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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Degradação do tetracloroeteno por consórcios bacterianos em reator
horizontal de leito fixo
Rafael Dutra de Armas
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola
Piracicaba
2011
1
Rafael Dutra de Armas
Bacharel e Licenciado em Ciências Biológicas
Degradação do tetracloroeteno por consórcios bacterianos em reator
horizontal de leito fixo
Orientador:
Prof. Dr. MARCIO RODRIGUES LAMBAIS
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em
Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola
Piracicaba
2011
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP
Armas, Rafael Dutra de Degradação do tetracloroeteno por consórcios bacterianos em reator horizontal de leito fixo / Rafael Dutra de Armas. - - Piracicaba, 2011.
148 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2011.
1. Água - Contaminação 2. Bactérias 3. Biofilmes 4. Biorremediação 5. Cromatografia 6. RNA Ribossômico I. Título
CDD 628.16 A727d
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Aos meus pais, Edes e Neiva, ao meu irmão Eduardo e a
minha noiva Kelly, DEDICO.
4
5
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida e à fé necessária para seguirmos.
A meus pais, Edes e Neiva, pelo amor incondicional, carinho e conselhos.
A meu irmão, Eduardo, pelo carinho, amizade e exemplo de profissionalismo.
Ao meu amor, Kelly Justin da Silva, por todo apoio, compreensão nos momentos difíceis,
companheirismo, carinho, amor e ajuda na elaboração deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Marcio Rodrigues Lambais, pela orientação.
Ao CNPq, pela bolsa concedida.
À FAPESP, pelo financiamento do projeto.
À Coordenação do PPG-Microbiologia Agrícola e à ESALQ, pela oportunidade.
Aos técnicos, Wladimir, Denise e Fernando.
Ao amigo José Luis Paz Jara, pelo auxílio nas análises cromatográficas.
Aos colegas, Adriano, Alice, Denise, Eder, Elisa, Joze, Gisele, Giselle, Sandra, Silvia,
Tiago, Vivian e Winston, pelo convívio.
6
7
“O parasita toma tudo e não dá nada. O direito de domínio e
propriedade se reduz ao parasitismo. Ao contrário, o direito de
simbiose se define por reciprocidade: o que a natureza dá ao
homem é o que este deve restituir a ela, transformada em sujeito
de direito.”
Michel Serres.
8
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SUMÁRIO
RESUMO..... .......................................................................................................................... 13
ABSTRACT. .......................................................................................................................... 15
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ................................................................................................... 17
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ 19
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .............................................................................. 21
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 23
2 DESENVOLVIMENTO ...................................................................................................... 25
2.1 Revisão Bibliográfica ........................................................................................................ 25
2.1.1 A água no planeta ........................................................................................................... 25
2.1.2 Importância dos organoclorados na contaminação ambiental .......................................... 26
2.1.3 Tetracloroeteno .............................................................................................................. 27
2.1.3.1 Contaminação ambiental por PCE ............................................................................... 27
2.1.3.2 Riscos do PCE à saúde humana ................................................................................... 29
2.1.3.3 Remediação de áreas contaminadas com PCE .............................................................. 30
2.1.3.4 Vias de biodegradação do PCE .................................................................................... 33
2.1.3.4.1 Biodegradação anaeróbia .......................................................................................... 34
2.1.3.4.1.1 Descloração redutiva direta .................................................................................... 34
2.1.3.4.1.2 Descloração redutiva co-metabólica ....................................................................... 37
2.1.3.4.1.3 Descloração redutiva por bactérias anaeróbias facultativas ..................................... 40
2.1.3.4.2. Biodegradação aeróbia ............................................................................................. 40
2.1.3.4.2.1 Biodegradação oxidativa direta .............................................................................. 40
2.1.3.4.2.2 Biodegradação oxidativa co-metabólica ................................................................. 41
2.1.3.4.3 Consórcios bacterianos na degradação de cloroetenos ............................................... 41
2.2 Material e Métodos ........................................................................................................... 43
2.2.1 Área de estudo e amostragem ......................................................................................... 43
2.2.2 Imobilização do sedimento em suporte de poliuretano e acondicionamento em
RHLFs .................................................................................................................. 46
2.2.3 Cultivo de enriquecimento em RHLFs ............................................................................ 46
2.2.4 Estrutura da comunidade e diversidade bacteriana nos RHLFs ....................................... 47
10
2.2.4.1 Extração do DNA metagenômico ................................................................................48
2.2.4.2 Eletroforese em gel com gradiente desnaturante...........................................................48
2.2.4.2.1 Análise dos perfis de amplicons após DGGE ............................................................49
2.2.4.3 Detecção de Dehalococcoides por PCR .......................................................................49
2.2.4.4 Clonagem e sequenciamento de clones do gene rRNA 16S ..........................................50
2.2.4.4.1 Análise das sequências do gene rRNA 16S ...............................................................51
2.2.5 Ensaio de degradação do PCE em RHLF ........................................................................52
2.2.6 Varredura de COVs dos RHLFs .....................................................................................52
2.2.7 Isolamento e identificação de bactérias dos RHLFs ........................................................53
2.2.7.1 Coleta das amostras e plaqueamento ............................................................................53
2.2.7.2 Teste de crescimento em meio com PCE .....................................................................54
2.2.7.3 Identificação das bactérias isoladas dos RHLFs ...........................................................54
2.2.7.3.1 Extração do DNA .....................................................................................................54
2.2.7.3.2 BOX-PCR ................................................................................................................54
2.2.7.3.3 Sequenciamento do gene rRNA 16S .........................................................................55
2.2.7.3.3.1 Análise das sequências ...........................................................................................56
2.2.7.3.4 Marcadores moleculares ...........................................................................................56
2.2.8 Ensaio de degradação do PCE com os isolados selecionados dos RHLFs ........................57
2.2.8.1 Imobilização e cultivo de enriquecimento dos isolados ................................................57
2.2.8.2 Monitoramento dos isolados ........................................................................................57
2.2.8.3 Ensaios de degradação do PCE nos RHLFs .................................................................58
2.2.8.4 Ensaios de degradação do PCE com células em suspensão...........................................60
2.2.8.5 Ensaio de degradação do PCE com IIn2 em RHLF ......................................................61
2.2.8.6 Teste de inibição da via de monoxigenases ..................................................................61
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................................63
3.1 Análise de COVs e PFQs da área de estudo .......................................................................63
3.2 Seleção de bactérias por cultivo de enriquecimento em RHLFs .........................................65
3.2.1 Estrutura da comunidade de Bacteria nos RHLFs ...........................................................65
3.2.2 Detecção de populações de Dehalococcoides..................................................................68
3.2.3 Sequenciamento de clones do gene rRNA 16S de Bacteria dos RHLFs ...........................69
3.3 Ensaio de degradação do PCE em RHLF ...........................................................................77
11
3.4 Varredura de COVs dos RHLFs ........................................................................................ 80
3.5 Isolamento de bactérias presentes nos RHLFs ................................................................... 83
3.6 Teste de crescimento com PCE como única fonte de carbono ............................................ 83
3.7 BOX-PCR ......................................................................................................................... 84
3.8 Identificação dos isolados por sequenciamento do gene rRNA 16S ................................... 87
3.9 Marcadores moleculares para monitoramento dos isolados nos RHLFs ............................. 91
3.10 Avaliação da eficiência dos isolados na degradação do PCE ............................................ 94
3.10.1 Monitoramento dos isolados nos RHLFs ...................................................................... 94
3.10.2 Ensaio de degradação aeróbia do PCE nos RHLFs........................................................ 95
3.10.3 Ensaio de degradação do PCE com células em suspensão ........................................... 101
3.10.4 Avaliação do I8In2 na degradação do PCE em RHLF ................................................. 103
3.10.5 Teste de degradação do PCE na presença de inibidor de monoxigenases..................... 104
4 CONCLUSÕES ................................................................................................................. 109
REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 111
APÊNDICES ........................................................................................................................ 137
ANEXOS...... ........................................................................................................................ 141
12
13
RESUMO
Degradação do tetracloroeteno por consórcios bacterianos em reator
horizontal de leito fixo
O tetracloroeteno (PCE), um dos principais contaminantes de águas subterrâneas, é uma
molécula recalcitrante, com toxicidade elevada. Processos de biorremediação de água ou solo
contaminados com PCE são normalmente limitados pela baixa eficiência de microrganismos
sabidamente envolvidos em sua degradação. No entanto, a prospecção de novos microrganismos,
mais eficientes na degradação do PCE é uma alternativa para otimizar esses processos. Os
objetivos deste estudo foram desenvolver uma técnica de biorremediação utilizando um reator
horizontal de leito fixo (RHLF) contendo consórcios de microrganismos eficientes na degradação
do PCE, e caracterizar a via de degradação do PCE utilizada pelo consórcio selecionado. Para
tanto, amostras de sedimento de dois poços de monitoramento de água foram coletadas de uma
metalúrgica com histórico de contaminação com PCE. Os sedimentos foram imobilizados,
acondicionados em RHLFs específicos e submetidos a cultivo de enriquecimento em meio
mínimo suplementado com PCE. A estrutura das comunidades e a diversidade bacteriana dos
RHLFs foram avaliadas e comparadas com as amostras do PM1 e PM2, por PCR-DGGE e
sequenciamento de bibliotecas de clones do gene rRNA 16S. Os resultados evidenciaram a
seleção de populações bacterianas no RHLF contendo o inóculo do PM1 (In1) após o cultivo de
enriquecimento, enquanto no RHLF contendo o inóculo do PM2 (In2), a estrutura da comunidade
bacteriana não diferiu daquela observada no PM2. Ensaios de degradação do PCE nos RHLFs,
usando cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas (CG/EM), mostraram, após
12 horas, uma eficiência de 87 % na degradação do PCE no reator com In1 e 96 % no reator com
In2. Foi feito o isolamento e identificação, por sequenciamento do gene rRNA 16S, das bactérias
dos RHLFs, sendo identificados 4 isolados do In1, similares a Burkholderia sp.,
Pseudomonas stutzeri, P. oryzihabitans e Stenotrophomonas maltophilia e 7 isolados do In2,
similares a Microbacterium trichotecenenolyticum, S. maltophilia, Klebsiella sp.,
Exiguobacterium acetylicum, P. oryzihabitans, Acinetobacter junii e Comamonas sp. Compostos
orgânicos voláteis nos reatores com In1 e In2 foram analisados por CG/EM, identificando a
produção de clorofórmio (TCM) e 1,1,1-tricloroetano (TCA) como produtos da degradação do
PCE. Consórcios formados por bactérias isoladas dos reatores In1 (IIn1) e In2 (IIn2) foram
imobilizados e acondicionados em RHLFs distintos para avaliar o potencial dos mesmos na
degradação do PCE. Após 12 horas, 92 % do PCE foi degradado nos reatores com IIn1 e IIn2,
com produção de TCM e TCA. Testes de degradação usando células em suspensão foram
conduzidos para avaliar a eficiência de cada isolado na degradação do PCE. O isolado I8 do In2
(I8In2), identificado como Comamonas sp., teve 68 % de eficiência na degradação do PCE.
Ensaios com inibidor de monoxigenases do citocromo P-450 (1-aminobenzotriazole) mostraram
que a degradação do PCE nos RHLFs, contendo IIn1, IIn2 e I8In2, foram dependentes dessa
enzima. Como conclusão, nós identificamos uma nova via de degradação do PCE altamente
eficiente, aeróbia e mediada por monoxigenases e isolamos cepas bacterianas que podem ser
usadas como consórcios imobilizados nos RHLFs como uma alternativa eficiente na remediação
de áreas contaminadas com PCE.
Palavras chave: PCR-DGGE; rRNA 16S; Imobilização bacteriana; Cromatografia gasosa;
Monoxigenase
14
15
ABSTRACT
Degradation of tetrachloroethene by bacterial consortia in horizontal
fixed bed reactor
Tetrachloroethene (PCE), one of the main contaminants of groundwater, is a recalcitrant
molecule with high toxicity. Bioremediation processes of water or soil contaminated with PCE
are usually limited by the low efficiency of microorganisms known to be involved in its
degradation. However, the exploration of new and more efficient microorganisms in the
degradation of PCE is an alternative to optimize these processes. The objectives of these studies
were to develop a bioremediation technique using horizontal fixed bed reactor (HFBR)
containing microbial consortia effective in the PCE degradation, and to characterize the PCE
degradation pathway used by the selected consortium. For that, sediment samples of two
groundwater monitoring wells were collected from a metallurgical plant with historical of PCE
contamination. The sediments were immobilized, packed in specific HFBRs and subjected to
enrichment in minimal medium supplemented with PCE. The bacterial community structure and
diversity in the HFBRs were evaluated and compared to samples from the MW1 and MW2, by
PCR-DGGE and sequencing of 16S rRNA gene clone libraries. The results revealed the selection
of bacterial populations in the HFBR containing inoculum from MW1 (In1) after enrichment,
while in the HFBRs containing inoculum from MW2 (In2), the bacterial community structure did
not differ from that observed in MW2. Tests of PCE degradation in HFBRs using gas
chromatography-mass spectrometry (GC/MS) showed, after 12 hours, an efficiency of 87 % in
the PCE degradation in the In1 reactor and 96 % in the In2 reactor. Bacteria from HFBR were
isolated and identified by sequencing of 16S rRNA gene, and 4 isolates from In1, similar to
Burkholderia sp., Pseudomonas stutzeri, P. oryzihabitans and Stenotrophomonas maltophilia,
and 7 isolates from In2, similar to Microbacterium trichotecenenolyticum, S. maltophilia,
Klebsiella sp., Exiguobacterium acetylicum, P. oryzihabitans, Acinetobacter junii and
Comamonas sp. were identified. Volatile organic compounds in the reactors with In1 and In2
were analyzed by GC/MS, showing the production of chloroform (TCM) and
1,1,1-trichloroethane (TCA) as PCE degradation products. Consortia composed of bacteria
isolated from the In1 (IIn1) and In2 (IIn2) reactors were immobilized and packed in distinct
HFBRs to evaluate the potential of specific consortia in PCE degradation. After 12 hours, 92 %
of PCE was degraded in reactors with IIn1 and IIn2, with the production of TCM and TCA.
Degradation tests using cells suspension were conducted to evaluate the efficiency of each isolate
in PCE degradation. Isolate I8 from In2 (I8In2), identified as Comamonas sp., showed 68 %
efficiency in the PCE degradation. Assays using inhibitor of monooxygenases cytochrome P-450
(1-aminobenzotriazole) showed that the PCE degradation in HFBRs containing IIn1, IIn2 and
I8In2 were dependent of this enzyme. In conclusion, we have identified a new highly efficient
PCE degradation pathway, aerobic and mediated by monooxygenases, and isolated bacterial
strains that may be used as consortia which immobilized in HFBRs as an efficient alternative in
the remediation of PCE contaminated areas.
Keywords: PCR-DGGE; 16S rRNA; Bacterial immobilization; Gas chromatography;
Monooxygenase
16
17
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Via de descloração redutiva do PCE........................................................................ 35
Figura 2 - Vias de degradação do PCE no ambiente ................................................................ 42
Figura 3 - Mapas ilustrando a localização geográfica e imagem aérea da área de estudo .......... 45
Figura 4 - Coleta do sedimento e acondicionamento em RHLF ............................................... 46
Figura 5 - Montagem do RHLF com sistema de circulação contínua e fechada de solução ...... 47
Figura 6 - Fluxograma com as metodologias utilizadas no trabalho ......................................... 62
Figura 7 - Comparação entre a estrutura da comunidade bacteriana dos PMs e dos RHLFs,
após enriquecimento ........................................................................................... 67
Figura 8 - Detecção de Dehalococcoides nos poços de monitoramento e RHLFs ..................... 69
Figura 9 - Abundância de grupos filogenéticos dos PMs e dos RHLFs (%), após cultivo de
enriquecimento ................................................................................................... 73
Figura 10 - Curva de rarefação indicando o número estimado de UTOs em bibliotecas de
clones do gene rRNA 16S de Bacteria nos PMs e nos RHLFs, após cultivo de
enriquecimento ................................................................................................... 74
Figura 11 - Diagrama de Venn baseado na frequência de UTOs dos PMs e do biofilme dos
RHLFs................................................................................................................ 75
Figura 12 - Relações filogenéticas entre as UTOs mais representativas com base no
sequenciamento do gene rRNA 16S de Bacteria do In1 e In2 .............................. 77
Figura 13 - BOX-PCR para seleção dos isolados do In1. ......................................................... 85
Figura 14 - Colônias dos isolados do In1 selecionados para sequenciamento ........................... 85
Figura 15 - BOX-PCR para seleção dos isolados do In2 .......................................................... 86
Figura 16 - Colônias dos isolados do In2 selecionados para sequenciamento ........................... 86
Figura 17 - Similaridade entre os isolados do In1 e In2 e sequências depositadas no
GenBank com base no sequenciamento do gene rRNA 16S de Bacteria .............. 88
Figura 18 - PCR-DGGE dos isolados do In1 ........................................................................... 92
Figura 19 - PCR-DGGE dos isolados do In2 ........................................................................... 93
Figura 20 - Marcadores moleculares dos isolados do In1 e In2 obtidos pela excisão das
bandas de cada isolado dos géis de DGGE .......................................................... 94
18
Figura 21 - Monitoramento dos isolados do In1 em diferentes portas do RHLF por PCR-
DGGE ................................................................................................................95
Figura 22 - Ensaios de degradação do PCE em RHLFs............................................................99
Figura 23 – Quantificação, em percentual de carbono, dos compostos da via de degradação
aeróbia do PCE nos RHLFs .............................................................................. 100
Figura 24 - Ensaio de degradação do PCE com células em suspensão dos IIn1 ...................... 102
Figura 25 - Ensaio de degradação do PCE com células em suspensão dos IIn2 ...................... 102
Figura 26 – Avaliação, em percentual de carbono, da eficiência do I8In2 na degradação do
PCE .................................................................................................................. 103
Figura 27 – Ensaio de inibição da via de monoxigenases na degradação do PCE no I8In2
pela adição de 1-aminobenzotriazole (ABT) ..................................................... 105
Figura 28 - Ensaio de inibição da via de monoxigenases na degradação do PCE no IIn1
pela adição de 1-aminobenzotriazole (ABT) ..................................................... 106
Figura 29 - Ensaio de inibição da via de monoxigenases na degradação do PCE no IIn2
pela adição de 1-aminobenzotriazole (ABT) ..................................................... 106
19
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Quantificação do PCE e dos produtos da via de descloração redutiva no PM1 e
PM2 de uma área com histórico de contaminação por PCE ................................. 64
Tabela 2 - Resultado do teste de similaridade por Pairwise (pareamento) baseado nos
perfis de amplicons do gene rRNA 16S de Bacteria dos PMs e RHLFs, após
cultivo de enriquecimento ................................................................................... 68
Tabela 3 - Estimativa de riqueza de UTOs, índice de diversidade e cobertura de
amostragem calculados a partir de bibliotecas de clones do gene rRNA 16S
de Bacteria de amostras dos PMs e RHLFs, após cultivo de enriquecimento ....... 70
Tabela 4 - Valores de p calculado nas comparações múltiplas entre as bibliotecas de
clones do gene rRNA 16S das comunidades de Bacteria de amostras dos PMs
e RHLFs, após cultivo de enriquecimento ........................................................... 73
Tabela 5 - Resultados dos ensaios de degradação do PCE no In1 e In2 .................................... 79
20
21
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABT - 1-aminobenzotriazole
ANM - atenuação natural monitorada
BTEX - benzeno, tolueno, etil-benzeno e xileno
cDCE - cis-1,2-Dicloroeteno
CE - condutividade elétrica
CV - cloreto de vinila
COV - composto orgânico volátil
DGGE - eletroforese em gel com gradiente desnaturante
DNA - ácido desoxirribonucleico
DNAPL - fase líquida não aquosa mais densa que água
Eh - potencial redox
ETE - etileno
IE - impacto de elétrons
HCFC-22 - hidroclorofluorcarbono
IIn1 - isolados do inóculo do PM1
IIn2 - isolados do inóculo do PM2
In1 - inóculo do poço de monitoramento 1 imobilizado no reator horizontal de leito fixo
In2 - inóculo do poço de monitoramento 2 imobilizado no reator horizontal de leito fixo
Koc - coeficiente de partição de carbono orgânico
Kow - coeficiente de partição octanol/água
LNAPL - fase líquida não aquosa menos densa que a água
MM - meio mínimo
NAPL - fase líquida não aquosa
OD - oxigênio dissolvido
oMO - orto-monoxigenase
pb - pares de base
PCE - tetracloroeteno
PCP - pentaclorofenol
PCR - reação em cadeia da polimerase
22
pH - potencial hidrogeniônico
PM1- poço de monitoramento 1
PM2 - poço de monitoramento 2
pMMO - metano monoxigenase
POA - processos oxidativos avançados
POP - poluente orgânico persistente
SPME - microextração em fase sólida
RHLF - reator horizontal de leito fixo
rRNA - ácido ribonucléico ribossomal
TCA - 1,1,1-tricloroetano
TCE - tricloroeteno
TCM - clorofórmio
ToMO - tolueno-o-xileno-monoxigenase
23
1 INTRODUÇÃO
A água é um recurso natural de valor inestimável. Mais que um insumo indispensável à
produção e um recurso estratégico para o desenvolvimento econômico, é vital para a manutenção
dos ciclos biológicos, geológicos e químicos que mantêm em equilíbrio os ecossistemas. É, ainda,
uma referência cultural e um bem social indispensável à adequada qualidade de vida da
população. Desta forma, a utilização da água de forma consciente, levando em conta
principalmente sua conservação, evitando o desperdício, controlando as fontes de contaminação e
investindo em programas de recuperação de áreas contaminadas, são pontos chave na
manutenção deste recurso natural.
Na recuperação de águas contaminadas deve-se considerar que, apesar de mais protegidas
do que as águas superficiais, as águas subterrâneas, maiores reservas exploráveis de água doce do
planeta, estão sujeitas a contaminação, a qual pode ocorrer pelo aumento da densidade
demográfica, modificações do uso da terra, industrialização acelerada, entre outros. Dentre os
contaminantes de águas subterrâneas destacam-se os organoclorados, sendo um dos mais
frequentes o tetracloroeteno (PCE). O PCE é classificado como poluente orgânico persistente
(POP), e é um dos contaminantes de águas subterrâneas mais preocupantes, por ser uma molécula
de alta persistência no ambiente, de difícil degradação química e biológica e alta solubilidade em
lipídios, o que, associado a sua toxicidade e seu potencial carcinógeno, intensifica os riscos à
saúde pública.
O PCE pertence a uma classe de contaminantes que é relativamente insolúvel e mais
densa do que a água, e ao ser liberado ou derramado no solo, tende a migrar verticalmente,
acumulando-se em camadas de baixa permeabilidade. O PCE em fase livre age como uma fonte
contínua de contaminação da água subterrânea e pode persistir em subsuperfície por décadas.
Muitos fatores, tais como a viscosidade baixa e densidade elevada do PCE, bem como a
heterogeneidade geológica, influenciam na migração, distribuição e biodisponibilidade do PCE,
dificultando sua localização, quantificação e a remediação de áreas contaminadas.
Diferentes técnicas de remediação in situ e ex situ vêm sendo utilizadas em áreas
contaminadas com PCE, no entanto dificuldades têm sido encontradas para a remediação dessas
áreas devido às características recalcitrantes desta molécula. Técnicas de remediação ex situ,
caracterizadas pela extração do meio contaminado e tratamento por métodos físicos, químicos e
24
biológicos específicos em local pré-determinado, tem sido utilizadas na recuperação de áreas
contaminadas com PCE. No entanto, as maiores dificuldades na implantação destas técnicas
dizem respeito à extração do PCE do ambiente, o qual pode acumular-se em grandes
profundidades, inviabilizando financeira e tecnicamente a remediação ex situ. Devido à baixa
solubilidade, seu bombeamento é dificultado, necessitando de um grande volume de água para
extrair o PCE, o que incrementa os custos operacionais, aumentando o volume de resíduo, sem a
garantia da descontaminação da área.
As tecnologias de remediação in situ, que promovem o tratamento diretamente na área
contaminada, caracterizam-se por não necessitarem de transporte, do meio contaminado. No
entanto, as condições do ambiente, como pH, temperatura e potencial de oxi-redução interferem
diretamente na eficiência dos processos de remediação do PCE in situ. Apesar disso, é uma
alternativa para a degradação do PCE, pois devido à versatilidade metabólica dos
microrganismos, diferentes vias de biodegradação podem ser estimuladas, formando substâncias
inócuas, seja por técnicas de bioestímulo ou bioaumento. As principais dificuldades na
implantação de técnicas de biorremediação in situ estão associadas com a ocorrência dos
microrganismos no foco da contaminação, seu estímulo, bem como a manutenção das condições
físico-químicas ideais para sua ação. Adicionalmente, quando os microrganismos são
introduzidos no local contaminado, a sobrevivência dos mesmos pode ser baixa, devido à pressão
de seleção.
Uma alternativa para a biorremediação in situ de áreas contaminadas com PCE é a
utilização de reatores biológicos on site, ou seja, uma técnica caracterizada pelo bombeamento da
água subterrânea contaminada, tratamento em reatores biológicos e sua reintrodução no aquífero.
A vantagem desta técnica é utilizar microrganismos selecionados, de eficiência conhecida, além
de possibilitar o controle das características do meio para aumentar a eficiência de
biodegradação.
