UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE … · Às minhas amigas Roselene Martins, Lauramares Aranha, Hildes Delduque e ... Heitor Vieira Dourado, no período entre janeiro

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

DIAGNÓSTICO DE VÍRUS CAUSADORES DE INFECÇÃO NO SISTEMA

NERVOSO CENTRAL EM UMA UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE NO ESTADO

DO AMAZONAS

MICHELE DE SOUZA BASTOS BARRIONUEVO

Manaus

2012

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DO AMAZONAS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas

Orientador (a): Profa Dra. Maria Paula Gomes Mourão

MANAUS

2012

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Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central da Universidade do Amazonas

B276d Barrionuevo, Michele de Souza Bastos. Diagnóstico de vírus causadores de infecção no sistema

nervoso central em uma Unidade Terciária de Saúde no Estado

do Amazonas /Michele de Souza Bastos Barrionuevo: UEA,

2012.

104 p.: il.; 30 cm

Orientador: Maria Paula Gomes Mourão

Tese (Doutorado em Doenças Tropicais e Infecciosas)

Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, 2012.

Inclui bibliografia

1. Meningoencefalite. 2. Infecções agudas – Sistema Nervoso. 3.

Herpesvírus. 4. Arbovírus. 5. Enterovírus I. Mourão, Maria Paula

Gomes. II. Universidade do Estado do Amazonas. III. Título

CDU 616-022.1:616.8(811.3)

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FOLHA DE JULGAMENTO



DO AMAZONAS


“Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças

Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-

Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em

convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”

Banca Julgadora:

____________________________________________

Profa Maria Paula Gomes Mourão, Dra.

Presidente

________________________________________

Prof. Luiz Tadeu Moraes de Figueiredo, Dr.

Membro

_______________________________________

Prof. Marcelo Cordeiro dos Santos, Dr.

Membro

_____________________________________

Prof. Maurício Lacerda Nogueira, Dr.

Membro

______________________________________

Prof. Wornei Silva Miranda Braga, Dr.

Membro

v

Dedicatória

“A minha mãe, Maria José de S. Bastos; a minha avó,

Francisca P. de Souza, pelos melhores conselhos

pelos bons exemplos e incentivos sempre.”

vi

Agradecimentos

Em primeiro lugar aos meus meninos, por todos os momentos em que estiveram ao

meu lado, pela paciência, pelo incentivo e por toda alegria que trouxeram e trazem a

minha vida: Cesar Leiva, meu marido; Caio Cesar e Enzo, meus filhos.

Aos meus irmãos, Ritta Bastos e Alessandro Bastos; à minha cunhada Lourdes

Colares e a minha sobrinha, Salomé Bastos, por serem sempre carinhosos,

incentivadores e solidários.

Às minhas amigas Roselene Martins, Lauramares Aranha, Hildes Delduque e

Regismeire Viana, pela amizade constante desde o mestrado, pelo incentivo, pela

presença e pelo apoio nos momentos de difícil decisão.

Aos meus professores orientadores da iniciação científica, Dra. Regina Luizão, Dra.

Ângela Líbia e Dr. Adalberto Val que, pela dedicação e ensinamentos, despertaram

em mim o interesse pela pesquisa.

À minha orientadora, Dra. Maria Paula Gomes Mourão, não somente pela idéia

central deste tema, mas também por ter acreditado, incentivado e orientado de modo

preciso, este trabalho.

À Rossicléia Lins Monte, por ter acreditado, incentivado, e pela primorosa triagem

das amostras.

À Dra. Regina Figueiredo, pela amizade, pelo incentivo constante e pela doação dos

primeiros recursos, para que este trabalho fosse adiante.

Ao amigo, Dr. Felipe Naveca, pela paciência, pelas minuciosas orientações

metodológicas e pela amizade que se solidificou ao logo deste trabalho.

Ao professor Luiz Tadeu Figueiredo pelos ensinamentos preciosos e pelas

experiências compartilhadas e, sobretudo, pelo carinho e incentivo constante.

Ao Dr. Rajendranath Ramasawmy, pelas orientações metodológicas e correções dos

textos em inglês e, especialmente, pelo incentivo, tolerância e amizade.

Ao Dr. Milton Moraes, pela orientação e ensinamentos de biologia molecular básica.

Aos professores doutores, Edson Elias da Silva e Eliane Veiga da Costa,

responsáveis pelo laboratório Referência Nacional de Enteroviroses, por terem me

recebido com todo carinho e pelo treinamento em cultivo celular de enterovirus.

À minha querida amiga Valquíria do Carmo Rodrigues Alves, pela presença

constante em minha vida, pela participação e apoio e por ter sido uma grande

companheira durante minha jornada academia.

vii

Às minhas preciosas alunas Natália Lessa e Valéria Kramer, não apenas pela

dedicação, participação ativa nos experimentos deste estudo mas, sobretudo, pelo

carinho e amizade.

À minha amiga, Jainara Cristina Alves, pelo apoio e carinho sempre.

Ao Dr. Sérgio Nozawa, por ter cedido gentilmente seu laboratório para o

sequenciamento das amostras.

A todos os professores do Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical, pelos

preciosos ensinamentos.

À Conceição Tufic e Altariza Freitas (Iza), secretárias do PPGMT, pela colaboração

e apoio sempre.

À Universidade do Estado do Amazonas e ao Programa de Pós-Graduação em

Medicina Tropical, por terem me acolhido e dado suporte para que este trabalho

fosse realizado.

Aos colegas da Gerência de Virologia da FMT-HVD, Dr. Wornei Braga, Dra. Cintia

Mara Oliveira, Dra. Márcia Castilho, Elisabeth Galusso, Evaulino Itapirema, Liane

Calado e alunos de graduação e pós-graduação Carol, Marcela, Sérgio e Renata,

pelo apoio constante e convívio agradável.

À Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, por permitir a realização

deste estudo.

À Dra. Leni Marreiros, Marlise Santana e Roosevelt Oliveira, pela pronta e eficiente

colaboração sempre que foi necessária.

À todos os colegas da pós-graduação, pela convivência agradável, pelo crescimento

e amadurecimento conjuntos.

À FAPEAM, que oportunamente financiou este projeto de pesquisa e concedeu a

bolsa de estudo.

À SUFRAMA, CAPES E FMURAKI, agências financiadoras e colaboradoras do

PPGMT.

viii

“A coisa mais importante na vida é ter uma grande meta

e possuir aptidão e perseverança para atingi-la”.

Goethe

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Resumo

As infecções agudas do sistema nervoso central são uma emergência médica e a

maioria é causada por vírus. Dentre estes, os mais importantes são os herpesvírus

humano os enterovírus e os arbovírus. A situação epidemiológica observada nos

últimos quatro anos na cidade de Manaus revelou uma incidência de 21% de casos

de meningites de provável etiologia viral, sem identificação do agente etiológico.

Sendo assim, o objetivo principal deste estudo foi identificar agentes virais que

causam infecção no sistema nervoso central em pacientes atendidos em uma

Unidade Terciária de Saúde no Amazonas, a Fundação de Medicina Tropical Dr.

Heitor Vieira Dourado, no período entre janeiro de 2010 a agosto de 2012. Durante a

etapa deste estudo um total de 165 amostras de LCR foram testadas por métodos

de diagnóstico molecular, tais como PCR e RT-PCR para identificação dos agentes

virais. A média de idade destes pacientes foi de 27,2 anos; 91 (55,1%) eram do sexo

masculino; 41 (24,8%) eram menores de 15 anos. O genoma de um ou mais

agentes virais foi detectado em 49 (29,7%) das 165 amostras de LCR coletadas. Os

enterovirus foram os mais prevalentes, sendo detectados em 16 (32,6%) das

amostras positivas, seguido pelos EBV em 11 (22,4%), VZV em 10 (20,4%), CMV

em 9 (18,4%), HSV-1 e HSV-2 em 2 (4,1%) cada, e pelos arbovirus em sete (14,3%);

quatro vírus dengue (DENV); e três vírus Oropouche (OROV). A detecção de

infecção simultânea por dois diferentes vírus, causando meningoencefalite, foi

identificada em 8 (16,4%) dos pacientes analisados, sendo mais frequente a

associação de CMV/VZV e EVs/EBV. Trata-se do primeiro estudo, na Amazônia

Ocidental Brasileira, para detecção e monitoramento de infeções virais no sistema

nervoso central que revela a importância desta abordagem para o manejo

apropriado dos pacientes afetados pela doença e para o planejamento das políticas

públicas de saúde.

Palavras chave: Meningoencefalite, arbovírus, enterovírus, herpesvírus, diagnóstico

molecular.

x

Summary

Acute infections of the central nervous system (CNS) are an important cause of

medical emergency. Most are due to viruses, especially the human herpesvirus,

enteroviruses and arboviruses. Epidemiology surveillance during the recent four

years in the city of Manaus revealed an incidence of 21% of meningitis of probable

viral etiology. However, the viral agents were not identified. The main aim of this

study was to identify the viruses that caused infections of the CNS in patients

enrolled in a Tertiary Health Unit of the state of Amazonas, the Fundação de

Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, from January 2010 through August

2012. A total of 165 samples of cerebrospinal fluid (CSF) was submitted for viral

molecular diagnostic by Polymerase Chain Reaction and Reverse Transcriptase -

Polymerase Chain Reaction. The mean age of the patients was 27.2 years. Of the

165 patients, 41 (24.8%) were below 15 years and 91 (55.1%) were male. In 49

samples (29.7%), the viral agents’ genomes were identified. Among these patients,

11 were >15 years, 9, 6 and 5 suffered from encephalitis, meningitis and

meningoencephalitis respectively. Co-infections (CMV/VZV; VZV/EBV; CMV/EVs and

EBV/EVs) were detected in 16,4%. Enteroviruses (16/49; 32.6%) were the most

prevalent, followed by EBV (11/49;22.4%), VZV (10/49;20.4%) CMV (9/49; 18.4%),

HSV-1 (2/49; 4.1%), HSV-2 ((2/49; 4.1%), and the arbovíruses (7/49;14.3%). Of the

arboviruses, 4 were of dengue virus (3 DENV-2 and 1 DENV-1) and 3 of the

oropouche virus (OROV). This is the first time such a study has been undertaken for

the identification of viral agents causing infections of the CNS in the Brazilian

Occidental Amazon. The detection of different viruses in the CNS of patients with

meningitis or encephalitis highlights the importance of maintaining a system of active

laboratorial monitoring diagnostics with rapid methodology of high sensitivity in areas

of viral hyperendemicity such as Manaus.

Keywords: Meningoencephalitis, arbovirus, enterovírus, herpesvírus, molecular

diagnostic.

xi

Lista de Abreviaturas

AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida

CMV Citomegalovírus

cDNA DNA Complementar

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DENV Vírus Dengue

DENV-1 Vírus dengue sorotipo 1




EBV Vírus Epstein-Barr

EEEV Vírus da Encefalite Equina do Leste

EV Enterovírus

FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

HEV Enterovírus Humano

HSV Vírus herpes simples

HSV-1 Vírus herpes simples tipo 1

HSV-2 Vírus herpes simples tipo 2

JEV Vírus da Encefalite Japonesa

LCR Líquido Cefalorraquidiano

LACV Vírus Lacross

MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal

MAC-ELISA Ensaio imunoenzimático para captura de IgM

NHE Núcleo Hospitalar de Epidemiologia

OROV Vírus Oropouche

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PV Poliovírus

RNA Ácido Ribonucléico

RT-PCR Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase

ROCV Vírus Rocio

SLEV Vírus da Encefalite de Saint Louis

SMV Síndrome da Meningoencefalite Viral

SNC Sistema Nervoso Central

TBEV Tick-borne encephalitis vírus

VZV Vírus Varicela Zoster

VEEV Vírus da Encefalite Equina Venezuelana

WNV Vírus do Oeste do Nilo

WEEV Vírus da Encefalite Equina do Oeste

xii

Lista de Figuras

Figura 1: Distribuição dos casos de meningites, por etiologia, atendidos em uma unidade terciária de saúde do Estado do Amazonas, a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, entre 2007 e 2010................................................................................................................

03

Figura 2: Representação esquemática do ciclo de vida dos arbovírus......................................................................................................... 14

Figura 3: Algoritmo de processamento das amostras de LCR para identificação viral................................................................................................................. 44

xiii

Lista de Tabelas

Tabela 1: Agentes causadores de doença neurológica, distribuídos de acordo com o material genético, DNA e RNA .............................................................. 05

Tabela 2: Distribuição dos Herpesvirus de acordo com a doença, epidemiologia, transmissão e rotas de acesso ao sistema nervoso central ........................ 06

Tabela 3: Classificação dos vírus da família Herpesviridae em subfamília, gênero, nome popular e latência .............................................................................. 07

Tabela 4: Propriedades biológicas das subfamílias dos Herpesviridae ....................... 08

Tabela 5: Distribuição dos vírus RNA, de acordo com a doença, epidemiológia, vetor e rotas de acesso ao sistema nervoso central ............................... 15

Tabela 6: Características do líquido cefalorraquidiano nas infecções bacterianas e virais ................................................................................................... 25

Tabela 7: Relação dos vírus investigados na pesquisa................................................. 32

Tabela 8: Relação dos iniciadores utilizados para detectar os vírus da família Herpesviridae................................................................................................ 34

Tabela 9: Relação das cepas virais utilizadas como controle....................................... 36

Tabela 10: Relação dos iniciadores utilizados para detecção dos gêneros Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus........................................................................ 38

Tabela 11: Relação dos iniciadores espécie-específicos utilizados no utilizados no estudo para identificação dos Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus .... 40

Tabela 12: Relação dos iniciadores utilizados para detecção dos Enterovirus................................................................................................... 43

xiv

Sumário

1 INTRODUÇÃO

1.1 Apresentação do problema.......................................................................... 02

1.2 A doença...................................................................................................... 04

1.3 Etiologia das meningoencefalites virais....................................................... 06

1.3.1 A família Herpesviridae............................................................................. 06

1.3.2 Estrutura viral............................................................................................ 07

1.3.3 Replicação viral......................................................................................... 09

1.3.4 Vírus herpes simples................................................................................. 09

1.3.5 Vírus varicela zoster.................................................................................. 11

1.3.6 Vírus epstain-barr...................................................................................... 11

1.3.7 Citomegalovirus......................................................................................... 12

1.4 Arbovírus...................................................................................................... 13

1.4.1 Família Flaviviridae................................................................................... 15

1.4.2 Família Togaviridae................................................................................... 19

1.4.3 Família Bunyaviridae................................................................................. 20

1.4.4 Família Picornaviridae............................................................................... 22

1.5 Diagnóstico Laboratorial.............................................................................. 24

2 OBJETIVOS

2.1 Geral............................................................................................................. 28

2.2 Específicos................................................................................................... 28

3 MATERIAL E METÓDOS

3.1 Tipo de Estudo............................................................................................. 30

3.1.1 Participantes do Estudo............................................................................ 30

3.1.2 Critérios de Inclusão.................................................................................. 30

3.1.3 Critérios de Exclusão................................................................................ 30

3.1.4 Critério de Exclusão a posteriori............................................................... 30

3.1.5 Aspectos éticos......................................................................................... 31

3.2 Seleção dos pacientes e coleta do material biológico................................. 31

3.3 Algoritmo de investigação e diagnóstico...................................................... 31

3.4 Diagnóstico Molecular................................................................................ 33

3.4.1 Metodologia para identificação dos vírus DNA......................................... 33

3.4.1.1 Extração do DNA da amostra ............................................................... 33

3.4.1.2 PCR para identificação dos vírus da família Herpesviridae................... 33

xv

3.4.2 Metodologia para identificação dos Arbovírus.......................................... 34

3.4.2.1 Cepas virais controle.............................................................................. 34

3.4.2.2 Produção dos Estoque virais utilizados como controles........................ 35

3.4.2.3 Isolamento viral em culturas celulares de mosquito A. albopictus......... 35

3.4.2.4 Extração do RNA viral............................................................................ 36

3.4.2.5 Reação de Transcrição Reversa RT...................................................... 36

3.4.2.6 Reação em Cadeia da Polimerase........................................................ 37

3.4.2.7 Detecção dos gêneros Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus......... 37

3.4.2.8 Semi-Nested-PCR para identificação de Alphavirus e Flavivirus.......... 39

3.4.2.9 Nested-PCR para identificação do vírus Oropouche............................. 39

3.4.3 Detecção do genoma viral dos Enterovirus.............................................. 41

3.4.3.1 Tentativas de isolamento viral em culturas celulares........................... 41

3.4.3.2 Detecção do gênero Enterovirus por RT-PCR....................................... 41

3.5 Visualização dos produtos amplificados...................................................... 43

3.6 Fluxograma simplificado da metodologia..................................................... 44

3.7 Sequenciamento Nucleotídeo...................................................................... 45

4 RESULTADOS

Resultados estão apresentados na forma de artigo........................................

Artigo publicado..................................................................................................

46

47

Artigo enviado para publicação......................................................................... 52

5 CONCLUSÃO

5.1 Conclusão.................................................................................................... 75

5.2 Considerações Finais.................................................................................. 77

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................

78

ANEXOS

Anexo 1: Protocolo de aprovação do projeto no Comitê de Ética em

Pesquisa da FMT-HVD...................................................................................... 96

Anexo 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido pós-informado............ 98

Anexo 3: Protocolo de seguimento hospitalar dos pacientes com suspeita de

infecção viral no sistema nervoso central.......................................................... 102

Anexo 4: Fluxograma para coleta e separação das amostras de LCR.............. 105

1 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

1. Introdução


1.1 APRESENTAÇÃO DO PROBLEMA

As infecções do sistema nervoso central (SNC) atingem anualmente milhões

de pessoas em todo o mundo. Podem ser causadas por vírus DNA e RNA e são

responsáveis por um grande numero de doenças neurológicas(1). Dentre elas, as

mais frequentes são as meningites, encefalites e meningoencefalites (2), infecções de

grande importância, devido ao grande potencial em causar danos neurológicos e

morte(3).

Estas infecções manifestam-se, geralmente, por um quadro clínico de início

súbito, agudo e com alta gravidade por sua localização, dependendo do agente

etiológico. Por outro lado, os sinais e sintomas apresentados por estes pacientes

estão relacionados à irritação meníngea e/ou ao acometimento encefálico, com

cefaleia, alterações da consciência e crises convulsivas e, na maioria dos casos, não

permitem chegar, pelo quadro clínico, à etiologia. Também, deve-se ressaltar que

existe tratamento antiviral efetivo para o caso de algumas meningoencefalites por

vírus, como é o caso da herpética e da citomegalovirótica quando utilizado,

idealmente com precocidade, pode melhorar significantemente a evolução desses

quadros(4). Ainda, para outras meningoencefalites, como as por arbovírus e

enterovírus, o conhecimento etiológico pode gerar medidas epidemiológicas visando

ao controle de surtos(5). Neste contexto, deve-se ressaltar que o diagnóstico

laboratorial rotineiro destas infecções não costuma ocorrer na maior parte do Brasil,

apesar da sua enorme importância.

