UNIVERSIDADE DO PORTO · ... Prof. Doutor José Alberto Duarte. ... LISTA DE ABREVIATURAS XVIII 1. ... Introdução Geral O atual decréscimo no gasto de energia para realizar atividades

I

UNIVERSIDADE DO PORTO

FACULDADE DE DESPORTO

EFEITO CADIOPROTETOR DO EXERCÍCIO FÍSICO REGULAR NO

FENÓTIPO MALADAPTATIVO DO VENTRÍCULO ESQUERDO, NUM

MODELO ANIMAL DE HIPERTENSÃO ARTERIAL PULMONAR INDUZIDA

PELA MONOCROTALINA.

Dissertação apresentada com vista à obtenção

do grau de mestre em Atividade Física e

Saúde, da Faculdade de Desporto da

Universidade do Porto ao abrigo do Decreto de

Lei nº 74/2006 de 24 de Março, orientada pelo

Professor Doutor José Alberto Ramos Duarte e

co-orientada pelo Professor Doutor Daniel

Moreira Gonçalves.

José Antonio Franchi Bovolini

Porto, 2013

II

Bovolini, A. (2013). EFEITO CADIOPROTETOR DO EXERCÍCIO FÍSICO

REGULAR NO FENÓTIPO MALADAPTATIVO DO VENTRÍCULO

ESQUERDO, NUM MODELO ANIMAL DE HIPERTENSÃO ARTERIAL

PULMONAR INDUZIDA PELA MONOCROTALINA. Dissertação de Mestrado

em Atividade Física e Saúde. Faculdade de Desporto da Universidade do

Porto, Porto.

Palavras-Chaves: Exercício Físico Crónico; Cardioproteção; Hipertensão

Arterial Pulmonar; Disfunção Ventricular Esquerda.

III

Fonte de Financiamento

O estudo experimental incluído nesta tese foi apoiado por um projeto

financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia

(PTDC/DES/104567/2008).

Esta dissertação foi realizada no Centro de Investigação em Actividade

Física, Saúde e Lazer (CIAFEL), unidade de pesquisa alojada na Faculdade de

Desporto da Universidade do Porto, Portugal.

V

Aos meus pais

VII

Pai e Mãe…

… meus maiores modelos, meus heróis;

a vocês que deram a mim quem mais amo, meus irmãos;

Espero deixá-los orgulhosos…

…obrigado por tudo!

IX

Agradecimentos

Á minha família pelo apoio incondicional. Desculpas por ter partido e

deixado a saudade no meu lugar, espero poder dar outro motivo para as

lágrimas, o orgulho. Aos meus irmãos, Rafael e Rafaela, fizeram sempre muita

falta durante este percurso. Aos meus pais, Antonio e Lena Bovolini, as

melhores e mais honradas pessoas que conheci. Não é possível descrever o

orgulho e amor que sinto por vocês, mais uma vez, muito obrigado. Apesar de

estarmos a um oceano de distância, carreguei vocês sempre comigo e sempre

o farei…

Ao meu orientador, Prof. Doutor José Alberto Duarte. Obrigado por me

acolher no laboratório de bioquímica, pela oportunidade de crescimento e por

abrir as portas de um mundo novo. Do primeiro dia em sala de aula a

posteridade, o Senhor foi sempre o exemplo seguido nestes dois anos de

aprendizado intenso. Obrigado.

Ao meu coorientador, Prof. Doutor Daniel Moreira Gonçalves. Impossível

agradecer a amizade e o constante suporte dedicado. Pela paciência e

incontável aprendizado compartilhado, foi um prazer aprender contigo. És das

melhores pessoas que conheci neste breve jornada. Obrigado.

Á Cristine. Grande amizade! Tenho o orgulho de dividir este trabalho

contigo. Obrigado pelo apoio em todas as horas, pelos momentos bons, pelos

momentos ruins, pelas conversas partilhadas junto aos ratos e por estar

sempre ao meu lado. Que o destino se encarregue de manter esta amizade.

Obrigado por tudo “Gringa”!

À Morgana, Renata, Wagner e Valdir, o caminho não teria sido o mesmo

sem vocês. Obrigado pela amizade que sempre se fez companheira! Em

especial à Diana Ospina, por ter o maior coração que conhecí, muchas gracias

X

por todo! Ao César, pela amizade em boas e nem tão boas horas, meu irmão

longe de casa. Ao Nórton e a Ana, pelo companheirismo, irmandade e

conversas junto ao chimarrão; grandes amigos! Vocês fizeram do Porto minha

casa, obrigado a todos.

Ao Helder Fonseca e ao laboratório de bioquímica, Ana Carvalho,

Eduardo Teixeira, Gonçalo Castro, Daniel Girardi. A recém chegada Maria do

Amparo. A Dona Celeste Maria pela ajuda, ensinamentos e pela amizade. Em

especial a Teresa Baltazar. Tive a sorte de poder aprender e conviver com

quem gosto. Obrigados a todos pela ajuda, pelos bons momentos, pela

amizade e por dividirem comigo o orgulho desta terra. Carrego de cada um de

vocês um ensinamento.

A Susana Confortin, amizade de uma vida inteira! Aos amigos que

sempre me receberam com um sorriso ao voltar para casa, Roberta

Dalenogare, Nicolas Soares, Michele e Milene Menezes. E às amizades

contruídas aqui, Carol Reyes, Carol Pinho, ao casal Bruna e Júlio e a Rose

Autran. Á Dona Manuela e a todos do refeitório por me receberem com o

mesmo sorriso que os antigos amigos. Á Maria Domingues, um agradecimento

tão obrigatório quanto sentido. Muito obrigado.

O meu mais sincero agradecimento a todos.

XII

ÍNDICE GERAL

FONTE DE FINANCIAMANETO III

AGRADECIMENTOS IX

ÍNDICE XII

RESUMO XIV

ABSTRACT XVI

LISTA DE ABREVIATURAS XVIII

1. INTRODUÇÃO GERAL E ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO 1

1.1. Introdução Geral 3

1.2. Estrutura da Dissertação 5

1.3. Referências Bibliográficas 6

2. ESTADO DA ARTE 9

3. ARTIGO EXPERIMENTAL: “Efeito protetor do exercício físico regular

na remodelação ventricular esquerda secundária à hipertensão arterial

pulmonar induzida pela Monocrotalina”.

35

4. CONCLUSÃO 63

XIV

Resumo

A Hipertensão Arterial Pulmonar é uma doença altamente mortal, caracterizada

por um aumento progressivo das resistências vasculares pulmonares. O aumento

progressivo da pós-carga sobre o miocárdio devido à obliteração arterial pulmonar,

que acomete seletivamente o ventrículo direito (VD), inicia um conjunto de alterações

que convergem para a disfunção. Consequente à disfuncionalidade do VD, a

disfuncionalidade ventricular esquerda (DVE) também vem sendo descrita tanto em

modelos animais quanto em humanos acometidos pela HAP. As atuais evidências

associam a disfuncionalidade do ventrículo esquerdo (VE) a uma série de mecanismos

tais como a redução da massa ventricular, a ativação neuro-humoral e alterações da

matriz extracelular. Até ao momento, não existem terapias eficazes no tratamento da

HAP e da disfunção secundária a esta doença. Sabe-se hoje que o exercício físico

regular é capaz de modular as vias de sinalização ativadas na insuficiência cardíaca

esquerda, mecanismos esses que se encontram também ativados na HAP. Contudo,

desconhece-se se este efeito benéfico do exercício poderá também estar presente em

doentes com HAP. Assim sendo, o reconhecimento desse efeito protetor do exercício

bem como o desconhecimento do seu impacto sobre a DVE secundária à HAP,

estabeleceu a base para o desenvolvimento deste estudo. O nosso objetivo foi estudar

os possíveis efeitos cardioprotetores do exercício físico regular na função do VE num

modelo animal de HAP induzida por monocrotalina (MCT). Para tal, desenvolvemos

um estudo experimental com ratos Wistar machos aleatoriamente separados nos

seguintes grupos: i) sedentários ou exercitados tratados com MCT (SED+MCT e

EX+MCT, respectivamente; 60mg/kg), e ii) sedentários ou exercitados tratados com

solução veículo (SED+V e EX+V, respectivamente; 1mL/kg de solução salina). Após a

administração de MCT ou V, os animais do grupo EX+MCT e EX+V foram submetidos

a um protocolo de treino (corrida sobre tapete rolante a motor, 5 dias/semana, 60

min/dia a 25m/min durante 4 semanas) enquanto os animais do grupo SED+MCT e

SED+V permaneceram com movimentação confinada ao espaço da gaiola durante 4

semanas. Foram efetuadas as seguintes avaliações: tolerância ao esforço, avaliação

ecocardiográfica e hemodinâmica do VE, avaliação histológica e molecular do VE, e

estudo da sobrevida. Em condições basais foi observada disfunção sistólica e

diastólica no grupo SED+MCT, sendo essas alterações prevenidas pelo exercício no

grupo EX+MCT. Em resposta à oclusão da artéria aorta ascendente, enquanto o grupo

SED+MCT apresentou alterações apenas nos parâmetros diastólicos, o grupo

XV

EX+MCT respondeu positivamente, sem apresentar indícios de disfunção. EX+MCT

também apresentou reversão da atrofia miocitária e da fibrose intersticial encontrados

em SED+MCT, assim como a normalização do nível ventricular de ET-1.

Contrariamente aos animais SED+MCT, os animais do grupo EX+MCT apresentaram

melhoria do desempenho no teste de esforço bem como melhoria da sobrevida. Estes

resultados suportam a nossa hipótese de que o treinamento físico tem um papel

protetor e terapêutico na modulação da resposta ventricular esquerda na HAP.

Palavras chave: Exercício Físico Crónico; Cardioproteção; Hipertensão Arterial

Pulmonar; Disfunção Ventricular Esquerda.

XVI

Abstract

Pulmonary Arterial Hypertension is a deadly disease, characterized by a

progressive increase in pulmonary artery resistances. The progressive increase in

afterload to the myocardium due to the obliteration of the pulmonary artery selectively

overloads the right ventricle (RV), triggering several adaptations that culminate in

dysfunction. Consequently to RV dysfunction, left ventricular dysfunction was also

observed in both human and animals with HAP. Current evidences suggest that LV

dysfunction may result from different mechanisms such as reduced ventricular mass,

increased neuro-humoral activation and extracellular matrix remodeling. Until now,

there are no effective therapies for the treatment of PAH or the resultant cardiac

dysfunction. It is known that regular physical exercise can modulate several signaling

pathways that are activated in left heart failure, and these mechanisms are also

present in patients with PAH. Thus, the recognition of this protective effect together

with the lack of knowledge regarding the impact of exercise training in LV dysfunction

secondary to PAH, established the rationale to perform this study. Our aim was to

study the possible cardioprotective effects of exercise training in LV function in animals

with monocrotaline (MCT)-induced PAH. For that purpose we performed an experiment

with male Wistar rats, randomly divided in the following groups: i) sedentary or

exercised treated with MCT (SED+MCT and EX+MCT), respectively; 60mg/kg, ip), and

ii) sedentary or exercised treated with vehicle solution (SED+V e EX+V respectively;

1ml/kg saline). After administration of MCT or V, the animals of the group EX+MCT and

EX+V were submitted to a training protocol (running on treadmill motor, 5 days/week,

60 min/day to 25m/min for 4 weeks) while the animals of group SED+MCT and SED+V

remained confined with restricted movements to the space of the cage for 4 weeks.

The following evaluations were performed: exercise tolerance, LV hemodynamic and

echocardiographic evaluation, LV histological and molecular evaluation, and study of

survival. At baseline conditions it was observed systolic and diastolic dysfunction, being

these changes prevented by exercise in the EX+MCT group. In response to the

occlusion of the ascending aorta, while the SED+MCT group showed only changes in

diastolic parameters, the EX+MCT group responded positively, without presenting

evidence of dysfunction. EX+MCT also showed reversion of cardiomyocyte atrophy

and interstitial fibrosis found in SED+MCT, as well as the normalization of ventricular

level of ET-1. Contrary to animals SED+MCT, the animals from the EX+MCT group

showed an improved performance on the exercise tolerance test as well as improved

XVII

survival. These results support our hypothesis that physical training has a protective

and therapeutic role in the modulation of left ventricular response in PAH.

