UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASrepositorio.unicamp.br/.../334789/1/Santos_ErikaGomes_M.pdfBiblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Márcia Regina Garbelini Sevillano -

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos

ERIKA GOMES SANTOS

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO DE SÓDIO E SAIS

SUBSTITUTOS AO CLORETO DE SÓDIO NA RESISTÊNCIA TÉRMICA DE

CLOSTRIDIUM DIFFICILE EM CALDO DE CARNE

CAMPINAS

2019

ERIKA GOMES SANTOS

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NITRITO DE SÓDIO E SAIS

SUBSTITUTOS AO CLORETO DE SÓDIO NA RESISTÊNCIA TÉRMICA DE

CLOSTRIDIUM DIFFICILE EM CALDO DE CARNE

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Ciência de Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Dirce Yorika Kabuki

ESTE TRABALHO CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELA ALUNA ERIKA

GOMES SANTOS E ORIENTADA PELA

PROFA. DRA. DIRCE YORIKA KABUKI.

CAMPINAS

2019

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 130547/2013-1ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7873-6179

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos

Márcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647

Santos, Erika Gomes, 1986-

Sa59i SanInfluência da concentração de nitrito de sódio e sais substitutos ao cloreto

de sódio na resistência térmica de Clostridium difficile em caldo de carne /

Erika Gomes Santos. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.

SanOrientador: Dirce Yorika Kabuki.

SanDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade

de Engenharia de Alimentos.

San1. Clostridium difficile. 2. Produtos cárneos. 3. Esporos. I. Kabuki, Dirce

Yorika. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de

Alimentos. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Influence of the concentration of sodium nitrite and saltssubstitutes to sodium chloride on the thermal resistance of Clostridium difficile in meat broth

Palavras-chave em inglês:Clostridium difficile

Meat products

Spores

Área de concentração: Ciência de AlimentosTitulação: Mestra em Ciência de AlimentosBanca examinadora:Dirce Yorika Kabuki [Orientador]

Alessandra Regina da Silva Marques

Renata Bromberg

Data de defesa: 27-02-2019Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Profa. Dra. Dirce Yorika Kabuki

Faculdade de Engenharia de Alimentos, FEA, UNICAMP

Orientadora

______________________________________________________________________

Dra. Alessandra Regina da Silva Marques

LABTERMO

Membro Titular

______________________________________________________________________

Dra. Renata Bromberg

Instituto de Tecnologia de Alimentos, ITAL

Membro Titular

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se

no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria de Pós-

Graduação da Faculdade de Engenharia de Alimentos.

À minha família, dedico.

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo entendimento concedido e por estar sempre comigo.

Gostaria de agradecer aos meus pais, irmãos e sobrinhos pelo amor, apoio e

incentivo em todas as etapas.

Agradeço ao Prof. José Luís e à Profa. Dirce por terem me aceitado como

orientada. Em especial, agradeço à professora Dirce pelo acompanhamento, pela

confiança, pela amizade, por todos os ensinamentos, pela experiência de PED e por

estar sempre presente.

A todos da LabTermo, obrigada pela oportunidade e aprendizado em

microbiologia. Agradeço à Profa. Pilar pela confiança e pelos valiosos ensinamentos.

Alê, você é uma pessoa maravilhosa, muito obrigada pela amizade, pelos conselhos

e orientação no “mundo da micro”, aprendi muito com você!

A todos os professores, funcionários e alunos da área de Microbiologia, muito

obrigado pela ajuda! Ju, Aninha e Norma não há palavras suficientes para agradecer

por todo apoio durante o mestrado!

À minha amiga Ju Carusi & família, que tornaram a jornada mais leve e os

dias mais alegres.

Aos amigos de laboratório Marina, Taísa, Andrea, Matheus, Caio, Murilo e

Karen agradeço pelo carinho, pelos risos e por toda ajuda.

Aos queridos amigos da Casa da ABU, obrigada pela paciência, convivência,

amizade, ajuda e ensinamentos. Fabi, Eltermann, Sydnei, Ricardo, Lucas, Thais,

Baker, Aline e Érika foi muito divertido morar com vocês!

Agradeço a todos da IPBG e da ABU pela amizade, ajuda e ensinamentos,

guardarei com carinho todas as lembranças!

À Sufis/Gecoq da Conab, muito obrigada pelo apoio e compreensão.

A todos os professores e funcionários da Faculdade de Engenharia de

Alimentos agradeço pela contribuição na minha formação.

Agradeço aos professores membros da banca de defesa, todas as

contribuições e sugestões tornaram meu trabalho melhor.

Agradeço ao CNPq pelo apoio financeiro.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) código de

financiamento 001.

RESUMO

A infecção causada por Clostridium difficile (CDI) está associada ao

tratamento com antibióticos e pode variar desde diarreia a grave colite

pseudomembranosa. Os fatores de risco relacionados ao CDI incluem longos

períodos de hospitalização, exposição a antibióticos, comorbidades subjacentes e

idade superior a 65 anos. Recentemente, os casos de CDI têm sido observados na

comunidade, em populações consideradas de baixo risco, tais como os jovens.

Diversas pesquisas mostram que animais são portadores assintomáticos de C.

difficile, assim a transmissão por meio de alimentos de origem animal é uma

potencial fonte de contaminação. Todavia, faltam estudos para comprovar a

transmissão da doença por alimentos. Além disso, os esporos de C. difficile podem

resistir por até 2 h a 71°C em solução salina tamponada. O objetivo desta pesquisa

foi estudar a ocorrência de C. difficile em produtos cárneos, os parâmetros de

resistência térmica (D e z) de seus esporos em caldo de carne (72°C, 77°C e 82°C)

e a influência da concentração de nitrito de sódio e sais substitutos na resistência

térmica de esporos de C. difficile a 72°C, em caldo de carne, por meio de um

delineamento fatorial 22, com triplicata no ponto central. Foram analisadas 45

amostras de produtos cárneos adquiridas em estabelecimentos comerciais,

entretanto nenhuma amostra apresentou contaminação por C. difficile. Na

temperatura 72°C, a curva de sobreviventes para os esporos de C. difficile, em caldo

de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2, apresentou desvio de

linearidade (cauda), sendo que o tempo para primeira redução decimal (δ),

determinado de acordo com o modelo Weibull, proposto por Mafart et al. (2002),

nessa temperatura foi de 31,87 min. Já nas temperaturas de 77°C e 82°C, o valor de

D calculado por regressão linear foi de 14,04 min e 4,23 min, respectivamente. O

valor de z obtido por regressão linear foi de 11,4°C, com coeficiente de ajuste de

0,988. Foi verificado que a substituição parcial (50%) de cloreto de sódio por uma

mistura de cloreto de potássio (50%) e cloreto de cálcio (50%) não afetou a

resistência térmica de C. difficile a 72°C em caldo de carne pH 5,3, ao nível de

significância de 95%. Embora o nitrito de sódio não iniba o crescimento de C.

difficile, o efeito conjunto da concentração de nitrito de sódio e temperatura na

resistência térmica foi estatisticamente significativo (p-valor

ABSTRACT

The infection caused by Clostridium difficile (CDI) is associated with antibiotic

treatment and can range from diarrhea to severe pseudomembranous colitis. Risk

factors related to CDI include long period of hospitalization, exposure to antibiotics,

underlying comorbidities and age over 65 years. Recently, cases of CDI have been

observed in the community, in people considered to low risk, such as young people.

Several studies show that animals are asymptomatic carriers of C. difficile, so the

transmission from animal food is considered a potential source of contamination.

Although there have been no confirmed cases of any foodborne disease caused by

C. difficile. In addition, C. difficile spores may survive for 2 h at 71° C in phosphate

buffered saline. The aim of this study was to investigate the C. difficile occurrence in

meat products, the parameters of thermal resistance of C. difficile spores in meat

broth (72°C, 77°C and 82°C) and the influence of the concentration of sodium nitrite

and substitute salts in the thermal resistance of C. difficile spores at 72°C in meat

broth, by a factorial design 22, with triplicate at the central point. A total of 45 samples

of meat products purchased at commercial establishments were analyzed, although

contamination with C. difficile was not found. At 72°C, the survival curve for the C.

difficile spore in meat broth, pH 5,3, with 2% NaCl and 150 ppm NaNO2 showed

linearity deviation (tail), the time for first decimal reduction (δ), determined according

to the Weibull model, proposed by Mafart et al. (2002) at this temperature was 31,87

min. At temperatures of 77°C and 82°C, the D value calculated by linear regression

was 14,04 min and 4,23 min, respectively. The z value obtained by linear regression

was 11,4°C, with a coefficient of adjustment of 0.988. It was found that the partial

replacement (50%) of sodium chloride by a mixture of potassium chloride (50%) and

calcium chloride (50%) did not affect the thermal resistance of C. difficile at 72°C in

meat broth pH 5,3 at a significance level of 95%. Although sodium nitrite did not

inhibit C. difficile growth, the combined effect of sodium nitrite concentration and

temperature on thermal resistance was statistically significant (p-value

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Ultraestrutura do esporo do C. difficile R20291, ribotipo 027 .................... 28

Figura 2. Casos de CDI nos Estados Unidos ........................................................... 30

Figura 3. A: PaLoc - tcdR, tcdB, tcdE, tcdA e tcdC. B: Genes codificadores da toxina

binária - cdtR, cdtA e cdtB ......................................................................................... 33

Figura 4. Fluxograma de detecção de C. difficile por plaqueamento direto e com

tratamento alcoólico para ativação de esporos ......................................................... 53

Figura 5. Produtos de amplificação dos genes tpi nos micro-organismos isolados de

amostras de produtos cárneos (I1-I13) e nas cepas de referência de C. difficile (VPI)

por meio da técnica da PCR ...................................................................................... 62

Figura 6. Curva de sobreviventes de C. difficile a 72°C, em caldo de carne, pH 5,3,

com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2 .................................................................... 66





Figura 9. Curva TDT. ................................................................................................ 73

Figura 10. Curva de sobreviventes a 72°C ............................................................... 74

Figura 11. Diagrama de Pareto (Equação 2) ............................................................ 75

Figura 12. Superfície de resposta para δ72°C (min) ................................................... 79

Figura 13. Curva de contorno para δ72°C (min) ......................................................... 79

Figura 14. Diagrama de Pareto (Equação 3) ............................................................ 80

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação por tipo toxigênico e correlação com ribotipo. ..................... 34

Tabela 2. Prevalência da contaminação de alimentos por C. difficile. ...................... 39

Tabela 3. Planejamento de amostragem para cada temperatura de ensaio. ............ 59

Tabela 4. Delineamento fatorial 22 com 3 repetições no ponto central para avaliação

da combinação dos efeitos das concentrações de nitrito de sódio e blend de sais na

resistência térmica de C. difficile a 72°C. .................................................................. 61

Tabela 5. Variáveis e níveis utilizados no planejamento experimental. .................... 61

Tabela 6. Parâmetros de resistência térmica a 72°C de C. difficile em caldo de

carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2. ............................................ 67

Tabela 7. Parâmetros de resistência térmica a 77°C e a 82°C de C. difficile em caldo

de carne, pH 5,3, com 2% de NaCl e 150 ppm de NaNO2. ....................................... 68

Tabela 8. Resultados de δ72°C. .................................................................................. 74

Tabela 9. Coeficientes de regressão do delineamento fatorial 22 para as variáveis

concentração de NaNO2 e concentração de NaCl no blend. ..................................... 75

Tabela 10. Análise de variância (ANOVA) do modelo linear proposto para a

resistência térmica de C. difficile a 72°C em caldo de carne contendo NaNO2 e NaCl.

