UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PHILIPE COSTAsiaibib01.univali.br/pdf/Philipe Costa.pdf · Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO ... Color. Cópia de computador (Printout(s))

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PHILIPE COSTA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DE

Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO

MIRSINÓICO A E TRIGLICERÍDEO SOBRE A MEMÓRIA DE ANIMAIS

NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO

Itajaí - 2011

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

PHILIPE COSTA




NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO

Dissertação submetida ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Profa. Dra. Márcia M. de Souza Co-orientador: Profa. Dra. Angela Malheiros

Itajaí, Maio de 2011.

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FICHA CATALOGRÁFICA

C823a

Costa, Philipe, 1984- Avaliação da atividade do extrato dos frutos de Rapanea ferruginea e dos compostos isolados ácido mirsinóico A e triglicerídeo sobre a memória de animais normais e com Alzheimer induzido [manuscrito] / Philipe Costa. – 2011. 133 f. : il. Color. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, 2011. “Orientadora: Profª. Drª. Márcia M. de Souza ”. “Co-orientadora: Profª. Drª. Angela Malheiros

Bibliografia: f. 114-132.

1. Alzheimer, doença de. 2. Memória. 3. Enzimas. I. Souza, Márcia M. de. II. Malheiros, Angela. III. Título.

CDU: 616.831

Claudia Bittencourt Berlim – CRB 14/964

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NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO.

PHILIPE COSTA

‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências

Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’

____________________________________ Márcia Maria de Souza, Doutora

Orientadora __________________________________________________________

Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________

Doutora Márcia Maria de Souza (UNIVALI) Presidente

______________________________________

Doutora Angela Malheiros Co-orientadora

______________________________________

Doutor Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI) Membro

______________________________________

Doutor Claudio da Cunha (UFPR) Membro

Itajaí (SC), 27 de Maio de 2011.

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Aos meus pais, Mário e Inês, que acreditaram no meu sonho

e me incentivaram a seguir adiante; e, a Janaína pela

compreensão e amor em todos os momentos.

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AGRADECIMENTOS

Esta dissertação é fruto de muito trabalho, pesquisa e dedicação. Muitas

pessoas participaram desta conquista, e, graças a sua ajuda, conquistei os

resultados aqui expostos;

Primeiramente gostaria de agradecer às minhas orientadoras, Márcia Maria

de Souza, pelo carinho e dedicação em todos os momentos; Angela Malheiros,

pelos ensinamentos e ajuda com a bolsa de estudos e Cristiane Bürger, que mesmo

não sendo oficialmente orientadora, me auxiliou como qual. Aprendi com vocês

muito mais do que se encontra aqui exposto;

Muitas amizades foram feitas durante o Mestrado. Quero deixar aqui

registrado a participação dos meus amigos Luiz Carlos Klein Júnior, José Roberto

Santin, Aline Debrassi, Thaisa Baccarin, Alessandro Silveira, Marivane Lemos,

Isabel Machado, Juliana Paula de Souza e Nicole Meira. Também aos meus mestres

e amigos Sérgio Faloni de Andrade, Clóvis Antonio Rodrigues e Rivaldo Niero;

Vários alunos da graduação me ajudaram durante os experimentos. Em

especial a Bruna Tridapalli, que realizou os ensaios bioquímicos; Stefany Andrade

Serrão, Carla Jane Weber, Taise Quevedo e Ana Elisa, que me auxiliaram com os

experimentos farmacológicos; e, Bruna Silva e Fellippe Wolff, que ajudaram com o

isolamento dos compostos;

Aos funcionários da UNIVALI, Maria Angélica Teixeira de Azevedo, pela sua

dedicação com os laboratórios e animais que utilizei durante os experimentos; e,

Pedro Pablo Perez Netto, pela determinação e análise dos espectros de RMN;

Agradeço ainda a bolsa de estudos cedida pelo Instituto Nacional de Ciência

e Tecnologia para a Inovação Farmacêutica (INCT-IF) e Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por intermédio de Ivan da

Rocha Pitta, e, o auxílio financeiro, concedido pelo meu tio Ademar Felisky, no início

de meus estudos.

Meus sinceros agradecimentos a todos vocês.

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“A mente que se abre a uma nova idéia jamais

voltará ao seu tamanho original”.

Albert Einstain

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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DA



NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO.

Philipe Costa Maio/2011

Orientador: Márcia Maria de Souza, Doutora. Co-orientador: Angela Malheiros, Doutora Área de Concentração: Ciências Farmacêuticas Número de Páginas: 133

A Doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa que implica na destruição neuronal, acarretando em perda de tecido cerebral e levando o paciente à demência. Esta patologia ainda não possui cura e o tratamento existente apenas diminui os sintomas de falta de memória. Compostos de origem natural vêm sendo avaliados por diversos pesquisadores visando o tratamento desta patologia. Este trabalho proporcionou um estudo farmacológico de um extrato diclorometano da Rapanea ferruginea (ERF) e seus compostos isolados ácido mirsinóico A (AMA) e um triglicerídeo (TGL), ainda não identificado, sobre a memória de animais normais e com DA induzida por estreptozotocina (STZ). O ERF foi fracionado por cromatografia em coluna e resultou na purificação dos compostos AMA e TGL, os quais foram identificados por ressonância magnética nuclear (RMN). O ERF também foi avaliado por RMN e constatou-se predominância dos dois compostos no extrato. Para a indução da DA, camundongos fêmeas (25-35g) receberam infusão intraventricular (ICV) de STZ (2,5 mg/mL - 0,2uL) em duas aplicações com latência de 48h entre elas. Após a indução da DA os animais foram tratados com ERF (50, 150 e 300 mg/kg – v.o.), AMA (5, 15 e 30 mg/kg – v.o.), TGL (5, 15 e 30 mg/kg – v.o.), veículo ou galantamina (0,5 mg/kg – v.o.). A memória foi avaliada através do teste da esquiva inibitória. Também foram verificados os efeitos dos tratamentos nos testes complementares do Open Field (OF) e labirinto em cruz elevado (LCE). Após os ensaios farmacológicos os animais foram sacrificados por método de guilhotina e, os cérebros foram retirados para a realização de avaliação bioquímica das enzimas antioxidantes. A determinação dos efeitos do ERF sobre a memória dos animais normais demonstrou que este extrato apresenta ação facilitadora para todas as etapas (aquisição, consolidação e evocação) da memória. Em animais com DA o tratamento com ERF (50, 150 e 300 mg/kg) produziu facilitação da consolidação da memória dos animais (125,0; 145,0 e 180,0 s respectivamente) de forma semelhante ao fármaco galantamina (133,0 s). O tratamento dos animais com TGL produziu uma melhora na cognição, sendo a menor dose (5mg/kg) a mais eficiente (165,0 s). Um perfil farmacológico semelhante ao ERF foi observado com AMA. Animais tratados com AMA (15 e 30 mg/kg) também tiveram facilitação (140,0 s; 143,5 s respectivamente) da consolidação da memória na esquiva inibitória. Quando avaliados no OF e LCE os resultados demonstraram que o ERF e o AMA não

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produziram alterações comportamentais relacionadas à ansiedade e à locomoção. Entretanto, TGL na dose de 30 mg/kg de produziu um efeito ansiogênico aumentando a permanência e a freqüência de entradas no braço fechado, além do aumento no número de rearings. Os ensaios bioquímicos caracterizaram um aumento na atividade das enzimas SOD, CAT, GPx e GR no córtex cerebral dos animais com DA tratados com o TGL na dose de 5 mg/kg, sugerindo que o efeito neuroprotetor do TGL possa ser mediado pelo aumento da atividade das enzimas do sistema antioxidante. O nível de peroxidação lipídica caracterizado pelo ensaio do MDA reduziu, confirmando ainda que o TGL protege o tecido cerebral dos animais da degradação lipídica causada pela STZ. Os ensaios bioquímicos realizados com o tecido cerebral dos animais tratados com o AMA reveralaram que este composto não apresenta atividade sobre as enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR. De modo geral, pode-se constatar que a melhora da cognição verificada nos animais tratados com o ERF pode estar relacionada com a atividade farmacológica que os compostos isolados AMA e TGL apresentaram. Palavras-chave: Rapanea ferruginea. Doença de Alzheimer, Memória. Ácido mirsinóico A. Triglicerídeo. Enzimas antioxidantes.

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EVALUATION OF ACTIVITY OF Rapanea ferruginea FRUIT

EXTRACT AND THE ISOLATED COMPOUNDS MIRSINOIC ACID A

AND TRIGLYCERIDE ON THE MEMORY OF NORMAL ANIMALS

AND WITH ALZHEIMER'S INDUCED

Philipe Costa

April/2011

Advisor: Márcia Maria de Souza, Doctor Co-advisor: Angela Malheiros, Doctor Area of Concentration: Pharmaceutical Sciences Number of Pages: 133

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder that involves neuronal damage, resulting in loss of brain tissue and leading to dementia. This disease has no cure, and the only existing treatment involves reducing the symptoms of memory loss. Natural compounds have been tested by many researchers with the aim of treating this condition. This work provides a pharmacological study of a dichloromethane extract of Rapanea ferruginea (ERF) and its isolated compounds mirsinoic acid A (AMA) and an unidentified triglyceride (TGL), on the memory of normal mice, and mice with streptozotocin-induced DA (STZ). The ERF was fractionated by column chromatography, resulting in the purification of AMA and TGL, which were identified by nuclear magnetic resonance (NMR). The ERF was also evaluated by NMR, and a predominance of the two compounds was found in the extract. For the induction of AD, female mice (25-35g) received an intraventricular infusion (ICV) of STZ (2.5 mg/mL - 0.2 uL) in two applications with latency of 48 hours between them. After induction of DA, the animals were treated with ERF (50, 150 and 300 mg / kg - po), AMA (5, 15 and 30 mg / kg - po), TGL (5, 15 and 30 mg / kg - vo ), vehicle or galantamine (0.5 mg / kg - po). The memory was assessed using the inhibitory avoidance test. Were also verified the effects of the treatments in the Open Field (OF) and elevated plus maze (EPM) tests. After the pharmacological tests, the animals were sacrificed by the guillotine method, and the brains were removed for biochemical evaluation of the antioxidant enzymes. The determination of the effects of ERF on memory in normal animals demonstrated that this extract has facilitating action for all stages (acquisition, consolidation and evocation) of memory. In animals with DA, treatment with ERF (50, 150 and 300 mg/kg) produced facilitation of memory consolidation in the animals (125.0, 145.0 and 180.0 respectively) similar to the drug galantamine (133.0 s). Treatment of animals with TGL produced an improvement in cognition in these animals, the lower dose (5 mg / kg) being the most efficient (165.0 s). The AMA produced a similar pharmacological profile to ERF. Animals treated with AMA (15 and 30 mg / kg) also had facilitation (140.0 s, 143.5 s respectively) of memory consolidation in inhibitory avoidance. When evaluated in the OF and EPM, the results showed that the ERF and the AMA did not produce behavioral changes related to anxiety and

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locomotion. However, TGL at a dose of 30 mg/kg produced an anxiogenic effect, increasing the persistence and frequency of entries into the closed arm, and also increased the number of rearings. Biochemical assays characterized the increase in activity of SOD, CAT, GPx and GR in the cerebral cortex of AD animals treated with TGL at a dose of 5 mg/kg, suggesting that the neuroprotective effect may be mediated by TGL, increasing the enzymatic activity of the antioxidant system. The level of lipid peroxidation, characterized by the reduced malondialdehyde assay, also confirmed that TGL protects the animal’s brain tissue from lipid degradation caused by STZ. Biochemical experiments performed with brain tissue from animals treated with the AMA revealed that this compound apparently has no activity on the antioxidant enzymes SOD, CAT, GPx and GR. In general, in is observed that the improvement in cognition observed in animals treated with ERF may be related to the pharmacological activity of the isolated compounds TGL and AMA.

Key words: Rapanea ferruginea. Alzheimer’s disease. Memory. Mirsinoic acid A. Triglyceride. Antioxidant enzymes.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização de uma placa amilóide.................................................................................................25

Figura 2 Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização das alterações neurofibrilares de TAU..........................................................................27

Figura 3 Fotografia da Rapanea ferruginea evidenciando a altura da árvore e os galhos com frutos..................................................................................34

Figura 4 Fórmula estrutural do (a) ácido graxo, (b) glicerol e (c) triglicerídeos. Sendo R uma cadeia hidrocarbônica com número de carbonos e de insaturações diferentes para cada ácido graxo. A numeração 1,2 e 3 refere-se à posição de cada ácido graxo no triglicerídeo......................40

Figura 5 Fotografia demonstrando a avaliação da memória no teste da esquiva inibitória.................................................................................................50

Figura 6 Fotografia demonstrando a avaliação da ansiedade no modelo do labirinto em cruz elevado......................................................................51

Figura 7 Fotografia demonstrando a avaliação da capacidade locomotora através do modelo do Open Field. .......................................................52

Figura 8 Indução de DA através do modelo farmacológico da STZ para avaliação da memória...........................................................................53

Figura 9 Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr3a.................................61

Figura 10 Representação estrutural da molécula de um triglicerídeo demonstrando a numeração relacionada aos carbonos relacionados no espectro de RMN..................................................................................62

Figura 11 a) Espectro de RMN 13C (b) Espectro de RMN 13C/DEPT da Sfr3a (CDCl3, 75,5 MHz).................................................................................63

Figura 12 Representação da estrutura molecular do ácido mirsinóico A..............64

Figura 13 Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr7b................................65

Figura 14 a) Espectro de RMN13C. b) Espectro de RMN13C/DEPT da Sfr7b (CDCl3, 75,5 MHz).................................................................................66

Figura 15 Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do ERF..................................68

Figura 16 Espectro de RMN13C (CDCl3, 75,5 MHz) do ERF.................................69

Figura 17 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg) 1 hora antes do treino (A – aquisição), imediatamente após o treino (B – consolidação)

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e 1 hora antes do teste (C – evocação), sobre a latência de descida dos ratos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001)..........................................................................73

Figura 18 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre memória dos ratos com DA induzida por STZ (2,5mg/mL - 0,2uL) nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8- 10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).......................................................76

Figura 19 Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg e Galantamina (0,5 mg/kg) sobre a memória dos animais nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001)............................................................78

Figura 20 Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre a latência de descida dos ratos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01); *** (p<0,001)........................................81

Figura 21 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................83

Figura 22 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................84

Figura 23 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.

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Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................85

Figura 24 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................86

Figura 25 Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de animais tratados com DA induzida por STZ e tratados com TGL (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................87

Figura 26 Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................88

Figura 27 Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg)

sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................89


sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................90


sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................91

Figura 30 Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de camundongos

tratados com DA induzida por STZ e tratados com AMA (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................92

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato diclorometano da R. ferruginea......................................................................................45

Tabela 2 Reunião das frações obtidas na CC1.....................................................46

Tabela 3 Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento da FR3........................46


Tabela 5 Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da FR4....................... 47


Tabela 7 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o Sfr3a e comparação com os dados da literatura para o triglicerídeo.............................................................................................62

Tabela 8 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H e 13C obtidos para o Sfr7b e comparação com os dados da literatura para o AMA........................................................................................................67

Tabela 9 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL.........................................................................................................69

Tabela 10 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL.........................................................................................................70

Tabela 11 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..................74

Tabela 12 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo......................................................................................................74

Tabela 13 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..........................................................................76

Tabela 14 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do LCE. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..................77

Tabela 15 Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o

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comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n=10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)................................................................................79

Tabela 16 Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); *** (p<0,001)......................79

Tabela 17 Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo......................................................................................................81

Tabela 18 Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..............................................................................................82

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LISTA DE ABREVIATURAS

ACh – Acetilcolina

AChE – Acetilcolinesterase

AChT - Acetiltransferase

AcOEt – Acetato de etila

AINES – Antiinflamatórios não-esteroidais

AMA – Ácido mirsinóico A

AMB – Ácido mirsinóico B

APP – Proteína precursora amilóide

ATP – Adenosina tri-fosfato

Aβ – Beta amilóide

BChE – Butirilcolinesterase

CAT – Catalase

CC – Cromatografia em coluna

CCD – Cromatografia em camada delgada

ChAT - Acetiltransferase

CoA – Coenzima A

DA – Doença de Alzheimer

D-Gal – D-Galactose

DHA – Ácido docosahexanóico

DM – Diclorometano

ERF – Extrato diclorometano de Rapanea ferruginea

EROs – Espécies reativas de oxigênio

GPx – Glutationa peroxidase

GR – Glutationa redutase

Hex – Hexano

ICV – Intracerebroventricular

IR – Receptor de insulina

LCE – Labirinto em cruz elevado

MDA - Malondialdeído

MDL – Memória de longa duração

MeOH – Metanol

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OF – Open Field

RMN ¹H – Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RMN ¹³C – Ressonância magnética nuclear de carbono-13

SNC – Sistema Nervoso Central

SOD – Superóxido dismutase

STZ – Estreptozotocina

TAU – Proteína TAU

TBARS – Ácido Tiobarbitúrico

TGL - Triglicerídeo

TMS – Tetrametilsilano

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................21

2 OBJETIVOS............................................................................................................23

2.1 Objetivo Geral.....................................................................................................23

2.2 Objetivos Especificos........................................................................................23

3 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................24

3.1 Doença de Alzheimer.........................................................................................24

3.1.1 Conceito............................................................................................................24

3.1.2 Epidemiologia....................................................................................................25

3.1.3 Distúrbios neuroquímicos..................................................................................25

3.1.4 Sintomas da Doença de Alzheimer...................................................................28

3.1.5 Estresse oxidativo e Alzheimer.........................................................................29

3.1.6 Processos inflamatórios e Alzheimer................................................................30

3.1.7 Tratamento........................................................................................................31

3.1.8 Modelos farmacológicos para o estudo do Alzheimer.......................................33

3.3 Aspectos gerais sobre plantas medicinais......................................................35

3.4 Gênero Rapanea e Rapanea ferruginea...........................................................37

3.5 Lipídios e doença de Alzheimer........................................................................39

4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................43

4.1 Material: ..............................................................................................................43

4.1.1 Material Vegetal: ...............................................................................................43

4.1.2 Material e Reagentes: ......................................................................................43

4.1.3 Equipamentos: ..................................................................................................44

4.2 Métodos ..............................................................................................................45

4.2.1 Obtenção do extrato..........................................................................................45

4.2.2 Fracionamento cromatográfico do extrato.........................................................45

4.3 Ensaios farmacológicos....................................................................................49

4.3.1 Animais..............................................................................................................49

4.3.2 Tratamentos......................................................................................................49

4.3.3 Modelo de avaliação da memória – teste da esquiva inibitória.........................49

4.3.4 Modelo de ansiedade - teste do labirinto em cruz elevado...............................50

4.3.5 Modelo de deambulação - teste do Open Field................................................51

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4.3.6 Indução do Alzheimer pelo modelo da Estreptozotocina..................................52

4.3.7 Avaliação da memória de animais normais tratados com o ERF......................53

4.3.8 Determinação da memória dos animais com Alzheimer induzido por

estreptozotocina e tratados com o ERF.....................................................................54

4.3.9 Determinação da memória dos animais com Alzheimer induzido por STZ e

tratados com o TGL....................................................................................................54

4.3.10 Avaliação da memória dos animais com Alzheimer induzido por

estreptozotocina e tratados com o AMA.....................................................................54

4.4 Análises bioquímicas “in vitro”........................................................................55

4.4.1 Preparação das amostras do tecido cerebral....................................................56

4.4.2 Medida dos sistemas e produtos oxidativos......................................................56

4.5 Análise Estatística..............................................................................................57

5 RESULTADOS........................................................................................................59

5.1 Obtenção e rendimento do ERF, Sfr3a e Sfr7b................................................59

5.2 Identificação das substâncias isoladas e análise do ERF.............................59

5.2.1 Identificação da substância Sfr3a......................................................................59

5.2.2 Identificação da substância Sfr7b......................................................................64

5.2.3 Análise do ERF por RMN..................................................................................67

5.3 Ensaios farmacológicos....................................................................................71

5.3.1 Atividade do ERF sobre a memória de animais normais..................................71

5.3.2 Ação do ERF sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com

Alzheimer induzido por Estreptozotocina...................................................................75

5.3.3 Atividade do TGL sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com


5.3.4 Efeito do AMA sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com


5.4 Medidas de sistemas e produtos oxidativos...................................................80

5.4.1 Efeito do TGL sobre a atividade da Superóxido Dismutase..............................82

5.4.2 Ação do TGL sobre a atividade da Catalase.....................................................83

5.4.3 Efeito do TGL sobre a atividade da Glutationa Peroxidase..............................84

5.4.4 Ação do TGL sobre a atividade da Glutationa Redutase..................................85

5.4.5 Efeito do TGL sobre os níveis de Malondialdeído.............................................86

5.4.6 Efeito do AMA sobre a atividade da Superóxido Dismutase.............................87

21

5.4.7 Ação do AMA sobre a atividade da Catalase....................................................88

5.4.8 Efeito do AMA sobre a atividade da Glutationa Peroxidase..............................89

5.4.9 Ação do AMA sobre a atividade da Glutationa Redutase................................90.

5.4.10 Efeito do AMA sobre os níveis de Malondealdeido.........................................91

6 DISCUSSÃO...........................................................................................................93

7. CONCLUSÕES....................................................................................................113

REFERÊNCIAS........................................................................................................114

ANEXO 1..................................................................................................................133

22

1 INTRODUÇÃO

O Mal de Alzheimer ou Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem

neurodegenerativa caracterizada pela irreversível e progressiva perda de memória,

diminuição do desempenho nas atividades diárias, fala e percepção visual, seguida

pela completa demência (KOEDAM; PIJNEBUR; DEEG, 2008).

Geralmente, a primeira estrutura cerebral atingida pela DA é o hipocampo,

que por sua vez, é uma estrutura chave do Sistema Nervoso Central (SNC) nos

processos de memória. Posteriormente, a progressão da doença afeta as outras

estruturas cerebrais levando aos sintomas da demência (MIMURA, 2008).

