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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - UNIVALI CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR – CTTMar

Jessica Engel Montemor

Avaliação da atividade lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados marinhos de profundidade

Itajaí 2013

i

Jessica Engel Montemor

Avaliação da atividade lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados marinhos de profundidade

Tabalho de Conclusão de Curso Área de conhecimento: Oceanografia Sub- área de conhecimento: Biológica Modalidade: Pesquisa Orientador: Dr. Marcus Adonai Castro da Silva

Itajaí 2013

ii

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao professor Marcus Adonai, pela orientação, paciência, dedicação, apoio e

principalmente confiança para a realização deste projeto.

Ao pessoal do LAMA Tiago e César e também ao Tiago do LBB pelo apoio em todas

as atividade de laboratório.

Aos meus pais e irmão, por proporcionarem a realização deste e sonho e pelo apoio e

incentivo em todos os momentos, principalmente naqueles em que pensei em desistir.

Sem vocês nada teria sido possível. Agradeço a honra de ter vocês sempre presentes

na minha vida, e me apoiando a cada novo passo a ser dado.

Á minha segunda família, onde encontrei apoio e conforto em todos os momentos,

seja nas conversas e concelhos da minha sogra Marly, ou nos momentos em que

precisava de distração, ao Murilo e Amanda.

Ao meu namorado Maurício, não devo a você somente o meu TCC, mas toda a minha

faculdade, ninguém melhor do que você acompanhou toda essa minha jornada, todas

as minhas dificuldades e sempre ficou ao meu lado, me dando força pra seguir em

frente, não deixando nada me abalar. Obrigado pelo companheirismo, pelas ajudas,

pelas noites não dormidas e pelo nosso filho maravilhoso. Nestes 5 anos, mesmo que

de longe nesta reta final, sempre me deu a força e a coragem para continuar.

Ao meu filho Bernardo que me ensina a ser cada dia melhor e que toda dificuldade

vem recompensada em apenas um sorriso seu. Por você entender melhor que gente

grande tudo que passamos nesse momento e por trazer luz, felicidade e prazer aos

meus dias.

Aos amigos mais antigos, que mesmo não tão presentes, estiverem sempre ao meu

lado, principalmente á Melanie, que nos nossos quase 20 anos de amizade provaram

que não é preciso estar sempre perto para se ser amigo, e você mesmo com as

distâncias que enfrentamos ao longo de nossas vidas, permaneceu ao meu lado, me

ensinou a ter garra e coragem, tu é meu exemplo em tudo na vida, agradeço a vida

pela irmã que me deu.

Aos amigos que fiz durante a faculdade, que ajudaram a tornar esse período mais

prazeroso e me proporcionaram momentos e aprendizados que levarei eternamente

comigo.

iii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... iv

LISTA DE APÊNDICES ............................................................................................... vi

RESUMO ..................................................................................................................... vii

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 4

2.1. Objetivo Geral ................................................................................................... 4

2.2. Objetivos Específicos ...................................................................................... 4

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................................. 5

3.1. Elevação do Rio Grande .................................................................................. 5

3.2. Microbiota de Invertebrados Marinhos de Profundidade .............................. 6

3.3. Atividade Lipolítica e Celulolítica de Bactérias Marinhas ............................. 7

4. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 10

4.1. Amostras e Área de Estudo ........................................................................... 10

4.2. Isolamento e Armazenamento dos Micro-organismos ................................ 10

4.3. Avaliação da Atividade Lipolítica e Endoglucanolítica ................................ 11

4.4. Análise de dados ............................................................................................ 11

5. RESULTADOS ....................................................................................................... 12

6. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 15

7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 19

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 20

APÊNDICES ............................................................................................................... 27

iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Crescimento das colônias e halos nos meios CMC (A) e Tween 20 (B). ...... 11

Figura 2. Distribuição das linhagens isoladas entre as cinco amostras analisadas de

invertebrados marinhos. ............................................................................................. 12

Figura 3. Distribuição das linhagens com atividade lipolítica e endoglucanolítica entre

as cinco amostras analisadas de invertebrados marinhos. ......................................... 12

Figura 4. Distribuição das amostras com atividade percentual de atividade enzimática.

................................................................................................................................... 13

Figura 5. Média e desvio padrão (barras verticais) do índice enzimático nos meios

contendo CMC e Tween 20. Cor amarela, amostra de holotúria; cor violeta, amostra de

coral; cor azul, amostra de ofíuro; cor verde, amostra de ouriço; cor marrom, amostra

de poliqueta. ............................................................................................................... 14

Figura 6. Média e desvio padrão (barras verticais) do crescimento (diâmetro das

colônias) dos mcro-organismos com atividade hidrolitica nos meios contend CMC e

Tween 20. Cor amarela, amostra de holotúria; cor violeta, amostra de coral; cor azul,

amostra de ofíuro; cor verde, amostra de ouriço; cor marrom, amostra de poliqueta. . 14

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Amostras de invertebrados marinhos analisadas no presente estudo e região

de origem. ................................................................................................................... 10

vi

LISTA DE APÊNDICES

Apêndice 1. Micro-organismos isolados da região do Lineamento Cruzeiro do Sul. ... 27