Key words: Chronic Physical Exercise; Cardioprotection; Pulmonary Arterial

Hypertension; Left Ventricular Dysfunction.

XVIII

Lista de Abreviaturas

•NO: oxido nítrico

ADP: adenosina difosfato

Ang II: angiotensina II

ATP: adenosina trifosfato

Ca2+: cálcio

CAM: molécula de adesão intercellular

dP/dtmáx: velocidade de elevação de pressão

dP/dtmín: velocidade de queda de pressão

DVE: disfunção ventricular esquerda

EROs: espécies reativas ao oxigénio

ET-1: endotelina-1

ETA: receptor de endotelina tipo A

FC: frequência cardíaca

HAP: hipertensão arterial pulmonar

HAPA: hipertensão arterial pulmonar associada a doenças cardíacas

HP: hipertensão pulmonary

IC: insuficiência cardiaca

IL: interleucina

iNOS: óxido nitrico sintase induzida

KATP: canal de potássio

MC: massa corporal

MCP: miosina de cadeia pesada

XIX

MCT: monocrotalina

MCTP: monocrotalina pirrole

MEC: matriz extra cellular

MnSOD: manganês superóxido dismutase

NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

NF-KB: factor de transcrição nuclear

PC/Tíbia: peso do coração/tíbia

PC: peso do coração

PGast: peso dos gastrocnêmios

PLN: fosfolamban

PVEmax: pressão sistólica máxima

SERCA2a: bomba de cálcio do reticulo endoplasmático

SOD: superóxido dismutase

tau: velocidade de relaxamento

TF: treinamento físico

TGF-β: fator transformador de crescimento beta

TNF: fator de necrose tumoral

VCAM: molécula de adesão vascular

VD: ventrículo direito

VE/T: ventrículo esquerdo/tíbia

VE: ventriculo esquerdo

VE+S: ventrículo esquerdo + sépto

1

Secção 1

Introdução Geral e Estrutura da Dissertação

2

3

1.1. Introdução Geral

O atual decréscimo no gasto de energia para realizar atividades diárias

como trabalhar e atividades domésticas rotineiras, gerou uma verdadeira

epidemia no aumento de factores de risco para a ocorrência de

cardiovasculares (1). O exercício regular é comprovadamente fundamental

para a prevenção e modulação de fatores de risco de doenças, morbidade e

mortalidade induzidas pelo decréscimo das exigências funcionais (15),

possuindo uma relação inversamente associada aos fatores de risco em

condições de inactividade física em modo de dose-resposta, especialmente em

doenças cardiovasculares (8, 9). Entre os factores nos quais o exercício age

como modulador, pode-se citar as alterações do metabolismo glicolítico e

insulínico, obesidade abdominal, dislipidemia e hipertensão arterial,

importantes contributos patológicos para o desenvolvimento de cardiopatias

(4).

A fisiologia do sistema cardiovascular humano evoluiu devido à

necessidade de quantidades prodigiosas de despêndio energético através do

esforço físco, exigido pelo ambiente, para desempenhar atividades básicas de

sobrevivencia (2). Esta relação estabelecida entre atividade física, produção e

despêndio energético e o desenvolvimento do sistema cardiorespiratório,

tornou a aptidão cardiorrespiratória um importante indicador de risco de doença

cardiovascular e demonstra claramente a correlação entre níveis de atividade

física e cardioproteção (10). Particularmente, o estudo dos efeitos protetores do

exercício regular sobre as doenças cardiovasculares tem-se intensificado

desde meados década de 50, onde extensos dados epidemiológicos e

4

experimentais vêm sendo acumulados, permitindo o estabelecimento de uma

relação de causalidade entre altos níveis de trabalho físico e cardioproteção

(16).

De facto, a capacidade do exercício físico em desenvolver um fenótipo

cardioprotetor é largamente aceito e fundamentado contra diversos factores de

risco e diferentes insultos cardíacos como infarto agudo do miocárdio (3),

diferentes agentes cardiotóxicos (7, 17, 18) e alterações hemodinâmicas de

carga e pressão impostas ao coração (13). A hipertensão arterial pulmonar

(HAP) e seu aumento progressivo da pós-carga ao miocárdio, característica

patológica da obliteração vascular pulmonar, acomete diretamente o ventrículo

direito (VD) tornando-o disfuncional (14). Consequente à hipertrofia prolongada

com disfuncionalidade do VD, a disfuncionalidade ventricular esquerda (DVE)

também tem sido descrita, tanto em humanos acometidos pela HAP, quanto

em modelos animais (5). Embora ainda pouco esclarecidos e compreendidos,

as evidências atuais relacionam a disfuncionalidade do VE a uma série de

mecanismos maladaptativos adotados pelo miocárdio, tais como a atrofia

ventricular (6), a remodelação deletéria da matriz extra celular (19) e a

activação dos mediadores neuro-humorais (12), especialmente a endotelina

(ET-1) (11).

Os benefícios cardioprotetores do exercício físico regular são bem

estabelecidos na população em geral contra diversas cardiopatias e factores de

risco. Contrariamente, os efeitos protetivos e os exatos mecanismos de

atuação dentro da DVE induzida pela HAP ainda permanecem por esclarecer

e, de facto, o VE tem sido de menor importância dentro da investigação no

cenário da HAP. Desta maneira, objetivamos com este estudo analisar o

5

possível efeito cardioprotetor do exercício físico regular e seus mecanismos de

atuação através de um programa de treino em um modelo de HAP induzida por

monocrotalina (MCT).

1.2. Estrutura da Dissertação

Esta dissertação é apresentada de acordo com o modelo escandinavo,

sendo dividida em quatro seções:

Secção 1: Este capítulo constitui a introdução geral sobre o tema, destacando

a relevância do estudo e seus objetivos.

Secção 2: Este capítulo, constitui uma revisão bibliográfica referente aos

potenciais mecanismos da cardioproteção induzida pelo exercício físico regular

na remodelação e disfuncionalidade ventricular esquerda.

Secção 3: Este capítulo constitui-se de um artigo experimental intitulado “Efeito

protetor do exercício físico regular na remodelação ventricular esquerda

secundária à hipertensão arterial pulmonar induzida pela Monocrotalina”.

Contém a parte experimental da dissertação, apresentando os materias e

métodos utilizados assim como os resultados obtidos e sua discussão.

Secção 4: Neste capítulo são apresentadas as principais conclusões da

dissertação.

6

1.3. Referencial Bibliográfico

1. Archer E, and Blair SN. Physical Activity and the Prevention of Cardiovascular Disease:From Evolution to Epidemiology. Progress in Cardiovascular Diseases 53: 387-396, 2011. 2. Bramble DM, and Lieberman DE. Endurance running and the evolution of Homo.Nature 432: 345-352, 2004. 3. Giallauria F, Acampa W, Ricci F, Vitelli A, Torella G, Lucci R, Del Prete G, Zampella E,Assante R, and Rengo G. Exercise training early after acute myocardial infarction reduces stress-induced hypoperfusion and improves left ventricular function. European journal of nuclear medicine and molecular imaging 40: 315-324, 2013. 4. Grundy SM, Cleeman JI, Daniels SR, Donato KA, Eckel RH, Franklin BA, Gordon DJ,Krauss RM, Savage PJ, and Smith Jr SC. Diagnosis and management of the metabolic syndrome: an American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute scientific statement. Current opinion in cardiology 21: 1, 2006. 5. Hardziyenka M, Campian ME, Reesink HJ, Surie S, Bouma BJ, Groenink M, KlemensCA, Beekman L, Remme CA, and Bresser P. Right Ventricular Failure Following Chronic Pressure Overload Is Associated With Reduction in Left Ventricular MassEvidence for Atrophic Remodeling. Journal of the American College of Cardiology 57: 921-928, 2011. 6. Hardziyenka M, Campian ME, Reesink HJ, Surie S, Bouma BJ, Groenink M, KlemensCA, Beekman L, Remme CA, Bresser P, and Tan HL. Right Ventricular Failure Following Chronic Pressure Overload Is Associated With Reduction in Left Ventricular Mass: Evidence for Atrophic Remodeling. Journal of the American College of Cardiology 57: 921-928, 2011. 7. Hydock DS, Lien C-Y, Jensen BT, Parry TL, Schneider CM, and Hayward R.Rehabilitative exercise in a rat model of doxorubicin cardiotoxicity. Experimental Biology and Medicine 237: 1483-1492, 2012. 8. Kohl 3rd H. Physical activity and cardiovascular disease: evidence for a dose response.Medicine and Science in Sports and Exercise 33: S472, 2001. 9. Laaksonen DE, Lakka HM, Salonen JT, Niskanen LK, Rauramaa R, and Lakka TA. Lowlevels of leisure-time physical activity and cardiorespiratory fitness predict development of the metabolic syndrome. Diabetes care 25: 1612-1618, 2002. 10. Lee D, Sui X, Ortega F, Kim Y, Church T, Winett R, Ekelund U, Katzmarzyk P, and BlairS. Comparisons of leisure-time physical activity and cardiorespiratory fitness as predictors of all-cause mortality in men and women. British Journal of Sports Medicine 45: 504-510, 2011. 11. Lisy O, Redfield MM, Jovanovic S, Jougasaki M, Jovanovic A, Leskinen H, Terzic A, andBurnett Jr JC. Mechanical unloading versus neurohumoral stimulation on myocardial structure and endocrine function in vivo. Circulation 102: 338-343, 2000. 12. Lourenço AP, Roncon-Albuquerque R, Brás-Silva C, Faria B, Wieland J, Henriques-Coelho T, Correia-Pinto J, and Leite-Moreira AF. Myocardial dysfunction and neurohumoral activation without remodeling in left ventricle of monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 291: H1587-H1594, 2006. 13. Moreira-Gonçalves D, Henriques-Coelho T, Fonseca H, Ferreira RM, Amado F, Leite-Moreira A, and Duarte JA. Moderate exercise training provides left ventricular tolerance to acute pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 300: H1044-H1052, 2011. 14. Noordegraaf AV, and Galie N. The role of the right ventricle in pulmonary arterialhypertension. European Respiratory Review 20: 243-253, 2011. 15. Powell KE, Thompson PD, Caspersen CJ, and Kendrick JS. Physical activity and theincidence of coronary heart disease. Annu Rev Public Health 8: 253-287, 1987.

7

16. Powell KE, Thompson PD, Caspersen CJ, and Kendrick JS. Physical activity and theincidence of coronary heart disease. Annual review of public health 8: 253-287, 1987. 17. Riezzo I, De Carlo D, Neri M, Nieddu A, Turillazzi E, and Fineschi V. Heart diseaseinduced by AAS abuse, using experimental mice/rats models and the role of exercise-induced cardiotoxicity. Mini Reviews in Medicinal Chemistry 11: 409-424, 2011. 18. Scott JM, Lakoski S, Mackey JR, Douglas PS, Haykowsky MJ, and Jones LW. Thepotential role of aerobic exercise to modulate cardiotoxicity of molecularly targeted cancer therapeutics. The Oncologist 18: 221-231, 2013. 19. Takano H, Hasegawa H, Nagai T, and Komuro I. Implication of cardiac remodeling inheart failure: mechanisms and therapeutic strategies. Internal medicine (Tokyo, Japan) 42: 465, 2003.

