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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
TIAGO JOSÉ BONOMINI
PADRONIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO DO
FITOCONSTITUINTE MAJORITÁRIO DAS FLORES DE Allamanda
cathartica L. (APOCYNACEAE)
Itajaí – 2013
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
TIAGO JOSÉ BONOMINI
PADRONIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO DO
FITOCONSTITUINTE MAJORITÁRIO DAS FLORES DE Allamanda
cathartica L. (APOCYNACEAE)
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dra. Ângela Malheiros Co-orientadora: Prof. Dra. Ruth M. Lucinda da Silva
Itajaí, Julho
FICHA CATALOGRÁFICA
B644p
Bonomini, Tiago José 1988- Padronização de metodologia para extação do fitoconstituinte majoritário das flores de Allamanda catártica L. (Apocynaceae) [manuscrito] / Tiago José Bonomini. – 2013. 34 f. : 30 cm. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas. Área de Concentração em Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas, 2013. “Orientadora: Profª. Drª. Ãngela Malheiros ”. “Co-Orientadora: Profª, Drª. Ruth Meri Lucinda Silva” Bibliografia: f. 28-34. 1. Plantas medicinais. 2. Apocinaceas. 3.Farmacologia – Plantas medicinais I. Malheiros, Ãngela. II. Silva, Ruth M. Lucinda da. III. Título.
CDU: 615.03
Claudia Bittencourt Berlim – CRB 14/964
PADRONIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO DO FITOCONSTITUINTE MAJORITÁRIO DAS FLORES DE Allamanda
cathartica L. (APOCYNACEAE)
Tiago José Bonomini
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________ Profª. Dra. Angela Malheiros
__________________________________________________________
Profª. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Profª. Dra. Angela Malheiros (UNIVALI) Presidente
______________________________________
Profª. Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva (UNIVALI) Co-orientadora
______________________________________ Profª. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin (UNIVALI)
Membro
______________________________________ Prof. Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI)
Membro
____________________________________ Prof. Dr. Antônio Laverde Junior (UFPR)
Membro
Itajaí (SC), 28, fevereiro, 2013.
AGRADECIMENTOS
À orientadora Prof.ª Dra. Angela Malheiros que prestou todo o suporte
necessário para a realização deste trabalho, além de toda a sua dedicação,
compreensão, amizade e confiança;
À co-orientadora Prof.ª Dra. Ruth M. Lucinda da Silva que teve grande
participação, contribuindo com todo seu conhecimento, apoio, amizade,
dedicação e disposição;
Aos membros da banca examinadora, Prof.ª Dra. Tânia Mari Bellé
Bresolin e Prof. Dr. Rivaldo Niero, pelas suas contribuições e sugestões
construtivas que vieram a somar na qualidade deste trabalho;
Á minha família principalmente pelo incentivo, confiança e por
acreditarem em meu potencial.
PADRONIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO DO
FITOCONSTITUINTE MAJORITÁRIO DAS FLORES DE
Allamanda cathartica L. (APOCYNACEAE)
Tiago José Bonomini
Julho/2013
Orientadora: Profa. Dra. Angela Malheiros Co-orientadora: Profa. Dra. Ruth M. Lucinda-Silva Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de páginas: 34 Espécies pertencentes ao gênero Allamanda possuem metabólitos secundários que apresentam expressiva atividade farmacológica como os iridoides, flavonoides, cumarinas e terpenoides. O composto chamado pelo código AC1 é relatado por apresentar grande potencial anti-inflamatório. As flores da Allamanda cathartica apresentam flavonoides e iridoides como os principais metabólitos secundários, por isto este trabalho teve como objetivo padronizar diferentes metodologias de extração e purificar o AC1 do extrato etanólico obtido por maceração. Os extratos foram obtidos a partir das flores por maceração estática (2, 4 e 7 dias) e por extração assistida por micro-ondas (EAM) (5, 10 e 20 min – 100, 200, e 300 W) com etanol e acetato de etila a 50 ºC e 76 ºC. O AC1 foi isolado por cromatografia em coluna (CC) e purificado por lavagens com acetona e recristalização em metanol. Os extratos foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para quantificação do AC1 utilizou-se o método de padronização externa validada por Wittkowski e Tomczak (2008) e co-validado para o AC1 por Góes (2011). A caracterização do marcador deu-se por CLAE e RMN. O extrato etanólico obtido por EAM a 76 ºC apresentou o maior rendimento em massa de extrato. O maior rendimento do composto AC1 obtida por maceração estática foi utilizando etanol. Na EAM os melhores rendimentos do composto AC1 foram obtidos a 76 ºC. O etanol foi o melhor solvente extrator e ajustando as condições de extração (10 min - 300 W – 76 ºC) obteve-se alta concentração do marcador. Após purificação, o AC1 apresentou um rendimento de 9% em relação ao extrato seco. Pode-se concluir que a EAM apresenta vantagens em relação aos métodos de extração convencionais para extração do AC1. Palavras-chave: EAM. Allamanda cathartica. Apocynaceae.
STANDARDIZATION OF METHODS FOR EXTRACTION OF THE MAJOR PHYTOCONSTITUENT IN FLOWERS OF Allamanda
cathartica L. (APOCYNACEAE) Tiago José Bonomini
July/2013
Supervisor: Prof.. Dr. Angela Malheiros Co-supervisor: Prof.. Dr. Ruth M. Lucinda-Silva Area of concentration: Natural products and synthetic bioactive substances. Number of pages: 34 Species belonging to the genus Allamanda present secondary metabolites with significant pharmacological activity, such as iridoids, flavonoids, coumarins and terpenoids. The compound called by code AC1 has been reported in the literature for its high anti-inflammatory potential. The flowers of Allamanda cathartica present iridoids and flavonoids as major secondary metabolites. This study therefore aimed to standardize different methods of extraction and purification of AC1 from the ethanol extract obtained by maceration. The extracts were obtained from the flowers by static maceration (2, 4 and 7 days) and by microwave-assisted extraction (MAE) (5, 10 and 20 min - 100, 200, and 300 W) with ethanol and ethyl acetate at 50ºC and 76ºC. The AC1 was isolated by column chromatography (CC) and purified by washing with acetone and recrystallization with methanol. The extracts were analyzed by HPLC and for the quantification of AC1, the external standard method validated by Wittkowski and Tomczak (2008) and co-validated to AC1 by Góes (2011) was used. The characterization of the marker was done by HPLC and NMR. The extracts obtained by EAM at 76ºC had the highest yield by weight of extract. The best concentration of AC1 obtained by static maceration was with ethanol. In EAM using 76ºC, better AC1 yields were obtained in the same extraction time. Ethanol was the best solvent extractor for extraction, and it was only by adjusting the extraction conditions (10 min - 300 W - 76 °C) that it was possible to obtain high concentrations of the marker. After purification, the AC1 yield was 9% compared to the dry extract. It can be concluded that the EAM has advantages over conventional extraction methods for extraction AC1.
