UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE …taurus.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/331906/1/Oliveira_CristianeDe... · pelo auxílio Pesquisa Processo 191/14. A minha eterna gratidão

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CRISTIANE DE OLIVEIRA

IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE SUSCETIBILIDADE HERDADA PARA O

MELANOMA CUTÂNEO POR GENOTIPAGEM EM LARGA ESCALA

CAMPINAS

2017


IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE SUSCETIBILIDADE HERDADA PARA O

MELANOMA CUTÂNEO POR GENOTIPAGEM EM LARGA ESCALA

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual

de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de

Doutora em Ciências.

ORIENTADOR: PROFA. DRA.CARMEN SILVIA PASSOS LIMA

COORIENTADOR: PROF. DR. GUSTAVO JACOB LOURENÇO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA

ALUNA CRISTIANE DE OLIVEIRA, E ORIENTADA PELA

PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA

CAMPINAS

2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO


ORIENTADOR: PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA

COORIENTADOR: PROF. DR. GUSTAVO JACOB LOURENÇO

MEMBROS:

1. PROF. DR. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA

2. PROF. DR. ROGER CHAMMAS

3. PROF. DR. SÉRGIO VICENTE SERRANO

4. PROF. DR. CARMEN SILVIA BERTUZZO

5. PROF. DR. FÁBIO ROSSI TORRES

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 22 de fevereiro de 2017

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à minha amada família, pelo constante

apoio e compreensão em todos os momentos.

E aos pacientes que participaram da elaboração deste

trabalho, por doarem um pouco de si, em momento tão

delicado em suas vidas

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima, pela orientação, apoio, amizade,

compreensão e profissionalismo, sem os quais eu não teria terminado minha dissertação.

Ao meu grande amigo e co-orientador Prof. Dr. Gustavo Jacob Lourenço pela amizade,

apoio e ajuda imensurável em todas as etapas desse trabalho, principalmente por me nortear

nas etapas mais difíceis.

Ao Dr. José Augusto Rinck Júnior, do ambulatório de Oncologia Clínica, e à Profa. Dra.

Aparecida Machado de Moraes, do ambulatório de Dermatologia do Hospital de Clínicas da

UNICAMP, pelo apoio e enorme ajuda na obtenção das amostras de pacientes.

À Maria Eugênia do Laboratório de Biociências do LNSBio do CNPEN pela paciência

e prontidão para me ajudar nos momentos delicados.

Ao Miguel e a Dra Maria Carolina do Laboratório de Pesquisa do Fleury pela ajuda e

gentileza em disponibilizar o uso da plataforma Affymetrix.

Ao Fábio Rossi do Laboratório de Genética Molecular da FCM pela ajuda, amizade e

compreensão nos momentos de grande dificuldade durante parte dos experimentos e no uso

do equipamento.

Ao Dr. Benilton Carvalho pela ajuda e competência com as análises de bioinformática.

À Stela, do Registro Hospitalar do Câncer, pela obtenção dos prontuários, a todos os

funcionários do ambulatório de Oncologia Clínica e de Dermatologia do Hospital de Clínicas

da UNICAMP, pela ajuda na coleta do sangue de pacientes.

Aos meus amigos Anderson, Raquel e Alessandro pela amizade, foram fundamentais no

desenvolvimento do meu trabalho, mesmo que distante.

Ao Laboratório de Genética do Câncer (LAGECA), por me proporcionar momentos

únicos e de grande aprendizado profissional e pessoal, um lugar que tenho um carinho enorme

que cuidei como se fosse a minha “primeira” casa e que já sinto saudades imensas.

À Leisa, Éricka e Angelo pela ajuda e pelos altos papos do dia-a-dia (científicos ou não)

que foram de grande valia no decorrer desse trabalho e no meu aprendizado.

Ao pessoal do LAGECA, Carla, Gabriela, Juliana, Gabriela Tortorelli, Vanessa, João

Pedro, Guilherme Rossi pela ajuda e coleguismo.

Ao João pelo companheirismo, carinho e atenção especial, pela insistência em me

mostrar o lado bom das coisas, por não me deixar desanimar e por me fazer acreditar que tudo

dará certo (basta respirar e acreditar!)

Aos meus pais, Lourdes e Luiz, alicerces da minha existência e formação, meu porto

seguro em todos os momentos; à minha avó Jovina, à minha irmã Elaine e ao meu cunhado

Mendes pelo amor e apoio incondicional sem os quais eu não teria chegado aqui.

A todos os pacientes, que diante de tantos problemas, aceitaram participar deste estudo,

doando um pouco de si e me permitindo mesmo que por alguns minutos ouvir e compartilhar

suas histórias de vida.

Às agências de fomento FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo) pela concessão de bolsa (nº 2012/16617-4) e auxílio pesquisa (nº 2012/1588-3), CNPq

(Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo auxílio Pesquisa

Processo nº 479529/2012-4 e FAEPEX (Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão

pelo auxílio Pesquisa Processo 191/14.

A minha eterna gratidão a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram

para a realização, desenvolvimento e conclusão desse trabalho!

RESUMO

As associações de alterações genéticas herdadas, como polimorfismos gênicos de base única

(SNPs) com o risco de melanoma cutâneo (MC), com suas manifestações clinicopatológicas e

prognóstico de portadores do tumor não foram estabelecidas e, desta forma, estes foram os

objetivos do presente estudo. O DNA genômico de sangue periférico de 103 pacientes com

MC e de 103 controles foi analisado por meio de lâminas com microarranjos de DNA (SNPs).

As frequências de 12.994 SNPs foram distintas entre pacientes e controles; 6.814 SNPs

(52,4%) estiveram localizados em regiões regulatórias da transcrição do DNA (regiões 5’ e 3’

não traduzidas e intergênicas), 26 (0,2%) em regiões codificantes de aminoácidos, 6.042

(46,5%) em íntrons e 112 (0,9%) em regiões não identificadas. Dez SNPs localizados em

regiões regulatórias da expressão de genes, relacionados com a melanogênese, WNT8B c.-

101T>C (rs rs3793772), KIT c.67+12766T>C (rs2017472), GNAI1 g.80130766C>T

(rs2079162), ADCY3 c.675+9196T>G (rs11900505), PLCB1 g.8908966C>A (rs4295085),

PRKCA c.205+407G>A (rs12601850), PRKCA c.288+33994A>G (rs1806448), CALM2

g.47384601A>G (rs11884600), CREB1 c.303+373G>A (rs10932201) e MITF

c.938-325A>G (rs7623610), foram considerados de interesse para o estudo e foram utilizados

para a validação dos resultados obtidos na GELE por meio da reação em cadeia da polimerase

em tempo real com ensaios TaqMan® (Applied Biosystems®). Todos os SNPs isolados e em

combinações específicas de dois a dois alteraram o risco de ocorrência de MC. Os SNPs

ADCY3 c.675+9196T>G e MITF c.938-325A>G merecem destaque entre os demais. Os

genótipos isolados ADCY3 TT e MITF AA e o genótipo combinado TT+GG + AA+AG dos

SNPs estiveram associados a riscos 4,86, 3,13 e 19,17 vezes maiores de ocorrência de MC do

que os demais genótipos. Aos 60 meses de observação, os pacientes com o genótipo MITF

AA e com o genótipo combinado ADCY3 + MITF TT+AA apresentaram menor SLP (44,5%

versus 68,2%, P= 0,007; 22,2% versus 61,3%, P= 0,006) e menor SG (67,7% versus 81,7%,

P= 0,009; 44,4% versus 72,5%, P= 0,006) do que os pacientes com os outros genótipos dos

genes (Estimativas de Kaplan-Meier). Pacientes com os repectivos genótipos estiveram sob

riscos 2,40 e 3,53 vezes maiores de apresentarem progressão da doença e 2,85 e 3,84 vezes

maiores de apresentarem evolução para o óbito (análise univariada de Cox). Nossos resultados

indicam, pela primeira vez, que SNPs em genes de melanogênese podem contribuir para

identificar indivíduos com alto risco de MC e de pacientes com prognóstico desfavorável, que

mereçam maior atenção na prevenção, diagnóstico precoce ou terapêutica do tumor.

Palavras chave: Melanoma, Técnicas de genotipagem, Polimorfismo genético, Melaninas,

Análise de microarranjos

ABSTRACT

Combinations of inherited genetic alterations, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) in

association with cutaneous melanoma (CM) risk, clinical manifestation and prognosis in patients have

not been clarified. Therefore, this was the aim of the present study. Genomic DNA was extracted of

the peripheral blood samples of 103 CM patients and 103 controls. Each sample was genotyped using

DNA high-resolution microarrays (Affymetrix® SNP 6.0). We observed 12.994 SNPs differentially

between patients and controls groups. Among them, 6.814 SNPs (52.4%) were located in regulatory

regions of DNA transcription (in 3’ and 5’ untranslated), 26 (0.2%) in coding sequence of amino acids

regions, 6.042 (46.5%) in introns and 112 (0.9%) unidentified regions. Ten SNPs, located in

regulatory regions of gene associated with melanogenesis pathway, WNT8B c.-101T>C (rs

rs3793772), KIT c.67+12766T>C (rs rs2017472), GNAI1 g.80130766C>T (rs2079162), ADCY3

c.675+9196T>G (rs11900505), PLCB1 g.8908966C>A (rs4295085), PRKCA c.205+407G>A

(rs12601850), PRKCA c.288+33994A>G (rs1806448), CALM2 g.47384601A>G (rs11884600),

CREB1 c.303+373G>A (rs10932201) e MITF c.938-325A>G (rs7623610), were considered of interest

for the study and validated by polymerase chain reaction in real time using TaqMan assays (Applied

Biosystems®). All SNPs isolated and combined alter the risk for CM. SNPs ADCY3 c.675+9196T>G

and MITF c.938-325A>G deserves highlight. The isolated genotypes ADCY3 TT and MITF AA and

TT+GG + AA+AG combined were associated with 4,86, 3,13 and 19,17-fold increased risk for CM.

During 60 months of observation, patients with MITF AA genotypes and ADCY3 + MITF TT+AA

combined genotypes were associated with poor progression free survival (44,5% versus 68,2%, P=

0,007; 22,2% versus 61,3%, P= 0,006) and lower overall survival (67,7% versus 81,7%, P= 0,009;

44,4% versus 72,5%, P= 0,006) than the patients with others genotypes (Kaplan-Meier estimates).

Carriers of the same genotypes had 2,40 and 3,53 more chances of disease progression and 2,85 and

3,84 more chances to evolve to death, respectively (Cox univariate). Our results suggest, for the first

time, that SNPs related in melanogenesis pathway may contributed for identify people with high risk

for CM and patients with poor prognosis, that need to receive more attention on preventing, early

diagnosis or treatment.

Key words: Melanoma, Genotyping techniques, Polymorphism, Genetic, Melanins, Microarray

analysis

Lista de Figuras

Figura 1. Representação esquemática da infiltração do melanoma cutâneo nas

camadas da pele e critérios previamente definidos para as espessuras

de Breslow e os níveis de Clark

23

Figura 2. Localização cromossômica dos genes de alta penetrância, média e

baixa associados com maior predisposição ao melanoma cutâneo

31

Figura 3. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma

cutâneo e controles

39



40

Figura 5. Representação esquemática do protocolo Affymetrix® Genome-Wide

Human SNP Array 6.0 para a genotipagem em larga-escala de

pacientes com melanoma cutâneo e controles

43

Figura 6. Imagem padrão gerada pela excitação dos fluoróforos contidos em

lâmina de um indivíduo controle capturada por scanner para a

genotipagem em larga escala

50

Figura 7. Sobrevida livre de progressão, estimadas pelo método de Kaplan-

Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por

espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios clínicos

90

Figura 8. Sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de

pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,

sexo, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor

91

Figura 9. Sobrevida livre de progressão e sobrevida global, estimadas pelo

método de Kaplan-Meier, de pacientes com melanoma cutâneo

estratificados por genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G

94

Figura 10. Sobrevida livre de progressão, estimadas pelo método de Kaplan-

Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por

genótipos combinados dos polimorfismos ADCY3 e MITF, GNAI1 e

PLCB1, GNAI1 e MITF e CALM e MITF

97

Figura 11. Sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de

pacientes com melanoma cutâneo estratificados por genótipos

combinados dos polimorfismos KIT e MITF e ADCY3 e MITF

98

Figura 12. Representação esquemática da via da melanogênese de acordo com as

funções conhecidas ou presumidas das proteínas codificadas pelos

genes polimórficos identificados neste estudo

115

Lista de Tabelas

Tabela 1. Polimorfismos de base única associados com risco de melanoma

cutâneo em estudos de genotipagem em larga escala

30

Tabela 2. Sequências de lavagens e marcações dos microarranjos contidos em

lâminas por fluoróforos para a genotipagem em larga escala

42

Tabela 3. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo e controles de

acordo com a idade, sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cor dos

cabelos, presença de sardas, presença de nevos e exposição solar

48

Tabela 4. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a

localização do tumor, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios

clínicos do tumor

49

Tabela 5. Regiões do DNA que albergam os polimorfimos com frequências

genotípicas distintas em pacientes com melanoma cutâneo e controles

51

Tabela 6. Distribuições dos dez polimorfismos gênicos localizados em genes

relacionados com a melanogênese

52

Tabela 7. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT,

GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1 e MITF,

identificados por genotipagem em larga escala e reação em cadeia da

polimerase em tempo real, em pacientes com melanoma cutâneo e

controles

53

Tabela 8. Teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg dos dez polimorfismos gênicos

selecionados em pacientes com melanoma cutâneo e controles

55

Tabela 9. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos

polimorfismos WNT8B c.-101T>C e KIT C.67+12766T>C em pacientes

com melanoma cutâneo e controles

56

Tabela 10. Distribuições dos alelos selvagem e variante dos polimorfismos GNAI1

g.80130766C>T e ADCY3 c.675+9196T>G em pacientes com

melanoma cutâneo e controles

57


polimorfismos PLCB1 g.8908966C>A e PRKCA c.205+407G>A em


59


polimorfismos PRKCA c.288+33994A>G e CALM2 g.47384601A>G

em pacientes com melanoma cutâneo e controles

60


polimorfismos CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em


61

Tabela 14. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT,

GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados

dois a dois, em pacientes melanoma cutâneo e controles

63

Tabela 15. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em


sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de

nevos e exposição solar

66

Tabela 16. Distribuições dos genótipos do polimorfismo no gene KIT

C.67+12766T>C em pacientes com melanoma cutâneo estratificados

por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de

efélides, presença de nevos e exposição solar

67

Tabela 17. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T

em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,



68

Tabela 18. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G




69

Tabela 19. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A




70

Tabela 20. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A




71

Tabela 21. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G




72

Tabela 22. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G




73

Tabela 23. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A




74

Tabela 24. Distribuições dos genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G em




75

Tabela 25. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos nos genes

WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1,

MITF, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo

estratificados de acordo com o fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos

e presença de efélides e nevos

77

Tabela 26. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em

pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,

espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor

79

Tabela 27. Distribuições dos genótipos do polimorfismo KIT C.67+12766T>C em



80

Tabela 28. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T

em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,


81

Tabela 29. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G



82

Tabela 30. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A



83

Tabela 31. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A



84

Tabela 32. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G



85

Tabela 33. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G



86

Tabela 34. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A



87




88

Tabela 36. Distribuições diferenciadas dos genótipos de polimorfismos nos genes,

WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1,

MITF, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo

estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e

estágios do tumor

89

Tabela 37. Impacto de aspectos clínicos de pacientes e biológicos do tumor na

sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com

melanoma cutâneo na análise univariada de Cox

92

Tabela 38. Impacto de polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3 e

PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1 e MITF na sobrevida livre de

progressão e sobrevida global dos pacientes com melanoma cutâneo na

análise univariada de Cox

95

Tabela 39. Associação dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3,

PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados dois a dois, na

sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com


99

Tabela 40.

Resumos dos principais resultados de associação dos dez polimorfismos

da via da melanogênese isolados no risco de ocorrência, nos aspectos

clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo

100

Tabela 41. Resumos dos principais resultados de associação dos dez polimorfismos

da via da melanogênese combinados no risco de ocorrência, nos

aspectos clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma

cutâneo

101

Lista de Abreviaturas

ADCY3 Adenilato ciclase tipo 3

AJCC American Joint Committee on Cancer

BRAF Protoncogene B-RAF

BSA Albumina bovina sérica

CALM2 Calmodulina 2

cAMP AMP ciclíco

CDKN2A Gene inibidor de ciclina dependente de quinase

CQ Controle de qualidade

CREB1 Elemento de ligação 1 de AMPc

crlmm Algoritmo corrected robust linear model with maximum likelihood

classification

CT Tumografia computadorizada

DAVID Database for annotation, visualization and integrated discovery

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

EDTA Ácido etilenodiamino tetracético

GELE Genotipagem em larga escala

GNAI1 Proteína G sub unidade alfa i1

HCl Ácido clorídrico

kDA Kilodaltons

KIT Proto oncogene receptor de tirosina quinase

M Molar

MC Melanoma cutâneo

MC1R Receptor de melanocortina

MES Ácido 4-morpholineethanesulfonic

mg Miligrama

MITF Fator de transcrição associado a microftalmia

ml Mililitro

mM Mili molar

n Número de indivíduos

N Número total de indivíduos

ng Nanograma

OCR Oligo control reagent

OR Risco de ocorrência

PA Poder da análise

Pb Pares de base

PCR Reação em cadeia da polimerase

PLCB1 Fosfolipase tipo 1 beta

PRKCA Proteina quinase C alfa

RAS Oncogene RAS

RCF Força centrífuga relativa

RFLP RFLP

RNA Ácido ribonucléico

RR Risco relativo

rs Número de referência do SNP

RT Tempo real

SG Sobrevida global

SLP Sobrevida livre de progressão

SNP Polimorfismo de troca de base única

TdT Enzima terminal deoxynucleotidyl transferase

TE Tampão Tris EDTA

U Unidades

UV Raios ultravioleta

Wnt8B Proteína transmembrana wingless 8 beta

α-MSH Alfa hormônio estimulante de melanócito

μl Microlitro

SUMÁRIO

RESUMO ............................................................................................................... 08

ABSTRACT............................................................................................................ 09

INTRODUÇÃO...................................................................................................... 21

1. Considerações gerais ...................................................................................... 21

2. Aspectos clínico patológicos .......................................................................... 22

3. Aspectos ambientais e constitucionais ........................................................... 24

4. Aspectos genéticos ......................................................................................... 25

5. Justificativa do estudo .................................................................................... 31

OBJETIVOS .......................................................................................................... 33

PACIENTES E MÉTODOS ................................................................................. 34

1. Avaliação clínica ............................................................................................ 34

2. Terapêutica ..................................................................................................... 35

3. Genotipagem em larga escala ......................................................................... 35

4. Genotipagem dos polimorfismos gênicos ..................................................... 44

5. Análise estatística da genotipagem em larga escala ....................................... 44

6. Seleção dos polimorfismos gênicos .............................................................. 45

7. Validação dos resultados ............................................................................... 45

8. Análise estatística de associações de SNPs e aspectos clinicopatológicos ... 46

9. Aspectos éticos ............................................................................................... 46

RESULTADOS ..................................................................................................... 47

1. Avaliação clínica ............................................................................................ 47

2. Aspectos do tumor ......................................................................................... 49

3. Terapêutica dos pacientes .............................................................................. 50

4. Determinação dos polimorfismos gênicos .................................................... 50

5. Identificação dos polimorfismos gênicos por genotipagem em larga escala 51

6. Seleção dos polimorfismos gênicos ............................................................... 51

7. Validação dos resultados ................................................................................ 52

8. Polimorfismos em genes da via da melanogênese em pacientes e controles 54

9. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos clínicos de pacientes 65

10. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos do tumor de

paciente.

78

11. Polimorfismos em via da melanogênese e prognóstico dos pacientes ......... 89

12. Resumo dos resultados ................................................................................. 100

DISCUSSÃO .......................................................................................................... 103

CONCLUSÕES ..................................................................................................... 114

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 115

ANEXOS ................................................................................................................ 129

21

INTRODUÇÃO

1. Considerações gerais

O aparecimento de um tumor está associado com a ocorrência de alterações

genéticas que se acumulam progressivamente no material genético (DNA) de uma célula

normal (Wunsch Filho & Gattás, 2001). Dessa forma, o câncer é uma doença genética e a

identificação e a caracterização dos genes alterados são fundamentais para a compreensão

da sua fisiopatologia (Wunsch Filho & Gattás, 2001). Além disso, o aumento da

expectativa de vida, a urbanização e a globalização são alguns dos fatores que podem

explicar aumento de novos casos de câncer no mundo (GLOBOCAN, 2012).

O melanoma cutâneo (MC) é um tumor de baixa incidência (corresponde a 5% dos

tumores de pele) mas de alta letalidade devido ao alto potencial metastático (corresponde a

60% das mortes causadas por esta neoplasia) (Instituto Nacional do Câncer, 2016). O MC

resulta da transformação maligna dos melanócitos cutâneos, que são células responsáveis

pela produção da melanina, pigmento protetor natural da pele, e que estão localizados na

camada basal da epiderme (Slingluff et al., 2011).

A incidência do MC dobrou nas últimas décadas e aumentou rapidamente em

comparação à de outros tipos de cânceres (American Cancer Society, 2011). O aumento da

incidência da doença foi observado em países com população de pele clara como a

Austrália, a Nova Zelândia, os Estados Unidos da América (EUA), o Canadá, e a Europa

central e norte (Jemal et al., 2011; Godar, 2011). Além disso, esse aumento também foi

observado na população do Brasil (Instituto Nacional do Câncer, 2016).

Estima-se que anualmente, ocorram cerca de 232 mil novos casos desse tumor no

mundo, com cerca de 55 mil óbitos (GLOBOCAN, 2012). Foi estimado para o ano de

2015, nos EUA, a ocorrência de 74 mil casos novos de MC (43 mil homens e 31 mil

mulheres) com cerca de 10 mil mortes (6.700 homens e 3.300 mulheres). O tumor acomete

preferencialmente indivíduos caucasianos, com proporções de 1:40 em brancos, 1:200 em

hispânicos e 1:1.000 em negros (American Cancer Society, 2011). Estima-se a ocorrência

de 5.670 casos novos de MC no Brasil nos anos de 2016 e 2017 (Instituto Nacional do

Câncer, 2016).

O MC é considerado um grave problema de saúde pública na maioria dos países do

mundo, incluindo o Brasil (Instituto Nacional do Câncer, 2016). A magnitude do problema

encontra-se no diagnóstico da doença em fases avançadas e, muitas vezes, com metástases,

especialmente em indivíduos de classes sócio-econômicas menos privilegiadas, quando o

tratamento é pouco efetivo e as chances de cura são mínimas (Livingstone et al., 2012).

22

2. Aspectos clínicopatológicos

O MC acomete predominantemente indivíduos com pele, cabelos e olhos claros,

com incapacidade de bronzeamento, presença de efélides e nevos atípicos (Leiter et al.,

2014). Portadores da síndrome xeroderma pigmentoso, caracterizada pela deficiência

herdada de reparo de lesões de DNA, apresentam elevada fotossensibilidade nas regiões

expostas à luz solar, tendo o câncer de pele, incluindo o MC, como consequência (Leiter et

al., 2014).

A incidência do MC aumenta com o passar dos anos, sendo 50 anos a mediana de

idade ao diagnóstico (Jemal et al., 2004; Leiter et al., 2014).

O MC usualmente se apresenta como uma lesão de pele com algumas das seguintes

características: assimetria, bordas irregulares, variações de cor e aumento ou regressão de

tamanho ao longo do tempo (Giorgi et al., 2012). Em homens caucasianos, os locais mais

acometidos de melanoma são o dorso e os membros superiores, em mulheres caucasianas,

o dorso e os membros inferiores são os locais de maior exposição solar (Caini et al., 2009).

O diagnóstico do MC é realizado com a exérese da lesão e a avaliação histológica

de fragmentos tumorais incluídos em parafina (Slingluff JR et al., 2011).

O crescimento vertical da lesão é o principal fator prognóstico para os portadores

de MC, quanto mais o tumor se aprofunda nas camadas da pele, pior é o prognóstico

(Balch et al., 2009; Mrazek & Chao, 2014). A espessura de Breslow, que corresponde à

profundidade de infiltração do tumor na pele (Breslow, 1970) e o nível de Clark, que

corresponde ao comprometimento das camadas cutâneas pelo tumor (Clark et al., 1969),

são utilizados na rotina para avaliar o crecimento vertical da lesão.

São cinco os níveis de Clark: no nível I, as células tumorais estão confinadas à

epiderme; no nível II, o tumor invade a derme papilar, atravessando a membrana basal;

nível III, o tumor preenche a derme papilar e estende-se entre a derme papilar e reticular;

no nível IV, o tumor invade a derme reticular e nível V, o tumor invade o tecido

subcutâneo (Clark et al., 1969). São quatro as espessuras de Breslow: menor do que 0,75

mm, entre 0,76 e 1,5 mm, entre 1,51 e 4 mm e maior do que 4 mm de infiltração da pele

(Breslow, 1975). Os níveis de Clark e os índices de Breslow são considerados fatores

isolados de maior impacto no prognóstico dos pacientes com o tumor (Spatz et al., 2010)

(Figura 1). A sobrevida global (SG) dos pacientes em cinco anos de acordo com o nível de

Clark II, III, IV e V corresponde a 100%, 93%, 89% e 82%, e a sobrevida livre de doença

(SLD) corresponde a 85%, 88%, 77% e 55%, respectivamente. A SG em cinco anos dos

23

pacientes com tumores com Breslow menor ou igual a 1,0 mm, entre 1,01 a 2,00 mm, 2,01

a 4,00 mm e maior que 4,0 mm correspondem a 97%, 94%, 86% e 78%, respectivamente, e

a SLD corresponde a 94%, 87%, 72% e 62%, respectivamente (Elsaeber et al., 2012). A

ulceração é um fator prognóstico importante para portadores do tumor. A frequência de

ulceração aumenta conforme a espessura do tumor: em melanomas finos é de apenas 6% e

em espessos pode chegar a 63%. A SG em cinco anos para pacientes com tumor ulcerado é

de cerca de 66% e para aqueles com tumor sem ulceração é de cerca de 92% (Mervic,

2012). O envolvimento linfonodal também constituiu fator prognóstico para portadores do

tumor, tendo influência tanto o número de linfonodos envolvidos como a forma de invasão

dos mesmos, micro ou macroscópica (Paxton et al., 2011). Apenas 54% dos casos com

comprometimento linfonodal pelo tumor sobrevivem por cinco anos (Elsaeber et al.,

2012).

Figura 1. Representação esquemática da infiltração do melanoma cutâneo nas camadas

da pele e critérios previamente definidos para as espessuras de Breslow e os

níveis de Clark

O sistema de estagiamento do MC é o TNM, determinado por critérios do American

Joint Committee on Cancer (AJCC). O sistema considera a extensão do tumor na pele e

tecidos adjacentes (T) com a presença ou não de ulceração no tumor (a, b) e a identificação

de metástases linfonodais (N) ou à distância (M). Dez estágios do tumor são identificados

(0, Ia, Ib, IIa, IIb, IIc, IIIa, IIIb, IIIc e IV) (Balch et al., 2009; Boland et al., 2016).

A única terapêutica curativa para pacientes com o MC até o momento é a remoção

cirúrgica da lesão com margens livres de tumor; a quimioterapia, a radioterapia e a

24

imunoterapia atuam como tratamento complementares ao cirúrgico (Testori et al., 2009;

Livingstone et al., 2012; Hamid et al., 2013). Medicamentos alvo específicos, como o

vemurafenibe e o mesilato de imatinibe têm indicação precisa para pacientes com

mutações no gene BRAF (Chapman et al., 2011) e no gene cKIT (Carvajal et al., 2011),

respectivamente. Outros medicamentos que merecem destaque, na atualidade, são aqueles

que estimulam o sistema imunológico, como o anti-CTLA4 ipilimumabe (Fellner, 2012) e

os antiPD1 nivolumabe isolado (Robert et al., 2015) ou associado a pembrolizumabe

(Ascierto e Marincola, 2015), para que este reconheça o tumor como algo a ser combatido

3. Aspectos ambientais e constitucionais

O MC é um tumor heterogêneo, determinado pela interação entre fatores ambientais

e genéticos. O principal fator de risco é a exposição solar aos raios ultravioleta A (UVA),

B (UVB) e C (UVC) (Gandini et al., 2011). Os raios UV na pele induzem dano genético às

células (Thompson et al., 2005). A radiação UVA corresponde a mais de 90% da radiação

solar e causa dano indireto ao DNA por meio da formação de espécies reativas de oxigênio

(ERO) com quebras na dupla fita (Svobodova et al., 2011; Mouret et al., 2012).

As radiações UVB e UVC alteram diretamente a estrutura do DNA pela formação

de dímeros de ciclobutano pirimidina e fotoprodutos de pirimidina-pirimidona (Svobodova

et al., 2011). A exposição consistente ao sol, principalmente na infância, e as queimaduras

solares em qualquer fase da vida estão associadas com maior risco de desenvolvimento do

MC.