.................................................................................................................................. 78

Tabela 11. Coeficientes de regressão para delineamento fatorial 22 para a variável

concentração de NaNO2. ........................................................................................... 80

Tabela 12. Análise de variância (ANOVA) do modelo linear proposto para a

resistência térmica de C. difficile a 72°C em caldo de carne contendo NaNO2, pH 5,3.

.................................................................................................................................. 81

Tabela A1. δ72°C observados e δ72°C preditos (Equação 2). ..................................... 119

Tabela A2. δ72°C observados e δ72°C preditos (Equação 3). ..................................... 120

SUMÁRIO

1. Introdução Geral................................................................................................. 14

2. Objetivos ............................................................................................................ 16

3. Revisão Bibliográfica .......................................................................................... 17

3.1. Produção de carnes no Brasil ......................................................................... 17

3.1.1. Cloreto de sódio na dieta e nos produtos cárneos................................. 18

3.1.2. Nitrito de sódio nos produtos cárneos ................................................... 23

3.2. Clostridium difficile .......................................................................................... 25

3.2.1. Patogenicidade de C. difficile................................................................. 30

3.2.2. Ocorrência em alimentos ....................................................................... 35

3.2.3. C. difficile no Brasil ................................................................................ 46

3.3. Resistência térmica......................................................................................... 48

4. Material e Métodos ............................................................................................. 50

4.1. Prevalência de C. difficile em produtos cárneos processados ........................ 51

4.1.1. Amostras................................................................................................ 51

4.1.2. Detecção de C. difficile .......................................................................... 51

4.1.3. Identificação dos isolados por Polymerase Chain Reaction .................. 54

4.2. Micro-organismo ............................................................................................. 55

4.2.1. Preparo da suspensão de esporos de C. difficile ................................... 55

4.2.2. Contagem da suspensão de esporos .................................................... 56

4.3. Crescimento de esporos de C. difficile em presença de nitrito de sódio ......... 57

4.4. Avaliação da resistência térmica de esporos de C. difficile ............................ 57

4.4.1. Preparo de caldo de carne..................................................................... 57

4.4.2. Resistência térmica de C. difficile .......................................................... 58

4.4.3. Determinação dos parâmetros cinéticos de destruição térmica de C.

difficile ............................................................................................................... 59

4.4.4. Avaliação da resistência térmica a 72°C em diferentes concentrações de

sais e de nitrito de sódio ..................................................................................... 59

5. Resultados e Discussão ..................................................................................... 62

5.1. Detecção de C. difficile em produtos cárneos processados ........................... 62

5.2. Crescimento do C. difficile em presença de nitrito de sódio ........................... 64

5.3. Determinação dos parâmetros de resistência térmica de esporos de C.

difficile .................................................................................................................... 66

5.3.1. Determinação dos parâmetros D e z ..................................................... 66

5.3.2. Avaliação da influência das concentrações de NaCl e NaNO2 na

resistência térmica de C. difficile a 72°C ............................................................ 74

6. Conclusão .......................................................................................................... 81

7. Referências ........................................................................................................ 82

8. Apêndices ........................................................................................................ 119

A. δ72°C observados e δ72°C preditos ................................................................... 119

14

1. Introdução Geral

A carne e os produtos cárneos são gêneros alimentícios de grande interesse

econômico. A carne desempenha um papel crucial na evolução humana e é um

importante componente de uma dieta saudável e bem equilibrada devido à sua

riqueza nutricional. O mérito nutricional da carne é função da sua composição de

proteína de alto valor biológico, que contém todos os aminoácidos essenciais, bem

como minerais biodisponíveis, vitaminas e micronutrientes como ferro, selênio, zinco

e vitamina B12 (LEDESMA; RENDUELES; DÍAZ, 2016).

Os produtos cárneos emulsionados são muito populares e consumidos tanto

em nível doméstico como no mercado de alimentação rápida (BETANHO;

SHIMOKOMAKI; OLIVO, 1994; JIMENEZ-COLMENERO; CARBALLO; COFRADES,

2001). O consumo de produtos de origem animal, incluindo a carne e os produtos

cárneos, tem expandido globalmente com o aumento da renda familiar. Em paralelo,

a demanda por produtos seguros e de alta qualidade também cresceu com os novos

conceitos de produto natural e produto rótulo limpo (ALAHAKOON et al., 2015).

Por outro lado, muitas pessoas acreditam que o consumo de carne e de

produtos cárneos não é saudável porque o alto conteúdo de gordura, colesterol e

antimicrobianos pode estar associado com o desenvolvimento de doenças

degenerativas (SERRANO et al., 2007).

O sal tem sido utilizado desde os tempos antigos para preservação de

produtos cárneos e constitui-se em um excelente realçador de sabor e aroma, além

de ser o responsável pela textura característica dos produtos emulsionados, devido

à extração das proteínas miofibrilares, que contribuem efetivamente para o aumento

da capacidade de retenção de água, formação de gel e emulsão, bem como ligação

de gordura na matriz cominuída e estabilizada após o cozimento. Assim, quanto

maior a extração das proteínas miofibrilares, mais fácil é a incorporação de gordura

nas massas, formando uma emulsão mais estável (TERRELL, 1983).

O consumo de sódio na maioria dos países excede a recomendação

nutricional, o que preocupa as agências de saúde pública em todo o mundo devido à

associação entre a elevada ingestão de sódio e o desenvolvimento de inúmeras

doenças, principalmente a hipertensão (DAHL, 1972; FRIES, 1976; LAW; FROST;

15

WALD, 1991a; 1991b; 1991c; ADROGUÉ; MADIAS, 2007). A hipertensão, por sua

vez, é considerada fator de risco para doenças cardíacas, doenças renais e acidente

vascular cerebral (LEWINGTON et al., 2002).

Uma das maiores fontes de sódio na dieta é proveniente do cloreto de sódio

que, por sua vez, é amplamente utilizado em produtos cárneos industrializados

(WHO, 2003; ALIÑO et al., 2010) devido aos seus benefícios tecnológicos e as suas

propriedades em conferir sabor, textura e extensão da vida útil (ARMENTEROS et

al., 2012; SOFOS, 1983; TERRELL, 1983).

Por outro lado, a qualidade microbiológica dos produtos cárneos está

associada às Boas Práticas de Fabricação, como o uso de matéria-prima de

qualidade e condições adequadas de processamento.

Neste sentido, estudos têm demonstrado que alguns animais são portadores

assintomáticos de C. difficile, assim a transmissão por meio de alimentos de origem

animal é considerada como uma potencial fonte de contaminação (HENSGENS et

al., 2012). O C. difficile já foi isolado a partir de bezerros (KEEL et al., 2007), cavalos

(BÅVERUD et al., 2003), porcos (AL SAIF, BRAZIER, 1996; COSTA et al., 2013;

KEEL et al., 2007), aves (ZIDARIC et al., 2008), avestruzes (FRAZIER et al., 1993),

entre outros.

C. difficile é um bactéria Gram-positiva, anaeróbia, produtora de esporos e

toxinas. As toxinas produzidas pelo C. difficile causam diarreia, podendo evoluir para

colite pseudomembranosa levando à dilatação de cólon, sepse e até morte. Este

agente é uma das principais causas de diarreia associada ao tratamento prévio com

antibióticos (CURRY, 2010).

A microbiota intestinal, tanto do homem como dos animais, quando íntegra,

impede a colonização pelo C. difficile. Todavia, os antibióticos constituem o principal

fator de alteração da microbiota, provocando a sua substituição por micro-

organismos resistentes aos antimicrobianos em uso, os quais proliferam e podem

provocar quadros patológicos diversos (CARRICO et al., 2008).

Houve duas principais mudanças na epidemiologia da CDI ao longo dos

últimos anos. A primeira foi um aumento na incidência e severidade de CDI

associado ao tratamento hospitalar, com muitos surtos, altas taxas de mortalidade e

pior resposta ao tratamento. Isto foi em grande parte atribuída ao surgimento e

disseminação do ribotipo NAP1/027, mas outros fatores, como o aumento no uso de

16

fluoroquinolonas, também podem estar envolvidos. A segunda mudança tem sido o

crescente aparecimento da doença na comunidade, o que inclui indivíduos jovens e

pessoas tradicionalmente consideradas de baixo risco (DUPONT et al., 2008;

WEESE, 2010).

Várias pesquisas sobre C. difficile em alimentos estão sendo publicadas em

outros países, no entanto, no Brasil, ainda são escassos os trabalhos científicos

nesta área. Poucos trabalhos sobre a resistência térmica de C. difficile ou a

detecção do micro-organismo em alimentos processados foram encontrados na

literatura. Portanto, os objetivos deste trabalho foram determinar os parâmetros de

resistência térmica de C. difficile em caldo de carne, verificar sua ocorrência em

produtos cárneos e determinar o perfil toxigênico dos isolados.