8

9

Secção 2

Estado da Arte

10

11

1. Introdução

A Hipertensão Arterial Pulmonar é caracterizada pela redução gradativa

da capacidade funcional e da qualidade de vida dos pacientes [1]. A

remodelação obliterativa do endotélio vascular pulmonar, decorrente da

doença, e o aumento progressivo da pós-carga imposta ao ventrículo direito

culmina com a falência ventricular direita [2], podendo também o ventrículo

esquerdo ser afetado secundariamente, e manifestar disfunção ventricular

esquerda [3]. A DVE possui diferentes implicações, tanto centrais quanto

periféricas, e sua associação com a HAP exacerba o mau prognóstico do

doente [4]. Apesar dos progressos terapêuticos realizados nos últimos anos,

com melhoria clínica no prognóstico, pacientes com HAP continuam a reportar

intensa intolerância ao exercício físico agudo [5]. No entanto, a reabilitação

com exercício físico regular tem sido apontada como benéfica para estes

doentes e parece tornar-se um padrão terapêutico mais frequente em pacientes

com insuficiência cardíaca (IC) e doenças pulmonares obstrutivas [6, 7], sendo

extensamente aceito como ferramenta na promoção de um fenótipo

cardioprotetor [8-10]. Reconhecer a capacidade profilática e terapêutica do

exercício crónico contra diferentes doenças pulmonares obstrutivas [11] e nas

patologias cardiovasculares subsequentes [12], torna tentador a utilização do

treino como terapia coadjuvante para a HAP e suas consequências cardíacas.

De facto, nos últimos anos, têm surgido alguns estudos que suportam a

implementação de protocolos de exercício físico nestes doentes (153, 154).

Os mecanismos exatos responsáveis pela ação cardioprotetora do

exercício ainda permanecem parcialmente desconhecidos, assim como os

mecanismos responsáveis pela disfuncionalidade e falência ventricular

esquerda induzida pela HAP. Esta revisão bibliográfica foi estruturada para

sintetizar: i) informação relativa aos mecanismos subjacentes à DVE

secundária à HAP; ii) o potencial da aplicação do exercício físico enquanto

medida terapêutica coadjuvante e iii) refletir sobre os potenciais mediadores de

cardioproteção no contexto da DVE secundária à HAP, assim como de

compreender os mecanismos indutores da cardioproteção motivados pelo

exercício crónico.

12

2. Hipertensão Arterial Pulmonar

2.1. Etiologia

Hipertensão Pulmonar (HP) é a designação genérica que define o aumento

nos valores médios em repouso da pressão arterial pulmonar e engloba cinco

diferentes subgrupos etiológicos [13], com diferente gravidade dos sintomas e

de intolerância à atividade física [14]. A Hipertensão Arterial Pulmonar (HAP),

um dos subgrupos da HP, é definida como um aumento da pressão arterial

pulmonar em repouso superior a 25mmHg com uma pressão capilar pulmonar

inferior a 15mmHg [13]. Acomete patologicamente as pequenas artérias e

arteríolas pulmonares, motivada por um desequilíbrio entre proliferação e morte

celular, provocando a remodelação das células endoteliais e musculares lisas

vasculares, diminuindo o lúmen arterial e aumentando progressivamente a

resistência da vasculatura pulmonar [15, 16]. A remodelação obliterativa

arteriolar restringe gradualmente o fluxo sanguíneo através da circulação

pulmonar com a progressão da doença, e a manutenção da perfusão

sanguínea através destes vasos implica que ocorra aumento da pressão

arterial, caracterizando a hipertensão [17].

Da população doente diagnosticada, 80% são do sexo feminino, com idade

média de diagnóstico da doença de aproximadamente 50 anos [18]. Em 50%

da totalidade diagnosticada, a causa é idiopática, embora indícios recentes

apontem para uma forte componente genética no desenvolvimento da

patologia, mais evidente quando a HAP ocorre em contexto familiar onde as

mutações do gene BMPRII, membro da sinalização do fator de crescimento β,

responsável pela proliferação celular, são detectadas em aproximadamente

70% dos casos consanguíneos [19]. A etiologia da HAP dá-se também para

além da origem idiopática e genética, embora estas pareçam ser as derivações

mais significativas da génese da doença. A HAP pode também estar associada

(HAPA) a um número significativo de condições de riscos e ou doenças

secundárias, tais como doenças do tecido conjuntivo, doenças hepáticas, como

a hipertensão portal, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV),

exposição a toxinas e medicamentos, incluindo os supressores de apetite [20] e

também associadas a doenças cardíacas congénitas [21].

13

A HAPA é um importante subgrupo da HAP e responde por

aproximadamente 11% de todos os pacientes diagnosticados com HAP [22]. A

cada 1.000 nascimentos, 1 é diagnosticado com HAPA, sendo este grupo

possuidor do pior prognóstico clínico dos doentes acometidos por HP [23]. Os

registos europeus sugerem uma prevalência de HAPA em cerca de 4-10% dos

adultos portadores de doenças cardíacas congénitas (CHD) [22, 24]. O

subgrupo CHD-HAPA possui fisiopatologia geralmente idêntica a HAP

idiopática [7], embora apresente uma tolerância ao esforço bastante reduzida e

baixa qualidade de vida [25]. A HAPA a patologias cardíacas acarreta também

uma menor capacidade de exercício em comparação com outras formas de HP

[25], assim como mortalidade 2 vezes mais elevada se comparada a pacientes

sem doenças cardíacas associadas [26]. De facto, as características

patológicas tornam a HAP uma doença altamente mortal e que padece de

terapêuticas eficazes [4].

2.2. Fisiopatologia da IC secundária à HAP

De patologia multifatorial, a IC subsequente à HAP é resultado do contínuo

e crescente aumento da resistência vascular pulmonar imposta ao músculo

cardíaco [27]. A exposição prolongada, especificamente do VD, à sobrecarga

mecânica, resulta em remodelação cardíaca que progride para a disfunção e

insuficiência cardíaca [28]. De facto, a circulação pulmonar é um dos principais

determinantes da pós-carga ventricular direita e, portanto, influencia

diretamente o débito cardíaco do VD [29]. O aumento na resistência oferecida

pela remodelação obstrutiva que ocorre nos vasos pulmunares provoca

sobrecarga mecânica e desencadeia o processo hipertrófico no VD, permitindo

compensatoriamente o desenvolvimento de mais força pelo miocárdio [2, 30].

Inicialmente eficaz, o aumento progressivo e continuo da pós-carga segue-se

até o VD ser incapaz de compensar a resistência pulmonar e a hipertrofia

prolongada acaba por resultar em disfunção mecânica, remodelação

(dilatando-se, da forma elipsoide a esférica), disfuncionalidade e insuficiencia

[28, 31]. A vasoconstrição progressiva e a disfuncionalidade ventricular direita

parecem ser as causas centrais da IC secundária à HAP, embora sua

fisiopatologia esteja também relacionada com a disfuncionalidade e ou

14

expressão anormal dos canais de potássio (KATP) e disfunção endotelial [15]. A

disfunção endotelial, fundamentalmente, vem sendo associada à diminuição da

produção e libertação de substâncias vasodilatadoras, tais como o óxido nítrico

e as prostaciclinas, juntamente com expressão significativamente aumentada

de vasoconstritores, tais como a endotelina ET-1 [32].

2.3. Patofisiologia da DVE secundária à HAP

A sobrecarga crónica de pressão, característica da HAP, seguida da

falência ventricular direita, parecem ser os maiores contributos patológicos

para DVE e são responsáveis por desencadear uma série de maladaptações

miocárdicas [33]. Alguns estudos vem descrevendo o desenvolvimento de

insuficiência ventricular esquerda em pacientes diagnosticados com HAP [34].

A disfuncionalidade ventricular esquerda parece ser a progressão patológica

sequencial do miocárdio em virtude da interdependência funcional entre o VE e

o VD [35]. A adoção de mecanismos fisiopatológicos de adaptação ao

enchimento ventricular, prejudicado pela diminuição da fração e do volume de

ejeção do VD disfuncional [36], parece ser também um dos mecanismos que

afeta o VE e vem sendo proposto para explicar a disfuncionalidade e a

remodelação ventricular esquerda secundária a HAP.

Os mecanismos responsáveis pela consequente disfuncionalidade do VE

em resposta a HAP não são totalmente compreendidos. Alguns, como a atrofia

ventricular [4, 37], a ativação neuro-humoral [38], a inflamação e o

remodelação da matriz extracelular [39] vêm sendo propostos como peças

chaves na tentativa de explicar o declínio funcional e recorrente falência do VE.

Vital importância assume também a interdependência funcional interventricular

dentro do multifacetado cenário dos possíveis mecanismos que tem sido

propostos para explicar a disfuncionalidade do VE [40], visto que as alterações

hemodinâmicas e, especificamente, o enchimento prejudicado do VE, parece

ser a chave das maladaptações ventriculares desencadeadas [36]. De facto,

compreender estes mecanismos e suas interações, é de fundamental

importância no desenvolvimento de intervenções terapêuticas eficazes e

15

seguras para a IC secundária a HAP e parece ganhar importância no campo

científico.

2.3.1. Interdependência ventricular

A diminuição do volume de enchimento no ventrículo esquerdo está

associada às alterações funcionais e estruturais em ambos os ventrículos,

nomeadamente a alteração geométrica da cavidade ventricular esquerda. Esta

alteração estrutural parece resultar da redução do espaço da cavidade

ventricular ocasionado pelo deslocamento do septo em direção à parede do

VE, devido à hipertrofia e consequente dilatação do VD como resposta à

prolongada sobrecarga de pressão imposta pela HAP [41, 42]. A hipertrofia do

septo, somada à dilatação do VD, comprime a cavidade ventricular esquerda,

distorcendo a sua geometria, podendo assim comprometer o enchimento do VE

[43]. O enchimento ventricular esquerdo prejudicado, impõe ao miocárdio

novas exigências funcionais e a diminuição do trabalho mecânico conduz a

remodelação maladaptativa adotada pelo VE [36].

2.3.2. Atrofia ventricular esquerda

O trabalho mecânico parece desempenhar um papel fundamental na

determinação da massa cardíaca e, desta maneira, as alterações

hemodinâmicas impostas ao VE pelo seu enchimento prejudicado estão

diretamente ligados à ocorrência de atrofia do VE [44, 45]. A diminuição de

massa apresentada pelo VE secundária à HAP, pode ser explicada pela atrofia

miocitária [4, 44]. As alterações hemodinâmicas, mecânicas e as novas

exigências energéticas induzem o VE a adoptar um perfil de controle

energético e a expressar genes fetais [46]. Embora a atrofia dos cardiomiócitos

pareça ser o principal mecanismo para explicar a diminuição da massa

ventricular esquerda ao unloading, algumas vias de morte celular vêm

ganhando força como importantes mecanismos coadjuvantes na perda de

cardiomiócitos e na progressão do declínio da função ventricular esquerda [47,

48]. Três principais vias de degradação celular vêm sendo destacadas como

16

mecanismos auxiliares responsáveis pela resposta atrófica do VE ao

enchimento prejudicado: 1) o sistema de calpaínas dependente de cálcio, 2) a

autofagia e 3) o sistema ubiquitina-proteassoma [49]. Apesar das evidências,

as vias responsáveis pela degradação proteica no tecido cardíaco ainda não

são totalmente claras e estudá-las é fundamental no entendimento da

remodelação atrófica do VE como resposta ao enchimento prejudicado.

2.3.3. Ativação neuro-humoral

A sobrecarga de pressão e as alterações hemodinâmicas são factores

fundamentais para a perturbação da homeostasia bioquímica e fisiologia dos

cardiomiócitos e da função miocárdica [50]. Logo, a estimulação neuro-humoral

e as concentrações elevadas de mediadores neuro-endócrinos encontrados no

VE, no VD e nos pulmões, podem contribuir para explicar a disfunção cardíaca

[38]. A ativação neuro-humoral parece ser de responsabilidade de uma série de

fatores, como a interdependência e a influência ventricular direita [40], a

estimulação do sistema nervoso simpático [51] e dos mediadores neuro-

endócrinos, como o aumento na produção de angiotensina [52], ambos

indutores da estimulação neuro-humoral e da expressão gênica de ET-1 no

miocárdio.

