Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
ESTUDO DE CÉLULAS T REGULADORAS (TREG) (TCD4+CD25+FOXP3+) NAS DIVERSAS FORMAS CLÍNICAS DA HANSENÍASE E ESTADOS REACIONAIS
JOSÉ NAPOLEÃO TAVARES PARENTE
MANAUS 2012
i
JOSÉ NAPOLEÃO TAVARES PARENTE
ESTUDO DE CÉLULAS T REGULADORAS (TREG) (TCD4+CD25+FOXP3+) NAS DIVERSAS FORMAS CLÍNICAS DA HANSENÍASE E ESTADOS REACIONAIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador (a): Profª Dra. Carolina Chrusciak Talhari Cortez Co-orientador (es): Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro-Rodrigues Prof. MSc. Antônio Pedro Mendes Schettini
MANAUS 2012
Ficha Catalográfica
Elaborada pela Bibliotecária Sônia Maria Nunes de Souza CRB-11ª 646
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS Av. Carvalho Leal, 1777 – Cachoeirinha - Escola Superior de Ciências da Saúde
Cep. 69.065-001 – Manaus-Am
P228e Parente, José Napoleão Tavares Estudo de Células T Reguladoras (TREG) (TCD4+CD25+FOXP3+) nas diversas formas clínicas da Hanseníase e estados reacionais / José Napoleão Tavares Parente. - Manaus: UEA, 2012.
63 fls.: il; 27cm.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Profª. Dra. Carolina Chrusciak Talhari Cortez
1. CD4 2.CD25 3. Células T Regulatórias. 4. Linfócitos T Reguladores. I.Título
CDU 616-002.73
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
ESTUDO DE CÉLULAS T REGULADORAS (TREG) (TCD4+CD25+FOXP3+) NAS DIVERSAS FORMAS CLÍNICAS DA
HANSENÍASE E ESTADOS REACIONAIS
JOSÉ NAPOLEÃO TAVARES PARENTE
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.
Banca Julgadora:
_________________________________ Profª. Carolina Chrusciak Talhari Cortez, Dra.
Presidente
_________________________________ Prof. Luiz Carlos de Lima Ferreira, Dr.
Membro
_________________________________ Profª. Maria da Graça Souza Cunha, Dra.
Membro
iii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais e meus irmãos que me deram o apoio fundamental para a realização
deste trabalho.
As minhas queridas avós Hermínia (in memoriam) e Nadir por terem me ajudado a
enxergar que o estudo era o único caminho para um futuro próspero e feliz.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me orienta e ilumina em todos os momentos de minha vida.
À Profª Dra. Carolina Chrusciak Talhari Cortez pela excelente orientação deste
trabalho e pela contribuição de conhecimentos.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro-Rodrigues pelo apoio na realização deste trabalho.
Ao Prof. Ms. Antonio Pedro Mendes Schettini pelo incentivo e estímulo constante.
Ao Prof. Dr. Césare Massone que muito contribuiu para o meu desempenho.
Ao Prof Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira pela grande contribuição de conhecimentos.
À Dra. Alessandra Fayad pelo estímulo e grande apoio na realização dessa
dissertação.
Aos amigos Júlio Sampaio e Ana Célia pela grande consideração, atenção e ajuda.
À Fundação “Alfredo da Matta” que permitiu a execução e realização deste estudo.
Aos funcionários do setor de histopatologia da Fundação “Alfredo da Matta” pela
colaboração na coleta de dados deste estudo.
Aos funcionários do setor de histopatologia da Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas (FMTA) pela colaboração na realização dos exames.
À Universidade Estadual do Amazonas (UEA) em parceria com a FMTA, pela
experiência adquirida e pelo conhecimento assimilado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES e à
Fundação MURAKI pelo apoio na pesquisa científica.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
v
EPÍGRAFE
“Sei que meu trabalho é uma gota no oceano, mas sem ele, o oceano seria menor”
Madre Tereza de Calcutá
vi
RESUMO
Introdução: A hanseníase é caracterizada, do ponto de vista histopatológico, por quadros granulomatosos de distribuição espectral, o que reflete a resposta imune do paciente ao Mycobacterium leprae. Embora as células T reguladoras CD4 + CD25 + Foxp3 + sejam fundamentais para imunorregulação; a presença, freqüência e distribuição de Tregs na hanseníase e seus estados reacionais foram investigadas em poucos estudos. Objetivos: Verificar a freqüência e distribuição das células células T reguladoras nas diferentes formas clínicas e estados reacionais da hanseníase. Metodologia: Foi realizado estudo imunohistoquímico retrospectivo envolvendo 96 casos de hanseníase (9 casos de hanseníase indeterminada; 13 de hanseníase tuberculóide; 26 hanseníase borderline tuberculóide; 3 hanseníase borderline borderline; 8 hanseníase borderline virchowiana; 27 hanseníase virchowiana virchowiana; 8 de reação hansênica tipo I e 2 de reação hansênica tipo II). Resultados: As células FoxP3 positivas estavam presentes em 100% dos casos estudados, com densidade média de 2,82% do infiltrado e mostravam incremento estatisticamente significante entre os casos de reação hansênica tipo I e hanseníase indeterminada (P = 0,0228); hanseníase borderline tuberculóide (P = 0,0351) e hanseníase virchowiana virchowiana (P = 0,0344). Conclusão: Nossos dados sugerem papel relevante das Tregs na etiopatogenia da hanseníase. Estas células regulariam a extensão do processo inflamatório, induzindo provavelmente o aparecimento de formas com tendência ao pólo tuberculóide da doença e quadro reacionais do tipo I.
Palavras-chaves: CD4; CD25; FoxP3; células T regulatórias; linfócitos T reguladores; linfócitos T supressores de ocorrência natural; Linfócitos T CD4-Positivos; células Th3
vii
ABSTRACT
Introduction: Leprosy is histologically characterized by a spectrum of different granulomatous skin lesions reflecting patient’s immune response to Mycobacterium leprae. Although CD4+CD25+ FoxP3+ T regulatory cells are pivotal on immuneregulation, presence, frequency, and distribution of Tregs in leprosy and its reactional states were investigated in few studies. Objectives: This study aimed to verify the frequency and distribution of cell regulatory T cells in different clinical forms and reactional states of leprosy. Methods: Here, we performed a imunohistochemical study on 96 cases of leprosy [Indeterminate: 9 patients; tuberculoid tuberculoid: 13 patients; borderline tuberculoid: 26 patients; borderline borderline: 3 patients; borderline lepromatous: 8 patients; lepromatous lepromatous: 27 patients; reversal reaction: 8 patients; and erythema nodosum leprosum: 2 patients]. Results: FoxP3-positive cells were present in 100% of the cases with an average density of 2.82% of the infiltrate. Their distribution was not related to granulomatous structures or special locations. There was a statistical significant increment of FoxP3 expression in patients with reversal leprosy reactions (RR) when compared to patients presenting I leprosy (P= 0,0228); BT (P = 0,0351) and LL (P = 0,0344). Conclusion: These findings suggest that Treg cells seem to have a relevant role on leprosy ethiopathogenesis, mainly in type I leprosy reaction.
Key-words: CD4; CD25; FoxP3; regulatory T cells; regulatory T lymphocytes; suppressor T lymphocytes naturally occurring; CD4-Positive T-Lymphocytes; cells Th3
viii
LISTA DE FIGURAS
Artigo
Figure A - BT leprosy: epitheliod granulomas surrounded and infiltrated by
lymphocytes. Hematoxylin–eosin staining; original magnification x100. .................... 30
Figure B - Immunohistochemical stainings of FoxP3; Tregs are present around and
within the granuloma; original magnification x100. .................................................... 30
Figure C - LL leprosy: diffuse infiltrate of vacuolated macrophages together with
lymphocytes in the dermis. Hematoxylin-eosin staining; original magnification x 100.
.................................................................................................................................. 30
Figure D - Immunohistochemical stainings of FoxP3 show a diffuse distribution of
Tregs; original magnification x 100. ........................................................................... 30
Figure E - ENL: granulomatous infiltrate of vacuolated macrophages and neutrophils
in the dermis. Hematoxylin– eosin staining; original magnification X 100. ................ 31
Figure F - Immunohistochemical stainings of FoxP3 show Tregs distribution in the
infiltrate; original magnification x 100. ....................................................................... 31
Figure G - Nuclear FoxP3 staining in BT leprosy. Original magnification X 400. .... 31
Figure H - Nuclear FoxP3 staining in ENL. Original magnification x 400. ................. 31
ix
LISTA DE TABELAS
Dissertação
Tabela 1 - Amostra do estudo ................................................................................... 17
Artigo
Table 1 - Mean FoxP3 positivity ................................................................................ 37
x
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDAS
Dissertação
Α - Alfa Ac - Anticorpo ANOVA - Teste Análise de Variância aTreg - Célula T Reguladora Adaptativa β - Beta BB - Hanseníase Borderline Borderline BCG – Bacilo de Calmette Guérin BL - Hanseníase Borderline Lepromatosa BT - Hanseníase Borderline Tuberculóide BV - Hanseníase Borderline Virchowiana CCR6 – Receptor de Quimiocina 6 CCR7 - Receptor de Quimiocina 7 CD3 – Molécula de expressão de superfície celular do sinal de transdução pelo receptor de célula T CD4 – É uma glicoproteína monomérica de 59kDa que contém quatro domínios (D1, D2, D3, D4) do tipo imunoglobulinas CD8 – É uma glicoproteína transmembrana que serve como co-receptor para o receptor de célula T CD 25 – Receptor da Cadeia Alfa de Interleucina 2 CD 103 – Dímero com subunidades de 150 e 25 kD, ligado não covalentemente à subunidade integrina beta 7 CD 127 – Cadeia Alfa do Receptor Interleucina 7 Células Teff – Células T Efetoras CEP - Comitê de Ética em Pesquisa CTLA-4 – Antígeno 4 associado ao Linfócito T Citotóxico DAB - Diaminobenzidina ENH - Eritema Nodoso Hansênico FoxP3 - Fator de Transcrição Específico para Célula T Reguladora FUAM - Fundação “Alfredo da Matta” GITR - Receptor do Fator de Necrose Tumoral Glicocorticóide Induzido HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana HLA - Antígeno Leucocitário Humano HSV – Vírus Herpes Simples IFN-γ - Interferon Gama IL - Interleucina IL-10 - Interleucina 10 IL-12 - Interleucina 12 IL-2 - Interleucina 2 IL-4 - Interleucina 4 IL-5 - Interleucina 5 IL-6 – Interleucina 6 IL-8 – Interleucina 8 IL-1B – Interleucina 1 beta IPEX – Síndrome hereditária ligada ao cromossomo X caracterizada por imunodesregulação, poliendocrinopatia e enteropatia
xi
NKT - Células T Natural-Killer iNKT - Células T Natural-Killer Invariantes IPEX - Síndrome Hereditária Ligada ao Cromossomo X LAM - Lipoarabinomannan Lama2 - Laminina-α 2 kDa - Quilodálton M. leprae - Mycobacterium Leprae M. tuberculosis - Mycobacterium Tuberculosis MBL-2 - Lectina Ligante de Manose MHBB – Mal de Hansen Borderline Borderline MHBT - Mal de Hansen Borderline Tuberculóide MHBV - Mal de Hansen Borderline Virchowiana MHI - Mal de Hansen Indeterminada MHT - Mal de Hansen Tuberculóide MHVV - Mal de Hansen Virchowiana ml - Mililitro mM – Milimol mRNA - RNA Mensageiro NKT - Célula T Natural Killer nTreg - Célula T Reguladora Natural p - Probabilidade de que as diferenças encontradas tenham sido decorrentes do acaso PARK2/PACRG – Genes que codificam a Parkina PBS - Tampão Fosfato Salino PCR - Reação em Cadeia da Polimerase PGL1 - Glicolipídio-Fenólico 1 pH - Potencial Hidrogeniônico PRR - Receptor de Reconhecimento de Padrões RR - Reação Reversa SD – Desvio Padrão TB - Tuberculose TCR - Receptor de Célula T Teff - Células T Efetoras Teste T de Student - É um teste de hipótese que usa conceitos estatísticos para rejeitar ou não uma hipótese nula TGF-β - Fator Transformador de Crescimento Beta Th - T Helper Th1 - T Helper 1 Th2 - T Helper 2 Th0 - Naive T TLR – Receptor toll-like TLR1 – Receptor toll-like Tipo 1 TLR2 – Receptor toll-like Tipo 2 TNF- Fator de Necrose Tumoral TNFR – Receptor do Fator de Necrose Tumoral TR1 - Célula T Reguladora Tipo 1 Tregs - Células T Reguladoras Tregs CD4+CD25+high - Células T Reguladoras que Expressam CD 25 em Alta Intensidade. TT - Hanseníase Tuberculóide
xii