2. Objetivos

Os objetivos desta pesquisa foram:

Determinar a ocorrência de C. difficile em produtos cárneos;

Determinar a influência de nitrito de sódio no crescimento de C.

difficile em meio de cultura;

Determinar os parâmetros de resistência térmica (D e z) do C. difficile

em caldo de carne a 72°C, 77°C e 82°C;

Determinar o efeito da concentração de nitrito de sódio e sais

substitutos ao cloreto de sódio na resistência térmica do C. difficile

em caldo de carne, pH 5,3, a 72°C.

17

3. Revisão Bibliográfica

3.1. Produção de carnes no Brasil

Preve-se que a produção global de carne bovina irá crescer 1% em 2019,

atingindo aproximadamente 63,6 milhões de toneladas (USDA, 2018).

O Brasil é um grande produtor mundial de proteína animal e tem no mercado

interno o principal destino de sua produção. Em 2016, a produção brasileira de

carnes (bovina, suína e de aves) foi estimada em 26,35 milhões de toneladas

(EMBRAPA, 2017a). Já em relação à carne bovina, em 2015 o país se posicionou

com o maior rebanho de gado bovino (209 milhões de cabeças), o segundo maior

consumidor (38,6 kg/habitante/ano) e o segundo maior exportador (1,9 milhões

toneladas), sendo que 80% da carne bovina consumida pelos brasileiros são

produzidas no próprio país (EMBRAPA, 2017b).

De acordo com as projeções do Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA), a produção de carne (bovina, suína e aves) deverá

aumentar em 12,6 milhões de toneladas até 2018/2019, o que corresponde a um

acréscimo de 51% em relação à produção de carnes de 2008 (MAPA, 2016b).

Por outro lado, o consumo de carne e de produtos cárneos tem sido

associado ao aumento dos riscos de desenvolvimento de doenças crônicas, como

obesidade, câncer e acidente vascular cerebral. As mudanças nas exigências dos

consumidores e a crescente concorrência tem impulsionado a busca de novos

ingredientes e novas tecnologias para processamento de produtos cárneos (WEISS

et al., 2010).

No que diz respeito aos suínos, o uso de alimentação controlada, à base de

ração de milho e farelo de soja, junto com o bom manejo, permitem que a produção

alcance ótimo níveis zootécnicos e de conversão alimentar. A adoção desses

métodos em conjunto com a evolução genética permitiu a redução de gordura da

carne em 31%, bem como do colesterol (10%) e das calorias (14%) (MAPA, 2016a).

18

3.1.1. Cloreto de sódio na dieta e nos produtos cárneos

A ingestão de sódio em todo o mundo está acima da necessidade fisiológica,

que é de 230 a 460 mg/dia. A maioria da população adulta tem ingestão média de

sódio maior que 2.300 mg/dia e para muitos, principalmente em países asiáticos, a

ingestão é maior que 4.600 mg/dia (BROWN, 2009).

De acordo com dados publicados pela WHO (2007; 2010), a ingestão de

sódio nos Estados Unidos foi estimada em 3.466 mg/dia e no noroeste do Japão em

torno de 10.600 mg/dia. No Canadá a estimativa foi de 3.500 mg/dia (PENZ;

JOFFRES; CAMPBELL, 2008). No Brasil, a partir dos dados da Pesquisa de

Orçamento Familiar de 2008/2009 (POF) realizada pelo Instituto Brasileiro de

Geografia e Estatística (IBGE, 2010), estima-se que a ingestão média de sódio é de

4.700 mg/dia por pessoa (equivalente a quase 12 g de sal). A maior parte do sódio

disponível para consumo foi proveniente do sal de cozinha e de condimentos a base

desse sal (76,2%). A fração proveniente de alimentos processados com adição de

sal representou 9,7% do total de sódio no quinto inferior da distribuição da renda per

capita e 25% no quinto superior (SARNO, 2010).

Em contrapartida, nos Estados Unidos a principal fonte de ingestão de sódio

são os alimentos processados, representando 77% (SEBASTIAN, 2013). Na França,

esse número chega a 80% (DELAHAYE, 2013) e no Reino Unido os produtos a base

de carne vem em segundo lugar como maior fonte do consumo diário de sódio, atrás

somente dos produtos a base de cereal, isto representa 980 mg/dia do consumo

total de 2.560 mg/dia (WHO, 2007). Já nos países asiáticos e em muitos países

africanos, o sal adicionado no preparo do alimento e presente em molhos e

temperos representa a principal fonte de sódio da dieta (IBRAHIN et al, 1995). De

acordo com a Avalição de Saúde e Nutricional Chinesa (Chinese Health and

Nutrition Survey) realizada em 2002, 72% da ingestão de sódio foi proveniente de

sal adicionado durante o preparo dos alimentos e 8% proveniente de molho de soja

(LI et al., 2005).

O consumo excessivo de sal pode levar ao aumento do volume de sangue,

causando pressão sobre os vasos, aumentando as chances de desenvolver

hipertensão arterial. Projeções indicam um aumento de 1,15 bilhões de hipertensos

19

em países em desenvolvimento até 2025. Existe uma variabilidade na prevalência

global de hipertensão, estando presente em 35% da população latino americana, 20

a 30% da população chinesa e indiana e 14% nos países da África (MITTAL;

SINGH, 2010). A alta ingestão de sódio ainda está relacionada com a formação de

cálculos renais (CIRILLO et al., 1994), câncer de estômago (TSUGANE et al., 2004),

asma (CAREY et al., 1993) e osteoporose (DEVINE et al., 1995; MARTINI et al.,

2000).

Evidências indicam que a redução do consumo de sódio diminui riscos de

doenças cardiovasculares (COOK et al., 2007; CHANG et al., 2006; PENZ;

JOFFRES; CAMPBELL, 2008). A ingestão diária de menos de 2 g de sódio é

benéfica para a pressão arterial e não apresenta efeito adverso significativo sobre os

lipídios do sangue, os níveis de catecolaminas ou a função renal (BROWN, 2009).

A OMS recomenda que sejam consumidos no máximo 2.000 mg de sódio/dia

por pessoa, o equivalente a 5.000 mg de cloreto de sódio (WHO, 2012).

Entre todas as categorias de alimentos industrializados, os produtos cárneos

contribuem com aproximadamente 16-25% do consumo total de sódio recomendado

(WHO, 2003).

Trinta e duas iniciativas para redução do consumo de sal em diferentes

países foram identificadas, sendo a maior parte na Europa (19 países). A maioria

dos países possuem metas de consumo de sal variando de 5.000 a 8.000 mg/dia.

Vinte e seis dessas estratégias foram conduzidas pelo governo, cinco por

organizações não governamentais e uma por indústria. Essas estratégias incluíram

reformulação de alimentos, iniciativas de sensibilização dos consumidores e ações

de rotulagem (WEBSTER et al., 2011).

A Finlândia representa um dos melhores exemplos de campanhas de redução

de sódio a nível mundial. Na década de 70, os trabalhos foram iniciados com

regulamentação das indústrias de alimentos, educação dos consumidores,

reformulação de produtos, rotulagem e ações voluntárias das indústrias de

alimentos. Este esforço resultou na redução de 40% do consumo de sódio, em 1972

o consumo era 5.600 mg/dia, já em 2002 era 3.200 mg/dia (APPEL et al., 2012;

KARPPANEN; MERVAALA, 2006).

No Canadá, a indústria tem reformulado produtos para redução de sódio. O

chamado “Sodium Working Group” foi formado pelo governo em 2007 com apoio dos

20

setores alimentícios e da saúde para supervisionar a redução de sódio na dieta de

acordo com a Referência Dietética de Ingestão Americana e Canadense “Canadian

and American Dietary Reference Intakes” (MOHAN; CAMPBELL; WILLIS, 2009). Em

2010 o grupo publicou o relatório “Estratégias para Redução de Sódio no Canadá”

(Sodium Reduction Strategy for Canada), que inclui 33 recomendações. O objetivo é

reduzir o consumo de sódio na população de uma média de 3.400 mg/dia para 2.300

mg/dia em 2016, com novas metas para redução posterior. É ainda recomendado

que seja considerado como ingestão adequada 1.500 mg/dia para a idade adulta,

com níveis mais baixos para outras faixas etárias (CAMPBELL; STRANG; YOUNG,

2011).

Na França, as estratégias para redução no consumo de sódio, iniciaram em

2004, com colaboração das indústrias. Foram realizadas reformulações de produtos

e desenvolvimento de rotulagens opcionais para teor de sódio, porém sem uma

regulamentação.

Todavia, não ocorreram muitas mudanças para a indústria alimentícia, exceto

para o setor de panificação (WHO, 2007).

Lançada em 2003, a campanha de redução da ingestão de sódio no Reino

Unido teve como objetivo reduzir o consumo de sal de 9.500 mg/dia para 6.000

mg/dia, equivalente a uma redução no consumo de sódio de 3.700 para 2.400

mg/dia através da reformulação de alimentos processados, campanhas de

sensibilização dos consumidores e melhoria das informações nutricionais nas

embalagens (APPEL et al., 2012; INSTITUTE OF MEDICINE, 2004). A experiência

do Reino Unido também destaca a importância de organizações não

governamentais (ONGs) na formação de políticas, como por exemplo, o Consensus

Action on Salt and Health, uma ONG composta por peritos científicos formada em

1996, com o intuito de aumentar a consciência sobre os perigos da ingestão

excessiva de sal. Seus esforços têm sido fundamentais para convencer tanto o

governo quanto as indústrias de alimentos para prosseguir com a redução do sal

(HE; MACGREGOR, 2009).

Nos Estados Unidos, no período entre 2001/2002 a 2005 houve um aumento

no consumo de sódio de 3.329 mg/dia para 3.436 mg/dia (MOHAN; CAMPBELL,

WILLIS, 2009). Os governos estaduais e municipais estão desenvolvendo iniciativas

para reduzir o consumo de sódio na população e a nível federal o programa Pessoas

21

Saudáveis 2020 (Health People 2020). O Instituto de Medicina do Canadá e dos

Estados Unidos estabeleceu um nível tolerável de ingestão de 2.300 mg/dia para

adultos (HE; MACGREGOR, 2009; INSTITUTE OF MEDICINE, 2004).

