Universidade Estadual de Campinas - biq.iqm.unicamp.brbiq.iqm.unicamp.br/arquivos/teses/vtls000294016.pdf · Aluno: André Romero da Silva Orientador: Prof. Dr. Renato Atílio Jorge

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Universidade Estadual de Campinas Instituto de Química

Dissertação de Mestrado

Análise das Propriedades Fotossensibilizantes do In(III)-mesotetrafenilporfirina para uso em

Terapia Fotodinâmica

14/02/2003

Aluno: André Romero da Silva

Orientador: Prof. Dr. Renato Atílio Jorge

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Aos meus pais, Roseli e Miguel, e irmãos, Alessandra e Adriano, pelo apoio e incentivo que sempre me concederam, desde a época de graduação.

À minha esposa, pelo carinho, compreensão e incentivo durante a realização deste trabalho.

A coisa mais bela que o homem pode experimentar é o mistério. Éessa emoção fundamental que está na raiz de toda ciência e todaarte. (Albert Einstein)

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Agradecimentos Gostaria de agradecer imensamente: ao Prof. Dr. Renato Atilio Jorge pela orientação que me foi concedida e pela oportunidade de poder trabalhar com ciência.

a Profa. Dra. Tereza Dib Zambon Atvars pela forma atenciosa com que me auxiliou na resolução de problemas relacionados a fotoquímica e fotofísica.

ao Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda pelo empréstimo do banho de ultrassom e da centrífuga utilizados neste trabalho.

a Profa. Dra. Inés Joekes, pelos inúmeros conselhos e incentivos que me deste para trabalhar com ciência.

a srta. Aline Cristina Prezedel, funcionária do Hemocentro do Hospital das Clínicas da Unicamp, pelas inúmeras doações de sangue que foram concedidas para a realização dos ensaios de hemólise.

a srta. Dayanne Santos da United Medical Ltda, pela doação do fármaco Photofrin®.

aos meus amigos do laboratório, Joselito, Adriana, Araceli, Clésia, César, Edenir,

Fabíola, Geraldo, Guida, Kennedy, Lilian, Luciana, Madson, Mariana, Marcel e Thais, pelo carinho e respeito com que me trataram no laboratório.

aos meus amigos do laboratório da Profa. Tereza, Marcelo, Neife, Rafael, Sahori e Tatiana, pela atenção e respeito com que me trataram durante as inúmeras análises espectrofluorimétricas que foram realizadas durante este trabalho.

aos funcionários da secretária da pós-graduação, André, Bel, Celi e Rodrigo, pela competência, responsabilidade e profissionalismo com que tratam todos os pós-graduandos.

as técnicas Cláudia, Débora, Elisabeth e Egli, pela amizade e o carinho com que me trataram durante o desenvolvimento deste trabalho.

a sr. Fontana da vidraria, pelo profissionalismo e carinho com que me tratou durante todo o mestrado.

a Fapesp e ao CnPq pelo apoio financeiro.

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Curriculum Vitae

Formação Acadêmica

• Bacharel em Química com Atribuições Tecnológicas. Universidade Estadual de Campinas – Instituto de Química (março/2001)

• Técnico em Administração. E.E.I.P.S.G.E.S. Fundação Bradesco (dezembro/1991)

Experiência Científica

• Mestrado desenvolvido no Instituto de Química-Unicamp, na área de concentração físico-química, sob orientação do Prof. Dr. Renato Atílio Jorge, sendo a tese intitulada: Análise das propriedades fotossensibilizantes do In(III)-mesotetrafenilporfirina para uso em terapia fotodinâmica. (agosto/2001 a fevereiro/2003)

Experiência Profissional

• Banco ABN AMRO Real S/A, trabalho executado na área de atendimento a clientes e na área de processamento de dados. (janeiro/1990 a agosto/2001).

• Núcleo de Preparação de Oficiais da Reserva, 28o Batalhão de Infantaria Blindado-CMSE-2a DE- Campinas/SP , trabalho executado na seção técnica de ensino. (fevereiro/1991 a abril/1992)

• TecForm administração Ltda, estágio realizado na empresa-escola localizada na Fundação Bradesco /Campinas-SP no departamento de auditoria e inspetoria. (agosto/1989 a dezembro/1991)

Honras • 1o Colocado no exame de ingresso ao curso de Mestrado do Instituto

de Química-Unicamp (agosto/2001) • Prêmio Lavoisier, concedido pelo Conselho Regional de Química-IV

Região-SP devido ter obtido os melhores resultados durante o curso de graduação de bacharel em química tecnológica (março/2001).

• Medalha de Bronze, concedido pelo Banco Real S.A. devido ter alcançado a cota de abertura de contas correntes estipulada pela Campanha Batalha Real (julho/1999).

• Diploma de Honra ao Mérito, concedido pelo 28o Batalhão de Infantaria Blindado-NPOR, devido aos bons serviços prestados durante o serviço militar (março/1993).

• Medalha de Honra ao Mérito, concedido pela direção da Fundação Bradesco, devido ter obtido os melhores resultados durante o curso de técnico em administração (dezembro 1991).

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Congressos • WorkShop em Terapia Fotodinâmica: Complexo de Moléculas Fotoativas e suas Aplicações. Aspectos Físicos, Químicos, Biológicos e Médicos – Novembro/2002 – São Pedro-SP. • Apresentação de palestra: Determinação do mecanismo de ação da

meso-tetrafenilporfirina de índio na fotoxidação de biomoléculas. • Apresentação de pôster: Eficiência da meso-tetrafenilporfirina de

índio na fotoxidação de biomoléculas. • XXXI Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e

Biologia Molecular – Maio/2002 – Caxambu-MG. • Apresentação de pôster: Analysis of photosensitizing properties of

In(III)-meso-tetraphenylporphyrin to use in photodynamic therapy.

Atividades extra

curriculares

• Representante discente junto a comissão de pós-graduação do Instituto de Química da Unicamp. (2002-2003)

• Representante discente junto a comissão de graduação do Instituto de

Química da Unicamp. (1997-1998)

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Análise das Propriedades Fotossensibilizantes do In(III)-

mesotetrafenilporfirina para uso em Terapia Fotodinâmica

Resumo

Foi estudada a capacidade da meso-tetrafenilporfirina de índio (InTPP) para atuar

como sensibilizador na terapia fotodinâmica (PDT), através da comparação dos valores das

constantes de velocidade (k) de fotoxidação do triptofano (Trp), albumina bovina (BSA) e

eritrócitos na presença de InTPP ou Photofrin®. O mecanismo de ação do InTPP na

fotoxidação de biomoléculas e eritrócitos, através do efeito da azida de sódio (NaN3) e de

água deuterada (D2O) sobre a constante de velocidade da reação de fotoxidação foi também

estudado.

As soluções contendo as biomoléculas foram irradiadas com uma lâmpada de

mercúrio, em um período máximo de 60 minutos e suas fotoxidações foram monitoradas

pelas determinações das fluorescências. Através de k pode-se verificar que o InTPP foi, em

média, 26% mais eficiente em fotoxidar o Trp e a BSA, quando comparado à eficiência do

Photofrin®. Os resultados das fotoxidações das soluções de eritrócitos, utilizando-se uma

baixa concentração de InTPP ou de Photofrin® (0,2 mg L-1), em um período de irradiação

entre 60 a 120 minutos, mostraram que o InTPP é 83 vezes mais eficiente do que o

Photofrin®. Para soluções mais concentradas (4,9 e 15,3 mg L-1) observou-se que a

hemólise de 50% das hemácias foi mais rápida quando se utiliza o InTPP. No entanto, para

estas concentrações, a hemólise atingiu um valor máximo de 80%, provavelmente devido

ao favorecimento da agregação do InTPP em um meio contendo hemácias. Os resultados

obtidos no estudo das propriedades fotossensibilizantes do InTPP indicam que esta

substância é, provavelmente, um potencial fotossensibilizador para uso em PDT.

Os resultados também mostraram que a constante de velocidade de fotoxidação de

Trp e de BSA aumentou 4 e 13 vezes, respectivamente, na presença de D2O e diminuiu 4 e

3 vezes, respectivamente, na presença de NaN3, indicando que o mecanismo preponderante

na fotoxidação de biomoléculas é do tipo II.

x

Analysis of photosensitizing properties of the In(III)-mesotetraphenyl-

porphyrin to use in photodynamic therapy

Abstract

The use of indium (III)-mesotetraphenylporphyrin (InTPP) as a sensitizer in

photodynamic therapy (PDT) was investigated by comparing the rate constants (k) of

tryptophan (Trp), bovine albumin (BSA) and erythrocytes photoxidation in the presence of

InTPP or Photofrin®. The mechanism involved in the photoxidation of biomolecules and

erythrocytes was also studied by seeing how sodium azide (NaN3) and deuterium oxide

(D2O) affect the photoxidation rate constant.

The solutions of biomolecules were irradiated with a mercury lamp, for a maximum

period of 60 minutes and their photoxidations were monitored for measures of

fluorescence. It can be verified by was of k that the InTPP was, in average, 26% more

efficient to photoxidate Trp and BSA when compared with the efficiency of Photofrin®.

Results of erythrocytes solutions photoxidations, using a low concentration of InTPP or

Photofrin® (0,2 mg.L1), in the irradiation period of between 60 and 120 minutes, showed

that InTPP is 83 times more efficient than Photofrin®. For more concentrated solutions (4,9

and 15,3 mg.L-1), it was observed that haemolysis of 50% of the erythrocytes was faster

when the InTPP is used. However, the haemolysis reached a maximum value of 80% for

these concentrations, probably because of the favoring of photosensitizer aggregation in the

erythrocytes solutions. The results obtained from the study of photosensitizing properties of

InTPP indicate that this compound is, probably, a potential photosensitizer to use in PDT.

The results showed that the photoxidation rate constant of Trp and BSA increased 4

and 13 times, respectively, in the presence of D2O and decreased 4 and 3 times,

respectively, in the presence of NaN3, indicating that the preponderant mechanism in the

biomolecules photoxidation is of type II.

xi

ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO 1 1.1 Definição 2

1.2 Histórico 2

1.3 Mecanismo 5

1.4 Oxigênio singlete 8

1.5 Apoptose 11

1.6 Necrose tumoral devido ao efeito vascular da PDT e a interferência do

óxido nítrico

15

1.7 Propriedades de um fotossensibilizador 17

1.8 Novos fotossensibilizadores 19

1.8.1 As meso-tetrafenilporfirinas e a PDT 22

2. OBJETIVO

24

3. JUSTIFICATIVA 24

4. MATERIAIS E MÉTODOS

25 4.1 Reagentes e equipamentos 25

4.2 Determinação do comprimento de onda de excitação e de emissão 25

4.3 Estudo do estado de agregação do fotossensibilizador 26

4.3.1 Influência da concentração de Tween 20 e da porcentagem de

fase aquosa no estado de agregação do InTPP

26

4.3.2 Determinação da constante de dimerização 27

4.4 Fotoxidação de biomoléculas 28

4.4.1 Triptofano 28

4.4.2 Albumina bovina 29

4.4.3 Cálculo da constante de velocidade 29

4.4.4 Sistema utilizado na fotoxidação de biomoléculas 31

4.5 Fotobranqueamento do InTPP 31

4.6 Hemólise de células vermelhas do sangue 33

4.7 Determinação do mecanismo envolvido na fotoxidação de biomoléculas 35

xii

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 36 5.1 Espectros de absorção e de emissão dos fotossensibilizadores 36

5.2 Estudo do estado de agregação do fotossensibilizador 39

5.2.1 Influência da concentração de Tween 20 e da porcentagem de

fase Aquosa no estado de agregação do InTPP

39

5.2.2 Determinação da constante de dimerização 42

5.3 Fotoxidação de biomoléculas 50

5.3.1 Fotoxidação de triptofano 50

5.3.2 Fotoxidação de albumina bovina 57

5.4 Fotobranqueamento do InTPP 60

5.5 Hemólise de eritrócitos 64

5.6 Determinação do mecanismo envolvido na fotoxidação de biomoléculas 70

6. CONCLUSÕES

76

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

78

xiii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Mecanismos de fotoxidação de biomoléculas.

5

Figura 2 – Reações envolvidas na geração de intermediários de oxigênio altamente reativos, como • O2

-, H2O2 e • OH.

6

Figura 3 – Reações do oxigênio singlete com algumas biomoléculas.

8

Figura 4 – Representação dos orbitais moleculares π*x e π*

y relativos às formas 1∆x e 1∆y do oxigênio singlete: os lóbulos sombreados representam o orbital molecular antiligante que possui o par de elétrons.

9

Figura 5 – Estrutura de alguns fotossensibilizadores que vem sendo pesquisados.

21

Figura 6 – Estrutura da meso-tetrafenilporfirina de Ga.

23

Figura 7 – Sistema utilizado na fotoxidação de biomoléculas.

31

Figura 8 – (A) Espectros de absorção e de emissão do InTPP (8,5 mg.L-1), em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v). (B) Espectros de absorção e de emissão do Photofrin (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.

38

Figura 9 – Convolução dos espectros de absorção e emissão do (A) InTPP (8,5 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v), e do (B) Photofrin (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.

39

Figura 10 – (A) Variações do espectro de fluorescência ou (B) da intensidade de fluorescência em 613 nm do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e diferentes concentrações de Tween® 20. (C) Variações do espectro de fluorescência ou (D) da intensidade de fluorescência em 613 nm do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e diferentes porcentagens de fase aquosa.

41

Figura 11 – Intensidade de fluorescência relativa versus concentração de InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v).

42

Figura 12 – Gráfico C/F versus F para determinação da constante de dimerização do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v).

43

xiv

Figura 13 – Estrutura da deuteroporfirina IX (A), mesoporfirina IX (B) e do InTPP (C).

44

Figura 14 – Variação da absorbância do InTPP em função da concentração, em meio tamponado PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, no comprimento de onda 427 nm.

44

Figura 15 – Formação de dímeros para os derivados de hematoporfirina.

46

Figura 16 – Conformação do tipo H (face-a-face) para agregados de hematoporfirina.

47

Figura 17 – Interação entre dímeros de TPP para a formação de oligômeros.

48

Figura 18 – Formação de dímero através de ponte oxo.

49

Figura 19 – Espectro de emissão da Lâmpada de Hg e espectro de absorção (A) de InTPP (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v), e (B) espectro de absorção do Photofrin (15,3 mg.L-1) em PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.

50

Figura 20 – (A) Espectros de absorção e emissão de uma solução 150 µM de triptofano em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20, 5% (v:v) de DMF e 15,3 mg.L-1 de InTPP. (B) Espectros de absorção e emissão de uma solução 150 µM de triptofano em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e 15,3 mg.L-1 de Photofrin®.

52

Figura 21 – Gráfico ln(F/Fo) versus tempo de irradiação para a fotoxidação de triptofano (150 µM), na presença de (A) InTPP (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, e na presença de (B) Photofrin (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.

53

Figura 22 – Fotoxidação de Trp (175 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP (A) e Photofrin (B), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). (C) Gráfico da variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação do triptofano em relação a concentração do fotossensibilizador.

55

Figura 23 – Variação da intensidade de fluorescência de uma solução 100 µM de BSA, durante fotoxidação na presença de tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), InTPP 9,3 mg.L-1 e 5% de DMF.

57

xv

Figura 24 – (A) Espectros de absorção e emissão de uma solução 40 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20, 5% (v:v) de DMF e 15,3 mg.L-1 de InTPP. (B) Espectros de absorção e emissão de uma solução 100 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e 15,3 mg.L-1 de Photofrin®.

58

Figura 25 – Fotoxidação da BSA (23,5 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP (A) e Photofrin (B), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). (C) Gráfico da variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação da BSA em relação a concentração do fotossensibilizador.

59

Figura 26 – Fotobranqueamento de uma solução 15,3 mg.L-1 de InTPP, em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, monitorado pela variação da fluorescência do InTPP no comprimento de onda 613 nm.

61

Figura 27 – Mecanismo do fotobranqueamento de complexos metálicos de meso-tetrafenilporfirina.

63

Figura 28 – Variação da absorbância da oxihemoglobina na fotoxidação de uma solução 0,5% (v:v) de eritrócitos em tampão PBS pH 7.4, 1% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de 4,8 mg.L-1 de InTPP.

64

Figura 29 – Porcentagem de hemólise em soluções 0,5% (v:v) de hemácias, em tampão PBS pH 7.4 e na presença de diferentes concentrações de (A) Tween 20 e (B) DMF.

66

Figura 30 – Porcentagem de hemólise das soluções de eritrócitos (0,5% v:v), devido ação do InTPP ou Photofrin® (0,2-15,3 mg.L-1), em tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF.

67

Figura 31 – Visualização da hemólise de uma solução 0,5% (v:v) de eritrócitos, em tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de InTPP ou Photofrin® (4,9 mg.L-1).

70

Figura 32 – Reações de supressão do 1O2 singlete pela ação da NaN3.

71

Figura 33 – Variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação do Trp (150 µM) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (20 µM), na presença de concentrações variadas (A) de NaN3 e (B) de D2O.

72

xvi

Figura 34 – Fotoxidação (A) de uma solução 116 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (24 µM), com a presença de NaN3 e fotoxidação (B) de uma solução 23 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (1,1 µM), com a presença de D2O.

73

Figura 35 – Porcentagem de hemólise de uma solução 0,5% (v:v) de hemácias, em tampão PBS pH 7.4, Tween 20 0,05% (v:v) e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de InTPP (6,4 µM) e D2O.

74

xvii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Ocupação dos orbitais moleculares antiligantes para os estados eletrônicos do O2.

9

Tabela 2 – Concentração de fotossensibilizador necessária para inibir 50% do crescimento do neurito.

23

Tabela 3 – Constante de velocidade da fotoxidação do Trp (150 µM) na presença de InTPP ou Photofrin (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v).

53

Tabela 4 – Valores de k2.α para a fotoxidação de Trp (175 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP e Photofrin , tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v).

56

Tabela 5 – Valores de k2.α para a fotoxidação da BSA (23,5 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP e Photofrin , tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v).

60

Tabela 6 – Tempo necessário para que 50% das células vermelhas do sangue sejam hemolisadas pelos fotossensibilizadores.

69

Dissertação de mestrado André Romero da Silva

1

1. INTRODUÇÃO

Tumor, sinônimo de neoplasma ou blastoma, é o crescimento anormal dos tecidos,

onde as células doentes com um distúrbio genético passam a se reproduzir mais

rapidamente do que as células normais. O tumor é maligno quando seu crescimento é muito

acelerado e desorganizado e com tendência a se alastrar a outros órgãos1.

Câncer é a designação genérica de qualquer tumor maligno; a palavra câncer é

derivada do latim (cancer) e significa caranguejo. O nome é decorrente da facilidade com

que este crustáceo tem de se aderir firmemente em qualquer lugar, assim como o tumor se

adere ao local do corpo humano em que se desenvolve1.

Estimativas da incidência e mortalidade por câncer, realizadas pelo Instituto

Nacional do Câncer (INCA), prevêem para 2002 um total de 246.000 óbitos e 700.000

novos casos no Brasil. O câncer se constitui na terceira causa de mortes em nosso país,

perdendo apenas para as causas externas, como acidentes de trânsito, e mortes por doenças

do coração 2.

Atualmente, os hospitais brasileiros dispõem dos seguintes recursos para o

tratamento do câncer: cirurgia, radioterapia, quimioterapia, hormonioterapia e

imunoterapia, que podem ser usados de forma isolada ou combinados. O tratamento

cirúrgico é uma técnica radical que visa à retirada do órgão afetado pelo câncer,

ocasionando em muitas situações, alterações fisiológicas nos pacientes como alterações dos

processos digestivos e de excreção, sendo sua utilização limitada à localização e às

dimensões do tumor. A radioterapia é um método capaz de destruir células tumorais,

empregando um feixe de radiações ionizantes, sendo que a resposta do tecido às radiações

depende de fatores como a sensibilidade do tumor à radiação, sua localização e o tempo de

irradiação do tumor. A quimioterapia é uma técnica baseada na utilização de substâncias

químicas que interferem na síntese de enzimas celulares, afetando a função e a proliferação

das células normais como das neoplásicas. A hormonioterapia é uma técnica baseada na

manipulação do sistema endócrino estabelecido para neoplasias malignas

hormoniossensíveis. Inicialmente utilizada no câncer de mama, a hormonioterapia foi sendo

subseqüentemente aplicada a outros tumores que mostravam hormoniossensibilidade, como

os carcinomas tiroidianos e de próstata. A imunoterapia esta baseada na utilização de

substâncias que estimulam o sistema imunológico a alterar a resposta biológica do


2

organismo, proporcionando capacidade imunológica de combate às células cancerígenas

através da produção de linfócitos e monócitos reguladores do crescimento celular 2.

Embora nos últimos anos estas técnicas tenham sofrido um desenvolvimento

substancial, permitindo o aumento do tempo de vida dos pacientes com câncer, ainda os

pacientes são acometidos de efeitos colaterais, como alopecia (queda de cabelo), alterações

gastrintestinais (náuseas, vômitos e diarréia) e adinamia (prostração física), tornando o

tratamento muito difícil aos doentes. Diante dos graves efeitos colaterais e da eficiência

limitada das terapias tradicionais (cirurgia, quimioterapia e radioterapia) outras alternativas

estão sendo constantemente propostas na área da oncologia, a fim de se obter formas mais

seletivas de tratamento que possam atuar preferencialmente sobre os tecidos tumorais e

causar menos efeitos colaterais 1,2. Dentre estas, destaca-se a terapia fotodinâmica (PDT),

uma modalidade relativamente nova no tratamento de câncer 1.

1.1 Definição

A fototerapia é definida como sendo o uso da luz visível ou visível próximo

(infravermelho) como agente terapêutico na medicina clínica, sendo dividida em duas

categorias: direta, sem a administração de um fotossensibilizador (o tratamento de icterícia

neonatal com feixe de luz na região do azul); e a indireta, onde o efeito é obtido via

administração de um fotossensibilizador o qual absorve efetivamente a luz 3,4. Esta última é

mais conhecida como PDT, uma técnica usada para o tratamento de câncer que está

baseada no uso combinado da administração sistêmica de um fotossensibilizador, o qual é

retido preferencialmente pelo tumor, e na iluminação da lesão por meio de uma fonte de

luz visível de alta intensidade, a qual fotodestroi o neoplasma através da geração de

radicais tóxicos ou através do oxigênio singlete 3,5. A PDT também é utilizada para

destruição de vírus, bactérias e fungos 6.

1.2 Histórico

Há mais de 4.000 anos atrás os egípcios deram início a essa terapia, através da

ingestão de plantas (contendo os psoralenos, furo[3,2-g]-coumarina ou ácido 6-hidroxi-5-

benzofurano-acrílico δ-lactona) e luz solar, para tratar doenças como o vitiligo1. No

entanto, considera-se que a fototerapia tenha sido originada em 1890 quando Finsen tratou


3

uma tuberculose cutânea (lupus vulgaris), utilizando-se uma lâmpada de arco-carbono

(constituída de dois eletrodos de carbono conectados a um terminal de corrente elétrica e

separados por poucos milímetros) e um filtro para radiação infravermelha, fato que rendeu

ao pesquisador o prêmio Nobel de 1903 4.

Em 1900 Raab relatou que a combinação de alaranjado de acridina e luz poderia

destruir microorganismos7. Em 1920 Policard notou que tecidos tumorais eram

inerentemente mais fluorescentes do que tecidos normais 5.

Ronchese tentou, em 1950, ativar moléculas endogênicas fluorescentes em tecidos

tumorais para identificar de forma mais exata as fronteiras do tumor. Entre 1940 e 1960

Figge e Rasmussen-Taxdal administraram porfirinas naturais a pacientes com câncer, na

tentativa de se detectar com maior precisão os tumores através da fluorescência7.

Na década de 50 Schwartz mostrou que nos experimentos relizados por Meyer-Betz

para identificar substâncias fototóxicas bioendogênicas, o príncipio ativo não estava

relacionado ao estado monomérico da hematoporfirina (pois esse composto é facilmente

eliminado do organismo), mas na realidade tratava-se de uma mistura de diversas

substâncias oligoméricas provenientes do método original de síntese e isolamento a partir

do sangue 8. Schwartz enriqueceu a mistura de oligômeros e a chamou de derivados de

hematoporfirina e Richard Lipson, sob sua orientação, em 1960, investigou o acúmulo

preferencial destes oligômeros em tumores implantados em camundongos e ratos, sendo

observado que a incidência de luz proporcionava regressão da doença 1.

