONES ON GLUCOSE METABOLISM AND LIPOLYSIS. The Journal of

biological chemistry, v. 239, p. 375–80, fev. 1964.

SAMPATH, H. et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 mediates the pro-lipogenic effects of

dietary saturated fat. The Journal of biological chemistry, v. 282, n. 4, p. 2483–93, 26

jan. 2007.

SANTOS, M. P. DOS et al. A low-protein, high-carbohydrate diet increases fatty acid

uptake and reduces norepinephrine-induced lipolysis in rat retroperitoneal white adipose

tissue. Lipids, v. 47, n. 3, p. 279–89, mar. 2012.

104


SCHELL, J. C.; RUTTER, J. The long and winding road to the mitochondrial pyruvate

carrier. Cancer & metabolism, v. 1, n. 1, p. 6, jan. 2013.

SCHMID, H.; KETTELHUT, I. C.; MIGLIORINI, R. H. Reduced lipogenesis in rats

fed a high-protein carbohydrate-free diet. Metabolism: clinical and experimental, v.

33, n. 3, p. 219–23, mar. 1984.

SEWTER, C. P. et al. Regulation of tumour necrosis factor-alpha release from human

adipose tissue in vitro. The Journal of endocrinology, v. 163, n. 1, p. 33–8, out. 1999.

SHEARMAN, M. S.; HALESTRAP, A. P. The concentration of the mitochondrial

pyruvate carrier in rat liver and heart mitochondria determined with alpha-cyano-beta-

(1-phenylindol-3-yl)acrylate. The Biochemical journal, v. 223, n. 3, p. 673–6, 1 nov.

1984.

SHIMANO, H. et al. Sterol regulatory element-binding protein-1 as a key transcription

factor for nutritional induction of lipogenic enzyme genes. The Journal of biological

chemistry, v. 274, n. 50, p. 35832–9, 10 dez. 1999.

SMITH, P. K. et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical

biochemistry, v. 150, n. 1, p. 76–85, out. 1985.

SONG, Y. et al. CRTC3 links catecholamine signalling to energy balance. Nature, v.

468, n. 7326, p. 933–9, 16 dez. 2010.

STEPPAN, C. M. et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature, v. 409,

n. 6818, p. 307–12, 18 jan. 2001.

STERN, J. S. et al. Glycerol kinase activity in adipose tissue of obese rats and mice:

effects of diet composition. The Journal of nutrition, v. 113, n. 3, p. 714–20, mar.

105


1983.

STRISSEL, K. J. et al. Adipocyte death, adipose tissue remodeling, and obesity

complications. Diabetes, v. 56, n. 12, p. 2910–8, dez. 2007.

SUN, H. et al. The effect of LXRα, ChREBP and Elovl6 in liver and white adipose

tissue on medium- and long-chain fatty acid diet-induced insulin resistance. Diabetes

research and clinical practice, v. 102, n. 3, p. 183–92, dez. 2013.

SURWIT, R. S. et al. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes, v. 37,

n. 9, p. 1163–7, set. 1988.

SUSINI, C.; LAVAU, M.; HERZOG, J. Adrenaline responsiveness of glucose

metabolism in insulin-resistant adipose tissue of rats fed a high-fat diet. The

Biochemical journal, v. 180, n. 2, p. 431–3, 15 maio 1979.

SWINBURN, B. A. et al. The global obesity pandemic: shaped by global drivers and

local environments. Lancet, v. 378, n. 9793, p. 804–14, 27 ago. 2011.

TAKAHASHI, K. et al. JNK- and IkappaB-dependent pathways regulate MCP-1 but

not adiponectin release from artificially hypertrophied 3T3-L1 adipocytes preloaded

with palmitate in vitro. American journal of physiology. Endocrinology and

metabolism, v. 294, n. 5, p. E898–909, maio 2008.

TEPPERMAN, H. M.; DEWITT, J.; TEPPERMAN, J. Effect of a high fat diet on rat

adipocyte lipolysis: responses to epinephrine, forskolin, methylisobutylxanthine,

dibutyryl cyclic AMP, insulin and nicotinic acid. The Journal of nutrition, v. 116, n.