Desde 2010, o governo brasileiro promove, por meio do Ministério da Saúde,

discussões com instituições e organizações envolvidas direta e indiretamente com a

redução do consumo de sódio. Em relação aos alimentos processados, estabeleceu-

se em 2007, um termo de cooperação entre o Ministério da Saúde e a Associação

Brasileira das Indústrias de Alimentação (ABIA), principal associação representativa

do setor produtivo no Brasil, com o objetivo de trabalhar propostas para a

reformulação desses alimentos (NILSON; JAIME; RESENDE, 2012). De acordo com

a RDC nº 360 de 2003, da Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA), o valor diário

de referência (VDR) adotado para o sódio é de 2.400 mg (BRASIL, 2003).

Um dos principais desafios na redução de sódio, para a indústria de

alimentos, esbarra no aspecto econômico, visto que o cloreto de sódio é um dos

ingredientes mais baratos utilizados no processamento de produtos cárneos e é o

responsável por auxiliar o desenvolvimento das propriedades funcionais, sensoriais

e de conservação nos produtos (DESMOND, 2006).

A maioria dos produtos cárneos processados e emulsionados contêm

quantidades variadas de sal e são associados como produtos com alto conteúdo de

sódio. A principal fonte do sódio é o NaCl, porém outros ingredientes utilizados

também afetam o conteúdo final de sódio nesses produtos, tais como: tripolifosfato

de sódio, nitrato de sódio, eritorbato ou ascorbato de sódio, nitrito de sódio e

glutamato monossódico (MAURER, 1983).

A Pesquisa de Orçamento Familiar (POF) 2008/2009 apresentou tabelas de

composição nutricional de alimentos consumidos no Brasil, nas quais os teores de

sódio para salsicha foram de 1.74,71 mg/100 g, salsicha light 1.257 mg/100 g,

mortadela 930 mg/100 g e mortadela light 716 mg/100 g (IBGE, 2010).

Paes et al. (2011) avaliaram nove marcas de salsichas embaladas à vácuo do

mercado brasileiro, foram encontrados os seguintes teores de sódio 745 mg/100 g,

900 mg/100 g, 870 mg/100 g, 1.010 mg/100 g, 1.100 mg/100 g e 1.355 mg/100 g.

Sais clorados (KCl, MgCl2 e CaCl2), fosfatos e sais orgânicos, são

apresentadas como alternativas para uma substituição parcial de NaCl e,

22

consequentemente uma redução de sódio na elaboração de produtos processados

(RUUSSUNEN, POULANNE, 2005).

O KCl exerce um efeito de percepção de gosto salgado semelhante ao NaCl,

enquanto MgCl2 e CaCl2 exercem um efeito de percepção de gosto salgado menor.

Porém, efeitos sensoriais indesejáveis como sabor amargo e metálico são

percebidos quando esses sais substitutos são utilizados (PÉREZ-JUAN; FLORES;

TOLDRÁ, 2007).

O cloreto de potássio é o substituto do sal mais utilizado em alimentos com

baixo ou reduzido teor de sal/sódio. Entretanto, a substituição de cloreto de sódio

por cloreto do potássio superior a 50% resulta em gosto amargo e na perda do gosto

salino (DESMOND, 2006). Diversas pesquisas atuais concentram-se em minimizar

os gostos amargo e metálico por meio do uso combinado de cloreto de potássio com

outros sais supressores do gosto amargo (como glutamato monossódico, sulfato de

magnésio e aminoácidos) (KILCAST; DEN RIDDER, 2007).

A redução do teor de sal sem utilização de algum sal substituto pode resultar

em um sabor brando indesejável e uma significativa perda de outros atributos, tais

como vida útil, textura ou retenção de água. O uso de mistura de sais ou cloreto de

potássio ajuda a manter a força iônica que exerce importante efeito funcional nos

produtos cárneos (TERRELL, 1983).

A substituição de aproximadamente 35% de NaCl (2,5%) por cloreto de

potássio (KCl) ou cloreto de magnésio (MgCl2) em salsichas de carne suína ou peru,

não apresentou alteração da aceitabilidade global do produto recém produzido, com

decréscimo na aceitação global após 6 semanas de armazenamento refrigerado

(HAND, TERRELL, SMITH, 1982).

Bidlas e Lambert (2008) avaliaram a capacidade de cloreto de potássio em

substituir o NaCl como um agente conservante. Neste estudo, foi verificado que o

KCl em uma substituição molar direta de 1:1, possui efeito conservante similar ao sal

comum.

Horita et al. (2011) testaram diferentes concentrações e combinações de

NaCl, KCl, MgCl2 e CaCl2 em mortadelas com teor reduzido de gordura. A

substituição de 50% de NaCl por KCl, não apresentou diferença significativa em

relação a proposta com 2% de NaCl. Além disso, a substituição do cloreto de sódio

por outros sais não comprometeu a estabilidade microbiológica em até 45 dias de

23

prateleira, especialmente com relação ao crescimento de micro-organismos

psicrotróficos.

Pesquisas tem demonstrado que o aumento na ingestão de potássio, que

proporcionalmente eleva o nível de potássio plasmático, inversamente se associa à

diminuição da pressão sanguínea e à diminuição da mortalidade por acidente

vascular cerebral e por doenças cardíacas (WHELTON, 1997; 1999).

3.1.2. Nitrito de sódio nos produtos cárneos

Nitratos e nitritos são aditivos alimentares, classificados como conservantes

de acordo com a Legislação Brasileira de Alimentos, ou seja, são substâncias

adicionadas aos alimentos que visam evitar sua deterioração (BRASIL, 1998). Além

do papel de conservante, os nitritos são utilizados no processo de cura de produtos

cárneos para retardar o processo de oxidação dos lipídios evitando a rancidez e a

formação de off-flavor, fixar e desenvolver cor pela formação de nitrosomioglobina,

pigmento de coloração rósea (ALMUDENA; LIZANO, 2001; PETENUCI et al., 2004).

O termo “curado” relativo a produtos cárneos processados é entendido

universalmente como a adição de nitrito ou nitrato juntamente com sais e outros

ingredientes à carne para melhorar a preservação (PEGG; SHAHIDI, 2000). Para

produtos curados, o nitrito é um ingrediente único e diferencial, para o qual não há

substituto capaz de prover as características desejadas nos produtos como salsicha,

mortadela, bacon e presunto (SEBRANEK; BACUS, 2007).

O nitrito de sódio também é considerado um dos ingredientes essenciais na

fabricação de produtos cárneos devido à inibição do crescimento de Clostridium

botulinum (WEISS et al., 2010).

Além disso, a concentração de nitrito em produtos cárneos curados diminui

durante o processo de produção e a vida de prateleira. Pardi et al. (1994) estima que

50% do nitrito adicionado é perdido em 24 horas e menos de 10% permanece após

7 dias.

Apesar dos benefícios tecnológicos, a redução da utilização de nitritos tornou-

se fundamental para a indústria pelo efeito tóxico do excesso de nitrito na dieta, com

24

a formação endógena de nitrosaminas que apresentam efeito cancerígeno

(JAKSZYN; GONZALEZ, 2006).

A ingestão diária elevada de íons nitrito a partir de alimentos e água ocasiona

acúmulo desses íons no sistema digestório, ocorrendo absorção e consequente

entrada na corrente sanguínea. Estes íons podem agir sobre a hemoglobina,

originando a metahemoglobina, a qual não transporta o oxigênio, limitando a

capacidade do sangue de carregar oxigênio para os tecidos (YUE; SONG, 2006).

Nos Estados Unidos, é proibida a adição direta de nitrito ou nitrato em

produtos cárneos naturais e processados orgânicos (USDA, 2005; USA, 2016). A

estratégia utilizada pela indústria foi adicioná-los indiretamente por meio de

ingredientes que em sua composição possuam alto teor nitrato, como sal marinho,

condimentos e aromatizantes naturais. Outra alternativa é utilizar sucos

concentrados ou o pó de vegetais vastamente conhecidos como fonte de nitrato,

com concentração entre 1.500 e 2.800 ppm, como o aipo, a alface e a beterraba

(SEBRANEK; BACUS, 2007).

A legislação vigente no Brasil estabelece como quantidade residual máxima

para nitritos e nitratos, respectivamente, 150 mg/kg e 300 mg/kg (BRASIL, 1998).

Em uma pesquisa realizada em Recife sobre o teor residual de nitrito e nitrato

de sódio em 54 amostras de salsichas tipo hot dog foi constatado que 56% das

amostras estavam em desacordo com o limite máximo especificado para nitrato na

legislação (300 mg/kg). Em relação ao nitrito, foi verificado que 18% das amostras

apresentaram valores acima de 150 mg/kg (MELO FILHO; BISCONTINI; ANDRADE,

2004).

Já em Salvador, foi verificado que 44,44% das amostras de salsichas (5/11

salsichas de ave e 7/16 salsichas de carne suína e bovina com ave) apresentaram

teor de nitrito acima de 150 mg/kg (ANDRADE; TRIGUEIRO, 2008).

Oliveira et al. (2017) analisaram a concentração de nitrito de sódio de 270

amostras de embutidos (salsicha, mortadela e linguiça frescal) de três diferentes

marcas, obtidas no comércio de Avaré - SP e região. Entre esses produtos, a

concentrações médias de nitrito variaram de 29,25 a 249,80 ppm. As amostras de

linguiça das marcas A e C apresentaram um teor de nitrito superior a 150 ppm.

25

3.2. Clostridium difficile

O C. difficile é uma bactéria anaeróbia estrita, heterotrófica (YUILLE et al.

2015) e mesófila que pode ser encontrada no solo, na água e no trato digestório de

mamíferos (BAUER; KUIJPER, 2015; LAWSON et al., 2016). As colônias de C.

difficile em meio ágar C. difficile moxalactan norfloxacina (CDMNA) apresentam

coloração acinzentada ou branca, opacas, chatas ou pouco convexas, rizoídes ou

circulares e de tamanho variando de 2 - 5 mm (GEORGE et al., 1979) e odor

característico de esterco de cavalo (DELMÉE, 2001). Os esporos são ovais,

subterminais e intumescidos (LAWSON et al., 2016).

Filogeneticamente, o C. difficile pertence à família Peptostreptococcaceae

(LUDWIG et al., 2009). O gênero Clostridium é dividido em clusters baseados em

análise de 16S rDNA, o C. difficile pertence ao grupo XI, outras espécies

pertencentes a este cluster são o C. sordellii e C. bifermentans, Peptostreptococcus

anaerobius e Eubacterium tenue (COLLINS et al., 1994).

