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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
EZEQUIEL MARCELINO DA SILVA
Biodegradação de resíduo de eucalipto por linhagens de Lentinula edodes: Influência da
adição de farelo de cereais na produção de enzimas e na eficiência biológica
Lorena – SP
2007
EZEQUIEL MARCELINO DA SILVA
Biodegradação de resíduo de eucalipto por linhagens de Lentinula edodes: Influência da
adição de farelo de cereais na produção de enzimas e na eficiência biológica
Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Microbiologia Aplicada Orientadora: Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres
Lorena – SP 2007
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Catalogação na Publicação
Biblioteca Universitária Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
Silva, Ezequiel Marcelino da
Biodegradação de resíduo de eucalipto por linhagens de Lentinula edodes: influência da adição de farelo de cereais na produção de enzimas e na eficiência biológica / Ezequiel Marcelino da Silva; orientadora Adriane Maria Ferreira Milagres. -- 2007
93 f.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Microbiologia Aplicada) – Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
1. Biotecnologia 2. Lentinula edodes 3. Resíduo de eucalipto 4. Enzimas lignocelulolíticas 5. Farelo de cereais 6. Eficiência biológica 7. Proteínas. I. Título. 574.6 - CDU
AGRADECIMENTOS
O autor agradece com sinceridade:
À orientadora desta tese de doutorado, Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres, por
dispensar dedicada orientação durante as atividades de pesquisa em laboratório e
principalmente no auxílio à revisão crítica desta obra.
Aos alunos de graduação e pós-graduação, Michel Brienzo, Stella Forganes, Pérola
Magalhães, Joseana Rocha e Valdeir Arantes, pela amizade e auxílio em várias atividades de
pesquisa dentro do Grupo de Microbiologia e Bioquímica.
Aos técnicos de laboratório, Djalma Alves Primo, Jussara, Paulo, José Moreira e José
Carlos, que sempre mostraram disponibilidade em ajudar a resolver problemas técnicos
necessários para o bom andamento desta pesquisa.
Aos doutores do Departamento de Biotecnologia, Adriane Milagres, André Ferraz,
Maria das Graças, Inês Roberto, Maria Eleonora, Maria Bernadete de Medeiros e Adilson
Gonçalves, pelos esclarecimentos sobre biotecnologia, necessários à compreensão
aprofundada na área de microbiologia aplicada.
RESUMO
SILVA, E. M. Biodegradação de resíduo de eucalipto por linhagens de Lentinula edodes: Influência da adição de farelo de cereais na produção de enzimas e na eficiência biológica. 2007. 93f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial). Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo. A exploração das florestas de eucalipto pelas indústrias papeleiras gera um volume de resíduo constituído por folhas, galhos e casca. Como alternativa, a bioconversão deste resíduo permite reduzir o impacto ambiental. O cultivo de Lentinula edodes (Berkeley) Pegler utilizando este material lignocelulósico minimiza a poluição além de formar produtos de interesse comercial e industrial, como obtenção de enzimas e cogumelos comestíveis com alto valor nutricional. Para este propósito, resíduo de eucalipto foi empregado neste estudo para se analisar a produção de enzimas extracelulares responsáveis pela degradação de compostos lignocelulósicos e produção de cogumelos por duas linhagens de L. edodes. Sendo assim, meios de cultivo constituído por resíduo de eucalipto moído, suplementado com farelo de arroz ou soja a 10 e 20%, com umidade de 65% foram inoculados com micélio das linhagens desenvolvido em grãos de cevada. O crescimento da biomassa fúngica, consumo de matéria orgânica, efeito de pH e as atividades de enzimas hidrolíticas (xilanase, β-xilosidase, β-glicosidase, e endo-glicanase) e oxidativas (lacase e Mn-peroxidase) foram investigadas durante 30, 45, 60, 75 e 90 dias, compreendendo a fase vegetativa das linhagens. No final desta fase, as linhagens foram induzidas a frutificação para se determinar eficiência biológica e conteúdo de proteínas dos basidiomas produzidos pelas linhagens em diferentes composições dos substratos. Durante a fase vegetativa, foram observadas variações na produção de enzimas hidrolíticas e oxidativas pelas duas linhagens quando o resíduo de eucalipto foi suplementado com diferentes concentrações de farelo de cereais. Concentração mais elevada de farelo de soja aumentou a produtividade das enzimas hidrolíticas, mas as enzimas oxidativas foram produzidas em níveis mais baixos, principalmente Mn-peroxidase. Resíduo de eucalipto suplementado com farelo de arroz favoreceu a produção de enzimas hidrolíticas sem causar repressão na produtividade de enzimas oxidativas. A produção destas enzimas foi acompanhada com a redução de pH dos meios de cultivos durante todo o período investigado. O consumo de matéria orgânica chegou próximo a 50% pelas duas linhagens no final da fase vegetativa. A frutificação ocorreu apenas com a linhagem SJC cultivada em diferentes substratos, com exceção da adição de farelo de soja a 20%. Esta linhagem apresentou eficiência biológica variável, atingindo um máximo de 67% em um único ciclo de produção em resíduo suplementado com 10% de farelo de arroz. Verificou-se diferença significativa no teor de proteína dos basidiomas cultivados em diferentes substratos, variando de 17,3 a 22,7%. Como método alternativo à esterilização do substrato por autoclavagem, verificou-se a possibilidade do uso de peróxido de hidrogênio como agente de descontaminação. Por comparação dos dois métodos, investigou-se a produção de enzimas, efeito de pH e consumo de matéria orgânica das duas linhagens cultivadas em resíduo de eucalipto suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz. Utilizando-se peróxido de hidrogênicio verificou-se maior produção de biomassa e enzimas para a linhagem SJC, mas o consumo de matéria orgânica não aumentou para nenhuma das linhagens.
Palavras-chave: Lentinula edodes, Resíduo de eucalipto, Enzimas lignocelulolíticas, Farelo de
cereais, Eficiência biológica, Proteínas.
ABSTRACT SILVA, E. M. Biodegradation of eucalyptus residue by Lentinula edodes strains: Influence of cereal bran addition on enzymes production and biological yield. 2007. 93p. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnolgoy), Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, São Paulo. The exploration of eucalyptus forests by pulp industries generates large quantities of residues constituted of leaves, branches and bark. Alternatively, bioconversion of this residue allows reducing the environmental impact. The cultivation of Lentinula edodes (Berkeley) Pegler using this lignocellulosic material minimize pollution besides forming products of industrial and commercial interest, such as enzymes and edible mushrooms with high nutritional values. To this purpose, eucalyptus residue was employed in this study to analyze the production of extracellular enzymes responsible for the degradation of lignocellulosics and production of mushrooms by two strains of L. edodes. In this matter, cultivation media constituted of milled eucalyptus residue supplemented with 10 and 20% rice bran or soy bran, with 65% moisture were inoculated with mycelium grown on soybeans. Fungal growth, consume of organic matter, effect of pH and the hydrolytic (xylanase, β-xylosidase, β-glucosidase, e endo-glucanase) and oxidative (laccase e Mn-peroxidase) activities were investigated during 30, 45, 60, 75 e 90 days, regarding the vegetative phase. At the end of this phase, the strains were induced to fructification to determine the biological yield and the protein content of the basidiomes produced under different substrate compositions. During the vegetative phase, it was observed variations on production of hydrolytic and oxidative enzymes by both strains when the eucalyptus residue was supplemented with different concentrations of cereal bran. Higher concentration of soy bran increased hydrolytic enzymes yield, but the oxidative enzymes were produced at lower levels, especially Mn-peroxidase. Eucalyptus residue supplemented with rice bran favored the production of hydrolytic enzymes without causing repression of oxidative enzymes yield. The production of these enzymes was followed by reduction of pH of the media during all cultivation period investigated. Consume of organic matter reached about 50% by both strains at the end of the cultivation period. Fructification occurred only with the SJC strain cultivated in different substrates, except when 20% soy bran was added. This strain presented variable biological yield, reaching 67% in only one production cycle with residue supplemented with 10% rice bran. Significant difference was observed for the protein content of the basidiomes on different substrates, varying from 17.3 to 22.7%. As an alternative method to the substrate sterilization by autoclaving, it was verified the possibility of using hydrogen peroxide as a decontamination agent. By comparison of both methods, it was investigated the production of enzymes, effect of pH and consume of organic matter of both strains cultivated on eucalyptus residue supplemented with various concentrations of rice bran. When hydrogen peroxide was utilized, it was observed higher biomass and enzymes production for the SJC strain, but consume of organic matter was not increased.
Key words: Lentinula edodes, Eucalyptus residue, Ligninolytic enzymes, Cereal brans, Biological efficiency, Proteins.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................................9
2 REVISÃO DA LITERATURA ..........................................................................................11
2.1 Lentinula edodes..........................................................................................................11
2.1.1 Compostos de L. edodes com valor medicinal .............................................................12
2.2 Cultivo de cogumelo “Shiitake”...................................................................................13
2.3 Etapas do desenvolvimento de L. edodes .....................................................................14
2.4 Sistema enzimático de fungo degradador de madeira ..................................................15
2.4.1 Sistema hidrolítico........................................................................................................15
2.4.2 Sistema oxidativo .........................................................................................................16
2.5 Nutrição e fisiologia .....................................................................................................17
2.6 Medida do crescimento de fungos em substrato sólido................................................20
2.7 Descontaminação dos meios de cultivo........................................................................21
2.7.1 Tratamento por via úmida em autoclave ......................................................................21
2.7.2 Tratamento com peróxido de hidrogênio......................................................................21
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................24
4 MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................25
4.1 Matéria-prima ...............................................................................................................25
4.1.1 Obtenção e preparo da matéria-prima ..........................................................................25
4.1.2 Caracterização da matéria-prima..................................................................................25
4.1.3 Determinação de metais ...............................................................................................26
4.2 Organismo ....................................................................................................................27
4.3 Produção do inóculo .....................................................................................................27
4.4 Crescimento em substrato sólido..................................................................................28
4.5 Cultivo das linhagens em substratos tratados com peróxido de hidrogênio.................29
4.5.1 Tratamento do farelo de arroz com peróxido de hidrogênio ........................................29
4.5.2 Descontaminação dos substratos com peróxido de hidrogênio ...................................30
4.6 Fase de colonização e frutificação................................................................................32
4.7 Colheita.........................................................................................................................33
4.8 Métodos Analíticos.......................................................................................................33
4.8.1 Plano de Amostragem e Extração Enzimática..............................................................33
4.8.2 Determinação das atividades enzimáticas ....................................................................33
4.8.3 Determinação da biomassa fúngica .............................................................................36
4.8.4 Determinação de extrativos do meio de cultivo solúveis em etanol.............................37
4.8.5 Perda de componentes do resíduo de eucalipto............................................................37
4.8.6 Determinação da eficiência biológica ..........................................................................38
4.8.7 Determinação do teor de proteínas ...............................................................................38
4.8.8 Matéria orgânica ...........................................................................................................39
4.8.9 Determinação de pH .....................................................................................................39
4.8.10 Análise estatística .........................................................................................................40
4.9 Produção de LiP por Phanerochaete chrysosporium ...................................................40
4.9.1 Obtenção da solução de esporos de P. chrysosporium .................................................41
4.9.2 Condições de cultivo de P. chrysosporium ...................................................................41
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................41
5.1 Enzimas produzidas por L. edodes cultivado em substratos autoclavados...................42
5.1.1 Resíduo de eucalipto suplementado com farelos de cereais.........................................43
5.1.1.1 Endo-1,4-β-glicanase (CMCase) ..................................................................................44
5.1.1.2 β-glicosidase.................................................................................................................46
5.1.1.3 Xilanase ........................................................................................................................47
5.1.1.4 β-xilosidase..................................................................................................................48
5.1.1.5 Lacase ...........................................................................................................................50
5.1.1.6 Peroxidase.....................................................................................................................52
5.1.1.7 Manganês peroxidase (MnP)........................................................................................53
5.1.2 Variação de pH durante fase vegetativa de L. edodes...................................................56
5.1.3 Extrativos do meio de cultivo.......................................................................................58
5.1.4 Consumo de matéria orgânica (CMO)..........................................................................59
5.1.5 Biomassa fúngica..........................................................................................................61
5.1.6 Eficiência biológica ......................................................................................................62
5.1.7 Teor de proteína dos basidiomas ..................................................................................65
5.2 Efeito do farelo de soja na produção de enzimas .........................................................66
5.2.1 Endo-1,4-β-glicanase (CMCase) ..................................................................................67
5.2.2 β-glicosidase................................................................................................................67
5.2.3 Xilanase ........................................................................................................................68
5.2.4 β-xilosidase...................................................................................................................69
5.2.5 Lacase ...........................................................................................................................70
5.2.6 Manganês-peroxidase ..................................................................................................70
5.2 Cultivo de L. edodes em substratos tratados com peróxido de hidrogênio ..................71
5.3.1 Estudo de inativação de catalase do farelo de arroz .....................................................72
5.3.2 Tratamento dos substratos com peróxido de hidrogênio ..............................................73
5.3.3 Produção de enzimas ....................................................................................................74
5.3.3.1 Endo-1,4-β-glicanase (CMCase) ..................................................................................74
5.3.3.2 β-glicosidase.................................................................................................................76
5.3.3.3 Xilanase ........................................................................................................................77
5.3.3.4 β-xilosidase...................................................................................................................78
5.3.3.5 Lacase ...........................................................................................................................80
5.3.3.6 Manganês peroxidase ...................................................................................................81
5.3.4 Consumo de matéria orgânica ......................................................................................82
5.3.5 Biomassa fúngica..........................................................................................................83
5.3.6 Variação do pH durante a fase vegetativa.....................................................................85
5.3.7 Frutificação de L. edodes em substratos tratados com peróxido de hidrogênio ...........86
6 CONCLUSÕES....................................................................................................................87
7 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................88
9
1 INTRODUÇÃO
A atividade florestal fornece um volume de 20% de resíduo orgânico, como folhas,
galhos e cascas, provenientes principalmente de madeiras de pinus e eucalipto, o qual
contribui para a propagação dos incêndios florestais. Muitas alternativas têm sido
constantemente apresentadas e estudadas para o aproveitamento desses resíduos: produção de
energia através da queima, produção de materiais estruturais para a construção civil, produção
de polpas celulósicas incorporadas ou não a materiais sintéticos biodegradáveis para fins
comerciais e industriais, produção de xilitol, álcool, cogumelos comestíveis e outras
substâncias orgânicas utilizando os microrganismos como agentes dessas bioconversões.
O aproveitamento dos resíduos de eucalipto tem como proposta evitar seu acúmulo no
campo, pois apesar de poderem ser naturalmente decompostos, o processo é lento. A
extensão e a rapidez do processo de decomposição dos resíduos de eucalipto dependem do
tipo de microrganismo presente e das condições ambientais, principalmente a temperatura e a
umidade. Atualmente, as indústrias fazem a remoção destes materiais e os depositam em
locais fora da área de plantio.
O acúmulo destes resíduos causa sérias ameaças ao ambiente, pessoas, animais e na
sustentabilidade do ecossistema. Tudo isto, associado à necessidade de produção de alimento
com alto valor nutritivo e medicinal, tem levado ao aumento na produção e no consumo de
cogumelos. Adicionalmente, o sistema enzimático produzido pelos cogumelos comestíveis
converte os resíduos lignocelulósicos em materiais mais solúveis, possibilitando a sua
utilização como adubos para plantas, no condicionamento de solos ou obtenção de enzimas. O
uso de fungos de podridão branca na bioconversão de resíduos agrícolas confere um
subproduto final com alto valor nutritivo e de alta digestibilidade, podendo ser utilizado como
alimento para ruminantes.
Lentinula edodes, conhecido como shiitake, é o segundo cogumelo mais cultivado e
conhecido no mundo. Tradicionalmente seu cultivo é realizado em toras de carvalho,
castanheiras ou de eucalipto. Para o aproveitamento dos resíduos agrícolas e florestais, e
minimização da poluição, substratos alternativos como a serragem suplementada com farelos
de centeio, de soja, de arroz, de milho ou de trigo, palhas e sabugos de milho são muito
utilizados.
Para serem aproveitados na produção de cogumelos comestíveis, os resíduos agrícolas
devem passar por procedimentos de descontaminação. O tratamento térmico é atualmente a
técnica utilizada, a qual representa uma boa parte dos custos do processo, principalmente para
10
pequenos produtores. Uma alternativa seria a aplicação de agentes químicos, como o peróxido
de hidrogênio, cuja eficácia tem sido demonstrada em meios de cultivo para produção de
cogumelos em sacolas (WAYNE, 2001) e também na extensão da vida de prateleira do
produto (FORNEY et al., 1991). A ação antimicrobiana do peróxido de hidrogênio se dá pela
habilidade em formar espécies reativas de oxigênio na presença de metais e em contato com
material orgânico, que podem interagir com o DNA e constituintes da membrana (JUVEN;
PIERSON, 1996). Embora a reação que converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio e
água pareça muito simples, não está claro se uma atividade residual persistente venha afetar o
desenvolvimento do fungo e a ação de enzimas oxidativas que degradam a lignina, como
lignina peroxidase (LiP) e manganês peroxidase (MnP).
A combinação de farelos de cereais aos materiais lignocelulósicos tem sido objeto de
vários trabalhos, porém ainda há necessidade de novos estudos para o desenvolvimento de
meios de cultivo que favoreçam a produção das enzimas e também a degradação do substrato.
Após uma cuidadosa revisão na literatura, observou-se que existem muitas informações
conflitantes em relação a este assunto. Isto justificou uma investigação mais detalhada do
ponto de vista cinético.
A seguir será apresentada, uma revisão da literatura sobre Lentinula edodes, sua
fisiologia, nutrição e enzimas envolvidas na degradação de celulose, hemicelulose e lignina.
Será apresentada, também, uma revisão sobre as propriedades físico-químicas do peróxido de
hidrogênio.
11
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Lentinula edodes
Lentinula edodes (Berkeley) Pegler, conhecido como shiitake (“shiia”, tipo de árvore;
“take”, cogumelo em japonês), é cultivado comercialmente em toras de carvalho, de
castanheiras e de eucalipto. É um basidiomiceto de podridão branca, decompõe todos os
constituintes da parede celular vegetal para utilizá-los como fonte de carbono e energia
durante as duas fases do seu ciclo de vida (Figura 1).
Figura 1. Diagrama representativo do ciclo de vida de um fungo típico da espécie tetrapolar.
Seu ciclo reprodutivo é relativamente simples quando comparado com o de outros
fungos. Os esporos, ou basidiósporos, formam-se nos basídios das lamelas, na parte inferior
dos carpóforos (“chapéus”), e ao caírem em substratos adequados desenvolvem as hifas que
formam o micélio primário. Estes micélios fundem-se formando os micélios secundários, que
em situações especiais, enovelam-se e direcionam novas hifas que vão, por sua vez, formar
um novo basidioma.
12
São conhecidas duas fases do seu ciclo de vida: a fase vegetativa, a qual é de longa
duração, e a fase reprodutiva. A fase vegetativa está relacionada à fase micelial. A fase
seguinte, a de frutificação está relacionada à rápida atividade metabólica, a qual confere ao
cogumelo o grande valor nutritivo, com textura e sabor (KÜES; LIU, 2000).
A rápida atividade metabólica de L. edodes gera o corpo de frutificação rico em
proteínas, carboidratos, fibras, vitaminas e minerais, com baixo teor de gordura e colesterol. É
um alimento com alto valor protéico e baixo valor calórico, comparado a vegetais e animais,
podendo ser consumido diariamente, principalmente no combate à obesidade, quando
comparado com alimento animal, o qual apresenta alto teor de gordura (RAJARATHNAM et
al., 1998; KÜES, LIU, 2000).
O ”shiitake” desidratado contém em média 25% de proteína, 0,5-2% de lipídeos, 65% de
carboidratos, 2,6-6,5% de sais minerais, vitaminas B2 e C (LONGVAH; DEOSTHALE,
1998; RAJARATHNAM et al., 1998; MORAIS et al., 2000).