Os mediadores neuro-endócrinos tem sido implicados não apenas na

fisiopatologia da IC e na gravidade clínica da HAP [53], como também na

funcionalidade cardíaca [54, 55]. Particularmente a ET-1 vem sendo estudada

como principal contribuinte neuro-humoral para as alterações cardiopulmonares

em HAP induzida pela monocrotalina (MCT) [56]. Aumentos significativos na

circulação de ET-1 têm sido observados em modelos experimentais de

insuficiência cardíaca, incluindo o modelo de HAP [57]. Produzida e liberada

localmente (mas não só) pelos cardiomiócitos quando sobreacarregados [58], a

ET-1 possui importantes efeitos cardíacos e parece estar envolvido na

regulação da contractilidade e do relaxamento no miocárdio [59]. A ET-1

influencia o movimento e a concentração iónica intracelular de Ca2+ e também

vem sendo implicada na modificação miofibrilar das isoformas de miosina de

cadeia pesada [60-62]. Estas isoformas condicionam o tempo dos ciclos

17

cardíacos sistólicos e diastólicos, através da velocidade no estabelecimento

das pontes cruzadas com os filamentos de actina no miocárdio [62]. O

favorecimento na expressão da cadeia β parece ser um importante contributo

na disfuncionalidade ventricular esquerda, visto que está atrelada a ciclos mais

lentos de contractilidade das fibras musculares cardíacas [62].

2.3.4. Remodelação da matriz extracelular

A matriz extracelular (MEC) é fundamental na manutenção estrutural e

geométrica do coração [63, 64]. O fibroblasto é responsável pela síntese da

MEC e a interação fibroblasto / MEC parece ser regulada por múltiplas vias,

incluindo as integrinas e canais iónicos [65, 66]. As alterações hemodinâmicas,

a estimulação dos factores neuro-humorais e o aumento das citocinas, do

stress oxidativo e mecânico parecem ser os principais mecanismos que

desencadeiam o processo de adaptação e de remodelação da MEC no coração

[67]. O processo de remodelação maladaptativa do músculo cardíaco está

associado ao aumento da deposição de colagénio e fibrose. Factores neuro-

humorais como a ET-1, a angiotensina e a aldosterona podem também estar

vinculadas ao processo de aumento de fibrose ventricular [68, 69]. De facto, a

ET-1, através dos receptores ETA, ativa a expressão do factor de crescimento

TGF-β (principal ativador dos fibroblastos) [69]. Durante a resposta inflamatória,

mediadorores como NF-kB também são ativados, participando da estimulação

fibroblástica [70]. O aumento nos níveis circulantes destas citocinas

inflamatórias também tem sido relacionados diretamente com a queda de

desempenho cardíaco [71, 72]. A morte celular, especificamente a

apoptose/necrose miocitária, vem sendo documentada em quadros de IC

avançada [73], factor sabidamente contribuidor para o aumento na deposição

fibrótica da MEC. O aumento da fibrose na MEC afeta diretamente a

funcionalidade cardíaca através do aumento na rigidez ventricular esquerda [9,

38, 69] com disfunção diastólica [74]. Embora os exactos mecanismos

moleculares subjacentes à disfunção diastólica sejam mal compreendidos, a

fibrose é apontada como um importante contributo para a sua progressão.

Notadamente, o aumento da atividade de citocinas inflamatórias e acúmulo de

18

proteínas na MEC parecem ser as principais características da maioria das

doenças fibróticas [75]. Desta maneira, o factor de crescimento TGF-β, uma

citocina pró-fibrotica, atua sinergeticamente com factor de crescimento do

tecido conjuntivo (CTGF), promovendo a proliferação de fibroblastos e a

deposição de colagénio e de fibronectina [76].

2.4. DVE induzida pela monocrotalina

A MCT é uma fitotoxina alcalóide derivada de plantas do género

Crotalaria Spectabilis [77] sendo largamente utilizada na indução de HAP em

modelos animais, incluindo em ratos [78]. Apesar de não ser totalmente

compreendido, sabe-se que a metabolização do alcalóide bruto é feita pelo

fígado, sendo convertido no electrófilo ativo, monocrotalina pirrole (MCTP) [79].

O mecanismo de ativação da MCTP é altamente dependente dos citocromos

hepáticos e acontece especificamente no citocromo P-450 [80, 81]. Este

derivado electrofílico é caracterizado pela alta reatividade patológica e por ter

um tempo de semi-vida muito curto, de aproximadamente 3 a 4 segundos se

em ambientes aquosos e com pH próximos da neutralidade [82, 83]. A sua

seletividade de ação pelos pulmões, finalidade de sua utilização em modelos

de indução de HAP, pode ser explicada pela combinação da curta semi-vida

deste derivado e pela proximidade circulatória entre o fígado e árvore vascular

dos pulmões [84]. Seu transporte na corrente sanguínea está associada aos

eritrócitos que estabilizam a alta reatividade molecular e facilitam o transporte

até ao local alvo [85] que, no contexto da HP, é o endotélio pulmonar.

Apesar da sua seletividade pelo endotélio pulmonar, sabe-se que que a

MCT também possui efeito neurotóxico [86] e hepatotóxico [87]. De notar que a

forma mais agressiva de hipertensão pulmonar em modelos animais é

provocada pela administração via injeção do alcalóide bruto ou ativo, e

modelos estabelecidos na indução de HAP incluem aplicação subcutânea ou

intraperitoneal de MCT ou MCTP [88, 89]. Logo após sua administração,

seguem-se alterações progressivas na estrutura das paredes dos vasos

pulmonares que incluem espessamento da camada média dos vasos por

hiperplasia das células do músculo liso e por aumento na matriz extracelular

19

vascular [78]. A lesão endotelial da vasculatura pulmonar, com subsequente

remodelação obliterativa arteriolar provoca o aumento progressivo da pressão

intrapulmonar [90], hipertrofia ventricular direita devido a sobrecarga mecânica

e posterior falência [91]. De facto, diferentes trabalhos também vêm

comprovando que o modelo de HAP induzida por MCT conduz a remodelação

e disfuncionalidade ventricular esquerda [3, 92, 93] e apesar de nenhum

modelo experimental ser capaz de reproduzir completamente as alterações

histopatológicas da HAP em humanos [94], o modelo de HAP induzido por

MCT parece ser o que mais se aproxima das alterações induzidas pela HP,

principalmente em relação a insuficiência cardíaca humana [95]. Baseando-se

nas atuais evidências sobre cardioproteção e exercício, o modelo parece ser a

opção adequada para compreender a interação entre exercício e IC direita,

seus benefícios, malefícios e limitações, notadamente na disfuncionalidade

ventricular esquerda acompanhada de remodelação [67], atrofia [4] e

alterações do equilíbrio neuro-humoral [96]. Embora amplamente utilizado, o

modelo sofre algumas criticas devido à toxicidade hepática e nervosa. Os

baixos custos, a facilidade de execução e de reprodutibilidade assim como a

pouca invasividade [77], tornam o modelo animal de HAP induzido por MCT

uma excelente ferramenta para desenvolver novas e coadjuvantes estratégias

terapêuticas para insuficiência cardíaca direita e a disfuncionalidade ventricular

esquerda.

3. Exercício físico regular e cardioproteção

A capacidade do exercício físico regular em proteger o miocárdio contra

diferentes patologias cardiovasculares é amplamente aceite e possui

sustentação em inúmeros estudos [9, 10, 97, 98]. Embora seja evidente a

capacidade do exercício em promover um fenótipo cardioprotetor, os

mecanismos exatos para explicar o fenótipo induzido pelo exercício

permanecem em parte desconhecidos. As atuais evidências deixam claro que o

exercício físico regular reduz os danos oxidativos e melhora a funcionalidade

como demonstram diferentes modelos de insultos cardíacos como o de

isquemia-reperfusão do miocárdio [99].

20

3.1. Cardioproteção e exercício físico regular: potenciais

mecanismos

De facto, potenciais mecanismos para explicar os efeitos crónicos

cardioprotetores do exercício físico regular têm sido destacados e recebido

maior atenção na tentativa de compreender o complexo fenótipo cardioprotetor.

Apesar desta rede intrincada de mecanismos ser desconhecida, a atuação anti-

inflamatória [100], anti-fibrótica [101] e anti-oxidante [102] vem ganhando

destaque dentro das principais contribuições crónicas do exercício, assim como

a modulação neuro-humoral [103] e a melhoria da contratilidade miocárdica

[104]. Estes e outros mecanismos estão sendo desvendados, podendo possuir

importantes papéis no processo cardioprotetor induzido pelo exercício.

Compreender com exatidão a base molecular destes mecanismos

cardioprotetores é fundamental para a utilização do exercício como ferramenta

terapêutica complementar ou como terapia alternativa aos tratamentos

farmacológicos de cardiopatias.

3.1.1. Efeito antioxidante do exercício físico regular

Entre os diferentes mecanismos responsáveis pela cardioproteção

induzida pelo treino físico (TF), a redução do stress oxidativo miocárdico [102,

105] tem sido apontada entre os mais importantes. Esta redução pode resultar

do aumento de expressão e funcionalidade das defesas antioxidantes e/ou

através da redução da produção de compostos pro-oxidantes pela fosforilação

oxidativa [106, 107]. Estas espécies reactivas, em especial as de oxigénio,

podem interagir com qualquer tipo de molécula orgânica, modificando a sua

estrutura e comprometendo a sua funcionalidade [106]. Numerosos estudos

indicam que tanto a curto prazo (dias) quanto a longo prazo (semanas a

meses) o TF promove um acréscimo da capacidade antioxidante do miocárdio

[109], através do aumento de importantes enzimas antioxidantes como a

superóxido dismutase de manganês (MnSOD) [102, 105, 110], glutationa

peroxidase [109, 111], e catalase [109, 111].

21

3.1.2. Efeito anti-inflamatório do exercício físico regular

A resposta inflamatória é reconhecida como um importante fator da

fisiopatologia da IC [112]. Elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias

circulantes, principalmente o factor de necrose tumoral (TNF-α) e a interleucina

(IL-6) [100, 113], são encontrados na IC. A ativação de citocinas inflamatórias

pode ter uma influência negativa na funcionalidade miocárdica, principalmente

na contratilidade do miocárdio, induzindo ativação de óxido nítrico sintase

induzida (iNOS), aumentando o stresse oxidativo celular e tecidual, inibindo a

liberação sarcoplasmática de Ca2+ e a expressão de fosfolambam (PLN),

promovendo a apoptose dos miócitos e a remodelação maladaptativa cardíaca

[114, 115]. O aumento da produção de citocinas circulantes pode também

conduzir a disfunção endotelial através do aumento da produção de espécies

reativas de oxigénio, seguindo-se da apoptose das células endoteliais [116].

Níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias também possuem um efeito

prejudicial sobre o metabolismo e a contratilidade do músculo esquelético,

promovendo o stress oxidativo e apoptose celular esquelética e

comprometimento do metabolismo aeróbico [117, 118]. Níveis continuamente

elevados de citocinas circulantes podem potencializar e induzir o catabolismo

muscular esquelético e possível emagrecimento [119]. O efeito anti-inflamatório

do TF consiste principalmente em aumentar os níveis plasmáticos da citocina

anti-inflamatória IL-10 [120] e atuando sobre o sistema imunitário, influenciando

a função de macrófagos e linfócitos [121]. Em humanos, o TF intenso pode

reduzir os níveis plasmáticos de citocinas inflamatórias e marcadores

periféricos da disfunção endotelial como as moléculas de adesão intercelular

(CAM’s) e vascular (VCAM) [122]. O TF também reduz a expressão de

citocinas pró-inflamatórias e iNOS no músculo esquelético, com o aumento da

atividade do citocromo c e melhoria do metabolismo oxidativo muscular [123].

Portanto, O TF pode, ser considerado como uma relevante estratégia

terapêutica anti-inflamatória para os pacientes com IC.