A deposição da proteína beta-amilóide (Aβ) em diversas áreas do tecido

cerebral é assumida como o início da cascata patológica da doença, que resulta na

perda e disfunção sináptica, além da morte cerebral (CHUANG, 2010).

Na DA ocorrem distúrbios bioquímicos diversos decorrentes da formação

das placas senis pelos agregados da proteína Aβ. Estas alterações provocam

disfunções na homeostasia do cálcio, resposta inflamatória neuronal, estresse

oxidativo com conseqüente aumento de radicais livres. Estas ações interferem nos

fatores de transcrição nuclear e ocasionam a apoptose, levando a danos sinápticos

e neurotoxicidade, que induzem a DA (KELLY; FERREIRA, 2006).

A acetilcolina (ACh) é um importante neurotransmissor do SNC e sistemas

periféricos, responsável por grande parte das transmissões colinérgicas no

organismo. Diversos estudos demonstram que a deficiência do funcionamento do

sistema colinérgico está ligada à perturbação da memória, e, uma vez que na DA

ocorre destruição dos neurônios colinérgicos, ocorrem os sintomas patológicos

relatados (ABREU-VILLAÇA; FIGUEIRA; MANHÃES, 2010).

Alguns medicamentos aprovados para o tratamento da DA são inibidores da

acetilcolinesterase (AChE), como a tacrina, rivastigmina, donepezil e galantamina.

Sendo a AChE a enzima responsável pela hidrólise de acetilcolina, os

medicamentos utilizados para o tratamento dos sintomas da DA produzem um

aumento na memória através da inibição da enzima, aumentando os níveis cerebrais

de ACh (FORLENZA, 2005).

Mais de 35.000 espécies de plantas medicinais já foram estudadas pela

comunidade científica, além de mais de 4000 compostos de origem natural, entre

23

eles flavonóides, terpenos e alcalóides (MANACH et al., 2004). Como exemplo,

pode-se citar a galantamina, uma substância de origem natural que é utilizada no

tratamento da DA desde 2000. Este composto, que é um alcalóide fenantrênico,

demonstra que as substâncias oriundas de plantas medicinais são fundamentais na

pesquisa de novos fármacos na terapêutica da DA (BARREIRO, 2009).

Em contrapartida, verifica-se uma busca cada vez maior da população, em

grande maioria os idosos, a terapias alternativas como as plantas e os produtos

naturais (SANTOS et al., 2007)

A Rapanea ferruginea (Myrsinaceae) é uma planta medicinal cujas

propriedades terapêuticas vêm sendo largamente estudas, possuindo atividades

antinociceptiva (GALVAN, 2007), antiinflamatória (ANTONIALLI, 2008) e anti-

hiperglicemiante (MONTEIRO et al., 2007) relatadas. Além disso, alguns compostos

dela isolados, como os ácidos mirsinóicos A e B, apresentam ação

anticolinesterásica “in vitro” o que impulsiona estudos de ação sobre a DA (GAZONI,

2009; FILLIPIN, 2010).

Em virtude disto, a R. ferruginea apresenta-se como uma espécie candidata

à realização de estudos para investigação de potencial terapêutico frente à DA, uma

vez que apresenta características farmacológicas relevantes ao tratamento e

estagnação da patologia. Neste sentido, o presente trabalho direciona esforços para

contribuir com a avaliação do potencial terapêutico da Rapanea ferruginea.

24

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar os efeitos de um extrato diclorometano de frutos da Rapanea

ferruginea (ERF) e seus compostos isolados sobre a memória de animais normais e

animais com doença de Alzheimer induzida por estreptozotocina (STZ).

2.2 Objetivos Específicos:

a) preparar um extrato de frutos secos da Rapanea ferruginea através de

maceração com diclorometano;

b) fracionar o ERF por cromatografia em coluna visando obter compostos

purificados

c) identificar os compostos isolados por RMN ¹H e ¹³C;

d) avaliar o perfil fitoquímico do ERF por RMN

e) analisar os efeitos do ERF sobre as etapas (aquisição, consolidação e

evocação) da memória de animais normais;

f) avaliar os efeitos do ERF e dos compostos TGL e AMA em animais com

Alzheimer induzido por STZ

g) averiguar se os efeitos do ERF e dos compostos TGL e AMA podem ser

influenciados pela ansiedade através do modelo do labirinto em cruz elevado;

h) investigar se os efeitos do ERF e dos compostos TGL e AMA podem sofrer

interferência pela capacidade locomotora através do modelo do Open Field;

i) determinar os efeitos do TGL sobre as enzimas antioxidantes superóxido

dismutas, catalase, glutationa peroxidase e glutationa redutase de tecido

cerebral;

j) avaliar o nível de peroxidação lipídica em tecido cerebral através do teste do

malondialdeído, na presença do TGL

k) determinar os efeitos do AMA sobre as enzimas antioxidantes SOD e CAT

25

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Doença de Alzheimer

3.1.1 Conceito

A DA foi descrita inicialmente pelo médico alemão, Alois Alzheimer em 1906.

Alzheimer definiu a doença como uma patologia neurológica, qualificada como uma

demência, onde se destacavam os sintomas de déficit de memória, alterações de

comportamento e incapacidade para atividades rotineiras. Alzheimer ainda

evidenciou características anatomopatológicas como o acúmulo de placas senis e de

emaranhados neurofibrilares, além da perda neuronal (FRATIGLIONI; WINBLAD;

STRAUSS, 2007).

Segundo o DSM-IV-TR (2008), os transtornos de demência caracterizam-se

pelo desenvolvimento de múltiplos déficits cognitivos (incluindo comprometimento da

memória) devido aos efeitos fisiológicos diretos de uma condição médica geral, aos

efeitos persistentes de uma substância ou de múltiplas etiologias, como efeitos

combinados de doença cerebrovascular e DA (

A DA é a forma mais comum de demência. A demência é caracterizada pelo

declínio progressivo e global das funções cognitivas, na ausência de um

comprometimento agudo do estado de consciência, e que seja suficientemente

importante para interferir nas atividades sociais e ocupacionais do indivíduo

(ABREU, FORLENZA; BARROS, 2005). É a demência mais comum entre os idosos,

com apresentação clínica e patológica bem definidas, afetando indivíduos com idade

a partir de 65 anos (PLASSMAN et al., 2007).

Por fim, a DA está relacionada com condições neurodegenerativas

caracterizadas pela progressiva disfunção cerebral ocorrendo em uma seqüência

biológica distinguida por falha sináptica e injúria e morte neuronal (BUTTERFIELD,

2004).

26

3.1.2 Epidemiologia

A DA afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. As despesas

por detrás desta doença são altas, chegando a ter um gasto estimado direto e

indireto de 100 bilhões de dólares no tratamento de pacientes, apenas nos Estados

Unidos (RAFII; AUSEN, 2009).

Esta patologia é a quarta maior causa de morte em idosos com mais de 65

anos. Estima-se que o número de pessoas com algum tipo de demência ou

Alzheimer no mundo deve praticamente dobrar em 20 anos. Estudos indicam que

em 2030, devem ser 65,7 milhões, e em 2050, a previsão é de 115,4 milhões de

pacientes (SCORER, 2001; PIMENTEL, 2010).

Estimativas demonstram que a população de idosos no Brasil é de

aproximadamente 15 milhões de pessoas e a prevalência de doentes com demência

aproxima-se de 1,1 milhão. Cerca de 7% da população brasileira com mais de 65

anos são acometidos pela DA. O Ministério da Saúde aponta que os gastos com

esta patologia chegam a R$ 129 milhões apenas em medicamentos. (BRASIL,

2010).

Estudos realizadas pela Academia Brasileira de Neurologia revelaram que as

mortes relacionadas a DA registraram um aumento superior a 500% no Brasil,

quando avalia-se o período entre 1999 e 2008. Estes dados, associados com o

aumento da expectativa de vida da população brasileira indicam que a cada ano o

número de portadores da DA tende a subir no Brasil, assim como em todo o mundo

(PIMENTEL, 2010).

3.1.3 Distúrbios neuroquímicos

A DA é uma neuropatologia caracterizada por uma perda de neurônios

colinérgicos inicialmente na região do hipocampo, seguida pela diminuição da

memória, até a progressão para a completa demência (AKAISHI et al., 2008).

A cascata de eventos que caracteriza a DA é originada pela clivagem errônea

da proteína precursora amilóide (APP), que é uma proteína de membrana expressa

27

por muitas células, inclusive os neurônios do SNC. A APP é processada pelas β e γ

secretases, que ao realizarem a clivagem proteolítica da mesma originam peptídeos

beta-amilóides (Aβ) 1-40 e 1-42, os quais resultam na formação de depósitos

extracelulares amorfos denominados placas senis. Estas placas acarretam em

neurotoxicidade, inflamação, diminuição das sinapses e apoptose (Figura 1)

(HAASS; STROOPER, 1999; SELKOE, 2001).

O peptídeo Aβ1-42 é a forma mais tóxica dentre os derivados da clivagem da

APP devido a um resíduo metionina na posição 35, o qual, quando oxidado gera a

metionina sulfóxido, que é responsável por modular o estresse oxidativo. O peptídeo

Aβ1-40 é um fragmento mais curto, porém menos estável que o Aβ1-42, o que torna

sua produção reduzida em relação ao outro peptídeo (BUTTERFIELD; BOYD-

KIMBALL, 2005; MURRAY; SINDONI; AXELSEN, 2005).

Figura 1: Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização de uma placa amilóide Fonte: http://anatpat.unicamp.br/bineualzheimer.html

Os mecanismos responsáveis pela neurotoxicidade das Aβ são complexos,

mas parecem envolver um desequilíbrio na homeostase intracelular do cálcio e

potássio, indução de estresse oxidativo e ativação do processo de morte celular.

28

Além disso, transtornos da transmissão da acetilcolina e acetiltransferases ocorrem

freqüentemente nos indivíduos afetados (HAASS, 2004; MATTSON, 2004)

Outro fator no estágio bioquímico, responsável pelos eventos da DA, são os

emaranhados neurofibrilares intraneuronais, compreendidos por filamentos de uma

forma fosforilada da proteína TAU (Figura 2). A TAU é um constituinte normal dos

neurônios, estando associada aos microtúbulos, e, na DA a mesma sofre

fosforilação sendo depositada dentro das células como filamentos helicoidais

pareados. No momento em que as células morrem, estes filamentos se agregam na

forma de emaranhados extracelulares que, somados às placas senis contribuem

para os eventos patológicos da DA (BUTTERFIELD, 2004).

Figura 2: Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização das alterações neurofibrilares de TAU Fonte: http://anatpat.unicamp.br/bineualzheimer.html

29

Entretanto, verifica-se ainda que diversos fatores ambientais e genéticos

convergem para a susceptibilidade de desenvolver a DA. Observa-se que a baixa

escolaridade, traumatismo craniano, sexo feminino, depressão, diabetes melittus,

hipertensão arterial, fumo, hiperinsulinemia, inatividade física, fibrilação arterial, dieta

rica em gorduras e alterações genéticas, apresentadas nos cromossomos 21, 14, 19

e 12, são fatores de risco que interagem entre si durante toda a vida dos pacientes e

qualifica-os a desenvolver a DA (MEDEIROS, 2007).

3.1.4 Sintomas da Doença de Alzheimer

A fase inicial da DA é descrita por muitos pesquisadores como uma

diminuição suave da cognição. Esta fase é intermediária entre o estado normal do

indivíduo e a etapa avançada da DA. Pacientes neste estado inicial apresentam um

declínio na cognição, porém, nenhum sinal de demência. As atividades de vivência

diárias não são afetadas, entretanto ocorrem brandas perdas de memória (MORRIS

et al., 2001; MORRIS, 2005).

Posteriormente iniciam-se dificuldades discretas de memória, perda de

interesse e apatia. O prejuízo de memória aumenta gradualmente, e aparecem

déficits de outras capacidades cognitivas, como julgamento, raciocínio abstrato,

cálculos e habilidades visuo-espaciais (RINWA et al., 2010).

Nos estágios intermediários da doença surge a afasia, que afeta a fluência e

começa como uma dificuldade para nomear objetos ou escolher a palavra certa para

expressar uma idéia. Essa afasia é progressiva em muitos pacientes, especialmente

naqueles com doença de início precoce, levando a perda total da seqüência lógica

da fala (KAPCZINSKI; QUEVEDO; IZQUIERDO, 2004).

A progressão da doença torna o paciente completamente dependente das

pessoas que tomam conta dele. A linguagem fica reduzida a simples falas ou

palavras e nos estágios finais da doença os pacientes apresentam grande alteração

do ciclo sono/vigília, tendem a perambular e tornar-se episodicamente agitados e

irritáveis. As tarefas diárias ficam comprometidas devido à apatia, cansaço e

depressão, o que leva à perda da mobilidade e até mesmo de atender a suas

30

necessidades pessoais, como vestir-se, alimentar-se e cuidar da higiene (CADDEL;

CLARE, 2010).

Devido a diversas complicações, inúmeras patologias oportunistas acabam

por levar o paciente a óbito. Todas essas manifestações são temporais e ocorrem

com a progressão da doença sendo resultados da neurodegeneração progressiva do

SNC (FORLENZA, 2005).

3.1.5 Estresse oxidativo e Alzheimer

Diversos estudos demonstram que déficits de memória são conseqüência de

desequilíbrios entre espécies reativas de oxigênio (EROs) e a capacidade

antioxidante disponível no cérebro. Além disso, o acúmulo de proteínas oxidadas no

cérebro potencializa a neurodegeneração e diminui as funções cognitivas (AMES,

2006; CORBETTA; PATEL; SHULMAN, 2008).

O estresse oxidativo tem sido avaliado como uma das vias cruciais na

patogênese de diversas doenças, incluindo desordens neurodegenerativas, câncer e

isquemia (LI; MA; LIU, 2007). Uma vez que os neurônios são particularmente

suscetíveis a EROs, o estresse oxidativo é apontado como uma das fontes das

várias alterações patológicas que ocorrem na DA, pois as macromoléculas

biológicas oxidadas levam a distúrbios homeostásicos que podem resultar na morte

celular (GLADE, 2010).

Todos os tecidos do organismo são vulneráveis a danos oxidativos devido a

alta utilização de oxigênio, aumento dos níveis de ácidos graxos poliinsaturados e

alta transmissão de íons metálicos. Uma vez que o tecido cerebral tem relativamente

baixos índices de antioxidantes, este é altamente suscetível a danos oxidativos

causados pela reação do óxido nítrico com compostos oxigenados, que gera

espécies altamente reativas (ALTIERI, 2008).

A deterioração cumulativa e agravada das mitocôndrias desempenha um

papel importante no processo de envelhecimento e é uma característica central do

declínio nas habilidades de funcionamento cognitivo, que é comumente associado

com o avançar da idade (MURPHY, 2009). As mitocôndrias desempenham um papel

essencial na geração de energia, o que as torna alvos extremamente suscetíveis a

31

oxidantes biológicos exógenos e endógenos. Estima-se que 2 a 3% do oxigênio

consumido pelas mitocôndrias é convertido em superóxido (PRYDE; HIRST, 2011).

Quando a taxa de entrada de elétrons na cadeia respiratória excede a

capacidade limite, podem ocorrer reações que sobrecarreguem a capacidade

de extinção dos radicais livres, servindo de gatilho para uma produção exacerbada

de EROs (KING; SHARPLEY; HIRST, 2009).

Visto isto, observa-se diversas linhas de pesquisa que buscam aumentar o

arsenal antioxidante a nível cerebral visando uma longevidade cognitiva, impedindo

que patologias neurodegenetarivas como a DA venham a afetar cérebros mais

sucetíveis, como é o caso dos idosos (GLADE, 2010).

3.1.6 Processos inflamatórios e Alzheimer

As células microgliais, que possuem um elevado poder fagocitório,

representam uma variedade dos macrófagos que atuam na defesa do sistema

nervoso. Pacientes com DA exibem ativação substancial da microglia nas áreas

afetadas de seus cérebros, com a infiltração microglial bem localizada e infiltrada em

torno das placas amilóides (MEDEIROS, 2007).

Componentes do sistema complemento mostram-se desregulados nas placas

neuríticas e emaranhados neurofibrilares. Diversos fatores demonstram que este

processo inflamatório não é meramente um subproduto da cascata patológica,

podendo efetivamente contribuir para a progressão da doença, possibilitando até

mesmo a inicialização da DA (MEYER-LUEHMANN et al., 2008).

Diversos estudos demonstram que danos neuronais progressivos estão

associados à doença, podendo ser conseqüência de reações inflamatórias locais no

SNC. Neste sentido, tem sido proposto que uma fagocitose ineficiente dos peptídeos

Aβ por parte da microglia, e que a conseqüente hiperativação celular, liberação de

mediadores inflamatórios e fatores neurotóxicos contribuiriam de maneira decisiva

no processo neurodegenerativo verificado na DA (LUCIN; WYSS-CORAY, 2009).

Estudos epidemiológicos tem reportado uma substancial diminuição de risco

de desenvolver DA após utilização prolongada de antiinflamatórios não-esteroidais

(AINES). Os AINES têm causado redução da ativação da microglia e uma

32

diminuição no depósito de Aβ em cultura de cérebro de animais. Além disso, estes

estudos sugerem ações sobre as γ-secretases pela seletiva redução do Aβ42.

Associado aos AINES verifica-se ainda a utilização de substâncias antioxidantes,

que seriam capazes de reduzir a prevalência da DA e melhorar os sintomas

inflamatórios de pacientes acometidos por esta patologia (VLAD et al., 2008)

3.1.7 Tratamento

A DA é atualmente tratada utilizando-se agentes que restituem o nível de

transmissão colinérgica no cérebro, através da inibição das duas maiores enzimas

de clivagem de ACh, a acetilcolinesterase (AChE) e a butirilcolinesterase (BChE)

(LOIZZO et al., 2008), além da redução da transmissão glutamatérgica, que em

níveis elevados torna-se tóxica (ARRIETA, 2006).

O tratamento baseado na hipótese colinérgica da disfunção cognitiva postula

que o declínio cognitivo experimentado pelos pacientes com DA resulta da

deficiência do neurotransmissor ACh na transmissão colinérgica

(SONKUASARE;KAUL; RAMARAO, 2005; MENICHINI et al., 2009).

Os fármacos anticolinesterásicos aprovados pela Food and Drug

Administration (FDA) nos Estados Unidos para o tratamento da DA são a tacrina,

donepezil, e galantamina (inibidores reversíveis da enzima, respectivamente de

duração curta, intermediária e longa), e a rivastigmina (inibidor irreversível).

Entretanto, todos estes têm limitações clínicas quanto ao seu uso, isso devido tanto

aos seus respectivos tempos de meia-vida, quanto aos seus efeitos colaterais

indesejáveis (SONKUASARE; RAMARAO, 2004; FORLENZA, 2005).

Todavia, estes fármacos apresentam uma terapêutica paliativa e limitada,

porque apenas melhoram os déficits de memória no estágio inicial da doença, uma

vez que não interrompem o processo neurodegenerativo (EPIS et al., 2010).

Outros fatores relevantes são as respostas positivas ao tratamento, que

dependem da integridade dos neurônios pré-sinápticos, além da série de efeitos

colaterais e/ou adversos provenientes do aumento dos níveis de ACh nos sistemas

periféricos e centrais, tais como: distúrbios gastro-intestinais (vômitos, náuseas,

cólicas abdominais , diarréia e anorexia), hipotensão, bradicardia, dores de cabeça

câimbras e disfunção hepática. Para alguns pacientes, os efeitos adversos e/ou

33

colaterais são tão intensos que levam a não adesão ao tratamento (HAKE, 2001;

SONKUASARE; KAUL; RAMARAO, 2005).

Determinadas pesquisas levaram a constatação de que uma alta estimulação

excitatória causava danos cerebrais aos pacientes comprometidos pela DA. Em

virtude disso, o FDA aprovou a utilização da Memantina em 2003 (ARRIETA, 2006).

A memantina é o primeiro fármaco desta uma nova classe de medicamentos

que está sendo recomendada para os estágios moderado a grave da DA. Trata-se

de um fármaco antagonista, não-competitivo do receptor N-metil-D-aspartato

(NMDA), que bloqueia os efeitos patológicos dos níveis elevados de glutamato

(DOODY et al., 2007).

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do cérebro. Constata-

se que uma alta estimulação glutamatérgica pode resultar em prejuízo neuronal,

levando a morte de neurônios e prejudicando ainda mais o quadro geral do paciente

comprometido com a DA. Este fenômeno é denominado excitotoxicidade (CASTILLO

et al., 2010).

Em função da evolução da patologia, a cognição e a funcionalidade do SNC

acabam ficando cada vez mais comprometidos. Assim sendo, diversos distúrbios

comportamentais acabam por atingir cerca de 90% dos pacientes com DA

(SERENIKI; VITAL, 2008).

É comum a estes pacientes a ocorrência de estados de agitação psicomotora,

vagância, agressividade, ansiedade e alucinações, o que determinam muitas vezes

a institucionalização dos mesmos. Verifica-se ainda uma alta incidência de

depressão, inapetência, insônia e irritabilidade que acabam por complicar ainda mais

o tratamento do doente e a convivência com os familiares (BIERMAN et al., 2009).

O tratamento da DA é bastante complexo, uma vez que a esta patologia afeta

o SNC de maneira bastante degenerativa. Diversos medicamentos são utilizados e

associados para auxiliar o tratamento da DA. Além dos anticolinesterásicos, que

tratam apenas falta de memória, são empregados medicamentos como os

antipsicóticos, ansiolíticos e antidepressivos que tem por propósito ajudar a melhorar

o quadro geral dos pacientes (PAULO; YASSUDA, 2010).