Keywords: MAE. Allamanda cathartica. Apocynaceae.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 8
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 10
2.1 Plantas Medicinais com Potencial Terapêutico ..................................... 10
2.2 Gênero Allamanda .................................................................................... 13
2.3 Tecnologias de Extração ......................................................................... 16
2.4 Métodos de Separação ............................................................................ 22
2.4.1 Cromatografia preparativa em camada delgada (CPCD) ................... 22
2.4.2 Cromatografia em Coluna Aberta (CC) ................................................ 23
2.4.3 Cromatografia Líquida Sob Pressão.................................................... 24
3 CONCLUSÕES ............................................................................................. 27
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 28
8
1 INTRODUÇÃO
A história relata o uso de plantas medicinais desde a antiguidade, com o
uso da beladona, ópio, ginseng, acônito, quina, alho, sene, cânfora, entre
outras, sendo que as primeiras descrições sobre plantas medicinais feitas pelo
homem remontam às sagradas escrituras (GURIB-FAKIM, 2006).
As plantas superiores são fonte de milhões de estruturas químicas
diferentes. Estas moléculas muitas vezes apresentam atividade biológica e
podem ser úteis para os seres humanos ou servirem de modelos para o
desenvolvimento de novos fármacos. O grande desafio do último século tem
sido desvendar e validar cientificamente espécies vegetais com potencial
clínico (HOSTETTMANN et al., 2008).
O isolamento e a determinação estrutural de substâncias produzidas pelo
metabolismo secundário de organismos vivos assumem importância fundamental
para o desenvolvimento científico da química de produtos naturais e contribui
para avanço de outras atividades científicas e tecnológicas no país (STICHER,
2007).
Levando em consideração os milhares de fitoconstituintes encontrados
em uma planta, o processo de separação e isolamento pode ser longo e
possuir várias etapas. Em geral, esse processo combina diversas técnicas de
separação, que dependem da solubilidade, volatilidade e estabilidade dos
compostos a serem separados. Esse interesse crescente nos produtos naturais
fez expandir e modificar o arsenal de métodos de extração tradicionais. As
recentes técnicas apresentam vantagens em relação aos métodos tradicionais
de extração como diminuição na quantidade de solvente orgânico, maior
eficiência e menor tempo de extração. Incluem-se nestes métodos a extração
com fluído supercrítico (EFS), extração com líquido pressurizado (ELP) e
extração assistida por micro-ondas (EAM) (STICHER, 2007).
Juntamente com os processos extrativos, a instrumentação analítica
surge como uma ferramenta útil para a determinação e a quantificação dos
produtos naturais com destaque para a cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE). Esta é uma das técnicas mais utilizadas para a caracterização,
detecção e separação de compostos devido a sua alta sensibilidade, fácil
adaptação e adequação à separação de compostos não voláteis ou
9
termicamente frágeis, e acima de tudo, sua ampla aplicabilidade a substâncias
de grande interesse para a indústria (SKOOG, 2002).
Entre as plantas que despertam grande interesse, encontram-se o
gênero Allamanda, que pertencem à família Apocynaceae. Neste gênero já
foram relatadas atividades biológicas como, fungicida, bactericida,
leishmanicida e antileucêmica (ANDERSON; CHANG; McLAUGHLIN, 1988;
DIXIT; TRIPATHI; OJAHA, 1982; SCHMIDT et al., 2006; TROST; BALKOWEC;
MAO, 1986). A. cathartica, A. schottii e A. blanchettii são espécies deste
gênero que estão sendo investigadas pelo grupo de Produtos Naturais
Bioativos/CCS/UNIVALI em parceria com outros centros de pesquisa. Diversos
grupos químicos já foram isolados entre eles iridoides, cumarinas, flavonoides
e terpenoides (BARBETTA; RAMOS, 2006; SCHAAB, 2005; SCHMIDT, 2005).
Wittkowski e Tomczak (2008) desenvolveram uma metodologia analítica
para quantificação dos iridoides presentes nos extratos de acetato de etila
obtido das partes aéreas da A. schottii, empregando CLAE. Góes (2011)
otimizou o método analítico para quantificação de iridoides em extratos
etanólicos obtidos das flores. Também foi demonstrado que formulações
tópicas a base de gel contendo 1 % de extrato mole da A. cathartica
apresentou alto potencial antioxidante e anti-inflamatório.
Portanto, devido a resultados promissores obtidos com os iridoides, o
presente estudo visou determinar uma metodologia mais adequada para
extração e purificação do composto denominado de AC1 das flores da A.
cathartica.
10
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Plantas Medicinais com Potencial Terapêutico
Desde a antiguidade os produtos naturais são utilizados pelo homem
como fonte segura e eficaz de tratamento contra várias patologias (TIWARI,
2008). As plantas medicinais são fontes importantes de substâncias
biologicamente ativas, servindo de base para pesquisa farmacológica e
descoberta de novas moléculas com atividade terapêutica (CALIXTO, 1997;
LOPEZ, 2011, KINGSTON, 2011). Segundo a Organização Mundial da Saúde
(OMS), cerca de 80% da população de países em desenvolvimento depende
da medicina tradicional para sua atenção primária utilizando as plantas
medicinais como única fonte de cuidados básicos de saúde (PRABHADEVI et
al., 2012; CALIXTO, 2005; WHO, 1998).
Uma revisão realizada por Newman e Cragg (2007) sobre fontes de
novos fármacos entre 1982 e 2006, indicou que aproximadamente 50% dos
novos fármacos aprovados durante esse período são baseados em estruturas
de produtos naturais.