22

3.1.3. Efeito anti-neuro-humoral do exercício físico regular

Diferentes modelos experimentais de IC vêm demonstrando que o TF

reduz os níveis plasmáticos de Angiotensina II assim como atenua a atividade

simpática e normaliza o barorreflexo [124, 125], importantes mecanismos

autonómicos presentes na IC. O exercício regular também exerce efeitos

benéficos no sistema nervoso central, incluindo uma redução da concentração

de receptores de Angiotensina II [124], redução de expressão de NADPH e

supra-regulação de expressão de superóxido dismutase [126]. O treinamento

físico é associado com a reversão da disfunção autonómica em pacientes com

IC, induzindo uma importante mudança da atividade simpática [127]. De facto,

diferentes protocolos de TF parecem estar associados a redução da atividade

simpática, como mostrado pela redução na atividade nervosa simpática

muscular em modelos experimentais [128]. O TF em pacientes com IC é

responsável pelo aumento do tónus parassimpático, como demonstrado por um

aumento na oscilação da frequência cardíaca em alguns estudos [129, 130],

podendo também reduzir os níveis locais e circulantes de neuro-hormônios,

incluindo Angiotensina II, aldosterona, vasopressina e peptídeos natriuréticos

[103, 131]. As atuais evidências sustentam o efeito anti-neuro-humoral do TF,

modulando os efeitos deletérios da ativação neuro-humoral prolongada em

pacientes com IC, resultando em melhora da função cardíaca, redução da

vasoconstrição com melhoria da perfusão sanguínea periférica e esquelética e,

consequentemente, melhoria da tolerância ao exercício. Estes resultados

demonstram que o treinamento físico pode reduzir cronicamente a excitação

simpática através da modulação de mecanismos centrais e periféricos com seu

efeito anti-neuro-humoral, importante fisiopatologia da IC [132].

3.1.4. Melhoria funcional miocárdica induzida pelo

exercício físico regular

A tolerância ao exercício é um dos mais importantes indicadores de

funcionalidade cardiovascular, visto que reflete a capacidade do coração em

corresponder ao aumento periférico de exigência de oxigênio [133]. De facto,

não se sabe exatamente quais os mecanismos moleculares adaptativos

23

responsáveis pelo aumento funcional do miocárdio mas sabe-se que os canais

de potássio sensível ao ATP (KATP) são os maiores responsáveis pelo reajuste

excitatório da membrana cardíaca em resposta a alterações dos níveis de ADP

e ATP [134-136]. Ativado pela redução dos níveis de ATP e pelo aumento da

concentração de ADP devido o aumento da demanda metabólica celular, o

KATP reduz a amplitude dos potenciais de ação cardíacos [134, 137] através do

fluxo celular de potássio e sódio, reduzindo os requisitos de energia para a

contração e prolongando também o intervalo diastólico, necessário para

reestabelecer os recursos energéticos do miocárdio [104, 134, 138, 139].

Desta maneira, os canais KATP cardíacos parecem desempenhar um

fundamental papel na cardioproteção em resposta a patologias indutoras de

disfuncionalidade miocárdica e, de facto, tem-se comprovado a capacidade do

exercício em aumentar a expressão de canais de KATP melhorando a

velocidade de encurtamento muscular cardíaco e optimizando o consumo de

energia sob condições de maior exigência funcional. Baseado nas evidencias,

a expressão aumentada de canais de KATP induzido pelo exercício torna este

mecanismo essencial no contexto da cardioproteção [140] visto que a abertura

de apenas 1 % de canais KATP é suficiente para causar significativa alteração

no ciclo cardíaco [134, 141].

4. Treino físico e HAP

A interação positiva entre exercício físico e a HAP começa a ser

descoberta e entendida. Sabidamente, pacientes acometidos com HAP

possuem graves limitações ao exercício agudo [142] e entender os

mecanismos de atuação parece ser o caminho para desenvolver uma

terapêutica adequada e eficiente através do exercício. A limitação ao esforço

físico tem sido caracterizada principalmente por dois importantes sintomas

clínicos, a dispneia e a fadiga, e parece acometer estes pacientes mesmo com

cargas bastante baixas de trabalho [142, 143]. Os mecanismos propostos para

explicar tais sintomas baseiam-se principalmente na hipoperfusão sanguínea e

debilidade muscular periférica, característica dos pacientes com hipertensão

pulmonar [143, 144]. Vários estudos têm demonstrado alterações morfológicas

24

e funcionais significativas na musculatura esquelética, parecendo estar

relacionadas com a diminuição do transporte de oxigênio [144-146] e com a

presença de citocinas pro-inflamatórias [155]. Alterações como a atrofia

muscular, redução de enzimas oxidativas e aumento da proporção de fibras

musculares do tipo II parecem favorecer o aparecimento precoce da acidose

láctica e reduzir a capacidade aeróbia [11, 145]. A contribuição da patologia

muscular esquelética no agravamento clínico destes pacientes justificou então

o papel do exercício físico na HAP [147].

A utilização terapêutica do exercício físico regular na hipertensão arterial

pulmonar parece seguir uma tendência semelhante à usada na reabilitação da

insuficiência cardíaca congestiva em meados dos anos 80. Naquela época, os

pacientes com IC foram excluídos de qualquer forma de exercício físico, uma

vez que se acreditava ser prejudicial para a sua condição clínica [148]. A

mudança de paradigma aconteceu juntamente com as novas evidências

científicas e o treinamento físico agora vem estabelecendo-se como importante

ferramenta terapêutica e ganhando importância no cenário científico. De facto,

atualmente sabe-se que o exercício físico regular atua beneficamente na HAP

modulando positivamente os seus principais mecanismos fisiopatológicos, não

contribuindo para o agravamento da remodelação vascular pulmonar e para a

insuficiência cardíaca direita, antigo temor na prescrição de exercícios,

melhorando a capacidade cardiorespiratória e funcional, bem como a qualidade

de vida destes pacientes [11, 149-152], todos significativamente afetados pela

HAP. Atualmente, a Sociedade Torácica Britânica (British Thoracic Society) e a

Sociedade Europeia de Cardiologia recomendam que pacientes com HAP

devem permanecer tão ativos quanto seus sintomas permitirem, sendo

aceitável uma leve falta de ar [6, 7], ratificando de facto a mudança de

paradigma na terapia da HAP.

Nos últimos anos, diferentes estudos sobre treinamento físico em

populações com HAP tem sido desenvolvidos [11, 153, 154]. Nos estudos

reportados, foram recrutados indivíduos com HAP idiopática ou hipertensão

pulmonar tromboembólica crónica, clinicamente estabilizados com tratamento

médico. O regime de exercício físico nestes estudos variaram em termos da

frequência semanal (3 a 7 dia/semana), de duração (7 a 15 semanas) e

25

modalidades de exercício. Os tipos de exercícios realizados incluíram bicicleta

ergométrica, caminhada, treinamento muscular periférico, exercícios de

respiração, exercícios para os membros superiores, yoga e condicionamento

mental. Todos os três estudos demonstraram melhorias significativas na

tolerância ao exercício físico, medida através do aumento na distância de

caminhada de 6 minutos (6MWT) [153] ou no tempo de resistência em bicicleta

ergométrica [11]. De notar que, apesar da grande variedade de modalidades

utilizada, eventos adversos não foram relatados em qualquer dos estudos,

sendo reportada melhoria na qualidade de vida destes indivíduos [153]. Estes

resultados juntam-se a um corpo crescente de evidências que vem sendo

produzido que estabelecem os efeitos benéficos do exercício nesta população

e que, apesar dos recentes avanços nas terapias farmacológicas, os mesmos

resultados não são apresentados por muitos pacientes que estão estabilizados

apenas com terapia farmacológica, que continuam a apresentar significativa

limitação ao exercício, baixa qualidade de vida e altos índices de mortalidade

[5], tornando a contribuição do exercício físico regular ainda mais significativa

na busca de terapias para a HAP.

5. Conclusão

Apesar dos mecanismos responsáveis pelo fenótipo cardioprotetor não

serem claros e completamente conhecidos, o reconhecimento que o exercício

físico regular é capaz de fornecer tal benefício é amplamente aceito e

comprovado contra diferentes insultos cardíacos. Seu benefícios no contexto

da IC induzida pela HAP ainda necessitam maior investigação, visto que sua

interação com exercício pode variar de acordo a intensidade, volume e tipo de

protocolo de treino proposto. Adicionalmente, do ponto de vista estrutural e

funcional cardíaco, ainda pouco se sabe sobre o impacto do exercício físico,

quer sobre o VD quer sobre o VE, tendo sido nesse contexto que surgiu o

interesse na realização do presente estudo.

26

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155. Van Tassell, B.W., et al., Enhanced Interleukin-1 Activity Contributes to Exercise Intolerance in Patients with Systolic Heart Failure. Plos One, 2012. 7(3).

35

Secção 3

Artigo Experimental

37

Efeito protetor do exercício físico regular na remodelação

ventricular esquerda secundária à hipertensão arterial

pulmonar induzida pela Monocrotalina

Resumo

Introdução: O exercício físico é uma ferramenta terapêutica amplamente aceite e implementada nos protocolos de reabilitação cardíaca de doentes com insuficiência cardíaca (IC) esquerda de diferentes etiologias. Contudo, pouco ou nada se sabe sobre o impacto do exercicio físico na função ventricular esquerda de doentes com Hipertensão Pulmonar Arterial (HPA). Para além de sobrecarregar seletivamente o ventrículo direito (VD), existem evidencias de que as consequências deletéreas da HPA também se estendem ao ventrículo esquerdo (VE), estando estas ainda pouco esclarecidas. Assim sendo, o objetivo deste estudo foi avaliar o possível impacto protetor do exercício físico crónico (EFC) na disfunção do VE secundária àHAP induzida pela Monocrotalina (MCT). Material e Métodos: O estudo foi dividido em três fases. Na primeira fase, 60 ratos machos Wistar foram aleatoriamente separados nos seguintes grupos: i) sedentários ou exercitados tratados com MCT (SED+MCT (n=25) e EX+MCT (n=15), respectivamente; 60mg/kg), e ii) sedentários ou exercitados tratados com solução veículo (SED+V e EX+V, respectivamente; n=10/grupo; 1mL/kg de solução salina). Após a administração de MCT ou V, os animais do grupo EX+MCT e EX+V foram submetidos a um protocolo de treino (corrida sobre tapete rolante, 5 dias/semana, 60 min/dia a 25m/min, durante 4 semanas) enquanto os animais do grupo SED+MCT e SED+V permaneceram com movimentação confinada ao espaço da gaiola durante 4 semanas. Após terminarem os respectivos protocolos, os animais foram preparados para avaliação hemodinâmica em condições basais e isovolumétricas. De seguida foram sacrificados e amostras de VE foram colhidas e preparadas para análise de microscopia de luz (área da seção transversal dos cardiomiócitos e deposição de colágeno) e biologia molecular (mRNA de endotelina-1). A segunda fase consistiu na avaliação ecocardiográfica e da tolerância ao exercício, para o qual foram incluidos mais 15 animais, divididos pelo grupo SED+V (n=5), SED+MCT (n=5) e EX+MCT (n=5). A terceira fase do estudo consistiu avaliação da taxa de sobrevivência, com 40 animais a serem submetidos aos respectivos protocolos experimentais (SED+V, n=5; SED+MCT, n=15; EX+V, n=5; EX+MCT, n=15). Resultados: Em condições basais foi observada disfunção sistólica (diminuição da pressão sistólica máxima e dp/dt máx) e diastólica (diminuição do dp/dt min e aumento do Tau) no grupo SED+MCT (P<0.05), sendo essas alterações prevenidas pelo exercício no grupo EX+MCT. Em resposta à oclusão da artéria aorta, enquanto o grupo SED+MCT apresentou alterações apenas nos parametros diastólicos (P<0.05), o grupo EX+MCT respondeu positivamente, sem apresentar indícios de disfunção. EX+MCT também apresentou reversão da atrofia miocitária e da fibrose intersticial encontrados em SED+MCT, assim como a normalização do nível ventricular de ET-1 (P<0.05). Contrariamente aos animais SED+MCT, os animais do grupo EX+MCT apresentaram melhoria da performance no teste de esforço bem como melhoria da sobrevida. Conclusão: Estes resultados suportam a hipótese de que o treino físico pode ter um papel protetor e terapêutico fundamental na modulação da resposta ventricular esquerda secundária à HPA.

Palavras-chave: cardioproteção, treino físico, disfunção ventricular esquerda, hipertensão arterial pulmonar, colagénio, endotelina-1.