10, p. 1984–91, out. 1986.

TONTONOZ, P. et al. mPPAR gamma 2: tissue-specific regulator of an adipocyte

106


enhancer. Genes & Development, v. 8, n. 10, p. 1224–1234, 15 maio 1994.

TOWBIN, H.; STAEHELIN, T.; GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,

v. 76, n. 9, p. 4350–4, set. 1979.

TRAYHURN, P.; WOOD, I. S. Adipokines: inflammation and the pleiotropic role of

white adipose tissue. The British journal of nutrition, v. 92, n. 3, p. 347–55, set. 2004.

TREBLE, D. H.; MAYER, J. GLYCEROLKINASE ACTIVITY IN WHITE ADIPOSE

TISSUE OF OBESE-HYPERGLYCAEMIC MICE. Nature, v. 200, p. 363–4, 26 out.

1963.

TURNER, N. et al. Distinct patterns of tissue-specific lipid accumulation during the

induction of insulin resistance in mice by high-fat feeding. Diabetologia, v. 56, n. 7, p.

1638–48, jul. 2013.

VALENTIM, R. R. O papel das catecolaminas na regulação da gliceroquinase e sua

importância no tecido adiposo branco de ratos. [s.l: s.n.].

VÁZQUEZ-VELA, M. E. F.; TORRES, N.; TOVAR, A. R. White Adipose Tissue as

Endocrine Organ and Its Role in Obesity. Archives of Medical Research, v. 39, n. 8, p.

715–728, nov. 2008.

WANG, F. et al. Activated glucose-6-phosphate dehydrogenase is associated with

insulin resistance by upregulating pentose and pentosidine in diet-induced obesity of

rats. Hormone and metabolic research = Hormon- und Stoffwechselforschung =

Hormones et métabolisme, v. 44, n. 13, p. 938–42, dez. 2012.

107


WATT, M. J.; STEINBERG, G. R. Regulation and function of triacylglycerol lipases in

cellular metabolism. The Biochemical journal, v. 414, n. 3, p. 313–25, 15 set. 2008.

WELLEN, K. E.; HOTAMISLIGIL, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. The

Journal of clinical investigation, v. 115, n. 5, p. 1111–9, maio 2005.

WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). WHO | Obesity and overweight. n.

Fact sheet N°311, 2015.

WIESER, V.; MOSCHEN, A. R.; TILG, H. Inflammation, Cytokines and Insulin

Resistance: A Clinical Perspective. Archivum Immunologiae et Therapiae

Experimentalis, v. 61, n. 2, p. 119–125, 10 jan. 2013.

WINDMUELLER, H. G.; SPAETH, A. E. Perfusion in situ with tritium oxide to

measure hepatic lipogenesis and lipid secretion. Normal and orotic acid-fed rats. The

Journal of biological chemistry, v. 241, n. 12, p. 2891–9, 25 jun. 1966.

WU, C. et al. [Roles of glucose-6-phosphate dehydrogenase in obesity induced by high

fat diet]. Wei sheng yan jiu = Journal of hygiene research, v. 42, n. 3, p. 447–50,

maio 2013.

YAMAUCHI, T. et al. The mechanisms by which both heterozygous peroxisome

proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) deficiency and PPARgamma

agonist improve insulin resistance. The Journal of biological chemistry, v. 276, n. 44,

p. 41245–54, 2 nov. 2001.

ZHAO, P.; STEPHENS, J. M. Identification of STAT target genes in adipocytes. JAK-

STAT, v. 2, n. 2, p. e23092, 1 abr. 2013.

ZIMMERMANN, R. et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose

108


triglyceride lipase. Science (New York, N.Y.), v. 306, n. 5700, p. 1383–6, 19 nov.

2004.

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Medicina de ... · Rafael Rossi Valentin, te agradeço um monte por todos os nossos “embates” científicos extremamente enriquecedores,