Estima-se que 65% dos tumores estão relacionados à exposição solar de alguma forma,

seja crônica ou intermitente (Armstrong et al., 1993).

Outro fator de risco para o tumor é o fototipo cutâneo, que considera a coloração da

pele e o tipo de reação diante da exposição ao sol. Fitzpatrick (1975 e 1988) descreveu seis

fototipos cutâneos: I, pele branca, muito sensível ao sol, que nunca brônzeia; II, pele

branca sujeita a bronzeado; III, pele morena clara; IV, pele morena moderada; V, pele

morena escura e VI, pele negra. Indivíduos com o fototipo I têm risco 2,27 vezes maior de

desenvolver o MC, enquanto que os com o fototipo II e III têm riscos de 1,99 vezes e 1,35

vezes, respectivamente (Gandini et al., 2005). Outros fatores constitucionais, como cabelos

ruivos (risco 2,6 vezes maior) e loiros (risco 2,0 vezes maior) (Lotze et al., 2001), olhos

azuis (risco 1,6 vezes maior) e verdes (risco 1,5 vezes maior) (Gandini et al., 2005), a

presença de sardas (risco 2,0 vezes maior) (Grulich et al., 2007) e nevos congênitos

25

melanocíticos e displásicos (risco 6,4 vezes maior) (Ernst et al., 2014) foram também

associados à ocorrência do tumor.

A proteção contra a radiação UV é feita pela melanina que previne danos ao DNA,

pela absorção e espalhamento da radiação. A formação de fotoprodutos estimula a

produção do alfa-hormônio estimulante de melanócito (α-MSH), que se liga ao receptor de

melanocortina 1 (MC1R) nos melanócitos, com consequente aumento na produção de

melanina. Esse hormônio induz o aumento da concentração de AMP cíclico (cAMP) nos

melanócitos, que ativa a proteína quinase A (PKA), que desencadeia o aumento da

expressão do fator de transcrição associado a microftalmia (MITF) (Prusis et al., 1997). O

gene MITF é crucial na regulação de proliferação e síntese de melanina em melanócitos

(Moan et al., 2014) e anormalidades nestes processos foram associados com o surgimento

do MC (Hartman & Czyz, 2015).

4. Aspectos genéticos

O conceito para o risco genético de MC é dinâmico e multifacetado devido à

heterogeneidade do tumor.

Anormalidades em genes específicos relacionados com a origem do MC incluem,

predominantemente, as mutações gênicas (Zhang et al., 2016; Read et al., 2016).

As mutações gênicas são mudanças na sequência do DNA dos genomas nucleares e

mitocondriais, variando desde uma pequena mudança, como em um único nucleotídeo, até

alterações que podem afetar milhões de pares de base. Quando uma variante é tão comum

que é encontrada em mais de 1% de cromossomo na população geral, a variante consitui o

que é conhecido como polimorfismo genético. Em contrapartida, os alelos com frequência

menor que 1% são, por convenção, chamado de variantes raras. Embora muitos tipos de

mutações deletérias sejam variantes raras, não há uma simples correlação entre frequência

de alelos e o efeito do alelo sobre a saúde. Muitas variantes raras parecem não ter efeitos

deletérios, enquanto algumas variantes bastante comuns para serem polimórficas são

conhecidas por predisporem a sérias doenças (Nussbaum, 2008).

Há vários tipos de polimorfismos que podem ser devidos a variantes que consistem

em deleções, duplicações, triplicações e assim por diante de centenas de milhões de pares

de bases de DNA, e não estão associados a qualquer fenótipo de doença conhecida; outras

alterações de grandeza semelhante são variantes raras que claramente causam sérias

doenças.

26

Os mais simples e mais comuns de todos os polimorfismos são os polimorfismos de

troca de base única, denominado de single nucleotide polymorphisms (SNPs). Os SNPs

possuem dois alelos correspondendo a duas diferentes bases que ocupam uma localização

em particular no genoma (Nussbaum, 2008).

Os SNPs alteram tanto aspectos físicos, como a cor da pele, olhos e cabelos, o

desenvolvimento de efélides e nevos, como aspectos metabólicos, incluindo o controle do

ciclo celular, o reparo de DNA, a apoptose, a angiogênese, a capacidade de metabolizar

carcinógenos e a síntese de melanina (Seal et al., 2014).

A avaliação de SNPs em pacientes com MC e controles por métodos

convencionais, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de digestão

enzimática (RFLP), constitui uma avaliação lenta e trabalhosa, por possibilitar a avaliação

de pequeno número de variações genéticas em um estudo (Ward et al., 2012).

Com a conclusão do Projeto Genoma Humano (www.genome.gov), que possibitou

o mapeamento genético, e o início do Projeto Internacional HapMap, que identificou

variantes genéticas entre as pessoas (www.hapmap.ncbi.nlm.nih.gov), os pesquisadores

puderam desfrutar de um conjunto de ferramentas como banco de dados de sequências do

genoma humano do projeto denominado Ensembl (Herrero et al., 2016), catálogos de

variações genéticas, como o GenBank (Banson et al., 2013) e um conjunto de novas

tecnologias de alto rendimento de genotipagem disponibilizadas pelas empresas Affymetrix

e Illumina que possibilitaram a investigação dessas variantes em diferentes populações.

Diante desse cenário, foi descrito o método de genotipagem em larga escala

(GELE), que permitiu analisar centenas ou milhares de SNPs com rapidez e confiabilidade

em estudo único. O método tem como base a análise de microarranjos de DNA de cada

indivíduo separadamente (Mao et al., 2007; Xing et al., 2008). Com isso, estudos de

associação do genoma completo permitiram a descoberta de novos marcadores genéticos

associados com doenças, incluindo tumores (Waddell et al., 2008).

Além de mutações, a interação de múltiplos eventos genéticos e epigenéticos foram

descritos como responsáveis pelo surgimento e agressividade do tumor (Slingluff JR et al.,

2011).

Mutações em genes associados com o MC foram classificados como de alta, média

e baixa penetrância, considerando a probabilidade de portadores de anormalidades

genéticas desenvolverem o tumor ao longo do tempo (Read et al., 2016).

27

4.1. Genes de alta penetrância

Mutações genéticas podem provocar grandes mudanças na função de um gene,

podendo ocasionar a inativação do gene. Quando uma mutação hereditária tem um grande

efeito na função de um gene a ponto de causar uma doença ou uma alteração perceptível na

maioria das pessoas que as têm, essa mutação é chamada de alta penetrância (Read et al.,

2016).

Genes de alta penetrância estão relacionados com a ocorrência de melanoma

hereditário, particularmente em oncogenes ou supressores tumorais, desenvolvem em idade

precoce e acometem parentes de primeiro grau (Read et al., 2016).

O gene CDKN2A está localizado no cromossomo 9p21 é um gene supressor de

tumor responsável por codificar a proteína p16 (Gray-Schopfer et al., 2007). A p16 é

considerada inibidora específica das quinases dependentes de ciclina (CDK), CDK4 e

CDK6, sendo estas as principais CDKs que se ligam às ciclinas D, colaborando no controle

da transição da fase G1 para S (Gray-Schopfer et al., 2007). Deleções ou mutações

pontuais no gene CDKN2A foram identificadas em linhagens celulares de melanoma,

indicando a importância desse gene no desenvolvimento do tumor, inibindo o ciclo celular

ou permitindo o acúmulo de danos no DNA e induzindo a proliferação celular (Goldstein

et al., 2008). Aproximadamente 20 a 40% das mutações no gene CDKN2A estão

implicadas no risco do melanoma hereditário, e as frequências dessas mutações são

variáveis em diferentes populações étnicas (Barrett et al., 2015). Mutações no gene CDK4,

localizado no cromossomo 12q14, impactam na mesma via de atuação do gene CDKN2A,

determinando efeito oncogênico no controle do ciclo celular (Puntervoll et al., 2013)

4.2. Genes de média penetrância

Algumas mutações hereditárias não parecem afetar a função dos genes e muitas

vezes não provocam alterações evidentes. Essas mutações são chamadas de média e baixa

penetrância, dependo da sua frequência de ocorrência e o risco relativo associado. Essas

mutações, podem afetar o risco de câncer através de efeitos sutis em determinados

mecanismos, além de interagir com outros fatores de risco para doença (Read et al., 2016).

SNPs em genes de média penetrância são prevalentes na população em geral, mas

não conduzem ao desenvolvimento de MC de forma isolada. No entanto, a interação de

vários SNPs pode aumentar o risco de ocorrência do tumor (Read et al., 2016).

28

Dois genes de média penetrância, o MC1R, e o MITF, relacionados com o processo

de pigmentação da pele, foram associados com maior risco de MC (Read et al., 2016).

O gene melanocortin receptor gene (MC1R), codifica uma proteína receptora que

tem como principal ligante o hormônio alfa estimulante de melanócitos (α-MSH). O α-

MSH se liga ao receptor MC1R, que ativa as proteínas adenilatos ciclases, com

consequente aumento dos níveis intracelulares de monofosfato cíclico de adenosina

cíclicos (AMPc) (Read et al., 2016). O aumento do AMPc ativa a via de sinalização do

gene MITF, que codifica um fator de transcrição associado à microftalmia, e proteínas

tirosinases, que promovem a proliferação de melanócitos e a síntese do pigmento

eumelanina (preto/marrom) em melanócitos (Beaumont et al., 2007). Existe um balanço na

síntese dos tipos de melanina eumelanina (coloração preto/marrom) e feomelanina

(coloração vermelho/amarelo) (Read et al., 2016). O aumento da síntese de eumelanina,

que possui efeito protetor dos raios UV, inibe a síntese do pigmento feomelania que é

pouco efetivo na proteção dos raios UV. O tipo e a quantidade de pigmento a ser

sintetizado determina o fenótipo da pele (cor e sensibilidade ao sol), dos cabelos e dos

olhos (Read et al., 2016). O MC1R é altamente polimórfico. Variações nesse gene foram

associados com redução da capacidade de ligação do α-MSH, causando a redução dos

níveis de AMPc e aumento da síntese de feomelanina e foram também associadas ao

fenótipo ruivo (Beaumont et al., 2007).

O gene MITF, codifica um fator de transcrição que tem como principal função a

regulação da síntese de melanina e o desenvolvimento e a diferenciação dos melanócitos

(Ploper & Robertis, 2015). Esse gene é polimórfico e encontra-se hiperexpresso em 20%

dos MC, particularmente em tumores metastáticos, e esteve associado também com pior

sobrevida global (Hartman & Czyz, 2015).

4.3. Genes de baixa penetrância

Os genes de baixa penetrância seguem as mesmas definições dos genes de média

penetrância, alterando somente as frequências e o risco relativo dessas variantes genéticas

na ocorrência da doença (Read et al., 2016).

Associações de inúmeros genes de baixa penetrância como MC foram identificadas

na meta-análise conduzida por Law et al. (2015). Onze estudos conduzidos por GELE em

MC e controles saudáveis foram incluídos na meta-análise, sendo que sete foram

previamente publicados (Bishop et al., 2009; Nan et al., 2009, Amos et al., 2011; Barrett et

al., 2011; McGregor et al., 2011; Iles et al., 2013; Law et al., 2015) e cinco ainda não

29

foram publicados. Foram avaliados 15.990 casos de MC e 26.409 controles da Europa,

Austrália e EUA. Esse estudo faz parte do GENOMEL, um consórcio sem fins lucrativos

de grupos de pesquisa de todo o mundo e que tem como objetivos a identificação de genes

associados com aumento do risco de MC e a interação entre genes e ambiente na

ocorrência do tumor (http://www.biogenomel.eu) (Law et al., 2015).

Foram identificados na meta-análise, loci de genes relacionados com o processo de

pigmentação, síntese de melanina, reparo de DNA, manutenção dos telômeros e outros

mecanismos desconhecidos em associação com o risco de MC ou de suas manifestações

clinicopatológicas (Tabela 1).

SNPs nos genes TERT e OBFC1, relacionados com comprimento do telômero,

estiveram associados a risco de MC (Barret et al., 2011; Law et al., 2015). Os genes Agouti

signalling protein (ASIP), Tyrosinase (TYR), Tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) e

Oculocutaneous albinism type II (OCA2) estão envolvidos com o mecanismo de

pigmentação; o gene ASIP codifica um antagonista do hormônio α-MSH que

competitivamente se liga ao receptor MC1R, bloqueando a síntese de eumelanina (Bishop

et al., 2009; Nan et al., 2009; Amos et al., 2011; Law et al., 2015). SNPs nos genes ASIP e

MC1R foram associados com o fenótipo ruivo, presença de sardas e risco de MC (Bishop

et al., 2009). A proteína codificada pelo gene TYR influencia na síntese de eumelanina para

feomelanina; SNPs nos genes TYR e TYRP1 foram associados com o fenótipo de olhos

claros, pele sensível ao sol e risco de MC (Bishop et al., 2009; Nan et al., 2009). SNPs

localizado nos genes HERC2 ou OCA2, com papéis na pigmentação cutânea, estiveram

associados a risco de MC (Amos et al., 2011; Law et al., 2015). SNPs nos genes PLA2G6,

CASP8 (Bishop et al., 2009; Barrett et al., 2011), AGR3 (Law et al., 2015) e FTO (Iles et

al., 2013) foram associados com a quantidade de nevos e risco de MC. Outros quatro loci

que estão localizados os genes ARNT/SETDB1, CYP1B1, MX2 e TEMEM38B/RAD23B

foram associados a risco de MC, mas por mecanismos ainda desconhecidos (Barrett et al.,

2011; Mcgregor et al., 2011; Law et al., 2015).

30

Tabela 1. Polimorfismos de base única associados com o risco de melanoma cutâneo

em estudos de genotipagem em larga escala de acordo com o gene,

localização cromossômica, número de referência, risco de ocorrência,

envolvimento com pigmentação, presença de nevos e seus respectivos autores

(adaptado Law et al., 2015 e Read et al., 2016)

31

As localizações cromossômicas dos genes de alta, média e baixa penetrância

envolvidos com o MC estão apresentadas na Figura 2.

Figura 2. Localização cromossômica dos genes de alta penetrância (preto), média (azul)

e baixa (vermelho) associados com predisposição ao melanoma cutâneo

(adaptado de Read et al., 2016.)

Até onde atinge o nosso conhecimento, estudos por GELE em MC foram

conduzidos apenas em caucasianos (Law et al., 2015). É fundamental comentar que as

frequências dos genótipos dos SNPs variam substancialmente em diferentes populações

étnicas (Chung & Chanock, 2011) e, desta forma, suas relações com a origem ou

manifestações clínicas de doenças não podem ser generalizadas para todas as populações.

5. Justificativa do estudo

O problema do câncer no Brasil ganha relevância pelo perfil epidemiológico que a

doença apresenta e o número de casos aumenta a cada ano no país (INCA). É esperado o

aumento no número casos de MC no estado de São Paulo e no Brasil. Merece destaque o

32

fato de que vivemos em país tropical, sob os efeitos intensos da radiação UV (Instituto

Nacional do Câncer, 2016).

Além disso, a nossa população é altamente heterogênea e miscigenada, composta

por imigrantes da Europa, Ásia e África (Mendes et al., 2010), com possíveis diferenças na

suscetibilidade aos efeitos deletérios dos raios UV na pele e diferentes suscetibilidades ao

MC.

Até onde atinge o nosso conhecimento, não há estudos de GELE para identificação

de SNPs associados com o risco de MC na população brasileira. Assim, nos pareceu

relevante identificar novos SNPs ou confirmar papéis de SNPs já identificados em outras

populações em associação com o MC em nossa população.

33

OBJETIVOS

Avaliar pacientes com MC atendidos nos ambulatórios de Oncologia Clínica e de

Dermatologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP e indivíduos saudáveis do Centro de

Hematologia e Hemoterapia (HEMOCENTRO) da UNICAMP, que servirão como

controles, tendo como objetivos:

Identificar SNPs envolvidos com o risco para o MC por meio de microarranjos de

DNA da empresa Affymetrix®, utilizando a GELE;

Validar SNPs localizados em genes de interesse identificados no estudo por meio

da técnica de PCR em tempo real (RT-PCR);

Verificar se os genótipos dos SNPs selecionados estão associados aos aspectos

clínicos dos pacientes (idade, sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos, cor dos cabelos,

presença de sardas, presença de nevos e tipo de exposição solar), e aos aspectos

biológicos do tumor (localização, espessura de Breslow, nível de Clark e estágio

TNM);

Verificar se os genótipos dos SNPs selecionados influenciam a sobrevida livre de

progressão (SLP) e a sobrevida global (SG) dos pacientes com MC.

34

PACIENTES E MÉTODOS

Foram avaliados 103 pacientes não aparentados com MC atendidos ao diagnóstico

ou durante o seguimento clínico, nos ambulatórios de Oncologia Clínica e de Dermatologia

do Hospital de Clínicas da UNICAMP, sob supervisão da Profa. Dra. Carmen Silvia Passos

Lima e da Profa. Dra. Aparecida Machado de Moraes. Foram excluídos os pacientes sem

tumor primário definido, tumor localizado em mucosas e na região ocular, e aqueles que

não aceitaram participar do estudo.

Foi também avaliado um grupo controle, constituído por 103 doadores de sangue

atendidos no HEMOCENTRO da UNICAMP, pareado aos pacientes por sexo. Foram

excluídos os pacientes que não aceitaram participar do estudo.

1. Avaliação clínica

Os dados relativos à identificação, à idade, ao sexo, ao fototipo cutâneo, cor dos

olhos e dos cabelos, presença de sardas e nevos e o tipo de exposição solar foram obtidos

no momento da aplicação do questionário específico em pacientes e controles, pelo

pesquisador responsável pelo estudo (Anexo 1).

Os pacientes e controles foram classificados de acordo com o fototipo cutâneo, cor

dos olhos e cor dos cabelos. O fototipo foi definido usando critérios já definidos por

Fitzpatrick que considera a cor e o grau de sensibilidade da pele quando exposta ao sol.

Indivíduos com fototipo I possuem pele clara, se queimam com facilidade e nunca se

bronzeiam; fototipo II são indivíduos com pele clara, se queimam com facilidade e

bronzeiam-se pouco; fototipo III indivíduos com pele morena, se queimam e bronzeiam-se

de forma moderada; fototipo IV indivíduos de pele morena que se queimam pouco e

bronzeiam-se com facilidade; fototipo V indivíduos de pele morena que se queimam pouco

e sempre se bronzeiam; e fototipo VI indivíduos de pele negra que nunca se queimam

quando expostos ao sol (Fitzpatrick, 1988). Foram considerados portadores de olhos claros

os indivíduos com olhos azuis e verdes e portadores de olhos não claros aqueles com olhos

castanhos e pretos. Foram considerados portadores de cabelos claros os indivíduos com

cabelos loiros e ruivos naturais e indivíduos com cabelos castanhos e pretos naturais foram

classificados como portadores de cabelos não claros (Fitzpatrick, 1988).

Foram considerados portadores de nevos aqueles com pelo menos um nevo

melanocítico maior que 2 mm de diâmetro em qualquer área do corpo (exceto no couro

cabeludo, púbis e região perineal, que não foram avaliadas ao exame físico). Os pacientes

35

foram categorizados de acordo com protocolo de identificação da International Agency for

Research on Cancer (IARC) em: sem nevos ou com poucos nevos (≤ 20), e com moderado

número de nevos ou muitos nevos (>20) (English e Mac Lennan, 1990). Foram

classificados como portadores de efélides, os indivíduos que apresentam manchas

hipercrômicas pequenas (até 5 mm de diâmetro) e de limites bem nítidos (Gandini et al.,

2005).

Indivíduos expostos ao sol por mais de duas horas ao dia e por mais de 10 anos

foram considerados expostos ao sol, sendo a exposição classificada como intermitente

(exposição solar relacionada a atividades recreativas em menos de 50% na semana ou

férias) ou crônica (atividade laboral ou domiciliar em mais de 50% do tempo sob a

exposição solar), e sem exposição (não enquadramento nas definições anteriores) (Gordon

et al., 2015)

O diagnóstico de MC foi realizado por exame histopatológico realizado em cortes

de fragmentos do tumor incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina. Os

dados da localização primária (classificados em cabeça, tronco, dorso e membros),

espessura de Breslow (classificados em ≤ 1,5 mm ou >1,5 mm) e níveis de Clark foram

coletados do laudo do exame anatomopatológico.

O estágio do tumor foi determinado com base nos resultados obtidos do exame

histológico da peça cirúrgica, dos exames de imagem e da dosagem da lactato

desidrogenase (LDH). Os exames de imagem realizados foram a radiografia do tórax,

ultrassonografia do abdome, ressonância magnética ou computed tomography (CT) do

tórax e ou abdome, positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), e

ainda ressonância magnética de crânio e cintilografia óssea em casos com suspeita clínica

de infiltração de sistema nervoso central ou óssea, para a definição da presença ou ausência

de metástases distantes. O estágio do tumor foi classificado de acordo com os critérios do

American Joint Comitee on Cancer (Edge et al., 2010). Essas informações foram obtidas

dos prontuários médicos pelo pesquisador do estudo.

2. Terapêutica

Ampliação de margem cutânea foi realizada quando a excisão inicial foi um

procedimento apenas diagnóstico (Gillgren et al., 2011). A pesquisa de linfonodo

sentinela teve indicação em pacientes com índice de Breslow maior que 1 mm, porém

36

não foi um procedimento obrigatório pois sua realização não melhora a curva de

sobrevida específica em estudo prospectivo e randomizado (Morton et al., 2014).

O tratamento adjuvante com interferon alfa 2b (IFN alfa 2b) constitui modalidade

terapêutica com questionável benefício na sobrevida global (SG) de pacientes com MC

(apenas 11% de aumento) (Mocellin et al., 2010), mas com ganho real na sobrevida livre

de recidiva (SLR) (aumento de 18%), especialmente em esquemas de longa duração (1 a

5 anos) e com doses intermediárias ou altas do fármaco (Mocellin et al., 2010). Por

serem tratamentos com alta toxicidade, utilizamos em nosso serviço a estratégia de

discutir os riscos e benefícios do tratamento adjuvante com cada paciente, cabendo uma

decisão conjunta médico-paciente, sobre a sua realização. A discussão do tratamento

adjuvante com IFN alfa 2b ocorreu em especial com pacientes com linfonodos

acometidos ou com tumores com índice de Breslow maior que 4 mm (Kirkwood et al.,

1996).

Os pacientes com metástase única ou recidiva operável foram submetidos à

remoção cirúrgica com objetivo de ressecção completa do tumor (Sondak & Guibney

2014). Aqueles com recidivas inoperáveis ou com metástases múltiplas receberam a

monoquimioterapia com dacarbazina (Sasse et al., 2007).

A radioterapia foi utilizada no tratamento local de pacientes com impossibilidade

cirúrgica, pois apresenta pouco impacto no tratamento do MC, tendo apenas papel

paliativo, principalmente em lesões com sangramentos, metástases ósseas ou cerebrais

(Burmeister et al., 2012).

A SLP foi definida como a data da ampliação de margem e a data da primeira

progressão ou recidiva, ou óbito de causas decorrente da doença. A SG foi definida como

o intervalo entre a data do diagnóstico e a data do óbito por qualquer causa ou data do

último segmento.

3. Genotipagem em larga escala (GELE)

As etapas de extração do DNA de amostras de leucócitos do sangue periférico dos

pacientes e dos controles, digestão enzimática, PCR, purificação, fragmentação e marcação

foram realizadas nas instalações do Laboratório de Genética do Câncer da Faculdade de

Ciências Médicas da UNICAMP.

As etapas de hibridização, lavagem e escaneamento das lâminas de microarranjos

foram realizadas na plataforma de GELE da empresa Affymetrix® disponível no

Laboratório Nacional de Biociências do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e

37

Materiais de Campinas, São Paulo; na plataforma disponível no Laboratório de Pesquisa e

Desenvolvimento do Grupo Fleury de São Paulo, São Paulo; e no Laboratório Multiusuário

de Genética Molecular do Câncer da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, de

Campinas, São Paulo. A referida plataforma de GELE é composta de um forno de

hibridização, estação de lavagem e escaner acoplados a um computador.

Foram utilizadas 206 lâminas (103 para pacientes e 103 para controles) com

microarranjos de DNA contendo 906.000 SNPs (Genome Wide Human SNP Array 6.0) e o

kit de reagentes compatíveis (Genome Wide Human SNP Nsp/Sty Assay Kit 6.0). Os

procedimentos para a identificação dos SNPs foram realizados de acordo com o protocolo

do fabricante, descrito sucintamente abaixo.

3.1. Extração do DNA a partir dos leucócitos

O DNA genômico foi obtido de amostras de sangue periférico dos pacientes com

MC e dos controles com a utilização do kit de extração de DNA QIAamp DNA Blood Kit

(QIAGEN, Hilden, Germany). A concentração do DNA foi determinada por meio de

espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA). O DNA foi diluído

em tampão TE (0,01 mM ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), 10 mM Tris HCl, pH

8,0) para 50 ng/μl e foi armazenado a -20 ºC até o próximo passo.

3.2. Digestão com a enzima StyI, ligação a adaptadores e amplificação

Os DNAs dos pacientes e controles foram submetidos à digestão com a enzima StyI

para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada uma reação de

5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10X), 0,2 μl de albumina

bovina sérica (BSA) (100 X, 10 mg/ml) e 1,0 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi

incubadas no termociclador (Eppendorf, Hamburg, Germany) por duas horas a 37 ºC e 20

minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão foram armazenados a -20 ºC até o próximo

passo.

A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos

com a reação de 0,75 μl de adaptador StyI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10 X) e 2,0 μl da

enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas

a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de

água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.

38

Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores StyI foram submetidos a três PCRs

realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10 X), 20 μl de

potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5

mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq

DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30

segundos), a 60º C (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Foram obtidos fragmentos de

250 a 1100 pares de bases (pb). A presença dos fragmentos foi analisada por eletroforese

em gel de agarose 2% (Figura 3A). Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até

o próximo passo.

3.3. Digestão com a enzima NspI, ligação a adaptadores e amplificação

Os DNAs dos pacientes e controles também foram submetidos à digestão com a

enzima NspI para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada

uma reação de 5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10 X), 0,2

μl de BSA (100 X, 10 mg/ml) e 1 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi incubada

no termociclador por duas horas a 37 ºC e 20 minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão

foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.

A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos

com a reação de 0,75 μl de adaptador NspI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10X) e 2 μl da

enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas

a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de

água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.

Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores NspI foram submetidos a quatro

PCRs realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10X), 20 μl

de potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5

mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq

DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30

segundos), a 60 ºC (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Os fragmentos de 250 a 1100

pares de bases (pb) foram analisados em eletroforese em gel de agarose 2% (Figura 3B).

Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.

39


cutâneo e controles. Produtos da amplificação dos fragmentos obtidos das

digestões com a enzima StyI (A) NspI (B) de DNA genômico visualizados em

gel de agarose 2% corado com brometo de etídio, para a hibridização em

lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA de 100 pares de

bases (pb), estão representados nas colunas L. Os fragmentos de 250 a 1100 pb,

que correspondem à amplificação dos fragmentos da digestão enzimática, estão

representados nas demais colunas. Os resultados obtidos de controles negativos

estão representados nas colunas B.

3.4. Reação dos produtos das PCRs, purificação e quantificação

Os produtos das PCRs das enzimas StyI e NspI foram misturados. A reação

compreendeu 100μl do produto de cada uma das três PCRs da enzima StyI e 100 μl do

produto de cada uma das quatro PCRs da NspI. Em seguida, os produtos misturados

(volume final de 700 μl) foram purificados por meio do método de precipitação de ácidos

nucléicos com isopropanol. A purificação consistiu na adição de 12 μl de EDTA 0,5 M em

cada amostra, seguida de incubação por 10 minutos em temperatura ambiente.

Posteriormente, foram adicionados 200 μl de acetato de amônio 7,5 M e 700 μl de

isopropanol em cada amostra, em seguida, elas foram centrifugadas a 2.250 RCF (força

centrífuga relativa) por 30 minutos e apenas o precipitado foi mantido. A ele, foram

acrescentados 1,6 ml de etanol 75%, com posterior homogeneização e centrifugação a

2.250 RCF por 5 minutos. Após, o sobrenadante foi retirado por inversão cuidadosamente

40

do tubo e o precipitado de ácidos nucleicos foi ressuspenso em 55 μl de tampão de eluição,

com agitação vigorosa durante 30 minutos. A concentração dos ácidos nucleicos foi

determinada em espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA), por

leitura da densidade óptica no comprimento de onda de 260 nanômetros. As amostras com

concentrações entre 450-600 μg/μl foram armazenadas a -20 ºC até o próximo passo.

