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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE ODONTOLOGIA
CRISTINA NASCIMENTO DE SOUZA
PAULA RABELLO FERNANDES
AVALIAÇÃO DO PODER ANTIMICROBIANO DO ÓLEO DE
MELALEUCA E DA PLANTA VERNONIA SCORPIOIDES EM
ALVEOLITE INDUZIDA EM RATOS.
Itajaí(SC), 2006.
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CRISTINA NASCIMENTO DE SOUZA
PAULA RABELLO FERNANDES
AVALIAÇÃO DO PODER ANTIMICROBIANO DO ÓLEO DE
MELALEUCA E DA PLANTA VERNONIA SCORPIOIDES EM
ALVEOLITE INDUZIDA EM RATOS.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para obtenção do Titulo de Cirurgião-Dentista do Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí.
Orientadora: Profa. Maria Regina Orofino Kreuger.
Itajaí (SC), 2006.
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AVALIAÇÃO DO PODER ANTIMICROBIANO DO ÓLEO DE MELALEUCA E DA PLANTA VERNONIA SCORPIOIDES EM ALVEOLITE INDUZIDA EM RATOS.
Cristina Nascimento de SOUZA e Paula Rabello FERNANDES Orientador: Prof. Dra. Maria Regina Orofino KREUGER Data de defesa: abril de 2006.
Resumo: Diversos medicamentos utilizados correntemente na terapêutica da clínica médica foram originados a partir de pesquisas com vegetais utilizados popularmente por diversas civilizações. A planta Vernonia scorpioides tem mostrado citotoxidade contra células tumorais, fungos e bactérias. Seus efeitos citotóxicos são atribuídos à presença do seu princípio ativo lactonas sesquiterpênicas. Da mesma forma a planta Melaleuca alternifolia
com seu óleo essencial conhecido como tea tree oil, é bastante utilizado como agente antimicrobiano na medicina popular com diversas publicações confirmando seu poder microbicida. Na presente pesquisa foram utilizados 32 ratos (Rattus novergicus albinus, Wistars) que foram divididos em quatro grupos. Grupo I: curetagem e irrigação com soro fisiológico; Grupo II: curetagem e irrigação com soro fisiológico e tratamento com Rifocina M® 25 mg; Grupo III: curetagem e irrigação com soro fisiológico e tratamento com óleo de Melaleuca a 2% e Grupo IV: Curetagem e irrigação com soro fisiológico e tratamento com fração DCM (diclorometano) da planta Vernonia scorpioides. Os animais foram sacrificados 21 dias pós-tratamento e as peças obtidas foram analisadas através de microscopia óptica. Os resultados foram submetidos a análises quantitativas e qualitativas. Com base nos achados, foi possível concluir que o óleo de Melaleuca teve comportamento semelhante ao Controle, já a Vernonia scorpioides apresentou grau de evolução semelhante ao da Rifocina, que ainda continua sendo uma excelente alternativa para tratamento de alveolites. Palavras-chave: alveolite, Melaleuca alternifolia, processo de reparo alveolar, Rifocina, Vernonia scorpioides.
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AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Deus por ter nos abençoado nos momentos de alegria e
carregado no colo nos momentos de fraqueza.
Agradecemos aos nossos pais, pelo apoio, dedicação e carinho ao longo
dessa trajetória e por mais esta vitória em nossas vidas.
À nossa orientadora e amiga Prof. Dra. Maria Regina, pela sabedoria em nos
orientar, pela confiança depositada em nós e pelos conhecimentos transmitidos
durante toda nossa formação acadêmica.
Agradecemos ao Setor de Apoio à Pesquisa da Universidade do Vale do Itajaí
e, em especial, ao Professor Nivaldo Murilo Diegoli.
Agradecemos a todos os funcionários que direta ou indiretamente
colaboraram para a execução dessa pesquisa, em especial: Alexandre Dala Cruz
por nos fornecer as bactérias, à professora Maique Biavatti por manipular o gel
contendo o composto ativo da planta Vernonia scorpioides e à professora Silvana
Leite pelo óleo de Melaleuca.
Aos funcionários do Laboratório de Histologia: Professor David RiveroTames,
Professora Christine K. Philippi, Maria de Lurdes Corrêa, Beatriz Pacheco Corrêa e
Professora Simony Davet Muller.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 5
2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................... 7 2.1 Alveolite................................................................................................. 7 2.2 Plantas Medicinais................................................................................ 10 2.3 Vernonia scorpioides........................................................................... 11 2.4 Melaleuca alternifolia........................................................................... 15 2.5 Rifocina.................................................................................................. 17
3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................... 19 3.1 Local da pesquisa................................................................................ 19 3.2 Animais.................................................................................................. 19 3.3 Substâncias químicas......................................................................... 19 3.4 Procedimentos...................................................................................... 20 3.5 Análise dos campos............................................................................ 21 3.6 Análise estatística................................................................................ 22
4 RESULTADOS.......................................................................................... 23 4.1 Determinação da porcentagem da área de Lesão Tecidual............. 23 4.2 Determinação da porcentagem da área de Tecido de Granulação.. 24 4.3 Determinação da porcentagem da área de Osteogênese................. 25 4.4 Análise das fotomicrografias.............................................................. 26
5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS........................................................... 32
6 CONCLUSÃO............................................................................................ 36
5
1 INTRODUÇÃO
O termo alveolite designa a inflamação de um alvéolo dentário após a
extração de um dente, sendo ela uma complicação da extração dentária. Ocorre
pela perturbação no processo de reparo alveolar causada pela degradação do
coágulo sangüíneo, devido a fatores de ordem geral e local. (CAMINO; LUZ, 2003)
Com o desaparecimento do coágulo o alvéolo torna-se vazio e seco, por esta
razão é também denominado de alvéolo seco. Manifesta-se geralmente no segundo
ou terceiro dia após a extração, com quadro clínico de dor intensa e halitose; em
alguns casos pode apresentar também mal-estar geral e hipertermia. (GRAZIANI,
1995; GREGORI, 2004)
Apesar de sua sintomatologia ser vastamente conhecida pelos cirurgiões -
dentistas, não é uma patologia freqüente, pois sua incidência é cerca de 4,12%. Por
possuir uma patogênese desconhecida, não existe ainda um método bem sucedido
para sua prevenção, contudo, vem diminuindo através do emprego de medidas
profiláticas. (CARVALHO; OKAMOTO, 1978)
Na tentativa de facilitar a conduta clínica, e visando aumentar a eficiência
antimicrobiana, o emprego de antibióticos tópicos ainda é o mais aceito, visto que o
uso de antibióticos sistêmicos provoca efeitos colaterais podendo também gerar
resistência microbiana.