Apêndice 2. Micro-organismos isolados da região da Elevação do Rio Grande. ......... 28

vii

RESUMO

Com a dificuldade de acesso e de manutenção de organismos em laboratório, os mares profundos tornam-se ambientes pouco estudados, apesar de sua importância e de abrigarem uma grande diversidade de micro-organismos, os quais são as entidades bióticas mais numerosas e antigas, capazes de colonizar diversos nichos ecológicos, e são essenciais para o funcionamento e equilíbrio dos ecossistemas. Além disso, os micro-organismos representam uma importante fonte de recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento econômico sustentável. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo isolar e avaliar a atividade lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados marinhos coletados na região da Elevação do Rio Grande e no Lineamento Cruzeiro do Sul, Oceano Atlântico Sul. Para isso, foi feito o isolamento de cinco micro-organismos, pelo método de inoculação em superfície e os meios de cultura Ágar Marinho e R2A Marinho, diluídos (1:5), de amostras de organismos, oriundas das áreas de estudo. Posteriormente, foi feita a avaliação da sua atividade hidrolítica sobre Tween20 e carboximetilcelulose, em ensaios com placas conduzidos a 15ºC, comparados através de índices de atividade enzimática. Como resultado, de 68 organismos isolados, 29 apresentaram alguma atividade hidrolítica, sendo 18 deles lipolíticos. A amostra de coral foi a que rendeu um menor número de linhagens com atividade enzimática, enquanto que a de holotúria apresentou-se como a mais representativa. A partir do cálculo do índice enzimático (I.E.), no meio Tween 20, todas as linhagens apresentaram diferença entre si, com exceção da LAMA 1283 e LAMA 1290, as quais não apresentaram diferença significativa (p=0,999925), sendo estes os organismos com maior atividade lipolítica. Para a hidrólise de CMC a linhagem LAMA 1334 foi a que apresentou maior I.E., comparando com todas as amostras (p<0,005), sendo que 13 amostras apresentaram atividade celulolítica. Tornando possível então a conclusão de que o presente trabalho apresentou bactérias de invertebrados, em especial de equinodermos, com potencial para obtenção de lipases e endoglucanases, sendo estas amostras, de equinodermos, as quais proporcionaram o isolamento de um maior número de bactérias.

Palavras-chave: bactérias, Elevação do Rio Grande, enzimas adaptadas ao frio.

1

1. INTRODUÇÃO

Os ecossistemas marinhos são importantes no estudo dos micro-organismos,

em razão da sua biodiversidade. Estes micro-organismos são as entidades bióticas

mais numerosas e antigas, capazes de colonizar diversos nichos ecológicos. Sua

presença e atividade são essenciais para o funcionamento e equilíbrio dos

ecossistemas. Além disso, os micro-organismos representam uma importante fonte de

recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento econômico

sustentável.

Os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a

diversidade microbiana são extensos (COLWELL, 1997; HUNTER-CEVERA, 1998),

entre eles, a melhor compreensão das funções exercidas pelas comunidades

microbianas nos ambientes e o conhecimento das suas interações com outros

componentes da biodiversidade. Já os benefícios econômicos e estratégicos estão

relacionados com a descoberta de micro-organismos potencialmente exploráveis nos

processos biotecnológicos para produção de: novos antibióticos e agentes

terapêuticos, probióticos, produtos químicos, enzimas e polímeros para aplicações

industriais e tecnológicas, biorremediação de poluentes e biolixiviação e recuperação

de minérios. Outros benefícios incluem o prognóstico e prevenção de doenças

emergentes em seres humanos, animais, plantas, e a otimização da capacidade

microbiana para a fertilização dos solos e despoluição das águas (OLIVEIRA et. al.,

2006).

O potencial destes micro-organismos para biotecnologia já foi demonstrado em

vários trabalhos, incluindo a produção de moléculas como exopolissacarídeos (QIN et

al., 2007), metabólitos secundários como antitumorais (MINCER et al., 2005),

pigmentos (YADA et al., 2008) e enzimas (ZENG et al., 2004).

As enzimas produzidas por micro-organismos de águas profundas merecem

atenção especial, já que conseguem realizar suas atividades em ambientes totalmente

diferentes dos terrestres, com baixas temperaturas e sob altas pressões, e no caso

das lipases e celulases, podem ser utilizadas em diversos processos como a produção

de biocombustíveis e no tratamento de águas residuais (ROSA, 2011).

Há uma crescente atenção na pesquisa de micro-organismos adaptados ao

frio. Estes desempenham um papel importante nos processos de renovação de

nutrientes a baixas temperaturas (KOTTMEIER; SULLIVAN 1990; RIVKIN et al., 1989).

Desde a última década tem havido um esforço contínuo para se conhecer mais sobre

as enzimas de organismos marinhos. Entre as mais citadas com potencial

2

biotecnológico tem-se: proteases (GIONGO, 2006), carboidrases (BERTUCCI; COURI,

2004), peroxidases (DEBASHISH et al., 2005), lipase e celulases (ODISI et al., 2012),

sendo que todas elas foram obtidas de organismos que habitam ambientes marinhos

profundos.

Apesar da sua importância, os mares profundos são ecossistemas pouco

estudados, pela dificuldade de acesso e de manutenção de seus organismos em

laboratório. Mais recentemente, pesquisas com finalidades comerciais e científicas têm

sido realizadas, visando uma maior e melhor exploração de recursos em águas

profundas ao redor do mundo, uma vez que seus habitantes são menos afetados por

mudanças climáticas (mesmo sendo vítimas de degradação via atividades pouco

regulamentadas) (KITAHARA, 2007; VENN et al., 2009). No Brasil, algumas

expedições oceanográficas, têm contribuído para uma melhor compreensão da

biodiversidade desses ambientes, como o Projeto Mar-Eco, o qual é um projeto

internacional de pesquisa que envolve cientistas de 16 países e tem como objetivo

investigar a diversidade da vida animal ao longo das correntes do oceano aberto de

montanhas submarinas, tendo o presente trabalho como objetivo avaliar a atividade

lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados coletados na

região da Elevação do Rio Grande e do Lineamento Cruzeiro do Sul, oceano Atlântico

Sul.

3

4

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Isolar e avaliar a atividade lipolítica e endoglucanolítica a 15ºC de bactérias

isoladas de invertebrados coletados na região da Elevação do Rio Grande e do

Lineamento Cruzeiro do Sul, oceano Atlântico Sul.

2.2. Objetivos Específicos

Isolar bactérias de cinco amostras de invertebrados marinhos coletados nas

áreas de estudo.

Avaliar a atividade lipolítica e endoglucanolítica dos micro-organismos isolados

em ensaios em placas conduzidos a 15ºC.