2.1.1 Compostos de L. edodes com valor medicinal
Além do valor nutricional, o shiitake é bastante utilizado pelo seu valor medicinal e
muitos de seus compostos foram purificados e identificados. A lentinana é um polissacarídeo
solúvel em água, composto de β-1,3 glicana, com ramificação β-1,6, que estimula o sistema
imunológico aumentando a resistência ao vírus da imunodeficiência humana (HIV). Atua
também como agente antiviral, antibacteriano, antifúngico, no controle de diabetes e do
crescimento de tumores cancerígenos (KUES; LIU, 2000). Resultados obtidos por Sugui et al.
(2003) mostram que o efeito antimutagênico de L. edodes pode variar entre as linhagens
obtidas de diferentes regiões, devido à variação na composição química do cogumelo e
conseqüentemente nos efeitos de modulação. Extrato metanólico de várias espécies de
cogumelos, entre eles L. edodes, produz uma inibição extremamente efetiva da peroxidação
de lipídios, mostrando alta atividade antioxidante, como também alto poder redutor, os quais
podem reagir com radicais livres, estabilizando-os e terminando com as reações em cadeia
(YANG; LIN; MAU, 2002). L. edodes produz a cortinelina que é aplicado como antifúngico.
Também foi verificada atividade antiviral em compostos obtidos do extrato da cultura
micelial (LEM) de L. edodes, em meio sólido, composto de bagaço de cana-de açúcar e farelo
de arroz (SUZUKI et al., 1989). A fração LEM contém como maior constituinte um
heteroglicano conjugado com proteínas, ácidos nucleicos e componentes vitamínicos. Chibata
13
et al. (1969) identificaram no basidioma do cogumelo shiitake uma substância denominada
lentinacina (2 ®, 3 ®-dihidroxi-4-(9 adenil)-ácido butírico), também conhecida como
eritadenina (KUES; LIU, 2000), que possui atividades antivirais. Em estudos realizados por
Sugiyama, Arashi e Yamakawa (1993, 1995), a eritadenina apresentou fatores
hipocolesterolêmicos. A medicina popular indica que, em humanos, o “shiitake” é um
alimento com funções de fortificar e restaurar os organismos. Atualmente, é recomendado
para todas as doenças que envolvem diminuição das funções imunológicas.
2.2 Cultivo de cogumelo “Shiitake”
O interesse no cultivo do “shiitake” tem se expandido por muitos países e seu consumo
e produção mostram uma tendência de crescimento (MORAIS et al., 2000). No mercado
mundial, o “shiitake” é o segundo cogumelo mais cultivado e consumido (HATVANI;
MÉCS, 2002). A China é um grande exportador de várias espécies de cogumelo, incluindo
Agaricus bisporus, Lentinula edodes e Ganoderma lucidum (CHIU et al., 2000). No Japão,
China e alguns países da Europa, o cultivo de “shiitake” tem sido realizado em toras de
carvalho ou de castanheiras. No Brasil, o cultivo é feito principalmente em toras de eucalipto
e, esta prática, vem crescendo significativamente, principalmente nos estados de São Paulo e
Paraná, devido ao bom retorno econômico com baixo investimento (ROSSI; MONTEIRO;
MACHADO, 2001).
Os Estados Unidos, Taiwan, Canadá e Singapura produzem “shiitake” em cultivo
axênico com serragem suplementada com farelos de cereais, utilizando sacos plásticos de
polipropileno ou polietileno (ROYSE; SCHISLER; DIEHLE, 1985).
O cultivo axênico de shiitake em substratos naturais como a serragem ou outros resíduos
lignocelulósicos suplementados com farelos de centeio, soja, arroz, milho ou trigo, palhas e
sabugos de milho tem se destacado em vários países. Além disso, é mais fácil o controle de
variáveis do cultivo, tais como a temperatura e a umidade (KÜES; LIU, 2000; OHGA, 1992).
O uso desses substratos diminui o tempo de produção e aumenta a eficiência biológica do
fungo (ROSSI; MONTEIRO; MACHADO, 2001).
Os cogumelos produzidos em culturas axênicas são, geralmente, menores, mais claros e
apresentam estirpes alongadas, quando comparados aos produzidos em toras. O rendimento
dos cogumelos pode ser afetado por fatores como o tempo de crescimento micelial durante a
fase vegetativa, tipo do substrato lignocelulósico, tipo de suplementação nutricional, conteúdo
14
de água e concentração de gases acumulados no ambiente, como CO2. Muitas das linhagens
disponíveis são apropriadas para o cultivo em toras ao ar livre e não são apropriadas para o
cultivo em substratos axênicos (OHGA, 1992; CHIU et al., 2000).
2.3 Etapas do desenvolvimento de L. edodes
A valorização de resíduos agroindustriais para o cultivo de cogumelos demanda
experimentação extensiva com várias espécies e com várias condições de crescimento. As
condições que favorecem a fase vegetativa são muito diferentes das condições que favorecem
a fase reprodutiva. Em geral, o tempo necessário para produção de cogumelos está associado
à velocidade de crescimento do micélio vegetativo (PHILIPPOUSSIS;
DIAMANTOPOULOU; ZERVAKIS, 2003). A duração desta fase é de importância
economicamente direta, pois o meio que não está completamente colonizado pelas hifas está
disponível às infecções fúngicas e bacterianas resultando na redução do rendimento de
cogumelo (ZERVAKIS et al., 2001).
Os cultivadores de “shiitake” geralmente acreditam que a serragem fina é mais aceitável
para o cultivo axênico porque podem ser mais facilmente hidrolisadas pelo fungo (ROYSE;
SANCHEZ-VAZQUEZ, 2001). A eficiência biológica de várias espécies de cogumelos
cultivados, em termos de rendimento de massa fresca do cogumelo sobre a massa seca do
composto utilizado, varia de 17 a 250% (CHIU et al., 2000). Royse e Sanchez-Vazquez
(2001) analisaram o rendimento do corpo de frutificação em diferentes tamanhos de partículas
de serragem e observaram que os substratos com tamanhos de partículas menores que 0,85
mm apresentaram uma eficiência biológica (EB) de 87,1%. Em contrapartida, partículas entre
0,85 e 1,7 mm apresentaram o melhor rendimento do corpo de frutificação com uma EB de
107,4%.
A espécie de madeira também influencia no rendimento do cogumelo. Dare; Clark e
Chu-Chou (1988) constataram que serragem de Pinus radiata (madeira mole) e Beilamieda
tawa (madeira dura) diferenciam-se na capacidade de degradação por L. edodes desses
materiais lignocelulósicos. Esses autores demonstraram que a extensão da degradação dos
componentes das serragens foi quase a mesma. No entanto, a deficiência de potássio em Pinus
radiata ocasionou um menor rendimento de cogumelo.
O acondicionamento do meio de cultivo para o crescimento micelial durante a fase
vegetativa é realizado no escuro por um período que varia de 50 a 80 dias. A temperatura e a
15
umidade relativa de incubação depende da espécie ou até mesmo da linhagem de uma mesma
espécie. Certas linhagens de L. edodes são acondicionadas a 24 ± 2ºC com umidade relativa
de 60 – 70% por 80 – 90 dias (MORAIS et al., 2000).
A frutificação é tipicamente induzida, depois do crescimento vegetativo, pela redução
em mais de 5ºC na temperatura (KÜES; LIU, 2000; OHGA; ROYSE, 2001). Rotineiramente,
o choque térmico é realizado através da imersão dos blocos sintéticos em tanque de água
limpa e fria, o que facilita o abaixamento da temperatura e, conseqüentemente, o aumento da
umidade do meio, o qual é necessário para rápida atividade metabólica durante o
desenvolvimento do basidioma (CAMPBELL; RACJAN, 1999; OHGA, 1992; ROYSE;
RHODES; SANCHEZ, 2002). O tempo de imersão pode variar de 1 a 48 horas. Campbell e
Racjan (1999), durante a produção de L. edodes, utilizaram um tempo de 48 horas para a
imersão das toras de carvalho.
Após o choque térmico, as sacolas de polipropileno são removidas e os meios são
transferidos para a sala de frutificação, a qual se mantém em condições ambientais ótimas
para uma melhor produtividade. A umidade relativa deve ser elevada para 85 – 95%
(MORAIS et al., 2000; ROYSE; RHODES; SANCHEZ, 2002).
A luz é essencial para a morfologia normal e pigmentação do basidioma. Diariamente, 3
horas de luz pode ser fornecida por lâmpada branca fria (fluorescente) com ventilação para
manter o nível de CO2 em 1900 ppm (ROYSE; RHODES; SANCHEZ, 2002). Morais et al.
(2000) utilizaram intensidade de luz de 500 lux (400-750 ηm), 12 h por dia durante a fase de
frutificação de L. edodes. Outras condições usadas para estimular a frutificação foram:
redução da temperatura de 24ºC para 20ºC e a ventilação diária por 30 min para manter a
concentração de CO2 entre 0,1 e 0,5%.
A maturidade dos cogumelos é determinada pelo rompimento do véu, o qual leva a
exposição completa das guelras (brânquias) (MORAIS et al., 2000; ROYSE; RHODES;
SANCHEZ, 2002). Após a primeira colheita, as sacolas voltam a ser incubadas e após um
período de 30 dias podem receber novos choques térmicos para as colheitas subseqüentes, até
o esgotamento total dos nutrientes (DARE; CLARK; CHU-CHOU, 1988).
2.4 Sistema enzimático de fungo degradador de madeira
2.4.1 Sistema hidrolítico
Todos os microrganismos capazes de decompor celulose e hemicelulose produzem uma
série de enzimas com diferentes especificidades, que podem atuar em sinergia (BÉGUIN;
16
HUBERT, 1994). A biodegradação da celulose ocorre pela ação de três grupos de enzimas
que atuam sinergicamente. Esses grupos de enzimas compreendem as endo-1,4-β-glicanases,
as exo-1,4-β-glicanases e as 1,4-β-glicosidases. A endo-1,4-β-glicanase hidrolisa as ligações
internas β-1,4-glicosídicas, nas regiões amorfas das microfibrilas de celulose. Essa ação leva
a formação de novos terminais redutores e não-redutores da cadeia de celulose. Nestes finais
redutores e não-redutores ocorre ação enzimática das exo-1,4-β-glicanases (celobiose
hidrolase I e celobiose hidrolase II), as quais hidrolisam a cadeia de celulose em unidades de
celobiose. Por fim, a enzima β-glicosidase cliva a ligação β-1,4 das unidades de celobiose
produzindo duas moléculas de glicose (KIRK; CULLEN, 1998).
A hidrólise de hemicelulose exige um conjunto complexo de enzimas extracelulares,
devido a sua estrutura de heteropolissacarídio ramificado. As enzimas que participam na
degradação da hemicelulose são denominadas hemicelulases e são classificadas dependendo
do substrato sobre o qual elas atuam. Sistema enzimático incluindo endo e exo-xilanases,
mananases, β-xilosidase, α-glucuronidase e α-arabinofuranosidase é necessário para a
hidrólise completa desse constituinte. Formas múltiplas de cada classe de enzimas podem
ocorrer e essas podem cooperar na hidrólise do substrato (WONG; TAN; SADDLER, 1988).
A enzima endo-1,4-β-xilanase atua aleatoriamente na clivagem das ligações internas β-
1,4 glicosídicas da cadeia principal de xilana. Acetilxilana esterases agem sobre a ligação
éster do grupo lateral acetil da cadeia principal da xilana. As α-glucuronidases clivam as
ligações α-1,2 do grupo lateral do ácido 4-O-metil-glucurônico ligado à unidade de xilose da
cadeia principal da xilana. Esta enzima age em xilooligômeros de baixa massa molecular, na
ligação entre a unidade de xilose do final não redutor da cadeia e o resíduo do ácido 4-O-
metil-glucurônico. As β-xilosidases hidrolisam as ligações β-1,4 das unidades de xilobiose,
liberando duas unidades de xilose até completa hidrólise da xilana.
2.4.2 Sistema oxidativo
A biodegradação da lignina ainda não foi completamente elucidada devido a sua
maior complexidade estrutural, mas supõe-se que um grupo amplo de enzimas esteja
relacionado à sua biodegradação. No entanto, existem ainda hoje, controvérsias sobre a real
participação de cada grupo de enzimas e a função que cada uma delas exerce no processo
global de oxidação que leva a lignina até dióxido de carbono e água. Essas enzimas podem
17
ser agrupadas em pelo menos duas classes distintas: enzimas que atuam na oxidação do
polímero lignocelulósico que são dependentes de peróxido de hidrogênio em seus ciclos
catalíticos e enzimas que não necessitam desta substância para voltar a sua forma nativa. As
peroxidases que estão envolvidas na biodegradação da lignina são lignina peroxidase (LiP,
EC 1.11.1.14) e peroxidase dependente de manganês (MnP, EC 1.11.1.13). As lacases (EC
1.10.3.2, benzenediol oxigênio oxidoredutase), são cuproproteínas que não dependem de
peróxido para atuar (HATAKKA, 1994; HATAKKA et al., 1996). Existem evidências que
todas as três enzimas podem agir com mediadores de baixa massa molecular para ocasionar a
oxidação da lignina. Alguns fungos de podridão branca produzem todas as três enzimas,
alguns somente duas, e poucos, somente uma (ERIKSSON; BLANCHETE; ANDER, 1990;
HATAKKA, 1994). As enzimas que produzem peróxido de hidrogênio são acessórias às
atividades de peroxidases, gerando peróxido de hidrogênio ‘in situ’ e possibilitam que elas
atuem.
LiP contém ferro protoporfirínico como grupo prostético e é dependente de H2O2 para
sua atividade. As enzimas MnPs ocorrem nos fungos de podridão branca e a maioria de suas
propriedades estruturais é semelhante às de LiP (GLEN; GOLD, 1985). MnP é
cataliticamente dependente de H2O2 e íons Mn(II). MnP também possui um ciclo catalítico
(WARIISHI; AKILESWARAN; GOLD, 1988) semelhante as LiPs, mas tendo Mn(II) como
doador de elétron. As lacases são cuproproteínas que não dependem de peróxido de
hidrogênio para agirem. O ciclo catalítico da lacase envolve quatro íons Cu2+, normalmente
ligados a uma única proteína ou a duas cadeias protéicas acopladas, quatro substratos
fenólicos, quatro prótons e uma molécula de oxigênio (THURSTON, 1994).
2.5 Nutrição e fisiologia
A fase de colonização do substrato pela biomassa fúngica depois da inoculação e antes
da formação dos primórdios é essencial para o cultivo. Durante esta fase, o controle da
cinética do crescimento e da produção e consumo de metabólitos é essencial e contribui de
forma significativa para o sucesso do cultivo (ZERVAKIS et al., 2001).
Embora os materiais lignocelulósicos apresentam-se como material principal do meio de
cultivo, suplementações com farelos de centeio, de soja, de arroz, de milho ou de trigo, que
são ricos em proteínas e minerais, são comumente utilizadas (OHGA, 1992; MATA;
SAVOIE, 1998, ROYSE et al, 2001). O cultivo axênico em serragem de madeira ou outros
18
resíduos agrícolas, como palha de arroz ou trigo, suplementados com várias fontes de carbono
e nitrogênio oferece importante vantagem sobre o método de cultivo em toras naturais com
respeito ao tempo e eficiência de produção (PHILIPPOUSSIS; DIAMANTOPOULOU;
ZERVAKIS, 2003). A combinação de diferentes resíduos lignocelulósicos com
concentrações variadas de nitrogênio de diferentes fontes altera as condições fisiológicas dos
fungos. Geralmente, a razão C/N é usada como indicador para compostabilidade do substrato,
com valor ótimo entre 25 e 30 (LÓPEZ et al., 2002). O aumento na concentração de
nitrogênio tende a aumentar o crescimento fúngico, entretanto, nitrogênio em excesso pode
também inibir a síntese de enzimas que degradam lignina (BISARIA; MADAN;
VASUDEVAN, 1997). Segundo esses autores, uma razão C/N menor proporciona maior
degradação de celulose e hemicelulose, enquanto a degradação da lignina é mais efetiva
quando a razão C/N é maior.
Por ser apto a utilizar lignina, celulose e hemicelulose, L. edodes produz uma série de
enzimas para degradar os substratos lignocelulósicos. Durante o crescimento vegetativo e
frutificação ocorrem mudanças nas atividades enzimáticas, indicando uma conexão entre a
produção de enzimas e a formação dos basidiomas. As atividades de lacase são mais altas
antes da formação do corpo de frutificação e declinam rapidamente com a formação dos
primórdios. O contrário normalmente ocorre com xilanase e celulase, as quais são mais altas
quando do desenvolvimento do basidioma (KÜES; LIU, 2000). As atividades enzimáticas
associadas à degradação dos materiais ligninocelulósicos foram examinadas, durante toda a
fase de frutificação de L. edodes cultivado sobre serragem (MATSUMOTO, 1988). As
atividades de fenoloxidase e lacase aumentaram no segundo dia após o choque térmico e
reduziram depois disso. As atividades de endo-1,4-glicanase (CMCase), β-glicosidase,
xilanase, β-1,3-glicanase e quitinase aumentaram nos primeiros estágios do desenvolvimento,
atingindo altos níveis durante o amadurecimento do basidioma.
A degradação de lignina pelos fungos decompositores da madeira, como L. edodes,
parece ser o primeiro passo para a colonização do substrato. O desenvolvimento de estratégias
para aumentar o rendimento na produção de cogumelos requer um profundo entendimento do
sistema ligninolítico e dos fatores fisiológicos que afetam a atividade deste sistema
(BUSWELL; CAI; CHANG, 1995). Estudos têm demonstrado que a produção de MnP é
dependente de concentrações limitantes de manganês e nitrogênio no meio de cultivo
(BUSWELL; CAI; CHANG, 1995; FIELD; KAAL; JOYCE, 1995; HADAR; KEREM, 1993;
HATVANI; MÉCS, 2002). Em meio líquido, com concentrações de nutrientes definidos, a
produção de MnP por L. edodes é favorecida em baixa concentração de nitrogênio (2,6 mM)
19
e na presença de 1,1 ppm de Mn (BUSWELL; CAI; CHANG, 1995). Não foi detectada
atividade desta enzima na ausência de Mn ou acima de 30 ppm.
Comparações entre nitrogênio orgânico e inorgânico adicionados ao meio de cultura
revelaram que L. edodes e outros fungos de decomposição branca podem aumentar a
atividade de MnP em até 20 vezes quando o nitrogênio é de origem orgânica (FIELD; KAAL;
JOYCE, 1995; HATVANI; MÉCS, 2002). Altas atividades de lacase foram detectadas em 20
e 40 dias, em sistema de fermentação em estado sólido com L. edodes, quando cultivado em
subproduto do processo de cervejaria contendo malte (HATVANI; MÉCS, 2001).
Em relação à produção das enzimas hidrolíticas, a literatura indica que L. edodes produz
altas atividades de endoglicanases em 14 dias em palha de trigo, estabilizando-se em um valor
mais baixo de atividade durante todo o período restante da fase vegetativa, sendo este
resultado confirmado pela análise de açúcares redutores (MATA; SAVOIE, 1998). Ohga
(1992), observou que linhagem de L. edodes que frutifica em sistema axênico de cultivo
apresenta um significante aumento de carboidratos solúveis em água em 30 e 45 dias de
cultivo em serragem suplementada com farelo de arroz e trigo. Os resultados apresentados
por estes autores confirmam que a hidrólise de celulose, ocasionada pela alta atividade de
glicanases, gera grande quantidade de carboidratos, os quais podem ser absorvidos pelo
micélio e, assim, agir como uma fonte de energia para a formação do corpo de frutificação. Os
estudos realizados por Mata e Savoie (1998) mostraram que o pico de atividade de β-
glicosidase não coincidiu com o pico de atividade de endoglicanases após 14 dias de cultivo
de L. edodes em palha de trigo, mas indicaram um aumento crescente da atividade de β-
glicosidase durante todo o período da fase vegetativa, que se prolongou por 49 dias. Após
este período, altas atividades de β-glicosidase foram obtidas durante as duas primeiras
semanas da fase de frutificação. Segundo estes mesmos autores, alta atividade de xilanase foi
obtida em 14 dias de cultivo de L. edodes sobre palha de trigo, a qual declinou em 21 dias e
manteve-se constante até o final da fase vegetativa.