Richard Lipson foi o primeiro a tratar uma paciente com câncer de mama e

metástase na região torácica por PDT em 1966. Após Lipson, experimentos usando a PDT

no tratamento do câncer foram realizados, em 1972, pela universidade da Califórnia,

universidade de San Francisco e pelo instituto do câncer Roswell Park (Buffalo-New

York)9.

Em 1976, Kelly e Snell trataram um paciente com câncer na bexiga usando

derivado de hematoporfirina (Hpd) e luz branca, registrando respostas positivas sobre a

técnica 9. Ainda na década de 70, várias preparações de derivados porfirínicos começaram

a ser testadas para uso em PDT, culminando com o desenvolvimento do Photofrin II

(refinamento do Hpd) por Dougherty 1. Então, o grupo da Roswell Park começou a realizar

um amplo estudo clínico da PDT para o tratamento de tumores cutâneos em estado de


4

metástase, de mama e outros, usando Photofrin II e uma lâmpada que emitia na região

do vermelho 9.

Os resultados da primeira fase dos tratamentos clínicos com PDT utilizando-se

Photofrin II foram registrados em 1977 e 1978 9. Posteriormente, no fim da década de 80,

a empresa QLT Inc. através de purificações e otimizações do preparado anterior, via

processos de liofilização, chegou ao medicamento Photofrin (éter/éster de

dihematoporfirina). No ano 2000, a QLT vendeu a marca do seu produto para a Axcan

Scandipharm Inc 1. O Photofrin é o único medicamento aprovado pela FDA/EUA (Food

and Drug Administration) para o tratamento do câncer com a técnica de PDT (aprovação

datada de 22 de dezembro de 1998) sendo vendido no mercado a U$ 2.200/75 mg 1.

Entretanto vários autores3,10,11,12 relataram algumas desvantagens deste fotossensibilizador,

como a alta sensibilidade do tecido irradiado e fraca absorção da banda na região do

vermelho.

No Brasil a técnica de PDT vem sendo implantada desde 1999, pela equipe do Dr.

Guilherme Cestari Filho, médico do Hospital Amaral de Carvalho em Jaú-SP que foi

pioneiro na implantação da terapia fotodinâmica no país, e pela equipe da Prof. Dr. Cacilda

da Silva Souza, médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto-SP13.

Clinicamente, o PDT tem sido principalmente usado para câncer de bexiga, pulmão,

cérebro, mama, pescoço, oral, doenças malignas da pele e para cânceres do trato-

aerodigestivo, em países como Canadá, Alemanha, Estados Unidos, França, Japão e Brasil.

Dados recentes demonstram que o número de pacientes tratados com PDT no ano 2000 foi

superior a 15.000 13,14.


5

1.3 Mecanismo

Existem dois mecanismos de ação dos fotossensibilizadores sobre as biomoléculas:

mecanismo do tipo I e mecanismo do tipo II, conforme representado na figura 1 3,5,15,16,17.

hvvvvFonteLuz

Fotosensibilizador (P)

Tipo I

Tipo II

So

S1

T1

3O2

3O2.- + P .+

BiomoléculasFotoprodutos

BiomoléculasP.+ + S.-

So

S1

T1

3O2

FotoprodutosBiomoléculas

1O2 + Po

HP. + S.

Figura 1 – Mecanismos de fotoxidação de biomoléculas.

Na figura 1, temos uma representação dos níveis de energia eletrônico/vibracional

de um fotossensibilizador, o qual é excitado a um determinado nível de energia após ser

irradiado através de uma fonte de excitação. Como os processos de decaimentos não

radioativos, sobretudo as relaxações vibracionais (> 1012 s-1), são mais rápidos do que os

processos de decaimentos radioativos como fluorescência (106-109 s-1) e fosforescência

(10-2-104 s-1), as moléculas excitadas do fotossensibilizador decaem por relaxações

vibracionais, em geral, ao primeiro estado singlete excitado S1 (regra de Kasha)18. Deste

nível de energia, as moléculas do fotossensibilizador podem decair ao estado fundamental

So por fluorescência (transição S1→So do diagrama) e por processos não radioativos como

relaxações vibracionais e conversões internas (não representados na figura 1) ou podem


6

sofrer transições não radioativas a um estado triplete excitado via cruzamento intersistemas

(transição S1→T1 do diagrama). Neste nível de energia as moléculas do fotossensibilizador

podem sofrer decaimentos radiativos como fosforescência (transição T1→So do diagrama)

e não radioativos como conversões internas (não representados na figura 1), retornando ao

estado fundamental 18.

No mecanismo do tipo I, os fotossensibilizadores no estado triplete interagem

diretamente com o substrato e/ou solvente, através de reações de transferência de elétrons

ou transferência de hidrogênio, gerando íons radicais ou radicais, os quais reagem

instantaneamente com o oxigênio, produzindo uma mistura de intermediários de oxigênio

altamente reativos, conforme figura 2, como radical superóxido (•O2-), peróxido de

hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (•OH), capaz de oxidar uma grande variedade de

biomoléculas.

O2 O2e

O2 O2 H2O2 O22H

O2 H2O2 O2 OH OH Figura 2 – Reações envolvidas na geração de intermediários de oxigênio altamente reativos, como • O2

-, H2O2 e • OH.

Substâncias com estruturas facilmente oxidáveis (como phenóis e aminas) ou

reduzíveis (como quinonas) em meios polares e anaeróbios, favorecem o mecanismo do

tipo I3. Este mecanismo também é favorecido pelo uso de fotossensibilizadores que

absorvem na região espectral do ultravioleta, devido aos estados tripletes apresentarem

energias relativamente altas, facilitando as reações de transferência de hidrogênio e por

conseqüência a formação de radicais19. Processos de transferência de elétrons são

claramente aumentados sobre a excitação de fotossensibilizadores à estados

singlete/triplete de altas energias, em razão do aumento do caráter doador de elétrons do

fotossensibilizador 5.

No mecanismo do tipo II, os estados tripletes excitados dos fotossensibilizadores,

podem interagir com o estado fundamental do oxigênio (3∑g– O2 ou 3O2) para produzir o

oxigênio singlete (1∆g O2 ou 1O2), o qual é citotóxico, através de um processo de


7

transferência de energia não radioativo. O mecanismo de transferência de energia aparenta

ser mais eficiente (constantes de velocidade por volta de 2x1010 M-1s-1) quando comparado

às constantes de velocidade das reações de transferência de cargas (mecanismo tipo I),

usualmente abaixo de 107 M-1s-1 20,21,22. Esta transferência de energia dos estados tripletes

de ftalocianinas para o oxigênio, em soluções aquosas, é muito rápida (valores entre 2x109

a 6x109 M-1s-1) 23. Consequentemente, a energia transferida para outros compostos que

possam competir com o oxigênio é esperado ser de menor importância e o mecanismo do

tipo II, é comumente dominante, ocorrendo conforme esquema abaixo 3,17,24,25,26,27,28,29 .

F(So) F(S1)hv cints F(T1)

F(T1) + 3O2

F(So) + 1O2

Biomoléculas + 1O2 Produtos

onde: cints = cruzamento intersistemas F = fotossensibilizador; So, S1 = estado singlete

fundamental e excitado, respectivamente; To, T1 = estado triplete fundamental e excitado,

respectivamente.

O oxigênio singlete pode reagir com lipídeos insaturados (incluindo colesterol) e

aminoácidos, como o triptofano, conforme figura 3. Lipídeos insaturados e proteínas são os

principais constituintes das membranas biológicas, sendo alvos subcelulares destruídos na

PDT. Portanto, estas reações ocasionam alterações da permeabilidade celular, provocando

efeitos celulares como edemas, resultando na morte das células3,4.


8

Triptofano

Lipídios insaturados

Colesterol

Metionina

Guanina

OOH

Produtos

HOOOH

R

RNHCHCOR'

CH2

CH2

OSMe

sulfóxido

N

HN

NH

N

O

1O2

H2N

H2N

NH CO2

NH

1O2

Ene adição

1O2

Ene adição

R

RNHCHCOR'

CH2

CH2

SMe

1O2

1O2

Cicloadição

CH2 COR'CH

RNH

NH

O

O

NHCHO

HO

COR'CH

RNH

CH2

COR'CH

RNH

CH2C

O

NH

NHO

O

OH2N Figura 3 – Reações do oxigênio singlete com algumas biomoléculas.

1.4 Oxigênio singlete

Os três estados eletronicamente excitados imediatamente superiores ao oxigênio

molecular no estado fundamental (3∑g-) são denominados de oxigênio singlete. Segundo a

teoria do orbital molecular, a configuração eletrônica do oxigênio no estado fundamental

possui dois elétrons desemparelhados nos orbitais moleculares degenerados π*x e π*

y. Estes

elétrons tendem a possuir o mesmo spin de forma a produzir multiplicidade máxima e


assim, um estado de mais baixa energia. Esta é a razão pela qual o estado fundamental do

oxigênio é um estado triplete. A tabela 1 apresenta as formas de ocupação nestes orbitais

moleculares antiligantes, para o oxigênio no estado fundamental, assim como, para os

estados excitados imediatamente superiores 6,22.

Tabela 1 – Ocupação dos orbitais moleculares antiligantes para os estados eletrônicos do O2.

Estado Orbital molecular antiligante Energia(a) (KJ.mol-1) 3∑g

- [ ↑ ] π*x [ ↑ ] π*

y 0 1∆x [ ↑↓ ] π*

x [ ] π*y 92,4

1 * *

(a) rel

os re

molé

vida

possu

possu

antili

figura

Figurdo oxque p

1∆
{g
9

∆y [ ] π x [ ↑↓ ] π y 92,4 1∑g

+ [ ↑ ] π*x [ ↓ ] π*

y 159,6

ativa ao estado fundamental.

Destes estados, os que possuem energia intermediária (1∆x e 1∆y; 92,4 KJ.mol-1) são

sponsáveis pela reatividade química do oxigênio singlete. A simetria dessas

culas, diferente da do estado fundamental, lhes confere um considerável tempo de

quando comparado com a forma de mais alta energia (1∑g+; 159,6 KJ.mol-1), que

i a mesma simetria do estado fundamental. Os estados 1∆x e 1∆y são degenerados e

em uma distribuição eletrônica onde os elétrons que ocupam um dos orbitais

gantes π* se encontram em um dos planos mutuamente perpendiculares, conforme

4 6.

x xy y

x xy y

( (

x1 ( (

y1

a 4 – Representação dos orbitais moleculares π*x e π*

y relativos às formas 1∆x e 1∆y igênio singlete: os lóbulos sombreados representam o orbital molecular antiligante ossui o par de elétrons.


10

Por serem degenerados, os estados 1∆x e 1∆y são, por conveniência, representados

como sendo o estado 1∆g. O orbital molecular vazio no estado 1∆g garante ao oxigênio

singlete um caráter eletrofílico, favorecendo sua participação em reações químicas,

principalmente, no caso em que os substratos possuem sítios ricos em elétrons 6.

O tempo de vida do oxigênio singlete em solução é extremamente sensível a

natureza do solvente e varia de 4 a 100.000 µs 6. A desativação do 1O2 na maioria dos

solventes é ocasionada por processos colisionais, onde há conversão de energia eletrônica

do 1O2 em energia vibracional da molécula do solvente, devido ao acoplamento dos modos

vibracionais dos ligantes terminais das moléculas dos solventes com as transições

eletrônicas e vibrônicas do 1O2 30. O tempo de vida do 1O2 em água é cerca de 2-3µs e em

água deuterada, situa-se em torno de 70 µs 6,31. Entretanto em sistemas biológicos o

oxigênio singlete apresenta tempo de vida extremamente baixo, inferior a 250 ns,

difundindo-se menos do que 0,1 µm no meio celular. Como o diâmetro das células

humanas variam entre 10 a 100 µm, o local de geração primária do 1O2 na célula

determina qual a estrutura subcelular pode sofrer a ação do oxigênio singlete 5,6,32.

Os sítios cistidil, histidil, metionil, triptofil e tirosil são severamente destruídos nas

maiorias das enzimas e proteínas. De forma notável, os aminoácidos localizados mais na

região superficial da proteína, são rapidamente fotoxidados comparados aos resíduos de

aminoácidos localizados mais internamente na proteína. Se a proteína é completamente

desnaturada, todos os aminoácidos suscetíveis a fotoxidação (cisteina, histidina, metionina,

triptofano e tirosina) podem ser destruídos pelas espécies citotóxicas5. A maioria das

proteínas estão ligadas a outras proteínas ou às moléculas de DNA ou RNA, portanto

modificações fotoquímicas em sítios de ligações resultam na danificação das funções das

proteínas e enzimas, como a inibição do transporte de glicose e aminoácidos e da perda da

atividade biocatalítica 5. Embora seja grande o número de alvos subcelulares que podem

sofrer a ação da PDT, como mitocôndrias, lisossomos e retículos endoplasmáticos,

verifica-se geralmente, que os núcleos não são fotodestruídos. Isto é importante, em vista

do fato que se podem excluir possíveis riscos mutagênicos ao DNA que levariam à

formação de células cancerígenas 5.

Os passos envolvidos na regressão tumoral compreendem a necrose maciça do

tumor após 72h da exposição à luz; formação de ferida sobre a área depois de 3-4 dias da


11

fototerapia, desaparecimento da ferida e completa regressão tumoral dentro de 7-13 dias,

seguido pela cura da pele e crescimento dos pelos após 3 semanas, sem formação de

cicatrizes ou perda do tecido irradiado 13,33.

Células cancerígenas não apresentam mecanismos de morte celular programada

(apoptose), fato que provoca o crescimento descontrolado de células tumorais. Pesquisas

têm demonstrado que a PDT pode reativar o mecanismo de morte celular programada,

quando fotossensibilizadores localizados em organelas subcelulares como mitocôndrias,

provocam a liberação de enzimas envolvidas na apoptose 4,5,7. Argawal et. al.34

demonstraram que fosfolipases C e A2, enzimas que hidrolisam fosfolipídios para produzir

precursores de ácido araquidônico (fonte de hormônios como prostaglandinas e

tromboxanos) e que estão envolvidas na apoptose celular, são ativadas depois da utilização

do Photofrin como fotossensibilizador .

1.5 Apoptose

Necrose e apoptose são dois caminhos pelos quais as células eucarióticas podem

morrer. A necrose é caracterizada por processos não mediados pelo ATP, como os danos

vasculares nos tecidos tumorais ocasionados pela PDT enquanto que a apoptose é

caracterizada por processos mediados pelo ATP como a ativação de caspases que são

proteases que catalisam uma série de reações hidrolíticas, provocando a clivagem e

inativação de proteínas que protegem as células da morte 5,7. Danos genéticos subletais

sinalizam às células para morrer apoptoticamente enquanto que danos severos destroem a

habilidade das células em produzir ATP matando-as por necrose 7 .

A apoptose é caracterizada por uma série de modificações celulares que podem ser

vistas pelo microscópio, incluindo a condensação de cromatina e a formação de corpos

apoptóticos. Pode-se avaliar se a morte celular ocorreu apoptoticamente através da

avaliação de padrões eletroforéticos de DNA extraídos de células. O DNA extraído de

células que morreram por apoptose formam um padrão “escada” por causa que o DNA está

clivado dentro de múltiplos fragmentos chamados de corpos apoptóticos 7.

O termo apoptose foi introduzido em 1972, sendo uma palavra de origem grega que

significa cair em pedaços (fall off), sendo um processo fisiológico essencial para o controle

do desenvolvimento e evolução do tecido. Inúmeros fenômenos biológicos se devem a este


12

mecanismo de morte celular controlado pela célula, como metamorfose de larvas de

anfíbios (perda da cauda de girinos), atrofia de tecidos em organismos adultos por razões

fisiológicas ou patológicos (atrofia de rins devido à obstrução de ductos excretores) e a

eliminação das membranas interdigitais presentes na formação da mão durante a

embriogênese 35,36.

Embora a PDT possa ocasionar a morte celular por necrose ou apoptose, ou uma

combinação destes, a terapia fotodinâmica tem demonstrado ser altamente eficiente em

induzir apoptose, quando baixas concentrações de fotossensibilizadores são utilizadas em

comparação as concentrações necessárias para produzir necrose 36.

Quatro componentes genéricos devem ser considerados em relação ao mecanismo

apoptótico: as caspases, os complexos sinalizadores de morte celular, as mitocôndrias e as

proteínas da família Bcl-2.

Caspases: As reações hidrolíticas centrais dos processos apoptóticos são

catalizadas por uma família de proteases chamadas de caspases, as quais apresentam um

sítio ativo de cisteína. Caspases são sintetizadas como pro-enzimas que são ativadas por

clivagens, ou em modo autolítico ou por outras caspases. Caspases são freqüentemente

classificadas como enzimas inicializadoras ou efetoras dos processos apoptóticos,

dependendo da sua atuação se no estímulo de sinais iniciais ou na última etapa de

destruição celular via apoptose 36. Caspases efetoras clivam e inativam proteínas que

protegem as células da apoptose, como as proteínas reparadoras do DNA, poli(ADP-

ribose) polimerase, proteínas que inibem as caspases ativadoras de DNase (nuclease

responsável pela fragmentação do DNA) ou as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 36.

Complexos sinalizadores de morte celular: A apoptose é rapidamente induzida pela

ativação de complexos sinalizadores de morte celular (DISCs – death-inducing signaling

complexes) na membrana plasmática. DISCs são formados quando ligantes extracelulares

interagem com os receptores das superfícies celulares pertencentes a superfamília de genes

receptores ricos em cisteína, chamados TNF (do inglês tumor necrosis factor). Os

receptores da morte Fas (também chamados CD95 ou Apo1) e TNFR1 (também chamados

p55 ou CD120a) são os dois receptores mais bem caracterizados pela literatura. Os

complexos (Fas-ligante) são importantes para eliminação de linfócitos T ativados (T-4),

responsáveis pelo combate a infeções, e para induzir o ataque de linfócitos T citotóxicos


13

(T-8) sobre as células cancerígenas. As ligações entre Fas e seu ligante também causam a

formação de domínios de morte intracelular, devido à ligação entre receptores, levando a

formação de clusters que agem como receptores de procaspases como a procaspase-8, a

qual é ativada por processo de auto-clivagem. A caspase-8 ativa uma cascata de caspases

efetoras como a caspase-3, levando a célula à apoptose. Alternativamente a caspase-8 pode

clivar uma proteína da família Bcl-2, chamada de Bid, promovendo apoptose mitocondrial 36.

Mitocôndrias: A mitocôndria vem sendo considerada como a organela central dos

processos apoptóticos. Sinais oriundos dos receptores da superfície da célula ou de sítios

danificados, convergem sobre a mitocôndria, levando a permeabilização de ambas as

membranas mitocondriais, dissipação do potencial transmembrana da membrana interna e

liberação de proteínas relacionadas a apoptose tais como citocromo c, derivados

mitocondriais ativadores de caspases e certas procaspases a partir do espaço

intermembranas 36. Tem sido proposto que a liberação de proteínas indutoras de apoptose e

que o colapso do potencial transmembrana mitocondrial resultam da abertura de largos

canais de condução conhecidos como poros de transição de permeabilidade, os quais são

formados pelo contato de sítios das membranas mitocondriais internas e externas. O

potencial através da membrana mitocondrial interna é uma conseqüência do bombeamento

de prótons para o lado citoplasmático da membrana usando-se a energia de transporte de

elétrons. Sobre condições normais, a passagem de moléculas e íons através da membrana

mitocondrial interna é fortemente regulada. Em resposta às variações no estado de oxi-

redução, pH e concentração local de ATP/ADP e íons, tais como Ca2+ e Mg2+, os poros de

transição de membrana regulam a permeabilização da membrana. Abrindo-se um canal

seletivo na membrana interna, permite-se o equilíbrio entre a matriz e o espaço

intermembranas, portanto dissipando o gradiente de H+ através da membrana interna e

colapsando a cadeia respiratória. Outra possível conseqüência da abertura de poros de

transição de permeabilidade é a alteração do volume mitocondrial. Desde que as cristas da

membrana mitocondrial interna tem uma larga área superficial quando comparadas a

membrana mitocondrial externa, a expansão da matriz mitocondrial causa a ruptura da

membrana externa e, conseqüentemente, a liberação de proteínas presentes no espaço

intermembranas que ativam as caspases dentro do citosol 36.


14

Proteínas da família Bcl-2: Estas proteínas regulam a morte celular induzida por

muitos estímulos apoptóticos, primariamente em nível de mitocondrias 37. Membros anti-

apoptóticos desta larga família de proteínas incluem Bcl-xL e Bcl-w e entre os membros

pro-apoptóticos incluem Bax, Bad e Bid. Na ausência de sinais de morte, os membros da

família Bcl-2 pró-apoptóticos são freqüentemente “sequestrados” por proteínas

citoplasmáticas ou são associados às membranas. A atividade destas proteínas é regulada

através de vários mecanismos, incluindo os níveis de “sequestros”, clivagens e

fosforilações. A Bid (proteína pró-apoptótica), por exemplo, é clivada por caspase-8,

gerando uma proteina (t-Bid) a qual transloca-se a mitocondria para se integrar à

membrana mitocondrial, provocando a liberação do citocromo c (proteína envolvida na

cadeia respiratória). O citocromo c liga-se a procaspase-9, ocasionando a auto clivagem e

ativação desta caspase a qual ativa a caspase-3, desencadeando uma cascata de caspases

que leva a apoptose celular 36.

Deve-se salientar que a resposta apoptótica das células aos agentes danificadores do

DNA, tais como a radiação ionizante, é controlada pelo gene supressor de tumores p53.

Este gene provoca o acúmulo da proteína p53, a qual retarda o ciclo celular, a fim de que

as mutações possam ser reparadas. Caso o reparo não seja possível, a proteína induz a

célula ao suicídio, via apoptose, prevenindo a proliferação de danos genéticos que

poderiam levar ao câncer 36,44. Fisher et al. 38 fizeram uma comparação das respostas da

ação do PDT sobre diversas células tumorais de humanos, onde a presença da função do

gene p53 foi avaliada através do acúmulo da proteína p53. Células leucêmicas

promielocíticas de humanos expressaram maior sensibilidade à morte celular por PDT,

utilizando-se o Photofrin e Sn-etiopurpurina, do que células HL60 nas quais o gene p53

foi inativado 38.

Inúmeras pesquisas tem demonstrado que a PDT conduz à morte celular via

processos apoptóticos 5,7,39. Kessel et. al.40 registraram perda imediata do potencial

transmembrana mitocondrial após uso da PDT sobre células leucêmicas P388, utilizando-

se os porficenos como fotossensibilizador. Similarmente, fotossensibilizadores localizados

nas mitocôndrias como hipericina ou hipocrelina, também induzem ao rápido colapso do

potencial transmembrana desencadeando o processo apoptótico. Ativação de caspases tais

como 2, 6, 7 e 8 foram registradas após a liberação de citocromo c, utilizando-se o


15

fotossensibilizador Verteporfina sobre células cancerígenas do tipo HeLa ou células

endoteliais de humanos 41.

Originalmente alguns pesquisadores 42,43 pensavam que a destruição do tecido

tumoral estivesse unicamente associada a retenção do fotossensibilizador pelo tumor em

uma concentração adequada e de uma dose de luz para produzir quantidades letais de

oxigênio singlete e assim danificar a célula, em geral, via destruição da membrana

plasmática. Entretanto, resultados experimentais 4,5,7,9 tem demonstrado que danos

vasculares ocasionados pela PDT podem matar as células tumorais por falta de oxigênio e

nutrientes.

1.6 Necrose tumoral devido ao efeito vascular da PDT e a interferência do óxido

nítrico

A quebra da membrana celular causa a liberação de fosfolipídios, os quais são

facilmente atacados por fosfolipases, gerando ácido lisofosfatídico que é um precursor do

ácido araquidônico. Este ácido é o mais importante precursor de eicosanoídes (compostos

constituídos por cadeias de 20 carbonos) como prostaglandinas, prostaciclinas,

tromboxanos e leucotrienos, os quais são responsáveis por efeitos fisiológicos como: a

resposta inflamatória, a produção de dor e febre, a indução de coágulos de sangue, o

controle da pressão sanguínea e de várias funções reprodutivas como a indução às dores do

parto 44.