Comparar os organismos obtidos com outras bactérias já avaliadas pelo grupo

de pesquisa, em relação com a atividade lipolítica e endoglucanolítica.

5

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Elevação do Rio Grande

O Oceano Atlântico Sul foi formado pela separação das placas da América do

Sul e da África há 175 - 90.000.000 anos atrás. Sua configuração e tamanho são

resultantes de dois processos de espalhamento independentes: um que formou o

Atlântico Norte no Mesozóico, iniciado a cerca de 200 milhões de anos atrás, e outro

que formou o Atlântico Sul, 100.000 mil anos mais tarde. Este processo de

espalhamento resultou na formação de conexões com outros três oceanos: do Sul,

Pacífico e Índico (FAIRHEAD e WILSON, 2004). Por ser relativamente jovem, o

Atlântico Sul é estreito e tem uma alta proporção entre margem continental e águas

profundas (LEVIN e GOODAY, 2003).

Cordilheiras meso-oceânicas e as cadeias de montes submarinos são

estruturas proeminentes do mar profundo que atraem considerável atenção pela sua

biodiversidade, pesca e recursos minerais (CLARK et al., 2010). A Elevação do Rio

Grande é uma feição positiva do Atlântico Sul, que alcança profundidades mais rasas

que 600m e é circundada por assoalho oceânico com profundidades médias de

4.000m. A Elevação do Rio Grande está além dos limites da plataforma continental

jurídica brasileira, ou seja, está em águas internacionais, uma região conhecida como

"A Área".

A origem da Elevação do Rio Grande ainda é cercada de controvérsias.

Mohriak et. al., (2010) elencam as seguintes hipóteses para a origem desta feição: (i)

um edifício vulcânico ou platô enraizado no manto, (ii) uma zona de cisalhamento

intraplaca afetando as crostas continental e oceânica, (iii) uma área oceânica com uma

atividade ígnea anormal causada por um ponto quente ou uma anomalia térmica no

manto, (iv) um paleo-centro de expansão do assoalho oceânico formado durante o

Cretáceo, (v) uma área de excessiva atividade vulcânica resultante de uma

diferenciação do manto devido a descompressão adiabática, e (vi) um remanescente

isolado de crosta continental, deixado para trás durante o processo de separação

América do Sul-África. São muitas as possibilidades, demonstrando que ainda existe

muito a se fazer.

O potencial para a exploração sustentável destes ecossistemas profundos,

como a elevação do Rio Grande, e a necessidade de sua conservação têm sido um

tema de crescente preocupação em todo o mundo e motivaram iniciativas científicas

modernas (McINTYRE, 2010). Uma dessas iniciativas, MAR-ECO, foi proposta em

6

2001 para estudar a diversidade e ecologia do norte da Dorsal Meso-Atlântica

(BERGSTAD e GODO, 2003).

Historicamente, esta extensa e topográfica área dos fundos oceânicos foi

pobremente amostrada, com exceção dos ecossistemas quimiossintéticos que se

encontram ao longo de pequenas porções de cume. Iniciativas como a de 2006, para

expandir as atividades de amostragem e estudos para o Atlântico Sul dorsal meso-

oceânica desmembrada do projeto MAR-ECO, apoiado pelo (Censo da Vida Marinha

em Seamounts) projeto CenSeam (CONSALVEY et al., 2010), vieram a enriquecer os

estudos.

A primeira expedição de campo realizada em 2009 para amostrar a biota

pelágica e bentônica do sul da Dorsal Meso-Atlântica efetivamente iniciou o "South

Atlantic MAR-ECO" (SA MAR-ECO), projeto voltado para melhorar o conhecimento

sobre os padrões de biodiversidade desta área oceânica vasta e pouco

conhecida(Perez et. al., 2012). Desde então outras três amostragens foram realizadas,

sendo a mais recente a bordo da embarcação NPq Yokozuka neste ano, na qual foram

coletadas as amostras estudadas neste trabalho.

3.2. Microbiota de Invertebrados Marinhos de Profundidade

Os animais que não possuem notocorda nem coluna vertebral são conhecidos

como invertebrados. Esse grupo é muito grande e inclui animais que apresentam

formas e comportamentos bem diferentes. Eles podem ser encontrados nos mais

diversos ambientes (aquáticos ou terrestres) e podem ser parasitas de plantas ou de

outros animais (BONECKER et. al., 2002).

O número de bactérias que residem nestes invertebrados podem ser tão

variados e numerosos que podem constituir, por exemplo, até 60% da biomassa total

de esponjas (OLSON; MCCARTHY; 2005). Isto evidência que as bactérias têm papel

fundamental nas funções biológicas de seus hospedeiros, atuando na nutrição, saúde

e substâncias de defesa. O papel destes micro-organismos nos ecossistemas de

recifes e corais não está bem elucidado, sendo que os micro-organismos podem atuar

como saprofíticos ou patógenos, ou ainda desenvolver outras funções importantes no

ecossistema (SHNIT-ORLAND & KUSHMARO; 2008). Em relações simbiônticas com

corais a microbiota pode contribuir para obtenção de nutrientes como o nitrogênio e

fósforo ou ainda desenvolver funções importantes de proteção contra patógenos.

As bactérias marinhas são seres procariontes, na sua grande maioria são

gram-negativas, flageladas e não esporuladas, podendo ocorrer Gram-positivas,

7

apresentam formas variadas como bacilos, cocos, vibriões e espirilos (MUNN, 2004).

As Gram-negativas são representadas principalmente pelos gêneros: Cythophaga,

Flavobacterium, Oceanospirillum, Pseudomonas, Roseobacter, Shewanella e Vibrio

(GONTANG; FENICAL; JENSEN, 2007). Dentre a biodiversidade de Gram-positivas,

os filos Actinobacteria (Actinomicetos) e Firmicutes (gêneros Bacillus e Clostridium)

são amplamente encontrados. Conhecidos como saprófitos do solo, Bacillus e

Clostridium são componentes de sedimentos marinhos (GROSSART et al., 2004 apud

RODRIGUES, 2008).