O uso de plantas medicinais na medicina popular leva à pesquisa por novos
medicamentos. Órgãos de pesquisa no Brasil têm financiado (incrementando) a
pesquisa com fitoterápicos na busca de novas terapias.
A utilização das plantas como medicamentos para tratamento de doenças, é
uma prática realizada há muito tempo. Isso ocorre com a planta Vernonia
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scorpioides que é conhecida por provocar cicatrização de úlceras varicosas. Na
medicina popular é recomendada como uso externo de extrato aquoso para tratar
doenças da pele como alergias, parasitas, irritações, prurido dentre outros.
(MOARES, 1997; CABRERA; KLEIN,1980) Suas subfrações tem apresentado
atividade antitumoral. (PAGNO, 2004)
Atualmente sabe-se que a atividade tumoricida desta planta, deve-se a
presença do princípio ativo lactonas sesquiterpênicas. (BLIND; MOYA, 2005)
Da mesma forma a Melaleuca alternifolia é uma planta nativa da Austrália,
onde há milhares de anos o óleo essencial é feito de suas folhas maceradas, e é
utilizado como anti-séptico pelos povos aborígenes. (MARGOLIS, 2001) Segundo
PRD (2000), esta planta apresenta propriedades antimicrobianas, antivirais e
antimicóticas, sendo o óleo utilizado como medicamento em problemas de trato
respiratório e problemas de pele.
A aplicação deste óleo na forma de gel a 20% em alvéolo dental de ratos
demonstrou toxicidade celular e retardo na evolução do processo de reparo.
(TERRES; MELO, 2004) Desta forma a diminuição de concentração poderá levar a
menor dano, e possivelmente preservar a ação bactericida já relatada na literatura.
Sabendo das propriedades microbicidas e ou citotóxicas destas plantas
utilizadas na medicina popular, o objetivo da presente pesquisa é analisar o efeito
destas substâncias na alveolite experimental.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Alveolite
Alveolite é uma patologia gerada por complicações nas extrações dentárias,
de natureza infecciosa causada principalmente por estreptococos e estafilococos. A
ocorrência de alveolites nas exodontias varia de 2 a 6%, sendo que para terceiros
molares inferiores em semi-oclusão o índice atinge 25%. (CARVALHO et al., 1991)
Após e extração dental forma-se um coágulo sangüíneo no local, com
organização eventual do coágulo por tecido de granulação e uma substituição
gradual por um tecido osso primário e, finalmente, por osso maduro. (CARVALHO;
OKAMOTO, 1978)
A complicação mais comum da cicatrização de extrações é conhecida como
“alvéolo seco”. É uma osteomielite focal na qual o coágulo sangüíneo se desfaz ou
desloca, resultando em odor e dor intensa. (SHAFER et al., 1987) A infecção
constitui a única causa mais importante de retardo na cicatrização. (KUMAR et al.,
2005) De acordo com Poi et al., (1998) a presença de infecção durante ou após a
extração, trauma excessivo do osso alveolar durante a cirurgia, circulação
sangüínea insuficiente no alvéolo e o aumento da atividade fibrinolítica acentuada,
também são fatores que podem desencadear alveolite. É caracterizada pela
ausência ou perda de coágulo devido às condições esclerosantes das paredes do
alvéolo, onde há ausência de vasos para nutrir o coágulo. (GRAZIANI, 1995)
São fatores predisponentes para a ocorrência de alveolite, a idade (entre 30 e
40 anos), pacientes fumantes, usuários de pílula anticoncepcional, o sexo (em
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mulheres a incidência é de 3:2) e também as extrações em molares inferiores.
(CARVALHO et al., 1991)
A alveolite usualmente ocorre nos primeiros dias após a extração, mas é
sabido que pode ocorrer até mesmo uma semana ou mais tarde. (SHAFER et al.,
1987) Observa-se a desintegração do coágulo sangüíneo, quando o paciente
queixa-se de dor intensa e pulsátil e apresentando halitose freqüentemente refratária
aos analgésicos comuns. (CAMINO; LUZ, 2003)
Nota-se a mucosa gengival marginal edemaciada, hiperêmica, com o tecido
ósseo exposto, ou mesmo recoberto por um coágulo sangüíneo em avançada fase
de desorganização. (GREGORI, 2004)
Seu tratamento resume-se à limpeza cirúrgica até a colocação de materiais
medicamentosos no interior do alvéolo após a limpeza como o Arpenyl, Alvogyl,
Alveoliten, Alveosan e Gilfoan embebido em antibiótico. (CARVALHO et al., 1991)
Após a extração de um dente inicia a conhecida seqüência de inflamação,
epitelização, fibroplastia e remodelação vista em reparo de feridas na pele ou na
mucosa. Os alvéolos cicatrizam por segunda intenção, e muitos meses devem
passar até que um alvéolo alcance um grau máximo de cicatrização. (PETERSON et
al., 2005)
O alvéolo vazio é composto de osso cortical coberto por fibras do ligamento
periodontal rompidas, com uma borda de epitélio oral deixada na porção coronária.