No caso de antitumorais e anti-infecciosos cerca de 60% dos fármacos
disponíveis ou em estudo clínico são de origem natural (BUTLER, 2008).
Segundo Newman e Cragg (2012) nos últimos 30 anos os produtos
naturais de uma forma ou de outra continuam a desempenhar papel
fundamental na descoberta de novos fármacos ou no desenvolvimento de
novas estruturas. Também demonstraram que ainda em 2010 o campo dos
produtos naturais foi responsável em cerca de 50% das aprovações de novas
moléculas ativas, sendo que a metade das moléculas aprovadas seria
diretamente obtida dos produtos naturais sem qualquer modificação. Em geral,
das 1355 novas entidades químicas aprovadas cobrindo de 1981-2010, 29% é
de origem totalmente sintética, 4% obtido de síntese, mas com farmacóforo de
produtos naturais, 22% são derivados de produtos naturais e 4% são produtos
naturais (15% de origem biológica, geralmente grandes peptídeos ou proteínas
isoladas de células ou produzidas por biotecnologias, 6% vacinas, 9% produtos
que imitam substratos naturais, mas com farmacóforo natural e 11% produtos
11
que imitam substratos naturais obtidos totalmente com síntese). Pelo número
de fármacos aprovados, as principais doenças pesquisadas pela indústria
farmacêutica são: doenças infecciosas, câncer, hipertensão e inflamação
(NEWMAN; CRAGG, 2012).
As plantas medicinais possuem componentes complexos e os efeitos
terapêuticos podem ser resultado de uma ação sinérgica e/ou supressiva.
Também há a preocupação de inconsistência com a composição do extrato
vegetal e contaminação ocasional por adulterantes e componentes tóxicos. O
controle de qualidade visa assegurar a consistência, segurança e eficácia da
droga vegetal, criando uma correlação entre os componentes e sua ação
farmacológica (LIU et al., 2010; LI et al., 2008; LIANG; XIE; CHAN, 2004).
A qualidade de medicamento à base de planta medicinal pode ser
afetada por muitos fatores, incluindo as mudanças de estação, tempo de
colheita, locais de cultivo, processamento pós-colheita, adulterantes e
procedimentos de extração e preparação. Da colheita até o produto final os
marcadores químicos desempenham um papel crucial na avaliação da
qualidade dos medicamentos fitoterápicos. Além disso, o estudo de
marcadores químicos é aplicável a muitas áreas de pesquisa, incluindo
autenticação de uma espécie vegetal, pesquisa de novos protótipos ou
substitutos de matérias-primas, otimização de métodos de extração e
purificação, elucidação da estrutura e determinação da pureza. Investigações
sistemáticas utilizando marcadores químicos podem levar a descobertas e
desenvolvimento de novos fármacos. A Agência Européia de Medicamentos
(EMEA) define marcadores químicos como constituintes quimicamente
definidos ou grupos de constituintes de um produto à base de plantas
medicinais que são de interesse para fins de controle de qualidade,
independentemente se eles possuem alguma atividade terapêutica. A
quantidade de um marcador químico pode ser um indicador da qualidade de
um medicamento à base de plantas (LI et al., 2008).
O Brasil é signatário da Convenção sobre Diversidade Biológica (CDB),
acordo estabelecido pela Organização das Nações Unidas (ONU) e integrado
por 188 países cujos objetivos são:
12
a conservação da diversidade biológica, a utilização sustentável de seus componentes e a repartição justa e equitativa dos benefícios derivados da utilização dos recursos genéticos. A mesma Convenção ressalta a importância dos conhecimentos tradicionais de povos indígenas e de comunidades locais para o alcance destes objetivos, delegando aos seus signatários o dever de garantir a esses povos e comunidades o direito de decidir sobre os usos desses saberes e de também perceber os benefícios decorrentes de seu uso (BRASIL, 2006).
Segundo a CDB, o Brasil hospeda entre 15 e 20% da
biodiversidade mundial, compreendendo cerca de 55 mil espécies identificadas
em um total estimado entre 250 mil e 350 mil espécies de plantas existentes no
mundo. Sendo 75% das espécies brasileiras localizadas na Floresta Tropical
Atlântica e Floresta Amazônica, tornando o Brasil uma fonte importante de
novos fitoterápicos e fitofármacos (BARREIRO; BOLZANI, 2009). Dentre todas
as espécies de plantas identificadas até hoje, somente cerca de 15% foram
estudadas fitoquimicamente e 6% biologicamente (GURIB-FAKIM, 2006).
As plantas superiores além de constituírem uma fonte importante de
substâncias utilizadas diretamente como agentes medicinais, também
fornecem modelos para modificações estruturais e otimização das
propriedades farmacológicas, servindo de estímulo para enfrentar os desafios
da química sintética de novos fármacos (PRABHADEVI et al, 2012; BRAZ
FILHO, 2010).
Devido a grande biodiversidade das florestas tropicais há uma grande
interação envolvendo planta-planta, planta-animal e animal-animal. Essa
interação entre os organismos vivos depende da força metabólica e da química
do metabolismo secundário que assume papel especial na bioprodução de
substâncias orgânicas destinadas a manutenção da vida dos meios ambientes
naturais e artificiais produzidos pela atuação do homem. Sendo assim, o
isolamento e a determinação estrutural dessas substâncias originadas do
metabolismo secundário de organismos vivos, representa importância
fundamental para a química de produtos naturais e para o desenvolvimento
científico de novos fármacos (BRAZ FILHO, 2010).
As plantas medicinais são usadas extensivamente pela população, no
entanto seu uso indiscriminado pode promover efeitos adversos ou até mesmo
a possibilidade de interação entre planta e medicamento. Portanto, somente
13
por estudos químicos e farmacológicos, é possível a confirmação de sua
eficácia, qualidade e segurança (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Nesse contexto, os produtos naturais necessitam de um controle de
qualidade com métodos desenvolvidos e padronizados, na tentativa de obter
um material apropriado para o consumo, buscando a qualidade, segurança e
eficácia dos fitoterápicos ou fitofármacos (RAZMOVSKI-NAUMOVSKI et al.,
2010; NEWMAN; CRAGG, 2007).