Da mesma maneira, as bactérias associadas com invertebrados marinhos são

bastante diversificadas. Li et al. (2007), por exemplo, estudaram as bactérias

associadas com esponjas do Mar da China, tendo isolado várias linhagens com

atividade hidrolítica. Os micro-organismos obtidos pertenciam a dois filos bacterianos,

Proteobacteria e Firmicutes, sendo o gênero Bacillus o mais frequentemente isolado.

Já Mourino (2008) observou alta carga de Vibrio nas águas do Laboratório de

Camarões Marinhos, da Universidade Federal de Santa Catarina. Costa (2006)

estudou os víbrios associados ao cultivo de camarão L. vannamei em fazendas do

Ceará. Pereira et. al., (2007) investigaram a presença de víbrios em 40 amostras de

ostras (Crassostrea rhizophoreae) servidas em 15 restaurantes da Cidade do Rio de

Janeiro.

Rosenberg et. al., (2007) iniciou a investigação da microbiologia no coral

focada na camada de muco da sua estrutura, utilizando técnicas de cultura

tradicionais. Estes estudos demonstraram que esta camada suporta uma comunidade

de bactérias benéficas, diversas e abundantes, incluindo fixadoras de azoto e

decompositores de quitina. Já os esqueletos de coral, são estruturas porosas

habitadas por uma variedade de bactérias. Estas podem ser cruciais para a

sobrevivência do coral, quando perde a suas algas endossimbióticas, causando uma

doença conhecida como branqueamento do coral.

3.3. Atividade Lipolítica e Celulolítica de Bactérias Marinhas

Celulases são enzimas que constituem um complexo capaz de atuar sobre

materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise. Estas enzimas são biocatalisadores

altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, dos quais

a glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido à possibilidade de sua

conversão em etanol (OLSSO; HAHN-HAGERDAL, 1996).

8

A classificação das celulases, de acordo com seu local de atuação no substrato

celulósico, pode se apresentar em três grandes grupos: endoglucanases (EnG), que

clivam ligações internas da fibra celulósica; exoglucanases (ExG), que atuam na

região externa da celulose; e b-glicosidases (BG), que hidrolisam oligossacarídeos

solúveis em glicose (CASTRO, 2010)

A endoglucanase possui como nome sistemático, segundo a IUBMB –

International Union of Biochemistry and Molecular Biology –, 1,4-β-D-glucana-4-

glucano-hidrolase. É a enzima do complexo celulolítico responsável por iniciar a

hidrólise. Tal enzima hidrolisa randomicamente as regiões internas da estrutura amorfa

da fibra celulósica, liberando oligossacarídeos de diversos graus de polimerização

(GP) e, consequentemente, novos terminais, podendo ser um redutor (quando a

glicose possui uma hidroxila heterosídica livre) e um não redutor (quando a hidroxila

heterosídica da molécula da extremidade participa de ligação com a glicose

adjacente). A EnG é a enzima celulolítica responsável pela rápida solubilização do

polímero celulósico (redução do GP), devido à sua fragmentação em oligossacarídeos

(FRACHEBOUD, CANEVASCINI, 1989). As endoglucanases são produzidas

principalmente por fungos, bactérias e protozoários (KUMAR et al., 2008).

A literatura mostra a produção de endoglucanases por actinomicetos, em

especial Streptomyces, em diferentes substratos, a estirpe de Streptomyces, a T3-1,

produziu 40,3 U/ mL em 1,5% de CMC e sulfato de amônio, ureia e peptona, porém os

nutrientes utilizados não eram substratos de baixo custo. Streptomyces sp. isolada de

solo do Canadá foi cultivada em uma solução de sais de Mandel contendo peptona,

tween 80 em 1,0% de celulose cristalina e produziu 11,8 U/mL de CMCase; enquanto

Thermomonospora sp., um actinomiceto alcalotermofílico, quando cultivado em meio

contendo celulose de papel em pó, extrato de levedura e Tween 80, apresentou um

pico de atividade de 23 U/mL, e quando cultivado em farelo de trigo a atividade foi de

8,5 U/mL (PACHECO et. al., 2011).

Uma outra classe de enzimas com grande relevância são as lipases

(triacilglicerol acilhidrolases E.C. 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise total

ou parcial de triacilglicerol (TAG), formado por três ácidos graxos de cadeia longa

ligados na forma de ésteres a uma molécula de glicerol, fornecendo diacilglicerol

(DAG), monoacilglicerol (MAG), glicerol e ácidos graxos livres.

Apresentam capacidade de agir apenas na interface óleo/água sendo as

enzimas que agem em ésteres solúveis em água, ou que hidrolisam outros lipídios,

excluídas desta definição. Além disso, não precisam de cofatores, e catalisam não só

reações de hidrólise, como também de síntese, como esterificação, interesterificação,

9

transesterificação, alcoólise e aminólise, e por atuar sobre substratos não naturais

(AEHLE, 2007).

As lipases apresentam variadas aplicações: em tratamento de esgoto ou caixas

de gordura, produção comercial de biodiesel e produção de alimento e algumas

drogas. No tratamento de esgoto ou em caixas de gordura, as lípases atuam

diminuindo custos de manutenção e reduzindo impactos negativos ao meio ambiente

(AEHLE, 2007). Na produção comercial de biodiesel, são ótimas diminuindo a

quantidade de resíduos e facilitando a recuperação do produto final. Comparando-se

combustíveis fósseis com biocombustíveis, o segundo apresenta a vantagem de ser

uma fonte de energia renovável (SALIS; et. al., 2007). Na indústria alimentícia, seu uso

está associado à produção de queijos, sucos de frutas e vegetais, clarificação de

sucos e vinhos, panificação e cervejaria (BERTUCCI; COURI, 2004). E, em algumas

drogas, possuem a capacidade de reduzir os efeitos colaterais causados pelas

mesmas (KIM et al., 2007).