De acordo com Dare, Clark e Chu-Chou (1988), o cultivo de L. edodes em serragem de
madeira levou a um grande consumo de xilana e produção de altas atividades de
hemicelulases durante a fase vegetativa e frutificação. A produção de endo-xilanase por L.
edodes em palha de milho foi máxima em 11 dias de cultivo, indicando uma degradação da
hemicelulose neste período (SERMANNI et al., 1994).
L. edodes, quando cultivado sobre palha de milho, apresentou altas atividades de lacase
e hemicelulases depois de 11 dias de cultivo (SERMANNI et al., 1994). Segundo estes
20
mesmos autores, as hemicelulases podem melhorar a acessibilidade das enzimas que oxidam a
lignina e, conseqüentemente, levar a uma maior extração da lignina, apresentando, então, um
sinergismo das enzimas hidrolíticas e oxidativas na degradação da parede celular das plantas
(SERMANNI et al., 1994; KANTELINEN et al., 1993).
Segundo Dare, Clark e Chu-Chou (1988), L. edodes é altamente ativo no consumo de
matéria orgânica proveniente de madeira dura e menos ativo em material lignocelulósico
proveniente de madeira mole. Uma explicação para este fato pode estar relacionada com as
unidades siringil de lignina presentes em maior quantidade em madeira dura, as quais são
degradadas mais rapidamente por L. edodes do que as unidades guaiacil, que estão presentes
quase que inteiramente na formação da macromolécula de lignina de madeira mole (DARE;
CLARK; CHU-CHOU, 1988).
2.6 Medida do crescimento de fungos em substrato sólido
Embora o estudo de atividades de enzimas extracelulares gerar muitas informações a
respeito do desenvolvimento dos fungos em substratos lignocelulósicos, esses resultados
ainda são escassos e há necessidade de se integrar os dados de enzimologia com a cinética do
crescimento em substratos sólidos (ZERVAKIS et al., 2001).
Alguns métodos são utilizados na determinação do crescimento micelial dos fungos
comestíveis em diferentes substratos. Os métodos podem ser diretos ou indiretos. Métodos
diretos consistem em verificar a velocidade do crescimento micelial em mm/dia (ROSSI;
MONTEIRO; MACHADO, 2001; ZERVAKIS et al., 2001) e os indiretos consistem em
analisar a concentração de certas substâncias existentes na parede ou membrana celular dos
fungos.
Técnicas indiretas de análise do crescimento da biomassa fúngica são utilizadas pela
determinação do conteúdo de quitina (OHGA, 1992), quantificação de ATP (OKEKE et al.,
1994), glicosamina (SANTOS et al., 2003) e de ergosterol (MONTGOMERY et al., 2000).
Determinação da biomassa fúngica através do conteúdo de ergosterol é considerada a mais
sensível e não está sujeita a interferências, devido à ausência deste composto nas membranas
das células vegetais. Este esterol é encontrado na bicamada de fosfolipídeo da membrana
celular, principalmente em estado livre e, em menor quantidade, esterificado com ácidos
graxos (MONTGOMERY et al., 2000; OKEKE et al., 1994; RICHARDSON; LOGENDRA,
1997).
21
O método da extração de ergosterol com metanol, através de um sistema de refluxo,
apresenta resultado melhor que com etanol (RICHARDSON; LOGENDRA, 1997). Em
contrapartida, o método da saponificação com KOH (OKEKE et al., 1994) ou NaOH com
aquecimento em microondas, seguido pela extração com pentano, consegue extrair 9 vezes
mais ergosterol que os métodos rotineiros (MONTGOMERY et al.,2000).
A quantificação da biomassa fúngica (BF) pode ser determinada usando um fator que
correlaciona a massa micelial com o conteúdo de ergosterol, obtido através da medida do
crescimento do fungo em meio líquido (SILVA; MACHUCA; MILAGRES, 2005a).
2.7 Descontaminação dos meios de cultivo
2.7.1 Tratamento por via úmida em autoclave
O tratamento térmico por autoclavagem é o método mais utilizado para redução de
contaminantes de meios de cultura. O binômio tempo/temperatura com intervalos de
resfriamento e novo ciclo de autoclavagem é o mais usado para a redução da contaminação de
meios preparados em sacolas para produção de cogumelos (MORAIS et al., 2000; OHGA;
ROYSE, 2001; OHGA, 1992). Normalmente, o material deve ficar em autoclave
convencional durante 30 minutos em temperaturas de 121°C a 132°C. Tal procedimento
proporciona a eliminação de microrganismos e também a inativação de enzimas. Este
tratamento, mesmo não sendo totalmente eficiente, ainda é insuperável quanto à qualidade de
assepsia, possibilidade de monitoração do processo e rapidez. Porém, autoclaves de maior
tamanho que possam atender a demanda de uma produção comercial ainda são consideradas
muito caras. Além disso, o consumo de energia ou combustível torna este procedimento
muitas vezes inviável, principalmente pela necessidade de temperaturas mais elevadas por um
período de tempo maior.
2.7.2 Tratamento com peróxido de hidrogênio
As soluções aquosas de peróxido de hidrogênio, quando aciduladas, são relativamente
estáveis. Porém, a decomposição pode ser iniciada e acelerada pela luz, aquecimento ou pela
presença de vários tipos de impurezas, por exemplo, os íons metálicos de transição (LUCK;
JAGER, 1997).
22
A ação antimicrobiana do peróxido de hidrogênio ocorre não pelas propriedades
oxidativas da molécula, mas pela produção de outros oxidantes, tais como o oxigênio singlete,
radicais superóxidos e radical peroxil (DAVIDSON; BRANEN, 1993). O peróxido de
hidrogênio na presença de íons metálicos como Fe2+ ou Cu+ é transformado em radical
hidroxila (YANG; LIN; MAU, 2002) e estes, por reações em cadeia, podem gerar várias
outras espécies de oxigênio reativo, como por exemplo, peróxidos orgânicos radicalares que
reduzem a atividade de enzimas necessárias ao funcionamento das células (ESCOBAR;
RUBIO; LISSI, 1996). Estas espécies de oxigênios reativos são oxidantes fortemente potentes
e capazes de oxidar certas substâncias orgânicas das células. Freqüentemente, exercem danos
pela destruição de membranas, enzimas e DNA, ocasionando a lise celular (BROCK et al.,
1994).
O peróxido de hidrogênio é produzido naturalmente por sistemas enzimáticos, e é
utilizado para destruição de bactérias pelos lisossomas de organismos durante a fagocitose
(BROCK et al., 1994). O peróxido de hidrogênio é usado desde 1800, na concentração de 3%
para limpeza de infecções da pele (DAVIDSON; BRANEN, 1993), e por algum tempo foi
usado na descontaminação de leite (LUCK; JAGER, 1997), porém seu uso em alimentos é
limitado.
O peróxido de hidrogênio tem sido associado à pasteurização como método para
descontaminar as matérias-primas lignocelulósicas usadas na produção de cogumelos
comestíveis. A presença de farelo de cereais no preparo destes meios reduz a sua eficácia,
pois em geral os farelos são ricos em catalase, podendo comprometer o processo de
descontaminação (WAYNE, 2001).
A catalase é uma heme proteína contendo porfirina como grupo prostético, que se
assemelha às enzimas lignina peroxidase e manganês peroxidase (LARDINOIS;
MESTDAGH; ROUXHET, 1996; VALDERRAMA; AYALA; VAZQUEZ-DUHALT, 2002).
O ciclo catalítico da catalase ocorre através da oxidação do seu estado nativo pelo H2O2
liberando uma molécula de H2O e levando a enzima ao complexo radicalar oxo-porfirina Fe4+,
a qual volta ao seu estado nativo pela redução de mais uma molécula de H2O2, liberando uma
molécula de O2 (LARDINOIS; MESTDAGH; ROUXHET, 1996; VALDERRAMA;
AYALA; VAZQUEZ-DUHALT, 2002).
Por outro lado, a inativação reversível e irreversível de catalase por excesso de H2O2
tem sido objetivo de vários estudos (ANDERSON, 2002; ESCOBAR; RUBIO; LISSI, 1996;
LARDINOIS; MESTDAGH; ROUXHET, 1996; VALDERRAMA; AYALA; VAZQUEZ-
DUHALT, 2002).
23
Wayne (2001) avaliou o cultivo de Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Agaricus
subrufescens, Hypsizygus, Lentinula edodes, Hericium erinaceus e Grifola frondosa. De
acordo com o autor, uma baixa concentração de peróxido de hidrogênio (3% v/v) pode ser
utilizada para umedecer e descontaminar o material lignocelulósico, antes da inoculação.
O uso do peróxido de hidrogênio como agente de esterilização do meio de cultivo, pode
ser uma alternativa para a produção de cogumelo, pois como mencionado anteriormente, a
autoclavagem do meio de cultivo apresenta alto consumo de energia. Apesar disto, ainda é
possível que esporos remanescentes de fungos indesejáveis possam germinar e comprometer
todo o processo de produção (ZERVAKIS et al., 2001).
Enfim, o processo de descontaminação do meio de cultivo com solução de peróxido de
hidrogênio para o cultivo de cogumelos pode se tornar viável, incentivando a prática de
cultura familiar.
24
3 OBJETIVOS
Comparar a produção de enzimas, o consumo de matéria orgânica e a eficiência
biológica durante a biodegradação do resíduo de eucalipto por duas linhagens de L. edodes. A
abordagem experimental envolveu o estudo do processo biodegradativo em diversas
condições de cultivo com os seguintes objetivos específicos:
Verificar a viabilidade de cultivo utilizando resíduo de eucalipto como substrato único
e também suplementado com farelos de cereais para o cultivo de L. edodes;
Avaliar as diferenças existentes no crescimento das linhagens de L. edodes e nas
atividades das enzimas relacionadas à degradação de celulose, hemicelulose e lignina
em substratos sólidos;
Verificar a influência da adição de farelos de cereais, utilizados como suplemento do
resíduo de eucalipto, no consumo de matéria orgânica e na eficiência biológica das
linhagens de L. edodes;
Verificar se há diferenças no teor de proteínas dos cogumelos produzidos em função
do tipo e concentração dos farelos de cereais;
Verificar a eficiência do peróxido de hidrogênio na descontaminação do resíduo de
eucalipto suplementado com diferentes concentrações de farelo de arroz.
25
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Matéria-prima
4.1.1 Obtenção e preparo da matéria-prima
O resíduo de eucalipto utilizado nos experimentos foi obtido das plantações da Cia
Suzano de Papel e Celulose – São Luis do Paraitinga – SP. Este resíduo, constituído por
folhas, galhos e casca, foi moído em moinho tipo martelo para obter partículas menores que 5
mm.
Os farelos de arroz e soja foram obtidos das indústrias de beneficiamento agroindustrial
para serem utilizados como suplementação protéica dos meios de cultivo sólidos. De acordo
com a literatura, farelo de arroz possui em média 13% de proteína (MILLER; CHURCHELL;
1986) e o farelo de soja, 37% de proteína (VALENTAS; LEVINE; CLARK, 1991).
4.1.2 Caracterização da matéria-prima
O resíduo de eucalipto moído foi caracterizado quanto ao teor de celulose, hemicelulose,
lignina e extrativos. Aproximadamente 1g de amostra foi extraída com etanol 95% em
extrator Soxhlet por 6 horas. Após a extração, as amostras foram secas em estufas a 60 ºC e
posteriormente a 105 ºC até massa constante, para a determinação dos extrativos (FERRAZ et
al., 2000).
Após remoção dos extrativos, o resíduo de eucalipto foi caracterizado quimicamente
quanto aos teores de celulose, polioses e lignina residual. Em tubo de ensaio, cerca de 300 mg
de amostra foram hidrolisadas com H2SO4 72 % (p/p) por 1 hora a 30 ºC. Em seguida, o
conteúdo do tubo foi transferido quantitativamente para um Erlenmeyer de 250 ml com o
auxílio de 79 ml de água destilada. Essa mistura foi, então, autoclavada a 121 ºC por 1 hora.
O conteúdo do Erlenmeyer foi filtrado em filtro de placa porosa nº 3, previamente seco a
105 ºC e pesado. O resíduo sólido foi lavado com 2 porções de 5 ml de água, seco em estufa a
105 ºC e pesado até peso constante para a determinação gravimétrica da lignina insolúvel
(Klason). A fração solúvel foi diluída para 100 ml em um balão volumétrico. Parte da fração
solúvel foi utilizada para a determinação dos teores de glicose, xilose e ácido acético por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O sistema cromatográfico é composto por
uma coluna BIORAD HPX-87H eluída com H2SO4 50 mM a 0,6 ml/min e aquecida a 45 ºC.
26
Utilizou-se um detector diferencial de índice de refração Shimadzu mod. RID-6A, bomba de
pistão Shimadzu mod. LC-10AD e forno para colunas Shimadzu mod. CTO-6A acoplado com
injetor de amostras mod. 7125.
Determinou-se a concentração dos açúcares através de curvas de calibração preparadas
com padrões de grau analítico secos em dessecadores com P2O5 e sob vácuo. A partir das
concentrações de glicose, xilose e ácido acético calcularam-se os teores de glucana, xilana e
acetil, multiplicando as porcentagens de cada composto por 0,9, 0,88 e 0,72, respectivamente.
Os fatores mencionados se referem à adição de água aos polímeros durante a hidrólise ácida.
Para esse cálculo supõe-se que os polímeros apresentam grau de polimerização infinito.
O teor de lignina solúvel em ácido foi determinado por medida de absorbância em 205
ηm de uma diluição 2:10 do hidrolisado. Para o cálculo da concentração de lignina solúvel
utilizou-se uma absortividade de 105 L/g.cm nesse comprimento de onda (FERRAZ et al.,
2000).
4.1.3 Determinação de metais
Resíduo de eucalipto foi moído para obter partículas menores que 0,5mm. Amostras de
500 mg de resíduo de eucalipto e de farelos de arroz e soja foram hidrolisados com 6 ml de
ácido sulfúrico (72%) em um digestor Digesdahl Hach aquecidas por 5 min a 440 °C. Depois,
3 ml de peróxido de hidrogênio 30% foram adicionados e a mistura aquecida a 440 °C por 3
min adicionais. Depois de esfriado, o volume de solução foi aumentado para 50 ml em balão
volumétrico com água deionizada. Esta solução foi analisada em equipamento de absorção
atômica ICP-GBC Integra XM para determinar o conteúdo de cálcio, ferro, cobre, manganês,
zinco, potássio, mercúrio, cádmio e chumbo (Tabela 1).
27
Tabela 1 – Conteúdo de íons metálicos presentes no resíduo de eucalipto, farelo de arroz e farelo de soja em ppm.
Metal Resíduo de eucalipto Farelo de arroz Farelo de soja
Cálcio 1832 54 1522
Ferro 426 95 126
Cobre < 1 1,6 6,6
Manganês 183 144 34
Zinco < 10 < 10 < 10
Potássio 970 12914 23042
Mercúrio < 0,1 < 0,1 < 0,1
Cádmio < 0,02 < 0,1 < 0,05
Chumbo < 0,6 < 0,3 < 0,7
4.2 Organismo
As culturas de Lentinula edodes, identificadas como CCB-514 e SJC, sendo este último,
cultivado comercialmente, foram mantidas a 4 ºC em tubo inclinado contendo como meio de
manutenção batata-dextrose-ágar 2%.
As duas culturas de L. edodes foram repicadas em placas de Petri em meio de cultivo
BDA (batata-dextrose-ágar 2%) e incubadas a temperatura de 27 ± 2 ºC por 10 dias no escuro.
4.3 Produção do inóculo
Grãos de cevada foram imersos em água destilada e fervidos por 15 minutos. A água
em excesso foi escoada e 0,5% (m/m) de carbonato de cálcio e 2% (m/m) de sulfato de cálcio
foram adicionados para se evitar a aglomeração dos grãos de cevada (MORAIS et al., 2000).
Em frascos de vidro de 250 ml, foram acondicionados 100 g de grãos e autoclavados a 121 ºC
por 30 minutos. Após resfriamento, os grãos foram inoculados, em condições assépticas, com
dez discos de micélio (Ø = 8 mm), retirados das placas de Petri, preparadas conforme item
4.2. Os grãos de cevada inoculados foram incubados a 27 ± 2 ºC, por no mínimo 20 dias, no
escuro, até que todo o meio estivesse totalmente colonizado pelo micélio.
28
4.4 Crescimento em substrato sólido
Prévio aos experimentos, resíduo de eucalipto foi mantido em água destilada por um
período de 12 horas. O excesso de água foi então drenado e 10 ou 20% dos farelos de arroz ou
soja foram adicionados, em experimentos separados, considerando-se a massa seca do resíduo
de eucalipto e dos farelos. A umidade do meio de cultivo foi ajustada para 65% e 750 g da
mistura úmida foi acondicionada em sacolas de polipropileno (25 x 30 cm) introduzindo-se
um tubo de ensaio no centro do meio de cultivo com o objetivo de formar um canal de
inoculação da semente (Fotografia 1).
B
D C
Fotografia 1. Preparo do meio de cultivo em sacolas de polipropileno. (A) introdução do tubo de ensaio para formação do canal de inoculação do micélio; (B) fechamento das sacolas com o auxílio de dois anéis concêntricos de PVC e papel impermeável; (C) inóculo preparado em grãos de cevada e (D) tubo de ensaio retirado após resfriamento do meio de cultivo esterilizado para a introdução do inóculo.
29
As sacolas foram fechadas com o auxílio de dois anéis concêntricos de PVC e papel
impermeável. O conjunto todo foi autoclavado três vezes consecutivas a 115 ºC por 1 hora,
obedecendo a um intervalo de 24 horas. Após resfriamento, retirou-se o tubo de ensaio em
condições assépticas e cerca de 9 g do inóculo preparado conforme item 4.3 foram
introduzidos no canal. As sacolas foram novamente fechadas com anéis de PVC e papel
impermeável.
Neste experimento, dois diferentes controles foram efetuados. O primeiro controle foi
preparado apenas com o resíduo de eucalipto umedecido com água destilada e tratado da
mesma forma que as sacolas suplementadas com os farelos de cereais. O segundo controle foi
preparado somente com farelo de soja, utilizando vermiculita como material inerte. Para este
experimento, o farelo de soja foi misturado com vermiculita na proporção 20/80 em massa
seca. A umidade do meio foi ajustada para 65% e 250g de substrato foi acondicionado em
sacolas de polipropileno (10 x 15 cm). As sacolas foram fechadas com o auxílio de dois anéis
concêntricos de PVC e papel impermeável. Por fim, elas foram autoclavadas três vezes
consecutivas a 115 ºC por 1 hora, obedecendo a um intervalo de 24 horas. Após resfriamento,
cerca de 3 g, de inóculo preparado conforme item 4.3, foram adicionados ao substrato
controle. As sacolas foram novamente fechadas com anéis de PVC e papel impermeável.
4.5 Cultivo das linhagens em substratos tratados com peróxido de hidrogênio
Antes de proceder com o cultivo das linhagens em substratos descontaminados com
solução de peróxido de hidrogênio, o farelo de arroz foi previamente tratado com peróxido de
hidrogênio para que a catalase presente no farelo fosse inativada.
4.5.1 Tratamento do farelo de arroz com peróxido de hidrogênio
a) Inativação química de catalase
Ao farelo de arroz foram adicionados peróxido de hidrogênio nas concentrações de 50,
100, 150, 200 e 250 mM com o propósito de inativar as enzimas presentes, em especial a
catalase. As concentrações de peróxido usadas foram determinadas pela medida da
absorbância no comprimento de onda de 240 ηm (ε240 = 39,4 M-1 cm-1) (AEBI,1995).