Yutin e Galperin (2013) sugeriram a reclassificação de C. difficile para

Peptoclostridium difficile. Recentemente o C. difficile foi rebatizado como

Clostridioides difficile (LAWSON et al.,2016).

Em 2013, o odor característico do micro-organismo possibilitou a identificação

da infecção em pessoas por um cachorro durante um surto da doença num hospital

em Amsterdã. O cão foi treinado para sentar ou deitar quando identificasse à

presença do odor específico do C. difficile, a análise pelo cão consistiu em andar

entre as camas dos pacientes na ala do hospital. O cachorro realizou 651 análises,

envolvendo 371 pacientes, foram identificados corretamente 12 dos 14 casos de CDI

(sensibilidade 86%) e 346 dos 357 participantes CDI negativos (especificidade de

97%) (BOMERS et al., 2014).

O micro-organismo foi descrito em 1935 por Hall e O‟Toole, isolado das fezes

de neonatos sadios, nascidos em Denver. Inicialmente foi denominado de Bacillus

difficilis devido à dificuldade em isolar e manter o micro-organismo em cultura pura.

Hall e O‟Toole observaram que a injeção da cultura líquida ou do filtrado do meio

que continha o C. difficile em animais experimentais apresentou efeito tóxico,

26

causando lesões, parada respiratória e morte (HALL; O‟TOOLE, 1935; LYERLY;

KRIVAN; WILKINS, 1988).

A colite associada ao tratamento com antibiótico foi observada pela primeira

vez em 1950, quando o uso crescente de cloranfenicol e tetraciclina foram

relacionados com o aumento da incidência de colite pseudomembranosa (PMC)

(GEORGE, 1984).

Na década de 1970, a PMC atingiu proporções epidêmicas, tornando-se uma

complicação comum ao uso de antibióticos. O tratamento com antibióticos foi

considerado o fator desencadeante da PMC, possivelmente pela eliminação das

bactérias entéricas, favorecendo o C. difficile (KELLY et al., 1994; LYERLY,

KRIVAN, WILKINS, 1988).

Todavia, somente em 1977 é que foi identificada nas fezes dos pacientes a

toxina que causava mudanças citopáticas nos tecidos (LARSON et al., 1977).

Bartlett et al. (1978) identificaram o C. difficile como o produtor desta toxina e o

agente etiológico da PMC associada ao tratamento com antibióticos.

Basicamente, qualquer antibiótico pode facilitar a infecção por C. difficile,

porém, os antibióticos de amplo espectro com atividade contra as bactérias entéricas

são os mais comuns (KELLY et al., 1994).

A infecção causada por C. difficile (CDI) varia desde diarreia autolimitada a

PMC, megacólon tóxico, sepse e morte (AMY; JOHANESEN; LYRAS, 2015;

RUPNIK; WILCOX; GERDING, 2009).

Os fatores de risco relacionados ao CDI incluem período longo de

hospitalização, exposição prolongada aos antibióticos, comorbidades subjacentes e

idade superior a 65 anos (BADGER et al., 2012).

Para o crescimento do micro-organismo, após a ingestão de esporos, é

essencial que a microbiota intestinal esteja desequilibrada, típica, mas não

exclusivamente por efeito de antibióticos (KELLY et al., 1994; MOORE et al., 2013;

SORG; SONENSHEIN, 2008). O tratamento com antibióticos é o fator de risco mais

importante por causar alteração da microbiota, favorecendo a colonização pelo C.

difficile e subsequente infecção (JOHNSON; GERDING, 1998). O desenvolvimento

da doença também esta associado à falha da resposta imunológica contra as toxinas

produzidas pelo C. difficile (SANCHEZ-HURTADO et al., 2008).

27

O micro-organismo é adquirido, em muitos casos, a partir de origem exógena:

de um indivíduo contaminado, de pessoas que cuidam do paciente ou indiretamente

a partir de ambiente contaminado (PAREDES-SABJA; SHEN; SORG, 2014).

A forma vegetativa de C. difficile é sensível à presença de oxigênio e resiste

por pouco tempo em condições aeróbias no ambiente. Já os esporos podem

permanecer viáveis por longos períodos e resistir a diversos tipos de desinfetantes,

favorecendo a contaminação ambiental, principalmente em hospitais (BUGGY;

WILSON; FEKETY, 1983).

Edwards et al. (2016) demonstraram que os esporos apresentam alta

resistência ao etanol, peróxido de hidrogênio e clorofórmio, enquanto células

vegetativas de C. difficile foram rapidamente destruídas por esses agentes.

Os esporos de C. difficile possuem ultraestrutura semelhante à dos esporos

de outras espécies do gênero Clostridium e Bacillus. Entretanto as análises por

microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelaram que a camada externa do

exósporo de esporos de C. difficile exibem várias características únicas (BARRA-

CARRASCO et al., 2013; GIL et al., 2017; PERMPOONPATTANA et al., 2011). O

exósporo da maioria dos isolados de C. difficile apresenta projeções semelhantes a

cabelo (Figura 1), similar ao exósporo de esporos de Bacillus cereus (PAREDES-

SABJA; SHEN; SORG, 2014).

Pesquisas indicam que as proteínas das camadas mais externas do exósporo

apresentam papel relevante nas interações entre o esporo e as células do

hospedeiro (BARRA-CARRASCO et al., 2013; PHETCHARABURANIN et al., 2014),

semelhante ao verificado aos esporos de B. cereus (STEWART, 2015).

Análises por MET de células Caco-2, modelo do adenocarcinoma de cólon

humano, demonstraram que as projeções semelhantes a cabelos presentes na

superfície dos esporos de C. difficile R20291 estavam próximas à membrana

plasmática e às microvilosidades das monocamadas indiferenciadas e diferenciadas

de células Caco-2, sugerindo que estas projeções do exósporo de C. difficile

favorecem a aproximação dos esporos e das células epiteliais do intestino (MORA-

URIBE et al., 2016).

Além disso, foi verificado que não há espaço entre o exósporo e a capa do

esporo, a camada mais externa do esporo está em contato direto com a capa do

esporo, de forma semelhante à camada mais externa de esporos de Bacillus subtilis

28

(BARRA-CARRASCO et al., 2013; PAREDES-SABJA; SHEN; SORG, 2014;

STEWART, 2015).

Díaz-González et al. (2015) identificaram 184 proteínas no exósporo de

esporos de C. difficile: 7 proteínas de revestimento da capa dos esporo/exósporo; 7

proteínas possivelmente envolvidas com a resistência dos esporos; 6 possivelmente

envolvidas na patogenicidade; 13 proteínas não caracterizadas e 146 proteínas

citosólicas. As camadas subjacentes do esporo de C. difficile são semelhantes aos

observados em outros esporos bacterianos (GIL et al., 2017).

Segundo Barra-Carrasco et al. (2013), a proteína rica em cisteína do

exósporo do C. difficile (CdeC - C. difficile exosporium cysteine - rich protein), é

essencial na morfogênese do exósporo, das projeções semelhantes a cabelo e na

resistência à agentes físicos e químicos. Nesta pesquisa foi verificado que os

esporos da cepa mutante de C. difficile, sem o gene responsável pela formação da

CdeC, apresentaram menor resistência ao etanol e ao calor, praticamente ausência

do exósporo e não foi observado projeções semelhantes a cabelo.

Figura 1. Ultraestrutura do esporo do C. difficile R20291, ribotipo 027, esta cepa

apresenta os genes tcdA, tcdB, cdtB e não possui o gene ctdA. O exósporo (Ex) e a

capa do esporo (Ct) estão identificados na figura (BARRA-CARRASCO et al., 2013).

A CDI é causada por toxinas produzidas durante a fase logarítmica de

crescimento das células vegetativas (RUPNIK; WILCOX; GERDING, 2009).

Os principais fatores de virulência do C. difficile são duas exotoxinas: a toxina

A (TcdA) e a toxina B (TcdB), formadas por monocadeias polipeptídicas de alto peso

molecular com múltiplos domínios e estruturas com funcionalidades distintas

(MONAGHAN, 2015). Além disso, algumas cepas de C. difficile produzem uma

29

toxina binária C. difficile transferase (CDT), associada a casos mais severos da

doença (SCHWAN et al., 2014).

Recentemente, a epidemiologia das infecções por C. difficile tem se tornado

complexa, com casos de CDI sendo observados na comunidade (FREEMAN et al.,

2010; GUPTA; KHANNA, 2014). Além do aumento na incidência de CDI, também

tem sido verificado aumento na gravidade da infecção, altas taxas de recorrência

sintomática e aumento significante nas taxas de mortalidade, ocorrendo em

populações antes consideradas de baixo risco, como pacientes jovens sem doença

prévia e mulheres peri-parto (FREEMAN et al., 2010; GAREY et al., 2008; YE et al.,

2016).

Um dos fatores relacionados com a crescente letalidade de CDI foi o

aparecimento de cepas hipervirulentas conhecidas como North American Pulsed

Field type 1 (NAP1), Endonuclease de Restrição (Restriction Endonuclease - REA)

tipo BI e a designação baseada na tipagem molecular por meio de ribotipagem 027

(NAP1/BI/027) (COHEN et al., 2010; FREEMAN et al., 2010; TO; NAPOLITANO,

2014).

As cepas hipervirulentas são caracterizadas pela produção significativamente

maior das toxinas TcdA e TcdB e pela sua resistência à fluoroquinolonas; muitas

vezes produzem mais esporos, em comparação com outras linhagens e sintetizam a

toxina binária CDT (SCHWAN et al., 2014).

O ribotipo 027 foi identificado pela primeira vez na província do Québec

(Canadá), em 2005, como causa de surtos hospitalares de infecção severa com alta

taxa de mortalidade (LOO et al., 2005).

O C. difficile é a principal causa de infecção nosocomial em países

desenvolvidos (ELLIOT et al., 2017). Nos Estados Unidos, a taxa de mortalidade por

CDI varia entre 5 e 10%, resultando em mais de 14.000 mortes por ano

(DUBBERKE; OLSEN, 2012; HONDA; DUBBERKE, 2014). O ônus econômico anual

é estimado em 5,4 bilhões de dólares, dos quais 4,7 bilhões de dólares

correspondem aos custos para o sistema de saúde e 725 milhões de dólares

correspondem aos gastos comunitários indiretos (DESAI et al., 2016).