Enquanto a ciclooxigenase, um complexo multienzimático, catalisa a conversão do

ácido araquidônico em tromboxanos (A2, B) e prostaglandinas (PGD2, PGE2), a 5-

lipoxigenase converte o ácido a leucotrienos (B4, C4, D4) e hidroxiácidos. Juntos, estas

substâncias iniciam uma reação inflamatória aguda. Prostaglandinas primeiramente causam

uma vasodilatação de arteríolas terminais e danificam o endotélio e as células musculares

lisas que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. As fissuras criadas entre as

células endoteliais levam a um edema local pelo aumento de efluxo de água,

macromoléculas e células do sangue, como neutrófilos, leucócitos e macrófagos, dentro do

tecido tumoral. Tromboxanos e leucotrienos danificam as células por vasoconstrição.

Além disso, os tromboxanos promovem agregações de plaquetas (células sangüíneas

responsáveis pela coagulação do sangue), levando a formação de coágulos sanguíneos. A


16

isquemia (ausência de circulação arterial num orgão ou região) finalmente cria uma área de

hipoxia (ausência de oxigênio), iniciando o processo necrótico por falta de nutrientes 5.

Entretanto, estes eventos são providos de alta sensibilidade a NO.

O óxido nítrico (NO) é reconhecido como o maior efetor molecular de diversos

processos fisiológicos e patológicos, como controle da ativação de linfócitos T e do

desenvolvimento do cérebro embrionário, sendo um importante neurotransmissor 45,46,47.

Tem se tornado evidente que este gás, produzido por muitas células no corpo humano, não

apenas controla importantes funções do crescimento tumoral, como tem influência sobre

terapias do câncer, em especial, aquelas mediadas pela geração de espécies reativas de

oxigênio, como a terapia fotodinâmica 48.

Koberlik et. al.48 estudaram a influência de inibidores de NO sintase [Nω-nitro-L-

arginina (L-NNA) e o éster metílico de Nω-nitro-L-arginina (L-NAME)] no grau de

destruição das células tumorais após o tratamento de PDT em camundongos cujos tumores

são caracterizados pela elevada produção de NO (RIF e SCCVII) ou pela baixa produção

de NO (EMT6 e FsaR). Os resultados mostraram que estes dois grupos tumorais

respondem diferentemente ao tratamento de modulação de NO. Os tumores caracterizados

pela alta produção de NO, foram mais eficientemente destruídos pela PDT quando os

inibidores foram adicionados ao meio reacional. O fluxo sanguíneo regular nestes tumores

aparentemente são mantidos pela constante vaso dilatação exercida pelo NO em razão do

forte impacto dos inibidores L-NNA e L-NAME no grau de destruição do tumor. Deve-se

ressaltar que o óxido nítrico tem um importante papel na restituição do fluxo sanguíneo,

inibido devido aos processos inflamatórios desencadeados pela terapia fotodinâmica, desde

que os vasos afetados não tenham sido completamente danificados. Por outro lado, o grau

de destruição dos tumores que apresentam baixa produção de NO (EMT6 e FsaR) não foi

afetado significativamente na presença de inibidores de óxido nítrico indicando que a

perfusão sanguínea destes tumores é independente do NO48.

Segundo koberlik et. al.48 o NO pode facilitar ou inibir a progressão do tumor,

dependendo do genótipo tumoral e/ou do seu nível de produção pelos tumores. A

facilidade em promover a progressão tumoral está associada à característica vasodilatadora

do NO, que permite o fluxo sangüíneo nas células tumorais, assim como à sua capacidade

de induzir angiogênesi (induzir a formação de novos vasos). Sob altas concentrações


17

(micromolar) o NO é citotóxico, podendo inibir a progressão tumoral em razão da inibição

do citocromo c oxidase e consequentemente do processo respiratório, resultando no

aumento de elétrons oriundos da cadeia respiratória e no favorecimento da superprodução

de radicais superóxidos. Estes radicais, que também podem ser gerados durante a PDT,

atuam diretamente na destruição celular, através da indução de stress oxidativo sobre o

tecido endotelial, ou indiretamente, através da interação entre o radical superóxido e o

óxido nítrico, havendo a geração do íon peroxinitrito (ONOO-), um potente oxidante e

agente nitrosante capaz de reagir com proteinas, DNA, lipídios e uma variedades de outras

moléculas48,49.

Óxidos nitrogenados tais como o dióxido de nitrogênio (NO2) e o trióxido de

dinitrogênio (N2O3) podem resultar de uma autoxidação do NO, sendo agentes nitrosantes

potentes de aminas primárias e secundárias, possibilitando a desaminação de bases de

DNA, desencadeando uma série de processos que levam a apoptose celular 48,49.

1.7 Propriedades de um fotossensibilizador

A escolha de um fotossensibilizador deve dar preferência a uma substância que

apresente pequena ou nenhuma toxidade no escuro, sendo cinética e termicamente estável

para conferir a substância um adequado tempo de vida necessário às reações de

transferência de elétrons (mecanismo tipo I) e as reações de transferência de energia

(mecanismo tipo II) 3.

Definido como o tempo médio que uma molécula gasta em seu estado triplete

excitado, o tempo de vida do estado triplete (τT) limita o tempo disponível para a colisão

entre o 3O2 e o estado triplete do fotossensibilizador. Dessa forma, quanto maior o tempo

de vida do estado triplete, e desde que a energia do estado triplete seja > 94 KJ.mol-1

(energia envolvida na transição 3O2→1O2), maior será a eficiência da transferência de

energia do fotossensibilizador para o 3O2 e maior será o rendimento quântico de oxigênio

singlete (citotóxico), aumentando-se a eficiência fotodinâmica do fotossensibilizador 3,5,19.

Deve-se ressaltar que fotossensibilizadores com baixo rendimento quântico de

fluorescência apresentam maior probabilidade de decaimentos não radioativos,

possibilitando um aumento do rendimento quântico do estado triplete.


18

A absorção e o espalhamento de luz, pelos tecidos, aumentam quando se diminui o

comprimento de onda do feixe de radiação incidente. Portanto, os fotossensibilizadores que

apresentam forte absorção na região final do vermelho do espetro visível (640-700nm), são

mais eficientemente excitados in vivo, pois nesta faixa do espectro eletromagnético a

absorção e o espalhamento de luz por parte dos tecidos são menores, resultando no

aumento do número de moléculas excitadas do fotossensibilizador. Como a penetração

efetiva da luz nos tecidos tumorais dependem da absorção ótica de cromóforos

bioendogênicos e do espalhamento da luz pelo tecido, o desenvolvimento de lasers com

alto grau de monocromaticidade e coerência, na faixa de comprimento de onda também

chamada de “janela terapêutica”, permite que a fotoxidação dos tecidos tumorais não seja

apenas superficial, aumentando portanto, a eficiência do fotossensibilizador 3,23,50.

Raramente tem sido empregadas lâmpadas de xenônio, as quais requerem o

emprego de filtros adequados para a seleção do comprimento de onda de irradiação e um

sistema ótico bastante eficiente a fim de dirigir a radiação ao local a ser irradiado com o

mínimo de perdas 6. Lasers no estado sólido tipo Nd:YAG têm sido empregados mais

recentemente, entretanto o problema nesse caso é o elevado preço de custo . Uma

alternativa de custo intermediário seria a utilização dos lasers de diodo os quais cobrem

praticamente todo o espectro visível e infravermelho próximo podendo assim atender boa

parte dos agentes fototerapêuticos já existentes no mercado. Com o emprego de agentes

fototerapêuticos de segunda geração, em virtude de sua elevada absortividade molar, o uso

de diodos emissores de luz (LEDs) tem também se tornado viável, possibilitando uma

maior redução no custo dos procedimentos 6,13. Alguns aparatos têm sido desenvolvidos de

modo a melhorar a eficiência do tratamento em casos específicos. No tratamento do câncer

de bexiga, por exemplo, tem-se empregado um difusor esférico, o qual é montado na

extremidade do feixe de fibras ópticas introduzida no paciente através de um endoscópio:

isto melhora a distribuição de luz no interior da bexiga 6,13.

A partir de uma certa concentração os fotossensibilizadores passam a se agregar,

levando a diminuição do tempo de vida da fluorescência e fosforescência, devido ao

aumento dos decaimentos não radioativos por conversão interna o que torna mais difícil a

transferência de energia do fotossensibilizador do estado triplete excitado para o 3O2 51,52,

diminuindo a eficiência do fotossensibilizador. Os valores de pH, variações de


19

temperatura, estruturas moleculares, a natureza do íon metálico central e os grupos

funcionais periféricos substituídos nos fotossensibilizadores, podem influenciar

grandemente a agregação 53,54.

Alguns derivados porfirínicos exibem alta afinidade por lipoproteínas de baixa

densidade (LDL) do fluxo sangüíneo e como extensamente documentado, tecidos em

metástase possuem alta concentração de receptores deste tipo de lipoproteína (em

comparação às células normais). Esta propriedade promove um maior acúmulo do fármaco

no tecido doente, de maneira que tem sido aceito que a seletividade tumoral aumenta com

o caráter lipofílico do agente fotossensibilizante 1,4,5.

As substâncias fotoativas devem ser suficientemente anfifílicas para penetrarem nas

membranas intra e extracelulares, a fim de atingir mais rapidamente os tecidos tumorais 17,32. Para fotossensibilizadores hidrofóbicos é necessário o uso de suspensões micelares,

lipossomos ou adição de grupos polares para permitir sua penetração nas membranas 7.

1.8 Novos fotossensibilizadores

Apesar de diversos tipos de compostos fotossensíveis terem sido intensamente

investigados, o primeiro a ser aprovado pela FDA para o tratamento de câncer através da

PDT foi um derivado de hematoporfirina (Photofrin ) produzido pela QLT Inc. e

atualmente vendido pela Axcan Scandipharm Inc., o qual apresenta outras variantes

comerciais como Photosan , Photogem e Photocarcinorin 1. O Photofrin , considerado

como um fotossensibilizador de primeira geração, é uma mistura de derivados de

hematoporfirina que ministrado de forma intravenosa, acaba sendo absorvido

principalmente pelos tecidos tumorais na ordem de micrograma por grama de tecido.

Somente o fígado e o baço é que acumulam doses comparáveis aos tumores, não sendo

metabolizada pelo organismo humano. Sua excreção é lenta, sendo bifásica: uma

porcentagem maior da droga tem tempo de vida de cerca de 12 horas enquanto que a droga

restante desaparece depois de 8-10 dias. A excreção lenta do Photofrin é responsável pela

fotossensibilidade que ocorre em pacientes por várias semanas depois do tratamento com

PDT 4.

Em geral, o protocolo padrão empregado em terapia de tumores, envolve a

administração intravenosa do agente fototerapêutico (cerca de 1,5 a 5 mg/Kg de massa


20

corporal). Estas quantidades são ínfimas se comparadas às doses mínimas que podem

induzir efeitos tóxicos em seres humanos (300-500 mg/Kg). O início do tratamento ocorre

entre 24 a 72 horas após a administração do agente fototerapêutico, onde o tumor é

irradiado com fontes que emitem na região do visível e do infravermelho próximo, com

uma fluência de radiação incidente entre 100 e 200 mJ.cm-2, de modo a evitar o

sobreaquecimento dos tecidos, o que reduziria a seletividade do processo 4,6. Entretanto,

vale ressaltar que as concentrações utilizadas de medicamento e as características do laser

(tipo, dosagem de potência e tempo de iluminação) dependem da droga que está sendo

aplicada e da espécie e gravidade da doença tratada 1,4,13.

Embora o Photofrin represente um importante progresso na pesquisa de novas

terapias oncológicas, envolvendo pequenos efeitos colaterais, há algumas desvantagens a

serem citadas. Mais especificamente: 1) o Photofrin tem pequena absorção na região da

“janela terapêutica” limitando sua eficiência na PDT; 2) sua excreção lenta pelo

organismo, devido ao fato do mesmo ser retido em vários tipos de tecidos normais como

pele e fígado, por períodos de 4-6 semanas, resulta em uma prolongada fotossensibilidade

do tecido irradiado, exigindo que o paciente permaneça ao abrigo do sol por vários dias; 3)

é constituído por uma mistura complexa de derivados de hematoporfirinas, de maneira que

o isolamento e purificação da droga não é simples nem barato, se constituindo em um

fotossensibilizador pouco acessível economicamente (75mg de Photofrin custam U$

2.200) 4,6,13.

Com o objetivo de se diminuir os itens acima citados e de se aumentar a destruição

dos tecidos irradiados é que inúmeros fotossensibilizadores vem sendo sintetizados e

estudados. O fato das porfirinas serem bons geradores de oxigênio singlete e que esta

forma ativa de oxigênio é responsável, em geral, pela eficiência da PDT, faz com que

novos derivados porfirínicos sejam pesquisados 4. Especial atenção tem sido dada ao grau

de hidrofobicidade e hidrofilicidade destes novos fotossensibilizadores, uma vez que o

esqueleto porfirínico é essencialmente hidrofóbico e a hipótese que a localização tumoral

poderia ser modulada pela introdução de substituintes polares, tem estimulado a síntese de

estruturas com ácidos sulfônicos, ácidos carboxílicos, hidroxil e sais quaternários de

amônio como substituintes 4. Pesquisadores 7,55,56 têm sintetizado fotossensibilizadores

conjugados a fosfolipídios, proteínas ou polissacarídeos a fim de aumentar a capacidade de


21

interação dos fotossensibilizadores com as membranas lipídicas e assim, melhorar a

eficiência fotodinâmica dos novos fotossensibilizadores. Entretanto, os resultados das

pesquisas tem demonstrado que a conjugação de ligantes extensos aos

fotossensibilizadores acarreta a diminuição da eficiência fotodinâmica em gerar espécies

tóxicas de O2, devido ao aumento da dissipação de energia vibracional 7.

Várias substâncias derivadas de bacterioclorinas, clorinas, purpurinas e

ftalocianinas vem sendo estudadas 3,4,5,36, sendo compostos que apresentam a mesma

estrutura principal das porfirinas, as quais são caracterizadas pelos quatro anéis pirrólicos,

conforme figura 5.

HN

NH N

O OOH OH

N

protoporfirina IX

CO2CH2CH3

NH N

HNN

etiopurpurina

(Purlytin)

O H O H

N H

N H N

O O

N C O O C H 3

C O O C H 3

benzoporfirina (Verteporfin)

NH

N

N

HN

HO

OH

OH

OH

m-tetrahidroxifenilporfirina (foscan)

NH

N

N

HN

meso-tetrafenilporfirina

NH

N

N

NN

N

HN

N

ftalocianina

Figura 5 – Estrutura de alguns fotossensibilizadores que vem sendo pesquisados.


22

Uma outra classe de fotossensibilizadores é a endogênica, baseada na administração

por via oral ou mesmo por uso tópico do ácido δ-aminolevulínico (ALA → ácido 5-amino-

4-oxopentanóico). Esse ácido é o precursor metabólico da protoporfirina IX na rota

biosintética para o heme57. A sobrecarga de ALA sobre as células provoca a geração da

protoporfirina IX, com velocidade mais rápida do que a capacidade da ferroquelatase em

convertê-la em heme. Dessa forma, tem-se a produção de um fotossensibilizador

endogênico que se acumula nas células cancerígenas. Apesar do ALA atravessar

passivamente as barreiras da pele, a concentração utilizada para se obter uma

biodisponibilidade local adequada para o tratamento de câncer de pele é alta e, muitas

vezes, insuficiente para produzir o efeito terapêutico desejado58. O ALA tem sido eficiente

na destruição de tumores superficiais, contudo, sua eficiência fica prejudicada no caso de

tumores com mais de 1 mm de profundidade 7.

Um outro grupo de derivados porfirínicos que vem sendo estudado é constituído

pelas meso-tetrafenilporfirinas, cuja anfifilicidade pode ser modulada pela conjugação de

diferentes substituintes nos grupos fenila 4.

1.8.1 As meso-tetrafenilporfirinas e a PDT

Pesquisas demonstraram que o aumento de grupos sulfonatos na meso-

tetrafenilporfirina, eleva a anfifilicidade da molécula e diminui o grau de agregação do

fotossensibilizador, afetando as propriedades fotofísicas da substância como o rendimento

quântico do estado triplete 7. Entretanto, estudos in vitro 59 e in vivo 60 têm demonstrado

que as meso-tetrafenilporfirinas sulfonadas são neurotóxicas, pois provocam a morte de

neurônios, inibem o crescimento de neuritos (prolongação dos neurônios) e diminuem a

velocidade de condução dos impulsos nervosos. Nestas pesquisas também foram avaliadas

as toxidades de outros fotossensibilizadores e os resultados são mostrados na tabela 2. Não

há informações na literatura sobre a toxidade do InTPP ou da meso-tetrafenilporfirina não

sulfonada.


23

Tabela 2 – Concentração de fotossensibilizador necessária para inibir 50% do crescimento do neurito.

Porfirina Concentração

ALA > 1,5 mM

Uroporfirina I 100 µM

Coproporfirina I 100-500 µM

Protoporfirina IX 50 nM

Meso-tetrafenilporfirina sulfonada 6 µM

Derivado de Hematoporfirina 50-100 µM

Os derivados das tetrafenilporfirinas são compostos de grande interesse na PDT,

devido à alta eficiência na geração de oxigênio singlete, cuja propriedade depende da

natureza do íon metálico central e do caráter dos substituintes periféricos. Por exemplo, o

GaTPP (meso-tetrafenilporfirina de Ga), apresentado na figura 6, é caracterizado pela alta

solubilidade em solvente orgânico e apreciável estabilidade fotoquímica. Experimentos

mostraram que o GaTPP, devido ao “efeito do átomo pesado”, apresenta rendimentos

quânticos de geração de oxigênio singlete relativamente altos, constituindo-se em um

fotossensibilizador em potencial para tratamento de câncer através da PDT 24,61,62.

Estudos realizados por Cañete et. al.63 demonstraram que a meso-tetrafenilporfirina

(TPP) incorporada em sistemas vesiculares (lipossoma) apresenta eficiência fotodinâmica

para uso em PDT, em razão dos resultados obtidos quando culturas de células cancerígenas

(Hela) foram irradiadas na presença de TPP (5 a 100 µM).

ClN

N

N

NGa

Figura 6 – Estrutura da meso-tetrafenilporfirina de Ga.


24

A meso-tetrafenilporfirina de índio é uma substância que já foi estudada para ser

utilizada como um radiomarcador64,65. Os radiomarcadores são compostos que têm várias

aplicações clínicas, como a identificação de plaquetas, eritrócitos e leucócitos presentes em

órgãos normais ou doentes64. Isto permiti a detecção de lesões inflamatórias bem como de

coágulos sanguíneos intravasculares por imagens64,65. Estudos in vitro64,65 demonstraram

que o InTPP foi eficiente em identificar as plaquetas e leucócitos sem causar alterações na

fisiologia celular. Na presença de eritrócitos o InTPP tende a se deslocar das plaquetas para

as hemácias, não sendo um bom radiomarcador de plaquetas nestas condições. Estudos in

vivo65 demonstraram que o InTPP mostrou uma excelente visualização da medula óssea em

pacientes com anemia hemolítica. Em razão do InTPP ser bem mais barato do que o

Photofrin® (250 mg de InTPP custam U$ 105 enquanto e 75 mg de Photofrin® custam U$

2.200) e em razão do InTPP apresentar estrutura semelhante ao GaTPP, torna-se

interessante em termos de custo e propriedades fotofísicas/fotoquímicas o seu estudo para

aplicação em terapia fotodinâmica.

2. OBJETIVOS

Este trabalho tem os seguintes objetivos: a) investigar, in vitro, a habilidade do

meso-tetrafenilporfirina de índio (InTPP), para atuar como potencial fotossensibilizador na

PDT; b) investigar qual o mecanismo (tipo I ou II) está envolvido na fotoxidação de

biomoléculas.

3. JUSTIFICATIVA

A meso-tetrafenilporfirina de gálio (GaTPP) é um fotossensibilizador que apresenta

alta eficiência na geração de oxigênio singlete, sendo uma substância fotoativa de 25 a 30

vezes mais potente que a hematoporfirina em ensaios biológicos, in vivo, para tratamento

de células cancerígenas 66,67. A meso-tetrafenilporfirina de índio é uma substância que tem

a mesma estrutura química do GaTPP e ambos os átomos centrais pertencem ao mesmo

grupo da tabela periódica, sendo que vários artigos relatam o potencial das meso-

tetrafenilporfirinas em PDT 24,62,66,67. Dessa forma, será investigado, in vitro, a habilidade

do InTPP em atuar como novo potencial sensibilizador para a PDT.


25

Conforme algumas publicações 3,68,69, o oxigênio singlete produzido no mecanismo

tipo II, tem maior difusibilidade do que os radicais produzidos pelo mecanismo do tipo I, e

a velocidade das reações de transferência de energia (mecanismo tipo II), entre o oxigênio

e o fotossensibilizador no estado triplete, é maior quando comparada às reações de

transferência de elétrons (mecanismo tipo I)18. Mediante estas informações, torna-se

necessário a investigação do mecanismo (I e II) envolvido na fotoxidação da biomolécula

pelo fotossensibilizador, já que o oxigênio singlete é um agente citotóxico mais eficiente

que os radicais gerados no mecanismo do tipo I.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Reagentes e Equipamentos

O cloreto de meso-tetrafenilporfirina de índio foi adquirido da Porphyrin Products

Inc., com grau de pureza maior que 95% e o Photofrin foi cedido pela Axcan Pharma

Ltda, com grau farmacéutico. A dimetilformamida (DMF) foi obtida da VETEC Química

Fina Ltda, o polioxietileno-sorbitan monolaurato (Tween 20) e o triptofano foram

adquiridos da Sigma , a albumina bovina foi obtida da Quimibrás Ind. Químicas Ltda., a

água deuterada foi obtida da Aldrich enquanto que a azida de sódio, o fosfato

monobásico e dibásico de potâssio, o cloreto de sódio e o cloreto de potâssio, foram

obtidos da Merck®. O sangue utilizado nos ensaios de hemólise de eritrócitos, foi cedido

pelo Hemocentro do Hospital das Clínicas da UNICAMP.

Foram utilizados os espectrofluorímetros PTI LS-100TM – Luminescence System

LS-100TM e ISS PC1TM – Photon Counting; o espectrofotômetro Hewlett Packard 8453A

– Diode Array; uma lâmpada de mercúrio HPLN 80W (Phillips) contendo filtro para

bloqueio das emissões abaixo de 400 nm e acima de 600 nm; as centrífugas NT-811 (Nova

Técnica) e Revan 14000D (Revan Instrumentos Científicos); a balança analítica Mettler

AE200 e a microbalança Perkin Elmer AD-6 Autobalance.

4.2 Determinação do comprimento de onda de excitação e de emissão.

O comprimento de onda de excitação de cada fotossensibilizador (InTPP e

Photofrin ) em uma solução de tampão fosfato (PBS) pH 7.2 contendo 1% (v:v) de

Tween 20 foi obtido através do espectro de absorção na região do UV-Visível. Os


26

comprimentos de onda de emissão dos fotossensibilizadores foram obtidos no

espectrofluorímetro através da excitação da molécula no comprimento de onda onde a

mesma apresentou maior absorbância.

4.3 Estudo do estado de agregação do fotossensibilizador

4.3.1 Influência da concentração de Tween 20 e % de fase aquosa no estado de

agregação do InTPP

A fim de se minimizar a agregação do fotossensibilizador, otimizou-se a

concentração de surfactante presente em PBS pH 7.2 e 5% de DMF, fixando-se a

concentração de InTPP (15,3 mg.L-1) e variando-se a porcentagem de Tween 20 em PBS

(0 a 1% (v:v)). A concentração do surfactante foi mantida bem acima da CMC de valor

0,04 mM 70 para que o fotossensibilizador pudesse ser totalmente incorporado pelas

micelas. A excitação do InTPP foi feita no comprimento de onda 427 nm e a emissão foi

verificada em 613 nm para cada concentração pesquisada de surfactante (vide figura 10,

p.41). Foi utilizada fenda de excitação e de emissão de 4 nm e uma cubeta de quartzo

triangular de dimensão 1,4x1,0x1,0 cm.