Este trabalho teve como objetivos desenvolver uma técnica de biorremediação, utilizando
um reator horizontal de leito fixo (RHLF) contendo consórcios de microrganismos previamente
selecionados eficientes na degradação do PCE, bem como caracterizar a via de degradação do
PCE utilizada pelo consórcio bacteriano selecionado.
25
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão Bibliográfica
2.1.1 A água no planeta
A água é essencial para a manutenção dos ciclos biológicos, geológicos e químicos que
mantêm em equilíbrio os ecossistemas, sendo também fundamental para as atividades antrópicas.
A maior parte da água utilizada para consumo humano e suas atividades socioeconômicas é
captada dos rios, lagos, represas e aquíferos subterrâneos (CABRAL, 2010; SIMONOVIC,
2002).
Apesar de ser um recurso natural abundante, com volume total no planeta estimado em
1.386.000 km3, e cobrindo aproximadamente 70 % da superfície da Terra, 97,5 % é formado de
água salgada (oceanos e mares) e apenas 2,5 % de água doce (COMPANHIA DE
TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL - CETESB, 2010; REBOUÇAS, 2001). A
maior parcela dessa água doce (68,9 %) forma as calotas polares, as geleiras e neves que cobrem
os cumes das montanhas. Outra fração importante, 29,9 %, é constituída de águas subterrâneas. A
água do solo (inclusive permafrost) e as águas dos pântanos representam cerca de 1,0 % do total,
e a água doce dos rios e lagos apenas 0,3 % (MALMQVIST; RUNDLE, 2002).
Dentre as fontes de água doce, as águas subterrâneas representam mais de 95 % das
reservas exploráveis do globo terrestre e, devido à crescente demanda por recursos hídricos, sua
exploração desponta como uma alternativa importante. Isso se deve não somente à sua
abundância, mas também a qualidade e baixo custo de captação, principalmente considerando a
baixa qualidade das águas superficiais, associadas ao elevado custo do tratamento e escassez
verificada em algumas regiões. Assim, as águas subterrâneas vêm se tornando estratégicas para o
desenvolvimento econômico da sociedade, devendo ser preservadas (CETESB, 2010).
Embora mais protegidas do que as águas superficiais, as águas subterrâneas também são
vulneráveis à contaminação, sendo sua fragilidade relacionada com o grau de proteção natural
contra possíveis ameaças de contaminação, o qual depende das características litológicas e
hidrogeológicas dos estratos que as separam da fonte de contaminação, e dos gradientes
26
hidráulicos que determinam o fluxo dos contaminantes através dos sucessivos estratos e dentro do
aquífero (BORBA; FIGUEIREDO; CAVALCANTI, 2004).
2.1.2 Importância dos organoclorados na contaminação ambiental
Os compostos organoclorados são obtidos pela hidrocloração e cloração de compostos
orgânicos. A família dos organoclorados é composta por seis produtos principais: cloreto de
metileno, tricloroeteno (TCE), clorofórmio (TCM), tetracloreto de carbono, cloreto de metila e
PCE.
Os primeiros solventes clorados foram produzidos na Alemanha no século XIX e a
produção nos Estados Unidos teve inicio em 1906. O uso em larga escala dos solventes clorados
nas indústrias de manufatura iniciou-se durante a segunda guerra mundial e cresceu nas três
décadas posteriores. Os organoclorados podem ser utilizados como herbicidas, inseticidas,
fungicidas, solventes, fluídos hidráulicos, fumigantes, aditivos de gasolina, desengraxantes e
intermediários para síntese de vários produtos químicos (FLORES et al., 2004). Devido a sua
ampla utilização, nas mais variadas atividades e de forma indiscriminada, os organoclorados
tornaram-se os principais contaminantes ambientais. A contaminação da água subterrânea por
estes compostos não era reconhecida até o final da década de setenta, quando considerava-se a
alta persistência destes compostos no ambiente como característica importante para o controle de
pragas na agricultura. Após este período, inúmeros relatos de contaminação de águas
subterrâneas por organoclorados foram observados (FLORES et al., 2004).
A toxicidade dos organoclorados, sua capacidade de bioconcentração, persistência no
ambiente e distribuição ubíqua na biosfera, geram preocupação sobre sua influência na qualidade
de vida (BHATT et al., 2007). Dentre as características mais preocupantes destes compostos para
a saúde pública está a genotoxicidade, que merece atenção especial, pois alterações no material
genético podem levar, dentre outros problemas, ao desenvolvimento de câncer (NUNES;
TAJARA, 1998).
A contaminação ambiental por organoclorados tem-se difundido de forma tão
generalizada que já foram detectados organoclorados mesmo em regiões que não foram expostas
a estes compostos. Na última década, por exemplo, compostos semi-voláteis, como o
hexaclorobenzeno, 1,1,1-tricloro-2,2-bis (4-clorofenil) etano (DDT) e os seus metabólitos e
27
bifenilos policlorados, substâncias conhecidamente persistentes no ar, água e sedimentos, foram
detectadas na região ártica (FREIRE et al., 2000).
2.1.3 Tetracloroeteno
Dentre os organoclorados, o PCE se destaca por ser um composto de ampla utilização e
um dos principais contaminantes da atmosfera, do solo e da água. É um líquido incolor, não
inflamável, com odor característico, semelhante ao éter, classificado como substância altamente
tóxica e potencialmente carcinógena (BHATT et al., 2007).
O primeiro relato de síntese do PCE foi em 1821, por Michael Faraday, através do
aquecimento do composto hexacloroetano até a sua decomposição em PCE e Cl2, sendo em 1925
produzido comercialmente nos Estados Unidos (AGENCIA PARA SUSTANCIAS TÓXICAS Y
EL REGISTRO DE ENFERMEDADES - ATSDR, 1996). O PCE atingiu o auge de sua
utilização no século XX, juntamente com o TCE, produto da descloração do PCE, devido à
extensa utilização destes compostos nas indústrias, em centros militares e em residências, como
solvente não inflamável.
O PCE também é utilizado na indústria de lavagem a seco, onde, devido às suas
características de não-inflamabilidade, não-explosividade e alto poder de solvência, assumiu
papel de destaque. Além de possuir baixa viscosidade, sua fácil penetração em tecidos,
dissolvendo a maioria das substâncias encontradas no mesmo, sem deixar odor, além de possuir
característica antimicrobiana, lhe garantiram ampla utilização (BRUIN et al., 1992).
Sua aplicação indiscriminada, bem como seu armazenamento de forma inadequada,
culminou com abundante contaminação em várias partes do mundo, sendo considerado um dos
maiores contaminantes do solo e da água (PARSONS et al., 1984; SEMPRINI; YU, 2009;
WEISSFLOG et al., 2004).
2.1.3.1 Contaminação ambiental por PCE
Estudos com modelagem matemática estimam que 76 % do PCE do ambiente esteja no ar,
23 % na água, 0,06 % no solo e 0,23 % em sedimentos. No entanto, cabe ressaltar que na
atmosfera o PCE encontra-se em concentrações inferiores aquelas encontradas nos demais
28
ambientes, principalmente quando comparado com águas subterrâneas. O PCE pode migrar entre
os distintos compartimentos ambientais, do solo para águas subterrâneas, de águas superficiais
para a atmosfera, bem como entre fases, sendo encontrado no ambiente tanto na forma líquida
quanto gasosa (EUROPEAN COMMISSION - EC, 2001).
O PCE pode ser adsorvido às partículas do solo, e essa adsorção varia conforme o
conteúdo de carbono orgânico. Com base no coeficiente de partição de carbono orgânico (Koc),
que é uma medida da tendência de um composto orgânico ser adsorvido no solo ou sedimento,
determinou-se o coeficiente de adsorção do PCE, o qual varia entre 177 e 534, valores estes
indicativos de adsorção moderada (GRATHWOHL, 1990).
Como o PCE apresenta baixa solubilidade em água e tem moderada mobilidade no solo
(Koc moderado), não se espera que seu tempo de residência em ambientes de superfície seja maior
que alguns dias. No solo e águas superficiais, em função da pressão de vapor e constante de
Henry altos, indicativo do grau de volatilidade de um composto químico em uma solução, o PCE
volatiliza rapidamente para a atmosfera, percola ou é lixiviado atingindo águas subterrâneas,
onde persiste durante vários meses (SEIP et al., 1986; ZYTNER; BISWAS; BEWTRA, 1989).
A presença das fases livre e residual de PCE na zona não saturada permite a volatilização
do mesmo, formando uma fase gasosa, a qual é desprendida para o ambiente. Na atmosfera,
estudos mostram a presença do PCE em amostras de água de chuva, porém, sua solubilidade
baixa em água sugere que a remoção do PCE da atmosfera pelas chuvas ocorra lentamente
(KENAGA, 1980; SWANN; LASKOWSKI; MCCALL, 1983).
Como foi relatado anteriormente, o PCE é pouco adsorvido no solo, tendendo a percolar e
atingir a subsuperfície, onde devido a sua solubilidade baixa (150 mg L-1
) forma uma fase
imiscível ao atingir a água subterrânea (ALLEN-KING; GRATHWOHL; BALL, 2002),
denominada fase livre.
Na terminologia ambiental, a fase líquida imiscível em água subterrânea é conhecida
como fase líquida não aquosa (NAPL - Non-Aqueous Phase Liquid). Existem dois tipos de
NAPL, uma com fase líquida não aquosa menos densa que a água, conhecida como LNAPL
(Light Non-Aqueous Phase Liquid) (ARRUDA; JARDIM, 2007) e outra mais densa do que a
água conhecida como DNAPL (Dense Non-Aqueous Phase Liquid). O PCE, por ser mais denso
do que a água (densidade específica 1,6 kg L-1
), se enquadra entre os DNAPLs (ARRUDA;
JARDIM, 2007). Esta característica impõe preocupações ambientais quanto à qualidade da água
29
de abastecimento proveniente de aquíferos profundos, tendo-se em vista que dependendo das
condições geológicas e da eventual contaminação com PCE, os aquíferos profundos podem
apresentar fase livre do composto (KUEPER; FRIND, 1988).
Desta forma, pelas características destacadas do PCE, tais como solubilidade e densidade,
bem como a heterogeneidade geológica nas áreas contaminadas, a migração e distribuição do
DNAPL são muito variáveis e, consequentemente, o PCE em subsuperfície é difícil de ser
localizado, quantificado e remediado.
2.1.3.2 Riscos do PCE à saúde humana
O PCE, pela sua distribuição ubíqua, bem como estados físicos que é encontrado no
ambiente, é um contaminante que oferece grande risco para a saúde pública. A principal rota de
absorção do PCE por seres humanos é através das vias respiratórias, sendo o composto
rapidamente absorvido pelo sangue. Em contraste, o PCE não é absorvido pela pele. A
quantidade de PCE absorvida por inalação está relacionada à concentração deste composto no ar,
bem como com a massa corpórea, nível de atividade durante a exposição e tempo de exposição ao
PCE. Após inalação, devido à característica lipofílica do PCE (determinado a partir do
coeficiente de partição octanol/água, Kow), o mesmo é acumulado nos tecidos adiposos, sendo
também metabolizado no fígado pelo citocromo P-450, formando ácido tricloroacético e
tricloroetanol (AGGAZZOTTI; FANTUZZI; RIGHI, 1994; BOSCO; FIGA-TALAMANCA;
SALERNO, 1987; RASTKARI; YUNESIAN; AHMADKHANIHA, 2011; TOVALIN-
AHUMADA; WHITEHEAD, 2007).
Altas concentrações de PCE, principalmente em ambientes fechados e pouco ventilados,
podem causar tontura, dor de cabeça, sonolência, confusão mental, náusea, dificuldade de fala e
locomoção e em casos extremos morte. Nas indústrias, onde os trabalhadores podem ser expostos
a baixas concentrações de PCE, observaram-se alterações no sistema nervoso, embora não haja
qualquer prova da ocorrência de lesão permanente ao mesmo, não sendo também comprovados
efeitos de ordem reprodutiva a partir de ensaios realizados com ratos. Quanto ao seu potencial
como agente carcinógeno, estudos com ratos demonstraram a ocorrência de aumento de tumores
no fígado quando os animais foram expostos ao PCE. Em humanos não foram estabelecidas
relações entre exposição ao PCE e carcinogênese (ATSDR, 1996).
30
2.1.3.3 Remediação de áreas contaminadas com PCE
Os processos de transformação e degradação de organoclorados no ambiente dependem
tanto das características do solo quanto das características físico-químicas dos compostos. Em
solos argilosos, por exemplo, com alto teor de matéria orgânica, determinados contaminantes são
complexados, aumentando a persistência dos mesmos no ambiente (MOREIRA; CRUZ, 1996).
Em contrapartida, moléculas de alto peso molecular, contendo halogênios e/ou anéis aromáticos
condensados, característico de organoclorados, também tendem a persistir no ambiente
(MUSUMECI, 1992).
A contaminação de solos e águas subterrâneas por compostos químicos recalcitrantes,
desperta, desde a década de 70, o interesse pelo estudo de diferentes tecnologias para a
degradação destes contaminantes. Os conhecidos métodos não destrutivos, como por exemplo, a
adsorção sobre carvão ativado, extração por vapor, air stripping, entre outros, são tecnologias
bastante difundidas e aplicadas, pois o custo inicial de tratamento a partir destes processos é
bastante atrativo. No entanto, o fato de promoverem apenas a transferência de massa do
contaminante, despertou a necessidade de desenvolvimento de tecnologias de tratamento capazes
de degradar os compostos contaminantes a compostos não tóxicos (SATO; HARTENSTEIN;
MOTES, 2001). A grande vantagem dos processos destrutivos é a mineralização das moléculas
do contaminante, formando substâncias inócuas, como água e gás carbônico, além de íons
inorgânicos. Existem diferentes tipos de tratamentos destrutivos, entre eles, a incineração (que
utiliza a combustão como processo de degradação), a utilização de substâncias que promovam a
degradação química das moléculas (ex.: processos oxidativos avançados) e as tecnologias que
envolvem a degradação mediada por microrganismos (biorremediação) (HIRVONEN;
TUHKANEN; KALLIOKOSKI, 1996; SATO; HARTENSTEIN; MOTES, 2001).
Na degradação do PCE, os processos naturais costumam ser pouco eficientes, como é o
caso da fotólise (CHODOLA; BISWAS; BEWTRA, 1989). Em outros casos, como por exemplo,
na hidrólise química, condições específicas para degradação do PCE são necessárias, como
temperaturas elevadas e valores de pH acima de 9,0 e mesmo assim o processo é lento
(BOUWER; McCARTY, 1982). Dos processos de atenuação natural, a biodegradação é o mais
eficiente, embora estudos mostrem que o PCE seja uma molécula de difícil biotransformação
(WAKEHAM; DAVIS; KARAS, 1983).
31
Desta maneira, técnicas para aumentar a eficiência de degradação do PCE são necessárias,
sendo ainda um desafio por se tratar de um composto com alta persistência e toxicidade. De
maneira geral, preconiza-se uma alternativa que permita não somente a remoção do PCE do
ambiente, mas a sua degradação a substâncias inócuas e, preferencialmente, sua mineralização
(IMAMURA et al., 2000).
Em função dos baixos custos relativos associados ao processo de monitoramento e pelo
fato do PCE ser passível de sofrer degradação natural, a atenuação natural monitorada (ANM) é
normalmente considerada uma alternativa para remediação de áreas contaminadas com PCE. No
entanto, conforme visto anteriormente, o PCE é recalcitrante em subsuperfície, deste modo, o
emprego da ANM apresenta aspectos limitantes, como o tempo de monitoramento necessário
para atingir os níveis de prevenção e os riscos da pluma de contaminação migrar e atingir
potenciais receptores em função da persistência do PCE em subsuperfície. Além disso, pode
ocorrer a formação e acúmulo de subprodutos mais móveis e tóxicos, como o cloreto de vinila
(CV), durante o processo de ANM (SCHMIDT, 2010).
Quando a ANM não mostra-se eficiente na recuperação de áreas contaminadas com PCE,
outras metodologias podem ser aplicadas, dentre as quais podemos destacar os métodos físicos,
químicos e biológicos, podendo ser desenvolvidos ex situ ou in situ.
Os métodos físicos, pelo fato de não degradarem os contaminantes de interesse, são
considerados métodos não destrutivos. Esses métodos são caracterizados por processos de
separação de fases (sedimentação, decantação, filtração, centrifugação e flotação), transição de
fases (destilação, evaporação e cristalização), transferência de fases (adsorção, air-stripping e
extração por solventes) e separação molecular (hiperfiltração, ultrafiltração, osmose reversa e
diálise). De maneira geral, os tratamentos físicos permitem a depuração de áreas contaminadas
com PCE, entretanto, o contaminante não é degradado ou eliminado, sendo apenas transferido
entre fases diferentes (SILVA et al., 1999).
Bons resultados na eliminação de clorofenóis e PCE por adsorção em carvão ativado, de
clorodioxinas em Sephadex e de cloroetanos em surfactantes têm sido obtidos (BOVING;
WAREG; BRUSSEAU, 1999). A eficiência destes sistemas mostra-se elevada, entretanto,
problemas associados à perda de eficiência, tornam os procedimentos pouco viáveis
economicamente. Pelas características citadas, os métodos físicos têm sido pouco atrativos na
remediação de áreas contaminadas com PCE, pois além de promoverem apenas a transferência de
32
fase do contaminante, geram passivos de difícil disposição (STREAT; PATRICK; PEREZ, 1995;
TAKEHITA; AKIMOTO; NITO, 1995).
Apesar disto, a utilização dos métodos físicos em etapas de pré-tratamento ou polimento
no processo final de remediação de áreas contaminadas com PCE pode ser uma alternativa
interessante. Neste sentido, a tecnologia de filtração com membranas tem se mostrado eficiente,
principalmente no tratamento e reaproveitamento de águas residuárias de indústrias (MADAENI,
1999).
Os métodos químicos têm apresentado aplicabilidade em sistemas ambientais como
purificação de ar, desinfecção e purificação de água e efluentes industriais. Dentre as técnicas de
degradação química de contaminantes, algumas são discutíveis como é o caso da precipitação e
incineração. A precipitação, assim como os métodos físicos, promove apenas a mudança de fase
dos compostos (HOFFMANN et al., 1995), enquanto a incineração além de onerosa, pode formar
compostos mais tóxicos do que o contaminante, como por exemplo dibenzo-p-dioxinas e
dibenzofuranos policlorados formados em processos de incineração de resíduos domésticos
(ADDINK; GOVERS; OLIE, 1995; ADDINK; GOVERS; OLIE, 1998; HARNLY et al., 1995).
Dentre os métodos químicos mais eficientes na degradação do PCE têm se destacado os
Processos Oxidativos Avançados (POA), os quais baseiam-se na geração do radical hidroxila
(●OH), o qual tem alto poder oxidante e pode promover a degradação de vários compostos
orgânicos (HIRVONEN; TUHKANEN; KALLIOKOSKI, 1996; VINODGOPAL et al., 1998).
Os radicais ●OH podem reagir com os contaminantes por mecanismos distintos, dependendo da
estrutura do composto-alvo. Hidrocarbonetos alifáticos são susceptíveis a reações de abstração de
hidrogênio, produzindo radicais orgânicos que rapidamente se ligam ao oxigênio molecular e
geram radicais peróxidos que, por sua vez, iniciam reações oxidativas em cadeia, transformando
o substrato orgânico em CO2, H2O e sais inorgânicos. No caso de hidrocarbonetos halogenados
ou com alto grau de impedimento estérico, o mecanismo de reação predominante é a
transferência eletrônica (SUNDSTROM; WEIR; KLEI, 1989).
Alguns processos de produção de radicais ●OH têm sido estudados, utilizando
principalmente ozônio (O3), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o reagente de Fenton (H2O2/Fe2+
).
Estes processos vêm sendo aplicados com sucesso na descontaminação in situ de solos, na
desinfecção de águas (MESQUITA, 2004), na remediação de águas subterrâneas, no tratamento
de efluentes municipais ou efluentes contendo surfactantes (SANZ et al., 2003), água para
33
consumo humano, lixiviado de aterros e águas superficiais. Uma das vantagens dos POA é o fato
de não produzirem resíduos que necessitem de posterior disposição, como é o caso do método
físico de adsorção em carvão ativado (IMAMURA et al., 2000; CATALKAYA; BALI;
SENGÜL, 2003). Apenas o reagente de Fenton exige a retirada dos sais de ferro formados após o
processo oxidativo. Outro ponto que cabe destacar é a inespecificidade destes compostos,
comprometendo a eficiência de degradação da molécula alvo, além de possuírem ação
antimicrobiana, inibindo a biodegradação (TEIXEIRA, 2002). Apesar das limitações citadas para
os métodos químicos, os mesmos podem servir de etapa preliminar para a biorremediação,
gerando compostos mais facilmente biodegradáveis.
Desta forma, os métodos físicos, limitados pela transferência de massa para outras fases e
os métodos químicos, limitados pela não especificidade dos oxidantes e seus efeitos
antimicrobianos, podem ser ineficientes na remediação de áreas contaminadas com PCE.
Alternativamente, os métodos biológicos podem ser utilizados, produzindo compostos não
tóxicos em determinadas condições (FREEDMAN; GOSSETT, 1989).
2.1.3.4 Vias de biodegradação do PCE
Para os compostos organoclorados, as vias de biodegradação anaeróbias são consideradas
mais eficientes do que as aeróbias. A energia disponível dos organoclorados diminui com o
aumento da halogenação em condições aeróbias. Associado a isto, por serem moléculas
fortemente oxidadas, sua utilização como doadores de elétrons pelos microrganismos aeróbios é
dificultada. Contrariamente, a energia dos organoclorados aumenta em condições anaeróbias,
possibilitando sua utilização como aceptor de elétrons por microrganismos anaeróbios. Em
anaerobiose os organoclorados são mais instáveis, facilitando sua degradação. Estas
características explicam a maior susceptibilidade de PCE e TCE em serem degradados
anaerobiamente e de cDCE e CV serem degradados aerobiamente (MATTES; ALEXANDER;
COLEMAN, 2010; THOMPSON et al., 2004).
As vias anaeróbias são destacadas na degradação do PCE, sendo classificadas em
descloração redutiva direta e descloração redutiva co-metabólica, mediada por microrganismos
acetogênicos, metanogênicos e redutores de sulfato. No ambiente, processos aeróbios e
anaeróbios de degradação de diferentes compostos se complementam. Espécies altamente
34
cloradas, como é o caso do PCE, podem ser mais rapidamente degradadas anaerobiamente,
enquanto compostos menos clorados, como cis-1,2-dicloroeteno (cDCE), intermediário da via de
descloração redutiva do PCE, podem ser degradados em condições anaeróbias e de forma mais
eficiente por processos aeróbios, via oxidação direta e oxidação co-metabólica (HARTMANS et
al., 1985; HARTMANS; de BONT, 1992; VERCE; ULRICH; FREEDMAN, 2000; ELANGO;
LIGGENSTOFFER; FATHEPURE, 2006).
Diferentes bactérias já foram isoladas de ambientes contaminados com PCE, sendo
utilizadas em ensaios de degração deste composto isoladamente e em consórcios. No entanto,
muitas bactérias envolvidas na degradação do PCE não são cultiváveis e desta forma, estratégias
de enriquecimento seletivo têm sido utilizadas, estimulando grupos específicos na degradação do
PCE (DAMBORSKY, 1999).
2.1.3.4.1 Biodegradação anaeróbia
2.1.3.4.1.1 Descloração redutiva direta
A via de descloração redutiva é a principal e mais eficiente na biodegradação do PCE,
sendo caracterizada por um processo sequencial de substituição de átomos de cloro por átomos de
hidrogênio. O TCE, cDCE, CV e etileno (ETE) são frequentemente formados como
intermediários na via de descloração redutiva do PCE (Figura 1). Destes, apenas o ETE é
considerado não tóxico (NIELSEN; KEASLING, 1999; SCHOLZ-MURAMATSU et al., 1990).
A descloração redutiva pode ser realizada por vários grupos de bactérias. A maioria
possui a capacidade de degradar PCE a cDCE quando utilizados isoladamente, e somente
Dehalococcoides ethenogenes possui a capacidade de degradar PCE a ETE. Outros isolados de
Dehalococcoides sp. possuem a capacidade de degradar cDCE a CV, mas não possuem
capacidade para desclorar PCE a TCE (BRADLEY; CHAPELLE, 2003; DENNIS, 2003;
FREEDMAN; GOSSETT, 1989; MAYMÓ-GATELL et al., 1997; PARKIN, 1999).
A descloração redutiva do PCE ocorre na presença de doadores de elétrons específicos
para cada grupo de microrganismos. Dehalospirullum multivorans utiliza hidrogênio, bem como
compostos orgânicos, com exceção do acetato, como doadores de elétrons;
Dehalobacter restrictus, Desulfitobacterium sp. e Dehalococcoides ethenogenes utilizam
35
hidrogênio como doador de elétrons, enquanto Desulfuromonas chloroethenica e
Desulfomonile tiedjei utilizam tanto o acetato quanto o hidrogênio como doadores de elétrons
(BHATT et al., 2007; HOLLIGER; WOHLFARTH; DIEKERT, 1999; VLIEG; JANSSEN,
2001).
Figura 1 - Via de descloração redutiva do PCE. Adaptado de Zinder; Gossett (1995)
Dehalobacter restrictus é uma bactéria Gram-positiva pertencente à classe Clostridia, que
utiliza o hidrogênio como doador de elétrons e PCE e TCE como aceptores de elétrons. Em
ensaios de degradação do PCE por D. restrictus foi constatado o envolvimento de menaquinonas
(possivelmente envolvidas no transporte de elétrons da hidrogenase para PCE redutase) e
citocromo b (envolvido no transporte de elétrons e na geração de ATP), sendo a PCE redutase
responsável pela redução do PCE e TCE a cDCE. (HOLLIGER et al., 1993; HOLLIGER et al.,
1998; SCHUMACHER; HOLLIGER, 1996; WOHLFARTH; DIEKERT, 1997).