A identificação de agentes virais causadores de meningites no Brasil só tem

sido possível em algumas situações, como nos surtos, nas quais existe um esforço

conjunto para o esclarecimento do agente etiológico. Sendo assim, o sistema de

vigilância epidemiológica de meningites virais dispõe de poucos dados sobre os

principais agentes(6).

A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD),

localizada na cidade de Manaus, estado do Amazonas, é um centro de referência

para doenças tropicais. O seu Núcleo Hospitalar de Epidemiologia (NHE) é

responsável por aproximadamente 80 a 90% das notificações de casos de

meningites conhecidos no município de Manaus. As meningites virais são


diagnosticadas neste hospital, como na maior parte do país, através da clínica,

citologia, bioquímica liquórica, e epidemiologia. No período entre 2007 a 2010 o NHE

da FMT-HDV, notificou, entre todos os casos de meningites, 21% de meningite com

suposta etiologia viral, porém sem diagnóstico etiológico definido (Figura 1).

Essa situação epidemiológica vivida no Brasil e mais especificamente no

Amazonas, demonstra a necessidade de desenvolver e padronizar metodologias

que possibilitem o diagnóstico confiável de agentes causadores da infecção no

sistema nervoso central.

Figura 1: Distribuição dos casos de meningites, por etiologia, atendidos em uma

unidade terciária de saúde do Estado do Amazonas, a Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, entre 2007 e 2010.

M. Bacteriana 66%

M. Tuberculose 3%

M. Não Especificada 6%

M. Viral 21%

M.Outras Etiologias 4%

Fonte: SINAN/FMT-HVD


1.2 A DOENÇA

As doenças infecciosas estão continuamente emergindo nas populações

humanas. Muitas destas infecções são reconhecidas como causa de doença

neurológica e 39% evoluem para quadros grave causando encefalite(7).

As infecções do sistema nervoso central podem ser classificadas segundo a

forma de apresentação, evolução clínica e região afetada do SNC. Neste aspecto,

as infecções são classificadas em meningites, encefalites e mielites.

Meningites são mais comuns na população pediátrica, cursando de forma

aguda com sinais meníngeos, cefaleia, fotofobia e febre. Geralmente é benigna, com

duração de, no máximo, duas semanas. Os enterovírus são os principais

responsáveis por casos de meningites virais em crianças(8).

Encefalite é um processo agudo, geralmente difuso, que acomete o encéfalo,

determinando alterações no nível de consciência, febre, convulsões e sinais

neurológicos focais. Dentre as causas estão os vírus, agentes etiológicos mais

importantes, destacando-se nos hospedeiros imunocompetentes os vírus do grupo

herpesvirus, arbovirus e enterovírus(9-11).

Mielite é a inflamação da medula espinhal e pode ser causada por vários

agentes incluindo os vírus e pode apresentar-se como paralisia flácida aguda ou

disfunção neurológica devido ao envolvimento da substancia branca. A infecção

mais proeminente da medula espinhal pode resultar na síndrome da mielite

transversa aguda, quando os indivíduos afetados exibem fraqueza, perda sensorial,

e comprometimento da bexiga urinária(12).

As infecções virais do sistema nervoso são quase sempre parte de uma

doença infecciosa sistêmica e generalizada. Assim, outros órgãos podem estar

envolvidos antes ou em associação com as manifestações clínicas do SNC, e as

evidências devem ser investigadas a partir da história ou durante o exame clínico do

paciente. Erupções cutâneas, por exemplo, são pouco frequentes em infecções

virais do sistema nervoso central, no entanto, podem estar relacionadas às infecções

por herpesvirus; sinais de doença gastrointestinal podem estar relacionadas à

enterovírus, também achados de infecção respiratória, como a gripe, podem

acompanhar infecções como encefalite pelo HSV-1(13).


Há uma variedade de vírus que podem invadir e causar doença no sistema

nervoso central, como observado na Tabela 1. Estes vírus estão agrupados de

acordo com o seu material genético, que é constituído por ácido ribonucleico (RNA)

ou ácido desoxirribonucleico (DNA)(14).

Tabela 1. Agentes causadores de doença neurológica, distribuídos de acordo com

material genético, DNA e RNA.

Doença neurológica RNA vírus DNA vírus

Meningites Coxsackievirus HSV-2 (associado com herpes genital primária), VZV

Echovirus

Caxumba (raro)

Encefalites JE vírus HSV-1 (adultos)

Coxsackievirus HSV-2 (recém-nascidos)

Echovirus Adenovirus, VZV, CMV

* Artropod-borne EBV

WNV, EEEV, WEEV, VEEV

SLEV

Mielites WNV

Poliovirus

HSV-1, VZV, EBV

Abreviaturas: CMV, citomegalovirus; EBV, vírus epstein-barr; EEEV, vírus da encefalite equina do leste; HSV, vírus do herpes simples; JEV, vírus da encefalite japonesa; VZV, vírus varicela zoster; VEEV, vírus da encefalite eqüina venezuelana; WEEV, vírus da encefalite eqüina do oeste; WNV, vírus do oeste do Nilo (14).


1.3 ETIOLOGIAS DA MENINGOENCEFALITE VIRAL

1.3.1 A Família Herpesviridae

A família Herpesviridae pertence à ordem Herpesvirales e possui mais de 200

espécies já identificadas(15); cinco delas são descritas como patógenos humanos

causadores de infecção no SNC. (Tabela 2).

Os herpesvírus são amplamente distribuídos na natureza. A maioria das

espécies animais hospeda algum destes vírus, os quais são uma das principais

causas de doenças virais humanas, perdendo apenas para o vírus da gripe. Eles

são capazes de estabelecer infecção latente em tecidos específicos(14).

Tabela 2. Distribuição dos herpesvirus de acordo com a doença, epidemiologia,

transmissão e rotas de acesso ao sistema nervoso central.

Vírus Doença no SNC Curso da doença Transmissão Rotas ao SNC

HSV tipo 1 Encefalite

Aguda (congênita)

Esporádica (reativação)

Humana Neuronal, sangue

HSV tipo 2 Meningite e encefalite

Primária ou recorrente

Aguda (congênita)

Humana Neuronal, sangue

CMV

Encefalite (imunossuprimidos e neonatos)

Aguda e

Subaguda Humana Sangue

EBV

Encefalite, meningite, mielites, Guillain-Berré síndrome

Aguda Humana Sangue

VZV Encefalite, meningite, mielite e cerebelite

Aguda pós-infecciosa,

Reativação latente Humana Sangue, neuronal

Abreviaturas: HSV, vírus do herpes simples; CMV, citomegalovírus; EBV, vírus epstein-barr; VZV, vírus varicela zoster.


O termo herpes é derivado do grego herpes, etos e do latim herpes, etis, que

significa doença da pele(16).

O Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus(17) classificou a família

Herpesviridae em três subfamílias: alphaherpesvirinae, betaherpesvirinae e

gammaherpesvirinae, de acordo com suas propriedades biológicas, sua localização

e estado de latência (Tabela 3 e Tabela 4).

Tabela 3. Classificação da família Herpesviridae em subfamília, gênero, nome

popular e latência.

1.3.2 Estrutura viral

O genoma dos herpesvirus é constituído de filamento linear de DNA fita dupla,

circundado pelo capsídeo icosaédrico contendo 162 capsômeros. Os herpesvirus

são dotados de envelope derivado de membrana nuclear, com capsídeo variando de

120 a 300nm. Esta variação está relacionada à espessura do tegumento e às

características do envelope. Envelopes intactos são impermeáveis e geralmente

mantêm o formato esférico do vírion(18).

Nome Oficial Subfamília Gênero Nome Popular Latência

Human

herpesvirus 1

Alphaherpesvirinae Simplexvirus Herpes simples

tipo 1 (HSV-1)

Neurônio

Human

herpesvirus 2

Alphaherpesvirinae Simplexvirus Herpes simples

tipo 2 (HSV-2)

Neurônio

Human

herpesvirus 3

Alphaherpesvirinae Varicellovirus Varicela zoster

(VZV)

Neurônio

Human

herpesvirus 4

Gammaherpesvirinae Lymphocryptovirus Epstein-Barr

(EBV)

Linfócito B

Human

herpesvirus 5

Betaherpesvirinae Cytomegalovirus Citomegalovirus

(CMV)

Monócitos,

linfócito

Human

herpesvirus 6

Betaherpesvirinae Roseolovirus Herpes vírus

linfotrópico (HHV-6)

Linfócito T

Human

herpesvirus 7

Betaherpesvirinae Roseolovirus Vírus herpes

humano 8 (HHV-8)

Linfócito T

Human

herpesvirus 8

Gamaherpesvirinae Rhadinovirus Sarcoma de

Kaposi (KSHV)

Desconhecido

Fonte: www.ictvonline.org (2012)

http://www.ictvonline.org/


Tabela 4. Propriedades biológicas das subfamílias dos vírus da família Herpesviridae

Propriedades comuns

- O genoma é de DNA dupla fita, linear e grande.

- A síntese de DNA e montagem de capsídeo ocorre dentro do núcleo, adquire envelope por brotamento através da membrana nuclear.

- Apresenta uma grande variedade de enzimas envolvidas no metabolismo e síntese do ácido nucléico.

- Produção da progênie viral resulta na destruição da célula hospedeira.

- Estabelece latência em seus hospedeiros naturais.

Alphaherpesvirinae

- Gama de hospedeiros variáveis

- Ciclo reprodutivo curto.

- Rápida propagação em cultura de células.

- Destruição eficiente de células infectadas.

- Estabelece latência, principalmente, mas não com exclusividade nos gânglios sensoriais.

Betaherpesvirinae

- Gama de hospedeiros restritos (propriedade não exclusiva desta subfamília)

- Ciclo reprodutivo longo.

- Propagação lenta em cultura.

- Latência nas glândulas secretoras, células linforeticulares, rins e outros tecidos.

Gammaherpesvirinae

- Gama de hospedeiros experimentais limitados à família ou à ordem do hospedeiro natural.

- Replicação in vitro em células linfoblastóides.

- Na replicação in vivo e latência em ambos os linfócitos T ou B.

Adaptado de (CLEATOR & KLAPPER, 2005)(15)


1.3.3 Replicação viral

O ciclo replicativo inicia-se com a ligação do vírus aos receptores de

superfície celular, através das glicoproteínas do envelope externo. O nucleocapsídeo

é liberado no citoplasma através da fusão do envoltório com a membrana

plasmática. Após penetrar no núcleo celular a proteína regulatória viral é ativada e

leva a tradução dos genes alfa e beta. Assim, ocorre a produção de múltiplas cópias

do DNA de novos vírions do herpes vírus(18).

O genoma viral é transcrito por uma RNA polimerase DNA dependente, e

regulados por fatores nucleares da célula hospedeira. A inter-relação destes fatores

determina se a infecção será lítica, persistente ou latente.

Após a infecção no hospedeiro natural, o vírus estabelece uma infecção

latente que persiste durante toda a vida. No estado latente apenas um pequeno

subconjunto dos genes virais são expressos. A reativação, com expressão de

proteínas virais e produção de progênie viral, pode ocorrer em intervalos e produzir

infecção recorrente.

1.3.4 Vírus herpes simples

Os vírus do herpes simples (HSV) foram os primeiros vírus humanos a serem

descobertos e estão entre os mais intensamente estudados. Com base em

similaridades do genoma, tipagem sorológica e sintomas clínicos, foram separados

em dois tipos: herpes simples tipo 1 (HSV-1) e herpes simples tipo 2 (HSV-2)(19).

O homem é o único hospedeiro natural. Durante a infecção, estes vírus

estabelecem latência, sempre nos sítio da infecção primária que, para o HSV-1 é o

gânglio trigêmeo; e para o HSV-2, o gânglio sacral. Outros sítios, como a raiz do

gânglio dorsal, incluindo o cervical superior, vagal e gânglio genicular também

podem abrigá-los(15).

As infecções mais severas causadas por estes vírus ocorrem no sistema

nervoso central são as encefalite e as meningites asséptica.


A encefalite por herpes simples produz uma infecção nos neurônios têmporo-

mediais com intenso fenômeno inflamatório local. A doença é progressiva e a

gravidade dos sintomas aumenta; leva a uma redução da consciência, podendo

evoluir para casos graves como o coma e ou a morte. A encefalite herpética ocorre

em todas as idades e gêneros com a mesma frequência(15).

Os HSV são os agentes mais comuns em casos de encefalite esporádica fatal

(20). O HSV-1 é responsável por 90% dos casos de encefalite focal em adolescentes

e adultos imunocompetentes. O HSV-2 está associado à encefalite em pacientes

imunocomprometidos(21). A encefalite por herpesvírus não tratada tem uma taxa de

70% de letalidade; em pacientes tratados, diminui para 19%, no entanto 50% destes

pacientes apresentam sequelas neurológicas que vão de moderada a grave.

A incidência desta doença, só nos EUA, é de aproximadamente 2000 casos

por ano, sendo o HSV-1 responsável por mais de 90% das encefalite na infância e

nos adultos (22). É preciso ressaltar que um terço dos casos de encefalite HSV-1

ocorre em menores de 20 anos, em consequência de uma infecção primária,

enquanto o restante dos casos é decorrente da reativação viral. Em contraste, o

HSV-2 é responsável por 80% dos casos no período neonatal, em consequência da

passagem por um canal de parto infectado(23).

Outras complicações observadas em associação com o HSV-2 são as

doenças neurológicas, incluindo meningite asséptica, radiculopatia recorrente e

mielite, em pacientes imunocomprometidos. Os sintomas observados são dores de

cabeça, febre, rigidez de nuca e pleocitose linfomonocitária no LCR(24).

A meningite causada pelo HSV-2 ocorre entre 4-8% dos casos de herpes

genital primário. As mulheres parecem ser mais afetadas que os homens, apesar de

o HSV-2 ser a causa mais comum. Ocasionalmente, o HSV-1 também pode causar

meningite após infecção genital primária(15).

A patogênese de encefalite por herpes ainda não é muito bem compreendida.

A estrutura da vasculatura dentro do cérebro, juntamente com as meninges que o

envolvem, representam, no hospedeiro fisiologicamente normal, uma barreira

significativa à entrada de vírus para o parênquima cerebral. A disseminação viral

através da via hematogênea para o cérebro é normalmente evitada pelas barreiras

sangue-cérebro e sangue-líquido cefalorraquidiano. Para ter acesso ao órgão, o


vírus deve contornar as barreiras anatomo-fisiológicas. O vírus pode conseguir este

trânsito a partir da periferia dentro das células nervosas. Várias vias têm sido

propostas, mas, embora com toda a probabilidade, não há ainda, uma rota que

explique todos os casos de encefalite por herpes(15). Acredita-se que os lobos

frontais e temporais, associados à estrutura límbica do cérebro, parecem ser os

alvos principais do processo infeccioso(25).

1.3.5 Vírus varicela zoster

O vírus varicela-zoster (VZV), outro membro dos herpesvirus, causa encefalite

que segue três diferentes padrões clínicos, dependendo da localização do vírus

durante a reativação e de como ele foi transportado para o sistema nervoso central.

A disseminação por via hematogênea leva à vasculite de grandes vasos (infartos

isquêmicos ou hemorrágicos) e à vasculite de pequenos vasos (pequenas lesões

isquêmicas ou hemorrágicas nas zonas de substância cinza e branca); e a

disseminação ventricular leva à encefalite, que se apresenta em forma de

periventriculite. Essa gravidade na infecção por VZV é mais observada em pacientes

imunocomprometidos(23).

A infecção por VZV ocorre em mais de 90% da população antes da

adolescência e, aproximadamente, 20-30% irão desenvolver herpes zoster na vida

adulta(26). A incidência na população, em geral, é de aproximadamente 2,9-3,3 por

1000 pessoas/ano e aumenta para 10,2 ou 11,6 em pacientes com idade acima dos

80 anos(27).

1.3.6 Vírus epstein-barr

A infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV) está associada a várias doenças do

sistema nervoso central (SNC), em hospedeiros imunocomprometidos e

imunocompetentes. Essas doenças podem ser meningite, encefalite e linfoma do

sistema nervoso central, em pacientes com AIDS. O EBV também esta associado à

síndrome de Guillain-Barré, mielorradiculite e encefalomieloradiculite(28).


EBV infecta os linfócitos B e T de mais de 90% da população, em geral, antes

da idade adulta. EBV replica na orofaringe e é transmitido através de secreções

orais. Infecção primárias por EBV, frequentemente, resulta em mononucleose

infecciosa(29). Encefalite e meningite são as complicações neurológicas mais

comumente observadas em associação com a mononucleose infecciosa. A

síndrome Guillain-Barré também está a ela relacionada. Estima-se que as

complicações neurológicas ocorrem em 1-5% de indivíduos com mononucleose

infecciosa(28).

1.3.7 Citomegalovirus

Citomegalovírus é o herpesvirus que mais causa manifestações clinicas,

variando desde uma infecção inaparente até casos fatais. Normalmente, a infecção

ocorre na infância e permanece latente em indivíduos imunocompetentes. No

entanto, pacientes imunocomprometidos, principalmente os transplantados de

órgãos e os HIV, podem desenvolver uma doença clínica grave, a partir de uma

infecção primária ou após reativação viral(30).

A maioria das infecções são primárias é assintomática em 60% dos adultos

nos países desenvolvidos e, praticamente, 100%, em países em desenvolvimento,

apresentam anticorpos contra CMV. Normalmente a encefalite por CMV é

autolimitada, apresentando episódios febris com manifestações clínicas de

meningoencefalite não específicas, com dor de cabeça, confusão e raramente,

convulsões e coma. O líquido cefalorraquidiano apresenta pleocitose, proteína

levemente aumentada, níveis normais de glicose(31).


1.4 Arbovírus

O termo “arbovírus” origina-se das duas primeiras letras das palavras que

compõem a expressão inglesa arthopod-borne, acrescida da palavra vírus. Significa

vírus transmitidos por artrópodes (mosquitos e carrapatos) para primatas humanos e

não humanos, aves, répteis, marsupiais, entre outros. Eles constituem o maior grupo

conhecido, com 537 membros registrados no Catálogo Internacional dos Arbovírus

distribuídos em 63 grupos antigênicos(32).