38

Introdução

A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença de fisiopatologia

bastante complexa e de rápida progressão, associada a uma elevada taxa de

mortalidade atribuida ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca direita (ICD)

(39). Evidencias experimentais têm mostrado que abordagens terapeuticas

direcionadas especificamente para o VD tem um impacto positivo na melhoria

da função cardíaca, na prevenção da remodelação maladaptativa e na

sobrevida (15, 16, 23, 24, 37, 48). Curiosamente, foi demonstrado em humanos

bem como em animais, que a função ventricular esquerda também sofre

alterações secundária à HAP, contribuindo assim, também, para aumentar a

complexidade desta doença (21). Apesar de menos compreendido do que o

VD, alguns estudos sugerem que a interdependência ventricular seja o principal

mecanismo das adaptações deletérias observadas no VE (12, 53). Mais

recentemente, outras alterações, nomeadamente a activação neuro-humoral

(29), a atrofia ventricular (12), a remodelação da matriz extracelular (53) e

alterações intrínsecas aos cardiomiócitos (10, 38), têm sido implicadas na

etiologia da disfunção ventricular esquerda secundária à HAP (36). Assim

sendo, e dada a diversidade de mecanismos envolvidos, é fundamental

encontrar uma opção terapeutica capaz de modelar múltiplos alvos

terapeuticos, simultaneamente.

Neste contexto, o exercício físico crónico (EXC) assume-se como um

forte candidato. Possui benefícios que são amplamente reconhecidos devido

ao seu efeito modulador do risco cardiovascular, prevenindo o desenvolvimento

de doenças cardíacas e proporcionando um fenótipo cardioprotetor (46, 54). O

EXC tornou-se um aliado eficaz e seguro não apenas na prevenção, mas

também enquanto ferramenta terapêupica de cardiopatias, incluindo as que

culminam com a disfunção e a decorrente insufuciência cardíaca (IC),

melhorando o prognóstico e a qualidade de vida destes doentes (29). No

contexto da HAP, contrariamente ao que se pensava (18), hoje sabe-se que o

exercicio físico pode ter um efeito benéfico, não agravando a remodelação

arterial pulmonar ou a insufuciência cardíca direita, melhorando a capacidade

39

cardiorespiratória e funcional, bem como a qualidade de vida destes pacientes

(2, 3, 9, 11, 40). Apesar de ainda pouco esclarecido, este efeito protetor do

exercício tem sido relacionado com a sua ação anti-inflamatória (35, 42), anti-

neurohumoral (7, 43) e anti-oxidante (20, 45), como mecanismos de vital

importância na cardioproteção. Considerando que estas vias estão presentes

na HAP, é possível que o exercício fisico exerça um efeito modulador sobre as

mesmas, podendo então culminar com melhorias ao nível funcional, estrutural

e molecular.

Tendo em conta este racional, o objectivo do presente estudo foi o de

analisar os possíveis efeitos protectores do treino no VE no desenvolvimento

da IC no modelo animal de HAP induzida por MCT.

Material e métodos

O presente trabalho foi realizado em 3 fases que serão apresentadas

separadamente de modo a facilitar a compreensão do desenho experimental

do estudo.

Fase 1

Modelo animal e desenho experimental

Os procedimentos experimentais envolvendo cuidados com os animais e

seu sacrifício foram realizadas de acordo com a lei Portuguesa de bem-estar e

especificações do Instituto Nacional de Saúde (INS) Guia para o Cuidado e

Uso de Animais de Laboratório, aprovado pelo comitê de ética local,

(Universidade do Porto). Depois de uma semana de quarentena, 50 ratos

Wistar machos (4 semanas de idade, Charles River Laboratories, Barcelona),

foram alojados em grupos de 5 ratos por gaiola, mantidos num ciclo de luz /

escuro de 12h invertido, num ambiente controlado com temperatura de 22° C,

com livre acesso a comida. Logo após, foram aleatoriamente separados nos

seguintes grupos: i) sedentários ou exercitados tratados com monocrotalina

40

(SED+MCT (n=25) e EX+MCT (n=15), respectivamente; 60mg/kg, sc.; Sigma),

e ii) sedentários ou exercitados tratados com solução veículo (SED+V e EX+V,

respectivamente; n=10/grupo; 1mL/kg de solução salina). Após a administração

de MCT ou solução veículo, os animais dos grupos EX foram submetidos a um

protocolo de treino de corrida durante 4 semanas, enquanto que os animais

dos grupos SED permaneceram sedentários durante esse mesmo período de

tempo.

Protocolo de treino: Inicialmente, os animais foram aclimatados ao

tapete durante uma semana, onde a velocidade e a duração do exercício foram

gradualmente aumentando até os animais atingirem 60 min/sessão, à

velocidade de 25 metros/minuto, correspondendo a uma taxa de consumo

máximo de oxigénio estimada de 70% (33). Apó a aclimatação, os animais

treinaram durante 4 semanas, 5 dias por semana, 60 minutos/dia, a 25

metros/minuto.

Avaliação hemodinâmica

Procedimento: Após cumprirem as 4 semanas de protocolo (28º- 29º dia

após adminstração de MCT ou solução veículo), os animais foram preparados

para avaliação hemodinâmica ventricular esquerda. Os animais foram

anestesiados por inalação de uma mistura de 4% de sevoflurano com oxigénio,

entubados para ventilação mecânica (frequência respiratória de 100 ciclos/min

e volume de ar corrente de 1 mL/100 gr; Harvard VentilatorModel Small Animal

683) e colocados sobre uma placa de aquecimento para manter a temperatura

coporal nos 37ºC. A anestesia foi mantida com sevoflurano de 2,5-3%, ajustado

de acordo com reflexo no dedo do pé. A veia jugular direita foi canulada para

administração de fluido pré-aquecido (NaCl a 0,9%), para compensar as perdas

de fluido peri-operatórios. Foi realizada esternotomia mediana para expor o

coração e o pericárdio foi removido. Um cateter de pressão-volume (SPR-838,

Millar Instruments) foi inserido por punção apical no interior da cavidade do VE

e colocado ao longo do seu eixo longitudinal. O cateter foi conectado com o

sistema de condutancia MVP-300 (Millar Instruments), acoplado ao conversor

PowerLab 16/30 (AD Instruments) e a um computador para aquisição de

41

dados. Após a conclusão da preparação experimental, os animais foram

deixados a estabilizar durante 15 min. Os registos hemodinâmicos foram feitos

com a ventilação suspensa no final da expiração, em condições basais ou em

condições de stress hemodinamico induzido pela oclusão abrupta da artéria

aorta acendente (ciclos isovolumetricos). Os parâmetros obtidos pelo cateter de

condutância foram gravados à velocidade de 1000 Hz, a fim de captar os dados

provenientes dos ciclos cardíacos mais rápidos. Por fim, os dados foram

armazenados e analisados com software de aquisição e análise de dados de

condutância Millar (PVAN3.5).

Parâmetros hemodinâmicos avaliados: Foram avaliados os seguintes

parâmetros hemodinamicos: frequência cardíaca (FC), pressão sistólica

máxima (PVEmáx), velocidade máxima de elevação (dP/dtmax) e queda (dP/dt

min) de pressão e velocidade de relaxamento determinada pela constante de

tempo Tau.

Sacrifício dos animais e recolha tecidual

Imediatamente após a avaliação hemodinâmica, os animais foram

eutanaziados por exsanguinamento, sendo o coração excisado e pesado.

Procedeu-se à separação do ventrículo esquerdo juntamente com o septo

(VE+S) e respetiva pesagem. Tanto o peso do coração quanto do VE+S foram

normalizados com o comprimento da tíbia (VE+S/T) e o peso corporal

(VE+S/PC). Sequencialmente, o VE foi separado do septo e seccionado em

amostras para análise, por microscopia de óptica (MO), da área de secção

transversa dos cardiomiócitos (AST) e da deposição de colagénio intersticial.

Amostras de VE foram também imediatamente congeladas a -80ºC para

posterior quantificação de mRNA de ET-1 por RT-PCR de acordo com

procedimentos que serão descritos posteriormente. O músculo gastrocnémio

direito foi colhido e pesado.

42

Análise histológica

O vértice do ventrículo esquerdo foi fixado com paraformaldeído 4%,

PBS 0,1 M, pH 7,2-7,4, com 2,5% de sacarose e glutaraldeído 0,1%, durante

24 horas, posteriormente desidratado em etanol, fixadas com xilol e embebidos

em parafina de acordo com procedimentos histológicos habituais. Após

embebição em parafina, seções destes tecidos processados foram cortados em

peças de aproximadamente 5 μm de espessura (Leica Microsystems, modelo

M2125) e montados em lâminas com revestimento de silano (Sigma, S4651-

72EA). Em seguida, foram colocadas durante aproximadamente 48 horas em

estufa com temperatura média de 35ºC para promover maior adesão do tecido

à lâmina. Após desparafinação em xilol e hidratação com etanol, as lâminas

foram coradas com hematoxilina e eosina seguindo os procedimentos

habituais. Para a quantificação do colagénio total utilizou-se um protocolo de

coloração com Sirius Red (0,5g/500ml de solução aquosa saturada de ácido

pícrico). Após contacto com solução de Sirius Red por aproximadamente duas

horas as lâminas foram lavadas em duas mudanças de água acidificada (5%

ácido acético) e posteriormente removido o excesso de água por agitação

vigorosa da lâmina. Logo após, os tecidos foram desidratados em três

mudanças de etanol a 100% e posteriormente colocados em xilol e, finalmente,

preparados em lamelas com DPX. Para análise morfológica dos cortes

transversais dos ventrículos, as lâminas coradas com hematoxilina e eosina ou

com Sirius Red foram fotografadas em microscópio óptico (Carl Zeiss) com a

objetiva de 40x. As fotografias foram digitalizadas e analisadas com o software

NIH ImageJ (Image Processing and Analysis in Java, USA). Foram

contabilizadas para área de secção transversa apenas cardiomiócitos

arredondados com núcleo centralmente localizado. Para cada grupo foram

contabilizadas as áreas de aproximadamente 968 cardiomiócitos. Para

quantificação do colagénio total foi utilizado o software Image Pro Plus 6. Para

cada coração processado foram contabilizados 10 fotografias, totalizando

aproximadamente 50 fotografias por grupo. A percentagem da área total

ocupada por colagênio foi mensurada através da quantificação da cores

designadas no software para a diferenciação entre colagénio, espaço

intersticial e fibra muscular.

43

Quantificação relativa de mRNA da endotelina-1

O mRNA total foi extraído de amostras do VE e procedeu-se à sua

quantificação relativa por transcrição reversa e reação em cadeia da

polimerase em tempo–real (Real-Time RT-PCR; Lightcycler-II, Roche) como

descrito previamente (10, 24, 25). O GAPDH foi usado como controlo interno e

os resultados são relativos às médias obtidas no grupo SED+V normalizadas

para o GAPDH, apresentados como número de vezes acima ou abaixo do

SED+V. Os pares de sondas (Tabela 1) foram concebidos com software

(DNAstarTM).

Fase 2

Para a realização do teste de tolerância ao esforço e avaliação

ecocardiográfica, um grupo adicional de 15 animais foi distribuido pelos grupos

SED+V (n=5), SED+MCT (n=5) e EX+MCT (n=5) e submetido aos respectivos

protocolos experimentais, anteriormente descritos.