No Brasil está sendo estabelecida a Política Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos que tem por objetivo respeitar a segurança e eficácia
na saúde pública e conciliar o desenvolvimento socioeconômico com a
conservação ambiental. Portanto, essa política deverá reconhecer e promover
práticas eficazes e aprovadas para o manuseio das várias formas de uso das
plantas medicinais, desde o uso caseiro até a fabricação de medicamentos
industrializados. Atualmente, os fitoterápicos são objetos de interesses
empresariais privados e fator de competitividade da indústria nacional (BRASIL,
2006).
Por sua vez, a Política Nacional de Práticas Integrativas e
Complementares no SUS, aprovada pelo Conselho Nacional de Saúde no ano
de 2005 e publicada por meio de Portaria GM nº 971, de 03 de maio de 2006,
propõe a inclusão das plantas medicinais e fitoterapia, homeopatia, medicina
tradicional chinesa/acupuntura e termalismo social/crenoterapia como opções
terapêuticas no sistema público de saúde. Essa política traz dentre suas
diretrizes para plantas medicinais e fitoterapia a elaboração da Relação
Nacional de Plantas Medicinais e de Fitoterápicos e o acesso a plantas
medicinais e fitoterápicos aos usuários do SUS (BRASIL, 2006).
2.2 Gênero Allamanda
A família Apocynaceae que apresenta cerca de 200 gêneros com mais
de 2.000 espécies de distribuição marcadamente tropical e subtropical em todo
o mundo. São plantas de hábito variado, ervas, subarbustos, árvores e
trepadeiras, na maioria latescentes, encontrada tanto nos campos como nas
matas (JOLY, 1998).
14
O gênero Allamanda compreende doze espécies distribuídas pela parte
tropical da América, sendo cultivada na Índia como planta ornamental. No
Brasil são encontradas dez espécies distribuídas por todo território nacional. As
mais comuns são a A. cathartica (flores grandes e amarelas), A. schottii (flores
pequenas e amarelas) e A. blanchetti (flores grandes de coloração
rosa/arroxeada). Entre as classes de metabólitos secundários isolados
encontram-se esteróides, terpenoides, flavonoides, cumarinas, lignanas e
iridoides (LORENZI; MOREIRA, 2001).
O gênero Allamanda pode contribuir de forma significativa através de
compostos que exercem atividade antiviral, como é o caso do iridoide
fulvoplumierina, em que a efetividade contra o vírus da imunodeficiência
humana tipo 1 (HIV-1) foi comprovada (ABE; YAMAUCHI, 1988).
Estudos fitoquímicos realizados por pesquisadores do Curso de
Farmácia da UNIVALI relataram cinco compostos presentes nas raízes da A.
schottii: plumericina, isoplumericina, 1-(3,4-dimetoxi-fenil)-etano-1,2-diol,
escoparona e mistura de β-sitosterol e estigmasterol (SCHAAB, 2005).
Outro trabalho com a A. schotti realizado em colaboração entre
pesquisadores do NIQFAR/UNIVALI com o Laboratório de Produtos
Naturais/UFSC apresentou como principais constituintes desta espécie uma
mistura dos esteróides sitosterol e estigmasterol, plumericina, escopoletina e
ácido ursólico (SCHMIDT, 2005).
Barbetta e Ramos (2006) isolaram e identificaram o triterpeno ácido
ursólico, o iridoide plumericina e a mistura dos esteróis campesterol, β-
sitosterol e estigmasterol, das partes aéreas da A. schotti.
Dentre as atividades estabelecidas até o momento, destaca-se a
atividade antileucêmica observada nos extratos das raízes da A. schottii
(SCHMIDT et al., 2006). A atividade antineoplásica em tumor de Erlish em
camundongos foi constatada para o extrato etanólico das partes aéreas da A.
cathartica (BERRI; SCARIOT, 2004).
Devido ao interesse nos iridoides presentes na Allamanda, Wittkowski e
Tomczak (2008) otimizaram e validaram uma metodologia analítica para
quantificação do iridoide plumericina por CLAE dos extratos de acetato de etila
obtidos a partir das partes aéreas da A. schottii. Após várias modificações, o
melhor gradiente foi a combinação entre os solventes metanol: acetonitrila:
15
água acidificada (H3PO4 0,5% v/v) na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10
minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos,
50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, retorno à condição
inicial, com fluxo constante de 0,8 mL/min.
Nascimento (2008) avaliou a influência da sazonalidade na produção de
iridoides nas raízes, caules e folhas da A. schottii, e quantificou dois iridoides
presentes nas frações de diclorometano e acetato de etila utilizando método
por CLAE validado por Wittkowski e Tomczak (2008). Foi observado que as
mudanças climáticas não interferem no número de metabólitos, mas sim nas
suas concentrações.
Mafra e Bonomini (2008) analisaram qualitativamente e
quantitativamente a presença de flavonoides nas flores das espécies A.
schottii, A. cathartica e A. blanchettii através da CLAE. Também validaram uma
metodologia analítica por CLAE usando o flavonoide rutina como marcador. De
acordo com os resultados foi observado que o principal compostos encontrado
nas frações de acetato de etila e diclorometano das flores das três espécies do
gênero Allamanda são a rutina. A maior concentração de rutina foi observada
na A. cathartica.
Posteriormente, Góes (2011) otimizou e co-validou o método analítico
desenvolvido por Wittkowski e Tomczak (2008) para quantificação do marcador
AC1 por CLAE nos extratos etanólicos e frações obtido das flores da A.
cathartica, comprovando a linearidade, precisão e exatidão, de acordo com a
literatura (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004). O método desenvolvido
anteriormente foi validado para extratos de acetato de etila obtidos de raízes,
caules e folhas da A. schottii (WITTKOWSKI; TOMCZAK, 2008).
Góes (2011) após utilizar maceração dinâmica, variando tempo de
extração, graduação alcoólica e proporção droga vegetal: solvente, observou
que os maiores teores de AC1 encontraram-se nos extratos obtidos com álcool
70 e 90 °GL e 10% de droga vegetal. A relação droga:solvente e grau alcoólico
foram os fatores de maior influência no processo de extração, sendo o tempo o
menos significativo.