Com base em suas propriedades físico-químicas, a maioria dos arbovírus se

distribui por 5 famílias: Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae e

Togaviridae(32, 33). Os arbovírus são vírus mantidos na natureza, mediante

transmissão biológica entre hospedeiros vertebrados suscetíveis e artrópodes

hematófagos ou entre hospedeiros artrópodes, por meio da via transovariana e,

possivelmente, da via venérea; multiplicam-se e produzem viremia nos vertebrados,

assim como nos tecidos dos artrópodes. São transmitidos a novos vertebrados

suscetíveis através da picada do inseto, após um período de incubação extrínseca,

vide ciclo Figura 2(34).

As infecções por arbovírus, pertencentes aos gêneros Flavivirus, Alphavirus e

Bunyavirus, podem levar a uma síndrome clínica conhecida como doença aguda do

sistema nervoso central, que se manifesta na forma de meningite e encefalite

conforme observado na tabela 5(35).

Os Arbovírus, amplamente distribuídos em todo o mundo, representam quase

30% de todas as doenças infecciosas emergentes da última década(36). Embora as

variáveis que contribuem para a epidemiologia de todos os vírus sejam únicas,

alguns outros fatores como os sócio-econômicos, os ambientais e os ecológicos têm

papel relevante para a emergência destas arboviroses(37). O comportamento humano

tem desempenhado um papel significativo na emergência e reemergência de

doenças por arbovírus, sugerindo que o aumento da exposição humana aos

mosquitos e a outros artrópodes vetores é um importante fator no surgimento da

doença(36). A encefalite por arbovírus é causa importante de mortalidade e

morbidade em muitas regiões tropicais do mundo onde estes vírus causam

epidemias.


As viagens modernas e o comércio entre países facilitaram a propagação dos

arbovírus de forma altamente eficiente. Vários exemplos comprovam isso, como a

introdução do tigre asiático, o mosquito Aedes albopictus na América do Norte e

Europa(38), a introdução do Vírus Oeste do Nilo (WNV), em 1999, na América do

Norte, a partir do Oriente Médio(39); a propagação do vírus da encefalite japonesa

(JEV) na Índia, Nepal e norte da Austrália(40, 41); e os surtos explosivos de 2005-2007

da infecção pelo vírus Chikungunya, no Oceano Índico e na Índia(42, 43).

Figura 2. Representação esquemática do ciclo de vida dos arbovírus. (Ciclo adaptado de Hollidge, B.S. e col)(34). Os vetores são representados pelos mosquitos nesta figura. Para muitos arbovírus, a transmissão vertical de mosquito fêmea infectado para sua progênie ocorre por via transovariana, exemplo LACV [vermelho] e WNV [verde]. Mosquitos infectados do sexo masculino podem infectar mosquitos fêmeas virgens por transmissão venérea. No ciclo enzoótico, os arbovírus usam a transmissão silvestre (linhas em vermelho e verde) (por exemplo, LACV, pequenos roedores e WNV e SLEV, aves). Na maioria dos casos, humanos servem como hospedeiro final e não desempenham um papel importante na manutenção do ciclo dos arbovírus. No entanto, alguns arbovírus (por exemplo, VEEV, cavalos e JEV, porcos) estabeleceram ciclos de amplificação epizoótica em animais domésticos (cinza). Uma preocupação crescente é que alguns arbovírus (por exemplo, DENV) pode manter amplificação em humano (azul) em um cenário urbano.


Tabela 5. Distribuição dos vírus RNA de acordo com a doença, epidemiologia, vetor

e rotas de acesso ao sistema nervoso central.

Abreviaturas: WEEV, vírus da encefalite equina do oeste; EEEV, vírus da encefalite equina do leste; VEEV, vírus

da encefalite equina venezuelana; JEV, vírus da encefalite japonesa; SLEV, vírus da encefalite de Saint louis;

WNV, vírus oeste do Nilo; TBEV, Tick-borne encephalitis vírus.

1.4.1 Família Flaviviridae

Os Flavivírus, mesmo tirando a participação dos vírus do dengue, são

importante causa de doença em todo mundo, destacando-se um complexo

identificado filogeneticamente por vírus zoonóticos de aves, transmitido por

mosquitos culicídeos e que ao infectarem o homem podem causar

meningoencefalites(44). Membros importantes do complexo encefalite japonesa são

os vírus da Encefalite de Saint Louis (SLEV), Rocio (ROCV), e vírus Oeste do Nilo

(WNV). Cada um desses causa doença similar em humanos, variando de

assintomática ou de uma doença de média gravidade gripe-símile a uma encefalite

(45).

O vírus da encefalite Saint Louis está amplamente distribuído em todo o

hemisfério ocidental do Canadá à Argentina. O SLEV foi isolado pela primeira vez

RNA vírus Doença no SNC Casos Fatais (%)

Vetor Rotas SNC

Alphavírus

(WEEV, EEEV, VEEV)

Meningites e

Encefalites

WEEV 3-10

EEEV >30

VEEV <1

Mosquitos

Sangue

Flavivírus

(JEV, SLEV, WNV, TBEV)

Meningites e

Encefalites

JEV – 25

SLEV – 7

WNV – 11 a

33

TBEV – 20

Mosquitos

Carrapatos

Sangue

Bunyavírus

Vírus encefalite Califórnia

Meningites e

Encefalites <1% Mosquitos

Sangue


em 1933, durante uma grande epidemia que ocorreu em Saint Louis (Missouri,

EUA), com relato de aproximadamente 1000 casos de encefalite(46).

Foram descritos nos Estados Unidos, no período entre 1999 a 2007, 188

casos de doença neuroinvasiva, ocasionada pelo vírus da encefalite de Saint Louis -

dados provenientes de 19 estados - sendo Louisiana, Texas, Arizona, Michigan e

Mississipi responsáveis por 87% de todos os casos(11).

No Brasil, o SLEV foi isolado pela primeira vez na 1960 de um pool de

mosquitos na Bacia Amazônica. Posteriormente, o vírus foi repetidamente isolado de

animais e artrópodes na região Amazônica e estado de São Paulo(47). No entanto, o

isolamento do SLEV, a partir de soros humanos, ficou restrito a apenas dois,

isolados na região amazônica, na decada de setenta. Em ambos os casos, o quadro

clinico foi de uma doença febril com icterícia, sem envolvimento do sistema nervoso

central(47-49).

Mais recentemente, o SLEV foi isolado de um paciente com doença febril,

suspeito de dengue, em 2005, na cidade de São Pedro(50). No ano seguinte, foi

detectado em quatro pacientes com sintomas clínicos semelhantes aos observados

nos casos de dengue, assim como em dois outros pacientes, clinicamente

diagnosticados com meningoencefalite viral, em São José do Rio Preto, São Paulo

(51). Além disso, um inquérito sorológico, realizado em equinos do Pantanal, revelou

uma alta prevalência de anticorpos neutralizantes (50,9%) para SLEV(52).

O WNV foi Isolado pela primeira vez em 1937 no distrito de West Nile,

Uganda. Este vírus não tinha sido encontrado no hemisfério ocidental até 1999,

quando foi detectado em um surto na cidade de Nova York, o que resultou em 62

casos de encefalite com sete mortes(39, 53, 54). Após a introdução de WNV em Nova

York, o vírus se expandiu pelos 48 estados americanos e também para o Canadá,

México, Caribe e Colômbia(55, 56). Entre 2002 e 2003, a doença se expandiu de tal

modo que houve confirmação de cerca de 3000 casos de doença neuroinvasiva

(encefalite, meningite, paralisia flácida aguda)(57). WNV é agora a principal causa de

encefalite por arbovírus nos Estados Unidos da América(55, 58).

WNV tem a mais ampla distribuição geográfica de todos os flavivírus.

Estende-se na América (do Norte à do Sul), Europa, Oriente Médio, África, Ásia

Ocidental e Austrália(39).


Estudos recentes notificaram a presença de anticorpos neutralizantes para

WNV em equinos na Colômbia(59). Em 2007, o vírus foi isolado de equinos na

Argentina(60). No Brasil, o WNV ainda não foi isolado, mas anticorpos neutralizantes

foram recentemente relatados em cavalos no Pantanal(61). Mais recentemente foi

verificada evidência sorológica de que o WNV tem circulado não apenas em cavalos,

mas também em aves(62). Até o momento a presença deste vírus ainda não foi

detectada em humanos(63).

O vírus Rocio (ROCV) foi originalmente isolado do tecido nervoso de um caso

de encefalite fatal na década de 70 e, posteriormente, foi responsável por uma

epidemia de encefalite, em humanos, no Vale do Ribeira, sudeste do Estado de São

Paulo, entre 1973 e 1980. Neste período foram notificados 1021 casos de encefalite,

onde foi observado quadro clinico agudo de febre, dor de cabeça. Os pacientes

evoluíram com convulsão e, ou alteração da consciência, resultando em 10% de

letalidade(64). Além disso, cerca de 20% dos sobreviventes desenvolveram sequelas,

tais como alterações motoras (49,65%), especialmente da marcha e equilíbrio(65).

O vírus foi isolado de ave da espécie Zenothrichia capensis e estudos

sorológicos sugerem que as aves selvagens podem ser seus reservatórios, como

também, de pool de mosquitos do gênero Psorophora e Aedes(64, 66). Apesar de a

epidemia de ROCV ter sido um episódio isolado, ocorrido há mais de três décadas,

inquéritos sorológicos em moradores do interior do Estado de São Paulo(5, 67) e do

Estado da Bahia(68) mostraram evidência de anticorpos neutralizantes para ROCV.

Recentemente, inquérito sorológico realizado em equinos dos estados de São Paulo,

Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro e Paraíba revelou soro positividade do tipo

monotípica para o vírus Rocio em 6% dos animais testados(69), isso indica a

dispersão deste vírus pelo país, especialmente em áreas rurais e mantém um risco

permanente de reemergência do ROCV, podendo vir a causar novas epidemias(5).

O dengue é a arbovirose mais importante em todo o mundo e está

amplamente distribuída. Cerca de 2,5 bilhões de pessoas que vivem em áreas

tropicais e subtropicais estão em risco de infecção por esse vírus(70).

A infecção por dengue é causada por quatro sorotipos diferentes (DENV-1,2,3

e 4) e é transmitida principalmente pelo mosquito Aedes aegypti. Pode causar

infecção assintomática ou dois diferentes quadros clínicos: a febre do dengue (DF) e


/ ou febre hemorrágica do dengue / síndrome do choque por dengue (FHD / SCD)

(71).

Nos últimos anos, manifestações incomuns da infecção por dengue, como a

síndrome neurológica, têm sido descritas(72-75), incluindo encefalite, encefalomielite

aguda disseminada, mielite transversa e síndrome de Guillain Barré(75-78). Estes

achados corroboraram com o aumento das evidências clínicas e laboratoriais, dando

suporte à hipótese de neurotropismo pelo vírus dengue(79).

Manaus, capital do estado do Amazonas, com quase 2 milhões de habitantes,

sofre com surtos de dengue desde 1998, a partir da introdução do DENV-1(80). Em

2001, com a introdução do DENV-2 e a segunda epidemia(81). O DENV-3 foi

detectado em 2002; desde então, observa-se um número crescente de casos graves

da doença, principalmente em crianças(82). Até 2008 no Brasil, circulavam apenas

três sorotipos do vírus, quando o DENV-4 foi detectado em três pacientes em

Manaus(83), após 26 anos de seu primeiro relato na cidade de Boa Vista, estado de

Roraima. Estes dados indicaram a circulação dos quatro sorotipos em momentos

deferentes. No entanto, seguindo uma tendência de aumento da dengue no Brasil,

nos primeiros meses de 2011, Manaus começou com um novo surto, com quase

40.000 casos, que afetou pacientes de todas as regiões da cidade e causou

doenças de gravidades distintas. Durante este surto foi detectada a circulação

simultânea dos quatro sorotipos do vírus dengue, evidência clara de

hiperendemicidade o que poderá resultar em aumento da morbidade, formas graves

da doença e mortes(84).

Essa situação epidemiológica, observada em Manaus, deve ser vista como

um alerta, principalmente, em relação ao surgimento de casos neurológicos em

pacientes com síndrome febril, pois estudos realizados no Rio de Janeiro

demonstraram que meningite e encefalite foram as manifestações neurológicas mais

comuns entre os pacientes com dengue em área endêmica(85, 86). Outro estudo,

realizado pelos mesmos pesquisadores, também mostrou que o dengue é o agente

mais comum de encefalite viral em pacientes adolescentes e adultos

imunocompetentes(86).


1.4.2 Família Togaviridae

O gênero Alphavirus compreende 29 espécies virais, agrupados em, pelo

menos, sete complexos antigênicos(87).

Estes vírus são esféricos, envelopados, medem entre 60 a 70 nm de

diâmetro, têm o genoma composto por RNA linear de fita simples, com polaridade

positiva. As proteínas são codificadas por sete genes, sendo quatro não estruturais

(NSP1, NSP2, NSP3 e NSP4) e as proteínas estruturais (glicoproteínas E1, E2 e E3,

glicoproteínas do envelope e a proteína C do capsídeo)(88).

Pertencentes a este gênero têm-se os vírus da Encefalite Equina

Venezuelana (VEEV), Encefalite Equina do Leste (EEEV) e Encefalite Equina do

Oeste (WEEV). São vírus do Novo Mundo e, como o nome sugere, causam

encefalite em cavalos e em seres humanos. No entanto, os três vírus apresentam

virulência e incidência variável(89).

O VEEV foi detectado na década de 90 no México(7) e, posteriormente, no

Peru, mas as maiores epidemia e epizootia ocorreram em 1995, quando este vírus

infectou aproximadamente 100 mil pessoas e milhares de equinos na Venezuela e

na Colômbia(90, 91). O WEEV, em 2009, foi responsável por um caso fatal de

encefalite no Uruguai(92).

O EEEV, endêmico nas regiões das Américas, é encontrado desde o sudeste

do Canadá. Atinge a costa leste e golfo dos Estados Unidos e Caribe e da América

Central se estendeu para Trinidad, Brasil, Guiana e Argentina(93). Este vírus

apresenta duas distintas variantes antigênicas: cepas da América do Norte e

América do Sul(94). A primeira causa surtos periódicos de encefalite em humanos e

equinos(95, 96); é altamente neurovirulenta e, em comparação com o VEEV e WEEV,

causa encefalite em humanos de maior gravidade. Considerando que VEEV e

WEEV normalmente causam doença febril mas raramente progride para a encefalite

(97), adultos infectados com cepas de EEEV americano, ao contrário, desenvolvem

doença com evolução rápida, cujos sintomas iniciais são febre, calafrios, mialgia,

artralgia, dor retro-ocular, dor de cabeça e redução dos níveis de consciência(95). Os

indivíduos mais jovens, muitas vezes, experimentam, ainda, sintomas neurológicos


sem pródromos. A doença neurológica resulta em paralisia, convulsões, coma e

morte em 30-80% dos pacientes. Estima-se, também que ocorram déficits

neurológicos em 35% dos sobreviventes(97).

Quando os Alphavirus causadores de encefalite infectam os neurônios, ocorre

rapidamente alterações no SNC para iniciar uma resposta protetora(98). Os neurônios

podem responder à infecção através da produção de Interferon β e γ, IL-6 e

quimiocinas, como CXCL10, CCL21 e CX3CL1(99, 100). Macrófagos e células da glia

são ativados nas fases iniciais da resposta e produzem rapidamente uma variedade

de citocinas (IL-1, TNF-α, IL-6) e quimiocinas (CXCL10, CCL2, CCL5)(101, 102) os

quais rapidamente regulam o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) em

células da micróglia, para melhorar a entrada de células ativas no SNC. Esta

atividade imunológica pode contribuir para ambos os mecanismos de proteção ou

patogênicos(103).

Dentre os Alphavirus de importância no Brasil, tem-se descrito os vírus das

Encefalites Equina Venezuelana (VEEV), Equina do Leste (EEEV) e Equina do

Oeste (WEEV), como os agentes responsáveis por epizootias em equinos

domésticos e surtos de doença febril aguda ou meningoencefalites em humanos(47).

1.4.3 Família Bunyaviridae

Os vírus da família Bunyaviridae são esféricos, medem entre 80 a 120 nm e

são envelopados. O genoma é constituído por três segmentos de RNA fita simples,

denominados (S) pequeno, (M) médio e (L) grande(104).

O segmento S codifica duas proteínas, a nucleoproteína estrutural N e uma

outra, pequena, não estrutural NSs em sobreposição de fase de leitura. O segmento

M codifica uma poliproteína precursora que, após clivagem, dá origem as proteínas

estruturais G1 e G2 do envelope e a proteína NSm, presente apenas entre os

Orthobunyavirus. A proteína L codifica uma grande proteína que contem atividade de

RNA polimerase, importante na replicação e transcrição dos segmentos

genômicos(105).


Entre os membros da família Bunyaviridae, destacam-se os Hantavírus,

causadores de doença pulmonar, e o vírus Oropouche (OROV), importante causa de

doença febril no Brasil(106).

O OROV é o arbovírus que, depois do dengue, causa mais epidemias de

doença febril na Amazônia e é a segunda causa mais comum de arbovirose urbana

no Brasil. Estima-se que nos últimos 30 anos tenham ocorridos mais de meio milhão

de casos no Brasil(107). O vírus foi isolado, pela primeira vez, a partir do sangue de

um trabalhador florestal em Trinidad, 1955. O primeiro isolamento no Brasil foi em

1960, a partir do sangue de uma preguiça (Bradypus tridactylus). O potencial da

epidemia de OROV foi reconhecido durante um surto em Belém, Pará, em 1961,

onde aproximadamente 11.000 pessoas foram infectadas(108). Nos últimos 40 anos,

a febre do Oropouche tem emergido como um problema de saúde pública em áreas

tropicais da América Central e do Sul(109). Além do Brasil, o OROV também foi

isolado em Trinidad, Panamá e Peru(110).

De 1960 a 1980, surtos de febre por Oropouche foram detectados apenas no

Estado do Pará, principalmente em Belém e áreas vizinhas, onde milhares de

pessoas foram infectadas(108, 109).