O InTPP é um composto extremamente hidrofóbico, sendo necessária a utilização

de solvente orgânico (DMF) para solubilização do mesmo. Portanto, foi averiguada a

influência da porcentagem de fase aquosa sobre o processo de agregação do InTPP, para

que a menor porcentagem possível de solvente orgânico fosse utilizada, através da medida

da fluorescência do InTPP, mantendo-se sua concentração (15,3 mg.L-1) e a de Tween 20

(1% v:v) fixas, diminuindo-se a porcentagem de DMF e aumentado-se a porcentagem de

tampão PBS pH 7.2 (0 a 95%). Houve formação de emulsão quando foram utilizadas

concentrações abaixo de 40% de fase aquosa, impossibilitando as medidas de fluorescência

nesta faixa de concentração. Portanto, os resultados obtidos (vide p. 41) compreendem os

experimentos realizados com 0% de fase aquosa e com concentrações acima de 40% de

fase aquosa.


27

4.3.2 Determinação da constante de dimerização.

Duas considerações foram feitas para se obter a constante de dimerização: 1) a

baixas concentrações, a dimerização é o processo de agregação dominante; 2) entre

monômeros e dímeros presentes em solução, somente os monômeros fluorescem 71. Dessa

forma, pode-se representar o processo de dimerização como 71:

2M D ; KD = [D]/[M]2 (1)

[T] = [M] + 2.[D] (2)

onde: [M] é a concentração do monômero, [D] é a concentração do dímero, KD é a

constante de equilíbrio e [T] é a concentração total analítica.

A partir da equação (1) e (2), obtém-se a seguinte expressão:

[T] / [M] = 2.KD.[M] + 1 (3)

Como a [M] é proporcional à fluorescência medida, isto é: F = α.[M], onde α é uma

constante de proporcionalidade e F é a fluorescência, substituindo [M] na equação (3),

pode-se chegar a expressão abaixo:

[T] / F = 2.KD.α-2.F + α-1 (4)

através da inclinação e da intercecção do gráfico [T] / F contra F pode-se obter o valor de

KD.

Inicialmente, foi determinada a faixa de concentração do InTPP, cuja intensidade de

fluorescência era suprimida devido à formação de agregados, medindo-se a fluorescência

do InTPP (0,01 - 2,5 µM) na presença de Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e tampão

fosfato pH 7.2.

O InTPP foi excitado no comprimento de onda onde houve a maior absorção do

composto (427 nm). A fluorescência no comprimento de onda de máxima emissão (606

nm) foi utilizada para se calcular a constante de dimerização (vide resultados p.43) sendo


28

utilizada nas medidas de fluorescência, uma cubeta de quartzo triangular de dimensão

1,4x1,0x1,0 cm e fendas de excitação e emissão de 8,0 nm.

Medidas da absorbância de soluções de InTPP (0-2,5 µM), na presença de Tween

20 1% (v:v) , 5% (v:v) de DMF e tampão fosfato pH 7.2, foram realizadas para se avaliar a

sensibilidade do método espectrofotométrico na identificação do processo de agregação,

através da análise da linearidade do gráfico de absorbância versus concentração do

fotossensibilizador. As medidas espectrofotômetricas foram realizadas, utilizando-se cubeta

de vidro (caminho ótico 0,5 cm), e os valores de absorbância utilizados na construção do

gráfico de absorbância versus concentração, correspondem ao comprimento de onda de

máxima absorção do InTPP (427 nm).

4.4 Fotoxidação de Biomoléculas

4.4.1 Triptofano

Após borbulhamento de oxigênio por 20 minutos, uma amostra contendo 150 µM

de triptofano (Trp) e 15,3 mg.L-1 de InTPP em PBS pH 7.2, 5% de DMF e Tween 20 1%

(v:v), foi irradiada com lâmpada de Hg, por períodos de 7 minutos, durante cerca de 63

minutos, de forma que a cubeta contendo a solução a ser irradiada fosse mantida distante 5

cm do canhão de luz. A excitação do Trp foi realizada no comprimento de onda 281 nm e a

variação da intensidade de fluorescência foi acompanhada no comprimento de onda 355 nm

(vide figura 20, p. 52), utilizando-se fenda de excitação e emissão de 4,0 nm e cubeta de

quartzo triangular com dimensões 1,4x1,0x1,0 cm. Para efeito de comparação, o mesmo

experimento foi realizado na presença de Photofrin (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2,

Tween 20 1% (v:v) e ausência de DMF, sendo a excitação do Trp realizada no

comprimento de onda 271 nm e a variação da intensidade de fluorescência acompanhada no

comprimento de onda de emissão de 340 nm (vide figura 20, p.52). Estes experimentos

foram realizados em duplicata e destes foram obtidas as constantes de velocidade da

fotoxidação, conforme será demonstrado no item 4.4.3.

Para avaliação da influência de diferentes concentrações de fotossensibilizador na

velocidade de fotoxidação de biomoléculas, foram realizados novos experimentos,

variando-se a concentração de InTPP e Photofrin (1 a 27 mg.L-1).


29

4.4.2 Albumina Bovina (BSA)

Após borbulhamento de oxigênio por 20 minutos, amostras contendo 23,5 µM de

BSA e 1-14 mg.L-1 de InTPP em PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v),

foram irradiadas com lâmpada de Hg, por períodos de 2 a 5 minutos, durante cerca de 70

minutos, de forma que a cubeta contendo a solução a ser irradiada fosse mantida distante 5

cm do canhão de luz. A fotoxidação da BSA foi acompanhada através da variação da

intensidade do máximo de fluorescência em 323 nm (vide figura 24, p.58), sendo utilizado

o comprimento de onda 279 nm para excitar a molécula, uma cubeta de quartzo triangular

com dimensões 1,4x1,0x1,0 cm e fenda de excitação e emissão de 4,0 nm. Para efeito de

comparação, o mesmo experimento foi realizado na presença de Photofrin (1-18 mg.L-1),

tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e ausência de DMF, sendo a excitação da BSA

realizada no comprimento de onda 279 nm e a variação da intensidade de fluorescência

acompanhada no comprimento de onda de emissão de 320 nm. Estes experimentos foram

realizados em duplicata e destes foram obtidas as constantes de velocidade da fotoxidação,

conforme será demonstrado no item 4.4.3.

4.4.3 Cálculo da constante de velocidade

Embora as reações de fotoxidação possam ocorrer via mecanismo tipo I ou II, a

maioria das reações ocorrem via mecanismo tipo II, conforme citado no item 1.3. Neste

projeto, como será demonstrado adiante, também foi observado que o mecanismo de ação

do InTPP na fotoxidação de biomoléculas (Trp e BSA), é do tipo II. Este mecanismo ocorre

segundo as reações elementares abaixo:

k2S1O2 Produto

1P hv 1

P* 3

P* ISC

3P

* 3O2

1P

1O2

k1

onde P é o fotossensibilizador e S é a biomolécula.


30

Considerando que a última reação seja a etapa mais lenta do mecanismo tipo II,

pode-se determinar a velocidade de consumo da biomolécula, conforme equação 5.

d [S] / dt = -k2.[1O2].[S] (5)

onde k2 é a constante de velocidade de 2a ordem.

Utilizando-se a lei de Henry 72, pode-se estimar a concentração de 3O2 nas soluções

a serem fotoxidadas. O seu valor estimado (2,6 mol.L-1) foi muito maior do que a

concentração experimental da biomolécula. Portanto a concentração do oxigênio singlete,

originária da 2a etapa do mecanismo, é praticamente constante e a equação (5) pode ser

reescrita como:

d [S] / dt = -k.[S] (6)

onde k é a constante de velocidade de pseudo-primeira ordem (k = k2.[1O2]).

Integrando-se a equação 6, obtém-se a conhecida lei de velocidade integrada,

conforme equação abaixo 73:

ln ([S] / [So]) = - k.t (7)

onde: [S] é a concentração da biomolécula num dado momento de irradiação, [So] é a

concentração inicial da biomolécula (t = 0), t = tempo e k é a constante de velocidade de

pseudo-primeira ordem.

Como foram utilizadas concentrações de biomoléculas onde se manteve uma relação

linear entre a fluorescência (F) da biomolécula e sua concentração, ou seja, F = α.[S], pode-

se substituir esta igualdade na equação (7), obtendo-se a equação abaixo:

ln (F / Fo) = - k.t (8)

onde F é a intensidade de fluorescência da biomolécula num determinado tempo de

irradiação e Fo é a intensidade de fluorescência inicial da biomolécula antes da irradiação.


31

A partir do gráfico de ln (F / Fo) versus tempo de irradiação, foi possível, através do

coeficiente angular, determinar a constante de velocidade (k) da fotoxidação das

biomoléculas.

4.4.4 Sistema utilizado na fotoxidação de biomoléculas

O sistema utilizado na fotoxidação de biomoléculas consiste de um canhão de luz, o

qual é constituído por uma lâmpada de mercúrio de 80W, um compartimento contendo

água, a fim de se absorver a radiação infravermelha e um filtro que permite a passagem da

radiação emitida pela lâmpada na região entre 400 a 600 nm, sendo que as soluções a serem

fotoxidadas eram mantidas 5 cm distantes do canhão, conforme figura 7.

1 2

3

Figura 7 – Sistema utilizado na fotoxidação de biomoléculas. (1-Filtro, 2-Compartimento com água e 3-Lâmpada de mercúrio). 4.5 Fotobranqueamento do InTPP

Na literatura, há vários termos que são empregados para se referir à degradação de

corantes e pigmentos em relação à radiação. Os mais freqüentemente usados são

fotodesbotamento e fotobranqueamento. Em fotoquímica ou fotobiologia, o termo

fotobranqueamento (ou branqueamento) é geralmente usado para se definir a perda da

intensidade de absorção ou emissão de uma substância, quando exposta à luz 74. Há dois

tipos de fotobranqueamento que resultam em modificações químicas nos cromóforos: a

fotomodificação, onde há diminuição da absorbância ou fluorescência em alguns

comprimentos de onda, em decorrência de alterações estruturais resultantes de reações de

fotoadição ou fotociclisação, de forma que o cromóforo se mantenha nesta forma

modificada, e o fotobranqueamento verdadeiro, onde variações químicas profundas,


32

decorrentes de reações de fotoredução ou fotoxidação, resultam na fragmentação da

substância e na perda acentuada da absorbância e fluorescência. Segundo Bonnett et al.74,

em sistemas onde ocorrem modificações, freqüentemente, também ocorrem

fotobranqueamentos de forma concomitante.

Vários estudos têm sido realizados sobre o fotobranqueamento de

fotossensibilizadores, devido a sua importância na eficiência da PDT75,76,77.

Fotossensibilizadores que são fotobranqueados, muito rapidamente, quando irradiados com

feixe de luz, podem prejudicar a destruição do tumor, tornando-a incompleta 75. Portanto, o

fotobranqueamento dos fotossensibilizadores deve ser considerado no cálculo da dose

fotodinâmica (definida como o produto entre a concentração do fotossensibilizador e a dose

de luz, onde se obtém a mesma resposta biológica)77,78. Para fotossensibilizadores

fotoestáveis, como ftalocianinas de alumínio tetrasulfonadas ou meso-tetrafenilporfirinas

tetrasulfonadas, a dose fotodinâmica (E) é definida como 77:

E = c.j (9)

onde c é a concentração do fotossensibilizador (mg.Kg-1) e j é a dose de luz incidente

(J.cm-2). Quando o fotobranqueamento dos fotossensibilizadores é significante durante a

irradiação, como em clorina e6 onde mais de 50% da absorção inicial é reduzida em uma

dose de iluminação de 100 J.cm-2, deve-se calcular a dose fotodinâmica conforme abaixo:

E c e- j= −β

β[ ].1 (10)

onde c é a concentração do fotossensibilizador (mg.Kg-1), j é a dose de luz incidente

(J.cm -2) e β é a constante de velocidade de fotobranqueamento do fotossensibilizador

(J-1.cm2).

Portanto, a fim de se determinar a constante de velocidade de fotobranqueamento do

InTPP, uma solução de meso-tetrafenilporfirina de índio (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH

7.2, Tween® 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, foi irradiada utilizando-se uma lâmpada de

mercúrio, por cerca de 100 minutos, sendo acompanhado a variação da intensidade de

fluorescência do InTPP no comprimento de onda 613 nm e a excitação realizada em 427


33

nm. Este ensaio foi realizado em duplicata, sendo utilizado uma cubeta de quarto triangular

com dimensões 1,4x1,0x1,0 cm e fendas de excitação e emissão de 4,0 nm.

4.6 Hemólise de células vermelhas do sangue

O sangue utilizado nos ensaios de hemólise de eritrócitos foi cedido pelo

Hemocentro do Hospital das Clínicas da UNICAMP, sendo coletado num frasco contendo

EDTA como anticoagulante, 48 horas antes da análise, e mantido sob refrigeração até a

utilização. O soro e os leucócitos foram separados das células vermelhas através de

centrifugação à 2000g por 10 minutos. As células vermelhas do sangue foram então lavadas

com 3 vezes o seu volume, utilizando-se uma solução 0,85% (m/v) de NaCl, e em seguida,

centrifugadas à 3000g por 10 minutos, para eliminação de resíduos de anticoagulante, soro

e leucócitos, sendo este procedimento realizado 3 vezes.

Antes da realização da fotoxidação das suspensões de eritrócitos, na presença dos

fotossensibilizadores, foram avaliadas as influências do Tween® 20 e do DMF na

porcentagem de hemólise de eritrócitos, a fim de se minimizar a interferência destes

compostos na hemólise das células vermelhas do sangue, devido à ação dos

fotossensibilizadores. Para o ensaio, as seguintes soluções foram preparadas:

a) Branco B(1): solução contendo tampão PBS pH 7.4 e solução de Tween 20 (0 - 0,15%

v:v), ou tampão PBS pH 7.4 e DMF (1,6 - 13,25% v:v).

b) Branco B(2): solução contendo tampão PBS pH 7.4, Tween 20 (0 - 0,15% v:v) e 0,5%

(v:v) de hemácias ou tampão PBS pH 7.4, DMF (1,6 - 13,25% v:v) e 0,5% (v:v) de

hemácias.

As soluções acima foram irradiadas com uma lâmpada de Hg durante um período

máximo de até 60 minutos. Durante este período, alíquotas de 550 µL eram retiradas da

solução irradiada em intervalos de 10 minutos e centrifugadas à 2000g por 5 minutos,

sendo o sobrenadante coletado e analisado espectrofotometricamente na faixa de 180 a 820

nm, utilizando-se uma cubeta de vidro com caminho ótico de 0,5 cm, a fim de se detectar a

absorbância da oxihemoglobina em 542 nm (vide figura 28, p. 64), liberada em função do

rompimento da membrana das células vermelhas do sangue, devido à ação do surfactante e

do solvente orgânico.


34

Para o cálculo da porcentagem de hemácias lisadas, devido à ação do Tween 20

(0-0,15% v:v) ou do DMF (1,6-13,25% v:v) na ausência de fotossensibilizador, foi utilizada

a seguinte equação abaixo:

AHemólise (Branco) = ABranco B(2) - ABranco B(1) (11)

onde: AHemólise (Branco) é a absorbância da oxihemoglobina em 542 nm, ABranco B(2) é a

absorbância da solução nomeada como Branco B(2) em 542 nm e ABranco B(1) é a

absorbância da solução designada Branco B(1) em 542 nm.

Para o acompanhamento da hemólise de eritrócitos, devido à ação dos

fotossensibilizadores, foram preparadas as seguintes soluções:

a) Branco A: solução contendo tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween 20, 1,6% (v:v)

de DMF e 0,5% (v:v) de hemácias.

b) Amostra A: solução contendo tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween 20, 1,6%

(v:v) de DMF, 0,5% (v:v) de hemácias e solução do fotossensibilizador (0,2-15,3 mg.L-1).

Nos ensaios de hemólise de eritrócitos, realizados na presença de Photofrin , não

houve a necessidade de DMF, uma vez que o fotossensibilizador é solúvel em meio aquoso.

Portanto, nenhuma das soluções utilizadas no ensaio (branco A e amostra A) continham o

solvente orgânico.

Após um período de incubação de 20 minutos (no escuro à temperatura ambiente),

as soluções acima citadas, foram irradiadas com lâmpada de Hg durante um período

máximo de até 120 minutos. Durante este período, alíquotas de 550 µL eram retiradas da

solução irradiada em intervalos de 10 ou 20 minutos e centrifugadas à 2000g por 5 minutos,

sendo o sobrenadante coletado e analisado espectrofotometricamente na faixa de 180 a 820

nm, utilizando-se uma cubeta de vidro com caminho ótico de 0,5 cm, a fim de se detectar a

absorbância da oxihemoglobina (542 nm), liberada em função do rompimento da

membrana das células vermelhas do sangue, devido à ação citotóxica de espécies reativas

(1O2, O2 . -, OH.) geradas na PDT.

Para o cálculo da porcentagem de hemácias lisadas, devido à ação do

fotossensibilizador, foi utilizado a seguinte equação:


35

AHemólise = AAmostra A - ABranco A - AFotossensibilizador (12)

onde: AHemólise é a absorbância da oxihemoglobina em 542 nm, ABranco A é a absorbância da

solução nomeada como Branco A em 542 nm e AFotossensibilizador é a absorbância do

fotossensibilizador em 542 nm.

A concentração de hemácias lisadas foi obtida através da Lei de Beer 72:

AHemólise = ε.b.c (13)

onde: AHemólise é a absorbância da oxihemoglobina em 542 nm, ε = coeficiente de hemólise

[(cm.%)-1], b = caminho ótico (0,5 cm) e c = concentração de hemácias lisadas [% ( v:v)].

O coeficiente de hemólise [(2,6 ± 0,2)/(cm.%)-1] foi obtido utilizando-se a Lei de

Beer, medindo-se a absorbância da oxihemoglobina em 542 nm da solução totalmente

hemolisada de 0,5% (v:v) de eritrócitos em PBS pH 7.4, Tween 20 0,05% (v:v) e o

fotossensibilizador (0,2-15,3 mg.L-1), após um período de 20 minutos num banho de ultra-

som.

Conhecendo-se a concentração de hemácias lisadas, foi possível a determinação da

porcentagem de eritrócitos hemolisados, conforme equação abaixo:

% Hemólise = (c x100)/0,5 (14)

onde c = concentração de hemácias lisadas em % e 0,5 = concentração inicial de hemácias

em % (v:v).

4.7 Determinação do mecanismo envolvido na fotoxidação de biomoléculas

Tem sido observado que a água deuterada (D2O) aumenta em torno de 10 a 26 vezes

o tempo de vida do 1O2 (2-3 µs) 31,79. Portanto, a presença de D2O no meio reacional deve

aumentar a constante de velocidade da reação de fotoxidação das biomoléculas (Trp e

BSA) e de eritrócitos, caso o mecanismo preponderante seja o do tipo II.

A azida de sódio (NaN3) é um eficiente supressor de oxigênio singlete 79,80.

Portanto, ao se adicionar NaN3 no meio reacional, espera-se que a constante de velocidade


36

da reação de fotoxidação das biomoléculas diminua, caso o mecanismo preponderante seja

do tipo II. Para avaliar o mecanismo envolvido na fotoxidação do Trp (tipo I ou II), foram

averiguadas as influências da água deuterada (0-50% v:v) e da azida de sódio (0-2,0 mM)

sobre as constantes de velocidade da reação de fotoxidação do Trp 150µM, contendo InTPP

(20 µM), tampão PBS pH 7.2 , 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v).

A avaliação do mecanismo de fotoxidação da BSA, foi realizada através da

influência da porcentagem de água deuterada (0-50% v:v) na constante de velocidade da

reação de fotoxidação da BSA (23 µM), contendo InTPP (1,1 µM) , tampão PBS pH 7.2,

5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v). Um novo experimento foi realizado para

averiguar a influência da azida de sódio (NaN3) (0-2,5 mM) na constante de velocidade da

reação de fotoxidação da BSA (116 µM), contendo InTPP (24 µM), tampão PBS pH 7.2,

5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v).

O mecanismo de ação do InTPP, na fotoxidação de hemácias, foi avaliado através

da influência da porcentagem de D2O (0-75% v:v) na porcentagem de hemólise de uma

solução 0,5% (v:v) de eritrócitos, em tampão PBS pH 7.4, 1,6% (v:v) de DMF, Tween 20

0,05% (v:v) e InTPP (6,4 µM), irradiada com uma lâmpada de Hg por um período de 60

minutos.

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Espectros de absorção e de emissão dos fotossensibilizadores

As porfirinas apresentam uma forte delocalização de elétrons π, a qual é responsável

pelo caráter aromático do núcleo porfirínico, resultando numa pequena diferença de energia

entre o HOMO (orbital preenchido de maior energia) e o LUMO (orbital vazio de menor

energia) e, consequentemente, no aumento das intensidades das bandas de absorção do

visível e do ultravioleta 81. As bandas do visível, em geral, são oriundas de transições do

tipo π-π*, e as transições do tipo n-π*, são típicas de porfirinas substituídas com grupos

carbonílicos 82.

As metaloporfirinas apresentam três bandas de absorção características, na região do

visível: uma banda mais intensa designada como Banda de Soret a qual é originária do

segundo estado singlete excitado, ocorrendo normalmente a 420 nm, relacionada à


37

transição de um orbital a1u para o orbital degenerado eg (referente a progressão vibrônica ν0

→ ν0), e duas bandas de menor intensidade, chamadas de Bandas Q. A banda de menor

energia (Banda α) é originária do primeiro estado singlete excitado e está relacionada à

transição de um orbital a2u para o orbital degenerado eg (referente a progressão vibrônica ν0

→ ν0), enquanto que a segunda banda (Banda β), está relacionada à transição de um orbital

a2u para um orbital eg (referente a progressão vibrônica ν0 → ν1) 81,82,83,84,85.

Tem-se observado que porfirinas metaladas com Ni(II), Co(II) e Cu(II), estáveis em

relação a dissociação do metal, apresentam a banda α mais intensa do que a β, enquanto

que porfirinas metaladas com Mg(II), Zn(II), Cd(II) e Mn(II), menos estáveis em relação a

dissociação do metal, apresentam a banda β mais intensa do que a α81.

Os espectros de absorção das porfirinas não metaladas diferenciam-se das metaladas

por apresentarem 4 bandas Q ao invés de 2 bandas. As porfirinas não metaladas apresentam

distorções na sua estrutura principal da molécula, ou seja, no conjunto dos anéis pirrólicos,

ocasionando uma diferença de 25 a 29 KJ.mol-1 entre os níveis de energia, e

consequentemente, o aumento do número de bandas Q. Como em porfirinas não metaladas

os dipolos relacionados às transições π-π* não são equivalentes nas direções x e y, devido

às distorções na estrutura principal da molécula, a banda Qx (ν0 → ν0) não estará

convoluída com a banda Qy (ν0 → ν0), nem a banda Qx (ν0 → ν1) estará convoluída com a

banda Qy (ν0 → ν1), resultando em quatro bandas Q. A primeira banda (de maior energia) é

identificada como banda IV (Qx, ν0 → ν1) , a segunda como III (Qx, ν0 → ν0), a terceira

como II (Qy, ν0 → ν1) e a última (de menor energia) como I (Qy, ν0 → ν0) 82. Nas porfirinas

metaladas, com simetria D4h (planar), as transições π-π* apresentam dipolos equivalentes

nas direções x e y, de maneira que apenas uma banda referente à transição ν0 → ν0 será

observada, assim como, uma banda referente a transição ν0 → ν1, resultando em duas

bandas Q.

Os espectros de absorção e fluorescência de uma solução de InTPP 8,5 mg.L-1 em

tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v) e de uma solução de

Photofrin 15,3 mg.L-1, em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF, foram

obtidos para identificação do comprimento de onda de excitação e de emissão dos

fotossensibilizadores, conforme figura 8.