Assim, estes dados embasam o presente estudo que visa selecionar um
processo de extração e purificação mais eficiente e com menor tempo de
processamento para obtenção do composto AC1.
16
2.3 Tecnologias de Extração
A extração consiste uma das primeiras etapas para a obtenção do
medicamento a partir de uma espécie vegetal. Sendo conhecidas as
substâncias ou classes relacionadas à atividade farmacológica é fundamental,
para o alcance de um maior rendimento extrativo, a escolha correta do solvente
e do método. Na otimização do processo de extração deve-se levar em
consideração, além do método, solvente e relação planta-solvente a facilidade
operacional, inocuidade fisiológica e ambiental, gastos de tempo e energia. Os
solventes mais empregados para obtenção de extratos como matéria prima
farmacêutica são água, álcool, glicerina, propilenoglicol ou misturas desses
(COUTO; SILVA; VITORINO, 2010).
A eficácia e a segurança de espécies vegetais utilizadas para fins
terapêuticos dependem da qualidade da droga vegetal, assim, é importante
obedecer às condições ideais de cultivo, colheita, secagem, estabilização,
conservação e armazenamento (BRAGA et al., 2007; GOBBO-NETO; LOPES,
2007). Na obtenção de produtos derivados de material vegetal utiliza-se
preferencialmente o material seco, pois a secagem interrompe processos de
degradação, reduz a contaminação e proliferação de micro-organismos e
possibilita o armazenamento e transporte do material (ROCHA, 2000).
Um tratamento prévio da amostra é necessário para economizar tempo e
esforço nas etapas de isolamento. Antes da extração se deve secar e
pulverizar o material vegetal, tomando cuidado com alguns fatores como: luz
solar direta, temperatura excessiva na moagem, líquen ou outros parasitas do
material vegetal que podem vir a degradar ou transformar os compostos
originais em artefatos (HOSTETTMANN et al., 2008).
O alto teor de água nas matéria-primas vegetais possibilita a ação de
enzimas e propicia o desenvolvimento de fungos e bactérias, portanto, é um
parâmetro indicativo de estabilidade da droga vegetal. Processos de secagem
inadequados podem levar a contaminação, podendo transformar ou alterar os
princípios ativos originais, tornando-o impróprio ao consumo (BRAGA et al.,
2007).
17
O quadro 1 apresenta os principais fatores desencadeantes de artefatos
durante os processos de manipulação da droga vegetal (HOSTETTMANN et
al., 2008; HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003).
Quadro 1 - Formação de artefatos durante os processos de extração e isolamento. Etapa Origem Secagem O2, luz, temperatura, microrganismos Moagem Temperatura Armazenamento O2, luz, temperatura Extração Método, solvente, tempo, temperatura, atividade enzimática
(H2O) Remoção de solvente Temperatura, tempo, O2 Isolamento Catálise em fase estacionária, adsorção, solvente, tempo, pH Fonte: Hostettmann et al., 2008.
Inicialmente faz-se uma seleção do solvente de extração. Em uma
extração inicial com solventes de baixa polaridade obtêm-se compostos mais
lipofílicos, enquanto que o uso de solventes alcoólicos proporciona a extração
de um amplo espectro de substâncias polares e apolares, permitindo assim
fracionamentos posteriores, resultando em frações de distintas polaridades.
Métodos de extração são utilizados como passo de pré-purificação para
remover seletivamente componentes interferentes e ou isolar os compostos
ativos (STICHER, 2007).
O primeiro passo na análise dos produtos naturais é a extração para
separar os compostos da matriz vegetal. Essa etapa de extração e
recuperação do soluto pode ser explicada em um processo de cinco etapas: 1)
dessorção do composto do sítio ativo da matriz; 2) difusão para a própria
matriz; 3) dissolução do analito pelo líquido extrator; 4) difusão do composto no
líquido extrator e 5) coleta do líquido extrator (STICHER, 2007).
Dois fenômenos ocorrem em paralelo no processo de extração: a
lixiviação das substâncias solúveis de células rompidas e a dissolução e
difusão das substâncias solúveis das células intactas. O solvente ao penetrar
nas células induz um momento dipolar nas moléculas a extrair, ocorrendo uma
associação química às moléculas do solvente. Essa capacidade de ligação
pode ser expressa em termos de constante dielétrica, que é uma função
derivada das propriedades eletroquímicas do solvente, sendo que, quanto mais
polar for o solvente maior será sua constante dielétrica. Assim, compostos
ionizáveis ou altamente polares se dissolvem em líquidos de elevada constante
18
dielétrica, e compostos apolares se dissolverão em solventes de baixa
constante dielétrica (MARQUES; VIGO, 2009).
Idealmente, um processo de extração deve ser exaustivo no que diz
respeito aos compostos a serem analisados, ou isolados, rápido, simples,
barato e passível de automação. Os métodos convencionais de extração de
produtos naturais incluem extração com Soxhlet, maceração, percolação,
turbólise e sonicação (CHAN et al., 2011; STICHER, 2007).
Maceração é o processo no qual a droga vegetal pulverizada fica em
contato com o líquido extrator em recipiente fechado, em temperatura ambiente
ou mais elevada (digestão), durante um longo período (horas ou dias), sob
agitação ocasional (estática) ou constante (dinâmica) sem renovação do líquido
extrator. Ao final do processo o líquido extrator é separado e o resíduo
prensado (MARQUES; VIGO, 2009; MARTIN; BUSTAMANTE, 1993).
Essa técnica não leva ao esgotamento total da droga vegetal devido à
saturação do solvente e/ou ao estabelecimento de um equilíbrio entre o
solvente e o interior da célula. Também depende de fatores como
granulometria, teor de umidade, concentração e seletividade do solvente e grau
de intumescimento das células (MARQUES; VIGO, 2009). Quando empregado
em nível industrial os extratores podem ser cubas fixas ou móveis, apresentar
ou não camisa de vapor e ainda diferenciando em tamanho, forma geométrica
e presença de agitação interna (ROCHA, 2000).