Dehalospirillum multivorans é uma bacteria Gram-negativa pertencente à classe
Epsilonproteobacteria. Comparada com D. restrictus, é mais versátil, pois utiliza o hidrogênio,
piruvato e formato como doadores de elétrons e PCE como aceptor de elétrons e consequente
fonte de energia, mas também utiliza outros aceptores de elétrons, como fumarato, arsenato e
selenato. Alguns destes aceptores de elétrons alternativos têm sido relatados como inibidores da
descloração redutiva do PCE em experimentos com células em suspensão (NEUMANN;
SCHOLTZMARAMATSU; DIEKERT, 1994; MILLER; WOHLFAHTH; DIEKERT, 1997). Em
ensaios de degradação do PCE por D. multivorans foi constatado o envolvimento de
menaquinonas e os citocromos b e c (componente essencial da cadeia transportadora de elétrons),
na redução do PCE a cDCE, mediada pela PCE redutase (SCHOLZ-MURAMATSU et al., 1995).
36
Desulfitobacterium é um gênero de bactérias Gram-positivas, com algumas espécies
formadoras de endósporos, pertencente à classe Clostridia. Em alguns destes organismos,
menaquinona, citocromos b e c têm sido detectados. Espécies de Desulfitobacterium descloram
redutivamente uma variedade de organoclorados (GERRITSE et al., 1996). Alternativamente,
membros deste gênero utilizam sulfito e tiossulfato, mas não sulfato, como aceptores de elétrons,
e piruvato e substâncias complexas não definidas como doadores de elétrons. (BOUCHARD et
al., 1996; UTKIN; WOESE; WIEGEL, 1994). As cepas PCE1 e PCE-S de D. dehalogenans têm
sido associadas com a degradação de clorofenóis e PCE (MILLER; WOHLFAHTH; DIEKERT,
1997). D. dehalogenans cepa PCE1 degrada o PCE a TCE, com acúmulo de pequenas
concentrações de cDCE, enquanto a cepa PCE-S degrada PCE e TCE, com acúmulo de cDCE
(GERRITSE et al., 1996, UTKIN; DALTON; WIEGEL, 1995; MACKIEWICZ; WIEGEL,
1998).
Desulfuromonas chloroethenica é uma bactéria Gram-negativa redutora de sulfato,
pertencente à classe Deltaproteobacteria, a qual utiliza piruvato e acetato como doadores de
elétrons na redução do PCE ou TCE a cDCE. No entanto, não é certo que a descloração redutiva
do PCE esteja relacionada com o metabolismo energético desta bactéria (KRUMHOLZ; SHARP;
FISHBAIN, 1996), pois não pode ser descartado o envolvimento da oxidação do acetato, em vez
da redução do PCE, esteja envolvida nesse processo. Assim, a degradação do PCE pode ocorrer
por co-metabolismo. Vários estudos têm associado a presença de citocromo c com a degradação
do PCE nestas bactérias (KRUMHOLZ et al., 1996; KRUMHOLZ, 1997; THAUER; MÖLLER-
ZINKHAN; SPORMANN, 1989).
Dehalococcoides ethenogenes é uma bactéria Gram-positiva, pertencente à classe
Chloroflexi. É anaérobia estrita, o que dificulta seu isolamento e cultivo. Foi o primeiro
organismo capaz de degradar PCE a ETE, utilizando especificamente hidrogênio como doador de
elétrons, descrito (MAYMÓ-GATELL et al., 1997). Doadores de elétrons alternativos, como
metanol e butirato não contribuíram para a degradação do PCE (DISTEFANO; GOSSETT;
ZINDER, 1991; TANDOI et al., 1994). Duas dehalogenases estão envolvidas na descloração
redutiva do PCE em D. ethenogenes, uma envolvida na redução do PCE para TCE, e outra do
TCE para ETE, via cDCE e CV (MAYMÓ-GATELL et al., 1997).
É importante salientar que cada intermediário da reação de descloração redutiva do PCE é
fonte de energia para D. ethenogenes. No entanto, a degradação de CV a ETE é um processo co-
37
metabólico, mas que mesmo não provendo benefício energético para a bactéria, é uma etapa
crítica na degradação completa do PCE.
Como podemos observar, a utilização de isolados bacterianos na descloração redutiva
direta do PCE é uma alternativa de remediação. Porém, o acúmulo de intermediários tóxicos é um
fator limitante, tendo em vista que apenas D. ethenogenes possui a capacidade de degradar o PCE
a ETE.
2.1.3.4.1.2 Descloração redutiva co-metabólica
Os grupos de microrganismos metanogênicos, acetogênicos e redutores de sulfato
caracterizam-se por degradar o PCE por co-metabolismo, resultando no acúmulo de TCE e em
alguns casos cDCE (VOGEL; CRIDDLE; MCCARTY, 1987). As reações co-metabólicas não
utilizam o PCE como fonte de energia, pois apenas uma pequena fração dos doadores de elétrons
é utilizada para reduzir este composto. No entanto, em altas concentrações de PCE e intensa
metanogênese, acetogênese e redução de sulfato, a descloração pode ser significante.
Destes grupos, as bactérias acetogênicas são consideradas as menos eficientes na
degradação do PCE, pois formam apenas TCE.
Sporomusa ovata é uma bactéria acetogênica, Gram-negativa pertencente à classe
Negativicutes, a qual em paralelo à formação de acetato, utilizando metanol como doador de
elétrons, faz a descloração do PCE, formando TCE (TERZENBACH; BLAUT, 1994).
Acetobacterium woodii, também acetogênica, é uma bactéria Gram-positiva,
pertencente à classe Clostridia que utiliza doadores de elétrons específicos para a formação de
acetato. A descloração do PCE a TCE ocorre quando frutose é utilizada como doador de elétrons
na formação de acetato (EGLI et al., 1988). Em ensaios de degradação em reator de leito fixo
inoculado com A. woodii, onde glicose foi utilizada como doador de elétrons e convertida em
acetato, TCE foi degradado a ETE, enquanto em experimento semelhante PCE não foi degradado
(WILD; WINKELBAUER; LEISINGER, 1995).
Devido ao acúmulo de TCE, o estímulo deste grupo de microrganismos na degradação
do PCE no ambiente não tem sido empregado.
38
Já o grupo das bactérias metanogênicas são mais eficientes na degradação do PCE, com
formação de TCE e cDCE. Diferentes doadores de elétrons são utilizados na formação do
metano, mas o hidrogênio tem fornecido melhores resultados.
Methanosarcina sp. é um grupo de Archaea metanogênica, pertencente à classe
Methanomicrobia, o qual produz metano a partir de acetato e metanol como doadores de elétrons
(FATHEPURE; BOYD, 1988). Co-metabolicamente, Methanosarcina sp. degrada PCE a TCE,
pela ação da enzima metil-coenzima M redutase (HOLLIGER; SCHRAA, 1994). Em
experimentos de degradação do PCE por M. mazei, com metanol como doador de elétrons,
ocorreu o acúmulo de TCE (FATHEPURE; BOYD, 1988), da mesma forma que experimentos
conduzidos com Methanobacterium thermoautotrophicum, uma Archaea da classe
Methanobacteria (EGLI et al., 1987). Já experimentos em microcosmos inoculados com
M. mazei, Methanobacterium thermoautotrophicum e Methanosarcina sp. cepa DCM,
enriquecidos com hidrogênio, ocorreu a descloração do PCE com formação de TCE e cDCE
(FREEDMAN; GOSSET, 1989).
Desta forma podemos observar que a utilização do hidrogênio como doador de elétrons é
um ponto importante na degradação do PCE por organismos metanogênicos
Dos grupos de bactérias envolvidos na descloração co-metabólica do PCE, as bactérias
redutoras de sulfato são consideradas as mais eficientes, sendo cDCE frequentemente acumulado.
Assim como os organismos metanogênicos, na presença de hidrogênio como doador de elétrons a
degradação do PCE é mais eficiente.
Desulfomonile tiedjei é uma bactéria Gram-negativa redutora de sulfato, pertencente à
classe Deltaproteobacteria. Esta bactéria contem citocromo c, é dependente de 1,4-naftoquinona
como fator de crescimento (SHELTON; TIEDJE, 1984; DeWEERD; CONCANNON; SUFLITA,
1991) e utiliza hidrogênio e formato como doadores de elétrons e 3-clorobenzoato como aceptor
de elétrons, assim como PCE, formando cDCE (DeWEERD; CONCANNON; SUFLITA, 1991;
DOLFING, 2000, MOHN; TIEDJE, 1991). Estudos comprovaram que 3-clorobenzoato e PCE
são degradados pela mesma enzima, a qual é induzida por 3-clorobenzoato (COLE;
FATHEPURE; TIEDJE, 1995; TOWNSEND; SUFLITA, 1996). A presença do PCE não induz a
atividade da enzima, indicando que a redução do PCE é uma reação co-metabólica de descloração
redutiva do 3-clorobenzoato (COLE; FATHEPURE; TIEDJE, 1995; DeWEERD et al., 1990;
FATHEPURE; BOYD, 1988; LOUIE et al., 1997).
39
Em experimentos com estímulo das bactérias redutoras de sulfato Desulfitobacterium
frappieri TCE1 e Desulfovibrio sp., desenvolvidos em colunas com sedimentos de uma área
contaminada com PCE, a adição de sulfato estimulou a degradação do PCE, formando TCE e em
menores concentrações cDCE (DRZYZGA et al., 2002).
Apesar da possibilidade de estímulo das vias co-metabólicas de descloração do PCE, o
acúmulo de TCE e cDCE problemático, pois estes compostos apresentam maior toxicidade e
mobilidade em água subterrânea do que o PCE. Outro ponto importante é que microrganismos
metanogênicos e redutores de sulfato são mais eficientes na degradação do PCE quando utilizam
hidrogênio como doador de elétrons. Da mesma forma, bactérias que realizam a descloração
redutiva direta do PCE também são hidrogenotróficas, e desta forma competem pelo hidrogênio.
Como consequência, o acúmulo de TCE, cDCE e CV pode ser relacionado com a
indisponibilidade de hidrogênio necessária para sustentar a descloração realizada por bactérias
como Dehalobacter restrictus, Desulfitobacterium sp. e Dehalococcoides ethenogenes, e que
frequentemente acumulam ETE (HOELEN; REINHARD, 2004)..
Uma alternativa é a adição de compostos orgânicos fermentáveis, os quais podem formar
hidrogênio em concentrações que permitam sustentar a degradação de TCE e cDCE a ETE, e a
atividade de bactérias metanogênicas e redutoras de sulfato (HARKNESS et al., 1999; SEWELL;
GIBSON, 1991).
Um exemplo do benefício da adição de compostos orgânicos ao meio para estimular a
degradação do PCE pôde ser observado em microcosmos contaminados com este solvente e
inoculados com Dehalococcoides ethenogenes e Desulfovibrio sp. (bactéria redutora de sulfato).
Nos microcosmos onde as duas bactérias foram inoculadas o PCE foi degradado, com acúmulo
de cDCE e CV, com uma concentração final de hidrogênio de 0,6 nmol mL-1
. Ensaios contendo
apenas D. ethenogenes o PCE foi degradado a ETE e as concentrações finais de hidrogênio foram
de 1,7 nmol mL-1
. Já em microcosmos inoculados com as duas bactérias, mas suplementado com
tolueno (composto fermentável), o PCE foi degradado formando ETE com concentração final de
hidrogênio de 1,5 nmol mL-1
(HOELEN; REINHARD, 2004). Podemos observar que a
concentração de hidrogênio é um fator limitante da degradação de PCE, e a adição de tolueno
manteve as concentrações necessárias para a degradação a ETE. Esta alternativa é importante
para manter as concentrações de hidrogênio em áreas contaminadas, uma vez que diferentes
organismos utilizam o hidrogênio como doador de elétrons.
40
2.1.3.4.1.3 Descloração redutiva por bactérias anaeróbias facultativas
A degradação do PCE por bactérias anaeróbias facultativas foi demonstrada em estudos
com Enterobacter agglomerans, e mostrou ser dependente da ausência de oxigênio e nitrato, e
altas concentrações de compostos fermentáveis, dentre os quais glicose (SHARMA; McCARTY,
1996).
Enterobacter strain MS-1 e E. agglomerans são bactérias Gram-negativas, pertencentes
ao filo Proteobacteria, sendo as únicas bactérias anaeróbias facultativas envolvidas na
descloração redutiva do PCE reportadas. Essas bactérias degradam PCE a cDCE em condições
anaeróbias. Uma variedade de doadores de elétrons, como glicose, piruvato, formato, lactato, e
acetato, podem ser utilizados na redução do PCE (SHARMA; McCARTY, 1996). Uma vantagem
da utilização destas bactérias é a maior facilidade de cultivo, não exigindo anaerobiose estrita, o
que possibilita a multiplicação do inóculo em laboratório, E utilização em técnicas de
bioaumento.
2.1.3.4.2. Biodegradação aeróbia
Alternativamente à descloração redutiva, vias oxidativas de degradação do TCE, cDCE e
CV podem ser estimuladas a partir da oxidação direta e oxidação co-metabólica destes
compostos, formando cDCE ou ETE (BRADLEY; CHAPELLE, 1998; BRADLEY;
CHAPELLE, 1996; BRADLEY E CHAPELLE, 2000; BRADLEY; RICHMOND; CHAPELLE,
2005; COLEMAN et al., 2002).
2.1.3.4.2.1 Biodegradação oxidativa direta
Um amplo grupo de etenos clorados, dentre os quais cDCE e CV, podem ser degradados
por oxidação direta, formando CO2 em microcosmos aeróbios com Mycobacterium sp.
(HARTMANS; de BONT, 1992), Rhodococcus sp. (MALACHOWSKY et al., 1994) e
Nitrosomonas sp. (VANELLI et al., 1990). Esta via metabólica não foi relacionada com a
degradação do PCE e TCE, mas poderia ser utilizada como etapa posterior à descloração redutiva
do PCE e TCE, mineralizando cDCE e CV a CO2.
41
2.1.3.4.2.2 Biodegradação oxidativa co-metabólica
Bactérias metanotróficas contendo monoxigenases e dioxigenases podem degradar TCE,
cDCE e CV por co-metabolismo, a partir da oxidação de tolueno, fenol, metano e propano
(ENSLEY, 1991; VOGEL; CRIDDLE; McCARTY, 1987). Na degradação do PCE, a ação das
oxigenases pode formar epóxidos de cloro, os quais podem se decompor espontaneamente,
formando produtos livres de cloro, ou mesmo mineralizados por uma ampla gama de
microrganismos. No entanto, degradação expressiva do PCE por essa via metabólica ainda não
foi detectada (CHAUHAN; BARBIERI; WOOD, 1998; FOGEL; TADDEO; FOGEL, 1986;
FOLSOM; CHAPMAN; PRITCHARD, 1990; TSIEN et al., 1989).
2.1.3.4.3 Consórcios bacterianos na degradação de cloroetenos
A dinâmica de degradação do PCE no ambiente pode envolver diferentes mecanismos,
como por exemplo, a geração de metano em zonas saturadas, degradando o PCE co-
metabolicamente, e gerando principalmente TCE. O metano gerado pode prover carbono e
energia para a oxidação metanotrófica do TCE a cDCE e CV em subsequentes zonas aeróbias.
Por esta característica, tem sido proposta a utilização de reatores em dois estágios. Em um
primeiro reator anaeróbio, haveria degradação de PCE por co-metabolismo e em um segundo
reator aeróbio haveria estímulo de bactérias metanotróficas para a degradação do TCE a ETE.
Resultados promissores têm sido obtidos, com eficiência de degradação do PCE de 92 % após
120 horas, com acúmulo de ETE (MAYMÓ-GATELL et al., 1995; SUNG-IN; YOUN-KYOO;
BYUNG-CHAN, 2003).
Seguindo esta mesma linha de raciocínio, compostos clorados podem ser redutivamente
desclorados em consórcios sintróficos. Experimentos foram conduzidos com um consórcio de
Desulfovibrio desulfuricans, a qual produz hidrogênio pela oxidação de etanol para acetato em
concentrações de sulfato inferiores a 5 mM, Dehalospirillum multivorans, uma bactéria que
utiliza hidrogênio e PCE, e Methanobacterium formicicum, a qual também utiliza hidrogênio
como doador de elétrons. Nestas condições, D. multivorans competiu com
M. formicicum pelo hidrogênio presente (SMATLAK; GOSSETT; ZINDER, 1996). Estudos
anteriores com culturas mistas (BALLAPRAGADA et al., 1997) demonstraram que algumas
42
bactérias que descloram o PCE tem maior afinidade pelo hidrogênio presente do que
metanotróficas. Outro consórcio composto por Desulfomonile tiedjei, bactéria BZ-2 que utiliza
benzoato e uma espécie de Methanospirillum, foi utilizado para converter 3-clorobenzoato para
acetato e metano (MOHN; TIEDJE, 1992). Neste consórcio, D. tiedjei produz benzoato a partir
do 3-chlorobenzoato e hidrogênio. O benzoato foi convertido para acetato, hidrogênio e CO2 pela
bactéria sintrófica BZ-2. Methanospirillum também utiliza o hidrogênio formado pela oxidação
do benzoato e fornece vitaminas para D. tiedjei. Neste consórcio, nenhuma das bactérias
consumiu o hidrogênio necessário para atividade da outra.
Com base nas vias de degradação do PCE demonstradas (Figura 2), podemos observar
que as vias anaeróbias são as mais eficientes na degradação do PCE e TCE. No entanto, a
degradação de cDCE e CV em condições aeróbias é mais eficiente. No entanto, a escolha da via é
condicionada pelos organismos presentes no local e pelas condições do meio, pois a competição
entre os microrganismos e os parâmetros físico-químicos são determinantes para a remediação de
áreas contaminadas com PCE.
Figura 2 - Vias de degradação do PCE no ambiente. Adaptado de Lee; Odom; Buchanan (1998)
43
Apesar dos avanços tecnológicos na área, técnicas de biorremediação de águas
subterrâneas contaminadas com PCE apresentam limitações. A biorremediação ex situ, que
envolve a remoção do solo contaminado ou a extração da água subterrânea por bombeamento,
para que o tratamento biológico seja realizado em local adequado, pode ser menos recomendável
do que o uso da tecnologia in situ, onde não existe a necessidade de expor o contaminante a
outros ambientes. Entretanto, a biorremediação in situ de águas subterrâneas é dificultada pelo
fato do ambiente ser extremamente dinâmico, onde alterações das condições físico-químicas
ocorrem constantemente, devido à complexidade e heterogeneidade química e física do solo
saturado e não saturado, dificultando o controle do metabolismo de populações microbianas de
interesse (ALLEN-KING et al., 2006; BLACK, 2002). Um método que permite o controle de
condições limitantes na degradação do PCE, bem como o estímulo de grupos de microrganismos
de interesse é a biorremediação utilizando de reatores biológicos on site.
Desta forma, a hipótese deste trabalho é de que áreas contaminadas com PCE selecionam
microrganismos com potencial de degradação deste contaminante, e que consórcios microbianos
selecionados e imobilizados em reatores podem aumentar a eficiência da degradação do PCE.
2.2 Material e Métodos
2.2.1 Área de estudo e amostragem
Amostras de sedimento foram coletadas do fundo de dois poços de monitoramento de
água subterrânea (PM1 e PM2) de uma área com histórico de contaminação com PCE localizada
entre as coordenadas 46º35'14,649''N e 23º36'8,192''S, no município de São Paulo, SP (Figura 3),
com o auxílio de uma bomba peristáltica. Os PMs possuem uma profundidade de
aproximadamente 4 metros, com lençol freático a aproximadamente 1,5 metro da superfície do
solo. O material sedimentado foi removido e acondicionado a -80 ºC até a extração do DNA
metagenômico.
Para análise de compostos orgânicos voláteis (COVs) e determinação dos parâmetros
físico-químicos (PFQs), após a purga de três volumes dos PMs e consequente recuperação da
carga hidráulica dos mesmos, a água foi coletada com bomba peristáltica a 50 mL min-1
e
44
acondicionada em frascos com septo para análise de COVs e em frascos de vidro com tampa
rosqueável para análise dos PFQs. As amostras foram mantidas a 4 ºC até o processamento.
A análise de PCE, TCE, cDCE e CV foi feita pela empresa BIOAGRI (Piracicaba, SP),
por cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa (CG/ES) (Agilent7000A, Santa
Clara, CA, USA), de acordo com o método USEPA SW 846-8260B
(http://www.epa.gov/waste/hazard/testmethods/ sw846/online/8_series.htm).
Foram avaliados também in situ: oxigênio dissolvido (OD), potencial redox (Eh),
condutividade elétrica (CE) e potencial hidrogeniônico (pH). O OD foi mensurado utilizando-se
um medidor de oxigênio portátil (Ysi 55, Ohio, USA). O Eh foi medido utilizando-se um eletrodo
de platina (Hanna HI 98201, Padova, Itália), previamente calibrado com solução redox padrão.
Os valores obtidos de Eh foram corrigidos pela adição de um potencial de referência (244 mV). A
CE foi mensurada utilizando-se um condutivímetro (Digimed DM-32 meter, Belo Horizonte,
Brasil) e o pH foi determinado utilizando-se um pHmetro (Digimed DM-22 meter, Belo
Horizonte, Brasil).
45
Figura 3 - Mapas ilustrando a localização geográfica e imagem aérea da área de estudo. As linhas brancas representam a superfície potenciométrica e a seta o sentido de fluxo da água subterrânea
46
2.2.2 Imobilização do sedimento em suporte de poliuretano e acondicionamento em RHLFs
Visando selecionar microrganismos com potencial para degradar o PCE, foram coletadas
amostras de sedimento do fundo do PM1 e PM2 com o auxílio de uma bomba peristáltica,
homogeneizados e imobilizados em cubos de espuma de poliuretano de 1 cm de aresta (densidade
de 20 kg m-3
).
Os suportes com os sedimentos foram mantidos em frascos, previamente esterilizados, por
16 horas (Figura 4A), sendo em seguida acondicionados em RHLFs para realização do cultivo de
enriquecimento (Figura 4B). O RHLF com o sedimento do PM1 e PM2 foram designados
inóculo 1 (In1) e inóculo 2 (In2), respectivamente.
Figura 4 - Coleta do sedimento e acondicionamento em RHLF. A - Coleta de sedimento e imobilização em material
suporte; B - Acondicionamento do material imobilizado em RHLF
2.2.3 Cultivo de enriquecimento em RHLFs
O modelo de RHLF utilizado possui capacidade total de 1995 mL, sendo 700 mL de
volume útil. Foi confeccionado em acrílico, com 100 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro, e
possui portas superiores para a amostragem do material suporte, e portas laterais para a coleta de
amostras de água. Para o cultivo de enriquecimento, os RHLFs contendo as comunidades
microbianas do PM1 e PM2 foram mantidos em meio mínimo (MM) suplementado com PCE
(MM+PCE) (nitrato de potássio, 0,3 mg L-1
; fosfato de potássio, 0,15 mg L-1
; sulfito de sódio,
5 mg L-1; lactato de sódio, 2,5 mM L
-1; e PCE, 5 mg L-1
) (MAYMÓ-GATELL et al., 1997) com
circulação fechada e contínua. Para promover a circulação do meio foi utilizada uma bomba
peristáltica com vazão de 5 mL min-1
(Figura 5). O cultivo de enriquecimento foi realizado
47
durante nove meses, com substituição do MM+PCE a cada sete dias, visando manter constante a
concentração de PCE nos reatores. O período de nove meses foi utilizado por ser o tempo
necessário para a estabilização da estrutura da comunidade bacteriana nesse tipo de reator
(ARMAS, 2007).
Figura 5 - Montagem do RHLF com sistema de circulação contínua e fechada de solução
2.2.4 Estrutura da comunidade e diversidade bacteriana nos RHLFs
Como forma de avaliar as alterações nas estruturas das comunidades de bactérias nos
RHLFs, após nove meses de enriquecimento, espumas contendo os biofilmes imobilizados foram
coletadas ao longo do comprimento dos reatores (amostra composta) e acondicionadas em
béqueres autoclavados (50 mL) contendo solução tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) e
submetidas à sonicação por 5 minutos a 12 kHz em um disruptor de células ultrassônico (Misonix
Microson XL2000, Cole-Parmer Instrument Company, Illinois, USA), para liberação dos
microrganismos do material suporte. As soluções tampão contendo as suspensões de células
resultantes foram centrifugadas a 2.254 g por 10 minutos a 4 oC. Os péletes foram ressuspendidos
em 1,0 mL de solução tampão e as amostras foram armazenadas a -80 C para posterior extração
do DNA metagenômico. A estrutura da comunidade e a diversidade bacteriana nos RHLFs com
In1 e In2 foram comparadas com as das amostras de sedimento do PM1 e PM2, para detectar a
possível seleção de bactérias específicas após o cultivo de enriquecimento.
48
2.2.4.1 Extração do DNA metagenômico
O DNA metagenômico foi extraído utilizando-se o “Fast DNA kit” (MP Biomedicals,
Irvine, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do DNA foi
determinada por eletroforese em gel de agarose 0,5X TBE-0,8 %, depois de corado com “Sybr
Green” (Life Technologies, São Paulo, Brasil). A concentração do DNA foi determinada por
fluorimetria utilizando um fluorômetro Qubit (Life Technologies, São Paulo, Brasil).