Tγδ - Célula T Reguladora Gama Delta VDR - Receptor de Vitamina D VV - Hanseníase Virchowiana Artigo BB - Borderline Borderline Leprosy BL - Borderline Lepromatous Leprosy BT - Borderline Tuberculoid Leprosy CD25 – Alpha Chain of the Interleukin 2 Receptor CD4 - Co-Receptor that assists the T cell receptor (TCR) with an antigen-presenting cell CD8 - Transmembrane Glycoprotein that serves as a co-receptor for the T cell receptor CMI - Cell-Mediated Immunity DAB - 3,3'-Diaminobenzidine ENL - Erythema Nodosum Leprosum FoxP3 - Forkhead Family Transcription Factor HD - Leprosy or Hansen Disease HIV - Human Immunodeficiency Virus HLA - Human Leukocyte Antigen I - Indeterminate Leprosy IFN-g - Interferon-Gamma IL – Interleukin LL - Lepromatous Leprosy M. tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis NRAMP1 - Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 1 RR - Reversal Reaction SD – Standard Deviation TB - Tuberculosis TGF-ß - Transforming Growth Factor Beta Th - T Helper TLR - Toll-Like Receptor Tregs – T Regulatory Cells TT - Tuberculoid Leprosy VDR - Vitamin D Receptor
xiii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1 Hanseníase ........................................................................................................ 1 1.2 Etiopatogenia da hanseníase ............................................................................. 2 1.3 Formas clínicas da hanseníase .......................................................................... 6 1.3.1 Forma indeterminada (I) .................................................................................. 6 1.3.2 Forma tuberculóide (TT).................................................................................. 7 1.3.3 Forma virchowiana (VV) .................................................................................. 7 1.3.4 Formas borderlines (BT, BB, BV) .................................................................... 8 1.4 Estados reacionais da hanseníase .................................................................... 8 1.4.1 Reação do tipo 1 ou reação reversa (RR) ....................................................... 8 1.4.2 Reação do tipo 2 ou eritema nodoso hansênico (ENH) .................................. 8 1.5 Células T reguladoras (Treg) ............................................................................. 9 1.5.1 Células Treg e hanseníase ........................................................................... 12
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 15
2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 15 2.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 15
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 16
3.1 Modelo de estudo ............................................................................................. 16 3.2 Universo de estudo .......................................................................................... 16 3.2.1 População de estudo .................................................................................... 16 3.2.2 Amostra ........................................................................................................ 16 3.3 Análise estatística ........................................................................................... 19 3.4 Critérios de elegibilidade .................................................................................. 20 3.4.1 Critérios de inclusão ...................................................................................... 20 3.4.2 Critérios de exclusão ..................................................................................... 20 3.5 Análise histopatológica..................................................................................... 20 3.6 Análise imunohistoquímica ............................................................................... 20 3.7 Análise da contagem de células ....................................................................... 21 3.8 Controles .......................................................................................................... 22 3.9 Aspectos Éticos ................................................................................................ 22 3.9.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ............................................... 22 3.9.2 Parecer do Comitê de Ética .......................................................................... 22
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 23
5 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 42
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 43
7 ANEXOS ................................................................................................................ 47
Anexo 1 – Formulário de coleta de dados .............................................................. 47
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Hanseníase
A hanseníase, doença infecciosa e crônica, constitui grave problema de
saúde pública no Brasil. Pode causar incapacidade física permanente. É endêmica
no país, com distribuição variada nas diferentes regiões, tendo alta prevalência na
região amazônica (Ministério da Saúde, 2008).
O Brasil figura entre os cinco países mais endêmicos do mundo e contribui
com 9,4% dos casos existentes no continente americano. Várias unidades federadas
apresentam taxas de prevalência superiores a 1/10000, mostrando que a situação
da hanseníase ainda é preocupante (Talhari, 2006).
A hanseníase apresenta evolução lenta e seu agente etiológico é o
Mycobacterium leprae, um parasita intracelular obrigatório, com afinidade por células
cutâneas e nervos periféricos. É transmitida de pessoa a pessoa, por meio do
convívio de indivíduos geneticamente susceptíveis com doentes contagiantes. O
bacilo não é cultivado em meios artificiais, porém multiplica-se em alguns animais
como tatus e camundongos timectomizados e irradiados. O homem é considerado o
único reservatório natural do bacilo, apesar da existência de alguns relatos de
animais selvagens (tatus selvagens, chimpanzés e macacos) naturalmente
infectados com bactéria similar ao M. leprae (Talhari, 2006; Valverde, 1998).
A maioria das pessoas não é susceptível e não desenvolve a doença.
Aquelas que a desenvolvem, após período médio de incubação de 2 a 5 anos,
apresentam inicialmente lesão cutânea única, que pode evoluir para a cura
espontânea ou para as outras formas da doença (Noussitou, 1976; Fine, 1982).
A doença apresenta quadro clínico caracterizado por duas formas polares
estáveis, com aspectos imunopatológicos, baciloscópicos e clínicos diversos
(Madrid,1953; Ridley,1966). No pólo tuberculóide, o hospedeiro apresenta eficiente
resposta imune celular contra o M. leprae, ocorrendo destruição dos bacilos e
manutenção das lesões restritas a áreas limitadas da pele e feixes nervosos (Britton,
2004). No outro pólo, a forma virchowiana (VV) caracteriza-se por ineficiente
resposta imune mediada por células, com grande multiplicação bacilar e
2
disseminação da doença. Entre estas formas polares, situam-se as formas
borderlines, as quais são instáveis e classificadas em subgrupos intermediários,
denominados borderline virchowiana (BV), borderline borderline (BB) e borderline
tuberculóide (BT), conforme suas características clínico-laboratoriais assemelhem-se
mais ao pólo virchowiano ou ao tuberculóide. Os subgrupos são caracterizados pelo
número, tamanho e tipo de lesões, baciloscopia e aspectos histopatológicos, como
grau de diferenciação da célula macrofágica, número e modo de distribuição dos
linfócitos, número de bacilos nos granulomas e grau de comprometimento de filetes
nervosos (Fleury,1989).
A resposta imunológica pode ser avaliada pela reação de Mitsuda, que
consiste na inoculação intradérmica de mitsudina, suspensão de bacilos mortos pelo
calor. A leitura é feita após quatro semanas, podendo resultar em reação positiva;
presença de pápula infiltrada maior ou igual a 5mm de diâmetro, ou negativa;
ausência de alteração cutânea (Miranda et al, 2005).
1.2 Etiopatogenia da hanseníase
A hanseníase é uma doença granulomatosa crônica influenciada por fatores
genéticos do hospedeiro, fatores ambientais, como o estado nutricional, vacinação
com BCG e taxa de exposição ao M. leprae ou outras micobactérias (Moraes, 2006).
A resposta imune é fundamental para a defesa do organismo frente à
exposição ao bacilo. Sendo assim, existem diferentes aspectos clínicos e
histopatológicos, de acordo com a resposta imune celular mediada contra o M.
leprae. A classificação imunológica de Ridley e Jopling inclui o tipo indeterminado,
duas formas polares (tuberculóide e lepromatosa) e três formas intermediárias
(borderline tuberculóide, borderline borderline e borderline lepromatosa)
(Ridley,1966).
O predomínio da resposta imune celular está relacionado à forma clínica mais
localizada da doença (tuberculóide), enquanto que na forma virchowiana, com
lesões mais disseminadas, é encontrado predomínio da resposta imune humoral
(Mendonça, 2008).
3
A suscetibilidade ou resistência à infecção por M. leprae depende tanto da
resistência inata (mediada por células da linhagem monocítica) quanto do grau de
imunidade celular específica e de hipersensibilidade retardada gerada pelo indivíduo
infectado. A imunidade celular específica é mediada principalmente por meio da
função dos linfócitos T, em cooperação com células apresentadoras de antígeno.
Aproximadamente 95% da população mundial são resistente ao M. leprae. Alguns
genes envolvidos na imunidade inata e adquirida tem sido, recentemente,
identificados (Scollard, 2006). Um dos avanços mais importantes foi a associação de
um lócus dentro do gene PARK2/PACRG com susceptibilidade das populações
humanas ao M. leprae (Mira et al, 2004). As mesmas variações do sistema
PARK2/PACRG associadas à hanseníase foram relacionadas com susceptibilidade
à febre tifóide e paratifóide na Indonésia, sugerindo papel desses genes candidatos
no controle da susceptibilidade do hospedeiro a outros patógenos intracelulares
(Prevedello, 2007).
Polimorfismos e mutações em diversos genes relacionados ou não à resposta
imune têm sido associados à hanseníase como, por exemplo TNF, IL-10, TLR,
lectina ligante de manose (MBL-2), laminina-α 2 (Lama2) (Mendonça, 2008).
Estudos realizados, também indicam que diferentes alelos do gene receptor
de vitamina D (VDR) estão associados com a hanseníase TT e VV (Prevedello,
2007).
A primeira linha de interação entre o M. leprae e o homem é mediada por
receptores das células do hospedeiro que reconhecem padrões moleculares das
micobactérias, os chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRR)
(Modlin, 2010).
O perfil de citocinas presentes nas lesões de hanseníase parece estar
relacionado com as funções dos receptores Toll-like. Citocinas do tipo Th1 estão
associadas com a ativação do TLR1 e do TLR2, enquanto citocinas do tipo Th2
estão associadas com a inibição da ativação desses receptores. A expressão de
TLR1 e TLR2 está mais fortemente associada com monócitos e células dendríticas
de lesões TT do que em lesões LL. Além do mais, estudos in vitro mostraram que
4
lipoproteínas de 19 e 33 kDa do M. leprae poderiam ativar monócitos e monócitos
derivados de células dendríticas através do TLR-2 (Gulia, 2010).
Os receptores TLRs, especialmente o TLR-2, são ativados por lipoproteínas
do M. leprae, e a capacidade de iniciar a resposta protetora está diretamente
relacionada com a secreção de IL-12/23 e a diferenciação de macrófagos e células
dendríticas (Krutzik et al, 2005).
Estas últimas apresentam o antígeno e causam a ativação de células T
virgens através da secreção de IL-12. Esse processo pode levar à expansão e
diferenciação de células Th1 produtoras de interferon (IFN-γ), que induz os
elementos da resposta imune responsáveis pela eliminação do bacilo, controlando
assim a evolução da doença (Walker, 2006).
A resposta imune adaptativa depende de mecanismos que se baseiam no
reconhecimento específico de antígenos, mediado por receptores presentes nas
membranas dos linfócitos T e B. Classicamente, a resposta imune adaptativa pode
ser categorizada em celular ou do tipo 1, e humoral ou do tipo 2. A capacidade dos
linfócitos auxiliares (CD4+), também conhecidos como linfócitos T helper (Th), em
induzir as respostas celular ou humoral está relacionada com os tipos de citocinas
secretadas e proporcionará o desenvolvimento das já conhecidas respostas Th1 ou
Th2. O predomínio de resposta imune celular ou humoral, frente à infecção pelo
bacilo, pode influenciar a evolução da doença e estar associado, pelo menos em
parte, com as características clínicas observadas nos pacientes portadores das
formas TT e VV, respectivamente (Moraes, 2006).
Na forma TT da doença, interferon IFN-γ, IL-2 e linfotoxina-α são secretados
nas lesões, resultando em atividade fagocítica intensa (Mendonça, 2008).