3.5. Fragmentação dos produtos das PCRs

Foram adicionados 5 μl do tampão de fragmentação aos 45uL dos produtos

purificados de cada amostra. Em seguida, foram adicionados a cada amostra 14,4 μl da

enzima DNase I (2,5 U), 36 μl do tampão de fragmentação e 309,6 μl de água estéril. A

reação foi incubada no termociclador por 35 minutos a 37 ºC e 15 minutos a 95 ºC. A

fragmentação foi observada pela presença de fragmentos menores que 180 pb em

eletroforese em gel de agarose 4% corado com brometo de etídeo (Figura 4). Os

fragmentos obtidos foram utilizados imediatamente.


cutâneo e controles. Produtos da fragmentação visualizados em gel de agarose

corado com brometo de etídio. A reação de fragmentação foi realizada

utilizados os produtos das PCRs obtidos da digestão enzimática para a

hibridização em lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA

de 50 pares de bases (pb), estão representados nas colunas L e na coluna B está

representada a reação com água estéril, tida como controle negativo da reação.

Os fragmentos menores que 180 pb, correspondem à fragmentação das

amostras.

41

3.6. Marcação do DNA fragmentado com biotina

Inicialmente foi preparado a reação de marcação com 14 μl de tampão terminal

deoxynucleotidyl transferase (TdT) (5X), 2 μl de reagente de marcação de DNA (30 mM)

(biotina) e 3,5 μl da enzima TdT (30 U/μl). A marcação foi realizada com 53,5 μl de DNA

fragmentado e 19,5 μl da reação de marcação. A reação foi incubada em um termociclador

por quatro horas a 37ºC e 15 minutos a 95ºC. O DNA marcado com biotina foi armazenado

a -20ºC até o próximo passo.

3.7. Hibridização

Primeiramente foi preparado a reação de hibridização com 165 μl do reagente de

hibridização parte I, 15 μl do reagente de hibridização parte II, 7 μl do reagente de

hibridização parte III, 1 μl do reagente de hibridização parte IV e 2 μl do reagente de

controle interno (OCR 0100). Esta reação foi aquecida em termociclador a 95 °C por 10

minutos e resfriada a 49 ºC até o próximo passo. Após estes procedimentos, 200 μl da

reação desnaturada foi depositada em lâminas de vidro com os oligonucleotídeos pré-

arranjados. As lâminas e o material com o DNA foram hibridizados a 50 ºC durante 17

horas a 60 rpm (rotação por minuto).

3.8. Lavagens das lâminas e marcação com fluoróforos

Após as 17 horas de hibridização, as lâminas foram submetidas as sucessivas

lavagens com tampão de lavagem “A”, “B” e água destilada para remoção de excesso de

amostras que não se ligaram nas sondas e de reagentes. Em seguida foram realizadas as

lavagens com estreptavidina e ficoeritrina (reagente de marcação 1), seguida do anticorpo

biotinilado antiestreptavidina (reagente de marcação 2) e finalmente com MES (reagente

de marcação 3).

As lavagens e marcações foram realizadas com a utilização da estação de lavagem

GeneChip Fluidics Station 450. As sequências de lavagens e marcações dos microarranjos

contidos nas lâminas por fluoróforos estão descritas na Tabela 2.

42

Tabela 2. Sequências de lavagens e marcações dos microarranjos contidos em lâminas

por fluoróforos para a genotipagem em larga escala de polimorfismos gênicos

de base única em pacientes com melanoma cutâneo e controles

Etapas Descrição

Primeira lavagem pós-hibridização Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com

tampão de lavagem “A” a 25 ºC

Segunda lavagem pós-hibridização Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com

tampão de lavagem “B” a 45 ºC

Primeira marcação

(estreptavidina e ficoeritrina) Dez minutos em solução de marcação 1 a 25 ºC

Lavagem pós-marcação Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com

tampão de lavagem “A” a 25 ºC

Segunda marcação

(anticorpo biotinilado antiestreptavidina) Dez minutos em solução de marcação 2 a 25 ºC

Terceira marcação

(estreptavidina e ficoeritrina) Dez minutos em solução de marcação 3 a 25 ºC

Lavagem final Dez ciclos (seis reações por ciclo) com tampão

de lavagem “A” a 25 ºC

A representação esquemática da sequência de todos os passos técnicos envolvidos

no procedimento está apresentada na Figura 5.

43

Figura 5. Representação esquemática do protocolo Affymetrix® Genome-Wide Human

SNP Array 6.0 para a genotipagem em larga-escala de pacientes com

melanoma cutâneo e controles. O DNA genômico dos indivíduos foi digerido

com as enzimas StyI e NspI, em seguida, foi realizada a reação ligação de

adaptadores específicos para os fragmentos obtidos após a digestão enzimática. As

reações de amplificação, de mistura e purificação desses fragmentos foi seguida

pela fragmentação e marcação dos fragmentos de DNA com biotina. Após, o

DNA biotinilado foi hibridizado na lâmina de microarranjo seguido das etapas de

lavagens, marcações com estreptavidina ligada a ficoeritrina, e leitura dos

resultados por meio da captação de fluorescência pelo scanner

3.9. Captação de imagens e controle de qualidade dos experimentos

As lâminas com microarranjos foram inseridas no GeneChip Scanner 3000 7G,

gerenciado pelo programa computacional GeneChip® Command Console (versão 3.2.4,

Affymetrix, Santa Clara, CA USA). As imagens geradas pela excitação dos fluoróforos

(ficoeritrina) captadas pelo scanner foram submetidas primeiramente à análise de controle

44

de qualidade geral (CQC), que utiliza como base os controles de qualidade dos fragmentos

clivados e hibridizados das enzimas StyI (CQ StyI) e NspI (CQ NspI) e dos gragmentos

totais (CQ) por meio do programa Genotyping Console (versão 4.1.3, Affymetrix, Santa

Clara, CA, USA). Só foram e serão consideradas adequadas para análise as lâminas que

obtiverem taxas iguais ou maiores que 0,40 de contraste CQ.

4. Genotipagem dos SNPs

A identificação dos genótipos dos pacientes com MC e dos controles foi realizada

por meio do algoritmo computacional corrected robust linear mixture model (crlmm)

(Carvalho et al., 2010), disponível gratuitamente no programa Bioconductor (versão 3.3,

linguagem R) (www.bioconductor.org). O algoritmo crlmm permitiu realizar o

processamento das imagens obtidas, convertendo as intensidades das sondas dos

microarranjos em quantidades proporcionais à quantidade de DNA de cada amostra

associada com cada alelo, A e B, de cada SNP. O processamento consistiu nas seguintes

etapas: 1) normalização, que permitiu ajustar e corrigir as intensidades das sondas de cada

SNP, 2) sumarização, que consistiu nos valores numéricos associados à intensidade da

sonda de cada SNP e 3) genotipagem, que possibilitou a identificação dos genótipos

homozigoto selvagem (AA), heterozigoto (AB) e homozigoto variante (BB) (Carvalho et

al., 2010). (Carvalho et al., 2007).

5. Análises estatísticas da GELE

O significado estatístico das diferenças dos SNPs entre os grupos foi calculado por

meio de modelos elásticos e da regressão logística múltipla, utilizando o algoritmo lasso

and elastic-net regularized generalized linear models (glmnet). O glmnet emprega

estratégias computacionais e estatísticas que maximizam a adequacidade de ajustes entre

marcadores e informações clínicas nos diferentes grupos de pacientes e controles

(Friedman et al., 2010). Para isso, utilizou-se a área sob a curva característica como

estatística de adequacidade do modelo, a fim de determinar o melhor modelo preditivo. Por

meio da validação cruzada, as observações disponíveis foram divididas em dois grupos:

treino e teste. Com o grupo de treino, o método ajusta o melhor modelo, cujo desempenho

foi avaliada no grupo de teste. Este procedimento foi repetido diversas vezes para a final

determinação do modelo que melhor se adequou aos dados. As características clínicas que

45

foram significativas no modelo preditivo foram utilizadas como ajustes nas análises de

regressão logística, considerando valores significativos P <0,01.

6. Seleção dos polimorfismos de base única

Com o intuito de restringir os SNPs identificados por meio da GELE, nós

analisamos os resultados obtidos por meio dos bancos de dados Database for Annotation,

Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (Huang et al., 2009a; Huang et al.,

2009b) e do National Center for Biotechonology Information (NCBI) (Geer et al., 2010) e

selecionamos apenas os SNPs localizados em genes relacionados com o processo de

melanogênese.

A seguir, selecionamos os SNPs em que os genótipos dos indivíduos controles

estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e cujos tamanhos amostrais calculados

por normas definidas por Beiguelman (Beiguelman, 1995) tendo como base as frequências

genotípicas observadas em indivíduos saudáveis do International HapMap 3 Consortium

(International HapMap 3 Consortium et al., 2010), estavam disponíveis no Biorrepositório

do nosso laboratório (n= 110).

Selecionamos, a seguir, apenas os SNPs que estiveram localizados em regiões

regulatórias da expressão gênica. Para isso, utilizamos os programas Variant Effect

Predictor (Mclaren et al., 2010) e SNP Function Prediction (Xu & Taylor, 2009).

7. Validação dos resultados obtidos pela genotipagem em larga escala

Os resultados obtidos por meio da GELE foram validados utilizando a RT-PCR,

considerado o padrão ouro para a genotipagem de SNPs. Os genótipos dos SNPs

selecionados anteriormente foram obtidos por meio de ensaios para genotipagem TaqMan®

(Applied Biosystems®, Carlsbad, CA, USA), de acordo com o protocolo do fabricante.

Sucintamente, a RT-PCR foi realizada com a utilização de cerca de 20 ng de DNA, 0,5 µL

de ensaio específico para cada SNP e 5 µL de TaqMan® Universal PCR Master Mix, que

contém a AmpliTaqGold® DNA polimerase, dNTPs e tampão com componentes

otimizadores. As condições de amplificação consistiram na ativação inicial da AmpliTaq

Gold® a 95 °C por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de incubação a 92 °C por 15

segundos e a 60°C por 1 minuto.

46

8. Análise estatística de associações de SNPs e aspectos clinicopatológicos

O teste de verificação do equilíbrio de HW foi realizado com o intuito de verificar

se ocorreu distribuição preferencial de algum dos genótipos avaliados no grupo de

pacientes e controles utilizados no estudo (Beiguelman, 1995).

O significado estatístico das diferenças dos SNPs entre os grupos foi calculado por

meio do teste de Fisher ou χ2 e pelo modelo de regressão logística múltipla. As

determinações dos riscos de ocorrência entre os grupos foram obtidas por meio das razões

das chances (ORs) e calculadas considerando um intervalo de confiança (IC) de 95%. O

poder da análise (PA) foi calculado a fim de verificar o tamanho do efeito mínimo

suscetível de ser detectado em um estudo utilizando o tamanho amostral. Os resultados

foram selecionados utilizando-se nível de significância de 5% (P< 0,05).

Os tempos de SLP e SG foram estimados por meio da curva de Kaplan-Meier e a

comparação entre as curvas de sobrevida foi realizada por meio do teste de log rank. O

fator prognóstico de cada variável (características clínicas e do tumor e cada SNP) foi

avaliado por meio da análise univariada de Cox. Após a análise univariada, todas as

características que apresentaram valore de P <0,10 foram incluídas na análise multivariada

de Cox. Foram considerados significativos os valores de P <0,05.

9. Aspectos éticos

O estudo molecular foi realizado em amostras de sangue periférico obtidas por

ocasião da punção venosa realizada para a coleta de exames necessários para os exames

pré-operatórios e de estagiamento no momento do diagnóstico ou acompanhamento clínico

dos pacientes e de uma única punção venosa em controles.

O raio-X de tórax e a tomografia computadorizada foram exames realizados de

rotina para o estagiamento da doença e para as determinações do prognóstico e da

terapêutica a ser administrada. Nenhum material adicional foi coletado dos pacientes ou

controles.

Todos os procedimentos inerentes ao estudo foram realizados após aprovação do

Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP (Processo

nº 424/2006) (Anexo 2) e após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido por pacientes e controles (Anexos 3 e 4).

47

RESULTADOS

1. Avaliação clínica

As características demográficas e clínicas de pacientes e controles individualizados

estão apresentadas nos Anexos 5 a 7.

Já as distribuições dos 103 pacientes com MC e 103 dos controles estratificados por

idade, sexo, fototipo, cor dos olhos e cabelos, presença de efélides e nevos e exposição

solar estão apresentadas na Tabela 3.

Os pacientes apresentaram idade entre 19 e 88 anos (média ± desvio padrão: 55

anos ± 16 anos; mediana: 54 anos). Cerca de dois terços dos pacientes eram do sexo

masculino, do fototipo cutâneo I ou II, apresentaram com olhos e cabelos escuros e muitas

efélides e nevos, e se expuseram ao sol crônicamente.

Já os controles apresentaram idade entre 20 e 63 anos (média ± desvio padrão: 45 ±

8,4 anos; mediana: 47 anos). Cerca de metade do número de controles era do sexo

masculino e dos fototipos cutâneos III a VI. A maioria dos controles apresentaram olhos e

cabelos escuros.

Os pacientes foram mais velhos do que os controles; pele clara, olhos claros e

cabelos claros foram mais comuns em pacientes do que em controles. Assim, todas as

análises subsequentes envolvendo pacientes e controles, foram ajustadas por estas

variáveis.

48

Tabela 3. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo e controles de acordo

com a idade, o sexo, o fototipo cutâneo, a cor dos olhos e a cor dos cabelos, a

presença de efélides e nevos e a exposição solar

Variáveis Pacientes

(%)

Controles

(%)

Valor

de P

OR (IC95%)

Idade (anos)

< 54 53 (51,4) 89 (86,4) <0,001 5,99 (3,02-11,87)

≥ 54 50 (48,6) 14 (13,6)

Sexo

Masculino 61 (59,2) 55 (53,4) 0,48 1,26 (0,73-2,20)

Feminino 42 (40,8) 48 (46,6)

Fototipo cutâneo

I+II 69 (67,0) 53 (51,5) 0,03 1,91 (1,08-3,36)

III+IV+V+VI 34 (33,0) 50 (48,5)

Cor dos olhos

Verdes ou azuis 37 (35,9) 19 (18,4) 0,007 2,47 (1,30-4,70)

Castanhos ou pretos 66 (64,1) 84 (81,6)

Cor dos cabelos

Loiros ou ruivos 29 (28,1) 10 (9,8) 0,001 3,64 (1,66-7,95)

Castanhos ou pretos 74 (71,9) 93 (90,2)

Presença de efélides

Nenhuma/poucas 40 (38,8) NA

Muitas 63 (61,2)

Presença de nevos

≤ 20 40 (38,8) NA

> 20 63 (61,2)

Exposição solar

Crônica 49 (47,6)

NA

Intermitente ou nenhuma 37 (35,9)

Não obtido 17 (16,5)

OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelas; IC:

intervalo de confiança; valores de P< 0,05 estão destacados; NA: não avaliado

49

2. Aspectos do tumor

2.1 Tipo histológico, grau de diferenciação e estágio do tumor

As distribuições individualizadas dos 103 pacientes com MC de acordo com a

localização do tumor, espessuras de Breslow, os níveis de Clark e estágios clínicos TNM

estão apresentados no Anexo 8. As distribuições dos 103 pacientes com MC incluídos no

estudo, de acordo com os aspectos do tumor estão apresentadas na Tabela 4.

Tabela 4. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a

localização do tumor, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios

clínicos

Variáveis Pacientes (%)

Localização tumoral

Axial 59 (57,2)

Membros 31 (30,0)

Não avaliado 13 (12,8)

Breslow

< 1,5mm 42 (40,7)

≥ 1,5mm 49 (47,6)


Clark

I+II+III 56 (54,4)

IV+V 46 (44,6)


Estágio clínico

IS+I+II 58 (56,3)

III+IV 45 (43,7)

Axial: cabeça, face, pescoço e tronco

Cerca de metade dos nossos pacientes apresentaram tumores axiais, com espessuras

de Breslow maiores que 1,5 mm, restritos à derme (Clark I, II ou III) e em estágios iniciais.

50

3. Terapêutica dos pacientes

Dos 103 pacientes incluídos, 98 (95,2%) foram submetidos ao tratamento cirúrgico

com remoção da lesão e 62 (60,2%) realizaram ampliação de margens cirúrgicas. A

pesquisa do linfonodo sentinela foi realizada em 22 (21,3%) e aqueles com

comprometimento linfonodal foram submetidos a linfadenectomia. Onze pacientes (10,6%)

receberam tratamentos complementares, sendo que seis receberam quimioterapia com

dacarbazina, dois foram submetidos a radioterapia e três receberam a imunoterapia com

interferon.

4. Determinação dos polimorfismos gênicos

Foram utilizadas 206 lâminas de microarranjos para a GELE de amostras de DNA

de 103 pacientes e 103 controles. Todas as imagens obtidas após os procedimentos

técnicos apresentaram os controles de qualidade das reações adequados. As distribuições

individualizadas dos 103 pacientes com MC e dos 103 controles de acordo com os valores

de CQC, de CQ StyI, CQ NspI e CQ estão apresentadas no Anexo 9.

Todas as lâminas apresentaram o controle de qualidade (CQC) adequado para

análise de SNPs (maiores que 0,40).

Figura 6. Imagem padrão gerada pela excitação dos fluoróforos contidos em lâmina

de um indivíduo controle capturada por scanner para a genotipagem em

larga escala. Os quatro quadrados (A, B, C e D) representam a hibridização

adequada da amostra com as sondas que contêm os polimorfismos de base

única. A imagem mais clara em forma de cruz representa a hibridização

adequada da amostra em sondas para a variação do número de cópias do DNA.

A imagem no centro (→) representa um controle interno da lâmina

51

5. Identificação dos SNPs por meio da genotipagem em larga escala

Observamos que 12.994 SNPs apresentaram frequências genotípicas distintas

(maiores ou menores) em pacientes com MC e controles (P< 0,001). As regiões do DNA

onde estiveram localizados estes SNPs estão apresentadas na Tabela 5.

Tabela 5. Regiões do DNA que albergam os 12.994 polimorfismos gênicos de base única

com frequências genotípicas distintas em pacientes com melanoma cutâneo e

controles

Região do DNA Número de SNPs (%)

Regulatória da transcrição 6.814 (52,4)

Codificadora de

aminoácidos 26 (0,2)

Íntron 6.042 (46,5)

Não identificada 112 (0,9)

Total 12.994 (100,0)

SNPs: polimorfismos gênicos de base única

As regiões regulatórias e intrônicas foram as que apresentam maiores números de

SNPs com frequências genotípicas distintas em pacientes e controles. As regiões

regulatórias compreendem SNPs localizados nas regiões 3’ e 5’ não traduzidas.

6. Seleção dos polimorfismos gênicos

Oitenta e dois dos 12.994 SNPs, que apresentaram frequências genotípicas distintas

entre pacientes e controles, estiveram localizados em 32 genes distintos que atuam na via

da melanogênese.

As distribuições individualizadas dos 82 SNPs localizados em genes relacionados

com a melanogênese de acordo com seu número de referência, símbolo do gene, o tamanho

amostral, o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg do grupo de controles e a sua

localização na cadeia de DNA estão apresentadas no Anexo 10.

Quarenta e sete dos 82 SNPs apresentaram o tamanho amostral menor que 110

indivíduos e 16 deles estão localizados em regiões regulatórias da expressão gênica.

Os genótipos dos 16 SNPs estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg em controles.

52

Dez SNPs localizados em genes que atuam de forma conjunta na via da melanogênese

foram selecionados para validar os resultados obtidos na GELE.

As distribuições dos dez SNPs selecionados de acordo com o número de referência

do SNP, o símbolo do gene, a mudança da base nitrogenada, a localização genômica e o

tamanho amostral estão apresentadas na Tabela 6.

Tabela 6. Distribuições dos dez polimorfismos de base única (SNPs) localizados em

genes relacionados com a melanogênese de acordo com o número de referência

do SNP, o símbolo do gene, a mudança da base nitrogenada, a região do gene e

o tamanho amostral estimado

rs do SNP Símbolo do

gene

Mudança de base

nitrogenada

Região

genômica

Tamanho

amostral

3793772 WNT8B c.-101T>C Regulatória 93

2017472 KIT c.67+12766T>C Íntron 109

2079162 GNAL1 g.80130766C>T Regulatória 51

11900505 ADCY3 c.675+9196T>G Íntron 60

4295085 PLCB1 g.8908966C>A Íntron 65

12601850 PRKCA c.205+407G>A Íntron 68

1806448 PRKCA c.288+33994A>G Íntron 79

11884600 CALM2 g.47384601A>G Regulatória 59

10932201 CREB1 c.261+1161G>A Íntron 93

7623610 MITF c.635-325A>G Íntron 61

rs: número de referência do polimorfismo de base única (SNP)

7. Validação dos resultados obtidos pela genotipagem em larga escala

As frequências dos genótipos dos SNPs selecionados por GELE e RT-PCR em

pacientes e controles estão apresentados nas Tabelas 7 e 8.

53

Tabela 7. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos WNT8B c.-101T>C, KIT

c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1

g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CREB1

c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G, identificados por genotipagem em

larga escala e reação em cadeia da polimerase em tempo real, em pacientes

com melanoma cutâneo e controles

Genótipos Nº de pacientes

GELE/RT-PCR

Nº de controles

GELE/ RT-PCR

Porcentagem

de

concordância

WNT8B c.-101T>C

TT 55 / 56 78 / 78

TC 45 / 44 23 / 23 99%

CC 3 / 3 2 / 2

KIT c.67+12766T>C

TT 40 / 40 24 / 24

TC 50 / 50 49 / 50 99%

CC 13 / 13 30 / 29

GNAL1 g.80130766C>T

CC 5 / 5 17 / 17

CT 35 / 35 41 / 41 100%

TT 63 / 63 45 / 45

ADCY3 c.675+9196T>G

TT 38 / 37 32 / 32

TG 65 / 66 46 / 46 99%

GG 10 / 10 25 / 25

PLCB1 g.8908966C>A

CC 24 / 24 38 / 35

CA 60 / 61 42 / 45 98%

AA 19 / 18 23 / 23

PRKCA c.205+407G>A

GG 24 / 24 36 / 36

GA 56 / 56 54 / 54 100%

AA 23 / 23 13 / 13

PRKCA c.288+33994A>G

AA 57 / 57 71 / 71

AG 41 / 41 26 / 26 100%

GG 5 / 5 6 / 6

54

CALM2 g.47384601A>G

AA 19 / 19 39 / 39

AG 51 / 52 42 / 46 95%

GG 34 / 33 22 / 18

CREB1 c.261+1161G>A

GG 28 / 28 49 / 49

GA 54 / 55 42 / 42 99%

AA 21 / 20 12 / 12

MITF c.635-325A>G

AA 35 / 35 16 / 15

AG 43 / 43 51 / 52 99%

GG 25 / 25 36 / 36

GELE: genotipagem em larga escala; RT-PCR: reação em cadeia da polimerase

em tempo real

Observamos concordância de genótipos identificados pelos dois métodos em

95% a 100% dos casos. Informamos que apenas os genótipos dos SNPs identificados

por

RT-PCR (padrão ouro) serão considerados nas próximas análises.

8. Polimorfismos em genes da melanogênese em pacientes e controles

Os resultados das avaliações do equilíbrio de Hardy-Weinberg para os lóci dos

SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3

c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA

c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-

325A>G em amostras de pacientes com MC e controles estão apresentados na Tabela 8.

55

Tabela 8. Teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg de dez polimorfismos selecionados em

amostras de pacientes com melanoma cutâneo e controles

Equilíbrio de Hardy-Weinberg

SNP Pacientes Controles

WNT8B c.-101T>C χ2= 2,70; P= 0,10 χ2= 0,04; P= 0,84

KIT c.67+12766T>C χ2= 0,18; P= 0,67 χ2= 0,03; P= 0,86

GNAL1 g.80130766C>T χ2= 0,002; P= 0,96 χ2= 2,02; P= 0,15

ADCY3 c.675+9196T>G χ2= 2,89; P= 0,08 χ2= 1,08; P= 0,29

PLCB1 g.8908966C>A χ2= 3,66; P= 0,06 χ2= 1,34; P= 0,24

PRKCA c.205+407G>A χ2= 0,78; P= 0,37 χ2= 1,05; P= 0,30

PRKCA c.288+33994A>G χ2= 0,48; P= 0,48 χ2= 2,67; P= 0,10

CALM2 g.47384601A>G χ2= 0,008; P= 0,92 χ2= 0,47; P= 0,40

CREB1 c.261+1161G>A χ2= 0,57; P= 0,45 χ2= 0,41; P= 0,52

MITF c.635-325A>G χ2= 2,54; P= 0,11 χ2= 0,29; P= 0,59

SNP: polimorfismo de base única, χ2= qui quadrado, Valores de P maiores que

0,05 indicam que a amostra encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg

Observamos que as amostras de pacientes com MC e controles estiveram em

equilíbrio de Hardy-Weinberg nos lóci dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT


g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2

g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A, MITF c.635-325A>G.

As frequências dos genótipos dos dez SNPs selecionados em pacientes com MC e

controles estão apresentados nas Tabelas 9 a 13.

56

Tabela 9. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos

WNT8B c.-101T>C e KIT c.67+12766T>C em pacientes com melanoma


Genótipos Pacientes

n (%)

Controles

n (%) OR (IC 95%)

Valor de

P PA

WNT8B c.-101T>C

Alelo T 76% 87% referência

Alelo C 24% 13% 2,25 (1,27-3,98) 0,005

TT 56 (54,4) 78 (75,7) referência

TC 44 (42,7) 23 (22,4) 2,56 (1,30-5,03) 0,006 88%

CC 3 (2,9) 2 (1,9) 3,74 (0,53-26,34) 0,18

TT 56 (54,4) 78 (75,7) referência

TC+CC 47 (45,6) 25 (24,3) 2,46 (1,27-4,77) 0,008 90%

TT+TC 100 (97,1) 101 (98,1) referência

CC 3 (2,9) 2 (1,9) 2,85 (0,42-19,10) 0,28

KIT c.67+12766T>C

Alelo T 63% 48% 2,08 (1,34-3,21) 0,001

Alelo C 37% 52% referência

TT 40 (38,8) 24 (23,3) 5,35 (1,92-14,85) 0,001 68%

TC 50 (48,6) 50 (48,5) 3,35 (1,38-8,11) 0,07 5%

CC 13 (12,6) 29 (28,2) referência

TT 40 (38,8) 24 (23,3) 2,28 (1,15-4,51) 0,01 68%

TC+CC 63 (61,2) 79 (76,7) referência

TT+TC 90 (87,4) 74 (71,8) 3,67 (1,60-8,40) 0,001 80%

CC 13 (12,6) 29 (28,2) referência

OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC:

intervalo de confiança, PA: poder da análise; valores de P< 0,05 estão destacados

As frequências do alelo C, do genótipo TC e do genótipo TC ou CC do SNP

WNT8B c.-101T>C foram maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos com os

referidos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,25, 2,56 e 2,46 vezes maiores de

ocorrência do MC do que os indivíduos com os demais alelo e genótipos, respectivamente.

57

As freqüências do alelo T, do genótipo TT e do genótipo TT ou TC do SNP KIT

c.67+12766T>C foram maiores em pacientes com MC do que em controles. Indivíduos

com os referidos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,08, 5,35 e 3,67 vezes maiores

de ocorrência do MC do que os indivíduos com os demais alelo e genótipos,

respectivamente.


GNAI1 g.80130766C>T e ADCY3 c.675+9196T>G em pacientes com



n (%)

Controles

n (%) OR (IC 95%)

Valor

de P PA

GNAI1 g.80130766C>T

Alelo C 22% 36% Referência

Alelo T 78% 64% 2,05 (1,27-3,30) 0,003

CC 5 (4,9) 17 (16,5) Referência

CT 35 (33,9) 41 (39,8) 5,99 (1,51-23,74) 0,01 14%

TT 63 (61,2) 45 (43,7) 6,34 (1,85-21,66) 0,003 72%

CC 5 (4,9) 17 (16,5) Referência

CT+TT 98 (95,1) 86 (83,5) 6,30 (1,85-21,44) 0,003 77%

CC+CT 40 (38,8) 58 (56,3) Referência

TT 63 (61,2) 45 (43,7) 3,67 (1,60-8,40) 0,002 72%

ADCY3 c.675+9196T>G

Alelo T 63% 53% 1,52 (1,01-2,34) 0,04

Alelo G 37% 47% Referência

TT 37(35,9) 32 (31,0) 4,86 (1,66-14,18) 0,004 12%

TG 56 (54,4) 46 (44,8) 4,28 (1,66-11,03) 0,003 28%

GG 10 (9,7) 25 (24,2) Referência

TT 37(35,9) 32 (31,0) 1,08 (0,56-2,05) 0,81

TG+GG 66 (64,1) 71 (69,0) Referência

TT+TG 93 (90,3) 78 (75,8) 3,99 (1,64-9,73) 0,002 80%

GG 10 (9,7) 25 (24,2) Referência


intervalo de confiança; PA: poder da análise; valores de P< 0,05 estão destacados

58

As frequências do alelo T, do genótipo CT, do genótipo TT e do genótipo CT ou TT

do SNP GNAI1 g.80130766C>T foram maiores em pacientes do que em controles.

Portadores dos referidos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,05, 5,99, 6,34 e 6,30

vezes maiores de ocorrência do MC do que os indivíduos com os demais alelos e

genótipos, respectivamente.