2.2.4.2 Eletroforese em gel com gradiente desnaturante
As análises das estruturas das comunidades de bactérias, nos sedimentos dos PMs e nos
reatores, foram feitas por PCR-DGGE. A região V3 do gene rRNA 16S de Bacteria foi
amplificada por PCR utilizando-se o DNA metagenômico extraído e os iniciadores BA338fGC
(5’ GCC CGC CGC GCG CGG CGG GCG GGG CGG GGG CAC GGA CTC CTA CGG GAG
GCA GCA G 3’) e UN518r (5’ ATT ACC GCG GCT GCT GG 3’) (ØVREÅS et al., 1997). A
amplificação foi feita em solução tampão para Taq DNA polimerase contendo 0,2 mM de dNTPs,
3 mM de MgCl2, 1 U de Taq DNA polimerase (Life Technologies, São Paulo, Brasil), 5 pmol dos
primers e 10 ng do DNA metagenômico. As condições de amplificação da PCR foram 5 min a
95 ºC; 30 ciclos de 1 min a 95 ºC, 1 min a 55 ºC e 1 min a 72 ºC e extensão final por 10 min a
72 ºC. A concentração dos produtos da PCR (amplicons) foi determinada por fluorimetria.
Quantidades iguais de amplicons (300 ng) foram analisadas através de eletroforese em gel
com 8 % (m/v) de acrilamida:bisacrilamida (37,5:1, m:m), contendo um gradiente de 15 a 55 %
de formamida e uréia (ØVREÅS et al., 1997). A eletroforese foi realizada a 200 V e 60 ºC
constantes, utilizando-se um sistema “DCode” (BioRad, Hercules, CA, USA), e tampão 1X TAE
buffer. O DNA foi corado com “Sybr Green” (Life Technologies, São Paulo, Brasil) e a aquisição
das imagens dos géis foi feita por densitometria usando um densitômetro a laser Storm 845 (GE
Healthcare, Waukesha, WI, USA). Os perfis de amplicons foram analisados com o programa
“Diversity Database” (BioRad, Hercules, CA, USA).
49
2.2.4.2.1 Análise dos perfis de amplicons após DGGE
Os perfis de amplicons, após PCR-DGGE, foram comparados em um espaço de
ordenação em escala multidimensional (MDS), através do programa PRIMER 5 (PRIMER-E
Ltda, 2001), utilizando-se o coeficiente de similaridade de Bray Curtis para avaliar a distância
entre as amostras, comparando as distâncias com as respectivas (di)similaridades. A relação entre
estas duas medidas foi avaliada por regressão linear, sendo a confiabilidade da regressão
representada pelo stress. Para discriminar os grupos, foram testadas as diferenças entre o valor
médio de similaridade entre as amostras (rank) dentro dos grupos e entre os grupos, a partir da
análise de similaridade (ANOSIM), a qual calcula um valor R com base na comparação dos
grupos, sendo o R recalculado com base em permutações, permitindo determinar diferenças
estatísticas entre os perfis de bandas detectados nos géis.
2.2.4.3 Detecção de Dehalococcoides por PCR
Primeiramente o gene rRNA 16S de Bacteria foi amplificado por PCR utilizando-se o
DNA metagenômico extraído e os iniciadores BAC8f (5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
3’) e BAC1541r (5’ AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’) (DUHAMEL et al., 2002). A
amplificação do gene rRNA 16S foi feita em solução tampão para Taq DNA polimerase contendo
0,2 mM de dNTPs, 3 mM de MgCl2, 1 U de Taq Platinum DNA polimerase (Life Technologies,
São Paulo, Brasil), 5 pmol dos iniciadores e 10 ng do DNA metagenômico. As condições de
amplificação da PCR foram 3 min a 94 ºC; 30 ciclos de 45 seg a 94 ºC, 30 seg a 55 ºC e 90 seg a
72 ºC; e extensão final por 7 min a 72 ºC. A concentração dos produtos da PCR (amplicons) foi
determinada por densitometria, após eletroforese em gel de agarose 0,5X TBE-0,8 % e coloração
com “Sybr Green” (Life Technologies, São Paulo, Brasil), utilizando-se “Low DNA Mass
Ladder” (Life Technologies, São Paulo, Brasil) como padrão. A aquisição das imagens dos géis
foi feita por densitometria usando um densitômetro a laser Storm 845 (GE Healthcare, Waukesha,
WI, USA).
A partir do produto da primeira amplificação, foi feito nested-PCR utilizando-se
iniciadores específicos para Dehalococcoides DHA728f (5’ AAG GCG GTT TTC TAG GTT
GTC AC 3’) e DHA1115r (5’ AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’) (DUHAMEL et al.,
50
2002). A amplificação foi feita em solução tampão para Taq DNA polimerase contendo 0,2 mM
de dNTPs, 3 mM de MgCl2, 1 U de Taq Platinum DNA polimerase (Life Technologies, São
Paulo, Brasil), 5 pmol dos primers e 10 ng do produto da primeira PCR. As condições de
amplificação da PCR foram 3 min a 94 ºC; 30 ciclos de 45 seg a 94 ºC, 30 seg a 58 ºC e 1,5 min a
72 ºC; e extensão final por 7 min a 72 ºC. Após eletroforese em gel de agarose 0,5X TBE-0,8% e
coloração com “Sybr Green” (GE Healthcare, São Paulo, Brasil), utilizando-se “Low DNA Mass
Ladder” (Life Technologies, São Paulo, Brasil) como padrão, foi feita a aquisição das imagens
dos géis por densitometria usando um densitômetro a laser Storm 845 (GE Healthcare,
Waukesha, WI, USA).
2.2.4.4 Clonagem e sequenciamento de clones do gene rRNA 16S
Para avaliar a diversidade de bactérias nos reatores, quando comparadas com os PMs,
foram sintetizadas bibliotecas de clones do gene rRNA 16S. A região V1-V3 do gene rRNA 16S
de Bacteria foi amplificada por PCR utilizando-se o DNA metagenômico extraído e os
iniciadores PRBA63f (5’ GGA TCC CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC 3’) e UN518r (5’
ATT ACC GCG GCT GCT GG 3’) (LAMBAIS et al., 2006). A amplificação foi feita em solução
tampão para Taq DNA polimerase, contendo 0,2 mM de dNTPs, 3 mM de MgCl2, 1 U de Taq
DNA polimerase (Life Technologies, São Paulo, Brasil), 5 pmol dos primers e 10 ng do DNA
metagenômico. As condições de amplificação foram de 5 min a 95 ºC; 30 ciclos de 1 min a 95 ºC,
1 min a 55 ºC e 1 min a 72 ºC e extensão final a 72 ºC por 10 min.
Os amplicons foram purificados utilizando-se o kit Invisorb Fragment CleanUp (Invitek,
Berlin, Alemanha) e ligados em “pGEM-T Easy Vector” (Promega, Madison, WI, USA) a 4 oC
durante a noite, de acordo com as instruções do fabricante. O produto de ligação foi transformado
em células competentes de Escherichia coli DH5α por choque térmico, e as células transformadas
foram plaqueadas em ágar LB, contendo ampicilina (100 mg mL-1
) e X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-
indolil- α -D-galactosídeo). Colônias contendo o plasmídeo recombinante foram selecionadas e
cultivadas em meio líquido LB contendo 100 mg mL-1
de ampicilina a 37 oC durante a noite. Os
plasmídeos foram extraídos através de lise alcalina. As soluções de ácidos nucleicos foram
incubadas com 15 µg de RNase por 20 min a 37 oC. O DNA foi precipitado com equivalente
volume de isopropanol gelado, por 5 min a 4 °C e centrifugado a 2.254 g por 40 min a 4 oC. O
51
pélete de DNA foi lavado com etanol gelado 70 %, seco e solubilizado em água destilada
esterilizada. A concentração de DNA foi determinada espectrofotometricamente a 260 nm. O
sequenciamento foi executado utilizando-se 200-500 ng do DNA plasmidial, 10 pmol do
iniciador M13f (5’ GTA AAA CGA CGG CCA G 3’) (LAMBAIS et al., 2006), 2 µL de
“DYEnamic ET Terminator” (GE Healthcare, São Paulo, Brasil), 2 µL de tampão de
sequenciamento (200 mM de Tris-HCl pH 9,0 e 5 mM de MgCl2.6H2O) e H2O ultrapura para um
volume final de 10 µL, em 25 ciclos de 20 seg a 95 oC, 15 seg a 50
oC e 1 min a 60
oC. Os
produtos da PCR foram precipitados com etanol, lavados e solubilizados em formamida
deionizada. A eletroforese foi feita utilizando-se um sequenciador automático ABI 3100, de
acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies, São Paulo, Brasil).
2.2.4.4.1 Análise das sequências do gene rRNA 16S
As sequências foram processadas com o programa PHRED (EWING; GREEN, 1998)
para a remoção de bases com baixa qualidade (parâmetro de qualidade >20) e sequências do
vetor. Para a afiliação filogenética das sequências do gene rRNA 16S utilizou-se o programa
SeqMatch (COLE et al., 2007), o qual compara as sequências obtidas com as sequências do
banco de dados do Ribosomal Database Project II (release 10, update 27, Aug 09, 2011). Baseado
na distância evolutiva entre as sequências obtidas e aquelas de maior similaridade no banco de
dados, foram definidas possíveis classificações em diferentes níveis taxonômicos.
Para o agrupamento em unidades taxonômicas operacionais (UTOs) foi utilizado o
programa DOTUR (SCHLOSS; HANDELSMAN, 2005). Para tanto, uma matriz de distância
evolutiva foi calculada com o DNADIST (algoritmo de Jukes-Cantor) do programa PHYLIP 3.63
(FELSENSTEIN, 2006), a partir do alinhamento feito no Clustal X 2.0 (LARKIN et al., 2007),
com definições de parâmetros padrão, exceto “gap-opening penalty” (10,0) e “gap-extension
penalty” (0,1).
Os números de UTOs e de sequências de cada UTO foram computados e utilizados no
programa SPADE 3.1 (Species Prediction and Diversity Estimation) para o cálculo dos índices de
diversidade de Shannon e a recíproca do índice de Simpson, bem como para a estimativa de
riqueza de UTOs pelos métodos não paramétricos ACE e Chao1 (CHAO; CHEN, 2006), além da
estimativa da cobertura de amostragem. As comparações entre as bibliotecas de clones do gene
52
rRNA 16S foram feitas utilizando-se o programa ʃ-LIBSHUFF (SCHLOSS; LARGET;
HANDELSMAN, 2004) após o alinhamento das sequências e o cálculo das matrizes de
distâncias evolutivas conforme descrito acima.
2.2.5 Ensaio de degradação do PCE em RHLF
Para avaliar a eficiência de degradação do PCE nos RHLFs com In1 e In2, após nove
meses de cultivo de enriquecimento, iniciou-se a circulação do meio nos reatores em sistema
aberto (não ocorrendo a reintrodução do meio nos RHLFs), a uma vazão de 1 mL min-1,
mantendo um volume de meio de 700 mL no interior dos reatores (tempo de retenção de 700
minutos). O reator foi alimentado continuamente com o MM+PCE e o efluente coletado em
frascos erlenmeyer. Para equalizar a pressão nos reatores, balões foram conectados aos frascos
coletores e balões com N2 nos frascos alimentadores. As amostras de meio foram coletadas
24 horas após o início do experimento, com uma circulação de 1440 mL de meio pelos reatores
neste período. Como controle, foram instalados dois reatores, nas mesmas condições citadas
acima, um com circulação de meio, mas sem suporte (espuma e poliuretano) e sem inóculo -
controle 1 (C1) e outro reator com suporte mas sem inóculo - controle 2 (C2).
A coleta das amostras foi realizada na entrada (L/D = 0) e saída dos reatores (L/D = 20),
sendo as amostras acondicionadas em frascos com septo para análise de COVs e em frascos de
vidro com tampa rosqueável para determinação dos PFQs. A razão L/D refere-se ao comprimento
(L) e diâmetro (D) dos reatores.
As amostras para análise de PCE e PFQs foram mantidas a 4 ºC até o processamento. As
análises de PCE e a determinação dos PFQs foram feitas conforme descrito no item 2.2.1.
2.2.6 Varredura de COVs dos RHLFs
Uma vez caracterizada a eficiência de degradação do PCE nos reatores analisados,
iniciou-se a varredura de outros COVs formados no In1 e In2, com o intuito de caracterizar a via
de degradação do PCE. Para tanto, os RHLFs foram mantidos em sistema com circulação fechada
com MM+PCE, visando concentrar os compostos formados durante a degradação do PCE, pois
53
com o sistema aberto os compostos podem ser rapidamente transformados e não ser detectados
por cromatografia.
As amostras foram coletadas em três portas ao longo do comprimento dos reatores, com
relação comprimento/diâmetro (L/D) de 2, 10 e 18, respectivamente, e dispostas em frascos com
septo para análise de COVs. Os meios foram substituídos a cada 48 horas. Foram feitas cinco
coletas nas portas dos reatores, sendo as mesmas realizadas 12, 24 e 36 horas após a substituição
dos meios.
A varredura de COVs foi feita no Instituto de Química da UNICAMP, por CG/ES, de
acordo com o método USEPA SW 846-8260B.
2.2.7 Isolamento e identificação de bactérias dos RHLFs
Durante o cultivo de enriquecimento do In1 e In2 nos RHLFs, bactérias cultiváveis foram
isoladas por plaqueamento em meios de cultura específicos, genotipadas por BOX-PCR e
identificadas por sequenciamento do gene rRNA 16S.
2.2.7.1 Coleta das amostras e plaqueamento
Amostras dos biofilmes imobilizados foram coletadas dos RHLFs e acondicionadas em
béqueres autoclavados (50 mL) contendo solução tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) e
sonicadas por 5 minutos a 12 kHz em um disruptor de células ultrassônico (Misonix Microson
XL2000, Cole-Parmer Instrument Company, Illinois, USA), para liberação dos microrganismos
aderidos ao material suporte. As soluções tampão contendo as suspensões de células foram
centrifugadas a 2.254 g por 10 minutos a 4 °C. Posteriormente, os péletes foram ressuspendidos
em 1,0 mL de solução tampão. Alíquotas de 500 μL das suspensões foram incubadas em meio
agarizado em duplicata, sendo incubadas em aerobiose e anaerobiose (jarra de anaerobiose,
PROBAC do Brasil, São Paulo, Brasil) a 28 ºC por 48 horas, para o cultivo aeróbio e 28 ºC por
14 dias para o cultivo anaeróbio.
Neste processo, dois meios de cultura foram utilizados: ágar nutriente (triptona, 10 g L-1
;
extrato de levedura, 5 g L-1
; NaCl, 10 g L-1
; ágar, 15 g L-1
) e ágar mínimo suplementado com
54
PCE (nitrato de potássio, 0,3 mg L-1
; fosfato de potássio, 0,15 mg L-1
; sulfito de sódio, 5 mg L-1
;
lactato de sódio, 2,5 mM L-1
; PCE, 5 mg L-1
; ágar, 15 g L-1
).
Colônias que cresceram em ágar nutriente foram repicadas para ágar mínimo
suplementado com PCE para confirmação de crescimento no meio contendo PCE como fonte
carbono. As colônias que cresceram foram repicadas para tubos de 1,5 mL contendo ágar
nutriente e incubadas a 28 ºC por 48 horas para o cultivo aeróbio e 28 ºC por 14 dias para o
cultivo anaeróbio. Posteriormente foram adicionados 500 μL de glicerol 50 % aos tubos e estes
foram armazenados a -20 ºC.
2.2.7.2 Teste de crescimento em meio com PCE
Como o ágar mínimo contém lactato de sódio na sua composição (fonte de carbono),
foram feitos testes de crescimento das bactérias isoladas no mesmo meio, no entanto sem lactato
de sódio na sua composição, o que comprova a utilização apenas do PCE como fonte de carbono.
As condições de incubação foram às mesmas descritas no item 2.2.6.1.
2.2.7.3 Identificação das bactérias isoladas dos RHLFs
2.2.7.3.1 Extração do DNA
O DNA dos isolados foi extraído utilizando-se a técnica de lise térmica (HAGEN et al.,
2002). Uma colônia, crescida em caldo nutriente, foi transferida para tubos de 0,2 mL contendo
100 μL de H2O ultrapura e aquecida a 100 °C por 5 min. Em seguida foi feita uma centrifugação
a 13.000 g durante 3 min. O sobrenadante, contendo o DNA genômico, foi utilizado nas reações
subsequentes.
2.2.7.3.2 BOX-PCR
Para diferenciação dos isolados foi empregada à técnica de BOX-PCR, utilizando-se o
iniciador BOX A1R (5′ CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G 3′) (VERSALOVIC et al.,
1994).
55
A reação de amplificação foi realizada utilizando-se 1 μL do DNA extraído, 50 pmol do
primer BOX A1R, 2,5 μL de dNTPs 2 mM, 2,5 μL de DMSO 100 %, 4,0 μL de BSA
(1 mg mL-1
), 0,5 μL (1 U) de Taq DNA polimerase (Fermentas, São Paulo, Brasil) e 5 μL de 5X
Gitschier Buffer (83 mM de (NH4)2SO4; 335 mM de Tris-HCl pH 8,8; 33,5 mM de MgCl2;
33,5 µM de EDTA; 150 mM de ß-mercaptoetanol) e H2O ultrapura para um volume final de
25 μL. As condições de amplificação foram: 2 min a 95 ºC; 30 ciclos de 3 seg a 94 ºC, 30 seg a
92 ºC e 1 min a 50 ºC; e extensão final por 8 min a 65 ºC (VERSALOVIC et al., 1994).
Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5 % em
tampão 1X TAE (50 mM de Tris-HCl pH 8,8; 50 mM de ácido acético glacial; 25 mM de
EDTA), a 55 V por 3 horas. A aquisição das imagens foi feita por densitometria utilizando-se um
densitômetro a laser Storm 845 (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA). Os perfis de amplicons
foram analisados com o programa “Diversity Database” (BioRad, Hercules, CA, USA) e Systat
11.0, usando agrupamento hierárquico com base em dados binários (presença ou ausência de
bandas), pelo método de concordância simples (“simple matching”), com algoritmo de Ward e
distância euclidiana como unidade de medida.
2.2.7.3.3 Sequenciamento do gene rRNA 16S
Após a seleção dos isolados com perfis de BOX-PCR diferentes, o gene rRNA 16S foi
amplificado por PCR utilizando-se os iniciadores BAC8f (5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC
AG 3’) e BAC1541r (5’ AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’) (DUHAMEL et al., 2002). A
amplificação foi feita em solução tampão para Taq DNA polimerase, contendo 0,2 mM de
dNTPs, 3 mM de MgCl2, 1 U de Taq DNA polimerase (Life Technologies, São Paulo, Brasil),
5 pmol dos primers e 10 ng de DNA.
As condições de amplificação foram: 3 min a 94 ºC; 30 ciclos de 45 seg a 94 ºC, 30 seg a
55 ºC e 90 seg a 72 ºC; e extensão final por 7 min a 72 ºC. Os amplicons foram purificados
usando o kit Invisorb Fragment CleanUp (Invitek, Berlim, Alemanha), de acordo com as
instruções do fabricante.
O sequenciamento foi executado utilizando-se 200-500 ng dos amplicons purificados,
10 pmol dos iniciadores BAC8f, 341f (5’CCT ACG GGA GGC AGC AG 3’), 341r (5’CTG CTG
CCT CCC GTA GG 3’), 704f (5’ GTA GSG GTG AAA TSC GTA GA 3’), 704r (5’ TCT ACG
56
SAT TTC ACC SCT AC 3’), 1114f (5’ GCA ACG AGC GCA ACC C 3’), 1114r (5’ GGG TTG
CGC TCG TTG C 3’) e BAC1541r (BIANCIOTTO et al., 1996; DUHAMEL et al., 2002), 2 μL
de “DYEmanic ET Terminator” (GE Healthcare, São Paulo, Brasil), 2 μL de tampão de
sequenciamento (200 mM de Tris-HCl pH 9,0 e 5 mM de MgCl2.6H2O) e H2O ultrapura para um
volume final de 10 μL, em 25 ciclos de 20 seg a 95 ºC, 15 seg a 50 ºC e 1 min a 60 ºC. Os
produtos da PCR foram precipitados com etanol, lavados e solubilizados em formamida
deionizada. A eletroforese foi feita utilizando-se um sequenciador automático ABI 3100, de
acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies, São Paulo, Brasil).
2.2.7.3.3.1 Análise das sequências
As sequências foram processadas com o programa PHRED (EWING; GREEN, 1998)
para a remoção de bases com baixa qualidade (parâmetro de qualidade >20). Os contigs foram
obtidos a partir do programa CAP3 (HUANG; MADAN, 1999). Para a afiliação filogenética das
sequências do gene rRNA 16S utilizou-se o programa SeqMatch (COLE et al., 2007), o qual
compara as sequências obtidas com as sequências do banco de dados do Ribosomal Database
Project II (release 10, update 26, Mar 28, 2011). Baseado na distância evolutiva entre as
sequências que foram classificadas e aquelas de maior similaridade no banco de dados, foram
definidas possíveis classificações em diferentes níveis taxonômicos.
A árvore filogenética foi construída baseado na matriz evolucionária gerada por “Kimura
two-parameter” e “neighbor-joining”, com 1000 “bootstraps”, utilizando-se o programa MEGA
4 (TAMURA et al., 2007).
2.2.7.3.4 Marcadores moleculares
Para monitorar os isolados nos ensaios de degradação do PCE em RHLF (isolados do In1
- IIn1 e isolados do In2 - IIn2), foram confeccionados marcadores moleculares específicos para
cada grupo de isolados. Os marcadores foram obtidos a partir de PCR-DGGE (de acordo com
item 2.2.4.2) e a análise dos amplicons foi feita por agrupamento hierárquico utilizando-se o
programa Systat 11.0, com base em dados binários (presença ou ausência de bandas), pelo
57
método de concordância simples (“simple matching”), com algoritmo de Ward e distância
euclidiana como unidade de medida.
As bandas referentes a cada isolado foram excisadas e acondicionadas em tubos de
1,5 mL, onde foram lavadas por inversão em água Milli-Q (400 µL de água para cada lavagem -
2 lavagens). O DNA foi eluído por 10 min a 60 °C em 500 µL de solução tampão de eluição (Tris
10 mM; KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM pH 8,3; Triton X-100 0,1 %), e submetido a PCR-DGGE
(de acordo com o item 2.2.4.2) para confirmação da presença dos isolados selecionados nos
marcadores.
2.2.8 Ensaio de degradação do PCE com os isolados selecionados dos RHLFs
2.2.8.1 Imobilização e cultivo de enriquecimento dos isolados
A partir da caracterização dos isolados, os mesmos foram cultivados em caldo nutriente
(triptona, 10 g L-1
; extrato de levedura, 5 g L-1
; NaCl, 10 g L-1
) a 28 ºC por 24 horas, com rotação
de 150 rpm, para obtenção de massa bacteriana. O crescimento foi monitorado até cada isolado
atingir uma densidade ótica = 0,6 (λ = 600 nm). Os IIn1 e IIn2 foram homogeneizados em frascos
contendo espumas de poliuretano de 1 cm de aresta e imobilizados por 16 horas, sendo em
seguida acondicionados nos RHLFs. Os isolados foram mantidos nos RHLFs com MM+PCE
(sem lactato), em sistema fechado, durante um mês para adaptação dos consórcios nos reatores.
2.2.8.2 Monitoramento dos isolados
Utilizou-se PCR-DGGE para monitorar os isolados nos RHLFs, sendo coletadas amostras
em 3 portas ao longo do comprimento dos reatores, com relação comprimento/diâmetro (L/D) de
2, 10 e 18, respectivamente, após 7, 14 e 30 dias de cultivo de enriquecimento. Foram utilizados
os marcadores moleculares específicos para cada grupo de isolados, selecionados conforme o
item 2.2.7.3.4. Os biofilmes imobilizados foram acondicionados em béqueres autoclavados
(50 mL) contendo solução tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0) e submetidos à sonicação por
5 minutos a 12 kHz em um disruptor de células ultrassônico (Misonix Microson XL2000, Cole-
Parmer Instrument Company, Illinois, USA), para liberação dos microrganismos do suporte. As
58
soluções tampão contendo as suspensões de células resultantes foram centrifugadas a 2.254 g por
10 minutos a 4 oC. Os péletes resultantes foram ressuspendidos em 1,0 mL de solução tampão e
as amostras armazenadas a -80 C para posterior extração do DNA. A extração do DNA e PCR-
DGGE foram feitas conforme descrito nos itens 2.2.4.1 e 2.2.4.2, respectivamente. A análise dos
amplicons foi feita por agrupamento hierárquico utilizando-se o programa Systat 11.0, com base
em dados binários (presença ou ausência de bandas), pelo método de concordância simples
(“simple matching”), com algoritmo de Ward e distância euclidiana como unidade de medida.
2.2.8.3 Ensaios de degradação do PCE nos RHLFs
A partir do estabelecimento do consórcio, monitorado por PCR-DGGE, foram feitos os
ensaios de degradação do PCE nos reatores com os IIn1 e IIn2. Para comparar a eficiência de
degradação dos consórcios, In1 e In2 também foram avaliados.