Entretanto, o M. leprae pode apresentar mecanismos de escape à oxidação
intramacrofágica, pela produção dos antígenos PGL1 e LAM (Modlin, 2010).
Macrófagos sob a influência dessas citocinas, principalmente o TNF juntamente com
os linfócitos, formam o granuloma. Os linfócitos CD4+ são encontrados
principalmente dentro do granuloma, e os CD8+ são encontrados na área externa
que o envolvem (Mendonça, 2008).
5
Em contraste, observa-se, a presença de altos níveis circulantes de
TNF no plasma de alguns indivíduos com reações do tipo 2 (Walker, 2006).
A forma VV é caracterizada pela presença de granulomas mal-formados. A
produção é predominantemente das citocinas IL-4, IL-5, e IL-10. Tem-se descrito
que a IL-4 diminui a expressão dos TLR-2 nos monócitos e que a IL-10 suprime a
produção de IL-12, o que está associado com a predominância de linfócitos CD8+
nas lesões virchowianas (Walker, 2006).
No local da infecção pelo M. leprae, onde as células dendríticas reconhecem
o bacilo, há a produção de citocinas (IL-12 ou IL-10) e quimiocinas, que determinam
resposta Th1 ou Th2 contra o M. leprae (Mira et al, 2004).
As células de Langerhans são subtipos de células dendríticas que iniciam a
resposta imune na pele. Os pacientes com forma VV apresentam poucas células de
Langerhans na pele, em comparação com controles não infectados ou pacientes TT.
Em contraste, pacientes TT apresentam aumento do número de células Langerhans
nas lesões, sugerindo infiltração ativa dessas células no local (Mendonça, 2008).
As formas borderline do espectro da hanseníase são imunologicamente
instáveis, ocorrendo oscilação entre as duas formas polares. Nos pacientes BT, BB
e BV, a progressiva redução da resposta mediada por células da forma BT para a
forma BV é acompanhada pela presença de lesões de pele e nervos mais
numerosas, aumento da carga bacilar e dos níveis de anticorpos. A imunidade
humoral está presente nas formas VV e BV, e exibe altos títulos de anticorpos
específicos contra o glicolipídio-fenólico 1 (PGL-1), antígeno específico do M. leprae,
sem contudo conferir proteção significativa, pois o indivíduo tem disseminação
bacilar (Goulart, 2002).
O mecanismo fisiopatogênico dos estados reacionais da hanseníase parece
estar diretamente relacionado à presença de citocinas no processo inflamatório.
Estudos usando técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) demonstraram
que na reação tipo 1 há aumento da expressão de mRNA das citocinas IL - 1β, TNF,
IL-2 e IFN-γ nas lesões cutâneas, correspondendo a um padrão de resposta Th1
que favorece a ativação macrofágica e imunidade protetora. As citocinas do perfil
6
Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) estão diminuídas nesta forma (Modlin et al, 1988; Yamamura
et al, 1991).
Nas lesões da reação tipo 2, há aumento seletivo na expressão do mRNA de
IL-6, IL-8 e IL-10, e expressão persistente de IL-4 e IL-5, indicando resposta do tipo
Th2. A formação e deposição de imunocomplexos na parede de vasos e posterior
ativação do sistema complemento, com a liberação de mediadores da inflamação,
desempenham papel importante no mecanismo imunopatológico e na sintomatologia
clínica do ENH (Guerra, 2002).
A lesão do ENH representa reação do tipo hipersensibilidade III, com estímulo
seletivo de citocinas que atraem neutrófilos, estimulam a produção de anticorpos e
inibem a ativação macrofágica. No conjunto, o efeito destas citocinas permitiria a
persistência da infecção (Yamamura et al, 1992; Naafs,1994).
O melhor entendimento do impacto da genética em doenças infecciosas como
a hanseníase, juntamente com um maior esclarecimento sobre o papel das
quimiocinas sobre a patogênese dessa doença, poderá levar ao desenvolvimento de
novas estratégias de diagnóstico, prevenção e terapêutica (Prevedello, 2007).
Além disso, a presença de células Tregs em lesões cutâneas de hanseníase
e seu incremento na reversão dos estados reacionais indicam que essas podem
desempenhar papel importante na patogenia da hanseníase (Massone et al, 2010).
1.3 Formas clínicas da hanseníase
1.3.1 Forma indeterminada (I)
Na forma indeterminada é comum o aparecimento de área de hipoestesia
definida ou não por lesão visível, onde o bacilo é dificilmente encontrado. A forma I é
considerada benigna, podendo permanecer indefinidamente como I, evoluir para a
cura espontânea ou para um dos pólos espectrais (Ribeiro, 2009).
7
1.3.2 Forma tuberculóide (TT)
A forma TT é caracterizada pela presença de lesões cutâneas e/ou neurais
únicas ou em pequeno número, bem delimitadas, com distribuição assimétrica e com
tendência à cura espontânea. As lesões apresentam hipo ou anestesia local, borda
papulosa e infiltrada, coloração eritêmato-acastanhada, anidrose e/ou queda de
pêlos, e podem ser acompanhadas de espessamento de tronco neural próximo à
lesão. O envolvimento neural, sem lesão cutânea aparente, pode constituir o único
sinal da doença, sendo essa forma clínica denominada hanseníase tuberculóide
neural pura. O comprometimento neural na hanseníase ocorre devido à exacerbação
da resposta imune celular que leva à formação de granulomas, limitação das lesões
e destruição completa dos bacilos (Foss,1999). A histopatologia mostra granulomas
de células epitelióides, tuberculóide e escassez ou ausência de bacilos. Geralmente,
os granulomas são alongados, acompanham o trajeto do filete neural e, raramente,
apresentam necrose central, onde é possível encontrar restos de filetes nervosos
destruídos. A reação de Mitsuda na forma TT é positiva (Foss, 1999).
1.3.3 Forma virchowiana (VV)
A hanseníase virchowiana manifesta-se por lesões múltiplas, eritêmato-
infiltradas ou nodulares, simétricas, de limites mal definidos. Histologicamente,
observa-se, na derme, infiltrado inflamatório constituído de histiócitos com
citoplasma claro, vacuolizado (células de Virchow), nas quais são encontrados
bacilos isolados e agregados (globias). Nestas lesões não são encontrados
granulomas epitelióides organizados (Britton, 2004).
A forma VV é caracterizada pela ausência de resposta imune celular,
demonstrada in vivo pela negatividade do teste intradérmico de Mitsuda, e in vitro,
pela ausência de blastogênese de células T em resposta aos antígenos de M. leprae
(Modlin, 1987). Nessa forma, ocorre extensa multiplicação bacilar e disseminação da
infecção para vísceras e tecido nervoso (Talhari, 2006).
8
1.3.4 Formas borderlines (BT, BB, BV)
Nas formas borderlines da hanseníase, as manifestações clínicas são
semelhantes, principalmente nas formas BB e BV. Essas, apresentam geralmente,
lesões papulosas, eritematosas, edematosas, de limites internos bem definidos e
externos imprecisos, centro aparentemente poupado e anestesia local. Quando se
aproxima ao pólo tuberculóide, observam-se lesões melhor delimitadas, anestésicas
e de superfície seca, cuja pesquisa de bacilos mostra a raridade ou a ausência dos
mesmos. Por outro lado, quanto mais do pólo virchowiano, observam-se numerosas
lesões cutâneas, brilhantes, com bordas mal-delimitadas, com menor
comprometimento da sensibilidade e maior quantidade de bacilos. A reação
intradérmica de Mitsuda pode ser positiva, com bacilos raros ou ausentes, na forma
BT, e negativa na forma BV, com presença de numerosos bacilos na baciloscopia e
em cortes histológicos de pele (Foss,1999).
1.4 Estados reacionais da hanseníase
1.4.1 Reação do tipo 1 ou reação reversa (RR)
A reação do tipo 1 ou a reação reversa (RR) ocorre, frequentemente, nas
formas borderlines (Ribeiro, 2009). Aproximadamente 30% dos indivíduos com
hanseníase bordeline pode apresentar esse tipo de reação. A RR é caracterizada
pela presença de inflamação aguda das lesões da pele, nervos ou ambos. As lesões
cutâneas podem ulcerar. Edema das mãos, pés e face também podem ocorrer, mas
os sintomas sistêmicos são incomuns. A neurite aguda leva ao comprometimento da
função do nervo, que se não for tratada rapidamente e adequadamente, levará à
perda permanente da função nervosa, causando neuropatia periférica sensorial e
motora . As RR podem ocorrer a qualquer momento, mas são vistas com freqüência
após o início do tratamento ou durante o puerpério (Walker, 2006).
1.4.2 Reação do tipo 2 ou eritema nodoso hansênico (ENH)
A reação do tipo 2 ou eritema nodoso hansênico (ENH) constitui reação
inflamatória sistêmica relacionada à deposição de imunocomplexos na parede
vascular, semelhante à reação tipo III de Gell & Coombs. O ENH ocorre mais
comumente em pacientes multibacilares BV e VV. Associa-se a altas concentrações
9
de fator de necrose tumoral-α (TNF), infiltração de neutrófilos e ativação de
complemento, com comprometimento de vários órgãos (Mendonça, 2008).
Na pele, o ENH é caracterizado por lesões eritematosas, dolorosas, de
tamanho variado, incluindo pápulas e nódulos localizados em qualquer região do
corpo (Ribeiro, 2009). As lesões podem ser superficiais ou profundas, causando
paniculite. O ENH bolhoso tem sido descrito e as lesões podem ulcerar. O
comprometimento do tecido celular subcutâneo pode levar à limitação dos
movimentos articulares, causando perda de função (Walker, 2006). Os episódios de
ENH são, frequentemente, acompanhados por febre e comprometimento do estado
geral. Em alguns casos, ocorrem neurite, orquite, epididimite, irite, iridociclite, artrite,
mãos e pés reacionais, linfadenite e comprometimento hepático (Ribeiro, 2009).
1.5 Células T reguladoras (Treg)
As células Treg são linfócitos T+, CD4+CD25+FoxP3+ que compreendem
10% das células T CD4 + periféricas em camundongos normais e seres humanos.
Elas reagem a auto-antígenos de transplantação e podem influenciar outros tipos de
células que participam da resposta imune, habitualmente, promovendo a supressão
da resposta imune. Em seres humanos e camundongos, a ausência das células
Treg funcionais induzem o aparecimento de doenças autoimunes, doenças alérgicas
e inflamatórias (Thomas, 2005).
As células Treg são fundamentais para que haja equilíbrio imunológico
(Bacchetta, 2007). Na medula tímica são encontradas microestruturas características
do órgão, os corpúsculos de Hassall, constituídos por grupamentos de células
epiteliais medulares e células dendríticas. As funções destas estruturas
permanecem em discussão, mas parecem estar envolvidas na diferenciação de
linfócitos T regulatórios (Lima, 2007).
As células Treg que se originam no timo são chamadas de Treg naturais
CD4+CD25+ (nTreg) as quais devem ser distinguidas de células Treg CD4+CD25+
que são induzidas na periferia por diferentes antígenos e condições de tolerância ao
longo da vida, que são as células Treg adaptativas (aTreg) (Bluestone, 2003).
10
Vários outros tipos de células T reguladoras, tais como as células Tγδ, células
natural killer (NKT) e células T CD8+, têm sido descritas. As células T reguladoras
CD4+ podem ser ainda divididas em induzidas, que secretam IL-10 e TGF-β, tais
como as células TR1, e células T auxiliares 3 (T-helper 3, Th3) (LIMA, 2006).
Além da alta expressão de CD25, as células Treg CD4+CD25+high
expressam também CTLA-4 (Antígeno 4 associado a linfócito T citotóxico), GITR
(Receptor do fator de necrose tumoral glicocorticóide induzido) e HLA-DR. Há baixa
expressão de CD127 o qual poderia ajudar a diferenciá-las de células T efetoras
CD4+CD25+(Teff). A adequada expressão de receptores de quimiocinas como
CCR7, CCR6 e CD103 contribuem para o homing das Treg nos tecidos inflamados
(Bacchetta, 2007).