A incidência de CDI aumentou substancialmente nos últimos anos (Figura 2).

De acordo com os dados do Projeto de Custo e Utilização do Sistema de Saúde

(Healthcare Cost and Utilization Project), a incidência de CDI nos Estados Unidos,

30

como qualquer tipo de diagnóstico, no ano 2000 foi 134.518 casos, já em 2014 foi

361.945 casos (HCUP, 2017).

Figura 2. Casos de CDI nos Estados Unidos (Adaptado de HCUP, 2017).

A CDI adquirida na comunidade corresponde a um quarto de todos os

pacientes diagnosticados com CDI (KARLSTROM et al., 1998; KHANNA et al., 2012;

NOREN et al., 2004).

Estudos recentes indicam que, após admissão em hospitais, é estimado que

8% das pessoas tornam-se portadores assintomáticos de cepas toxigênicas de C.

difficile e, para estes o risco de desenvolvimento de CDI é maior quando comparado

com pacientes não portadores do micro-organismo (ZACHARIOUDAKIS et al.,

2015).

Várias pessoas que tiveram o trato digestório colonizado por cepas

toxigênicas de C. difficile tornaram-se portadores assintomáticos (KYNE et al., 2000;

LOO et al., 2011; MCFARLAND et al., 1986; SHIM et al., 1998). Todavia, o papel

desempenhado por portadores assintomáticos na transmissão de CDI ainda não foi

determinado (DONSKEY; KUNDRAPU; DESHPANDE, 2015).

3.2.1. Patogenicidade de C. difficile

As toxinas TcdA e TcdB entram nas células por endocitose mediada por

receptor (PAPATHEODOROU et al., 2010).

050.000

100.000150.000200.000250.000300.000350.000400.000

20

00

20

01

20

02

20

03

20

04

20

05

20

06

20

07

20

08

20

09

20

10

20

11

20

12

20

13

20

14

N° d

e c

aso

s d

e C

DI

(EU

A)

Ano

31

Ambas as toxinas TcdA e TcdB são glicosiltransferases (GTPAses) que

inativam as GTPases da célula hospedeira, causando ruptura do citoesqueleto de

actina, o que resulta em apoptose. Isto produz a perda da barreira epitelial intestinal

pela abertura das junções entre as células, aumentando a permeabilidade intestinal

e o acúmulo de fluidos, seguido pelo aparecimento de diarreia (JANK; AKTORIES,

2008; VOTH; BALLARD, 2005).

As toxinas TcdA e TcdB também induzem a liberação de citocinas que

conduzem à ativação de neutrófilos, mastócitos, nervos entéricos e neurônios

sensoriais dentro da lâmina própria do intestino. Estes, por sua vez, induzem a

liberação de neuropeptídeos e citocinas pró-inflamatórias que resultam na resposta

inflamatória e a formação de pseudomembrana (SHEN, 2012; SUN; HIROTA, 2015).

A importância das toxinas A e B para a patogenicidade da CDI tem causado

polêmica. Antigamente, acreditava-se que a toxina A era o principal fator de

virulência no CDI, contudo estudos recentes utilizando cepas mutantes de C. difficile

(produzindo apenas a toxina A ou B) mostraram que somente a TcdB é essencial

para a virulência (LYRAS et al., 2009).

Já em estudos posteriores, com modelos de infecção em hamster e cepas

mutantes de C. difficile, foi observado que tanto as cepas TcdA-/TcdB+ como as

cepas TcdA+/TcdB- foram capazes de causar a doença (KUEHNE et al., 2010;

KUEHNE; CARTMAN; MINTON, 2011).

Além da cepa hipervirulenta NAP1/BI/027, outras cepas emergentes de

ribotipo 017 e 078 estão sendo associadas a casos graves da doença na Ásia e

Europa (BOUILLAUT; SELF; SONENSHEIN, 2013; DRUDY et al., 2007; KIM et al.,

2008).

A toxina CDT é composta por duas cadeias: uma molécula apresenta

atividade de ADP-ribosiltransferase (CDTa) e o segundo componente (CDTb) está

envolvido na ligação da toxina às células do hospedeiro e é responsável pela

translocação da enzima para o citosol. A CDT age sobre G-actina inibindo a

polimerização da actina, o que facilita a colonização por indução da formação de

saliências de células (GERDING et al., 2014).

As cepas que produzem CDT, na ausência de TcdA e TcdB, foram

observadas em casos de CDI em indivíduos imunocomprometidos (ANDROGA et al.,

2015; ECKERT et al., 2015; GRANDESSO et al., 2016).

32

Além desses fatores, o C. difficile é capaz de formar um biofilme sobre

superfície abiótica, mas a robustez do biofilme formado varia entre linhagens. As

células bacterianas são incorporadas numa matriz composta de DNA, proteínas e

polissacarídeos, incluindo várias proteínas da parede celular e toxinas (TcdA)

(JANOIR, 2016; PANTALÉON et al., 2015; SEMENYUK et al., 2014). A formação de

biofilme por C. difficile é modulada por reguladores centrais (Spo0A e LuxS), e por

componentes de superfície tais como os flagelos e cisteína protease Cwp84

(DAWSON et al., 2012; PANTALÉON et al., 2015).

Existem fortes evidências sobre a capacidade de C. difficile formar biofilme in

vivo. Em um estudo com ratos foi observado que as células de C. difficile formaram

aglomerados em associação ao tecido danificado, o que poderia sugerir a formação

de microcolônias (LAWLEY et al., 2009). Pesquisas demonstram que células de C.

difficile alocam-se em comunidades multicelulares em associação com a mucosa do

hospedeiro (SEMENYUK et al., 2015). Sabe-se que os biofilmes contribuem com a

resistência aos antibióticos de C. difficile, bem como com o estresse de oxigênio

(DAWSON et al., 2012; SEMENYUK et al., 2014) e em promover a persistência de

esporos resistentes (CROWTHER et al., 2014). No entanto, torna-se necessário

definir mais precisamente o papel da formação de biofilme em CDI e suas

recorrências.

Os genes tcdA e tcdB que codificam, respectivamente, as toxinas TcdA e

TcdB estão no lócus de patogenicidade (Pathogenicity locus - PaLoc), fragmento de

19,6 kb (BRAUN et al., 1996). Também estão codificados no PaLoc três genes

acessórios: tcdR, regulador positivo; tcdC, regulador negativo e tcdE, gene que

codifica uma proteína similar a holina (HUNDSBERGER et al., 1997), requerido para

liberação de toxina (GOVIND; DUPUY, 2012) (Figura 3). Em cepas não toxigênicas,

o PaLoc é substituído por um fragmento de 115/85 pb (BRAUN et al., 1996; DINGLE

et al., 2014).

Quanto à toxina CDT, os genes cdtA e cdtB codificam, respectivamente os

componentes CDTa e CDTb, situados numa região cromossômica de 6,2 kb,

conhecido como CdtLoc. Também está presente o gene cdtR, regulador requerido

para expressão (CARTER et al., 2007). Nas cepas que não produzem a toxina

binária, essa região é substituída por uma sequência de 68 pb (CARTER et al.,

33

2007). O cdtR também mostrou regular a produção das toxinas A e B em algumas

cepas (LYON et al., 2016).

Figura 3. A: PaLoc- tcdR, tcdB, tcdE, tcdA e tcdC. B: Genes codificadores da toxina

binária - cdtR, cdtA e cdtB (Adaptado de ELLIOTT et al., 2017).

A identificação por PCR-ribotipagem é um dos métodos utilizados para

caracterizar os isolados de C. difficile (Tabela 1). Já a classificação do perfil

toxigênico das cepas de C. difficile é baseada na variabilidade da região

cromossômica que codifica as toxinas TcdA e TcdB (PaLoc), em relação a cepa de

referência VPI 10463. Cada tipo toxigênico possui cepas com alterações idênticas

nesta região do PaLoc. Atualmente são conhecidos 34 tipos toxigênicos, sendo que

a cepa VPI 10463 pertence ao tipo 0 (RUPNIK; JANEZIC, 2016).

A compreensão das alterações nos genes tcdA e tcdB e, consequentemente

das propriedades funcionais das variantes das TcdA e TcdB, é fundamental em

estudos epidemiológicos, em desenvolvimento de vacinas e no diagnóstico

molecular (DINGLE et al., 2014; LANIS et al., 2013; RUPNIK, 2008).

Existem várias razões pelas quais diferentes tipos toxigênicos podem se

correlacionar com as diferentes formas da doença, por exemplo, a produção de

toxinas com propriedades distintas. Já foi demonstrado para algumas linhagens que

as toxinas produzidas diferem nas propriedades catalíticas em relação à cepa VPI

10463 (CARMAN et al., 2011).

34

A heterogeneidade da sequência de aminoácidos nas toxinas resulta em

alterações na imunorreactividade, especificidade do substrato e efeito citopático

(RUPNIK, 2008).

Tabela 1. Classificação por tipo toxigênico e correlação com ribotipo.

Tipo TcdA TcdB CDT Ribotipo Cepa

0 + + - 087 VPI 10463 0/v + + + 131 597B I + + - 102 EX 623 II + + - 103 AC 008

IIIa + + + 080 SE 844 IIIb + + + 027 R 12087 IIIc + + + 251 CH6230 IIId + + + SLO 042 3073 IIIe + + + 251 AI 541 IV + + + 023 55767 V + + + 045 SE 881 VI + + + 127 51377 VII + + + 063 57267 VIII - + - 017 1470 IXa + + + 019 51680 IXb + + + 244 TFA/V20-1 IXc + + + 109 8785 IXd + + + SLO 228 1732874 Xa - + + 591 (CE) 8864 Xb - + + SLO 032 J9965 XIa - - + 033 IS 58 XIb - - + 288 (CE) R 11402 XIc - - + 033 OCD 5/2 XId - - + 153 (CE) TFA/V14-10 XII + + - 258 IS 25 XIII + + - 070 R 9367

XIVa + + + 111 R 10870 XIVb + + + 122 R 9385 XVI - + + 078 SUC36

XVIII + + - 014 K095 XIX + + - 018 TR13

35

Cont. Tabela 1.