Em virtude do exposto acima, verifica-se que a DA ainda é uma patologia que

não apresenta cura e apresenta um tratamento bastante complexo e ineficiente em

relação a neurodegeneração. Sendo assim, diversos estudos continuam sendo

34

realizados no sentido de buscar novos compostos com mais efetividade do que os

existentes e/ou apresentando menos efeitos colaterais (CHUANG, 2010).

3.1.8 Modelos farmacológicos para o estudo do Alzheimer

As inovações na compreensão dos mecanismos patofisiológicos relacionados

à DA estão sendo descritos em função de diversos modelos animais, que têm

contribuído consideravelmente para estes avanços. Graças aos modelos animais é

possível realizar a avaliação de eventuais drogas com potencial terapêutico, não

apenas de aliviar a demência associada com a DA, mas de modificar o processo da

doença (VAN; DE DEYN, 2006).

A DA é uma patologia neurodegenerativa ligada ao metabolismo energético.

Por este motivo o estresse oxidativo tem ganhado bastante importância nas últimas

décadas, pois diversas teorias demonstram que distúrbios cognitivos, como a DA,

têm sido caracterizados por danos celulares relacionados às EROs (FIGUEIREDO et

al., 2008).

Modelos farmacológicos que nos permitem mimetizar situações que ocorrem

em pacientes com DA são essenciais para o estudo de substâncias com efeitos

sobre esta patologia (WEI et al., 2005).

A cascata da neurodegeneração na DA está associada com estresse

oxidativo, disfunção mitocondrial, diminuição do metabolismo energético e ativação

das sinalizações das vias de apoptose celular (LESTER-COLL et al., 2006). Portanto

a investigação de drogas com potencial sobre a DA necessita de modelos que

possam induzir modificações neurológicas semelhantes as que ocorrem na patologia

(ANNAHÁZI et al., 2007).

Estudos recentes têm demonstrado que a administração contínua de injeções

de D-Galactose (D-Gal), em roedores, tem a ação de produzir radicais livres.

Subseqüentemente a D-Gal leva a uma redução na expressão de proteínas,

deterioração do aprendizado e funções da memória, associados com a diminuição

do sistema colinérgico no córtex cerebral (HUA et al., 2007; LEI et al., 2008)

A D-Gal é um açúcar redutor e pode ser metabolizado em concentrações

normais. Entretanto, em altos níveis, pode reagir com aminas livres e aminoácidos,

35

em proteínas e peptídeos “in vivo”, levando à formação de produtos finais de

glicação avançada, finalmente resultando em estresse oxidativo e acarretando em

danos semelhantes aos encontrados na DA (ZHANG et al., 2005; WEI et al., 2005;

LU et al., 2007).

A administração intracerebroventricular (ICV) de estreptozotocina (STZ) é

outro modelo farmacológico que tem sido descrito como uma metodologia

apropriada para causar DA esporádica, uma vez que proporciona uma progressiva

deterioração da memória e redução da glicose e metabolismo energético cerebral

(AWASTHI et al., 2010).

Os danos relacionados à STZ abrangem a inibição da síntese de ATP e

acetil CoA, que resulta numa deficiência do sistema colinérgico. Associado a estas

ações verifica-se também uma redução da atividade das acetiltransferases (AChT)

no hipocampo e um aumento na ação das AChE no cérebro de ratos (GEROZISSIS,

2008).

A STZ causa severas anormalidades nas vias metabólicas controladas pelos

receptores de insulina (IR). Os IR têm sido implicados na regulação da alimentação,

controle do peso e reprodução. Diversos estudos têm demonstrado relação entre

estes receptores e a DA, uma vez que o hipocampo e o córtex cerebral contém uma

alta densidade destes receptores (ZHAO et al., 2004).

A dessensibilização do IR têm sido proposta como a causa da redução do

metabolismo energético e síntese de acetil CoA, com resultados na deficiência

colinérgica. A deterioração dos IR está associada com a patogênese do

envelhecimento do cérebro e desordens neurodegenerativas, como a DA

(AGRAWAL et al., 2009).

Por fim, o decréscimo na sinalização da insulina causada pela administração

ICV de STZ resulta em injúria oxidativa, hiperfosforilação da proteína TAU e

precursores de proteína β-amilóide, o que sugere uma neurodegeneração

relacionada com a DA (PINTON et al., 2010).

Outras metodologias ainda vêm sendo aplicadas para estudar os processos

relacionados ao desenvolvimento e progressão da DA. Recentemente a

administração ICV de peptídeos Aβ (1-40 e 1-42), em camundongos, tem ganhado

destaque em diversas publicações devido à capacidade de assemelhar-se a

patogenia da DA (MCLARNON; RYU, 2008).

36

Estes prejuízos cognitivos têm sido documentados tanto em camundongos

geneticamente modificados, que apresentem uma expressão aumentada de APP,

quanto em roedores após a administração central aguda ou crônica dos fragmentos

Aβ 1-40 ou Aβ 1-42 (PREDIGER et al., 2007).

Numerosos animais knockout’s e trangênicos têm sido desenvolvidos para

explorar aspectos característicos da DA, visando avaliar avanços terapêuticos

particulares. A supressão de genes que codificam proteínas envolvidas na

patogênese, tem ajudado a antecipar os efeitos de novas moléculas desenhadas

para regular estas proteínas (EPIS et al., 2010).

A primeira geração desses animais, foi desenvolvida utilizando avanços na

tecnologia de DNA complementar, visando à expressão da APP humana em

cromossomos artificiais de leveduras (LAMB et al., 1993). Já a segunda geração

desses animais trangênicos possibilitou a criação de mutações nas presenilinas-1.

Ao cruzar estes animais com os animais com maior expressão de APP foi possível

criar camundongos com dupla alteração (BORCHELT et al., 1994, SAURA et al.,

2004).

Estudos mais recentes idealizaram uma terceira geração de animais

especiais, com três mutações, os quais são denominados 3xTg-AD. Estes

camundongos trangênicos expressam alterações nas presenilinas-1, APP e MAPT,

que são alterações nas proteínas TAU, o que possibilita a formação de novelos

neurofibrilares (ODDO et al., 2003; BALLATORE et al., 2007).

3.3 Aspectos gerais sobre plantas medicinais

As plantas medicinais vêm sendo utilizadas desde os primórdios da

humanidade, fazendo parte da evolução da medicina e cultura de diversas

populações. Muitos são os exemplos da utilização de ervas e plantas medicinais

pela cultura oriental, além dos diversos exemplos presentes em nosso país

(CECHINEL-FILHO, 2001; BARREIRO; BOLZANI, 2009).

O apelo para o tratamento com produtos naturais é muito bem aceito pela

população, principalmente a idosa, fato que fez com que o Sistema Único de Saúde

37

(SUS) adotasse essa prática, como o Programa Nacional de Plantas Medicinais e

Fitoterápicos, visando a utilização de diversas plantas medicinais, para o tratamento

de inúmeras afecções (FUNARI; FERRO, 2006).

A Organização Mundial da Saúde estima que atualmente mais de 1/3 da

população mundial, ainda não tem acesso regular aos medicamentos essenciais e

para tratamento de variadas afecções recorre à medicina tradicional. Esta situação

ocorre principalmente em países menos desenvolvidos. Portanto, a própria OMS

reconhece e estimula a utilização e o desenvolvimento das plantas e produtos

naturais para alívio de doenças (WHO, 2003).

O Brasil por sua vez tem uma flora extremamente rica e muito pouco

explorada. Estima-se que das 200 mil espécies vegetais existentes, 10 mil são

medicinais. Verifica-se que o Brasil concentra aproximadamente um terço das

espécies vegetais existentes no planeta, fato que nos proporciona uma fonte

bastante rica para o desenvolvimento de novos fitoterápicos e fitofármacos (CRAGG;

NEWMAN, 2009).

O mercado farmacêutico mundial cresce exponencialmente a cada ano.

Grande parte disso deve-se à pesquisa e desenvolvimento de medicamentos

fitoterápicos. Este setor movimenta cerca de 22 bilhões de dólares por ano, sendo

os valores dessas movimentações no mercado brasileiro correspondentes a cerca

de 160 milhões de dólares. Enquanto a venda de medicamentos sintéticos cresce

em torno de 4% ao ano, os fitoterápicos alcançam cerca de 15%. Estes valores

refletem o que a população mundial busca: medicamentos com menos efeitos

colaterais, mais baratos e mais eficazes, aliados à crença popular dos efeitos

benéficos da utilização de produtos naturais (CARVALHO et al. 2008).

Trevisan e Macedo (2003), realizaram um screening com diversas plantas

visando a avaliação do potencial anticolinesterásico de seus extratos. Foram

estudados 58 extratos de 30 espécies de diversos gêneros vegetais, através de

avaliação bioautográfica dos extratos sobre a atividade enzimática. Nestas análises

os autores consideraram resultados de inibição maior ou igual a 50% como critério

de seleção para o fracionamento químico. A partir do trabalho de triagem, Paulilinia

cupana (guaraná), Amburana cearensis (cumaru) e Lippia sidoides foram as

espécies que demonstraram melhores resultados, inibindo de 65 à 100% a atividade

enzimática nos ensaios realizados (TREVISAN; MACEDO, 2003)

38

Diversos estudos comprovam a ação de compostos naturais e extratos de

inúmeras plantas sobre a DA. Um exemplo é a quercetina, que apresenta-se como

um ótimo composto para auxiliar o tratamento da DA. Bhutada e colaboradores

(2010), verificaram a ação deste flavonóide em animais com DA induzida por

estreptozotocina (STZ) e verificaram que a quercetina preservou a memória dos

animais.

Determinados compostos polifenólicos, como os flavonóides Kaempferol,

Morina e Miricetina foram estudados, apresentando ação antioxidante e, portanto,

protetora do SNC em modelos de indução de DA (ONO et al., 2006; ANEKONDA et

al., 2006).

A Curcumina, um composto isolado da Curcuma longa reduz o acúmulo de Aβ

no cérebro de ratos transgênicos. Outros estudos demonstram que neste mesmo

modelo, um extrato de Ginkgo biloba previne o declínio da cognição espacial

(STACKMAN et al., 2003; YANG et al., 2005). Sharma e Gupta (2002)

demonstraram que o Resverastrol, um composto polifenólico presente na semente

de uvas e no vinho tinto é capaz de prevenir o déficit cognitivo de ratos, no modelo

de indução da DA por STZ.

A Huperizina A, um alcalóide extraído da Huperzia serrata, e o extrato de

Camellia sinensis (popularmente conhecida como chá verde) aumentaram a

concentração de acetilcolina em encéfalo de camundongos, através da inibição da

acetilcolinesterase, resultando em uma ampliação da memória (LIANG; TANG, 2004;

KIM et al., 2004).

3.4 Gênero Rapanea e Rapanea ferruginea

A Rapanea ferruginea é uma espécie pertencente à família Myrsinaceae, a

qual possui cerca de 40 gêneros e 1400 espécies. Dentre essas, em território

brasileiro foram detectados 8 gêneros e cerca de 70 espécies (SOUZA, 2005). O

gênero Rapanea apresenta árvores de porte médio, sendo a R. ferruginea

caracterizada como uma árvore com até 12 m de altura e 50 cm de diâmetro. Os

frutos são utilizados como alimentação da fauna silvestre, em especial inúmeras

39

espécies de pássaros, além dos seres humanos utilizarem como condimento em

vinagre (LORENZI,1992; LORENZI, 2000).

A Rapanea ferruginea (Figura 3) é uma espécie pantropical, encontrada na

América do Sul entre os países Bolívia, México, Argentina, Paraguai, Uruguai e no

Brasil. Encontra-se esta espécie principalmente nos estados litorâneos, dentre eles:

Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Rio Grande

do Sul e em Santa Catarina (LORENZI, 2000).

Figura 3: Fotografia da Rapanea ferruginea evidenciando a altura da árvore e os galhos com frutos Fonte: GAZONI (2009)

Esta espécie apresenta outra sinonímia científica, Myrsine coriacea e é

conhecida popularmente como “coporoquinha”, “canela-azeitona”, “canela-azeitona”,

“azeitona-do-mato”, “copororocaçu”, “capororoca-vermelha”, “pororoca” e

“capororoca-mirim” (SANCHOTENE, 1985; CARVALHO, 1994).

Diversas espécies de Rapanea apresentam derivados do ácido benzóico

prenilado, os quais apresentam-se como os componentes majoritários do

metabolismo secundário destas espécies. Já foram identificados os compostos ácido

mirsinóico A, B, C, D, E e F em diferentes espécies do gênero Rapanea (JANUÁRIO

et al., 1991; HIROTA et al., 2002)

Estudos conduzidos por pesquisadores do Núcleo de Investigações Químico

Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí demonstraram que

extratos das cascas da R. ferruginea apresentam atividade antinociceptiva,

juntamente com o ácido mirisinóico B (AMB) por meio da interação com os sistemas

adrenérgico, colinérgico, oxidanitérgico e parcialmente com o sistema

serotoninérgico (HESS et al., 2010). Observa-se ainda a ação antinociceptiva do

40

AMB na dor neuropática causada pela constrição parcial do nervo ciático em

camundongos (ANTONIALLI, 2008), e na dor neuropática diabética (GALVAN,

2007).

Outros estudos demonstram a atividade antiinflamatória do AMB administrado

oralmente, em modelo de dor inflamatória induzida por carragenina (ANTONIALLI,

2008) e potencial anti-hiperglicemiante em animais diabéticos induzido com aloxano,

onde o extrato da R. ferruginea e o AMB diminuem a glicose plasmática em jejum

(MATTOS, 2006; MONTEIRO et al., 2007)

O ácido mirsinóico A (AMA), isolado por Gazoni (2009), apresentou atividade

anticolinesterásica em estudo bioautográfico realizada através de placas

cromatográficas. Estes resultados subsidiaram a avaliação deste composto em

ensaios “in vitro” utilizando a metodologia de Ellman (1961), em tecido cerebral de

ratos. Os resultados indicaram uma atividade do AMA na inibição da enzima AChE

nas estruturas cerebrais: cerebelo, córtex, estriado, hipocampo e em cérebro total de

ratos (FILLIPIN, 2010).

A avaliação da atividade anticolineterásica do AMA, “in-vitro”, subsidiam a

continuidade dos testes e a avaliação do potencial deste composto em modelos “in

vivo”, onde as condições dependem de todo o metabolismo e barreiras fisiológicas

dos animais.

3.5 Lipídios e doença de Alzheimer

Os lipídios de origem vegetal são misturas de tri, di, e monogliceróis,

esteróis, glicolipídios, fosfolipídios e ácidos graxos livres. Os triglicerídeos (Figura 4)

são ésteres formados a partir do glicerol e ácidos graxos (MOTA; SILVA;

GONÇALVES, 2009).

A metabolização dos triglicerídeos ocorre através do processo digestivo,

realizado por atividade enzimática através de lipases, acarretando na liberação de

ácidos graxos, processo que ocorre através da hidrólise dos ésteres destas

moléculas (FRANCO, 2007).

41

Figura 4: Fórmula estrutural do (a) ácido graxo, (b) glicerol e (c) triglicerídeos. Sendo R uma cadeia hidrocarbônica com número de carbonos e de insaturações diferentes para cada ácido graxo. A numeração 1,2 e 3 refere-se à posição de cada ácido graxo no triglicerídeo. Fonte: COLZATO e colaboradores (2009).

Comparativamente, os óleos de origem vegetal possuem os níveis mais

elevados de ésteres de ácidos graxos poliinstaturados que os de origem animal.

Estes produtos são indispensáveis para diversos processos metabólicos, e, muitos

deles não podem ser sintetizados pelo nosso organismo, devendo ser encontrados

na alimentação (NOVELLO; PRANCESCHINI; QUINTILIANO, 2008).

Os componentes lipídicos, especialmente os ácidos graxos, estão presentes

nas mais diversas formas de vida, desempenhando importantes funções na estrutura

das membranas celulares e nos processos metabólicos (YEHUDA et al., 2002).

Os ácidos graxos poliinsaturados têm sido alvo de inúmeros estudos nas

últimas décadas. Destaca-se a importância da sua ingestão na fase gestacional

(HORNSTRA, 2000), nos primeiros meses após o nascimento (UAUY, 2001), na

terceira idade (ALBERTAZZI; COUPLAND, 2002) e em diversas doenças,

principalmente degenerativas, como é o caso da DA, Parkinson e esclerose

amiotrófica (SUMIYOSHI et al., 2008).

Muitos destes ácidos graxos são denominados essenciais, pois os animais

não conseguem sintetizá-los. Estes compostos encontram-se principalmente na

composição das células vegetais, sendo sua presença imprescindível na dieta,

especialmente, em se tratando dos ácidos linoléico e o linolênico, que são

precursores de diversos outros ácidos graxos (MARTIN et al., 2006).

Os ácidos graxos poliinsaturados abrangem as famílias de ácidos graxos

ômega-3 (n-3), ômega-6 (n-6) e ômega-9 (n-9), e desempenham importantes

funções no desenvolvimento e funcionamento do cérebro e da retina (MARTIN et al.,

2006).

42

Cerca de 70% do peso seco da bainha de mielina é de lipídeos, dentre eles

esfingolipídios, cerebrosídeos, sulfatídios e esfingomielinas. Um dos ácidos graxos

mais comuns dentre os esfingolipídeos é o ácido nervônico, que é o componente

majoritário dos cerebrosídeos e sulfatídeos da bainha de mielina (SANDHOFF,

2010).

Patologias como a adrenoleucodistrofia apresentam uma progressiva

desmielinização dos tecidos cerebrais centrais e periféricos, além de uma

insuficiência do córtex adrenal, sendo caracterizadas pela presença de ácidos

graxos de cadeias longas, como os ácidos hexacosanóico e tetracosanóico em

diferentes fluidos e tecidos biológicos. A presença destes ácidos graxos é

caracterizada pela ineficiência da defesa antioxidante do organismo na proteção dos

tecidos (DEON et al., 2007).

Estudos com administração dietética de ácido docosahexanóico (22:6 n-3) em

ratos com DA induzida pela infusão do peptídeo Aβ (1-40), demonstraram que este

ácido graxo possibilitou um aumento na cognição dos animais no modelo de

avaliação da memória do labirinto radial de 8 braços. O aprendizado e número de

erros foram diminuídos significativamente, quando comparados os animais normais

e com DA induzida, que receberam a administração prolongada do ácido

docosahexanóico (DHA), com os animais com DA sem a administração do DHA

(HASHIMOTO et al., 2005).

Astarita e colaboradores (2010) investigaram a taxa do DHA no fígado de

pacientes portadores da DA e verificaram uma concentração reduzida deste ácido

graxo poliinsaturado. O DHA é precursor de diversos ácidos graxos essenciais para

o funcionamento dos neurônios, entre eles o ácido tetracosanóico, um esfingolipídeo

formador da bainha de mielina dos neurônios.

Estudos reportam que a administração dietética de DHA em animais com DA

induzido está relacionada com uma melhora na cognição, facilitação da memória,

proteção da integridade da membrana lipídica e das funções celulares neuronais

(OSTER; PILLOT, 2010; JICHA; MARKESBERY, 2010)

Um estudo clínico com 402 pacientes demonstrou que a suplementação com

DHA não foi capaz de aumentar a memória, em avaliações cognitivas, além de

reduzir a degeneração cerebral, que foi determinada através de RMN (QUINN et al.,

2010).

43

Evidências sugerem que uma desestabilização das membranas neuronais

pelos oligômeros Aβ, pode ser um dos mecanismos primários para a patogenia da

DA. Vários estudos demonstram que a administração de colesterol e DHA protegem

culturas neuronais da neurotoxicidade dos oligômeros de Aβ (FLORENT-BEĆHAR,

et al., 2009).

Além disso, Hashimoto e colaboradores (2005) demonstraram que a

administração do DHA diminuiu significativamente o nível de peptídeo β-amilóide em

frações de membrana de animais com DA tratados com o DHA, em comparação aos

animais sem o tratamento com o composto. Sabe-se que a membrana plasmática

neuronal é facilmente perturbada pelas proteínas Aβ, sendo essas alterações

fundamentais para a cascata patológica da DA. Por outro lado, tem-se avaliado que

a manutenção da proteção lipídica possibilita uma proteção contra os efeitos

deletérios da DA sobre estas células (WASSALL et al., 2009).

Diversos estudos realizados em todo mundo demonstram que os ácidos

graxos poliinsaturados vêm tornando-se fortes aliados na pesquisa frente a DA.

Pesquisas com novas molécula subsidiam novos estudos (SU, 2010). Sendo assim,

a avaliação de um ácido graxo proveniente da R. ferruginea pode acrescentar a

literatura novos dados sobre o tratamento com ácidos graxo sobre esta patologia.

44

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Material:

4.1.1 Material Vegetal:

As partes aéreas da Rapanea ferruginea foram coletadas no município de

Blumenau, rua Belo Horizonte, estado de Santa Catarina, Brasil, em janeiro de 2009.

O material vegetal foi identificado pelo Prof. Oscar Benigno Iza (UNIVALI) e

uma amostra foi depositada no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí/SC), sendo

catalogada pelo código HBR52715.

As partes aéreas foram submetidas à secagem em uma sala de secagem

com temperatura e umidade controladas. Após estabilização do material vegetal, o

mesmo foi separado em caule, folhas e frutos. Posteriormente os frutos foram

processados em um moinho de facas, sendo triturados para preparo da solução

extrativa.

4.1.2 Material e Reagentes:

O perfil cromatográfico por CCD dos extratos e compostos puros obtidos foi

realizado com placas de sílica gel 60 GF 254, de 20 µm de espessura, preparados

sobre folhas de alumínio da Merck. Utilizaram-se vários sistemas de eluentes,

dependendo da polaridade das amostras. O revelador químico específico

empregado na CCD foi o anisaldeído sulfúrico (identificação de terpenos e

esteróides).