O FoxP3 desempenha uma parte vital na geração de Treg CD25+high e é o
marcador mais específico disponível (Lima, 2006). Atualmente, é bem aceito que o
FoxP3, apesar de ser uma molécula que caracteriza as Treg, também pode ser
expresso por células humanas Teff na ativação TCR-mediada. No entanto, nas
células Teff, sua expressão é transitória e nunca atinge os níveis de expressão
mostrada em células Treg (Bacchetta, 2007).
Nos seres humanos, a síndrome IPEX (síndrome hereditária ligada ao
cromossomo X), doença auto-imune sistêmica caracterizada pela desregulação
imune, poliendocrinopatia e enteropatia, está associada com defeitos hereditários no
gene FoxP3 (Thomas, 2005).
Shevach e colaboradores foram os primeiros a identificar que as células Treg
e as T supressoras são as mesmas células. O termo células Treg tem substituído,
gradativamente,o termo supressor (Shevach, 1998).
O mecanismo de regulação do sistema imune pelas células T+,
CD4+CD25+FoxP3+ ainda não está elucidado. Diversos estudos indicam que as
células Treg CD25+FoxP3+ suprimam a resposta imune. A supressão requer a
ativação das células Treg por seu receptor (TCR) ou CD3. A presença de células
apresentadoras de antígeno não é necessária para promover a supressão in vitro.
As células T+CD4+CD25+FoxP3+ são capazes de produzir IL-10 suprimindo certas
11
formas de inflamações auto-imunes do trato digestivo. Outro mecanismo de ação
destas células, independente da produção de citocinas, é o contato celular direto
(Lima, 2006).
Um terceiro mecanismo de ação tem sido proposto pela combinação dos
mecanismos mencionados acima. Estudos demostraram que células Tregs são
capazes de induzir, por contato, propriedades supressoras em células T CD4+CD25-
cultivadas in vitro e esta supressão ocorreu depois que as células Tregs
CD4+CD25+FoxP3+ começaram a produzir TGF-β ou IL-10 (Lima, 2006).
O equilíbrio homeostático do sistema imune depende de resposta celular e
humoral adequada. Agentes inflamatórios, físicos, químicos ou infecciosos, induzem
resposta imunológica que resulta em dano tecidual, que pode ser lesivo, se não
ocorrer a participação de mecanismos reguladores (Kumar, 2004). As células T+,
CD4+CD25+FoxP3+ regulam a resposta imune derivada de auto-antígenos ou de
microrganismos e tem sido demonstrado que sua ausência promove reação
inflamatória exacerbada e doenças auto-imunes (Lima, 2006).
A participação das células Treg tem sido estudada em doenças inflamatórias
da pele, como o lúpus eritematoso, dematite atópica, dermatite de contato alérgica,
psoríase, doença reação enxerto versus hospedeiro e neoplasias como carcinoma
basocelular, micose fungóide e síndrome de Sézary (Kumar, 2004). No processo
granulomatoso da tuberculose, as células T+CD4+CD25+Foxp3+ acumulam-se e
proliferam no local da infeccão, suprimindo a imunidade nos doentes com doença
ativa (Ring, 2006; Sugiyama et al, 2005).
A dermatite de contato foi uma das primeiras dermatoses onde a participação
das células T+CD4+CD25+FoxP3+ foi demonstrada. Na dermatite do contato por
níquel, estas células tem função reguladora, possivelmente via liberação de IL-10, a
qual reduz o influxo de células para o local da inflamação. Um espectro de células T-
CD4+, incluindo Th3, TR1, TCD4+CD25+FoxP3+ e NKT, parecem participar na
regulação da dermatite atópica. Esta doença pode resultar do balanço inadequado
entre as células T+CD4+CD25+FoxP3+ ativadas pelo alérgeno e as células Th2
(Kumar, 2004).
12
Na psoríase, a produção de células T+CD4+CD25+FoxP3+ é deficiente, e
assim, a resposta inflamatória é muito vigorosa tendo como conseqüência a
hiperproliferação de células nas lesões. Com isso, abre-se uma perspectiva de
manipulação das células T+, CD4+CD25+Foxp3+ com fins terapêuticos (Howard,
1998).
Nas infecções por Candida albicans a redução das células
T+CD4+CD25+Foxp3+ possibilita melhor resposta contra o agente inflamatório, mas
promove lesão tecidual mais intensa que se normaliza quando as células
T+CD4+CD25+Foxp3+ são reconstituídas. Também em infecções experimentais
pela leishmania major, as células T+CD4+CD25+Foxp3+ parecem reduzir a
efetividade de células T capazes de destruir o microrganismo, via IL 10, mas a
ausência destas células induz a um dano tecidual inapropriado (Lima, 2006).
Nas infecções pelo vírus do herpes simples (HSV), células
T+CD4+CD25+Foxp3+ suprimem células T CD8+ vírus-específicas, retardando a
eliminação viral. As células T+CD4+CD25+FoxP3+ foram também encontradas nas
células inflamatórias dos gânglios sensoriais infectados com HSV, provavelmente
para prevenir a destruição dos neurônios infectados (Lima, 2006). A depleção das
células Treg na infecção pelo HIV está associada à ativação imune e piora do estado
clínico do paciente (Shevach, 1998).
1.5.1 Células Treg e hanseníase
O Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) e o Mycobacterium leprae (M.
leprae) são os patógenos causadores de duas importantes doenças infecciosas
crônicas - tuberculose (TB) e hanseníase (Hussain, 2007). Para a grande maioria
dos hospedeiros imunocompetentes, a resposta imune é suficiente para controlar a
infecção inicial com esses patógenos e impedir o desenvolvimento da doença clínica
evidente (Chan, 2004).
No entanto, estes microorganismos permanecem latentes por longo período
de tempo em indivíduos infectados. Posteriormente, reativam causando a doença,
se o sistema imune do hospedeiro ficar debilitado (Chan, 2004). No caso do M.
tuberculosis, estima-se que apenas 10-15% das pessoas infectadas desenvolverão
13
tuberculose ativa dentro de 2 anos após a infecção inicial, enquanto que o restante
desenvolverá infecção latente com risco variável de reativação (Chan, 2004). A
reativação do M. tuberculosis e M. leprae latentes está intimamente relacionada
com a diminuição da imunidade do hospedeiro devido ao envelhecimento, mal
nutrição, terapia imunossupressiva e/ou coexistência de processos de doença ativa,
tais como a infecção pelo HIV (Thomas, 2005; Lund, 2003).
A eliminação bem sucedida de micróbios persistentes requer complexa
interação entre respostas imunes inatas e adquiridas, incluindo interações entre
macrófagos infectados e células T efetoras dentro da rede de citocinas, quimiocinas
e receptores correspondentes das células. Orquestrar todos os elementos da
imunidade inata e adquirida no momento e local certos é fundamental para
maximizar o controle das infecções microbianas, bem como para minimizar o dano
tecidual imune-mediado causado por excesso de resposta imune ativa (Chen et al,
2007; Mendelson et al, 2006).
Em um estudo imunohistoquímico retrospectivo envolvendo 20 casos de
hanseníase (1 TT, 3 BT, 5 BL, 5 LL, 1 BB-RR, 2 BT-RR e 3 ENL), células FoxP3
positivas estavam presentes em 95% dos casos, com uma densidade média de
2,9% do infiltrado. Não havia diferença estatística da expressão do FoxP3 entre TT,
BT, BL e LL, enquanto um incremento estatístico significativo (P = 0,042) foi
observado em pacientes acometidos por estados reacionais reversos (BT-RR e BB-
RR), em comparação com pacientes acometidos por ENH (Massone et al, 2010).
Estes dados sugerem que as células Treg poderiam ter papel relevante na
etiopatogenia da hanseníase, semelhante ao que já foi observado na leishmaniose
por Leishmania major, tuberculose, infecção pelo Helicobacter pylori, vírus da
hepatite B e HIV (Massone et al, 2010).
Um outro estudo caso-controle, utilizando citometria de fluxo, envolvendo 38
casos de hanseníase (9 TT, 6 BT, 4 BL, 8 LL, 3 BB e 6 ENL) e 38 controles,
evidenciou um aumento da quantidade de células Treg e da expressão de FoxP3
em todas as formas quando comparado com controles, principalmente TT. Além
disso, houve uma diminuição da quantidade de células Treg e aumento da
expressão de FoxP3 nos casos de ENL e LL (Attia et al, 2010).
14
Esse estudo sugere que o aumento da quantidade de células Treg intactas
poderia beneficiar pacientes com hanseníase pois a resposta imune tenderia para o
pólo caracterizado pelo predomínio da imunidade celular da doença, enquanto que a
alta expressão de FoxP3 induziria à maior imunossupressão celular, tendendo para
o pólo humoral, virchowiano da doença (Attia et al, 2010).
Recentemente, outro estudo caso-controle utilizando citometria de fluxo e
imunohistoquímica, envolvendo 28 casos de hanseníase (2 TT, 10 BT, 13 BL, 3 LL)
e 6 controles mostrou que havia níveis mais elevados de Tregs nas formas
virchowianas quando comparadas a formas tuberculóides e contatos sugerindo que
essas células possam desempenhar um papel patogênico em formas multibacilares
(Palermo et al, 2012). Esses dados diferem dos resultados de um outro grupo, que
encontrou maior freqüência de Tregs no sangue periférico dos pacientes
tuberculóides em relação aos lepromatosos (Attia et al, 2010).
Dessa forma, leucócitos reguladores, tais como células T CD4+CD25+,
células dendríticas plasmocitárias, e células T natural-killer invariantes (células iNKT)
podem desempenhar papel crucial na coordenação das funções específicas de
vários efeitos imunes envolvidos no controle ou erradicação de M. tuberculosis and
M. leprae (Chen et al, 2007; Mendelson et al, 2006).
Apesar da hanseníase ser uma doença muito prevalente em determinados
países, muitas dúvidas ainda persistem nos aspectos referentes à sua patogenia
(Talhari, 2006). Ainda há poucos estudos sobre Tregs na hanseníase, que parecem
exercer um papel central na determinação das formas clínicas e estados reacionais
(Attia et al, 2010; Massone et al, 2010; Palermo et al, 2012).
Este estudo tem o intuito de contribuir para uma melhor compreensão do
papel destas células trazendo informações sobre a imunopatologia do mal de
hansen e verificar se as Tregs exercem ação supressora sobre suas formas clínicas.
Ajudará esclarecer a patogênese desta doença no que se refere à influencia das
células T, na resposta imune granulomatosa.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Descrever a frequência e distribuição das células T reguladoras nas diversas
formas clínicas da hanseníase.
2.2 Objetivos específicos
Estimar a frequência e analisar a distribuição das células T reguladoras nos
infiltrados inflamatórios das diversas formas clínicas da hanseníase: indeterminada,
tuberculóide, dimorfa e virchowiana.
Estimar a frequência e analisar a distribuição das células T reguladoras nos
estados reacionais tipo I e II da hanseníase.
16
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Modelo de estudo
Trata-se de estudo descritivo, observacional e retrospectivo, fundamentado na
análise imunohistoquímica de cortes, em parafina, obtidos de biópsias de pacientes
com hanseníase.
3.2 Universo de estudo
3.2.1 População de estudo
Lâminas de pacientes que foram atendidos na Fundação “Alfredo da Matta”
no ano de 2008 e que tiveram o diagnóstico de hanseníase confirmado pelo exame
histopatológico e cujo bloco de parafina encontrava-se em condições adequadas,
arquivado no Setor de Histopatologia.
3.2.2 Amostra
Foi calculada uma amostra de estudo com base no número de casos de
hanseníase que foram submetidos à biópsia de pele no Laboratório de
Histopatologia da Fundação "Alfredo da Matta" no ano de 2008 (n=305).