Tipo TcdA TcdB CDT Ribotipo Cepa

XX + + - SLO 005 TR14 XXI + + - SLO 035 CH6223 XXII + + + 027 CD07-468 XXV + + + 027 7325 XXVI + + - 050 (CE) 7459 XXVII + + - SLO037 KK2443/2006 XXVIII + + + 126 CD08-070 XXIX + + - 001 CD07-140 XXX - + + SLO 101 ES 130 XXXI - + + SLO 098 WA 151 XXXII - + - 151 (CE) 173070 XXXIII + + - SLO 086 2402 XXXIV - + - SLO 201 CD10-055

Fonte: RUPNIK; JANEZIC (2016).

3.2.2. Ocorrência em alimentos

C. difficile tem sido isolado de diversos animais e de grande variedade de

alimentos, todavia faltam evidências para confirmar a hipótese de uma doença

transmitida por alimentos ou zoonose. A Tabela 2 mostra um resumo da detecção de

C. difficile em alimentos.

Provavelmente a primeira descrição de C. difficile em alimentos foi realizada

em 1996, por Broda e colaboradores. Nesse estudo o micro-organismo foi isolado de

amostras deterioradas de carne embalada a vácuo.

Em Glasgow (Escócia), das 40 amostras analisadas de saladas prontas para

consumo, em 3 (7,5%) foi observado à presença de C. difficile. Dois isolados foram

identificados como ribotipo 017 (toxina A-/B+) e o outro isolado foi identificado como

ribotipo 001 (BAKRI et al., 2009).

No Irã, esporos de C. difficile foram detectados em 1,36% (5/368) das

amostras de alimentos prontos para o consumo. A maior prevalência foi observada

em amostras de salada (4,29%), seguido pelo iogurte árabe (2%) (RAHIMI; AFZALI;

BAGHBADORANI, 2015). Já para as carnes, a maior incidência de C. difficile foi

encontrada em carne de búfalo (9%), carne caprina (3,3%), carne bovina de gado de

36

corte jovem (1,7%), carne bovina de gado leiteiro adulto (0,94%) e carne ovina

(0,9%) (RAHIMI; JALALI; WEESE, 2014).

Em uma casa de repouso na Bélgica foram coletadas amostras de 246

superfícies do ambiente e 188 amostras de alimentos. O C. difficile foi detectado em

uma amostra (0,53%) de uma a refeição composta por linguiça de porco, molho de

mostarda e salada de cenoura, preparada na cantina da casa de repouso. O isolado

foi identificado como ribotipo 078 (RODRIGUEZ et al., 2015).

Um estudo realizado com 40 amostras obtidas em 5 pontos de venda no

Texas (Estados Unidos da América - EUA) detectou C. difficile em 3 amostras

(7,5%): uma amostra de carne suína moída, uma amostra de chouriço de porco e

uma amostra de carne de peru moída (HARVEY et al., 2011).

Mooyottu et al. (2015) analisaram 300 amostras de carne (100 amostras de

carne suína, 100 amostras de carne bovina moída e 100 amostras de carne de

frango), obtidas a partir de mercearias geograficamente distantes em Connecticut

(EUA). O C. difficile foi observado em 2% das amostras de carne suína.

Em outra pesquisa realizada na Bélgica, o C. difficile foi identificado em 2,3%

(3/133) das amostras de carne bovina (duas amostras de hambúrguer e uma

amostra de carne moída) e em 4,7% (5/107) das amostras de carne suína (duas

amostras de carne suína moída, duas amostras de linguiça suína e uma amostra de

linguiça fresca chipolata) (RODRIGUEZ et al., 2014).

Em Costa do Marfim, Kouassi et al. (2014) analisaram 172 amostras de rim

bovino cozido e 223 amostras de carne bovina cozida adquiridas de vendedores

ambulantes entre 2009 e 2010. Foi verificada a incidência de 12,4% de C. difficile

nas amostras (11,04% em rim e 13,45% em carne).

Em Ontário (Canadá), o C. difficile ribotipo 078 foi detectado em 12,8%

(26/203) das amostras de carne de frango (sobrecoxa, coxa e asa) adquiridos em

pontos de venda. Em relação aos cortes de carne, foram positivas 9% (10/111) das

amostras de coxa, 18% (13/72) das amostras de asas e 15% (3/20) das amostras de

sobrecoxa (WEESE et al., 2010).

Na Austrália, um estudo analisou raízes vegetais de cultivo orgânico e

tradicional (batata, beterraba, cebola e cenoura), foi observada a incidência de

contaminação por C. difficile de 30% (30/100) das amostras. Apresentaram resultado

positivo para C. difficile 55,6% das amostras de batata orgânica, 50% das amostras

37

de batata de cultivo convencional, 22,2% das amostras de beterraba orgânica, 5,6%

das amostras de cebola orgânica e 5,3% de cenoura orgânica. Foram identificados

como cepas toxigênicas 51,2% (22/43) dos isolados, predominantemente A+B+CDT-

(81,8%, 18/22). Um isolado apresentou perfil A+B+CDT+ (2,3%) (LIM et al., 2018).

Em hospitais, na região central da Itália, foi detectada a presença de cepas

toxigênicas de C. difficile em 0,6% (2/350) das amostras de alimentos, sendo a

incidência de 0,3% (1/296) em amostra de alimento cozido (carne de frango) e de

1,96% (1/54) em alimento não cozido (salada de alface) (PRIMAVILLA et al., 2019).

Troiano et al. (2015) constataram a ocorrência de C. difficile em moluscos

bivalves comestíveis no sul da Itália. Foram investigadas 925 amostras, das quais

3,9% continham C. difficile. Dezoito isolados apresentaram perfil toxigênico A+/B+ e

um isolado apresentou o perfil A-/B+. Os genes para a toxina binária foram

detectados em 22,2% dos isolados. Quanto ao ribotipo, foram detectados: o 078/126

em 22,2% dos isolados, o 010 em 19,4% dos isolados e o 001 em 8,3% dos

isolados.

Norman et al. (2014) verificaram a prevalência de C. difficile em amostras de

peixes e frutos do mar adquiridas em supermercados no Texas (EUA). O C. difficile

foi encontrado em 4,5% (3/67) das amostras (uma amostra de mexilhão, uma

amostra de salmão e uma amostra de camarão).

Na Slovênia, uma pesquisa analisou a prevalência de C. diffcile em 154

amostras de vegetais folhosos e raízes (64 amostras de alface de cordeiro, 22

amostras de alface, 11 amostras de folhas de dente de leão, 2 amostras de alface

jovem, 2 amostras de rúcula, 2 amostras de radicchio, uma amostra mista de

vegetais folhosos, 15 amostras de gengibre e 75 amostras de batata). Resultado

positivo para a presença de C. difficile foi verificado em 18,2% (28/154) das

amostras (28% das amostras de batata, 9,4% das amostras de vegetais folhosos e

6,7% das amostras de gengibre). Foram isoladas 115 cepas de C. difficile, a

incidência de cepas toxigênicas foi 8,7% (10/115) dos isolados, predominantemente

o ribotipo 014/020 (TKALEC et al., 2019).

Rodriguez-Palacios et al. (2010) demonstraram que os esporos de C. difficile

sobrevivem por 2 h a 71°C. Assim, o processamento térmico atualmente aplicado

nas indústrias de produtos cárneos pode ser insuficiente para reduzir esporos de C.

difficile para um nível aceitável.

38

A fonte de contaminação dos animais é desconhecida, todavia foram

observadas as mesmas cepas em animais e em seres humanos, indicando que a

fonte de contaminação pode ser comum ou que os animais podem ser a fonte de

contaminação da população (WEESE, 2010).

39

Tabela 2. Prevalência da contaminação de alimentos por C. difficile.

Alimento Quantidade

total de amostras

Prevalência de contaminação por C. difficile

(%)

Observações Local Referência

Bibliográfica

Produtos cárneos (linguiça, carne

bovina/suína/peru moída, choriço e

linguiça de fígado de porco)

88 42,00 73% dos isolados identificados como

ribotipo 078 e 27% dos isolados identificados como ribotipo 027

Tuscon (EUA) Songer et al. (2009)

Carne bovina, suína e de frango 84 0 - Áustria Indra et al. (2009)

Salada pronta para consumo 40 7,50

75% dos isolados identificados como ribotipo 017 (A-/B+) e 25% dos

isolados identificados como ribotipo 001

Glasgow (Escócia) Bakri et al. (2009)

Carne moída mista (amostras compostas

por carne suína e carne bovina)

70 4,29

66,67% dos isolados identificados como ribotipo AI-57 (AI refere a

isolado na Áustria) e 33,33% dos isolados identificados como ribotipo

053

Áustria Jöbstl et al. (2010)

Carne bovina embalada a vácuo 13 15,38

Foram analisadas 8 amostras deterioradas e 5 amostras não

deterioradas

Estado de São Paulo Marques (2010)

Carne de frango 203 12,80 Isolados identificados como ribotipo 078 Ontário

(Canadá) Weese et al. (2010)

40

Cont. Tabela 2.

Alimento Quantidade

total de amostras

Prevalência de

contaminação por C. difficile

(%)


Bibliográfica

Produtos cárneos (varejo) 40 7,50

Foram analisadas amostras de carne suína moída, chouriço de

porco e carne de peru moída Texas (EUA) Harvey et al. (2011)

Peixes e frutos do mar 119 4,80 80% dos isolados identificados

como ribotipo 078 e 20% apresentaram perfil toxigênico A-/B-

Canadá Metcalf et al. (2011)

Carne (bovina moída, bovina peça, suína e

de frango) 147 11,50

6,25% dos isolados apresentaram pelo menos um gene de virulência avaliado (A-/B+), 35% dos isolados apresentaram os genes tcdA e tcdB (A+/B+) e 58,75% dos isolados não apresentaram os genes tcdA e tcdB

(A-/B-)

Campinas Tsuchiya (2012)

Produtos cárneos 102 2,00 Isolados identificados como ribotipo 078 Pittsburgh

(EUA) Curry et al. (2012)

Produtos de carne suína 31 35,48

Isolados identificados como ribotipo 078

Pittsburgh (EUA) Curry et al. (2012)

Carne bovina moída 956 0 EUA Kalchayanand et al. (2013)

41

Cont. Tabela 2.