As freqüências do alelo T, do genótipo TT, do genótipo TG e do genótipo TT ou TG

do SNP ADCY3 c.675+9196T>G foram maiores em pacientes do que em controles.

Individuos portadores do referido alelo e genótipos estiveram sob riscos de 1,52, 4,86, 4,28

e 3,99 vezes maiores de ocorrência do MC do que indivíduos com os demais genótipos,

respectivamente.

59


PLCB1 g.8908966C>A e PRKCA c.205+407G>A em pacientes com



n (%)

Controles

n(%) OR (IC 95%)

Valor

de P PA

PLCB1 g.8908966C>A

Alelo C 47% 56% Referência

Alelo A 53% 44% 1,24 (0,81-1,91) 0,30

CC 24 (23,3) 35 (34,0) referência

CA 61 (59,2) 45 (43,7) 2,42 (1,18-4,96) 0,01 61%

AA 18 (17,5) 23 (22,3) 1,38 (0,55-3,45) 0,49

CC 24 (23,3) 35 (34,0) Referência

CA+AA 79 (76,7) 68 (66,0) 1,98 (1,00-3,93) 0,04 40%

CC+CA 85 (82,5) 80 (77,7) Referência

AA 18 (17,5) 23 (22,3) 1,34 (0,61-2,92) 0,45

PRKCA c.205+407G>A


Alelo A 50% 39% 1,76 (1,14-2,71) 0,01

GG 24 (23,3) 36 (35,0) Referência

GA 56 (54,4) 54 (52,4) 2,00 (0,97-4,12) 0,05

AA 23 (22,3) 13 (12,6) 3,85 (1,37-10,83) 0,01 45%

GG 24 (23,3) 36 (35,0) Referência

GA+AA 79 (76,7) 67 (65,0) 2,38 (1,17-4,83) 0,01 46%

GG+GA 80 (77,7) 90 (87,4) Referência

AA 23 (22,3) 13 (12,6) 2,12 (0,93-4,82) 0,07



As frequências do genótipo CA e do genótipo CA ou AA do SNP PLCB1

g.8908966C>A foram maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos com os

respectivos genótipos estiveram sob riscos de 2,42 e 1,98 vezes maiores de desenvolver MC

do que indivíduos com os demais genótipos.

60

As freqüências do alelo A, do genótipo AA e do genótipo GA ou AA do SNP PRKCA

c.205+407G>A foram maiores em pacientes do que em controles. Individuos com os

respectivos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 1,76, 3,85 e 2,38 vezes maiores de

ocorrência do MC do que indivíduos com os demais genótipos.


PRKCA c.288+33994A>G e CALM2 g.47384601A>G em pacientes com



n (%)

Controles

n (%) OR (IC 95%)

Valor

de P PA


Alelo A 75% 82% Referência

Alelo G 25% 18% 1,36 (0,81-2,28) 0,23

AA 57 (55,3) 71 (68,9) Referência

AG 41 (39,8) 26 (25,3) 2,00 (1,00-3,92) 0,04 61%

GG 5 (4,9) 6 (5,8) 1,10 (0,27-4,36) 0,89

AA 57 (55,3) 71 (68,9) Referência

AG+GG 46 (44,7) 32 (31,1) 1,80 (0,95-3,52) 0,07

AA+AG 98 (95,1) 97 (94,2) Referência

GG 5 (4,9) 6 (5,8) 1,40 (0,36-5,43) 0,62

CALM2 g.47384601A>G

Alelo A 43% 60% Referência

Alelo G 57% 40% 2,21 (1,43-3,41) 0,001

AA 19 (18,4) 39 (37,9) Referência

AG 51 (49,6) 46 (44,6) 2,41 (1,12-5,18) 0,02 12%

GG 33 (32,0) 18 (17,5) 4,75 (1,90-11,87) 0,001 68%

AA 19 (18,4) 39 (37,9) Referência

AG+GG 84 (81,6) 64 (62,1) 3,32 (1,58-6,97) 0,001 88%

AA+AG 70 (68,0) 85 (82,5) Referência

GG 33 (32,0) 18 (17,5) 2,77 (1,33-5,77) 0,52



61

A frequência do genótipo AG do SNP PRKCA c.288+33994A>G foi maior em

pacientes do que em controles. Indivíduos com o referido genótipo estiveram sob risco de

ocorrência de de MC duas vezes maior do que os com os demais genótipos.

As frequências do alelo G, do genótipo AG, do genótipo GG e do genótipo AG ou

GG do SNP CALM2 g.47384601A>G foram maiores em pacientes do que em controles.

Portadores dos respectivos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,21, 2,41, 4,75 e 3,32

vezes maiores de ocorrência do MC do que índividuos com os demais genótipos.


CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em pacientes com melanoma



n (%)

Controles

n (%) OR (IC 95%)

Valor

de P PA

CREB1 c.261+1161G>A


Alelo A 46% 32% 1,98 (1,27-3,09) 0,002

GG 28 (27,2) 49 (47,6) Referência

GA 55 (53,4) 42 (40,7) 2,93 (1,48-5,79) 0,002 45%

AA 20 (20,4) 12 (11,7) 3,99 (1,37-11,63) 0,001 40%

GG 28 (27,2) 49 (47,6) Referência

GA+AA 75 (72,8) 54 (52,4) 2,93 (1,52-5,64) 0,001 87%

GG+GA 83 (79,6) 91 (88,3) Referência

AA 20 (20,4) 12 (11,7) 1,33 (0,55-3,24) 0,52

MITF c.635-325A>G

Alelo A 55% 40% 1,69 (1,10-2,59) 0,01


AA 35 (34,0) 15 (14,6) 3,13 (1,33-7,34) 0,009 91%

AG 43 (41,7) 52 (50,4) 1,10 (0,54-2,24) 0,78

GG 25 (24,3) 36 (35,0) Referência

AA 35 (34,0) 15 (14,6) 2,77 (1,30-5,88) 0,008 91%

AG+GG 68 (66,0) 88 (84,4) Referência

AA+AG 78 (75,7) 67 (65,0) 1,42 (0,73-2,77) 0,30

GG 25 (24,3) 36 (35,0) Referência



62

A frequência do alelo A, do genótipo GA, do genótipo AA e do genótipo GA ou AA

do SNP CREB1 c.261+1161G>A foram maiores em pacientes do que em controles.

Portadores dos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 1,98, 2,93, 3,99 e 2,93 vezes

maiores de ocorrência do MC do que portadores dos demais genótipos, respectivamente.

A frequência do alelo A e do genótipo AA do SNP MITF c.635-325A>G foram

maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos portadores do referido alelo e

genótipo estiveram sob riscos de 1,69 e 3,13 vezes maiores de ocorrência do MC do que

indivíduos com os demais genótipos.

As frequências diferenciadas de genótipos dos dez SNPs combinados dois a dois

em pacientes e controles foram estão apresentadas na Tabela 14.

63

Tabela 14. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos WNT8B

c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3


c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A, MITF

c.635-325A>G, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo

e controles

SNPs combinados Pacientes

n (%)

Controles

n (%) Valor de P OR (IC 95%)

WNT8B + PRKCA1

CC+ TC + AA+GA 36 (73,5) 17 (37,8) 0,001 5,08 (1,88-13,67)

TT + GG 13 (26,5) 28 (62,2) Referência

WNT8B + PRKCA2

CC+CT + GG+AG 23 (41,1) 9 (14,1) 0,004 4,20 (1,57-11,19)

TT + AA 33 (58,9) 55 (85,9) Referência

WNT8B + MITF

CC+CT + AA+GA 35 (72,9) 16 (37,2) 0,004 4,29 (1,59-11,52)

TT + GG 13 (27,1) 27 (62,8) Referência

KIT + PRKCA1

TT+TC + AA+GA 68 (97,1) 49 (81,7) 0,004 17,30 (2,46-121,55)

CC + GG 2 (2,9) 11 (18,3) Referência

KIT + PRKCA2

TT+TC + GG+AG 41 (83,7) 24 (53,3) 0,002 5,27 (1,84-15,09)

CC + AA 8 (16,3) 21 (46,7) Referência

KIT + MITF

TT + AA 11 (22,0) 5 (6,8) 0,03 3,80 (1,08-13,36)

TC+CC + GG+GA 39 (78,0) 69 (93,2) Referência

GNAI1 + PLCB1

TT+TC + AA+CA 75 (98,7) 62 (84,9) 0,006 22,86 (2,45-212,48)

CC + CC 1 (1,3) 11 (15,1) Referência

GNAI1 + MITF

TT + AA 22 (44,9) 6 (10,9) 0,001 6,93 (2,27-21,21)

CC+CT + GG+GA 27 (55,1) 49 (89,1) Referência

ADCY3 + CREB1

TT+TG + AA+GA 69 (94,5) 42 (76,4) 0,002 7,23 (2,02-25,84)

GG + GG 4 (5,5) 13 (23,6) Referência

ADCY3 + PRKCA1

TT+TG + AA+AG 72 (96,0) 52 (83,9) 0,009 7,67 (1,66-35,38)

GG + GG 3 (4,0) 10 (16,1) Referência

ADCY3 + PRKCA2

TT+TG + GG+AG 41 (89,1) 26 (57,8) 0,001 8,93 (2,50-31,83)

GG + AA 5 (10,9) 19 (42,2) Referência

ADCY3 + MITF

TT+TG + AA+AG 70 (97,2) 52 (83,9) 0,01 19,17 (1,97-186,35)

GG + GG 2 (2,8) 10 (16,1) Referência

PRKCA1 + PRKCA2

AA+GA + GG+AG 33 (75,0) 21 (45,7) 0,004 4,64 (1,62-13,30)

GG + AA 11 (25,0) 25 (54,3) Referência

PRKCA2 + PLCB1

GG+AG + AA+CA 37 (71,2) 22 (46,8) 0,009 3,71 (1,39-9,93)

AA + CC 15 (28,8) 25 (53,2) Referência

64

PRKCA2 + MITF

GG+AG + AA+GA 34 (72,3) 21 (45,7) 0,03 2,74 (1,09-6,88)

AA + GG 13 (27,7) 25 (54,3) Referência

CALM2 + CREB1

GG + AA 10 (14,3) 2 (2,6) 0,03 5,83 (1,08-31,21)

AA+AG + GG+GA 60 (85,7) 75 (97,4) Referência

CALM2 + PRKCA1

GG+AG + AA+GA 64 (94,1) 42 (75,0) 0,004 7,35 (1,89-28,50)

AA+GG 4 (5,9) 14 (25,0) Referência

CALM2 + PRKCA2

GG+GA + GG+AG 42 (73,7) 21 (42,9) <0,001 6,43 (2,28-18,13)

AA + AA 15 (26,3) 28 (57,1) Referência

CALM2 + PLCB1

GG+AG + AA+CA 63 (95,5) 41 (77,4) 0,003 9,87(2,14-45,55)

AA + CC 3 (4,5) 12 (22,6) Referência

CREB1 + WNT8B

AA+GA + CC+TC 32 (71,1) 9 (21,4) <0,001 9,93 (3,24-30,38)

GG+TT 13 (28,9) 33 (78,6) Referência

CREB1 + PRKCA2

AA+GA + GG+AG 36 (66,7) 17 (33,3) 0,001 4,83 (1,89-12,32)

GG+AA 18 (33,3) 34 (66,7) Referência

CREB1 + PLCB1

AA+GA + AA+CA 59 (96,7) 40 (81,6) 0,03 5,91 (1,14-30,64)

GG + AA 2 (3,3) 9 (18,4) Referência

CREB1 + MITF

AA+GA + AA+GA 57 (89,1) 34 (68,0) 0,004 5,06 (1,67-15,28)

GG + GG 7 (10,9) 16 (32,0) Referência

SNP: polimorfismo de base única, OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo

cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC: intervalo de confiança; PA: poder da análise; PRKCA1:

se refere ao SNP PRKCA c.205+407G>A; PRKCA2: se refere ao SNP PRKCA

c.288+33994A>G

65

As frequências dos genótipos combinados dos diversos SNPs acima apresentados

foram maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos com os respectivos genótipos

combinados estiveram sob riscos substancialmente maiores (2,74 a 22,86) de ocorrência de

MC do que os demais. Frequências similares das combinações dos demais genótipos foram

observadas em pacientes e controles. Indivíduos com os distintos genótipos dos referidos

SNPs estiveram sob riscos similares de MC do que os demais.

9. Polimorfismos em genes da melanogênese em aspectos clínicos de pacientes

As frequências dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1

g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA

c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1

c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em pacientes estratificados por idade mediana,

sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos, presença de efélides e nevos e exposição

solar estão apresentadas nas Tabelas 15 a 24.

66

Tabela 15. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em pacientes

com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de

olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar

Genótipos WNT8B c.-101T>C

Variável TT

n (%)

TC+CC

n (%)

Valor

de P

TT+TC

n (%)

CC

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 30 (56,6) 23 (43,4) 0,69 51 (96,2) 2 (3,8) 1,00

≥54 anos 26 (52,0) 24 (48,0) 49 (98,0) 1 (2,0)

Sexo

Masculino 34 (55,7) 27 (44,3) 0,84 59 (96,7) 2 (3,3) 1,00

Feminino 22 (52,4) 20 (47,6) 41 (97,6) 1 (2,4)

Fototipo

I+II 35 (53,0) 31 (47,0) 0,67 64 (97,0) 2 (3,0) 1,00

III+IV+V+VI 20 (58,8) 14 (41,2) 33 (97,1) 1 (2,9)

Cor dos olhos

Claros 22 (59,5) 15 (40,5) 0,53 37 (100) 0 (0,0) 1,00

Não claros 33 (52,4) 30 (47,6) 60 (95,2) 3 (4,8)

Cor dos cabelos

Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 0,12 29 (100) 0 (0,0) 0,55

Não claros 43 (60,6) 28 (39,4) 68 (95,8) 3 (4,2)


Sim 30 (47,6) 33 (52,4) 0,10 61 (96,8) 2 (3,2) 1,00

Não 26 (65,0) 14 (35,0) 39 (97,5) 1 (2,5)

Presença de nevos

>20 33 (52,4) 30 (47,6) 0,68 60 (95,2) 3 (4,8) 1,00

≤20 23 (57,5) 17 (42,5) 40 (100) 0 (0,0)

Exposição solar

Crônica 28 (57,1) 21 (42,9) 1,00 47 (95,9) 2 (4,1) 1,00

Intermitente/ nenhuma 22 (59,5) 15 (40,5) 36 (97,3) 1 (2,7)

67

Tabela 16. Distribuições dos genótipos do polimorfismo KIT c.67+12766T>C em

pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,

fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e

exposição solar

Genótipos KIT c.67+12766T>C

Variável TT

n (%)

TC+CC

n (%)

Valor

de P

TT+TC

n (%)

CC

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 18 (34,0) 35 (66,0) 0,31 48 (90,6) 5 (9,4) 0,38

≥54 anos 22 (44,0) 28 (56,0) 42 (84,0) 8 (16,0)

Sexo

Masculino 25 (41,0) 36 (59,0) 0,68 53 (86,9) 8 (13,1) 1,00

Feminino 15 (37,5) 27 (64,3) 37 (88,1) 5 (11,9)

Fototipo

I+II 22 (33,3) 44 (66,7) 0,08 57 (86,4) 9 (13,6) 1,00

III+IV+V+VI 18 (52,9) 16 (47,1) 30 (88,2) 4 (11,8)

Cor dos olhos

Claros 11 (29,7) 26 (70,3) 0,14 29 (78,4) 8 (21,6) 0,06

Não claros 29 (46,0) 34 (54,0) 58 (92,1) 5 (7,9)

Cor dos cabelos

Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 1,00 25 (86,2) 4 (13,0) 1,00

Não claros 28 (39,4) 43 (60,6) 62 (87,3) 9 (12,7)


Sim 25 (39,7) 38 (60,3) 0,83 54 (85,7) 9 (14,3) 0,76

Não 15 (37,5) 25 (62,5) 36 (90,0) 4 (10,0)

Presença de nevos

>20 24 (38,1) 39 (61,9) 1,00 54 (85,7) 9 (14,3) 0,76

≤20 24 (38,1) 39 (61,9) 36 (90,0) 4 (10,0)

Exposição solar

Crônica 23 (46,9) 26 (53,1) 0,51 42 (85,7) 7 (14,3) 1,00

Intermitente/nenhuma 14 (37,8) 23 (62,2) 32 (86,5) 5 (13,5)

68

Tabela 17. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T em



exposição solar

Genótipos GNAL1 g.80130766C>T

Variável CC

n (%)

CT+TT

n (%)

Valor

de P

CC+CT

n (%)

TT

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 1 (1,9) 52 (98,1) 0,19 24 (45,3) 29 (54,7) 0,22

≥54 anos 4 (8,0) 46 (92,0) 16 (32,0) 34 (68,0)

Sexo

Masculino 4 (6,6) 57 (93,4) 0,64 22 (36,1) 39 (63,9) 0,54

Feminino 1 (2,4) 41 (97,6) 18 (42,9) 24 (57,1)

Fototipo

I+II 2 (3,0) 64 (97,0) 0,33 22 (33,3) 44 (66,7) 0,13

III+IV+V+VI 3 (8,8) 31 (91,2) 17 (50,0) 17 (50,0)

Cor dos olhos

Claros 1 (2,7) 36 (97,3) 0,64 13 (35,1) 24 (64,9) 0,67

Não claros 4 (6,3) 59 (93,7) 26 (41,3) 37 (58,7)

Cor dos cabelos

Claros 2 (6,9) 27 (93,1) 0,62 13 (44,8) 16 (55,2) 0,50

Não claros 3 (4,2) 68 (95,8) 26 (36,6) 45 (63,4)


Sim 4 (6,3) 59 (93,7) 0,64 25 (39,7) 38 (60,3) 0,83

Não 1 (2,5) 39 (97,5) 15 (37,5) 25 (62,5)

Presença de nevos

>20 3 (4,8) 60 (95,2) 1,00 23 (36,5) 40 (63,5) 0,67

≤20 2 (5,0) 38 (95,0) 17 (42,5) 23 (57,5)

Exposição solar

Crônica 3 (6,1) 46 (93,9) 0,63 20 (40,8) 29 (59,2) 0,36


69

Tabela 18. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G em



exposição solar

Genótipos ADCY3 c.675+9196T>G

Variável TT

n (%)

TG+GG

n (%)

Valor

de P

TT+TG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 19 (35,8) 34 (64,2) 50 (94,3) 3 (5,7) 0,19

≥54 anos 18 (36,0) 32 (64,0) 1,00 43 (86,0) 7 (14,0)

Sexo

Masculino 22 (36,1) 39 (63,9) 1,00 56 (91,8) 5 (8,2) 0,73

Feminino 15 (35,7) 27 (64,3) 37 (88,1) 5 (11,9)

Fototipo

I+II 25 (37,9) 41 (62,1) 0,66 61 (92,4) 5 (7,6) 0,30

III+IV+V+VI 11 (32,4) 23 (67,6) 29 (85,3) 5 (14,7)

Cor dos olhos

Claros 17 (45,9) 20 (54,1) 0,13 34 (91,9) 3 (8,1) 0,74

Não claros 19 (30,2) 44 (69,8) 56 (88,9) 7 (11,1)

Cor dos cabelos

Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 0,49 27 (93,1) 2 (6,9) 0,71

Não claros 24 (33,8) 47 (66,2) 63 (88,7) 8 (11,3)


Sim 26 (41,3) 37 (58,7) 0,20 57 (90,5) 6 (9,5) 1,00

Não 11 (27,5) 29 (72,5) 36 (90,0) 4 (10,0)

Presença de nevos

>20 20 (31,7) 43 (68,3) 0,29 60 (95,2) 3 (4,8) 0,04

≤20 17 (42,5) 23 (57,5) 33 (85,5) 7 (17,5)

Exposição solar

Crônica 16 (32,7) 33 (67,3) 0,65 42 (85,7) 7 (14,3) 0,28


A diferença entre grupos está destacada

70

Tabela 19. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A em



exposição solar

Genótipos PLCB1 g.8908966C>A

Variável CC

n (%)

CA+AA

n (%)

Valor

de P

CC+CA

n (%)

AA

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 12 (22,6) 41 (77,4) 1,00 42 (79,2) 11 (20,8) 0,44

≥54 anos 12 (24,0) 38 (76,0) 43 (86,0) 7 (14,0)

Sexo

Masculino 10 (16,4) 51 (83,6) 0,06 52 (85,2) 9 (14,8) 0,43

Feminino 14 (33,3) 28 (66,7) 33 (78,6) 9 (21,4)

Fototipo

I+II 14 (21,2) 52 (78,8) 0,45 52 (78,8) 14 (21,2) 0,16

III+IV+V+VI 10 (29,4) 24 (70,6) 31 (91,2) 3 (8,8)

Cor dos olhos

Claros 8 (21,6) 29 (78,4) 0,81 29 (78,4) 8 (21,6) 0,41

Não claros 16 (25,4) 47 (74,6) 54 (85,7) 9 (14,3)

Cor dos cabelos

Claros 8 (27,6) 21 (72,4) 0,61 23 (79,3) 6 (20,7) 0,56

Não claros 16 (22,5) 55 (77,5) 60 (84,5) 11 (15,5)


Sim 17 (27,0) 46 (73,0) 0,34 52 (82,5) 11 (17,5) 1,00

Não 7 (17,5) 33 (82,5) 33 (82,5) 7 (17,5)

Presença de nevos

>20 12 (19,0) 51 (81,0) 0,23 53 (84,1) 10 (15,9) 0,60

≤20 12 (30,0) 28 (70,0) 32 (80,0) 8 (20,0)

Exposição solar

Crônica 11 (22,4) 38 (77,6) 0,80 41 (83,7) 8 (16,3) 0,78


71

Tabela 20. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A em



exposição solar

Genótipos PRKCA c.205+407G>A

Variável GG

n (%)

GA+AA

n (%)

Valor

de P

GG+GA

n (%)

AA

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 8 (15,1) 45 (84,9) 0,06 44 (83,0) 9 (17,0) 0,23

≥54 anos 16 (32,0) 34 (68,0) 36 (72,0) 14 (28,0)

Sexo

Masculino 15 (24,6) 46 (75,4) 0,81 52 (85,2) 9 (14,8) 0,06

Feminino 9 (21,4) 33 (78,6) 28 (66,7) 14 (33,3)

Fototipo

I+II 15 (22,7) 51 (77,3) 1,00 51 (77,3) 15 (22,7) 1,00

III+IV+V+VI 8 (23,5) 26 (76,5) 27 (79,4) 7 (20,6)

Cor dos olhos

Claros 8 (21,6) 29 (78,4) 1,00 30 (81,1) 7 (18,9) 0,62

Não claros 15 (23,8) 48 (76,2) 48 (76,2) 15 (23,8)

Cor dos cabelos

Claros 6 (20,7) 23 (79,3) 0,79 23 (79,3) 6 (20,7) 1,00

Não claros 17 (23,9) 54 (76,1) 55 (77,5) 16 (22,5)


Sim 19 (30,2) 44 (69,8) 0,05 49 (77,8) 14 (22,2) 1,00

Não 5 (12,5) 35 (87,5) 31 (77,5) 9 (22,5)

Presença de nevos

>20 15 (23,8) 48 (76,2) 1,00 52 (82,5) 11 (17,5) 0,15

≤20 9 (22,5) 31 (77,5) 28 (70,0) 12 (30,0)

Exposição solar

Crônica 15 (30,6) 34 (69,4) 0,31 36 (73,5) 13 (26,5) 0,30


72

Tabela 21. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G em



exposição solar

Genótipos PRKCA c.288+33994A>G

Variável AA

n (%)

AG+GG

n (%)

Valor

de P

AA+AG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 30 (56,6) 23 (43,4) 0,84 50 (94,3) 3 (5,7) 1,00

≥54 anos 27 (54,0) 23 (46,0) 48 (96,0) 2 (4,0)

Sexo

Masculino 30 (49,2) 31 (50,8) 0,16 57 (93,4) 4 (6,6) 0,64

Feminino 27 (64,3) 15 (35,7) 41 (97,6) 1 (2,4)

Fototipo

I+II 35 (53,0) 31 (47,0) 0,67 63 (95,5) 3 (4,5) 1,00

III+IV+V+VI 20 (58,8) 14 (41,2) 32 (94,1) 2 (5,9)

Cor dos olhos

Claros 20 (54,1) 17 (45,9) 1,00 36 (97,3) 1 (2,7) 0,64

Não claros 35 (55,6) 28 (44,4) 59 (93,7) 4 (6,3)

Cor dos cabelos

Claros 17 (58,6) 12 (41,4) 0,66 28 (96,6) 1 (3,4) 1,00

Não claros 38 (53,5) 33 (46,5) 67 (94,4) 4 (5,6)

Presença de

efélides

Sim 40 (63,5) 23 (36,5) 0,05 59 (93,7) 4 (6,3) 0,64

Não 17 (42,5) 23 (57,5) 39 (97,5) 1 (2,5)

Presença de nevos

>20 36 (57,1) 27 (42,9) 0,68 58 (92,1) 5 (7,9) 0,15

≤20 21 (52,5) 19 (47,5) 40 (100) 0 (0,0)

Exposição solar

Crônica 25 (51,0) 24 (49,0) 0,51 46 (93,9) 3 (6,1) 1,00

Intermitente 22 (59,5) 15 (40,5) 35 (94,6) 2 (5,4)

73

Tabela 22. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G em



exposição solar

Genótipos CALM2 g.47384601A>G

Variável AA

n (%)

AG+GG

n (%)

Valor

de P

AA+AG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 10 (18,9) 43 (81,1) 1,00 35 (66,0) 18 (34,0) 0,67

≥54 anos 9 (18,0) 41 (82,0) 35 (70,0) 15 (30,0)

Sexo

Masculino 16 (26,2) 45 (73,8) 0,02 45 (73,8) 16 (26,2) 0,14

Feminino 3 (7,1) 39 (92,9) 25 (59,5) 17 (40,5)

Fototipo

I+II 11 (16,7) 55 (83,3) 0,78 46 (69,7) 20 (30,3) 0,65

III+IV+V+VI 7 (20,6) 27 (79,4) 22 (64,7) 12 (35,3)

Cor dos olhos

Claros 4 (10,8) 33 (89,2) 0,18 27 (73,0) 10 (27,0) 0,50

Não claros 14 (22,2) 49 (77,8) 41 (65,1) 22 (34,9)

Cor dos cabelos

Claros 6 (20,7) 23 (79,3) 0,77 23 (79,3) 6 (20,7) 0,15

Não claros 12 (16,9) 59 (83,1) 45 (63,4) 26 (36,6)


Sim 14 (22,2) 49 (77,8) 0,29 41 (65,1) 22 (34,9) 0,51

Não 5 (12,5) 35 (87,5) 29 (72,5) 11 (27,5)

Presença de nevos

> 20 13 (20,6) 50 (85,5) 0,60 43 (68,3) 20 (31,7) 1,00

≤ 20 6 (15,0) 34 (79,4) 27 (67,5) 13 (32,5)

Exposição solar

Crônica 9 (18,4) 40 (81,6) 1,00 32 (65,3) 17 (34,7) 0,64


74

Tabela 23. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G em pacientes

com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de

olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar

Genótipos CREB1 c.261+1161G>A

Variável GG

n (%)

GA+AA

n (%)

Valor

de P

GG+GA

n (%)

AA

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 14 (26,4) 39 (73,6) 1,00 43 (81,1) 10 (18,9) 1,00

≥54 anos 14 (28,0) 36 (72,0) 40 (80,0) 10 (20,0)

Sexo

Masculino 17 (27,9) 44 (72,1) 1,00 51 (83,6) 32 (76,2) 0,44

Feminino 11 (26,2) 31 (73,8) 10 (16,4) 10 (23,8)

Fototipo

I+II 18 (27,3) 48 (72,7) 0,81 52 (78,8) 14 (21,2) 0,16

III+IV+V+VI 10 (29,4) 24 (70,6) 31 (91,2) 3 (8,8)

Cor dos olhos

Claros 13 (35,1) 24 (64,9) 0,25 29 (78,4) 8 (21,6) 0,41

Não claros 15 (23,8) 48 (76,2) 54 (85,7) 9 (14,3)

Cor dos cabelos

Claros 10 (34,5) 19 (65,5) 0,46 21 (72,4) 8 (27,6) 0,08

Não claros 18 (25,4) 53 (74,6) 62 (87,3) 9 (12,7)


Sim 16 (25,4) 47 (74,6) 0,65 51 (81,0) 12 (19,0) 1,00

Não 12 (30,0) 28 (70,0) 32 (80,0) 8 (20,0)

Presença de nevos

>20 15 (23,8) 48 (76,2) 0,36 49 (77,8) 14 (22,2) 0,44

≤20 13 (32,5) 27 (67,5) 34 (85,0) 6 (15,0)

Exposição solar

Crônica 49 (77,8) 14 (22,2) 0,44 13 (26,5) 36 (73,5) 0,63


75




exposição solar

Genótipos MITF c.635-325A>G

Variável AA

n (%)

AG+GG

n (%)

Valor

de P

AA+AG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 18 (34,0) 35 (66,0) 1,00 36 (67,9) 17 (32,1) 0,06

≥54 anos 17 (34,0) 33 (66,0) 42 (84,0) 8 (16,0)

Sexo

Masculino 21 (34,4) 40 (65,6) 1,00 47 (77,0) 14 (23,0) 0,81

Feminino 14 (33,3) 28 (66,7) 31 (73,8) 11 (26,2)

Fototipo

I+II 26 (39,4) 40 (60,6) 0,12 46 (69,7) 20 (30,3) 0,14

III+IV+V+VI 8 (23,5) 26 (76,5) 29 (85,3) 5 (14,7)

Cor dos olhos

Claros 14 (37,8) 23 (62,2) 0,66 28 (75,7) 9 (24,3) 1,00

Não claros 20 (31,7) 43 (68,3) 47 (74,6) 16 (25,4)

Cor dos cabelos

Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 0,35 24 (82,8) 5 (17,2) 0,31

Não claros 22 (31,0) 49 (69,0) 51 (71,8) 20 (28,2)

Presença de

efélides

Sim 19 (30,2) 44 (69,8) 0,39 46 (73,0) 17 (27,0) 0,48

Não 16 (40,0) 24 (60,0) 32 (80,0) 8 (20,0)

Presença de nevos

>20 23 (36,5) 40 (63,5) 0,53 47 (74,6) 16 (25,4) 0,81

≤20 12 (30,0) 28 (70,0) 31 (77,5) 9 (22,5)

Exposição solar

Crônica 20 (40,8) 29 (59,2) 0,36 38 (77,6) 11 (22,4) 1,00

Intermitente 11 (29,7) 26 (70,3) 28 (75,7) 9 (24,3)

76

Frequências similares dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT

c.67+12766T>C, GNAL1 g.80130766C>T, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA

c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-

325A>G foram observadas em pacientes estratificados pelas referidas características

clínicas.