Há relativamente poucos estudos com micro-organismos lipolíticos de

ambientes marinhos. Park et al, (2007) estudou a linhagem Vibrio GMD509 exibindo

atividade lipolítica, isolada a partir de ovos de lebre do mar, Aplysia kurodai,

caracterizando uma nova enzima lipolítica. Seo et al. (2005), por outro lado,

descreveram uma nova espécie bacteriana com atividade lipolítica, Phtobacterium

frigidiphilum, isolada de sedimentos marinhos coletados a 1450m, em um monte

submarino. A atividade lipolítica desta bactéria foi visualizada em Ágar Marinho

contendo o substrato tributirina (ODISI et. al., 2012).

Algumas bactérias produtoras de lípases são as do gênero Halomonas e

Marinobacter. Kaye et al,. (2004) procuraram avaliar a diversidade fisiológica e

filogenética de bactérias de fontes hidrotermais do oceano profundo. Como resultado,

quatro isolados foram totalmente caracterizados e, através de sequenciamento

genético, classificados e nomeados como Halomonas neptunia, H. sulfidaeris, H.

axialensis e H. hydrothermalis. Em outro trabalho, por sequenciamento genético, foi

descoberta uma nova espécie para o gênero Marinobacter, a M. excellens. Esta foi

encontrada a partir de 5 estirpes de bactérias halofílicas, gram-negativas isoladas de

amostras de sedimento coletadas na Baía de Chazhma, mar do Japão (GORSHKOVA

et al., 2003). Além destes, autores como Xiang et al. (2004) estudaram micro-

organismos lipolíticos psicrófilos dos gêneros Psychrobacter, Pseudoalteromonas e

Pseudomonas, do filo Proteobacteria, sendo isolados de sedimentos profundos do

Oceano Pacífico.

10

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Amostras e Área de Estudo

A área de estudo compreendeu a Elevação do Rio Grande e o Lineamento

Cruzeiro do Sul, localizados na parte oeste do Oceano Atlântico Sul. As amostras

estudadas foram coletadas pelo biológo Dr. André Oliveira de Souza Lima (da

Universidade do Vale do Itajaí) durante a expedição Iatá-Piuna, a bordo da

embarcação NPq Yokozuka entre abril e maio de 2013, com o submergível Shinkai

6500 tendo seu percurso da África do Sul até o Rio de Janeiro, sendo o primeiro

submergível tripulado no Oceano Atlântico Sul. No total, foram analisadas cinco

amostras de invertebrados marinhos (Tabela 1).

Tabela 1. Amostras de invertebrados marinhos analisadas no presente estudo e região de origem.

Profundidade (m)

Grupo Organismo Origem

4129 Equinodermo Holotúria Lineamento Cruzeiro do Sul 4203 Anelídeo Poliqueta Lineamento Cruzeiro do Sul 3752 Equinodermo Ouriço do mar Lineamento Cruzeiro do Sul 1251 Cnidário Coral negro Elevação do Rio Grande 1251 Equinodermo Ofiúro Elevação do Rio Grande

4.2. Isolamento e Armazenamento dos Micro-organismos

Para o isolamento dos micro-organismos, as amostras de invertebrados foram

trituradas em água marinha estéril, na proporção 1:9. Em seguida, as amostras

homogeneizadas foram diluídas de forma decimal em série (até 10-4), utilizando como

diluente água marinha estéril. Posteriormente, placas de Petri contendo os meios Ágar

Marinho Diluído (AMD) e R2A Marinho Diluído (R2AD), ambos na proporção 1:5, foram

inoculadas com alíquotas de 100μl das diluições previamente preparadas, em

duplicata, e incubadas a 5ºC por quatro semanas. Transcorrido o tempo de incubação,

as placas foram examinadas e três colônias de cada tipo morfológico presentes, de

cada placa, selecionadas e repicadas para novas placas de meio de cultura, para seu

isolamento. Este processo foi repetido até a obtenção de colônias puras. Os micro-

organismos isolados foram armazenados em ultrafreezer (-80ºC), em caldo marinho

suplementado com glicerol a 20%.

11

4.3. Avaliação da Atividade Lipolítica e Endoglucanolítica

As bactérias isoladas foram analisadas quanto à sua atividade de lipases e

endoglucanase. Para tanto, em placas de Petri contendo meio sólido suplementado,

separadamente, com os substratos Tween20 (para evidenciar a atividade lipolítica) e

carboximetilcelulose (CMC, para evidenciar a atividade endoglucanolítica) a 0,5%

(SMIBERT; KRIEG, 1994). A partir da colônia isolada, placas de Ágar Marinho

contendo os substratos mencionados foram inoculadas de forma pontual em triplicata,

com auxilio de palitos de dentes autoclavados, e incubadas a 15ºC por duas semanas.

Transcorrido o tempo de incubação, os diâmetros das zonas de hidrólise (fh) foram

medidos, assim como o diâmetro das colônias (fc), e índices de atividade enzimática

(IE) foram calculados utilizando-se a fórmula: IE = fh/fc (HANKIN; ANAGNOSTAKIS,

1975). Todas as bactérias isoladas foram avaliadas.

Para evidenciar as zonas de hidrólise de CMC, as placas de Petri foram

inundadas com uma solução de vermelho do congo à 0,1%, para a atividade

endoglucanolítica. Após 20 minutos, as placas foram lavadas com solução de NaCl a

5M, sendo então possível a visualização dos halos de produção enzimática. Para as

placas contendo Tween20 não foi necessária a aplicação de corantes para

evidenciação do halo de produção enzimática (Figura 1).

Figura 1. Crescimento das colônias e halos nos meios CMC (A) e Tween 20 (B).