Alimento Quantidade

total de amostras

Prevalência de


(%)


Bibliográfica

Produtos cárneos 133 2,30

25% dos isolados identificados como ribotipo 078, 50% dos

isolados identificados como ribotipo 014, 12,5% dos isolados

identificados como ribotipo UCL57 e 12,5% dos isolados

identificados como ribotipo UCL378

Bélgica Rodriguez et al. (2014)

Produtos cárneos prontos para o

consumo (rim bovino cozido e carne bovina

cozida)

395 12,40 - Costa do Marfim Kouassi et al. (2014)

Carne (bubalina, caprina, ovina, bovina

de gado de corte jovem e de gado

leiteiro adulto)

660 2,00

53,9% dos isolados identificados como ribotipo 078, 30,8% dos

isolados apresentaram os genes tcdA e tcdB, e 7,7% dos isolados

apresentaram o gene tcdB

Irã Rahimi, Jalali, Weese (2014)

Peixes e frutos do mar 67 4,50

Cepas isoladas a partir de mexilhão e salmão apresentaram o perfil toxigênico V e a cepa isolada a partir de camarão apresentou o

perfil toxigênico XII

Texas (EUA) Norman et al. (2014)

42

Cont. Tabela 2.

Alimento Quantidade

total de amostras

Prevalência de


(%)


Bibliográfica

Carne suína 100 2,00 Isolados apresentam o perfil toxigênico A-/ B- Connecticut

(EUA) Mooyottu et al.

(2015)

Alimentos para o consumo em casa de

repouso 188 0,53 Isolado identificado como ribotipo 078 Bélgica

Rodriguez et al. (2015)

Alimentos árabes prontos para o

consumo 368 1,36

20% dos isolados apresentaram os genes tcdA, tcdB e cdtB; 80% dos isolados apresentaram o gene tcdA

e tcdB

Irã Rahimi, Afzali, Baghbadorani (2015)

Moluscos bivalves 925 3,90

22,2% dos isolados identificados como ribotipo 078/126, 8,3% dos

isolados identificados como ribotipo 010 e 19,4% dos isolados

identificados como ribotipo 001

Sul da Itália Troiano et al. (2015)

Carne de frango (75 amostras de sobrecoxa com coxa, 75 amostras de peito, 60 amostras de asa, 60 amostras

de coxa e 40 amostras de fígado)

310 8,06

20% dos isolados apresentaram gene tcdB e 32% dos isolados

apresentaram o gene tcdA. Nenhum isolado apresentou gene para toxina

binária

Turquia Guran, Ilhak (2015)

43

Cont. Tabela 2.

Alimento Quantidade

total de amostras

Prevalência de


(%)


Bibliográfica

Produtos cárneos (hambúrguer, carne

bovina moída, nugget de frango, linguiça e

carne enlatada)

570 1,20 83,3% (5/6) dos isolados identificados como cepas toxigênicas Irã Rahimi, Khaksar

(2015)

Produtos cárneos (carne bovina,

hambúrguer após modelamento e

hambúrguer após congelamento)

100 7,0 28,5% dos isolados identificados como cepas toxigênicas Irã Esfandiari et al. (2015)

Carne (bovina, ovina e caprina) 600 1,50

61,1% dos isolados identificados como ribotipo 078. Não foi detectada

contaminação nas amostras de carne caprina

Jazan (Arábia Saudita)

Bakri (2016)

Alimento para consumo em hospital (gelatina e

vegetais/pão/grãos) 1.871 0,22

Isolado da amostra de gelatina identificado como ribotipo 001 e o

isolado da amostra de vegetais/pão/grão identificado como

ribotipo 027

Saint Louis (EUA)

Kwon et al. (2016)

Comida caseira 188 1,06 Isolados identificados como ribotipo 078 Ohio

(EUA) Rodriguez-Palacios, Ilic, Lejeune (2017)

44

Cont. Tabela 2.

Alimento Quantidade

total de amostras


(%)

Observações Local Referência Bibliográfica

Produtos cárneos suínos prontos para

consumo (cólon brazado e

pele/orelha/couro brazados)

65 23,00 20% dos isolados apresentaram o gene tcdA e tcdB Taiwan Wu et al. (2017)

Produtos cárneos suínos crus (carne

moída e pele) 62 27,00 9% dos isolados apresentaram o gene

tcdA e tcdB Taiwan Wu et al. (2017)

Vegetais folhosos e raízes (batata,

gengibre, rúcula, folhas de dente de leão, alface

e radicchio)

154 28,00 8,7% dos isolados (10/115) foram

identificados como cepas toxigênicas, ribotipo 014/020

Slovênia Tkalec et al. (2018)

Raízes vegetais de cultivo convencional e

orgânico (batata, beterraba, cebola e

cenoura)

100 30,00

51,2% dos isolados identificados como cepas toxigênicas, sendo 81,8% dos

isolados identificados com perfil A+B+CDT- (81,8%) e 2,3% dos isolados

apresentaram perfil A+B+CDT+

Austrália Lim et al. (2018)

45

Cont. Tabela 2.

Alimento Quantidade

total de amostras


(%)

Observações Local Referência Bibliográfica

Alimento cozido para consumo em hospital (massas, arroz, sopa,

batata, espinafre, cenoura, ervilha,

abobrinha e carne de frango/bovina/suína)

296 0,30 Isolado identificado como ribotipo

014/020, perfil toxigênico 0 (tcdA+ tcdB- cdtA- cdtB-)

Itália Primavilla et al. (2019)

Salada para consumo em hospital (tomate e

alface) 54 1,90

Isolado identificado como ribotipo 126, perfil toxigênico V (tcdA- tcdB- cdtA-

cdtB-) Itália Primavilla et al. (2019)

46

3.2.3. C. difficile no Brasil

No Brasil, Pinto et al. (2003) estudaram a incidência de C. difficile em crianças

no Rio de Janeiro, cepas toxigênicas de C. difficile foram identificadas por meio da

técnica de PCR em 4,2% dos pacientes internados e em 3,5% dos pacientes não

internados.

Outra ocorrência de CDI foi verificada na Unidade de Tratamento Intensivo de

Hospital Público em Santo André, no qual 44,9% (22/49) das amostras de fezes de

pacientes apresentaram resultado positivo para as toxinas de C. difficile (MARCON;

GAMBA; VIANNA, 2006).

Já no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), Rio de Janeiro,

foi verificado que 28,5% (6/21) dos pacientes apresentaram CDI e foram isoladas

quatro cepas de C. difficile. Todos os isolados possuem os genes tcdA e tcdB, dois

isolados pertencem ao ribotipo 014 e dois isolados pertencem ao ribotipo 106

(BALASSIANO et al., 2009).

Em pesquisa realizada em pacientes de dois hospitais de Porto Alegre

verificou-se que 9,4% (11/116) dos pacientes apresentaram resultado positivo para

cultura de C. difficile, tendo sido isoladas 10 cepas não toxigênicas e uma cepa

apresentou os genes tcdA e tcdB (MONTEIRO et al., 2014).

No Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Rio de Janeiro, 2,7% (3/74)

das amostras de fezes de pacientes apresentaram resultado positivo para as toxinas

de C. difficile, sendo que este foi isolado em duas (2/3) dessas amostras. Uma

terceira cepa de C. difficile foi recuperada de uma amostra que apresentou resultado

negativo no Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (Enzyme Linked Immuno Sorbent

Assay – Elisa). Os isolados apresentaram os genes tcdA e tcdB e pertencem aos

ribotipos 014, 043 e 046 (SECCO et al., 2014).

No Hospital Haroldo Juaçaba - Instituto do Câncer do Ceará, 23 (48%)

pacientes apresentaram CDI, sendo que o C. difficile foi isolado em quatro (17%)

amostras de fezes e todas as cepas apresentaram genes tcdA e tcdB. Três isolados

foram identificados como ribotipo 014/020 e perfil toxigênico XVIII e um isolado (ICC-

45) pertence a um novo ribotipo e ao perfil toxigênico IXb (COSTA et al., 2017).

47

Em 2011, ocorreu um surto de diarreia causada por C. difficile em leitões em

uma granja no Rio Grande do Sul. A frequência de diarreia em leitões com até sete

dias de idade aumentou de uma média de 2% para aproximadamente 20%. Na

necropsia dos leitões foi observado edema de mesocólon e, na avaliação

histopatológica, foi verificada uma colite neutrofílica necrotizante severa. Além disso,

o conteúdo intestinal dos leitões apresentou resultado positivo para as toxinas A e B

do C. difficile (COSTA et al., 2013).

C. difficile também foi identificado em amostras fecais de quati (Nasua nasua),

um mamífero pequeno urbano. No estudo, 46 quatis foram mantidos em gaiolas e

foram coletadas amostras fecais. C. difficile foi isolado a partir de 6,5% (3/46) dos

animais, sendo 2 cepas toxigênicas (A+/B+ CDT-, ribotipo 014/020 e 106) e 1 cepa

não toxigênica (A-/B- CDT-, ribotipo 053) (SILVA et al., 2014).

Silva et al. (2015) compararam os ribotipos de C. difficile isolados a partir de

seres humanos e de animais no Brasil. As cepas estudadas de C. difficile totalizaram

76, sendo 25 isoladas a partir de seres humanos, 23 de cães, 12 de leitões, 7 de

potros, 7 de vitelos, uma de gato e uma de lobo guará. Entre as cepas toxigênicas,

os ribotipos 014/020 e 106 foram os mais comuns, respondendo por 18,4% (14/76) e

10,5% (8/76) das amostras, respectivamente. Dentre os 14 diferentes ribotipos

detectados nos isolados a partir de humanos, nove deles também foram

identificados em, pelo menos, uma espécie animal.

Em Campinas, Tsuchiya (2012) estudou a incidência de C. difficile em

amostras de carne bovina moída, carne bovina peça (coxão mole), carne suína e

peito de frango; todas adquiridas em supermercados. A ocorrência de C. difficile foi

observada em 11,5% (17/147) das amostras analisadas, sendo que 27 isolados

provenientes das amostras de carne bovina moída não apresentaram perfil

toxigênico (A-/B-). Já dentre as cepas oriundas das amostras de frango, 23 isolados

apresentaram perfil toxigênico A+/B+, 5 isolados A-/B+ e 20 isolados A-/B-. Todos os

isolados provenientes de peça de carne bovina (coxão mole) apresentaram perfil

A+/B+ e não foi dete

Documents

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASrepositorio.unicamp.br/.../334789/1/Santos_ErikaGomes_M.pdfBiblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Márcia Regina Garbelini Sevillano -