Este se enche de sangue, que coagula promovendo o selamento do alvéolo do
ambiente da cavidade oral. (Ibidem)
O estágio inflamatório ocorre na primeira semana de cicatrização. Células
brancas do sangue entram no alvéolo para remover as bactérias contaminantes da
área e começam a destruir quaisquer restos, tais como fragmentos ósseos, deixados
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no alvéolo. A fibroplastia também ocorre nessa semana com o crescimento de
fibroblatos e capilares. (Ibidem)
A segunda semana é marcada pela grande quantidade de tecido de
granulação que preenche o alvéolo. Somente 4 a 6 meses após a extração, a
cortical óssea que forma o alvéolo é completamente reabsorvida. À medida que o
osso vai preenchendo o alvéolo, o epitélio caminha em direção à crista óssea
adjacente e, eventualmente, atinge o mesmo nível da crista óssea. (Ibidem)
O único remanescente visível do alvéolo depois do transcurso de 1 ano é a
faixa de tecido fibroso pouco vascularizado que permanece sobre o processo
alveolar edêntulo. (Ibidem)
Após a exodontia em ratos o período em que o alvéolo leva para neoformar
totalmente o trabeculado ósseo (processo de reparo) é de 21 dias. Porém, manobras
pós-exodônticas podem retardar a cronologia desse processo, como a curetagem e
a irrigação intra-alveolar (influência na formação do coágulo). (CARVALHO et al.,
1983)
Os antibióticos ganharam credibilidade e aceitação geral da teoria bacteriana
da alveolite para tratamento de infecção alveolar. Essa teoria afirma que a infecção
do local da extração é iniciada por bactérias presentes na flora normal. Carvalho et
al., (1997) relataram que a Rifocina M® quando usada na irrigação de alvéolos
dentais infectados de ratos, mostrou-se um antibiótico eficaz no processo de reparo
alveolar.
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2.2 Plantas Medicinais
A utilização de plantas medicinais nos programas de atenção primária à
saúde pode se constituir numa forma muito útil de alternativa terapêutica, por sua
eficácia aliada a um baixo custo operacional. (MATOS et al., 1998) As plantas
medicinais têm o seu poder, que precisa de maior investigação químico-
farmacológica, não só para confirmar um efeito orientado popularmente, como
também para esclarecer orientações tão pouco elucidativas de ordem popular.
(ALMEIDA, 1993)
Muitas espécies de plantas no Brasil têm sido largamente empregadas pela
população, algumas com estudos químicos e farmacológicos que dão suporte a sua
utilização, outras empregadas a partir do conhecimento empírico ou tradicional da
população. (SIMÕES et al., 1999)
Um dos principais aspectos relevantes na procura de substâncias a serem
empregados como agentes medicinais, provém do conhecimento prévio das
informações da medicina popular sobre o uso de plantas medicinais. (SOUZA, 1998)
Atualmente, alguns fatores têm contribuído para o aumento da utilização de
plantas medicinais, tais como: a crise econômica, o alto custo dos medicamentos
industrializados, o difícil acesso da população à assistência médica e farmacêutica,
bem como uma tendência generalizada dos consumidores em utilizar,
preferencialmente, produtos de origem natural. (SIMÕES et al., 1999)
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2.3 Vernonia scorpioides
A família Asteraceae compreende cerca de 920 gêneros com
aproximadamente 19.000 espécies, sendo, portanto a maior família das
angiospermas. São plantas de hábito muito variado, ervas, sub-arbustos, trepadeiras
ou excepcionalmente árvores. A grande maioria dos gêneros é constituída de
plantas de pequeno porte. (JOLY, 1998)
Esta família contém ampla diversidade de constituintes químicos, como
alcalóides, cumarinas, saponinas (BRUNETON, 1991) e flavonóides, mas são os
terpenóides denominados lactonas sesquiterpênicas os compostos característicos
da família Asteraceae. (PICMAM, 1986a) Atribuem-se a essas lactonas
sesquiterpênicas algumas atividades biológicas, incluindo atividade antitumoral,
antiinflamatória, antibacteriana, antifúngica, anticefaléia, citoprotetora gástrica e
efeitos neurotóxicos. (BLANCO et al., 2001)
Entre vários membros da família Asteraceae com atividade medicinal, inclui-
se a tribo Vernoniae, a qual pertence o gênero Vernonia. A variedade de compostos
presentes no gênero Vernonia constitui um importante tópico para pesquisa na
busca da descoberta de novas propriedades medicinais. (BOHLMANN et al., 1981;
PICMAN, 1986b)
Este gênero possui várias espécies consagradas pelo uso medicinal, como a
Vernonia guianensis, que é utilizada pela população de Camarões como um anti-
helmíntico, afrodisíaco, antídoto em envenenamentos e para tratamento de malária e
icterícia. Durante uma pesquisa por princípios antiparasitais em plantas medicinais
camaronesas (a casca do galho de Vernonia guianensis) ocorreu o isolamento de
dois compostos do tipo estigmasterol (vernoguinosterol e vernoguinosídeo) com
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significativa inibição da atividade Tripanossoma brucei rhodesiense. (TCHINDA et
al., 2002)
A Vernonia brachycalyx é usada por suas propriedades antiprotozoárias.