A frequência dos genótipos TT ou TG do SNP ADCY3 c.675+9196T>G foi maior

em pacientes com número de nevos maior que 20 do que naqueles com menor número de

nevos. Já a frequência dos genótipos AG ou GG do SNP CALM2 g.47384601A>G foi

maior em mulheres do que em homens.

As frequências diferenciadas dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT



g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G, associados dois a dois,

somente em pacientes com MC de acordo com as características clínicas como idade, sexo,

fototipo cutâneo, cor de olhos e cabelos estão apresentadas na Tabela 25.

77

Tabela 25. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos WNT8B c.-

101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3


c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A, MITF

c.635-325A>G, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo

estratificados por fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos e presença de

efélides e nevos

SNPs combinados Características clínicas Valor de P

Fototipo

GNAI1 + MITF I+II n (%) III+IV+V+VI n (%)

TT + AA 17 (56,7) 5 (26,3) 0,04

CC+CT + GG+GA 13 (43,3) 14 (73,7)

Cor dos olhos

ADCY3 + CREB1 Claros n (%) Não claros n (%)

TT + AA 6 (25,0) 2 (5,1) 0,04

TG+GG + GA+GG 18 (75,0) 37 (94,9)

Cor dos cabelos

ADCY3 + CREB1 Claros n (%) Não claros n (%)

TT + AA 5 (26,3) 3 (6,8) 0,04

TG+GG + GA+GG 14 (73,7) 41 (93,2)

ADCY3 + MITF

TT + AA 7 (36,8) 3 (9,7) 0,03

TG+GG + AG+GG 12 (63,2) 28 (90,3)

CREB1 + MITF

AA + AA 7 (30,4) 4 (8,3) 0,03

GG+GA + GG+GA 16 (69,6) 44 (91,7)

Efélides

PRKCA1+PRKCA2 Sim n (%) Não n (%)

AA+GA + GG+AG 13 (59,1) 20 (90,9) 0,03

GG + AA 9 (40,9) 2 (9,1)

PRKCA1 + PLCB1

AA+GA + AA+CA 33 (24,6) 28 (100) 0,03

GG + CC 6 (15,4) 0 (0,0)

Nevos

ADCY3 + WNT8B >50 n (%) ≤50 n (%)

TT+TG + CC+CT 28 (96,6) 15 (75,0) 0,03

GG + TT 1 (3,4) 5 (25,0)

78

ADCY3 + PRKCA1

TT + AA 9 (31,0) 2 (5,6) 0,009

TG+GG + GA+GG 20 (69,0) 34 (94,4)

SNP: polimorfismo gênico de base única; PRKCA1: se refere ao PRKCA

c.205+407G>A; PRKCA2: se refere PRKCA c.288+33994A>G. As diferenças entre

grupos estão destacadas

A frequência do genótipo combinado GNAI1 TT + MITF AA foi maior em

pacientes com fototipo I+II do que em pacientes com os demais fototipos. O genótipo

combinado ADCY3 TT + CREB1 AA foi mais comum em pacientes com olhos claros do

que pacientes com olhos escuros. As frequências dos genótipos combinados ADCY3 TT

CREB1 AA, ADCY3 TT + MITF AA e CREB1 AA + MITF AA foram maiores em

pacientes com cabelos claros do que pacientes com cabelos escuros. Os genótipos

combinados PRKCA1 AA+GA + PRKCA2 AG+GG e PRKCA1 AA+GA + PLCB1

AA+CA foram mais comuns em pacientes com efélides do que em pacientes sem efélides.

As frequências do genótipos combinados ADCY3 TT+TG + WNT8B CC+CT e ADCY3 TT

+ PRKCA1 AA foram maiores em pacientes com número de nevos maior que 50 do que

em pacientes com número menor de nevos.

10. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos do tumor em pacientes

As frequências dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C,

GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA

c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1

c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em pacientes estratificados por localização,

espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor estão apresentadas nas

Tabelas 26 a 35.

79

Tabela 26. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em pacientes

com melanoma cutâneo estratificados pela localização, espessuras de Breslow,

níveis de Clark e estágios do tumor

Genótipos WNT8B c.-101T>C

Variável TT

n (%)

TC+CC

n (%)

Valor

de P

TT+TC

n (%)

CC

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 30 (50,8) 29 (49,2) 1,00 57 (96,6) 2 (3,4) 0,54

Membros 16 (51,6) 15 (48,4) 31 (100) 0 (0,0)

Breslow

>1,5mm 26 (53,1) 23 (46,9) 0,83 48 (98,0) 1 (2,0) 0,59

≤1,5mm 24 (55,8) 19 (44,2) 41 (95,3) 2 (4,7)

Clark

I+II 28 (50,0) 28 (50,0) 0,40 54 (96,4) 2 (3,6) 1,00

III+IV+V 24 (60,0) 16 (40,0) 39 (97,5) 1 (2,5)

Estágio TNM

0+I+II 35 (60,3) 21 (46,7) 0,23 56 (96,6) 2 (3,4) 1,00

III+IV 21 (46,7) 24 (53,3) 44 (97,8) 1 (2,2)

Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco

80

Tabela 27. Distribuições dos genótipos do polimorfismo KIT c.67+12766T>C em

pacientes com melanoma cutâneo estratificados pela localização, espessuras

de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor

Genótipos KIT c.67+12766T>C

Variável TT

n (%)

TC+CC

n (%)

Valor

de P

TT+TC

n (%)

CC

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 22 (37,3) 37 (62,7) 1,00 47 (79,7) 12 (20,3) 0,03

Membros 11 (35,5) 20 (64,5) 30 (96,8) 1 (3,2)

Breslow

>1,5mm 16 (32,7) 33 (67,3) 0,28 41 (83,7) 8 (16,3) 0,36

≤1,5mm 19 (44,2) 24 (55,8) 39 (90,7) 4 (9,3)

Clark

I+II 22 (39,3) 34 (60,7) 1,00 48 (85,7) 8 (14,3) 1,00

III+IV+V 15 (37,5) 25 (62,5) 35 (87,5) 5 (12,5)

Estágio TNM

0+I+II 23 (39,7) 35 (60,3) 1,00 50 (86,2) 8 (13,8) 0,77

III+IV 17 (37,8) 28 (62,2) 40 (88,9) 5 (11,1)

Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco; a diferença entre grupos

está destacada

81

Tabela 28. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T em

pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras


Genótipos GNAL1 g.80130766C>T

Variável CC

n (%)

CT+TT

n (%)

Valor

de P

CC+CT

n (%)

TT

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 4 (6,8) 55 (93,2) 0,65 22 (37,3) 37 (62,7) 1,00

Membros 1 (3,2) 30 (96,8) 12 (38,7) 19 (61,3)

Breslow

>1,5mm 4 (8,2) 45 (91,8) 0,36 20 (40,8) 29 (59,2) 1,00

≤1,5mm 1 (2,3) 42 (97,7) 18 (41,9) 25 (58,1)

Clark

I+II 2 (3,6) 54 (96,4) 0,64 19 (33,9) 37 (66,1) 0,20

III+IV+V 3 (7,5) 37 (92,5) 19 (47,5) 21 (52,5)

Estágio TNM

0+I+II 2 (3,4) 56 (96,6) 0,65 21 (36,2) 37 (63,8) 0,54

III+IV 3 (6,7) 42 (93,3) 19 (42,2) 26 (57,8)


82

Tabela 29. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G em



Genótipos ADCY3 c.675+9196T>G

Variável TT

n (%)

TG+GG

n (%)

Valor de

P

TT+TG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 19 (32,2) 40 (67,8) 0,64 53 (89,8) 6 (10,2) 0,73

Membros 12 (38,7) 19 (61,3) 27 (87,1) 4 (12,9)

Breslow

>1,5mm 17 (34,7) 32 (65,3) 1,00 43 (87,8) 6 (12,2) 0,49

≤1,5mm 14 (32,6) 29 (67,4) 40 (93,0) 3 (7,0)

Clark

I+II 18 (32,1) 38 (67,9) 0,51 52 (92,9) 4 (7,1) 0,48

III+IV+V 16 (40,0) 24 (60,0) 35 (87,5) 5 (12,5)

Estágio TNM

0+I+II 20 (34,5) 38 (65,5) 0,83 54 (93,1) 4 (6,9) 0,32

III+IV 17 (37,8) 28 (62,2) 39 (86,7) 6 (13,3)


83

Tabela 30. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A em

pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de

Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor

Genótipos PLCB1 g.8908966C>A

Variável CC

n (%)

CA+AA

n (%)

Valor

de P

CC+CA

n (%)

AA

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 11 (18,6) 48 (81,4) 0,43 49 (83,1) 10 (16,9) 0,40

Membros 8 (25,8) 23 (74,2) 23 (74,2) 8 (25,8)

Breslow

>1,5mm 10 (20,4) 39 (79,6) 0,62 39 (79,6) 10 (20,4) 0,78

≤1,5mm 11 (25,6) 32 (74,4) 36 (83,7) 7 (16,3)

Clark

I+II 12 (21,4) 44 (78,6) 0,80 46 (82,1) 10 (17,9) 1,00

III+IV+V 10 (25,0) 30 (75,0) 33 (82,5) 7 (17,5)

Estágio TNM

0+I+II 16 (27,6) 42 (72,4) 0,34 47 (81,0) 11 (19,0) 0,79

III+IV 8 (17,8) 37 (82,2) 38 (84,4) 7 (15,6)


84

Tabela 31. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A em



Genótipos PRKCA c.205+407G>A

Variável GG

n (%)

GA+AA

n (%)

Valor

de P

GG+GA

n (%)

AA

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 14 (23,7) 45 (76,3) 1,00 48 (81,4) 11 (18,6) 0,19

Membros 7 (22,6) 24 (77,4) 21 (67,7) 10 (32,3)

Breslow

>1,5mm 14 (28,6) 35 (71,4) 0,63 43 (87,8) 6 (12,2) 0,04

≤1,5mm 10 (23,3) 33 (76,7) 30 (69,8) 13 (30,2)

Clark

I+II 12 (21,4) 44 (78,6) 0,35 40 (71,4) 16 (28,6) 0,08

III+IV+V 12 (30,0) 28 (70,0) 35 (87,5) 5 (12,5)

Estágio TNM

0+I+II 14 (24,1) 44 (75,9) 1,00 43 (74,1) 15 (25,9) 0,35

III+IV 10 (22,2) 35 (77,8) 37 (82,2) 8 (17,8)

Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco; a diferença entre grupos

está destacada

85

Tabela 32. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G em



Genótipos PRKCA c.288+33994A>G

Variável AA

n (%)

AG+GG

n (%)

Valor

de P

AA+AG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 32 (54,2) 27 (45,8) 0,82 55 (93,2) 4 (6,8) 0,65

Membros 16 (51,6) 15 (48,4) 30 (96,8) 1 (3,2)

Breslow

>1,5mm 26 (53,1) 23 (46,9) 1,00 46 (93,9) 3 (6,1) 1,00

≤1,5mm 23 (53,5) 20 (46,5) 41 (95,3) 2 (4,7)

Clark

I+II 30 (53,6) 26 (46,4) 1,00 53 (94,6) 3 (5,4) 1,00

III+IV+V 21 (52,5) 19 (47,5) 38 (95,0) 2 (5,0)

Estágio TNM

0+I+II 31 (53,4) 27 (46,6) 0,69 54 (93,1) 4 (6,9) 0,38

III+IV 26 (57,8) 19 (42,2) 44 (97,8) 1 (2,2)


86

Tabela 33. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G em



Genótipos CALM2 g.47384601A>G

Variável AA

n (%)

AG+GG

n (%)

Valor

de P

AA+AG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 11 (18,6) 48 (81,4) 1,00 41 (69,5) 18 (30,5) 0,48

Membros 6 (19,4) 25 (80,6) 19 (61,3) 12 (38,7)

Breslow

>1,5mm 11 (22,4) 38 (77,6) 0,79 37 (75,5) 12 (24,5) 0,25

≤1,5mm 8 (18,6) 35 (81,4) 27 (62,8) 16 (37,2)

Clark

I+II 11 (19,6) 45 (80,4) 1,00 37 (66,1) 19 (33,9) 0,65

III+IV+V 8 (20,0) 32 (80,0) 29 (72,5) 11 (27,5)

Estágio TNM

0+I+II 11 (19,0) 47 (81,0) 1,00 41 (70,7) 17 (29,3) 0,52

III+IV 8 (17,8) 37 (82,2) 29 (64,4) 16 (35,6)


87

Tabela 34. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A em



Genótipos CREB1 c.261+1161G>A

Variável GG

n (%)

GA+AA

n (%)

Valor

de P

GG+GA

n (%)

AA

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 17 (28,8) 42 (71,2) 0,62 51 (86,4) 8 (13,6) 0,05

Membros 7 (22,6) 24 (77,4) 21 (67,7) 10 (32,3)

Breslow

>1,5mm 12 (24,5) 37 (75,5) 0,48 37 (75,5) 12 (24,5) 0,29

≤1,5mm 14 (32,6) 29 (67,4) 37 (86,0) 6 (14,0)

Clark

I+II 17 (30,4) 39 (69,6) 0,48 46 (82,1) 10 (17,9) 0,45

III+IV+V 9 (22,5) 31 (77,5) 30 (75,0) 10 (25,0)

Estágio TNM

0+I+II 17 (29,3) 41 (70,7) 0,65 47 (81,0) 11 (19,0) 1,00

III+IV 11 (24,4) 34 (75,6) 36 (80,0) 9 (20,0)


88




Genótipos MITF c.635-325A>G

Variável AA

n (%)

AG+GG

n (%)

Valor

de P

AA+AG

n (%)

GG

n (%)

Valor

de P

Localização

Axial 17 (28,8) 42 (71,2) 0,24 44 (74,6) 15 (25,4) 1,00

Membros 13 (41,9) 18 (58,1) 24 (77,4) 7 (22,6)

Breslow

>1,5mm 21 (42,9) 28 (57,1) 0,07 39 (79,6) 10 (20,4) 0,33

≤1,5mm 10 (23,3) 33 (76,7) 30 (69,8) 13 (30,2)

Clark

I+II 15 (26,8) 41 (73,2) 0,12 38 (67,9) 18 (32,1) 0,06

III+IV+V 17 (42,5) 23 (57,5) 34 (85,0) 6 (15,0)

Estágio TNM

0+I+II 18 (31,0) 40 (69,0) 0,53 41 (70,7) 17 (29,3) 0,24

III+IV 17 (37,8) 28 (62,2) 37 (82,2) 8 (17,4)


Frequências similares dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, GNAL1

g.80130766C>, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA

c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-

325A>G foram observadas em pacientes com MC estratificados por aspectos do tumor.

A frequência dos genótipo TT ou TC do KIT c.67+12766T>C foi maior em

pacientes com tumores localizados nos membros do que em pacientes com tumores axiais.

A frequência do genótipo AA do SNP PRKCA c.205+407G>A foi maior em pacientes com

tumores menos espessos (Breslow < 1,5 mm) do que em pacientes com tumores mais

profundos (Breslow > 1,5 mm).

As frequências diferenciadas dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT



g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G, combinados dois a

89

dois, em pacientes com MC estratificados pelos aspectos do tumor estão apresentados na

Tabela 36.

Tabela 36. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos ADCY3

c.675+9196T>G, PRKCA c.205+407G>A, CREB1 c.261+1161G>A e MITF

c.635-325A>G, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma

cutâneo estratificados por localização do tumor

SNPs combinados Localização do tumor Valor de P

ADCY3 + CREB1 Axial n (%) Membros n (%)

TT + AA 2 (5,6) 34 (94,4) 0,04

TG+GG + GA+GG 6 (28,6) 15 (71,4)

PRKCA1 + MITF

AA + AA 2 (5,7) 5 (27,8) 0,03

GG+GA + GG+GA 33 (94,3) 13 (72,2)

SNP: polimorfismo gênico de base única; PRKCA1: se refere ao SNP PRKCA

c.205+407G>A; as diferenças entre grupos estão destacadas

Os genótipos combinados ADCY3 TT +CREB1 AA e PRKCA1 AA MITF AA foram

mais comuns em pacientes com tumores localizados nos membros do que em pacientes

com tumores axiais.

11. Polimorfismos em genes da melanogênese e prognóstico dos pacientes

11.1. Impacto de aspectos clinicopatológicos no prognóstico dos pacientes

Foram avaliados 86 pacientes para a SLP e a SG. A mediana de seguimento desses

pacientes foi de 43 meses (variação: 6-184). Ao final do estudo, 62 (72%) pacientes

estavam vivos, sendo 57 (92%) vivo sem a doença e 5 (8%) vivo com a doença; 24 (28%)

pacientes foram a óbito, sendo 4 (17%) óbitos sem a doença e 20 (83%) óbitos devido a

complicações do MC.

Aos 60 meses de observação, menor SLP foi observada em pacientes com

espessura de Breslow ≥ 1,5 mm (39,8% versus 90,4%, P< 0,001), nível de Clark III, IV ou

V (34,3% versus 84,2%, P< 0,001) e estágio III ou IV do tumor (29,1% versus 82,4%, P<

0,001) (Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 7).

90

Figura 7. Sobrevida livre de progressão de pacientes com melanoma cutâneo estratificados

por espessuras de Breslow (A), níveis de Clark (B) e estágios clínicos (C)

(Estimativas de Kaplan-Meier)

A SG foi menor em pacientes com idade >54 anos (66,8% versus 89,4%, P=

0,001), do sexo masculino (68,7% versus 89,8%, P= 0,001), com tumor com espessura de

Breslow ≥ 1,5 mm (63,6% versus 96,4%, P= 0,001), com nível de Clark III, IV ou V

(63,4% versus 92,3%, P= 0,001) e tumor nos estágio III ou IV (57,2% versus 90,9%, P<

0,001) aos 60 meses de observação (Estimativa de Kapan-Meier; Figura 8).

n= 39

n= 47

n= 54

n= 32

n= 51

n= 35

91

Figura 8. Sobrevida global de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade

mediana (A), sexo (B), espessuras de Breslow (C), níveis de Clark (D) e estágios

do tumor (E) (Estimativas de Kaplan-Meier)

O fototipo cutaneo, a cor dos olhos e dos cabelos, a presença de efélides e nevos, o

tipo de exposição solar e a localização do tumor não alteraram a SLP e a SG dos pacientes

com MC (Estimativas de Kaplan-Meier).

Os impactos dos aspectos clínicos e biológicos do tumor na SLP e SG em análise

univariada de Cox estão apresentados na Tabela 37.

n= 40

n= 46

n= 33

n= 53

n= 54

n= 32

n= 39

n= 47

n= 51

n= 35

92

Tabela 37. Impacto des aspectos clínicos de pacientes e biológicos do tumor na sobrevida

livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com melanoma cutâneo

na análise univariada de Cox

Características n/N SLP

RR (IC 95%)

Valor

de P n/N

SG

RR (IC 95%)

Valor

de P

Idade

<54 anos 16/40 Referência 0,66 5/40 Referência 0,003

>54 anos 20/46 1,15 (0,59-2,23) 19/46 4,45 (1,64-12,02)

Sexo

Feminino 13/33 Referência 0,77 4/33 Referência 0,02

Masculino 23/53 1,10 (0,55-2,18) 20/53 3,44 (1,17-10,10)

Fototipo

I+II 22/56 1,11 (0,56-2,22) 0,74 13/56 1,63 (0,72-3,70) 0,24

III+IV+V+VI 14/30 Referência 11/30 Referência

Cor olhos

Claros 12/32 1,03 (0,51-2,09) 0,91 9/32 1,02 (0,44-2,37) 0,95

Não claros 24/54 Referência 15/54 Referência

Cor cabelos

Claros 9/25 1,15 (0,53-2,47) 0,71 8/25 1,14 (0,48-2,72) 0,75

Não claros 27/61 Referência 16/61 Referência

Efélides

Nenhuma/poucas 13/32 Referência 0,63 6/32 Referência 0,31

Muitas 23/54 1,18 (0,58-2,37) 18/54 1,60 (0,63-4,04)

Nevos

<50 13/35 Referência 0,42 12/35 Referência 0,36

>50 23/51 1,32 (0,66-2,61) 12/51 1,45 (0,65-3,23)

Exposição solar

Crônica 14/41 Referência 0,70 12/41 Referência 0,94

Intermitente/nenhuma 12/30 1,26 (0,37-4,23) 8/30 1,03 (0,42-2,53)

Localização do tumor

Axial 25/57 1,12 (0,53-2,34) 0,75 19/57 2,32 (0,79-6,86) 0,12

Membros 10/28 Referência 4/28 Referência

Breslow

<1,5 mm 3/39 Referência <0,001 2/39 Referência 0,004

≥1,5 mm 33/47 11,44 (3,45-37,91) 22/47 8,47 (1,95-36,93)

Clark

I+II 13/54 Referência <0,001 9/54 Referência 0,002

III+IV+V 23/32 6,05 (2,68-13,64) 15/32 4,86 (1,75-13,47)

Estágio clínico TNM

I+II 8/51 Referência <0,001 6/51 Referência 0,001

III+IV 28/35 7,98 (3,61-17,60) 18/35 4,97 (1,92-12,34)

N: número de pacientes; SLP: sobrevida livre de progressão; SG: sobrevida global; RR:

risco relativo; IC: intervalo de confiança; Valores de P< 0,05 estão destacados

93

Os pacientes com tumores com espessura de Breslow maior 1,5 mm, nível de Clark

III, IV ou V e estágio III ou IV estiveram sob riscos 11,44, 6,05 e 7,98 vezes maiores de

apresentar progressão do tumor do que os demais pacientes, respectivamente (Análise

univariada de Cox). A espessura de Breslow (P= 0,002) e o estágio clínico (P= 0,001)

também influenciaram a SLP em análise multivariada de Cox; os pacientes com tumores

com espessura de Breslow maior 1,5 mm e estágio III ou IV estiveram sob riscos 6,81 (IC

95%: 1,97-23,52) e 3,92 (IC 95%: 1,69-9,05) vezes maiores de apresentar progressão do

tumor do que os demais pacientes, respectivamente

Os pacientes com idade maior 54 anos, do sexo masculino, com tumor com

espessura de Breslow maior 1,5mm, nível de Clark III, IV ou V e estágio clínico III ou IV

estiveram sob riscos 4,45, 3,44, 8,47, 4,86 e 4,97 maiores de evoluírem para óbito do os

demais pacientes, respectivamente (Análise univariada de Cox). A idade (P= 0,04) e a

espessura de Breslow

(P= 0,02) também influenciaram a SG em multivariada de Cox; pacientes com idade maior

54 anos e com tumor com espessura de Breslow maior 1,5 mm estiveram sob riscos 5,90

(IC 95%: 1,26-27,54) e 2,93 (IC 95%: 1,05-8,20) de evoluir para o óbito do que os demais.

11.2. Impacto dos polimorfismos gênicos no prognóstico dos pacientes

Aos 60 meses de observação, apenas os pacientes com o genótipo AA do SNP

MITF

c.635-325A>G apresentaram menor SLP (44,5% versus 68,2%, P= 0,007) e menor SG

(67,7% versus 81,7%, P= 0,009 do que os pacientes com os outros genótipos do gene

(Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 9).

94

Figura 9. Representação gráfica das curvas de sobrevida livre de progressão (A) e sobrevida

global (B) de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por genótipos do

polimorfismo MITF c.635-325A>G (Estimativas de Kaplan-Meier)

A SLP e a SG dos pacientes com MC não foram influenciadas pelos SNPs WNT8B

c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G,

PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2

.47384601A>G e CREB1 c.261+1161G>A isolados (Estimativas de Kaplan-Meier).

Os impactos dos SNPs na SLP e SG dos pacientes com MC em análise univariada

de Cox estão apresentados na Tabela 38.

n= 57

n= 29

n= 57

n= 29

95

Tabela 38. Impacto dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1

g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G e PLCB1 g.8908966C>A na

sobrevida livre de progressão e sobrevida global de pacientes com


Polimorfismos n/N SLP RR

(IC 95%)

Valor

de P n/N

SG RR

(IC 95%)

Valor

de P

WNT8B c.-101T>C

TT 19/44 10/44

TC+CC 17/42 1,13 (0,58-2,18) 0,70 14/42 1,40 (0,62-3,17) 0,41

TT+TC 36/84 24/84

CC 0/2 21,55 (NC) 0,45 0/82 21,26 (NC) 0,56

KIT c.67+12766T>C

TT 11/33 10/33

TC+CC 25/53 1,51 (0,74-30,7) 0,25 14/53 1,35 (0,60-3,06) 0,46

TT+TC 30/73 19/73

CC 6/13 1,25 (0,52-3,01) 0,61 5/13 1,92 (0,71-5,17) 0,19

GNAI1 g.80130766C>T

CC 3/5 2/5

CT+TT 33/81 1,05 (0,31-3,47) 0,93 22/81 1,03 (0,24-4,43) 0,96

CC+CT 13/33 10/33

TT 23/53 1,24 (0,63-2,47) 0,52 14/53 1,03 (0,45-2,33) 0,94

ADCY3 c.675+9196T>G

TT 13/31 8/31

TG+GG 23/55 1,05 (0,53-2,09) 0,86 16/55 1,16 (0,50-2,73) 0,71

TT+TG 32/79 21/79

GG 4/7 1,47 (0,52-4,18) 0,46 3/7 1,80 (0,53-6,07) 0,33

PLCB1 g.8908966C>A

CC 8/19 4/19

CA+AA 28/67 1,04 (0,47-2,28) 0,92 20/67 1,60 (0,54-4,72) 0,38

CC+CA 27/68 17/68

AA 9/18 1,78 (0,83-3,82) 0,13 7/18 1,97 (0,81-4,77) 0,13

PRKCA c.205+407G>A

GG 6/21 7/21

GA+AA 30/65 1,89 (0,78-4,56) 0,15 17/65 1,13 (0,46-2,73) 0,78

GG+GA 31/67 21/67

AA 5/19 2,08 (0,81-5,37) 0,12 3/19 2,02 (0,60-6,78) 0,25


AA 21/57 13/47

AG+GG 15/39 1,32 (0,68-2,58) 0,40 11/39 1,05 (0,47-2,36) 0,89

AA+AG 25/82 23/82

GG ¼ 2,14 (0,29-15,70) 0,45 1/4 1,24 (0,16-9,23) 0,83

CALM2 g.47384601A>G

AA 8/17 5/17

AG+GG 28/69 1,30 (0,59-2,86) 0,51 19/69 1,08 (0,40-2,91) 0,87

AA+AG 25/58 18/58

GG 11/28 1,01 (0,49-2,09) 0,96 6/28 1,21 (0,47-3,08) 0,68

CREB1 c.261+1161G>A

GG 8/24 6/24

GA+AA 28/62 1,53 (0,69-3,37) 0,28 18/62 1,13 (0,44-2,86) 0,78

GG+GA 29/70 20/70

AA 7/16 1,34 (0,58-3,07) 0,48 4/16 1,05 (0,35-3,10) 0,92

96

MITF c.635-325A>G

AA 2,40 (1,24-4,65) 0,009 2,85 (1,25-6,34) 0,01

AG+GG

AA+AG

GG 2,23 (0,86-5,75) 0,09 2,37 (0,70-7,97) 0,16

SLP: sobrevida livre de progressão; SG: sobrevida global; RR: risco relativo;

IC: intervalo de confiança; Valores de P< 0,05 estão destacados

Apenas os pacientes com o genótipo AA do SNP MITF c.635-325A>G estiveram

sob riscos 2,40 e 2,85 vezes maiores de apresentar progressão da doença e de evoluir para

o óbito do que os pacientes com os demais genótipos do gene, respectivamente (análise

univariada de Cox). Todos os dez SNPs avaliados não influenciaram a SLP e SG dos

pacientes com MC após análise multivariada de Cox.