Considerando uma sensibilidade de 90% para a técnica a ser testada, uma margem
de erro de 5% e um nível de confiança de 95%; chegou-se a um total de 96 casos
como amostra de estudo, segundo a fórmula utilizada (Wayne, 1987).
n = N.z2.p(1-p) di
2.(N-1) + z2.p(1-p) Onde: p = 0,90 (sensibilidade esperada);
N = 305 (tamanho da população);
di = 0,05 (erro amostral);
z = 1,96 (para 95% de confiança);
n = 96 (tamanho da amostra).
17
Sendo assim, a amostra foi constituída de 96 blocos de parafina de pacientes
portadores das diversas formas de hanseníase que representa 31,47% da
população do estudo. Foi usada a mesma proporção para o cálculo das diversas
formas clínicas: indeterminada (9), tuberculóide (13), boderline (BT: 26, BB: 3, BV: 8)
e virchowiana (27) e aqueles que apresentam estado reacional tipo I (8) e II (2).
Tabela 1 - Amostra do estudo
Nº Forma Clínica Sexo Idade 1 HI F 52 2 HI M 33 3 HI M 10 4 HI F 46 5 HI M 51 6 HI M 21 7 HI F 56 8 HI F 39 9 HI M 49 10 HT F 49 11 HT F 16 12 HT F 55 13 HT M 34 14 HT M 23 15 HT M 37 16 HT M 11 17 HT M 42 18 HT F 10 19 HT M 78 20 HT F 9 21 HT M 17 22 HT F 29 23 HBT M 55 24 HBT F 47 25 HBT F 49 26 HBT F 52 27 HBT M 30 28 HBT F 20 29 HBT F 68 30 HBT F 32 31 HBT M 32 32 HBT M 61 33 HBT M 8 34 HBT F 5 35 HBT M 51
18
36 HBT F 44 37 HBT M 60 38 HBT M 30 39 HBT F 64 40 HBT F 44 41 HBT F 31 42 HBT F 8 43 HBT M 66 44 HBT M 27 45 HBT F 38 46 HBT M 47 47 HBT F 10 48 HBT M 20 49 HBB M 34 50 HBB F 35 51 HBB F 45 52 HBV M 38 53 HBV M 19 54 HBV M 41 55 HBV M 66 56 HBV M 30 57 HBV F 12 58 HBV F 49 59 HBV M 20 60 HV F 48 61 HV M 26 62 HV M 19 63 HV M 64 64 HV M 34 65 HV F 28 66 HV F 47 67 HV F 15 68 HV F 50 69 HV F 41 70 HV M 49 71 HV M 63 72 HV M 32 73 HV M 41 74 HV M 38 75 HV M 45 76 HV F 25 77 HV M 25 78 HV M 79 79 HV M 32 80 HV F 58 81 HV F 30
19
82 HV M 20 83 HV F 30 84 HV M 5 85 HV M 52 86 HV M 19 87 Reação Tipo I F 11 88 Reação Tipo I F 56 89 Reação Tipo I F 74 90 Reação Tipo I F 56 91 Reação Tipo I M 40 92 Reação Tipo I M 26 93 Reação Tipo I M 51 94 Reação Tipo I M 30 95 Reação Tipo II F 28 96 Reação Tipo II M 59
3.3 Análise estatística
Para a análise descritiva desse estudo foram analisadas individualmente
todas as variáveis categóricas e numéricas. Foi feito um estudo de tabela de
contingência (cruzamento) para as variáveis categóricas (forma clínica e sexo);
enquanto que para as variáveis numéricas (Idade e FoxP3) foram feitas as análises
de medida de centralidade (média, mediana) e dispersão (desvio padrão).
Para avaliar a associação entre as variáveis categóricas e o resultado da
contagem de células, utilizou-se o teste qui-quadrado de Pearson, o qual também foi
utilizado nos demais cruzamentos das variáveis categóricas.
Para a comparação de médias entre os grupos utilizou-se o teste análise de
variância (ANOVA) ou teste T de Student para dados normalmente distribuídos.
(Vieira, 2004; Berquo, 1980).
Já para a comparação de médias entre as variáveis que não obedeceram a
distribuição normal foram utilizados os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e
Wilcox.
O software utilizado na análise foi o programa R Version 2.13.1 (07/08/2011).
Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
20
3.4 Critérios de elegibilidade
3.4.1 Critérios de inclusão
Material de biópsia cutânea de pacientes de ambos os sexos e qualquer
idade, com diagnóstico de hanseníase atendidos na Fundação “Alfredo da Matta” no
ano de 2008
3.4.2 Critérios de exclusão
a) Pacientes cujos blocos histológicos não tem a condição necessária para o
processamento.
b) Pacientes com exames que apresentam artefatos técnicos decorrente da
etapa de processamento.
c) Pacientes cujos blocos de parafina não estejam armazenados no arquivo do
setor de histopatologia da FUAM.
3.5 Análise histopatológica
Os espécimes de biópsia foram fixados em formol tamponado (10%) e,
posteriormente, incluídos em parafina. Os cortes foram corados com a coloração
hematoxilina-eosina para avaliação histopatológica de rotina.
3.6 Análise imunohistoquímica
A coloração imunohistoquímica para a detecção das células T+,
CD4+CD25+FoxP3+ foi realizada em seções histológicas retiradas dos espécimes
de biópsias com espessura de 5 micrômetros.
Foram utilizados anticorpo específico Anti-FoxP3 monoclonal (Clone 236A/E7,
eBioscience, San Diego, CA, USA) e sistema de detecção por polímero (MACH 4).
Após desparafinização com xilol e hidratação, foi realizada a recuperação
antigênica através da irradiação por microondas. As lâminas foram incubadas em
tampão citrato 10mM (pH 6,0), em forno de microondas (potência média), por 10
minutos (Tolosa, 1976).
21
Após o resfriamento natural, despreza-se a solução de citrato e realiza-se 02
banhos de 5 minutos de PBS (10mM de fosfato de sódio a 0,9% e pH 7,5).
Para o bloqueio da peroxidase endógena as lâminas foram submersas em
banho de 5 minutos em 100 ml de metanol com 1,72ml de água oxigenada, seguidas
de 02 banhos de PBS de 5 minutos cada.
Em seguida, realiza-se o bloqueio protéico incubando as lâminas com o
bloqueador protéico por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente.
Para a aplicação do anticorpo (Ac) primário, as lâminas foram incubadas com
anticorpo específico Anti-FoxP3 monoclonal (Clone 236A/E7), o qual foi diluído em
PBS na proporção 1:100, durante 16 a 18 horas a 4°C, em câmara úmida.
No dia seguinte, após 03 banhos de 5 minutos de PBS a reação será
retomada, incubando as lâminas por 30 minutos com o polímero.
Após a lavagem das lâminas por 3 vezes em solução de PBS (5 minutos), as
mesmas são incubadas em DAB (Diaminobenzidina) por 5 minutos, desenvolvendo
um precipitado castanho-dourado tênue.
Em seguida, as lâminas são imersas em água destilada corrente, e contra
coradas com hematoxilina de Harris. Após, secarem naturalmente, são montadas
com bálsamo do Canadá sob lamínulas.
Em cada reação utilizou-se como controle negativo, lâmina do próprio
paciente, utilizando-se solução PBS em substituição ao anticorpo primário. Como
controle positivo, foram utilizados fragmentos de pele humana (Líquen plano)
submetidos ao mesmo processo das amostras dos pacientes.
3.7 Análise da contagem de células
A coloração imunohistoquímica pelo FoxP3 foi quantificada visualmente por 3
investigadores (J.N.T.P. , J.C.M. , T.M.T.P.), que contaram o número de células
positivas na derme das amostras.
22
A contagem de células foi, separadamente, realizada para cada amostra.
Assim se obtiveram médias aproximadas de células FoxP3 positivas em relação ao
total de células presentes nos infiltrados de cada caso clínico.
As seções foram visualizadas diretamente na tela plana de um monitor de 15
polegadas. Para a visualização das imagens foram utilizados um microscópio ótico
Axioplan HBO 50, Zeiss® utilizando-se de uma ampliação de 400 x ; acoplado a uma
câmera digital Samsung®, SCC31 e um programa ATI Multimedia Center®.
3.8 Controles
Foram selecionadas duas biópsias de dermatite liquenóide (líquen plano)
como controles positivos para FoxP3.
3.9 Aspectos Éticos
3.9.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Conforme o parecer Nº 009/2010 CEP/FUAM em 18 de março de 2010, o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido não se aplica, pois o estudo utilizou
dados secundários, não havendo qualquer intervenção na conduta em relação aos
pacientes.
3.9.2 Parecer do Comitê de Ética
O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Fundação
Alfredo da Matta pelo parecer nº 009/2010 – CEP/FUAM em 18 de março de 2010.
23
4 RESULTADOS
Os resultados desta dissertação serão apresentados na forma de artigo
original.
24
4.1 Artigo
T REGULATORY CELLS (TREG)(TCD4+CD25+FOXP3+) DISTRIBUTION IN THE
DIFFERENT LEPROSY CLINICAL FORMS AND REACTIONAL STATES
José Napoleão Tavares Parente*, Antonio Pedro Mendes Schettini¶, Cesare
Massone§, Roberto Moreira da Silva Júnior Rodrigo Ribeiro-Rodrigues‡,
Carolina Talhari,
Abstract: Leprosy is histologically characterized by a spectrum of different
granulomatous skin lesions reflecting patient’s immune response to Mycobacterium
leprae. Although CD4+CD25+ FoxP3+ T regulatory cells (Tregs) are pivotal on
immuneregulation, presence, frequency, and distribution of Tregs in leprosy and its
reactional states were investigated in few studies. Here, we performed a
imunohistochemical study on 96 cases of leprosy [Indeterminate (I): 9 patients;
tuberculoid tuberculoid (TT): 13 patients; borderline tuberculoid (BT): 26 patients;
borderline borderline (BB): 3 patients; borderline lepromatous (BL): 8 patients;
lepromatous lepromatous (LL): 27 patients; reversal reaction (RR): 8 patients; and
erythema nodosum leprosum (ENL): 2 patients]. FoxP3-positive cells were present in
100% of the cases with an average density of 2.82% of the infiltrate. Their distribution
was not related to granulomatous structures or special locations. There was a
statistical significant increment of FoxP3 expression in patients with reversal leprosy
reactions (RR) when compared to patients presenting I leprosy (P= 0,0228); BT (P =
0,0351) and LL (P = 0,0344). These findings suggest that Treg cells seem to have a
relevant role on leprosy ethiopathogenesis, mainly in type I leprosy reaction.
Key Words: leprosy, T regulatory cells, T-Lymphocytes
25
1 INTRODUCTION
Leprosy or Hansen disease (HD) is characterized by a wide spectrum of
histologically distinct granulomatous skin lesions reflecting patient’s immune
response to Mycobacterium leprae, varying from predominantly epithelioid cells with
absence or occasional presence of bacilli at the tuberculoid end of the spectrum (TT)
to abundance of bacilli-filled foamy macrophages at the lepromatous leprosy (LL)
pole 1.
Between the leprosy polar forms (TT and LL), we find the borderline forms
which are immunologically unstable, and classified into intermediate subgroups
defined as borderline lepromatous (BL), borderline borderline (BB), and borderline
tuberculoid (BT) leprosy ². It is known that nearly 30% of the individuals with
borderline leprosy may present type-I reaction ³, and erythema nodosum leprosum
(ENL) is observed in up to 50% of lepromatous leprosy patients receiving
antimicobacterial therapy 4.
Treg cells are T-lymphocytes, CD4+CD25+FoxP3+ represents up to 10% of T
CD4+ cells found in the peripheral blood in normal mice and human beings 5.
Characteristically, they express CD25 and the forkhead family transcription factor
FoxP3, which plays a vital role in the generation of Treg CD25+high, and it is the
most specific marker currently available6. Treg cells are critically involved in
balancing the reactivity of the immune system and preventing autoimmunity. Paralelly
to their role in preventing autoimmune reactions, Treg cells have been shown to
control excessive inflammatory responses against pathogens 7.
However, a strict control of T effector cell responses by Treg cells may be
favor infection and promote pathogen persistence 8,9.