38

360 420 480 540 600 660 720

0.00

0.35

0.70

1.05

1.40

1.75

0.00

0.35

0.70

1.05

1.40

1.75A Absorção Emissão

665

613

602563

427

Intensidade de fluorescência (x 3,04.10

-5)

Abso

rbân

cia

Comprimento de onda (nm)

300 400 500 600 700 800

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2B Absorção Emissão

Intensidade de Fluorescência (x 1,03.10

-3)

624

695

574536503

630404

Abso

rbân

cia


Figura 8 – (A) Espectros de absorção e de emissão do InTPP (8,5 mg.L-1) , em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v). (B) Espectros de absorção e de emissão do Photofrin (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF. Os espectros de emissão da figura A e B foram obtidos utilizando-se o espectrofluorímetro PTI LS-100TM – Luminescence System LS-100TM.

Pode-se observar pela figura 8 que os espectros de absorção do InTPP e Photofrin®

apresentam uma banda com máxima intensidade em 427 e 404 nm, respectivamente, a qual

é conhecida como banda de Soret. Estes comprimentos de onda (404 e 427 nm) foram

utilizados na excitação dos fotossensibilizadores para a obtenção dos espectros de emissão.

As bandas com máximo em 563 e 602 nm, pertencentes ao espectro de absorção do InTPP,

correspondem às Bandas Q, respectivamente as bandas β e α. As bandas com máximo em

503, 536, 574, e 624 nm pertencentes ao Photofrin , correspondem às bandas Q,

respectivamente as bandas IV, III, II e I.

Os espectros de fluorescência, tanto do InTPP quanto do Photofrin®, são

caracterizados pela presença de duas bandas, com máximo de intensidade em 613 e 665

para o InTPP e em 630 e 695 nm para o Photofrin®.

Na região espectral de 575 a 650 nm, p ode-se identificar a convolução das bandas

de fluorescência e de absorbância tanto para o InTPP quanto para o Photofrin , sendo o

fenômeno chamado de supressão de fluorescência por autoabsorção, como pode ser

observado na figura 9.


39

500 550 600 650 700

0.00

0.03

0.06

0.09

0.12

0.00

0.03

0.06

0.09

0.12

A602

665

613563


-6)

Absorção Emissão

Abso

rbân

cia


560 595 630 665 700 735

0.000

0.018

0.036

0.054

0.072

0.000

0.018

0.036

0.054

0.072

B

Absorção Emissão

624

574

695

630


-5)

Abso

rbân

cia


Figura 9 – Convolução dos espectros de absorção e emissão do (A) InTPP (8,5 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v), e do (B) Photofrin (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.

A supressão de fluorescência por autoabsorção ocorre quando moléculas do

fotossensibilizador, que ainda não foram excitadas, absorvem a radiação emitida por

fluorescência pelas moléculas excitadas. Este processo altera os valores do rendimento

quântico de fluorescência do fotossensibilizador. Este problema foi solucionado, utilizando-

se uma cubeta triangular de quartzo, a qual permite que o feixe de excitação atinja a cubeta

à 45o e a fluorescência seja detectada à 45o, de forma que a emissão esteja associada à

fluorescência das moléculas que estão adjacentes à superfície da cubeta, resultando na

diminuição do efeito de autoabsorção. Na cubeta quadrada, a fluorescência é detectada à

90º e a emissão não está associada unicamente às moléculas que estão adjacentes à

superfície da cubeta, de forma que a sua utilização não reduz o processo de autoabsorção.

5.2 Estudo do estado de agregação do fotossensibilizador

5.2.1 Influência da concentração de Tween 20 e % de fase aquosa no estado de

agregação do InTPP

A hidrofobicidade tende a diminuir o potencial terapêutico dos

fotossensibilizadores86. Isto porque compostos apolares tendem a se agregar em soluções

aquosas, provocando a diminuição do tempo de vida dos estados singlete e triplete do

fotossensibilizador. Isto resulta na diminuição do rendimento quântico do oxigênio

singlete, o que diminui a eficiência fotodinâmica do fotossensibilizador 51,52.


40

Dados experimentais têm demonstrado que a adição de surfactantes, solventes

orgânicos ou proteínas do soro (como a albumina), diminuem o processo de agregação dos

fotossensibilizadores hidrofóbicos 86,87.

Para se estabelecer condições que minimizassem a agregação, foi avaliada a

influência do surfactante (Tween 20) na agregação do InTPP (15,3 mg.L-1) em tampão

PBS pH 7.2 e 5% (v:v) de DMF, através de medidas de fluorescência. Como houve a

necessidade da utilização de DMF para solubilização e mistura do InTPP com as soluções

de biomoléculas a serem fotoxidadas, foi avaliada a influência da porcentagem de fase

aquosa na agregação do InTPP, para se definir uma porcentagem máxima de fase aquosa

onde a agregação fosse a menor possível, através da medida de fluorescência de uma

solução 15,3 mg.L-1 de InTPP, na presença de tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e

porcentagens variadas de DMF. Ambos os resultados são mostrados na figura 10.

Pode-se verificar pela figura 10 (A) que a presença de Tween 20 na solução do

fotossensibilizador provocou o aumento da intensidade de fluorescência do InTPP,

indicando que a sua utilização realmente minimiza o processo de agregação, devido à

incorporação do fotossensibilizador nas micelas do surfactante, uma vez que a

concentração de Tween 20 está bem acima da concentração micelar crítica, conforme

item 4.3.1.

Através dos valores das intensidades de fluorescência da figura 10 (A) no

comprimento de onda 613 nm pode-se obter a figura 10 (B). Esta figura demonstra que

concentrações acima de 0,3% (v:v) de Tween® 20 ocasionam um aumento de 80% na

intensidade de fluorescência do InTPP. Pode-se também observar que a partir da

concentração 0,3% (v:v) de Tween® 20, praticamente não há variação da intensidade de

fluorescência do fotossensibilizador, entretanto, optou-se por trabalhar com uma

concentração de 1% de Tween 20.


41

580 600 620 640 660 680 7000

20

40

60

80

100

A% Tween(R) 20 1,00 0,30 0,10 0,02 0,00

613

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia


570 600 630 660 6900

40

80

120

160

200613 C

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia


% de Fase aquosa 0 40 50 60 90

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

B

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

Rel

ativ

a

Concentração Tween 20 (% v:v)

0 20 40 60 80 1000,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

D

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

R

elat

iva

% Fase aquosa (v:v)

Figura 10 – (A) Variações do espectro de fluorescência ou (B) da intensidade de fluorescência em 613 nm do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e diferentes concentrações de Tween® 20. (C) Variações do espectro de fluorescência ou (D) da intensidade de fluorescência em 613 nm do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e diferentes porcentagens de fase aquosa. As figuras (A) e (C) não contém todos os espectros de emissão obtidos nos ensaios experimentais. Os valores das fluorescências estão normalizados nas figuras (B) e (D), sendo que o valor máximo, em unidades arbitrárias, é de 90 no gráfico (B) e de 179 no gráfico (D). Os espectros de emissão da figura (A) e (C) foram obtidos utilizando-se o espectrofluorímetro PTI LS-100TM – Luminescence System LS-100TM.

A figura 10 (C) demonstra que o aumento da porcentagem de fase aquosa na

solução do fotossensibilizador resulta na diminuição da intensidade de fluorescência do

InTPP. Como a meso-tetrafenilporfirina de índio é um composto hidrofóbico, o aumento

da porcentagem de água favorece o processo de agregação do fotossensibilizador,

resultando na supressão da fluorescência.

Através dos valores das intensidades de fluorescência da figura 10 (C) no

comprimento de onda 613 nm pode-se obter a figura 10 (D). Nesta figura observa-se que

entre 0 e 40% de fase aquosa, há uma diminuição de cerca de 50% na intensidade de

fluorescência, devido ao aumento da agregação do InTPP, e entre 40-95% de fase aquosa,


42

há uma queda mais suave da intensidade de fluorescência. Abaixo de 40% de fase aquosa

não foi possível obter informações do sistema, devido à formação de uma emulsão, a qual

impediu a obtenção das medidas de fluorescência. Como havia o interesse de se trabalhar

com a menor porcentagem possível de solvente orgânico, optou-se por trabalhar com uma

porcentagem de 95% de fase aquosa.

5.2.2 Determinação da constante de dimerização.

É possível avaliar a tendência de agregação dos fotossensibilizadores através da

determinação da constante de equilíbrio de dimerização (KD), a qual foi determinada

utilizando-se o modelo de Margalit 86, baseado em técnica fluorimétrica, para uma faixa de

concentração de 0-2,5 µM de InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween

20 1%(v:v).

Inicialmente, foi acompanhada a variação da intensidade de fluorescência do InTPP

em relação a concentração da solução, a fim de se determinar a faixa de concentração do

fotossensibilizador que causa supressão de fluorescência devido a formação de agregados,

obtendo-se, dessa forma, o gráfico de intensidade de fluorescência relativa versus

concentração do fotossensibilizador, conforme figura 11.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Inte

nsid

ade

de fl

uore

scên

cia

rela

tiva

[InTPP] (µM)

Figura 11 – Intensidade de fluorescência relativa versus concentração de InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v). Os valores da fluorescência estão normalizados, sendo que o valor máximo, em unidades arbitrárias, é aproximadamente 167000. As medidas de fluorescência neste ensaio foram realizadas no Espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting. Os pontos de cores diferentes representam experimentos realizados em duplicata.

Pela figura 11, pode-se verificar que a partir de 0,75 µM de InTPP há um desvio da

linearidade do gráfico, o que é um indício de que o fotossensibilizador está agregando 71,86.


43

No entanto, isto não significa que na região linear (0-0,75 µM) o fotossensibilizador esteje

no estado monomérico. Nesta faixa de concentração podem estar ocorrendo processos de

agregação, como formações de dímeros e trímeros, que não estão ocasionando a supressão

da fluorescência do InTPP. O gráfico de C/F versus F foi então obtido nesta faixa linear,

conforme citado no item 4.3.2, sendo apresentado na figura 12.

10000 11000 12000 13000 14000

1.2x10-12

1.6x10-12

2.0x10-12

2.4x10-12

KD = 4,52x107

KD = 4,88x107

Con

cent

raçã

o / F

luor

escê

ncia

Fluorescência

Figura 12 – Gráfico C/F versus F para determinação da constante de dimerização do InTPP em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v).Os pontos de cores diferentes representam experimentos realizados em duplicata.

Para a construção do gráfico da figura 12, foram utilizados os dados obtidos na

figura 11 para concentrações abaixo de 0,04 µM, pois acima desta concentração, o modelo

matemático da Margalit et al. 71,86 não funciona, indicando que outros agregados maiores

(como trímeros ou tetrâmeros) estão sendo formados. O valor de KD, obtido através do

coeficiente angular do gráfico C/F versus F, conforme citado no item 4.3.2, foi de (4,7 ±

0,3)x107, sendo 100 vezes maior que a constante de dimerização da deuteroporfirina IX

[(6,5 ± 0,8)x105] e 10 vezes maior que a da mesoporfirina IX [(1,8 ± 0,7)x106] 86.

Observando-se as estruturas de ambos os compostos citados acima, conforme figura 13,

pode-se notar que a diferença estrutural entre a deuteroporfirina IX (DP) e a mesoporfirina

IX (MP) está na presença de duas etilas na MP, resultando num aumento de 10 vezes o

valor de KD para a MP, comparado ao valor da constante da DP 86. Como o InTPP não

apresenta grupos polares em sua estrutura, sua hidrofobicidade torna-se maior, resultando

num valor de KD maior em relação às outras porfirinas.


44

OH OH OO

N

N

NH

HN

A

HN

NH

N

N

O OH O OH B

ClN

N

N

N

In

C

Figura 13 – Estrutura da deuteroporfirina IX (A), mesoporfirina IX (B) e do InTPP (C).

Margalit et al.71,86 afirmaram que o método espectroscópico de absorção na região

do UV-visível, não é sensível o bastante para determinar diretamente o valor de KD, mas

apenas a sua ordem de magnitude. Alguns autores 88,89 se baseiam no desvio da

lineariadade da Lei de Beer para identificar a formação de agregados. Medidas da

absorbância de soluções de InTPP, na faixa de concentração de 0-2,5 µM de InTPP em

tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1%(v:v), foram obtidas e um gráfico de absorbância

versus concentração foi plotado, com a finalidade de se determinar a ocorrência de

agregação, conforme figura 14.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Concentração (µM)

Abso

rbân

cia

Figura 14 – Variação da absorbância do InTPP em função da concentração, em meio tamponado PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, no comprimento de onda 427 nm.

Pode-se verificar pela figura 14, que a relação entre absorbância e concentração do

InTPP na faixa de concentração 0-2,5 µM, obedece a lei de Beer, indicando erroneamente,

que não está ocorrendo agregação. Entretanto, através de métodos fluorimétricos conforme


45

figura 11, a formação de agregados foi identificada em função da supressão da

fluorescência a partir de 0,75 µM. Portanto, como Magalit et al. afirmaram 71,86, o método

espectroscópico de absorção não é sensível para se identifir a formação de agregados nem

para se determinar o valor de KD, porque nenhuma alteração espectral é observada a baixas

concentrações. No entanto, resultados experimentais 90,91 têm demonstrado que é possível a

determinação da constante de dimerização através de técnicas espectrofotométricas quando

há alterações no espectro de absorção do fotossensibilizador em razão da formação de

agregados.

A extensão dos agregados formados é grandemente influenciada pela estrutura

molecular, a natureza do íon metálico central e pelos grupos funcionais presentes nos

substituintes periféricos 53.

Resultados da literatura têm demonstrado que os derivados de hematoporfirina

podem se agregar através da ligação de unidades monoméricas via reações de formação de

éster, éter ou ligação C-C, formando agregados lineares, conforme representado na figura

153.


46

OH

HO

CO2Na CO2Na

NH

N

N

HN

Haematoporfirina

OCOCH3

CH3COO

CO2Na CO2Na

NH

N

N

HN

Diacetato de haematoporfirina

Formação de éter

OH

Formação de éster

Formação de ligação C-C

N OHN

OCOCH3

N O N NO

N

CO2

N

OCOCH3

N

O

O

N

N

HNN

OCOCH3 N

HN

N

Figura 15 – Formação de dímeros para os derivados de hematoporfirina3.

Karns et al.92 sugeriram que a dimerização das porfirinas está associada à

resistência do meio aquoso em abrir cavidades para as moléculas hidrofóbicas, resultando

na justaposição das superfícies hidrofóbicas, para minimizar a área exposta ao meio

aquoso. É proposto que a formação do dímero de hematoporfirina ocorra através das

interações π-π entre os anéis pirrólicos, resultando numa conformação do tipo H, também

conhecida como face-a-face, conforme representado na figura 16 93. Experimentos


47

realizados por Rotomskis et al.93, demonstraram que a agregação da hematoporfirina bem

como dos derivados de hematoporfirina são fortemente dependentes do pH, sendo mais

intensas em meio alcalino (pH 8-10) e desprezíveis em meio ácido (pH < 5,5).

COOHHO

HO

N

N

N

NH HN

NH HN

COOH

COOH

COOH Figura 16 – Conformação do tipo H (face-a-face) para agregados de hematoporfirina 93.

Udal’tsov et al.94 estudaram a agregação da meso-tetrafenilporfirina (TPP), em pH

ácido, através de técnicas fluorimétricas e microscopia eletrônica de varredura. Segundo

Udal’tsov et al.94, dímeros de TPP não se formam em condições usuais, devido à rotação

dos anéis fenílicos que dificulta a aproximação das moléculas. Contudo se os anéis

fenílicos contiverem substituintes periféricos, como um aminogrupo ou grupos ionizáveis,

a dimerização é observada. Estes pesquisadores observaram a formação de dímeros de

TPP, em soluções aquosas (pH ácido) contendo 7% (v:v) de solvente orgânico

(tetrahidrofurano), devido ao balanço entre as interações hidrofóbicas e as interações

ocasionadas pelas cargas localizadas na TPP protonada. O crescimento da estrutura do

agregado, na direção vertical, é suportado pelas interações do tipo ponte de hidrogênio

entre as moléculas de água que solvatam os dímeros, e horizontalmente, pela interação dos

anéis fenílicos de dímeros vizinhos, desde que ambos os anéis envolvidos na interação

promovam o contato, conforme estrutura proposta na figura 17 94.


48

H

OH

HO

H

NH

HNN

HN

N HN

N

N

H

OH

HO

H

NH

HNN

HN

N HN

N

N

Figura 17 – Interação entre dímeros de TPP para a formação de oligômeros94.

Gandini et. al.95 estudaram a agregação da meso-tetrafenilporfirina tetrasulfonada

(TPPS4) em pH ácido, utilizando-se a técnica de espalhamento de raio-X a baixo ângulo, e

verificaram que a TPPS4, em pH 4.0, agrega-se na forma de um cilíndro oco, com

agregados tipo J (interação lado a lado dos planos moleculares) na seção transversal e

agregados tipo H, entre as camadas dos cilíndros. A protonação dos nitrogênios cria cargas

positivas no anel porfirínico promovendo a atração eletrostática com os grupos sulfonatos

negativos, facilitando a agregação da TPPS495.

Em geral, os estudos fotofísicos e fotoquímicos referentes aos processos de

agregação das porfirinas, estão mais associados às porfirinas hidrofílicas, em meios ácidos

ou alcalinos. Neste trabalho, foi utilizado um meio tamponado (PBS pH 7.2), na presença

de um surfactante (Tween 20) e 5% (v:v) de solvente orgânico (DMF), para se determinar

a constante de dimerização do InTPP. Portanto, propor uma estrutura ou conformação do

agregado de InTPP neste sistema complexo, constituído de surfactante, tampão e solvente

orgânico, sem utilizar técnicas adequadas para a sua identificação, seria arriscado e repleto

de erro. Entretanto, pode-se esperar que a formação de dímeros e oligômeros estejam

fortemente influenciadas pela interação dipolar entre o solvente orgânico (DMF) e a

molécula de InTPP, a qual, embora hidrofóbica, apresenta uma polaridade que é resultante

da ligação entre o átomo de cloro e o índio. A formação de dímero tipo H, através da


49

interação π-π entre as moléculas do fotossensibilizador, é reduzida devido à rotação dos

anéis fenílicos que dificulta a aproximação entre as moléculas do InTPP.

A possibilidade da formação de dímeros de InTPP, através de pontes oxo

(InTPP-O-InTPP), é pequena, devido a baixa concentração de íons hidroxila (OH-) na

solução, oriundos da dissociação da molécula de água (1,0x10 -14 mol.L-1) 72, uma vez que

estamos trabalhando com soluções neutras (pH 7,2). Segundo dados da literatura 96, para

haver a formação de dímeros por pontes oxo, em porfirinas de Fe (III) ligadas a um átomo

de cloro, há a necessidade de excesso de OH-, resultando, inicialmente, na geração de uma

hidroxi porfirina, a qual interage com outra hidroxi porfirina, produzindo o dímero ligado

via ponte oxo e água, conforme figura 18.

OHN

N

N

NIn

ClN

N

N

NIn

OHN N

In

Cl

OH

O

NN In

N N

H2O

2N N

InN

N

N

N

Figura 18 – Formação de dímero através de ponte oxo

Vale ressaltar que os solventes orgânicos interferem na microestrutura dos

agregados obtidos em misturas de água e solvente orgânico (7% v:v). Microfotografias


50

obtidas por Udal’tsov 94 de agregados de meso-tetrafenilporfirina em misturas de água com

dioxano, com tetrahidrofurano e acetona, demonstraram que a forma, a superfície e as

dimensões dos agregados são diferentes, indicando a forte interferência dos solventes

orgânicos na formação dos agregados.

5.3 Fotoxidação de biomoléculas

5.3.1 Fotoxidação de triptofano

Antes da execução do experimento de fotoxidação das biomoléculas, foi obtido o

espectro da lâmpada de mercúrio (Hg), a qual foi utilizada como fonte de excitação para o

InTPP e o Photofrin , a fim de se demonstrar que a excitação dos fotossensibilizadores, foi

realizada por vários comprimentos de onda de emissão pertencentes à lâmpada de Hg,

conforme figura 19.

280 350 420 490 560 630 700

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0AIntensidade de Fluorescência (x 1,94.10

-1)

Comprimento de Onda (nm)

Abso

rbân

cia

Lâmpada InTPP

300 360 420 480 540 600 660

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0B Lâmpada Photofrin

Intensidade de fluorescência (x 1,14.10 -1)

Ab

sorb

ânci

a


Figura 19 – Espectro de emissão da Lâmpada de Hg e espectro de absorção (A) de InTPP (15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v), e (B) espectro de absorção do Photofrin (15,3 mg.L-1) em PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF.

Pela figura 19 pode-se verificar que a lâmpada de Hg apresenta 5 bandas intensas

em 366, 405, 436, 546 e 577 nm. A banda em 405 nm corresponde, praticamente, ao

comprimento de onda, onde o Photofrin apresenta máxima absorção em 404 nm (banda

Soret) e a banda em 577 nm está muito próxima ao comprimento de máxima absorção da

terceira banda Q do Photofrin (574 nm). A lâmpada de Hg não apresenta bandas que

correspondam, exatamente, ao máximo da absorção do InTPP. Portanto, a convolução dos

espectros da lâmpada e do Photofrin é maior do que entre a lâmpada e o InTPP.

Entretanto, isto não pode ser considerado como justificativa para se afirmar que o


51

Photofrin será excitado mais eficientemente que o InTPP, uma vez que a absorção dos

fotossensibilizadores, em soluções de mesma concentração (15,3 mg.L-1), é diferente em

termos da intensidade de absorbância para cada comprimento de onda. Esta diferença pode

estar associada ao fato de que as soluções dos fotossensibilizadores, embora, com a mesma

concentração em mg.L-1, não necessariamente são soluções equimolares, pois como o

Photofrin® é um oligômero, não se conhece seu peso molecular, de forma que não é

possível a determinação do número de moléculas do Photofrin® presentes em solução.

Portanto, se o número de moléculas do fármaco, em solução, for menor em relação ao

InTPP, o Photofrin® pode apresentar um espectro de absorção menos intenso do que a

meso-tetrafenilporfirina de índio, resultando num menor número de moléculas excitadas do

fármaco em comparação ao InTPP.

Assim como Lambert et al.97 e Ball et al.98 utilizaram a fotoxidação do triptofano

para avaliar a eficiência fotodinâmica de alguns derivados porfirínicos, foi avaliada a

capacidade do InTPP (15,3 mg.L-1) em fotoxidar uma solução 150 µM de Trp em tampão

PBS pH 7.2, 5% (v:v) de DMF e Tween 20 1% (v:v), comparado à capacidade do

Photofrin (15,3 mg.L-1) em fotoxidar uma solução de triptofano 150 µM, em tampão PBS

pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF. Inicialmente foram obtidos os espectros de

absorção e emissão do triptofano na presença de InTPP ou Photofrin®, conforme mostrados

na figura 20, a fim de se determinar o comprimento de onda onde há máxima absorção e

emissão.


52

240 270 300 330 360 390 4200,00

0,08

0,16

0,24

0,32

0,40

0,00

0,08

0,16

0,24

0,32

0,40

A

Absorção Emissão

355281


-4)

Abso

rbân

cia


240 270 300 330 360 390 420

0,00

0,14

0,28

0,42

0,56

0,00

0,14

0,28

0,42

0,56

B



-6)

340271

Abso

rbân

cia

Absorção Emissão

Figura 20 – (A) Espectros de absorção e emissão de uma solução 150 µM de triptofano em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20, 5% (v:v) de DMF e 15,3 mg.L-1 de InTPP. (B) Espectros de absorção e emissão de uma solução 150 µM de triptofano em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e 15,3 mg.L-1 de Photofrin®. O espectro de emissão da figura (A) foi obtido através do espectrofluorímetro PTI LS-100TM – Luminescence System LS-100TM e o espectro de emissão da figura (B) foi obtido através do espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting.