4.4. Análise de Dados

O crescimento (diâmetro das colônias) e os índices enzimáticos foram

comparados entre os micro-organismos com atividade, utilizando-se a Análise de

Variância e o teste post hoc de Tukey, com o software Statistica versão 8.0. Foram

considerados significantes valores que apresentaram níveis de p inferiores a 0,05.

A B

12

5. RESULTADOS

Neste trabalho foram obtidas através do isolamento, 68 linhagens de bactérias

das cinco amostras analisadas. Destas, 53% foram obtidas das amostras de holotúria

e ofiúro, das quais foram os únicos que, as bactérias presentes, tiveram atividade

enzimática tanto celulolítica quanto lipolítica. Conforme a Figura 2 pode-se observar

que a amostra de Coral foi a que rendeu menos quantidade de linhagens.

Figura 2. Distribuição das linhagens isoladas entre as cinco amostras analisadas de

invertebrados marinhos.

Vinte e nove das sessenta e oito linhagens obtidas, apresentaram alguma

atividade enzimática, e destas 18 apresentaram atividade lipolítica. A amostra de

holotúria apresentou-se como a mais representativa para obtenção de bactérias com

atividade endoglucanolítica, enquanto que para bactérias com atividade lipolítica a

amostra que mais se destacou foi a de Ouriço (Figura 3).

46%

31%

23%

Celulolíticas

28%

11%

44%

17%

Lipolíticas

Holotúria

Poliqueta

Ouriço

Coral

Ofíuro

Figura 3. Distribuição das linhagens com atividade lipolítica e endoglucanolítica entre as cinco

amostras analisadas de invertebrados marinhos.

13

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Holotúria Poliqueta Ouriço Coral Ofíuro

Nenhuma atividade

Ambas as atividades

Atividade celulolítica

Atividade lipolítica

Figura 4. Distribuição das amostras com atividade percentual de atividade enzimática.

Treze linhagens apresentam atividade endoglucanolítica, das quais seis foram

isoladas de holotúria [LAMA 1287, LAMA 1290, LAMA 1291, LAMA 1292, LAMA 1295

e LAMA 1298]. Destas seis, duas linhagens [LAMA 1290 e LAMA 1295] também

apresentaram atividade lipolítica, juntamente com outras três bactérias [LAMA 1281,

LAMA 1282 e LAMA 1283].

A segunda amostra que rendeu o maior número de linhagens celulolíticas foi a

de coral, com quatro linhagens com essa atividade enzimática. Nenhuma linhagem de

coral apresentou atividade lipolítica. Três linhagens obtidas da amostra de ofiúro

apresentaram atividade celulolítica [LAMA 1334, LAMA 1344 e LAMA 1348], e lipolítica

[LAMA 1339, LAMA 1340 e LAMA 1345].

Dois micro-organismos da amostra de poliqueta [LAMA 1303 e LAMA 1305] e

oito linhagens da amostra de ouriço [LAMA 1310, LAMA 1311, LAMA 1316, LAMA

1317, LAMA 1319, LAMA 1320, LAMA 1321 e LAMA 1322] apresentaram atividade

lipolítica, sendo este último o grupo mais representativo (44% do total de organismos

lipolíticos). Os micro-organismos destes invertebrados não apresentaram atividade

endoglucanolítica.

Os I.E.s foram analisados por ANOVA, e pode-se observar que, em relação á

atividade lipolítica, as linhagens LAMA 1283 e LAMA 1290 não apresentaram

diferença entre si (p=0,999925) (Figura 4), sendo os organismos com maior atividade

lipolítica. Para a hidrólise de CMC a linhagem LAMA 1334 foi a que apresentou maior

I.E. (Figura 4), se destacando das demais (em comparação com todas as amostras

p<0,005).

14

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

LAM

A 1

33

4

LAM

A 1

28

7

LAM

A 1

29

2

LAM

A 1

29

0

LAM

A 1

32

8

LAM

A 1

34

4

LAM

A 1

34

8

LAM

A 1

32

7

LAM

A 1

29

1

LAM

A 1

29

5

LAM

A 1

29

8

LAM

A 1

33

0

LAM

A 1

32

5

CMC

(mm)0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

LAM

A 1

28

3

LAM

A 1

29

0

LAM

A 1

28

2

LAM

A 1

28

1

LAM

A 1

32

0

LAM

A 1

34

0

LAM

A 1

32

1

LAM

A 1

32

2

LAM

A 1

30

3

LAM

A 1

33

9

LAM

A 1

31

6

LAM

A 1

30

5

LAM

A 1

31

7

LAM

A 1

31

1

LAM

A 1

31

9

LAM

A 1

31

0

LAM

A 1

34

5

LAM

A 1

29

5

Tween 20

(mm)

Figura 5. Média e desvio padrão (barras verticais) do índice enzimático nos meios contendo

CMC e Tween 20. Cor amarela, amostra de holotúria; cor violeta, amostra de coral; cor azul,

amostra de ofíuro; cor verde, amostra de ouriço; cor marrom, amostra de poliqueta.

Quando observamos o tamanho do diâmetro das colônias, vemos que, com

exceção da amostra LAMA 1310 (ouriço) que possuí um I.E. inferior, todas as outras

seguiram um padrão constante para o Tween20 (Figura 5). Já para no meio contendo

CMC, a amostra que não acompanhou o crescimento padrão foi LAMA 1325 (coral),

ambas tendo crescimento superior as demais.