(OKETCH-RABAH et al., 1997) Na Índia extratos alcoólicos de flores de Vernonia
cinera foram testados por seus efeitos antiinflamatórios adjuvantes no tratamento de
artrite. (LATHA et al., 1998) No Brasil, o extrato aquoso de folhas frescas da espécie
Vernonia condensata é usado para tratar distúrbios gastrointestinais. (MONTEIRO et
al., 2000) A espécie Vernonia amygalina foi investigada por várias atividades:
antitumoral (KUPCHAN et al., 1969; OBASEIKI-EBOR et al., 1993); e antimicrobiana.
(JISAKA et al., 1993) Foi investigado também o efeito antimicrobiano de Vernonia
acutangula. (ALBUQUERQUE et al., 1998)
A espécie Vernonia scorpioides é conhecida popularmente como Piracá,
Enxuga, Erva-Preá e Erva - São- Simão, floresce durante a primavera, estendendo-
se seu período de floração desde julho até dezembro ou janeiro. (CABRERA; KLEIN,
1980) Vegeta nas matas e terrenos abertos, sendo comum em toda América do Sul
como em todo o Brasil (CORREA, 1974; CABRERA; KLEIN, 1980), sua localidade
típica é em Brasília. Apresenta expressiva dispersão por toda a região da mata
pluvial, da encosta atlântica em Santa Catarina, sendo encontrada desde o extremo
norte até o extremo sul, interando-se pela “Porta de Torres” no estado do Rio grande
do Sul. Em sentido oeste se encontra no Alto vale do Itajaí. (CABRERA; KLEIN,
1980)
O extrato de Vernonia scorpioides é popularmente conhecido por favorecer a
cicatrização de úlceras varicosas. Esta erva tropical cresce facilmente em solos
pobres e devastados em todo o país. As pessoas nativas recomendam o uso
externo de extrato aquoso de Vernonia scorpioides para tratar várias doenças de
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pele como alergias, parasitas, irritações, prurido entre outras. (CABRERA; KLEIN,
1980)
Em 2001, Campos demonstrou que o extrato etanólico de folhas de Vernonia
scorpioides não apresentava atividade antimicrobiana na concentração até
1000µg/ml contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Contudo as frações
diclorometano e hexano, em menores concentrações demonstraram atuar contra
Staphylococcus aureus e também contra fungos Trichophyton mentagrophytes e
Microsporum gypseum.
A planta Vernonia scorpioides tem sido estudada em diversas atividades
biológicas, apresentando efeitos citotóxicos na maioria dos testes realizados.
Estudos prévios mostraram que a fração diclorometano e a hexano são bactericidas
e fungicidas. (CAMPOS, 2001)
Em 2002, Dalazen e Molon avaliaram o potencial de promoção de resposta
reparadora, induzindo por uma pomada contendo extrato bruto da planta,
demonstrando que esta foi tóxica na fase aguda do processo inflamatório, o que não
ocorreu após 21 dias de tratamento, exibindo uma resposta cicatrizante, quando
comparada com o grupo controle.
O extrato bruto alcoólico da planta Vernonia scorpioides é aplicado em úlcera
de membros inferiores em idosos no Centro de Idosos de Itajaí. Sua ação em lesões
da derme foi estudada experimentalmente em cobaias, mostrando que na fase de
cicatrização as lesões tratadas com extrato eram mais fibrosadas. (LEITE et al.,
2004) Dalazen et al. (2005), mostraram um efeito citotóxico deste extrato na fase
aguda de lesões cutâneas provocadas em camundongos.
Pagno, em 2004, estudou e demonstrou o efeito antitumoral da fração
Diclorometano (DCM), obtida a partir do extrato bruto desta planta em camundongos
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portadores de Tumor Ascístico de Ehrlich. Com os resultados obtidos, a fração DCM
foi submetida a novos fracionamentos e suas novas subfrações já foram estudadas,
principalmente na atividade antineoplásica. A subfração 2125 obtida do extrato
eliminou o Tumor Ascístico Sarcoma 180 em camundongos. (PACHECO; D’ÁVILA
JÚNIOR, 2005)
Atualmente já foram identificadas 5 lactonas sesquiterpênicas como sendo os
princípios ativos desta planta. (BLIND; MOYA, 2005) Propriedades antifúngicas,
antibacterianas, citotóxicas e antitumorais, são atribuídas às lactonas
sesquiterpênicas. (KUMARI et al., 2003)
No gênero Vernonia scorpioides, encontram-se as lactonas sesquiterpênicas
(WARNING et al., 1986), que formam um dos maiores grupos de compósitos
citotóxicos e antitumorais de plantas. (BRUNETON, 1991) Estudos comprovaram a
presença desses compostos, através do espectro de infravermelho de extrato de
folhas e caules de Vernonia scorpioides ( Lam.) Pers. ( FREIRE et al., 1996)
Estudos com lactonas sesquiterpênicas puras ou em extratos purificados de
plantas contendo tais lactonas foram testados para a atividade antimicrobiana, onde
a maioria dos resultados foi positivo, inibem bactérias Gram positivas
(Staphylococcus aureus, Bacilos subtilis, Streptococcus faecalis) e Gram negativas
(Escherichia coli, Proteus mirabilis e Pseudomas fluorescens), porém a atividade
contra as Gram positivas é mais eficaz sendo que as mais ativas foram as
eudesmanolídes. (PICMAN, 1986a; PICMAN; TOWERS, 1983)
Estudos sugerem que o mecanismo de ação antibacteriana dos compostos
com cetonas e lactonas insaturadas é através da reação destes grupos com o
grupamento tiol de enzimas, provavelmente interferindo em vários processos
fisiológicos das células. (PICMAN; TOWERS, 1983)
15
2.4 Melaleuca alternifólia
A árvore Melaleuca alternifólia pertencente ao gênero Melaleuca (família
Mirtaceae) é uma planta nativa da Austrália. Foi primeiramente utilizada por
aborígines australianos que retiravam de suas folhas maceradas o óleo essencial,
também conhecido como tea tree oil ou óleo de Melaleuca. (SCHULZ et al., 2000) A
Melaleuca alternifólia é uma árvore cujas propriedades medicinais também vêm
sendo estudadas. Das folhas e ramos desta árvore onde o óleo essencial é extraído,
é utilizado como desinfetante, em infecções do trato respiratório, úlcera na mucosa
oral, gengivites, micoses, úlceras, queimaduras e picadas de insetos. (PDR, 2000)
Existem evidências que os aborígenes australianos esmagavam folhas de
Melaleuca alternifolia para obter cataplasmas de ação antibacteriana séculos antes
do conhecimento científico sobre os microorganismos. (WILLIANS et al., 1990)
O comitê australiano de padronização estabeleceu que o óleo deve conter
quantidades de cienol abaixo de 15% e de terpineneo-4-ol acima de 30%, para que
tenha eficácia mínima como anti-séptico. Esses níveis são indicados principalmente
porque o cienol é conhecido como irritante da pele e o terpineno-4-ol é apontado
como o maior contribuinte da atividade antimicrobiana dentre os componentes.