Ecocardiograma

Quatro semanas após a injeção de MCT, os animais foram preparados

para avaliação ecocardiografica. A ecocardiografia transtorácica modo M,

bidimensional e Doppler foi realizada com um aparelho de ultrassom

(SequoiaAccuson C512), com um transdutor linear cardíaco de 15MHz. Os

ratos foram anestesiados por inalação de uma mistura de 4% de sevoflurano

com oxigénio, entubados para ventilação mecânica (frequência respiratória de

100 ciclos/min e volume de ar corrente de 1 mL/100 gr; Harvard

VentilatorModel Small Animal 683) e colocados sobre uma placa de

aquecimento para manter a temperatura coporal nos 37ºC. No plano

paraesternal foram obtidas imagens em modo M ao nível dos músculos

papilares para medições do septo interventricular (IVS), do diâmetro interno do

ventrículo esquerdo (LVID) e da parede livre do ventrículo esquerdo (LVFW)

em diástole (d) e emsístole (s). A massa ventricular esquerda (MVE) foi

44

determinada de acordo com a American Society ofEchocardiography guidelines

0.8{1.04[([LVIDd + IVSd+LVFWd]3 - LVIDd3)]} + 0.6. O índice de

excentricidade do ventrículo esquerdo foi definido como a razão entre o

comprimento de dois diâmetros perpendiculares do eixo menor, um dos quais

perpendicular ao septo interventricular, obtido no final da diástole (não medido

em sístole tal como já é conhecido que estamos a lidar com um modelo de

sobrecarga de pressão). O débito cardíaco foi obtido multiplicando o volume

sistólico pela frequência cardíaca/1000. O integral tempo da velocidade do

fluxo do trato de saída do VE (LVOT VTI) calculado no plano apical 5 câmaras

a nível do anel aortico. Para o cálculo do volume sistólico foi usada a seguinte

fórmula: π *(LVOTdiameter)2]/4)*LVOT VTI (58, 59).

Teste de tolerância ao esforço

Quarenta e oito horas após a avaliação ecocardiográfica, os animais

foram submetidos a um teste de tolerância ao esforço. O teste consistiu numa

corrida em tapete rolante a 20 m/min, sem inclinação, até à exaustão. A

exaustão foi definida como o momento a partir do qual os animais se

recusavam a correr, mesmo após receberem três choques elétricos

consecutivos.

Fase 3

Estudo da sobrevivência

Para efeitos do estudo da sobrevida, adicionalmente, 40 animais foram

divididos em SED+V (n=5), EX+V (n=5), SED+MCT (n=15), EX+MCT (n=15) e

submetidos aos respectivos protocolos experimentais anteriormente descritos.

Após terminarem as 4 semanas do protocolo, todos os animais permaneceram

sedentários, com movimentação restrita ao espaço da gaiola, durante mais 3

semanas (42º dia após administração de MCT), o qual foi considerado como

45

endpoint, sendo registrado o dia e o número de mortes para construção da

curva de sobrevivência.

Análise estatística

O teste Shapiro-Wilk foi utilizado para avaliar a normalidade dos dados.

Para os dados que não apresentaram normalidade em sua distribuição, foi

utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunns. Os dados com

distribuição normal foram tratados com ANOVA II, seguido pelo Student Keuls

como post hoc. Os dados são apresentados em média ± desvio padrão. Para

análise da sobrevivência, foram efetuadas curvas de Kaplan-Meier e utilizado o

teste de Gehan-Breslow. O método de Holm-Sidak foi utilizado para

comparações múltiplas. A análise estatística foi efectuada com o programa

Graph Pad Prism (versão 6). Os resultados foram considerados

estatisticamente significativos quando P<0.05.

Resultados

Análise morfomética

A tabela 2 sumariza todos os parâmetros morfométricos analisados. Os

animais apresentaram uma diminuição no peso corporal de aproximadamente

20% no grupo SED+MCT e 6% no grupo EX+MCT em relação ao grupo

SED+V (P<0.05). Observou-se também uma redução do peso do músculo

gastrocnémius nos animais sedentários administrados com MCT (P<0.05 vs.

SED+V), também atenuado pelo exercício (P<0.05 vs. SED+MCT). Os

resultados referentes ao peso do VE sugerem que a MCT induziu atrofia da

parede ventricular nos animais do grupo SED+MCT (P<0.05 vs. SED+V)

enquanto os animais treinados, grupo EX+MCT, apresentaram atenução desta

perda de massa cardíaca (P<0.05 vs. SED+MCT). Estas diferenças não

atingiram significancia quando o VE+S foi normalizado para o comprimento da

tíbia.

46

Parâmetros hemodinâmicos em condições basais

Tal como mostra a tabela 3, a HAP induzida pela MCT comprometeu

significativamente a função cardíaca do VE nos animais sedentários. O grupo

SED+MCT apresentou diminuição significativa da FC (P<0.05 vs. SED+V)

sugerindo disfunção beta-adrenérgica. Foram observadas também alterações

marcadas em diversos parâmetros da função sistólica no grupo SED+MCT, tais

como redução do débito cardíaco (figura 3-C), da Pmax (±20%) e do dP/dtmax

(±30%; P<0.05 vs. SED+V). Os animais do grupo SED+MCT apresentaram

ainda uma diminuição significativa do dP/dtmín (±40%; P<0.05 vs. SED+V) bem

como da velocidade de relaxamento avaliada pela constante de tempo Tau

(aumentou em cerca de 30%; P<0.05 vs. SED+MCT). De notar que no grupo

EX+MCT todas estas alterações foram prevenidas (P<0.05 vs. SED+MCT).

Parâmetros hemodinâmicos em condições de stress

Em condições de sobrecarga aguda de pressão, induzida pela oclusão

abrupta da artéria aorta ascendente, o grupo SED+MCT apresentou um

importante comprometimeno da função diastólica. Especificamente, apresentou

uma redução de 30% no dP/dtmín (P<0.05 vs. SED+V) e aumento significativo

da constante de relaxamento Tau, de aproximadamente 45% (P<0.05 vs.

SED+V), sendo este revertido pelo treino físico (P<0.05 vs. SED+MCT). Os

resultados são apresentados na tabela 3.

Parâmetros histológicos e bioquímicos

A análise histologica do VE mostrou uma atrofia significativa nos

cardiomiócitos do grupo SED+MCT (P<0.05 vs. SED+V) verificado pela

diminuição da AST apresentada na figura 1. Nos animais exercitados foi

observada uma hipertrofia dos cardiomiócitos no grupo EX+MCT (P<0.05 vs.

SED+MCT). A atrofia foi acompanhada por um aumento da deposição de

colagénio no grupo SED+MCT em comparação a todos os restantes grupos

(P<0.05; figura 2). Por sua vez, nos animais do grupo EX+MCT, observou-se

47

que o treino atenuou a deposição de colagénio. Seguindo este padrão de

resposta, foi observado que os níveis de expressão génica do pepitídeo ET-1

no VE aumentaram significativamente no grupo SED+MCT (P<0.05 vs.

SED+V). Os grupos exercitados apresentam níveis normalizados (figura 3),

demonstrando que treinamento físico modula significativamente a expressão de

ET-1 (P<0.05 vs. SED+MCT).

Parâmetros ecocardiográficos

Como pode ser observado na figura 4, os animais do grupo SED+MCT

apresentaram uma severa alteração da geometria ventricular esquerda. Tal

como ilustram as imagens obtidas no eixo curto paraesternal (em tele-diastole),

os animais do grupo SED+MCT apresentam dilatação do VD, com o septo

interventricular a perder a sua convexidade e a abaular para o interior do VE. O

VE assume uma cavidade em forma de “D” e as suas dimensões encontram-se

reduzidas. Por sua vez, os animais EX+MCT apresentam atenuação destas

alterações.

Teste de tolerância ao esforço

Verificou-se uma significativa diminuição no tempo de corrida dos

animais do grupo SED+MCT (P<0.05 vs SED+V e EX+MCT), demonstrando

intolerância ao esforço. O grupo exercitado apresentou melhorias nos tempos

de corrida até a exaustão, com todos os animais a atingirem o tempo máximo

de corrida estabelecido de 110 minutos (figura 5).

Taxa de sobrevida dos animais com HPA

Durante o período de tempo em análise, não houve mortes no grupo

controle (SED+V). Após o 42º dia da administração de MCT, 73% dos animais

do grupo EX+MCT sobreviveram, sendo verificado uma melhoria significativa

48

na taxa de sobrevida comparativamente ao grupo SED+MCT (P<0.05). A

percentagem de sobrevivência apresentada pelos animais sedentários

administrados com MCT foi de apenas 13%, demonstrando a efetividade do

exercício físico em melhorar a taxa de sobrevivência (figura 6).

Discussão

Os resultados do presente estudo sugerem que o treino físico exerce um

efeito cardioprotetor em ratos com HAP induzida por MCT. Para além de

prevenir a disfunção cardíaca e normalizar o débito cardíaco, o treino físico

teve um impacto positivo na remodelação maladaptativa do VE atenuando a

atrofia dos cardiomiócitos, a deposição de colagénio e a activação neuro-

humoral. Verificámos também que o treino induziu uma melhoria da tolerância

ao esforço e aumentou a sobrevida dos animais.

A HPA é uma doença altamente mortal, que padece de terapeuticas

eficazes, e que apesar de sobrecarrregar seletivamente o VD, afeta também o

VE (21). Considerando a capacidade profilática e terapêutica que o exercício

físico exerce sobre inúmeras doenças crónicas, nomeadamente as

cardiovasculares, quisemos verificar qual o seu impacto ao nível da função

cardíaca esquerda em animais com HPA induzida pela MCT. Este modelo

experimental é um modelo amplamente usado para estudar as alterações

biventriculares e pulmonares da HPA (10, 21, 24, 25, 30, 38, 52). Até há bem

pouco tempo, o exercício físico era contra-indicado nos doentes acometidos

pela HPA, principalmente devido ao receio de comprometimento da função

cardiaca direita, já por si fragilizada e, consequentemente, aumentar o risco de

morte súbita (17). Contrariamente a esta ideia, estudos recentes realizados em

humanos e em ratos mostram que o exercício físico não agrava a remodelação

das artérias pulmonares ou a disfunção cardíaca do VD, melhora a capacidade

funcional, a função cardiorespiratória e a qualidade de vida (2, 3, 9, 11, 40). O

nosso trabalho experimental corrobora estes resultados, sugerindo igualmente

que a prática de exercício físico foi benéfica para os animais tratados com

49

MCT. Tal como previamente descrito (10, 38), os animais do grupo SED+MCT

apresentaram alterações do débito cardíaco, bem como de vários parâmetros

de contratilidade e relaxamento do VE. As alterações hemodinâmicas foram

observadas não só em condições basais mas também em condições de stress

induzidas pela elevação aguda e abrupta da pós-carga do VE. Por sua vez, nos

animais do grupo EX+MCT as alterações acima descritas foram prevenidas.

Os mecanismos subjacentes à disfunção do VE na HPA permanecem

por esclarecer, sendo a interdependencia ventricular uma das explicações mais

unanimes, onde as alterações geométricas das cavidades ventriculares

conjuntamente com a redução do enchimento do VE (unloading) acabam por

ter repercussões hemodinamicas nefastas sobre o VE (34, 50). Os nossos

resultados corroboram esta interpretação na medida em que apenas os

animais SED+MCT (que apresentaram disfunção do VE) possuiam um

aumento do índice de excentricidade e indícios de unloading, indiretamemte

aferido pela observação de redução da massa cardíaca e da atrofia dos

cardiomiócitos do VE. De notar que, no grupo EX+MCT, estas modificações

foram prevenidas. Para além de ser uma resposta expectável ao unloading, a

remodelação atrófica do VE tem sido por si só implicada com o

desenvolvimento de disfunção sistólica e diastólica do VE em doentes com

HPA (21). Apesar de alguma morte celular poder também ocorrer (41, 51), as

evidências mais fortes sugerem mesmo a atrofia dos cardiomiócitos (21, 31)

acompanhada pela reduzida síntese de proteinas estruturais, como as

miosinas de cadeia pesada (6), como sendo o principal factor responsável pela

diminuição da massa ventricular. Assim sendo, a prevenção das alterações

geométricas das cavidades ventriculares bem como da atrofia que observámos

nos animais do grupo EX+MCT poderão explicar, parcialmente, a melhor

funcionalidade cardíaca apresentada.

Evidências crescentes sugerem também que as alterações da

composição da matriz extracelular possam estar envolvidas na disfunção do VE

secundária à HPA severa (1, 10, 56). No nosso estudo encontrámos níveis

elevados de fibrose no VE dos animais SED+MCT. Aparentemente, esta

alteração não teve repercussões ao nível hemodinâmico uma vez que as

pressões telediastólicas basais e em condições isovolumétricas permaneceram

50

inalteradas, tal como anteriormente descrito (10, 37). Contudo, Lourenço et al.