No processo conhecido como turbo-extração ou turbólise as partes
vegetais são submersas em solvente frio e submetidas a elevadas forças de
cisalhamento, geradas por um equipamento chamado turbolizador, que
trabalha com um rotor em alta velocidade (50.000 a 200.000 rpm) triturando e
dissolvendo seus conteúdos celulares (MARTIN; BUSTAMANTE, 1993). Essa
técnica resulta em grandes rendimentos devido à trituração e homogeneização
constante da droga vegetal e do solvente, levando também a um aumento da
temperatura que deve ser controlada devido a decomposição de compostos
termolábeis e diminuição do tamanho de partícula que pode dificultar a
separação da solução extrativa por filtração. Como desvantagem possui a
limitação quando se trata de materiais de elevada dureza como raízes e caules
(MARQUES; VIGO, 2009).
19
Alguns dos métodos tradicionais apresentam desvantagens como longos
tempos de extração, intensos procedimentos de laboratório, grandes
quantidades de solventes orgânicos, baixa eficiência de extração, e potencial
de degradação de compostos lábeis. Já técnicas de extração mais recentes
apresentam vantagens significativas sobre os métodos convencionais. Por
exemplo, redução no consumo de solvente orgânico e degradação da amostra,
redução no tempo de extração e etapas de clean-up ou de concentração,
melhora na eficiência de extração, seletividade e facilidade de automação.
Essas técnicas recentes incluem extração com fluidos supercríticos (EFS),
extração com líquido pressurizado (ELP) e extração assistida por micro-ondas
(EAM) (CHAN et al., 2011; STICHER, 2007).
A extração assistida por micro-ondas (EAM) é uma tecnologia recente
que utiliza a energia de micro-ondas para aquecer rapidamente e
eficientemente solventes para extrair compostos alvos a partir de várias
matrizes (JAIN et al., 2009; SPIGNO; FAVERI, 2009). Como a matriz vegetal
contém quantidade significativa de água que absorve fortemente a energia de
micro-ondas, ocorre um aquecimento interno, levando ao rompimento celular,
facilitando o processo de extração. Além de ocorrer a migração dos íons
dissolvidos, o que aumenta a penetração do solvente dentro da matriz e,
posteriormente, facilita a liberação dos compostos aumentando o rendimento
da extração (SPIGNO; FAVERI, 2009; WANG; WELLER, 2006). As principais
vantagens da EAM sobre as técnicas de extração convencionais são redução
do consumo de solvente e tempo de extração, recuperações moderadamente
elevadas, boa reprodutibilidade e manipulação mínima das amostras para o
processo de extração (SPIGNO; FAVERI, 2009; ARMENTA et al., 2008).
Micro-ondas são radiações eletromagnéticas não ionizantes, com
comprimentos de onda de 1 mm a 1 m com frequências correspondentes entre
300 MHz e 300 GHz. Seu uso como fonte de calor tem sido utilizado desde o
final dos anos 1970, entretanto seu uso para melhorar o processo de extração
é muito recente. Para o aquecimento através de microondas, duas frequências
são reservadas pela, Federal Communications Commission (FCC) para uso
industrial, científico e medicinal. As duas frequências mais comumente
utilizados são 0,915 e 2,45 GHz (SPIGNO; FAVERI, 2009; THOSTENSON;
CHOU, 1999).
20
No processo térmico convencional, a energia é transferida para o
material por meio de convecção, condução e radiação de calor a partir da
superfície do material. Em contraste, a energia de micro-ondas é transferida
diretamente aos materiais por meio da interação molecular com o campo
eletromagnético. O aquecimento por micro-ondas é a transferência da energia
eletromagnética em energia térmica e é a conversão de energia, em vez de
transferência de calor. Esta diferença na maneira como a energia é distribuída
pode resultar em muitas vantagens potenciais para a utilização de micro-ondas
para o processamento de materiais. Já que as micro-ondas podem penetrar a
matéria e depositar energia, o calor pode ser gerado por todo o volume do
material. A transferência de energia não depende da difusão do calor a partir
das superfícies, e é possível obter um aquecimento rápido e uniforme de todo o
material (STICHER, 2007; THOSTENSON; CHOU, 1999).
Vários fatores influenciam na extração de um composto alvo como,
duração da irradiação de microondas, a razão solvente/material, temperatura
de extração e o tipo de solventes. Na extração convencional, a eficiência da
extração de diferentes solventes, depende principalmente da solubilidade do
composto no solvente, a cinética de transferência de massa do produto, e a
força das interações soluto/matriz, enquanto que na EAM a taxa de
aquecimento desempenha um papel fundamental na eficiência de extração.
Sendo que o solvente deve ter constante dielétrica elevada (o que mede a
eficiência em que a energia de microondas pode ser absorvida e convertida em
calor no interior de um material quando um campo elétrico é aplicado). Devido
a essa constante, a água é o melhor solvente para EAM, e a sua adição pode
ser explorado para aumentar o índice de polaridade de outros solventes que
são geralmente utilizados para a extração de compostos bioativos de plantas
(etanol, metanol, acetona e acetato de etila), e assim aumentar a constante
dielétrica da mistura (SPIGNO; FAVERI, 2009; HEMWIMON; PAVASANT;
SHOTIPRUK, 2007).
O forno micro-ondas é composto por três componentes principais: a
fonte, as linhas de transmissão, e o aplicador. A fonte de microondas gera a
radiação eletromagnética, as linhas de transmissão levam a energia
eletromagnética a partir da fonte para o aplicador. No aplicador, a energia é
absorvida ou refletida pelo material. As equações de Maxwell são as leis físicas
21
que descrevem os campos eletromagnéticos que variam com o tempo. A
geração da radiação eletromagnética é resultado da aceleração de cargas.
Para alcançar a alta potência e frequências necessárias para aquecimento por
microondas, a maioria das fontes de microondas são tubos de vácuo. A energia
é transferida para os materiais através da interação dos campos
eletromagnéticos, a nível molecular, e as propriedades dielétricas determinam
o efeito do campo eletromagnético no material. A interação das microondas
com os dipolos moleculares resulta em rotação dos dipolos, e a energia é
dissipada na forma de calor a partir da resistência à rotação interna
(THOSTENSON; CHOU, 1999).
As micro-ondas podem ser utilizadas de duas formas: em recipientes
fechados sobre pressão e temperatura controladas, ou recipientes abertos a
pressão atmosférica. As duas tecnologias são comumente nomeadas de EAM
pressurizado (EAMP) ou EAM focalizado (EAMF), respectivamente.