Após o período de incubação iniciou-se a circulação do meio nos reatores, a uma vazão de
1 mL min-1
, mantendo-se um volume de meio de 700 mL no interior dos reatores (tempo de
retenção de 700 minutos). Os reatores foram alimentados continuamente com MM+PCE (sem
lactato) e o efluente coletado em frasco erlenmeyer fechado. Para equalizar a pressão nos
reatores, balões vazios foram conectados aos frascos coletores e balões com N2 nos frascos
alimentadores. As amostras foram coletadas 24 horas após o início do experimento, com uma
circulação de 1440 mL de meio pelos reatores neste período. Para análise de COVs e
determinação de PFQs, amostras foram coletadas em três portas ao longo do comprimento dos
reatores, com relação comprimento/diâmetro (L/D) de 2, 10 e 18, respectivamente, bem como da
entrada (L/D = 0) e saída dos reatores (L/D = 20). As amostras foram acondicionadas em frascos
com septo para análise de COVs e em frascos de vidro com tampa rosqueável para determinação
dos PFQs, sendo mantidas a 4ºC até o processamento.
A determinação dos PFQs foi feita conforme descrito no item 2.2.1. As análises de COVs
foram feitas por CG/ES, de acordo com o método USEPA SW 846-8260B, sendo quantificados
os COVs identificados nas amostras (item 2.2.7).
A extração dos COVs foi feita por Microextração em Fase Sólida (SPME) no modo
headspace. As técnicas de headspace são vantajosas na extração de compostos voláteis por
permitirem extrair os compostos em temperaturas baixas, reduzindo a probabilidade de alterações
59
na composição da mistura volátil. O princípio da SPME consiste na utilização de uma fibra de
sílica fundida, coberta com um filme de material sorvente (VALENTE; AUGUSTO, 2000). A
extração é feita pela exposição da fibra ao headspace da amostra para que os voláteis sejam
transferidos para o material sorvente da fibra. Os voláteis extraídos ficam sorvidos no
recobrimento da fibra, e passado o tempo de extração, a fibra é retraída, sendo posteriormente
introduzida diretamente no injetor do CG/ES. As substâncias extraídas serão dessorvidas
termicamente no injetor e arrastadas para a coluna cromatográfica.
A fibra de SPME empregada neste estudo foi a DVB/CAR/PDMS 50/30 StableFlex
(Divinilbenzeno, Carboxen, Polidimetilsiloxano) (Supelco, Bellefonte, PA, USA), com camada
interna de 30 µm de Carboxen ligada com PDMS e uma camada externa de 50 µm de DVB,
também ligada com PDMS e 2 cm de comprimento. Seu triplo revestimento é considerado como
de polaridade intermediária, com polímeros sólidos (DVB e Carboxen) dispersos em uma matriz
polimérica líquida (PDMS) (fibra mista) fixada em holder específico (Supelco, Bellefonte, PA,
USA). A camada de DVB, mais porosa, tem a função de reter os analitos maiores e menos
voláteis, permitindo a passagem dos analitos menores e mais polares, os quais ficam retidos na
camada de Carboxen, com menor porosidade (DEMYTTENAERE; VANOVERSCHELDE;
KIMPE, 2004; PAGE; LACROIX, 2000).
Previamente a sua utilização, a fibra foi acondicionada de acordo com as instruções do
fabricante, por uma hora a 270 °C. Foram retirados 10 mL das amostras e acondicionados em
novo frasco com septo, sendo o mesmo incubado por 5 min a temperatura ambiente. Para
extração dos COVs, o holder contendo a fibra, foi inserido no frasco, sendo a fibra exposta por
30 min a 45°C, com agitação a 800 rpm. Em seguida a fibra foi retraída e inserida no injetor do
CG/ES, onde foi novamente exposta, sendo os analitos dessorvidos da fibra por 15 min a 240 ºC.
As análises cromatográficas foram realizadas em CG/ES (GCMS-QP2010, Shimadzu,
Kyoto, Japão) com coluna cromatográfica capilar RTX-VMS (Restek, Bellefonte, PA, USA) de
30 m de comprimento, 1,4 µm de espessura de filme e 0,25 mm de diâmetro interno (APÊNDICE
A). He com pureza analítica 99,99 % (White Martins, Brasil) foi utilizado como gás de arraste
(fluxo de 1,0 mL min-1
). As condições operacionais foram: temperatura do injetor 240 ºC;
temperatura do detector 280 ºC; temperatura da fonte de íons 200 ºC; temperatura da interface
240 ºC; modo Split 1 em todas as injeções. A rampa de temperatura foi 5 min a 40 ºC, 5 ºC min-1
até 200 ºC. A confirmação dos COVs foi baseada nos espectros de massas obtidos por ionização
60
por impacto de elétrons (IE) a 70 eV de m/z 35 a 350. Os espectros de massas foram comparados
com os dados da biblioteca Wiley (Wiley, 8th Edition, 399.383 espectros, John Wiley & Sons,
Inc., Tokyo, Japão).
A análise quantitativa foi realizada empregando-se o método da padronização interna,
com tetracloroeteno, clorofórmio e 1,1,1-tricloroetano (100 µg L-1
, pureza superior a 99 %)
(SpecSol, São Paulo, Brasil), como padrões. Os limites de detecção e quantificação foram
determinados pela injeção de diluições sucessivas da mistura dos padrões tetracloroeteno e
clorofórmio nas concentrações de 20, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,05 e 0,005 µg L-1
e 1,1,1-tricloroetano
nas concentrações 20, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,05, 0,01 µg L-1
. A faixa de linearidade do detector
apresentou coeficiente de correlação médio maior do que 0,98 (ANEXO A). A identificação dos
compostos foi feita por comparação dos tempos de retenção dos picos dos compostos nas
amostras com os tempos de retenção dos padrões.
O modelo de fibra SPME, coluna cromatográfica, e as condições de extração e análise
cromatográficas foram as mesmas utilizadas para varredura de COVs no Instituto de Química da
UNICAMP.
2.2.8.4 Ensaios de degradação do PCE com células em suspensão
Cada isolado foi avaliado separadamente quanto ao seu potencial para degradação de
PCE. Os isolados foram cultivados em caldo nutriente (triptona, 10 g L-1
; extrato de levedura,
5 g L-1
; NaCl, 10 g L-1
) a 28 ºC por 24 horas, com rotação de 150 rpm, para obtenção de massa
bacteriana. O crescimento foi monitorado até cada isolado atingir uma densidade ótica = 0,6 (λ =
600 nm). Em seguida foram centrifugados a 2.254 g por 6 minutos a 4 ºC, sendo desprezado o
sobrenadante. Posteriormente os péletes foram lavados três vezes com solução 0,1 M de tampão
fosfato de potássio (PPB, pH 7,0) e centrifugados a 2.254 g por 6 minutos a 4 ºC (RYOO et al.,
2000). Os péletes foram ressuspendidos em 10 mL de PPB e 2 mL transferidos para frascos
selados contendo 100 mL de MM+PCE (sem lactato). As culturas foram incubadas a 28 ºC por
24 horas, sob agitação de 150 rpm (Innova 4300 Digital Incubator Shaker, NBSCO, New Jersey,
USA). Frascos contendo apenas MM+PCE (sem lactato) foram utilizados como controle
negativo, e frascos contendo IIn1 e IIn2 com MM+PCE (sem lactato) foram utilizados como
61
controles positivos. Todos os experimentos foram conduzidos em triplicata. As coletas foram
realizadas no tempo zero (T0) e após 24 horas de incubação (T24).
Após a incubação, amostras foram acondicionadas em frascos com septo para análise de
COVs e em frascos de vidro com tampa rosqueável para determinação dos PFQs, sendo mantidas
a 4ºC até o processamento.
A determinação dos PFQs foi feita conforme descrito no item 2.2.1, e as análises de
COVs de acordo com o item 2.2.8.4, no entanto apenas foi feita a quantificação do PCE.
2.2.8.5 Ensaio de degradação do PCE com IIn2 em RHLF
O isolado mais eficiente no experimento de degradação do PCE com as células em
suspensão foi avaliado quanto a sua eficiência em RHLF, sendo cultivado, imobilizado em
material suporte e acondicionado no reator, conforme descrito no item 2.2.8.1. O ensaio de
degradação foi conduzido conforme descrito no item 2.2.8.3. As amostras foram acondicionadas
em frascos com septo para análise de COVs e em frascos de vidro com tampa rosqueável para
determinação dos PFQs, sendo mantidas a 4 ºC até o processamento.
A determinação dos PFQs foi feita conforme descrito no item 2.2.1, e as análises de
COVs de acordo com o item 2.2.8.4.
2.2.8.6 Teste de inibição da via de monoxigenases
Para avaliar a influência das monoxigenases na degradação do PCE, foi adicionado ao
MM+PCE (sem lactato) um inibidor de citocromo P-450, 1-aminobenzotriazole (ABT), na
concentração de 1 mM mL-1
(MARCO-URREA et al., 2006). Os ensaios com ABT foram
realizados em RHLFs contendo IIn1, IIn2 e o I8In2. As bactérias foram cultivadas, imobilizadas
em material suporte e acondicionadas em RHLFs, conforme descrito no item 2.2.8.1. O ensaio de
degradação foi conduzido conforme descrito no 2.2.8.3, com o diferencial da adição do ABT ao
MM+PCE (sem lactato). As amostras foram acondicionadas em frascos com septo para análise de
COVs e em frascos de vidro com tampa rosqueável para determinação dos PFQs, sendo mantidas
a 4 °C até o processamento.
62
A determinação dos PFQs foi feita conforme descrito no item 2.2.1 e as análises de COVs
de acordo com o item 2.2.8.4.
Devido à complexidade metodológica utilizada foi montado um fluxograma para
observar a metodologia de forma esquemática (Figura 6).
Figura 6 - Fluxograma com as metodologias utilizadas no trabalho
63
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Análise de COVs e PFQs da área de estudo
A descloração redutiva é uma importante via para remediação de águas subterrâneas
contaminadas com PCE, sendo frequentemente formados TCE, cDCE e CV, tanto em estudos
com culturas de microrganismos em laboratório quanto em estudos de monitoramento de áreas
contaminadas com PCE (DISTEFANO; GOSSET; ZINDER, 1992; DUHAMEL et al., 2002;
FATHEPURE; BOYD, 1988; FREEDMAN; GOSSET, 1989; GOSSETT, 1985; SEWELL;
GIBSON, 1991; VOGEL; MCCARTY, 1985).
Nas análises cromatográficas do PM1 e PM2, foram detectadas concentrações de PCE
(Tabela 1) superiores ao limite de intervenção preconizado pela CETESB, estabelecido em
40 µg L-1
. Os compostos da via de descloração redutiva, TCE, cDCE e CV (Tabela 1) também
foram detectados em concentrações acima dos limites de intervenção preconizados pela
CETESB, tanto no PM1 quanto no PM2 (APÊNDICE B). Embora TCE, cDCE e CV tenham sido
formados, podemos observar o maior acúmulo de TCE no PM1 e de cDCE no PM2, o que pode
indicar grupos diferentes de microrganismos ativos nos diferentes PMs.
A degradação incompleta do PCE muitas vezes está relacionada com a ausência de grupos
de bactérias específicos, dentre os quais tem se destacado o gênero Dehalococcoides sp. Foi
destacado que essa bactéria é capaz de desclorar redutivamente PCE e CV, produzindo ETE
como parte de seu metabolismo, a partir da análise de 24 locais onde ocorreu descloração de
etenos clorados ao longo da América do Norte e Europa (HOLLIGER; WOHLFARTH;
DIEKERT, 1999). Em contrapartida, em sítios onde Dehalococcoides não foi detectado, a
descloração foi incompleta, sugerindo que a presença desta bactéria é uma condição essencial
para que o PCE seja degradado a ETE pela via de descloração redutiva (HOLLIGER;
WOHLFARTH; DIEKERT, 1999). Na presença de Dehalococcoideis sp., vários estudos de
campo e laboratório têm demonstrado a completa descloração do PCE a ETE, muito embora o
acúmulo de TCE, cDCE e CV possa ocorrer (DISTEFANO; GOSSET; ZINDER, 1992;
SEWELL; GIBSON, 1991; MAJOR; HODGINS; BUTLER, 1991).
A degradação do PCE a ETE, na presença de Dehalococcoides sp., pode muitas vezes ser
limitada pela falta de doadores de elétrons em concentrações que permitam a completa
64
degradação destes compostos a ETE, resultando assim no acúmulo de TCE, cDCE e CV. Glicose,
acetato, ácido fórmico e metanol têm sido capazes de sustentar a descloração redutiva do PCE
(FREEDMAN; GOSSET, 1989), assim como lactato, proprionato, butirato e etanol (GIBSON;
SEWELL, 1992). Outros agentes redutores, como tolueno (SEWELL; GIBSON, 1991) e
diclorometano (FREEDMAN; GOSSETT, 1991), também têm sido avaliados, e mostrado bons
resultados na descloração do PCE. O fato desta variedade de doadores sustentar a descloração
redutiva, aumentando a eficiência de formação de ETE, reduzindo as concentrações de TCE,
cDCE e CV, pode estar relacionado com a ação dos mesmos como precursores para a formação e
liberação de H2 via metabolismo fermentativo (GIBSON; SEWELL, 1992). Estudos demonstram
a formação de H2 a partir de lactato de etila, estimulando Dehalococcoides ethenogenes na
descloração redutiva do PCE e TCE, acumulando ETE (HOLLIGER; WOHLFARTH;
DIEKERT, 1999).
Tabela 1 - Quantificação do PCE e dos produtos da via de descloração redutiva no PM1 e PM2 de uma área com
histórico de contaminação por PCE
Amostra Tetracloroeteno
(PCE)
Tricloroeteno
(TCE)
cis-1,2-dicloroeteno
(cis-DCE)
Cloreto de vinila
(CV)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - µg L-1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - PM1 2.500 4.040 401 855
PM2 125.000 2.830 262.000 1.190
No entanto, o Eh (450 mV no PM1 e 400 mV no PM2) e o OD (5,0 mg L-1
no PM1 e 4,8
mg L-1
no PM2) nas amostras do PM1 e PM2 analisadas, caracterizam o ambiente como óxico,
quando se esperava um ambiente anóxico, devido a ocorrência da descloração. A anoxia é uma
condição essencial para a descloração redutiva do PCE. Em experimentos de degradação do PCE
com sub-culturas de um consórcio microbiano obtido de uma área com histórico de contaminação
com PCE, as bactérias foram expostas ao oxigênio, perdendo a habilidade de descloração do
PCE. Quando foi finalizado o fornecimento de oxigênio e adicionou-se lactato como doador de
elétrons, o PCE foi degradado, detectando-se a formação e acúmulo de CV. Em sub-culturas do
mesmo consórcio microbiano, que não foram expostas a oxigênio, o PCE foi degradado
completamente a ETE (RICHARDSON et al., 2002).
A presença, na área de estudo, dos produtos da via de descloração redutiva do PCE
evidenciam a presença de microrganismos capazes de degradar PCE, e sugere a ocorrência de
microambientes anóxicos, onde a descloração redutiva do PCE acontece. Assim, seria possível
65
isolar microrganismos ou consórcios microbianos eficientes em degradar PCE, para uma possível
utilização em processos de biorremediação.
3.2 Seleção de bactérias por cultivo de enriquecimento em RHLFs
Para o enriquecimento de culturas capazes de utilizar PCE como aceptor de elétrons,
precauções devem ser tomadas para assegurar um processo eficiente, pois o composto pode ser
adicionado em quantidades tóxicas, ou mesmo formar compostos tóxicos para os microrganismos
durante sua degradação. Esta limitação pode ser contornada pela substituição periódica do meio
de enriquecimento, mantendo-se níveis baixos dos compostos durante o cultivo de
enriquecimento (HOLLIGER; WOHLFARTH; DIEKERT, 1999). Outro ponto a ser observado
diz respeito às necessidades nutricionais específicas dos microrganismos, sendo que a preparação
de meios onde apenas o composto halogenado seja adicionado pode inibir a multiplicação de
alguns grupos de microrganismos importantes (HOLLIGER; SCHUMACHER, 1994). Por
exemplo, Desulfomonile tiedjei necessita de meio suplementado com fluído ruminal para sua
multiplicação na presença de PCE como aceptor de elétrons (SHELTON; TIEDJE, 1984), e
Dehalobacter restrictus depende de vitaminas, extrato de levedura e peptona para que realize a
descloração do PCE (HOLLIGER; WOHLFARTH; DIEKERT, 1999). Assim, foi adotado nesse
experimento o cultivo de enriquecimento utilizando a substituição periódica do MM+PCE,
visando estimular o estabelecimento de diferentes bactérias. Como foi destacado anteriormente,
grupos específicos de microrganismos têm necessidades específicas para o seu desenvolvimento,
desta forma, a seleção de bactérias necessita ser monitorada e os microrganismos identificados,
visando otimizar as condições para a degradação do PCE. A partir do cultivo de enriquecimento e
identificação dos microrganismos presentes no biofilme, meios alternativos para a multiplicação
dos grupos de interesse podem ser utilizados.
3.2.1 Estrutura da comunidade de Bacteria nos RHLFs
No monitoramento das bactérias nos RHLFs por PCR-DGGE, estruturas de comunidades
bacterianas distintas foram observadas nas amostras do sedimento do PM1 e do RHLF com o In1,
não havendo diferença significativa entre a estrutura da comunidade do PM2 e do RHLF com o
66
In2 (Tabela 2). Foi observado um menor número de amplicons no In1 (18), quando comparado
com o PM1 (32), evidenciando a eficiência do enriquecimento seletivo com PCE. Não houve
diferença no número de amplicons entre o PM2 e o In2 (10). É possível que a elevada
concentração de PCE no PM2 (125.000 µg L-1
) tenha pré-selecionado populações bacterianas
específicas, as quais se mantiveram no RHLF após nove meses de cultivo de enriquecimento com
PCE, sendo que a concentração de PCE no PM1 (2500 µg L-1
) não teve o mesmo efeito de
seleção, pois este processo ocorreu no In1 após nove meses de cultivo de enriquecimento (Figura
7A). Podemos observar que a comunidade bacteriana no In1 apresenta amplicons com
deslocamento no gel de poliacrilamida similares aos observados no PM2 e In2 (Figura 7A),
sugerindo a seleção de populações bacterianas filogeneticamente similares a partir do cultivo de
enriquecimento com PCE, grupos estes possivelmente envolvidos na degradação deste composto
(Figura 7B).
A comunidade microbiana em ecossistemas contaminados tende a ser dominada por
organismos capazes de utilizar o contaminante em seus processos metabólicos (ATLAS et al.,
1991; MACNAUGHTON et al., 1999). De uma maneira geral, a introdução de poluentes em
ecossistemas tende a reduzir a diversidade da comunidade bacteriana e promover a seleção de
vias metabólicas envolvidas na degradação dos mesmos (SAYLER et al., 1982; EICHNER et al.,
1999; Van der MEER, 2006).
A utilização de meios de enriquecimento tem possibilitado a seleção de bactérias
envolvidas na degradação do PCE em condições anaeróbias (SUNG et al., 2003; LORAH;
VOYTEK, 2004), tais como Desulfuromonas chloroethenica, Dehalococcoides ethenogenes,
Desulfuromonas acetoxidans, Desulfuromonas succinoxidans, Desulfuromonas thiophila e
Geobacter metallireducens, a partir do enriquecimento de amostras de água contaminada com
PCE (SUNG et al., 2003). Também foi possível detectar, após um ano de cultivo em
microcosmos enriquecidos com PCE, Dehalococcoides e Desulfuromonas, a partir de amostras
obtidas de uma área de descarte de contaminantes em Baltimore, USA (LORAH; VOYTEK,
2004). Da mesma forma, em estudos com culturas de enriquecimento com PCE, representantes
do gênero Dehalococcoides foram detectados utilizando-se hibridização in situ (YANG; ZEYER,
2003).
Processos de enriquecimento com PCE selecionam organismos com capacidade de
degradar o referido solvente, contudo períodos de enriquecimento longos são necessários para o
67
estímulo dos microrganismos selecionados no meio (DOLFING, 2000). Em trabalho
desenvolvido com sub-culturas em meio enriquecido com PCE, foi avaliada a estrutura das
comunidades bacterianas por PCR-DGGE, comparando-se estas estruturas com uma amostra
inicial de uma área com água subterrânea contaminada com PCE, e observaram-se modificações
consideráveis na estrutura das comunidades, havendo também diferenças entre as sub-culturas
com diferentes doadores de elétrons (YANG et al., 2005). Resultados semelhantes foram obtidos
com três sub-culturas distintas, as quais diferenciavam-se pelos compostos utilizados no
enriquecimento seletivo: PCE, TCE ou cDCE. Por PCR-DGGE pode-se observar estruturas de
comunidades bacterianas distintas entre as sub-culturas, evidenciando o estímulo de grupos
específicos em cada etapa do processo de degradação do PCE (GROSTERN; EDWARDS, 2006).
Figura 7 - Comparação entre a estrutura da comunidade bacteriana dos PMs e dos RHLFs, após enriquecimento.
M - marcadores moleculares; PM1 e PM2 - poços de monitoramento de água subterrânea; In1 e In2 -
RHLFs com inóculo do PM1 e PM2, respectivamente; 1, 2 e 3 - repetições das amostras. A - gel da DGGE; B - análise de MDS dos perfis de amplicons da DGGE
68
Tabela 2 - Resultado do teste de similaridade por Pairwise (pareamento) baseado nos perfis de amplicons do gene
rRNA 16S de Bacteria dos PMs e RHLFs, após cultivo de enriquecimento
Comparações entre horizontes Teste de similaridade por Pairwise
PM1, In1 1,000
PM1, PM2 1,000 PM1, In2 1,000 In1, PM2 1,000 In1, In2 1,000
PM2, In2 0,000
Nível de significância para R global = 0,833; P < 0,2.
Desta maneira, a variação na estrutura das comunidades bacterianas após nove meses de
enriquecimento no In1 e a manutenção da estrutura da comunidade bacteriana no In2, sugere que
houve seleção de bactérias específicas com habilidade para degradar PCE, havendo a necessidade
de identificar os organismos selecionados, e otimizar as exigências nutricionais e as condições
físico-químicas ideias para o estímulo dos consórcios selecionados na degradação do PCE.
3.2.2 Detecção de populações de Dehalococcoides
A detecção de microrganismos que comprovadamente degradam o PCE, em áreas
contaminadas com este composto, é indicativa da possível atividade dos mesmos no local. Desta
forma, foi avaliada a presença de populações de Dehalococcoides sp. nos PMs e RHLFs após
nove meses de enriquecimento, utilizando-se PCR com iniciadores específicos.
Populações de Dehalococcoides foram detectadas no PM1 e PM2, indicando a presença
de um grupo de bactérias envolvido na descloração redutiva do PCE. Da mesma forma,
Dehalococcoides sp. foi detectada tanto no In1 quanto no In2, após nove meses de cultivo de
enriquecimento, indicando a manutenção das populações de Dehalococcoides sp. após o
enriquecimento (Figura 8). Em estudos prévios, foi confirmada a presença do grupo
Dehalococcoides sp. em oito PMs na área de estudo, a partir da utilização da PCR com
iniciadores específicos para este grupo de bactérias (ARMAS, 2007). Estes resultados são
promissores, pois confirmam o potencial de degradação do PCE, por descloração redutiva, na
área amostrada.
No entanto, existem diferenças na habilidade de Dehalococcoides sp. em desclorar CV,
uma das principais etapas na descloração do PCE (HE et al., 2003). Populações de
Dehalococcoides cepa 195 degradam PCE para ETE, mas a transformação de CV para ETE é um
processo co-metabólico lento (MAYMÓ-GATELL et al., 1997). Cepas de Dehalococcoides que
69
co-metabolizam CV para ETE podem utilizar CV como aceptor de elétrons (DUHAMEL; MO;
EDWARDS, 2004), como é o caso das cepas VS e GT, as quais utilizam TCE, cDCE e CV como
aceptores de elétrons, mas não reduzem o PCE (SUNG et al., 2006). A cepa BAV1 utiliza cDCE
e CV como aceptores de elétrons, mas com baixa eficiência (HE et al., 2005). Já as cepas 195 e
FL2, utilizam TCE e cDCE como aceptores de elétrons, enquanto a descloração do CV para ETE
é um processo co-metabólico (HE et al., 2005).
Assim, a presença de Dehalococcoides não necessariamente implica em eficiente
degradação de PCE, e a seleção e identificação de outros microrganismos é importante, pois
permite suprir possíveis limitações na degradação de PCE por Dehalococcoides sp.
Figura 8 - Detecção de Dehalococcoides nos poços de monitoramento e RHLFs
3.2.3 Sequenciamento de clones do gene rRNA 16S de Bacteria dos RHLFs
Os índices de diversidade, estimativas de riqueza de UTOs e estimativas de cobertura de
amostragem, considerando distância evolutiva de 0,03 para a definição de UTOs, estão
apresentados na Tabela 3. A riqueza de UTOs não apresentou diferenças significativas em um
intervalo de confiança de 95 % de probabilidade entre PM1, In1, PM2 e In2. Já pelos índices de
diversidade de Shannon e recíproca de Simpson, In1 diferiu significativamente das amostras do
PM1, PM2 e In2, as quais não diferiram entre si (Tabela 3).