Para cada tratamento, 3 ml de solução de H2O2 foram adicionados a 2g de farelo. Esta
mistura foi incubada a 60 ºC no escuro, por 15 min, baseando-se no estudo desenvolvido por
30
Anderson (2002). Após o tratamento, 5% de polivinil polipirrolidona (PVPP) e 20 ml de
tampão fosfato (50 mM, pH= 7,0) foram adicionados ao farelo tratado.
O material foi homogeneizado em agitador de tubos por 2 minutos e centrifugado a 7000
rpm por 20 min. O sobrenadante foi filtrado em papel de filtro sob vácuo.
O uso de PVPP teve o propósito de eliminar cromóforos dos extratos dos farelos e assim
evitar interferência no ensaio de catalase, o qual é realizado na região do comprimento de
onda do ultra-violeta (240 ηm).
b) Determinação da atividade de catalase
O extrato aquoso (2 ml) foi fracionado em uma coluna de permeação em gel Sephadex
G-75 de 30 x 1,5 cm eluída com água a 0,5 mL/min para discriminar por massas molares as
proteínas dos compostos não protéicos que absorvem na região ultra-violeta do espectro. O
eluente da coluna foi coletado em frações de 2 mL que foram analisadas quanto à absorção
em 280 nm. As frações que absorveram neste comprimento de onda foram reunidas,
liofilizadas e diluídas em 2 ml de tampão fostato de sódio e potássio (50 mM, pH=7,0) para
análise da atividade de catalase.
Em cubetas de quartzo de 1 mL foram adicionados 500 μl de amostra de proteína do
farelo de cereal obtida por permeação em gel, 500 μl H2O2 (20 mM). A redução do peróxido
de hidrogênio foi acompanhada pela absorbância por até 2 min em um comprimento de onda
de 240 ηm (ε240 = 39,4 M-1 cm-1 ) (AEBI, 1995). Para o branco, substituiu-se o extrato aquoso
por água destilada.
4.5.2 Descontaminação dos substratos com peróxido de hidrogênio
Resíduo de eucalipto suplementado com 10 ou 20% de farelo de arroz foi colocado
dentro de um recipiente com tampa capaz de manter um ambiente hermeticamente fechado
(Fotografia 2). A umidade do meio foi ajustada para 65% por adição de solução de peróxido
de hidrogênio a 750 mM.
31
Fotografia 2. Balde plástico com tampa capaz de manter ambiente hermeticamente fechado para descontaminação do substrato com peróxido de hidrogênio.
Após 24 horas, o recipiente foi destampado parcialmente para eliminar o peróxido
remanescente por mais 24 horas. Depois deste processo, 750 g de substrato úmido foi
acondicionado em sacolas de polipropileno, recebendo cerca de 9 g de inóculo. As sacolas
foram fechadas com o auxílio de dois anéis concêntricos de PVC e papel impermeável. Este
procedimento foi realizado em ambiente aberto, sem condições restritas de assepssia.
A análise de peróxido residual foi realizada pela oxidação de vermelho de fenol na
presença da peroxidase de rabanete (HRP). Para isto, 50 ml de água desionizada foram
adicionados a 10 g de substrato tratado com peróxido de hidrogênio, sob agitação de 100 rpm
por 30 min a temperatura ambiente. O sobrenadante foi recolhido por filtração e a
concentração do peróxido residual foi determinada utilizando uma curva de calibração
elaborada pela reação de oxidação de 100 μl de vermelho de fenol (0,1%) na presença de 100
μl de peroxidase (HRP 0,05%) e 100 μl de diferentes concentrações de H2O2 (0,05 – 3,0 mM)
durante um período de 30s em um meio tamponado com 700 μl de tampão fosfato (50 mM,
pH=7,0). A reação foi interrompida com 50 μl de NaOH (2N). Depois de manter o recipiente
parcialmente destampado por 24 h, 10 g do substrato tratado com peróxido de hidrogênio foi
32
separado e submetido à análise de peróxido residual, substituindo o volume de solução de
peróxido utilizado para elaboração da curva de calibração pelo extrato obtido deste substrato
(PICK; KEISARI, 1980).
4.6 Fase de colonização e frutificação
As sacolas de polipropileno contendo os substratos inoculados foram mantidas no
escuro, em sala com temperatura controlada a 27 ± 2 ºC. Após 30, 45, 60, 75 e 90 dias de
incubação, as sacolas de polipropileno foram removidas e submetidas ao processo de extração
enzimática, conforme plano de amostragem.
Para a indução da frutificação, os substratos cultivados por 90 dias foram transferidos
para a câmara de frutificação com temperatura controlada a 20 ± 2 ºC com umidade relativa
do ar entre 85 e 95 % (Fotografia 3). Durante o desenvolvimento dos basidiomas, o ambiente
de frutificação foi mantido a uma intensidade de luz natural durante o dia.
Fotografia 3. Câmara de frutificação com temperatura controlada a 20 ± 2 °C com umidade relativa do ar entre 85 e 95 %.
33
4.7 Colheita Os basidiomas foram colhidos durante 5 a 10 dias após a indução do corpo de
frutificação. Os cogumelos apresentaram ainda o chapéu fechado, mesmo após o rompimento
do véu. Os cogumelos colhidos foram pesados para determinação da eficiência biológica do
fungo. Este procedimento foi realizado em um único ciclo.
4.8 Métodos Analíticos
Com o objetivo de acompanhar as atividades enzimáticas relacionadas à degradação da
lignina, celulose e hemicelulose, bem como o crescimento da biomassa fúngica, foram
retiradas amostras dos meios de cultivo nos períodos de 30, 45, 60, 75 e 90 dias, conforme
descrito a seguir:
4.8.1 Plano de Amostragem e Extração Enzimática
Foi retirado, de cada sacola de polipropileno, cerca de 1/3 da parte superior do seu
conteúdo, transferindo-o para um béquer para homogeneização. O extrato enzimático foi
obtido após adição de100 ml de solução tampão acetato de sódio (50 mM; pH 5,0) a 20 g de
amostra de substrato biodegradado, considerado em massa seca. Após agitação a 100 rpm por
3 h e a 15 °C, o sobrenadante foi recuperado por centrifugação a 7000 rpm a 5ºC por 20 min
(Centrífuga refrigerada IEC-DAMON). Em seguida, o sobrenadante foi filtrado através de
filtro de cerâmica porosa sinterizada (nº. 4), sob vácuo. Os volumes de extratos enzimáticos,
obtidos em cada extração, foram acondicionados em frascos de vidro ou plástico e mantidos a
4°C. Dos extratos enzimáticos obtidos foram determinadas as atividades enzimáticas
relacionadas à degradação da lignina, celulose e hemicelulose A atividade foi expressa como
unidades internacionais (UI) por kg de substrato.
Outros 6 g de substrato biodegradado, também considerado em massa seca, foram
utilizados para determinação da biomassa fúngica e porcentagem de extrativos.
4.8.2 – Determinação das atividades enzimáticas
Xilanase: A atividade de xilanase foi determinada pela liberação de açúcares redutores a
partir do substrato xilana de bétula (Sigma–St. Louis, USA) (BAILEY; BIELY; POUTANEN,
34
1992). Os açúcares redutores liberados durante a reação foram determinados pelo método do
DNS (MILLER, 1959).
A reção foi conduzida em tubos de ensaio de 10 ml contendo 900 μl de xilana 1% em
tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) e 100 μl de extrato enzimático. A reação foi mantida
em banho-maria a 50 °C. Após 5 minutos a reação foi interrompida pela adição de 1,5 ml de
reagentes DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico). A mistura reacional foi aquecida em banho-maria
a 100 °C por 5 min e depois de esfriar mediu-se a absorbância em 540 ηm. Para o branco,
substituiu-se o caldo enzimático por tampão de extração enzimática e o tampão acetato de
sódio sem a adição de xilana. Para descontar o teor de açúcares redutores presentes no caldo e
na solução contendo o substrato, um outro procedimento controle foi feito adicionando o
próprio caldo após a adição de DNS. Xilose (seca em P2O5 a vácuo) foi utilizada para
construção da curva de calibração.
β-xilosidase: Esta atividade foi determinada utilizando p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo
(pNPX) (Sigma – St. Louis, USA) como substrato. O p-nitrofenol liberado após ação da β-
xilosidase foi determinado pela leitura da absorbância em 410 ηm (TAN; MAYERS;
SADDLER, 1987). Os valores de absorbância obtidos foram transformados em μmoles de p-
nitrofenol liberados em comparação à curva de calibração de p-nitrofenol.
A reção foi conduzida em tubos de ensaio de 10 ml contendo 800 μl de de pNPX 0,1%
em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) e 200 μl de extrato enzimático. A reação foi
mantida em banho-maria a 50 °C. Após 30 minutos, a reação foi interrompida pela adição de
2,0 ml de bicarbonato de sódio a 10%.
Endo-glicanase: A atividade endo-1,4-β-glicanase (CMCase) foi determinada pela técnica
descrita por Tanaka et al. (1981), que consiste em conduzir a hidrólise de uma solução de
carboximetilcelulose 0,44 % (viscosidade média - Sigma – St. Louis, USA) em tampão
acetato de sódio (50 mM; pH 5,0). A quantidade de açúcares redutores é determinada pelo
método do DNS (MILLER, 1959).
A reção foi conduzida em tubos de ensaio de 10 ml contendo 900 μl de solução de
carboximetil celulose e 100 μl de extrato enzimático. A reação foi mantida em banho-maria a
50 °C. Após 60 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 1,5 ml de reagentes DNS. A
mistura reacional foi aquecida em banho-maria a 100 °C por 5 min e depois de esfriar mediu-
35
se a absorbância em 540 ηm. Para o branco, substituiu-se o caldo enzimático por tampão
acetato de sódio. Para descontar o teor de açúcares redutores presentes no caldo e na solução
contendo o substrato, fez-se o mesmo procedimento das xilanases. Glicose (seca em P2O5 a
vácuo) foi utilizada para construção da curva de calibração.
β-glicosidase: Esta atividade foi determinada com p-nitrofenil-β-Dglicopiranosídeo (pNPG)
(Switzerland) como substrato enzimático. O p-nitrofenol liberado após ação de β-glicosidase
foi determinado pela leitura da absorbância em 410 ηm (TAN; MAYERS; SADDLER, 1987).
Os valores de absorbância obtidos foram transformados em μmoles de p-nitrofenol em
comparação à curva de calibração de p-nitrofenol.
A reção foi conduzida em tubos de ensaio de 10 ml contendo 800 μl de de pNPG 0,1%
em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,0) e 200 μl de extrato enzimático. A reação foi
mantida em banho-maria a 50 °C. Após 30 minutos, a reação foi interrompida pela adição de
2,0 ml de bicarbonato de sódio 10%.
Lacase: A atividade de lacase foi determinada pela oxidação de uma solução etanólica de
siringaldazina (Sigma – St. Louis, USA) 1,0 mM, medida a 525 nm (ε525 = 65 mM-1 cm-1). As
cinéticas foram acompanhadas em cubetas de quartzo de 1 ml contendo 100 μl do substrato,
300 μl de tampão citrato-fosfato (75 mM, pH 5,0), 100 μl de água destilada e 500 μl de
extrato enzimático. O aumento da absorbância, ocasionado pela oxidação do substrato, foi
acompanhado durante 10 min em espectrofotômetro (SZKLARZ et al., 1989).
A atividade de lacase também foi determinada pela oxidação de ABTS (ácido-2,2’-
azinobis-3-benzotiazolina-sulfônico) (Sigma – St. Louis, USA) 1,0 mM (NIKU-PAAVOLA
et al., 1988). Para este ensaio, as cinéticas foram acompanhadas em cubetas de quartzo de 1
ml contendo 100 μl do substrato, 300 μl de tampão citrato-fosfato (75 mM, pH 3,0), 100 μl de
água destilada e 500 μl de extrato enzimático. Para o branco substituiu-se o caldo enzimático
por tampão de extração enzimática. O aumento da absorbância, ocasionado pela oxidação do
substrato, foi acompanhado durante 10 min em espectrofotômetro e medida em 420 nm (ε420=
36 mM-1.cm-1).
36
Peroxidase: Para verificar se a oxidação de siringaldazina ocorreu por uma fenoloxidase,
dependente de peróxido, os 100 μl de água destilada foram substituídos por 100 μl de H2o2
(1,0 mM) (SZKLARZ et al., 1989).
Manganês peroxidase: A atividade de manganês peroxidase (MnP) foi determinada
utilizando uma solução de vermelho de fenol a 0,1% como substrato fenólico (ε 610 = 22 mM-
1cm-1) (KUWAHARA et al., 1984). A reção foi conduzida em cubetas de quartzo contendo
100 μl de lactato de sódio 0,25M, 200 μl de albumina bovina 0,5%, 100 μl de vermelho de
fenol 0,1%, 50 μl de MnSO4 (2 mM) e 500 μl de extrato enzimático. A reação foi iniciada
com a adição de 50μl de H2O2 e interrompida pela adição de 50μl de NaOH 2 N. A
absorbância foi lida em 610 nm
Lignina peroxidase: Para a determinação de atividades de lignina peroxidase (LiP), utilizou-
se o corante Azure B como substrato (ARCHIBALD, 1992). A reação foi conduzida em
cubetas de quartzo de 1 ml contendo 100 μl de Azure B (0,32 mM), 500 μl do extrato
enzimático, 300 μl de solução tartarato de sódio (50mM, pH=4,5). A reação é iniciada com
100 μl de H2O2 (1 mM). Para o branco, substituiu-se o corante por água destilada. A cinética
foi lida em 651 nm por 10 min (ε 651= 48,8 mM-1cm-1).
4.8.3 Determinação da biomassa fúngica
Esta determinação foi realizada pela quantificação do teor de ergosterol extraído da
bicamada de fosfolípideo da membrana celular do fungo. Este método foi realizado conforme
procedimento proposto por Montgomery et al. (2000).
Em tubos de ensaio (27 ml) foram colocados 300 mg de amostra de substrato
biodegradado e 1,0 ml de NaOH 2N para promover a saponificação da membrana celular.
Após 30 minutos, foram adicionados 2,0 ml de metanol (p.a.). O tubo foi vedado com filme
de polietileno, colocado dentro de um recipiente de plástico com tampa e aquecido em forno
de microondas com 1150 W a uma irradiação de 40% desta potência por 20 segundos. Após o
resfriamento por 15 minutos, o material foi novamente irradiado por mais 10 segundos. O
material contido no tubo foi então neutralizado com 1,0 ml HCl 2N e tratado com 2 ml de
metanol (p.a.). Após neutralização, foram adicionados 2,0 ml de pentano e agitado
vigorosamente por 2 min. O pentano que restou no sobrenadante foi recolhido e o mesmo
37
procedimento repetido por mais duas vezes. O volume total de pentano coletado foi
evaporado a frio com o auxílio de fluxo de nitrogênio e o resíduo foi resuspendido em 2 ml de
metanol (p.a.)
A análise cromatográfica utilizou uma coluna de fase reversa C18 eluída com metanol a
um fluxo de 1 ml/min. Foi utilizado um detector de UV operando em um comprimetno de
onda de 282 nm. A concentração de ergosterol presente na amostra foi determinada através de
uma curva de calibração construída com solução padrão de ergosterol em metanol nas
concentrações de 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 e 200 μg/ml.
A correlação entre o conteúdo de ergosterol e biomassa fúngica foi determinada
utilizando a biomassa micelial de L. edodes cultivada em caldo malte 2 %, por 5, 10, 15, 20 e
25 dias, a 25 °C, no escuro e sem agitação. A massa micelial foi coletada por filtração,
congelada a –50 ºC e liofilizada até peso constante. Cerca de 30 mg de massa micelial foram
submetidas ao mesmo processo de extração de ergosterol descrito acima.
4.8.4 Determinação de extrativos do meio de cultivo solúveis em etanol
Amostras dos meios de cultivo antes dos processos de esterilização, após os dois
métodos de esterilização e as amostras obtidas após os períodos de degradação de 30, 45, 60,
75 e 90 foram submetidas à extração de materiais solúveis em etanol 95%.
Estas amostras foram moídas em moinho de facas até passarem por uma malha de 30
mesh. Aproximadamente 1g de amostra moída foi extraída com etanol 95% em extrator
Soxhlet por 6 horas. Após a extração, as amostras foram secas em estufas a 60 ºC e
posteriormente a 105 ºC até peso constante, para o cálculo de material extraído do meio
cultivado (FERRAZ et al., 2000).
4.8.5 Perda de componentes do resíduo de eucalipto
O cálculo da perda de componentes (celulose, hemicelulose e lignina) e perda de
massa foi realizado como se segue:
Pc (%) = mci – mcf x 100 mci
38
onde:
Pc: perda de componentes
mci: % componente inicial x massa inicial do resíduo de eucalipto (base seca)
mcf: % componente final x massa final do resíduo de eucalipto (base seca)
Pm (%) = mi – mf x 100 mi
onde:
mi: massa inicial (base seca) em gramas
mf: massa final (base seca) em gramas
4.8.6 Determinação da eficiência biológica
A eficiência biológica (EB) foi determinada como proposto por Morais et al. (2000),
utilizando a seguinte fórmula:
Error! Bookmark not defined. mc EB = x 100
ms Onde,
EB - eficiência biológica (%)
mc - massa de cogumelo fresco em gramas
ms - massa inicial do substrato seco em gramas
4.8.7 Determinação do teor de proteínas
Amostras de basidiomas foram congelados a –50 ºC por 24 horas e liofilizados até
massa constante. A amostra liofilizada (30 g) foi moída com o auxílio de um bastão de vidro
e 100 mg foram colocadas em tubo de centrífuga juntamente com cerca de 100 mg de pérolas
de vidro (0,5 mm). Foram adicionados 10 ml de tampão fosfato de sódio e potássio (50 mM,
pH= 7,0) e NaCl 500 mM. Esta mistura foi agitada durante 1 min em agitador de tubos e em
seguida centrifugada por 20 min a 7000 rpm. O sobrenadante foi separado (fração I) e ao
material insolúvel adicionou-se 5 ml de NaOH 0,5 M. Os tubos foram aquecidos em forno de
microondas por 20 s a uma potência de 460 W e esfriado em banho de gelo. Este
39
procedimento foi repetido por mais 10s a 460 W e novamente esfriado em banho de gelo e
neutralizado com 5 ml de HCl 0,5 M. O material foi novamente centrifugado e o sobrenadante
recolhido e considerado como fração 2 (BRAAKSMA; SCHAAP, 1996). O precipitado foi
tratado mais uma vez com 10 ml de solução tampão fosfato de sódio e potássio (50 mM, pH=
7,0) e NaCl 500 mM, agitado por 1 min em agitador de tubos e centrifugado nas mesmas
condições descritas acima. Obteve-se o sobrenadante (fração 3). Esta última extração foi
realizada para recuperar proteína residual. Todas as frações foram analisadas quanto ao teor de
proteína (BRADFORD, 1976). Em tubos de ensaio, foram adicionados 0,1 ml de amostra
com 1 ml de reagente preparado com “Coomassie Brilliant Blue” G-250 (0,01% p/v), etanol
(4,7% p/v) e ácido fosfórico (8,5% p/v). A leitura de absorbância a 595 ηm foi realizada entre
30 e 60 minutos após início da reação a temperatura ambiente. O valor de absorbância foi
transformado em mg de proteína por g de cogumelo seco em comparação à curva de
calibração elaborada com soro de albumina bovina nas mesmas condições de ensaio.
Cada uma das frações foi precipitada com ácido tricloroacético (TCA) 15% na
proporção 1:1. A mistura de amostra e TCA foi homogeneizada em agitador de tubos por 2
min e centrifugada a 7000 rpm a 4 °C por 20 min. Nos sobrenadantes e nos precipitados
foram determinados os teores de proteína.
4.8.8 Matéria orgânica
O consumo de matéria orgânica (CMO) foi determinado de acordo com a fórmula
abaixo e expressa em porcentagem:
CMO (%) = x 100
mi – (mf – mm)
mi
Onde:
mi - massa inicial do substrato em massa seca (g)
mf - massa final do substrato em massa seca (g)
mm - massa micelial determinada pelo conteúdo de ergosterol (g)
40
4.8.9 Determinação de pH
Em frascos Erlenmeyer de 125 ml, 1 g de substrato biodegradado foi acondicionado com
100 ml de água deionizada. Após agitação por 1 h a 150 rpm e 25 °C, o pH foi medido em
pHmetro MICRONAL.