Aos 60 meses de observação, os pacientes com os genótipos combinados ADCY3

TT + MITF AA (22,2% versus 61,3%, P= 0,006), GNAI1 TT + PLCB1 AA (36,4% versus

63,9%, P= 0,04), GNAI1 TT + MITF AA (41,6% versus 73,2%, P= 0,01) e CALM2 GG +

MITF AA (45,0% versus 64,1%, P= 0,04) apresentaram menor SLP do que os demais

pacientes (Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 10). A SG foi menor em pacientes com os

genótipos combinados dos SNPs KIT TT + MITF AA (62,2% versus 87,3%, P= 0,02) e

ADCY3 TT + MITF AA (44,4% versus 72,5%, P= 0,006) do que nos demais pacientes

(Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 11).

97

Figura 10. Sobrevida livre de progressão de pacientes com melanoma cutâneo

estratificados por genótipos combinados dos polimorfismos (A) ADCY3

c.675+9196T>G + MITF c.635-325A>G, (B) GNAI1 g.80130766C>T +

PLCB1 g.8908966C>A, (C) GNAI1 g.80130766C>T + MITF c.635-325A>G e

(D) CALM g.47384601A>G + MITF c.635-325A>G (Estimativas de Kaplan-

Meier)

n= 35

n= 9

n= 26

n= 11

n= 21

n= 17

n= 37

n= 8

98

Figura 11. Sobrevida global de pacientes com melanoma cutâneo de acordo com os

genótipos combinados dos polimorfismos (A) KIT c.67+12766T>C + MITF

c.635-325A>G e (B) ADCY3 c.675+9196T>G + MITF c.635-325A>G

(Estimativas de Kaplan-Meier)

Os impactos dos SNPs combinados na SLP e na SG de pacientes com MC na

análise univariada de Cox estão apresentados na Tabela 39.

n= 33

n= 9

n= 35

n= 9

99

Tabela 39. Associação dos polimorfismos de genes da melanogênese, combinados dois a

dois, na sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com


Polimorfismos

combinados n/N

SLP RR

(IC 95%)

Valor

de P n/N

SG RR

(IC 95%)

Valor

de P

ADCY3 + MITF

TG+GG + AG+GG 13/35 9/35

TT + AA 7/9 3,53 (1,35-9,19) 0,01 6/9 3,84 (1,35-10,89) 0,01

GNAI1 + PLCB1

CC+CT + CC+CA 11/26 7/26

TT+AA 7/11 2,67 (1,00-7,23) 0,04 4/11 1,68 (0,48-5,83) 0,41

GNAI1 + MITF

CC+CT + AG+GG 6/21 3/21

TT + AA 10/17 3,58 (1,21-10,60) 0,02 6/17 3,33 (0,82-13,54) 0,09

CALM + MITF

AA+AG + AG+GG 13/37 8/37

GG + AA 5/8 2,87 (1,00-8,25) 0,04 3/8 3,05 (0,75-12,33) 0,11

KIT + MITF

TC+CC + AG+GG 13/33 5/33

TT + AA 5/9 2,04 (0,71-5,81) 0,18 4/9 4,07 (1,08-15,35) 0,03

N: número de pacientes; SLP: sobrevida livre de progressão; SG: sobrevida global; RR: risco

relativo; IC: intervalo de confiança; Valores de P< 0,05 estão destacados

Os pacientes com o genótipo combinado ADCY3 TT + MITF AA apresentaram

riscos 3,53 e 3,84 vezes maiores de apresentarem progressão da doença e evolução para o

óbito do que os pacientes com os demais genótipos dos genes, respectivamente. Os

pacientes com os genótipos combinados GNAI1 TT + PLCB1 AA, GNAI1 TT + MITF AA

e CALM GG + MITF AA estiveram sob riscos 2,67, 3,58 e 2,87 vezes maiores de

apresentarem progressão da doença do que pacientes com os demais genótipos combinados

dos genes. Os pacientes com o genótipo combinado KIT TT + MITF AA apresentaram

riscos 2,04 e 4,07 vezes maiores de apresentarem progressão da doença e evolução para o

óbito do que os pacientes com os demais genótipos dos genes, respectivamente (Análise

univariada de Cox).

Apenas o genótipo combinado influenciou a SLP na análise multivariada de Cox

(P= 0,01); pacientes com o genótipo GNAI1 TT + PLCB1 AA estiveram sob risco 18,53

(3,38-101,35) vezes maior de apresentar progressão da doença do que os pacientes com os

demais genótipos combinados dos genes.

100

12. Resumo dos resultados principais obtidos no estudo

As principais associações dos SNPs com o risco de ocorrência, aspectos

clinicopatológicos do tumor e com a sobrevida de pacientes com MC encontradas no

presente estudo estão apresentadas na Tabela 40.

Tabela 40. Resumos dos principais resultados obtidos dos dez polimorfismos da via da

melanogênese isolados no risco de ocorrência, dados clínicopatológicos e

prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo

SNPs Resumo dos resultados

WNT8B T>C • Genótipos TC ou TC+CC estiveram associados com aumento do risco de MC

KIT T>C

• Genótipos TT ou TT+TC estiveram associados com aumento do risco de MC

• Pacientes com os genótipos TT+TC foram mais frequentes tumores localizados nos

membros

GNAI1 C>T • Genótipos TT ou CT+TT estiveram associados com aumento do risco de MC

ADCY3 T>G • Genótipos TT ou TT+TG estiveram associados com aumento do risco de MC

• A frequência dos genótipos TT+TG foi maior em pacientes com mais de 20 nevos

PLCB1 C>A • Genótipos CA ou CA+AA estiveram associados com aumento do risco de MC

PRKCA G>A

• Genótipos AA ou CA+AA estiveram associados com aumento do risco de MC

• A frequência do genótipo AA foi maior em pacientes com tumores mais finos

(Breslow <1,5mm)

PRKCA A>G • Genótipo AG esteve associado com aumento do risco de MC

CALM2 A>G • Genótipos AG ou GG isolado ou AG+GG estiveram associados com aumento do

risco de MC

CREB1 G>A • Genótipos GA ou AA isolado ou GA+AA estiveram associados com aumento do

risco de MC

MITF A>G

• Genótipo AA foi associado com aumento do risco de MC

• Pacientes com o genótipo AA estiveram pior sobrevida livre de progressão e

sobrevida global na análise de Kaplan-Meier e após análise univariada de Cox, sendo

características de prognóstico desfavorável.

101

As principais associações dos SNPs combinados com o risco de ocorrência,

aspectos clinicopatológicos do tumor e com a sobrevida de pacientes com MC encontradas

no presente estudo estão apresentadas na Tabela 41.

Tabela 41. Resumos dos principais resultados obtidos dos dez polimorfismos da via da

melanogênese combinados no risco de ocorrência, nos dados

clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo

SNPs combinados Resumo dos resultados

WNT8B + PRKCA1 Genótipos CC+TC + AA+GA foram associados com aumento do risco

WNT8B + PRKCA2 Genótipos CC+CT + AA+GA foram associados com aumento do risco

WNT8B + MITF Genótipos CC+CT + AA+GA foram associados com aumento do risco

KIT + PRKCA1 Genótipos TT+TC + AA+GA foram associados com aumento de risco

KIT + PRKCA2 Genótipos TT+TC + AA+GA foram associados com aumento de risco

KIT + MITF Genótipos TT + AA foram associados com aumento do risco e pacientes com

esse genótipo estiveram associados com pior sobrevida global

GNAI1 + PLCB1

Genótipos TT+TC + AA+CA foram associados com aumento de risco

Pacientes com os genótipos TT+AA tiveram pior sobrevida livre de

progressão

GNAI1 + MITF

Genótipos TT + AA foram associados com aumento do risco

A frequência desses genótipos foi maior em pacientes com fototipo I+II e foi

associado com pior sobrevida livre de progressão

ADCY3 + WNT8B A frequência dos genótipos TT+TG + CC+CT foi maior em pacientes com a

presença de mais de 50 nevos

ADCY3 + CREB1

Genótipos TT+TG + AA+GA foram associados com aumento de risco

A frequência dos genótipos combinados TT + AA foi maior em pacientes

com olhos e cabelos claros

ADCY3 + PRKCA1

Genótipos TT+TG + AA+AG foram associados com aumento de risco

A frequência dos genótipos TT + AA foi maior em pacientes com a presença

de mais de 50 nevos

ADCY3 + MITF

Genótipos TT+TG + AA+AG foram associados com aumento de risco

A frequência dos genótipos TT + AA foi maior em pacientes com cabelos

claros

Os pacientes com os genótipos TT+AA apresentaram pior sobrevida livre de

progressão e global

102

PRKCA1 +

PRKCA2

Genótipos AA+GA + GG+AG foram associados com aumento de risco

A frequência desses genótipos foi maior em pacientes com presença de

efélides

PRKCA2 + PLCB1

Genótipos GG+AG + AA+CA foram associados com aumento de risco

A frequência desses genótipos também foi maior em pacientes sem a

presença efélides

PRKCA2 + MITF Genótipos GG+AG + AA+GA foram associados com aumento de risco

CALM2 + CREB1 Genótipos GG + AA foram associados com aumento do risco

CALM2 + PRKCA1 Genótipos GG+AG + AA+GA foram associados com aumento de risco

CALM2 + PRKCA2 Genótipos GG+AG + GG+AG foram associados com aumento de risco

CALM2 + PLCB1 Genótipos GG+AG + AA+CA foram associados com aumento de risco

CALM2 + MITF Pacientes com os genótipos GG+AA tiveram pior sobrevida livre de

progressão

CREB1 + WNT8B Genótipos AA+GA + CC+TC foram associados com aumento de risco

CREB1 + PRKCA2 Genótipos AA+GA + GG+AG foram associados com aumento de risco

CREB1 + PLCB1 Genótipos AA+GA + AA+CA foram associados com aumento de risco

CREB1 + MITF

Genótipos AA+GA + AA+GA foram associados com aumento de risco

A frequência do genótipo AA + AA foi maior em pacientes com cabelos

claros

103

DISCUSSÃO

A incidência do MC aumenta rapidamente, superando qualquer outro tipo de câncer

(Schaffer et al., 2004; Niezgoda et al., 2015). O MC é um tumor com altas taxas de

mortalidade devido ao seu potencial metastático e ausência de resposta ao tratamento.

Além disso, vários de seus aspectos, como a etiologia e a fisiopatologia, ainda estão por

serem determinados com exatidão, o que em nossa opinião, justificou a realização desse

estudo.

O rápido crescimento da incidência do MC está possivelmente relacionado à

combinação dos seguintes fatores: maior exposição da pele aos raios UV da luz solar, à

depleção da camada de ozônio e aumento da longevidade com deficiências nos sistemas

associados com a carcinogênese (Rauterberg & Jung, 1993; Leiter et al., 2014).

Observamos que a idade mediana de nossos pacientes foi de 54 anos, semelhante a

de estudo prévio conduzidos em brasileiros (Naser, 2011) e as de estudos conduzidos em

outros países (Leiter et al., 2014).

A distribuição dos nossos pacientes por sexo foi semelhante: números similares de

homens e mulheres foram acometidos pelo tumor em nossa amostra. O tumor

habitualmente é mais agressivo em homens (Mackie et al., 2009). Já o aumento da

incidência do tumor em mulheres parece ter relação com hormônios reprodutivos, que

determinam aumento de pigmentação da pele (Lea et al., 2007).

Observamos que a maior parte dos nossos pacientes apresentou fototipo cutâneo

I+II e olhos e cabelos escuros. Entre as características fenotípicas mais comuns de

portadores de MC estão a de pele clara, olhos claros (verdes e azuis) e cabelos claros (loiro

e ruivo) (Gandini et al., 2005). Indivíduos com perfil “claro” para pele, olhos e cabelos,

são considerados mais fotossensíveis do que indivíduos com perfil “não claro” devido a

menor quantidade de melanina. Há ainda um padrão conhecido de inter-relação entre essas

características, ou seja, indivíduos ruivos possuem tendência para a presença de efélides e

olhos claros, enquanto indivíduos com cabelos escuros, raramente possuem efélides e

frequentemente possuem olhos escuros. O fator de risco mais importante relacionado com

o surgimento do MC é a cor da pele, uma vez que está relacionada com deficiência na

capacidade de reparar danos dos raios UV do sol. Vale comentar também, que olhos e

cabelos claros são pouco frequentes em indivíduos de nossa população, na qual europeus

foram miscigenados com ameríndios, asiáticos e negróides (Pena et al., 2011; Bakos et al.,

2013). Características como presença de efélides (em mais que uma parte do corpo), nevos

104

(mais que 25 nevos pelo corpo) e exposição solar crônica aumentam o risco de MC

possuem forte impacto no surgimento do MC (Bakos et al., 2013).

Observamos que os nossos casos apresentaram tumores predominantemente axiais

(cabeça, face, pescoço e tronco), com índices de Breslow maiores que 1,5 milímetros,

tumores com níveis de Clark I+II+III (restritos a epiderme) e estágios iniciais do tumor,

como previamente descrito (Niezgoda et al., 2015). Os aspectos do tumor estão

intimamente relacionadas com o prognóstico dos pacientes, uma vez que lesões iniciais

foram associadas com o melhor prognóstico e maior sobrevida dos pacientes (Berrocal et

al., 2014).

O MC está sendo extensivamente estudado nos últimos anos, particularmente em

suas características genéticas, por meio de métodos de identificação de mutações

adquiridas em oncogenes como BRAF, RAS, NF1 e KIT que possam auxiliar no

prognóstico e terapêutica de pacientes com o tumor (Cancer Genome Atlas Network,

2015).

Atualmente, os polimorfismos genéticos são considerados fatores importantes para

a predisposição herdada de um indivíduo a tumores, incluindo o MC (Bishop et al., 2009;

Amos et al., 2011; Barret et al., 2011; Macgregor et al., 2011; Iles et al., 2013; Law et al.,

2015). Essas variações genéticas determinam a capacidade distinta de cada indivíduo

metabolizar carcinógenos, controlar o mecanismo relacionados com a carcinogênese e

outros mecanismos fisiológicos, como a melanogênese. Assim, a constituição genética

pode predispor um indivíduo ao câncer.

Os SNPs mais estudados em MC foram aqueles localizados em genes que

codificam enzimas relacionados no reparo de DNA (Mocellin et al., 2009, Oliveira et al.,

2013), na apoptose (Jiang et al., 2011; Oliveira et al., 2014), ciclo celular (Udayakumar &

Tsao, 2009) e na síntese de melanina (Chatziasinou et al., 2011). Ainda, é possível que

outros SNPs envolvidos na via da melanogênese, na síntese de fatores de crescimento e

citocinas, hormônios, neuropeptídeos e neurotransmissores associados ao MC (Wellbrock

et al., 2015) possam ter papéis importantes na origem do tumor.

A GELE, baseada em microarranjos de DNA, possibilitou analisar milhares de

polimorfismos genéticos em um único estudo. A GELE proporciona a varredura de

diversos marcadores genéticos, localizados em uma única lâmina com microarranjos de

DNA, que podem estar relacionados com o surgimento e a agressividade de tumores. Além

disso, ela proporciona maior rapidez e confiabilidade para a avaliação de SNPs quando

comparada com métodos tradicionais, como a PCR-RFLP e PCR em tempo real.

105

Atualmente, o procedimento de GELE só é possível devido a avanços na área de

bioinformática. As sequências ordenadas de regras e cálculos determinados por algoritmos

computacionais possibilitam avaliar lâminas com microarranjos de DNA que possuem alta

densidade de marcadores genéticos em um pequeno espaço físico (Carvalho et al., 2010).

O algoritmo de análise da GELE de SNPs utilizado em nosso estudo foi o crlmm,

disponível no programa computacional Bioconductor, cujo código fonte está disponível

para qualquer pesquisador, sem custo. A sequência básica de regras deste algoritmo que

possibilita a genotipagem de SNPs de microarranjos de DNA consiste na normalização e

sumarização das intensidades das sondas contidas nas lâminas de microarranjos seguido da

genotipagem. O algoritmo crlmm foi descrito por possuir uma melhor acurácia quando

comparado com o algoritmo brlmm, descrito previamente (Carvalho et al., 2010).

Observamos que as frequências dos genótipos de 12.994 SNPs foram distintas entre

pacientes com MC e controles. Mais de 50% dos SNPs identificados estavam localizados

em regiões regulatórias da expressão gênica e a outra metade esteve localizada em regiões

de íntron. Aproximadamente 1% deles estavam em regiões que codificam proteínas. Esses

números foram considerados adequados, uma vez que foi observado em estudos prévios

que regiões regulatórias da expressão gênica são altamente polimórficas (Zhang et al.,

2007).

A seguir, agrupamos os SNPs considerando a função das proteínas codificadas

pelos genes que os albergam, integrando a via da melanogênese. Selecionamos psete SNPs

localizados em regiões intrônicas e três localizados em regiões regulatórias para a

continuidade do estudo.

Os SNPs localizados nos íntrons podem alterar o mecanismo de “splicing”

alternativo, que consiste na remoção dos íntrons e a união dos éxons a fim de síntetizar o

RNA mensageiro que será traduzido em proteína. Sua ocorrência permite que informações

específicas de um único gene se modifiquem dependendo de sinais do ambiente, gerando

transcritos maduros distintos, e conferindo assim uma maior plasticidade à expressão

gênica. Esse mecanismo é um mecanismo natural que ocorre em células eucariotas,

determinando a biodiversidade de proteínas que podem ser codificadas pelo genoma.

Alterações causadas por SNPs em íntrons podem gerar novos sítios para ocorrência do

“splicing” resultando na alteração da sequência de leitura do RNA mensageiro, podendo

alterar a quantidade ou qualidade das proteínas codificadas (Pagani & Baralle, 2004). Já os

SNPs localizados nas regiões 3' e 5' não traduzidas do DNA (região regulatória) controlam

a expressão gênica por meio da capacidade de manter a estabilidade do RNA mensageiro,

106

além de possuírem informações de posicionamento do RNA mensageiro nos ribossomos

para o início da tradução da sequência de nucleotídeos para aminoácidos e proteínas

(Hollams et al., 2002; Chen et al., 2006).

Vale salientar que, até onde atinge o nosso conhecimento, não há descrições de

associações e das funções dos SNPs selecionados neste estudo com o MC.

As amostras de pacientes e controles estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg

para os lóci dos genes WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAL1 g.80130766C>T,

ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA

c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF

c.635-325A>G, o que sugere que a amostra de controles é representativa da nossa

população e que as frequências dos diferentes genótipos dos dez SNPs foram similares em

pacientes e controles.

O gene WNT8B está localizado no cromossomo 10q24, possui seis éxons,

transcreve um RNA mensageiro de 1.996 pares de bases (PB) e uma glicoproteína rica em

cisteína de

38 kDa. O WNT8B faz parte de uma família de genes que codifiam proteínas ligantes do

receptor Frizzled que desempenham papel fundamental na regulação e diferenciação e

desenvolvimento dos melanócitos (Bellei et al., 2011). Hiperativação da via Wnt está

associado com MC, além disso, a hiperexpressão do gene WNT foi associado à

potencialização da expressão do gene MITF, com consequente aumento da proliferação

celular em melanoma (Ploper et al., 2015). Foi descrito um SNP no gene WNT8B

localizado na região 5’ não traduzida c.-101T>C (rs3793772) e as frequências dos

genótipos observadas em diferentes populações étnicas foram 60% a 77% para o genótipo

selvagem TT, 24% a 36% para o genótipo heterozigoto TC e 1% a 12% para o genótipo

variante CC (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Observamos em nosso

estudo que os indivíduos que apresentaram os genótipos TC ou CC estiveram sob risco de

cerca de 2,5 vezes maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os demais

genótipos. É sabido que o aumento da expressão de genes da família Wnt foram associados

com maior agressividade e invasão em células de melanoma (Weeraratna et al., 2002).

Diante disso, nós hipotetizamos que a proteína codificada pelo alelo C esteja associada

com maior expressão do gene WNT8B.

O gene KIT está localizado no cromossomo 4q12 possui 21 éxons, transcreve um

RNA mensageiro de 5.190 pb e codifica uma proteína tirosina quinase que é um receptor

transmembrana de 110 kDA. Esta proteína está envolvida no processo de proliferação,

107

diferenciação e sobrevida de melanócitos (Wehrle-Haller et al., 2003). Alta exposição aos

raios UV ativam a via da melanogênese aumentando o número de melanócitos acelerando

a síntese de pigmento na derme que é mediado pela ativação do gene KIT. O KIT ativado

irá estimular a proteína quinase ativadora de mitose (MAP kinase) que terá como alvo o

gene MITF (Kawaguchi et al., 2001). A expressão do KIT pode ser modulada pela

hiperexpressão do gene PRKCA, por meio de modificações pós traducionais (Ogawa et al.,

1995). Além disso, a ativação desta proteína está associada com o crescimento tumoral

(Slipicevic & Herlyn, 2015). Por esta razão, esse gene tem sido foco de estudos para o

desenvolvimento de novas terapêuticas para portadores de MC (Berrocal et al., 2014). Foi

descrito um SNP no gene KIT, localizado no íntron c.67+12766T>C (rs2017472), e as

frequências dos genótipos observadas em diferentes populações étnicas foram de 10% a

67% para o genótipo selvagem TT, 30% a 54% para o genótipo heterozigoto TC e 2% a

24% para o genótipo variante (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010).

Observamos, em nosso estudo, que o genótipo TT foi associado com aumento de risco de

cerca de 5,5 vezes maior de ocorrência do MC do que indivíduos com os demais genótipos.

A frequência dos genótipo TT ou TC do KIT c.67+12766T>C foi maior em pacientes com

tumores localizados nos membros do que em pacientes com tumores axiais. Assim nós

hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo TT esteja associada com ganho de

atividade do gene.

O gene GNAI1 está localizado no cromossomo 7q21, possui nove éxons, transcreve

um RNA mensageiro de 3.181 pb e codifica uma proteína G heterodímero da classe α que

é um elemento crucial de múltiplas vias atuando como sinal de transdução, incluindo

ativação da cAMP e consequente aumento da proliferação celular (Gupta et al., 1992). As

proteínas G desempenham um papel importante na biologia dos melanócitos por estarem

acopladas ao receptor de membrana MC1R, especificamente na síntese de melanina

regulada pela ativação desse receptor que é estimulada pelo α-MSH (hormônio estimulador

dos melanócitos), que desencadeará a ativação do AMP cíclico e consequente ativação do

MITF (Valverde et al., 1995). O aumento da expressão do GNAI1 também ativa a

expressão de ADCY3 (Beavo et al., 1995). Foi descrito o SNP g.80130766C>T

(rs2079162) localizado na região upstream do gene GNAI, e as frequências observadas em

diferentes populações étnicas foram de 4% a 46% para o genótipo selvagem CC, 34% a

58% para o genótipo heterozigoto CT e 11% a 55% para o genótipo variante TT

(International Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Observamos, em nossa amostra, que os

indivíduos portadores do genótipo TT isolado ou do genótipo CT ou TT estiveram sob

108

risco de cerca de 6,5 vezes maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os

demais genótipos. Nós hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo TT esteja

associada com maior expressão do gene GNAI1.

O gene ADCY3 está localizado no cromossomo 2p23.3, possui 26 éxons, transcreve

um RNA mensageiro de 4.410 pb que será traduzido em uma proteína de 129 kDa. A

proteína codificada é uma adenilato ciclase tipo 3 que catalisa a formação da adenosina

monofosfato cíclico (AMPc), uma molécula importante na transdução de sinal e um

segundo mensageiro universal. A Os padrões de expressão desse gene é importante na

regulação do ciclo celular (Pierre et al., 2009). O aumento da expressão da proteína Adcy3

foi observado em linhagens de células de melanoma B16-F10 (Cho et al., 2000). O mesmo

foi observado por Hong et al., (2013) em tumores gástricos. No entanto, a superexpressão

da proteína adcy3 foi associada com promoção da tumorigênese, como aumento de

migração, invasão e proliferação celular devido a consequente ativação da via do gene

CREB. Foi descrito o SNP c.675+9196T>G (rs11900505) localizado no íntron do gene

ADCY3. As frequências observadas em diferentes populações étnicas foram de 10% a 44%

para o genótipo selvagem TT, 22% a 56% para o genótipo heterozigoto TG e 11% a 80%

para o genótipo variante GG (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010).

Observamos, em nosso estudo, que os indivíduos que apresentaram o genótipo selvagem

TT isolado ou o genótipo TT ou TG estiveram sob risco de cerca de 5 vezes maior de

ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os demais genótipos. A frequência dos

genótipos TT ou TG do SNP ADCY3 c.675+9196T>G foi maior em pacientes com número

de nevos maior que 20 do que naqueles com menor número de nevos. Assim, nós

hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo TT esteja associada com ganho de

atividade do gene.

O gene PLCB1 está localizado no cromossomo 20p12, possui 36 éxons, transcreve

um RNA mensageiro de 7.103 pb e codifica um proteína 138 kDa. A proteína codificada é

da classe das fosfolipases C que são dependentes de cálcio e a sua ativação é feita pela

proteína G da classe α. Ativação desse gene pode contribuir para a progressão do câncer

devido ao descontrole do ciclo celular e diferenciação celular (Fiume et al., 2012). Além

disso o gene PLCB1 pode atuar como ativador do gene PRKCA (Linger et al., 2008) Foi

descrito o SNP g.8908966C>A (rs4295085) localizado no íntron do gene PLCB1. As

frequências observadas em diferentes populações étnicas foram de 10% a 44% para o

genótipo selvagem CC, 37% a 51% para o genótipo heterozigoto CA e 15% a 38% para o

genótipo variante AA (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Nós observamos

109

que os indivíduos que apresentaram o genótipo heterozigoto CA isolado e o genótipo CA

ou AA estiveram sob risco de cerca de 2,5 vezes maior de ocorrência do MC do que

aqueles que apresentaram os demais genótipos. Nós hipotetizamos que a proteína

codificada pelo alelo A esteja associada com ganho de atividade.

O gene PRKCA (PKC-alfa) está localizado no cromossomo 17q24.2, possui 21

éxons, transcreve um RNA mensageiro de 8.787 pb e uma proteína citoplasmática de 77

kDa.

A proteína codificada é uma proteína kinase C-alfa dependente de cálcio que foi descrita

por participar em processos como adesão, transformação, ponto de checagem do ciclo

celular e controle celular (Timár et al., 1996). O papel da expressão dessa proteína ainda é

controverso em células de MC. Lahn et al. (2004) observaram que o aumento da expressão

da proteína esteve associado a proliferação e invasão de células de MC (Lahn & Sundell et

al., 2004; Krasagakis et al., 2004). Por outro lado, a ativação da proteína Pkc se dá pelo

AMPc, com consequente redução da expressão do gene MITF e inibição da melanogênese

(Bertolotto et al., 1998). Além disso, Ogawa et al. (1995) observaram que a inibição da

expressão do gene KIT pode ser modulada pelo aumento da expressão do gene PRKCA

(Ogawa et al., 1995). Dois SNPs foram descritos nesse gene o c.205+407G>A

(rs12601850) e c.288+33994A>G (rs1806448) ambos localizados em íntrons.

As frequências observadas em diferentes populações étnicas do SNP

c.205+407G>A foram de 17% a 53% para o genótipo selvagem GG, 38% a 60% para o

genótipo heterozigoto GA e 1% a 44% para o genótipo variante AA (International

Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Observamos, em nossa amostra, que os indivíduos

com o genótipo AA isolado e o genótipo CA ou AA estiveram sob risco de cerca de 4

vezes maior de ocorrência do MC do que índividuos com os demais genótipos. A

frequência do genótipo AA do SNP PRKCA c.205+407G>A foi maior em pacientes com

tumores menos espessos (Breslow < 1,5 mm) do que em pacientes com tumores mais

profundos (Breslow > 1,5 mm). Nós hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo

AA esteja associada com ganho de atividade do gene.

As frequências do SNP c.288+33994A>G em diferentes populações étnicas foram

de 53% a 93% para o genótipo selvagem GG, 6% a 50% para o genótipo heterozigoto AG

e 3% a 39% para o genótipo variante GG (International Hapmap 3 Consortium et al.,

2010). Observamos, em nossa amostra, que indivíduos com o genótipo hetozigoto AG

apresentaram risco duas vezes maior de ocorrência do MC do que indivíduos com os

demais genótipos.

110

O gene CALM2 está localizado no cromossomo 2p21, possui seis éxons, transcreve

um RNA mensageiro de 1.377 pb e codifica a proteína calmodulina de 17 kDa. A

calmodulina é ligante de cálcio e participa de vias relacionadas com a progressão do ciclo

celular, além de modular os níveis de cAMP ativando o gene ADCY3 (Knaup et al., 2004).