Na figura 20 pode-se verificar que o triptofano apresenta uma banda com máxima

absorção em 281 nm na presença de InTPP ou 271 nm na presença de Photofrin®. Os

espectros de emissão do triptofano foram obtidos utilizando-se os comprimentos de onda

281 nm e 271 nm para a excitação do aminoácido, resultando nas bandas de fluorescência

com máximo em 355 nm na presença de InTPP e 340 nm na presença de Photofrin®. Os

deslocamentos dos espectros de absorção e emissão do triptofano observado na figura 20

(B) comparado com a figura 20 (A) podem estar relacionados à ausência de DMF nos

ensaios realizados na presença de Photofrin® como podem estar relacionados às interações

do Trp e o fotossensibilizador. Os valores das intensidades de fluorescência do triptofano

nestes comprimentos de onda foram utilizados para se determinar o valor de ln(F/Fo) em

relação a um determinado tempo de irradiação, conforme citado no item 4.4.3. Os

resultados são mostrados na figura 21.


53

0 12 24 36 48 60-1,80

-1,44

-1,08

-0,72

-0,36

0,00 Fotoxidação com InTPP

A

k = 4,5x10-4 s-1

k = 4,0x10-4 s-1

ln (F

/Fo)

Tempo de irradiação (minutos)

0 15 30 45 60 75

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0,0 Fotoxidação com Photofrin

B

k = 3,57x10-4 s-1

k = 3,63x10-4 s-1

ln (F

/Fo)

Tempo de Irradiação (minutos)

Figura 21 – Gráfico ln(F/Fo) versus tempo de irradiação para a fotoxidação de triptofano (150 µM), na presença de (A) InTPP (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, e na presença de (B) Photofrin (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e sem DMF. Os pontos de cores diferentes representam experimentos realizados em duplicata. Pela figura 21 e equação 8, pode-se obter os valores das constantes de velocidade

de pseudo-primeira ordem, para as reações de fotoxidação do triptofano na presença de

InTPP e Photofrin , através do coeficiente angular dos gráficos plotados, sendo os valores

mostrados na tabela 3.

Tabela 3 – Constante de velocidade da fotoxidação do Trp (150 µM) na presença de InTPP ou Photofrin (15,3 mg.L-1), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v).

Fotossensibilizador k /(10-4 s-1)

InTPP 4,3 ± 0,4

Photofrin 3,60 ± 0,04

Pode-se observar na tabela 3 que o InTPP foi 13-30% mais rápido em fotoxidar o

Trp comparado ao Photofrin . Deve-se ressaltar, que esta diferença pode estar relacionada

à maior absorção do InTPP em relação ao Photofrin , conforme pode ser verificada na

figura 19. Quanto maior o número de moléculas localizadas no estado fundamental, maior

será a absorção da energia de excitação e, portanto, maior a absorbância. Logo, se um

maior número de moléculas forem excitadas, maior será a probabilidade da ocorrência de

moléculas do fotossensibilizador no estado triplete, aumentando, dessa forma, o

rendimento quântico de geração de oxigênio singlete e consequentemente, a eficiência do

fotossensibilizador em fotoxidar as biomoléculas. É evidente que esta hipótese está


54

intimamente ligada à concentração dos fotossensibilizadores utilizada nos experimentos de

fotoxidação de Trp. Como o Photofrin é um oligômero, a concentração utilizada nos

experimentos foi expressa em mg.L-1, sendo idêntica para o InTPP e o Photofrin (15,3

mg.L-1), no entanto, está concentração não representa que as soluções dos

fotossensibilizadores sejam equimolares. Portanto, se a solução de InTPP (15,3 mg.L-1)

contiver um maior número de moléculas do fotossensibilizador, em relação a solução do

Photofrin (15,3 mg.L-1), maior será a eficiência do InTPP em gerar o oxigênio singlete,

comparado à eficiência do fármaco, e consequentemente, maior será a eficiência do InTPP

em fotoxidar o aminoácido. Não só o número de moléculas do fotossensibilizador, mas

também os coeficientes de extinção (propriedade intrínseca do fotossensibilizador) podem

estar relacionados à diferença da eficiência fotodinâmica entre o InTPP e Photofrin®. Se

maior for o coeficiente de extinção do InTPP em relação do Photofrin®, maior será o

número de moléculas excitadas do InTPP e portanto, maior a sua eficiência em gerar

oxigênio singlete comparado ao fármaco.

A maior eficiência do InTPP em fotoxidar o Trp comparado ao Photofrin® também

pode estar relacionada ao tempo de vida do fotossensibilizador no estado triplete excitado.

Se o tempo de vida do InTPP no estado triplete excitado for maior em relação ao

Photofrin® maior será a probabilidade de interação entre as moléculas de InTPP e do

oxigênio, do que entre o oxigênio e o Photofrin®. Neste caso o InTPP apresentaria um

rendimento quântico de geração de oxigênio singlete maior do que o Photofrin® o que

resultaria numa maior eficiência fotodinâmica. Portanto, a determinação do tempo de vida

do estado triplete dos fotossensibilizadores estudados poderia auxiliar na comparação da

eficiência fotodinâmica entre o InTPP e Photofrin®.

Através da figura 21, pode-se também concluir que todas as considerações citadas

no item 4.4.3, necessárias para a determinação da constante de velocidade da reação de

fotoxidação do Trp (pseudo primeira ordem), são válidas, devido a relação linear entre

ln(F/Fo) e o tempo de irradiação.

Com o objetivo de se averiguar a influência da variação da concentração dos

fotossensibilizadores na fotoxidação do Trp (175 µM), em tampão PBS pH 7.2, Tween 20

1% e 5% (v:v) de DMF (no caso do InTPP) ou sem DMF (no caso do Photofrin ), outros


55

experimentos foram realizados na presença de diferentes concentrações de

fotossensibilizador, obtendo-se os resultados da figura 22.

Pode-se verificar pelas figuras 22 (A) e (B), que o aumento da concentração do

InTPP e Photofrin , resulta no aumento da inclinação dos gráficos de ln(F/Fo) versus o

tempo de irradiação, indicando o aumento da constante de velocidade da reação de

fotoxidação do Trp. Através dos coeficientes angulares dos gráficos da figura 22 (A) e (B),

foi possível a construção do gráfico 22 (C), o qual demonstra que existe uma relação linear

entre a constante de velocidade de fotoxidação do triptofano e a concentração do

fotossensibilizador.

0 12 24 36 48 60 72

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

A

[InTPP] (mg/L) 0,9 4,5 9,1 15,8 20,9

ln (F

/Fo)


0 15 30 45 60 75 90 105

-1,5

-1,2

-0,9

-0,6

-0,3

0,0

B

[Photofrin] (mg/L) 0,93 4,45 9,03 17,80 26,62

ln (F

/Fo)


0 5 10 15 20 25 300,0

1,5x10-4

3,0x10-4

4,5x10-4

6,0x10-4

7,5x10-4

C

InTPP Photofrin

k (s

-1)

[Fotossensibilizador] (mg/L)

Figura 22 – Fotoxidação de Trp (175 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP (A) e Photofrin (B), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). 5% v:v de DMF foram utilizados nos ensaios com o InTPP. (C) Gráfico da variação da constante de velocidade (pseudo-primeira ordem) da reação de fotoxidação do triptofano em relação a concentração do fotossensibilizador. Os valores de fluorescência utilizados nos cálculos de ln(F/Fo) foram obtidos no espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting.

Como pode ser verificado na figura 22 (C), praticamente não houve diferença entre

a eficiência fotodinâmica do InTPP e do Photofrin® na fotoxidação de triptofano, quando

baixas concentrações de fotossensibilizador (0-10 mg.L-1) foram utilizadas. No entanto, o


56

InTPP tende a ser mais eficiente que o Photofrin® quando maiores concentrações de

fotossensibilizador (15-26 mg.L-1) são utilizadas na fotoxidação do aminoácido,

demonstrando que a eficiência fotodinâmica dos fotossensibilizadores estudados depende

da concentração do fotossensibilizador.

Considerando que a [1O2] é diretamente proporcional a [1P], pode-se reescrever a

equação (5) e redefinir a constante k da equação (6) como:

d[S] / dt = - k2.α.[1P].[S] (17)

k = k2.α.[1P] (18)

onde α é a constante de proporcionalidade entre [1O2] e [1P].

Portanto, o aumento linear da constante de velocidade da reação de fotoxidação do

Trp, em relação à concentração do fotossensibilizador, indica que a fotoxidação do

triptofano, na presença InTPP ou Photofrin , ocorre segundo uma cinética de segunda

ordem (primeira ordem em relação à concentração do fotossensibilizador e primeira ordem

em relação à concentração da biomolécula, conforme equação 17). O valor da inclinação

da reta na figura 22 (C) representa o valor de k2.α, como descrito na equação 18, e pode ser

utilizado como parâmetro de comparação da eficiência fotodinâmica dos

fotossensibilizadores na fotoxidação do aminoácido. Os valores de k2.α são mostrados na

tabela 4.

Tabela 4 – Valores de k2.α para a fotoxidação de Trp (175 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP e Photofrin , tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). 5% v:v de DMF foram utilizados nos ensaios com o InTPP.

Fotossensibilizador k2.αααα /(10-2 L.g-1.s-1)

InTPP (2,8 ± 0,2)

Photofrin (2,2 ± 0,1)

Através da tabela 4 pode-se verificar que o InTPP é em média 24-30% mais rápido

em fotoxidar o triptofano quando comparado ao Photofrin®.


57

5.3.2 Fotoxidação de Albumina Bovina

Não somente a fotoxidação de aminoácidos é utilizada como parâmetro para se

avaliar a eficiência fotodinâmica de um fotossensibilizador, mas também fotoxidações de

purinas, lipídios, carbohidratos e proteínas. Em particular, a fotoxidação de proteínas leva a

degradação de suas cadeias devido à presença de aminoácidos suscetíveis as fotoxidações

como cisteína, histidina, metionina, triptofano e tirosina. Em geral, no caso onde há maior

destruição de aminoácidos aromáticos, a proteína mostra uma diminuição da sua

intensidade de fluorescência 68.

A albumina é a proteína mais abundante do sangue que apresenta funções

importantes como o transporte de vários metabólitos no sistema circulatório, como

hormônios reguladores do nível de stress (epinofrinas) 44,68. Um estudo realizado por

Silvester et al.99 determinou que a fotoxidação da BSA por hematoporfirina e

tetrametilpiridínioporfirina ocorria em dois diferentes sítios específicos da proteína: nos

resíduos Trp-134 e/ou Trp-214 e no resíduo Cis-34 (cisteína). Essa fotoxidação gera

radicais RS. no caso da cisteína e radicais em carbonos terciários no triptofano, e nesse

caso, a formação de radicais coincide com a diminuição da fluorescência da BSA. Na

figura 23, é demonstrada esta diminuição para a fotoxidação de uma solução 20 µM de

BSA, em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), InTPP 9,3 mg.L-1 e 5% de DMF.

300 330 360 390 4200

90000

180000

270000

360000

450000 Tempo Irradiação (minutos) 0 6 12 18 24 30 36 42


Figura 23 – Variação da intensidade de fluorescência de uma solução 20 µM de BSA, durante fotoxidação na presença de tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), InTPP 9,3 mg.L-1 e 5% de DMF. Os espectros de fluorescência foram obtidos no espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting.


58

Antes da realização dos ensaios de fotoxidação da BSA, foram obtidos os espectros

de absorção e emissão da proteína na presença de InTPP ou Photofrin®, conforme

mostrados na figura 24, a fim de se determinar os comprimentos de onda onde a BSA

apresenta máxima absorção e emissão.

240 270 300 330 360 390 420

0,00

0,15

0,30

0,45

0,60

0,75

0,00

0,15

0,30

0,45

0,60

0,75

A

Absorção Emissão

279 323

Intensidade de fluorescência

(x 1,1.10-6)

Abso

rbân

cia


270 300 330 360 390

0,0

0,6

1,2

1,8

2,4

0,0

0,6

1,2

1,8

2,4

B

Absorção Emissão

320279 Intensidade de fluorescência (x 2,12.10

-6)

Abso

rbân

cia


Figura 24 – (A) Espectros de absorção e emissão de uma solução 40 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20, 5% (v:v) de DMF e 15,3 mg.L-1 de InTPP. (B) Espectros de absorção e emissão de uma solução 100 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, 1% (v:v) de Tween® 20 e 15,3 mg.L-1 de Photofrin®. Os espectros de emissão da figura (A) e (B) foram obtidos no espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting.

Na figura 24 pode-se verificar que a BSA apresenta uma banda com máxima

absorção em 279 nm na presença de InTPP ou Photofrin®. Este comprimento de onda foi

utilizado para excitar a proteína, resultando nas bandas de fluorescência com máximo em

323 nm na presença de InTPP e 320 nm na presença de Photofrin®. Os valores das

intensidades de fluorescência da BSA nestes comprimentos de onda foram utilizados para

se calcular o valor de ln (F/Fo) em relação a um determinado tempo de irradiação,

conforme citado no item 4.4.3. Os resultados são mostrados na figura 25

Pode-se verificar nas figuras 25 (A) e (B) que a relação linear entre ln(F/Fo) e o

tempo de irradiação foi mantida na fotoxidação da proteína, assim como foi observada na

fotoxidação do triptofano. Portanto, conclui-se que todas as considerações feitas no item

4.4.3, necessárias para a determinação da constante de velocidade da reação de fotoxidação

da BSA (pseudo-primeira ordem), são válidas. Pode-se verificar também que o aumento da

concentração do fotossensibilizador, resulta no aumento da inclinação do gráfico de

ln(F/Fo) versus tempo de irradiação, indicando o aumento da constante de velocidade de

fotoxidação da BSA. Os coeficientes angulares destes gráficos foram obtidos e o gráfico 23

(C) foi plotado.


59

0 15 30 45 60 75 90-0,75

-0,60

-0,45

-0,30

-0,15

0,00 A

[InTPP] (mg/L) 0,82 3,85 7,07 13,99

ln (F

/Fo)


0 20 40 60 80 100

-0,72

-0,54

-0,36

-0,18

0,00 B[Photofrin] (mg/L)

1,05 4,85 9,04 17,81

ln (F

/Fo)


0 3 6 9 12 15 180,0

1,2x10-4

2,4x10-4

3,6x10-4

4,8x10-4

6,0x10-4

C

k

(s-1)

[Fotossensibilizador] (mg/L)

Photofrin InTPP

Figura 25 – Fotoxidação da BSA (23,5 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP (A) e Photofrin (B), tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). 5% v:v de DMF foram utilizados nos ensaios com o InTPP. (C) Gráfico da variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação da BSA em relação à concentração do fotossensibilizador. Os espectros de emissão da figura (A) e (B) foram obtidos no espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting.

Pela figura 25 (C), pode-se verificar que a relação linear entre a constante de

velocidade da reação de fotoxidação e a concentração do fotossensibilizador foi mantida,

assim como foi observada na fotoxidação do Trp, confirmando o mecanismo global da

fotoxidação de biomoléculas, como sendo uma cinética de segunda ordem (primeira ordem

em relação ao fotossensibilizador e primeira ordem em relação à biomolécula). Observa-se

nesta figura que a eficiência fotodinâmica do InTPP é praticamente a mesma em relação ao

Photofrin®, quando baixas concentrações de fotossensibilizador (1-5 mg.L-1) são utilizadas

na reação de fotoxidação da BSA. Entretanto, o InTPP é mais eficiente que o Photofrin®

sob altas concentrações de fotossensibilizador (7-17 mg.L-1), indicando que a eficiência

fotodinâmica dos fotossensibilizadores é dependente da concentração.


60

Os coeficientes angulares dos gráficos da figura 25 (C) foram obtidos, a fim de

serem utilizados como parâmetros de comparação da eficiência fotodinâmica do InTPP na

fotoxidação da BSA, comparado ao Photofrin®, sendo os resultados mostrados na tabela 5.

Tabela 5 – Valores de k2.α para a fotoxidação da BSA (23,5 µM), na presença de diferentes concentrações de InTPP e Photofrin , tampão PBS pH 7.2 e Tween 20 1% (v:v). (5% v:v de DMF foram utilizados nos ensaios com o InTPP)

Fotossensibilizador k2.αααα (10-2 L.g-1.s-1)

InTPP (3,6 ± 0,2)

Photofrin (2,88 ± 0,04)

Verifica-se pela tabela 5 que o InTPP foi em média 20-30% mais rápido em

fotoxidar a BSA, comparado ao Photofrin®. Como foi apresentada no item 5.3.1, esta

diferença pode estar relacionada à maior absorção do InTPP em relação ao Photofrin e

com o tempo de vida dos fotossensibilizadores no estado triplete excitado.

5.4 Fotobranqueamento do InTPP

Na PDT, o primeiro trabalho relevante sobre fotobranqueamento foi realizado por

Moan et al 100, usando-se células do tipo NHIK 25 incubadas com Photofrin®. Em função

de potenciais benefícios que o fotobranqueamento pode causar na PDT, o número de

estudos sobre o fotobranqueamento dos fotossensibilizadores vem aumentando a cada ano 74.

Em princípio, a fotodestruição, in vivo, dos fotossensibilizadores usados na PDT,

apresenta vantagens e desvantagens. Se o fotossensibilizador fotobranquear rapidamente

durante a incidência de luz, a destruição do tumor pode ser incompleta, diminuindo-se a

eficiência da PDT. No entanto, o fotobranqueamento pode destruir, rapidamente, grandes

quantidades do fotossensibilizador, localizado em tecidos saudáveis ao redor do tumor, o

que pouparia o tecido normal dos danos causados pela terapia, ao mesmo tempo em que se

aumentaria a seletividade da técnica e diminuiria o período de fotossensibilidade dos

pacientes tratados com PDT 76.

Em razão das vantagens clínicas do fotobranqueamento, alguns trabalhos tratam da

fotodegradação, in vivo, da protoporfirina IX (PpIX) endógena produzida a partir do ALA


61

exógeno (pró-droga). Um exemplo é o estudo desenvolvido por König et al 101, onde a

fluorescência da PpIX foi analisada, utilizando-se um sensor de fibra óptica para

acompanhar a formação dos fotoprodutos. Numa primeira análise, não foi detectada a

fluorescência do fotossensibilizador, quando o ALA foi aplicado topicamente. Na

administração sistêmica da pró-droga, detectou-se uma banda de fluorescência em torno de

635 e 710 nm. Essas bandas diminuíram, conforme o tumor foi irradiado, enquanto

verificou-se o surgimento de uma nova banda na região de 670 nm, descrita como

pertencente a um fotoproduto fluorescente.

Com o objetivo de se determinar a constante de velocidade de fotobranqueamento

do InTPP, uma solução da meso-tetrafenilporfirina de índio (15,3 mg.L-1) em tampão PBS

pH 7.2, Tween 20 1% e 5% (v:v) de DMF foi irradiada com uma lâmpada de mercúrio,

sendo acompanhada a variação da intensidade de fluorescência do InTPP, no comprimento

de onda 613 nm, conforme demonstrado na figura 26.

0 20 40 60 80 1000

10

72

80

88

96

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia


Figura 26 – Fotobranqueamento de uma solução 15,3 mg.L-1 de InTPP, em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, monitorado pela variação da fluorescência do InTPP no comprimento de onda 613 nm. Os pontos de cores diferentes representam experimentos realizados em duplicata. Os valores de fluorescência utilizados nesta figura foram obtidos no espectrofluorímetro PTI LS-100TM – Luminescence System LS-100TM.

Como pode ser observado pela figura 26, não houve variação significativa da

intensidade de fluorescência do InTPP em função do tempo de irradiação, indicando que o

fotossensibilizador não está sendo fotobranqueado durante o período de irradiação.

Várias pesquisas têm demonstrado que o fotobranqueamento tende a ser menor em

fotossensibilizadores que estão agregados 27,74,75,76. Streckyte et al 102 estudaram os estados

de agregação do Photosan® (similar do Photofrin®) e sugeriram que o composto existe na

forma de oligômeros lineares ligados covalentemente e não covalentemente (por meio de


62

ligações de Van der Waals) e também na forma de agregados tipo “sanduíche” (tipo H).

Este estudo demonstrou que porfirinas que apresentam agregados do tipo H, como o

Photosan® e haematoporfirina, apresentam pequeno fotobranqueamento. Rotomskis et al 93

também sugeriram que os agregados da haematoporfirina e seus derivados são do tipo

“sanduíche” e que a fotoestabilidade destas substâncias, frente ao fotobranqueamento, se

deve a dificuldade de difusão do oxigênio sobre a estrutura compacta do agregado.

Spikes et al 76 sugeriram a existência de uma correlação entre o rendimento

quântico de fotobranqueamento de porfirinas e a constante dielétrica do solvente.

Dimetilformamida e álcoois têm baixas constantes dielétricas comparadas com a constante

dielétrica da água, e o fotobranqueamento dos fotossensibilizadores nestes solventes

orgânicos é menor do que em meio tamponado. O mecanismo envolvido nesta propriedade

dos solventes, em relação ao fotobranqueamento, ainda não está bem claro.

Spikes et al 76 sugeriram que se espécies iônicas intermediárias estivessem

envolvidas no fotobranqueamento dos fotossensibilizadores, estas espécies deveriam

apresentar tempos de vida muito menores em solventes de baixa constante dielétrica,

devido ao favorecimento da recombinação das espécies iônicas, em razão do aumento da

energia de interação coulombica, resultando na diminuição da velocidade de

fotobranqueamento.

O fotobranqueamento do mono-L-aspartilclorina e6 (Npe6) foi diminuído em 90%

na presença de surfactante catiônico (brometo de cetiltrimetilamônio), 70% em surfactante

não iônico (Triton X-100) e 15% em surfactante aniônico (dodecilsulfato de sódio) 75. A

diminuição do fotobranqueamento da meso-tetrafenilporfirina tetrasulfonada também foi

observada na presença de surfactante 76. Spikes et al. 75,76 sugeriram que a diminuição do

fotobranqueamento, devido a presença de surfactante, está relacionada a incorporação do

fotossensibilizador no sistema micelar, em regiões de baixa constante dielétrica, sobre as

quais o fotobranqueamento é menor. Esta explicação também pode se utilizada para o

estudo realizado por Handa et al103, o qual demonstrou que a meso-tetrafenilporfirina é

muito mais resistente à luz, quando incorporada dentro da região hidrofóbica das

membranas lipossomais. No entanto, os mecanismos envolvidos na diminuição do

fotobranqueamento, em sistemas vesiculares e micelares, ainda não são conhecidos.

Portanto, estes fatores citados acima, que reduzem o fotobraqueamento, podem ser


63

responsáveis pela ausência de fotobranqueamento do InTPP em tampão PBS pH 7.2,

Tween 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF.

Estudos sobre o fotobranqueamento da meso-tetrafenilporfirina, realizados por

Cavaleiro et al 27, utilizando-se as técnicas de ressonância magnética nuclear e

espectrometria de massa, determinaram que o fotobranqueamento da TPP ocorre

essencialmente com o mesmo mecanismo da octaetilporfirina, complexos de clorinas e

derivados de bacterioclorofilas, envolvendo a adição do oxigênio singlete ao anel

porfirínico, provocando a sua quebra. A razão da adição secundaria de água, no caso dos

fotoprodutos gerados pela abertura do anel, se deve a diminuição do efeito templete do

metal, o qual quando removido, reduz as interações estéricas entre os grupos terminais

benzoil e o anel pirrolinona, permitindo a adição de outra molécula de água, resultando no

ligante hidroxila, conforme demonstrado na figura 27 27,74.

H2O

N N

M

N

O

N

O

H

HH

NN

N

O

N

O

HO

1O2

N

N

N

NM

OO

N

N

N

NM

Figura 27 – Mecanismo do fotobranqueamento de complexos metálicos de meso-tetrafenilporfirina.


64

5.5 Hemólise de Eritrócitos

A eficiência fotodinâmica do InTPP também foi avaliada através da investigação da

capacidade da meso-tetrafenilporfirina de índio em causar hemólise nas células vermelhas

do sangue, as quais têm sido muito utilizadas como modelo para estudos fototóxicos in

vitro, em razão da facilidade e baixo custo dos ensaios 104,105,106.

Neste projeto a porcentagem de hemólise de células vermelhas do sangue, foi

determinada conforme citado no item 4.6, através de medidas de absorbância da

oxihemoglobina (542 nm) a qual é liberada pelos eritrócitos devido à destruição das

hemácias pela ação fotodinâmica dos fotossensibilizadores, conforme pode ser observado

pela figura 28.