4.8.10 Análise estatística
Os dados de eficiência biológica e teor de proteínas que foram obtidos pelo cultivo de L.
edodes em diferentes substratos foram submetidos à análise de variância. A análise dos dados
foi estudada utilizando o programa estatístico STATGRAPHICS - 6.0.
4.9 Produção de LiP por Phanerochaete chrysosporium
A produção de LiP por P. chrysosporium foi realizada em meio líquido em condição
limitada de nitrogênio (Tabela 2).
Tabela 2 – Composição do meio líquido para produção de LiP por P. chrysosporium em condição
estacionária.
Composição do meio de cultura Solução de elementos traços em g/L Cloreto de sódio 1,0 Sulfato de manganês•1H2O 0,5 Sulfato de zinco•7H2O 0,18 Sulfato de cobalto•7H2O 0,18 Sulfato ferroso•7H2O 0,10 Sulfato de alumínio e potássio•12H2O 0,02 Ácido bórico 0,01 Molibidato de sódio 0,01 Sulfato de cobre•5H2O 0,01 Itens adicionados para 1000 ml de meio de cultura Glicose (g) 10,0 Fosfato monobásico de potássio (g) 2,0 Sulfato de magnésio•7H2O (g) 0,5 Tartarato de amônio (g) 0,22 Cloreto de cálcio (g) 0,10 Tiamina (mg) 1,0 Solução de elementos traços (mL) 1,0 Tampão tartarato de sódio e potássio (10 mM; pH 4,5) Álcool veratrílico para concentração final de 2,5 mM
41
As soluções para a elaboração do meio de cultura, bem como os frascos de 125 mL,
foram esterilizadas a 115 °C por 30 min antes de proceder com o cultivo.
4.9.1 Obtenção da solução de esporos de P. chrysosporium
Esporos de P. chrysosporium foram inoculados em tubos de ensaio inclinados contendo
como meio extrato de malte-ágar 2% e incubados a 37 °C por 5 dias para obtenção de mais
esporos. Os esporos foram então recolhidos com alíquotas de água destilada esterilizada e
filtrada em lã de vidro para eliminar micélio do meio. O filtrado foi centrifugado a 7000 rpm
por 20 min a 5 °C. O sobrenadante foi recolhido e a concentração de esporos foi determinada
por espectrofotometria a 650 ηm através da curva de calibração elaborada com soluções de
esporos com concentrações conhecidas por câmara de Neubauer (n° de esporos/mL= (Abs650 x
diluição / 0,1843) x 106).
4.9.2 Condições de cultivo de P. chrysosporium
Em frascos Erlenmeyers de 125 mL foram adicionados 20 mL de meio de cultura e
inoculados com 2,5 x 105 esporos/mL. Os frascos foram fechados com rolha de borracha
provido de dois tubos de vidro para entrada e saída de ar e incubados no escuro a 37 °C em
condição estacionária por 10 dias. Gás oxigênio (600 ml/min) foi introduzido no frasco após
inoculação por 3 min e este procedimento foi repetido a cada 2 dias. Um frasco foi retirado a
cada 2 dias e o conteúdo foi filtrado em papel de filtro Whatman n° 1 sob vácuo para a análise
de LiP.
42
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
L. edodes produz várias enzimas para degradar os substratos lignocelulósicos das quais
celulases, xilanases, lacases e Mn-peroxidases foram avaliadas ao longo do cultivo em resíduo
de eucalipto. Durante a fase vegetativa do crescimento ocorreram mudanças nas atividades
enzimáticas e no consumo de matéria orgânica indicando o progresso da colonização do
substrato.
Os resultados das atividades enzimáticas de duas linhagens de L. edodes cultivadas em
resíduo de eucalipto foram comparados em função do tipo e concentração de farelos de
cereais. A seleção das duas linhagens usadas neste trabalho ocorreu em função de estudo
anterior em que se verificou o rápido desenvolvimento em resíduo de eucalipto (SILVA;
MACHUCA; MILAGRES, 2005a), porém um estudo minucioso da produção das enzimas
que evidenciasse serem estas espécies promissoras para a degradação do substrato, ainda não
havia sido realizado.
5.1 Enzimas produzidas por L. edodes cultivado em substratos autoclavados
A atividade biodegradadora de L. edodes SJC e CCB 514 cultivados em resíduo de
eucalipto (controle) foi determinada por análise do conteúdo de celulose, hemicelulose e
lignina e da perda de massa do resíduo durante o cultivo dos fungos (Tabela 2). A massa de
resíduo de eucalipto foi determinada nas sacolas antes de inocular os fungos e nos períodos de
tempo definidos no ensaio. Foi possível constatar diferenças visuais no crescimento dos
isolados SJC e CCB 514 no primeiro mês de cultivo, mas que foram ficando menos evidentes
com o tempo. Verificou-se que o isolado CCB 514 apresentou um crescimento micelial mais
rápido, que refletiu na perda de massa do resíduo. Embora a massa de micélio tenha
aumentado com o tempo, a perda de massa do resíduo foi bastante alta, justificando os
resultados positivos obtidos no cálculo da perda de massa (Tabela 3).
A perda de celulose e hemicelulose foi muito semelhante entre as linhagens, enquanto a
perda de lignina foi mais significativa para a linhagem CCB 514, sugerindo que há diferenças
entre as linhagens.
43
Tabela 3: Porcentagem de celulose, hemicelulose e lignina do resíduo de eucalipto biodegradado pelos isolados de L. edodes
Tempo (mês)
mi (g) mf (g) % celulose % hemicelulose % lignina
0 39,5 13,97 32,3 1 319,2 304,7 36,1 12,4 30,1 2 322,8 264,7 36,8 12,5 28,1
SJC
3 314,9 229,4 39,3 12,8 29,1 0 39,5 13,97 32,3 1 318,1 284,9 37,1 12,8 27,0 2 316,8 253,4 37,1 12,3 19,1
CCB-514
3 314,1 235,5 40,3 12,4 19,4
Tabela 4: Perdas de componentes do resíduo de eucalipto.
Tempo (mês)
Perda de massa (%)
Perda de celulose (%)
Perda de hemicelulose (%)
Perda de lignina (%)
1 4,5 12,8 15,1 11,1 2 18,0 23,7 26,3 28,8
SJC
3 27,2 27,6 33,5 34,3 1 10,4 15,9 17,8 25,1 2 20,0 24,9 29,6 52,7
CCB 514
3 25,0 23,6 33,5 54,9
5.1.1 Resíduo de eucalipto suplementado com farelos de cereais
Nitrogênio é um importante elemento para o crescimento de todos os organismos. Ele é
essencial para a síntese de ácidos nucléicos, aminoácidos, proteínas e, no caso especial de
fungos, para a síntese de quitina, componente da parede celular. Os fungos de podridão branca
em seu ambiente natural, crescem em substratos que praticamente não contém nitrogênio.
Vários autores estudaram a influência de diversas fontes inorgânicas e orgânicas de nitrogênio
sobre o crescimento de espécies de L. edodes, obtendo resultados bastante variáveis quanto à
necessidade de se suplementar o substrato com fonte externa de nitrogênio (KAAL; FIELD;
JOYCE, 1995; BUSWELL; SHU-TING CHANG, 1995).
Leatham e Kirk (1983) mencionaram que, para a obtenção de rendimentos ótimos na
degradação de material lignocelulósico pobre em nitrogênio, a suplementação com este
elemento é essencial. Com espécies que não têm a atividade ligninolítica regulada por
44
nitrogênio, este poderia ser adicionado ao substrato sem que houvesse interferência na
degradação de lignina, o que poderia resultar na rápida e eficiente utilização do substrato e no
aumento do rendimento em cogumelos.
De qualquer forma, diferenças metabólicas entre linhagens de uma mesma espécie
podem causar grandes diferenças na habilidade de utilização de sais como fonte de nitrogênio
(MATA; SAVOIE, 1998; MORAIS et al., 2001; MORAIS et al., 2000; OHGA, 1992). Como
os resultados da literatura não deixam claro qual o tipo e concentração da fonte de nitrogênio
que se deve utilizar para suplementar o substrato e como a influência deste elemento é
dependente da espécie de fungo utilizada, farelo de arroz e de soja em duas diferentes
concentrações foram acrescentados ao substrato.
A influência da adição de nitrogênio foi apresentada e discutida para cada uma das
enzimas relacionadas à degradação de celulose, hemicelulose e lignina. As duas linhagens de
L. edodes colonizaram o substrato após 30 dias, a partir do inóculo, em 100%, enquanto que
no controle, o substrato foi colonizado apenas parcialmente. Após noventa dias de cultivo, a
colonização foi total em todos os tratamentos. As atividades das enzimas foram medidas após
30, 45, 60, 75 e 90 dias de cultivo. Os diferentes níveis de farelo de arroz ou soja
acrescentados ao resíduo de eucalipto aumentaram o conteúdo de nitrogênio orgânico, e
proporcionaram mudanças na produção de enzimas, quando comparado com o cultivo
realizado somente em resíduo de eucalipto.
A produção das enzimas hidrolíticas pelas duas linhagens de L. edodes variou durante o
cultivo nos meios preparados com os diferentes farelos de cereais. A hidrólise de celulose e
hemicelulose, ocasionada pela alta atividade das enzimas produzidas, gera grande quantidade
de carboidratos, que absorvidos pelo micélio estimula a formação do corpo de frutificação
(MATA; SAVOIE, 1998; OHGA, 1992).
5.1.1.1 Endo-1,4-β-glicanase (CMCase)
As duas linhagens de L. edodes, CCB-514 e SJC apresentaram perfis bastante distintos
na produção de CMCase em função da adição de farelos de cereais ao resíduo de eucalipto
(Gráfico 1). A adição de 10 ou 20% de farelo de arroz ao substrato não proporcionou um
aumento significativo na produção de CMCase pela linhagem SJC, quando comparado com o
controle (Gráfico 1A). No entanto, a linhagem CCB-514 apresentou após 30 dias de cultivo
aproximadamente 1200 UI/kg de CMCase nas duas concentrações de farelo de arroz, e em 45
45
dias obteve-se 1750 UI/kg de CMCase quando 20% de farelo de arroz foram combinados com
resíduo de eucalipto (Gráfico 1B).
A utilização de farelo de soja como suplemento do resíduo de eucalipto proporcionou
um aumento na produção de CMCase durante o cultivo das linhagens CCB-514 e SJC
(Gráficos 1C e 1D). Independente do meio de cultivo, a linhagem SJC produziu níveis
semelhantes de atividade de CMCase em 30 dias de incubação, porém com 10 % de farelo de
soja a maior atividade ocorreu em 60 dias (2000 UI/kg) (Gráfico 1C). Um pico de atividade
aconteceu em 45 dias no meio com 20% de farelo de soja. A linhagem CCB-514 produziu as
maiores atividades de CMCase em 30 dias quando o resíduo de eucalipto foi suplementado
com 20% de farelo de soja (Gráfico 1D).
0 15 30 45 60 75 900
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500SJC
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
CM
Cas
e (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500SJC
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
CM
Cas
e (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500 CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500CCB-514
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C)
(D)
Gráfico 1. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelos de cereais sobre a produção de CMCase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C.
L. edodes CCB-514 apresentou maior produtividade de CMCase que a linhagem SJC
nos meios em que houve a adição de 20% de farelo de soja, ocasionado provavelmente pela
46
menor razão C/N. Este comportamento foi observado anteriormente por SILVA; MACHUCA;
MILAGRES (2005b) para outros isolados de L. edodes em 30 dias de cultivo.
5.1.1.2 β-glicosidase
A produção de β-glicosidase pelas duas linhagens de L. edodes acompanhou a produção
de CMCase, evidenciando a função da β-glicosidase na conversão de celulose em glicose. O
perfil das atividades de β-glicosidase foi diferente entre CCB 514 e SJC (Gráfico 2).
80
60
40
200
0
0
0
1000
1200
Gráfico 2. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelos de cereais sobre a produção de β-glicosidase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C.
0 15 30 45 60 75 900
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
β-gl
icos
idas
e (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
200
400
600
800
1000
1200
SJC 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
β-gl
icos
idas
e (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
200
400
600
800
1000
1200
CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
200
400
600
800
1000
1200 CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(B)
(C) (D)
(A)
47
No substrato controle, a atividade foi baixa para as linhagens, enquanto que nos meios
suplementados com os farelos, a atividade foi mais alta para CCB 514. As suplementações do
resíduo de eucalipto com diferentes níveis de farelo de arroz não propiciaram um aumento
significativo na produção de β-glicosidase pela linhagem SJC durante os primeiros 45 dias de
cultivo (Gráfico 2A). Entretanto, a linhagem CCB-514 superou a linhagem SJC quando 20%
de farelo de arroz foram adicionados ao meio controle, alcançando 600 UI/kg (Gráfico 2B).
A linhagem CCB-514 produziu um pico de atividade de β-glicosidase em 30 dias de
cultivo com adição de 10% de farelo de arroz, alcançando 400 UI/kg e mantendo-se
praticamente constante até o final do experimento (Gráfico 2B). A produção de β-glicosidase
pela linhagem SJC foi pouco favorecida pela adição de farelo de soja (Gráfico 2C), mantendo-
se praticamente constante durante 90 dias e não se diferenciando da linhagem CCB-514
quando 10% de farelo de soja foram utilizados na suplementação do resíduo de eucalipto
(Gráfico 2D). Por outro lado, a adição de 20% de farelo de soja estimulou a produção de β-
glicosidase pela linhagem CCB-514, alcançando 1000 UI/kg em 30 dias, com forte queda de
atividade após este período, mas sendo mais significativo que a adição de 10% de farelo de
soja durante todo o período investigado (Gráfico 2D).
5.1.1.3 Xilanase
A adição de farelo de arroz ao resíduo de eucalipto não aumentou a produção de
xilanase quando comparado com o substrato controle, para as duas linhagens (Gráfico 3A e
3B). A atividade desta enzima manteve-se praticamente constante durante todo o período de
cultivo.
Resultados mais relevantes de produção de xilanase pelas duas linhagens foram obtidos
pela adição de farelo de soja (Gráfico 3C e 3D). A adição de 20% de farelo de soja ao resíduo
de eucalipto proporcionou maior atividade de xilanase pela linhagem CCB-514, alcançando
110 000 UI/kg em 30 dias (Gráfico 3D), enquanto a linhagem SJC produziu 90 000 UI/kg em
45 dias (Gráfico 3C). Valores mais baixos de atividade de xilanase foram observadas pela
adição de 10% de farelo de soja ao resíduo de eucalipto. Os resultados das atividades
produzidas pelas duas linhagens quando do uso de diferentes concentrações de farelo de arroz
ou 10% de farelo de soja não diferiram entre si. Observou-se diferença significativa apenas
entre o meio suplementado com 20% de farelo de soja e o substrato controle.
48
20000
8000
6000
2000
Gráfico 3. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelos de cereais sobre a produção de xilanase por linhage ns de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C.
5.1.1.4 β-xilosidase
As duas linhagens produziram β-xilosidase em todos os substratos usados neste estudo
durante 90 dias de cultivo. A linhagem CCB-514 foi extremamente ativa na produção de β-
xilosidase em 30 dias de cultivo quando comparada com a linhagem SJC, nas concentrações
de farelo de cereal usadas (Gráfico 4).
Baixos níveis de β-xilosidase foram observados com a linhagem SJC quando cultivada
em resíduo de eucalipto com concentrações variáveis de farelo de arroz, não apresentando
diferença significativa na produção desta enzima no substrato controle (Gráfico 4A). A adição
de farelo de arroz ao resíduo de eucalipto propiciou um aumento na atividade de β-xilosidase
em 30 dias de cultivo da linhagem CCB-514, alcançando 225 UI/kg (Gráfico 4B). Após este
período, uma a atividade desta enzima reduziu-se, mantendo-se constante até o fim do cultivo.
0 15 30 45 60 75 900
0
40000
0
0
100000
1SJC
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Xila
nase
(UI/k
g)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
20000
40000
60000
80000
100000
120000SJC
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Xila
nase
(UI/k
g)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000CCB-514
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
20000
40000
60000
80000
100000
120000CCB-514
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(B)
(C) (D)
(A)
49
Uma maior produção de β-xilosidase foram alcançados pela adição de farelo de soja ao
resíduo de eucalipto. Quando 20% de farelo foram adicionados, a linhagem SJC produziu
cerca de 200 UI/kg em 45 dias de cultivo (Gráfico 4C), semelhante ao obtido com a linhagem
CCB-514 em farelo de arroz. Não houve diferença significativa na produção de β-xilosidase
pela linhagem SJC cultivada em resíduo de eucalipto suplementado com diferentes níveis de
farelo de soja após 60 dias de cultivo (Gráfico 4C). A linhagem CCB-514 produziu cerca de
325 UI/kg da enzima em 30 dias de cultivo (Gráfico 4D). Após este tempo, observou-se uma
queda da produção desta enzima, a qual manteve-se em patamar mais baixo e constante até o
final do experimento.
0 15 30 45 60 75 900
50
100
150
200
250
300
350
400
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
β-xi
losi
dase
(UI/k
g)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
50
100
150
200
250
300
350
400
CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
50
100
150
200
250
300
350
400
CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(A) (B)
0 15 30 45 60 75 900
50
100
150
200
250
300
350
400
SJC 10% farelo de soja 20% farelo de soja
controle
β−xi
losi
dase
(UI/
kg)
Tempo (dias)
(C) (D)
Gráfico 4. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelos de cereais sobre a produção de β-xilosidase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C.
As linhagens cultivadas somente em resíduo de eucalipto produziram atividades de β-
xilosidase em níveis mais baixos do que quando cultivadas em resíduo de eucalipto
suplementado com concentrações variáveis de farelos de cereais.
50
Em trabalho anterior, realizado com estas linhagens em resíduo de eucalipto
suplementado com farelo de soja a 20% em 30 dias de cultivo, observou-se que as atividades
de xilanase e β-xilosidase aumentaram seis vezes, enquanto atividades de CMCase e β-
glicosidase apenas duplicaram (SILVA; MILAGRES, 2006). Este resultado foi semelhante ao
obtido neste estudo para os períodos iniciais do cultivo. Resultado semelhante foi obtido por
Dare, Clark e Chu-Chou (1988) durante a fase vegetativa de L. edodes em serragem de
madeira suplementada com farelo de cereal, em que atividades de xilanases e mananases
foram também altas no início do cultivo. A presença de substâncias facilmente disponíveis no
meio, como açúcares solúveis, aminoácidos, podem estar agindo como repressores das
celulases, sem causar o mesmo efeito na produção de hemicelulases. De fato, as
hemicelulases de alguns fungos não são reprimidas pelos produtos de hidrólise do substrato
(xilose, arabinose e xilobiose) quando estes estão presentes em baixas concentrações no meio,
mas o contrário ocorre para as celulases, a qual é reprimida por glicose e celobiose (ARO;
PAKULA; PENTILLÃ, 2005). Geralmente a presença de hemicelulose e compostos derivados
deste polímero induzem as hemicelulases, mas há outros resultados mostrando que
concentrações altas de xilose no meio de cultura podem agir como fonte de carbono
repressora de hemicelulase, como já demonstrado em A. niger (ARO; PAKULA; PENTILLÃ,
2005).
O aumento na degradação de celulose e hemicelulose foi observado no início dos
cultivos, principalmente nos meios suplementados com os farelos. Resultado semelhante foi
observado durante o cultivo de Pleurotus sajor-caju em palha de arroz ou trigo suplementado
com farelo de soja. Neste meio, em que a razão C/N foi baixa obteve-se maior atividade de
enzimas hidrolíticas (BISARIA; MADAN; VASUDEVAN, 1997). A disponibilidade de
nitrogênio é um fator que sabidamente afeta a produção de celulases e hemicelulases. Estudos
recentes mostraram que uma proteína (fator Are A), presente em muitos fungos, ativa os
genes do metabolismo do nitrogênio e afetam positivamente a produção de celulases (ARO;
PAKULA; PENTILLÃ, 2005).