Foi utilizada como fase estacionária sílica gel 60 (Merck) de granulometria 70-

230 mesh (φ = 0,063-0,20mm). O diâmetro e altura das colunas foram escolhidos de

acordo com a quantidade do material a ser cromatografado. A eluição foi realizada

com solventes orgânicos em ordem crescente de polaridade. Os solventes utilizados

45

foram hexano (Hex), diclorometano (DM), acetato de etila (AcOEt), acetona e

metanol (MeOH) provenientes dos Laboratórios Dinâmica, Quimex ou Vetec. As

frações coletadas foram reunidas conforme as semelhanças de fator de retenção

(Rf) identificadas na CCD.

Para análise de RMN H1 e RMN C13 foi utilizado o clorofórmio deuterado,

proveniente da Cambridge Isotope Laboratories Inc, tendo como referência interna o

tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos foram

registrados em valores adimensionais δ (ppm).

Para realização dos ensaios farmacológicos utilizou-se solução salina (NaCl

0,9%) para diluições dos compostos e como controle negativo, STZ (MP

Biomedicals) para a indução da DA, Galantamina (Sigma-Aldrich) como fármaco de

referência, xilasina e ketamina (Rhobifarma) para anestesiar os animais.

Os reagentes utilizados nas análise bioquímicas estão descritos ao longo da

metodologia.

4.1.3 Equipamentos:

Para visualização da fluorescência dos compostos rastreados por CCD, foi

utilizada radiação ultravioleta Minerallight (λ = 254 e 366nm), e, os espectros de

RMN 1H e RMN13C foram realizados em espectrômetro BRUKER AC-300F 300 MHz.

Os extratos foram concentrados em rotavapor TECNAL TE-2II com controle

de temperatura, e pesados em balança analítica SHIMADZU LIBROR-AEG-220 e

SHIMADZU LIBROR EB-33OD.

Os experimentos farmacológicos pré-clínicos foram realizados

utilizando-se a esquiva inibitória Insigth, labirinto em cruz elevado de camundongos

e de ratos, e o Open Field de camundongos e de ratos (Insigth).

As análises bioquímicas foram realizadas com auxílio de uma guilhotina,

homogeinizador Potter, sonicador de sonda (Branson) e uma centrífuga de

eppendorf refrigerada.

46

4.2 Métodos

4.2.1 Obtenção do extrato

Os frutos da R. ferruginea (1,2 kg) foram submetidos à maceração com

diclorometano por um período de 5 dias. Após este período o extrato diclorometano

da Rapaena ferruginea (ERF) foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo.

4.2.2 Fracionamento cromatográfico do extrato

O ERF (25,0 g) foi submetido à cromatografia em coluna aberta (CC1). O

esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 1. Tal gradiente foi

escolhido baseado na observação prévia do comportamento do extrato frente a

diferentes eluições do mesmo em Cromatografia em Camada Delgada (CCD).

Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato diclorometano da R. ferruginea

Eluente % Volume eluído (mL) Frações obtidas

Hex 100 1500 1-10

Hex/Acetona 95:5 750 11-12

Hex/Acetona 90:10 750 13-14

Hex/Acetona

MeOH

50:50

100

500

500

15

16

Coletaram-se coletadas 16 frações que foram acompanhadas por CCD.

Após verificação do perfil químico, as mesmas foram reunidas de acordo com a

semelhança cromatográfica. A reunião delas está disposta na Tabela 2.

47

Tabela 2: Reunião das frações obtidas na CC1

Frações Nomenclatura

1 FR1

2-6 FR2

7-12 FR3

13-14 FR4

15 FR5

16 FR6

As frações FR3 e FR4 foram selecionadas para purificação cromatográfica

considerando seus rendimentos e perfis cromatográficos.

A CCD da FR3 apresentava 4 manchas quando reveladas com anisaldeído

sulfúrico, das quais, a substância sob Rf 0,5 apresentava-se em quantidade muito

superior às outras.

A purificação cromatográfica da FR3 foi realizada através de cromatografia

em coluna aberta (CC2), e tem seu esquema de eluição descrito na Tabela 3.

Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento da FR3


Hex 100 200 1-5

Hex/AcOEt

Hex/AcOEt

95:5

50:50

800

300

6-69

70-77

Foram coletadas 77 frações, as quais após análise sob CCD foram reunidas

de acordo com o perfil cromatográfico das substâncias. A junção das frações deu

origem 4 sub-frações da FR3, as quais estão dispostas na Tabela 4.

48


Sub-frações Nomenclatura

1-5 Sfr1a

6-19 Sfr2a

20-60 Sfr3a

61-77 Sfr4a

Observando o perfil cromatográfico das sub-frações obtidas da CC2

verificou-se que a Sfr3a apresentava apenas uma mancha roxa quando avaliada por

CCD sob revelação com anisaldeído sulfúrico. Esta sub-fração, caracterizada como

um óleo levemente amarelado e teve uma alíquota direcionada para a elucidação

estrutural por RMN.

Avaliando o perfil cromatográfico da FR4 foi possível verificar uma grande

concentração de uma substância de coloração roxa, quando revelava-se a CCD com

anisaldeído sulfúrico. Em função disto e do elevado rendimento desta fração,

procedeu-se a separação cromatográfica da mesma. A cromatografia em coluna da

FR4 (CC3) foi realizada utilizando-se o esquema de eluição descrito na Tabela 5.

Tabela 5: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da FR4.


Hex 100 100 0

Hex/AcOEt 99:1 200 1-33

Hex/AcOEt 95:5 200 34-56

Hex/AcOEt 90:10 250 57-73

Hex/AcOEt 85:15 500 74-112

Hex/AcOEt 80:20 200 113-137

Hex/AcOEt 75:25 200 138-149

Hex/AcOEt 70:30 200 150-166

Hex/AcOEt 60:40 100 167-174

Hex/AcOEt 50:50 100 175-181

Hex/AcOEt 25:75 100 182-190

AcOEt 100 200 191-205

MeOH 100 300 206-208

49

Foram obtidas 208 frações, as quais sofreram avaliação do perfil

cromatográfico por CCD. As substâncias foram reunidas de acordo com sua

semelhança química e a junção delas está demonstrada na Tabela 6.


Sub-frações Nomenclatura

1-9 Sfr1b

10-37 Sfr2b

38-40 Sfr3b

41-51 Sfr4b

52-62 Sfr5b

63-68 Sfr6b

69-71 Sfr7b

72-79 Sfr8b

80-86 Sfr9b

87-98 Sfr10b

99-119 Sfr11b

120-134 Sfr12b

135-156 Sfr13b

157-194 Sfr14b

195-205 Sfr15b

206-208 Sfr16b

Observando o perfil cromatográfico das sub-frações obtidas da CC3 verificou-

se que a Sfr7b apresentava apenas uma mancha roxa quando avaliada por CCD

sob revelação com anisaldeído sulfúrico.

Esta sub-fração apresentava-se como um óleo claro, levemente amarelado.

Uma alíquota foi separada e destinada para elucidação estrutural a partir da RMN.

50

4.3 Ensaios Farmacológicos

4.3.1 Animais

Para os ensaios farmacológicos “in vivo” foram utilizados ratos albinos (250-

300 g) fêmeas e camundongos Swiss (25-30g) fêmeas obtidos no Biotério Central da

UNIVALI, mantidos a 22-27°C com livre acesso a água e comida, em ciclo

claro/escuro 12:12h exceto durante os ensaios farmacológicos. Os ensaios

farmacológicos foram realizados segundo os aspectos éticos da experimentação

animal, sendo respeitadas as normas preconizadas pelo COBEA (Colégio Brasileiro

de Experimentação Animal). Os experimentos foram aprovados pela Comissão de

Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Itajaí sob Protocolo 300/09 (Anexo

1).

4.3.2 Tratamentos

As doses utilizadas nos experimentos farmacológicos foram obtidas baseadas

na literatura, em testes farmacológicos pilotos, e, em trabalhos anteriores realizados

em nossos laboratórios. A galantamina foi utilizada como controles positivos nos

testes de memória e a doses foi baseada no trabalho de Tanaka e colaboradores

(2009). Solução salina foi utilizada como controle negativo nos experimentos e para

indução de DA por STZ foi utilizado líquor artificial. O líqüor artificial foi preparado

conforme descrito por Berté (2009). A doses de STZ utilizada na indução da DA

foram baseadas nos trabalhos de Pinton e colaboradores (2010).

4.3.3 Modelo de avaliação da memória – teste da esquiva inibitória

A atividade cognitiva dos animais pode ser mensurada através de testes de

esquiva inibitória (Figura 5). A tarefa de esquiva inibitória é um dos modelos mais

utilizados e consiste em inibir a exploração do ambiente pelo animal através da

aplicação de choques de pequena intensidade. O aparelho a ser utilizado é uma

51

caixa medindo 50 cm de comprimento, 25 cm de largura e 25 cm de altura para os

ratos e 30 cm de comprimento, 20 cm de largura e 25 cm de altura para os

camundongos. Parte do chão do aparelho possui grade com barras de bronze, com

1 mm de diâmetro, com espaço de 1 cm. Inicialmente o animal é treinado, e

posteriormente coloca-se o mesmo sobre a plataforma e mede-se o tempo de

latência para a descida. Quando isso ocorre o animal começa a levar choques (0,4

mA) por um período de 2 s e, 24 horas depois são realizados os testes. No teste há

a omissão dos choques e os animais são observados quanto à esquiva do choque.

O aprendizado consiste em o animal não descer da plataforma, sendo utilizado

como parâmetro de aprendizado a latência de descida (IZQUIERDO; MEDINA 1997;

WANG; CHAI; HOLAHAN, 2010).

Figura 5: Fotografia demonstrando a avaliação da memória no teste da esquiva inibitória. Fonte: Autor (2010).

4.3.4 Modelo de ansiedade - teste do labirinto em cruz elevado (LCE)

No teste do labirinto em cruz elevada (LCE), foi avaliada a intensidade do

grau de ansiedade dos animais no momento da exploração do ambiente (Figura 6).

O LCE é constituído de madeira, em forma de cruz grega, com dois braços abertos

(30 x 5 x 0,2 cm), e dois fechados (30 x 5 x 15 cm). Os braços são conectados por

uma área central aberta (5 x 5 cm) e são elevados a uma altura de 45 cm sobre o

52

chão, no caso dos camundongos. O LCE utilizado na avaliação dos ratos possui

dois braços abertos (40 x 10 x 1 cm) e dois braços fechados (40 x 10 x 40 cm), e, é

elevado a uma altura de 50 cm do solo (EMAMGHOREISHI; KHASAKI; AAZAM,

2005).

Os animais foram colocados no centro do LCE voltados para um dos braços

fechados para observação durante 5 minutos. Durante esse tempo, foi registrado

quanto tempo o animal gastou nos braços fechados e abertos, bem como a

freqüência de entradas nos mesmos. As entradas foram definidas quando o animal

esteve com todas as quatro patas no braço visitado (FILE, 1997; RABBANI;

SAJJADI; ZAREI, 2005).

Figura 6: Fotografia demonstrando a avaliação da ansiedade no modelo do labirinto em cruz elevado. Fonte: Autor (2010).

4.3.5 Modelo de deambulação - teste do Open Field

O teste do Open Field (OF) (Figura 7) foi realizado com o intuito de verificar

se o tratamento utilizado não interferiu com a mobilização do animal e

conseqüentemente nos resultados referentes a memória e a ansiedade, uma vez

que os modelos da esquiva inibitória e do LCE exigem o processo de movimentação

do animal tendo o sistema motor influência na resposta emitida

53

Os animais foram transferidos para um aparato de madeira, com um lado de

acrílico transparente e com o assoalho dividido em 9 quadrantes. Durante o período

de 6 minutos cada animal foi observado e o número de cruzamentos entre os

quadrantes bem como o número de posturas de exploração (rearings) foram

contados cumulativamente (RODRIGUES et al., 1996; DE SOUZA et al., 2003).

Figura 7: Fotografia demonstrando a avaliação da locomoção através do modelo do Open Field. Fonte: Autor (2010).

4.3.6 Indução do Alzheimer pelo modelo da Estreptozotocina

Para a indução da DA utilizando o modelo da estreptozotocina (STZ) foram

utilizados 10 grupos de camundongos (n=10). Os procedimentos foram realizados

conforme descrito por Pinton e colaboradores (2010) com algumas modificações

(Figura 8).

Os camundongos, previamente anestesiados Xilazina/Ketamina, sofreram

uma cirurgia para retirada do tecido cutâneo visando a exposição do crânio. Após

este procedimento repousaram por 24 h.

No dia seguinte os animais foram submetidos uma injeção

intracerebroventricular (ICV) de uma solução 2,5 mg/mL de STZ, sendo administrado

um volume de 2,0 µL. O procedimento foi realizado sob anestesia de éter etílico.

54

Após 48 horas da primeira injeção, o método foi repetido com outra administração de

2,0 µL de STZ.

Procedeu-se a injeção utilizando a fissura bregma como referência, sendo o

sítio da injeção 1 mm para a direita ou esquerda do ponto central das fissuras do

crânio, diretamente no ventrículo cerebral. O aparato utilizado para as injeções ICV

consistiu de uma agulha hipodérmica acoplada a uma seringa Hamilton de 5 µL.

Após o período de indução, os animais foram avaliados nos modelos de memória,

deambulação e ansiedade.

Figura 8 – Indução de DA através do modelo farmacológico da STZ para avaliação da memória

4.3.7 Avaliação da memória de animais normais tratados com o ERF

A determinação da memória dos animais normais foi realizada visando

verificar os efeitos do ERF sobre as etapas da memória (aquisição, consolidação e

55

evocação). Os ratos Wistar receberam o ERF nas doses de 50, 150 e 300 mg/kg

(v.o.) e foram submetidos ao teste da esquiva inibitória, conforme o item 4.3.3.

Para avaliação da aquisição, os animais receberam o ERF 1 hora antes do

treino na esquiva inibitória, sendo testados 24 horas após este procedimento. Na

consolidação, o tratamento com o ERF foi realizado imediatamente após o treino na

esquiva, com realização do teste conforme relatado na aquisição. Para a verificação

da atividade do ERF sobre a evocação, os animais foram treinados no equipamento,

e 24 horas após receberam o ERF. Após 1 hora foram testados na esquiva inibitória.

O controle negativo foi tratado apenas com salina (NaCl 0,9%; 0,3 mL/100 g de

peso; v.o.).


tratados com o ERF

Os camundongos com Alzheimer induzindo por STZ, conforme relatado no

item 4.3.6, foram tratados com ERF visando verificar a ação do mesmo sob a etapa

da consolidação da memória, de acordo com o item 4.3.3.

As doses utilizadas foram 50, 150 e 300 mg/kg (v.o.) Como controle positivo

foi utilizado o fármaco referência Galantamina na dose de 0,5 mg/kg (v.o.) (TANAKA

et al., 2009) e o controle negativo recebeu apenas uma solução salina (NaCl 0,9%;

0,1 mL/10 g de peso; v.o.).

No anterior ao teste de memória, os animais receberam novamente o ERF e

controles nas mesmas doses citadas e foram avaliados seqüencialmente na

atividade locomotora, no modelo de deambulação do OF, e ansiedade, através do

modelo LCE, conforme citado nos itens 4.3.5 e 4.3.4 respectivamente.


tratados com o Triglicerídeo

Para avaliação da ação do triglicerídeo sob a consolidação da memória foram

utilizados os camundongos com DA induzida por STZ, conforme descrito no item

4.3.6.

56

Os animais receberam o triglicerídeo nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg (v.o.) O

controle positivo foi realizado utilizando o fármaco de referência Galatamina na dose

de 0,5 mg/kg (v.o.) (TANAKA et al., 2009). O controle negativo recebeu somente

uma solução salina (NaCl 0,9%; 0,1 mL/10 g de peso; v.o.).

A determinação dos efeitos do triglicerídeo sob a memória dos camundongos

foi realizada como consta no item 4.3.3. Após 24 horas, os animais foram

submetidos aos testes comportamentais de deambulação e ansiedade, conforme

citado nos itens 4.3.5 e 4.3.4 respectivamente.

4.3.10 Avaliação da memória dos animais com Alzheimer induzido por STZ e

tratados com o AMA

Os efeitos do AMA sobre a consolidação da memória foi determinado com os

animais com DA induzido por STZ conforme demonstra o item 4.3.3.

Os camundongos receberam o AMA nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg (v.o.).

Como controle positivo foi selecionado fármaco referência Galantamina na dose 0,5

mg/kg (v.o.) (TANAKA et al., 2009). O controle negativo recebeu apenas uma

solução salina (NaCl 0,9%; 0,1 mL/10 g de peso; v.o.). Após o tratamento com os

compostos, os animais foram avaliados no modelo da esquiva inibitória de acordo

com o item 4.3.3. Conforme descrito anteriormente, também foram analisados os

efeitos do AMA sobre a deambulação e ansiedade 24 horas antes do teste de

memória.

4.4 Análises bioquímicas “in vitro”

Para os testes “in vitro” foram utilizados os camundongos avaliados nos testes

farmacológicos. Após a realização dos estudos “in vivo”, os grupos de animais com

DA induzida e tratados com o TGL e com o AMA foram separados, juntamente com

o controle negativo, e um grupo de animais Naive, os quais representaram animais

normais, sem qualquer indução oxidativa ou cirúrgica.

57

4.4.1 Preparação das amostras de tecido cerebral

Para os estudos bioquímicos, animais foram sacrificados através de

decapitação por guilhotina. Os cérebros foram dissecados e perfundidos com 50mM

(pH 7,4) de tampão fosfato (PBS) em temperatura baixa. Os cérebros foram

homogeneizados em 1% (P/V) de PBS contendo uma mistura de inibidores de

protease a 1200 rpm, utilizando-se um homogenizador Potter. Após, o material

cerebral foi sonicado em 6x/1 min com intervalos de 30 s usando-se sonicador de

sonda Bronson. Os homogeneizados foram divididos em duas frações. Uma foi

centrigugada a 8000 g/10 min para obter o sobrenadante. Alícotas do sobrenadante

foram utilizadas para determinar a atividade das seguintes enzimas: catalase (CAT),

glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) os níveis de malondialdeído

(MDA), além de proteínas totais. A segunda parte do homogenizado foi centrifugada

a 5000 g/10 min a 4°C, e o sobrenadante foi coletado para determinação da

atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) (LU et al., 2007).

4.4.2 Medida de sistemas e produtos oxidativos

4.4.2.1 Determinação da atividade da Superoxido Dismutase (SOD).

A atividade da SOD foi determinada pela inibição da auto-oxidação da

adrenalina medida espectrofotometricamente a 480 nm, de acordo com Bannister e

Clabrese (1987. Para tanto, em cada análise, a 1 mL de tampão glicina foram

adicionados 40 µL da amostra. Após zerar o espectrofotômetro (Shimadzu- UV/Vis

1620), 17 µL de epinefrina foram adicionados e a leitura foi realizada por um período

de 2 minutos (SILVEIRA et al., 2009).

4.4.2.2 Determinação da atividade da Catalase (CAT)

A atividade da CAT foi verificada através do método de Aebi (1984). O meio

de reação consistiu de 0,65 mL de tampão fosfato (50 mM, pH 7,0) e 50 µL de

58

amostra . A reação iniciou-se pela adição de 0,3 mL peróxido de hidrogênio 30 mM.

A decomposição de peróxido de hidrogênio foi monitorada em 240 nm a 25ºC (AEBI,

1984; SILVEIRA et al., 2009).

4.4.2.3 Determinação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPx)

A atividade da GPx foi verificada através do método de Paglia e Valentine

(1967), através do consumo de NADPH em 340 nm conforme descrito LU e

colaboradores (2007).

4.4.2.4 Determinação da atividade da Glutationa Redutase (GR)

A atividade da GR foi realizada através do método de Mizumo e Ohta (1986),

onde se verificou a diminuição na absorbância em 340nm do NADPH, conforme

descrito por LU e colaboradores (2007).

4.4.2.5 Determinação dos níveis de Malondialdeido (MDA)

A concentração de MDA foi determinada pelo método de Uchiyama e Mihara

(1978) conforme descrito por Lu e colaboradores (2007). Em um eppendorf foram

pipetados 1000 µL de amostra, acrescidos de 300 µL de ácido tiobarbitúrico (0,67%)

e 4 µL de BHT. A mistura foi incubada em banho-maria a 95ºC durante 10 min, e, em

seguida colocada em banho de gelo por 5 min. Em seguida os eppendorfs foram

centrifugados por 10 min a 3500 rpm. O sobrenadante foi lido em 530 nm em

espectrofotômetro.

4.5 Análise Estatística

A análise estatística dos dados da latência de descida da plataforma, no

teste da esquiva inibitória, foi realizada por análise de variância (ANOVA) não

paramétrica de uma via (Kruskal-Wallis). A análise post hoc dos dados foi feita por

59

meio do teste não-paramétrico de comparações múltiplas Dunns. Os resultados

estão apresentados como medianas seguidas dos intervalos interquatil (25-75%).

No teste do OF e LCE os dados foram analisados por análise de variância

(ANOVA) e uma via. A análise post hoc foi feita utilizando o teste de Newman Keuls.

Para os testes “in vitro” foi utilizado ANOVA com o teste de Dunnett como

análise post hoc.

Os dados obtidos são apresentados como médias seguidas pelos

respectivos erro padrão médio (EPM).

Todos os dados foram analisados através do software GrafhPad Prism®,

sendo considerados estatisticamente significantes os valores de p menor do que

0,05 (p<0,05).

60

5 RESULTADOS

5.1 Obtenção e rendimento do ERF, Sfr3a e Sfr7b

Os frutos da Rapanea ferrugina, após secos e processados, sofreram

extração com diclorometano através do processo de maceração para obtenção do

extrato denominado ERF. Em seguida, o ERF foi concentrado em evaporador

rotativo a pressão reduzida e temperatura inferior a 40ºC. Após a completa

eliminação do solvente, o resíduo sólido foi reunido e a massa final foi calculada.