Associando-se o I.E. com o crescimento das colônias, é possível observar que

a amostra que apresentou o maior I.E. para o CMC foi a que apresentou o menor

crescimento da colônia, enquanto que para o Tween 20 a linhagem com maior I.E.

apresentou-se com crescimento de colônia mediano. Para a linhagem com menor I.E.

de CMC, observou-se que esta se apresentou como a colônia de maior crescimento,

enquanto que para o Tween 20 não pode-se obter relação entre a linhagem com

menor valor de I.E. e o crescimento da colônia.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

LAM

A 1

32

5

LAM

A 1

32

7

LAM

A 1

29

5

LAM

A 1

34

4

LAM

A 1

29

8

LAM

A 1

32

8

LAM

A 1

29

0

LAM

A 1

33

0

LAM

A 1

28

7

LAM

A 1

29

2

LAM

A 1

29

1

LAM

A 1

34

8

LAM

A 1

33

4

CMC

(mm)

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

LAM

A 1

31

0

LAM

A 1

33

9

LAM

A 1

29

5

LAM

A 1

32

1

LAM

A 1

30

3

LAM

A 1

34

5

LAM

A 1

31

6

LAM

A 1

28

3

LAM

A 1

31

9

LAM

A 1

34

0

LAM

A 1

32

2

LAM

A 1

31

7

LAM

A 1

31

1

LAM

A 1

32

0

LAM

A 1

28

2

LAM

A 1

29

0

LAM

A 1

28

1

LAM

A 1

30

5

Tween 20

(mm)

Figura 6. Média e desvio padrão (barras verticais) do crescimento (diâmetro das colônias) dos

mcro-organismos com atividade hidrolitica nos meios contend CMC e Tween 20. Cor amarela,

amostra de holotúria; cor violeta, amostra de coral; cor azul, amostra de ofíuro; cor verde,

amostra de ouriço; cor marrom, amostra de poliqueta.

15

6. DISCUSSÃO

Neste estudo foram avaliados micro-organismos extraídos de invertebrados

marinhos, obtidos de zonas profundas região da Elevação do Rio Grande e do

Lineamento Cruzeiro do Sul, oceano Atlântico Sul, quanto à produção de lipase e

endoglucanase. Investigar a atividade de micro-organismos de ambientes extremos,

bactérias e suas enzimas metabólicas, se torna interessante não apenas por motivos

científicos, como também para desenvolvimento comercial, devido à atividade

catalítica alta em baixas temperaturas e especificidades incomuns destes organismos

(ZHANG; ZENG, 2008).

Neste trabalho a amostra de holotúria esteve entre as duas que

proporcionaram o isolamento de um maior número de micro-organismos. Isto está de

acordo com a sugestão de Zhang e colaboradores (2012) de que as bactérias atuam

na digestão de detritos no trato intestinal destes invertebrados. Estes autores

relataram o isolamento de 141 bactérias de holotúrias, sendo Bacillus e Vibrio os

principais gêneros identificados. As bactérias isoladas no presente estudo não foram

identificadas, porém para uma melhor avaliação dos resultados sugere-se que o

mesmo seja feito em realização de trabalhos futuros.

Os ofiúros constituem o único grupo de equinodermos que ocorrem em

populações densas. O sistema nervoso relativamente primitivo e sensorial dos

equinodermos tem sido incapaz de produzir um comportamento social com os outros

de sua própria espécie. Reese (1966) sugere que as agregações são dadas como

respostas individuais às características físicas do ambiente, por exemplo, estrelas

frágeis poderiam se reunir em áreas onde há fortes correntes e comida abundante,

podendo explicar a elevada presença de linhagens bacterianas na amostra deste

grupo de organismos, analisada no presente estudo.

A amostra de coral foi a que apresentou um menor número de linhagens de

bactérias com atividade enzimática. Isto pode ser explicado por Rosenberg et. al.,

(2007) onde a abundância de bactérias na camada de muco foi estimada em 105-106

unidades formadoras de colônias (UFC) por ml. Curiosamente, estes valores são de

aproximadamente 0,2 % do total de contagens bacterianas que foram determinadas

microscopicamente. Porém os autores ressaltam que há diferentes populações

bacterianas no muco, no esqueleto e no tecido a partir do mesmo fragmento de coral,

podendo acarretar em diferentes resultados nos estudos. Diversos autores relataram a

presença Vibrio, Aspergillus, Aurantimonas, Thalassomonas, e Serratia como

patógenos de corais em diferentes regiões.

16

No presente trabalho os micro-organismos exibiram variação tanto no diâmetro

dos halos quanto na própria formação deste. Isto pode ser devido ao fato das enzimas

excretadas por algumas bactérias não possuirem capacidade específica para degradar

o Tween 20 e/ou CMC, sendo que as bactérias podem apresentar divergência quanto

à degradação do substrato (JAEGER et al., 1994). Para o Tween 20 a variação

ocorreu entre 11,47 e 2,35mm e para o CMC foi entre 7,10 e 2,30mm. As linhagens

LAMA 1305, para Tween 20, e LAMA 1334, para CMC, foram as que apresentaram o

menor crescimento de colônia, sendo que esta última apresentou o maior Índice

enzimático, podendo indicar um alto potencial de produtividade enzimática, ao

contrário da linhagem LAMA 1325, a qual obteve maior crescimento da colônia, porém

baixo I.E., ressaltando que colônias pequenas com halos grandes resultam em valores

maiores de IE.

De modo geral, as linhagens que mais se diferiram do padrão das demais, nos

índices enzimáticos, foram as obtidas da amostra de ouriço, que proporcionou o

isolamento de maior quantidade de bactérias lipolíticas. Burnett (1997) explicou que

muitas espécies de equinodermos, em todas as cinco classes existentes, contêm

bactérias simbiontes subcuticulares (SCB), que tem sido objeto de estudo considerável

no que diz respeito à sua distribuição sistemática entre os equinodermos, possível

função e potencial para utilização em ensaios subletais de stress. Embora haja alguma

sugestão de que SCB pode estar envolvido com o metabolismo do nitrogênio, a

compreensão da base da simbiose, bem como as possíveis vantagens ou

desvantagens, quer hospedeiros ou simbiontes, é limitada. Com a possível

degradação de lipídeos para a colonização do hospedeiro, por estas bactérias

simbiontes subcuticulares, justifica-se o maior isolamento de micro-organismos

lipolíticos das amostras de ouriço. Para o substrato CMC apenas uma linhagem da

amostra de ofiúro apresentou uma diferença considerável na atividade hidrolítica, em

relação com as demais. Vale ressaltar que esta amostra foi a que rendeu um menor

número de linhagens bacterianas. É possível que este menor número de organismos

esteja relacionado com a presença de bactérias que não cresçam nos meios de

cultura empregados no isolamento. Isto é relatado para vários tipos de amostras, e

sugere uma relação de dependência da maioria da microbiota com seu hospedeiro.