Umemura et al. (2014) verificaram que o CALM2 atuou como ativador do gene RAF-1,

promovendo a progressão do MC devido à maior proliferação, migração e metástases

(Umemura et al., 2014). Foi descrito o SNP g.47384601A>G (rs11884600) localizado na

região regulatória do gene CALM2. As frequências observadas em diferentes populações

étnicas foram de 3% a 84% para o genótipo selvagem AA, 14% a 54% para o genótipo

heterozigoto AG e 11% a 80% para o genótipo variante GG (International Hapmap 3

Consortium et al., 2010). Observamos, em nossa amostra, que os indivíduos que

apresentaram o genótipo GG ou AG isolados e o genótipo AG ou GG estiveram sob risco

de cerca de 5 vezes maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os

demais genótipos. Já a frequência dos genótipos AG ou GG do SNP CALM2

g.47384601A>G foi maior em mulheres do que em homens. Assim, nós hipotetizamos que

a proteína codificada pelo alelo G esteja associada com maior expressão.

O gene CREB1 está localizado no cromossomo 2q34, possui 15 éxons, transcreve

um RNA mensageiro de 9.752 pb que codifica a proteína ligante de DNA de 36 kDa. A

proteína Creb1 é a principal efetora da sinalização do AMPc atuando como fator de

transcrição para ativação do gene alvo da via da melanogênese o MITF. O CREB1 é crucial

para o aumento da expressão do MITF causando o desenvolvimento e diferenciação dos

melanócitos. (Rodriguez & Selaturi 2014). É sabido que o CREB1 está altamente expresso

em MC e está envolvido com o crecimento tumoral e metástase, além disso, regula a

expressão de diversos genes como o MMP2 que codifica proteína metalopreteínase 2

(Melnikova et al., 2006), o CYR61 que regula negativamente angiogênese e a induz a

apoptose (Dobroff et al., 2009) e o AP-2α que atua como um supressor tumoral

(Melnikova et al., 2010). Foi descrito o SNP nesse gene c.261+1161G>A (rs10932201)

localizado em íntron. As frequências observadas em diferentes populações étnicas foram

de 9% a 77% para o genótipo selvagem GG, 22% a 54% para o genótipo heterozigoto GA

e 4% a 50% para o genótipo variante AA (International Hapmap 3 Consortium et al.,

2010). Observamos, 3em nosso estudo, que os indivíduos que apresentaram o genótipo AA

e o genótipo GA isolados e o genótipo GA ou AA estiveram sob risco de cerca de 4 vezes

maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os demais genótipos. A

frequência dos genótipos GA ou AA foi também maior em pacientes com idade maior que

111

54 anos, do sexo masculino e com fototipo I ou II. Assim, hipotetizamos que a proteína

codificada pelo alelo A esteja associado com maior expressão do gene.

O gene MITF está localizado no cromossomo 3p14.2, possui 16 éxons, transcreve

um RNA mensageiro de 4.472 pb e codifica uma proteína de 59 kDa com a função de fator

de transcrição específico do melanócito. O MITF é o grande regulador dos melanócitos por

atuar na ativação de centenas de genes que desempenham funções importantes

relacionadas com o desenvolvimento, síntese de melanina, diferenciação e sobrevida

(Ploper et al., 2015). O MITF está altamente expresso em MC (Vachtenhein & Ondrusová,

2015), com isso conferindo características tumorais como aumento da diferenciação,

proliferação, migração e sobrevida celular (Hartman et al., 2015). Diversos genes

envolvidos na via da melanogênese, como os descritos anteriormente como o WNT8B, KIT,

GNAI1, ADCY3, PRKCA, CALM2 e o CREB1 (como sendo ativador direto), possuem

como denominador comum o MITF. Assim, alterações na expressão destes genes

certamente implicarão na desregulação da expressão do gene MITF (Hsiao & Fisher 2014).

Em linhagem de MC, o aumento da expressão de MITF foi associado com a diferenciação

do tumor, enquanto que a redução dos níveis de expressão foi associada com a senescência

celular (Vachtenhein & Ondrusová, 2015). Foi descrito o SNP nesse gene c.635-325A>G

(rs7623610) localizado no íntron. As frequências observadas em diferentes populações

étnicas foram de 2% a 30% para o genótipo selvagem AA, 2% a 89% para o genótipo

heterozigoto GA e 22% a 96% para o genótipo variante GG (International Hapmap 3

Consortium et al., 2010). Observamos, em nosso estudo, que os indivíduos que

apresentaram o genótipo AA estiveram sob risco cerca de 3 vezes maior de ocorrência do

MC do que aqueles que apresentaram os demais genótipos. Além disso, esse genótipo

também foi associado com sobrevida livre de progressão e sobrevida global mais curta do

que a observada em pacientes com os demais genótipos do gene. Nós hipotetizamos que a

proteína codificada pelo genótipo AA esteja associada com ganho de atividade do gene.

Além disso, quando avaliamos os SNPs em conjunto, combinados dois a dois,

observamos que a combinação potencializou os efeitos dos SNPs isolados no risco de

ocorrência do MC, em manifestaçoes clínicas e aspectos biológicos do tumor, bem como

na SLP e SG dos pacientes. De fato, a frequência do genótipo combinado GNAI1 TT +

MITF AA foi maior em pacientes com fototipo I+II do que em pacientes com os demais

fototipos, a frequência do genótipo combinado ADCY3 TT + CREB1 AA foi maior em

pacientes com olhos claros do que pacientes com olhos escuros e as frequências dos

genótipos combinados ADCY3 TT CREB1 AA, ADCY3 TT + MITF AA e CREB1 AA +

112

MITF AA foram maiores em pacientes com cabelos claros do que pacientes com cabelos

escuros. Os genótipos combinados PRKCA1 AA+GA + PRKCA2 AG+GG e PRKCA1

AA+GA + PLCB1 AA+CA foram mais comuns em pacientes com efélides do que em

pacientes sem efélides. As frequências do genótipos combinados ADCY3 TT+TG +

WNT8B CC+CT e ADCY3 TT + PRKCA1 AA foram maiores em pacientes com número de

nevos maior que 50 do que em pacientes com número menor de nevos. Os genótipos

combinados ADCY3 TT +CREB1 AA e PRKCA1 AA MITF AA foram mais comuns em

pacientes com tumores localizados nos membros do que em pacientes com tumores axiais.

Estes resultados, em seu conjunto, indicam que os SNPs, isolados ou combinados, estão

associados com aspectos clínicos e biológicpos do tumor. Também merece destaque o

papel do genótipo combinado TT do SNP ADYC3 com o AA do SNP MITF na redução da

SLP e SG em pacientes com MC.

Até onde atinge o nosso conhecimento, não há estudos que avaliaram a influência

desses SNPs ADCY3 c.675+9196T>G (rs 11900505), CALM2 g.47384601A>G (rs

11884600), MITF c..635-325A>G (rs 7623610), KIT c.67+12766T>C (rs 2017472),

GNAI1 g.80130766C>T (rs2079162), WNT8B c.-101T>C (rs3793772) e PRKCA

c.288+33994A>G (rs1806448) no risco de ocorrência ou no prognóstico do MC, bem

como em suas mnifestações clinicopatológicas.

Vale reforçar que ainda não foram estabelecidos se os referidos SNPs determinam

variações quantitativas ou qualitativas nas proteínas produzidas. Mas é sabido que as

proteínas codificadas desempenham funções fundamentais na melanogênse e que estão

interligadas entre si. Além disso, esses SNPs estão localizados em regiões estratégicas que

podem alterar funcionalmente as proteínas codificadas.

Assim, apresentamos pela primeira vez evidencias de que estes SNPs

desempenham papéis importantes em MC. Acreditamos que, esses resultados em conjunto,

poderão contribuir para o entendimento da fisiopatologia do MC, bem como funcionar

como alvos para novas terapêuticas para portadores da doença (Figura 12). Estamos

cientes de que estes resultados necessitam confirmação em estudo com maior casuística e

por estudos funcionais que nos permitam conhecer os papéis dos alelos distintos na síntese

das respectivas proteínas.

113

Figura 12. Representação esquemática da via da melanogênese de acordo com as funções

conhecidas ou presumidas das proteínas codificadas por genes polimórficos

identificados e selecionados em pacientes com melanoma cutâneo e controles, por

meio da genotipagem em larga escala. Os polimorfismos (SNPs) selecionados

correspondem aos genes que codificam proteínas nomeadas em preto na figura.

Não identificamos SNPs nos genes codificadores das proteínas nomeadas em azul.

A via da melanogênese inicia com ativação dos receptores de membrana, Frizzled,

MC1R e KIT através dos ligantes WNT8B, α-MSH e SCF, respectivamente, a

partir dos efeitos da luz UV na pele. Posteriomente ativação de proteínas G GNAI1

se ligarão ativando proteínas como ADCY3 e PLCB1 que na presença de

calmodulina codificado pela CALM2 repassam o sinal de ativação para o PRKCA

que ativará o CREB1 e consequente ativando o MITF causando ativação do ciclo

celular, resistência a apoptose, diferenciação celular e aumento da síntese de

pigmento, que são funções importantes na origem do melanoma cutâneo

114

CONCLUSÕES

O método de GELE possibilitou a identificação de SNPs localizados em genes

envolvidos com a via da melanogênese que podem predispor indivíduos para MC;

Os resultados encontrados a partir da GELE foram confirmados utilizando a técnica

de PCR em tempo real, considerada a técnica “padrão-ouro” para genotipagem;

Os SNPs selecionados da via da melanogênese WNT8B c.-101T>C, KIT



g.47384601A>G, CREB1 c.303+373G>A e MITF c.938-325A>G, isolados ou

agrupados, influenciaram o risco de ocorrência e os aspectos clínicopatológicos e

de pacientes e biológicos do tumor;

Os SNPs selecionados da via da melanogênese WNT8B c.-101T>C, KIT



g.47384601A>G, CREB1 c.303+373G>A e MITF c.938-325A>G, em particular os

SNPs ADCY3 c.675+9196T>G e MITF c.938-325A>G, isolados ou agrupados,

influenciaram a sobrevida de portadores do tumor; e

Em conjunto, os resultados contribuem para o entendimento e compreensão da

fisiopatologia do MC, bem como para o possível desenvolvimento de novas

terapias alvo-específicas para a doença.

115

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Ingvar C, Janssen M, Jenkins MA, Kanetsky PA, Kiemeney LA, Lang J, Lathrop GM,

Leachman S, Lee JE, Lubiński J, Mackie RM, Mann GJ, Martin NG, Mayordomo JI,

Molven A, Mulder S, Nagore E, Novaković S, Okamoto I, Olafsson JH, Olsson H,

Pehamberger H, Peris K, Grasa MP, Planelles D, Puig S, Puig-Butille JA, Randerson-

Moor J, Requena C, Rivoltini L, Rodolfo M, Santinami M, Sigurgeirsson B, Snowden

H, Song F, Sulem P, Thorisdottir K, Tuominen R, Van Belle P, van der Stoep N, van

Rossum MM, Wei Q, Wendt J, Zelenika D, Zhang M, Landi MT, Thorleifsson G,

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Gillanders EM, Goldstein AM, Gruis NA, Hansson J, Helsing P, Hočevar M, Höiom V,

Ingvar C, Kanetsky PA, Chen WV; GenoMEL Consortium; Essen-Heidelberg

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Investigators; ATHENS Melanoma Study Group, Landi MT, Lang J, Lathrop GM,

Lubiński J, Mackie RM, Mann GJ, Molven A, Montgomery GW, Novaković S, Olsson

H, Puig S, Puig-Butille JA, Qureshi AA, Radford-Smith GL, van der Stoep N, van

Doorn R, Whiteman DC, Craig JE, Schadendorf D, Simms LA, Burdon KP, Nyholt

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Holland EA, Duffy DL, Zhang M, Painter JN, Nyholt DR, Maskiell JA, Jetann J,

Ferguson M, Cust AE, Jenkins MA, Whiteman DC, Olsson H, Puig S, Bianchi-Scarrà

G, Hansson J, Demenais F, Landi MT, Dębniak T, Mackie R, Azizi E, Bressac-de

Paillerets B, Goldstein AM, Kanetsky PA, Gruis NA, Elder DE, Newton-Bishop JA,

Bishop DT, Iles MM, Helsing P, Amos CI, Wei Q, Wang LE, Lee JE, Qureshi AA,

Kefford RF, Giles GG, Armstrong BK, Aitken JF, Han J, Hopper JL, Trent JM, Brown

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129

ANEXO 1

Ficha de Coleta dos Dados Clínicos de Pacientes e Dados do Tumor

1) Identificação

Nome: _______________________________________HC_____________________________

Sexo: Feminino ( ) Masculino ( ) Data de Nascimento:_____/_______/________

2) Dados Tumorais:

2.1) Data do Diagnóstico:______/_______/_______

2.2) Localização tumoral: _____________________________________________________

2.3) Breslow (mm):________________

2.4) CLARK: I( ) II( ) III( ) IV( ) V( )

2.5) TNM: _____________________________ EC:_________________________________

2.7) Subtipos (padrão histológico): ______________________________________________

2.8) Tipo de crescimento: ______________________________________________________

2.9) Taxa de mitose: __________________________________________________________

2.10) DHL: __________________________ (Anotar o valor de normalidade do laboratório)

3) Caracteres Pessoais:

3.1) Cor da Pele: Branca( ) Negra( ) Parda( )

3.2) Cor dos olhos: Azul( ) Verde( ) Castanho/Preto( )

3.3) Cabelo: Preto( ) Castanho( ) Loiro( ) Ruivo( )

3.4) Sardas: nenhuma/raras ( ) algumas/muitas( )

3.5) Nevos: <20( ) 20-50( ) >50( )

3.6)Fototipo: I( ) II( ) III( ) IV( ) V( ) VI ( )

4) Antecedentes pessoais:

4.1) Exposição Solar: Sim( ) Não( ) Por quanto tempo:______________________ anos

4.2) Ocupação exposto ao sol: Sim ( ) Não ( ) Qual?_______________________________

4.3) Tipo de exposição solar: Nenhum ( ) Intermitente ( ) Crônica (...)

4.4) Anos de exposição ao Sol: 0( ) ≤ 20 ( ) >20 ( )

4.5) Histórico de outro tipo de câncer: Sim ( ) Não ( )

5) Antecedente Familiares:

5.1) Câncer de Pele Não Melanoma Negativo ( ) Positivo ( ) 1 ou mais da família

5.2) Câncer de Pele Melanoma Negativo ( ) Positivo ( ) 1 ou mais da família

5.3) Histórico de Câncer: Negativo ( ) Positivo ( ) com histórico de pai e mãe

OBERVAÇÕES:_________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

__

130

ANEXO 2

Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa

131

ANEXO 3

Termo de Consentimento Livre Esclarecido a ser obtido dos pacientes, para participação no

estudo intitulado “Identificação de Genes de Susceptibilidade Herdada para o Melanoma

Cutâneo por Genotipagem em Larga Escala”

Nome do paciente: ____________________________________________________________

Idade:____________anos RG:_____________________HC___________________________

Endereço:___________________________________________________________________

Nome do responsável legal (se paciente incapacitado): ________________________________

RG:_________________________.Grau de parentesco:_____________________________

Aceito participar do estudo proposto, no qual fornecerei uma amostra de sangue (volume: 10 ml) a

ser colhida em veia de um dos braços. Estou ciente de que este sangue será utilizado para a

avaliação de uma predisposição pessoal para o desenvolvimento de melanoma cutâneo ou de como

o melanoma evolui. Estou ciente de que não terei prejuízos com a realização destes exames. Sei

que posso sentir dor de pequena intensidade e curta duração no local de punção da veia. Sei que

terei direito de saber o resultado do meu exame, caso esteja interessado. Neste caso, poderei marcar

uma consulta no ambulatório de Oncogenética, que é realizado no mesmo local do ambulatório de

Oncologia Clínica, no terceiro andar do Hospital de Clínicas da UNICAMP, no telefone 35217363,

com a Profa. Dra. Carmen Silvia Bertuzzo ou a Profa. Dra Fátima Aparecida Böttcher Luiz, que

darão esclarecimentos necessários para o meu caso. Sei que posso sair do estudo a qualquer

momento e que isto não vai prejudicar o meu tratamento na UNICAMP. Sei que meus dados

pessoais serão mantidos em sigilo pelo pesquisador. Sei que outros estudos só serão realizados com

o meu sangue após a aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da

UNICAMP e caso eu concorde com o seu armazenamento.

Eu concordo com o armazenamento do meu sangue ou produto do meu sangue

SIM □ NÃO □

Se tiver qualquer dúvida sobre o estudo poderei procurar o Dr. José Augusto Rinck Júnior ou a

Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima, no ambulatório de Oncologia Clínica do Hospital de

Clínicas da UNICAMP, Tel: (19) 3521 7496, ou Cristiane de Oliveira tel (19) 3521-8695.

Se tiver reclamações sobre qualquer procedimento do estudo, poderei procurar a secretaria do

Comitê de Ética do Hospital das Clínicas UNICAMP. Tel: (19) 3521 8936.

Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e recebi esclarecimentos sobre as minhas dúvidas oralmente.

_________________________________ ______________________________

Assinatura do paciente Assinatura do pesquisador legal

Campinas, ........ / ........ / ......

132

ANEXO 4

Termo de Consentimento Livre Esclarecido a ser obtido dos controles, para participação no

estudo intitulado “Identificação de Genes de Susceptibilidade Herdada para o Melanoma

Cutâneo por Genotipagem em Larga Escala”

Nome: __________________________________________________________________

Registro HEMOCENTRO: ____________________________________________________

Idade:____________anos _______________________Telefone: ______________________

Endereço:____________________________________________________________________

Aceito participar do estudo proposto, no qual fornecerei informações sobre a ocorrência de

melanoma em meus familiares e uma amostra de sangue a ser colhida em veia de um dos braços

(volume: 10 ml). Estou ciente que este material será utilizado para a avaliação de uma

predisposição pessoal para o desenvolvimento de melanoma maligno. Estou ciente de que não terei

prejuízos com a realização deste exame. Sei que posso sentir dor de pequena intensidade e curta

duração no local de punção da veia. Sei que terei direito de saber o resultado do meu exame, caso

esteja interessado. Neste caso, poderei marcar uma consulta no ambulatório de Oncogenética, que é

realizado no mesmo local do ambulatório de Oncologia Clínica, no terceiro andar do Hospital de

Clínicas da UNICAMP, no telefone (19) 35217363, com a Profa. Dra. Carmen Silvia Bertuzzo ou a

Profa. Dra Fátima Aparecida Böttcher Luiz, que darão esclarecimentos necessários para o meu

caso. Sei que posso sair do estudo a qualquer momento e que isto não vai prejudicar o meu

atendimento na UNICAMP. Sei que meus dados pessoais serão mantidos em sigilo pelo

pesquisador. Sei que outros estudos só serão realizados com o meu sangue após a aprovação do

Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP e caso eu concorde com o seu

armazenamento.

Eu concordo com o armazenamento do meu sangue ou produto do meu sangue

SIM □ NÃO □

Se tiver qualquer dúvida sobre o estudo poderei procurar a Dr. José Augusto Rinck Jr. ou a Dra.

Carmen Silvia Passos Lima, no ambulatório de Oncologia Clínica do Hospital de Clínicas da

UNICAMP. Tel: (19) 3251 7363. Se tiver reclamações sobre qualquer procedimento do estudo,

poderei procurar a secretaria do Comitê de Ética do Hospital das Clínicas UNICAMP. Tel: (19)

3521 8936.

Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e recebi esclarecimentos sobre as minhas dúvidas oralmente.

___________________________________ ________________________________

Assinatura do controle Assinatura do pesquisador legal

Campinas, ........ / ........ / ......

133

ANEXO 5

Distribuição dos 103 pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a idade, o sexo, a

cor dos olhos, a cor dos cabelos e o fototipo cutâneo

Número Iniciais Idade Sexo Cor dos olhos Cor do cabelo Fototipo cutâneo

0001 RCO 19 M castanhos castanhos IV

0002 MGM 62 F Azuis loiros I

0003 CLS 71 M verdes castanhos II

0004 OKG 76 M azuis castanhos III

0005 JW 34 F castanhos loiros II

0006 TVSM 50 F castanhos castanhos II

0007 SMN 56 M azuis loiros I

0008 WC 49 M castanhos castanhos II

0009 JDJ 63 M castanhos loiros I

0010 AD 76 F castanhos castanhos II

0011 CG 54 M verdes loiros II

0012 BGL 56 F castanhos castanhos III

0013 AGO 50 M castanhos ruivos II

0014 RABB 37 F castanhos castanhos II

0015 NPJ 37 M azuis loiros II

0016 ACF 62 F castanhos castanhos III

0017 DSF 40 F verdes loiros I

0018 HB 45 M pretos castanhos IV

0019 AC 88 M castanhos castanhos II

0020 AMGA 50 F castanhos castanhos II

0021 JAN 64 M verdes castanhos III

0022 EMT 60 F azuis castanhos I

0023 JCM 69 M castanhos castanhos III

0024 MRS 70 M azuis loiros I

0025 PAV 56 M castanhos castanhos II

0026 LSL 84 F castanhos castanhos II

0027 JMP 50 M azuis castanhos II

0028 AC 67 M castanhos castanhos IV

0029 RAFP 47 F verdes castanhos II

0030 LFS 46 F castanhos castanhos II

0031 RNB 84 F azuis castanhos II

0032 DGO 38 M verdes castanhos II

0033 MCS 66 M castanhos castanhos II

0034 AS 47 M castanhos castanhos III

0035 JBO 79 M castanhos castanhos III

0036 AM 66 F verdes loiros I

0037 IBCP 60 F castanhos castanhos III

0038 ICQM 33 F azuis loiros I

0039 LMS 54 M azuis loiros I

0040 AM 73 M castanhos pretos II

0041 EMJ 62 F castanhos castanhos II

0042 TAPB 63 F castanhos castanhos III

0043 AF 86 M verdes castanhos II

0044 CILP 58 F castanhos loiros II

0045 NPPA 37 F castanhos castanhos II

0046 JBM 30 M castanhos castanhos II

0047 CRPI 39 F castanhos castanhos I

0048 ADF 46 M castanhos castanhos I

0049 MMB 32 M castanhos ruivos III

0050 ERM 58 M castanhos castanhos II

0051 PN 73 M verdes castanhos III

0052 RAS 64 M azuis loiros I

134

0053 WJBF 56 M castanhos castanhos III

0054 RMSM 32 F verdes loiros I

0055 ND 64 M azuis loiros I

0056 JCV 57 M castanhos castanhos III

0057 BJ 79 M castanhos castanhos III

0058 GM 68 M castanhos pretos IV

0059 MC 71 M castanhos castanhos III

0060 NIG 82 F azuis castanhos I

0061 DCS 69 M castanhos pretos II

0062 ABG 78 F castanhos loiros III

0063 AS 71 M azuis loiros I

0064 CV 47 M verdes loiros I

0065 CB 53 M verdes loiros II

0066 MIAN 45 F verdes castanhos II

0067 LSDS 63 F castanhos pretos II

0068 LRCN 63 M NA NA

0069 JDGM 63 M castanhos castanhos III

0070 EAM 33 F NA NA

0071 JRF 57 M azuis loiros II

0072 BJP 66 M castanhos castanhos V

0073 BGS 53 M castanhos castanhos II

0074 RPC 39 F castanhos ruivos I

0075 JFPO 25 F castanhos castanhos III

0076 RB 29 F castanhos castanhos III

0077 RAM 26 M castanhos castanhos II

0078 NLDT 25 F castanhos loiros III

0079 RS 37 M NA NA

0080 CLP 56 M castanhos pretos III

0081 MF 49 M castanhos castanhos III

0082 AB 71 M castanhos castanhos III

0083 ABM 60 F castanhos castanhos II

0084 MPR 52 F azuis loiros I

0085 AZO 82 F verdes loiros II

0086 DAS 38 M castanhos castanhos II

0087 SLPB 30 F azuis castanhos I

0088 RBS 25 F castanhos castanhos III

0089 FDC 38 M castanhos castanhos III

0090 MEKS 45 F castanhos castanhos VI

0091 JCSS 46 M castanhos castanhos IV

0092 RFM 40 F castanhos castanhos II

0093 LCQ 37 M azuis loiros I

0094 AT 49 M castanhos castanhos II

0095 MJS 55 M verdes castanhos II

0096 MLC 51 F castanhos castanhos III

0097 GNC 44 M castanhos castanhos III

0098 JAJ 59 M azuis castanhos II

0099 P-N 44 M castanhos ruivos II

0100 MFP 30 F verdes castanhos II

0101 CLZ 54 F castanhos castanhos II

0102 EFS 45 M azuis castanhos I

0103 CET 46 M azuis loiros II

Sexo: M: masculino, F: feminino; Fototipo: I: pele branca e muito sensível ao sol, II: pele branca e sensível

ao sol, III: pele morena clara e sensibilidade normal ao sol, IV: pele morena moderada e sensibilidade normal

ao sol, V: pele morena escura e pouca sensibilidade ao sol, VI: pele negra e insensível ao sol; NA: não

avaliado

135

ANEXO 6

Distribuição dos 103 pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a presença de efélides,

a presença de nevos e o tipo de exposição solar

Nº Iniciais Efélides Nevos Tipo de exposição solar

0001 RCO algumas/muitas 20-50 não

0002 MGM algumas/muitas <20 crônica

0003 CLS algumas/muitas 20-50 crônica

0004 OKG algumas/muitas <20 crônica

0005 JW algumas/muitas 20-50 NA

0006 TVSM nenhuma/raras 20-50 crônica

0007 SMN nenhuma/raras <20 crônica

0008 WC algumas/muitas 20-50 crônica

0009 JDJ algumas/muitas >50 crônica

0010 AD algumas/muitas <20 não

0011 CG algumas/muitas >50 intermitente

0012 BGL algumas/muitas <20 crônica

0013 AGO algumas/muitas >50 não

0014 RABB nenhuma/raras 20-50 não

0015 NPJ nenhuma/raras <20 intermitente

0016 ACF algumas/muitas 20-50 crônica

0017 DSF algumas/muitas <20 crônica

0018 HB algumas/muitas >50 crônica

0019 AC algumas/muitas 20-50 crônica

0020 AMGA algumas/muitas >50 intermitente

0021 JAN algumas/muitas <20 NA

0022 EMT algumas/muitas <20 intermitente

0023 JCM nenhuma/raras 20-50 não

0024 MRS algumas/muitas <20 crônica

0025 PAV nenhuma/raras >50 crônica

0026 LSL algumas/muitas >50 crônica

0027 JMP nenhuma/raras <20 crônica

0028 AC nenhuma/raras <20 crônica

0029 RAFP algumas/muitas >50 crônica

0030 LFS nenhuma/raras <20 crônica

0031 RNB algumas/muitas >50 crônica

0032 DGO nenhuma/raras <20 crônica

0033 MCS nenhuma/raras 20-50 crônica

0034 AS nenhuma/raras 20-50 crônica

0035 JBO algumas/muitas 20-50 crônica

0036 AM algumas/muitas <20 não

0037 IBCP algumas/muitas 20-50 não

0038 ICQM nenhuma/raras >50 crônica

0039 LMS nenhuma/raras <20 crônica

0040 AM algumas/muitas 20-50 não

0041 EMJ nenhuma/raras 20-50 crônica

0042 TAPB algumas/muitas <20 crônica

0043 AF nenhuma/raras <20 NA

0044 CILP nenhuma/raras <20 crônica

0045 NPPA nenhuma/raras 20-50 crônica

0046 JBM algumas/muitas 20-50 não

0047 CRPI algumas/muitas >50 não

0048 ADF algumas/muitas >50 intermitente

0049 MMB nenhuma/raras 20-50 não

0050 ERM nenhuma/raras >50 NA

0051 PN algumas/muitas 20-50 não

0052 RAS algumas/muitas 20-50 NA

136

0053 WJBF algumas/muitas 20-50 NA

0054 RMSM algumas/muitas >50 não

0055 ND algumas/muitas >50 NA

0056 JCV nenhuma/raras <20 crônica

0057 BJ nenhuma/raras <20 crônica

0058 GM algumas/muitas <20 NA

0059 MC algumas/muitas <20 NA

0060 NIG algumas/muitas 20-50 crônica

0061 DCS algumas/muitas <20 crônica

0062 ABG nenhuma/raras <20 não

0063 AS nenhuma/raras <20 NA

0064 CV algumas/muitas >50 não

0065 CB algumas/muitas <20 intermitente

0066 MIAN algumas/muitas <20 crônica

0067 LSDS algumas/muitas 20-50 crônica

0068 LRCN NA 20-50 NA

0069 JDGM nenhuma/raras <20 crônica

0070 EAM NA NA NA

0071 JRF nenhuma/raras <20 crônica

0072 BJP algumas/muitas 20-50 NA

0073 BGS nenhuma/raras <20 crônica

0074 RPC algumas/muitas 20-50 intermitente

0075 JFPO algumas/muitas 20-50 NA

0076 RB nenhuma/raras 20-50 NA

0077 RAM algumas/muitas 20-50 NA

0078 NLDT algumas/muitas 20-50 NA

0079 RS nenhuma/raras <20 NA

0080 CLP nenhuma/raras <20-500 crônica

0081 MF algumas/muitas 20-50 NA

0082 AB algumas/muitas >50 crônica

0083 ABM nenhuma/raras <20 crônica

0084 MPR algumas/muitas 20-50 crônica

0085 AZO algumas/muitas <20 crônica

0086 DAS algumas/muitas 20-50 intermitente

0087 SLPB algumas/muitas 20-50 NA

0088 RBS nenhuma/raras 20-50 Não

0089 FDC algumas/muitas 20-50 NA

0090 MEKS algumas/muitas <20 NA

0091 JCSS nenhuma/raras <20 NA

0092 RFM nenhuma/raras <20-500 intermitente

0093 LCQ algumas/muitas 20-50 crônica

0094 AT algumas/muitas >50 crônica

0095 MJS nenhuma/raras 20-50 crônica

0096 MLC algumas/muitas >50 crônica

0097 GNC nenhuma/raras >50 crônica

0098 JAJ algumas/muitas 20-50 intermitente

0099 P-N algumas/muitas <20-500 intermitente

0100 MFP algumas/muitas <20-500 intermitente

0101 CLZ algumas/muitas <20-500 intermitente

0102 EFS nenhuma/raras <20 não

0103 CET nenhuma/raras <20 intermitente

Efélides: nenhuma/raras: efélides em nenhuma ou apenas em um região do corpo; algumas/muitas: efélides em mais de

uma parte do corpo; Nevos: quantidade de nevos observados em toda extensão corporal