(37), utilizando o mesmo modelo de HPA, descreveram alterações na relação

pressão-volume telediastólica, o qual é um parâmetro mais sensível para

avaliar a rigidez do micárdio. Para além de poder afetar a rigidez do miocárdio,

a fibrose favorece o aparecimento de arrítmias e prejudica a difusão do

oxigénio até aos cardiomiócitos, podendo assim aumentar a susceptibilidade

para o desenvolvimento da insuficiencia cardíaca. (5, 13, 22) Nos animais

EX+MCT, por sua vez, observámos que o treino foi capaz de prevenir o

aumento de fibrose, o que poderá ser explicado em parte pelo seu efeito anti-

neurohumoral (7) e anti-inflamatório (42). De facto, no nosso estudo, os

animais EX+MCT apresentaram baixos níveis de expressão de ET-1

comparativamente os SED+MCT, sugerindo então que o exercício físico

modulou a activação neurohumoal. Para além do seu potencial em favorecer a

ativação dos fibroblastos e consequente formação de fibrose (53), a ET-1

parece também exercer um efeito deletério direto na função cardíaca (26, 38,

44). Esta relação direta foi previamente demonstrada em modelos de HP, com

a administração de antagonistas de ET-1 a resultarem numa melhoria na

funcionalidade ventricular esquerda e na inibição da ET-1 produzida localmente

nos miócitos do VE (27, 38). O efeito na contractilidade e relaxamento do

miocárdio acima descritos parecem ser mediados por disturbios da

homeostasia do Ca2+ (8) bem como pelo favorecimento da expressão da

isoforma beta das cadeias pesadas de miosina (MHC-beta) (14). De notar que

já se demonstrou noutros modelos de insuficiencia cardíaca esquerda que o

exercício físico consegue normalizar estas duas alterações (28, 47, 49).

A diminuição de tolerância ao esforço representa um dos fatores de valor

prognóstico mais relevante para a morte ou internamento em doentes com

disfunção cardíaca secundária à hipertensão pulmonar ou doença cardíaca

congénita (19). No presente estudo, demostrámos também claramente que o

treino aeróbio aumentou a tolerância ao esforço bem como a sobrevida. O

fenótipo cardíaco observado nos animais treinados poderá ter sido um dos

principais factores a considerar para a melhoria da sobrevida. O aumento da

performance no teste de esforço poderá resultar, para além das melhorias

centrais, de importantes alterações periféricas, nomeadamente ao nível

51

muscular. Especula-se que baixos níveis de atividade dos músculos

esqueléticos juntamente com uma diminuição do débito cardíaco secundária à

doença (21), contribuam para uma redução no aporte de oxigénio para os

músculos esqueléticos e conduzam a alterações fisiopatológicas nefastas tais

como a atrofia muscular esquelética e a redução de sua capacidade oxidativa

(4, 57). Contrariamente aos animais EX+MCT, os animais SED+MCT

apresentaram atrofia muscular esquelética, constatada pelo peso dos

gastrocnêmios, e dimininuição do débito cardíaco. Estudos em doentes com

HPA bem como portadores de IC de outra etiologia sugerem que os efeitos

benéficos do exercício físico regular se devem também à melhoria da eficiência

múscular esquelética, ao aumento da densidade capilar e a melhoria na

actividade enzimática oxidativa (11, 32, 55).

Conclusão

Os resultados do presente estudo sugerem que a realização de exercício

físico regular durante o desenvolvimento da HPA poderá previnir a disfunção

cardíaca do VE secundária à HPA induzida pela MCT, aumentar a tolerância ao

esforço e melhorar a sobrevida. As melhorias observadas poderão dever-se à

prevenção da deformação da geometria das cavidades vetriculares, da atrofia,

da acumulação de fibrose e da ativação neurohumoral.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pela Fundação para a Ciência e a

Tecnologia através do projeto PTDC/DES/104567/2008.

52

Referencial Bibliográfico

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56

Legenda das Figuras:

Figura 1: Fotografias de microscopia ótica (coloração com hematoxilina-eosina) e resultados

da área de secção transversal dos cardiomiócitos do VE nos grupos sedentário com veículo

(SED+V), sedentário com monocrotalina (SED+MCT), exercitado com veículo (EX+V) e

exercitado com monocrotalina (EX+MCT). Os dados são apresentados como média±desvio

padrão. *P<0.05 vs. SED+V; †P<0.05 vs. SED+MCT; ‡P<0.05 vs. EX+V.

Figura 2: Fotografias de microscopia ótica (coloração com Sirius Red) e resultados da

quantificação do colagénio intersticial (% da área) nos grupos sedentário com veículo (SED+V),

sedentário com monocrotalina (SED+MCT), exercitado com veículo (EX+V) e exercitado com

monocrotalina (EX+MCT). Os dados são apresentados como média±desvio padrão. *P<0.05

vs. SED+V; †P<0.05 vs. SED+MCT; ‡P<0.05 vs. EX+V.

Figura 3: Resultados da relação de mRNA da endotelina-1 (ET-1) e da gliceraldeído 3-

fosfato desidrogenase (GAPDH) nos grupos sedentário com veículo (SED+V), sedentário com

monocrotalina (SED+MCT), exercitado com veículo (EX+V) e exercitado com monocrotalina

(EX+MCT). Os dados são apresentados como média±desvio padrão. *P<0.05 vs. SED+V;

†P<0.05 vs. SED+MCT; ‡P<0.05 vs. EX+V.

Figura 4: Fotografias da avaliação ecocardiográfica (A) e resultados do índice de

excentricidade (B) e do débito cardíaco (C) nos grupos sedentário com veículo (SED+V),

sedentário com monocrotalina (SED+MCT) e exercitado com monocrotalina (EX+MCT). Os

dados são apresentados como média±desvio padrão.*P<0.05 vs. SED+V; †P<0.05 vs.

SED+MCT; ‡P<0.05 vs. EX+V.

Figura 5: Resultados do teste de tolerância ao esforço nos grupos sedentário com veículo

(SED+V), sedentário com monocrotalina (SED+MCT) e exercitado com monocrotalina

(EX+MCT). Os dados são apresentados como média±desvio padrão. *P<0.05 vs. SED+V;

†P<0.05 vs. SED+MCT; ‡P<0.05 vs. EX+V.

Figura 6: Resultados da taxa de sobrevida nos grupos sedentário com veículo (SED+V),

sedentário com monocrotalina (SED+MCT) e exercitado com monocrotalina (EX+MCT). Os

dados são apresentados como média±desvio padrão*P<0.05 vs. SED+V; †P<0.05 vs.

SED+MCT; ‡P<0.05 vs. EX+V.

57

Tabela 1: Sondas utilizados na quantificação de mRNA em tempo-real por RT-PCR

Gene Sequência 5’→ 3’

GAPDH fw: TGG CCT TCC GTG TTC CTA CCC

rev: CCG CCT GCT TCA CCA CCT TCT

ET-1 fw: CGG GGC TCT GTA GTC AAT GTG

rev: CCA TGC AGA AAG GCG TAA AAG

GAPDH: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; ET-1: endotelina 1; fw: forward; rev:

reverse

Tabela 2: Parâmetros morfométricos (média±desvio padrão) avaliados nos grupos sedentário

com veículo (SED+V), sedentário com monocrotalina (SED+MCT), exercitado com veículo

(EX+V) e exercitado com monocrotalina (EX+MCT).

SED+V EX+V SED+MCT EX+MCT

MC (g) 343±0,013 323±0,025 275±0,020* 320±0,020†

PC (g) 0.8345±0.098 0,9309±0.069 0,9895±0,085* 1,053±0,104*‡

PGast (g) 2,131±0,1627 2,068±0,1994 1,795±0,1319* 2,084±0,1630†

PC/Tíbia (g/cm) 0,2249±0,011 0,2439±0,019 0,2643±0,024 0,2301±0,104

VE+S (g) 0,6166±0,049 0,6162±0,046† 0,5588±0,036* 0,6203±0,60†

VE/T (g/cm) 0,1588±0,012 0,1603±0,012 0,1492±0.010 0,1601±0,015

MC: massa corporal; PC: peso do coração; PC/Tíbia: peso do coração/tíbia; VE+S: ventrículo esquerdo+sépto; VE/T: ventrículo esquerdo/tíbia; PGast: peso dos gastrocnêmios; *P<0.05 vs SED+V; †P<0.05 vs SED+MCT; ‡P<0.05 vs EX+V.

58

Tabela 3: Parâmetros hemodinâmicos (média±desvio padrão) avaliados nos grupos

sedentário com veículo (SED+V), sedentário com monocrotalina (SED+MCT), exercitado com

veículo (EX+V) e exercitado com monocrotalina (EX+MCT), em condições basais e

isovolumétricas.

SED+V EX+V SED+MCT EX+MCT

Condições Basais

FC (bpm) 399,6±26,5 389,0±32,2 330,1±54,2* 376,2±50,7†

PVEmax(mmHg) 114,2±15,4 121,4±18,1 92,74±19,2* 101,7±13,4‡

dP/dtmax(mmHg/s) 7765±1678 7228±1233 5633±2078* 6204±1162

dP/dtmín(mmHg/s) -8925±2069 -8613±940 -5315±2692* -7059±1800

tau(ms) 8,75±0,9 10,59±2,3 12,33±3,1* 10,22±1,4†

Condições Isovolumétricas

PVEmax(mmHg) 169,7±9,4 164,7±10,4 151,0±22,8 188,7±17,5†‡

dP/dtmax(mmHg/s) 7260±946,6 7971±3079 5364±1769 7043±1198

dP/dtmín(mmHg/s) -7002±2465 -6718±2600 -4425±1852* -5654±1047

tau(ms) 9,5±0,9 13,1±1,7 16,9±4,3* 11,3±1,8†

FC: frequência cardíaca; PVEmax: pressão sistólica máxima; dP/dtmáx: velocidade de elevação de pressão; dP/dtmín: velocidade de queda de pressão; tau: velocidade de relaxamento; *P<0.05 vs. SED+V; †P<0.05 vs. SED+MCT; ‡P<0.05 vs. EX+V.

59

Figura 1

Figura 2

60

Figura 3

Figura 4

S E D + V E X + V S E D + M C T E X + M C T

0

2

4

6

8

1 0

VE

ET

-1/G

AP

DH

mR

NA

(u

.a)

*

†

61

Figura 5

Figura 6

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

E X + M C T

S E D + M C T

S E D + C o n tro l

*

†

†

D ia s a p ó s a d m in is tra ç ã o d a M C T

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0 5 0 1 0 0 1 5 0

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T e m p o a té e x a u s tã o (m in )

*

†Te

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Es

forç

o

63

Secção 4

Conclusões Gerais

65

Baseados na revisão da literatura efetuada e nos resultados encontrados no

nosso estudo, podemos ressaltar as seguintes conclusões:

1. A atual literatura, de facto, demonstra a mudança de paradgma na

utilização terapêutica de diferentes tipos de programas de teino na HAP

e nas cardiopatias subsequentes, reconhecendo que o exercício físico

regular é capaz de induzir um efeito protetor a estes pacientes, embora

maiores pesquisas sejam necessárias para prescrição adequada e

segura do exercício.

2. O programa de treino físico não exerceu um impacto negativo na

progressão e agravamento da HAP;

3. O programa de treino físico modulou as alterações estruturais (indice de

exentricidade), a atrofia ventricular esquerda, assim como a deposição

de colagénio e a ativação neuro-humoral, nomeadamente os níveis

locais de ET-1;

4. Os parâmetros hemodinâmicos sistólicos e diastólicos foram

melhorados pelo programa de treino físico, demonstrando a atuação

positiva na disfuncionalidade do VE;

5. O programa de treino físico reverteu a intolerância ao exercício e

aumentou significativamente a sobrevida dos animais;

As conclusões do presente estudo corroboram com as atuais evidências de

que o exercício físico não é prejudicial na HAP. Adicionalmente, podemos

concluir que as principais alterações no VE decorrentes da doença podem ser

moduladas positivamente pelo exercício físico regular.

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