494 520 546 572 598 624

0,00

0,14

0,28

0,42

0,56 542 Tempo de irradiação Minutos

60 50 40 30 20 10 0Ab

sorb

ânci

a


Figura 28 – Variação da absorbância da oxihemoglobina na fotoxidação de uma solução 0,5% (v:v) de eritrócitos em tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de 4,8 mg.L-1 de InTPP.

Resultados da literatura têm demonstrado que a hemólise de eritrócitos pode

ocorrer devido a um processo osmótico-coloidal, resultante da retenção de sais e água pela

célula, havendo perda da permeabilidade seletiva da membrana, resultando na entrada

indiscriminada de moléculas do soluto, e consequentemente, no inchamento e eventual

ruptura da membrana. Além disso, a hemólise também pode ocorrer devido a fotoxidação

das proteínas intrínsecas à membrana, as quais estão ligadas aos fosfolipídios, resultando

na formação de poros e no aumento da mobilidade dos fosfolipídios, provocando a ruptura

da membrana, e consequentemente, a liberação da oxihemoglobina presente no interior dos

eritrócitos, cuja detecção pode ser realizada através de técnicas espectrofotométricas,

permitindo a monitoração da hemólise das células vermelhas do sangue em função do

tempo de irradiação. Alguns estudos, também demonstram que a oxidação dos


65

fosfolipídios insaturados constituintes da membrana de eritrócitos, pelas espécies reativas

produzidas na PDT, aumentam a mobilidade dos fosfolipídios, resultando na formação de

poros, e consequentemente, na ruptura da membrana das células vermelhas do sangue 104,105.

Estudos têm sugerido que substâncias anfifílicas interferem na estabilidade física

das membranas biológicas, em razão das suas propriedades serem semelhantes às dos

surfactantes. Os surfactantes provocam a hemólise dos eritrócitos através da solubilização

dos lipídios e proteínas que constituem a membrana, em geral, quando suas concentrações

estão próximas ou acima da CMC, onde o surfactante interage diretamente no núcleo

hidrofóbico da bicamada lipídica. Têm se demonstrado que em baixas concentrações as

espécies monomêricas dos surfactantes, e não as formas micelares, interagem com a região

hidrofóbica da bicamada lipídica, mantendo-se a parte apolar do surfactante penetrado na

camada hidrofóbica da membrana e o núcleo polar do surfactante localizado na superfície

externa da membrana, resultando no aumento da permeabilidade da membrana, sem

ocorrência de rompimento da mesma. Resultados experimentais têm demonstrado que

surfactantes que apresentam longas cadeias alquílicas e grandes grupos hidrofílicos

apresentam baixa atividade hemolítica, devido à dificuldade de interação com a membrana

dos eritrócitos107,108,109.

Portanto, houve a preocupação de se estabelecer condições em termos das

porcentagens de Tween 20 e de DMF presentes à solução a ser fotoxidada pelo InTPP, de

forma a minimizar a hemólise causada pela ação do surfactante e do solvente orgânico.

Para este fim, soluções 0,5% (v:v) de hemácias em tampão PBS pH 7.4 foram fotoxidadas

na presença de diferentes porcentagens (v:v) de DMF ou de Tween 20, conforme

mostrado na figura 29.


66

0 10 20 30 40 50 60

0

5

10

15

20

25

A

conc. Tween 20 0,00% 0,01% 0,05% 0,15%

% H

emól

ise


0 10 20 30 40 50 60

0

20

40

60

80

100

B

Sem InTPP 1,6% DMF 5,0% DMF 13,25% DMF

% H

emól

ise


Figura 29 – Porcentagem de hemólise em soluções 0,5% (v:v) de hemácias, em tampão PBS pH 7.4 e na presença de diferentes concentrações de (A) Tween 20 e (B) DMF.

Pela figura 29 pode-se verificar que concentrações acima de 0,05% (v:v) de

Tween 20 e 1,6% (v:v) de DMF, provocam hemólises mais significativas das células

vermelhas do sangue. Portanto, optou-se por trabalhar com uma concentração 0,05% (v:v)

de Tween 20 e 1,6 % de DMF, a fim de se minimizar as influências do surfactante e do

solvente orgânico na porcentagem de hemólise oriunda da ação do fotossensibilizador. Não

se optou por trabalhar com uma concentração 0,01% (v:v) de Tween® 20, embora esta

concentração tenha causado a menor hemólise nas células vermelhas do sangue, em razão

desta concentração estar abaixo da CMC, o que impossibilita a incorporação do

fotossensibilizador e favorece a sua agregação, resultando na diminuição da eficiência

fotodinâmica da espécie fotoativa.

A oxidação da oxihemoglobina em metahemoglobina, durante a reação de

fotoxidação de eritrócitos, pode interferir nos resultados das porcentagens de hemólise

oriundos da ação dos fotossensibilizadores, em razão da diminuição da absorbância da

oxihemoglobina, cuja intensidade é utilizada como parâmetro da eficiência fotodinâmica

dos fotossensibilizadores em promover a hemólise das células vermelhas do sangue.

Portanto, as influências do surfactante, do solvente orgânico, ou da oxidação da

oxihemoglobina (HbFe(II)O2) em metahemoglobina (HbFe(III)), na hemólise de

eritrócitos, foram compensadas, utilizando-se uma solução controle (branco), cuja

absorbância foi subtraída dos resultados das hemólises na presença dos

fotossensibilizadores, conforme equações demonstradas no item 4.6. Zavodnik et al 104 não

detectaram a oxidação da oxihemoglobina em metahemoglobina, durante a fotoxidação de

eritrócitos na presença de ftalocianina de zinco.


67

Utilizando-se as condições pré-estabelecidas anteriormente (0,05% v:v de Tween®

20 e 1,6% v:v de DMF), soluções com concentrações variadas de InTPP e Photofrin® (0,2

a 15,3 mg.L-1) em tampão PBS pH 7.4, foram irradiadas utilizando-se uma lâmpada de

mercúrio, sendo os resultados mostrados na figura 30. Nos experimentos realizados com o

Photofrin®, não houve a necessidade da utilização de solvente orgânico, uma vez que o

fármaco é solúvel em meio aquoso.

0 20 40 60 80 100 120

0

20

40

60

80

100

[InTPP] em mg/L 0,2 4,9 15,3

[Photofrin]em mg/L 0,2 4,9 15,3

% H

emól

ise


Figura 30 – Porcentagem de hemólise das soluções de eritrócitos (0,5% v:v), devido à ação do InTPP ou Photofrin® (0,2-15,3 mg.L-1), em tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF. Nos experimentos realizados com Photofrin®, não foi necessário a utilização de DMF. Os ensaios foram realizados em triplicata com exceção do experimento realizado na presença de Photofrin® (0,2 mg.L-1) que foi realizado 6 vezes.

Como se pode verificar na figura 30, o InTPP apresentou maior eficiência

fotodinâmica quando soluções 0,2 mg.L-1 foram irradiadas. Neste caso a porcentagem

máxima de eritrócitos hemolisados [(101,2 ± 8,8)]% foi maior do que a porcentagem

máxima obtida [(82,2 ± 5,5)]% utilizando-se maiores concentrações do fotossensibilizador.

Nesta concentração o InTPP foi cerca de 41 a 103 vezes mais eficiente em fotoxidar

eritrócitos, comparado ao Photofrin . Esta enorme diferença na eficiência fotodinâmica

entre os fotossensibilizadores estudados, pode estar associada à maior capacidade de

interação do InTPP com a membrana de eritrócitos. Conforme o princípio de Davson-

Danielli 65, a facilidade de um composto penetrar através através das membranas celulares

é proporcional a sua natureza lipofílica. A eficiência do InTPP pode também estar

relacionado a maior capacidade de geração de oxigênio singlete, devido ao efeito do átomo

pesado, onde as interações entre o momento angular spin e o momento angular orbital de

um mesmo elétron, também chamado de acoplamento spin-orbita, resultam na quebra da


68

regra de seleção que proíbe as transições entre níveis de multiplicidade diferente (∆S = 0),

de maneira que as transições T1 ↔ So possam ocorrer, provocando, em geral, a diminuição

da fluorescência e o aumento da fosforescência dos fotossensibilizadores 18,81. As

determinações do rendimento quântico de fluorescência e fosforescência dos

fotossensibilizadores utilizados, poderiam auxiliar na identificação da eficiência

fotodinâmica do InTPP, em relação ao Photofrin®, em gerar oxigênio singlete, e

consequentemente, em fotoxidar as células vermelhas do sangue. Estas determinações

serão realizadas posteriormente no meu projeto de doutorado. Fatores apresentados no item

5.3.1 (como o tempo de vida dos fotossensibilizadores no estado triplete excitado, a

absortividade e o número de moléculas dos fotossensibilizadores presentes em solução)

podem estar relacionados com a eficiência do InTPP em hemolisar as células vermelhas do

sangue.

Houve um aumento na velocidade de fotoxidação das células vermelhas do sangue,

na presença de InTPP, quando se aumentou a concentração do fotossensibilizador (em

particular de 0,2 para 4,9 mg.L-1), como pode ser observado na figura 30, através do

deslocamento do gráfico de hemólise para regiões de menor tempo de irradiação. No

entanto, não houve alteração da velocidade de fotoxidação quando a concentração de

InTPP aumentou de 4,9 para 15,3 mg.L-1, provavelmente em razão da saturação dos sítios

de interação presentes na membrana dos eritrócitos ocasionada pelas moléculas do

fotossensibilizador e/ou oxigênio singlete. Possivelmente o estado de agregação do InTPP

deve estar interferindo na geração de 1O2 em razão da diminuição dos tempos de vida do

fotossensibilizador nos estados singlete e triplete excitados, uma vez que sob altas

concentrações (4,9-15,3 mg.L-1) a porcentagem máxima de hemólise foi em torno de 75-

88% (sendo 19-23% menos eficiente que o Photofrin®) e a baixas concentrações (0,2

mg.L-1) foi em torno de 100%. Não se observa a diminuição da eficiência fotodinâmica do

InTPP sob altas concentrações, tanto para Trp e BSA. Provavelmente isto ocorre devido as

diferentes condições de agregação do InTPP em meio aquoso com biomoléculas (Trp ou

BSA) ou com eritrócitos. No caso do Photofrin® provavelmente as condições de agregação

são as mesmas.

Com o objetivo de se comparar numericamente a velocidade com que os

fotossensibilizadores fotodestroem os eritrócitos, os tempos necessários para que 50% das


69

células vermelhas do sangue fossem hemolisadas foram obtidos da figura 30, sendo

mostrados na tabela 6.

Tabela 6 – Tempo necessário para que 50% das células vermelhas do sangue sejam hemolisadas pelos fotossensibilizadores. O gráfico da hemólise de eritrócitos na presença de InTPP 2,4 mg.L-1 não foi demonstrado na figura 30.

Fotossensibilizador Concentração/(mg.L-1) Tempo/minutos

InTPP 15,3 37,8 ± 2,6

2.4 45,1 ± 2,3

0,2 61,0 ± 1,4

Photofrin 15,3 55,3 ± 2,0

4,9 65,8 ± 2,1

0,2 Não apresentou fotoxidação

Á medida que se diminui a concentração do fotossensibilizador, verifica-se pela

tabela 6, um aumento no tempo necessário para que 50% dos eritrócitos sejam

hemolisados, sendo um fenômeno principalmente observado para o InTPP. Comparando-se

os tempos necessários para que ambos os fotossensibilizadores possam hemolisar 50% dos

eritrócitos, verifica-se que o InTPP age mais rapidamente na distruição das hemácias do

que o Photofrin® à medida que se aumenta a concentração do fotossensibilizador, como

pode ser verificado na figura 30, pelo deslocamento do gráfico do InTPP para regiões de

menor tempo de irradiação. Na faixa de concentração de 2,4 a 15,3 mg.L-1 o InTPP foi em

média 29,7-33,4% mais rápido em fotoxidar as hemácias comparado ao Photofrin®.

A fotoxidação dos eritrócitos foi também acompanhada visualmente, conforme

mostrado na figura 31. Para cada período de irradiação, existem dois viais, um identificado

como B que contem a solução controle (branco) e um outro identificado como A, que

contem uma alíquota da solução fotoxidada na presença do fotossensibilizador. À medida

que se aumenta o tempo de irradiação, a solução A torna-se mais avermelhada que a

solução B, indicando que a hemólise ocasionada pela ação fotodinâmica dos

fotossensibilizadores é maior do que a hemólise ocasionada pelo surfactante ou pelo

solvente orgânico. A intensidade da cor torna-se mais avermelhada devido à liberação de

oxihemoglobina, contida no interior das células vermelhas do sangue, em razão da ruptura


70

da membrana dos eritrócitos. Pode-se observar que a intensidade da cor vermelha da

solução A, no final de 60 minutos de irradiação, para os ensaios realizados na presença de

InTPP, é maior do que a solução A utilizada nos ensaios com o Photofrin®, mostrando

visualmente a maior eficiência do InTPP em hemolisar as células vermelhas do sangue.

B = ControleA = Com Photofrin®

(4,9 mg/L)

B = ControleA = Com InTPP (4,9 mg/L)


0 30 50 60

B A B A B A B A

Figura 31 – Visualização da hemólise de uma solução 0,5% (v:v) de eritrócitos, em tampão PBS pH 7.4, 0,05% (v:v) de Tween® 20 e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de InTPP ou Photofrin® (4,9 mg.L-1). Nos ensaios realizados com o Photofrin®, não houve a necessidade da utilização de DMF.

5.6 Determinação do mecanismo envolvido na fotoxidação de biomoléculas

Em geral, os solventes diminuem o tempo de vida do oxigênio singlete através de

processos colisionais 30,111. O primeiro pesquisador a discutir as reações de oxidação de

biomoléculas utilizando-se fotossensibilizadores, foi Livingston em 1961, o qual classificou

estas reações em dois grupos: as procedidas por intermediários radicalares e as reações

oriundas de intermediários eletronicamente excitados 68. Foi Gollnick em 1968, o primeiro

pesquisador a denominar estes dois grupos como reações do tipo I (radicalares) e do tipo II

(via oxigênio singlete) 68,110.

Rodgers111, Hurst e Schuster112 foram os primeiros pesquisadores a quantificar a

supressão de 1O2 pela ação dos solventes. Eles demonstraram que a constante de velocidade

de segunda ordem da supressão do oxigênio singlete (kD) , era diretamente proporcional à

somatória do número de ligantes terminais por molécula de solvente (NXY) e à constante de


71

decaimento do oxigênio singlete em relação a cada um dos ligantes terminais presentes na

molécula do solvente (kXY), conforme equação (15):

∑=XY

XYXYD kNk (15)

Reinhard Schmidt30, um pesquisador do departamento de físico-química da

Universidade de Frankfurt, demonstrou que existe uma relação exponencial entre kXY e a

energia vibracional de cada ligante terminal XY. Portanto, o aumento do tempo de vida do 1O2 em água deuterada (D2O), cerca de 10 a 26 vezes, comparado à água não deuterada (2-3

µs) 31,79 , se deve a menor energia vibracional do D2O em relação à água não deuterada, de

maneira que o valor de kXY é menor, e consequentemente, menor será o valor de kD e maior

será o tempo de vida do oxigênio singlete. Dessa forma, a presença de D2O no meio

reacional deve aumentar a constante de velocidade da reação de fotoxidação das

biomoléculas, caso o mecanismo preponderante seja do tipo II.

A azida de sódio (NaN3) é um eficiente supressor de oxigênio singlete 31,79,80,113 via

reações reversíveis ou irreversíveis, conforme representado na figura 32 22.

D + 1O2 D + 3O2 (16)D+ O21 3

O2D+

1O2 + N3 O2 + N3 (17)

Figura 32 – Reações de supressão do 1O2 singlete pela ação da NaN3. D representa a azida de sódio.

Portanto, ao se adicionar NaN3 no meio reacional, espera-se que a constante de

velocidade da reação diminua, caso o mecanismo preponderante na fotoxidação das

biomoléculas seja do tipo II.

Têm sido sugerido por alguns pesquisadores 7,5 que o mecanismo de fotoxidação do

tipo I é favorecido em solventes polares, uma vez que os radicais gerados, em função das

reações de transferência de elétrons, seriam estabilizados em solventes de alta constante

dielétrica. Em contraste, a solubilidade e o tempo de vida do oxigênio singlete são maiores

em solventes lipofílicos, de maneira que o mecanismo do tipo II é mais favorecido em

ambientes hidrofóbicos. No entanto, publicações têm demonstrado que mesmo em meios

polares, o mecanismo de fotoxidação de biomoléculas envolvendo o oxigênio singlete é

mais eficiente quando comparado aos processos dependentes das espécies radicalares, em


72

função da alta difusibilidade do oxigênio singlete e em função das reações de transferência

de energia serem, em geral, mais rápidas do que as reações de transferência de elétrons 3,20,21,114. Portanto, torna-se interessante a determinação do mecanismo de ação do InTPP

na fotoxidação de biomoléculas.

Com o objetivo de se determinar o mecanismo de ação do InTPP na fotoxidação de

biomoléculas, foram adicionados D2O ou NaN3 às soluções a serem fotoxidadas. Gráficos

da variação da constante de velocidade (pseudo-primeira ordem) versus concentração de

D2O e NaN3 foram obtidos, conforme demonstrado na figura 33.

0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3

7,0x10-5

1,4x10-4

2,1x10-4

2,8x10-4

3,5x10-4

4,2x10-4

A

k (s

-1)

[NaN3] (M)

0 10 20 30 40 50

3,0x10-4

6,0x10-4

9,0x10-4

1,2x10-3

1,5x10-3

B

k (s

-1)

% D2O (v:v)

Figura 33 – Variação da constante de velocidade da reação de fotoxidação do Trp (150 µM) em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (20 µM), na presença de concentrações variadas (A) de NaN3 e (B) de D2O. Os dados utilizados na figura (A) e (B) foram obtidos no espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting

Pelos resultados da figura 33 (A), pode-se verificar que o aumento da concentração

da azida de sódio na solução fotoxidada resulta na diminuição da constante de velocidade

da reação de fotoxidação do triptofano, havendo uma diminuição abrupta da constante

velocidade a baixas concentrações de NaN3 e uma diminuição mais lenta quando altas

concentrações NaN3 foram utilizadas. Em altas concentrações de NaN3 há uma competição

entre a inibição da reação de fotoxidação do triptofano, devido à supressão do oxigênio

singlete pela azida de sódio (equação 16) e a fotoxidação do aminoácido pelos radicais

superóxido e azida, gerados na reação irreversível entre o 1O2 e a NaN3 (equação 17),

resultando na diminuição mais lenta da constante de velocidade da reação de fotoxidação

do triptofano.

Observando-se a figura 33(B), pode-se verificar que à medida que se aumenta a

concentração de D2O na solução a ser fotoxidada, maior a constante de velocidade da


73

reação de fotoxidação de Trp, em razão do aumento do tempo de vida do oxigênio singlete.

Este aumento permiti que a ação do 1O2 sobre a biomolécula seja maior, resultando no

aumento da constante de velocidade de fotoxidação31,79.

Portanto, tanto os resultados obtidos para as reações de fotoxidação de Trp na

presença de D2O como na presença de NaN3, indicam que o mecanismo de ação do InTPP

na fotoxidação do triptofano é preponderantemente do tipo II, ou seja, envolve o oxigênio

singlete. No entanto, não é possível afirmar que a fotoxidação do triptofano ocorra apenas

por este mecanismo, pois vários relatos tem demonstrado que as fotoxidações de

biomoléculas podem ocorrer pelos dois mecanismos simultaneamente28,79. Segundo

Ochsner 5, sobre baixas concentrações de triptofano (≤ 0,1 mM), o mecanismo do tipo II

compete com o mecanismo do tipo I, mesmo em soluções altamente polares onde há o

favorecimento das reações que envolvem espécies radicalares. Portanto, num próximo

projeto, será avaliada a influência do mecanismo do tipo I na fotoxidação do Trp, através

do uso de supressores de radicais como ferricianeto (supressor não específico), superóxido

dismutase (supressor de O2.-), manitol (supressor de OH.) e glutationa peroxidase

(supressora de H2O2 e de peróxidos orgânicos).

Um experimento semelhante foi realizado para se determinar o mecanismo de

fotoxidação da BSA, em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e

InTPP, conforme resultados da figura 34.

0,0 7,0x10-4 1,4x10-3 2,1x10-3 2,8x10-3

4,0x10-4

6,0x10-4

8,0x10-4

1,0x10-3

1,2x10-3

1,4x10-3

(M)

A

k (s

-1)

[NaN3]

0 10 20 30 40 50

0,0

1,4x10-4

2,8x10-4

4,2x10-4

5,6x10-4

7,0x10-4

B

k (s

-1)

% D2O (v:v)

Figura 34 – Fotoxidação (A) de uma solução 116 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (24 µM), com a presença de NaN3 e fotoxidação (B) de uma solução 23 µM de BSA em tampão PBS pH 7.2, Tween 20 1% (v:v), 5% (v:v) de DMF e InTPP (1,1 µM), com a presença de D2O. Os dados utilizados na figura (A) e (B) foram obtidos no espectrofluorímetro ISS PC1TM – Photon Counting.


74

Pela figura 34, pode-se verificar que à medida que se aumenta a concentração de

NaN3 no meio reacional, ocorre a diminuição da constante de velocidade da reação de

fotoxidação da albumina bovina, enquanto que o aumento na porcentagem de D2O, resulta

no aumento da constante de velocidade da reação de pseudo-primeira ordem. Estes

resultados são similares aos obtidos para a fotoxidação do Trp, indicando que a

fotoxidação da BSA se dá preferencialmente pelo mecanismo do Tipo II. Conforme citado

acima, em relação a fotoxidação do Trp, não é possível afirmar que a fotoxidação da BSA

ocorra apenas pelo mecanismo do tipo II, uma vez que não foram realizados experimentos

na presença de supressores de espécies radicalares para se avaliar a influência do

mecanismo do tipo I na fotoxidação da proteína.

Deve-se ressaltar que os mecanismos de fotoxidação das biomoléculas podem ser

alterados em sistemas biológicos, quando comparados aos ensaios realizados em soluções

homogêneas, devido à concentração local de oxigênio e a localização do

fotossensibilizador. Como exemplo, pode-se relatar os resultados obtidos com a

octaetilporfirina de cobre (II), os quais demonstram que o fotossensibilizador ligado ou

localizado próximo aos substratos macromoleculares (membranas, proteínas ou ácidos

nucléicos) favorece o mecanismo tipo I 5.

No intuito de se determinar o mecanismo de fotoxidação das hemácias, foi

monitorada a porcentagem de hemólise de uma solução 0,5% (v:v) de eritrócitos em

tampão PBS pH 7.4, Tween 20 0,05% (v:v) e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de InTPP

(6,4 µM) e D2O, em função do tempo de irradiação da amostra, utilizando-se uma lâmpada

de Hg. Os resultados são mostrados na figura 35.

0 10 20 30 40 50 60

0

20

40

60

80

100

% H

emól

ise

Tempo de irradiação (minutos)

% D2O (v:v) 0 25 50 75

Figura 35 – Porcentagem de hemólise de uma solução 0,5% (v:v) de hemácias, em tampão PBS pH 7.4, Tween 20 0,05% (v:v) e 1,6% (v:v) de DMF, na presença de InTPP (6,4 µM) e D2O.


75

Pela figura 35 pode-se verificar, em geral, que à medida que se aumenta a

porcentagem de deutério, ocorre uma diminuição da velocidade da reação de fotoxidação

das hemácias, fato também observado por De Paolis et al115. Segundo Reuters et al.116, a

energia de ligação das pontes de deutério é maior quando comparada com a energia das

pontes de hidrogênio, resultando na deformação das estruturas terciárias de

macromoléculas biológicas, em especial, as proteínas116. Em um sistema envolvendo

eritrócitos, uma hipótese provável é que o aumento na porcentagem de deutério pode estar

ocasionando algum tipo de deformação na estrutura das proteínas presentes nas membranas

dos eritrócitos. Esta deformação poderia proteger os aminoácidos suscetíveis a

fotoxidação, dificultando a ação das espécies reativas geradas na PDT e resultando na

diminuição da velocidade de hemólise de eritrócitos.