70
Tabela 3 - Estimativa de riqueza de UTOs, índice de diversidade e cobertura de amostragem calculados a partir de bibliotecas de clones do gene rRNA 16S de
Bacteria de amostras dos PMs e RHLFs, após cultivo de enriquecimento
Comunidade NSa NU
b
Estimativa de riqueza de UTOs
Índice de Diversidade
ECAe
ACE Chao1 Shannonc 1/D
d
D = 0,03
PM1 78 41 90,1 (60,7; 163,3) 83,3 (56,4; 156,7) 3,39 (3,19; 3,59) 20,00 (13,70; 35,71) 0,667
In1 93 27 75,2 (43,7; 166,0) 51,1 (34,3; 106,0) 2,11 (1,77; 2,44) 3,41 (2,36; 6,06) 0,817
PM2 84 36 71,1 (49,0; 130,4) 80,1 (50,8; 167,3) 3,07 (2,83; 3,30) 12,97 (10,07; 18,21) 0,726
In2 84 37 73,9 (50,8; 135,4) 78,1 (51,4; 154,8) 3,09 (2,85; 3,32) 13,07 (10,18; 18,25) 0,714
Para a definição de UTOs foi utilizado D = 0,03: aNúmero de sequências. bNúmero de UTOs determinado pelo DOTUR. cEstimador de máxima semelhança. dRecíproco do índice de Simpson (estimador de máxima semelhança). eEstimativa de cobertura de amostragem. Valores entre parênteses
representam o intervalo com 95% de confiança.
71
Estudos de ecologia microbiana realizados em áreas contaminadas com PCE têm como
principal limitação a avaliação por técnicas dependentes de cultivo, subestimando a diversidade
dos organismos presentes (AMANN; LUDWIG; SCHEIFER, 1995; SMIDT; DE VOS, 2004).
Neste trabalho, os resultados obtidos por sequencimento do gene rRNA 16S permitiram
explorar a diversidade de bactérias presentes na área de estudo, bem como os grupos selecionados
após os cultivos de enriquencimento nos RHLFs. Os resultados foram semelhantes aos
observados por PCR-DGGE, ocorrendo a seleção de populações bacterianas no In1 após o cultivo
de enriquecimento com PCE, quando comparado com PM1. Já na comparação das comunidades
de PM2 e In2, não observou-se diferenças entre os grupos filogenéticos detectados (Figura 9).
Na comunidade bacteriana do In1 prevaleceram bactérias da classe Alphaproteobacteria
(73 %), selecionadas após nove meses de enriquecimento no RHLF. As demais classes foram
encontradas com frequências inferiores a 5 %. Apenas 2 % das sequências representativas das
bactérias do biofilme do In1 não puderam ser classificadas em nível de filo pelo SeqMatch. Já na
comunidade bacteriana do sedimento do PM1 prevaleceram bactérias das classes
Gammaproteobacteria (29 %), Alphaproteobacteria (17 %), Betaproteobacteria (11 %) e
Acidobacteria (5 %). As demais classes foram detectadas com frequências inferiores a 5 %. As
sequências do PM1 que não puderam ser classificadas em nível de filo pelo SeqMatch
totalizaram 15 %. A única classe exclusiva do In1 foi Sphingobacteria.
Nas comunidades bacterianas do biofilme do In2 e do sedimento do PM2, prevaleceram
bactérias das classes Alphaproteobacteria (50 e 54 %, respectivamente) e Betaproteobacteria (31
e 27 %, respectivamente). As demais classes foram detectadas com frequências inferiores a 5 %.
Apenas 3 % das sequências do In2 e 4 % das sequências do PM2 não puderam ser classificadas
em nível de filo pelo SeqMatch. Assim como no In1, Alphaproteobacteria foi o grupo mais
abundante, sugerindo que bactérias pertencentes a esta classe tem papel importante na degradação
do PCE, assim como os representantes da classe Betaproteobacteria, abundantes no PM2 e In2.
Como podemos observar, nos RHLFs predominaram bactérias afiliadas a Proteobacteria,
normalmente o grupo mais abundante nos diferentes compartimentos ambientais, sendo
constituído por bactérias de diferentes características morfológicas e metabólicas (MARGULIS;
SCHWARTZ, 1998). Dentre as classes pertencentes ao filo Proteobacteria detectadas,
Alphaproteobacteria foi a mais abundante, sendo composta por organismos que, na sua maioria,
72
habitam ambientes aquáticos, incluindo representantes envolvidos na degradação de
hidrocarbonetos aromáticos (FREEBORN et al., 2005; GARRITY; HOLT, 2001).
Outra classe abundante foi Betaproteobacteria, a qual inclui bactérias quimioautotróficas e
quimioheterotróficas. Membros desta classe podem ser encontrados no solo e água, e alguns são
patogênicos a humanos (GARRITY; HOLT, 2001).
Pelos resultados obtidos a partir da avaliação da estrutura das comunidades e diversidade
de Bacteria nos RHLFs, podemos observar a seleção de grupos bacterianos distintos no In1 e In2,
indicando que a degradação do PCE foi realizada por diferentes grupos de bactérias em cada
reator analisado. Estes resultados são promissores, pois quanto maior a diversidade de bactérias
com capacidade de degradar o PCE, maiores as chances de otimizar as condições para
degradação deste contaminante em processos de biorremediação.
Muito embora a cobertura de amostragem tenha sido relativamente elevada (Tabela 3),
sequências afiliadas ao grupo Dehalococcoides (classe Chloroflexi) não foram detectadas nas
bibliotecas de clones do gene rRNA 16S analisadas. Estes resultados sugerem que populações de
Dehalococcoides sp. presentes na área podem estar em número reduzido, pois foram detectados
usando PCR com iniciadores específicos, mas não em bibliotecas de clones, as quais foram
sintetizadas com fragmentos do gene rRNA 16S amplificados com iniciadores específicos para o
domínio Bacteria. Este resultado é intrigante, pois sugere que o gênero mais característico na
degradação do PCE estudado até o momento, pode não ser o principal responsável pela
degradação do PCE na área em estudo, bem como nos RHLFs.
73
Figura 9 - Abundância de grupos filogenéticos dos PMs e dos RHLFs (%), após cultivo de enriquecimento. PM1 e
PM2 - poços de monitoramento de água subterrânea; In1 e In2 - RHLF com inóculo do PM1 e PM2,
respectivamente
As comparações das bibliotecas de clones do gene rRNA 16S, utilizando o ʃ-LIBSHUFF,
mostraram que a comunidade bacteriana do sedimento do PM1 foi estatiscamente diferente da
comunidade bacteriana do In1, não havendo diferença entre as comunidades bacterianas do
sedimento do PM2 e In2, as quais diferem estatisticamente de PM1 e In1 (P≤0,05) (Tabela 4).
Tabela 4 - Valores de p calculado nas comparações múltiplas entre as bibliotecas de clones do gene rRNA 16S das
comunidades de Bacteria de amostras dos PMs e RHLFs, após cultivo de enriquecimento
X
Y
PM1
In1
PM2
In2
PM1 - 0,0000 0,0000 0,0000
In1 0,0000 - 0,0000 0,0000 PM2 0,0000 0,0000 - 0,0065
In2 0,0000 0,0000 0,0051 -
X homólogo na coluna e Y homólogo na linha. Valores mínimos
para diferença significativa: 0,0008 e 0,0043 para 1% e 5% de
probabilidade, respectivamente.
74
Estas diferenças também podem ser observadas a partir da curva de rarefação (Figura 10),
que relaciona o número de clones sequenciados com o número estimado de UTOs. Um menor
número de UTOs foi observado na amostra do In1. As amostras do PM2 e In2 não apresentaram
diferenças entre si, tendo um menor número de UTOs quando comparadas com a amostra do
PM1. As diferenças tornam-se significativas com o aumento do número de clones do gene rRNA
16S.
Estes resultados mostram que o cultivo de enriquecimento foi eficiente na seleção de
bactérias no In1, sendo que a menor diversidade obtida, quando comparada com PM2 e In2, pode
estar relacionada com as concentrações de PCE encontradas nos PMs analisados. No In2 a
concentração de PCE utilizada no cultivo de enriquecimento foi inferior a detectada no PM2, o
que permitiu a manutenção da comunidade bacteriana previamente selecionada no PM2. Já no
In1, a concentração de PCE foi superior a utilizada no PM1, a qual foi suficiente para selecionar
grupos específicos após nove meses de cultivo de enriquecimento.
Figura 10 - Curva de rarefação indicando o número estimado de UTOs em bibliotecas de clones do gene rRNA 16S
de Bacteria nos PMs e nos RHLFs, após cultivo de enriquecimento
Na comparação entre as UTOs do PM1 e In1, somente duas foram comuns entre as
amostras, evidenciando a seleção de grupos bacterianos específicos no In1 após o cultivo de
83
75
enriquecimento. Das 93 sequências do In1, 49 sequências (53 %) se agruparam em uma UTO e
nove sequências em outra (10 %), sendo ambas filogeneticamente relacionadas com a classe
Alphaproteobacteria. Estas bactérias podem estar diretamente relacionadas com a biodegradação
do PCE no In1. Na comparação entre as UTOs do PM2 e In2, 34 UTOs foram comuns entre as
duas amostras, confirmando que não ocorreu seleção de bactérias no In2 após o cultivo de
enriquecimento. Das UTOs do PM2 e In2, destacam-se duas, representando cada uma 14 % do
total de sequências obtidas no PM2 e In2, sendo uma UTO classificada como
Alphaproteobacteria e a outra como Betaproteobacteria. A amostra do In2 apresentou uma UTO
exclusiva e PM2 não apresentou UTOs exclusivas (Figura 11).
Figura 11 - Diagrama de Venn baseado na frequência de UTOs dos PMs e do biofilme dos RHLFs. Valores entre
parênteses referem-se à UTOs exclusivas e valores sem parênteses a UTOs comuns
Estes resultados sugerem que bactérias pertencentes às classes Alphaproteobacteria e
Betaproteobacteria foram selecionadas e preservadas nos RHLFs, podendo ter envolvimento
direto com a degradação do PCE.
Dentre as bactérias identificadas até o momento com eficiência comprovada na
degradação do PCE, podemos destacar Dehalospirillum multivorans (Epsilonproteobacteria),
76
Desulfitobacterium spp. (Clostridia), Dehalococcoides ethenogenes (Chloroflexi),
Dehalobacter restrictus (Clostridia), Desulfuromonas chloroethenica (Deltaproteobacteria),
Desulfomonile tiedjei (Deltaproteobacteria), Geobacter metallireducens (Deltaproteobacteria) e
Pseudomonas stutzeri OX1 (Gammaproteobacteria) (SCHUMACHER; HOLLIGER, 1996;
MAGNUSON et al., 1998; MILLER; WOHLFARTH; DIEKERT, 1998; NEUMANN;
WOHLFARTH; DIEKERT, 1995; NEUMANN; WOHLFARTH; DIEKERT, 1996; SHIM et al.,
2001; SUNG et al., 2003). Assim, não existem evidências reportadas de que Alphaproteobateria e
Betaproteobacteria estejam relacionados com a degradação do PCE.
Alguns representantes de Alphaproteobacteria já foram encontrados em áreas
contaminadas com TCE e cDCE, no entanto apenas em locais co-contaminados com óleo diesel e
tetrakis (2-etil butoxi) silano (TKEBS) (CH3CH2CH(CH2CH3)CH2O)4Si. Como exemplos temos
espécies de Sphingomonas, as quais estão associadas com o co-metabolismo do TCE, sendo
frequentemente encontradas em consórcios microbianos (DEN; HUANG; LI, 2003; GROSSE et
al., 1999; HEYER, GALCHENKO; DUNFIELD, 2002; LEE et al., 2002; McDONALD et al.,
1997; NAKAJIMA et al., 1992). Outros exemplos são espécies de Methylocystis que produzem
metano monoxigenases (pMMo) solúveis capazes de oxidar substratos aromáticos e alifáticos,
incluindo TCE e outros etenos clorados (GROSSE et al., 1999; HUMPHRIES et al., 2005;
SHIGEMATSU et al., 1999). Outros grupos estão relacionados com a formação de biofilmes em
amostras de água contaminadas com etenos clorados, como é o caso de Reyranella massiliensis
(PAGNIER, RAOULT; SCOLA, 2008).
Já Betaproteobacteria, grupo abundante no PM2 e In2, tem sido frequentemente
encontrado em áreas contaminadas com TCE, sendo um importante grupo envolvido na
degradação aeróbia deste contaminante. Na presença de tolueno e fenol, Burkholderia cepacia
G4 é capaz de oxidar e mineralizar o TCE por co-metabolismo, pela ação da enzima tolueno orto-
monoxigenase (BARTH et al., 2002). Também têm sido descritas bactérias em associação com
plantas na degradação do PCE, como é o caso de Cupriavidus taiwanensis associada com
Mimosa pudica (CHEN et al., 2008). Cupriavidus necator também tem sido relacionado com a
degradação de uma variedade de compostos cloroaromáticos, tais como, 4-cloro-2-
metilfenoxiacetato (MCPA), ácido 3-clorobenzóico (3-CB), 2,4,6-triclorofenol a 4-fluobenzoato
(LYKIDIS et al., 2010). Já Cupriavidus metallidurans, uma espécie típica de água doce, tem
chamado à atenção pelo seu potencial na imobilização de metais pesados (SARRET et al., 2010).
77
Como podemos observar, as UTOs mais representativas dos RHLFs apresentaram
similaridade com grupos específicos de Alphaproteobacteria e Betaproteobacteria, os quais estão
associados com as vias de degradação de compostos aromáticos, alifáticos e alguns etenos
clorados, dentre os quais o TCE (Figura 12).
Figura 12 - Relações filogenéticas entre as UTOs mais representativas com base no sequenciamento do gene rRNA 16S de Bacteria do In1 e In2, usando árvore neighbour-joining gerada a partir do parâmetro Kimura 2, apresentando a similaridade entre as sequências obtidas e organismos referência. Os números dos nós são percentagens indicando os níveis de bootstrap suportados. Somente valores acima de 50% são apresentados. A barra representa 0,02 substituições por posição de nucleotídeo. Dados entre parênteses representam os números de acesso das sequências
no GenBank. As UTOs estão destacadas em negrito. Prochlorales cyanobacterium foi utilizado como outgroup
Apesar da seleção de bactérias após o cultivo de enriquecimento, estes resultados não
confirmam o potencial destes microrganismos na degradação do PCE nos RHLFs, pois a técnica
de detecção é baseada na análise do DNA total. A confirmação do potencial de degradação do
PCE pelos isolados selecionados foi realizada a partir dos ensaios de degradação do PCE nos
RHLFs.
3.3 Ensaio de degradação do PCE em RHLF
O RHLF tem sido utilizado para a degradação de diferentes compostos, como
pentaclorofenol (PCP) sob condições metanogênicas (BARALDI, 2001; DAMIANOVIC, 1997;
MONTENEGRO, 2001; MONTENEGRO; ARAUJO; VAZOLLER, 2003), benzeno, tolueno,
etil-benzeno e xileno (BTEX), tanto em condições metanogênicas quanto sulfidogênicas
78
(BOLAÑOS, 2001; CATTONY et al., 2005; NARDI et al., 2005). No entanto, o emprego desse
tipo de reator na degradação do PCE não havia sido relatado. Sua possível aplicabilidade está
relacionada com a retenção de biomassa ativa no interior dos reatores, condição esta limitante,
pois a perda da biomassa influencia negativamente na eficiência de degradação de contaminantes.
As análises cromatográficas mostraram que, após um tempo de retenção de 12 horas, o
In1 apresentou 87 % de eficiência na degradação do PCE, não sendo detectados produtos da via
de descloração redutiva, e o In2 96 % de eficiência na degradação do PCE, com a formação de
TCE e cDCE. O controle C1 teve uma redução de 2 % da concentração inicial de PCE, enquanto
o controle C2 uma redução de 7 %, o que indica que a degradação no In1 e In2 é biológica e
altamente eficiente (Tabela 5).
Em experimentos com culturas enriquecidas com acetato, em cultivo anaeróbio, 92 % do
PCE (5 µg L-1
) foi degradado formando CV e ETE, após 240 horas de incubação com as células
em suspensão (MAYMÓ-GATELL et al., 1995). Em experimentos semelhantes, utilizando
metanol e H2 como doadores de elétrons, 90 % do PCE foi degradado após 75 horas de
incubação, enquanto na ausência de doadores elétrons o tempo necessário para atingir os mesmos
níveis foi de 150 horas. No entanto, a concentração de PCE nesses experimentos foi de 2,5 µg L-1
(AULENTA et al., 2002).
Já em estudos com consórcios imobilizados em argila expandida, obtidos de uma área
contaminada com PCE, após um ano de cultivo de enriquecimento, ensaios de degradação do
PCE foram realizados utilizando-se acetato como doador de elétrons e inoculação com
Dehalospirillum multivorans, e após 4 horas não foi mais detectado PCE no reator. No entanto,
houve acúmulo de TCE, o qual foi completamente degradado após 22 horas, formando cDCE
(HÖRBER et al., 1999). Como podemos observar, esses experimentos foram realizados em
condições anaeróbias, com estímulo para descloração redutiva e acúmulo de cDCE, CV e ETE.
Pelas análises dos PFQs, de uma maneira geral, os reatores utilizados em nosso estudo
apresentaram elevadas concentrações de OD e alto Eh, caracterizando o ambiente nos reatores
como óxico, condição a priori não adequada para a degradação do PCE, já que as vias são,
predominantemente, anaeróbias. Comparativamente, os valores de Eh (550 mV no In1 e 600 mV
no In2) e OD (8 mg L-1
no In1 e 9 mg L-1
no In2) dos reatores foram maiores do que nos PMs,
enquanto os valores de CE (2000 µS cm-1
no In1 e 2200 µS cm-1
no In2) e pH (3,3 para In1 e 3,6
no In2) foram próximos dos determinados nos PMs in situ. Já os valores dos PFQs nos controles
79
foram: Eh (534 mV no C1 e 587 mV no C2), OD (7 mg L-1
no C1 e 8 mg L-1
no C2),
CE (1987 µS cm-1
no C1 e 2137 µS cm-1
no C2) e pH (3,4 para C1 e 3,5 no C2). Estes resultados
mostram uma condição de aerobiose ainda maior nos reatores quando comparado com os PMs
analisados, sugerindo a existência de uma via alternativa de degradação do PCE nos reatores.
Apesar da condição aeróbia nos reatores, é possível a ocorrência de microambientes anaeróbios
no In2 favorecendo a descloração redutiva, já que houve formação de TCE e cDCE no referido
reator.
Tabela 5 - Resultados dos ensaios de degradação do PCE no In1 e In2
Amostra Tetracloroeteno
(PCE)
Tricloroeteno
(TCE)
cis-1,2-dicloroeteno
(cis-DCE)
Cloreto de vinila
(CV)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - µg L-1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
In1 Entrada 5697 < 1 < 2 < 1
Saída 723 < 1 < 2 < 1
In2 Entrada 5015 < 1 < 2 < 1
Saída 200 40 8,8 < 1
C11 Entrada 5586 < 1 < 2 < 1
Saída 5418 < 1 < 2 < 1
C22 Entrada 5395 < 1 < 2 < 1
Saída 5018 < 1 < 2 < 1 1Controle sem espuma e sem inóculo; 2Controle com espuma e sem inóculo.
É provável que a habilidade de descloração redutiva tenha sido perdida com o cultivo de
enriquecimento no reator com In1, pois TCE, cDCE e CV foram detectados no PM1 (Tabela 1),
com acúmulo maior de TCE. Em contraste, a condição observada no reator com In1, não levou ao
acúmulo dos produtos da via de descloração redutiva, sugerindo que os mesmos não estão sendo
formados, ou que estão sendo completamente degradados.
Já no In2, o PCE foi degradado formando TCE e cDCE, não havendo formação de CV, o
que ocorria no PM2, sendo uma condição favorável, já que CV apresenta toxicidade mais elevada
do que TCE e cDCE. Resultados semelhantes já foram obtidos em ensaios de degradação do
PCE, com acúmulo de cDCE em reatores inoculados com Dehalospirillum multivorans
imobilizados em argila expandida utilizando formato e acetato como doadores de elétrons
(HÖRBER et al., 1999). Dos 96 % de PCE degradados no In2, com base na quantidade de
carbono, apenas 0,8 % de TCE e 0,2 % de cDCE foram formados, sugerindo uma via alternativa
de degradação do PCE, a qual ocorre simultaneamente com a descloração redutiva no In2. Como
foram analisadas duas portas dos reatores (entrada e saída), as baixas concentrações de TCE e
80
cDCE na saída do In2 pode indicar que os mesmos foram degradados ao longo dos reatores ou
mesmo que a contribuição da descloração redutiva no In2 é baixa, sendo a via alternativa de
degradação predominante.
Como já foi visto, a descloração do PCE ocorre exclusivamente sob condições anaeróbias
(FREEDMAN; GOSSET, 1989), sendo a completa descloração para ETE observada em
consórcios microbianos, mas também em culturas puras de Dehalococcoides ethenogenes, cepa
195 (DEBRUIN et al., 1992; DISTEFANO; GOSSETT; ZINDER, 1991; FREEDMAN;
GOSSET, 1989; MAYMÓ-GATTELL et al., 1997). No entanto, muitas vezes ocorre o acúmulo
de seus intermediários tóxicos, TCE, cDCE e CV, os quais podem ser degradados por diferentes
microrganismos em condições aeróbias (FOGEL; TADDEO; FOGEL, 1986). Desta maneira, um
sistema de dois estágios (anaeróbio-aeróbio) tem sido proposto como um método promissor para
a mineralização de PCE (ENZIEN et al., 1994; FATHEPURE; VOGEL, 1991; GERRITSE et al.,
1995).
A partir dos resultados obtidos podemos afirmar que o cultivo de enriquecimento nos
RHLFs resultou na seleção de microrganismos eficientes na degradação de PCE, sendo esta
eficiência superior às relatadas em trabalhos citados em literatura. O In2 foi mais eficiente na
degradação do PCE do que o In1, possivelmente pela prévia seleção de microrganismos na área
de estudo. No entanto, é necessária a caracterização da via metabólica e a identificação dos
compostos que estão sendo formados na degradação do PCE.
3.4 Varredura de COVs dos RHLFs
Os COVs possuem diferentes definições, mas, de uma forma geral, são caracterizados
como compostos orgânicos que apresentam pressão de vapor maior que 0,01 kPa e ponto de
ebulição abaixo de 150 ºC. São considerados os contaminantes ambientais mais problemáticos,
devido a sua toxicidade, dificuldade de degradação e possibilidade de bioacumulação (FREIRE et
al., 2000; PARREIRA; CARDEAL, 2005). Dentre as técnicas para detecção destes compostos
uma das mais empregadas é a cromatografia gasosa, pois apresenta boa resolução, versatilidade
de detecção, e permite a determinação simultânea de diferentes compostos, além da possibilidade
de utilização de diferentes padrões internos e identificação dos compostos por EM (GODOI;
FAVORETO; SANTIAGO-SILVA, 2003; MATA et al., 2004).
81
Pelas análises cromatográficas, tanto no In1 quanto no In2 foram detectados
1,1,1-tricloroetano (TCA) e clorofórmio (TCM) (ANEXOS B e C). Estes resultados demonstram
a ocorrência de uma via oxidativa de degradação do PCE em ambos os reatores. No In2 não
foram detectados TCE e cDCE, diferindo dos resultados obtidos no ensaio de degradação anterior
(item 3.3), onde baixas concentrações de TCE e cDCE foram detectadas, o que demonstra que a
descloração redutiva foi uma via pouco efetiva de degradação do PCE. Nossos resultados
mostram pela primeira vez a formação de TCA e TCM a partir da degradação do PCE.
Estes resultados são promissores, pois tanto TCA quanto TCM são considerados menos
tóxicos do que o PCE e os intermediários da via de descloração redutiva (TCE, cDCE e CV), o
que pode ser evidenciado pelos maiores valores estipulados como limites de intervenção para
TCA (280 µg L-1) e TCM (200 µg L
-1) em água subterrânea (APÊNDICE B).
O TCA é um haloalcano incolor de aroma doce, produzido industrialmente e empregado
como solvente, sendo amplamente utilizado na limpeza e desengraxe de metais a frio devido as
suas propriedades tecnológicas, baixa toxicidade e fácil biodegradação, sendo geralmente
mineralizado (não deve ser confundido com o seu isômero mais tóxico, 1,1,2-tricloroetano)
(SALVINI; BINASCHI; RIVA, 1971).
O TCA é susceptível a uma variedade de transformações abióticas e bióticas, no entanto,
as taxas de transformação são frequentemente insuficientes para prevenir a migração deste
composto em águas subterrâneas. O TCA é mais denso do que a água (gravidade específica de
1,32 g cm-3
) e quando migra em subsuperfície, normalmente forma uma DNAPL, percolando
verticalmente no aquífero por força da gravidade, e acumulando-se no aquífero. A dissolução do
TCA em fase livre no aquífero é um processo lento, devido à solubilidade do TCA em água ser
relativamente baixa (1135 mg L-1
) (SCHEUTZ et al., 2011).
O TCM é um líquido incolor com um odor agradável não irritante e um sabor levemente
adocicado, que revolucionou a medicina como um dos primeiros anestésicos cirúrgicos, e desde
então tem sido utilizado para diferentes aplicações que vão desde o controle de fungos na
agricultura até a produção artificial de seda. Atualmente, o TCM é usado principalmente na
síntese de hidroclorofluorcarbono (HCFC-22), um gás refrigerante amplamente utilizado
(ROSSBERG et al., 2006). Grande parte do TCM encontrado no ambiente provém de emissões
industriais, sendo comumente detectado em efluentes de estações de tratamento de água e esgoto
82
que utilizam processos de cloração, pois o cloro pode reagir com a matéria orgânica presente,
formando TCM, embora em pequenas quantidades (GROSTERN et al., 2011).
Quando atinge o solo, parte do TCM é perdida por volatilização para a atmosfera e parte
percola chegando a subsuperfície. Devido a sua alta volatilidade, o mecanismo de transporte
predominante nas camadas superficiais do solo é a volatilização, com resultados semelhantes para
diferentes tipos de solo (McCULLOCH, 2003). O TCM não apresenta adsorção significativa em
sedimentos ou material particulado suspenso (Koc = 45), tendo mobilidade alta no solo
(SABLJIC, 1984), de onde migra atingindo águas subterrâneas e, por ser mais denso do que a
água (1,48 g cm-3
) percola verticalmente até atingir uma camada de impedimento, sendo
dissolvido lentamente na água por possuir baixa solubilidade (8000 mg L-1
).
No ambiente, o TCM é lentamente transformado por processos abióticos ou degradado co-
metabolicamente em processos aeróbios e anaeróbios, sendo eficiente em culturas
metanogênicas, acetogênicas e redutoras de sulfato (BOUWER; MCCARTY, 1983; CHUNG;
RITTMANN, 2008; FREEDMAN et al., 1995; GUERRERO-BARAJAS; FIELD, 2005; GUPTA
et al., 1996; KOONS; BAESEMAN; NOVAK, 2001; OLIVAS; DOLFING; SMITH, 2002;
WEATHERS; PARKIN, 2000).
Algumas bactérias metanotróficas, como por exemplo, Methylocystis cepa H2s e SB2, são
capazes de oxidar organoclorados na presença de metano, dentre os quais TCE, cDCE, CV, TCA
e TCM, pela ação da enzima pMMo. Maior atividade enzimática tem sido observada em ensaios
avaliando-se a degradação de cloroetenos e cloroetanos separadamente, enquanto em ensaios
conduzidos com a mistura de cloroetenos e cloroetanos ocorre a inibição competitiva da atividade
de pMMO (IM; SEMRAU, 2011).
A via de degradação aeróbia de diferentes organoclorados está relacionada com a ação de
monoxigenases e dioxigenases, catalisadas pelo citocromo P-450, presentes em plantas e
microrganismos. Têm sido observados diferentes grupos de bactérias relacionados com a
degradação oxidativa de compostos tri, di ou monoclorados, mas não tetraclorados. No entanto,
essa degradação já foi relatada em plantas e animais (VLIEG; JANSSEN, 2001). O metabolismo
oxidativo de organoclorados gera epóxidos, os quais são instáveis e, devido a sua toxicidade, são
prontamente degradados pelos organismos via epóxido-hidrolases, as quais convertem estes
compostos em dióis vicinais pela adição régio e estereoespecífica de uma molécula de água,
resultando em produtos mais solúveis em água e menos tóxicos (ADAMS et al., 1995). Epóxido-
83
hidrolases de origem microbiana incluem enzimas encontradas em bactérias, fungos filamentosos
e leveduras. As epóxido-hidrolases de origem bacteriana são utilizadas na síntese orgânica devido
a sua produção em larga escala, entretanto, cada enzima possui suas limitações quanto ao tipo de
substrato e também quanto à enantiosseletividade. Estudos têm sido desenvolvidos usando
epóxido-hidrolases sintetizadas por diferentes bactérias (Rhodococcus, Mycobacterium,
Arthrobacter, Mycoplana, Nocardia e Corynebacterium) na síntese de compostos bioativos com
elevado valor comercial, e de aplicação na área médica, de alimentos, na agricultura e na
remediação de áreas contaminadas por diferentes compostos (STEINREIBER et al., 2001;
MAYER et al., 2001; ORRU et al., 1998).
Os resultados obtidos demonstram o potencial dos microrganismos selecionados na
degradação aeróbia do PCE, formando TCA e TCM, uma via alternativa ainda não descrita na
literatura, sendo a identificação dos organismos envolvidos neste processo uma etapa
fundamental.
3.5 Isolamento de bactérias presentes nos RHLFs
O isolamento de bactérias selecionadas a partir de cultivos de enriquecimento é
importante, pois desta forma é possível avaliar o potencial de cada isolado na degradação do
composto de interesse, selecionar os mais eficientes e cultivá-los em laboratório. Esta seleção
permitirá montar um consórcio eficaz na degradação do PCE, eliminando microrganismos que
possam inibir o processo de degradação.
No In1 foram obtidos 14 isolados a partir do cultivo de enriquecimento, sendo 11 obtidos
em aerobiose e três em anaerobiose. No In2 foram obtidos 18 isolados, 14 em aerobiose e quatro
em anaerobiose.
3.6 Teste de crescimento com PCE como única fonte de carbono
Todos os isolados aeróbios do In1, com exceção do I6, apresentaram potencial de
crescimento em meio seletivo contendo apenas PCE como fonte de carbono. Os isolados
anaeróbios do In1 não apresentaram potencial de crescimento no meio seletivo.
84
Todos os isolados aeróbios do In2 foram positivos no crescimento em meio seletivo
contendo apenas PCE como fonte de carbono. Os isolados anaeróbios do In2 não apresentaram
potencial de crescimento no meio seletivo.
Isolados negativos foram removidos das análises subsequentes, onde foi feita a
diferenciação dos isolados a partir da técnica de BOX-PCR e posterior identificação pelo
sequenciamento do gene rRNA 16S.
3.7 BOX-PCR
A BOX-PCR tem sido utilizada com sucesso para a análise de populações bacterianas em
diversos ambientes, permitindo diferenciar genótipos, bem como realizar inferências de
variabilidade e similaridade genética (CAMBON-BONAVITA et al., 2001; GIRAFFA;
VECCHI; ROSSETTI, 1998; LAGACÉ et al., 2004; ROSS et al., 2000; ROY; SIROIS;
VINCENT, 2001). Sua principal vantagem está em ser uma metodologia simples, rápida e eficaz
para distinguir isolados e até mesmo estirpes relacionadas filogeneticamente (BRUIJN;
RADEMAKER; SCHENEIDER, 1996).
Os resultados da BOX-PCR indicaram a presença de quatro haplótipos diferentes no In1.
Os isolados I1, I4, I7, I8, I9 I10 e I11 apresentaram o mesmo padrão de bandas, enquanto I2, I3 e
I5 apresentaram padrões distintos dos demais (Figura 13 A e B). Dessa forma, foram
selecionados I2, I3, I5 e I8 para sequenciamento (Figura 14).
Para os isolados provenientes do In2, os padrões de bandas resultantes da BOX-PCR
indicaram a presença de sete haplótipos distintos. Os isolados I2, I7, I11 e I14 apresentaram o
mesmo padrão de bandas, da mesma forma que I6, I9 e I10 e I8, I12 e I13 (Figura 15 A e B). Os
isolados I1, I3, I4 e I5 apresentaram padrões distintos dos demais. Desse modo, foram
sequenciados os haplótipos I1, I2, I3, I4, I5, I6 e I8 (Figura 16).
85
Figura 13 - BOX-PCR para seleção dos isolados do In1. A - Perfis de bandeamento obtidos por BOX-PCR dos
isolados do In1, M - marcador molecular; os números indicam os isolados; B - Cluster gerado pela análise de agrupamento hierárquico do perfil de bandeamento da BOX-PCR
Figura 14 - Colônias dos isolados do In1 selecionados para sequenciamento
86
Figura 15 - BOX-PCR para seleção dos isolados do In2. A - Perfis da BOX-PCR dos isolados do In2, M - marcador
molecular; os números indicam os isolados; B - Cluster gerado pela análise de agrupamento hierárquico
do perfil de bandeamento da BOX-PCR
Figura 16 - Colônias dos isolados do In2 selecionados para sequenciamento
87
3.8 Identificação dos isolados por sequenciamento do gene rRNA 16S
Durante as duas últimas décadas foram isoladas diferentes bactérias de áreas
contaminadas com PCE a partir do cultivo de enriquecimento, as quais foram identificadas como
pertencentes aos gêneros Desulfomonile, Dehalobacter, Sulfurospirillum, Desulfitobacterium,
Desulfuromonas, Clostridium, Dehalobium e Geobacter (MAYMÓ-GATELL, et al., 1997;
SMIDT; DE VOS, 2004).
Dos isolados obtidos do In1, I2In1 apresentou similaridade com Burkholderia sp.
(Betaproteobacteria), I3In1 com Pseudomonas stutzeri (Gammaproteobacteria), o I5In1 com
Pseudomonas oryzihabitans (Gammaproteobacteria) e I8In1 com Stenotrophomonas maltophilia
(Gammaproteobacteria) (Figura 17).
Já entre os isolados do In2, I1In2 apresentou maior similaridade com
Microbacterium trichotecenenolyticum (Actinobacteria) I2In2 com
Stenotrophomonas maltophilia (Gammaproteobacteria), I3In2 com Klebsiella sp.
(Gammaproteobacteria), I4In2 com Exiguobacterium acetylicum (Firmicutes), I5In2 com
Pseudomonas oryzihabitans (Gammaproteobacteria), I6In2 com Acinetobacter junii
(Gammaproteobacteria) e I8In2 com Comamonas sp. (Betaproteobacteria) (Figura 17).
Entre os dois inóculos, apenas os isolados I5In1 e I5In2 foram classificados na mesma
UTO, sendo similares a Pseudomonas stutzeri.
Nenhum destes gêneros havia sido identificado em cultivos de enriquecimento com PCE,
indicando que além da presença de uma via oxidativa de degradação do PCE nos RHLFs, novos
grupos bacterianos podem estar envolvidos na degradação deste composto nos reatores. Apesar
disso, bactérias relacionadas aos isolados obtidos já foram detectadas em áreas contaminadas com
organoclorados, sendo algumas associadas a processos de oxidação do PCE, embora não tenham
sido isoladas de áreas contaminadas com o referido solvente.
Cabe ressaltar que representantes da classe Alphaproteobacteria, a qual foi a mais
abundante nas bibliotecas de clones do In1 e In2, não foram isolados a partir dos meios de cultivo
utilizados. É possível que bactérias não-cultiváveis possam também estar envolvidas na
degradação do PCE em nossos reatores.
88
Figura 17 - Similaridade entre os isolados do In1 e In2 e sequências depositadas no GenBank com base no sequenciamento do gene rRNA 16S de Bacteria, usando árvore neighbour-joining gerada a partir do parâmetro Kimura 2, apresentando a relação
entre os isolados obtidos do In1 (I2In1, I3In1, I5In1 e I8In1) e do In2 (I1In2, I2In2, I3In2, I4In2, I5In2, I6In2 E I8In2) e organismos referência. Os números dos nós são percentagens indicando os níveis de bootstrap suportados. Somente valores acima de 50% são apresentados. A barra representa 0,02 substituições por posição de nucleotídeo. Dados entre parênteses representam os números de acesso das sequências no GenBank. Os isolados obtidos estão destacados em negrito. Prochlorales cyanobacterium foi utilizado como outgroup
89
O gênero Burkholderia compreende mais de 60 espécies, isoladas de diferentes nichos
ecológicos, dentre os quais solo, rizosfera, água, plantas, fungos, animais, ambientes hospitalares
e infecções humanas (VIAL et al., 2011). Estudos em solos e águas subterrâneas têm
demonstrado o envolvimento de Burkholderia sp. na degradação de compostos clorados a partir
do isolamento deste grupo de locais contaminados e consequentes ensaios de degradação em
microcosmos (VOGT; ALFREIDER; LORBEER, 2004; YANG et al., 2006), sendo
B. vietnamiensis (previamente conhecida como Pseudomonas cepacia) a primeira bactéria isolada
capaz de mineralizar TCE em ensaios com células em suspensão (NELSON et al., 1986). Esta
eficiência de degradação do TCE também foi comprovada para B. cenocepacia G4 por co-
metabolismo, a partir do estímulo da enzima tolueno orto-monoxigenase (oMO) com tolueno ou
fenol (BARTH et al., 2002; SUBBALAXMI; SHREVE, 1999). Cepas mutantes de B. cepacia G4
têm sido desenvolvidas com o objetivo de eliminar a necessidade de estímulo com tolueno ou
fenol para ação de oMO na degradação do TCE (INGUVA; SHREVE, 1999).
O gênero Pseudomonas compreende 126 espécies com uma grande diversidade
metabólica, o que lhe confere habilidade de colonizar diferentes nichos (PAL; WAUTERS;
PAUL, 2007). P. stutzeri OX1 é a única bactéria citada em literatura com resultados capaz de
degradar PCE por via oxidativa, usando uma tolueno-o-xileno-monoxigenase (ToMO) (RYOO et
al., 2001). Uma característica importante é o estímulo da atividade desta enzima na presença de
PCE e TCE, não necessitando de enriquecimento com outras substâncias, como é o caso da ação
de oMO de B. cenocepacia G4 na degradação do TCE, que necessita de tolueno ou fenol para
estímulo da enzima, sendo que na ausência destes compostos não ocorre a degradação do TCE
(ARENGHI et al., 1999). Outra espécie, P. oryzihabitans (também conhecida como
Flavimonas oryzihabitans) também é eficiente na degradação de DDT e endosulfan, sendo o
inóculo obtido de grãos verdes de café (BARRAGÁN-HUERTA et al., 2007).
Outro gênero distribuido em diferentes compartimentos ambientais é
Stenotrophomonas sp., sendo frequentemente encontrado no solo, em associação simbiótica com
plantas, assim como em associação patogênica oportunista em humanos (HAUBEN et al., 1999).
Stenotrophomonas maltophilia tem sido utilizada em consórcios microbianos para degradação de
compostos caracterizados como disruptores endócrinos, dentre os quais PCE, TCE e TCA (LEE,
2008).
90
Os demais grupos bacterianos isolados não haviam sido detectados em áreas
contaminadas com PCE, bem como relacionados com a degradação deste contaminante. No
entanto, apresentam potencial de degradar diferentes compostos, como é o caso do gênero
Microbacterium, o qual está associado com a degradação, co-metabólica ou não, de BTEX
(CAVALCA; DELL’AMICO; ANDREONI, 2004), bem como de halogenados, como bifenilos
policlorados (PCBs) e clorofenóis (RYBKINA et al., 2003). Outro exemplo é o gênero
Exiguobacterium, que suporta condições ambientais extremas e está envolvido em processos de
degradação de hidrocarbonetos. E. acetylicum é capaz de promover a biorremoção de crômio
hexavalente de águas contaminadas com este elemento traço (OKEKE et al., 2008). O gênero
Klebsiella é caracterizado por sua capacidade de degradar moléculas como dibenzofurano e fenol
em condições aeróbias (ABD-EL-HALEEM et al., 2002). Já espécies do gênero Comamonas
podem degradar compostos clorados como bifenilpoliclorado (PCB) e cloronitrobenzeno (WU et
al., 2004). Acinetobacter está associado à degradação de compostos halogenados como
4-clorofenol e o herbicida atrazina, bem como bifenis e uma variedade de compostos aromáticos
mono, hetero e policíclicos (THANGARAJ; KAPLEY; PUROHIT, 2007).
Alguns trabalhos relatam a utilização de consórcios bacterianos, obtidos a partir do
isolamento de Pseudomonas sp., Acinetobacter sp. e Klebsiella sp. de águas subterrâneas
contaminadas com cDCE na África do Sul e Nigéria. Microcosmos com diferentes substratos
primários (glicose, sacarose, lactose, tolueno, fenol e extrato de levadura) foram avaliados na
degradação de cDCE por co-metabolismo, sendo os melhores resultados obtidos com a glucose,
com degradação de 85 % do cDCE em 7 dias. Os compostos formados não foram identificados
(OLANIRAN; PILLAY; PILLAY, 2004; OLANIRAN; PILLAY; PILLAY, 2005; OLANIRAN;
PILLAY; PILLAY, 2006).
Desta maneira, apesar da similaridade das sequências dos isolados obtidos com bactérias
caracterizadas na degradação de diferentes compostos, ensaios de degradação em RHLFs são
necessários para confirmar o potencial destes isolados na degradação do PCE, bem como
comprovar se os organismos selecionados mantêm a mesma eficiência de degradação do PCE dos
consórcios nos RHLFs.
91
3.9 Marcadores moleculares para monitoramento dos isolados nos RHLFs
Com o intuito de verificar a imobilização dos isolados no material suporte dos reatores,
bem como o comportamento destes durante o cultivo de enriquecimento, foram montados
marcadores a partir da PCR-DGGE dos isolados do In1 (IIn1) e dos In2 (IIn2). Pode-se observar
que pela DGGE foi obtida a mesma separação dos isolados obtida pela BOX-PCR, tanto dos
isolados do In1 quanto do In2 (Figura 18 e Figura 19).
Na DGGE, cada banda, teoricamente, corresponde a uma espécie, embora uma espécie
possa ter múltiplos genes rRNA 16S com pequenas diferenças nas sequências, o que pode gerar
diferentes bandas (FERRIS; WARD, 1997). Os isolados avaliados por PCR-DGGE, tanto do In1
quanto do In2, apresentaram baixa complexidade, sendo possível diferenciar os grupos de
isolados nos géis (Figura 18 e Figura 19).
No marcador obtido pela excisão das bandas de cada isolado do In1, foi possível
diferenciar os mesmos, pois pelo padrão de bandeamento não ocorreu a sobreposição de bandas
representativas dos isolados, o que permite monitorar os mesmos no RHLF com este marcador.
Já no marcador do In2 as bandas referentes aos I2In2 e I3In2 ficaram sobrepostas no gel,
impossibilitando a diferenciação destes isolados. Da mesma forma, as bandas do I4In2 e do I5In2
ficaram muito próximas no gel, dificultando a utilização deste marcador no monitoramento dos
isolados no RHLF (Figura 20).
Estes resultados mostram a dificuldade de utilizar a PCR-DGGE como ferramenta para
diferenciação de isolados, pois com o maior número de espécies aumentam as chances de
sobreposição de bandas. A técnica da PCR-DGGE baseia-se na amplificação, por PCR, de
fragmentos de fita dupla de DNA de mesmo tamanho. Embora do mesmo tamanho, a sequência
de nucleotídeos dos organismos avaliados é divergente (ROSADO; DUARTE, 2002). Na
separação das fitas de DNA no gradiente desnaturante, os fragmentos irão migrar
diferencialmente, de acordo com o seu teor de G+C, formando um padrão de bandeamento
distinto quando houver diferença (MUYZER; SMALLA, 1999). No entanto, fragmentos
diferentes podem ter características similares de mobilidade no gel, podendo apresentar o mesmo
teor de G+C em diferentes posições ao longo do fragmento de DNA (GELSOMINO et al., 1999).
Desta forma apenas o marcador confeccionado para os IIn1 foi utilizado para
monitoramento no RHLF.
92
Figura 18 - PCR-DGGE dos isolados do In1. A - Perfis de bandeamento obtidos por PCR-DGGE dos isolados do
In1, M - marcador molecular; os números indicam os isolados; B - Cluster gerado pela análise de
agrupamento hierárquico do perfil de bandeamento da PCR-DGGE
93
Figura 19 - PCR-DGGE dos isolados do In2. A - Perfis de bandeamento obtidos por PCR-DGGE dos isolados do
In2, M - marcador molecular; os números indicam os isolados; B - Cluster gerado pela análise de
agrupamento hierárquico do perfil de bandeamento da PCR-DGGE
94
Figura 20 - Marcadores moleculares dos isolados do In1 e In2 obtidos pela excisão das bandas de cada isolado dos
géis de DGGE. In1 - Marcador com os isolados do inóculo 1; In2 - Marcador com os isolados do inóculo
2. As identificações das bandas referem-se aos isolados dos referidos inóculos
3.10 Avaliação da eficiência dos isolados na degradação do PCE
3.10.1 Monitoramento dos isolados nos RHLFs
Pelo monitoramento dos IIn1 por PCR-DGGE, observou-se que após sete dias de
enriquecimento as bandas referentes a cada isolado poderam ser detectadas no gel, com a banda
referente ao I8In1 (S. maltophilia) mais intensa (Figura 21). S. maltophilia é caracterizada por ser
uma bactéria de aderência em superfícies abióticas, sendo foco de estudos por seu
desenvolvimento em cateteres, e por se tratar de uma bactéria oportunista, frequentemente
relacionada com patogenias em humanos (BONAVENTURA et al., 2004). Esta característica de
aderência pode ser importante para o estabelecimento do consórcio, pois o isolado similar a
S. maltophilia pode servir como base para a imobilização das demais bactérias na superfície das
espumas. Algumas bandas inespecíficas foram detectadas, indicando uma possível contaminação
no RHLF durante o acondicionamento das espumas.
Após 14 dias de incubação pode-se observar uma maior homogeneidade das bandas
(Figura 21), sugerindo maior abundância dos isolados após um maior tempo de incubação,
embora bandas referentes a alguns isolados ainda não demonstrem aumento na abundância,
95
caracterizando a necessidade de um período maior de incubação para homogeneização da
biomassa no reator com os IIn1. Após este período ainda podemos observar a presença de bandas
inespecíficas.
Aos 30 dias de enriquecimento uma maior homogeneidade nas três portas amostradas
pode ser observada (Figura 21), sugerindo a presença de todos os isolados com abundâncias
similares, o que caracteriza um consórcio bem estabelecido no suporte. Bandas inespecíficas não
foram observadas após 30 dias de incubação.
Estes resultados mostram que os isolados foram corretamente imobilizados e
acondicionados no RHLF, permitindo avaliar a eficiência do consórcio bacteriano do IIn1 e IIn2
na degradação do PCE.
Figura 21 - Monitoramento dos isolados do In1 em diferentes portas do RHLF por PCR-DGGE. P1, P2 e P3 são as
portas de coleta e os números subsequentes, 1, 2 e 3 referem-se aos tempos de coleta, 7, 14 e 30 dias de
enriquecimento
3.10.2 Ensaio de degradação aeróbia do PCE nos RHLFs
A partir da identificação dos compostos formados no RHLF durante a degradação do PCE
(TCA e TCM), isolamento e identificação de bactérias e monitoramento dos isolados por PCR-
DGGE nos RHLFs, novos ensaios de degradação foram conduzidos, visando quantificar cada um
dos compostos formados ao longo dos reatores, sendo estes experimentos realizados nos RHLFs
com In1 e In2, para confirmar a formação de TCA e TCM, e nos reatores contendo os isolados
obtidos do In1 (IIn1) e do In2 (IIn2) imobilizados.
A Purge & Trap é a metodologia padrão para extração de COVs de matrizes sólidas e
líquidas, sendo preconizada por agências regulatórias, incluindo United States Environmental
96
Protection Agency (USEPA), United States Department of Energy (USDOE) e United Sates
Department of Defense (USDOS). Apesar de não empregar os tradicionais solventes de alta
pureza das extrações convencionais, esta técnica é relativamente dispendiosa, devido ao alto
custo dos equipamentos e do gás He empregado para extrair os analitos da amostra. Desta forma,
uma opção que tem apresentado excelentes resultados é a SPME, a qual é uma técnica simples e
versátil (ARTHUR; PAWLISZYN, 1990) que envolve apenas quatro etapas: a extração, pré-
concentração, clean-up da amostra e introdução dos analitos no sistema de CG. Além da sua
simplicidade, outra característica importante é o fato de dispensar o uso de solvente orgânico, em
concordância com as políticas de controle e proteção ambiental (EISERT; LEVSEN, 1996).
Estudos foram realizados comparando-se a eficiência de extração de COVs por Purge &
Trap e extração por SPME através do headspace, combinadas a CG/EM, visando diferenciar
espécies e subespécies de fungos do gênero Penicillium (P. hirsutum var. albocoremium e var.
venetum, P. decumbens e P. discolor). Para as extrações por Purge & Trap, os voláteis gerados
nos meios de cultura foram arrastados por um fluxo de ar até cartuchos contendo Tenax com
posterior dessorção térmica diretamente na coluna. Nas extrações por SMPE foram testadas fibras
recobertas com polidimetilsiloxano e poliacrilato. Os resultados dos dois métodos testados foram
similares, sendo que a SPME se mostrou mais rápida e simples (NILSSON et al., 1996).
Em estudos com matrizes aquosas contaminadas com BTEX, foram comparadas as
metodologias de extração Purge & Trap, headspace estático e SPME. A repetibilidade,
reprodutibilidade e exatidão do método SPME foi similar às outras técnicas, sendo sua precisão
superior ao método headspace direto. A SPME teve boa linearidade e os limites de detecção
foram abaixo de 100 ng L-1
(FACCHETTI; FERRARI; NILSSON, 1997). Pelos bons resultados
obtidos neste e em outros estudos, a técnica de extração SPME tem sido utilizada na análise
química de alimentos, de amostras ambientais e na medicina.
Desta maneira, a partir da técnica de extração por SPME e análise por CG/EM, os ensaios
de degradação do PCE em RHLF comprovaram a degradação deste contaminante em todos os
reatores analisados, com exceção dos controles (Figura 22). Os valores absolutos dos ensaios de
degradação do PCE nos RHLFs podem sem observados no Anexo D. Os controles totalizaram
uma perda de 7,5 % de PCE nos RHLFs, considerada baixa por se tratar de uma molécula
extremamente volátil. A eficiência de degradação do PCE nos diferentes RHLFs foi alta,
97
destacando-se a maior eficiência dos IIn1 (92 %) e dos IIn2 (92 %), quando comparados com In1
(82 %) e In2 (88 %).
Estes resultados comprovam que os isolados obtidos são ativos na degradação do PCE,
além de serem de fácil cultivo, o que viabiliza a maior produção de biomassa, aumentando a
eficiência de degradação do PCE. Contrariamente aos resultados dos inóculos dos PMs (In1 e
In2), onde In2 mostrou uma maior eficiência na degradação do PCE, não houve diferença de
eficiência entre os IIn1 e os IIn2. Esses resultados são importantes, pois mostram a eficiência de
bactérias que ainda não haviam sido relacionadas com a degradação de PCE.