Algumas cepas isoladas se destacaram em relação com seus índices

enzimáticos (Figura 3), sugerindo produção de enzima em quantidades maiores, e

que, em vez de permanecerem no interior das células, foram excretadas no meio

(MADIGAN et al., 2004). Estas enzimas extracelulares podem ser encontradas no

meio de cultivo ou de propagação celular, sendo então mais facilmente isoladas e

avaliadas. As enzimas originadas das bactérias possuem diferentes aplicações e

17

efeitos, como na área de álcool industrial para liquefação e sacarificação de

amiláceos, lavagem e limpeza na remoção de manchas, peles e couros para remoção

de elastina, alimentos protéicos na obtenção de hidrolisados e xaropes de alto teor de

frutose (KIELING, 2002). Portanto os micro-organismos que se destacaram no

presente estudo, podem ser avaliados de forma mais pontual para que sejam

aproveitados para suas respectivas aplicações.

A característica de bactérias marinhas apresentarem várias enzimas

hidrolíticas extracelulares é conhecida, pois são estas enzimas que permitem que os

micro-organismos participem na biodegradação de moléculas complexas de

polissacarídeos, proteínas e ácidos de nucléicos (ROMANENKO; KALINOVSKAYA;

MIKHAILOV 2000). Pereira (2009) encontrou atividade enzimática extracelular em sete

das vinte e uma linhagens analisadas. As amostras de ouriço, polvo e anêmona são

exemplos destas. Outro fator muito estudado é a atividade antimicrobiana retirada de

extratos de vários invertebrados marinhos como esponjas, corais e moluscos. Há

variantes entre as atividades desenvolvidas pelos corais, sendo que estes podem

possuir grandes ou pequenas atividades microbianas, isto pode ser explicado pela

associação que o coral possui com seus micro-organismos, por exemplo. Em estudos

realizados por Ritchie e colaboradores (2006) foi demonstrado que o muco que

determinados corais excretam podem inibir o crescimento de micro-organismos

potencialmente invasivos e mais de 20% das bactérias presentes neste muco

possuíam alta atividade antimicrobiana.

Pereira (2009) observou que das 72 bactérias cultivadas, 21 foram lipolíticas,

sendo que destas, 42,85% foram obtidas das amostras de ouriço, corroborando com o

presente estudo onde 44% dos micro-organismos lipolíticos foram provenientes da

amostra de ouriço. Maior atividade enzimática ocorreu sobre o substrato lipídico no

presente estudo, assim como observado por Rosa (2011), que relatou atividade

lipolítica em 67% dos isolados, e Cherobin (2009), no qual todos os isolados

apresentaram atividade lipolítica. Diniz (2012), estudando bactérias isoladas de

amostras de água, observou que quatorze das vinte cepas apresentou halos de

secreção de enzimas em três dos quatro substratos testados na temperatura de 30ºC,

cinco cepas apresentaram halos de secreção de enzimas em dois substratos testados

a 15ºC e, para a temperatura de 5ºC, somente cinco cepas apresentaram secreção

enzimática para o substrato lipase. Para o substrato CMC do mesmo estudo, nas três

temperaturas testadas, nenhuma cepa apresentou secreção enzimática, diferindo-se

do presente trabalho, onde das vinte e nove linhagens obtidas, onze foram de

atividade celulolítica. Isto demonstra que os invertebrados podem ser uma melhor

fonte de micro-organismos com atividade endoglucanolítica.

18

Comparando-se os trabalhos realizados com diferentes amostras e ambientes,

pode-se observar que Pereira (2009) e Cherobin (2009), relatam diferentes

porcentagens de micro-organismos lipolíticos, 29% e 100%, respectivamente, sendo

que ambos estudaram micro-organismos isolados de invertebrados marinhos. No

presente trabalho 26% (n=18) dos micro-organismos isolados apresentaram atividade

lipolítica. Por outro lado, Rosa (2011), estudando amostras de sedimento observou

que 66% apresentaram atividade lipolítica, enquanto que Diniz (2012), estudando

amostras de água, observou aproximadamente 38% de micro-organismos com esta

atividade. Portanto, não se pode concluir qual tipo de amostra proporcionou o

isolamento de um maior número de organismos com atividade lipolítica, porém os

micro-organismos, de maneira geral, podem ser considerados com um bom meio para

a produção enzimática.

19

7. CONCLUSÃO

As amostras de equinodermos proporcionam o isolamento de um maior número

de bactérias.

As bactérias de invertebrados, em especial de equinodermos, apresentaram

potencial para a obtenção de lipases e endoglucanases.

As bactérias de invertebrados são fontes melhores de organismos

endoglucanolíticos, enquanto que bactérias lipolíticas podem ser igualmente

obtidas de outros tipos de amostras, como água e sedimentos.

20

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICES

Apêndice 1. Micro-organismos isolados da região do Lineamento Cruzeiro do Sul.

Código Meio Mergulho Amostra Data

LAMA 1281 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013














LAMA 1295 R2A marinho diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013





LAMA 1300 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013







LAMA 1307 R2A marinho diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013



LAMA 1310 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013









LAMA 1319 R2A marinho diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013




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Apêndice 2. Micro-organismos isolados da região da Elevação do Rio Grande.

Código Meio Mergulho Amostra Data

LAMA 1332 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013











LAMA 1343 Ágar Marinho Diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013






LAMA 1323 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013







LAMA 1330 Ágar Marinho Diluído #1338 Coral 30/04/2013

LAMA 1331 Ágar Marinho Diluído #1338 Coral 30/04/2013

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