Considerando que no sistema aberto não se tem o controle da pressão, a
temperatura é limitada pelo ponto de ebulição do solvente a pressão
atmosférica, no sistema fechado o solvente pode ser aquecido acima do ponto
de ebulição pela simples aplicação de pressão, aumentando assim a
velocidade de extração e eficiência (CHAN et al., 2011; WANG; WELLER,
2006). O sistema aberto utiliza micro-ondas focalizadas, resultando em um
aquecimento homogêneo e mais eficiente. Já o sistema fechado usa micro-
ondas difusas e o campo elétrico não é homogêneo e, portanto, o recipiente é
colocado em uma plataforma giratória (STICHER, 2007). Recentes avanços no
sistema fechado levaram ao desenvolvimento da Extração Assistida por Micro-
ondas de Alta Pressão (HPMAE-sigla em inglês), o aumento da temperatura e
pressão acelera a extração devido a capacidade do solvente extrator de
absorver a energia de micro-ondas. Além disso, o sistema fechado também
oferece uma extração mais rápida e eficiente com menor consumo de solvente
(CHAN et al., 2011). Os resultados obtidos até o momento levam a conclusão
que essa radiação não causa degradação dos compostos extraídos, a menos
que, sejam alcançadas altas temperaturas (STICHER, 2007).
Baixos rendimentos na EAM devido à degradação térmica e oxidação
levaram ao desenvolvimento de EAM mais eficientes, criando novas
modificações. Na EAM protegida por nitrogênio (NPMAE – sigla em inglês), a
22
oxidação de compostos ativos durante a extração pode ser prevenida usando
um gás pressurizado inerte como nitrogênio no sistema fechado. EAM no
vácuo (VMAE – sigla em inglês), onde é realizada a extração de compostos
termo sensíveis utilizando uma condição de trabalho com baixa temperatura.
Esse tipo de EAM aumenta o mecanismo de transferência de massa pela
difusão dos compostos ativos para o solvente através da pressão de sucção,
sendo o risco de degradação térmica e oxidação diminuída. Outras
modificações podem ser encontradas como EAM sem solvente (SFMAE) que é
utilizada para extração de óleos essenciais onde pode ser incorporada água
para extrair um composto alvo. Esse tipo de EAM reduz significantemente o
tempo de extração comparado com técnicas convencionais de extração, de
horas para 20-30 minutos (CHAN et al., 2011).
Proestos e Komaitis (2008) desenvolveram um método de extração por
EAM de compostos fenólicos de plantas aromáticas oriundas da Grécia e
compararam com um método convencional. O método por EAM foi mais
eficiente, diminui o uso de solvente e reduziu o tempo de extração. Muitas
pesquisas foram publicadas nos últimos anos sobre a aplicação da EAM de
metabólitos secundários de plantas (LIAO et al, 2008; XIAO; HAN; SHI, 2008;
ZHANG; YANG; LIU, 2008; CHEN; XIE; GONG, 2007; HAO et al, 2002;).
Também foi utilizada para o isolamento de ginsenosídeos da raiz do Panax
ginseng (SHU; KO; SHANG, 2003), polifenóis e cafeína das folhas da Camellia
sinensis (PAN; NIU; LIU, 2003) e antraquinonas da raiz da Morinda citrifolia
(HEMWIMON; PAVASANT; SHOTIPRUK, 2007).
2.4 Métodos de Separação
2.4.1 Cromatografia preparativa em camada delgada (CPCD)
A cromatografia é o método cromatográfico mais antigo e conhecido,
sendo uma técnica de separação básica que utiliza a migração da fase móvel
através de uma fase estacionária por capilaridade (HOSTETTMANN et al.,
2008).
Vários estudos têm investigado os parâmetros mais importantes sobre o
desenvolvimento do método em camada delgada, tais como a seleção da fase
23
estacionária, fase móvel, o modo de desenvolvimento, bem como a otimização
da fase móvel e de transferência de fase móvel (STICHER, 2007).
Sílica gel é o adsorvente mais empregado na separação de misturas de
substâncias tanto lipofílicas como hidrofílicas. A espessura do adsorvente mais
utilizado sobre as placas de vidro ou alumínio fica entre 0,5 e 2 mm, o tamanho
geralmente é de 20 x 20 cm ou 20 x 40 cm. A limitação da espessura e do
tamanho da placa cromatográfica restringem a quantidade de amostra, sendo
que uma placa de 1 mm de espessura suporta 5 mg/cm² de amostra
(HOSTETTMANN et al., 2008; STICHER, 2007).
A banda em que a amostra é aplicada deve ser tão reduzida quanto
possível, já que a resolução depende da largura da banda. Uma seleção prévia
da fase móvel deve ser otimizada por cromatografia em camada delgada
analítica. A adição de ácido acético ou dietilamina em pequenas quantidades é
útil para a separação de compostos ácidos e básicos, respectivamente
(HOSTETTMANN et al., 2008).
A eluição das placas é realizada em tanques de vidro contendo a fase
móvel, e mantendo essa saturada pela adição de uma folha de papel filtro
sumergida no solvente. Após a eluição as bandas são raspadas com a ajuda
de uma espátula e as substâncias desejadas devem ser extraídas do
adsorvente, utilizando solvente menos polar possível, o metanol não é
recomendado, posto que pode dissolver a sílica gel e as impurezas. Quanto
mais tempo os compostos ficarem em contato com o adsorvente, maior a
probilidade de ocorrer degração. Durante a extração das substâncias
separadas das placas, pode se extrair impurezas como aglutinantes e
indicadores fluorescentes. Por esta razão recomenda-se uma etapa final de
purificação por filtração em gel através de Sephadex LH-20 (HOSTETTMANN
et al., 2008).
2.4.2 Cromatografia em Coluna Aberta (CC)
A CC é uma técnica universalmente utilizada para separação de
produtos naturais devido a sua simplicidade de operação, baixo custo e de não
precisar de equipamentos especializados (HOSTETTMANN et al., 2008).