Treg cells have been described in infectious diseases (leishmaniasis,
tuberculosis); autoimmune diseases like lupus erythematosus, psoriasis, graft-
versus-host disease, sarcoidosis; and in cutaneous cancer (basal cell carcinoma,
mycosis fungoides, and Sezary syndrome) 1.
This work is an expansion of a previous pilot study performed by Massone
(retrospective immunohistochemical study on 20 cases of leprosy) on which it was
26
observed a significant statistically difference of FoxP3 expression in patients with
reverse reaction states (BT-RR and BB-RR), when compared with the forms of non-
reaction disease (BL, BT, LL, TT) 1.
Recently, it was reported that frequency circulating Tregs were elevated in TT
patients, suggesting that rather than being detrimental to immunity, intact Tregs
activity could be beneficial to leprosy patients 10.
Another study showed that Tregs are present in increased numbers and may
have a pathogenic role in leprosy patients harboring uncontrolled bacillary
multiplication (lepromatous leprosy) but not in those individuals capable of limiting M.
leprae growth (tuberculoid leprosy) 11.
In order to further the knowledge about the role of Tregs in leprosy, we
performed a retrospective study on 96 cases of HD to investigate its presence,
frequency, and distribution of Treg cells in skin lesions.
2 MATERIALS AND METHODS
Data from 96 patients were retrieved from the databases of the Department of
Pathology at Alfredo da Matta Foundation in Manaus, Brazil. A total of 96 biopsy
specimens (male:female ratio = 53:43; mean age: 37.51 years; median age: 37,5
years; age range: 5–79 years) were available for the study.
Cutaneous biopsies had been performed at the time of the diagnosis in 86
cases; 8 cases of RR were biopsied 5, 4, 2, 4, 5, 3, 4 and 3 months respectively after
beginning of multidrug therapy. Two cases of ENL were biopsied 12, and 10 months
after beginning of multidrug therapy for LL, respectively.
2.1 Histopathology
Biopsy specimens were fixed in 10% buffered formalin and subsequently
embedded in paraffin. Sections were stained with hematoxylin–eosin for routine
histopathological evaluation.
27
All specimens were stained with modified Fite–Faraco stain for acid fast bacilli;
the bacterial index of the granuloma was assessed with the logarithmic scale
according to Ridley 12,13.
2.2 Immunohistology
The immunohistochemichal investigation for the detection of T
CD4+CD25+FoxP3+ cells was performed on histological sections taken from the 5-
µm-thick biopsy specimens.
Specific antibody monoclonal Anti-FoxP3 (Clone 236A/E7; eBioscience, San
Diego, CA, USA), and polymer detection system (MACH 4) were used.
After deparaffinization with xilol and hydration, the antigenic recovery was
performed through microwaves irradiation. The blades were incubated into citrated
buffer 10mH (pH 6,0), in microwave oven (average power), for 10 minutes 14 .
After the natural cooling, the citrate solution is ignored and 02 PBS baths of 5
minutes are performed (10mM of sodium chloride on 0.9% and pH 7.5).
For the block of the endogenous peroxidase, the blades were submerged in 5-
minute bath in 100 ml of methanol with 1.72 ml of hydrogen peroxide, followed by 02
PBS baths of 5 minutes each.
Next, protein blocking is performed by incubating the blades with the protein
blocker for 10 to 15 minutes in room temperature.
For the application of the primary antibody (Ac), the blades were incubated
with specific antibody monoclonal Anti-FoxP3, which was diluted in PBS on the 1:100
proportion during 16 to 18 hours, on 4 degrees Centigrade, in humid chamber.
The next day, after 03 PBS baths of 5 minutes, the reaction will resume,
incubating the blades for 30 minutes with the polymer.
After washing the blades for three times in PBS solution (5 minutes), they will
be incubated in DAB (Diaminobenzidine) for 5 minutes, developing a tenuous
precipitate brownish.
28
Next, the blades are immerged in distilled running water, and stained against
with Harris hematoxylin. After naturally drying, they are set with Canada balsam
under cover slips.
Blade from the patient was used as negative control in every reaction, by
using PBS solution in substitution for the primary antibody. As positive control, two
biopsies of lichen planus were used, which were subjected to the process of the
patients samples.
2.3 Analysis
Immunohistochemical staining was quantified visually by 3 of the investigators
(J.N.T.P. , J.C.M. , T.M.T.P.), who, counted the numbers of FoxP3 positive cells in
the dermis of the samples. The cell counts were separately averaged for each
sample giving a rough percentage in proportion to the infiltrate.
2.4 Statistical Analysis
Data were analyzed statistically by R Version 2.13.1 (07/08/2011) software
package as follows:
• Description of quantitative variables as means ± SD, medians and ranges,
and description of qualitative variables as numbers and percents.
• Student’s t-test, one-way ANOVA test and non parametric tests (Kruskal-
Wallis and Wilcox).
• Pearson correlation study.
Probability or P value of <0.05 was considered statistically significant.
2.5 Institutional Review Board
This study was approved by the Ethics Committee Foundation Alfredo da
Matta in Manaus, Brazil, in March 2010 (#03/18).
29
3 RESULTS
Patients were classified as follows: I: 9 patients; TT: 13 patients; BT: 26
patients; BB: 3 patients; BL: 8 patients; LL: 27 patients; RR: 8 patients; and ENL: 2
patients. All cases were classified according to the Ridley and Jopling classification 12,13 .
Microscopic examination of the immunohistochemically stained sections
revealed FoxP3-positive cells in 96 (100%) of the specimens with an average of
2,82% of the infiltrate (range: 1–7). we quantified the FoxP3-positive cells by only
counting the number of positive cells in the dermis of the samples and we expressed
this value as a rough percentage in proportion to whole the infiltrate. The
immunohistochemical study was performed in all cases and no case was excluded.
(Table 1).
In TT and BT, FoxP3-positive cells were observed both inside and around the
granulomas (Fig. A, B). In BL and LL, FoxP3-positive cells were present randomly in
the diffuse macrophages infiltrate (Fig. C, D). A similar pattern was also observed in
ENL lesions (Fig. E, F). FoxP3-positive cells presented a nuclear staining (Fig. G, H).
30
Figure A - BT leprosy: epitheliod
granulomas surrounded and infiltrated by
lymphocytes. Hematoxylin–eosin staining;
original magnification x100.
Figure B - Immunohistochemical
stainings of FoxP3; Tregs are present
around and within the granuloma; original
magnification x100.
Figure C - LL leprosy: diffuse infiltrate of
vacuolated macrophages together with
lymphocytes in the dermis. Hematoxylin-
eosin staining; original magnification x 100.
Figure D - Immunohistochemical stainings
of FoxP3 show a diffuse distribution of
Tregs; original magnification x 100.
31
Figure E - ENL: granulomatous infiltrate of
vacuolated macrophages and neutrophils in
the dermis. Hematoxylin– eosin staining;
original magnification X 100.
Figure F - Immunohistochemical stainings of
FoxP3 show Tregs distribution in the
infiltrate; original magnification x 100.
Figure G - Nuclear FoxP3 staining in BT
leprosy. Original magnification X 400.
Figure H - Nuclear FoxP3 staining in ENL.
Original magnification x 400.
A significant statistical increment of FoxP3 expression between reversal
leprosy reactions (RR) was found when compared with patients affected by I (P =
0,0228); BT(P = 0,0351) e LL(P = 0,0344), respectively. However, no significant
difference was observed between the other clinical forms.
32
4 DISCUSSION
Susceptibility or resistance to M. leprae infection depends on both innate
resistance (mediated by cells of the monocytic lineage) and the degree of specific
cellular immunity and delayed hypersensitivity generated by the infected subject. The
specific cellular immunity is mediated primarily through the function of T lymphocytes,
in cooperation with antigen presenting cells 15.
Interactions among host proteins and bacterial antigens preventing invasion
and infection by the bacilli have been associated with many genetic factors, and the
high complexity of all these molecular events may explain the wide spectrum of
clinical forms of leprosy 16 .
The cytokines profile in the leprosy lesions seems to be related with the
functions of the Toll-like receptor 4 .The TLRs receptors, specially the TLR-2, are
activated by lipoproteins of M.leprae, and the capacity to start the protector answer is
directly related with the secretion of IL-12/23, and the differentiation of macrophages
and dendritic cells 17.
On the foci of infection by M. leprae, dendritic cells recognize the bacilli, and
produce cytokines (IL-12 or IL-10) and chemokines responsible for determining which
type of immune response (Th1 or Th2) against the M. leprae will be generated 18.
While in LL there is lack of specific CMI to the pathogen with increased
production of IL-10 by monocytes, and a predominant Th2 response with release of
different subsets of cytokines (IL-4, IL-5, IL-10, and IL-13), the TT pole is
characterized by a Th1 immunity with a significant production IL-2, interferon-gamma
(IFN-γ), and TNF-alpha (TNF-α) 10 .
Various genes and regions in the human genome have been linked to or
associated with susceptibility to leprosy per se or with a particular type of leprosy ³ .
Numerous non-HLA variants located in different genes, such as the vitamin D
receptor (VDR), the natural resistance-associated macrophage protein 1 (NRAMP1),
the IL-10, and the PARK2 and PACRG genes have been described as leprosy
genetic risk factors 4 .
33
Immunopathological studies in HD showed that TT lesions have a
predominant CD8+ suppressor-cytotoxic T-cell infiltrate in the mantle of the
granulomas, whereas CD4+ T cells have been exclusively observed within the
epitheliod granulomas 1. Lepromatous lesions showed a diffuse distribution of both
CD8+ and CD4+ cells among histiocytes, without any resemblance of mantle
formation 1.
Other studies observed that in ENL the lymphocyte subsets were diffusely
distributed throughout the granulomas in a manner similar to LL, whereas in type I
reaction only 30% of the granulomas showed CD8+ T cells located in the mantle
zone 1, 19 .
Unlike HIV-negative patients with leprosy, patients co-infected with HIV and
leprosy present an almost exclusive CD8+ cytotoxic infiltrate at both tuberculoid and
lepromatous poles of the disease 20.
Natural Tregs (CD25+FoxP3+cells) are known to maintain tolerance,
suppressing the function of autoreactive T cells in different cutaneous diseases 20 .
They have been found reduced or absent in the skin biopsies of patients with
autoimmune illnesses like erythematosus lupus and dermatomyositis, or of patients
with atopic dermatitis, as well as graft versus host disease 21, 22.
The expression FoxP3 was evaluated on a variety of cutaneous infiltrated of T
lymphocytes, and it was found that the Tregs were present in a larger quantity under
reactive conditions (where hardly exceeded 30% of all the infiltrated), than in
lymphomas of T-cells, suggesting then that the reduction on the regulatory function of
the T-cell may be permissive to the neoplastic transformation 1.
Tregs also play an essential role for the control of the excessive immune
answer against microbial antigens, specially against pathogens that establish
persistent infections 23.
In this study FoxP3-positive cells were present in 100% of investigated skin
specimens; the density of FoxP3-positive cells was low (average 2.82%, range: 0–7).
In TT and BT, FoxP3-positive cells were observed on the center and the periphery of
34
the granulomas (Fig. A, B). In BL and LL, FoxP3-positive cells were present randomly
in the diffuse macrophages infiltrate (Fig. C, D). A similar pattern was also observed
in ENL lesions (Fig. E, F). In all investigated cases, FoxP3-positive cells were
observed closely related to epitheliod cells or macrophages, suggesting a possible
functional interaction between Tregs and histiocytes (Fig. G, H), as shown on a
previous pilot study performed by Massone 1.
There was a statistical significant increment of FoxP3 expression between
reversal leprosy reactions (RR) compared with patients affected by I (P=0,0228), BT
(P=0,0351) and LL(P=0,0344); respectively; showing partial concordance with our
previous study, on which it was observed a significant statistically difference in
patients with reverse reaction states (BT-RR and BB-RR), when compared with the
forms of non-reaction disease (BL, BT, LL, TT) 1.
Data presented here suggests that Treg cells may have a relevant role on
leprosy’s etiopathogenesis, similar to what was already observed in leishmaniasis by
Leishmania major, tuberculosis, Helicobacter pylori infection, B hepatitis and HIV
viruses 1,24,25.