Obteve-se, portanto, um total de 85,25 g de extrato seco, que é equivalente a 7,1%

da massa inicial de material vegetal (1200 g).

O fracionamento do ERF, foi realizado com 25,0 g do extrato através de CC,

resultando em 6 frações. As frações FR3 e FR4 apresentaram um perfil

cromatográfico mais puro e rendimento adequado, sendo selecionadas para

procedimentos cromatográficos posteriores.

A fração FR3 originou a subfração Sfr3a demonstrando uma substância

isolada. A Sfr3a apresentou um rendimento de 560,6 mg, equivalente a 2,24% de

ERF, e, 0,16% em relação ao material vegetal utilizado para a extração. Em seguida

foi encaminhada para determinação da estrutura molecular através de RMN.

A fração FR4, purificada por CC, apresentou uma subfração que revelou uma

substância isolada, a qual recebeu a denominação de Sfr7b. O rendimento calculado

foi de 196,5 mg, equivalente a 0,79% de ERF, e, 0,05% em relação a massa dos

frutos utilizados na extração.

5.2 Identificação das substâncias isoladas e análise do ERF

5.2.1 Identificação da substância Sfr3a

O composto Sfr3a foi isolado por CC de uma fração do extrato diclorometano

dos frutos da R. ferruginea. Este composto apresentou-se como um óleo levemente

amarelado com um odor bastante característico de gordura.

61

A análise do espectro de RMN de 1H do Sfr3a (Figura 9) possibilita a

caracterização deste composto como um lipídio, mais precisamente um triglicerídeo.

A Figura 10 demonstra uma molécula padrão de um triglicerídeo, apontando em sua

estrutura a numeração para facilitar a identificação dos sinais no espectro de RMN 1H. O sinal 1, em 0,88 ppm é referente aos hidrogênios das metilas terminais dos

ácidos graxos, o número 2, em 1,30 ppm é atribuído aos hidrogênios de grupos

metileno das cadeias alifáticas. O sinal número 3, em 1,58 ppm é característico aos

hidrogênios do carbono γ do éster. O sinal 4 em 2,06 ppm está relacionado aos

hidrogênios do carbono β de dupla ligação. O sinal 5, em 2,31 ppm é atribuído aos

hidrogênios do carbono β do éster. O sinal 6 é atribuído aos hidrogênios do carbono

central aos carbonos de duplas ligações, o sinal 7 em 4,17 ppm são referentes aos

hidrogênios ligados ao carbono do glicerol. O sinal 8 está relacionado ao hidrogênio

do carbono α ligado ao oxigênio do éster e finalmente o sinal 9, em 5,36 ppm;

referente aos hidrogênios ligados aos carbonos das duplas ligações.

A Tabela 7 apresenta os sinais encontrados na avaliação espectroscópica

do Sfr3a, juntamente com dados de avaliação de triglicerídeos disponíveis na

literatura.

62

Figura 9: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr3a.

H

C

C

C

H

H O

H O

H O

CO (CH2)n

CO (CH2)n CH3

CO (CH2)n CH3

(CH2)n CH3

123

4

56

7

89

9992

7

Figura 10: Representação estrutural da molécula de um triglicerídeo demonstrando a numeração relacionada aos carbonos relacionados no espectro de RMN

TMS 1

2

3

4 5

6 7 8

9

63

Tabela 7: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o Sfr3a e comparação com os dados da literatura para o triglicerídeo.

Carbono RMN 1H δ (ppm) Sfr3a

RMN 1H δ (ppm)

GUILLÉN e RUIZ (2001) COLZATO et al. (2008)

Atibuição

1 0,88 0,90 – 0,80 -CH3 2 1,30 1,40 – 1,15 -(CH2)n 3 1,58 1,70 – 1,50 -OCO-CH2-CH2- 4 2,06 2,10 – 1,90 -CH2-CH=CH- 5 2,31 2,35 – 2,20 -OCO-CH2- 6 2,75 2,80 – 2,70 =HC-CH2-CH= 7 4,17 4,32 – 4,10 CH2OCO- 8 5,32 5,26 – 5,20 CHOCO- 9 5,36 5,40 – 5,26 -CH=CH-

O espectro de RMN de 13C/DEPT do composto Sfr3a (Figura 11) apresenta

os sinais dos carbonos metílicos em 14,0 ppm; dos metilênicos na região de 20,0 a

35,0 ppm; o sinal em 62,0 ppm refere-se aos carbonos 7 e o sinal em 68,8 ppm

refere-se ao carbono 8 do glicerol; sinais correspondentes aos carbonos insaturados

encontram-se na região de 127,0 a 130,2 ppm e os sinais dos carbonos das

carboxilas em 172,8 e 173,2 ppm.

Considerando que a técnica de RMN não viabiliza a identificação estrutural

deste tipo de composto, uma vez que os sinais correspondentes as cadeias

carbônicas saturadas dos ácidos graxos podem ter inúmeros carbonos que

aparecerão como o mesmo sinal no espectro de RMN, o composto Sfr3a foi

denominado Triglicerídeo (TGL) neste trabalho. Para uma definição adequada da

molécula do TGL se faz necessário um detector de Massas, que ao fragmentar a

estrutura da molécula torna possível sua identificação.

64

Figura 11: a) Espectro de RMN 13C (b) Espectro de RMN 13C/DEPT da Sfr3a (CDCl3, 75,5 MHz).

Carbonos saturados

Carbonos insaturados

Grupo carboxila

Glicerol

65

5.2.2 Identificação da substância Sfr7b

O composto Sfr7b foi isolado por CC de uma fração do ERF. Esta substância

apresentou-se como um óleo levemente amarelado. Ao realizar-se CCD com

substâncias padrões isoladas da R. ferruginea verificou-se semelhança fitoquímica

por comparação. O Sfr7b apresentou o mesmo Rf e coloração com revelação com

anisaldeído sulfúrico que o ácido mirsinóico A.

Os espectros de RMN 1H e 13C obtidos para o Sfr7b foram comparados com

aqueles obtidos por Gazoni (2009) e constatou-se que este composto tratava-se

realmente do ácido mirsinóico A (Figura 12).

4"

5" 9'

8'

10'

O OH

1234

56

7

1'2'

3'4'

5'6'

7'1"2"

3"

Figura 12: Representação da estrutura molecular do ácido mirsinóico A

66

Figura 13: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr7b.

No espectro de RMN 1H (Figura 13) observou-se em 7,76 ppm o sinal

correspondente aos hidrogênios aromáticos 2 e 6. Os sinais em 5,32 e 5,08 ppm

correspondem aos hidrogênios olefínicos 2’, 2’’ e 6’. O sinal em 3,38 ppm é atribuído

aos hidrogênios metilênicos 1’ e 1’’. Finalmente, os sinais em 1,78; 1,68 e 1,60 ppm

são referentes os hidrogênios das 5 metilas existentes no AMA.

67

Figura 14: a) Espectro de RMN13C. b) Espectro de RMN13C/DEPT da Sfr7b (CDCl3, 75,5 MHz)

68

No espectro de RMN 13C (Figura 14 a) o sinal em 171,9 ppm é referente ao

carbono da carboxila, já os sinais de 150 a 120 ppm estão relacionados aos

carbonos aromáticos e olefínicos. Os sinais abaixo de 40 ppm referem-se aos

carbonos alifáticos.

A Tabela 8 dispõe os sinais referentes aos espectros de RMN 1H e 13C

relacionados com o AMA. Estão ainda identificados nesta tabela os sinais de RMN 1H e 13C encontrados por Gazoni (2009), para o AMA.

Tabela 8: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H e 13C obtidos para o Sfr7b e comparação com os dados da literatura para o AMA.

Carbono RMN 1H δ (ppm) Sfr7b

RMN 1H δ (ppm)

GAZONI, 2009

RMN 13C δ (ppm) Sfr7b

RMN 13C δ (ppm)

GAZONI, 2009 1 121,1 121,0 2 7,76 7,77 130,4 130,5 3 127,0 127,0 4 158,0 158,0 5 127,0 127,0 6 7,76 7,77 130,4 130,5 1’ 3,40 3,38 29,6 29,7 2’ 5,32 5,32 121,2 121,2 3’ 139,1 139,1 4’ 39,7 39,7 5’ 2,11 2,11 26,4 26,3 6’ 5,08 5,08 123,7 123,8 7’ 132,0 131,8 8’ 1,68 1,69 25,6 25,7 9’ 1,78 1,77 16,2 16,2

10’ 1,60 1,60 17,9 17,7 1’’ 3,40 3,40 29,3 29,3 2’’ 5,32 5,32 121,3 121,4 3’’ 134,9 134,0 4’’ 1,78 1,77 17,9 17,9 5’’ 1,78 1,77 25,7 25,8

COOH 171,9 172,0

5.2.3 Análise do ERF por RMN

O extrato dos frutos obtido com diclorometano apresentou um perfil muito

simples quando avaliado por CCD, com predominância dos dois compostos

isolados, o TGL e AMA. Este extrato foi então submetido a análise espectroscópica

69

de RMN 1H e 13C. Nas Figuras 14 e 15 estão apresentados estes espectros.

Analisando os espectros nota-se que o ERF apresenta um perfil bastante limpo, com

sinais bem predominantes dos compostos isolados.

As Figuras 15 e 16 apresentam os espectros de RMN 1H e 13C do ERF

comparado aos compostos TGL e AMA. As Tabelas 9 e 10 estão apresentado os

sinais correspondentes aos compostos TGL e AMA no ERF.

Figura 15: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) comparando o TGL e AMA com o ERF.

Através desta análise de RMN 1H foi possível determinar a proporção entre

os compostos dentro do extrato. Para realizar isso foi necessário selecionar sinais

exclusivos de cada composto no espectro do ERF. Sendo assim, o sinal em 7,75

ppm, com integral de 1,0 refere-se aos hidrogênios H-2 e H-5 do AMA. Já o sinal em

4,30 ppm, com integral de 1,58, refere-se aos hidrogênios H-7 do TGL. Cada sinal

AM

A

TG

L

TGL

AMA

ERF

70

corresponde a dois hidrogênios. Nas integrais para estes dois sinais tem-se 1,5:1 de

TGL para AMA. Então esta é proporção entre estes dois compostos.

Tabela 9: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL

RMN 1H Sinal (δ=ppm) AMA Triglicerídeo Atribuição

0,88 x 1 1,30 x 2 1,60 x x 3 1,68 x 4’’ 1,77 x 5’’ 2,04 x x 4 TGL e 5’ AMA 2,32 x 5 2,77 x 6 3,38 x 1’ e 1’’ 4,14 x 7 4,30 x 7 5,10 x 6’ 5,34 x x 2 e 2’’ AMA / 8 e 9 TGL 7,75 x 2

Figura 16: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) comparando o TGL e AMA com o ERF.

TGL

AMA

ERF

71

Tabela 10: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL

RMN 13C Sinal (δ=ppm)

AMA Triglicerídeo Atribuição

14,08 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 16,23 x 9’ 17,71 x 10 17,90 x 4’ 22,58 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 22,69 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 24,70 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 24,84 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 25,63 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 25,69 x 5’ 25,82 x 8’ 26,36 x 5’’ 27,20 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 31,53 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 31,91 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 34,94 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 34,03 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 34,20 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 39,69 x 4’ 62,11 x 7, 8 68,88 x 7, 8

120,92 x 1 121,16 x 2’ 121,33 x 2’’ 123,76 x 6’ 126,95 x 3 127,41 x 5 127,90 x C. Insaturado 9 128,07 x C. Insaturado 9 129,71 x C. Insaturado 9 130,02 x C. Insaturado 9 130,23 x x 2 130,43 x x 6 132,01 x 7’ 139,09 x 3’’ 157,96 x 3 171,57 x COOH AMA 172,89 x COO TGL 173,31 x COO TGL

72

5.3 Ensaios farmacológicos

5.3.1 Atividade do ERF sobre a memória, deambulação e ansiedade dos

animais normais

O ERF foi administrado em ratos visando verificar seu efeito sobre as etapas

da memória de longa duração (MLD), aquisição, consolidação e evocação. Para

tanto utilizou-se o modelo farmacológico da esquiva inibitória. O ERF (50, 150 e 300

mg/kg) foi administrado pré-treino, pós-treino e pré-teste para avaliação da

aquisição, consolidação e evocação respectivamente.

No processo de aquisição (Figura 17 a), verificou-se que o tratamento dos

animais com ERF facilitou a aquisição da memória dos animais quando comparado

com o tratamento com controle negativo (NaCl 0,9%; 0,3 mL/100 g de peso; v.o.). As

latências de descida da sessão teste dos grupos tratados com 150 e 300 mg/kg

foram respectivamente de 180,0 s (134,5 – 180,0 s) e 180,0 s (180,0 – 180,0 s). Os

controle apresentaram uma latência de 29,5 s (10,5 – 29,5 s). A análise estatística

revelou uma diferença significativa entre os grupos. A análise post hoc mostrou que

a administração do ERF nas doses de 150 e 300 mg/kg aumentou a latência de

descida de forma significativa (p<0,001), em relação ao grupo controle.

Na etapa da consolidação (Figura 17 b) observou-se que todas as doses

utilizadas o tratamento com ERF produziu efeito facilitatório da consolidação da

memória dos animais. As latências de descida nas doses utilizadas (50, 150 e 300

mg/kg) foram 180,0 s (28,0 – 180,0 s), 177,5 s (61,0 – 180,0 s) e 180,0 s (180,0 –

180,0 s) respectivamente e, o grupo tratado com veículo apresentou uma latência de

descida de 14,0 s (10,0 – 26,5 s). A análise estatística apontou uma diferença

significativa entre os grupos. A análise post hoc indicou que a administração do ERF

apresentou diferença significativa, sendo nas doses de 50 e 150mg/kg, p<0,01; e na

dose de 300mg/kg, p<0,001.

Os resultados obtidos da evocação estão apresentados na Figura 17 c. Os

resultados demonstraram que o tratamento com o ERF melhorou a evocação da

memória dos animais testados em todas as doses avaliadas. As latências de

descida dos tratamentos (50, 150 e 300 mg/kg) foram de 117,0 s (67,0 – 180,0 s),

73

175,0 s (61,5 – 180,0 s) e 180,0 s (180,0 – 180,0 s) respectivamente. O tratamento

dos animais com veículo revelou uma latência de descida de 16,5 s (10,5 – 42,5 s).

A análise estatística indicou uma diferença significativa entre os grupos. Verificou-se

que o tratamento com o extrato acresceu 163,5 s, ou de 90,8%, na latência de

descida dos animais da plataforma, para a dose de 300 mg/kg. A análise post hoc

indicou que a administração do ERF apresentou diferença significativa em relação

ao controle, sendo na dose de 50 mg/kg, p< 0,05; na dose de 150mg/kg, p<0,01, e

na dose de 300mg/kg, p<0,001.

74

0

50

100

150

200

Salina ERF50 ERF150 ERF300

A****** Treino

Teste

Latê

ncia

de

desc

ida

(s)

0

50

100

150

200


B** ** ***

Latê

ncia

de

desc

ida

(s)

0

50

100

150

200


C* ** ***

Latê

ncia

de

desc

ida

(s)

Figura 17: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg) 1 hora antes do treino (A – aquisição), imediatamente após o treino (B – consolidação) e 1 hora antes do teste (C – evocação), sobre a latência de descida dos ratos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).

75

Na Tabela 11 estão apresentados os resultados obtidos sobre os efeitos do

tratamento com ERF na avaliação da atividade locomotora dos animais, no teste do

OF, após administração do ERF. Os dados obtidos demonstram que a administração

do ERF não alterou a deambulação dos animais, uma vez que não houve alterações

significativas no número de cruzamentos e de rearings dos animais tratados com o

extrato em relação ao grupo controle.

Tabela 11: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.

Tratamentos Cruzamentos Rearings

Salina 103,1 ± 2,5 50,1 ± 3,2

ERF 50 104,7 ± 4,2 49,9 ± 4,0

ERF 150 101,9 ± 6,1 51,5 ± 2,5

ERF 300 106,2 ± 2,9 53,1 ± 2,8

Na Tabela 12 estão representados os resultados obtidos dos animais

tratados com ERF e submetidos ao teste de ansiedade, o LCE. Os resultados

demonstram que não houve diferenças significativas entre os os animais que

receberam o ERF em relação ao grupo controle, em todos os parâmetros

comportamentais observados

Tabela 12: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.

Tratamentos % Frequência

no Braço Aberto

% Frequência no Braço Fechado

% Tempo no Braço Aberto

% Tempo no Braço

Fechado Salina 41,5 ± 2,5 58,5 ± 2,5 45,7 ± 3,0 54,3 ± 3,0

ERF 50 43,8 ± 1,7 56,2 ± 1,7 44,3 ± 4,6 55,7 ± 4,6

ERF 150 46,7 ± 3,0 53,3 ± 3,0 43,2 ± 4,1 56,8 ± 4,1

ERF 300 42,5 ± 2,0 57,5 ± 2,0 46,0 ± 3,9 54,0 ± 3,9

76

5.3.2 Ação do ERF sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com

Alzheimer induzido por STZ.

A Figura 18 mostra o efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg)

e o fármaco de referência, Galantamina (0,5 mg/kg), sobre a latência de descida da

plataforma, no processo de conosolidação da memória no teste da esquiva inibitória,

dos animais com Alzheimer induzido pelo modelo da STZ. Os resultados

demonstram que o tratamento dos animais com o ERF significantemente produziu

efeito facilitatório da memória da esquiva inibitória. As latências de descida dos

animais tratados com as doses de 50, 150 e 300 mg/kg de ERF no teste foram 125,5

s (65,0 – 180,0 s); 145,0 s (84,5 – 180 s) e 180,0 s (130,0 – 180 s) respectivamente,

comparados com o grupo controle (10,0 s (6,0 – 19,0 s). Também foi observado

efeito facilitatório com a Galantamina com uma latência de descida de 133,0 s (60,0

– 180 s).

A análise estatística revelou que existe diferença significativa entre os

grupos. O teste post hoc indicou que a dose de 50 mg/kg foi significativa e

apresentou um p<0,05 em relação ao grupo controle. Da mesma maneira, as doses

de 150 e 300 mg/kg apresentaram, respectivamente p<0,01 e p<0,001. O tratamento

com Galantamina também revelou significância em relação ao controle, obtendo

p<0,05. Observou-se ainda que não ocorreu diferença signficativa entre os grupos

tratados com o ERF em relação ao grupos de animais que receberam Galantamina.

77

0

50

100

150

200

Salina Galant.ERF300

ERF150

ERF 50

* ** *** * TreinoTeste

Latê

ncia

de

desc

ida

(s)

Figura 18: Efeito da administração do ERF (pós-treino) (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre memória dos ratos com DA induzida por STZ (2,5mg/mL - 0,2uL) nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).

A Tabela 13 apresenta os resultados obtidos com animais com DA induzida

por STZ no teste do OF. A análise estatística revelou que a administração do ERF

(50, 150 e 300 mg/kg) e da Galantamina (0,5 mg/kg) não alteram o número de

cruzamentos e de rearings neste experimento, quando comparados com o grupo

que recebeu veículo.

Tabela 13: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.

Grupo Cruzamentos Rearings

Salina 120,9 ± 3,0 31,1 ± 3,0

ERF 50 134,8 ± 11,7 30,0 ± 4,7

ERF 150 133,0 ± 4,8 37,1 ± 2,0

ERF 300 135,8 ± 2,9 38,9 ± 1,5

Galantamina 120,1 ± 6,3 31,7 ± 3,1

78

Adicionalmente, também foi verificado que os tratamentos com ERF (50, 150

e 300 mg/kg) quando comparado com o veículo não alterou os parâmetros

comportamentais dos animais no LCE, uma vez que a análise estatística não revelou

qualquer diferença significativa entre os grupos testados neste modelo. Os

resultados (Tabela 14) demonstram que o tratamento dos animais com o extrato não

altera o grau de ansiedade dos animais comparados com o controle.

Tabela 14 : Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.


no Braço Aberto



% Tempo no Braço

Fechado

Salina 47,5 ± 3,0 52,5 ± 3,0 49,4 ± 4,5 50,6 ± 4,5

ERF 50 39,8 ± 4,0 60,2 ± 4,0 40, 5 ± 3,0 59,5 ± 3,0

ERF 150 39,6 ± 2,6 60,4 ± 2,6 40, 2 ± 4,2 59,7 ± 4,2

ERF 300 45,3 ± 2,6 54,7 ± 2,6 52,6 ± 1,6 47,4 ± 1,6

5.3.3 Atividade do Triglicerídeo sobre a memória, deambulação e ansiedade de

animais com Alzheimer induzido por STZ.

Uma vez que o ERF produziu efeito facilitatório da memória de animais

normais e com DA induzida, também foi avaliado nos mesmos modelos

farmacológicos, o efeito dos compostos isolados desse extrato.

Os resultados obtidos demonstram que o tratamento dos animais com o

triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) induziu um aumento na latência de descida dos

animais avaliados na esquiva inibitória quando comparado ao grupo tratado apenas

com a solução salina.

Entretanto, o efeito foi mais pronunciado com a menor dose utilizada (Figura

19). As latências de descida dos grupos tratados com 5, 15 e 30 mg/kg de

triglicerídeo são respectivamente 165,0 s (85,0 – 180,0 s); 130,0 s (40,0 – 180 s) e

79

76,0 s (62,0 – 175,0 s). Os animais que receberam a Galantamina obtiveram 133,0 s

(60,0 180,0 s) e os tratados com salina 10,0 s (8,5 – 16,0 s)

A análise estatística revelou uma diferença significativa entre os grupos

avaliados. O post hoc demonstrou que o triglicerídeo apresentou diferença

significativa em relação ao controle negativo em todas as doses avaliadas, sendo a

dose de 5 mg/kg p<0,001; e as doses de 15 e 30 mg/kg, p<0,5.