As análises dos PFQs nos diferentes RHLFs mostraram valores semelhantes aos obtidos
nas análises anteriores, ou seja, valores de Eh entre 530 mV e 650 mV e OD entre 8 mg L-1
e
9,5 mg L-1
elevados, caracterizando um ambiente óxico e comprovando que a degradação do PCE
ocorreu em aerobiose.
Em todos os RHLFs avaliados foi confirmada a formação de TCA e TCM ao longo dos
reatores (Figura 23). Os resultados são expressos em percentual de carbono, em relação do total
de carbono inicial do PCE. Este cálculo foi possível, pois o PCE foi a única fonte de carbono
presente nos reatores. No In1, 26 % do carbono total estava na forma de TCM e 6% na forma de
TCA, no In2, 40 % na forma de TCM e 10% na forma de TCA, no IIn1, 28 % na forma de TCM
e 10% na forma de TCA, no In2, 40 % na forma de TCM e 15% na forma de TCA. No total de
C-PCE adicionado inicialmente nos reatores, cerca de 40 % do carbono inicial do In1, 58 % do
In2, 46 % do IIn1 e 63 % do IIn2 foi detectado na forma de TCM e TCA. O restante do C-PCE
foi possivelmente mineralizado a CO2.
O acúmulo de TCA e TCM não havia sido relacionado com a degradação do PCE, tanto
que a presença de TCM é indesejada em ensaios de degradação anaeróbia, pois inibe a via de
descloração redutiva do PCE, bem como de diferentes cloroetenos (BAGLEY; GOSSET, 1995;
MAYMÓ-GATELL; NIJENHUIS; ZINDER, 2001). Em estudos com consórcio microbiano, uma
concentração de 1 mg L-1
de TCM levou à inibição completa da via de descloração redutiva,
sendo também um limitante em ensaios de degradação do PCE por Dehalococcoides ethenogenes
e Dehalospirillum multivorans (MAYMÓ-GATELL; NIJENHUIS; ZINDER, 2001;
NEUMANN; WOHLFARTH; DIEKERT, 1996).
Um ponto importante na aplicabilidade da degradação aeróbia do PCE é o fato de TCM
ser frequentemente detectado em áreas contaminadas com PCE, o que restringe a eficiência da
98
descloração redutiva, além da dificuldade de gerar anaerobiose nestes ambientes. A presença de
TCM em áreas contaminadas com PCE pode ser um indicativo de degradação aeróbia deste
contaminante, a qual pode ser estimulada em estudos de biorremediação in situ.
99
Figura 22 - Ensaios de degradação do PCE em RHLFs. In1 - RHLF com inóculo do PM1; In2 - RHLF com inóculo do PM2; IIn1 - RHLF com os isolados do In1; IIn2 - RHLF com os isolados do In2; C1 - RHLF sem espuma e sem inóculo; C2 - RHLF com espuma mas sem inóculo
100
Figura 23 – Quantificação, em percentual de carbono, dos compostos da via de degradação aeróbia do PCE nos RHLFs. In1 - RHLF com inóculo do PM1; In2 -
RHLF com inóculo do PM2; IIn1 - RHLF com isolados do In1; IIn2 - RHLF com os isolados do In2
101
3.10.3 Ensaio de degradação do PCE com células em suspensão
A partir da confirmação da degradação do PCE nos reatores contendos os IIn1 e os IIn2,
outros ensaios foram conduzidos para avaliar a eficiência de cada isolado na degradação do PCE.
Os IIn1 não tiveram eficiência na degradação do PCE quando utilizados separadamente, sendo
que avaliados conjuntamente, a eficiência de degradação do PCE foi de 56 % (Figura 24). Estes
resultados são frequentes em estudos de degradação de diferentes compostos, pois consórcios
bacterianos apresentam uma maior diversidade de enzimas e vias metabólicas, aumentando a
eficiência de degradação (SUYAMA et al., 2002).
Os IIn2 foram mais eficientes do que os IIn1 na degradação do PCE com células em
suspensão, mas a eficiência de modo geral foi baixa (10 % em média), com excessão do I8
(Comamonas sp.), o qual teve uma eficiência de 68 %, enquanto o consórcio apresentou 76 % de
eficiência (Figura 25). Dos estudos de degradação do PCE realizados com bactérias até o
momento, apenas Dehalococcoides ethenogenes apresentou a capacidade de degradar PCE com
formação de compostos não-tóxicos (ETE). Os valores absolutos dos ensaios de degradação do
PCE com células em suspensão podem ser observados no Anexo E.
Diferentes isolados apresentam potencial de degradação do PCE, via descloração redutiva,
como é o caso de Dehalospirillum multivorans, Sporomusa ovata, Dehalobacter restrictus e
Desulfitobacterium sp., mas acumulam cDCE e CV (NEUMANN, A., WOHLFARTH, G.,
DIEKERT, 1996; TERZENBACH; BLAUT, 1994; WILD; HERMANN; LEISINGER, 1996),
enquanto D. ethenogenes acumula ETE (MAYMÓ-GATELL et al., 1997). Já P. stutzeri não
forma nenhum destes compostos por utilizar uma via oxidativa mediada por ToMO. No entanto,
os produtos da via não são conhecidos, pois as análises de degradação do PCE foram feitas pela
quantificação de íons cloreto (RYOO et al., 2000).
Comparativamente, a eficiência de degradação do PCE do consórcio dos IIn1 e dos IIn2
com suspensão em frascos foi menor do que no RHLF (92 %), sugerindo que a degradação é
mais eficiente na presença de biofilmes. Desta forma, pela eficiência do I8In2 em suspensão na
degradação do PCE, o mesmo ensaio foi conduzido em RHLF, com quantificação do PCE, TCA
e TCM, para confirmar se a via de degradação do PCE do I8In2 é a mesma dos consórcios IIn1 e
IIn2.
102
Nos ensaios com células em suspensão, os valores de Eh (entre 520 mV e 680 mV), OD
(entre 7,5 mg L-1
e 9,8 mg L-1
), CE (entre 1987 µS cm-1
e 2200 µS cm-1
) e pH (entre 3,3 e 3,8),
foram semelhantes ao obtidos nos demais experimentos.
Figura 24 - Ensaio de degradação do PCE com células em suspensão dos IIn1. IIn1 - frasco com os isolados do In1;
C- - frasco controle com meio, mas sem inóculo; as demais colunas representam os isolados; T0 - tempo
zero; T24 - 24 horas de incubação
Figura 25 - Ensaio de degradação do PCE com células em suspensão dos IIn2. IIn2 - frasco com os isolados do In2;
C- - frasco controle com meio, mas sem inóculo; as demais colunas representam os isolados; T0 - tempo
zero; T24 - 24 horas de incubação
103
3.10.4 Avaliação do I8In2 na degradação do PCE em RHLF
Confirmando a maior eficiência de degradação do PCE do IIn1 e IIn2 nos RHLFs, o
experimento com I8In2 também apresentou o mesmo resultado, com uma eficiência de
degradação do PCE de 77 %, sendo que do total de carbono, 54 % foi transformado em TCM e
6 % em TCA (Figura 26), enquanto com células em suspensão a eficiência de degradação do PCE
foi de 68 %. Estes resultados mostram que o isolado I8In2 (Comamonas sp.) é altamente eficiente
na degradação do PCE em condições aeróbias (OD 8,5 mg L-1
e Eh 600 mV).
Figura 26 – Avaliação, em percentual de carbono, da eficiência do I8In2 na degradação do PCE
Este é o primeiro relato da capacidade de Comamonas sp. em degradar PCE. Pesquisas
com C. testosteroni, bactéria mais similar ao I8In2, têm evidenciado a ação de monoxigenases na
degradação de compostos clorados e hidrocarbonetos aromáticos (BEILEN et al., 2003;
LOCHER; LEISINGER; COOK, 1991). A potencialidade de degradação do PCE pela ação de
monoxigenases está relacionada com a degradação aeróbia de clorotrifluoroetileno, pois a
mineralização deste composto foi obtida a partir da ação de pMMo solúvel, purificada de
Methylosinus trichosporium OB3b. Uma vez que o flúor é mais eletronegativo e mais ligado do
104
que o cloro, clorotrifluoroetileno, teoricamente, deve ser mais difícil de ser oxidado do que o
PCE. Portanto, é razoável sugerir que monoxigenases possam estar envolvidas na degradação do
PCE (ENSLEY, 1991; McCARTY, 1997; FOX et al., 1990).
Com base nos resultados confirmatórios de degradação aeróbia do PCE nos RHLFs e
possível envolvimento de monoxigenases, ensaios subsequentes utilizando-se um inibidor de
monoxigenases foram conduzidos.
3.10.5 Teste de degradação do PCE na presença de inibidor de monoxigenases
Por alguns anos o PCE foi considerado como não biodegradável na presença de oxigênio.
Mas a degradação aeróbia foi reportada em estudos com P. stutzeri OX1, envolvendo ToMO
(RYOO et al., 2000; SHIM et al., 2001). Esta constatação, como já foi citado anteriormente,
baseou-se na quantificação de íons cloreto, não sendo identificados os produtos da degradação do
PCE. Outros pesquisadores observaram a degradação do PCE em condições aeróbias, mas
sugerem que microssítios anaeróbios promoveram a descloração redutiva do PCE (ENZIEN et
al., 1994).
Alguns fungos são capazes de degradar lignina utilizando sistemas enzimáticos não
específicos como lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacase. Estas enzimas utilizam
radicais livres para catalisar a degradação de diferentes poluentes aromáticos (KAMEI; KONDO,
2005; YADAV et al., 1995). No entanto, estudos subsequentes têm demonstrado que o
mecanismo de degradação de alguns poluentes não está relacionado com a produção destas
enzimas, mas sim com oxigenases alternativas, particularmente monoxigenases do tipo citocromo
P-450 (DODDAPANENI; YADAV, 2004; SUTHERLAND et al., 1991).
As enzimas do complexo citocromo P-450 constituem uma heterogênea classe de
hemeproteínas que reduzem o oxigênio molecular para uma espécie coordenada ao Fe que é
prontamente inserida em substratos moleculares. A constatação de que determinados substratos
ao longo do tempo perturbam a biossíntese do grupo heme, reduzindo o nível hepático de
citocromo P-450 em roedores, resultou na descoberta de que citocromo P-450 é inativado durante
o dobramento de olefinas terminais, acetilenos e alenos. O primeiro composto avaliado com
atividade inibitória de citocromo P-450 foi 1-aminobenzotriazole (ABT) (MONTELLANO;
105
MATHEWS; LANGRY, 1984; WADA et al., 1968), o qual foi utilizado nos ensaios de
degradação do PCE nos RHLFs.
Os resultados mostraram que nos três RHLFs avaliados, IIn1 (Figura 27), IIn2 (Figura 28)
e I8In2 (Figura 29), ABT inibiu a degradação do PCE, confirmando que a degradação do PCE
nos RHLFs, a partir dos inóculos obtidos de uma área contaminada com PCE, bem como o
isolado similar com Comamonas sp., ocorre aerobicamente, mediada por monoxigenases e com a
formação de TCA e TCM.
As análises dos PFQs nos diferentes RHLFs mostraram valores semelhantes aos obtidos
nas análises anteriores, ou seja, valores de Eh (entre 542 mV e 638 mV) e OD (entre 7,6 mg L-1
e
9,2 mg L-1) elevados, comprovando a via aeróbia de degradação do PCE, com CE entre
1987 µS cm-1
e 2200 µS cm-1
e pH entre 3,3 e 3,8 nos RHLFs sem ABT. Nos ensaios com
inibidor, os valores de Eh (entre 510 mV e 630 mV) e OD (entre 5,0 mg L-1
e 8,0 mg L-1) foram
semelhantes aos do reator sem inibidor, bem como CE (1128 µS cm-1
e 2012 µS cm-1
) e pH entre
3,3 e 3,6.
Os valores absolutos dos ensaios de degradação do PCE nos RHLFs com inibidor de
monoxigenases podem sem observados no Anexo G.
Figura 27 – Ensaio de inibição da via de monoxigenases na degradação do PCE no I8In2 pela adição de 1-
aminobenzotriazole (ABT)
106
Figura 28 - Ensaio de inibição da via de monoxigenases na degradação do PCE no IIn1 pela adição de
1-aminobenzotriazole (ABT)
Figura 29 - Ensaio de inibição da via de monoxigenases na degradação do PCE no IIn2 pela adição de 1-
aminobenzotriazole (ABT)
107
Este é o primeiro estudo que descreve a degradação aeróbia bacteriana de PCE, via
monoxigenases, e quantifica os compostos formados durante o processo. Resultados semelhantes
foram obtidos em estudos com Trametes versicolor, um cogumelo poliporo encontrado em todo o
mundo, onde o PCE foi degradado formando cloreto de acetil tricloro o qual foi rapidamente
hidrolisado (abioticamente) formando ácido tricloroacético, via já descrita em plantas e animais,
sendo também inibida em experimentos com ABT (MARCO-URREA et al., 2006).
Comparando a eficiência de degradação em diferentes trabalhos, Methanosarcina sp. e
Acetobacterium woodii, em ensaios com microcosmos, degradaram 98 % do PCE (concentração
inicial de 5000 µg L-1
), após 8000 horas, com acúmulo de ETE (FETZNER, 1998), enquanto
microcosmos contendo Sulfurospirillum multivorans e Dehalococcoides ethenogenes degradaram
a mesma concentração inicial de PCE em 4 horas, com acúmulo de CV e ETE após 800 horas de
dehalorespiração, com uma eficiência de 96 % (MAYMÓ-GATELL et al., 1997). T. versicolor
degradou 50 % do PCE após nove dias de incubação em frascos, com uma concentração inicial
de 375 µg L-1
(MARCO-URREA et al., 2006). Em nossos experimentos de degradação, 90 % do
PCE no reator do IIn1, 91 % no IIn2 e 77 % no I8In2 foi degradado após um tempo de retenção
de 12 horas nos RHLFs, com uma concentração inicial de 5000 µg L-1
, com acúmulo de TCA e
TCM.
Desta forma, com este trabalho obtivemos dois consórcios bacterianos, bem como um
isolado similar a Comamonas, com alta eficiência na degradação do PCE, os quais por ação de
monoxigenases degradam PCE a compostos menos tóxicos (TCA e TCM) e de mais fácil
biodegradação do que os intermediários da via de descloração redutiva. Essas bactérias poderiam
ser usadas em reatores de grandes volumes para a remediação de água subterrânea contaminada
com PCE, como alternativa aos métodos físico-químicos tradicionalmente usados.
108
109
CONCLUSÕES
A análise da estrutura das comunidades bacterianas mostrou a seleção de bactérias no In1
e a manutenção da estrutura da comunidade no In2, após cultivo de enriquecimento de nove
meses.
Alphaproteobacteria foi à classe predominante nos RHLFs após cultivo de
enriquecimento.
Os ensaios de degradação do PCE em RHLFs, com In1 e In2, apresentaram alta eficiência
de degradação do PCE, mas não foram detectados os intermediários da via de descloração
redutiva no In1, sendo detectados TCE e cDCE no In2, embora em baixas concentrações.
A varredura de COVs do In1 e In2 permitiu detectar a formação de TCM e TCA durante a
degradação do PCE.
Em todos os ensaios realizados, a eficiência de degradação do PCE foi superior a 90 %,
com tempo de retenção de 12 horas, em condições óxicas.
Dos isolados avaliados na degradação do PCE, I8In2, similar a Comamonas sp., foi o
mais eficiente, degradando 77 % do PCE em 12 horas.
Os testes de inibição com ABT confirmaram que a degradação do PCE é mediada pela
ação de monoxigenases.
Este é o primeiro trabalho que descreve a degradação aeróbia de PCE por bactérias,
mediada por monoxigenases, com produção de TCM e TCA como intermediários dessa via de
degradação.
110
111
REFERÊNCIAS
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136
137
APÊNDICES
138
APÊNDICE A - Detalhes da coluna capilar RTX-VMS
139
APÊNDICE B - Valores orientadores de PCE, TCE, DCE, CV, TCA e TCM para solo e água subterrânea no estado
de São Paulo (SÃO PAULO, 2011)
Substância CAS nº
Solo
(mg kg-1
de peso seco)1
Água subterrânea
(µg L-1
)
Prevenção Intervenção
Intervenção Agrícola Residencial Industrial
Tetracloroeteno 127-18-4 0,054 4 5 13 40
Tricloroeteno 79-01-6 0,0078 7 7 22 70
cis-1,2-Dicloroeteno 156-59-2 - 1,5 2,5 4 50
Cloreto de vinila 75-01-4 0,003 0,005 0,003 0,008 5
1,1,1-Tricloroetano 71-55-6 - 11 11 25 280
Clorofórmio 67-66-3 1,75 3,5 5 8,5 200 1 Procedimentos analíticos devem seguir SW-846, com metodologias de extração de inorgânicos 3050b ou 3051
ou procedimento equivalente.
140
141
ANEXOS
142
ANEXO A - Curvas dos padrões internos evidenciando a faixa de linearidade do detector. A - PCE; B - TCA;
C - TCM
143
ANEXO B - Varredura de COVs do In1
144
ANEXO C - Varredura de COVs do In2
145
ANEXO D - Valores absolutos dos compostos detectados no ensaio de degradação do PCE em diferentes RHLFs
Amostra Repetição
0 2 6 10 14 18 20
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - L/D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -µg L-1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
1 4838 < 10 < 5 3025 < 10 < 5 2038 < 10 83 1963 < 10 258 1598 37 1287 1058 210 1987 589 354 2001
In1 2 7025 < 10 < 5 3265 < 10 < 5 2189 < 10 98 1789 < 10 267 1463 69 1156 1039 197 2032 547 267 2105
3 5687 < 10 < 5 3284 < 10 < 5 2182 < 10 102 1657 < 10 233 1389 54 1247 985 243 1953 624 287 2251
1 5897 < 10 < 5 4701 < 10 < 5 2039 < 10 169 1420 54 387 389 189 1687 320 314 2384 204 428 3211
In2 2 5397 < 10 < 5 3800 < 10 < 5 3247 < 10 147 1389 67 369 412 147 1548 283 248 2148 214 469 3187
3 5413 < 10 < 5 3721 < 10 < 5 2198 < 10 138 1217 42 428 458 163 1124 279 310 2143 197 478 3089
1 7183 < 10 < 5 3222 < 10 22 321 < 10 145 116 35 320 55 154 1430 20 320 2150 23 520 2225
IIn1 2 4815 < 10 < 5 3034 < 10 29 681 < 10 168 257 39 348 89 126 1329 48 348 2121 34 480 2300
3 5931 < 10 < 5 3021 < 10 32 1255 < 10 179 441 46 380 137 113 1568 54 356 2098 29 430 2450
1 6001 < 10 < 5 4701 < 10 120 513 49 310 165 123 543 69 329 1800 37 480 2500 30 689 3430
IIn2 2 5488 < 10 < 5 3800 < 10 130 1245 38 328 427 145 578 153 315 1729 72 350 2235 53 693 3300
3 5749 < 10 < 5 3721 < 10 142 1540 57 347 609 195 625 233 389 1323 120 468 2245 57 673 3210
1 4680 < 10 < 5 4670 < 10 < 5 4675 < 10 < 5 4580 < 10 < 5 4574 < 10 < 5 4520 < 10 < 5 4500 < 10 < 5
C1 2 4580 < 10 < 5 4500 < 10 < 5 4480 < 10 < 5 4476 < 10 < 5 4468 < 10 < 5 4448 < 10 < 5 4440 < 10 < 5
3 4321 < 10 < 5 4300 < 10 < 5 4310 < 10 < 5 4305 < 10 < 5 4298 < 10 < 5 4286 < 10 < 5 4285 < 10 < 5
1 4930 < 10 < 5 4931 < 10 < 5 4854 < 10 < 5 4732 < 10 < 5 4530 < 10 < 5 4428 < 10 < 5 4130 < 10 < 5
C2 2 4060 < 10 < 5 4058 < 10 < 5 4038 < 10 < 5 4024 < 10 < 5 4013 < 10 < 5 3831 < 10 < 5 3900 < 10 < 5
3 4122 < 10 < 5 4110 < 10 < 5 4103 < 10 < 5 4094 < 10 < 5 4080 < 10 < 5 4028 < 10 < 5 4025 < 10 < 5
146
ANEXO E - Valores absolutos dos compostos detectados no ensaio de degradação do PCE em frascos
Amostra Repetição Tempo 0 (horas) Tempo 24 (horas)
PCE (µg L-1)
I2In1
1 6124 5614
2 4678 4234
3 5110 4525
I3In1
1 6124 5547
2 4678 4184
3 5110 4470
I5In1
1 6124 5641
2 4678 4260
3 5110 4698
I8In1
1 6124 5547
2 4678 4193
3 5110 4758
In1
1 6124 2370
2 4678 1685
3 5110 2400
C-*
1 6124 5410
2 4678 4234
3 5110 4214
I1In2
1 4913 3952
2 5016 3623
3 5016 3664
I2In2
1 4913 3674
2 5016 3100
3 5016 3519
I3In2
1 4913 3416
2 5016 3247
3 5016 3454
I4In2
1 4913 3560
2 5016 3450
3 5016 3500
I5In2
1 4913 3554
2 5016 3366 3 5016 3474
I6In2
1 4913 3529
2 5016 3445
3 5016 3479
I8In2
1 4913 1579
2 5016 1583
3 5016 1548
In2
1 4913 866
2 5016 671
3 5016 685
C-
1 4913 4605
2 5016 4552 3 5016 4523
*Controle negativo - frasco com MM+PCE
147
ANEXO F - Valores absolutos dos compostos detectados no ensaio de degradação do PCE com o I8In2 em RHLF
Amostra Repetição
0 2 6 10 14 18 20
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - L/D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -µg L-1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
1 7084 < 10 < 5 3354 < 10 38 2250 44 139 1647 101 349 1543 289 1320 1056 330 2000 867 532 2500
I8n2 2 4987 < 10 < 5 3058 < 10 45 2390 38 132 1598 93 312 1493 223 1202 1278 329 2101 853 529 2620
3 5856 < 10 < 5 3033 < 10 52 2489 32 158 1897 94 367 1402 242 1240 1340 371 2032 897 510 2430
148
ANEXO G - Valores absolutos dos compostos detectados no ensaio de degradação do PCE em diferentes RHLFs com inibição da via de monoxigenases
Amostra Repetição
0 2 6 10 14 18 20
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - L/D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM PCE TCA TCM
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -µg L-1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
1 7183 < 10 < 5 3222 < 10 22 321 < 10 145 116 35 320 55 154 1430 20 320 2150 23 520 2225
IIn1_ABT- 2 4815 < 10 < 5 3034 < 10 29 681 < 10 168 257 39 348 89 126 1329 48 348 2121 34 480 2300
3 5931 < 10 < 5 3021 < 10 32 1255 < 10 179 441 46 380 137 113 1568 54 356 2098 29 430 2450
1 5632 < 10 < 5 5547 < 10 < 5 5187 < 10 < 5 5097 < 10 < 5 5095 < 10 < 5 5048 < 10 < 5 5037 < 10 < 5
IIn1_ABT+ 2 5547 < 10 < 5 5489 < 10 < 5 5153 < 10 < 5 5069 < 10 < 5 5037 < 10 < 5 5012 < 10 < 5 4987 < 10 < 5
3 5698 < 10 < 5 5641 < 10 < 5 5487 < 10 < 5 5347 < 10 < 5 5279 < 10 < 5 5159 < 10 < 5 5098 < 10 < 5
1 6001 < 10 < 5 4701 < 10 120 513 49 310 165 123 543 69 329 1800 37 480 2500 30 689 3430
IIn2_ABT- 2 5488 < 10 < 5 3800 < 10 130 1245 38 328 427 145 578 153 315 1729 72 350 2235 53 693 3300
3 5749 < 10 < 5 3721 < 10 142 1540 57 347 609 195 625 233 389 1323 120 468 2245 57 673 3210
1 6025 < 10 < 5 5879 < 10 < 5 5712 < 10 < 5 5647 < 10 < 5 5589 < 10 < 5 5547 < 10 < 5 5540 < 10 < 5
IIn2_ABT+ 2 5741 < 10 < 5 5632 < 10 < 5 5478 < 10 < 5 5389 < 10 < 5 5347 < 10 < 5 5243 < 10 < 5 5201 < 10 < 5
3 5268 < 10 < 5 5178 < 10 < 5 5047 < 10 < 5 5098 < 10 < 5 5018 < 10 < 5 4968 < 10 < 5 4936 < 10 < 5
1 7084 < 10 < 5 3354 < 10 38 2250 44 139 1647 101 349 1543 289 1320 1056 330 2000 867 532 2500
I8In2_ABT- 2 4987 < 10 < 5 3058 < 10 45 2390 38 132 1598 93 312 1493 223 1202 1278 329 2101 853 529 2620
3 5856 < 10 < 5 3033 < 10 52 2489 32 158 1897 94 367 1402 242 1240 1340 371 2032 897 510 2430
1 5897 < 10 < 5 4701 < 10 < 5 4854 < 10 < 5 4732 < 10 < 5 4687 < 10 < 5 4598 < 10 < 5 4586 < 10 < 5
I8In2_ABT+ 2 4890 < 10 < 5 4868 < 10 < 5 4765 < 10 < 5 4762 < 10 < 5 4698 < 10 < 5 4631 < 10 < 5 4529 < 10 < 5
3 4815 < 10 < 5 4789 < 10 < 5 4852 < 10 < 5 4781 < 10 < 5 4700 < 10 < 5 4638 < 10 < 5 4575 < 10 < 5