5.1.1.5 Lacase
A produção de lacase pelos dois isolados foi maior quando o resíduo de eucalipto foi
suplementado com os farelos (Gráfico 5). Para a linhagem SJC, a maior atividade de lacase
51
ocorreu após 60 dias de cultivo (Gráficos 5A e 5C). Entretanto, o pico de produção de lacase
por CCB 514 ocorreu com 90 dias de incubação (Gráficos 5B e 5D).
0 15 30 45 60 75 900
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000SJC
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Laca
se (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000SJC
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Laca
se (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 5. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelos de cereais sobre a produção de lacase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C.
Resultados mais significativos na produção de lacase foram obtidos com o cultivo das
duas linhagens em resíduo de eucalipto combinado com os diferentes níveis de farelo de soja
(Gráficos 5C e 5D). A linhagem SJC produziu atividades semelhantes nos meios de cultivo
com 10 ou 20% de farelo de soja, alcançando 3500 UI/kg em 60 dias (Gráfico 5C). Quando se
utilizou o farelo de arroz, que possui um conteúdo protéico mais baixo que o farelo de soja, a
atividade de lacase foi mais alta em 20% de farelo (Gráficos 5A e 5C). Resultados
semelhantes foram obtidos para a produção de lacase por L. edodes em meio líquido com
concentração alta de nitrogênio (26 mM), o qual foi cinco vezes maior quando comparado
com nível baixo de nitrogênio (2,6 mM) (BUSWELL; CAI; CHANG, 1995).
52
A atividade de lacase foi detectada em níveis baixos no início do cultivo, aumentando a
atividade nos períodos finais provavelmente em função da indução da enzima por compostos
aromáticos provenientes da degradação do resíduo de eucalipto. De fato, a expressão de lacase
ocorre em estágios posteriores da colonização do substrato, principalmente durante a
formação de esporóforos, indicando que a expressão do gene da lacase seja importante para o
desenvolvimento do basidioma (CHEN et al., 2004).
Todos estes resultados de atividade de lacase foram obtidos pela oxidação de ABTS, um
substrato modelo de lignina fenólica. Outro substrato também utilizado para a determinação
de lacase foi siringaldazina, mas os extratos enzimáticos do cultivo das duas linhagens não
foram capazes de oxidá-lo. No entanto, ao adicionar peróxido de hidrogênio no meio
reacional observou-se a oxidação de siringaldazina, indicando que os extratos possuem uma
enzima dependente de peróxido.
5.1.1.6 Peroxidase
As atividades de peroxidase foram produzidas pelas linhagens de L. edodes durante todo
o período de cultivo analisado (Gráfico 6).
Atividades de peroxidases foram obtidas logo no início do cultivo de CCB-514,
alcançando atividade máxima em 60 e 75 dias, quando 20 ou 10% de farelo de arroz foram
adicionados ao resíduo de eucalipto, respectivamente (Gráfico 6B).
A adição de 20% de farelo de soja não aumentou a produção de peroxidase pela
linhagem SJC mostrando níveis de atividade comparáveis ao substrato controle (Gráfico 6C).
Nesta concentração de farelo de soja, a linhagem CCB-514 produziu uma atividade de lacase
superior ao controle, mas menor que o obtido em 10% de farelo de soja (Gráfico 6D). A
adição de 10% de farelo de soja proporcionou maiores atividades de peroxidase em 30 dias de
cultivo, com crescente aumento atingindo um patamar de atividade de 1750 UI/kg em 60 dias.
Porém, este pico de atividade não diferiu dos resultados alcançados com as diferentes
combinações de farelo de arroz para esta linhagem, apesar de apresentar o pico de atividade
em um tempo mais tardio quando 10% de farelo de arroz foram utilizados como suplemento
do resíduo de eucalipto.
A linhagem SJC produziu baixas atividades de peroxidase em resíduo de eucalipto e a
adição de concentrações crescentes de farelo de arroz aumentou a produção da enzima
(Gráfico 6A).
53
500
Gráfico 6. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelos de cereais sobre a produção de
peroxidase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C.
5.1.1.7 Manganês peroxidase (MnP)
A linhagem SJC produziu 4000 UI/kg de MnP em 45 dias quando suplementado com
20% de farelo de arroz, a qual manteve-se praticamente constante durante 90 dias (Gráfico
7A). Este mesmo substrato foi mais favorável para a linhagem CCB-514, pois a mesma
atividade foi obtida em 30 dias, seguido de uma redução de atividade em 45 dias, voltando a
aumentar em 60 dias para 8000 UI/kg (Gráfico 7B).
A adição de farelo de soja ao resíduo de eucalipto proporcionou um aumento da
atividade de MnP pela linhagem SJC chegando a 6000 UI/kg em 75 dias de cultivo, quando se
utilizou 10% de farelo de soja (Gráfico 7C). A linhagem CCB-514 alcançou a máxima
atividade em 30 dias e manteve-se constante durante 90 dias (Gráfico 7 D).
Em resíduo de eucalipto com 20% de farelo de soja obteve-se uma menor produção de
MnP pelas duas linhagens. Durante quase todo o período analisado, a atividade manteve-se
0 15 30 45 60 75 900
1000
1500
2000
2500
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Pero
xida
se (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
500
1000
1500
2000
2500
SJC 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Pero
xida
se (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
500
1000
1500
2000
2500CCB-514
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
500
1000
1500
2000
2500 CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(B)
(C) (D)
(A)
54
em nível semelhante ao do substrato controle, com tendência a aumentar no final (Gráficos 7C
e 7D). O resultado deste aumento foi alcançado com o cultivo de CCB-514, a qual produziu
8000 UI/kg em 90 dias (Gráfico 7D).
0 15 30 45 60 75 900
2000
4000
6000
8000
10000
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
MnP
(UI/k
g)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
2000
4000
6000
8000
10000
SJC 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
MnP
(UI/k
g)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
2000
4000
6000
8000
10000 CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
2000
4000
6000
8000
10000
CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 7. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelos de cereais sobre a produção de
MnP por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C.
A adição de uma alta concentração de farelo de soja ou a ausência deste nutriente no
meio afetou a produção de MnP. Em geral, a expressão de MnP é ativada pela diminuição da
fonte de nitrogênio e a expressão de muitos genes ocorre em resposta à escassez de algum
nutriente (ARO; PAKULA; PENTILLÃ, 2005). No entanto, outros estudos revelaram que a
natureza e a concentração da fonte de nitrogênio disponível exerce uma grande influência
sobre a produção de enzimas ligninolíticas por basidiomicetos que degradam madeira
(BOYLE, 1998). Embora a concentração e a fonte de nitrogênio afetem a produção de
enzimas ligninolíticas, não existe uma relação estrita entre estes dois fatores. Muitas fontes de
nitrogênio inibem a degradação de lignina por vários fungos de podridão branca, mas esta
inibição pode variar entre gêneros, espécies ou até mesmo entre linhagens de uma mesma
55
espécie (BOYLE, 1998). Várias espécies produzem altas atividades destas enzimas em
concentrações baixas de nitrogênio (2-3 mM). Entretanto, para outras espécies, a produção de
enzimas ligninolíticas é estimulada pela alta concentração de nitrogênio (25-60 mM)
(HATVANI; MÉCS, 2002).
A produção de manganês peroxidase (MnP) por L. edodes é bem estudada com relação à
concentração da fonte de nitrogênio, sempre avaliando a relação carbono/nitrogênio (C/N) dos
substratos (BUSWELL; CAI; CHANG, 1995; HATVANI; MÉCS, 2002; KAAL; FIELD;
JOYCE, 1995; SILVA; MACHUCA; MILAGRES, 2005b). Estudos realizados com Pleurotus
sajor-caju visando a degradação de lignina de palha de arroz suplementada com farinha de
soja, mostraram melhores resultados em uma razão C/N de 60 quando comparada a 74 ou 30
(BISARIA; MADAN; VASUDEVAN, 1997). Outro fator importante é o tipo da fonte de
nitrogênio, sendo que a atividade de MnP produzida por L. edodes na presença de nitrogênio
orgânico é mais alta do que na presença de nitrogênio inorgânico (HATVANI; MÉCS, 2002;
KAAL; FIELD; JOYCE, 1995). Nossos resultados mostram que as atividades de MnP
produzidas pelas duas linhagens de L. edodes foram reprimidas com alta concentração de
farelo de soja, não apresentando significativa diferença quando cultivadas somente em resíduo
de eucalipto. Estes resultados indicam que a produção de MnP por SJC e CCB 514 depende
da relação C/N. Sendo assim, as relações C/N alcançadas pela adição de farelo de arroz a 10
ou 20% e farelo de soja a 10%, apresentaram maior produtividade de MnP pelas duas
linhagens de L. edodes.
5.1.1.8 Lignina Peroxidase (LiP)
As linhagens de L. edodes não produziram LiP ou esta não foi detectada através do
ensaio com Azure B (ARCHIBALD, 1992). Esta metodologia é amplamente usada para a
determinação de LiP produzida em meios preparados com materiais lignocelulósicos. Cultivos
de P. chrysosporium, Trametes versicolor, Daedalea flavida, Irpex flavus e Polyporus
sanguineus em meio líquido, preparados com 1% de palha de trigo, palha de arroz e bagaço
de cana-de-açúcar, enriquecido com sais minerais, extratos de malte e álcool veratrílico não
apresentaram interferência no ensaio de oxidação de Azure B (ARORA; GILL, 2001). No
entanto, quando o ensaio da atividade de LiP foi realizado com álcool veratrílico e a leitura
da absorbãncia feita a 310 ηm, houve grande interferência por substâncias aromáticas,
presentes em extratos de cultivo de materiais lignocelulósicos, que absorvem neste
56
comprimento de onda, assim como, a interferência da atividade de álcool veratrílico oxidase
(ARORA; GILL, 2001; ARCHIBALD, 1992).
Paralelamente aos ensaios de LiP realizado nos extratos de cultivo de L. edodes, foi feito
um cultivo com Phanerochaete chrysosporium ATCC 24.725-UMIST (University of
Manchester Institute of Science and Technology - Inglaterra) em meio líquido. Os resultados
mostram que o pH ótimo para a atividade de LiP foi 3,5 e que a enzima oxida os substratos,
Azure B e álcool veratrílico, porém a atividade de LiP foi menor com Azure B (Tabela 5).
Tabela 5: Atividade de LiP em extrato de P. chrysosporium pela oxidação de diferentes substratos. Atividade expressa em UI/L.
Tartarato de sódio
(pH) Azure B Álcool veratrílico
3,5 13,8 40,6
4,5 9,1 22,4
O filtrado de cultivo de P. chrysosporium, com atividade de LiP foi adicionado
combinando 100, 200, 300 ou 400 μl do filtrado de cultivo de com 500 μl de extratos de L.
edodes. Em seguida, fêz-se uma nova determinação de atividade enzimática, utilizando Azure
B como substrato, e observou-se que a atividade de LiP desapareceu. A presença de
compostos aromáticos, íons metálicos ou produtos de degradação do substrato podem ter
inibido a LiP de P. chrysosoporium. Sendo assim, pode-se especular que ausência da
atividade de LiP nos cultivos realizados com L. edodes não implica que este fungo seja
deficiente na produção desta enzima. É possível que esta enzima seja produzida e em seguida
inativada, como aconteceu com a LiP de Phanerochaete chrysosporium. Essa informação é
reforçada por resultados da literatura que mostram que em outros cultivos de L. edodes esta
enzima foi detectada (ARORA; GILL, 2001; LI et al., 2004).
5.1.2 Variação de pH durante fase vegetativa de L. edodes
O pH reduziu durante o período de incubação das linhagens de L. edodes (Gráfico 8).
Um menor pH (3,5) foi observado com o cultivo das linhagens somente em resíduo de
57
eucalipto, enquanto nos meios suplementados com farelo de arroz o pH do meio de cultura
alterou de 5,5 para 4,5 após 30 dias de cultivo (Gráfico 8A e 8B).
0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0 CCB-514
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0 SJC
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
pH d
e cu
ltura
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
pH d
e cu
ltura
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0
CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
(C)
(A) (B)
(D)
Gráfico 8. Variação do pH durante o cultivo de linhagens de L. edodes em resíduo de eucalipto suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz e de soja a 27 ± 2ºC.
Uma diminuição menos expressiva de pH foi observada no substrato com 20% de farelo
de soja, porém a adição de 10% de farelo de soja ao resíduo de eucalipto também
proporcionou redução no pH para valores semelhantes aos meios com farelo de arroz (Gráfico
8C e 8D).
Ohga (1992) durante o cultivo de L. edodes em serragem suplementada com farelo de
cereais associou a redução do pH do meio à produção de ácidos orgânicos. De fato, já está
bem registrado que ácidos orgânicos, como oxálico, fumárico e málico são produzidos por
basidiomicetos de podridão branca em substratos lignocelulósicos (HAKALA et al., 2005;
58
HOFRICHTER et al.,1999). Por outro lado, Kalberer (1995) afirma que valor de pH baixo do
substrato é pré-requisito para formação de primórdios.
5.1.3 Extrativos do meio de cultivo
A porcentagem de extrativos do resíduo de eucalipto foi baixa, mas a adição dos farelos
de cereais aumentou a porcentagem de compostos solúveis, variando de 4 a 6% (Gráfico 9).
24
20
16
12
Gráfico 9. Porcentagem de extrativos solúveis em etanol 95% obtidos do cultivo de linhagens de L. edodes em resíduo de eucalipto suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz e de soja a 27 ± 2ºC.
Durante o cultivo das duas linhagens no resíduode eucalipto suplementado com farelo
de arroz observou-se um aumento significativo dos compostos extraíveis do meio, alcançando
cerca de 12% em 45 dias e não ocorreu diferença entre as duas linhagens (Gráfico 9A e 9B).
Após este período, ocorreu um aumento significativo de extrativos com a combinação de 20%
de farelo de arroz e resíduo de eucalipto, alcançando cerca de 18% com as duas linhagens de
0 15 30 45 60 75 900
4
8
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Solú
veis
em
eta
nol (
%)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
4
8
24
12
16
20
SJC 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Solú
veis
em
eta
nol (
%)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
4
8
12
16
20
24 CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
4
8
12
16
20
24 CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(B)
(C) (D)
(A)
59
L. edodes em 90 dias. O cultivo realizado somente com o resíduo de eucalipto apresentou
baixos teores de compostos solúveis em etanol 95% durante todo o tempo do cultivo.
As porcentagens de extrativos obtidas para as duas combinações de farelo de soja não
diferiram entre si em 30 dias (Gráficos 9C e 9D). No entanto, diferença significativa entre as
linhagens foi observada no final do experimento. Após 90 dias de cultivo, obteve-se cerca de
23% de compostos solúveis em etanol a partir do material biodegradado pela linhagem CCB
514 e 19% quando biodegradado pela linhagem SJC (Gráficos 9C e 9D).
Este aumento na porcentagem de compostos solúveis pode estar associado com a
degradação dos polímeros que compõem o substrato. Ohga (1992) mostrou resultados de
aumento dos compostos fenólicos e carboidratos solúveis em água durante a frutificação de L.
edodes, indicando diferença entre linhagens da mesma espécie. Posteriormente, Mata e Savoie
(1998) mostraram que a produção máxima de endo-glicanase e xilanase de seis linhagens de
L. edodes estava associada à liberação de açúcares redutores e fenóis solúveis em água.
5.1.4 Consumo de matéria orgânica (CMO)
O consumo de matéria orgânica durante o cultivo é um parâmetro pelo qual pode-se
avaliar a atividade de degradação do substrato de um determinado microrganismo. No cultivo
das linhagens SJC e CCB 514 em resíduo de eucalipto suplementado com a adição de
diferentes concentrações de farelos de cereais, observou-se alto consumo de matéria orgânica
seca (Gráfico 10).
As duas linhagens não diferiram entre si no CMO quando do uso de 10 ou 20% de farelo
de arroz até 45 dias de cultivo (Gráficos 10A e 10B). Entretanto, com 60 dias de cultivo, a
linhagem SJC consumiu cerca de 20% de matéria orgânica e CCB-514 consumiu cerca de
30%. No final do cultivo o consumo de matéria orgânica foi de 40% em resíduo de eucalipto
adicionado de 20% de farelo de arroz.
Nos meios contendo farelo de soja, o consumo de matéria orgânica pelas duas linhagens
foi praticamente o mesmo com os diferentes níveis de farelo de soja, alcançando cerca de
30% durante os primeiros 60 dias (Gráficos 10C e 10D).
A linhagem CCB-514 consumiu 45% da matéria orgânica para as duas concentrações de
farelo de soja testadas (Gráfico 10D).
As duas linhagens de L. edodes consumiram altos teores de matéria orgânica, mas pouca
diferença foi encontrada entre elas nos diferentes meios de cultivo. O consumo de matéria
orgânica (CMO) pela linhagem SJC foi praticamente a mesma usando qualquer combinação
60
de farelo de arroz ou soja. Entretanto, uma tendência em maior consumo de matéria orgânica
foi observada com a linhagem CCB-514 no final do cultivo quando o meio foi suplementado
com farelo de soja.
0 15 30 45 60 75 900
10
20
30
40
50SJC
10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
CM
O (%
)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
10
20
30
40
50
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
CM
O (%
)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
10
20
30
40
50 CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
10
20
30
40
50CCB-514
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C)
(D)
Gráfico 10. Consumo de matéria orgânica seca por linhagens de L. edodes, cultivadas em resíduo de eucalipto suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz e de soja a 27 ± 2ºC.
O consumo de matéria orgânica pelas linhagens correlaciona-se a com o conjunto de
enzimas hidrolíticas e oxidativas produzidas durante o cultivo e não com a produção de uma
enzima específica. Enquanto a linhagem CCB-514 produziu altas atividades de enzimas
hidrolíticas no início do cultivo e baixas atividades de lacase, nos ensaios com a linhagem
SJC, a atividade de lacase foi maior, apesar de apresentar menores atividades de enzimas
hidrolíticas neste período. Por outro lado, o fato da linhagem CCB-514 ter produzido maior
atividade de enzimas hidrolíticas que SJC, pode indicar que esta é uma linhagem com maior
potencial de gerar açúcares solúveis para produção de energia, formação de glicogênio e
61
síntese da parede celular (BROCK et al., 1994). De fato, foi observado em estudo realizado
por OGHA (1992) que o micélio de L. edodes acumula glicogênio durante a fase vegetativa
do fungo, cuja concentração diminui após a formação do basidioma.
Os resultados de consumo de matéria orgânica, contrariamente aos obtidos com a
produção de enzimas, não evidenciam que a razão C/N do meio afeta a degradação do
substrato. Resultados da literatura revelaram que uma razão C/N de 30 é ideal para maior
consumo de matéria orgânica (CMO) por P. Sajor-caju (BISARIA; MADAN; VASUDEVAN,
1997). Estes autores observaram que em palha de trigo ou arroz suplementado com farinha de
soja, um menor consumo de matéria orgânica é observado nos meios com baixa concentração
de nitrogênio.
O monitoramento do consumo de matéria orgânica pelas duas linhagens não indicou
qual linhagem absorveu mais nutrientes solúveis no meio de cultivo quando da adição de
diferentes níveis de farelos de cereais. No entanto, um aumento contínuo de substâncias
solúveis do meio de cultivo em etanol 95% foi observado para as duas linhagens de L. edodes.
A linhagem CCB-514 parece mostrar maior capacidade em hidrolisar e oxidar o substrato,
tornando-o mais solúvel e de fácil absorção pelo micélio, devido às altas atividades de
enzimas.