24
Esta técnica é baseada na capacidade de adsorção e solubilidade, entre
uma fase sólida e uma líquida, onde o equilíbrio dinâmico é estabelecido entre
a concentração do soluto em duas fases. A amostra a ser separada é
submetida a um fluxo contínuo de solventes, usando um sistema crescente de
polaridade. A capacidade do eluente em arrastar um composto adsorvido na
fase estacionária depende quase totalmente da polaridade do solvente em
relação ao composto. Assim compostos apolares passam facilmente pela
coluna, já que compostos mais polares possuem maior afinidade com a fase
estacionária (HOSTETTMANN; MARSTON; HOSTETTMANN, 1997).
Emprega-se como fase estacionária sílica gel, e pode-se trabalhar com
30 mg de amostra por grama de suporte com 60-200 µm de granulometria,
porém esta capacidade só é possível quando as substâncias de interesse
possuem valores de fator de retenção diferentes. Entretanto, quando se utiliza
para filtração é possível trabalhar com 1 g de amostra por 10 gramas de
suporte (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003). No entanto, esta técnica
possui algumas limitações, como: separações lentas; baixa resolução;
adsorção irreversível de alguns solutos; requer grandes quantidades de
solventes e incompatibilidades com partículas de baixa granulometria.
2.4.3 Cromatografia Líquida Sob Pressão
A cromatografia líquida sob pressão refere-se a qualquer método que
envolva aplicação de pressão em uma coluna cromatográfica, incluindo todas
as categorias, desde a cromatografia “flash” (2 bar) até a cromatografia líquida
de alta eficiência preparativa (100 bar), e quantidades das amostras (de mg até
gramas). A diferença entre a cromatografia preparativa e a analítica é que,
enquanto a última se preocupa com a separação, identificação e determinação,
não importando a recuperação da amostra, a cromatografia preparativa, sendo
um processo de purificação, permite o isolamento de substâncias puras
contidas em uma mistura (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003).
O termo “cromatografia líquida de alta eficiência” (CLAE) se aplica
convencionalmente a colunas com pratos teóricos superior a 2.000, com
valores típicos entre 2.000-20.000 (SNYDER, 1992). O uso da CLAE
preparativa se tornou a base no isolamento da maioria das classes de produtos
25
naturais. CLAE é uma técnica robusta, versátil e rapidamente purifica
compostos de uma mistura complexa (STICHER, 2007).
A principal diferença entre a CLAE preparativa e outras cromatografias
de “pressões menores” é a consistência e tamanho de partícula da fase
estacionária. A separação de dois compostos aumenta com a diminuição do
tamanho de partícula. A média do tamanho de partícula da CLAE preparativa é
entre 3 e 10 µm, muito menor que outras fases estacionárias. Devido ao
pequeno tamanho de partícula da fase estacionária, altas pressões são
necessárias para empurrar a fase móvel através do sistema. Sendo assim, a
alta área de superfície das partículas disponibiliza uma maior interação do
soluto com a fase estacionária resultando em alto poder de resolução, que é
necessário para purificação de complexas misturas de produtos naturais
(STICHER, 2007). Isso é possível pelo fato da fase móvel e estacionária
possuir um amplo espectro de polaridade no qual a seletividade no processo de
separação pode ser otimizada e ajustada (COLLINS; GUIMARÃES; JARDIM,
2006). Usualmente utilizam-se colunas com diâmetros entre 10-100 mm. Em
geral, a CLAE preparativa é a etapa final de purificação (STICHER, 2007).
A CLAE é a técnica analítica mais usada de separação devido à sua
sensibilidade e aplicabilidade a substâncias de interesse para a indústria e a
pesquisa. Tem sido usada rotineiramente para o isolamento e controle de
componentes de produtos naturais como, por exemplo, extratos de plantas
(VILEGAS; CARDOSO, 2007). A CLAE utiliza instrumentos que podem ser
totalmente automatizados. É um tipo de cromatografia líquida que emprega
colunas recheadas com materiais especialmente preparados e uma fase móvel,
eluída sob alta pressão. Tem capacidade de realizar separações e análises
quantitativas de uma grande variedade de compostos presentes em diversos
tipos de amostras, em poucos minutos, com alta resolução, eficiência e
detectabilidade (COLLINS; GUIMARÃES; JARDIM, 2006).
Dentre as vantagens que a CLAE oferece pode-se citar: a possibilidade
de separação de compostos em baixas concentrações, tempo curto de análise,
fase móvel e estacionária com ampla faixa de polaridade (de modo que a
seletividade no processo de separação possa ser ajustada), além da
minimização de decomposição de compostos instáveis na amostra. Esta
também permite análises qualitativas e quantitativas de misturas complexas
26
com alta resolução e sensibilidade (HOSTETTMANN; MARSTON;
HOSTETTMANN, 1997).
27
3 CONCLUSÕES
� Os extratos obtidos por maceração com etanol apresentaram os
melhores rendimentos em massa, que pode estar relacionado com a
maior extração de compostos polares e açúcares.
� O extrato de acetato de etila resultou em maior concentração de AC1 em
massa de extrato. Entretanto, o extrato etanólico foi o que apresentou
maior quantidade do AC1 por grama de flores secas devido ao maior
rendimento do extrato.
� A EAM em 50 ºC proporcionou rendimentos (%) semelhantes à
maceração clássica em um menor tempo de extração. O aumento da
temperatura para 76 ºC aumentou o rendimento de extração do AC1.
� Na otimização do processo de extração por EAM foi observado que a
eficiência da extração do AC1 é influenciada pela temperatura para
ambos os solvente, etanol e acetato de etila. Nas extrações com etanol
a potência teve forte influência no rendimento do AC1 por grama de
extrato. Já nas extrações com acetato de etila o tempo foi fator de maior
influência no rendimento do marcador.
� A metodologia de EAM foi otimizada pelo aumento da temperatura, que
foi possível já que o composto alvo apresenta ponto de fusão elevado,
sendo a melhor condição de trabalho para o etanol: 10 minutos, potência
300 W e temperatura de 76 ºC; e para acetato de etila: 20 minutos,
potência 200 W e temperatura de 76 ºC.
� O etanol foi o melhor solvente extrator para extração e isolamento do
AC1, sendo que apenas ajustando as condições de extração (10 min -
300 W – 76 ºC) pode se obter alta concentração do marcador.
28
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