137

ANEXO 7

Distribuição dos 103 controles de acordo a idade, o sexo, a cor dos olhos, a cor dos cabelos

e o fototipo cutâneo

Nº Iniciais Idade Sexo Cor dos olhos Cor dos cabelos Fototipo cutâneo

0001 FRD 36 F castanhos castanhos III

0002 JLB 53 M castanhos pretos II

0003 ORS 49 M castanhos castanhos IV

0004 CAGV 56 F castanhos castanhos II

0005 EGS 48 M castanhos castanhos IV

0006 SEP 51 F azuis loiros III

0007 VJB 49 M castanhos pretos III

0008 JLR 47 M castanhos loiros II

0009 VB 47 M castanhos castanhos II

0010 LAG 37 F castanhos castanhos I

0011 JBR 46 M azuis loiros I

0012 LCFC 47 M castanhos castanhos I

0013 SCJ 56 M verdes castanhos I

0014 LRP 46 M castanhos castanhos II

0015 MAT 53 M castanhos pretos III

0016 FJBS 46 M castanhos pretos II

0017 MCA 34 F castanhos castanhos VI

0018 LAM 47 M verdes castanhos I

0019 LACC 47 M verdes pretos II

0020 PPS 53 M castanhos castanhos III

0021 MAJ 49 F castanhos castanhos III

0022 JCL 51 M castanhos pretos II

0023 CBS 53 M castanhos castanhos III

0024 MAPF 57 F castanhos pretos VI

0025 JCA 50 F verdes castanhos I

0026 JCS 58 M castanhos pretos V

0027 AAF 53 M castanhos castanhos II

0028 FBA 46 M castanhos castanhos III

0029 BTCP 54 F castanhos pretos II

0030 VDG 50 M castanhos castanhos III

0031 FCM 32 F azuis loiros I

0032 ESG 46 M castanhos pretos II

0033 MCD 52 F castanhos castanhos II

0034 EAR 46 M verdes loiros I

0035 ALPR 55 M castanhos castanhos III

0036 PAMP 55 M castanhos pretos III

0037 VCV 50 F castanhos pretos IV

0038 DCA 38 F castanhos castanhos III

0039 MLFS 55 F azuis castanhos III

0040 MEFS 60 F castanhos pretos II

0041 MAS 58 F castanhos pretos II

0042 GMS 49 M castanhos pretos IV

0043 LCCS 46 M castanhos pretos III

0044 ERS 48 M castanhos pretos I

0045 TBSM 54 F castanhos pretos IV

0046 PRS 55 M azuis loiros I

0047 MAP 46 M castanhos castanhos III

0048 IAM 49 M castanhos castanhos III

0049 CAM 49 M verdes loiros I

0050 RCM 32 F castanhos castanhos III

0051 MRQ 53 F castanhos castanhos I

0052 MCAS 45 F castanhos pretos II

138

0053 SMCM 51 F castanhos castanhos II

0054 FSR 37 F castanhos castanhos III

0055 AAS 49 M castanhos pretos III

0056 IV 57 F verdes loiros I

0057 ACOD 45 F castanhos castanhos III

0058 ACPBM 40 F verdes loiros I

0059 LRSS 50 F azuis castanhos III

0060 FRBC 46 M castanhos pretos I

0061 ELM 37 M castanhos pretos IV

0062 MLFCD 41 F castanhos castanhos I

0063 ROF 41 F castanhos pretos II

0064 VSA 37 F castanhos pretos III

0065 TES 35 F verdes castanhos III

0066 AMFSML 37 F castanhos pretos I

0067 JBS 47 M castanhos pretos V

0068 JO 29 M verdes castanhos II

0069 MFS 33 F castanhos castanhos I

0070 JLP 44 M castanhos castanhos III

0071 BLO 62 M castanhos pretos VI

0072 ACC 58 M verdes castanhos III

0073 AECB 50 F castanhos castanhos III

0074 ORS 52 M castanhos pretos I

0075 NÃO 47 F castanhos castanhos III

0076 MAOP 41 F castanhos pretos II

0077 JCD 63 M castanhos pretos II

0078 RSP 52 M castanhos castanhos III

0079 MCVDA 37 F castanhos pretos I

0080 MCR 47 F castanhos castanhos II

0081 CFL 34 F castanhos pretos VI

0082 SRO 29 F castanhos castanhos II

0083 SR 52 M castanhos castanhos V

0084 MCG 44 F castanhos castanhos II

0085 SLB 49 M castanhos castanhos III

0086 LSO 32 F castanhos pretos III

0087 JAI 32 F castanhos pretos III

0088 AS 47 M verdes pretos II

0089 SCM 38 F castanhos castanhos V

0090 DMPS 44 F castanhos pretos III

0091 LERR 20 M verdes pretos I

0092 ACS 35 F castanhos castanhos III

0093 AC 34 M castanhos pretos I

0094 OE 45 M castanhos pretos II

0095 CR 34 M castanhos pretos II

0096 ASJL 38 M castanhos castanhos IV

0097 AJC 48 M castanhos pretos II

0098 FHP 27 M castanhos pretos II

0099 IFS 50 F castanhos pretos II

0100 DBC 48 F castanhos pretos IV

0101 EFA 47 M castanhos pretos II

0102 HM 40 F castanhos pretos IV

0103 MC 34 M castanhos loiros I

Sexo: M: masculino, F: feminino; Fototipo: I: pele branca e muito sensível ao sol, II: pele branca e sensível

ao sol, III: pele morena clara e sensibilidade normal ao sol, IV: pele morena moderada e sensibilidade normal

ao sol, V: pele morena escura e pouca sensibilidade ao sol, VI: pele negra e insensível ao sol; NA: não

avaliado

139

ANEXO 8

Distribuição dos 103 pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a localização tumoral,

espessura de Breslow, nível de Clark e estágio clínico

Nº Iniciais Localização tumoral Breslow (mm) Clark Estágio clínico

0001 RCO cabeça in situ I 0

0002 MGM membro inferior NA I 0

0003 CLS cabeça NA I 1

0004 OKG cabeça 0,3 II 1

0005 JW tronco 0,6 III 1

0006 TVSM tronco 6, V 2

0007 SMN cabeça 0,8 III 1

0008 WC cabeça 0,3 II 1

0009 JDJ tronco 0,9 III 1

0010 AD membro superior 0,2 I 1

0011 CG tronco in situ I 0

0012 BGL membro superior in situ I 0

0013 AGO tronco 9 IV 2

0014 RABB membro superior 0,3 II 1

0015 NPJ membro superior 0,5 III 1

0016 ACF membro inferior 0,5 II 1

0017 DSF tronco 2,6 II 2

0018 HB tronco 5, IV 2

0019 AC cabeça 2,1 V 2

0020 AMGA membro superior in situ IS 0

0021 JAN cabeça in situ I 0

0022 EMT membro inferior 4,8 IV 2

0023 JCM tronco in situ I 0

0024 MRS tronco in situ I 0

0025 PAV tronco 0,7 III 1

0026 LSL tronco 1,8 III 1

0027 JMP tronco 0,5 III 1

0028 AC cabeça 4, IV 2

0029 RAFP tronco 10,3 III 2

0030 LFS membro inferior in situ I 0

0031 RNB membro inferior 6,8 IV 2

0032 DGO tronco 0,7 III 1

0033 MCS tronco in situ I 0

0034 AS membro inferior 0,8 IV 1

0035 JBO cabeça 5 IV 2

0036 AM tronco in situ I 0

0037 IBCP cabeça 1,7 IV 2

0038 ICQM membro inferior 0,4 III 1

0039 LMS tronco 0,7 III 1

0040 AM cabeça 1,6 II 2

0041 EMJ tronco 0,2 II 1

0042 TAPB membro superior 0,4 III 1

0043 AF tronco 4, IV 2

0044 CILP membro inferior 2, II 2

0045 NPPA tronco 0,2 II 1

0046 JBM membro superior 0,6 II 1

0047 CRPI membro inferior 0,3 II 1

0048 ADF tronco 0,6 III 1

0049 MMB tronco 0,8 III 1

0050 ERM cabeça 6,8 III 2

0051 PN tronco 5 IV 3

0052 RAS membro superior 2,5 IV 4

140

0053 WJBF membro inferior 0,6 III 3

0054 RMSM membro inferior NA NA 3

0055 ND membro superior 9,4 IV 4

0056 JCV cabeça 4 V 4

0057 BJ tronco 4,2 IV 4

0058 GM tronco 1,1 III 3

0059 MC tronco 2,5 III 4

0060 NIG tronco 4 IV 3

0061 DCS tronco NA x 4

0062 ABG tronco 2,8 IV 3

0063 AS tronco 3, IV 3

0064 CV membro inferior 2, III 3

0065 CB tronco 6, IV 3

0066 MIAN tronco 2,9 IV 3

0067 LSDS membro inferior 2,3 IV 3

0068 LRCN tronco 12, IV 3

0069 JDGM tronco NA NA 4

0070 EAM tronco NA III 3

0071 JRF NA NA NA 4

0072 BJP tronco NA NA 4

0073 BGS membro inferior 4,2 V 3

0074 RPC NA 2,5 IV 3

0075 JFPO tronco 1,2 III 4

0076 RB tronco 4,5 IV 3

0077 RAM cabeça 4 IV 3

0078 NLDT membro inferior 2,7 III 3

0079 RS membro superior 3,6 IV 3

0080 CLP NA 9 V 3

0081 MF tronco 2 IV 3

0082 AB tronco 4, IV 3

0083 ABM membro inferior 3,2 IV 4

0084 MPR membro superior 6, V 3

0085 AZO membro inferior 2,2 IV 4

0086 DAS NA >0,5 I 4

0087 SLPB tronco 3,1 IV 3

0088 RBS membro superior 4 III 3

0089 FDC membro inferior 1,5 III 3

0090 MEKS membro inferior 1,6 III 3

0091 JCSS tronco NA NA 4

0092 RFM NA NA III 3

0093 LCQ NA 7 IV 3

0094 AT tronco 12, II 2

0095 MJS NA 0,6 III 1

0096 MLC NA NA NA 3

0097 GNC NA 3,7 IV 2

0098 JAJ NA 1,2 IV 1

0099 P-N NA 0,8 II 1

0100 MFP NA 1,6 IV 2

0101 CLZ NA 0,6 III 1

0102 EFS cabeça in situ I 0

0103 CET tronco 1,2 IV 3

NA: não avaliado

141

ANEXO 9

Distribuições individualizadas dos 103 pacientes com melanoma cutâneo e dos 103 controles

de acordo com o controle de qualidade de contraste (CQC), controle de qualidade de

fragmentos hibridizados e clivados pela enzima de restrição StyI (CQ StyI), pela enzima de

restrição NspI (CQ NspI), e dos fragmentos totais (CQ)

Amostras CQC CQ

StyI

CQ

NspI

CQ (%)

Paciente0001 0.94 0.98 0.01 96.06

Paciente0002 0.52 0.32 0.54 95.80

Paciente0003 0.82 0.84 0.41 96.82

Paciente0004 1.11 1.24 0.71 94.14

Paciente0005 0.78 0.72 0.39 95.20

Paciente0006 1.08 1.06 0.39 97.35

Paciente0007 1.26 1.22 0.59 96.86

Paciente0008 1.52 1.94 1.30 94.14

Paciente0009 0.65 0.71 0.31 92.42

Paciente0010 0.62 0.65 0.50 95.96

Paciente0011 1.64 1.52 1.45 97.92

Paciente0012 0.99 1.68 0.82 94.24

Paciente0013 0.97 1.07 0.22 97.12

Paciente0014 0.73 0.71 0.58 93.91

Paciente0015 0.72 1.22 1.21 95.27

Paciente0016 0.81 0.72 0.47 96.46

Paciente0017 1.46 1.34 1.07 96.96

Paciente0018 0.79 1.05 1.03 95.47

Paciente0019 1.18 1.14 1.05 96.49

Paciente0020 1.47 1.40 0.77 96.79

Paciente0022 0.63 0.70 0.50 97.19

Paciente0023 0.51 0.99 0.24 95.57

Paciente0024 1.97 1.71 1.49 98.18

Paciente0025 1.49 1.56 1.18 97.58

Paciente0026 1.06 1.14 0.84 96.13

Paciente0027 0.94 0.44 -0.03 94.31

Paciente0028 1.27 1.11 0.80 94.18

Paciente0029 0.48 0.49 0.76 94.77

Paciente0030 1.57 1.51 1.46 96.89

Paciente0031 1.04 1.75 1.36 98.25

Paciente0032 1.63 0.75 0.72 95.86

Paciente0033 1.16 1.07 0.36 96.13

Paciente0034 0.99 0.74 0.29 94.77

Paciente0036 1.02 1.13 1.17 95.14

Paciente0037 0.99 1.11 0.94 95.96

Paciente0038 0.55 0.26 0.00 93.71

Paciente0039 1.28 1.43 0.96 96.89

Paciente0040 0.73 1.44 0.00 96.66

Paciente0041 1.34 0.99 0.99 96.13

Paciente0042 0.51 -0.16 0.21 95.30

Paciente0043 0.60 0.25 0.44 96.16

Paciente0044 0.42 0.17 0.22 94.67

Paciente0045 0.79 0.62 0.26 97.12

Paciente0046 1.05 1.21 1.03 94.18

Paciente0047 0.76 0.23 0.44 95.70

Paciente0048 1.62 1.19 1.11 95.57

Paciente0049 0.52 0.03 0.08 95.93

Paciente0050 1.17 1.49 0.96 96.56

Paciente0051 0.55 0.54 0.24 95.96

Paciente0052 0.84 0.77 0.00 95.67

Paciente0053 0.86 0.96 0.43 96.19

Paciente0054 1.38 1.34 0.61 93.88

Paciente0055 0.63 0.61 0.00 95.90

Paciente0056 1.04 0.95 0.29 95.96

Paciente0057 0.85 1.08 0.56 95.33

Paciente0058 0.49 0.43 0.46 95.76

Paciente0059 0.73 0.99 0.38 96.39

Paciente0060 0.93 0.57 0.86 96.16

Paciente0061 0.65 0.63 0.57 93.94

Paciente0062 0.91 1.61 1.07 95.90

Paciente0063 1.27 1.43 1.07 96.69

Paciente0064 1.48 1.33 0.65 94.41

Paciente0065 1.27 1.59 1.31 96.33

Paciente0066 1.03 0.68 0.50 93.98

Paciente0067 1.07 0.93 0.42 97.35

Paciente0068 1.75 1.50 1.59 97.25

142

Paciente0069 1.72 1.92 1.35 97.58

Paciente0070 1.65 2.11 1.76 96.53

Paciente0071 0.76 0.34 0.56 95.00

Paciente0072 0.67 0.42 0.41 94.24

Paciente0073 0.82 0.71 0.44 95.14

Paciente0074 1.84 2.26 1.92 96.62

Paciente0075 0.87 0.69 0.34 95.00

Paciente0076 0.90 1.44 0.84 94.84

Paciente0077 1.65 2.50 2.04 95.07

Paciente0078 0.84 0.74 0.47 95.14

Paciente0079 1.21 1.14 0.68 95.90

Paciente0080 1.94 2.36 2.01 96.79

Paciente0081 1.39 1.27 1.23 96.86

Paciente0082 1.43 1.38 0.73 93.85

Paciente0083 0.70 1.23 0.51 96.76

Paciente0084 1.33 1.71 0.00 96.82

Paciente0085 0.51 0.99 0.88 94.31

Paciente0086 0.81 0.29 0.37 95.53

Paciente0087 1.12 0.85 0.63 94.97

Paciente0088 1.18 1.90 1.02 96.56

Paciente0089 1.13 1.10 0.45 97.55

Paciente0090 1.45 1.78 1.51 97.39

Paciente0091 1.00 2.00 0.78 94.37

Paciente0092 1.48 2.02 1.02 96.66

Paciente0093 1.27 1.73 0.24 92.59

Paciente0094 1.35 1.90 0.63 94.31

Paciente0095 1.54 2.28 0.90 96.00

Paciente0096 0.75 2.21 0.43 94.64

Paciente0097 1.01 1.43 0.24 96.33

Paciente0098 1.30 2.24 0.52 95.50

Paciente0099 1.04 1.67 0.52 96.43

Paciente0100 1.18 1.91 0.52 93.35

Paciente0101 1.09 1.74 0.44 92.42

Paciente0102 1.49 2.20 0.69 95.67

Paciente0103 1.70 2.17 1.17 97.52

Controle001 1.28 1.23 0.08 95.33

Controle002 0.78 0.80 0.64 96.79

Controle003 0.74 0.65 0.58 95.73

Controle004 1.03 1.46 0.77 97.25

Controle005 1.00 1.05 0.23 95.70

Controle006 1.50 1.63 1.45 97.32

Controle007 1.17 1.44 0.56 95.76

Controle008 1.08 0.41 0.08 96.33

Controle009 0.95 0.84 0.00 95.67

Controle010 1.15 1.49 0.88 91.93

Controle011 1.19 1.35 0.89 96.00

Controle012 1.27 1.58 1.27 94.90

Controle013 1.18 0.98 0.56 96.69

Controle014 1.13 0.94 0.72 96.43

Controle015 0.48 0.82 0.08 93.28

Controle016 0.41 0.53 0.36 96.39

Controle017 1.26 1.27 1.11 96.49

Controle018 1.28 1.49 1.15 97.15

Controle019 0.54 0.86 0.33 95.60

Controle020 0.50 0.59 0.13 95.70

Controle021 1.64 1.23 1.39 97.72

Controle022 0.63 0.00 0.23 93.85

Controle023 0.97 1.09 1.23 96.43

Controle024 0.67 0.95 0.74 95.10

Controle025 1.39 1.52 1.19 96.79

Controle026 1.10 1.18 1.00 94.31

Controle027 0.41 0.00 0.07 90.83

Controle028 1.87 1.67 1.27 97.32

Controle029 1.70 1.23 1.33 97.78

Controle030 0.62 0.85 0.74 96.19

Controle031 0.64 1.24 0.53 95.60

Controle032 0.57 0.44 0.63 92.95

Controle033 1.02 0.32 0.42 94.71

Controle034 0.91 1.29 0.53 96.99

Controle035 1.04 1.31 1.04 95.90

Controle036 0.55 0.52 0.16 95.96

Controle037 0.72 1.14 0.71 93.94

Controle038 0.69 0.81 0.66 93.41

Controle039 1.49 1.23 1.04 96.33

Controle040 0.89 0.65 0.19 94.77

Controle041 1.55 1.55 1.10 93.45

Controle042 0.77 0.99 0.71 97.42

Controle043 1.03 0.92 0.38 95.67

Controle044 0.61 0.67 0.79 96.72

Controle045 0.66 1.22 0.40 97.02

Controle046 1.36 1.48 0.72 93.65

Controle047 0.58 0.27 0.10 96.03

143

Controle048 1.07 0.74 0.15 96.19

Controle049 1.37 1.92 1.51 97.39

Controle050 0.89 0.95 0.99 94.57

Controle051 1.01 0.43 0.42 94.18

Controle052 0.60 0.20 0.44 94.44

Controle053 1.07 1.70 0.73 95.90

Controle054 0.40 0.19 0.19 94.80

Controle055 1.42 1.13 1.01 95.73

Controle056 1.25 1.33 1.71 95.70

Controle057 1.18 0.86 0.63 96.79

Controle058 0.76 0.99 0.55 95.86

Controle059 0.65 0.21 0.00 93.68

Controle060 0.84 1.11 0.65 96.99

Controle061 1.01 0.86 0.52 96.13

Controle062 1.35 1.52 0.94 97.05

Controle063 0.99 1.81 1.05 96.39

Controle064 1.09 0.28 0.40 95.00

Controle065 1.10 1.71 1.69 93.85

Controle066 0.92 1.64 1.44 96.96

Controle067 0.51 1.20 0.54 92.92

Controle068 1.56 1.92 2.01 97.35

Controle069 0.76 1.02 0.80 95.07

Controle070 1.41 1.55 1.37 96.16

Controle071 1.37 1.93 1.33 96.86

Controle072 0.59 0.46 0.25 95.60

Controle073 0.55 0.85 0.67 93.28

Controle074 0.42 0.90 0.89 96.03

Controle075 1.92 1.54 0.76 95.93

Controle076 1.19 1.12 0.44 96.76

Controle077 1.86 2.24 1.82 98.11

Controle078 0.62 0.17 0.00 91.73

Controle079 1.16 1.03 0.50 96.86

Controle080 0.74 1.05 0.48 95.86

Controle081 0.92 1.31 0.95 96.19

Controle082 0.64 0.53 0.42 95.33

Controle083 1.20 1.20 0.69 95.93

Controle084 0.67 1.13 0.94 96.36

Controle085 1.18 1.13 0.89 97.25

Controle086 0.94 0.20 0.08 95.14

Controle087 1.18 0.63 0.49 94.80

Controle088 0.61 1.34 1.32 96.62

Controle089 0.84 0.02 0.23 95.00

Controle090 2.01 1.76 0.63 97.45

Controle091 1.20 1.23 0.02 96.03

Controle092 0.72 0.06 0.10 95.40

Controle093 0.78 0.53 1.22 95.17

Controle094 0.71 1.20 1.17 96.76

Controle095 0.54 0.67 0.02 95.96

Controle096 1.42 1.92 1.97 98.21

Controle097 0.63 0.77 0.52 95.83

Controle098 1.30 2.24 0.52 95.50

Controle099 1.04 1.67 0.52 96.43

Controle0100 1.18 1.91 0.52 93.35

Controle101 1.09 1.74 0.44 92.42

Controle102 1.49 2.20 0.69 95.67

Controle103 1.70 2.17 1.17 97.52

CQC: controle de qualidade de contraste, CQ StyI: controle de qualidade de fragmentos

hibridizados e clivados pela enzima de restrição StyI, CQ NspI: controle de qualidade de

fragmentos hibridizados e clivados pela enzima de restrição NspI, CQ: controle de qualidade

dos fragmentos totais

144

ANEXO 10

Distribuição dos 82 polimorfismos de base única (SNP), que apresentaram frequências genotípicas

distintas entre 103 pacientes com melanoma cutâneo e 103 controles, localizados em genes

relacionados com o processo da melanogênese, de acordo com o número de referência do SNP,

símbolo do gene, frequência do alelo variante, tamanho amostral, teste de equilíbrio de

Hardy-Weinberg do grupo de controles e a localização do SNP no gene

rs do SNP Símbolo do

gene

Frequência do

alelo variante

(%)

Tamanho

Amostral

Equilíbrio de Hardy-

Weinberg Localização

X2 P valor

rs1864071 ADCY2 32 92 0,63 0,42 Íntron

rs11900505 ADCY3 46 50 3,27 0,07 Íntron

rs10198275 ADCY3 46 65 0,00 0,97 Íntron

rs10200566 ADCY3 45 232 0,13 0,71 Íntron

rs1865689 ADCY3 49 51 5,71 0,01 Íntron

rs2033653 ADCY3 44 633 0,46 0,49 íntron

rs2384058 ADCY3 43 49 0,69 0,40 regulatória

rs6545814 ADCY3 46 48 1,08 0,29 íntron

rs6733224 ADCY3 46 48 1,08 0,29 íntron


rs9841477 ADCY5 41 71 2,30 0,12 íntron


rs7812946 ADCY8 28 120 0,30 0,58 íntron

rs1027478 CALM2 47 48 1,08 0,29 regulatória



rs7095575 CALML3 26 250 1,41 0,23 regulatória

rs4724298 CAMK2B 10 295 0,32 0,57 regulatória

rs28599641 CAMK2D 21 188 0,95 0,32 íntron

rs6853484 CAMK2D 21 215 1,66 0,19 íntron

rs10932201 CREB1 40 117 0,45 0,50 regulatória

rs11977277 CREB3L2 10 376 1,32 0,25 íntron

rs273988 CREB3L2 45 84 0,06 0,80 íntron

rs273995 CREB3L2 41 90 0,06 0,80 íntron

rs273996 CREB3L2 42 90 0,06 0,80 íntron

rs10279584 CREB5 38 194 0,20 0,65 íntron

145

rs17156685 CREB5 8 215 2,46 0,11 íntron

rs2237364 CREB5 48 47 1,71 0,19 íntron

rs34143286 CREB5 6 633 0,46 0,49 íntron

rs41342 CREB5 49 57 0,52 0,47 íntron

rs4722839 CREB5 6 420 1,06 0,30 íntron

rs982950 CREB5 31 61 0,21 0,64 íntron

rs39733 CREBBP 10 108 0,32 0,57 regulatória

rs2079162 GNAI1 43 74 2,02 0,15 regulatória

rs17724988 GNAQ 1 633 0,46 0,49 íntron

rs6100260 GNAS 26 126 0,56 0,45 íntron

rs2017472 KIT 41 47 0,21 0,64 regulatória

rs10865653 MITF 32 90 0,41 0,52 íntron

rs7623610 MITF 32 63 0,08 0,77 regulatória

rs9822057 MITF 34 70 9,17 0,00 íntron

rs2072668 OGG1 33 120 0,30 0,58 regulatória

rs17365739 PLCB1 23 114 7,19 0,01 regulatória




rs2299680 PLCB4 10 836 2,61 0,10 íntron

rs7272444 PLCB4 22 157 6,36 0,01 íntron

rs10277859 PRKAG2 10 58 0,02 0,88 regulatória







rs12601850 PRKCA 10 67 1,10 1,00 regulatória

rs1806448 PRKCA 16 108 2,67 0,10 regulatória

rs12445719 PRKCB 10 376 1,32 0,25 íntron

rs1868388 PRKCE 45 81 4,32 0,03 íntron

rs6760363 PRKCE 33 90 1,20 0,27 íntron

rs11627926 PRKCH 49 59 1,52 0,21 íntron

rs11852192 PRKCH 25 48 1,08 0,29 íntron

146

rs1536014 PRKCH 10 133 2,47 0,11 íntron

rs2058716 PRKD3 10 148 1,12 0,28 regulatória

rs1033969 PRKG1 43 58 0,06 0,80 íntron

rs10997502 PRKG1 10 64 0,91 0,34 íntron

rs10997540 PRKG1 25 46 2,76 0,09 íntron

rs10997689 PRKG1 36 55 3,02 0,08 íntron

rs16923827 PRKG1 7 8750 0,00 0,96 íntron

rs293332 PRKG1 22 44 0,48 0,48 íntron

rs4935222 PRKG1 22 140 2,04 0,15 íntron

rs7099012 PRKG1 37 63 1,24 0,26 íntron

rs2410988 PRKRIP1 23 117 1,39 0,23 regulatória

rs7797435 PRKRIP1 42 58 0,30 0,58 regulatória

rs10503830 RNA5SP259 10 152 1,22 0,26 regulatória

rs10953363 RP11-

163E9.1 42 103 0,68 0,40 regulatória

rs6997554 RP11-

737F9.1 48 47 0,26 0,61 regulatória

rs2568210 TCF7L1 34 77 4,75 0,02 íntron

rs3790608 WNT2B 10 201 0,34 0,55 íntron

rs10883497 WNT8B 10 56 0,01 0,77 íntron

rs1417823 WNT8B 10 260 0,00 0,97 íntron

rs3793771 WNT8B 10 132 0,04 0,84 codificadora

rs3793772 WNT8B 18 132 0,04 0,84 regulatória

rs: número de referência do polimorfismo de base única (SNP), χ2= qui quadrado, valores de P valores

maiores que 0,05 indicaram que a amostra encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg

147

ANEXO 11

Artigo Publicado

148

149

150

151

152

153

154

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