5.1.5 Biomassa fúngica
O efeito da suplementação do resíduo de eucalipto com os farelos de cereais altera a
produção de enzimas, consumo de matéria orgânica e consequentemente o crescimento do
fungo (BOYLE, 1998). O aumento da biomassa foi significativo no resíduo de eucalipto
suplementado com as diferentes concentrações de farelos de cereais (Gráfico 11). Em 60 dias
de cultivo, as linhagens de L. edodes não diferiram entre si quando 10 ou 20% de farelo de
arroz foram adicionados ao resíduo de eucalipto (Gráficos 11A e 11B). As massas de micélio
obtidas no meio suplementado com farelo de soja foram semelhantes às obtidas com a
suplementação do meio com farelo de arroz (Gráficos 11C e 11D).
62
0 15 30 45 60 75 900
1
2
3
4
5
6
7
8SJC
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Biom
assa
Fún
gica
(g)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
1
2
3
4
5
6
7
8
SJC 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Biom
assa
Fún
gica
(g)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
1
2
3
4
5
6
7
8 CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
1
2
3
4
5
6
7
8 CCB-514 10% farelo de soja 20% farelo de soja controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 11. Crescimento da biomassa fúngica durante o cultivo de linhagens de L. edodes em resíduo de eucalipto suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz e de soja a 27 ± 2ºC.
5.1.6 Eficiência biológica
As duas linhagens de L. edodes foram induzidas à frutificação com 90 dias de fase
vegetativa nos diferentes substratos. Entre as duas linhagens, somente a linhagem SJC
apresentou capacidade de frutificação nas condições de temperatura e umidade estabelecidas
(Fotografia 4).
O fato da linhagem CCB-514 não ter frutificado nos substratos testados, não significa
que a linhagem não tenha se adaptado às condições de cultivo. Pelo contrário, a linhagem
CCB 514 apresentou um rápido desenvolvimento, porém este não é o único fator requerido
pelo fungo para induzir a frutificação. Para otimização da produção de cogumelos e eficiência
biológica é importante conhecer a fonte e o conteúdo de celulose e lignina dos substratos.
63
Também é fato que não existe uma condição ambiental universal que leva a frutificação em
todos os fungos (KÜES; LIU, 2000). Um estudo mais amplo neste sentido foi apresentado por
Morais et al. (2000) com quatro linhagens de L. edodes em quatro substratos. Verificou-se que
o desenvolvimento de basidiomas ocorreu apenas em um dos substratos, sendo que uma das
linhagens não frutificou em nenhuma das formulações. Este resultado foi associado ao baixo
conteúdo de lignina e celulose em um dos substratos. Outro substrato que apresentou maior
conteúdo de lignina e celulose, mas com altos níveis de nitrogênio proveniente de farelo de
soja também inibiu a frutificação das linhagens de L. edodes.
3° dia2° dia
7° dia4° dia
Fotografia 4. Período de frutificação da linhagem de L. edodes SJC em câmara com temperatura controlada a 20 ± 2 °C com umidade relativa do ar entre 85 e 95%.
O início da frutificação da linhagem SJC ocorreu no 2° dia após indução da frutificação
e os cogumelos foram coletados entre o 6° e 7° dia. Não se observou diferença no tempo
64
necessário para frutificação em função do tipo de suplementação e a eficiência biológica
obtida nos diferentes substratos foi determinada (Tabela 6).
A adição de diferentes concentrações de farelos de cereais propiciou diferenças
significativas na eficiência biológica em um único ciclo. Resíduo de eucalipto suplementado
com 10 ou 20% de farelo de arroz foram os substratos que propiciaram maior eficiência
biológica e não apresentaram diferença significativa em nível de 95% de confiança,
alcançando 67% e 62,8%, respectivamente.
Tabela 6 – Eficiência biológica da linhagem de L. edodes SJC em diferentes substratos
Substrato Eficiência biológica (%) P < 0,05 * RE (100%) 15,2 ± 2,6 a RE (90%) + FA (10%) 67,0 ± 9,0 b RE (80%) + FA (20%) 62,8 ± 11,1 b RE (90%) + FS (10%) 22,8 ± 1,2 a RE – resíduo de eucalipto FA – farelo de arroz FS – farelo de soja *mesmas letras denotam nenhuma diferença significativa entre as médias da eficiência biológica em nível de 95% de confiança.
A eficiência biológica de SJC no meio com 10% de farelo de soja foi muito próxima ao
controle, e com 20% de farelo de soja não induziu a formação de basidiomas. Este resultado
pode estar associado ao alto teor de nitrogênio presente no farelo de soja, evidenciando que a
relação C/N do substrato é um fator de grande importância no sucesso do cultivo de
cogumelos. Estudos realizados por Philippoussis, Diamantopoulou e Zervakis (2003)
indicaram que substratos como serragem de madeira dura com razão C/N de 20,38 e palha de
trigo com 25,10 asseguraram maior eficiência biológica que espiga de milho com razão C/N
de 47,55. Para alcançar as relações C/N os substratos foram suplementados com farelos de
cereais, os quais aumentaram a disponibilidade de nitrogênio.
Variação na eficiência biológica entre 9,2 e 121,2% também foi observada durante o
cultivo de Pleurotus ostreatus em palha de trigo e folhas de avelã (YILDIZ et al., 2002). Essa
dispersão nos resultados foi associada com a disponibilidade de nitrogênio de fácil
assimilação contida em cada substrato.
Além de diferentes substratos proporcionarem variação na eficiência biológica, outro
fator importante é o tempo de fase vegetativa. Royse (1985) observou que fases vegetativas
65
longas, ou seja, o dobro da usual, aumenta significativamente a eficiência biológica, como
também o tamanho dos cogumelos.
5.1.7 Teor de proteína dos basidiomas
O conteúdo de proteína do basidioma de L. edodes depende da composição do meio de
cultivo, número de ciclos de frutificação, tempo de colheita e também da linhagem fúngica. L.
edodes apresenta em sua composição cerca de 10 a 17% (matéria seca) de proteína
(PRZYBYLOWICZ; DONOGHUE, 1990). Para o cogumelo Agaricus Blasei (cogumelo do
sol), o teor de proteínas é mais elevado, sendo encontrada principalmente no píleo com
55,16% (nos cogumelos menores) e 46,8% (nos maiores), confirmando seu potencial
nutricional (BRAGA et al, 1998). Geralmente, os métodos para determinar o conteúdo de
proteína são baseados na análise de aminoácidos e no uso de corantes que se ligam à proteína
(BRAKSMA; SCHAAP, 1996).
A extração das proteínas do basidiocarpo produzido pela linhagem SJC, cultivada em
diferentes substratos, foi feita em três etapas visando recuperar todo o seu conteúdo. A
primeira etapa consistiu na extração de proteínas solúveis em tampão, na segunda etapa foi
feita a saponificação da membrana celular com NaOH para extração de proteínas de
membrana e a terceira etapa foi novamente usado tampão para extração de proteína residual
no material que ainda permaneceu insolúvel (Tabela 7).
O total do conteúdo de proteínas obtido pela soma das três frações não apresentou
similaridade com a composição média apresentada na literatura (PRZYBYLOWICZ;
DONOGHUE, 1990). Pode-se verificar na Tabela 7 que o L. edodes linhagem SJC,
apresentou teores de proteínas superiores, principalmente quando suplementado com 20% de
farelo de arroz. De acordo com Braga et al. (1998), a idade, o ambiente, o local e a natureza
do substrato de cultivo também exercem grande influência em seu conteúdo protéico. Em
termos percentuais, geralmente, os cogumelos jovens são mais ricos em proteínas que os
maduros e que os cogumelos menores, apresentam maior teor de proteínas, principalmente na
região do píleo. Ao contrário dos tecidos animais, uma porção relativamente grande da
proteína existe, de fato, como aminoácidos livres nos tecidos vegetais e basidiomas. Este
valor pode, inclusive ultrapassar 50%.
66
Tabela 7– Estimativa do teor de proteínas em mg/g de massa seca dos basidiomas obtidos em diferentes substratos com a linhagem de L. edodes SJC pelo método de Bradford.
substrato Fração 1 Fração 2 Fração 3 Total
RE (100%) 227,8 ± 4,3 275,6 ± 17,2 51,2 ± 3,5 554,6 ± 13,8 RE (90%) + FA (10%) 208,6 ± 20,5 243,8 ± 4,7 48,7 ± 6,0 501,1 ± 23,0 RE (80%) + FA (20%) 305,7 ± 39,9 328,4 ± 10,8 61,4 ± 4,1 695,5 ± 41,6 RE (90%) + FS (10%) 224,0 ± 11,0 271,2 ± 24,0 50,4 ± 5,9 545,6 ± 35,3 Interferentes após precipitação de proteína com TCA 15% Fração 1 + Fração 2 Fração 3 RE (100%) 174,6 ± 16,4 0,5 ± 0,2 175,1 ± 16,3 RE (90%) + FA (10%) 149,0 ± 21,6 1,5 ± 0,9 150,5 ± 22,3 RE (80%) + FA (20%) 205,6 ± 26,9 11,4 ± 5,5 217,0 ± 29,5 RE (90%) + FS (10%) 174,5 ± 15,5 1,0 ± 0,7 175,5 ± 16,2 Teor de proteínas precipitadas com TCA 15% mg/g p<0,05 RE (100%) 173,0 ± 10,0 a RE (90%) + FA (10%) 183,2 ± 16,3 ab RE (80%) + FA (20%) 226,9 ± 8,9 c RE (90%) + FS (10%) 196,1 ± 3,8 b Fração 1, fração 2 e fração 3 – análise de proteína nos sobrenadantes antes e depois da precipitação com TCA 15%. RE – resíduo de eucalipto FA – farelo de arroz FS – farelo de soja *mesmas letras denotam nenhuma diferença significativa entre as médias do teor de proteínas
A avaliação da proteína real foi feita extraindo-se as proteínas do material, precipitando-
as com TCA (ácido tricloroacético) e determinando o teor de proteína do precipitado e do
sobrenadante (BRAAKSMA; SCHAAP, 1996). Verificou-se que o sobrenadante de cada
fração interferiu com o método de Bradford. A análise de proteínas precipitadas das frações 1,
2 e 3, mostrou um valor próximo dos reportados na litertura para L. edodes.
Os resultados da proteína precipitada com TCA mostram que os basidiomas
desenvolvidos nos meios contendo farelo contêm um maior teor de proteína.
5.2 Efeito do farelo de soja na produção de enzimas
Para se verificar se as linhagens produzem enzimas hidrolíticas e oxidativas pelo
consumo somente de farelo de soja, foram preparadas sacolas com meio composto por 20%
67
de farelo de soja e 80% de vermiculita. Os resultados foram comparados com a produção de
enzimas apenas em resíduo de eucalipto e no resíduo de eucalipto suplementado com 20% de
farelo de soja.
5.2.1 Endo-1,4-β-glicanase (CMCase)
O meio contendo somente farelo de soja proporcionou uma menor produção da enzima,
quando comparado ao controle com resíduo de eucalipto e principalmente com o resíduo
suplementado com o farelo de soja (Tabela 8). Portanto, maior produtividade desta enzima
para estar relacionada com a combinação do farelo de soja com o resíduo de eucalipto.
Tabela 8 – Produção de CMCase por duas linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto
suplementado com farelo de soja em comparação com substratos controle.
Linhagem Tempo Atividade de CMCase (UI/kg)
L. edodes (dias) VE + FS RE RE + FS
30 276 ± 6 723 ± 42 904 ± 62
45 470 ± 75 890 ± 70 2190 ± 363 SJC
60 320 ± 75 693 ± 118 1623 ± 178
30 194 ± 27 455 ± 42 1756 ± 138
45 248 ± 10 640 ± 127 980 ± 120 CCB-514
60 203 ± 17 157 ± 28 622 ± 85
VE + FS (80% vermiculita + 20% farelo de soja) RE – 100% residuo de eucalipto RE + FS (80% residuo de eucalipto + 20% farelo de soja)
5.2.2 β-glicosidase
A produção de β-glicosidase nos substratos controles foi diferente para as duas
linhagens quando comparada com a produção da enzima em resíduo de eucalipto
suplementado com 20% de farelo de soja (Tabela 9).
68
A produção de β-glicosidase por SJC em vermiculita ou resíduo de eucalipto,
suplementados com farelo de soja, foi maior que a obtida em resíduo de eucalipto,
evidenciando a importância do farelo de soja para a produção da β-glicosidase. Entretanto, a
linhagem CCB 514 produziu maiores quantidades de β-glicosidase em resíduo de eucalipto
suplementado com farelo de soja.
Tabela 9 – Produção de β-glicosidase por duas linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto suplementado com farelo de soja em comparação com substratos controle.
Linhagem Tempo Atividade de β-glicosidase (UI/kg)
L. edodes (dias) VE + FS RE RE + FS
30 298 ± 38 87 ± 6 145 ± 6
45 231 ± 7 121 ± 26 192 ± 14 SJC
60 338 ± 36 86 ± 17 296 ± 14
30 137 ± 3 53 ± 4 974 ± 78
45 84 ± 3 74 ± 17 679 ± 32 CCB-514
60 84 ± 14 57 ± 2 644 ± 88
VE + FS (80% vermiculita + 20% farelo de soja) RE – 100% residuo de eucalipto RE + FS (80% residuo de eucalipto + 20% farelo de soja)
5.2.3 Xilanase
A produção de xilanase pelas duas linhagens foi maior no substrato elaborado com
resíduo de eucalipto e farelo de soja (Tabela 10). Em qualquer período analisado, a produção
da enzima foi mais baixa para as duas linhagens quando cultivado em vermiculita
suplementada com farelo de soja.
Como já mencionado, a razão C/N alcançada pela suplementação rica em proteína
aumenta a produtividade de celulases e hemicelulases. Portanto, resíduo de eucalipto
suplementado com 20% de farelo de soja alcança razão C/N ideal para produção desta
enzima.
69
Tabela 10 – Produção de xilanase por duas linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto
suplementado com farelo de soja em comparação com substratos controle.
Linhagem Tempo Atividade de xilanase (UI/kg)
L. edodes (dias) VE + FS RE RE + FS
30 9644 ± 177 22608 ±749 62204 ± 8162
45 9703 ± 1091 29091 ± 3035 88049 ± 16506 SJC
60 9759 ± 1430 22073 ± 2668 45730 ± 10067
30 5037 ± 212 20255 ± 766 114407 ± 5733
45 6706 ± 160 17345 ± 1705 67210 ± 5407 CCB-514
60 6165 ± 563 16575 ± 1258 81202 ± 10667
VE + FS (80% vermiculita + 20% farelo de soja) RE – 100% residuo de eucalipto RE + FS (80% residuo de eucalipto + 20% farelo de soja)
5.2.4 β-xilosidase
Tabela 11 – Produção de β-xilosidase por duas linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto suplementado com farelo de soja em comparação com substratos controle.
Linhagem Tempo Atividade de β-xilosidase (UI/kg)
L. edodes (dias) VE + FS RE RE + FS
30 22,0 ± 0,3 18,8 ± 0,6 65,1 ± 5,6
45 14,1 ± 0,5 26,9 ± 5,3 199,5 ± 45,9 SJC
60 17,0 ± 0,9 20,1 ± 0,9 127,9 ± 27,5
30 6,6 ± 0,4 16,3 ± 1,6 314,7 ± 35,0
45 7,9 ± 0,5 23,4 ± 1,6 169,3 ± 35,1 CCB-514
60 7,0 ± 1,4 21,0± 1,8 97,2 ± 20,8
VE + FS (80% vermiculita + 20% farelo de soja) RE – 100% residuo de eucalipto RE + FS (80% residuo de eucalipto + 20% farelo de soja)
70
A produção de β-xilosidase também foi mais significativa quando o resíduo de eucalipto
foi combinado com 20% de farelo de soja. Os meios controles não diferenciaram
significativamente e proporcionaram atividades mais baixas (Tabela 11).
5.2.5 Lacase
A produção de lacases, obtida no início do cultivo, foi induzida pelo farelo de soja.
Em períodos de cultivo mais longos a linhagem SJC continuou a produzir lacase, mas o
mesmo não é observado para a linhagem CCB 514 (Tabela 12). Somente em farelo de soja, a
enzima é produzida, mas observa-se que o resíduo de eucalipto suplementado aumenta a
produtividade em períodos mais longos quando comparado com o cultivo somente em resíduo
de eucalipto.
Tabela 12– Produção de lacase por duas linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto suplementado com farelo de soja em comparação com substratos controle.
VE + FS (80% vermiculita + 20% farelo de soja)
Linhagem Tempo Atividade de lacase (UI/kg)
L. edodes (dias) VE + FS RE RE + FS
30 1886 ± 216 469 ± 103 1214 ± 66
45 184 ± 6 583 ± 96 1171 ± 120 SJC
60 770 ± 141 589 ± 177 3729 ± 509
30 764 ± 78 0 774 ± 150
45 611 ± 63 0 1919 ± 327 CCB-514
60 207 ± 30 16 ± 5 220 ± 19
RE – 100% residuo de eucalipto RE + FS (80% residuo de eucalipto + 20% farelo de soja)
5.2.6 Manganês-peroxidase
O cultivo das linhagens somente em farelo de soja não induziu a produtividade de MnP.
De fato, a produção de MnP é induzida pela presença de íons Mn (II), e o farelo de soja
apresenta baixa concentração deste íon (34 ppm). Entretanto, maior produção foi observada
71
com resíduo suplementado com a soja ou até mesmo somente em resíduo em que a
concentração do íon é maior, 153 e 183 ppm, respectivamente.
Tabela 13 – Produção de MnP por duas linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto
suplementado com farelo de soja em comparação com substratos controle.
VE + FS (80% vermiculita + 20% farelo de soja)
Linhagem Tempo Atividade de MnP (UI/kg)
L. edodes (dias) VE + FS RE RE + FS
30 0 13 ± 2 185 ± 52
45 66 ± 2 911 ± 58 780 ± 151 SJC
60 0 709 ± 100 346 ± 59
30 0 11 ± 2 151 ± 21
45 0 199 ± 33 583 ± 122 CCB-514
60 0 56 ± 16 1956 ± 305
RE – 100% residuo de eucalipto RE + FS (80% residuo de eucalipto + 20% farelo de soja)
O cultivo de Ceriporiopsis subvermispora em madeira de Pinus taeda, que possui uma
concentração de íons Mn(II) de 97 ppm apresentou atividade de MnP, mas o extrato dializado
não apresentou atividade da enzima, mesmo na presença de peróxido. Contudo, a atividade foi
restaurada com a adição de 111 μM de MnSO4 (Souza-Cruz et al, 2004).
5.2 Cultivo de L. edodes em substratos tratados com peróxido de hidrogênio
A ocorrência de fungos contaminantes e competidores é comum durante o cultivo de L.
edodes, pois a matéria-prima usada para o cultivo já vem com uma alta carga microbiológica.
Sabe-se que a incidência destes fungos em grandes proporções pode levar à improdutividade
do cultivo, e por isso várias formas de se tratar o meio para o cultivo de L. edodes tem sido
objeto de estudos. A escolha do método depende em boa parte, da eficiência e custo do
processo. Como anteriormente relatado, o tratamento térmico em autoclave é uma forma
eficiente de descontaminar o substrato, mas em contrapartida, necessita-se de equipamentos
que muitas vezes inviabilizam a produção em larga escala. Como uma alternativa aos
processos de descontaminação dos substratos usados na produção de cogumelos, foi feito um
72
ensaio de avaliação do efeito do peróxido de hidrogênio no tratamento do resíduo de eucalipto
suplementado com farelo de arroz, para o controle de fungos contaminantes e sua resposta na
produção de shiitake. Foram analisadas as atividades das enzimas hidrolíticas e oxidativas, o
consumo de matéria orgânica durante a fase vegetativa das duas linhagens de L. edodes (SJC
e CCB-514) cultivadas em substratos tratados com peróxido de hidrogênio.
5.3.1 Estudo de inativação de catalase do farelo de arroz
O farelo de arroz foi tratado com peróxido de hidrogênio nas concentrações de 0; 50;
100; 150; 200 e 250 mM e observou-se uma redução na atividade da catalase com o aumento
da concentração de peróxido (Gráfico 12).