As primeiras epidemias de OROV registradas, fora do estado do Pará

ocorreram na década de 80 no Amazonas - nas cidades de Manaus e Barcelos(111);

na cidade de Mazagão no Amapá; em outros estados amazônicos, incluindo Acre e

Rondônia; e fora da Amazônia, no Maranhão e em Tocantins(107, 112). Mais

recentemente, o OROV foi detectado nas cidades de Minas Gerais(113), Acre(114) e

em Manaus(115). Um grande número de casos e surtos de febre por Oropouche têm

sido relatados em áreas da Amazônia brasileira, o que sugere a circulação endêmica

deste vírus(116).

A infecção por Oropouche manifesta-se na forma de episódios febris agudos.

Os primeiros sintomas são febre, dor de cabeça, calafrios, dor muscular, artralgia e

fotofobia. Podem ocorrer, também, dor retro-ocular e, ocasionalmente,

manifestações neurológicas, relatadas durante um surto de febre, no estado do

Pará, em 1980. A maioria dos pacientes apresentou manifestações neurológicas

típicas relacionadas à meningite assépticas no inicio da fase aguda e,

aproximadamente, um terço deles apresentou náuseas e vômitos. Alguns evoluíram

com letargia(117).


Recentemente, em um estudo realizado com 110 amostras de LCR de

pacientes com meningoencefalite, foi detectada a presença do OROV em três

(2,7%) casos. Dois pacientes, entre estes, tinham outra doença afetando o SNC

(AIDS e Neurocisticercose), evidenciando que a ocorrência de infecção no SNC

causada por OROV, pode ser subestimada, especialmente em pacientes

imunocomprometidos(118).

Pouco se conhece sobre a patogênese da febre do Oropouche. O agente

produz uma infecção sistêmica em humanos com fase virêmica, onde os títulos virais

são geralmente altos nos dois primeiros dias da doença(119). O fato de que o OROV

foi capaz de causar meningite asséptica - combinada com o isolamento do vírus no

LCR - sugere que este vírus tem habilidade para atravessar a barreira

hematoencefálica(120).

Estudo realizado por Rodrigues e Col. 2011, utilizando hamsters como

modelo experimental, para tentar simular a infecção natural, demonstrou que o vírus

Oropouche causa viremia e possui marcante tropismo para fígado e cérebro. A

invasão do SNC pelo OROV foi bastante evidente, com sinais de danos neurológicos

graves, incluindo deficiência motora, paralisia dos membros posteriores. Os autores

ainda sugerem as hipóteses de que o OROV pode chegar ao SNC via barreira

hematoencefálica e ou por rotas de invasão neuronal(121).

1.4.4 Família Picornaviridae

A família Picornaviridae (“pico”= pequeno, “RNA”= ácido ribonucléico) é

composta por nove gêneros: Enterovirus, Aphthovirus, Cardiovirus, Hepatovirus,

Parechovirus, Rhinovirus, Erbovirus, Kobovirus e Teschovirus. Somente os seis

primeiros gêneros infectam humanos(122).

Os Enterovírus (EVs) são assim designados devido a sua replicação ocorrer

no trato gastrointestinal humano. Este gênero possui 10 espécies e sete são

capazes de causar doença em humanos. De acordo com a ultima atualização do

ICTV, os enterovirus estão classificados em 4 espécies: enterovirus humano grupo

A, enterovirus humano grupo B, enterovirus humano grupo C e enterovirus humano


grupo D. Estes vírus são esféricos, não envelopados e medem 27nm de diâmetro

(123).

A estrutura genômica dos enterovírus consiste em RNA de fita simples de

polaridade positiva, com aproximadamente 7500 nucleotídeos e peso molecular de

2,6X106 D. A região 5’ NTR (não traduzida) do genoma está ligada covalentemente a

uma pequena proteína viral, VPg (Virion Protein genome), que é codificada por um

único gene em todos os picornavírus. Devido sua presença se dá no início da

replicação do RNA, estudos sugerem que ela possa ter a função de um iniciador

para esta síntese(122).

A região 3' NTR (não traduzida) é menor e tem cerca de 47 nucleotídeos,

contém uma estrutura secundária que está relacionada ao controle da síntese do

RNA viral. Ambas as moléculas de RNA e mRNA possuem uma cauda poli (A) que

varia de 35 a 100 nucleotídeos (Figura 4). Estudos mostram que sua função pode

estar relacionada à infecciosidade viral(124).

Os Enterovírus (EV) são uma importante causa de morbidade e mortalidade

em todo o mundo. Embora muitas infecções por enterovírus não pólio sejam

assintomáticas, estima-se que eles causam entre 10-15 milhões ou mais de

infecções sintomáticas só nos EUA(125). Muitas infecções por enterovírus não

causam doença expressiva, mas, especialmente em crianças e em

imunocomprometidos, podem levar a casos graves. Este grupo de vírus são a causa

mais comum de meningite asséptica, uma das infecções mais frequentes no sistema

nervoso central(122).

A replicação dos picornavírus ocorre no citoplasma das células-alvo.

Primeiramente, a partícula viral liga-se a receptores celulares específicos, presente

na membrana plasmática; em seguida, ocorre a adsorção, e o vírus é internalizado

por endocitose e tem seu capsídeo fragmentado. O RNA viral é, então, exposto,

através de um processo que envolve mudanças estruturais no capsídeo. Uma vez

dentro do citoplasma, a fita positiva de RNA viral é transcrita em proteínas

essenciais para a replicação de novas partículas. O ciclo de replicação de uma única

partícula viral pode levar de 5 a 10 horas, no entanto, muitas variáveis estão

envolvidas, tais como: particularidades da cepa, temperatura, pH. Muitos

picornavírus são liberados das células através da lise levando-as a morte(122).


Com a introdução da vacina da poliomielite, o nicho ecológico dos poliovírus

tem se tornado extremamente restrito. Contudo, observa-se um aumento

significativo na circulação, detecção, identificação e evolução dos enterovírus não-

polio e o surgimento de surtos provocados por cepas epidêmicas e emergentes(126).

Os enterovírus humanos são responsáveis por uma variedade de doenças e

manifestações clínicas, tais como: miocardite, exantema, conjuntivite hemorrágica,

meningite, encefalite, diabetes, dentre outras(127).

As meningites virais, causadas por Enterovírus, são relatadas com grande

frequência em diversos países do mundo, atingindo principalmente a faixa etária

mais jovem e de classe socioeconômica baixa. Estão diretamente relacionadas às

condições sanitárias precárias e às grandes aglomerações populacionais, que

favorecem a transmissão por via fecal-oral. Dados epidemiológicos mostram que os

Enterovirus são responsáveis por cerca de 85% de todos os casos de meningite nos

quais um agente etiológico é identificado(128-132).

Muitos sorotipos de enterovírus têm sido descritos como responsáveis por

surtos ou casos esporádicos de meningite asséptica. Estudos epidemiológicos

realizados no Brasil, sobre esses casos, têm identificado o Echovírus 30 nos estados

do Paraná, Pernambuco, São Paulo, Rio de Janeiro e Belém, como o agente mais

frequente(132-136), seguido pelo Enterovírus 71(137-140). Outras cepas de Enterovírus

ainda foram identificadas (E-6, E-4), Coxsakievírus B (cepas 2, 3, 5, 6 e 9)(141, 142).

1.5 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O diagnóstico laboratorial das meningites é realizado através do estudo do

líquido cefalorraquidiano. Os principais exames para o esclarecimento diagnóstico

de casos suspeitos são: quimiocitológico, bacterioscopia direta e culturas.

A obtenção do LCR para análise é um dos passos mais importantes para o

diagnóstico. Sua análise é de grande importância, devendo ser considerada um

conjunto de testes que expressem o estado do fluido e que possa caracterizá-lo

dentro dos limites de normalidade ou não. Na Tabela 6, podem ser observadas

algumas características do líquido cefalorraquidiano em infecções bacteriana e viral.


O LCR é um fluido corporal, livre de sangue, oligocelular e oligoprotéico

intimamente relacionado com o SNC e seus envoltórios. Está presente nas

cavidades ventriculares e no espaço subaracnóideo, envolvendo a medula espinhal

e o encéfalo. Este fluido, em condições normais, contém concentração reduzida de

proteínas, glicose, potássio e magnésio e relativamente elevada de cloreto de sódio.

Valores normais de celularidade no LCR variam de 1 a 5 células por milímetro

cúbico (mm3). E por apresentar aspecto límpido, incolor e translúcido recebe muitas

vezes a denominação de “água de rocha”(143).

Tabela 6. Características do líquido cefalorraquidiano nas infecções bacterianas e

virais.

Parâmetros do LCR Infecção bacteriana Infecção viral

Glóbulos brancos Contagem total ( <5 céls/mm3) 1000-5000 céls/mm3

Tipicamente <500 céls/mm3

Diferencial (normalmente linfócitos, sem neutrófilos ou células vermelhas).

Predomínio de Neutrófilos, mas

linfócitos podem estar presentes no início da doença.

Predomínio de linfócitos, mas neutrófilos podem estar presente.

LCR: Concentração de Glicose sérica (40 a 80mg/dl) Baixo Normal Concentração de Proteínas (15 a 50mg/dl)

Elevada

Normal/ levemente aumentada

Adaptado de (143)

As infecções agudas do SNC, como encefalite e ou meningites, normalmente

não sugerem um agente etiológico específico. Por isso, faz-se necessário o uso de

métodos de diagnóstico específicos, sensíveis e rápidos, para que se faça a

vigilância e a detecção precoce destes agentes.

A maioria dos vírus não são facilmente detectados no LCR e pode não estar

presente no sangue. Assim, o diagnóstico sorológico é difícil em áreas tropicais,

onde alguns vírus são endêmicos, pois reações cruzadas podem ocorrer entre

diferentes vírus, tornando difícil a interpretação dos resultados.


A pesquisa de anticorpos é um método muito utilizado para a identificação do

agente etiológico no soro e pouco utilizado no LCR. No entanto, este teste tem

certas limitações. A reação cruzada entre anticorpos, por exemplo, é um problema

no ensaio de captura de IgM, também a neutralização por redução de placa é

demorada(144-146). O método tradicional para identificação de arbovirus, o isolamento

viral em cultura de células de mamíferos ou de insetos, é o método clássico de

escolha para o diagnóstico, mas também tem suas limitações, pois o período de

viremia é geralmente de curta duração e a probabilidade de obtenção de um isolado

é baixa no soro e principalmente no líquor(144).

Nos últimos anos, as técnicas baseadas na amplificação do ácido nucléico,

principalmente a reação em cadeia da polimerase (PCR), têm revolucionado o

diagnóstico de infecções no sistema nervoso central, especialmente aquelas

causadas por vírus(147), sobretudo, por serem rápidas, sensíveis, específicas,

reprodutíveis e passíveis de automação. As vantagens dessas técnicas foram

observadas pelo sucesso no diagnóstico neurovirológico a partir da amplificação de

qualquer ácido nucleico viral presente no LCR de pacientes com poucos dias de

infecção(129, 148). Atualmente são os métodos de escolha para detecção de herpes

vírus e enterovírus(128).

Nos últimos quatro anos, os dados epidemiológicos revelaram 21% de casos

de meningite de provável etiologia viral na cidade de Manaus. Essa situação

epidemiológica evidencia a necessidade de desenvolver e padronizar metodologias

que possibilitem um diagnóstico rápido e confiável de agentes que causadores da

infecção no sistema nervoso central. A escolha da RT-PCR e PCR justifica-se por

seu uso bem sucedido no diagnóstico em todo o mundo, visto ser considerada de

alta sensibilidade e especificidade e a confirmação laboratorial da etiologia é

fundamental para a vigilância epidemiológica das meningites, assim como para o

adequado tratamento dos casos.


2. Objetivos


2.1 GERAL

Identificar agentes virais que causam infecção no Sistema Nervoso Central

em pacientes de uma Unidade Terciária de Saúde no Amazonas.

2.2 Específicos

1. Detectar os Arbovírus que causam infecção no sistema nervoso central

pertencente às famílias:

- Flaviviridae (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, ROCV, SLEV, WNEV);

- Togaviridae (WEE, VEE, EEE e MAYV);

- Bunyaviridae (OROV);

2. Detectar os vírus da família Picornaviridae que causam infecção no sistema

nervoso central, principalmente os enterovírus não pólio;

3. Detectar os vírus da família Herpesviridae (HSV1, HSV2, EBV, CMV E VZV), que

causam infecção no sistema nervoso central;

4. Descrever os aspectos epidemiológicos, clínicos e achados liquóricos dos

pacientes com infecção viral detectada;


3. Material e Métodos


3.1 Tipo de Estudo

Descritivo prospectivo, do tipo série de casos, utilizando amostra de líquor de

pacientes com suspeita clínica de Síndrome de Meningoencefalite Viral (SMV).

3.1.1 Participantes e amostras do Estudo

Pacientes em qualquer idade com suspeita clínica de Síndrome de

Meningoencefalite Viral (SMV), captados a partir da demanda das unidades de

pronto atendimento da FMT-HVD, do Hospital 28 de Agosto, do Hospital Dr. João

Lúcio Pereira Machado, dos Hospitais Infantil Zona Leste, Zona Oeste e Sul no

período de janeiro de 2010 a dezembro de 2012.

3.1.2 Critérios de Inclusão

Pacientes que concordarem em participar do estudo, com quadro agudo,

apresentando qualquer alteração neurológica. Líquor com exame direto negativo

para Gram e tinta da china, compatível com infecção viral.

3.1.3 Critérios de Exclusão

Amostras de LCRs recebidas pelo laboratório em quantidades insuficientes

para uma extração do material genético (volume < 200 µl) não foram utilizadas no

estudo, uma vez que não foi possível a estocagem de material clínico remanescente,

para uma posterior repetição, caso necessário.

3.1.4 Critérios de Exclusão a posteriori

Cultura do LCR positiva para bactérias piogênicas, Micobacterium

tuberculosis ou fungos.


3.1.5 Aspectos éticos

Este projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em

Seres Humanos (CEP) da FMT-HVD (Processo Nº 2891, de 5 de dezembro de

2007), e está de acordo com as normas previstas na resolução Nº196/96, do

Conselho Nacional de Saúde (Anexo 1).

Todo Individuo que aceitou participar do estudo assinou o Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido.

3.2 Seleção dos pacientes e coleta do material biológico

Pacientes com suspeita da Síndrome de Meningoencefalite Viral foram

convidados a participar do estudo, assinaram o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido Pós-Informação (Anexo 2). Quando houve concordância em participar

da pesquisa, foi preenchida a ficha clinica (Anexo 3), coletou-se os dados de

identificação do prontuário do paciente, histórico de deslocamentos recentes e

principais sinais e sintomas. O líquor foi coletado pelo médico do pronto

atendimento, conforme o Fluxograma de coleta (Anexo 4). As amostras que

apresentaram padrão viral após os testes bioquímicos e citológicos foram

encaminhadas para o Laboratório de Virologia. Este material foi separado em três

alíquotas. Alíquotas: 1 (extração do DNA viral), 2 (extração do RNA viral) e 3

(Isolamento viral). Após separação das alíquotas, estas foram armazenadas a -700C,

compondo o banco de líquor da Gerência de Virologia.

3.3 Algoritmos de Investigação e Diagnóstico

Os vírus avaliados nesta pesquisa foram os arbovírus, herpesvírus e

enterovírus, responsáveis por casos de meningoencefalite viral, listados na tabela 7.

As atividades de investigação laboratorial em todas as fases do estudo

aconteceram na Gerência de Virologia da FMT-HVD.


Tabela 7: Relação de vírus investigados na pesquisa.

Família Gênero Vírus (Abreviação)

Togaviridae Alphavirus

Encefalite equina do leste (EEEV); Encefalite equina do oeste (WEEV); Encefalite equina venezuelana (VEEV) e Mayaro (MAYV)

Flaviviridae Flavivírus

Dengue 1-4 (DENV)

Saint Louis encefalite (SLEV)

Rocio (ROCV)

Ilhéus (ILHV)

Bunyaviridae Orthobunyavirus Oropouche (OROV)

Herpesviridae Herpesvirus

Herpes Simples tipo 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2)

Citomegalovírus (CMV)

Varicela-Zoster vírus (VZV)

Epstein-Barr vírus (EBV)

Picornaviridae Enterovírus Enterovirus não-polio

O processamento das amostras seguiu o fluxo estabelecido dentro do

Laboratório de Virologia. Primeiramente, foi realizada a extração do DNA viral e em

seguida a PCR, para identificar os vírus da família Herpesviridae. Após esta etapa,

as amostras, recebidas em volume suficiente, foram submetidas à extração do RNA

viral e RT-PCR, para identificação dos arbovírus e enterovírus. A terceira alíquota foi

encaminhada para tentativa de isolamento viral em culturas celulares específicas,

para isolamento de arbovírus e enterovírus. Todas as amostras ficaram

armazenadas a -70°C, em caixas específicas (criobox), etiquetadas e numeradas,

seguindo a ordem de numeração gerada no ato de entrada da amostra.


3.4 Diagnóstico molecular

3.4.1 Metodologia para identificação dos vírus DNA

Visando à detecção dos cinco herpesvírus (HSV-1 e 2; CMV, VZV, EBV) em

amostras de LCR, foi selecionado na literatura um protocolo (Multiplex PCR) descrito

por Markoulatos, et al. (2001)(149) já estabelecido e validado, que permite a

identificação dos cinco herpesvírus de maior interesse, utilizando apenas um tubo de

reação para cada amostra clínica, sendo possível, ainda, usar um controle interno na

reação, que é a amplificação do gene β-actina humano para validação da extração

do ácido nucléico.

3.4.1.1 Extração do DNA amostra

O DNA da amostra foi extraído a partir de 200l de líquido cefalorraquidiano,

utilizando QIAamp Viral DNA Mini Kit (QIAGEN, Inc., USA), seguindo-se as

instruções do fabricante. O volume final obtido foi de 40l.

3.4.1.2 PCR para identificação dos vírus da família Herpesviridae.

A amplificação gênica foi realizada pela técnica da PCR multiplex descritos

por Markoulatos, et al. (2001)(149), utilizando os primers H1P32, H1M32, EP5, EM3,

H2M40, CP15CM3, VP32, VM20. Tabela 8.

A mistura de PCR consistiu de 5l do extrato de DNA, 1U da enzima

polimerase (Platinum Taq DNA polymerase-Invitrogen, USA), 2,5 µl da solução

tampão 10 vezes concentrada (20mM Tris-HCl, (pH 8,0) 500mM KCl, 1µl de MgCl2 a

50mM, 4µl do pool de primer descrito na Tabela 9 a 100M, 1µl da mistura contendo

100M de cada dNTP e água suficiente para completar 25l.

A mistura foi submetida a 30 ciclos de 95oC por 30 segundos (seg), 60oC por

30 seg. e 72oC por 30 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 10 min. As

reações de PCR foram realizadas em termociclador marca Eppendorf.


A detecção do produto da PCR foi visualizado através de eletroforese em gel

de agarose corado com brometo de etídio, sendo registrado em sistema de foto

documentação digital.

Tabela 8. Relação dos iniciadores utilizados para detectar os vírus da família Herpesviridae.

Iniciadores Seqüência (5’-3’) Vírus Amplicon

(pb)

Região do Genoma

H1P32 TGGGACACATGCCTTCTTGG HSV-1 147

RL2

H1M32 ACCCTTAGTCAGACTCTGTTACTTACCC

EP5 AACATTGGCAGCAGGTAAGC EBV 182

Exon 4/5 terminal EM3 ACTTACCAAGTGTCCATAGGAGC

H2M40 GTACAGACCTTCGGAGG HSV-2 227 UL28

H2P4 CGCTTCATCATGGGC

CP15 GTACACGCACGCTGGTTACC CMV 256 IRL11

CM3 GTAGAAAGCCTCGACATCGC

VP20 CACACGATAATGCCTGATCGG VZV 275 ORF 8

VM20 TGCTGATATTTCCACGGTACAGC

B ACT TCTACAATG AGC TGCGTGTG Β ACT 540

B ACT CATCTCTTGCTCGAAGTCC

3.4.2 Metodologia para identificação dos Arbovírus

3.4.2.1 Cepas virais controle

Os arbovírus utilizados neste estudo como controles positivos - listados na

Tabela 9 -, foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo,

do Laboratório de Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto-USP.


A propagação destes vírus foi realizada por inoculação intracerebral em

camundongos recém-nascidos ou em culturas celulares da linhagem C6/36 de

mosquito A. albopictus(150).

3.4.2.2 Produção dos estoques virais utilizados como controles

Suspensões dos vírus utilizados como controles foram obtidas a partir de

macerados dos cérebros de camundongos infectados. Para tanto, ninhadas de

camundongos (Mus musculus– variedade albino suíço) recém-nascidos (2 a 3 dia de

vida) foram inoculadas pela via intra-cerebral com 0,025ml de cada um dos vírus,

contidos em cérebros de camundongos previamente infectados, diluídos (1/20) em

solução salina tamponada com fosfato (PBS pH 7,4). Os animais foram mantidos em

gaiolas plásticas, juntamente com suas mães, para aleitamento. Foram observados,

diariamente, por até 10 dias. Animais moribundos - que apresentaram encefalite -

foram sacrificados e armazenados a -70oC até o momento do uso.

3.4.2.3 Isolamento Viral em culturas celulares do clone C6/36 de mosquito

Aedes albopictus.

O isolamento viral para arbovírus foi realizado em culturas celulares de

mosquito Aedes albopictus C6/36, a partir de amostras de LCRs, provenientes de

pacientes com suspeita clinica da SMV. Após a confluência do tapete celular, 0,2 ml

de LCR foi inoculado em tubos contendo 2 ml de suspensão viral em meio Leibowitz

L15, contendo 10% de soro fetal bovino inativado. Os tubos foram incubados a 28°C,

e diariamente, foi realizada a leitura dos tubos em microscópio investido, por sete

dias consecutivos. As amostras que apresentaram efeito citopático (ECP) ou não,

foram estocadas a -70°C para posterior identificação por RT-PCR. As amostras

negativas na primeira passagem foram submetidas a uma segunda passagem.

Também, foram mantidos frascos de células não infectadas, em todos os

experimentos, como controles negativos.


Tabela 9: Relação das cepas virais utilizadas como controle no estudo.

Família Gênero Vírus (abreviação) Estirpes (abreviação)

Alphaviridae

Alphavirus

Venezuelan Equine

Encephalitis (VEEV)

BeAr 40403

78V 3531

Eastern Equine

Encephalitis (EEEV) SpAn 14723

Western Equine

Encephalitis (WEEV)

Rio 1257

BeAn 70100

Mayaro (MAYV) BeAr 20290

Flaviviridae

Flavivirus

Dengue (DENV) DENV 1 RibH 830

DENV 2 Cea 24622

DENV 3 Rib H1

St. Louis Encephalitis

(SLEV) BeAn 421498

Rocio (ROCV) SpH 34675

Bunyaviridae Orthobunyavirus Oropouche (OROV) BeAn 19991

3.4.2.4 Extração do RNA da amostra

O RNA da amostra foi extraído a partir de 140l da amostra de LCR e de

fluído provenientes dos cultivos celulares, utilizando-se o QIAamp Viral RNA Mini

Kit (QIAGEN, Inc., USA), seguindo-se as instruções do fabricante. O volume final

obtido foi de 40l.

3.4.2.5 Reação de Transcrição reversa (RT)

Para a reação de transcrição reversa foi utilizado o AccessQuickTM RT-PCR

System kit (Promega).


A mistura de RT consistiu de 5l do extrato de RNA, 1 unidade (U) da enzima

transcriptase reversa (Promega, USA), 12,5l do Master Mix AccessQuickTM (2x),

1µl do Random primer, 20U do inibidor de ribonuclease (RNaseOUT-Invitrogen,

USA) e água suficiente para completar 20l. A mistura contendo o RNA e a enzima

foi incubada a 72oC por 5 minutos. Após a incubação foi colocada em banho de gelo

e adicionada o máster mix, seguindo para uma segunda incubação de 60 minutos a

45oC. Após obtenção do cDNA, este foi armazenado a – 20 ºC.

A utilização do Random primers, na síntese de transcrição reversa, permitiu

que o produto fosse utilizado para as reações de PCR dos diferentes grupos de vírus

RNA (Arbovírus e Enterovirus).

3.4.2.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Os iniciadores selecionados para detecção dos gêneros Alphavirus foram

(M2W e cM3W) se ligam a regiões do gene da proteína nsP1, e para a detecção dos

Flavivirus foram (FG1 e FG2), que se ligam a regiões do gene da proteína NS5,

descritos por de Moraes Bonzoni (2005)(151). Para detecção do gênero

Orthobunyavírus foram selecionados os iniciadores (BUN-C e BUN-S) que se ligam

ao segmento S da Nucleoproteína do genoma viral do Oropouche, protocolo descrito

por Moreli (2002)(152). Esses protocolos baseiam-se em sistema de amplificação,

utilizando duplex, multiplex RT-PCR e Nested-PCR para detecção dos diferentes

subtipos virais.

3.4.2.7 Detecção dos gêneros Alphavírus, Flavivírus e Orthobunyavírus.

Foi realizada uma reação com os iniciadores específicos para detecção de

cada gênero separadamente. Para detecção de Alphavirus usamos os iniciadores

(M2W e cM3W), para Flavivírus (FG1 e FG2) e para Orthobunyavírus (BUN-C e

BUN-S), todos a uma contração de 10mM.


Tabela 10: Relação dos iniciadores utilizados para detecção dos gêneros

Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus.

Iniciadores Sequência (5’-3’) Amplicon Referência

M2W (+) YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW

CM3W (-) ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC 434 (153)

FG1 (+) TCAAGGAACTCCACACATGAGATGTACT

FG2 (-) GTGTCCCATCCTGCTGTGTCATCAGCATACA 1000 (154)

BUN-S AGTAGTGTGCTCCAC

BUN-C AGTAGTATACTCCAC 700/1000 (152)

A mistura de PCR consistiu de 5l do produto da RT, 1U da enzima (Platinum

Taq DNA polymerase – Invitrogen, USA), 2,5µl da solução tampão 10 vezes

concentrada (200mM Tris-HCl, pH 8,4, 500mM KCl), 1µl de MgCl2 a 50mM, 1µl de

cada primer específico a 10mM, 1µl da mistura contendo 0,2mM de cada dNTP e

água suficiente para completar 25l.

A mistura contendo os iniciadores (M2W e cM3W), para identificação do gênero

Alphavirus, foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 45 seg. 45oC por 45 seg. e 72oC

por 45 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.

A mistura contendo os iniciadores (FG1 e FG2), para identificação do gênero

Flavivirus, foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 1 min, 53oC por 1 min e 72oC por 2

min, finalizando com um ciclo de 72oC por 5 min.

A mistura contendo os iniciadores (BUN-C e BUN-S), para identificação do

gênero Orthobunyavirus, foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 45 seg. 50oC por 45

seg. e 72oC por 45 seg, finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.

Todas as reações de PCR foram realizadas em termociclador da marca

Eppendorf.


3.4.2.8 Semi-Nested-PCR para identificação de Alphavirus e Flavivirus

Para a amplificação espécie-específica dos vírus foi utilizada a Semi Nested

PCR (S-N-PCR) com os iniciadores descritos na Tabela 11.

A mistura de S-N-PCR consistiu de 1l do produto obtido na primeira PCR, 1U

da enzima Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA) e 2,5µl da solução

tampão 10 vezes concentrada (200mM Tris-HCl, pH 8,4, 500mM KCl), 2µl de MgCl2

a 50mM, 1µl de cada iniciador externo cM3W (a 10mM) ou FG1 (a 10mM), 1µl de

cada iniciador interno espécie-específico (a 10mM), 1µl da mistura contendo 0,2mM

de cada dNTP e água suficiente para completar 25l. A mistura foi submetida a 28

ciclos térmicos iguais aos descritos para a PCR (seção 5.5.7).

3.4.2.9 Nested-PCR (N-PCR) para identificação do vírus Oropouche.

A mistura da N-PCR para identificação do vírus Oropouche consistiu de 1l do

produto obtido na primeira PCR, 1U da enzima Platinum Taq DNA polymerase

(Invitrogen, USA) e 2,5µl da solução tampão 10 vezes concentrada (200mM Tris-

HCl, pH 8,4, 500mM KCl), 1µl de MgCl2 a 50mM, 1µl de cada primer BS-S e BS-C (a

10mM), 1µl da mistura contendo 0,2mM de cada dNTP e água suficiente para

completar 25l. A mistura foi submetida a 28 ciclos de 94oC por 60 seg.; 55oC por 60

seg.; e 72oC por 60 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.


Tabela 11. Relação dos iniciadores espécie-específicos utilizados no estudo para

identificação das espécies de Alphavirus, Flavivirus e Orthobunyavirus.

Iniciadores (-) Seqüência (5’-3’) Amplicon (pb)*

Iniciadores espécie-específicos para Flavivírus

nDEN1 CGTTTTGCTCTTGTGTGCGC 472

nDEN2 GAACCAGTTTGGTTDRTTTCATCGCTGCC 316

nDEN3 TTCCTCGTCCTCAACAGCAGCTCTCGCACT 659

nDEN4 GCAATCGCTGAAGCCTTCTCCC 222

nSLE ATTCTTCTCTCAATCTCCGT 232

nBSQ AAGTGACACCTGTTCAGGGTA 388

nILH TCCACCGCTGATCTGAGCCCGTGA 474

nROC TCACTCTTCAGCCTTTCG 230

nYF CTGTCTCAACCCTGCGTGYC 171

Iniciadores espécie-específicos para Alphavirus

nVEE ACGGAGGTAGACCCATCCGA 400

nEEE CCACGGTACCGTTGCC 124

nWEE GGCGGCAGACCTGCTGGAA 208

nMAY GGAAGTTGGCCAAGGC 270

Iniciadores espécie-específicos para Oropouche

BS-S GTGGGGTCCAATTTGC 300

BS-C TGAACCCTATGCATCT 300


3.4.3 Detecção do genoma viral dos Enterovirus

3.4.3.1 Tentativas de isolamento viral em Culturas Celulares

Tentativas de isolamento viral foram realizadas a partir de LCRs provenientes

de pacientes com suspeita clinica da SMV. As amostras foram inoculadas em

culturas celulares, que permitem a replicação dos enterovírus. As linhagens

celulares utilizadas foram (RD e HEp2), gentilmente cedidas pelo Dr. Edson Elias da

Silva (Laboratório Referência para Enterovírus/IOC/FIOCRUZ).

Foram inoculados 0,2 ml de cada amostras de LCR que teve volume

suficiente, em tubos contendo 1,0mL de suspensão de células RD

(rabdomiosarcoma humano) e em tubos contendo células HEp2 (células de

carcinoma epidermóide de laringe humana). Após 30 minutos de adsorção do

inóculo, foi adicionado o meio (MEM-Earle’s), contendo 2% de soro fetal bovino. Os

tubos foram incubados a 37°C e, diariamente, foi realizada a leitura destes tubos em

microscópio investido, por sete dias consecutivos. Todas as amostras inoculadas

foram estocadas a -70°C para posterior identificação por RT-PCR. As amostras

negativas na primeira passagem foram submetidas a uma segunda passagem.

3.4.3.2 Detecção do gênero Enterovírus por RT-PCR

Foram utilizados três protocolos diferentes para a identificação molecular dos

enterovírus. A extração do RNA da amostra foi realizada conforme já descrito na

seção 3.4.2.4 e a síntese de cDNA, de acordo com a exposta na seção 3.4.2.5. O

controle utilizado foi cepa vacinal do poliovírus, gentilmente cedida pelo Dr. Felipe

Naveca, do Centro de Pesquisas Leônidas e Maria Deane (CPqL&MD/FIOCRUZ

Amazônia)


1 – Protocolo:

Para a detecção do gênero Enterovirus, primeiramente foram utilizados os

iniciadores grupo-específico EVR e EVF (tabela 12) que flanqueiam a região terminal

5’NC (não codificante) do RNA, a qual é conservada e comum ao genoma de todos

os enterovírus humanos conhecidos. Este par de iniciadores é utilizado na rotina de

diagnóstico do Laboratório de Enterovirus IOC/FIOCRUZ (dados não publicados). A

mistura foi submetida a 35 ciclos de 94oC por 30 seg. 55oC por 30 seg., e 72oC por

30 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por 7 min.

2 – Protocolo:

Para a tipagem molecular dos enterovírus isolados, foi utilizado o protocolo

descrito por Oberste e colaboradores (155), utilizando a sequência dos iniciadores

222 e 292 (Tabela 12), que amplificam 357 pb do gene, codificadora da região da

proteína VP1. Isso permite a identificação dos sorotipos após sequenciamento.

A mistura de PCR consistiu de 3l do produto da RT, 1U da enzima Platinum

Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA) e 2,5µl da solução tampão 10 vezes

concentrada (200mM Tris-HCl, pH 8,4, 500mM KCl), 1µl de MgCl2 a 50mM, 1µl de

cada iniciador específico a 10mM, 1µl da mistura contendo 0,2mM de cada dNTP e

água suficiente para completar 25l. A mistura foi submetida a 35 ciclos de 94oC por

30 seg., 42oC por 30 seg., e 72oC por 30 seg., finalizando com um ciclo de 72oC por

7 min.

Devido a uma positividade muito baixa, em consequência da utilização de um

protocolo de PCR com apenas uma rodada de amplificação, e o tamanho do produto

amplificado de 357 pb, foi utilizado um terceiro protocolo para detecção do gênero

enterovírus.

3 – Protocolo:

O terceiro protocolo permitiu duas rodadas de amplificação. Foram utilizados os

iniciadores grupo-específico HK2F, HK3R e HK10R, descritos na Tabela 12. Estes

iniciadores flanqueiam a região terminal 5’NC (não codificante) do RNA, região


conservada e comum ao genoma de todos os enterovírus humanos conhecidos. Foi

preparada uma mistura para a primeira amplificação com volume final de 25ul,

contendo 3 µl do DNA da amostra, 0,3 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada iniciador

específico (HK2F e HK3R), 0,4 mM de cada dNTP, 01 U enzima Taq DNA

polimerase (Invitrogen). A PCR foi realizada sob as seguintes condições ciclagem:

30 segundos a 95°C, 1 minuto a 63°C, seguido de 10 ciclos e 30 segundos a 95°C,

30 segundos a 60°C, 30 segundos a 72°C seguidos de 30 ciclos, com um passo de

extensão final a 72°C durante 7 min. 1 µL da reação de PCR foi adicionada a uma

mistura de reamplificação com volume final de 49 µL, seguindo as mesmas

condições de ciclagem da PCR.

3.5 Visualização dos produtos amplificados

Os fragmentos detectados foram separados por eletroforese num gel de

agarose 2% e foram visualizadas em um transiluminador sob luz ultravioleta e

corado com brometo de etídio. Utilizando marcador de tamanho molecular 100 bp

A figura 3 representa de forma simplificada todos os passos realizados na

metodologia.

Tabela 12: Relação dos iniciadores utilizados para detecção dos Enterovirus.

Primers Sequencia (5’ – 3’) Amplicon

EVR ATT GTC ACC ATA AGC AGC C 153 pb

EVF CTC CGG CCC CTG AAT GCG GCT A

222 – R CIC CIG GIG GIA YRW ACA T 357 pb

292 – F MIG CIG YIG ARA CNG G

HK2 – F CAA GCA CTT CTG TTT CCC CGC

398 pb HK3 – R ATT GTC ACC ATA AGC AGC CA

HK10 – R ACG GAC ACC CAA AGT AGT CG


3.6 Fluxograma simplificado da metodologia

Figura 3. Algoritmo de processamento das amostras de LCR para identificação viral.

Sequenciamento


3.7 Sequenciamento nucleotídeo

Para o sequenciamento, todos os procedimentos foram executados usando-

se o kit de sequenciamento de DNA Big Dye terminator Cycle Sequencing kit

Version 3.1 (Applyed Biosystems), seguindo-se as instruções do fabricante e

analisando as amostras no sequenciador automático ABI 3130xl.

Para edição manual, alinhamento dos nucleotídeos e tradução da sequência

de aminoácidos, convertido em um arquivo FASTA, foi utilizado o programa BioEdit

Sequence Alignment Edit, versão 7.0.9.0(156). As sequências foram confrontadas

com outras, existentes no GeneBank, através do programa BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool). http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi


4. Resultados

Os resultados estão apresentados na forma de

Artigos.


Artigo Publicado – “Identification of Oropouche

Orthobunyavirus in the cerebrospinal fluid of three

patients in the Amazonia, Brazil”

Am. J. Trop. Med. Hyg., 86(4), 2012, pp. 732–735doi:10.4269/ajtmh.2012.11-0485Copyright © 2012 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene

Short Report: Identification of Oropouche Orthobunyavirus in the Cerebrospinal Fluid

of Three Patients in the Amazonas, Brazil

Michele de Souza Bastos,* Luiz Tadeu Moraes Figueiredo, Felipe Gomes Naveca, Rossicleia Lins Monte,Natalia Lessa, Regina Maria Pinto de Figueiredo, Joao Bosco de Lima Gimaque, Guilherme Pivoto Joao,

Rajendranath Ramasawmy, and Maria Paula Gomes Mourao

Fundacao De Medicina Tropical – Dr. Heitor Vieira Dourado, University of State of Amazonas, Manaus, AM, Brazil; School of Medicine of theUniversity of Sao Paulo in Ribeirao Preto, SP, Brazil; Instituto Leonidas e Maria Deane - FIOCRUZ, Amazonia, Manaus, Brasil; Nilton Lins

University Center, Manaus, AM, Brasil; University Federal of Amazon, Manaus, AM, Brazil

Abstract. Oropouche fever is the second most frequent arboviral infection in Brazil, surpassed only by dengue.Oropouche virus (OROV) causes large and explosive outbreaks of acute febrile illness in cities and villages in theAmazon and Central-Plateau regions. Cerebrospinal fluid (CSF) samples from 110 meningoencephalitis patients wereanalyzed. The RNA extracted from fluid was submitted to reverse transcription-polymerase chain reaction and sequenc-ing to identify OROV. Three CSF samples showed the presence of OROV causing infection in the central nervoussystem (CNS). These patients are adults. Two of the patients had other diseases affecting CNS and immune systems:neurocysticercosis and acquired immunodeficiency syndrome, respectively. Nucleotide sequence analysis showed thatthe OROV from the CSF of these patients belonged to genotype I. We show here that severe Oropouche disease isoccurring during outbreaks of this virus in Brazil

INTRODUCTION

Oropouche virus (OROV) is an Orthobunyavirus in theBunyaviridae family. These viruses are negative polarity tri-segmented single-stranded RNA viruses. The RNA segments,known as large (L), medium (M), and small (S), encode anRNA-dependent RNA polymerase, envelope surface glyco-proteins (Gn and Gc), and a nucleocapsid protein, respec-tively. The virus replicates in the cytoplasm, buds into theGolgi apparatus, and is excreted by the cell.1

Oropouche virus is an arbovirus, transmitted to sloths, mar-supials, primates, and birds by Aedes serratus and Culexquinquefasciatus mosquitoes. Notably, this virus has adaptedto an urban cycle involving man, with midges (Culicoidesparaensis) as the primary vector.2 Oropouche fever is thesecond most frequent arboviral infection in Brazil, surpassedonly by dengue. Oropouche virus causes large and explosiveoutbreaks of acute febrile illness in cities and villages in theAmazon and Central-Plateau regions of Brazil. An estimated500,000 cases of OROV infection have occurred in Brazil inthe past 48 years. In addition to outbreaks, OROV can alsocause sporadic human infections.3 We have recently reportedan outbreak of OROV, occurring from 2007 through 2008, inManaus, the capital of Amazonas State, a large city with�2 million inhabitants.4 In that report, 128 OROV serologi-cally confirmed patients, 2–81 years of age, were identified. Inaddition to fever, the patients had headache (72.7%), myal-gias (70.3%), and arthralgias (57.8%). Rash was observed in42.2%, and hemorrhagic phenomena (petechiae, epistaxis,and gingival bleeding) were observed in 15.5%. All patientsrecovered without sequelae and were not hospitalized.Despite reference of sporadic cases of symptoms of involve-ment of the central nervous system (CNS) in OROV out-breaks, data concerning CNS symptoms were not given.4,5

In Brazil, many CNS infections seemed to be caused byviruses such as enterovirus, cytomegalovirus, herpes simplexvirus type 1, varicella-zoster virus or Epstein-Barr virus.6 Inaddition to OROV, anotherOrthobunyavirus, the Tucundubavirus has been reported to cause meningoencephalitis inBrazil.7 However, identification of the virus causing CNSinfection is uncommon. We report here three cases of CNSinfection by OROV diagnosed using reverse transcription(RT) followed by polymerase chain reaction (PCR) andnucleotide sequencing from RNA extracted from cerebrospi-nal fluid (CSF).

MATERIALS AND METHODS

Cerebrospinal fluid samples from 110 meningoencephalitispatients were analyzed. All study patients provided aninformed consent and authorized in a signed documentdivulgation of results obtained as part of this work. This studywas approved (nr.0048.0.114.000-07) by the Ethics ReviewBoard of the Tropical Medicine Foundation of Amazonas(FMTAM), Manaus, Amazonas, Brazil.These patients were hospitalized and treated, from 2005

to 2010, in the Hospital of the Institute of Tropical Medicineof Amazonas State (TMF-AM), a tertiary care center spe-cializing in tropical and infectious diseases located in thecity of Manaus. The analysis of viruses in the CSFs attendedto the best interest of the patients as part of the routinediagnostic procedures.Detection of virus genomes. Nucleic acids were extracted

from the CSF of the patients by using the QIAmp viral RNAMini Kit (QIAGEN, Valencia, CA), following the manufac-turer’s specifications. For the RT-PCR, the reverse transcrip-tion was conducted in 5 mL of the RNA extracts with randomprimers (AccessQuick RT-PCR System, Promega, Madison,WI). The RT-PCR was followed by a nested-PCR, with specificSimbu serogroup primers selected on the basis of the nucleo-tide sequence of OROV TrVL9760 strain S segment, produc-ing 300 base pair amplicons, as previously reported.8 Thesamples were also tested by PCR for herpesvirus (herpes sim-plex virus types 1 and 2, varicella zoster virus, cytomegalovirus,and Epstein-Barr virus),9 and by RT-PCR for enterovirus.10

*Address correspondence to Michele de Souza Bastos, Fundacao deMedicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Av. Pedro Teixeira,25 – Dom Pedro Manaus-Am, Brazil, CEP: 69040-000. E-mails:[email protected] or [email protected]

732

The amplicons were directly sequenced after purification.Aliquots of 40 mL of each amplicon were purified with theQIAmp PCR purification kit (QIAGEN) and sequencedin both directions by using the Simbu serogroup primersand the BigDye Terminator Cycle Sequence Kit v3.1 inan ABI3130 +l automated sequencer (Applied Biosystems,Foster City, CA). Nucleotide sequences were subjected to thebasic local alignment search tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) analysis using the megablast algorithm for highlysimilar sequences.11

Detection of IgM antibodies to OROV. Immunoglobulin M(IgM) and IgG antibodies to OROV were analyzed in theCSF of the patients by an in-house enzyme immunoassay thatuses virus-infected cultured cells as antigen (EIA-ICC).12

RESULTS

Detection of virus genomes was performed in CSF samplesby PCR for herpesvirus, RT-PCR for enterovirus, and RT-nested-PCR for OROV. The CSF samples having OROVgenome detected by RT-PCR were also tested for IgM- andIgG-specific antibodies to OROV in the CSF of the patientsby an in-house EIA.All of the 110 CSFs samples were negative in the RT-PCR

for enterovirus and in the PCR for herpesvirus. Three patients(2.7%) were positive for OROV by RT-nested-PCR. The CSFof the three patients positive for OROV was searched forantibodies to OROV by the EIA-ICC assay. All three patientsshowed IgG antibodies to OROV in the CSF and one of thesepatients (patient 2) showed also specific IgM to OROV. Thesethree patients had fever and symptoms of CNS involve-ment suggesting meningoencephalitis. Cerebrospinal fluid ofthese patients showed a predominantly lympho-monocytic pat-tern, suggestive of viral infection, as shown in Table 1. Theamplicons obtained from CSFs of the three patients by RT-nested-PCR for OROV were directly sequenced. All threesequences AMLq13 (Gene Bank accession HM107840),AMLq14 (HM107841), and AMLq16 (HM107842), showed100%, 99%, and 100% similarity, respectively, to the provi-sional reference sequence of OROV TRVL9760 (AF64531)and to the strain BeAn19991 (AF164532), isolated in Brazil50 years ago.13

To genotype the three OROV detected in this study, theirsequences were aligned with a dataset of Oropouchesequences TRVL9760 (AF164531), BeH505663 (AF164543),

BeH505442 (AF164542), DEI209 (AF164551), BeH544552(AF164546), BeAn19991 (AF164532), BeH475248 (AF164540),GML444477 (AF164555), GML445252 (AF164557), andGML444911 (AF164556) and Aino virus (M22011) as anoutgroup, using the ClustalX software.14 Phylogenetic analy-sis was conducted with the neighbor-joining method and theKimura 2-parameter nucleotide substitution model usingMEGA 4 software (Figure 1).15

DISCUSSION

Oropouche virus, present only in South America, is one ofthe most important arbovirus that infects humans in theBrazilian Amazon. In this study, OROV was found to causeCNS infection in three patients. Clinical presentation ofOROV infection was first reported by Pinheiro and others2

and since then, < 10 sporadic cases have been reported. In thisstudy, the three patients with meningoencephalitis presenteda clear lympho-monocytic cellular pattern in CSF, high pro-tein, and normal to slightly decreased glucose levels. This isstrongly suggestive of a viral infection. Of note, two of thesepatients presented with underlying infections that may affectthe CNS and immune systems. One patient had neurocysti-cercosis whose diagnosis was based on magnetic resonancesuggestive image and the other patient had human immuno-deficiency virus (HIV)/acquired immunodeficiency syndrome(AIDS) and herpes zoster. As not all patients infected withneurocysticercosis and HIV/AIDS and herpes zoster devel-oped meningitis, it is probable that the two patients co-infected with OROV progressed to meningitis because ofbeing immunocompromised. The third patient developedmeningitis probably because of OROV as no other infectionswere observed. This infection was also confirmed by the pres-ence of IgM- and IgG-specific antibodies to OROV in theCSF. Thus, it is possible that the invasion of CNS by OROVhas been facilitated by previous blood-brain barrier damage.All three patients survived despite a long hospitalization.Saeed13 and others8 reported the first molecular epidemiol-

ogy analysis of OROV, suggesting the existence of at leastthree genotypes (I, II, and III) of the virus in the Americas.In this study, OROV from the three patients belonged togenotype I, grouping with the first isolated OROV, fromTrinidad TRVL9760, 1955 (AF64531), and the first Brazilianisolate of OROV BeAn19991, 1960 (AF164532). In Brazil,the genotype I was originally isolated in Santa Maria County,

Table 1

Clinical and laboratory data of the 3 patients having infection by OROV in CSF*Patient 1 2 3

OROV sequence AMLq13 AMLq14 AMLq16Genera/age (years) Male/54 Male/20 Female/37Profession/county oforigin/year

Fisherman/Uricurituba/September 2006

Agriculture worker/Manacapuru/February 2007

Domestic worker/ Manaus/June 2007

Signs and symptoms Headache, dizziness, cloud vision,and Romberg sign

Headache, fever, chills and malaise Headache, nausea, vomiting,and paraplegia

Associated diseases Neurocysticercosis (diagnosed by amagnetic resonance image)

No reference HIV/AIDS Herpes zoster

CSF analysis 6 monocytes/mL, glucose: 59 mg/dL,protein: 40 mg/dL

134 cells/mL (100% lympho-monocyticcells), glucose: 50 mg/dL, protein:107 mg/dL

533 cells/mL (100% lymphomonocyticcells), glucose: 107 mg/dL, protein:136 mg/dL

Outcome Survived after 4 dayshospitalization

Survived after 24 dayshospitalization

Survived after 32 dayshospitalization

*OROV = oropouche virus; CSF = cerebrospinal fluid; HIV = human immunodeficiency virus; AIDS = acquired immunodeficiency syndrome.

OROPOUCHE ORTHOBUNYAVIRUS 733

at the State of Para, and in the following years, it has beenreported in outbreaks of acute febrile illness in the State ofAmazonas and other western Brazilian States.3,16 Therefore,the high similarity of the short nucleotide sequences of theconserved N gene of OROV, with old OROV isolatesreported in this study, could be similar or bears little differ-ence if other parts of the viral genome were analyzed.Though we only identified three patients here, the occur-

rence of CNS involvement in OROV infections may be vastlyunderestimated, especially in patients immunocompromisedand those with previous blood-brain barrier disruption.Finally, these cases of severe Oropouche disease show thatOROV should be investigated in cases of meningoencephali-tis of unknown etiology.

Received July 26, 2011. Accepted for publication January 23, 2012.

Financial support: This research was supported by the AmazonasResearch Supporting Foundation (FAPEAM grant 871/10) toMichele de Souza Bastos and (FAPEAM grant 887/10) to MariaPaula Gomes Mourao.

Authors’ addresses: Michele de Souza Bastos and Joao Bosco deLima Gimaque, Fundacao De Medicina Tropical – Dr. Heitor VieiraDourado, Manaus, AM, Brasil; University of State of Amazonas,Manaus, AM, Brazil, E-mails: [email protected] and [email protected]. Rossicleia Lins Monte, Regina Maria Pinto de Figueiredo,and Guilherme Pivoto Joao, Fundacao De Medicina Tropical –

Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil, E-mails: [email protected], [email protected], and [email protected]. Rajendranath Ramasawmy, Fundacao De Medicina Tropical –Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil; Nilton LinsUniversity Center, Manaus, AM, Brasil, E-mail: [email protected]. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo, School of Medicine of theUniversity of Sao Paulo in Ribeirao Preto, SP, Brazil, E-mail:[email protected]. Felipe Gomes Naveca, Instituto Leonidas eMaria Deane - FIOCRUZ, Amazonia, Manaus, Brasil, E-mail:[email protected]. Natalia Lessa, Fundacao De MedicinaTropical – Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil;

University Federal of Amazon, Manaus, AM, Brazil, E-mail:[email protected]. Maria Paula Gomes Mourao, Fundacao DeMedicina Tropical – Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil;University of State of Amazonas, Manaus, AM, Brazil; NiltonLins University Center, Manaus, AM, Brasil, E-mail: [email protected].

REFERENCES

1. Elliot RM, Bouloy M, Calisher CH, Goldbach R, Moyer JT,Nichol ST, Pettersson R, Plyusnin A, Schmaljohn CS, 2000.Bunyaviridae. Van Regenmortel MH, Fauquet CM, BishopDH, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, MayoMA, McGeoch DJ, Pringle CR, Wickner RB, eds. Virus Tax-onomy: Seventh Report of the International Committee on Tax-onomy of Viruses. San Diego, CA: Academic Press, 599–621.

2. Pinheiro FP, Hoch AL, Gomes ML, Roberts DR, 1981.Oropouche virus. IV. Laboratory transmission by Culicoidesparaensis. Am J Trop Med Hyg 30: 172–176.

3. Bernardes-Terzian AC, de Moraes-Bronzoni RV, Drumond BP,Da Silva-Nunes M, da-Silva NS, Urbano-Ferreira M, SperancaMA, Nogueira ML, 2009. Sporadic oropouche virus infection,acre, Brazil. Emerg Infect Dis 15: 348–350.

4. Mourao MP, Bastos MS, Gimaque JB, Mota BR, Souza GS,Grimmer GH, Galusso ES, Arruda E, Figueiredo LT, 2009.Oropouche fever outbreak, Manaus, Brazil, 2007–2008. EmergInfect Dis 15: 2063–2064.

5. Pinheiro FP, Rocha AG, Freitas RB, Ohana BA, Travassos daRosa AP, Rogerio JS, Linhares AC, 1982. Meningitis associ-ated with Oropouche virus infections. Rev Inst Med Trop SaoPaulo 24: 246–251.

6. Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH,Figueiredo LT, 2007. Viral infections of the central nervoussystem in Brazil. J Infect 54: 589–596.

7. Shope RE, Woodall JP, Travassos da Rosa AP, 1998. The epide-miology of diseases caused by viruses in Groups C and Guama(Bunyaviridae). Monath TP, ed. The Arboviruses: Epidemiologyand Ecology. Fifth edition. Boca Raton, FL: CRC Press, 37–52.

8. Moreli ML, Aquino VH, Cruz AC, Figueiredo LT, 2002. Diagno-sis of Oropouche virus infection by RT-nested-PCR. J MedVirol 66: 139–142.

Figure 1. Phylogenetic analysis showing Oropouche virus (OROV) genotypes detected by reverse transcription-polymerase chain reac-tion (RT-PCR) in cerebrospinal fluids of three patients having meningoencephalitis (bold-italics). This neighbor-joining consensus tree wasinferred from 1,000 bootstrap replicates. The percentage of replicate trees, which clustered together in the bootstrap testing, is shown next to thebranches. Kimura 2-parameter nucleotide substitution model was chosen as the best-fit after a run on FindModel using all 28 models implemented.(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/findmodel/findmodel.html). Country and year of isolation is referred between brackets.

734 BASTOS AND OTHERS

9. Markoulatos P, Georgopoulou A, Siafakas N, Plakokefalos E,Tzanakaki G, Kourea-Kremastinou J, 2001. Laboratory diagno-sis of common herpesvirus infections of the central nervous sys-tem by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol 39: 4426–4432.

10. Dos Santos GP, Skraba I, Oliveira D, Lima AA, de Melo MM,Kmetzsch CI, da Costa EV, da Silva EE, 2006. Enterovirusmeningitis in Brazil, 1998–2003. J Med Virol 78: 98–104.

11. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ, 1990.Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403–410.

12. Figueiredo LT, Shope RE, 1987. An enzyme immunoassay fordengue antibody using infected cultured mosquito cells as anti-gen. J Virol Methods 17: 191–198.

13. Saeed MF, Wang H, Nunes M, Vasconcelos PF, Weaver SC,Shope RE, Watts DM, Tesh RB, Barrett AD, 2000. Nucleo-

tide sequences and phylogeny of the nucleocapsid gene ofOropouche virus. J Gen Virol 81: 743–748.

14. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettiganPA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R,Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG, 2007. Clustal W andClustal X version 2.0. Bioinformatics 23: 2947–2948.

15. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S, 2007. MEGA4: MolecularEvolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0.Mol Biol Evol 24: 1596–1599.

16. Vasconcelos HB, AzevedoRS, Casseb SM, Nunes-Neto JP, ChiangJO, Canturia PC, Segura MN, Martins LC, Monteiro HA,Rodrigues SG, Nunes MR, Vasconcelos PF, 2009. Oropouchefever epidemic in northern Brazil: epidemiology and molecularcharacterization of isolates. J Clin Virol 44: 129–133.

OROPOUCHE ORTHOBUNYAVIRUS 735

52

DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO VIRAL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

Artigo enviado para publicação – “Detection of

Herpesvirus, Enterovirus and Arbovirus infection in

patients with suspected central nervous system viral

infection in the Western Brazilian Amazon”

For Peer Review

Detection of Herpesvirus, Enterovirus and Arbovirus

infection in patients with suspected central nervous system

viral infection in the Western Brazilian Amazon

Journal: Journal of Medical Virology

Manuscript ID: Draft

Wiley - Manuscript type: Research Article

Date Submitted by the Author: n/a

Complete List of Authors: Bastos, Michele; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia; Universidade Federal do Amazonas, Lessa, Natalia; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia Naveca, Felipe; Centro de Pesquisa Leonidas & Maria Deane, Virologia Martins, Valquiria; Universidade Federal do Amazonas, Figueiredo, Regina; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia Gimaque, Joao Bosco; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia Kramer, Valeria; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia Monte, Rossicleia; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Bacteriologia Fragoso, Silvio; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia Lacerda, Mauiricio; Famerp, Virology; Braga, Wornei; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia Figueiredo, Luiz Tadeu; University of São Paulo at Ribeirão Preto, Virus Research Unit Ramasawmy, Rajendranath; Universidade do Estado do Amazonas, ; Universidade Nilton Lins, ; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia Mourao, M.; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Virologia; Universidade do Estado do Amazonas, ; Universidade Nilton Lins,

Keywords: Encephalitis , Herpesvirus, Enterovirus, Arbovirus, Meningitis

John Wiley & Sons

Journal of Medical Virology

For Peer Review

1

Detection of Herpesvirus, Enterovirus and Arbovirus infection in patients with

suspected central nervous system viral infection in the Western Brazilian Amazon

Michele S Bastos1,2, Natália Lessa1,3, Felipe G Naveca4, Valquíria RA Martins2, Regina MP

Figueiredo1, João Bosco L Gimaque1,2, Valéria Munique Kramer1, Rossicléia L Monte1, Silvio

Fragoso1, Maurício L Nogueira

7, Wornei S Braga

1, Luiz Tadeu M Figueiredo

6, Rajendranath

Ramasawmy1,5, Maria Paula G Mourão1,2,5.

1. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas,

Brazil.

2. Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil.

3. Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil.

4. Centro de Pesquisa Leonidas & Maria Deane, FIOCRUZ, Manaus, Amazonas, Brazil.

5. Universidade Nilton Lins, Manaus, Amazonas, Brazil.

6. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.

7. Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.

Keywords: Encephalitis, Meningitis, Arbovirus, Enterovirus, Herpesvirus

Running Title: Viral Infection in Central Nervous System, Amazon, Brazil

Corresponding Author

Michele de Souza Bastos

Laboratório de Virologia (FMT-HVD)

Av. Pedro Teixeira, 25. Bairro: Dom Pedro Manaus-Am. Brazil

CEP: 69040-000 Tel: 55 92 21273447 email: [email protected]

Page 1 of 20

John Wiley & Sons


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For Peer Review

2

Abstract

Acute infections of the central nervous system (CNS) are commonly caused by

emerging pathogens. In this study, we investigated the presence of herpesviruses

(HHV), enteroviruses (EVs) and arboviruses in CSF samples from 165 patients with

suspected CNS viral infection through polymerase chain reaction (PCR) and reverse

transcriptase PCR. The genome of one or more viral agents was detected in 29.7%

(49/165) of the CSF samples. EVs were predominant (16/49; 32.6%) followed by

Epstein-Barr virus (EBV) (22.4%), Varicella Zoster virus (VZV) (20.4%),

Cytomegalovirus (CMV) (18.4%), herpes simplex virus (HSV-1) (4,1%), (HSV-2)

(4.1%) and the arboviruses (14.3%). Of the arboviruses, 4 were of dengue virus

(DENV) and 3 of oropouche virus (OROV). The detection of different viruses in the

CNS of patients with meningitis or encephalitis highlights the importance of

maintaining an active laboratory monitoring diagnostics with rapid methodology of high

sensitivity in areas of viral hyperendemicity for tailoring treatment.

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Introduction

Acute infections of the CNS remain a medical emergency. Many are caused by

viruses besides bacteria and fungi. Among the viruses, the most important are the

human herpesviruses (HHVs), enteroviruses (EVs) and arboviruses [Reimann et al.,

2008; Dupuis et al., 2011]. Several arboviruses, especially from the genus Flavivirus,

are associated with encephalitis. In Brazil, three important flaviviruses and one

Orthobunyavirus among the arboviruses causing infection in the CNS are Rocio

(ROCV) [de Souza Lopes et al., 1978], St. Louis encephalitis virus (SLEV) [Mondini et

al., 2007], dengue (DENV) [Soares et al., 2011] and Oropouche (OROV) [Bastos et al.,

2012].

Manaus, the capital City of the Amazonas state with almost 2 million

inhabitants, is located in the middle of Amazon rain forest. In Manaus, during a four-

year period from 2006 to 2009, 585 cases of meningitis were reported. Of these, 109

(18.6%) were suspected to be of viral etiology. These preliminary data highlights the

importance in identifying the viral etiological agents responsible for infections of the

CNS and hereby, offering an adequate antiviral treatment. In this study, we investigated

the presence of HHVs, EVs, flaviviruses, alphaviruses and orthobunyavirus that may

cause infections of the CNS through molecular techniques.

Methods

Patients and CSF samples

A total of 165 patients with suspected CNS infection other than bacterial or

fungal enrolled at the Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-

HVD), a tertiary public health for Infectious Diseases from January 2010 through

August 2012 were included in this study. The FMT-HVD is a pioneer on investigation

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of acute febrile syndrome, including hemorrhagic fevers, in the Amazon region since

1998. Recently, from 2009 the monitoring of viral agents in CSF of patients with

suspected CNS viral infection is investigated. The hospital receives about 90% of all the

CSF of patients of the state.

The case definition of a CNS viral infection was the presence of acute

neurological signs and symptoms such as headache, fever, focal neurologic findings,

altered consciousness and laboratory findings such as total CSF cell count >5 cells/

mm3, predominantly by mononuclear cells and negative for fungal and bacterial

infections. This study was approved by the Ethics Committee of the FMT-HVD.

Written informed consent was obtained from all the patients included in the study or

their responsible party.

Lumbar puncture was performed in all patients on the day of hospital admission.

An aliquot of the CSF was submitted for routine analysis: total and differential cells

count; determination of protein, lactate and glucose, and microbiological tests for

bacteria and fungi.

Purification of Nucleic acids

Both DNA and RNA were extracted from 200µl and 140 µl of CSF samples

respectively using the QIAamp Viral DNA and RNA Mini Kit (QIAGEN, Inc., USA),

following the manufacturer's instructions. The DNA and RNA were stored at -80°C

before use.

After purification of RNA from the CSF, cDNA was synthesized by reverse

transcription with AccessQuickTM

RT-PCR System kit (Promega, USA). The RT

mixture consisted of 5 µl of RNA, 1 unit of the enzyme reverse transcriptase, 12.5µl of

AccessQuickTM

Master Mix (2x), 1µl of Random primer and 20U of RNase inhibitor

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(RNaseOUT -Invitrogen, USA) in a final volume of 20µl completed with RNase free

water. The mixture was incubated at 72 °C for 5 minutes (min) and at 45oC for 60 min.

and stored at - 20 °C until use.

Diagnostic testing

Specific viruses were determined according to the following:

- For the detection of five herpesvirus: herpes simplex virus type 1and 2 (HSV-1

and HSV-2), Cytomegalovirus (CMV), varicella zoster virus (VZV), Epstein-Barr virus

(EBV) in CSF samples, the protocol (multiplex PCR) described elsewhere was applied

[Markoulatos et al., 2001].

- For detection of flaviviruses (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, yellow

fever virus (YFV), ROCV, Ilheus virus (ILHV) and SLEV) and alphaviruses (Western

equine encephalitis virus (WEEV), Eastern equine encephalitis (EEEV), Venezuelan

equine encephalitis virus (VEEV) and Mayaro (MAYV)), the methods described by

Bronzoni et al. were used [de Morais Bronzoni et al., 2005; Bronzoni et al., 2004].

- The detection of Orthobunyavirus Oropouche was performed as described

elsewhere [Moreli et al., 2002].

- For the detection of the genus EV was performed as described elsewhere [Zoll

et al., 1992].

Statistical methods

The Epi Info version 3.3.2 software was used for data handling. Statistical

analyses were performed using SPSS version 17. P values < 0.05 were considered

significant. ANOVA and chi-square tests with Yates correction were used for statistical

comparisons.

Results

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Patient characteristics, clinical manifestation and incidence

During the study period, 165 patients with suspected CNS viral infection were

enrolled and CSF sample from all of them were submitted to molecular identification of

the viral agent. Baseline characteristics as well as laboratory findings and clinical

symptoms are shown in Table 1. The mean age of the patients was 27.2 years old

(ranging from 1 to 70 years) and 91 (55.1%) were male. Of the 165 patients, 41 (24.8%)

were under 15 years old.

The genome of one or more viral agents was detected in the CSF samples of 49

(29.7%) patients in total (11 were below 15 years). The viruses detected are listed in

Table 2. Viral monoinfection was detected in 41 patients (83.7%) while co-infection in

eight (3 with CMV / VZV; 1 with VZV / EBV, 1 with CMV / EVs and 3 with EV/

EBV). Screening of Alphaviruses (EEEV, WEEV, VEEV and MAYV) as well as other

Flaviviruses (SLEV, ILHV, ROCV) were also performed. However, none of these

viruses were detected.

Clinical diagnosis was available for only 54 patients of whom 23, 21, 8 and 2

had encephalitis, meningitis, meningoencephalitis and myelitis respectively. The viral

agent was detected in 37% (20/54) of the patients. Of the 20 patients with known viral

agents, 9, 6 and 5 had encephalitis, meningitis and meningoencephalitis respectively.

The most common symptoms were: headache, neck stiffness, fever, altered level of

consciousness and vomiting in 61%, 37%, 35.2%, 24.1% and 22.2% of the patients

respectively.

Laboratory findings of the 49 patients, including the 20 patients with known

clinical diagnosis and with viral genome detected in the CSF are shown in Table 3.

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CSF cell count displayed a mean of 271.6cells/mm3 (range 6 to1976 cells). High

protein level with a mean of 144.5 mg/dl (47-544) was observed in 41 patients. Glucose

level in the CSF samples was below reference value in one patient 19 mg/dl, as shown

in Table 3. The leukocyte counts in CSF of patients infected with EV varied from 15 to

1976 cells/mm3 (mean 360.9) compared to 6 to 1130 cells/mm

3 (mean 178.6) in EV

negative sample (p = 0.01) as shown Table 4. The protein level in CSF of patients with

HHV varied from 21.6 to 544 mg/dl (mean 155.8) compared to 9.8 to 857 mg/dl (mean

105.6) in HHV negative sample (p = 0.02).

Of the 49 CSF samples in which the viral agents were detected, HHV was the

most common (34/49; 69.4%) as follows: EBV and VZV present in 11 and 10 patients

respectively, CMV in 9, HSV-1 and HSV-2 in two each. HSV-2 was detected in a

patient with a clinical diagnosis of meningitis. EV was identified in 16 (32.6%) of the

49 samples. The mean age of these patients was 25.6 years old (≤ 4 - 59) and 10 were

female. Of those positive for EV, one had encephalitis while another one meningitis.

Infection with arbovirus was observed in 14.2% (7/49) of the samples. Only two

genera, Flavivirus and Orthobunyavirus, were observed. Of the genus Flavivirus, only

dengue virus was detected, one DENV-1 and 2 DENV-2. OROV was identified in three

CSF samples. This group of viruses (DENV and OROV) was associated with 4, 2 and 1

cases of meningoencephalitis, meningitis and encephalitis respectively.

Discussion

Our study prospectively investigated the common viruses circulating in the

Amazonas from CSF of patients with suspected CNS viral infection through PCR and

RT-PCR technology to provide a rapid diagnosis for improving management of patients

as the identification of the etiologic agent is extremely important for establishing the

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prognosis of patients and for epidemiological studies as well as for tailoring treatment

accordingly.

With the combinations of different molecular tests: PCR, RT-PCR and Semi-

Nested PCR for the detection of the genome of HHV, EVs, flaviviruses, alphaviruses

and OROV, it was possible to perform the first survey of viral CNS infections in the

Amazonas state. The abovementioned viruses were responsible for at least 29.7% of

suspected viral infection of the CNS suggesting that the remaining 70.3 % may be either

of non-viral or of other viral agents. Low detection rate has also been observed

worldwide as the causative agent of a substantial number of CNS infections remains

unknown [Huppatz et al., 2009; Tan et al., 2010].

The HHV (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV and CMV) can cause a variety of acute

infections of the CNS from either a primary infection or reactivation of latent virus, and

are often associated with encephalitis and meningitis [Kupila et al., 2004; Frantzidou et

al., 2008]. In this study, the genome of herpesvirus has been detected in more than half

of the patients who were PCR positive. The HSV-2 was associated with a female patient

with meningitis. Of note, high prevalence of herpes meningitis has been reported in

women [Kupila et al., 2004 ].

CNS infections associated with VZV is very well known [Persson et al., 2009].

The VZV was present in 10 patients. Four of them had co-infections, three with CMV

and one with EBV. Among the six VZV-mono-infected patients, one patient was below

15 years with previous diagnosis of encephalitis while another one was a 54-year old

female patient with human immunodeficiency virus (HIV) and scalp skin lesions of

herpes zoster that had altered level of consciousness and respiratory distress syndrome.

Severe neurological complications have been suggested to be more frequent in patients

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with HIV [Meyding-Lamade et al., 2012]. All the other patients, positive for VZV,

showed no skin symptoms and were immunocompetent. Of note, it is well-established

that VZV can cause CNS disease and other neuropathies in the absence of rash illness

[Mendoza et al., 2007; Echevarria et al., 1997].

The high number of EBV infections observed is surprising. However, in

immunocompromised individuals, reactivation of latent EBV infection is known. Of

note, although EBV was associated with other viruses that cause CNS disease, it cannot

be excluded that EBV is not involved in the development of encephalitis. For the time

being, the clinical significance of EBV DNA in CSF of patients with suspected

infection of the CNS is still poorly understood as this virus remains latent in B

lymphocytes after primary infection and can be detected even in the absence of

symptoms [Maurmann et al., 2003]. Here, EBV was detected in 11 patients, of whom 7

had concomitant co-infections: 3 with HIV, 3 with EV and 1 with VZV. EBV has been

reported to be often associated with other agents in the CNS infection [Martelius et al.,

2011]. Co-infections between EBV and EV have been cited [Dupuis et al., 2011]. The

presence of mRNA of EBV in CSF of patients co-infected with other virus highlights

that this virus is able to replicate in the presence of another virus [Weinberg et al.,

2011].

CMV was detected in 9 CSF samples. Four of these patients were HIV positive

and the remaining five were immunocompetent patients. The presence of CMV in the

CSF immunocompetent individuals with neurological manifestation suggests that CMV

may play a role in meningoencephalitis. In Brazil, nearly 90% of individual are CMV

seropositive by child-bearing age. Infection with CMV usually occurs during childhood

and remains latent in immunocompetent individuals [Taylor-Wiedeman et al., 1991].

However, it has also been demonstrated that detection of CMV DNA in CSF samples

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were not necessarily correlated with a latent CMV infection [Studahl et al., 1995]. Here,

CMV was detected in 5 CSF samples of immunocompetent patients, a result similar to

that observed by two recent studies [Mendoza et al., 2007; Nahdi et al., 2012]. These

findings also underline an important role of CMV in acute CNS infection in

immunocompetent individuals.

Here, EVs were the most detected as in other studies in Brazil [ Mendonza et al.,

2007; Vidal et al., 2011] and elsewhere [Dupuis et al., 2011] suggesting EVs are the

most common cause of infection in the CNS. Over 50% of infections were detected in

adults. A similar study in England showed that EVs are common causes of infection of

the CNS in immunocompetent adults [Ihekwaba et al., 2008].

We also observed two different arboviruses in 7 patients. The OROV, present

only in South America, is one of the most important arboviruses that infect humans in

the Brazilian Amazon. OROV was detected in the CNS of three patients with

meningoencephalitis recently [Bastos et al., 2012]. Neurologic manifestations

associated with OROV are not very common. However, in the Amazon during an

outbreak of Oropouche fever were reported neurological manifestations typical of

aseptic meningitis early in the acute phase [Pinheiro et al., 1982]. The invasion of the

CNS by OROV was described in an animal model, showing signs of serious

neurological damage, including motor impairment and paralysis of the hind limbs

[Rodrigues et al., 2011]. DENV was the only flavivirus detected in 4 patients. Those

patients had signs and symptoms consistent with classic dengue (fever, headache and

myoartralgia) in the acute phase of infection but evolved with presentation of

neurological neck stiffness and impaired consciousness. The DENV-2 was detected in

the CSF of three patients, a 9-year-old boy who had a clinical diagnosis consistent with

encephalitis, a 32 years old woman with signs and symptoms of classical dengue

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(thrombocytopenia 17,000) who developed neurological signs, with neck stiffness and

altered level of consciousness suggestive of meningoencephalitis, and one patient with

meningitis. The DENV-1 was detected in the patient with meningitis. None of these

patients evolved to severe disease or death.

Unusual manifestations of dengue infection, such as neurological syndrome,

have been increasingly reported and among these are encephalitis, transverse myelitis

and Guillain Barré syndrome [Borawake et al., 2011]. However, several studies have

also shown that dengue can cause meningitis. Studies in Jamaica and Vietnam showed

13.5% and 4.2% respectively of the CNS infection are caused by dengue virus and the

most common manifestation was meningitis [Solomon et al., 2000; Jackson et al.,

2008].

Although alphaviruses were not detected, the presence of DENV and OROV

infections together with the other viruses highlights the need for increased surveillance

in CNS infection, especially in patients with neurological manifestations in areas of

viral hyperendemicity such as Manaus with a simultaneous circulation of four DENV

serotypes [Bastos et al., 2012], OROV [Mourão et al., 2009] and MAYV [Mourão et al.,

2012].

The leukocyte count and biochemical analysis of the CSF samples infected by

viruses showed pleocytosis. Protein level was high in 78% of virus positive samples

suggesting alteration in the blood-CSF barrier and is consistent with an infectious

process in the CNS [Dimas et al., 2008]. Concerning glucose level which depends on

the correlation with blood glucose levels, we are unable to say if the increase or

decrease in glucose levels were related to infection in the CNS as we did not measure

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blood glucose level. However, the leukocyte count and biochemical analysis of the CSF

samples showed classical parameters of virus infection.

Conclusions

Laboratory identification of the agent responsible for CNS infections is needed

since clinical manifestations do not indicate the specific etiologic agent. Hence, the use

of diagnostic methods that is specific, sensitive and fast is needed in order to provide an

adequate antiviral therapy besides suggesting suitable epidemiological measures to

control these diseases. Altogether, the detection of different viruses in the CNS of

patients with meningitis or encephalitis highlights the importance of maintaining a

system of active laboratory monitoring diagnostics with rapid methodology of high

sensitivity in areas of viral hyperendemicity.

Funding

This work was supported by the Fundação de Apoio à Pesquisa no Estado do Amazonas

(FAPEAM) to Dr. MS Bastos [grant 871/2010 and grant 437/2012].

Conflicts of Interest

All authors: no conflicts.

Acknowledgments

We thank all members of the clinical staff of the Fundação de Medicina Tropical Dr.

Heitor Vieira Dourado, Hospital Universitário Getúlio Vargas and Hospital Pronto

Socorro Dr. João Lucio Machado and the patients for willing to participate in this study.

A special thank to Elizabeth dos Santos Galusso and Marcia Castilho for managing the

samples.

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For Peer Review

13

References

Bastos Mde S, Figueiredo LT, Naveca FG, Monte RL, Lessa N, Figueiredo RMP,

Gimaque JBL, Pivoto G, Ramasawmy R, Mourão MP. 2012. Identification of

Oropouche Orthobunyavirus in the cerebrospinal fluid of three patients in the

Amazonas, Brazil. Am J Trop Med and Hyg 86:732-735.

Bastos MS, de Figueiredo RM, Ramasawmy R, Itapirema E, Gimaque JB, Santos LO,

Figueiredo LT, Mourao MP. 2012. Simultaneous circulation of all four dengue

serotypes in Manaus, State of Amazonas, Brazil in 2011. Rev Soc Bras Med Trop

45:393-394.

Borawake K, Prayag P, Wagh A, Dole S. 2011. Dengue encephalitis. Ind J Crit Care

Med 15:190-193.

Bronzoni RV, Moreli ML, Cruz AC, Figueiredo LT. 2004. Multiplex nested PCR for

Brazilian Alphavirus diagnosis. Trans Royal Soc Trop Med and Hyg 98:456-461.

de Morais Bronzoni RV, Baleotti FG, Ribeiro Nogueira RM, Nunes M, Moraes

Figueiredo LT. 2005. Duplex reverse transcription-PCR followed by nested PCR

assays for detection and identification of Brazilian alphaviruses and flaviviruses. J

Clin Microbiol 43:696-702.

de Souza Lopes O, Coimbra TL, de Abreu Sacchetta L, Calisher CH. 1978. Emergence

of a new arbovirus disease in Brazil. I. Isolation and characterization of the

etiologic agent, Rocio virus. Am J Epidemiol 107:444-449.

Dimas LF, Puccioni-Sohler M. 2008. Cerebrospinal fluid exam: influence of sample

preparation, temperature and time on analytical stability. Bras Patol Med Lab

44:97-106.

Dupuis M, Hull R, Wang H, Nattanmai S, Glasheen B, Fusco H, Dzigua L, Markey K,

Tavakoli NP. 2011. Molecular detection of viral causes of encephalitis and

meningitis in New York State. J Med Virol 83:2172-2181.

Echevarria JM, Casas I, Tenorio A, de Ory F, Martinez-Martin P. 1994. Detection of

varicella-zoster virus specific DNA sequences in cerebrospinal fluid from patients

with acute meningitis and no cutaneous lessions. J Med Virol 43:331-335.

Frantzidou F, Kamaria F, Dumaidi K, Skoura L, Antoniadis A, Papa A. 2008. Aseptic

meningitis and encephalitis because of herpesviruses and enteroviruses in an

immunocompetent adult population. Eur J Neurology 15:995-997.

Huppatz C, Durrheim DN, Levi C, Dalton C, Williams D, Clements MS, Kelly PM.

2009. Ethiology of encephalitis in Australia, 1990-2007. Emerg Infect Dis 15:1359-

1365.

Ihekwaba UK, Kudesia G, McKendrick MW. 2008. Clinical features of viral meningitis

in adults: significant differences in cerebrospinal fluid findings among herpes

Page 13 of 20

John Wiley & Sons


123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960

For Peer Review

14

simplex virus, varicella zoster virus, and enterovirus infections. Clin Infect Dis

47:783-789.

Jackson ST, Mullings A, Bennett F, Khan C, Gordon-Strachan G, Rhoden T. 2008.

Dengue infection in patients presenting with neurological manifestations in a

dengue endemic population. West Ind Med J 57:373-376.

Kupila L, Vainionpaa R, Vuorinen T, Marttila RJ, Kotilainen P. 2004. Recurrent

lymphocytic meningitis: the role of herpesviruses. Arc Neurol 61:1553-1557.

Markoulatos P, Georgopoulou A, Siafakas N, Plakokefalos E, Tzanakaki G, Kourea-

Kremastinou J. 2001. Laboratory diagnosis of common herpesvirus infections of

the central nervous system by a multiplex PCR assay. J Clin Microbiol 39:4426-

4432.

Martelius T, Lappalainen M, Palomaki M, Anttila VJ. 2011. Clinical characteristics of

patients with Epstein Barr virus in cerebrospinal fluid. BMC Infec Dis 11:281.

Maurmann S, Fricke L, Wagner HJ, Schlenke P, Hennig H, Steinhoff J, Jabs W J. 2003.

Molecular parameters for precise diagnosis of asymptomatic Epstein-Barr virus

reactivation in healthy carriers. J Clin Microbiol 41:5419-28.

Mendoza LP, Bronzoni RV, Takayanagui OM, Aquino VH, Figueiredo LT. 2007. Viral

infections of the central nervous system in Brazil. J Infec 54:589-96.

Meyding-Lamade U, Strank C. 2012. Herpesvirus infections of the central nervous

system in immunocompromised patients. Ther Adv Neurol Dis 5:279-296.

Mondini A, Cardeal ILS, Lazaro E, Nunes SH, Moreira CC, Rahal P, Maia IL, Franco

C, Gongora DVN, Gongora-Rubio F, Cabrera SEM, Figueiredo LTM, Fonseca FG,

Bronzoni RVM, Chiaravalloti-Neto F, Nogueira ML. 2007. Saint Louis encephalitis

virus, Brazil. E Inf Dis 13:176-178.

Moreli ML, Aquino VH, Cruz AC, Figueiredo LT. 2002. Diagnosis of Oropouche virus

infection by RT-nested-PCR. J Med Virol 66:139-42.

Mourão MP, Bastos MS, Gimaque JB, Mota BR, Souza GS, Grimmer GH, Galusso ES,

Arruda E, Figueiredo LT. 2009. Oropouche fever outbreak, Manaus, Brazil, 2007-

2008. Emerg Infec Dis 15:2063-2064.

Mourão MP, Bastos MS, de Figueiredo RP, Gimaque JB, Galusso ES, Kramer VM,

Oliveira CM, Naveca FG, Figueiredo LT. 2012. Mayaro fever in the city of

Manaus, Brazil, 2007-2008. Vec Bor Zoonotic Dis 12:42-6.

Nahdi I, Boukoum H, Salem ANB, Romdane FB, Hammami S, Chebel S, Mahbouba F,

Guediche MN, Chakroun M, Aouni M, Imbert-Marcille B, Bressollette-Bodin C.

2012. Detection of herpes simplex virus (1 and 2), varicella-zoster virus,

cytomegalovirus, human herpesvirus 6 and enterovirus in immunocompetent

Tunisian patients with acute neuromeningeal disorder. J Med Virol 84:282-289.

Page 14 of 20

John Wiley & Sons


123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960

For Peer Review

15

Persson A, Bergstrom T, Lindh M, Namvar L, Studahal M. 2009. Varicella-zoster virus

CNS diseases – Viral load, clinical manifestations and sequels. J Clin Virol 46:249-

253.

Pinheiro FP, Rocha AG, Freitas RB. 1982. Meningitis associated with Oropouche virus

infections. Rev Inst Med Trop São Paulo 24:246-251.

Reimann CA, Hayes EB, DiGuiseppi C, Hoffman R, Lehman JA, Lindsey NP,

Campbell GL, Fischer M. 2008. Epidemiology of neuroinvasive arboviral disease

in the United States, 1999-2007. Am J Trop Med and Hyg 79:974-979.

Rodrigues AH, Santos RI, Arisi GM, Bernardes ES, Silva ML, Rossi MA, Lopes MB,

Arruda E. 2011. Oropouche virus experimental infection in the golden hamster

(Mesocrisetus auratus). Virus research 155:35-41.

Soares CN, Cabral-Castro MJ, Peralta JM, de Freitas MR, Zalis M, Puccioni-Sohler M.

2011. Review of the etiologies of viral meningitis and encephalitis in a dengue

endemic region. J Neurol Sciences 303:75-79.

Solomon T, Dung NM, Vaughn DW, Kneen R, Thao LT, Raengsakulrach B. 2000.

Neurological manifestations of dengue infection. Lancet 355:1053-9.

Studahl M, Bergstrom T, Ekeland-Sjoberg K, Ricksten A. 1995. Detection of

cytomegalovirus DNA in cerebrospinal fluid in immunocompetent patients as a

sign of active infection. J Med Virol 46:274-280.

Tan LV, Qui PT, Ha DQ, Hue NB, Bao LQ, Cam BV, Khanh TH, Hien TT, Chau NVV,

Tram TT, Hien VM, Nga TVT, Schultsz C, Farrar J, van Doorn HR, de Jong MD.

2010. Viral etiology of encephalitis in children in Southern Vietnam: Results of a

encephalitis prospective descriptive study. PLoS Negl Trop Dis 4:e854.

Taylor-Wiedeman J, Sissons JG, Borysiewicz LK, Sinclair JH. 1991. Monocytes are a

major site of persistence of human cytomegalovirus in peripheral blood

mononuclear cells. J Gen Virol 72:2059-2064.

Vidal LR, Almeida SM, Messias-Reason IJ, Nogueira MB, Debur Mdo C, Pessa LF,

Pereira LA, Rotta I, Takahashi GR, Silveira CS, Araújo JM, Raboni SM.

Enterovirus and herpesviridae family as etiologic agents of lymphomonocytary

meningitis, Southern Brazil. Arq Neuro-psiquiatria. 2011;69(3):475-81

Weinberg A, Bloch KC, Li S, Tang YW, Palmer M, Tyler KL. 2005. Dual infections of

the central nervous system with Epstein-Barr virus. J Infec Dis 191:234-237.

Zoll GJ, Melchers WJ, Kopecka H, Jambroes G, van der Poel HJ, Galama JM. 1992.

General primer-mediated polymerase chain reaction for detection of enteroviruses:

application for diagnostic routine and persistent infections. J Clin Microbiol

30:160-165.

Page 15 of 20

John Wiley & Sons


123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960

For Peer Review

16

Table 1. Patient demographic, clinical and laboratory features diagnosed with confirmed

or clinically suspected infection of CNS.

Variable N PCR+(%) (95%CI) p-value

Total sample 165 49 (29,7) (22.7 – 36.6)

Age group

≤ 15 41 11 (26,8) (13.3 – 40.4)

(22.5 – 38.7)

0.69

< 15 124 38 (30,6)

Gender

Female 74 20 (27.0) (16,9 – 37.1)

(27,0 – 36.8)

0.31

Male 91 29 (31.9)

Procedency

FMT-HVD 129 43 (33.3) ( 25.0 – 41.4)

(4.6 – 28.8)

0.06

Other 36 6 (16.7)

Signs Symptoms

Headache

Yes 34 15 (44.1) (27.5 – 60.7)

(-0.5 – 35.7)

0.07

No 17 3 (17.6)

Fever

Yes 20 8 (40.0) (29.1 – 50.9)

(15.9 – 48.7)

0.76

No 31 10 (32,3)

Vomiting

Yes 12 5 (41.7) (13.8 – 69.6) 0.73

No 39 13 (33.3) (18.1 – 48.4)

Neck stiffness

Yes 20 4 (20.0) (2.5 – 37.5) 0.08

No 31 14 (45.2) (27.7 – 62.7)

Consciousness

Yes 13 7 (53.8) (26.8 – 80.8) 0.17

No 38 11 (28.9) (14.9 – 42.9)

Convulsion

Yes 8 4 (50.0) ( 15.4 – 84.7 ) 0.43

No 43 14 (32.6) ( 18.7 – 46.5)

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For Peer Review

17

Table 2. Viruses observed in the cerebrospinal fluid of patients with suspected viral

infection of the central nervous system.

Virus

Positive PCR

CSF sample

n=49

<15 anos

n= 11

>15 anos

n= 38

Mono-

detection

n= 41

Co-

detection

n= 8

Clinical

Diagnosis

Evs 16 (32.6%) 3 (18.7%) 13 (81.2%) 12 (75%) 4 (25%) Encephalitis n=1

Meningitis n=1

EBV 11 (22.4%) 2 (18.2%) 9 (81.8%) 7 (63,6%) 4 (36.7%)

Encephalitis n=1

Meningitis n=2

ME n=1

VZV 10 (20.4%) 1 (10%) 9 (90%) 6 (60%) 4 (40%) Encephalitis n=1

CMV 9 (18.4%) 1 (11.1%) 8 (88.8%) 5 (55,6%) 4 (44.6%) Encephalitis n=3

Meningitis n=1

HSV-1 2 (4.1%) 2 (100%) 0 2 (100%) 0 -

HSV-2 2 (4.1%) 1 (50%) 1 (50%) 2 (100%) 0 Meningitis n=1

DENV 4 (8.2%) 1 (25%) 3 (75%) 4 (100%) 0

Encephalitis n=1

Meningitis n=2

ME n=1

OROV 3 (6.1%) 0 3 (100%) 3 (100%) 0 ME n=3

EVs, enteroviruses; EBV, Epstein-barrvirus; VZV, varicella zoster vírus; CMV, cytomegalovirus; HSV-1,

herpes simplex virus type-1; HSV-2, herpes simplex virus type-2; DENV, dengue vírus; OROV,

oropouche vírus; ME, meningoencephalitis.

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For Peer Review

18

Table 3. Clinical diagnosis and laboratory of the 49 patients with viral genome positive cerebrospinal

fluid (CSF) from patients with central nervous system infection in the Western Brazilian Amazon

Leukocyte counts

Biochemical

parameters

N.

Age/

Sex

Leukocyte

/µl L% N%

Protein

(mg/dl)

Glucose

(mg/dl)

Clinical

diagnosis Virus

Co

morbidity

1 04y/M 42 100 - 42 46 N/A HSV-1

2 15 y/F 160 98 2 47 70 N/A HSV-1

3 07 y/F 314 100 - 57 43 N/A HSV-2

4 18 y/F 677 94 6 202 34 M HSV-2

5 30y/M 10 100 - 196 59 N/A CMV HIV

6 19y/M 1520 100 - 129 48 N/A CMV

7 32y/F 80 100 - 168 26 E CMV, EV HIV

8 23y/M 77 100 - 78 41 M CMV

9 30y/M 51 100 - 457 41 E CMV Tuberculosis, HIV

10 25y/M 7 100 - 50 50 E CMV Malaria

11 43y/F 122 100 - 44 88 N/A CMV,VZV

12 09y/M 202 99 1 66 67 N/A CMV,VZV

13 43y/M 11 100 - 76 52 N/A CMV,VZV Tuberculosis, HIV

14 45y/M 126 100 - 209 55 N/A VZV

15 30y/M 426 100 - 120 63 N/A VZV

16 40y/M 25 100 - 37 95 N/A VZV

17 38y/M 12 100 - 67 71 N/A VZV

18 45y/F 18 100 - 22 62 N/A VZV HIV, Rush

19 19y/F 31 100 - 96 19↓ E VZV, EBV HIV

20 13y/M 44 100 - 57 52 E VZV

21 01y/M 256 64 36 427 39 N/A EBV

22 20y/M 96 100 - 142 166 N/A EBV HIV

23 24y/M 576 60 40 313 27 M EBV HIV

24 30y/M 139 94 6 73 52 E EBV, EV

25 06y/M 1066 86 14 83 46 N/A EBV, EV

26 30y/M 410 100 - 185 43 E EBV HIV

27 45y/M 277 78 22 324 27 ME EBV

28 30y/M 202 100 - 544 34 N/A EBV

29 28y/M 283 100 - 84 53 N/A EBV, EV

30 47y/M 528 91 9 392 35 N/A EBV

31 21y/F 448 100 - 138 59 N/A EV HIV

32 25y/M 1976 95 5 78 54 N/A EV

33 32y/F 80 100 - 168 26 N/A EV

34 30y/M 51 100 - 457 41 N/A EV

35 33y/F 90 100 - 41 59 N/A EV

36 15 y/F 198 100 - 148 54 N/A EV

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For Peer Review

19

Table 3. Continuation

(HIV) Human immunodeficiency virus ; L, lymphocyte; N, neutrophils; M, meningitis; E, encephalitis; ME,

meningoencephalitis; EV, enterovirus; OROV, oropouche virus ; N/A: not available

Leukocyte counts Biochemical

parameters

N.

Age/

Sex

Leukocyte

/µl L% N%

Protein

(mg/dl)

Glucose

(mg/dl)

Clinical

diagnosis Virus

Co

morbidity

37 30 y/M 224 85 15 184 24 M EV

38 11 y/F 458 98 2 146 46 N/A EV

39 59 y/M 208 100 - 106 56 N/A EV

40 32 y/F 163 100 - 57 91 N/A EV

41 04 y/F 341 99 1 61 25 N/A EV

42 21 y/F 283 100 - 41 95 N/A EV

43 54 y/M 6 100 - 40 59 ME OROV

44 20 y/M 134 100 - 107 50 ME OROV

45 37 y/F 533 100 - 136 107 ME OROV HIV

46 09 y/M 373 91 9 76 49 E DENV-2

47 32 y/F 112 92 8 434 73 ME DENV-2

48 25 y/F 20 100 - 24 75 M DENV-2

49 26 y/F 320 100 - 75 65 M DENV-1

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For Peer Review

20

Table 4. Laboratory findings for patients with enterovirus, herpesvirus or arbovirus

infection.

Laboratory finding in CSF

Enterovirus

n= 13

Herpesvirus

n= 23

Arbovirus

n= 7

Leukocyte count x106 360,88 (p=0,01)* 251,48 (P=0,36) 214,00 (P=0,91)

Protein level, mg/dL 136,52 (p=0,4) 155,83 (P=0,02)* 127,37 (P= 0,77)

Glucose level, mg/dL 55,12 (p=0,86) 53,6 (p=0,86) 68,29 (P=0,10)

*Statistically significant (P>0,05)

CSF: Cerebrospinal fluid

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