Segundo De Paolis et. al.115, o fato de não ocorrer um aumento na velocidade de

fotoxidação das hemácias em função do aumento da porcentagem de D2O, não pode ser

considerado um argumento para se afirmar que o mecanismo da reação não é do tipo II. De

acordo com estes autores, como a solubilidade do O2 é menor em H2O do que em solventes

orgânicos, a concentração de oxigênio dentro das bicamadas lipídicas da membrana deve

ser maior do que na região hidrofílica, enquanto que a concentração de água (deuterada ou

não) nas regiões hidrofóbicas da bicamada é menor. Dessa forma é esperado que o

aumento da concentração de D2O tenha um efeito pequeno ou inexistente no tempo de vida

do oxigênio singlete gerado dentro da membrana115. Provavelmente está prevalecendo o

efeito da deformação da estrutura da proteína, reduzindo a velocidade da hemólise com o

aumento da concentração de deutério. Portanto, não é possível por este experimento,

afirmar se o mecanismo de fotoxidação dos eritrócitos ocorre segundo um mecanismo tipo

I ou tipo II. Faz-se necessário a realização de outros ensaios, na presença de supressores de

oxigênio singlete, como NaN3, e de supressores de radicais como manitol e superóxido

dismutase para se determinar qual o mecanismo de ação do InTPP na fotoxidação das

células vermelhas do sangue.


76

6. CONCLUSÕES

A constante de dimerização da meso-tetrafenilporfirina de índio foi determinada

utilizando-se o modelo de Margalit et al.71,86 sendo seu valor superior às constantes de

dimerização de outras porfirinas obtidas da literatura86, como a mesoporfirina IX e

deuteroporfirina IX, em razão do InTPP ser um composto mais hidrofóbico do que as

outras substâncias, resultando na maior tendência a agregação, e consequentemente, no

maior valor de KD em relação as outras porfirinas.

Após a realização de uma série de experimentos com o objetivo de se avaliar a

eficiência fotodinâmica do InTPP em comparação ao Photofrin , verificou-se que a meso-

tetrafenilporfirina de índio foi em média 22-30% mais eficiente em fotoxidar o Trp e a

BSA, quando comparado ao fármaco terapêutico.

Os resultados das fotoxidações de eritrócitos demonstraram que o InTPP a baixas

concentrações, é cerca de 41-103 vezes mais eficiente que o Photofrin indicando que

possivelmente o InTPP possa ser utilizado como potencial fotossensibilizador para

aplicação in vivo. Esta diferença na eficiência fotodinâmica entre os fotossensibilizadores

pesquisados pode estar relacionada ao número de moléculas dos fotossensibilizadores

presente nas soluções a serem fotoxidadas. O Photofrin® é um oligômero, de maneira que o

seu peso molecular não é conhecido. Portanto, as soluções utilizadas nos experimentos de

fotoxidação de eritrócitos, embora iguais em mg.L-1, não necessariamente são equimolares.

Dessa forma, se um maior número de moléculas do InTPP estiver na solução a ser

fotoxidada, maior será o número de moléculas excitadas de InTPP do que de Photofrin®, e

consequentemente, maior será a eficiência fotodinâmica da meso-tetrafenilporfirina de

índio, em relação ao fármaco, na hemólise de eritrócitos. Fatores como o tempo de vida

dos fotossensibilizadores no estado triplete, o coeficiente de extinção e o efeito do átomo

pesado também podem estar relacionados com a diferença da eficiência fotodinâmica entre

o InTPP e Photofrin®, uma vez que estes fatores interferem na eficiência do

fotossensibilizador em gerar oxigênio singlete. Sob altas concentrações a porcentagem de

hemólise dos eritrócitos devido à ação do InTPP foi menor quando comparado ao

Photofrin®, possivelmente em razão da formação de agregados de InTPP. Este fato não é

observado em ensaios com Trp e BSA devido as diferentes condições de agregação do

fotossensibilizador em meio aquoso com biomoléculas ou com eritrócitos.


77

Ensaios demonstraram que o InTPP fotoxida mais rapidamente as células de

eritrócitos em relação ao Photofrin®. Esta é uma propriedade interessante à terapia

fotodinâmica, pois quanto mais rápida for a reação de fotoxidação para um dado

fotossensibilizador, menor será o tempo de irradiação necessário à destruição do tecido

doente.

Foi demonstrado que as reações de fotoxidação de Trp e BSA ocorrem segundo

uma cinética de segunda ordem: primeira ordem em relação ao fotossensibilizador, em

razão da constante de velocidade da reação variar linearmente com a concentração do

fotossensibilizador, e primeira ordem em relação ao substrato devido os gráficos típicos

para reações de primeira ordem (ln(F/Fo) versus tempo) serem lineares.

Ensaios foram realizados para se determinar a constante de fotobranqueamento do

InTPP em tampão PBS pH 7.2, Tween® 20 1% (v:v) e 5% (v:v) de DMF, entretanto, não

foi observado o fotobranqueamento da meso-tetrafenilporfirina de índio, possivelmente,

em função do estado de agregação do fotossensibilizador ou em razão da localização do

fotossensibilizador em regiões do sistema micelar com menor constante dielétrica.

O mecanismo de ação do InTPP na fotoxidação das biomoléculas ocorre,

preponderantemente, via oxigênio singlete (mecanismo tipo II) em razão das constantes de

velocidade de fotoxidação das biomoléculas aumentarem na presença de D2O e

diminuírem na presença de NaN3. No entanto, não é possível afirmar que este seja o único

mecanismo pelo qual o InTPP fotoxida as biomoléculas, uma vez que uma série de

resultados de outros pesquisadores tem demonstrado que estas fotoxidações ocorrem

através dos dois mecanismos simultaneamente28,79 e por que não foram realizados

experimentos de fotoxidação das biomoléculas na presença de supressores de radicais,

como o manitol e a superóxido dismutase. Experimentos realizados para se identificar o

mecanismo de ação do InTPP na hemólise de eritrócitos mostraram que o aumento da

porcentagem de D2O diminui a velocidade de fotoxidação das hemácias em razão das

alterações na estrutura das proteínas presentes nas membranas dos eritrócitos. Estas

alterações podem proteger os aminoácidos suscetíveis a fotoxidação ocasionando a

diminuindo da velocidade de fotoxidação das hemácias. Este resultado não permite

concluir se a fotoxidação das células vermelhas do sangue ocorre via mecanismo do tipo I

ou II.


78

Os resultados, in vitro, obtidos na fotoxidação de Trp, BSA e hemácias indicam que

o InTPP pode ser um potencial fotossensibilizador para uso em terapia fotodinâmica.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 Simplicio, F. I.; Maionchi, F.; Hioka, N.; (2002); Química Nova; 25(5); 801-807. 2 http://www.inca.gov/cancer/epidemilogia/estimativa2002/brasil.html. 3 Bonnett, R.; (1995); Chem. Soc. Rev.; 24(1); 19-35. 4 Dalla Via, L.; Magno, S. M.; (2001); Curr. Med. Chem.; 8; 1405-1428. 5 Oschsner, M.; (1997); J. Photoch. Photobio. B.; 39; 1-18. 6 Machado, A. E. H.; (2000); Química Nova; 23(2); 237-243. 7 MacDonald, I. J.; Dougherty, T. J.; (2001); J. Porphyrins Phthalocyanines; 5; 105-129. 8 Sternberg, E. D.; Dolphin, D.; Brückner, C.; (1998); Tetrahedron; 54(17); 4151-4202. 9 Dougherty, T. J.; (1993); Photochem. Photobiol.; 58(6); 895-900. 10 Wohrle. D; Shopova, M.; Müller, S.; Milev, A. D.; Mantareva, V. N.; Krastev, K. K.;

(1993); J. Photoch. Photobio. B; 21; 155-165. 11 Owens, J. W.; Smith, R.; Robinson, R.; Robins, M.; (1998); Inorg. Chim. Acta; 279; 226-231. 12 Vollano, J. F.; Bossard, G. E.;Martelluci, S. A.; Darkes, M. C.; Abrams, M. J.; Brooks,

R. C.; (1997); J. Photoch. Photobio. B; 37; 230-235. 13 Bagnato, V. S.; Marcassa, L. G.; Marcassa, J. C.; Cestari, G. F.; Ferreira, J.; Kurachi, C.; (2002); Guia Prático de Terapia Fotodinâmica para o Tratamento de Tumores; 1a Edição; Instituto de Física de São Carlos; pg. 1-2 e 65-91. 14 Schuitmarker, J. J.; Star, W. M.; (1996); J.Photoch. Photobio. B; 34; 3-12. 15 Zaidi, S. I. A.;Agarwal, R.; Eichler, G.; Rihter, B. D.; (1993); Photochem. Photobiol.;

58(2); 204-210. 16 Bisland, S. K.; Singh, D.; Gariépy, J.; (1999); Bioconjugate Chem.; 10; 982-992. 17 Songca, S. P.; Mbatha, B.; (2000); J. Pharm. Pharmacol.; 52; 1361-1367. 18 McGlynn, S. P.; Azumi, T.; Kinoshita, M.; (1969); Molecular Spectroscopy of The

Triplet State; 1st Edition; Prentice-Hall; p. 1-32. 19 Braun, A. M.; Maurette, M. T.; Oliveros, E.; (1991); Photochemical Technology; 1st

Edition; John Wiley & Sons; p. 457-463. 20 Parker, J. P.; Stanbro, W. D.; (1982); J. Am. Chem. Soc.; 104; 2067-2069. 21 Foote, C. S.; (1976); Free Radical Biol.; 2; 85-133. 22 Wasserman, H. H.; Murray, R. W.; (1979); Singlet Oxygen; Academic Press; 1st

Edition; p. 139-167, 337. 23 Ostler, R. B.; Scully, A. D.; Taylor, A. G.; Gould, I. R.; Smith, T. A.; Waite, A.; Phillips,

D.; (2000); Photochem. Photobiol.; 71(4); 397-404. 24 Zenkevich, E.; Sagun, E.; Knyukshto, V.; Shulga, S. P.; Mironov, A.; Efremova, O.;

Bonnett, R.; Songca, S. P.; Kassem, M.; (1996); J. Photoch. Photobio. B; 33; 171-180. 25 Howe, L.; Zhang, J. Z.; (1998); Photochem. Photobiol.; 67(1); 90-96. 26 Langlois, R.; Ali, H.; Brasseur, N.; Wagner, J. R.; Van Lier, J. E.; (1986); Photochem.

Photobiol.; 44(2); 117-123. 27 Cavaleiro, J. A. S.; Neves, M. G. P. S.; (1999); J. Chem. Soc. Perkin Trans.; 1937-1943. 28 Grossweiner, L.I.; Patel, A.S.; Grossweiner, J. B.; (1982); Photochem. Photobiol.; 36;


79

159-167.

29 Musewald, C.; Hartwich, G.; Pöllinger-Dammer, F.; Lossau, H.; Scheer, H.; Michel- Beyerle, M. E.; (1998); J. Phys. Chem.; 102; 8336-8342.

30 Schmidt, R.; (1989); J. Am. Chem. Soc.; 111; 6983-6987. 31 Sconfienza, C.; Vorst, A. V.; Jori, G.; (1979); Photochem. Photobiol.; 31; 351-357. 32 Maman, N.; Dhami, S.; Phillips, D.; Brault, D.; (1999); BBA-Biomembranes; 1420; 168- 178. 33 Van Leengoed, H. L. L. M.; Cuomo. V.; Versteeg, A. A. C.; Van Der Veen, N.; Jori, G.;

Star, W. M.; (1994); Brit. J. Cancer; 69; 840-845. 34 Agarwal, M. L.; Larkin, H. E.; Zaidi, S. I. A.; (1993); Cancer Res.; 53; 5897-5902. 35 http://www.fcm.unicamp.br/departamentos/anatomia/atdeg3.doc. 36 Oleinick, N. L.; Morris, R. L.; Belichenko, I.; (2002); Photochem. Photobiol. Sci.; 1; 1-

21. 37 Tsujimoto, Y.; Shimizu, S.; (2000); FEBS Lett.; 466; 6-10. 38 Fisher, A. M. R.; Ferrario, A.; Rucker, N.; Zhang, S.; Gomer, C. J.; (1999); Cancer Res.;

59; 331-335. 39 Zaidi, S. I. A.; Oleinick, N. L.; Zaim, M. T.; Mukhtar, H.; (1993); Photochem.

Photobiol.; 58; 771-776. 40 Kessel, D.; Luo, Y.; (1999); Cell Death Differ.; 6; 28-35. 41 Granville, D. J.; Carthy, C. M.; Jiang, H.; Shore, G. C.; McManus, B. M.; Hunt, D. W.

C.; (1998); FEBS Lett.; 437; 5-10. 42 Christensen, T.; Feren, K.; Moan, J.; Pettersen, E.; (1981); Br. J. Cancer; 44; 717-724. 43 Berns, M. W.; Dahlman, A.; Johnson, F. M.; (1982); Cancer Res.; 42; 2325-4329. 44 Voegt, D.; Voet, J. G.; (1995); Biochemistry; 2nd Edition; John Wiley & Sons; p704-713. 45 Schmidt, H. H. H.; Walter, U.; (1994); Cell; 78; 919-925. 46 Bredt, D. S.; Synder, S. H.; (1994); Annu. Ver. Biochem.; 63; 175-195. 47 Flora Filho, R.; Zilberstein, B.; (2000); Ver. Ass. Med. Brasil; 46(3); 265-71. 48 Korbelik, M.; Parkins, C. S.; Shibuya, H.; Cecic, I.; Stratford, M. R. L.; Chaplin, D. J.;

(2000); Br. J. Cancer; 82(11); 1835-1843. 49 Salgado, I.; Modolo, L. V.; Ribeiro, J. N.; Magalhães, J. R.; Tamashiro, W. M. S. C.;

(2002); Physiol. Mol. Biol. Plants; 8(2); 185-191. 50 Grieve, M. B.; Hudson, A. J.; Richardson, T.; Johnstone, R. A.W.; Sobral, A. J. F. N.; Rocha Gonçalves, A. M. A.;(1994); Thin Solid Films; 243; 581-586. 51 Daziano, J. P.; Steenken, S.; Chabannon, C.; Mannoni, P.; Chanon M.; Julliard, M.;

(1996); Photochem. and Photobiol.; 64(4); 712-719. 52 Crouch, A. M.; Langford, C. H.; (1990); J. Photoch. Photobio. A; 52; 55-64. 53 Fernández, D. A.; Awruch, J.; Dicelio, L. E.; (1996); Photochem. Photobiol.; 63(6); 784-

792. 54 Brault, D.; Vever-Bizet, C.; Le Doan, T.; (1986); BBA-Biomembranes; 857; 238-250. 55 Kaneko, M.; (1991); J. Chem. Soc. Faraday Trans.; 87(1); 83-86. 56 Hamazawa, A.; Kinoshita, I.; Breedlove, B.; Isobe, K.; Shibata, M.; Baba, Y.; Kakuchi, T.; Hirohara, S.; Obata, M.; Mikata Y.; Yano, S.; (2002); Chem. Lett.; 3;388-389. 57 Uchibayashi, T.; Koshida, K.; Kunimi, K.; Hisazumi, H.; (1995); Br. J. Cancer; 71; 625-

628. 58 Lopez, R. F. V.; Bentley, M. V. L. B.; Delgado-Charro, M. B.; Salomon, D.; Van Der

Bergh, H.; Lange, N.; Guy, R. H.; (2002); Livro de resumos do 1o Congresso


80

sobre Terapia Fotodinâmica: complexos de moléculas fotoativas e suas aplicações; São Pedro 27-30/11; p.27.

59 Riopelle, R. J.; Kennedy, J. C.; (1982); Can. J. Physiol. Pharmacol.; 60; 707-714. 60 Sima, A. F.; Kennedy, J. C.; Blakeslee, D.; Robertson, D. M.; (1981); Le Jour. Canad.

Sciences Neurol.; 8(2); 105-114. 61 Costa, C. A. M.; (2000); Preparação e caracterização de Lipossomas

Encapsulando Ácido Azeláico, Bleomicina e 5-Fluorouracil para a Aplicação na Terapia de Melanomas; Dissertação de mestrado da FEQ da Unicamp; 5-6.

62 Berg, K.; Western, A.; Bommer, J. C.; Moan, J.; (1990); Photochem. Photobiol.; 52(3); 481-487.

63 Cañete, M.; Villanueva, A.; Dominguez, V.; Polo, S.; Juarranz, A.; Stockert, J. C.; (1998); Int. J. Oncol.; 13; 497-504.

64 Cloutour, C.; Ducassou, D.; Pommier, J. C.; Vuillemin, L.; (1982); Int. J. Appl. Radiat. Isot.; 33; 1311-1318. 65 McAfee, J. G.; Thakur, M. L.; (1976); J. Nucl. Med.; 17; 480-487. 66 Bonnet, R.; McGarvey, D. J.; Harriman, A.; Land, E. J.; Truscott, T. G.; Winfield, U.J.;

(1988); Photochem. Photobiol.; 48(3); 271-276. 67 Faustino, M. A. F.; Neves, M. G. P. M. S.; Cavaleiro, J. A. S.; Neumann, M.; Brauer, H. D.; Jori, G.; (2000); Photochem. Photobiol.; 72(2); 217-225. 68 Straight, R. C.; Spikes, J. D.; (1985); Photosensitized Oxidation of Biomolecules; CRC

Press; 4; 92-143. 69 Jori, G.; (1980); Lasers in Phtomedicine and Photobiology; Springer-Verlag; 58-66. 70 Hinze, W. L.; Pramauro, E.; (1993); Critical Reviews in Analytical Chemistry; 24(2);

133-177. 71 Margalit, R.; Shaklai, N.; Cohen, S.; (1983); Biochem. J.; 209; 547-552. 72 Atkins, P. W.; (1995), Physical Chemistry; 5st Edition; Oxford University Press; p. 218,

545. 73 Atkins, P. W.; (1999); Físico Química; Vol. III; 6a Edição; Editora LTC; Rio de Janeiro;

p. 36-37. 74 Bonnett, R.; Martínez, G.; (2001); Tetrahedron; 57; 9513-9547. 75 Spikes, J. D.; Bommer, J. C.; (1993); Photochem. Photobiol.; 58(3); 346-350. 76 Spikes, J. D.; (1991); Photochem. Photobiol.; 55(6); 797-808. 77 Rotomskis, R.; Streckyte, G.; Bagdonas, S.; (1997); J. Photochem. Photobiol. B; 39; 167-

171. 78 Potter, W. R.; Mang, T. S.; Dougherty, T. J.; (1987); Photochem. Photobiol.; 46(1); 97-

101. 79 Inoue, K.; Matsuura, T.; Saito, I.; (1982); Bull. Chem. Soc. Jpn; 55; 2959-2964. 80 Spikes, J. D.; Van Lier, J. E.; Bommer, J. C.; (1995); J. Photoch. Photobio. A; 91; 193- 198. 81 Falk, J. E.; (1964); Porphyrins and Metalloporphyrins; Elsevier; Vol 2; 1st Edition; p. 72-

93. 82 Gouterman, M.; J. Mol. Spectr.; (1961); 6; 138-163. 83 Nguyen, K. A.; Day, P. N.; Pachter, R.; Tretiak, S.; Chernyak, V.; Mukamel, S.; (2002); J. Phys. Chem. A; 106; 10285-10293. 84 Gratz, H.; Penzkofer, A.; (2000); Chem. Phys.; 254; 363-374. 85 Darwent, J. R.; Douglas, P.; Harriman, A.; Porter, G.; Richoux, M. C.; (1982); Coord.


81

Chem. Reviews; 44; 83-126.

86 Margalit, R.; Rotenberg, M.; (1984); Biochem. J.; 219; 445-450. 87 Lewis, L. M.; Indig, G. L.; (2002); J. Photochem. Photobiol. B; 67; 139-148. 88 Shimidzu, T.; Iyoda, T.; (1981); Chem. Lett.; 7; 853-856. 89 Li, N.; Tong, S. Y.; (1993); Talanta; 41(10); 1657-1662. 90 Severino, D.; Junqueira, H. C.; Baptista, M. S.; (2002); Livro de resumos do 1o Congresso sobre Terapia Fotodinâmica: complexos de moléculas fotoativas e suas aplicações; São Pedro 27-30/11; p.115. 91 Gabrielli, D.; Belisle, E.; Severino, D.; Kowaltowski, A. J.; Baptista, M. S.; (2002);

Severino, D.; Junqueira, H. C.; Baptista, M. S.; (2002); Livro de resumos do 1o

Congresso sobre Terapia Fotodinâmica: complexos de moléculas fotoativas e suas aplicações; São Pedro 27-30/11; p.117.

92 Karns, G. A.; Gallagher, W. A.; Elliott, W. B.; (1979); Bioorg. Chem.; 8; 69-81. 93 Rotomskis, R.; Bagdonas, S.; Streckyte, G.; J. Photochem. Photobiol. B; (1996); 33; 61-

67. 94 Udal’tsov, A.V.; Kazarin, L. A.; Sweshnikov, A. A.; (2001); J. Mol. Structure; 562; 227-

239. 95 Gandini, S. C. M.; Gelamo, E. L.; Itri, R.; Tabak, M.; (2002); contido no livro de

resumos do 1o Congresso sobre Terapia Fotodinâmica: complexos de moléculas fotoativas e suas aplicações; São Pedro 27-30/11; p.97.

96 Cheng, R. J.; Grazynski, L. L.; Balch, A. L.; (1982); Inorg. Chem.; 21; 2412-2418. 97 Lambert, C. R.; Reddi, E.; Spikes, J. D.; Rodgers, M. A. J.; Jori, G.; (1986); Photochem.

Photobiol.; 44(5); p. 595-601. 98 Ball, D. J.; Wood, S. R.; Vernon, D. I.; Griffiths, J.; Dubbelman, T. M. A. R.;Brown, S.

B.; (1998); J. Photoch. Photobiol. B.; 45; 28-35. 99 Silvester, J. A.; Timmins, G. S.; Davies, M. J.; (1998); Free Rad. Bio. Med.; 24; 754-766. 100 Moan, J.; (1986); J. Cancer Lett.; 33; 45-53. 101 König, K.; Schneckenburger, H.; Rück, A.; Steiner, R.; (1993); J. Photochem.

Photobiol. B; 18; 287-290. 102 Streckyte, G.; Rotomskis, R.; (1993); J. Photochem. Photobiol. B.; 18; 259-263. 103 Handa, T.; Takeuchi, H.; Tagaki, H.; Toriyama, S.; Kawashima, Y.; Komatsu, H.;

Nakagaki, M.; (1988); Colloid Polym. Sci.; 266; 745-752. 104 Zavodnik, I. B.; Zavodnik, L. B.; Bryszewska, M. J.; (2002); J. Photochem. Photobiol. B; 67; 1-10. 105 Ali, I. A.; Gatasheh, K. M.; Naseem, I.; (2000); Biochim. Biophys. Acta; 1523; 225-229. 106 Guidi, G.; Costanzo, L. L.; Condorelli, G.; Giuffrida, S.; Miano, P.; Sortino, S.; Velardita, A.; (1996); Gazzet. Chim. Italiana; 126(11); 719-724. 107 Galembeck, E.; Alonso, A.; Meirelles, N. C.; (1998); Chem. Biol. Interactions; 113; 91- 103. 108 Ohnishi, M.; Sagitani, H.; (1993); J. Am. Chem. Soc.; 70(7); 679-684. 109 Trägner, D.; Csordas, A.; (1987); Biochem. J.; 244; 605-609. 110 Gollnick, K.; (1968); Adv. Photochem.; 6; 1-122. 111 Rodgers, M. A. J.; (1983); J. Am. Chem. Soc.; 105; 6201-6205. 112 Hurst, J. R.; Schuster, G. B.; (1983); J. Am. Chem. Soc.; 105; 5756-5760. 113 Spikes, J. D.; Van Lier, J. E.; Bommer, J. C.; (1995); J. Photoch. Photobio. A; 91; 193-

198.


82

114 Bartlett, J. A.; Indig, G. L.; (1999); Photochem. Photobiol.; 70(4); 490-498. 115 De Polis, A.; Chandra, S.; Charalambides, A. A.; Bonnett, R.; Magnus, I. A.; (1985); Biochem. J.; 226; 757-766. 116 Reuter, H. D.; Fischer, J. H.; Thiele, S.; (1985); Haemostasis; 15; 157-163.

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