0 50 100 150 200 250
0
20
40
60
80
100
Ativ
idad
e de
Cat
alas
e (%
)
H2O2 (mM)
Gráfico 12. Inativação de catalase do farelo de arroz por peróxido de hidrogênio.
Foi realizada extração de proteínas de farelo de arroz com solução tampão e determinou-
se atividade de catalase de 1,1 UI.ml-1. A inativação completa da enzima ocorreu com 250
mM de H2O2. Mesmo sendo o peróxido de hidrogênio o substrato da enzima, estudos
relacionados à inativação irreversível da catalase têm demonstrado que catalase é bastante
sensível às altas concentrações de peróxido de hidrogênio (ANDERSON, 2002; ESCOBAR;
RUBIO; LISSI, 1996; VALDERRAMA; AYALA; VAZQUEZ-DUHALT, 2002).
73
5.3.2 Tratamento dos substratos com peróxido de hidrogênio
Foi feito um primeiro ensaio em que o meio foi tratado com 250 mM de peróxido de
hidrogênio. Nos primeiros dez dias de incubação, foi possível observar uma grande
contaminação dos substratos por fungos que comprometeram o cultivo das duas linhagens de
L. edodes empregadas neste trabalho (Fotografia 5).
Fotografia 5. Contaminação dos substratos esterilizados com solução de peróxido de hidrogênio 250 mM após 10 dias de fase vegetativa de L. edodes.
Na tentativa de minimizar a contaminação, o resíduo de eucalipto suplementado com
diferentes níveis de farelos de arroz foi tratado com uma maior concentração de peróxido de
hidrogênio (750 mM). Verificou-se pouca contaminação durante o cultivo, (Fotografia 6),
pois nesta concentração, a solução de peróxido de hidrogênio foi capaz de inativar a catalase
presente no farelo de arroz, e também promover a descontaminação do meio de cultivo.
74
Fotografia 6. Substratos tratados com peróxido de hidrogênio 750 mM e inoculados com linhagens de L. edodes. Os cultivos são de 10 dias e o resíduo ainda não foi totalmente colonizado pelo fungo.
5.3.3 Produção de enzimas
As atividades das enzimas relacionadas à degradação da celulose, hemicelulose e lignina
foram medidas após 30, 45, 60, 75 e 90 dias de incubação, em resíduo de eucalipto
suplementado com farelo de arroz. Os resultados apresentados referem-se aos substratos que
foram descontaminados com peróxido de hidrogênio (Gráficos A e B) e aqueles tratados em
autoclave (Gráficos C e D).
5.3.3.1 Endo-1,4-β-glicanase (CMCase)
Independentemente do método usado na descontaminação do substrato, a atividade de
CMCase foi detectada em 30 dias de incubação (Gráfico 13). Nos substratos tratados com
75
solução de peróxido de hidrogênio (750 mM), pouca diferença foi observada na atividade de
CMCase quando 10 ou 20% de farelo de arroz foram adicionados ao resíduo de eucalipto
(Gráfico 13 A e 13B).
0 15 30 45 60 75 900
400
800
1200
1600
2000 CCB-514
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
400
800
1200
1600
2000 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
CMCa
se (U
I/kg)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
400
800
1200
1600
2000
CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
400
800
1200
1600
2000 SJC 10% de farelo arroz 20% de farelo arroz controle
CMCa
se (U
I/kg)
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 13. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelo de arroz na produção de CMCase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
Em 30 dias de cultivo, a linhagem SJC apresentou um pico de atividade de CMCase,
alcançando 1600 UI/kg com 20% de farelo de arroz (Gráfico 13A), enquanto a linhagem
CCB-514 produziu cerca de 1200 UI/kg de CMCase neste mesmo período, não se
diferenciando da linhagem SJC com a adição de 10% de farelo de arroz (Gráficos 13A e 13B).
Quando os substratos foram autoclavados, observou-se que a maior produção de
CMCase pela linhagem SJC ocorreu em 60 dias, independente da concentração de farelo de
arroz (Gráfico 13 C). Com a linhagem CCB-514 a maior atividade enzimática foi obtida com
76
45 dias de cultivo quando o resíduo de eucalipto foi suplementado com 20% de farelo de
arroz (Gráfico 13D).
A produção de CMCase em tempos mais curtos nos meios tratados com o peróxido de
hidrogênio pode ter sido ocasionado por alterções na estrutura da celulose. O peróxido de
hidrogênio forma o íon hidroperóxido que em contato com metais de transição produz radicais
que podem causar a clivagem das cadeias de celulose. Desta forma, o tratamento do substrato
com peróxido pode reduzir o tempo para o fungo iniciar a produção das celulases por
disponibilizar um substrato parcialmente hidrolisado.
5.3.3.2 β-glicosidase
A atividade β-glicosidase foi bem mais expressiva quando as duas linhagens foram
cultivadas em substratos tratados com peróxido de hidrogênio (Gráfico 14).
Gráfico 14. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelo de arroz na produção de β-glicosidase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
0 15 30 45 60 75 900
200
400
600
800
1000
1200
SJC 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
200
400
600
800
1000
1200
β-gl
icos
idas
e (U
I/kg) CCB-514
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
200
400
600
800
1000
1200
CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
200
400
600
800
1000
1200 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
(B)
(C) (D)
(A)
kg)
β-gl
icos
idas
e (U
I/
77
A adição de 20% de farelo de arroz proporcionou alta atividade de β-glicosidase pela
linhagem SJC, alcançando 1000 UI/kg em 30 dias de cultivo, sendo que a linhagem CCB-514
alcançou um patamar menor desta atividade neste mesmo período, alcançando cerca de 700
UI/kg, independente da concentração de farelo de arroz (Gráfico 14A e 14B).
Considerando o mesmo período de 30 dias, a atividade de β-glicosidase pelas duas
linhagens foi significante menor nos mesmos substratos autoclavados. Enquanto a linhagem
SJC alcançou 400 UI/kg em 60 dias de cultivo, a linhagem CCB-514 alcançou este mesmo
patamar em 30 dias (Gráfico 14 C e 14D).
Quanto ao substrato controle, em que somente resíduo de eucalipto foi utilizado para o
cultivo das duas linhagens, nenhuma diferença significativa ocorreu na atividade de β-
glicosidase, independente do método de esterilização utilizado (Gráfico 14).
5.3.3.3 Xilanase
A atividade de xilanase também foi favorecida nos cultivos em substrato tratado com o
peróxido de hidrogênio (Gráfico 15).
A linhagem SJC produziu um pico de atividade de 50000 e 40000 UI/kg em 30 dias de
cultivo quando 10 ou 20% de farelo de arroz foram utilizados, respectivamente. A linhagem
CCB-514 produziu atividade menor neste mesmo período (30000 UI/kg), independente da
concentração de farelo de arroz (Gráfico 15 A e 15B). Nos substratos autoclavados, a
produção de xilanase neste mesmo período alcançou 20000 UI/kg, independente da linhagem
cultivada e da concentração de farelo de arroz adicionada ao resíduo de eucalipto (Gráfico 15
C e 15D).
Apesar da alta atividade alcançada no período de trinta dias quando os substratos foram
tratados com peróxido de hidrogênio, a produção da enzima manteve-se em nível mais baixo
durante toda a fase vegetativa. O mesmo ocorreu com a linhagem CCB-514 quando os
substratos foram tratados por autoclavagem.
Enfim, a linhagem SJC alcançou atividades mais altas ao longo do cultivo quando os
substratos foram tratados por autoclavagem, independente da concentração de farelo de arroz.
78
0 15 30 45 60 75 900
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000 CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Xila
nse
(UI/k
g)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Xila
nase
(UI/k
g)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000 CCB-514
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 15. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelo de arroz na produção de xilanase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
5.3.3.4 β-xilosidase
O tratamento químico exerceu pouca influência na atividade de β-xilosidase para as
duas linhagens de L. edodes em comparação ao método de esterilização por autoclavagem
(Gráfico 16).
A linhagem de L. edodes CCB-514 apresentou resultados semelhantes de atividade de β-
xilosidase, alcançando patamar de 225 UI/kg em 30 dias de cultivo, com redução expressiva
da atividade em 45 dias, mantendo-se constante até o final da fase vegetativa (Gráfico 16 B e
16D).
79
0 15 30 45 60 75 900
50
100
150
200
250 SJC 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
β-xi
losid
ase
(UI/k
g)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
50
100
150
200
250 CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
50
100
150
200
250
SJC 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
β-xi
losid
ase
(UI/k
g)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
50
100
150
200
250 CCB-514
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 16. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelo de arroz na produção de β-xilosidase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
Resultado mais significante foi obtido com a linhagem SJC, em que o pico de atividade
de β-xilosidase alcançou um patamar de 100 UI/kg em 30 dias de cultivo quando 20% de
farelo de arroz foram combinados com resíduo de eucalipto, diferenciando da atividade de 50
UI/kg alcançada no substrato autoclavado (Gráfico 16A e 16C). Após 45 dias a atividade
reduziu drasticamente, assim como observado para a linhagem CCB-514.
Outro fator, que pode estar favorecendo a produção das enzimas hidrolíticas como
CMCase, β-glicosidase e xilanase nos substratos tratados quimicamente, é a disponibilidade
de oxigênio do meio. Sabe-se que a velocidade de miceliação não depende apenas da
formulação adequada do substrato, mas também do fornecimento de oxigênio que pode ser
melhorado com partículas de substratos menos compactadas (ZHANG; LI; FADEL, 2002).
De fato, foi observado neste estudo que o método de esterilização dos substratos por
autoclavagem proporciona um maior empacotamento das partículas que compõem o substrato
(Fotografia 1). Sendo que o contrário ocorre com o método de esterilização química,
80
facilitando o processo de aeração natural com conseqüente liberação facilitada de gás
carbônico (Fotografia 6). Enfim, a maior porosidade do meio pode favorecer a troca de gás
do interior do substrato para a superfície, aumentando o crescimento do micélio e o
desenvolvimento de basidiomas (ROYSE; RHODES; SANCHEZ, 2002).
5.3.3.5 Lacase
O peróxido de hidrogênio influenciou a produção de lacase pelas linhagens de L. edodes
(Gráfico 17A e 17B).
0 15 30 45 60 75 900
50010001500200025003000350040004500
SJC 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Laca
se (U
I/kg)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0500
10001500200025003000350040004500
CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
50010001500200025003000350040004500
CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0500
10001500200025003000350040004500 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Laca
se (U
I/kg)
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 17. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelo de arroz na produção de lacase por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
81
A produção enzimática foi significantemente mais baixa quando o substrato foi
inoculado com CCB 514, mesmo com a adição de diferentes concentrações de farelo de arroz
(Gráfico 17 B). Por outro lado, em substrato esterilizado por autoclavagem, a mesma
linhagem teve seu pico de produção deslocado, ocorrendo após 60 dias, com substancial
aumento de atividade em até 90 dias.
A produção de lacase pela linhagem SJC foi semelhante nos substratos tratados com o
peróxido de hidrogênio e autoclavado. Maior produção da enzima foi obtida em 90 dias
quando o substrato foi esterilizado pelo método químico, independente da concentração de
farelo de arroz (Gráfico 17A). Em comparação com o método de esterilização por
autoclavagem, a linhagem SJC alcançou um patamar de 3500 UI/kg em 60 dias em resíduo de
eucalipto com 20% de farelo de arroz (Gráfico 17C).
5.3.3.6 Manganês peroxidase
A atividade de MnP não foi estimulada quando o substrato foi tratado com peróxido de
hidrogênio (Gráfico 18), apesar da produção de MnP em geral ser regulada pela adição de
peróxido de hidrogênio e por condições de estresse do meio. Provavelmente, durante o longo
tempo necessário ao cultivo de L. dodes, o peróxido tenha se decomposto em oxigênio e água,
sem causar efeito na produção de MnP.
Li et al. (1995) examinaram o efeito do peróxido de hidrogênio na produção de MnP e
verificaram um aumento do número de cópias do RNA mensageiro para mnp quando o H2O2
foi adicionado juntamente com manganês. A transcrição de MnP ocorrreu com 1 mM de
H2O2, mas o mesmo efeito não foi observado com 2 mM do composto.
A adição de diferentes concentrações de farelo de arroz ao resíduo de eucalipto mostrou
um efeito positivo na atividade de MnP para as duas linhagens de L. edodes (Gráfico 18). A
adição de 20% de farelo de arroz ao resíduo de eucalipto proporcionou um aumento na
atividade de MnP, alcançando patamares mais elevados quando comparado com 10% de
farelo de arroz.
Verificou-se que o isolado CCB 514 apresentou atividade de MnP após 30 dias em todos
os meios de cultivo. Embora a produção de MnP pela linhagem SJC tenha sido mais
demorada, quando comparada ao isolado CCB 514, o mesmo apresentou atividade após 45
dias em todos os substratos.
82
8
6
3
4
1
2
Gráfico 18. Efeito do tempo e da adição de diferentes níveis de farelo de arroz na produção de MnP por linhagens de L. edodes cultivadas em resíduo de eucalipto a 27 ± 2 °C. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
5.3.4 Consumo de matéria orgânica
Os resultados de consumo de matéria orgânica, para as linhagens SJC e CCB 514, estão
apresentados no gráfico 19. Observou-se pouca diferença no consumo de matéria orgânica do
substrato descontaminado com o peróxido de hidrogênio ou autoclavado, após incubação com
as duas linhagens.
Resultado um pouco mais significativo foi observado com o cultivo da linhagem SJC
quando o resíduo de eucalipto foi suplementado com 20 % de farelo de arroz (Gráfico 19A).
Verificou-se variação na CMO de 20% a 40%, após 75 dias de incubação (Gráfico 19 A e
19C).
0 15 30 45 60 75 900
000
000000
000
5000000
7000
000 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
MnP
(UI/k
g)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
01000
20003000
40005000
6000
70008000
CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
1000
003000
005000
00
700000
20
40
60
80 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
MnP
(UI/k
g)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
01000
20003000
40005000
60007000
8000 CCB-514 10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
(B)
(C) (D)
(A)
83
O cultivo da linhagem CCB-514 em resíduo de eucalipto suplementado com diferentes
concentrações de farelo de arroz foi praticamente o mesmo com relação ao CMO (Gráfico
19B e 19D).
0 15 30 45 60 75 900
10
20
30
40
50CCB-514
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
10
20
30
40
50SJC
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
CMO
(%)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
10
20
30
40
50 SJC
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
CMO
(%)
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
10
20
30
40
50 CCB-514
10% Farelo de arroz 20% Farelo de arroz controle
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 19. Consumo de matéria orgânica seca por linhagens de L. edodes, cultivadas em resíduo de
eucalipto suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz a 27 ± 2ºC. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
5.3.5 Biomassa fúngica
As duas linhagens apresentaram perfis diferenciados em biomassa fúngica quando
cultivadas em substratos tratados com peróxido de hidrogênio em comparação aos substratos
tratados por autoclavagem (Gráfico 20).
Embora a suplementação do resíduo de eucalipto com farelo de arroz proporcionar
maior crescimento, a linhagem SJC alcançou níveis mais altos depois de 60 dias de cultivo em
84
resíduo de eucalipto suplementado com farelo de arroz, independente da concentração
utilizada (Gráfico 20A). Em comparação com substratos tratados por autoclavagem, a
linhagem alcançou níveis baixos de biomassa fúngica (Gráfico 20C).
O cultivo da linhagem CCB-514 em substratos suplementados e tratados com peróxido
apresentou, após 60 dias, pouca diferença em biomassa fúngica (Gráfico 20B), mas em
comparação com substratos suplementados e tratados por autoclavagem, nenhuma diferença
foi observada (Gráficos 20B e 20D).
0 15 30 45 60 75 900
2
4
6
8
10
12
14
CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
2
4
6
8
10
12
14 SJC
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Biom
assa
fúng
ica
(g)
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 900
2
4
6
8
10
12
14CCB-514
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
0
2
4
6
8
10
12
14 SJC
10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Biom
assa
Fún
gica
(g)
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 20. Crescimento da biomassa fúngica durante o cultivo de linhagens de L. edodes em resíduo
de eucalipto suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz a 27 ± 2ºC. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
85
5.3.6 Variação do pH durante a fase vegetativa
Embora a queda de pH ter ocorrido em todos os cultivos das duas linhagens, pouca
diferença significativa foi observada para os dois métodos de tratamento de descontaminação
dos substratos (Gráfico 21).
0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
pH d
e cu
ltura
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0
CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)
0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0
CCB-514 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
Tempo (dias)0 15 30 45 60 75 90
2.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0
SJC 10% farelo de arroz 20% farelo de arroz controle
pH d
e cu
ltura
Tempo (dias)
(A) (B)
(C) (D)
Gráfico 21.Variação do pH durante o cultivo de linhagens de L. edodes em resíduo de eucalipto
suplementado com concentrações variadas de farelo de arroz a 27 ± 2ºC. Substrato esterilizado com peróxido de hidrogênio (A e B) e substrato esterilizado por autoclavagem (C e D).
O cultivo da linhagem SJC em substratos tratados com peróxido de hidrogênio
apresentou uma redução um pouco maior de pH em comparação ao cultivo em resíduo de
eucalipto suplementado com farelo de arroz e tratados por autoclavagem, atingindo um valor
de pH de 4,0.
86
Normalmente, o crescimento micelial de várias espécies de basidiomicetos é menos
afetado pelo pH na região neutra, mas o desenvolvimento de basidiomas requer valores um
pouco mais baixos de pH, chegando em torno de 4,0 para L. edodes (OHGA, 1999).
5.3.7 Frutificação de L. edodes em substratos tratados com peróxido de hidrogênio
Experimentos em triplicata foram realizados para a indução da fruticação das linhagens
em substratos elaborados com resíduo de eucalipto com diferentes concentrações de farelo de
arroz para se comparar com os resultados obtidos anteriormente pelo processo de esterilização
dos substratos por autoclavagem. No entanto, devido à presença de contaminações por outros
microrganismos, não foi possível obter estes resultados, pois todas as outras amostras não
contaminadas foram coletadas e utilizadas durante a fase vegetativa para obtenção de dados
analíticos, os quais foram demonstrados e comparados com as análises realizadas com o
cultivo das linhagens em substratos esterilizados por autoclavagem.
87
6 CONCLUSÕES
Baseado nos resultados obtidos com o cultivo de duas linhagens de L. edodes em
resíduo de eucalipto, conclui-se que:
A regulação da produção de enzimas extracelulares de L. edodes é afetada pela
suplementação do resíduo comfarelo de cereais. Concentrações elevadas de farelo de
soja no meio de cultivo ocasiona uma repressão de enzimas oxidativas,
principalmente com MnP. No entanto, a produção de enzimas hidrolíticas é
estimulada pelo aumento da concentração de farelos de arroz e soja.
O efeito da suplementação do resíduo é positivo para o desenvolvimento de
biomassa e conseqüentemente maior consumo de matéria orgânica é observada.
A variação da concentração de farelo de cereais altera a eficiência biológica de L.
edodes. Concentração alta de farelo de soja não é propícia para frutificação. No
entanto, a concentração de farelo de arroz a 10% eleva a eficiência biológica de L.
edodes.
O acúmulo de proteínas nos basidiomas é regulado pelo cultivo de L. edodes em
resíduo suplementado, indicando que o tipo e a concentração de farelo de cereal
adicionado ao resíduo aumenta o teor de proteína.
As linhagens crescem bem no resíduo, suplementado ou não, produzem níveis altos
de enzimas extracelulares e apresentam alto consumo de matéria orgânica, mas
somente uma das linhagens produziu basidiomas, pelo menos nas condições de
temperatura e umidade estabelecidas para induzir a frutificação.
Como técnica alternativa de esterilização do substrato por autoclavagem, foi
avaliado a utilização de solução de peróxido de hidrogênio como agente de
descontaminação. Por comparação mostrou que: a produção de enzimas
extracelulares é favorecida pelo método químico de descontaminação, pois eleva a
níveis mais altos logo no início do cultivo; a produção de biomassa é diferenciada
entre as linhagens, sendo que uma delas apresentou maior crescimento, mas não
altera de forma significativa o consumo de matéria orgânica.
88
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