Tregs appear to control L. major infections by modulating the effector immune
response via IL-10, TGF-β and immunosuppression 26. In genetically resistant mouse
strains, they down-regulate protective Th1 responses allowing for parasite survival
and maintenance of memory responses 26.
Tregs are increased during active tuberculosis. Depletion of CD4+CD25+ cells
improved T cell IFN-γ production by CD4 T cells from newly diagnosed TB patients,
indicating that increased frequencies of CD4+CD25+ T cells are not simply a
reflection of the excessive immune activation during TB, but that subsets,
presumably those with a CD4+CD25hi+ phenotype, indeed have immunoregulatory
properties 27.
This study may have a certain limitation due to the fact that we used only the
immunohistochemistry exam. The ideal design would be if we had performed exams
to analyze peripheral blood and the tissues samples from the same patient so that
we could compare results. Besides, flow cytometry analysis would allow us to better
35
evaluate quantitatively Tregs 28.
Another control-case study using flow cytometry and involving 38 leprosy
cases (9 TT, 6 BT, 4 BL, 8LL, 3 BB and 6 erythema nodosum leprosum), and 38
controls, pointed an increase of Treg cells quantity and of FoxP3 expression in all
forms when compared with controls, mainly MHT. This study suggests that the
increase of intact Treg cells quantity could benefit leprosy patients, for the immune
answer would tend to the cellular pole of the disease 10 .
Another important date is that this same study showed that there was
reduction of the Treg cells quantity, and increase of FoxP3 expression in the cases of
erythema nodosum leprosum and LL, suggesting that the high FoxP3 expression
would induce to a bigger cellular immune suppression, tending to the humoral,
lepromatous pole of the disease10 .
Recently, another control-case study using flow cytometry and
immunohistochemistry, involving 28 leprosy cases (2 TT, 10 BT, 13 BL, 3 LL) and 6
controls showed that Tregs are present in increased numbers and may have a
pathogenic role in leprosy patients harboring uncontrolled bacillary multiplication
(lepromatous leprosy) but not in those individuals capable of limiting M. leprae growth
(tuberculoid leprosy) 11. Increased frequency of CD25+ FoxP3+ T cells was seen
both in in vitro M. leprae-stimulated and disease sites 11. The results differ from those
results of another group, which found higher frequency of circulating Tregs in the
peripheral blood of tuberculoid patients than lepromatous patients 10 .
The results of Palermo 11 differ from our study which is an expansion of the
pilot study performed by Massone 1, but we have to take into account the small
sample used (28 cases) and consists only of polar forms of the disease.
We used Foxp3 expression as the sole marker of a CD4+CD25+FoxP3+
regulatory T cell. In fact, Foxp3 expression is not specific for T-regs only as it can be
induced during T-cell stimulation; nevertheless, as already reported in the literature,
the nuclear expression of Foxp3 in paraffin-embedded tissue is still a relatively
accurate assessment of quantitative T-regs function 29 .
36
In the literature, there isn’t a consensus yet about the role of the Tregs in
leprosy. Common knowledge suggests that Treg cells may alter Th1 and Th2
response, interfering with the immune response against mycobacterial infection 6 .
Both the generation and the fate of Tregs depend on available cytokines
millieu, i.e. the microenvironment plays a crucial role in their differentiation, and also
in their expansion and function. The development of and maintenance of
CD4+CD25high FoxP3+ cells depends on TGF-β 10,30. In addition, IL-2 is essential
for maintaining a balanced natural and adaptive Treg activity 31. IL-2 also promotes
expansion as well as FoxP3 expression in Tregs, both in vivo and in vitro 10,32.
Besides, previous studies showed that the strength of T cell receptor and IL-2 signals
affects the magnitude of suppression achieved by Tregs, and that IL-2 plays an
important double-edged role both in enabling Tregs to suppress and target cells to
escape Tregs-suppression 33.
This information suggests that the expansion or detection of Tregs in the
leprosy tuberculoid or lepromatous poles, as previously shown in a study, is probably
due to the specific cytokines profile of these patients 10.
Our results confirm previous findings from our group 1, showing that there is a
statistically significant difference of the FoxP3 expression in cases of reversal
reaction leprosy in relation to patients with no reaction leprosy ( I, BT, LL).
These data suggest that the Treg cells may have a relevant role on the leprosy
etiopathogenesis, mainly in relation to the type 1 reaction, similar to what was
already observed in the leishmaniasis by L. major and tuberculosis by M.
tuberculosis.
37
Table 1 - Mean FoxP3 positivity
# Classification Overall Mean FoxP3 Positivity
# Classification
Overall Mean FoxP3 Positivity
(%) 1 I 2 49 BB 3 2 I 3 50 BB 2 3 I 1 51 BB 2 4 I 3 52 BL 3 5 I 4 53 BL 1 6 I 2 54 BL 2 7 I 2 55 BL 2 8 I 1 56 BL 5 9 I 2 57 BL 4 10 TT 5 58 BL 5 11 TT 2 59 BL 1 12 TT 2 60 LL 2 13 TT 4 61 LL 1 14 TT 1 62 LL 1 15 TT 2 63 LL 3 16 TT 5 64 LL 5 17 TT 1 65 LL 2 18 TT 3 66 LL 5 19 TT 3 67 LL 2 20 TT 4 68 LL 5 21 TT 5 69 LL 2 22 TT 3 70 LL 1 23 BT 4 71 LL 3 24 BT 2 72 LL 2 25 BT 1 73 LL 4 26 BT 3 74 LL 1 27 BT 2 75 LL 3 28 BT 4 76 LL 2 29 BT 5 77 LL 1 30 BT 2 78 LL 2 31 BT 1 79 LL 2 32 BT 4 80 LL 1 33 BT 4 81 LL 4 34 BT 2 82 LL 4 35 BT 2 83 LL 2 36 BT 1 84 LL 5 37 BT 5 85 LL 4 38 BT 2 86 LL 3 39 BT 2 87 RR 5 40 BT 3 88 RR 2 41 BT 2 89 RR 7 42 BT 4 90 RR 5 43 BT 2 91 RR 3 44 BT 1 92 RR 2 45 BT 5 93 RR 4 46 BT 4 94 RR 5 47 BT 2 95 ENL 2 48 BT 2 96 ENL 3
38
5 REFERENCES
1. Massone C, Nunzi E, Ribeiro-Rodrigues R, et al. T regulatory cells and
plasmocytoid dentritic cells in hansen disease: a new insight into
pathogenesis? Am J Dermatopathol. 2010 may; 32(3):251-56.
2. Fleury RN. Dificuldades no emprego da classificação de Ridley e Jopling: uma
análise morfológica. Hansen Int. 1989 Dez;14(2):101-6.
3. Walker SL, Lockwood DNJ. The clinical and immunological features of leprosy.
Br Med Bull. 2006 Nov;77-78(1):103-21.
4. Gulia A, Fried I, Massone C. New insights in the pathogenesis and genetics of
leprosy. F1000 Med Reports. 2010; 2:30.
5. Thomas WV, Mary BT, Wayne AFT. The role of CD4+CD25+ regulatory T cells
in viral infections. Vet Immunol Immunopathol. 2005;108(2):219-25.
6. Lima HC. Papel das células T reguladoras no desenvolvimento de dermatoses.
An Bras Dermatol. 2006 Maio/Jun;81(3):269-281.
7. Polansky L, Kretschmer K, Freyer J. et al. DNA methylation controls Foxp3
gene expression . Eur J Immunol. 2008 june, 38(6):1654-1663.
8. Belkaid Y, Rouse BT. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat
Immunol. 2005 mar; 6:353-360.
9. Sakaguchi S. Naturally arising FoxP3-expressing CD25+CD4+ regulatory T
cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol.
2005;6:345–352.
10. Attia EA, Abdallah M, Saad AA, et al. Circulating CD4+ CD25high FoxP3+ t cells
vary in different clinical forms of leprosy. Int J Dermatol. 2010 Oct;
49(10):1152-8.
11. Palermo ML, Pagliari C, Trindade MAB, et al. Increased Expression of
regulatory T cells and down-regulatory molecules in lepromatous leprosy. Am.
39
J Trop Med Hyg. 2012; 86(5):878-883.
12. Ridley DS. Histological classification and the immunological spectrum of
Leprosy. Bull WHO. 1974;51:451.
13. Ridley DS. Skin biopsy in leprosy. Basel, Switzerland: CIBA-GEIGY;1977.
14. Tolosa EMC, Rodrigues CJ, Behmer OA, et al. Manual de técnicas para
histologia normal e patológica. São Paulo: USP/EDART, 1976. Cap. 1
(Fixadores: conceitos gerais, álcool etílico, aldeído fórmico).
15. Scollard DM, Adams LB, Gillis TP, et al. The continuing challenges of leprosy.
Clin Microbiol Rev. 2006;19:338–381.
16. Goulart LR, Goulart IMB. Leprosy pathogenetic background: a review and
lessons from other mycobacterial diseases. Arch Dermatol Res.
2009;301:123-137.
17. Krutzik SR, Tan B, Li H, et al. TLR activation triggers the rapid differentiation
of monocytes into macrophages and dendritic cells. Nat Med. 2005
Jun;11(6):653-60.
18. Mira MT, Alcaïs A, Nguyen VT, et al. Susceptibility to leprosy is associated
with PARK2 and PACRG. Nature. 2004 Feb12; 427(6975):636-40.
19. Modlin RL, Gebhard JF, Taylor CR, et al. In situ characterization of T
lymphocyte subsets in the reactional states of leprosy. Clin Exp Immunol.
1983;53:17-24.
20. Massone C, Talhari C, Talhari S, Brunasso AM, Campbell TM, Curcic P,
Cerroni L, Ribeiro-Rodrigues R. Immunophenotype of skin lymphocytic ilfiltrate
in patients co-infected with mycobacterium leprae and human
immunodeficiency virus: a scenario dependent on CD8+ and/or CD20+ cells.
Br J Dermatol. 2011 Aug; 165(2):321-8.
21. Verhagen J, Akdis M, Traidl-Hoffmann C, et al. Absence of Tregulatory cell
expression and function in atopic dermatitis skin. J Allergy Clin Immunol. 2006
40
Jan;117(1):176-83.
22. Fujita S, Sato Y, Sato K, et al. Regulatory dendritic cells protect against
cutaneous chronic graft-versus-host disease mediated through
D4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 2007;110(10):3793-3803.
23. Belkaid Y. The role of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in leishmania
infection. Expert Opin Biol Ther. 2003;3:875-85.
24. Chen X, Zhou B, Li M, et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells
suppress mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active
disease. Clin Immunol. 2007 Apr;123(1):50-9.
25. Mendelson M, Hanekom WA, Ntutela S, et al. Quantitative and functional
differences between peripheral blood myeloid dendritic cells from patients with
pleural and parenchymal lung tuberculosis. Clin Vaccine Immunol. 2006
Dec;13(12):1299-1306.
26. Maurer M, Dondji B, Stebut E. What determines the success or failure of
intracellular cutaneous parasites? Lessons learned from leishmaniasis. Med
Microbiol Immunol. 2009 apr.;198:137-146.
27. Ribeiro-Rodrigues R, Resende Co T, Rojas R, et al. A role for CD4+CD25+ T
cells in regulation of the immune response during human tuberculosis. Clin
Exp Immunol. 2006 apr;144(1): 25–34.
28. Banica L, Besliu A, Pistol G, et al. Quantification and molecular
characterization of regulatory T cells in connective tissue diseases.
Autoimmunity. 2009 Jan; 42(1):41-9.
29. Solomon GJ, Magro CM. Foxp3 expression in cutaneous T-cell lymphocytic
infiltrates. J Cutan Pathol. 2008;35:1032–1039.
30. Marie J, Letterio J, Gavin M, et al. TGF-beta1 maintains suppressor function
and FoxP3 expression in CD4+ CD25+ regulatory T cells. J Exp Med.
2005;201: 1061-1067.