(Ibidem)
O óleo de Melaleuca possui um amplo espectro de ação e essa propriedade
está relacionada ao componente terpineno-4-ol. Sua atividade antimicrobiana mais
efetiva é contra bactérias Gram positivas como o Staphylococcus aureus e bactérias
Gram negativas como Escherichia coli, sendo que no caso dessas bactérias sua
morte ocorre devido ao extravasamento dos íons de potássio. (COX et al., 2000)
16
Penfold, em 1929, foi o primeiro a detectar as propriedades antimicrobianas
da planta Melaleuca alternifólia. (KONEMAN et al., 1992) Hart et al. (2000),
mostraram a habilidade dos componentes aquosos do óleo em suprimir a produção
in vitro, de agentes pró-inflamatórios como fator de necrose tumoral , interleucinas e
prostaglandina E2.
O Staphylococcus aureus é o mais importante patógeno humano dentre os
estafilococos, embora faça parte da microbiota normal humana, é freqüentemente
isolado de infecções em feridas pós-cirúrgicas. (KONEMAN et al., 1992)
Em estudo realizado por Cox et al. (2000), os microorganismos Escherichia
coli e Staphylococcus aureus foram expostos a concentração inibitória mínima do
óleo (0,25% para Escherichia coli e 0,5% para Staphylococcus aureus). Nestas
concentrações o óleo causa a inibição da respiração celular, permitindo a
penetração de substâncias às quais a membrana celular geralmente é impermeável,
além da perda de íons de potássio.
Segundo PRD (2000), apresenta propriedades antimicrobianas, antivirais e
antimicóticas, sendo o óleo utilizado como medicamento em problemas de trato
respiratório e problemas de pele.
O óleo pode ser usado puro ou diluído em água, sendo que o óleo sem
diluição causa reações alérgicas e irritações na pele, não sendo recomendado para
uso interno. (SCHULZ et al., 2000)
As concentrações freqüentemente empregadas são de 2 a 10% (SCHULZ et
al., 2000). Cox et al. (2000), em estudo in vitro, relataram que na concentração de
0,5% o óleo possui efeito antimicrobiano frente ao Staphylococcus aureus . Terres e
Mello (2004), realizaram um estudo para verificar a capacidade antimicrobiana da
aplicação tópica do óleo de Melaleuca a 20%, sobre o processo de reparo em
17
alvéolo dental infectado demonstrando uma toxicidade celular e retardo na evolução
do processo de reparo.
2.5 Rifocina
Rifamicinas ou rifocinas são uma família de antibióticos pertencente ao
grupo das ansamicinas ou macrolídeos. As rifamicinas são obtidas a partir do
Streptomyces mediterranei. Existem várias rifamicinas: A, AG, B, C, D, E, L, O, SV,
W, X e Y. Dessas, só a B, e a SV foram selecionadas para uso clinico, dada sua
maior atividade e menor toxicidade. Todas as rifamicinas utilizadas clinicamente são
semi-sintéticas, obtidas a partir das rifamicinas B e SV. (FONSECA, 1991)
A Rifocina M atua através de uma ação direta, inibe a síntese dos ácidos
nucléicos, DNA ou RNA, impedindo a replicação da transmissão genética, tem
portanto, ação bacteriostática. (FERRAZ, 1982) Entretanto, devido ao fato de os
germes abrangidos por seu espectro apresentarem sensibilidade a concentrações
muito baixas desses antibióticos, os níveis sangüíneos obtidos podem, na prática,
ter atividade bactericida. (FONSECA, 1991)
O espectro de ação dessa droga é mais ativo contra germes Gram
positivos, mesmo em baixas concentrações, principalmente o Staphylococcus
aureus, inclusive os produtores de penicilinase. Para os germes Gram-negativos,
exigem concentrações maiores. (LACAZ, 1975)
A Rifocina M possui um efeito tópico excelente em infecções orais.
(TORTAMANO, 1995) A irrigação preventiva com Rifocina M, diminui a incidência da
alveolite de maneira significativa. (OGAWA; MARIANO, 1997)
18
Uma das vantagens da aplicação tópica do antibiótico, é o fornecimento
concentrado do agente no local afetado, sem haver diluição por todo o corpo.
Porém, a aplicação tópica apresenta algumas desvantagens, como a dificuldade de
reter níveis terapêuticos no sítio de aplicação, pois o agente é facilmente dissolvido,
depurado, diluído ou “lavado” pela saliva. Há o risco de o hospedeiro apresentar
alergia ou sensibilidade, embora seja relacionado quase que exclusivamente com a
penicilina. (NEWMAN; KORMANN, 1990)
19
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Local da pesquisa
Laboratório de pesquisa do curso de Odontologia, Centro de Ciências da
Saúde, Campus Itajaí.
3.2 Animais
Foram utilizados neste experimento 32 ratos (Rattus norvegicus albinus,
Wistar), fêmeas, com idade variando de 70 a 90 dias, quando do início do trabalho,
com peso entre 250 e 300g. Os animais foram alimentados com ração industrial e
água antes, durante as fases experimentais.
Os experimentos foram conduzidos de acordo com os Princípios de
Pesquisas Biomédicas envolvendo animais (normas internacionais), que tem o
objetivo de evitar o uso excessivo ou inapropriado de animais de experimento,
devendo incentivar o uso e o cuidado adequado antes, durante e após a
experimentação. Todos os animais foram tratados adequadamente, evitando seu
sofrimento ao máximo (GOLDIN JÚNIOR, 1997).
3.3 Substâncias químicas
• Óleo de Melaleuca na concentração de 2%, diluído em gel neutro de carbopol,
elaborado pela farmácia escola do Curso de Farmácia da UNIVALI.
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• Pomada a base de extrato de Vernonia scorpioides 20% e 24g de vaselina
sólida e 56g de lanolina.
• Solução aquosa de Rifocina M® 25mg.
3.4 Procedimentos
Os animais foram divididos em quatro grupos:
Grupo I: 8 ratos, limpeza cirúrgica com cureta, irrigação com soro fisiológico (grupo
controle negativo).
Grupo II: 8 ratos, limpeza cirúrgica com cureta, irrigação com soro fisiológico e
irrigação com Rifocina M® 25mg (grupo controle positivo).
Grupo III: 8 ratos, limpeza cirúrgica com cureta, irrigação com soro fisiológico e
aplicação tópica de óleo de Melaleuca a 2%.
Grupo IV: 8 ratos, limpeza cirúrgica com cureta, irrigação com soro fisiológico e
aplicação tópica da fração DCM da Vernonia scorpioides.
Os ratos foram sacrificados por perfusão 21 dias após o tratamento.
Os ratos foram anestesiados com ketamina 8mg/Kg peso e xylazina 10mg/Kg
peso, mediante injeção intramuscular e os animais foram submetidos à extração do
incisivo superior direito de acordo com a técnica descrita por Okamoto e Russo
(1973). Os alvéolos foram irrigados com soro fisiológico e em seguida foram
contaminados com 200 µl de uma suspensão de Staphylococcus aureus, na
concentração 5x 106 bactérias por ml de salina, elaborada pelo laboratório de
microbiologia do Curso de Farmácia da UNIVALI.
Após 72 horas, com a constatação da infecção e verificando um botão de pus
nos alvéolos, estes foram curetados superficialmente e irrigados com solução de
21
soro fisiológico. Em seguida os ratos receberam o tratamento conforme os grupos
citados anteriormente. As aplicações medicamentosas foram feitas com auxílio de
seringas de 1 ml, dando como finalizada a aplicação com o extravasamento do
medicamento pelo alvéolo, aproximadamente 50 !l.
Após 21 dias, os animais foram novamente anestesiados, o tórax foi aberto e
o coração exposto sendo perfundidos com solução de formol a 10%. A maxila direita
foi separada da esquerda com uma incisão sagital mediana. Outra incisão foi feita
tangenciando a superfície distal dos terceiros molares, obtendo um bloco contendo o
alvéolo do incisivo direito. Em seguida, as peças foram imersas em solução de
formol a 10% durante 24 horas e descalcificados com ácido fórmico a 5% durante 21
dias. Após, foram desidratados em soluções de concentrações crescentes de álcool
etílico (70%,90%, 100%), diafanizados em xilol e incluídos na parafina. Em
micrótomo foram obtidos cortes semi-seriados de 7 !m de espessura que foram
colocados em lâminas de vidro para microscopia, e submetidos a colorações de
Hematoxilina e Eosina (HE) em seguida, cobertos com lamínula e fixada com resina.
Os cortes foram fotografados com o auxílio de fotomicroscópio ( Olympus PM-
20).
3.5 Análise dos campos
O terço médio do alvéolo foi analisado e dividido em três áreas (anterior,
médio e posterior). Um retículo de 100 quadrantes acoplado a um microscópio óptico
foi utilizado para determinar a porcentagem de área de lesão tecidual (necrose,
exsudato e coágulo), osteogênese e tecido de granulação, em um aumento de 100
vezes.
22
A média das três leituras de cada corte foi determinada e expressa
graficamente.
3.6 Análise estatística
As médias obtidas na análise das áreas de: lesão tecidual, osteogênese e
tecido de granulação, foram comparadas através da Análise de Variância (ANOVA).
As diferenças estatísticas entre os grupos foram analisadas segundo o teste de
Tukey.
23
4 RESULTADOS
4.1 . Determinação da porcentagem da área de Lesão Tecidual.
Considerou-se área de lesão tecidual a presença no alvéolo de coágulo,
exsudato contendo fibrina e tecido necrosado. A média da leitura da porcentagem
dos alvéolos em estudo apresentou os seguintes resultados. O grupo Controle,
infectado e tratado com solução de soro fisiológico foi o que apresentou a maior
média de área de necrose, exsudato e coágulo (21,8%), o grupo de alvéolos
tratados com óleo de Melaleuca a 2% demonstrou evolução levemente melhor que o
grupo Controle (20,76%) porém, menor em comparação aos grupos de alvéolos que
receberam tratamento com fração DCM de Vernonia scorpioides e tratamento com
Rifocina M®. Já os alvéolos que receberam fração DCM tiveram um processo
cicatricial superior aos grupos já citados (14,85%) mas inferior ou retardado quando
comparado ao tratamento com Rifocina M® (6,79%). Entretanto, na análise
estatística os dados não apresentaram diferença significante. (Gráfico 1). As
fotomicrografias 1A, 2A, 3A e 4A representam a maior área de lesão tecidual
encontrada em cada grupo em estudo.
24
ÁREA DE LESÃO TECIDUAL
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
controle rifocina vernonia melaleuca
Tratamento
Po
rce
nta
ge
m d
e l
es
ão
te
cid
ua
l
Gráfico 1- Ilustração gráfica dos valores médios da área de lesão tecidual nos alvéolos analisados.
4.2 Determinação da porcentagem da área de Tecido de Granulação
As áreas contendo células inflamatórias, neovasos e fibras colágenas foram
determinadas em porcentagem utilizando a mesmo retículo e aumento microscópico
citados na metodologia. A média das leituras dos alvéolos, mostrou que os alvéolos
tratados com a fração DCM foram aqueles que apresentaram menor área de tecido
de granulação (20,68%), seguido do grupo Controle (21%), do grupo tratado com
Rifocina M® (26,89%) e finalmente do grupo tratado com óleo de Melaleuca
(27,03%), demonstrado no gráfico 2. Os dados dos grupos não apresentaram
diferença estatisticamente significantes entre si. As áreas de tecido de granulação
estão ilustradas nas fotomicrografias 1B, 2B, 3B e 4B.
25
ÁREA DE TECIDO DE GRANULAÇÃO
0
5
10
15
20
25
30
35
40
controle rifocina vernonia melaleuca
Tratamento
Po
rcen
tag
em d
e ár
ea d
e te
cid
o d
e g
ran
ula
ção
Gráfico 2- Ilustração gráfica dos valores médios da área de tecido de granulação presente nos alvéolos analisados. 4.3 Determinação da porcentagem da área de Osteogênese
Com relação à área de osteogênese formada, o grupo tratado com Rifocina
M®, foi o que apresentou maior quantidade, quando comparado aos outros três tipos
de tratamento. A média da porcentagem de nova formação óssea nesse grupo foi de
47,31%. Os alvéolos infectados que receberam solução de soro fisiológico
apresentaram uma quantidade de osteogênese (43,85%). O tratamento com óleo de
Melaleuca e com a fração DCM demonstraram um retardo na quantidade de
osteogênese, sendo 40% e 39,24% a área de neoformação óssea respectivamente,
ilustrado no gráfico 3. A comparação entre os dados obtidos não foi significante na
26
análise estatística As fotomicrografias 1B, 2B, 3B e 4B representam a maior área de
osteogênese em cada grupo analisado.
ÁREA DE OSTEOGÊNESE
0
10
20
30
40
50
60
70
controle rifocina vernonia melaleuca
Tratamento
Po
rcen
tag
em d
a ár
ea d
e o
steo
gên
ese
Gráfico 3- Ilustração gráfica dos valores médios da área de osteogênese presente nos alvéolos analisados.
4.4 Análise das fotomicrografias
Analisando os resultados entre os animais do mesmo grupo (em todos os
grupos tratados), observou-se um comportamento que diferiu entre eles. Isso pode
ser explicado pela manobra pós-exodôntica.
27
As fotomicrografias demonstram o desvio-padrão que ocorreu entre cada
grupo, onde pelo menos um alvéolo de cada grupo apresentou grande quantidade
de coágulo e avançada osteogênese.
28
Fotografia 1 A : Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Controle Negativo – Presença de grande área de lesão tecidual (LT), e menor área de tecido de granulação (TG), e osteogênese (O). Coloração H.E Aumento de ± 4 x 3,5.
Fotografia 1 B : Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Controle Negativo – Presença de pouca lesão tecidual (LT), tecido de granulação em moderada quantidade (TG), e avançada osteogênese (O). Coloração H.E. Aumento de ± 4 x 3,5.
29
Fotografia 2 A : Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Melaleuca – Presença de grande área de lesão tecidual (LT), pequena área de tecido de granulação (TG) e Osteogênese retardada (O). Coloração de H.E. Aumento de ± 4 x 3,5.
Fotografia 2 B: Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Melaleuca –
Presença de menor área de lesão tecidual (LT), moderada quantidade de tecido de granulação (TG) e Osteogênese (O). Coloração H.E. Aumento de ± 4 x 3,5.
30
Fotografia 3 A: Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Vernonia – Presença
de área de lesão tecidual (LT), tecido de granulação (TG), e osteogênese (O) em quantidades proporcionais. Coloração H.E. Aumento de ± 4 x 3,5.
Fotografia 3 B: Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Vernonia – Ausência
de lesão tecidual (LT), pequena área de tecido de granulação (TG) e avançada área de osteogênese (O). Coloração H.E. Aumento de ± 4 x 3,5.
31
Fotografia 4 A: Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Rifocina – Presença de área de lesão tecidual (LT), tecido de granulação (TG) e osteogênese (O) em quantidades proporcionais. Coloração H.E.Aumento de ± 4 x 3,5.
Fotografia 4 B: Fotomicrografia de alvéolo dental de rato. Grupo Rifocina – Ausência
de área de lesão tecidual (LT), pequena área de tecido de granulação (TG) e avançada área de osteogênese (O). Coloração H.E. Aumento de ± 4 x 3,5
32
5 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
A alveolite é uma complicação pós-operatória rara que se constitui numa das
patologias mais pesquisadas dentro da Odontologia. Esta patologia originou uma
grande quantidade de estudos em busca de uma forma ideal para a sua prevenção e
tratamento.
Quando um paciente é infectado depois de uma cirurgia, a recuperação e a
cicatrização das feridas são substancialmente retardadas. (PETERSON et al., 2005)
A presença de microorganismos numa área de lesão é um dos fatores locais
que interferem na qualidade do reparo, retardando o processo cicatricial. Os
microorganismos podem multiplicar-se e causar uma infecção onde proteínas
bacterianas são liberadas destruindo o tecido do hospedeiro. (Ibidem)
Segundo Kumar et al. (2005), a infecção constitui a única causa mais
importante de retardo da cicatrização.
Os experimentos da presente pesquisa mostraram que animais do
mesmo grupo (em todos os grupos tratados) apresentaram comportamentos
diferentes. Em cada grupo, alvéolos apresentaram coágulo enquanto outros se
apresentaram com área de osteogênese mais evoluída. O fato de ter ocorrido um
desvio-padrão acentuado pode ser atribuído ao ato cirúrgico, que muitas vezes em
um animal pode ser mais traumático que em outro, podendo inclusive interferir na
análise dos resultados. Segundo Carvalho et al., (1983) após a exodontia em ratos o
período em que o alvéolo leva para neoformar totalmente o trabeculado ósseo
(processo de reparo) é de 21 dias. Porém, manobras pós-exodônticas podem
retardar a cronologia desse processo, como a curetagem e a irrigação intra-alveolar
(influência na formação do coágulo).
33
Todos os dados analisados entre os grupos Melaleuca e Controle indicaram
um resultado semelhante na cicatrização dos alvéolos. Porém, os alvéolos
infectados e irrigados com soro fisiológico apresentaram maior quantidade de área
de lesão tecidual. Os alvéolos tratados com óleo de Melaleuca apresentaram
resultados com maior porcentagem de tecido de granulação e menor área de
osteogênese, sugerindo que a atividade microbicida atribuída a este óleo não foi
eficiente, podendo ter sido inclusive inferior ao tratamento com soro fisiológico. É
possível que este retardo se deva à concentração utilizada neste experimento (2%).
Segundo Schulz et al. (2000), as concentrações freqüentemente empregadas
do óleo de Melaleuca são de 2 a 10%. Cox et al. (2000), fazendo um estudo in vitro,
mostraram que o óleo de Melaleuca possui efeito antimicrobiano frente ao
Staphylococcus aureus já na concentração a 0,5%. Resultados de alvéolos de ratos
infectados e tratados com óleo de Melaleuca a 20%, demonstraram toxicidade e
grandes extensões de áreas lesadas. (TERRES; MELLO, 2004)
Os resultados obtidos neste trabalho com o grupo que recebeu Rifocina M®
como tratamento, foram semelhantes aos já descritos na literatura.
Fonseca (1991), afirmou que as Rifocinas usadas clinicamente têm maior
atividade e menor toxicidade. Além disso, possuem um excelente efeito tópico em
infecções orais. (TORTAMANO, 1995)
O tratamento com Rifocina tem se mostrado eficiente contra bactérias,
especialmente Gram-positivas, como o Staphylococcus aureus, sendo utilizada no
tratamento da alveolite dental infecciosa. (OGAWA; MARIANO, 1997). Os resultados
da presente pesquisa confirmam a maior indicação deste produto já utilizado
comercialmente para o tratamento de lesões infectadas como alveolites.
34
Apesar da Rifocina ser amplamente utilizada na clínica e ser relatada na
literatura como tendo excelente atividade microbicida, os alvéolos que receberam
tratamento com a fração DCM de Vernonia scorpioides apresentaram maior
quantidade de lesão tecidual quando comparados com os alvéolos tratados com
Rifocina M®. Porém, na periferia de alguns alvéolos, o osso apresenta-se mais
compacto e com menor quantidade de tecido de granulação. A área de cicatrização
do alvéolo está mais reduzida, podendo sugerir uma aceleração no processo do
reparo alveolar.
Dalazen et al., (2005) mostraram que o uso do extrato desta planta nas lesões
cutâneas de camundongos, foi citotóxico na fase aguda da inflamação, porém, não
retardando o processo de formação de tecido de granulação. Leite et al. (2004),
publicaram que o uso diário do extrato de Vernonia scorpioides em lesões cutâneas
de cobaias, apresentou melhor cicatrização quando analisado após 30 dias de
tratamento. Popularmente, o extrato desta planta é utilizado na cicatrização de
úlceras de membros inferiores em idosos no Centro de Idosos de Itajaí. A literatura
relata que as plantas do gênero Vernonia apresentam lactonas sesquiterpênicas na
sua constituição às quais são atribuídas as propriedades antifúngicas,
antibacterianas, citotóxicas e antitumorais. (KUMARI et al., 2003)
A redução da área de cicatrização pode indicar maior atividade microbicida e
cicatrizante dos compostos existentes nesta planta, já que conforme Kumar et al.
(2005), o processo de contração diminui a área das feridas a serem cicatrizadas por
segunda intenção. Este processo de cicatrização acontece em alvéolos dentais pós-
exodontias. (PETERSON et al., 2005)
Os resultados desta pesquisa indica que o óleo de Melaleuca teve
comportamento semelhante ao Controle, já a Vernonia scorpioides apresentou grau
35
de evolução semelhante ao da Rifocina, que ainda continua sendo uma excelente
alternativa para tratamento de alveolites.
36
6 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que:
- Os alvéolos do grupo tratado com soro fisiológico, foram os que maior
retardo tiveram na cicatrização.
-Os alvéolos que receberam óleo de Melaleuca a 2%, apresentaram quadro
cicatricial levemente mais evoluído que o grupo controle.
- O grupo tratado com Rifocina M®, apresentou resposta cicatricial
semelhante ao descrito na literatura relativo ao processo de reparo de alvéolos
infectados.
- O tratamento com a fração DCM de Vernonia scorpioides apresentou grau
de evolução cicatricial semelhante ao tratado com Rifocina M®.
37
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