0

50

100

150

200

Salina Galant.TGL 30

TGL 15

TGL 5

*** * ** TreinoTeste

*

Naive

Lat

ên

cia

de

de

scid

a (s

)

Figura 19: Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) e Galantamina (0,5 mg/kg) sobre a memória dos camundongos nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001).

A análise dos resultados obtidos no teste do OF, descritos na Tabela 15,

revelaram que o tratamento com o triglicerídeo na dose de 30 mg/kg promoveu

alterações nos parâmetros comportamentais (rearings e cruzamentos), aumentando

de forma significativa (p<0,01) os rearings, quando comparados ao grupo controle

80

Tabela 15: Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).


Salina 102,6 ± 4,2 44,7 ± 3,4

TGL 5 127,7 ± 8,3 50,1 ± 4,0

TGL 15 112,7 ± 8,3 43,9 ± 2,7

TGL 30 140,0 ± 10,5 51,6 ± 7,3**

Da mesma maneira, o tratamento com 30 mg/kg do TGL produziu alterações

comportamentais no LCE (Tabela 16). Observou-se uma diminuição da freqüência

de entradas no braço aberto e do tempo de permanência nesse braço, ao mesmo

tempo em que aumentou a freqüência de entradas nos braços fechados e o tempo

de permanência neste braço de forma estatisticamente significante, sugerindo que o

composto possa nessa dose produzir efeito sedativo considerável.

Tabela 16: Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); *** (p<0,001).


no Braço Aberto



% Tempo no Braço

Fechado Salina 47,5 ± 3,0 52,5 ± 3,0 53,8 ± 4,1 46,2 ± 4,1

TGL 5 43,4 ± 2,1 56,6 ± 2,0 48,7 ± 4,1 51,3 ± 4,0

TGL 15 43,4 ± 2,1 60,1 ± 2,8 42,8 ± 3,0 57,2 ± 3,0

TGL 30 26,3 ± 4,8 * 73,7 ± 4,8 * 34,1 ± 5,9 *** 65,9 ± 5,9 ***

81

5.3.4 Efeito do Ácido Mirsinóico A sobre a memória, deambulação e ansiedade

de animais com Alzheimer induzido por STZ.

Também os efeitos do AMA, isolado de uma fração do ERF, foram testados

sobre a consolidação da memória de camundongos com DA induzido pelo modelo

da STZ (Figura 20).

O tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) promoveu facilitação da

memória dos animais uma vez que aumentou a latência de descida dos mesmos na

tarefa da esquiva inibitória, quando comparado com o controle negativo. As latências

de descida registradas nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg e veículo foram

respectivamente de 51 s (34,5 – 92,0 s), 140,0 s (109,5 – 180,0 s) , 143,5 s (101,0 –

180,0 s) e 17,0 s (15,0 – 24,0 s). Também foi observado que o tratamento dos

animais com a Galantamina produziu efeito facilitador demonstrando uma latência

de 133,0 s (60,0 – 180 s) sobre a memória dos animais avaliados.

A análise estatística demonstrou uma diferença significativa entre os grupos.

O post hoc identificou que o tratamento com o AMA apresentou uma diferença

estatística significativa (p<0,001) para as doses de 15 e 30 mg/kg do AMA e da

Galantamina (p<0,01) em relação ao controle negativo.

82

0

50

100

150

200

Salina Galant.AMA 30

AMA 15

AMA 5

*** *** ** TreinoTeste

Latê

ncia

de

desc

ida

(s)

Figura 20: Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre a latência de descida dos camundongos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01); *** (p<0,001).

A análise estatística dos dados obtidos no OF (Tabela 17) revelou que não

houve diferença estatística significativa nos parâmetros comportamentais registrados

neste experimento. Dessa forma, verifica-se que a administração do AMA não

alterou de modo significativo o número de cruzamentos e e o número de rearings,

provavelmente não alterando também a locomoção destes animais na tarefa da

esquiva.

Tabela 17: Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.


Salina 109,9 ± 8,2 44,7 ± 3,4

AMA 5 119,0 ± 12,6 50,0 ± 3,7

AMA 15 111,2 ± 9,2 52,5 ± 6,1

AMA 30 105,8 ± 7,5 53,2 ± 3,8

83

Com relação aos efeitos do AMA sobre os parâmetros comportamentais

avaliados no LCE, a Tabela 18 nos permite verificar que não foram evidenciadas

quaisquer diferenças estatísticas significativas entre os grupos tratados com AMA

em relação ao controle tratado com solução salina.

Tabela 18: Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.


no Braço Aberto



% Tempo no Braço

Fechado Salina 37,1 ± 2,1 62,9 ± 2,1 32,5 ± 1,5 67,53 ± 1,5

AMA 5 42,3 ± 1,4 57,7 ± 1,4 32,9 ± 4,1 67,1 ± 4,1

AMA 15 42,4 ± 3,7 57,6 ± 3,7 42,9 ± 5,0 57,0 ± 5,0

AMA 30 37,7 ± 3,7 62,3 ± 3,7 34,6 ± 4,7 65,4 ± 4,7

5.4 Medidas de sistemas e produtos oxidativos

5.4.1 Efeito do TGL sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD)

O tratamento dos animais com o TGL aumentou a atividade desta enzima

antioxidante de modo significativo em relação aos animais controle.

Analisando a Figura 21, é possível verificar que o pré tratamento dos

animais com DA induzidos com TGL nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg produziu um

aumento da atividade da SOD em 60%, 40% e 20%, respectivamente quando

comparado com animais tratados com veículo (controle). Pode-se observar também

que a dose de 5 mg/kg foi estatisticamente a mais ativa (p< 0,01), resultando em

uma atividade de 1,62 ± 0,02 µg de O2-·/h/mg de proteína. O grupo Naive, que

caracteriza os animais normais, sem danos oxidativos resultantes da DA, apresentou

um valor de atividade da SOD (1,85 ± 0,04 µg de O2-·/h/mg de proteína) bastante

semelhante ao encontrado para a dose de 5 mg/kg de TGL, o que representa a

efetividade deste tratamento na ativação desta defesa antioxidante do tecido

84

cerebral dos animais. As doses de 15 e 30 mg/kg apresentaram resultados menos

expressivos, porém, ainda significativos em relação ao controle negativo.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0ControleNaiveGlicerídeo

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

****

****

SO

D( µµ µµ

M O

2-./h

/mg

pro

teín

a)

Figura 21: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).

5.4.2 Ação do TGL sobre a atividade da catalase (CAT)

Através da Figura 22, é possível verificar que o tratamento dos animais com

o TGL também aumentou a atividade da CAT de modo bastante pronunciado. Pelos

resultados apresentados percebe-se que as doses de 5 e 15 mg/kg, promoveram

aumento da atividade desta enzima em 37,4% e 9,3%, respectivamente,

apresentando diferenças significativas em relação ao grupo controle negativo, que

contém os animais com DA tratados apenas com salina.

Observa-se ainda que o grupo que recebeu o TGL nas doses de 5 e 15

mg/kg apresentaram uma atividade enzimática de 764,0 ± 6,7 µmol de

H2O2/h/mg/proteína e 608,7 ± 6,2 µmol de H2O2/h/mg de proteína, respectivamente,

e, grupo de animais Naive, 784,5 ± 6,6 µmol de H2O2/h/MG/proteína, ambos

significativamente diferentes do controle (p<0,01), que obteve uma atividade de

557,0 ± 8,0 µmol de H2O2/h/mg/proteína. Estes resultados indicam que o tratamento

com o TGL em animais com DA induzida foi capaz de aumentar a atividade da CAT,

85

de modo a aproximar a atividade desta mesma enzima num grupo de animais sem a

patologia instaurada.

0

200

400

600

800ControleNaiveGlicerídeo

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

**

**

**

Cat

alas

e( µµ µµ

mol

H2O

2/h

/mg

pro

teín

a)

Figura 22: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).

5.4.3 Efeito do TGL sobre a atividade da glutationa peroxidase (GPx)

A Figura 23 demonstra que o tratamento dos animais com o TGL aumentou

a atividade da GPx. No entanto, verifica-se que esse efeito foi obtido somente com a

dose menor utilizada.

Animais tratados com o TGL na dose de 5 mg/kg apresentaram uma

atividade de 30,2 ± 0,8 µM de NAD+/h/MG proteína, representando um aumento de

27,6% na atividade da enzima. Este efeito também foi verificado nos animas Naive

que apresentaram uma atividade de 30,2 ± 0,2 µM de NAD+/h/mg proteína. Ambos

os resultados apresentaram diferença significante de p<0,01; em relação ao grupo

tratado apenas com a solução salina, o qual demonstrou uma atividade de 23,6 ± 0,1

µM de NAD+/h mg proteína.

86

0

5

10

15

20

25

30

35ControleNaiveGlicerídeo

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

** **G

Px

( µµ µµM

NA

D+/h

/mg

pro

teín

a)

Figura 23: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).

5.4.4 Ação do TGL sobre a atividade da glutationa redutase (GR)

A atividade da GR esta representada na Figura 24 e os resultados nos

permitem verificar que o tratamento com o TGL na dose de 5 e 15 mg/kg foram

capazes de aumentar de modo significativo a ação da GR em 24,6% e 4,1%

respectivamente em relação ao controle

As dose de 5 e 15 mg/kg apresentaram atividade de 11,2 ± 0,1 µmol de

NADPH/h/mg/proteína e 9,3 ± 0,06 µmol de NADPH/h/mg/proteína respectivamente,

enquanto o grupo Naive uma atividade de de 11,5 ± 0,1 µmol de NADPH/h/mg

proteína, ambos significativamente diferentes (p<0,01) do controle negativo que

obteve uma atividade de 8,9 ± 0,1 µmol de NADPH/h/mg proteína. Não foram

observados efeitos do TGL sobre a atividade enzimática da GR em animais tratados

com doses de 30 mg/kg de TGL.

87

0123456789

101112

ControleNaiveGlicerídeo

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

**

**

**G

R( µµ µµ

mol

NA

DP

H/

h/m

g p

rote

ína)

Figura 24: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).

5.4.5 Efeito do TGL sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)

Os resultados deste ensaio permitiram avaliar o grau de peroxidação lipídica

encontrada nas amostras do tecido cerebral dos animais tratados com o TGL,

animais controle negativo e o grupo Naive, correspondentes aos animais normais.

Analisando a Figura 25, é possível observar que o tratamento dos animais

com o TGL reduziu a peroxidação lipídica nas amostras avaliadas. Todas as doses

utilizadas (5, 15 e 30 mg/kg) apresentaram resultados efetivos, protegendo

efetivamente o tecido cerebral dos animais de maneira significativa (p<0,01) em

relação ao controle. Os tratamentos reduziram a peroxidação lipídica em 88,6 ; 54,0

e 18,5% respectivamente.

Este teste indicou que com a dose de 5 mg/kg obteve-se uma concentração

de 0,08 ± 0,001 µm de TBARS, enquanto o grupo Naive 0,07 ± 0,01 µm de TBARS.

Já o controle negativo demonstrou uma concentração de 0,27 ± 0,02 µm de TBARS,

indicando uma alta taxa de peroxidação lipídica.

88

0.0

0.1

0.2

0.3ControleNaiveGlicerídeo

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

**

**

**

**

TB

AR

S (

µµ µµm

)

Figura 25: Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de camundongos tratados com DA induzida por STZ e tratados com TGL (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).

5.4.6 Efeito do AMA sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD)

A avaliação da atividade da SOD no tecido cerebral dos animais que

receberam o tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) revelou um aumento na

atividade desta enzima. Observando a Figura 26 é possível verificar que o AMA na

dose de 30 mg/kg caracterizou uma atividade enzimática semelhante aos animais

Naive, grupo sem alterações da DA. Entretanto, as análises estatística não

demonstraram qualquer diferença significativa entre os grupos.

89

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04Controle

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

NaiveAMA

SO

D( µµ µµ

M O

2-./h

/mg

pro

teín

a)

Figura 26: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.

5.4.7 Ação do AMA sobre a atividade da catalase (CAT)

A Figura 27 apresenta os resultados obtidos na determinação da atividade

enzimática da CAT sobre os animais com DA induzida e tratados com o AMA (5, 15

e 30 mg/kg), além dos animais controle e Naive. Observando os dados obtidos, é

possível verificar que o AMA não apresentou atividade sobre esta enzima, uma vez

que não foi possível vericar um aumento em sua atividade. Análises estatísticas não

caracterizaram qualquer diferença significativa entre os grupos avaliados.

90

0

50

100

150

200

250

300

350ControleNaiveAMA

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

Cat

alas

e( µµ µµ

mol

H2O

2/h

/mg

pro

teín

a)

Figura 27: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos camungongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.

5.4.8 Efeito do AMA sobre a atividade da glutationa peroxidase (GPx)

A Figura 28 apresenta os resultados da avaliação da atividade da enzima

GR, do cérebro dos animais com DA induzida por STZ, e tratados com o AMA (5, 15

e 30 mg/kg). Analisando os dados obtidos é possível verificar que o tratamento com

o composto não alterou a atividade da enzima, uma vez que não verificou-se

diferenças significativas em relação ao grupo controle e Naive.

91

GP

x( µµ µµ

M N

AD

+/h

/mg

pro

teín

a)

0

1

2

3

4

5

6

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

ControleNaiveAMA

Figura 28: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.

5.4.9 Ação do AMA sobre a atividade da glutationa redutase (GR)

A Figura 29 demonstra os resultados obtidos na determinação da atividade

da enzima antioxidante GR, do tecido cerebral de animais com DA induzida, e,

tratados com o AMA. Analisando os resultados, é possível verificar que o AMA não

apresenta atividade nesta enzima antioxidante, pois não encontrou-se diferenças

significativas em relação aos animais controle.

92

GR

( µµ µµm

ol

NA

DP

H/

h/m

g p

rote

ína)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

ControleNaiveAMA

Figura 29: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.

5.4.10 Efeito do AMA sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)

Os resultados da avaliação da peroxidação lipídica (Figura 30) dos animais

com DA induzida, e tratados com o AMA, revelaram que este composto não foi

capaz de proteger os lipídios do tecido cerebral de danos oxidativos, uma vez que os

níveis de TBARS encontram-se significativamente equivalentes aos animais

controle.

93

TB

AR

S (

µµ µµm

)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

5 15 30

Tratamentos (mg/kg)

ControleNaiveAMA

Figura 30: Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de camundongos tratados com DA induzida por STZ e tratados com AMA (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.

94

6 DISCUSSÃO

A Rapanea ferruginea é uma planta medicinal pertencente a família

Myrsinaceae e que possui ampla distribuição pelo território brasileiro, bem como

diversas outras regiões da América do Sul. Esta espécie tem sido largamente

estudada por pesquisadores da UNIVALI e têm apresentado efeitos farmacológicos

promissores sobre o SNC (PEREIRA et al., 2004; GALVAN, 2007; ANTONIALLI,

2008; GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010)

A avaliação da R. ferruginea foi realizada através da preparação de um

extrato diclorometano (ERF), e, o isolamento e identificação de substâncias foram

oriundas desta extração, o que possibilitou a realização de testes farmacológicos e

bioquímicos na busca de efeitos anti-Alzheimer.

A extração e isolamento de compostos naturais têm colaborado para o

desenvolvimento de muitos fármacos que vêm sendo empregado no tratamento de

diversas patologias. Um exemplo é o alcalóide Galantamina, isolada da Galanthus

nivalis e de várias espécies da família Amaryllidaceae, que apresenta atividade

anticolinesterásica e é utilizado no tratamento da DA desde 2001 (HEINRICH, 2010).

Para a separação e purificação de compostos do ERF procedeu-se

realização de CC. Esta técnica cromatográfica utiliza uma fase estacionária, sílica

gel, e uma fase móvel, caracterizada por uma mistura de solventes orgânicos. A CC

é uma técnica bastante simples, de baixo custo, pouco material, e, que permite o

isolamento de compostos naturais de extratos e frações complexas (CECHINEL-

FILHO; YUNES, 1998; CAO et al., 2010).

Gazoni (2009) isolou diversas substâncias dos frutos, caules e folhas da R.

ferruginea utilizando esta mesma técnica cromatográfica. Entre estas substâncias

isoladas destacam-se o AMA, encontrado em abundância nos frutos, o AMB,

espinasterol, um ácido graxo de cadeia longa e um álcool graxo de cadeia longa,

que foram encontrados nos caules e folhas.

Este trabalho deu continuidade ao isolamento e identificação de substâncias

oriundas dos frutos. Como demonstrado, foi possível isolar novamente o AMA, além

de um lipídio, caracterizado como um triglicerídeo que foi denominado TGL.

As avaliações espectroscópicas de RMN condizeram com os resultados

encontrados anteriormente por Gazoni (2009), demonstrando realmente que o

95

composto isolado tratava-se do AMA. O TGL, também caracterizado por RMN,

apresentou resultados que foram comparados com a literatura, indicando sinais

caracerísticos do núcleo glicerídico, bem como das cadeias dos ácidos graxos

insaturados acoplados ao núcleo do glicerol (GUILLÉN; RUIZ, 2001; COLZATO et

al. 2008).

Até o presente momento não há relatos científicos do isolamento de um

triglicerídeo dos frutos desta espécie, bem como a caracterização farmacológica

deste composto sobre a DA, o que viabiliza as investigações realizadas com este

composto.

Em virtude do bom rendimento, facilidade em isolar e identificar um

composto, com características de marcador fitoquímico para o ERF, procedeu-se

uma avaliação do fingerprint deste extrato por RMN. Os espectros obtidos

mostraram um perfil bastante simples para o extrato, com predominâncias dos dois

compostos isolados. A avaliação metabolômica de extratos vegetais através de RMN

permitiu analisar a composição química de extratos, bem como identificar a

presença de compostos através da análise dos sinais específicos das substâncias

(HEINRICH, 2008).

Investigações metabolômicas têm permitido aos pesquisadores identificar

diferentes compostos em extratos de maneira rápida e precisa. Liu e colaboradores

(2010) utilizaram esta estratégia espectroscópica para diferenciar fitoquimicamente

extratos das espécies Artemisia afra e Artemisia annua, plantas medicinais utilizadas

no tratamento da Malária.

A análise de substâncias naturais é um domínio tradicional da

espectroscopia de RMN. Aplicações quantitativas estão sendo estudadas e

evoluindo ao longo dos anos. Estas análises vêm sendo cada vez mais procuradas,

porque uma grande quantidade de novos compostos, de interesse farmacêutico

derivam de produtos de origem natural (PAULI; JAKI; LANKIN, 2005).

A avaliação do potencial terapêutico desses compostos é quase sempre

confrontada com uma insuficiência na viabilização de padrões primários de

referência. Outra barreira encontrada é a síntese destes padrões analíticos para

quantificar estas substâncias naturais, que muitas vezes é muito complicada e cara,

ou, não é possível. Para produzir um padrão analítico, os compostos ativos devem

ser isolados de sua fonte natural e purificados ao máximo. Além disso, o

96

procedimento analítico deve ser capaz de detectar o padrão e tornar a análise viável

em relação ao extrato de origem (EISENREICH; BACHER, 2007)

Diversos compostos não podem ser detectados utilizando apenas um

método cromatográfico por diversas razões, entre elas a incapacidade da captação

dos sinais pelos detectores. Por outro lado, muitos compostos não apresentam a

volatilidade necessária para análises em cromatografias gasosas, incapacitando a

utilização desta metodologia (WOLFENDER; NDJOKO; HOSTETTMANN, 2003;

KESTING; HUANG; SORENSEN, 2010). Dessa forma, a caracterização de extratos

de plantas farmacologicamente relevantes com métodos cromatográficos, é

freqüentemente complicada devido a sua composição heterogênea. Por outro lado,

nos espectros de RMN de extratos vegetais, quase todas as moléculas solúveis

podem ser determinadas devido à resposta molecular (MALET-MARTINO;

HOLZGRABE, 2011).

O RMN é um método qualitativo e quantitativo satisfatório que permite a

análise de misturas complexas de extratos naturais além da definição da estrutura

molecular para propósitos cromatográficos, sem qualquer padrão natural

correspondente. Além disso, esta técnica se mostra vantajosa em relação aos

demais métodos químicos analíticos, pois além de requerer pouca preparação e ser

rápido, o espectro resultante permite obter parâmetros e informações de interesse e

de imediata comparação (CABRINI, 2007).

A análise de RMN do ERF possibilitou a identificação dos sinais pertinentes

aos compostos isolados AMA e TGL. Através da identificação destes sinais

exclusivos, foi possível realizar a determinação da integral do mesmo, o que permitiu

a verificação da proporção entre os compostos no ERF. Esta determinação resultou

em uma proporção de 1,5 de TGL para 1,0 de AMA, o que demonstra a

superioridade na concentração do TGL dentro do ERF.

A R. ferruginea têm apresentado diversas atividades farmacológicas

importantes, com propriedades antinociceptiva em modelos de dor aguda, bem

como modelos de dores crônicas. Uma ação aintihipernociceptiva foi obtida com

ácidos benzóico prenilado AMB, obtidos da planta, em modelos de hipernocicepção.

O AMB exibiu propriedade antinociceptiva em modelos de dor aguda em ratos e

camundongos (HESS, 2006), sendo que, o mecanismo de ação dessa propriedade

parece ser mediado pelos sistemas cujo mecanismo de ação envolve interações

com os sistemas L-arginina-óxido nítrico, serotoninérgico, colinérgico, bem como

97

interações com receptores α-adrenérgicos (HESS et al., 2010). Devido aos

excelentes resultados em modelos de dor aguda, o AMB também foi testado em

modelos de dores crônicas, como a dor neuropática induzida por diabetes (GALVAN,

2007), ou agentes flogísticos como a carragenina, substância P, histamina,

adrenalina, capsaicina, dentre outros (ANTONIALLI, 2008). Adicionalmente, uma

ação aintihipernociceptiva foi obtida com o composto em modelos de

hipernocicepção, como o modelo da constrição do nervo ciático em ratos, bem como

a hipernocicepção induzida pelo completo adjuvante de Freund (CFA), carragenina e

Prostaglandina E2 (PGE2) em camundongos (ANTONIALLI, 2009).

Extratos e compostos da planta foram testados frente à atividade da enzima

AChE em ensaios “in vitro” realizados com cérebro total e outras estruturas cerebrais

isoladas de ratos, resultando em efeito anticolinesterásico, sendo estes estudos um

indicativo de uma possível ação sobre a memória, além de efeito anti-Alzheimer

(GAZONNI, 2009; FILLIPIN, 2010).

No presente estudo, num primeiro momento, procurou-se verificar o efeito do

ERF sobre a memória de animais normais na tarefa da esquiva inibitória, avaliando

os efeitos do tratamento sobre as diversas etapas da memória (aquisição,

consolidação e evocação). Izquierdo (2002) define como memória, a capacidade de

um indivíduo (animal ou ser humano) armazenar informações, além de conservar e

evocar aprendizados durante sua existência. Sua modulação permite ao indivíduo a

modificação de determinado comportamento, além da aprendizagem e adaptação ao

meio (IZQUIERDO, 2002).

O processo de memória é dividido em três etapas: a aquisição, que é a

apresentação às informações (no caso do humano), e, tarefa ou comportamento

novo (no caso do animal); a consolidação, que caracteriza a filtração e fixação das

informações ou comportamentos adquiridos, e, a evocação, que é o resgate das

informações ou comportamentos consolidados (BOUTON; MOODY, 2004). Essas

etapas podem ser estudadas através de modelos animais como a esquiva inibitória

(IZQUIERDO, 2002; KORNISIUK et al., 2011), o labirinto de 8 braços (radial maze),

como proposto por Olton e Samuelson (1976) (JANITZKY et al., 2011), labirinto

aquático de Morris (water maze) (BANIK; ANAND, 2011), dentre outros. Ratos e

camundongos são os animais preferenciais para estudo com memória, mas, por

questões éticas, modelos de memória estão sendo padronizados com peixes da

espécie Danio rerio, conhecido como Zebrafisher (BROGLIO et al., 2010), répteis,

98

como a tartaruga Pseudemys nelsoni (DAVIS; BURGHARDT, 2007) e até mesmo

insetos, sobretudo moscas da espécie Drosophila melanogaster (MURAKAMI et al.,

2010). Dos modelos de memória, a esquiva inibitória tem se destacado pela

praticidade e facilidade do experimento em si. Trata-se de um modelo no qual o

animal pode aprender a tarefa com um único treino, diferente, por exemplo, de

modelos como o labirinto aquático de Morris, radial maze e a esquiva ativa, os quais

requerem diversas sessões de treino (LOPEZ et al., 2010). A memória da esquiva

inibitória tem sido exaustivamente estudada por pesquisadores renomados como

Kandel (LI et al., 2009), McGaughe e Roozendaal (BARSEGYAN et al, 2010),

Medina (BONINI et al., 2007), Izquierdo (MYSKIW et al., 2010) dentre outros.

Izquierdo e colaboradores (2008), têm estudado a memória da esquiva inibitória

farmacológica e bioquimicamente nas 4 últimas décadas, reunindo evidências entre

a memória da esquiva inibitória e o processo da potencialização de longa duração

(LTP), um processo de neuroplasticidade cerebral descoberto por Blis e Gardner-

Medwuin (1973), descrito como modelo neurofisiológico de memória (SALE et al.,

2011).

Na tarefa da esquiva inibitória, também denominada esquiva passiva, o

animal é colocado sobre uma plataforma, e, ao descer da plataforma, para explorar

o aparato, recebe um choque elétrico de intensidade variável (dependendo do

protocolo adotado) nas patas. Por conseqüência deste choque, o animal “aprende” a

permanecer na plataforma para evitar o choque, ou seja, ele se esquiva de explorar

o ambiente, inibindo um comportamento natural. Neste tipo de teste, o animal é

apresentado a um estímulo aversivo, em associação a um estímulo inicialmente

neutro do ambiente (FOWLER et al., 2011). Em função disso, o aprendizado se dá

rapidamente, uma vez que, instintivamente, os animais procuram evitar essas

situações aversivas. Dessa forma, a resposta da esquiva é, então, simplesmente

uma resposta de fuga com latência reduzida (WANG; CHAI; HOLAHAN, 2010).

Os estudos dos efeitos de compostos puros ou extratos de plantas sobre as

etapas da memória podem ser realizados, dependendo do protocolo utilizado,

independente do modelo animal escolhido. Dessa forma, todas as etapas da

memória têm sido caracterizadas farmacologicamente e bioquimicamente (OJHA et

al., 2010).

No presente estudo, o tratamento de animais normais com ERF produziu

efeito sobre a memória de ratos, avaliados no modelo da esquiva inibitória,

99

facilitando a memória dos mesmos, independentemente da etapa da memória

avaliada. Em relação aos efeitos observados com o extrato da R. ferruginea, esta

espécie apresenta diversos ácidos benzóicos prenilados como componentes

majoritários (HIROTA et al., 2002; GAZONI, 2009). Os ácidos benzóicos prenilados

(como o AMA) encontrados na espécie estudada possuem característica apolar

podendo facilmente atravessar a barreira hematoencefalica dos animais e atingir

regiões cerebrais importantes no processo de memória. Os efeitos desses

compostos sobre o SNC são pouco explorados farmacologicamente, entretanto, já

foram descritos na literatura efeito antioxidante (YAMAGUCHI et al., 2006) , podendo

tal efeito ser relacionado com os resultados facilitatórios do ERF observados no

presente estudo

A facilitação das etapas da memória (aquisição, consolidação e evocação),

verificadas nos testes da esquiva inibitória realizados, pode também estar

relacionada com a alta concentração destes ácidos benzóicos no extrato utilizado,

uma vez que os mesmos têm apresentado atividade anticolinesterásica em diversos

estudos realizados em nossos laboratórios (GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010).

A inibição das enzimas acetilcolinesterases é atualmente o mecanismo de

ação dos principais medicamentos aprovados para o tratamento da DA (EPIS et al.,

2010). Através da inibição da hidrólise enzimática da ACh pela AChE, este

neurotransmissor tem a possibilidade de estimular os neurônios colinérgicos

remanescentes do hipocampo e córtex cerebral, os quais estão sendo degradados

pela patologia. Este mecanismo possibilita uma transmissão colinérgica mais eficaz

e melhora significativamente os processos de memórias (declarativas e não

declarativas) dos portadores da DA (MENICHINI et al., 2009).

A relação entre a ACh, memória e DA tem sido extensivamente estudada

nos últimos anos (TAYEBATI; AMENTA, 2008). A participação da neurotransmissão

colinérgica no processo de memória, sobretudo na etapa da consolidação já foi

ricamente evidenciada em diversos modelos animais (POWER; VAZDARJANOVA;

MCGAUGH, 2003; PEPEU; GIOVANNINI, 2010) como também em seres humanos

(LANE; POTKIN; ENZ, 2006). A indução de amnésia temporária por escopolamina

(um antagonista dos receptores mucarinicos) em modelos animais, têm sido

bastante utilizada por pesquisadores no screening de substâncias com possíveis

efeitos sobre a DA (KLINKENBERG; BLOKLAND, 2010). Além disso, a

escopolamina também foi usada clinicamente (embora menos freqüentemente do

100

que em anos passados) como um adjuvante aos procedimentos cirúrgicos ou de

obstetrícia para induzir sedação e amnésia pós-procedimento (BUCAFUSCO, 2009).

Os extratos brutos das plantas contêm milhares de substâncias, o que torna

difícil a caracterização do mecanismo de ação exato, pois os compostos podem

estar interagindo entre si e atuando em sinergismo. Porém, os estudos realizados

por Gazoni (2009) e Fillipin (2010), reforçam a ação característica do ERF e do AMA

na inibição das colinesterases em ensaios preliminares.

Assim sendo, é possível conjecturar que a ação verificada nos modelos de

memória para o extrato dos frutos da Rapanea ferruginea em animais normais pode

estar relacionada com esta inibição enzimática. Os resultados apresentados

demonstraram que o ERF facilitou o desenvolvimento da atividade na esquiva

inibitória através, do aumento da cognição dos ratos em todas as doses utilizadas.

Analisando os dados obtidos, é possível verificar que a dose de 150 mg/kg foi capaz

de proporcionar uma inibição da descida da plataforma muito semelhante à dose de

300 mg/kg, onde todos os animais não desceram da plataforma no teste. Dessa

forma, as doses de 150 e 300 mg/kg proporcionaram a manutenção da memória dos

animais de maneira eficiente e significativa. Verificou-se ainda, uma grande

discrepância nas latências de descida entre os animais que receberam o ERF em

relação aos animais normais, que receberam apenas o veículo (solução salina),

demonstrando que os animais agiram de maneira significativamente diferente após o

aprendizado da tarefa. Este fato impulsionou-nos a realizar a avaliação do potencial

do ERF sobre a memória de animais com DA induzido.

Como relatado anteriormente, a DA é atualmente a desordem

neurodegenerativa com maior numero de casos diagnosticados no mundo. A DA é

caracterizada por um progressivo déficit cognitivo, bem como diminuição da memória

(RAFII; AUSEN, 2009). Além disso, a DA é uma patologia que apresenta

anormalidades no metabolismo da glicose, onde ocorre uma redução de sua

utilização, bem como alterações na metabolização do fosfato energético adenosina

trifosfato (ATP). Os distúrbios no metabolismo energético estão intrinsecamente

associados a um aumento de estresse oxidativo, o qual pode ser resultado de

oxidação de biomoléculas, e início de excitotoxicitade neuronal (TOTA et al., 2010).

Considerando que a DA apresenta disfunções oxidativas importantes já

relatadas na literatura (AGOSTINHO; CUNHA; OLIVEIRA, 2010), foi escolhido o

101

modelo da STZ, o qual possibilita a indução de dano oxidativo nos animais, para a

avaliação da atividade do ERF e dos compostos isolados, AMA e TGL.

O modelo farmacológico, utilizado para indução de déficit de memória nos

animais, foi a administração de doses subdiabetogênicas de STZ, através de

administrações ICV em roedores. Esse modelo tem sido bem aceito pela

comunidade científica devido à mimetização de vários aspectos patológicos da DA,

como, progressiva deterioração da memória, redução do metabolismo da glicose e

energia cerebral, indução de estresse oxidativo e promoção de disfunção colinérgica

(AWASTHI, 2010; PINTON et al., 2010). A diminuição da utilização cerebral da

glicose, e, os déficits no metabolismo energético representam anormalidades

encontradas em estágios iniciais de deficiência cognitiva, como é apontado em

diversos casos de DA (JEE et al., 2008).

A administração da STZ possibilita uma dessensibilização dos receptores

neuronais da insulina e redução da atividade das enzimas glicolíticas, causando

redução da energia cerebral, e, levando a uma disfunção cognitiva pela inibição da

síntese de ATP. Além disso, a redução da glicose cerebral a níveis críticos afeta o

sistema colinérgico, pois ocorre um decréscimo na síntese de acetilcolina, devido à

diminuição da concentração de acetil-CoA, que é um derivado de glicose (SHOHAM

et al., 2007; SHARMA; SINGH; SINGH, 2008).

Além disso, a glicose é metabolizada em produtos energéticos, e, é

transformada em fonte de energia para o cérebro. Por este motivo, interrupções no

metabolismo energético afetam criticamente as funções cerebrais, além de síntese

protéica e processos celulares e moleculares básicos (SPITALER et al., 2002).

Ishrat e colaboradores (2006) demonstraram ainda que a administração ICV

de STZ reduz a atividade da acetiltransferase (ChAT) no hipocampo, fator que

acarreta em uma deficiência de transmissão colinérgica, a qual é determinante na

redução da memória dos animais.

No presente estudo, o modelo da STZ foi utilizado conforme descrito por

Pinton e colaboradores (2010). Durante o procedimentos, duas infusões de STZ (2,5

mg/mL – 2 µL) foram administradas, em um intervalo de 48 horas entre cada dose,

para a indução de DA, causando nos animais em estudo uma significante redução

nas latências de descida como verificado nos animais tratados com veículo (NaCl

0,9%), e, testados na esquiva inibitória.

102

O déficit de memória causado pela STZ foi revertido pela administração do

ERF, sendo a ação da dose máxima utilizada, superior ao fármaco de referência

Galantamina. Na literatura, já foram evidenciados efeitos de extratos de plantas

(VEERENDRA; GUPTA, 2003), fitoconstituintes como flavonóides (AWASTHI et al.,

2010), e carotenóides (KHALILI; HAMZEH, 2010), revertendo e/ou prevenindo os

efeitos deletérios da STZ sobre a memoria de animais, da mesma maneira como

observado no estudo em questão.

Neste estudo, a administração de apenas uma dose do ERF foi capaz de

reverter os prejuízos gerados pelos danos energéticos e estresse oxidativo induzidos

pela STZ. Entretanto, Deshmukh e colaboradores (2009), e, Bhutada e

colaboradores (2010), realizando experimentos com a mesma metodologia,

necessitaram de administração prolongada dos compostos vimpocetina e quercetina

para melhora do processo cognitivo dos animais.

A STZ, administrada ICV, no ventrículo cerebral dos animais avaliados, tem

a capacidade de alterar a bioquímica local, destruindo diversos neurônios e

danificando a transmissão colinérgica destes animais (PIAZZA et al., 2011). Este

fato é facilmente verificado quando se analisam os resultados dos animais pré-

tratados com o veículo, os quais não tiveram habilidade cognitiva para realizar a

tarefa aprendida.

Os resultados obtidos nesta avaliação monstraram que a administração do

ERF tem a capacidade de facilitar o aprendizado dos animais com o déficit cognitivo

causado pela indução da DA, caracterizando uma ação farmacológica bastante

significativa. Além disso, como observado nos resultados, a Galantamina, utilizada

como controle positivo, apresentou a atividade esperada, melhorando a memória

dos animais de maneira significativa em relação ao controle negativo. Entretanto, a

ação do ERF equivale-se a ação do fármaco de referência, uma que vez não se

encontrou diferenças estatísticas significativas entre os grupos.

Um dos compostos isolados do ERF avaliados no presente estudo foi o TGL.

A determinação dos efeitos do TGL sobre os déficits de induzida por STZ foi

realizada utilizando-se o modelo da esquiva inibitória. Os resultados encontrados

demonstraram que o TGL foi capaz de facilitar a memória dos animais, e, que o

grupo que recebeu tratamento apenas com o veículo foi incapaz de “recordar” a

tarefa aprendida. Este fato foi verificado através do aumento da latência de descida

dos animais na sessão teste. Entretanto, verificou-se que o desempenho dos

103

animais que receberam a menor dose do TGL (5 mg/kg) foi superior as outras doses

utilizadas (15 e 30 mg/kg).

A busca de agentes capazes de proteger o organismo contra a

amiloidogênese e danos oxidativos é o objetivo das futuras terapias contra a DA. Um

tratamento interessante seria conseguir intervenções relacionadas à dietética.

Corroborando com esta situação, verifica-se a existência de muitos estudos

relacionados com o consumo de ácidos graxos poliinsaturados e DA (HASHIMOTO

et al, 2005; SUMIYOSHI et al., 2008).

Recentemente um estudo farmacológico pré-clínico revelou que uma dieta

rica em gorduras poliinsaturadas e polifenóis, influenciam o processo de

neurogênese. Camundongos tratados com uma dieta rica em ácidos graxos

poliinsaturados e polifenóis apresentaram uma maior proliferação de neurônios no

bulbo olfatório e no hipocampo, regiões cerebrais comumente comprometidas em

doentes que sofrem de DA (VALENTE et al., 2009).

Ao contrário do que se pensava anteriormente, sabe-se que os neurônios

continuam a surgir durante a fase adulta do indivíduo, porém a capacidade de

neurogênese do cérebro é limitada a duas áreas: o bulbo olfatório e o hipocampo

(VALENTE et al., 2009). Segundo Valente e colaboradores (2009), uma dieta rica

em polifenóis e ácidos graxos poliinsaturados, influencia significativamente na

prevenção da DA, e eventualmente contribui com a boa manutenção das funções

cerebrais.

Após metabolização enzimática pelas lipases digestivas, o TGL pode ter

disponibilizado para o organismo dos animais uma determinada concentração de

ácidos graxos poliinsaturados, os quais podem ter influenciado na manutenção da

capacidade cognitiva dos mesmos, facilitando o desenvolvimento da memória

durante os testes.

Nossos resultados corroboram com as hipóteses de Valente e colaboradores

(2009), e Sumiyoshi e colaboradores (2008), demonstrando que uma dieta contendo

ácidos graxos poliinsaturados pode caracterizar um tratamento preventivo contra a

DA. Todavia, os resultados obtidos neste estudo foram adquiridos realizando uma

administração aguda do TGL. Sendo assim, tais resultados, subsidiam novos

experimentos utilizando tratamento crônico sob animais com DA induzida, visando

obter um perfil da administração prologada deste composto sobre a memória dos

mesmos.

104

A formação de EROs tem sido proposta como um distúrbio importante na

morte neuronal em uma variedade de desordens neurodegenerativas, como a DA e

a Doença de Parkinson (SHIBATA; KOBAYASHI, 2008). Sabe-se que os neurônios

são particularmente suscetíveis a danos oxidativos resultantes de EROs nestas

células. Radicais livres oxidam diversas macromoléculas biológicas, causando

distúrbios homeostásicos neuronais e resultando em morte celular (DE IULIIS et al.,

2005).

As células cerebrais são bastante vulneráveis ao estresse oxidativo, devido

a sua alta utilização de oxigênio e a seu conteúdo substancial de ácidos graxos.

Danos oxidativos aos lipídios e proteínas podem promover disfunções funcionais e

estruturais nas membranas celulares, inativando enzimas e levando a morte celular

(RESENDE et al., 2008).

A concentração de EROs é determinada através do balanço entre a taxa de

produção destes elementos, e, a taxa de remoção dos mesmos pelos vários

componentes e enzimas antioxidantes. A quantificação da atividade destes sistemas

enzimáticos pode fornecer uma imagem clara do dano oxidativo (PAL et al., 2011).

A melhora no desempenho dos animais nos testes de memória pode ter

relação com um aumento nas defesas antioxidantes do organismo dos animais

submetidos ao tratamento com o TGL. Para verificação dessa hipótese, realizou-se

a medição da atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD),

catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) no tecido

cerebral destes animais. Além disso, o nível de peroxidação lipídica foi realizado o

teste do malondialdeído (MDA).

A SOD é uma enzima que catalisa a dismutação do superóxido em oxigênio

e peróxido de hidrogênio. Assim sendo, constitui uma importante defesa antioxidante

em quase todas as células do organismo expostas ao oxigênio. A função da SOD é

impedir reações prejudiciais do superóxido aos tecidos do organismo. O superóxido,

formado quando o oxigênio, é reduzido por um elétron e é uma das principais

espécies reativas de oxigênio, pois tem a capacidade de reagir com alvos celulares

sensíveis e críticos (TORSDOTTIR et al., 2010). Além disso, o peróxido de

hidrogênio formado pela ação da SOD é uma espécie oxidativa altamente nociva

para o organismo.

Outra enzima deste sistema, a CAT, é responsável pela conversão do

peróxido de hidrogênio em produtos menos reativos para o organismo. A CAT

105

rapidamente catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio

(VLASITS et al., 2010).

Entretanto, a ineficiência na degradação deste composto, provoca a criação

de outros radicais livres. O peróxido de hidrogênio tem a capacidade de produzir um

radical livre extremamente poderoso e tóxico através da reação de Fenton. Ao

reagir-se peróxido de hidrogênio com o íon Ferro (Fe2+) ocorre a produção do radical

livre hidroxila (OH•), que tem uma alta capacidade oxidativa e não possui sistema

enzimático para sua eliminação (MORIWAKI; OSBORNE; PHILLIP, 2008).

Sendo assim, a eliminação de todo o peróxido de hidrogênio formado é

extremamente importante. Para isso, existe outro sistema enzimático que constitui

defesa antioxidante em nosso organismo. Este sistema é constituído pelas enzimas

GPx e GR. A GPx utiliza a glutationa reduzida, que deve ser oxidada para o reduzir

o peróxido de hidrogênio. A GR tem por objetivo final a restauração da glutationa

reduzida com auxílio do NADPH, fornecendo este produto para o funcionamento da

GPx (DRINGEN, 2000; SHANMUGAM et al., 2011).

Outro fator mensurável relacionado a danos oxidativos pode ser investigado

analisando-se o grau de oxidação de lipídios. Este processo, denominado

peroxidação lipídica, ocorre quando radicais livres retiram elétrons dos lipídios das

membranas celulares, desestabilizando-as. A avaliação deste processo pode ser

realizada através da quantificação do produto final desta peroxidação, o MDA. Esta

determinação ocorre através da quantificação de MDA que reage com o ácido

tiobarbitúrico (TBARS). Quanto maior a concentração de TBARS, maior o grau de

destruição de membranas (CATALÁ, 2006).

A administração da STZ nos animais causou alterações na capacidade

cognitiva e antioxidante como avaliado nos resultados. Os danos oxidativos

neuronais, em animais com DA induzida por STZ, são consistentes com trabalhos

anteriores que utilizaram a mesma metodologia (ISHRAT et al., 2006; TAHIROVIC et

al., 2007; ISHRAT et al., 2009a; ISHRAT et al., 2009b)

Ishrat e colaboradores (2009a) realizaram tratamento com Selênio, em

animais que apresentavam DA induzida por STZ, e, verificaram uma melhora na

memória dos mesmos, além de um aumento na atividade antioxidante. Ishrat e

colaboradores (2009 b), também investigaram a ação da Curcumina sobre os déficits

de memoria induzidas pela DA, e, resaltaram que o mecanismo de ação deste

composto estaria relacionado com sua capacidade de inibir o estresse oxidativo.

106

Outro estudo, avaliou ainda, a atividade da vitamina E em animais com DA

induzida por STZ, demonstrando que o tocoferol promove um aumento na atividade

das enzimas antioxidantes SOD e GPx nesses animais (HONG et al., 2004).

Em nossos experimentos, o tratamento dos animais com o TGL promoveu

uma melhora na capacidade antioxidante, como demonstrada no aumento da

atividade das enzimas SOD, CAT, GPx e GR ao nível dos animais Naive, que não

sofreram qualquer alteração oxidativa, uma vez que não foram submetidos aos

efeitos da STZ.

Conforme observado através dos resultados apresentados, a menor dose do

TGL foi a responsável pelo melhor efeito nas avaliações farmacológicas, ação que

manteve a mesma característica nos testes bioquímicos. Dessa maneira, é possível

conjecturar que o TGL exerce um efeito protetor sobre o SNC, facilitando memória

dos animais, através da elevação da eficiência do complexo enzimático antioxidante.

Os resultados indicam ainda, que o efeito neuroprotetor do TGL também pode estar

associado com a redução da peroxidação lipídica, como demonstrado na

quantificação de TBARS no teste do MDA. Uma vez que o TGL protege as células

da peroxidação lipídica, sugere-se então, que este composto apresenta a

capacidade de proteger o tecido cerebral, e, dessa forma impedir a degradação

neuronal, como ocorre na DA (NARCISO-GAYTÁN et al., 2011).

Os resultados deste estudo condizem com o exposto por Awasthi e

colaboradores (2010), que investigaram a ação da curcumina; além de Tota e

colaboradores (2010), em sua avaliação da atividade da quercetina, ambos no

mesmo modelo de indução de DA. Nestes estudos, animais tratados com tais

compostos, tiveram uma redução no nível de TBARS da mesma forma que os

animais tratados com o TGL, demonstrando a proteção que estes compostos

realizam sobre o SNC.

Corroborando para a atuação dos ácidos graxos poliinsaturados nos estudos

de agentes anti-DA, Arnal e colaboradores (2010), avaliaram o potencial terapêutico

do DHA e da luteolina. Os autores verificaram que o tratamento dos animais com

estes compostos resultou em uma redução da peroxidação lipídica, além de em um

aumento da atividade da GPx e GR.

Como demonstrado neste estudo, o TGL em sua menor dose foi capaz de

igualar o nível de peroxidação lipídica dos animais com DA induzida, aos animais

Naive, demonstrando que este composto protegeu o cérebro dos animais.

107

Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia muito longa desempenham

importantes funções no desenvolvimento e funcionamento do cérebro. Alguns destes

ácidos podem ser sintetizados pelo organismo a partir dos ácidos linoléico e α-

linoléico, e, estão por muitas vezes presentes em diversos alimentos consumidos em

nossa dieta (MARTIN et al., 2006).

Os esfingolipídeos são ácidos graxos poliinsaturados e são componentes

majoritários da bainha de mielina. Entre eles encontra-se o ácido tetracosanóico,

também conhecido como ácido nervônico, cuja concentração é a mais elevada entre

estes componentes neuronais. Pacientes afetados pela adrenoleucodistrofia

apresentam uma desmielinização do córtex cerebral, associada a uma acumulação

do ácido tetracosanóico em diferentes fluidos orgânicos (SARGENT; COUPLAND;

WILSON, 1994; DEON et al., 2007). Como conseqüência desta desmielinização, os

pacientes com adrenoleucodistrofia apresentam hiperatividade, diminuição do

desempenho escolar, diminuição da compreensão da comunicação verbal (afasia),

dificuldade na deglutição e alterações no tônus muscular. A deterioração progressiva

do sistema nervoso resulta ainda em paralisia, perda da audição, deficiência visual

ou cegueira, deterioração da escrita e do controle motor fino, resultando ao final em

um estado vegetativo para o paciente (JARDIM et al. 2010).

Tem sido reportado que a perda desses ácidos graxos está associada a uma

destruição neuronal, e, à insuficiência do organismo de repor estes componentes

essenciais, resultando em apoptose das células do tecido cerebral. Assim, a

manutenção das concentrações destes ácidos graxos essenciais acarreta em uma

proteção para o organismo (VARGAS et al., 2004).

Neste contexto, no presente estudo, o tratamento com o TGL realizado com

os animais com DA induzida pode ter restaurado em parte, a comunicação entre

alguns neurônios danificados pelo estresse oxidativo, o que resultou numa melhora

da memória por parte dos animais.

As regiões cerebrais associadas às funções mentais superiores,

particularmente o córtex frontal e o hipocampo, são principalmente comandadas pelo

sistema colinérgico. Estes locais são os mais comprometidos pelas alterações

bioquímicas decorrentes da DA (VIEGAS JUNIOR et al., 2004).

O hipocampo é uma estrutura cerebral relativamente simples, e, é o local de

maior importância nos processos relacionados à memória (IZQUIERDO et al., 2008).

Uma vez que é principalmente no hipocampo que ocorrem os processos

108

neurodegenerativos iniciais, os distúrbios relacionados à falta de memória são os

primeiros sintomas da DA. Desta maneira, compostos que apresentem boa inibição

das colinesterases nas regiões cerebrais envolvidas com a memória, têm grandes

chances de serem candidatos a estudos relacionados à DA (ELDER; GASPERI;

SOSA, 2006).

O AMA vem sendo estudado a algum tempo pelos pesquisadores da

UNIVALI e já apresentava-se como um forte candidato a estudos “in vivo” sobre os

processos de memória, uma vez que avaliações “in vitro” demonstram que este

ácido benzóico é capaz de inibir as colinesterases em diversas estruturas cerebrais;

em especial o hipocampo (GAZONI, 2009; FILIPPIN, 2010).

Filippin (2010) demonstrou que o AMA induz uma inibição significativa da

AChE em cérebro total de 67,8% e no hipocampo de 76,7% (concentração de 44,0

µM). O mesmo estudo evidenciou a concentração inibitória da enzima (IC50, de 36,2

µM para o hipocampo e caracterizou a cinética enzimática do composto como um

mecanismo misto envolvendo a formação de um complexo catalítico enzima-inibidor-

substrato.

Os resultados farmacológicos obtidos no presente estudo demonstraram que

a indução da DA por STZ resultou numa diminuição da cognição dos animais, pois o

grupo controle não conseguiu recordar a tarefa aprendida na esquiva inibitória. O

tratamento com o AMA produziu uma ação farmacológica semelhante ao fármaco

referência utilizado como comparativo, a Galantamina, melhorando a memória dos

animais.

Todavia, as análises bioquímicas realizadas com o tecido cerebral dos

animais após tratamento com o AMA, não revelaram qualquer interação significativa

entre este composto e as enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR. Também

não encontrou-se relação entre o tratamento com o AMA, e proteção do tecido

cerebral contra peroxidação lipídica, visto que não verificou-se redução dos níveis de

TBARS no ensaio do MDA.

Como já descrito anteriormente, uma parte substancial da redução da

memória na DA tem sido atribuída a alterações em vários sistemas de

neurotransmissores, destacando-se o sistema colinérgico. A hipótese colinérgica

para a DA sugere uma redução dos marcadores colinérgicos como a ACh e a ChAT,

e um aumento na atividade da enzima AChE (TERRY JUNIOR; BUCCAFUSCO,

2003).

109

Dessa forma, verifica-se que a AChE é um importante alvo para ação

terapêutica de compostos na DA. Inibidores reversíveis desta enzima têm sido

utilizados como facilitadores cognitivos no tratamento da patologia (LANE et al.,

2006).

Pesquisadores em todo o mundo, buscam novos compostos de origem

natural ou sintética, que produzam uma atividade inibitória sobre a AChE.

Entretanto, tais agentes teriam que possuir efeitos adversos menos significativos do

que os atuais tratamentos disponíveis, que compartilham com esse mesmo

mecanismo de ação (ANEKONDA; REDDY, 2005). Sendo assim, os compostos com

atividade anticolinesterásicas, mas também antioxidantes, podem ser uma

alternativa viável na terapêutica da DA (GOMES et al., 2009).

As características farmacológicas fundamentais para qualquer nova planta

medicinal, a qual os almeja-se tranformar em fitoterápico, com a finalidade de tratar

a DA, é sem dúvida a capacidade de estimulação do complexo enzimático

antioxidante endógeno, além da propriedade de inibir as colinesterases cerebrais.

(GOMES et al., 2009).

Na literatura, ainda encontra-se em maior numero os estudos farmacológicos

com fitoconstituientes e/ou extratos de plantas avaliando principalmente os efeitos

anticolinesterásicos. Papandreou e colaboradores (2010) evidenciaram em estudos

farmacológicos e bioquímicos a ação de um extrato açafrão (Crocus sativus L.),

sobre a memória de ratos idosos. Os resultados deste estudo demonstraram que o

açafrão aumenta a latência na esquiva inibitória, facilitando o aprendizado dos

animais senescentes, e, este comportamento está relacionado à capacidade de

inibição da AChE.

O alcalóide huperizina A é outro exemplo de um composto de origem natural

que possui propriedades anti-DA, devido a inibição da AChE. Estudos de síntese

demonstraram ainda que, modificações estruturais nas quais acrescentavam-se

anéis aromáticos neste alcalóide potencializam a ação do mesmo frente às

colinesterases (YAN et al., 2009).

Vinutha e colaboradores (2007) realizaram um rastreamento em 38 plantas

utilizadas na medicina indiana em busca de extratos capazes de inibir a AChE de

maneira eficiente, em estudo “in vitro”, utilizando a metodologia de Ellmann (1961), e

técnica bioautográfica em CCD. Este estudo evidenciou 6 extratos de plantas com

características que subsidiam novos estudos.

110

Diversas outras espécies vegetais, muitas delas freqüentes em nossa dieta,

estão sendo avaliadas como anti-DA. A Beta vulgaris, popularmente conhecida

como beterraba, utilizada como salada em diversos países no mundo, foi estudada

frente a sua atividade anticolinesterásica. Sacan e Yanardag (2010) demonstraram

que um extrato aquoso da beterraba apresenta ação sobre a AChE e pode ser fonte

de recursos para o tratamento da DA.

Com relação aos nossos estudos, pode-se conjecturar que a facilitação da

memória verificada no teste de memória, realizado na esquiva inibitória em animais

com DA induzida, e, tratados com o AMA, pode estar relacionada principalmente

com a ação anticolinesterásica que este composto apresenta.

Muitos compostos derivados de plantas são alcalóides (como a Galantamina

e a Rivastigmina), os quais são conhecidos por suas características

anticolinesterásicas. Recentemente outras classes de compostos naturais como

terpenóides, sesquiterpenos glicosilados e cumarinas têm sido estudados como

novos agentes inibidores da AChE. Estes novos compostos apresentam menor

toxicidade quando comparados aos alcolóides, e, por isso, representam um avanço

na terapia anti-Alzheimer (DALLÁCQUA et al., 2010).

Outra estratégia encontrada pelos pesquisadores na busca de compostos

anti-DA é o design e a síntese de novas moléculas tomando como base compostos

derivados de produtos naturais. Uma série de compostos flavonolídicos

desenvolvida por Sheng e colaboradores (2010) demonstratam inibição da AChE e

da BChE, sendo alguns compostos mais potentes que a rivastigmina e com maior

inibição enzimática que o donepezil.

Vários estudos, que visam o desenvolvimento de extratos e compostos para

o tratamento da DA, têm sido realizados com plantas que possuem ação

reconhecida sobre o SNC em outras atividades. As espécies Hypericum perforatum,

Hypericum androsaemum e Hypericum undulatum, reconhecidas por suas

propriedades antidepressivas foram avaliadas quanto a ação anticolinesterásica.

Hernandez e colaboradores (2010) demonstram que extratos aquosos das três

espécies apresentaram atividade sobre as colinesterases e ação antioxidante, as

quais foram relacionadas à alta concentração dos compostos como o ácido

clorogênico, hiperosídeo, isoquercetina, quercetina e rutina, presente nas espécies.

Outros estudos “in vitro”, realizados com um extrato metanólico da

Tabernaemontana divaricata, demonstraram que esta espécie, rica em alcalóides,

111

tem uma capacidade de inibir as colinesterases em mais de 90% (INGKANINAN et

al., 2003), sendo usada na medicina popular no tratamento da miastenia gravis

(PRATCHAYASAKUl, et al., 2008). Chattipakorn e colaboradores (2007)

investigaram a ação de um extrato da Tabernaemontana divaricata “in vivo” frente à

inibição da AChE em ratos, e, verificaram que a espécie apresenta uma capacidade

de inibir a enzima de maneira reversível, aumentando a memória do roedores. Além

disso, a planta demonstrou exercer efeito revertendo o déficit cognitivo induzido pelo

peptídeo amilóide (NAKDOOk et al 2010). Além disso, exibe propriedade

antioxidante (JAIN et al, 2010), o que subsidia estudos posteriores para uma melhor

avaliação do extrato e compostos isolados frente a DA.

O fármaco de referência utilizado nos nosssos ensaios, como controle

positivo, foi a galantamina. Este medicamento é comercializado sob nome comercial

de Reminyl®, apresentado em concentrações que variam de 4, 8 e 12 mg, além de

formulações com liberação prolongada. A vantagem da utilização deste

medicamento sobre outros anticolinesterásicos é que, a galantamina é um inibor

reversível e de longa duração da AChE, enquanto, a rivastigmina inibe

irreversivelente a enzima, fator determinante para a potencialização dos efeitos

colaterais indesejáveis (SONKUASARE; KAUL; RAMARAO, 2005).

A avaliação da capacidade exploratória é amplamente utilizada em

pesquisas relacionadas ao comportamento animal, e, num sentido geral, refere-se a

todas as atividades relacionadas à obtenção de informações do ambiente. Os

parâmetros comportamentais avaliados nestes estudos farmacológicos incluem:

avaliação de risco (streach atempt), correr em círculos, cheirar o ambiente (sniffing),

levantar-se nas patas traseiras (rearings), locomover-se, movimentar as vibrissas,

escolher entre ambientes abertos ou fechados, direcionar-se ou esquivar-se de um

estímulo em particular, urinar e defecar no ambiente, dentre outros (SCHIMITT;

HIEMKE, 1998; MONTIGLIO et al., 2010).

Estudos psicológicos de atividade exploratória em animais têm se baseado

na exposição do animal a uma alteração ambiental discreta e localizada, nunca

experimentada antes. É o caso do LCE e do OF, onde o animal reage ao ambiente

de acordo com seus instintos e/ou motivado pela ação de substâncias (CAROLA et

al., 2002; LALONDE; STRAZIELLE, 2008).

No OF, o pressuposto básico envolvido é que, para explorar o ambiente, o

animal precisa locomover-se nele. Dessa forma, a quantidade de movimentos

112

executados passa a ser um indicador de atividade exploratória, a qual é mensurada

através da contagem do número de cruzamentos entre as seções que compõe o

aparato (geralmente com o assoalho dividido em quadrantes), e, o número de

rearings. A redução do número de cruzamentos também pode ser interpretada por

um suposto efeito sobre o sistema motor dos animais, o qual pode ser avaliado

posteriormente, pelo teste do rota-rod (HOLLAND; WELDON, 1986; FUKUSHIRO et

al., 2010).

Etiologicamente o LCE baseia-se na aversão apresentada pelos roedores a

locais abertos ou elevados, apresentando sinais de medo e esquiva quando neles

confinados. O aparato consiste de dois braços abertos e dois fechados, dispostos

em forma de cruz e elevado do chão. Durante o período de exploração no aparato,

os animais percorrem ambos os braços, porém, normalmente os roedores

apresentarão maior freqüência e tempo de permanência nos braços fechados.

Dessa forma, a mensuração de ansiedade é dada preferência e tempo de

exploração dos mesmos nos braços do labirinto (PELLOW et al., 1985; TRENT;

MENARD, 2010).

Uma preocupação importante em tarefas motivadas pelo choque,

particularmente naquelas em que se investiga o efeito de substâncias sobre a

memória, como no caso da esquiva inibitória e ativa, é se o tratamento

farmacológico afeta aspectos motivacionais do aprendizado, como atividade

locomotora, exploratória e aspectos da ansiedade dos animais (ALVARES et al.,

2005). Sendo assim, é comum nesses estudos, o acompanhamento de modelos de

ansiedade e deambulação, como o LCE e OF.

Neste estudo, foram avaliados o comportamento locomotor, exploratório e

sobre a ansiedade dos animais, após a sessão de testes na esquiva inibitória, para

identificar qualquer inaptidão que pudesse influenciar o desempeno dos animais no

teste de memória.

Os resultados da determinação da capacidade exploratória e a aferição do

grau de ansiedade dos animais normais, tratados com o ERF, demonstraram que o

tratamento com o extrato não pareceu afetar o comportamento dos animais. Estes

dados sugerem, portanto, que a capacidade motivacional e locomotora dos animais

não foi alterada, e, o desempenho dos mesmos nos testes de memória não sofreu

interferências. Adicionalmente, a avaliação da capacidade locomotora dos animais

que sofreram a indução de DA por STZ também não apresentou diferenças

113

significativas em relação aos tratamentos realizados com os compostos em estudo.

Os resultados obtidos, demonstram que o efeito da STZ sobre o SNC dos animais

não afeta regiões relacionadas com o controle do sistema motor, tão pouco o

tratamento agudo com o ERF afeta os parâmetros observados.

A determinação da locomoção e ansiedade dos animais que receberam o

AMA indicou que este composto não apresentou qualquer alteração nos resultados.

Isto indica que, os resultados obtidos na esquiva inibitória não apresentam desvios

relacionados a estes fatores.

O comportamento, verificado após o tratamento do TGL, na esquiva

inibitória, não exclusivamente pode ser um reflexo de ansiedade dos animais, no

momento do experimento. A avaliação dos parâmetros comportamentais dos

animais com DA e tratados com o TGL no OF demonstrou que, a dose de 30 mg/kg

pareceu interferir significativamente na ansiedade dos mesmos, diminuindo-a de

forma a aumentar a quantidade de rearings realizada pelo animal em relação ao

controle, (um parâmetro de avaliação da ansiedade). Contraditoriamente,

observando os resultados do LCE, pode-se verificar que o TGL nessa mesma dose

elevou o grau de ansiedade nos animais, pois se constatou uma diminuição na

freqüência de visitas ao braço aberto e um aumento de permanência no braço

fechado. Desta forma, testes mais específicos para verificação dos efeitos do TGL

sobre a ansiedade são necessários para se verificar a hipótese de que efeitos

sedativos e não ansiogênicos possam estar interferindo nos resultados de memória

obtidos com o composto em doses maiores.

Modelos farmacológicos como o OF e o LCE possuem grande importância

na avaliação da ação de compostos sobre a memória, uma vez que através deles é

possível verificar possíveis efeitos adversos dos compostos, como uma atividade

que venha a causar ansiedade, ou, efeitos inespecíficos no SNC, que possam

alterar a capacidade locomotora dos animais (SCHIMITT; HIEMKE, 1998;

MONTIGLIO et al., 2010).

114

7. CONCLUSÕES

A purificação cromatográfica da Rapaenea ferruginea resultou na obtenção

dos compostos isolados AMA e TGL. Análises espectroscópicas demonstraram que

o TGL encontra-se em maior proporção que o AMA, no ERF.

A avaliação farmacológica do ERF demonstrou que este extrato apresenta

atividade sobre a memória de animais normais nas três etapas: aquisição,

consolidação e evocação. Os animais com DA induzida, tratados com ERF, AMA e

TGL, apresentaram aumento na atividade de consolidação da memória.

O ERF facilitou a consolidação da memória dos animais com DA induzida

nas doses de 150 e 300 mg/kg. O AMA aumentou a capacidade cognitiva nas doses

de 15 e 30 mg/kg, com resultados semelhantes ao controle positivo, galantamina,

demonstrando que o AMA pode ter um possível efeito anticolinesterásico “in vivo”.

O TGL apresentou melhor atividade sobre a memória dos animais na menor

dose, facilitando a consolidação do aprendizado na esquiva. A menor dose do TGL

também foi responsável pela maior ativação dos sistemas enzimáticos avaliados,

SOD, CAT, GPx e GR, bem como pela redução da peroxidação lipídica avaliada

através da quantificação de TBARS. Os resultados indicam que o tratamento com o

TGL pode ter protegido o SNC dos animais, o que pode ter facilidado a consolidação

da memória e melhorado o desempenho dos mesmos nos testes farmacológicos. O

AMA, por sua vez, não apresentou atividade sobre as enzimas antioxidantes SOD,

CAT, GPx e GR, demonstrando não interagir nesta via bioquímica, e, também não

impediu a peroxidação lipídica, como avaliado no ensaio do MDA.

As avaliações comportamentais demonstraram que o ERF e o AMA não

apresentam atividade sobre a locomoção e a ansiedade dos animais. Entretanto, o

TGL apresentou alterações na ansiedade e a locomoção dos animais nos testes do

OF e do LCE, o que pode ter influenciado o desempenho dos animais no teste da

esquiva inibitória.

De modo geral, pode-se constatar que a melhora da cognição verificada nos

animais tratados com o ERF pode estar relacionada com a atividade farmacológica

que os compostos isolados AMA e TGL apresentaram.

115

REFERÊNCIAS

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ANEXO 1

PARECER CONSUBSTANCIADO PARA USO DE ANIMAIS

COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA DA UNIVALI

Título do Projeto: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DA Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO

MIRSINÓICO A E TRIGLICERÍDEO SOBRE A MEMÓRIA DE ANIMAIS NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Maria de Souza Acadêmico: Philipe Costa Data do Parecer: 31/07/2009 Cadastro: 300/09

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PHILIPE COSTAsiaibib01.univali.br/pdf/Philipe Costa.pdf · Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO ... Color. Cópia de computador (Printout(s))