41
31. La Cava A. Tregs are regulated by cytokines: implications for autoimmunity.
Autoimmun Rev. 2008; 8:83–87.
32. Zorn E, Nelson EA, Mohseni M, et al. IL-2 regulates FoxP3 expression in
human CD4+ CD25+ regulatory T cells through a STAT dependent
mechanism and induces the expansion of these cells in vivo. Blood.
2006;108:1571-1579.
33. Antons AK, Wang R, Kalams SA, et al. Suppression of HIV-specific and
allogeneic T cell activation by human regulatory T cells is dependent on the
strength of signals. PLoS ONE. 2008;3:e2952.
42
5 CONCLUSÃO
1)Este estudo imunohistoquímico envolveu 96 casos de hanseníase e demonstrou a
presença de células FoxP3 positivas em 100 % dos casos. Houve aumento
estatisticamente significante dessas células entre os casos de reação tipo I
hansênica e MHI; MHBT e MHVV.
2)Nas formas MHT e MHBT, as células Tregs estão distribuídas no centro e na
periferia dos granulomas
3)Nas formas MHBV e MHVV, células Tregs estão distribuídas difusamente no
infiltrado macrofágico
4)Houve aumento estatisticamente significante da expressão de FoxP3 nas formas
reacionais (RR) quando comparado as formas I.
5)Esses dados sugerem que as células Tregs são relevantes na etiopatogenia da
hanseníase, principalmente em relação a reação tipo I.
6)Novos estudos precisam ser realizados pois o completo entendimento do papel
das Tregs na hanseníase poderia implicar em novas abordagens terapêuticas.
43
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Attia EA, Abdallah M, Saad AA, Afifi A, Tabbakh AE, El-Shennawy D, Ali HB. Circulating CD4+ CD25high FoxP3+ t cells vary in different clinical forms of leprosy. Int J Dermatol 2010 Oct; 49(10):1152-8.
Bacchetta R, Gambineri E, Roncarolo MG. Role of regulatory T cells and FoxP3 in human diseases. J Allergy Clin Immunol 2007 Aug;120 (2):227-35.
Berquó ES, Souza JMP, Gotlieb SLD. Bioestatística. São Paulo: EPU, 1980.
Bluestone JA, Abbas AK. Natural versus adaptive regulatory T cells. Nat Rev Immunol 2003 Mar;3(3):253-7.
Britton WJ, Lockwood DN. Leprosy. Lancet 2004 Apr 10; 363(9416):1209-19.
Chan J, Flynn J. The immunological aspects of latency in tuberculosis. Clin Immunol 2004 Jan;110(1):2-12.
Chen X, Zhou B, Li M, Deng Q, Wu X, Le X, Wu C, Larmonier N, Zhang W, Zhang H, Wang H, Katsanis E. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol 2007 Apr;123(1):50-9.
Fine PE. Leprosy: the epidemiology of a slow bacterium. Epidemiol Rev 1982;4:161-88.
Fleury RN. Dificuldades no emprego da classificação de Ridley e Jopling: uma análise morfológica. Hansen Int 1989 Dez;14(2):101-6.
Foss NT. Hanseníase: aspectos clínicos, imunológicos e terapêuticos. An Bras Dermatol 1999 Mar./Abr;74(2):113-19.
Goulart IMB, Penna GO, Cunha G. Imunopatologia da hanseníase: a complexidade dos mecanismos da resposta imune do hospedeiro ao Mycobacterium leprae. Rev Soc Bras Med Trop. 2002 Jul./Ago;35(4):365-75.
Guerra JG, Penna GO, Castro LCM, Martelli CMT, Stefani MMA. Eritema nodoso hansênico: atualização clínica e terapêutica. An Bras Dermatol 2002 Jul./Ago.;77(4):389-407.
Gulia A, Fried I, Massone C. New insights in the pathogenesis and genetics of leprosy. F1000 Med Reports 2010; 2:30.
Howard CV, Reed MG. Unbiased stereology: three-dimensional measurement in microscopy. 2.ed. Berlin: Springer Verlag & Bios Scientific Publishers, 1998.
Hussain T. Leprosy and tuberculosis: an insight-review. Crit Rev Microbiol 2007; 33(1):15-66.
44
Krutzik SR, Tan B, Li H, Ochoa MT, Liu PT, Sharfstein SE, Graeber TG, Sieling PA, Liu Y, Rea TH, Bloom BR, Modlin RL. TLR activation triggers the rapid differentiation of monocytes into macrophages and dendritic cells. Nat Med 2005 Jun;11(6):653-60.
Kumar V. Homeostatic control of immunity by TCR peptide-specific Tregs. J Clin Invest 2004 Nov;114(9):1222-6.
Lima FA, Carneiro-Sampaio M. O papel do timo no desenvolvimento do sistema imune. Pediatria 2007 Jan;29(1):33-42.
Lima HC. Papel das células T reguladoras no desenvolvimento de dermatoses. An Bras Dermatol 2006 Maio/Jun;81(3):269-281.
Lund J, Sato A, Akira S, Medzhitov R, Iwasaki A. Toll-like receptor 9-mediated recognition of Herpes simplex virus-2 by plasmacytoid dendritic cells. J Exp Med 2003 Aug4;198(3):513-20.
Madrid Congress Number. Int J Lepr. 1953;21(4):504-10.
Massone C, Nunzi E. Note di Leprologia. Bologna: AIFO, 2009. p.260
Massone C, Nunzi E, Ribeiro-Rodrigues R, Talhari C, Talhari S, Schettini APM, Parente JNT, Brunasso AMG, Puntoni M, Clapasson A, Noto S, Cerroni L. T regulatory cells and plasmocytoid dentritic cells in hansen disease: a new insight into pathogenesis? Am J Dermatopathol 2010 may; 32(3):251-56.
Mendelson M, Hanekom WA, Ntutela S, Vogt M, Steyn L, Maartens G, Kaplan G. Quantitative and functional differences between peripheral blood myeloid dendritic cells from patients with pleural and parenchymal lung tuberculosis. Clin Vaccine Immunol 2006 Dec;13(12):1299-1306.
Mendonça VA, Melo GEBA, Teixeira AL, Costa RD, Antunes CM. Imunologia da hanseníase. An Bras Dermatol 2008 Jul./Ago;83(4):343-50.
Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de vigilância epidemiológica. 6.ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2008. p.304.
Mira MT, Alcaïs A, Nguyen VT, Moraes MO, Di Flumeri C, Vu HT, Mai CP, Nguyen TH, Nguyen NB, Pham XK, Sarno EN, Alter A, Montpetit A, Moraes ME, Moraes JR, Doré C, Gallant CJ, Lepage P, Verner A, Van De Vosse E, Hudson TJ, Abel L, Schurr E. Susceptibility to leprosy is associated with PARK2 and PACRG. Nature 2004 Feb12; 427(6975):636-40.
Miranda RN, Pereira LC, Tarlé SF, Nascimento RA, Mello SL, Mesquita LAF, Dechandt IT. Desenvolvimento de preparado antigênico Mitsuda-símile e sua avaliação em pacientes multibacilares Mitsuda-negativos. An Bras Dermatol 2005 Jul./Ago;80(4):355-62.
Modlin RL, Melancon-Kaplan J, Young SM, Pirmez C, Kino H, Convit J, Rea TH, Bloom BR. Learning from lesions: patterns of tissue inflammation in leprosy. Proc
45
Natl Acad Sci U S A 1988 Feb;85(4):1213-7.
Modlin RL, Rea TH. Leprosy: new insight into an ancient disease. J Am Acad Dermatol 1987 Jul;17(1):1-13.
Modlin RL. The innate immune response in leprosy. Curr Opin Immunol 2010 Feb; 22(1):48-54.
Moraes MO, Cardoso CC, Vanderborght PR, Pacheco AG. Genetics of host response in leprosy. Lepr Rev 2006 Sep;77(3):189-202.
Naafs B. Leprosy reactions. New knowledge. Trop Geogr Med 1994;46(2):80-4.
Noussitou FM, Sansarrick H, Walter J. Leprosy in children. WHO: Geneva, 1976. 28p.
Palermo ML, Pagliari C, Trindade MA, Yamashitafuji TM, Duarte AJ, Cacere CR, Benard G. Increased Expression of regulatory T cells and down-regulatory molecules in lepromatous leprosy. Am. J Trop Med Hyg. 2012; 86(5):878-883.
Prevedello FC, Mira MT. Hanseníase: uma doença genética?. An Bras Dermatol 2007 Set./Out;82(5):451-9.
Ribeiro SLE, Pereira HLA, Silva NP, Sato EI. Auto-anticorpos em pacientes com hanseníase, com e sem comprometimento articular, no estado do Amazonas. Rev Brás Reumatol 2009 Set./Out;49(5):547-61.
Ridley DS, Jopling WH. Classification of leprosy according to immunity: A five-group system. Inter J Lepr Other Mycobact Dis 1966 Jul;34(3):255-73.
Ring S, Schafer SC, Mahnke K, Lehr HA, Enk AH. CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress contact hypersensitivity reactions by blocking influx of effector T cells into inflamed tissue. Eur J Immunol 2006 Nov;36(11):2981-92.
Scollard DM, Adams LB, Gillis TP, Krahenbuhl JL, Truman RW, Williams DL. The continuing challenges of leprosy. Clin Microbiol Rev 2006 Apr;19(2):338-81.
Shevach EM, Thornton A, Suri-Payer E. T lymphocyte-mediated control of autoimmunity. Novartis Found Symp 1998;215:200-11.
Sugiyama H, Gyulai R, Toichi E, Garaczi E, Shimada S, Stevens SR, McCormick TS, Cooper KD. Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25high regulatory T cells in psoriasis: mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation. J Immunol 2005 Jan 1;174(1):164-73.
Talhari S, Neves RG, Penna, GO, Oliveira, MLV. Dermatologia tropical: hanseníase. Manaus, 2006. 214p.
Thomas WV, Mary BT, Wayne AFT. The role of CD4+CD25+ regulatory T cells in viral infections. Ver Immunol Immunopathol 2005;108(2):219-25.
46
Tolosa EMC, Rodrigues CJ, Behmer OA, Freitas Neto AG. Manual de técnicas para histologia normal e patológica. São Paulo: USP/EDART, 1976. Cap. 1 (Fixadores: conceitos gerais, álcool etílico, aldeído fórmico).
Valverde CR, Canfield D, Tarara R, Esteves MI, Gormus BJ. Spontaneous leprosy in a wild-caught cynomolgus macaque. Int J Lepr Other Mycobact Dis 1998 Jun; 66(2):140-8.
Vieira S. Bioestatística: tópicos avançados. 2.ed. rev. ampl. Rio de Janeiro: Elsevier, 2004.
Walker SL, Lockwood DNJ. The clinical and immunological features of leprosy. Br Med Bull 2006 Nov;77-78(1):103-21.
Wayne WD. Biostatistics: a fundation for analysis in the health sciences, 5 ed. John Wiley, 1987. p.157.
Yamamura M, Uyemura K, Deans RJ, Weinberg K, Rea TH, Bloom BR, Modlin RL. Defining protective response to pathogenes: cytokines profiles in leprosy lesions. Science. 1991 Oct11; 254(5029):277-9.
Yamamura M, Wang XH, Ohmen JD, Uyemura K, Rea TH, Bloom BR, Modlin RL. Cytokine patterns of immunologically mediated tissue damage. J Immunol 1992 Aug15; 149(4):1470-5.
47
7 ANEXOS
Anexo 1 – Formulário de coleta de dados
FORMULÁRIO DE COLETA DE DADOS
Rev.:
Data:
N. PROTOCOLO: N. REGISTRO:
SEXO: IDADE:
FORMA CLÍNICA:
BACILOSCOPIA INICIAL:
HISTOPATOLOGIA INICIAL:
TRATAMENTO INSTITUÍDO:
ESTADOS REACIONAIS:
EXAMES LABORATORIAIS DE IMPORTÂNCIA:
RESULTADOS DA IMUNOHISTOQUÍMICA:
OBSERVAÇÕES:
