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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
LUIZ HENRIQUE SOARES TIBO
IMUNOMODULAÇÃO INTRAVESICAL COM Salmonella enterica E VIOLACEÍNA
PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER DE BEXIGA URINÁRIA NÃO MÚSCULO
INVASIVO (CBNMI)
Campinas
2019
LUIZ HENRIQUE SOARES TIBO
IMUNOMODULAÇÃO INTRAVESICAL COM Salmonella enterica E VIOLACEÍNA
PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER DE BEXIGA URINÁRIA NÃO MÚSCULO
INVASIVO (CBNMI)
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
Doutor em Genética e Biologia Molecular, na área de
Genética de Microrganismos.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Brocchi
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO LUIZ
HENRIQUE SOARES TIBO, ORIENTADO PELO
PROF. DR. MARCELO BROCCHI.
Campinas
2019
Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de BiologiaMara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Tibo, Luiz Henrique Soares, 1985- T434i TibImunomodulação intravesical com Salmonella enterica e violaceína para o
tratamento do câncer de bexiga urinária não músculo invasivo (CBNMI) / LuizHenrique Soares Tibo. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
TibOrientador: Marcelo Brocchi. TibTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Tib1. Neoplasias da bexiga. 2. Imunoterapia. 3. Atividade antitumoral. 4.
Violaceína. 5. Salmonella. I. Brocchi, Marcelo, 1967-. II. Universidade Estadualde Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Intravesical immunomodulation with Salmonella enterica andviolacein for treatment of non muscle invasive urinary bladder câncer (NMIBC)Palavras-chave em inglês:Bladder neoplasmsImmunotherapyAntitumor activityViolaceinSalmonellaÁrea de concentração: Genética de MicroorganismosTitulação: Doutor em Genética e Biologia MolecularBanca examinadora:Marcelo Brocchi [Orientador]Claudio Chrysostomo WerneckAnderson Ferreira da CunhaJosé Andrés YunesGerson NakazatoData de defesa: 30-08-2019Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-3783-9331- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/3795440816818048
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
4
Campinas, 30 de Agosto de 2019
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Brocchi (Orientador)
Prof. Dr. Claudio Chrysostomo Werneck
Prof. Dr. Anderson Ferreira da Cunha
Prof. Dr. José Andrés Yunes
Prof. Dr. Gerson Nakazato
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de
Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Genética e Biologia Molecular do
Instituto de Biologia/UNICAMP.
5
AGRADECIMENTOS
À minha família, meus pais, Nilson Nogueira Tibo e Roselene Maria Soares Santana Tibo,
meus irmãos Leonardo Soares Tibo e Luciano Soares Tibo por todo apoio e pela presença
constante em minha vida.
À minha esposa, Natália Galdi Quel, por participar de todos os momentos e me ajudar a superar
os obstáculos nesta fase da minha vida.
Ao meu orientador Prof. Dr. Marcelo Brocchi, pela oportunidade, paciência e confiança durante
o desenvolvimento deste projeto.
Aos meus amigos e colegas no grupo de pesquisa do laboratório de genética e biologia
molecular bacteriana (LGBMB), por toda ajuda, companhia e colaboração nos experimentos.
Ao Prof. Dr. Wagner José Fávaro e ao grupo de pesquisa do Laboratório de carcinogênese
urogenital e imunoterapia (LCURGIM) pela paciência em ajudar com as metodologias e
análises histológicas.
Ao Prof. Dr. Luiz Fernando Celidônio Zerbini pela oportunidade de colaboração e ao grupo de
pesquisa do laboratório do Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia
(ICGEB) em Cape Town, África do Sul, pela ajuda em minha adaptação, treinamento e
experimentos.
À UNICAMP, pelo acolhimento durante esses anos, e também a todos os funcionários que me
ajudaram de alguma forma.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq Proc. 170567/2017-6) pelo
apoio financeiro. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento
001
6
RESUMO
Diversos fatores ambientais e biológicos são responsáveis pelos altos índices de câncer de
bexiga urinária. O tratamento com Bacillus Calmette-Guérin (BCG) é, atualmente, a forma mais
eficaz de imunoterapia intravesical para evitar a recorrência e a progressão do câncer de bexiga
urinária não-músculo invasivo (CBNMI). Porém, 90% dos pacientes tratados com BCG
apresentam efeitos colaterais, que podem ser locais e/ou sistêmicos e variam de leves irritações
do trato urinário até sepse e óbito. Além disto, há recorrência tumoral em até 31% dos casos.
Diante disto, há o interesse no desenvolvimento de novas alternativas de tratamento antitumoral
baseadas no uso de bactérias vivas atenuadas e de seus produtos purificados. Neste estudo, um
mutante de Salmonella enterica foi avaliado na terapia contra o câncer de bexiga, por apresentar
atenuação da virulência em modelo murino e por apresentar potencial imunomodulatório. Ao
mesmo tempo, foi avaliada a violaceína, um pigmento produzido por algumas bactérias Gram
negativas, que, dentre outras características, apresenta potencial terapêutico contra o câncer.
Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar se Salmonella enterica atenuada pode coabitar com
a microbiota vesical in vivo estimulando respostas inflamatórias dentro dos tumores com e sem
a associação com violaceína. Para avaliar a atividade antitumoral destes tratamentos, foram
realizados ensaios em modelo murino de câncer de bexiga e em cultivo de células de bexiga
humana. O tratamento combinado de S. enterica atenuada e violaceína foi eficiente na inibição
do desenvolvimento tumoral e também na ativação do sistema imune inato dos camundongos
tratados. Os resultados demonstram a viabilidade do uso de S. enterica atenuada e da violaceína
no tratamento alternativo para o câncer de bexiga não músculo invasivo em modelo murino.
Em perspectiva, a manipulação genética de microrganismos, associada à uma caracterização do
mecanismo de ação da violaceína em tumores, pode possibilitar o desenvolvimento de uma
opção terapêutica com menores efeitos colaterais, melhor reparo tecidual e menores chances de
recidiva do que as terapias atuais.
Palavras-chave: Câncer de bexiga, imunoterapia, terapia bacteriana, violaceína, Salmonella
7
ABSTRACT
Several environmental and biological factors are responsible for the high rates of urinary
bladder cancer. Nowadays, the treatment with Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the most
effective form of intravesical immunotherapy to prevent recurrence and progression of non-
muscle invasive bladder cancer (CBNMI). However, 90% of patients treated with BCG have
side effects, which may be local and/or systemic and range from mild urinary tract irritations to
sepsis and death. In addition, there is tumor recurrence in up to 31% of the cases. In view of
this, there is interest in the development of new antitumor treatment alternatives based on the
use of live attenuated bacteria and their purified products. In this study, a mutant strain of
Salmonella enterica was evaluated in the therapy against bladder cancer, because of its
attenuated virulence profile in murine model and based on its immunomodulatory potential. At
the same time, violacein, a pigment produced by some Gram-negative bacteria, was evaluated
regarding its therapeutic potential against cancer, as confirmed in other studies. Thus, the
objective of this study was to evaluate whether attenuated Salmonella enterica can cohabit with
the vesical microbiota in vivo stimulating inflammatory responses within the tumors with or
without the association with violacein. To evaluate the antitumor activity of these treatments,
murine bladder cancer model and human bladder cells culture assays were performed. The
combined treatment of attenuated S. enterica and violacein was efficient in inhibiting the tumor
development and also in the activation of the innate immune system of the treated mice. The
results demonstrate the viability of the attenuated S. enterica and violacein use in an alternative
treatment for murine non-muscle invasive bladder cancer. In perspective, the genetic
manipulation of microorganisms, associated to a characterization of the violacein mechanism
of action in tumors, may allow the development of a therapeutic option with lower side effects,
better tissue repair and less chance of recurrence than current therapies.
Keywords: Bladder cancer, immunotherapy, bacterial therapy, violacein, Salmonella
8
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 11
1.1 Bexiga urinária ............................................................................................................... 11
1.2 Câncer de bexiga ............................................................................................................ 11
1.3 Estudo do câncer em modelo animal .............................................................................. 13
1.4 Imunoterapia e câncer ..................................................................................................... 15
1.5 Violaceína ....................................................................................................................... 18
1.6 Terapia bacteriana........................................................................................................... 20
1.7 Salmonella e câncer ........................................................................................................ 21
1.8 Proteínas associadas ao nucleóide bacteriano (NAPs) e o fator de integração ao
hospedeiro (IHF) .................................................................................................................. 25
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 27
3. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 28
3.1 Objetivos específicos ...................................................................................................... 28
4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 29
4.1 Linhagem bacteriana e atenuação ................................................................................... 29
4.2 Meios de Cultura ............................................................................................................ 29
4.3 Plasmídeos e técnicas básicas de biologia molecular ..................................................... 29
4.4 Construção de mutante de S. enterica ............................................................................ 30
4.4.1 Eletrocompetência ................................................................................................... 30
4.4.2 Amplificação dos fragmentos lineares (Cassetes de recombinação) ....................... 31
4.4.3 Transdução com fagos P22Hint ............................................................................... 31
4.4.4 Complementação ..................................................................................................... 32
4.4.5 Eletroporação ........................................................................................................... 32
4.4.6 Eliminação da resistência ao cloranfenicol com o plasmídeo pCP20 ..................... 33
4.4.7 Construção de Duplo Mutante S. enterica ATCC14028 ∆ihfAihfB ........................ 33
4.5 Animais experimentais ................................................................................................... 34
4.6 Confirmação da atenuação in vivo .................................................................................. 34
4.7 Integridade da camada de LPS ....................................................................................... 35
4.8 Indução química do câncer de bexiga não-músculo invasivo ........................................ 36
4.9 Grupos experimentais ..................................................................................................... 36
4.10 Colonização do trato urinário por S. enterica ATCC14028 ∆ihfAihfB:cat .................. 37
4.11 Análise Histopatológica ................................................................................................ 37
9
4.11 Imunohistoquímica ....................................................................................................... 38
4.12 Western Blotting ........................................................................................................... 39
4.13 Ensaio de citotoxicidade da violaceína em células uroteliais ....................................... 40
4.14 Invasão e sobrevivência em células uroteliais .............................................................. 40
4.15 Análises estatísticas ...................................................................................................... 41
5. RESULTADOS ................................................................................................................ 42
5.1 Construção do duplo mutante ......................................................................................... 42
5.2 Confirmação de atenuação e imunogenicidade .............................................................. 42
5.3 Colonização do trato urinário por S. enterica ATCC 14028ΔihfAΔihfB:cat ................. 44
5.4 Análise Histopatológica .................................................................................................. 45
5.5 Imunohistoquímica ......................................................................................................... 46
5.6 Western Blotting ............................................................................................................. 48
5.7 Ensaio de citotoxicidade da violaceína em células uroteliais ......................................... 50
5.8 Ensaio de invasão, sobrevivência e multiplicação de S. enterica
ATCC14028ΔihfAΔihfB:cat em células ATCC 5637 .......................................................... 51
6. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 53
7. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 60
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 61
9. ANEXO I - AÇÃO DA VIOLACEÍNA EM CÉLULAS DE CÂNCER DE PRÓSTATA
...........................................................................................................................................76
9.1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 76
9.1.1 Próstata humana ....................................................................................................... 76
9.1.2 Câncer de próstata ................................................................................................... 76
9.2 OBJETIVO ................................................................................................................ 77
9.3 METODOLOGIA ...................................................................................................... 78
9.3.1 Ensaio de citotoxicidade ..................................................................................... 78
9.3.2 Visualização do efeito em células ........................................................................... 78
9.3.3 Migração celular ...................................................................................................... 79
9.3.4 Extração de RNA e qPCR ....................................................................................... 79
9.4 RESULTADOS ......................................................................................................... 80
9.4.1 Citotoxidade da violaceína em células de próstata .................................................. 80
9.4.2 Visualização do efeito da violaceína em células de próstata ................................... 81
9.4.3 Migração celular (Wound Healing) ......................................................................... 81
10
9.4.4 PCR em tempo real .................................................................................................. 83
9.5 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 84
9.6 CONCLUSÃO ........................................................................................................... 85
10. ANEXO II – CERTIFICADOS DO COMITÊ DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO
ANIMAL .................................................................................................................................. 86
11. ANEXO III - DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS.............................................89
11
1. INTRODUÇÃO
1.1 Bexiga urinária
A bexiga urinária é um orgão oco em forma de saco e tem a função de armazenar e
excretar urina. Este órgão é composto por um tecido muscular, que forma o músculo detrusor,
envolvido por uma camada serosa. O tecido muscular é ligado ao tecido conjuntivo, onde estão
contidos vasos sanguíneos e linfáticos, que forma a base para as camadas de células uroteliais
da bexiga. A camada urotelial é formada por três a sete camadas de células, dependendo da
distensão do órgão. As células uroteliais podem ser classificadas em três diferentes tipos. A
camada mais superficial do urotélio é formada por apenas uma linha de células elípticas com
citoplasma bastante eosinofílico conhecidas como células guarda-chuva. As células
intermediárias têm membranas bem definidas e com formas que variam entre cubos e pequenos
retângulos. E, por fim, uma linha de células em forma de cubo se organiza sobre uma lâmina
basal bem definida (1-3).
1.2 Câncer de bexiga
De acordo com estimativas recentes, em 2018, foram diagnosticadas mais de 540 mil
pessoas com câncer de bexiga em todo o mundo, sendo que destas, quase 200 mil foram a óbito
(4). No Brasil, foi estimado para o ano de 2018, o diagnóstico de 9480 novos casos de câncer
de bexiga (6690 homens e 2790 mulheres) (5). Dentre os fatores de risco para o
desenvolvimento deste tipo de câncer está a exposição à compostos químicos (aminas
aromáticas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, formaldeídos etc.) presentes na fabricação
de tintas e corantes, em solventes de tinta, produtos da combustão do diesel e, principalmente,
na fumaça do cigarro. Outro fator de risco é o histórico familiar, já que pessoas cujos parentes
de primeiro grau tiveram câncer de bexiga, tem um risco até duas vezes maior de desenvolver
a doença, quando comparado à população em geral. A etnia, o sexo e a idade também estão
associados à incidência deste tipo de câncer. Pessoas caucasianas têm o dobro de chances de
desenvolver câncer de bexiga quando comparadas a afrodescendentes. A incidência desta
doença é muito maior em homens do que em mulheres, sendo o sexto câncer mais comum no
sexo masculino e, em 90% dos casos, o paciente diagnosticado com câncer de bexiga tem mais
12
de 55 anos (5, 6). Além destes fatores de risco, foram relatados casos em que houve o
desenvolvimento do câncer de bexiga associado à infecção pelo verme Schistosoma
haematobium, que causa um tipo de esquistossomose se alojando na bexiga do hospedeiro.
Alguns estudos sugerem que diabetes mellitus, obesidade, papilomavírus humano, consumo
excessivo de carne vermelha e o uso por tempo prolongado de medicamentos como
ciclofosfamida e pioglitazona também podem ser considerados fatores de risco para o
desenvolvimento de câncer de bexiga (7).
Os sintomas mais comuns associados ao câncer de bexiga são hematúria, que é a
presença de sangue na urina, disúria, que é a dor e dificuldade ao urinar, dor abdominal e
constipação (8). A avaliação inicial de um paciente com suspeita de câncer de bexiga se baseia
na citoscopia, avaliação da função renal e análise de imagens do trato urinário superior.
Pacientes que apresentaram citoscopia anormal são submetidas à ressecção transuretral para
que um diagnóstico histopatológico possa ser realizado (7). Em mais de 90% dos casos
diagnosticados, o câncer de bexiga é histologicamente caracterizado como carcinoma urotelial.
As variáveis histopatológicas não-uroteliais mais comuns são o carcinoma de células escamosas
(2-5%) e o adenocarcinoma (1-2%). Estas variáveis histológicas do câncer de bexiga estão
associadas à doença causada pelo verme S. haematobium e são mais prevalentes em áreas
endêmicas desse parasita, como no Egito. O adenocarcinoma vesical também é associado à
extrofia da bexiga, uma má formação congênita (9). De acordo com a classificação mais recente
dos tumores do trato urotelial, feita pela organização mundial da saúde em 2016, os tumores
uroteliais não-invasivos, podem ser distinguidos como carcinoma in situ (pTis) e carcinoma
papilar (pTa), que possui outras variações dependendo do grau de invasividade (10). O pTis é
diagnosticado como uma lesão plana geralmente associada à formas mais agressivas do tumor,
pois tem comportamento imprevisível e pode se espalhar por metástase até em lugares mais
distantes do foco inicial (11). O carcinoma papilar é caracterizado como o desenvolvimento de
tumores em formas de cogumelo ou pólipos que podem se desenvolver em direção à luz da
bexiga ou em direção à lâmina própria. Este tipo de lesão é subdividida em diferentes classes
de acordo com o grau de agressividade, número de camadas de células, presença de figuras
mitóticas e alterações nucleares (10, 12). As lesões uroteliais podem também ser diagnosticadas
como hiperplasia plana, uma lesão benigna, e neoplasia intraurotelial de baixo grau, que é uma
lesões pré-malígna. A hiperplasia plana é o aumento do número de camadas de células, sem
citologia atípica e com figuras de mitose limitadas à camada de células basais. A neoplasia
intraurotelial é caracterizada pelo aumento no número de células e o grau varia de acordo com
13
o nível e quantidade de células atípicas e figuras de mitose (12). Se as células atípicas puderem
ser visualizadas além da lâmina própria, já no tecido conjuntivo, a lesão é classificada como
carcinoma urotelial invasivo (pT1), diagnóstico associado a um alto risco de invasão do tecido
muscular e metástase (11).
Aproximadamente 75% dos diagnósticos de câncer de bexiga no mundo são
caracterizados como câncer de bexiga urinária não-músculo invasivo (CBNMI) (13-16).
Geralmente, o tratamento usado para o CBNMI após a ressecção transuretral é a imunoterapia
intravesical com Bacilo Calmette-Guerin (BCG) para evitar a progressão tumoral e a recidiva
(7). A imunoterapia com BCG ativa a resposta imune induzindo a produção de citocinas como
o fator de necrose tumoral α (TNF-α), o fator estimulante de colônias de macrófagos (GMCSF),
interferon γ (IFN-γ) e interleucinas que por sua vez, induzem a resposta de linfócitos T–helper
e das células natural killer (NK) na bexiga (17). A resposta imune induzida pela instilação de
BCG no organismo tem longa duração, podendo persistir por mais de um ano. Contudo, esta
resposta tem muita variação entre os pacientes e a correlação entre BCG e a expressão de
citocinas ainda é investigada (18, 19). Além disto, mais de 90% dos pacientes tratados com
BCG apresentam sintomas adversos, que variam desde leves irritações no trato urinário até
sepse, e em mais de 30% destes pacientes o câncer reaparece, sendo que nestes casos, muitas
vezes não há mais resposta ao tratamento por BCG, sendo necessária a remoção total da bexiga
(cistectomia radical) (20). Dependendo do grau de agressividade do tumor diagnosticado
histopatologicamente após a ressecção intraurotelial, até mesmo o CBNMI pode ser tratado
com quimioterapia intravesical com mitomicina C, epirrubicina ou doxorrubicina (7). Pacientes
diagnosticados com lesões pT1 devem passar por cistectomia imediata seguida de imunoterapia
com BCG ou quimioterapia intravesical com mitomicina C. Pacientes com lesões acima de pT1,
ou seja, câncer de bexiga músculo invasivo, passam por cistectomia radical e quimioterapia
com cisplatina (7). O estudo de alternativas para o tratamento deste tipo de câncer, como o uso
de bactérias atenuadas ou substâncias com ação imunomodulatória como a violaceína, têm sido
propostas promissoras no tratamento de câncer de bexiga não-músculo invasivo (21-26).
1.3 Estudo do câncer em modelo animal
Com o uso de engenharia genética, enxertos e técnicas de indução viral, física e química,
diversos modelos animais foram criados para o estudo do câncer. As diferentes linhagens
genéticas de camundongos (Mus musculus) têm sido usadas como modelo padrão para pesquisa
14
básica e estudos pré-clínicos desta doença (27). Com o aumento do interesse no
desenvolvimento de novos tratamentos imunomodulatórios, torna-se essencial o
desenvolvimento de modelos de estudo em animais imunocompetentes. O requisito principal
dos modelos de estudo pré-clínicos é a mimetização do desenvolvimento do câncer em
humanos, reproduzindo a heterogeneidade genética com a maior fidelidade possível à doença,
além de incluir as células imunes que configuram o microambiente tumoral (28). O modelo
animal mais usado para a avaliação da toxicidade e eficácia de fármacos é o modelo xenográfico
de células cancerosas humanas. Esse modelo consiste no transplante de células cancerosas de
humanos para camundongos, o que confunde o sistema imune murino, diminuindo a eficácia
deste modelo no estudo de imunoterápicos (28). O melhor entendimento das alterações
genéticas que levam ao câncer, permitiu o desenvolvimento de modelos murinos alterados
geneticamente que apresentam crescimento tumoral autóctone em tecidos específicos. Porém,
o modelo em camundongo geneticamente modificado apresenta variações na latência e
capacidade metastática do câncer, além de ter baixa imunogenicidade (28). O modelo animal
mais antigo e também o mais usado em estudos pré-clínicos de agentes imunoterápicos para o
tratamento de tumores é o modelo singênico, que pode ser desenvolvido a partir do reimplante
de células tumorais isoladas do próprio camundongo ou da indução química, física ou viral do
câncer no próprio animal. Quando há o isolamento e expansão de células tumorais para o
reimplante, o tumor perde sua heterogeneidade genética e, além disto, este modelo fica limitado
à baixa quantidade de linhagens celulares que podem ser transplantadas. Já a indução do câncer
por agentes carcinógenos, com o devido controle sobre a latência e invasibilidade tumoral,
permite o desenvolvimento de um tumor autóctone, num modelo que apresenta uma maior
fidelidade à heterogeneidade genética do câncer, além de manter as características do sistema
imune hospedeiro, tornando o microambiente tumoral apto para o estudo de agentes
imunoterápicos no combate à diferentes tipos de câncer (28).
Em estudos pré-clínicos do câncer de bexiga é comum o uso do modelo singênico por
indução com carcinógenos, que foi usado pela primeira vez em ratos na década de 60 (29, 30).
No passado, diferentes espécies animais, como hamsters, cobaias, cachorros e coelhos foram
usadas para o estudo do câncer urotelial. Porém, por questões éticas e pela facilidade de
manipulação, os pequenos roedores são, atualmente, os mais usados como modelo. Além disto,
o trato urinário inferior e as neoplasias que se desenvolvem na bexiga dos camundongos são
muito parecidos com o do ser humano (31). Dentre os carcinógenos mais usados para o
desenvolvimento deste modelo em camundongos estão o N-Butil-N-(4hidroxibutil)nitrosamina
15
(BBN), o N-[4-(5-nitro-2-furil)-2thiazolil]formamida (FANFT) e o N-metil-N-nitrosoureia
(MNU) (32). O BBN, um derivado metabólico de compostos presentes na fumaça do cigarro,
causa, em camundongos, lesões uroteliais morfologicamente semelhante as de humanos. Esse
composto pode ser administrado por vias oral, subcutânea ou intravesical, causando danos ao
DNA das células uroteliais e induzindo a formação de tumores (31). O FANFT é um
carcinógeno que estimula a mucosa da bexiga, induzindo o desenvolvimento de carcinoma de
células transicionais após 5 a 8 meses de tratamento por via oral. Este composto é menos usado
por ser muito tóxico para o ser humano e para o meio ambiente (32). O MNU é um agente
alquilante, que, após administração via intravesical, induz câncer urotelial pela adição de grupos
metil ao DNA das células de bexiga. Com a administração de apenas uma dose deste composto,
é possível observar o desenvolvimento de tumores após 12 semanas (32-34). Outro carcinógeno
bastante usado para a indução de câncer em diferentes modelos é o N-etil-N-nitrosoureia
(NNN). O NNN é um carcinógeno sintético que causa mutações aleatórias pontuais no DNA
agindo como agente alquilante. Este composto tem alta capacidade de alquilação em oxigênios
presentes nas bases nitrogenadas, induzindo, na maioria das vezes, a transição GC-AT. Além
disto, a presença do grupo etil na molécula de NNN pode causar um erro de identificação das
bases etiladas durante o processo de replicação, resultando no não-pareamento de bases (35,
36). A alta eficiência e especificidade da mutagênese gerada por NNN em modelo murino, faz
com que este carcinógeno seja uma potencial ferramenta para o desenvolvimento e estudo de
tumores em diferentes órgãos de camundongos, inclusive na bexiga.
1.4 Imunoterapia e câncer
Uma das principais estratégias usadas na imunoterapia do câncer é o estímulo da
imunidade antitumoral do próprio paciente baseando-se na habilidade do sistema imune em
identificar e destruir as células cancerosas, criando uma memória de longa duração desta
interação (37). Até o momento, a maioria dos pacientes que não podem ser curados
cirurgicamente, depende de radioterapia e quimioterapia, que são terapias sem muita
especificidade e acabam danificando tecidos não afetados pelo tumor e gerando alta toxicidade.
Por isso, a imunoterapia, ativando uma resposta específica contra as células tumorais, é a
alternativa mais estudada atualmente para tratamento de pacientes com câncer (38).
Alguns tipos de câncer desenvolvem mecanismos para escapar do sistema imune do
paciente, por isso, algumas estratégias de tratamento são baseadas em gerar ou aumentar a
16
resposta imune (39, 40). Dentre estes mecanismos de evasão, estão a baixa imunogenicidade
das células tumorais, devido à baixa expressão de antígenos CHM (Complexo de
Histocompatibilidade Maior), moléculas de adesão, sinais para ativação de células T e citocinas
ativadoras da resposta imune local. Além disto, algumas células de câncer secretam moléculas
imunossupressoras como IL-10, TGF-β e PGE2 (37). Um tipo de imunossupressão é o estímulo
de pontos de checagem imune (Immune Checkpoints). Alguns dos checkpoints mais estudados
atualmente são a proteína de morte celular programada 1 (Programed cell death protein 1 - PD-
1) e a proteína linfócito-T citotóxica 4 (Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 - CTLA-4). Com o
desenvolvimento da imunoterapia contra o câncer pela inibição destas duas proteínas, James P.
Alisson e Tasuku Honjo receberam o prêmio Nobel de medicina em 2018. Estas proteínas tem
função de regular negativamente o sistema imune, quando há resposta excessiva ou muito
prolongada, evitando respostas autoimunes (41). Alguns tipos de câncer expressam ligantes
para estas proteínas enfraquecendo a resposta imune contra as células cancerosas. Por isso,
medicamentos baseados no uso de anticorpos monoclonais para o bloqueio de PD-1 e CTLA-
4, como ipilimumab e nivolumab, têm alta eficiência no tratamento de alguns tipos de câncer
como o de pulmão, rins, mama, melanoma, linfoma de Hodgkin, câncer hepatocelular e câncer
de bexiga (41-43). Além do bloqueio de pontos de checagem imune, existem diferentes formas
de aumentar a imunidade adaptativa, como o as vacinas anticâncer, a terapia com vírus
oncolíticos e a terapia celular adotiva (44). As vacinas anticâncer podem ser terapêuticas,
ativando as células do sistema imune e fazendo com que elas reconheçam antígenos presentes
apenas nas células cancerosas, ou preventivas, usadas para evitar o desenvolvimento de câncer
associado à infecções por vírus oncogênicos como o papilomavírus humano (HPV), o
herpesvírus 8 e o vírus da hepatite B (44). A terapia com vírus oncolíticos, ou viroterapia
oncolítica, é o uso de alguns tipos de vírus que, preferencialmente, infectam e rompem células
cancerosas. Como a ruptura de células tumorais também é um processo imunogênico, o vírus
combate ao câncer de duas formas: se replicando dentro das células cancerosas até o
rompimento e estimulando o sistema imune contra essas células (44). E, por fim, a terapia
celular adotiva, que se baseia na manipulação ex vivo de células T, para que estas expressem
receptores de antígenos quiméricos (Chimeric antigen receptors - CARs). Nesta abordagem, as
células T são extraídas, geneticamente modificadas e reintroduzidas no paciente. As células T,
expressando CARs, conseguem identificar e destruir células cancerosas (44).
Em alguns pacientes, o microambiente tumoral é escasso em células de defesa e
apresentam poucos sinais de ativação do sistema imune. Nestes casos, estratégias são
17
necessárias para o estímulo do sistema imune inato antes de aumentar a resposta da imunidade
adaptativa. Independente dos mecanismos de evasão usados por células cancerosas para escapar
do sistema imune, a ativação da imunidade inata pode ser essencial para o sucesso do tratamento
imunoterápico na supressão da proliferação tumoral e metástase (45). A indução do sistema
imune inato como estratégia imunoterápica no tratamento de câncer foi usada há mais de um
século, quando Willian B. Coley desenvolveu um tratamento para carcinomas e sarcomas,
usando uma mistura de bactérias inativadas, Streptococcus pyogenes e Serratia marcescens,
que chamou de toxina de Coley (46). A mesma estratégia é usada para o tratamento do câncer
de bexiga em estágio inicial desde 1976 com o uso do BCG, uma linhagem atenuada de
Mycobacterium bovis (19, 47). A imunidade inata é ativada pelo reconhecimento de padrões
moleculares associados à patógenos (Pathogen-associated molecular patterns - PAMPs) por
receptores de reconhecimento de padrões (Pattern recognition receptors - PRRs), presentes em
grande parte das células humanas, que reconhecem diferentes antígenos produzidos por
microorganismos invasores (45, 48). Os PRRs também são capazes de reconhecer alguns
padrões moleculares endógenos associados ao dano (Damage-associated molecular patterns –
DAMPS) incluindo alguns antígenos produzidos por células tumorais. Portanto, a ativação do
sistema imune inato, por meio do tratamento com DAMPs ou agonistas de PRRs, pode auxiliar
na resposta imune contra as células malignas no microambiente tumoral (45). Um dos grupos
de PRRs mais importantes para sistema imune inato são os receptores Toll-like (Toll-like
receptors – TLRs), proteínas transmembrana que podem ser localizadas na membrana celular
ou na membrana de endossomos (45). Os receptores TLR2 e TLR4 reconhecem PAMPs de
bactérias Gram positivas (Peptidioglicanos e ácido lipoteicóico) e Gram negativas
(Lipopolissacarídeos) respectivamente, dando início à resposta imune inata (49). Alguns
agentes agonistas destes receptores como o BCG e o monofosforil lipídeo A já são usados em
imunoterapias contra o câncer (45, 50). Quando ativados, esses receptores induzem transdução
de sinal pela via do fator de diferenciação primária de resposta mielóide gene 88 (Myeloid
differentiation primary response 88 - MyD88) e/ou do adaptador contendo domínio TIR
induzindo Interferon-β (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β - TRIF) (51,
52). O sinal gerado pela via MyD88-dependente, ou via canônica, ativa o fator nuclear κB
(Nuclear fator κB – NF-κB), que se liga ao DNA estimulando a produção de citocinas
inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa (Tumor necrosis factor alpha – TNFα) e a
interleucina 6 (IL-6) (45, 52-54). A presença destas citocinas no ambiente tumoral faz com que
macrófagos, células de defesa do sistema imune inato, sejam recrutados para identificar e
18
combater as células do câncer. Os macrófagos, dependendo de sua polarização, podem exercer
função em favor ou contra o desenvolvimento do câncer, sendo que em um tratamento
imunoterápico, preferencialmente, os macrófagos M1 (anti-tumorais) são ativados e os
macrófagos M2 (pró-tumorais) são inibidos ou repolarizados para M1 (50, 55). Já foi
demonstrado que a ativação de receptores TLR pode aumentar a ativação de macrófagos M1,
estimulando um efeito anti-tumoral (50). O resultado da ativação de diferentes TLRs é
complexo e pode tanto reduzir ou inibir o crescimento tumoral, quanto aumentar a proliferação
de células cancerosas e chances de metástase (45, 56). Por isso, estudos são necessários para
descrever quais vias ou sub-vias do sistema imune são ativadas e se a ordem cronológica de
ativação das TLRs ou outros receptores também influencia no tratamento. Muitas
imunoterapias têm se mostrado promissoras para o tratamento do câncer, principalmente,
quando são baseadas na ação sinérgica das imunidades inata e adaptativa, mostrando que a
combinação de tratamentos que ativem os dois tipos de imunidade é essencial para um
tratamento imunoterápico contra o câncer (45).
1.5 Violaceína
A violaceína (3-[1,2-dihidro-5-(5-hidroxi-1H-indol-3-il)-2-oxo-3H-pirrol-3-ilideno]-
1,3-dihidro-2H-indol-2-ona) é um pigmento violeta com massa molecular de 343,3 kDa
produzido por algumas bactérias gram-negativas, sendo Chromobacterium violaceum a mais
conhecida. A produção deste pigmento é regulada por sistema quorum sensing, que é ativado
quando as moléculas de N-acil homoserina lactonas (AHLs), dependendo da concentração no
meio, se ligam à proteína constitutiva CviR (homóloga à LuxR) estimulando a transcrição do
operon VioABCDE. O sistema também envolve a proteína CviI sintase (homóloga à LuxI), que
converte S-acetil metionina e ácidos graxos em AHLs (57, 58). O operon VioABCDE é
composto pelos genes codificadores das enzimas mono-oxigenages FAD-dependentes VioA,
VioC e VioD, da proteína Heme contendo Fe2+ VioB, que é considerada um policetídeo sintase
e, por fim, da enzima VioE, responsável pela conversão de flavonona em isoflavonona (57).
Estas enzimas participam em cinco dos seis passos da biossíntese da violaceína. Primeiramente,
VioA catalisa a formação de ácido indol pirúvico (Indole pyruvic acid - IPA) a partir de uma
molécula de L-triptofano. Em seguida, VioB catalisa a formação de um dímero formado por
moléculas de IPA. VioE catalisa a formação do ácido protodeoxiviolaceínico que é oxidado por
VioD tornando-se ácido protoviolaceínico. Após mais uma oxidação, dessa vez mediada por
19
VioC, é formado o ácido violaceínico. A última reação do processo biossintético é uma
descarboxilação oxidativa não enzimática que finalmente forma a violaceína (57, 59, 60).
Sabe-se que este pigmento apresenta propriedade antibacteriana, antiprotozoário e
antifúngica, podendo assim, ter função na competição entre os micro-organismos de um
determinado ambiente (24, 61, 62). Além disso, a violaceína tem ação antiviral,
antiulcerogênica, imunomodulatória, analgésica, antipirética e antitumoral (24, 25, 61, 63, 64).
Dentre os efeitos já descritos da atividade anticâncer da violaceína, está a capacidade de
aumentar a expressão de genes relacionados à morte celular induzindo apoptose em células de
câncer de mama (MCF-7), Leucemia (HL60 e TF1), câncer cervical (HeLa) e câncer de cabeça
e pescoço (HNC) (57). O efeito apoptótico da violaceína em células de câncer de mama ocorre
pelo aumento da expressão de TNF-α e P53 (25). Também em células de câncer de mama, a
violaceína é capaz de reduzir a expressão da quimiocina CXCL12 (C-X-C Motif Chemokine
Ligand 12) e do receptor CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4), que interagem
aumentando a adesão e migração de células metastáticas (65, 66). A indução de apoptose
promovida pela violaceína em células de leucemia mielóide (HL60) e eritroleucemia (TF1),
que são resistentes à morte celular programada, indica a ativação de uma via não canônica de
morte celular (67). Violaceína induz apoptose em células de câncer cervical (HeLa)
apresentando efeito de hiperpolarização da membrana mitocondrial (68). Em células de
carcinoma de cabeça e pescoço, a violaceína apresenta atividade inibitória de crescimento, in
vitro e in vivo, além de induzir autofagia e apoptose. A ação de violaceína em células de HNC
ocorre pela inibição da via NF-κB, evitando a formação de novos vasos sanguíneos
(neoangiogênese) na região hipóxica do tumor (24). A inibição da via NF-κB por violaceína
também foi observada em células de câncer colorretal (69). Além disto, a violaceína tem
capacidade inibitória da produção de metaloproteinases importantes na angiogênese, como
MMP-2 e MMP-9 (matrix metalloproteinase-2 e matrix metalloproteinase-9) (65). O efeito
citotóxico da violaceína em algumas linhagens de câncer, como MCF-7, células de câncer de
cólon (HCT116 e HT29) e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HN5),
aumenta em condição de hipóxia, inclusive em modelos in vivo (70). Portanto, dependendo das
concentrações e condições em que as doses de violaceína são ministradas, este composto pode
induzir diferentes vias de apoptose em células cancerosas, podendo ser considerado um agente
multialvo em terapia anticâncer (25).
20
1.6 Terapia bacteriana
A associação entre a infecção por bactérias e o efeito antitumoral foi feita pela primera
vez em 1813, quando foi relatada a redução de tumores em pacientes infectados por Clostridium
perfringens. Em 1891, pacientes com sarcomas, mielomas, linfomas e melanomas foram
tratados pela toxina de Coley, que é, como descrito anteriormente, uma mistura de bactérias
inativadas (71, 72). Em 1935, foram iniciados os estudos do uso de BCG em tratamento de
câncer, que foi aprovado em 1976 e é usado até hoje no tratamento de câncer de bexiga (71).
Neste cenário, destacam-se as bactérias que podem ser usadas como vetores genéticos e são
associadas a um efeito benéfico em terapias contra o câncer. Estudos recentes, envolvendo
engenharia genética, aumentaram o interesse neste tipo de tratamento, já que a bactéria
modificada demonstra capacidade de localizar o tecido com tumor, podendo ser usada como
“cavalos de Tróia” para entregar moléculas em áreas inacessíveis para outros tipos de
tratamento, além de apresentar efeito oncolítico (73). Vetores bacterianos apresentam alta
eficiência e baixo custo, sendo mais práticos em relação a outras alternativas, como os vetores
virais. Além disto, o sistema de cultivo bacteriano já é usado em indústrias de biotecnologia,
sendo assim, a infraestrutura necessária para a produção de vetores bacterianos já existe e pode
ser usada com baixo custo (73).
Já foi demonstrado que a terapia bacteriana pode regredir o tumor e promover
sobrevivência em modelo murino, porém, para que este tratamento seja usado em humanos,
pontos importantes precisam ser considerados. Dentre estes pontos estão a toxicidade intrínseca
da bactéria, a eficiência em chegar ao alvo, a instabilidade genética, a incompatibilidade com
outras terapias etc. Também seria necessário definir a dose suficiente para induzir os efeitos
terapêuticos sem apresentar toxicidade sistêmica, tendo em foco, principalmente, os pacientes
imunocomprometidos (74). Controlar a virulência bacteriana é essencial para garantir a
segurança de seu uso no tratamento em humanos. Todos estes desafios podem ser resolvidos
com técnicas de biologia molecular, pela manipulação de vários fatores, como por exemplo a
introdução de deleções gênicas que afetam o metabolismo bacteriano e/ou a virulência. Além
disso, bactérias podem ser utilizadas como vetores de moléculas imunomoduladoras ou tóxicas
para células tumorais, que podem ser carreadas por genes plasmidiais onde o número de cópias
é controlado, assim como o tipo de promotor (constitutivo ou induzível) utilizado na construção
da linhagem recombinante (74). Para determinar quais modificações genéticas podem ser
realizadas em uma bactéria para aumentar a eficiência desta no tratamento anticâncer é
21
necessário uma série de knockouts em genes de patogenicidade, sendo que em pouco tempo,
linhagens bacterianas poderão ser desenvolvidas para diagnose precoce de câncer,
sensibilização do sistema imune, tratamento de tumores primários e de metástases e tratamento
complementar em quimioterapia. Uma vantagem do tratamento bacteriano é a flexibilidade
genética das bactérias, o que permite que estas sejam modificadas para se obter efeitos
terapêuticos mais eficazes, alcançando diferentes locais de tumor e controlando sua
citotoxicidade. Cada vez mais aperfeiçoada, a terapia microbiana está se tornando uma
ferramenta promissora no tratamento anticâncer, detectando, prevenindo e tratando tumores e
metástases (74).
A presença e a replicação de bactérias no interior dos tumores deve-se a um processo
infeccioso propagado pela vascularização e a capacidade da bactéria de sobreviver e crescer em
ambiente com pouco oxigênio mediante a presença de nutrientes, principalmente os
encontrados nas regiões necróticas, como as purinas (75, 76). Além disso, a atração química de
bactérias por compostos presentes em regiões necróticas (aspartato, serina, citrato, ribose,
galactose etc.) produzidos por células cancerosas dormentes, a angiogênese exagerada na região
do tumor e a supressão imunológica local, têm sido sugeridos como fatores que contribuem
para a sobrevivência e replicação bacteriana em tumores (75).
Várias espécies bacterianas, incluindo Salmonella enterica, Listeria monocytogenes e
Escherichia coli, são avaliadas como vetores viáveis (77-83). Neste contexto, pode-se destacar
S. enterica, que tem eficiência em tratamento antitumoral, perfil de segurança em modelo
murino, tropismo para tecidos tumorais e capacidade de transportar e expressar genes
codificadores de inibidores de angiogênese, toxinas e citocinas que oferecem resposta às células
neoplásicas (75, 84).
1.7 Salmonella e câncer
O gênero Salmonella faz parte da família Enterobacteriaceae e é composto por espécies
de bactérias Gram-negativas, anaeróbias facultativas e geralmente flageladas. Dentre estas
espécies está a Salmonella enterica, que causa infecções instestinais e/ou extraintestinais em
humanos após ingestão de água ou alimentos contaminados (85, 86). A dose infectante média
suficiente para iniciar infecções clínicas ou sub-clínicas em humanos varia de 105 a 1010
microrganismos dependendo da sorovariedade de S. enterica ingerida e o estado imunológico
do hospedeiro (87). S. enterica é uma das bactérias mais estudadas em modelos de terapia
22
bacteriana para tratamento do câncer e, dentre os diversos sorovares desta espécie, S. enterica
Typhimurium atenuada é o mais estudado para o uso como agente imunoterapêutico, sendo que
este sorovar pode causar um tipo de infecção em camundongos que mimetiza as infecções
extraintestinais em humanos (71, 88). Em diferentes estudos, esta bactéria tem se mostrado
eficiente na imunomodulação em tratamento de câncer pela indução dos sistemas imunes inato
e adaptativo, além de apresentar citotoxicidade intrínseca com efeito oncolítico. Sua utilidade
neste tipo de tratamento foi demonstrada em diferentes estudos pré-clínicos e clínicos (71). A
atividade antitumoral promovida por S. enterica deve-se à dois fatores principais: a sua
toxicidade direta em células de câncer e a sua imunogenicidade. O seu efeito citotóxico direto
ocorre por indução de apoptose e autofagia nas células tumorais por diferentes mecanismos,
que ainda não foram completamente elucidados (89). Alguns destes mecanismos estão
associados ao acúmulo de bactérias na região afetada e competição por nutrientes, ao efeito de
toxinas secretadas por S. enterica, à ação enzimática de proteínas liberadas após a ruptura
bacteriana e à inibição de fatores de transcrição associados à angiogênese (71, 80). Foi descrito
que S. enterica é capaz de invadir e matar diferentes linhagens de células tumorais em menos
de duas horas (90). Quando aderidas às células tumorais, S. enterica pode se romper liberando
componentes celulares com ação anti-tumoral, como a enzima nitrato redutase, que reduz
nitratos e nitritos presentes nas regiões hipóxicas em óxido nítrico (NO), induzindo apoptose
nas células cancerosas (91, 92). S. enterica regula a formação de novos vasos sanguíneos no
microambiente tumoral reduzindo a expressão do fator de crescimento vascular endotelial
(Vascular endothelial growth factor - VEGF) e do fator 1-alfa induzível por hipóxia (Hypoxia-
inducible factor 1-alpha - HIF-1α) pela inibição da via da proteína quinase B fosforilada/Alvo
Mamífero de Rapamicina fosforilado (Phosphorylated protein kinase B/Phosphorylated
Mammalian Target of Rapamycin - P-AKT/P-mTOR) e da via de sinalização AKT (93). Além
de reduzir a angiogênese, a inibição da via de AKT/mTOR resulta na indução do processo de
autofagia em melanoma (94).
Além da atividade oncolítica intrínseca de S. enterica, outra estratégia para combater o
câncer usando esta bactéria é a sensibilização da imunidade inata e adaptativa, alterando as
características imunossupressivas do microambiente tumoral. Em 1982, foram realizados os
primeiros estudos abordando a capacidade imunoterapêutica de S. enterica Typhimurium, com
o uso de vesículas para o tratamento de sarcoma em modelo murino. O tratamento restaurou a
atividade quimiotáxica dos macrófagos no microambiente tumoral, inibindo o crescimento dos
tumores (95). A partir de então, vários estudos avaliaram a característica imunomodulatória da
23
Salmonella. A terapia bacteriana com S. enterica é capaz de induzir resposta imune pela
ativação de TLRs que reconhecem PAMPs, como LPS e flagelos, estimulando as vias MyD88
e TRIF dependentes. A ativação destas vias induz a produção de citocinas como o TNFα, IFNγ,
interleucina 1 beta (IL-1β) e interleucina 6 (IL6), recrutando células da resposta imune como
NK, neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos T CD8+ e linfócitos B para a região
tumoral (71, 89, 96, 97). Em modelo murino de adenocarcinoma de mama, o tratamento com
S. enterica reduz o crescimento tumoral e prolonga a vida dos animais testados com o estímulo
para liberação de calreticulina (CALR), proteína envolvida na via de morte celular imunogênica
e pelo aumento da expressão de IFNγ e IL-1β (98). A S. enterica, reduzindo a quantidade de
linfócitos T regulatórios CD4+ e CD25+ e dos níveis da enzima Indoleamina 2,3-dioxigenase
(IDO1), reverte a tolerância imune gerada pelo câncer no microambiente tumoral. Este
mecanismo de imunogenicidade deve-se à presença de LPS e lipoproteína de Braun na bactéria
(71).
A eficiência das propriedades de toxicidade intrínseca e imunogenicidade de S. enterica
em ambiente tumoral depende do tropismo desta bactéria pelo tumor e da sua capacidade de
penetração no tecido tumoral e invasão das células cancerosas. Algumas linhagens atenuadas
apresentam a capacidade de colonizar preferencialmente as regiões afetadas pelo câncer, sendo
encontradas em tumores numa proporção 1000 vezes maior do que em órgãos saudáveis (99).
O mecanismo de tropismo tumoral de S. enterica ainda não é completamente conhecido, porém,
sabe-se que a bactéria é atraída quimicamente, inicia a penetração no tecido tumoral e atinge a
região necrótica do tumor pela ativação de receptores de aspartato, serina e ribose/galactose
(100, 101). A região necrótica do tumor é formada pela alta taxa de morte celular associada ao
crescimento descontrolado de células que não acompanha a disposição de nutrientes e oxigênio
(71). A baixa concentração de oxigênio, ou hipóxia, nas regiões necróticas dos tumores também
é usada na localização do câncer pelas bactérias anaeróbicas ou anaeróbicas facultativas, como
S. enterica (71). Além da hipóxia, nutrientes presentes nas regiões necróticas tumorais
permitem que a colonização bacteriana seja eficiente nesses locais e evitam que as bactérias
sejam eliminadas facilmente pelo sistema imune do hospedeiro (102).
Todas as características que tornam S. enterica Typhimurium uma potencial alternativa
no tratamento imunoterápico de câncer (Tropismo pelo tumor, capacidade de penetração
intratumoral, citotoxicidade intrínseca em células tumorais, capacidade de inibição da
angiogênese, imunogenicidade) podem ser manipuladas geneticamente, na construção de um
mutante eficiente na eliminação do câncer e ao mesmo tempo, atenuado, considerando a
24
virulência desta bactéria e visando diminuir os efeitos adversos deste tipo de tratamento. A
atenuação de S. enterica por manipulação genética tem sido realizada pela deleção de genes
associados à integridade da camada de LPS e ao metabolismo bacteriano de nutrientes
essenciais, reduzindo a virulência e capacidade de sobrevivência destes mutantes após a
inoculação no hospedeiro (89). Os mutantes atenuados de S. enterica mais estudados quanto ao
efeito imunomodulatório em modelos in vivo são as linhagens VNP20009, A1-R, SHJ2037 e
χ4550. O mutante VNP20009 tem deleções no gene msbB (Lipid A biosynthesis
myristoyltransferase), relacionado à estrutura do lipídeo A, reduzindo a toxicidade e
imunogenicidade do LPS bacteriano, e no gene purI (Phosphoribosylaminoimidazole
synthetase), necessário para síntese de adenina, uma purina essencial para o microrganismo
(89). O mutante A1-R foi atenuado por deleções nos genes leu e arg, responsáveis pela síntese
de leucina e arginina. A linhagem SHJ2037 foi atenuada pela deleção dos genes relA (GTP
pyrophosphokinase) e spoT ((P)ppGpp synthetase II), relacionados à produção de ppGpp
(Guanosine tetraphosphate), uma molécula sinal que regula a adaptação bacteriana à ambientes
extremos. Por fim, a linhagem χ4550, em que foram deletados os genes cya (Adenilate cyclase)
e crp (Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) activated receptor protein), que codificam
adenosina 3',5'-monofosfato cíclico e seu receptor, proteínas importantes na transdução de sinal
celular (89). Dentre estes mutantes, destacam-se as linhagens VNP20009 e χ4550, que foram
usadas em estudos clínicos para tratamento de melanoma metastático, carcinoma de células
escamosas e carcinoma hepatocelular (103-106). Nestes estudos, foi observado a ausência de
toxicidade destas linhagens e o tropismo bacteriano pelas regiões tumorais em alguns dos
tratamentos, porém, não houve relato de melhora no quadro clínico de nenhum dos pacientes
(103-106). Também foram estudados mutantes com deleção nos genes aro, envolvido na
biossíntese de anéis aromáticos, phoP/phoQ, que regula a patogenicidade de S. enterica e
aumenta sua sobrevivência dentro de macrófagos, purA, envolvido na síntese de purinas, htrA,
relacionado à sobrevivência bacteriana em ambiente estressantes entre outros (89). A
manipulação genética de S. enterica tem se mostrado uma útil ferramenta na construção de
linhagens atenuadas para imunoterapia do câncer, permitindo que esta alternativa possa ser
testada em segurança até mesmo em humanos. Com o avanço da engenharia genética de
microrganismos, em breve será possível encontrar um equilíbrio entre virulência e
imunogenicidade bacteriana, possibilitando o desenvolvimento de uma linhagem ideal para o
tratamento imunomodulatório de diferentes tipos de câncer. Uma das abordagens que podem
ser usadas na atenuação bacteriana para o uso imunoterápico de S. enterica é a construção de
25
mutantes nulos para proteínas associadas ao nucleóide, que regulam a expressão de diversos
genes, incluindo genes codificadores de fatores de patogenicidade.
1.8 Proteínas associadas ao nucleóide bacteriano (NAPs) e o fator de integração ao
hospedeiro (IHF)
Uma série de mecanismos, incluindo o enovelamento do DNA, permite que o
cromossomo bacteriano seja compactado. Em bactérias, essa compactação é realizada por meio
de proteínas de baixo peso molecular que desempenham papel semelhante as histonas
eucarióticas, associando-se ao nucleóide e influenciando na topologia do DNA bacteriano
(107). Essas proteínas são descritas como associadas ao nucleóide bacteriano ou NAPs
(Nucleoid-associated proteins). Apesar de possuírem função semelhante às histonas, as NAPs
bacterianas não formam complexos análogos aos nucleossomas com o DNA (108). Além de
compactar o material genético bacteriano, a associação das NAPs com o DNA, regula a
replicação, a recombinação, o reparo e a transcrição genética, tendo assim, influência na
patogenicidade bacteriana (109, 110). Algumas NAPs ligam-se de forma não específica ao
DNA e tem a capacidade de proteger e manter a sua integridade (111). Além de ter influência
sobre a arquitetura do DNA, as NAPs também desempenham um importante papel na regulação
transcricional de genes que respondem ao estresse devido à mudanças ambientais (109, 110).
A composição proteica do nucleóide bacteriano não é estática e reflete as necessidades celulares
para que a célula se adapte às diversas condições ambientais (112). Na família
Enterobacteriaceae, pelo menos 12 diferentes proteínas foram classificadas como NAP, sendo
que as mais estudadas são IHF (Integration host fator), HU (Heat unstable), FIS (Factor for
inversion stimulation), H-NS (Histone-like nucleoid structuring protein) e DPS (DNA
protection during starvation protein) (113-117).
A proteína IHF foi descrita pela primeira vez em Escherichia coli, como essencial para
a integração e excisão sítio-específica do bacteriófago Lambda (118, 119). Esta proteína é
composta pelas subunidades IHF-α e IHF-β, que têm 25% de homologia entre si e podem
formar tanto heterodímeros quanto homodímeros (120). A forma ativa predominante é a
heterodimérica (αβ), embora os homodímeros αα e ββ também sejam biologicamente ativos
(115, 121). As subunidades α e β, codificadas pelos genes ihfA e ihfB, têm a expressão
aumentada na fase estacionária de crescimento. Estes genes estão localizados em regiões
diferentes do cromossomo bacteriano, sendo regulados independentemente (121, 122). Para
26
regular a expressão genética, o IHF realiza alterações importantes na topografia do DNA
bacteriano, podendo introduzir curvaturas de até 180º, compactando o DNA em até 30% (108,
111, 116, 117, 121). Esta proteína se associa à sítios especificamente localizados entre regiões
de ligação de proteínas reguladoras e regiões promotoras. Ao “dobrar” o DNA, o IHF
proporciona o contato da RNA Polimerase com estas duas regiões, formando o complexo
proteína reguladora/RNA polimerase/região promotora (123). Em S. enterica, IHF regula
positivamente a expressão de genes relacionados à ilhas de patogenicidade bacteriana (SPIs),
genes presentes em plasmídeos de virulência, como o spv (Salmonella plasmid virulence), genes
relacionados ao flagelo e à quimiotaxia desta bactéria, além de outros genes relacionados à
patogenicidade bacteriana (121). IHF é capaz de influenciar a ação e a expressão de outras
NAPs, suprimindo o efeito silenciador de H-NS e estimulando a expressão de FIS, que atua na
inversão de fase flagelar em S. enterica (124, 125). Como IHF é considerado um regulador
global da transcrição genética em E. coli e S. enterica, a deleção dos genes ihfA e ihfB leva à
alteração na expressão de diferentes genes de virulência, reduzindo a patogenicidade destas
bactérias (121, 126).
27
2. JUSTIFICATIVA
Já foi observado que algumas linhagens atenuadas de S. enterica, que atualmente vem
sendo objeto de estudo no Laboratório de Genômica e Biologia Molecular Bacteriana
(Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de Biologia, UNICAMP) sob a
supervisão do Prof. Dr. Marcelo Brocchi, apresentam ação vacinal no tratamento de processos
infecciosos (127) e efeito antitumoral no tratamento de câncer em modelo murino (128). Neste
trabalho, bactérias atenuadas e violaceína foram avaliadas pela primeira vez como
imunomoduladores para o tratamento de câncer de bexiga não músculo invasivo em modelo
murino. O modelo animal para a indução e estudo do câncer de bexiga foi padronizado pelo
grupo de pesquisa do Prof. Dr. Wagner José Fávaro do Laboratório de Carcinogênese
Urogenital e Imunoterapia (Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de
Biologia, UNICAMP). O uso da violaceína foi padronizado em outros estudos realizados pelo
nosso grupo (Igor Alexandre Campos Damiani, Proc. FAPESP 09/12659-1). Este estudo visa
demonstrar mecanismos de imunogenicidade ativados pelo tratamento com composto já
conhecido e bactérias atenuadas. Os resultados obtidos poderão auxiliar no desenvolvimento de
novas alternativas para o tratamento de pacientes com câncer de bexiga, com maiores chances
de reparo tecidual e menores chances do retorno do tumor após o tratamento.
28
3. OBJETIVOS
Avaliar o efeito antitumoral e a resposta inflamatória desencadeada pela ação de
Salmonella enterica atenuada e da violaceína em modelo murino de câncer de bexiga,
estabelecendo os possíveis mecanismos envolvidos na ativação do sistema imune.
3.1 Objetivos específicos
• Construir mutante ΔihfAΔihfB utilizando como background genético a linhagem de S.
enterica Typhimurium ATCC 14028;
• Confirmar a atenuação em modelo murino de infecção;
• Determinar a IC50 da violaceína em culturas de células ATCC 5637, derivadas de câncer
de bexiga;
• Avaliar o efeito dessas mutações na invasão, sobrevivência e multiplicação intracelular
de S. enterica ATCC 14028ΔihfAΔihfB em ATCC 5637;
• Comparar a eficácia dos diferentes tratamentos (S. enterica ATCC 14028ΔihfAΔihfB,
violaceína e S. enterica ATCC 14028ΔihfAΔihfB + violaceína) no tratamento de câncer
de bexiga induzido em modelo murino, comparando com o tratamento com BCG;
• Iniciar a caracterização dos possíveis mecanismos envolvidos na ativação do sistema
imunológico pelos diferentes tipos de tratamentos;
• Caracterização prévia da atividade da violaceína sobre linhagens celulares de câncer de
próstata.
29
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Linhagem bacteriana e atenuação
Foi usada a linhagem S. enterica Typhimurium ATCC 14028, que foi gentilmente
cedida pela Fundação Instituto Oswaldo Cruz, RJ. Esta linhagem foi atenuada com a deleção
dos genes ΔihfA e ΔihfB (IHF - Integration Host Factor).
4.2 Meios de Cultura
Para o cultivo bacteriano, foram utilizados os meios de cultivo: Luria-Bertani (LB), LB-
Ágar (LBA), MacConkey e Salmonella-Shigella (SS). Os antibióticos: Ampicilina (100mg/ml),
Cloranfenicol (25mg/ml) e Tetraciclina (15mg/ml) foram usados quando necessário (129). As
linhagens bacterianas utilizadas foram estocadas a -80ºC em meio LB com 15% de Glicerol
(129). Para o cultivo de células uroteliais, foi usado o meio RPMI (Roswell Park Memorial
Institute).
4.3 Plasmídeos e técnicas básicas de biologia molecular
Os plasmídios pKD46, pKD3 e pCP20, pertencentes ao sistema de recombinação Red
(130), foram mantidos em linhagens de E. coli BW25113, DH10β e BW25141 estocadas em
meio LB com glicerol 15% em Biofrezzer a -80°C. O plasmídio pACYC184 (New England
Biolabs, USA) foi utilizado na complementação dos mutantes. A extração e preparação do DNA
plasmidial foi realizada utilizando kits comerciais para purificação de plasmídeos QIAprep®
Spin Miniprep (QIAGEN, Hilden, Alemanha). A extração do DNA genômico e as reações de
amplificação de DNA seguiram protocolos padrões (129). As concentrações de Mg2+, DNA e
as condições do ciclo foram otimizadas para cada caso. Os plasmídeos que compõem o sistema
Red foram gentilmente cedidos pelo Dr. Barry L. Wanner (Department of Biological Sciences,
Purdue University, West Lafayette, USA). Nosso laboratório está credenciado e autorizado pela
CTNBio e CIBio de nossa instituição para trabalhar com microrganismos geneticamente
modificados de nível II, como é o caso de S. enterica Typhimurium.
30
4.4 Construção de mutante de S. enterica
O mutante ΔihfAΔihfB foi construído por deleção de genes utilizando o sistema Red
(130) e por transdução utilizando fago P22.
4.4.1 Eletrocompetência
Para eletrocompetência, um pré-inóculo de S. enterica Typhimurium 14028 selvagem
foi feito em 3ml de caldo LB, que foi incubado a 37°C por 16-18 horas. A quantidade de 100μl
deste pré-inóculo foi misturada em 100ml de meio LB, que foi incubado com agitação de
150rpm a 37°C, até a DO600 atingir entre 0,6 e 0,8. O cultivo foi então incubado em gelo por 15
minutos. Após esse tempo, a suspensão de bactérias foi centrifugada a 1000xg por 15 minutos
a 4°C (Eppendorf 5804R Rotor F-34-6-38). O sedimento de bactérias foi ressuspendido em
20ml de água estéril gelada. A suspensão foi novamente centrifugada a 1000xg por 15 minutos
a 4°C. O sedimento foi ressuspendido em 20ml de glicerol 10% esterilizado e gelado. A
suspensão foi novamente centrifugada a 1000xg por 15 minutos a 4°C. Após descartar o
sobrenadante, foram feitas alíquotas de 40μl de suspensão bacteriana concentrada em glicerol
10%. Estas alíquotas de células eletrocompetentes foram usadas em seguida para eletroporação
do plasmídeo pKD46. As que não foram usadas foram congeladas imediatamente em nitrogênio
líquido e mantidas a -80°C.
Para a deleção gênica, um pré-inóculo feito a partir da linhagem contendo o plasmídeo
pKD46 foi incubado a 30°C por 16-18 horas. A quantidade de 100μl deste pré-inóculo foi
misturada em 100ml de meio LB com ampicilina e com L-arabinose (2mM), que foi incubado
com agitação de 150rpm a 30°C, até a DO600 atingir entre 0,6 e 0,8. Em seguida, alíquotas
dessas preparações em glicerol 10% foram realizadas como já descrito e usadas para
eletroporação do fragmento linear para a construção dos mutantes.
31
4.4.2 Amplificação dos fragmentos lineares (Cassetes de recombinação)
Os fragmentos lineares para deleção dos genes ihfA e ihfB foram construídos usando o
plasmídeo pKD3 como molde em PCR com 30 ciclos e temperatura de anelamento de 66°C.
Os iniciadores usados foram desenhados para complementar a região do pKD3 adjacente ao
gene de resistência ao cloranfenicol e a região genômica bacteriana adjacente aos genes de
interesse (Tabela 1). Após a amplificação dos fragmentos, o amplicon foi tratado com enzima
de restrição DpnI (New England Biolabs), para digestão de DNA metilado. Após este
tratamento, o material foi dializado para uma maior purificação desses fragmentos.
4.4.3 Transdução com fagos P22Hint
Pré-inóculos foram feitos com as bactérias “doadoras”, que continham as mutações
simples no gene ihfA ou no gene ihfB inseridas usando o sistema Red. Estes pré-inóculos
foram feitos em 3ml de LB com cloranfenicol e foram incubados a 37°C com agitação de
150rpm, por 16-18 horas. Após a incubação, 500μl do pré-inóculo foi misturado à 2ml de
suspensão de fagos (109 unidades formadoras de placa - UFP) e incubado a 37°C por 24 horas.
Ao mesmo tempo, foi feito um pré-inóculo da bactéria “receptora” S. enterica Typhimurium
14028 selvagem em 3ml de LB e foi incubado a 37°C com agitação de 150rpm, por 16-18 horas.
Em seguida, 1,5ml da suspensão de células “doadoras” e fagos foram transferidos para
microtubos de 2ml. Então, 50μl de clorofórmio foram adicionados à suspensão, que após
homogeneização, foi centrifugada em velocidade máxima (12000rpm, Eppendorf 5804R Rotor
F-34-6-38) por 4 minutos e filtrada em filtro de seringa (0,22μm). Em um microtubo limpo,
foram misturados 100μl do pré-inóculo de bactérias “receptoras” e 10μl de suspensão filtrada
(suspensão de fagos). Este microtubo foi incubado a 37°C por 15 minutos sem agitação e após
este tempo, o volume do microtubo foi completado para 1ml com meio LB e incubado
novamente por mais 15 minutos à 37°C sem agitação. A mistura foi então centrifugada, o
sobrenadante foi descartado e o sedimento de bactérias ressuspenso e transferido para placas de
LBA com cloranfenicol. No dia seguinte as colônias que cresceram foram repassadas para uma
placa de LBA com cloranfenicol e a partir das colônias crescidas nesta placa, foram realizadas
as reações de PCR, usando iniciadores de detecção, para confirmação da mutação nos genes
ihfA e ihfB, desta vez por transdução. Este passo é importante para evitar a seleção de mutantes
32
com mutações secundárias durante o processo de recombinação com o sistema Red e/ou clones
com LPS incompleto. As linhagens recombinantes foram testadas em meio MintGreen para a
seleção de linhagens livres de fago P22 (131).
4.4.4 Complementação
Após a confirmação da ausência dos fagos, o mutante simples ΔihfA foi complementado
pela introdução do plasmídeo pACYC184 carreando o gene ihfA inserido de forma a
interromper a sequência do gene cat (cloranfenicol acetil-transferase) (132). Assim, este
plasmídeo conferia resistência apenas à tetraciclina. A complementação deste mutante foi
necessária porque IHF é essencial para que ocorra a integração e a excisão do fago Lambda no
genoma bacteriano, sendo que sua ausência dificulta a construção do duplo mutante pelo
sistema Red, pois este passo também requer um sistema de recombinação funcional. Portanto,
células eletrocompetentes foram feitas a partir do mutante simples S. enterica Typhimurium
14028 ∆ihfA:cat. Estas células foram usadas em seguida para eletroporação do plasmídeo
pACYC184 modificado.
4.4.5 Eletroporação
A quantidade de 100 a 200ng dos plasmídeos pKD46, pCP20, pACYC184 ou dos
fragmentos lineares foram adicionados à alíquota de 40μl de células eletrocompetentes. A
mistura foi transferida para cubeta de eletroporação de 1mm (BioRad, USA) esterilizada,
previamente incubada em gelo. A cubeta foi posicionada em eletroporador Gene Pulser XCell
(BioRad, USA) e um pulso elétrico de 1,8kV, 25µF e 200Ω foi aplicado. Após a eletroporação,
750μl de meio LB em temperatura ambiente foram adicionados à cubeta. A suspensão foi
homogeneizada e transferida para microtubo de 1,5ml, que foi incubado a 30°C por 1 hora.
Após este tempo, a suspensão foi centrifugada a 10.000rpm (Eppendorf 5804R Rotor F-34-6-
38) por 5 minutos e o sedimento bacteriano foi cultivado em placa de LBA com ampicilina a
30°C durante a noite. No dia seguinte as colônias que cresceram foram repassadas para caldo
LB com ampicilina e as culturas foram incubadas durante a noite a 30°C. O cultivo foi usado
para fazer estoque em LB com glicerol 15% que foi mantido a -80°C.
33
4.4.6 Eliminação da resistência ao cloranfenicol com o plasmídeo pCP20
No mutante complementado S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA:cat
pACYC184:ihfA:tc foi possível inserir o plasmídeo pCP20 para retirada do gene de resistência
ao cloranfenicol. Para isso, foram feitas células eletrocompetentes a partir do mutante S.
enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA:cat pACYC184:ihfA. Estas células eletrocompetentes
foram eletroporadas com o plasmídeo pCP20, que contém genes de resistência à ampicilina e
ao cloranfenicol, origem de replicação termossensível e carrega gene codificador de
recombinase responsável pelo evento de recombinação/deleção do cassete cromossômico de
resistência ao cloranfenicol. Após eletroporação, as bactérias foram cultivadas em placa de
LBA com ampicilina a 30°C durante a noite. Em seguida, as colônias foram cultivadas em placa
LBA, à 43°C por 16-18 horas. A partir deste cultivo, as amostras foram repassadas para placas
de LBA com tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol ou sem antibióticos, que foram incubadas a
37 °C. As amostras que cresceram apenas nos meios sem antibióticos foram consideradas
mutantes S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA sem resistência a cloranfenicol e livre do
plasmídeo que complementava a deleção. A presença de “cicatriz genômica” nestas amostras,
ou seja, a sequência remanescente após o evento de recombinação/deleção de cat, foi
confirmada por PCR, usando os primers ihfA DT para detecção.
4.4.7 Construção de Duplo Mutante S. enterica ATCC14028 ∆ihfAihfB
A amostra de S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA sem resistência ao cloranfenicol
foi usada como “receptora” para receber por transdução com fago P22Hint a mutação ihfB, a
partir de mutante simples S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfB:cat, usada como “doadora”.
Para isso, foi realizada o procedimento de transdução como descrito anteriormente. A
construção do duplo mutante S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA∆ihfB:cat foi confirmada
por PCR utilizando iniciadores flanqueando a região deletada (Tabela 1).
34
Tabela 1: Iniciadores utilizados para a construção e detecção das deleções em ihfA e ihfB.
com sequências complementares ao genoma da S. enterica 14028 e ao plasmídeo pKD3.
Iniciador Sequence
ihfA mut Foward TTAAAAGAGCGATTCCAGGCATCATTGAGGGATTGAACCTCATATGAATATCCTCCTTAGTTC
ihfA mut Reverse TGCCGCAATACACCCTGATGGATGTTATGCCTGGATCTGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
ihfB mut Foward CAGCCAATTTGCCTTTAAGGAACCGGAGGAATCATGACCAAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
ihfB mut Reverse TTTTTCGGGTTCAAGTTTTGCGTTAAAACTTAACCGTAAATCATATGAATATCCTCCTTAGTTC
ihfA DT Foward GCGTGATTTTACGGTGGGTA
ihfA DT Reverse TTGCGGAGGGTTATAAGAGC
ihfB DT Foward TTTCGGTCGAATAGCGTTT
ihfB DT Reverse GTTTCGGCCTGTAATCAAGC
4.5 Animais experimentais
Para a confirmação da atenuação do duplo mutante, foi realizado ensaio de
sobrevivência in vivo com 30 camundongos BALB/cAnUnib fêmeas de 6 a 10 semanas de
idade. A linhagem BALB/cAnUnib foi escolhida por ser mais frequentemente usada como
modelo na avaliação da patogenicidade de S. enterica Typhimurium. Para o modelo de câncer
de bexiga foram utilizados 30 camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6J, na faixa etária de
7 semanas, pesando em média 20 gramas. Todos os animais foram obtidos do Centro
Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área de Ciência em Animais de Laboratório
(CEMIB - UNICAMP). Os animais de todos os grupos experimentais receberam água e a
mesma dieta sólida ad libitum (Nuvilab, Colombo, PR, Brasil), sendo mantidos em
microisoladores em racks ventilados (ALESCO) em salas com temperatura, fotoperíodo e
humidade controladas. Os protocolos envolvendo ensaios in vivo foram aprovados pelo Comitê
de Ética em pesquisa com animais (CEUA) da Unicamp sob os números 4643-1/2017 e 4297-
1/2016 sendo seguidas todas as normas do CONCEA (Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal) para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
4.6 Confirmação da atenuação in vivo
A atenuação do mutante duplo S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA∆ihfB:cat foi
confirmada por ensaio de sobrevivência. Neste ensaio, suspensões de bactérias mutantes e
selvagens foram inoculadas por via intragástrica com o uso de uma agulha de gavagem
(CA2800, 22GA, 1mm, curvatura 8°). Os animais foram divididos nos seguintes grupos
35
experimentais: Grupo controle: uma dose intragástrica de 0,1ml de PBS (Phosphate Buffered
Saline) (129); Grupo 1: uma dose intragástrica de 0,1ml de suspensão bacteriana contendo
7,5x102 unidades formadoras de colônia (UFC) de S. enterica Typhimurium 14028 selvagem;
Grupo 2: uma dose intragástrica de 0,1ml de suspensão bacteriana contendo 7,5x103 UFC de S.
enterica Typhimurium 14028 selvagem; Grupo 3: uma dose intragástrica de 0,1ml de suspensão
bacteriana contendo 7,5x104 UFC de S. enterica Typhimurium 14028 selvagem; Grupo 4: uma
dose intragástrica de 0,1ml de suspensão bacteriana contendo 7,5x105 UFC de S. enterica
Typhimurium 14028 selvagem; Grupo 5: uma dose intragástrica de 0,1ml de suspensão
bacteriana contendo 7,5x108 UFC de S. enterica Typhimurium 14028 mutante ∆ihfA∆ihfB:cat.
Os animais foram observados por 30 dias após o inóculo.
4.7 Integridade da camada de LPS
A integridade da camada de lipopolissacarídeos (LPS), importante para a
imunogenicidade bacteriana, também foi confirmada em eletroforese em gel de poliacrilamida
(PAGE) (133, 134). O LPS bacteriano foi extraído e concentrado para corrida em PAGE por
centrifugação de suspensão bacteriana a 10000rpm por 1,5 minutos seguida da homogeneização
do sedimento bacteriano com 50µl de tampão Laemmli (Tris-HCl, pH 6.8 0,625M, glicerol
25%, SDS 2%, e azul de bromofenol 0,01%). À esta suspensão, foram adicionados 10µl de
proteinase K (2,5mg/ml) e o material foi incubado à 60°C por 1 hora. A suspensão foi então
aplicada em gel de poliacrilamida 12% que foi submetido à uma voltagem constante de 100V
por 1 hora e 40 minutos. Após a corrida o gel foi imerso em solução fixadora (Etanol 40% e
ácido acético 5%) por 24 horas, e, em seguida, em solução oxidante (Etanol 40%, ácido acético
5% e ácido periódico 0,7%) por 5 minutos. O gel foi lavado por imersão e agitação constante
em água destilada por 10 minutos. A lavagem foi repetida 3 vezes. O gel foi então tratado em
solução corante de prata (NaOH 0,02M, hidróxido de amônio 1,5% e nitrato de prata 0,7%) por
10 minutos em agitação. Após esse tempo, o gel foi lavado como descrito anteriormente e as
bandas foram reveladas em solução reveladora (Formaldeído 0,02% e ácido cítrico 0,005%)
com agitação. A intensidade da coloração foi controlada manualmente, sendo a coloração
interrompida por processo de lavagem em água destilada. Após coloração, o gel foi fotografado
e imerso em solução de conservação (Metanol 55% e glicerol 0,2%). Neste ensaio, foram
comparados os perfis eletroforéticos dos extratos de LPS de S. enterica ATCC 14028 selvagem,
S. enterica ATCC 14028 ΔihfA, S. enterica ATCC 14028 ΔihfB, S. enterica ATCC 14028
36
ΔihfAΔihfB e, como controle negativo, de Pseudomonas aeroginosa com deleção do gene wzz,
gene essencial para a biossíntese da camada de LPS. A amostra de Pseudomonas aeroginosa
Δwzz foi gentilmente cedida pela Dra. Regina Lúcia Baldini (Departamento de bioquímica,
Instituto de química, Universidade de São Paulo, SP, Brasil).
4.8 Indução química do câncer de bexiga não-músculo invasivo
Para a indução do CBNMI, os animais foram anestesiados com Cloridrato de Xilazina
2% (5mg/kg i.m.; König, São Paulo, Brasil) e Cloridrato de Ketamina 10% (60mg/kg, i.m.; Fort
Dodge, Iowa, EUA) por via intraperitonial. Após a anestesia foi instilada uma dose intravesical
de 1,5 mg/kg de N-etil-N-nitrosouréia (NNN - Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) dissolvida
em PBS a cada 7 dias (semanas 1, 2 e 3), totalizando 3 doses. Os animais que não receberem
NNN foram considerados como Grupo Controle. Uma semana após a última dose de NNN
foram iniciados os tratamentos. Para as inoculações intravesicais foram usados cateteres
flexíveis 20 gauge (Abocath, São Paulo, Brasil).
4.9 Grupos experimentais
Os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais: Grupo controle: uma
dose semanal intravesical de 0,1 ml de PBS com DMSO (Dimetilsufóxido) 0,02% por 6
semanas consecutivas; Grupo câncer: Após indução química do câncer de bexiga, recebeu uma
dose semanal intravesical de 0,1 ml de PBS com DMSO 0,02% por 6 semanas consecutivas;
Grupo câncer + BCG: Após indução química do câncer de bexiga, recebeu uma dose semanal
intravesical de 105 UFC – 40 mg de BCG (Fundação Ataulpho de Paiva, Rio de Janeiro, Brasil)
diluída em 0,1 ml de PBS por 6 semanas consecutivas; Grupo câncer + violaceína: Após
indução química do câncer de bexiga, recebeu uma dose semanal intravesical de 1,5 mg/kg de
violaceína dissolvida em 0,1ml de PBS com DMSO 0,02% por 6 semanas consecutivas; Grupo
câncer + Salmonella: Após indução química do câncer de bexiga, recebeu uma dose semanal
intravesical de 105 UFC de S. enterica Typhimurium ATCC 14028 ∆ihfA∆ihfB:cat em 0,1 ml
de PBS por 6 semanas consecutivas; Grupo câncer + Salmonella + violaceína: Após indução
37
química do câncer de bexiga, recebeu tratamento simultâneo com S. enterica Typhimurium
ATCC 14028 ∆ihfA∆ihfB:cat e violaceína 1,5mg/kg de acordo descrição anterior.
A violaceína usada neste trabalho foi extraída e purificada (grau de pureza de 95%) pelo
prof. Dr. Nelson Eduardo Duran Caballero do Laboratório de Nanotecnologia, UNICAMP. As
doses intravesicais nos diferentes grupos experimentais foram instiladas via cateter flexível 20
gauge (Abocath, São Paulo, Brasil). Após o tratamento, os animais foram eutanasiados e as
bexigas urinárias foram coletadas.
4.10 Colonização do trato urinário por S. enterica ATCC14028 ∆ihfAihfB:cat
Após inoculação de S. enterica ATCC14028 ∆ihfAihfB por via intravesical, a urina dos
animais foi coletada após uma semana para avaliar a colonização do trato urinário por esta
linhagem bacteriana. Amostras de urina foram inoculadas em meio SS e MacConkey para
detectar a presença de S. enterica.
4.11 Análise Histopatológica
Amostras da bexiga urinária de cada grupo experimental foram coletadas e fixadas em
Bouin (Ácido pícrico 1%, Formaldeído 10% e Ácido acético glacial 5%) por 24 horas. Após a
fixação, os tecidos foram desidratados por imersão em soluções de etanol em uma série
crescente de concentração de álcool (70, 80 e 100%). Após a desidratação, os tecidos foram
diafanizados em xilol por 2 horas e incluídos em polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis,
MO, EUA). Em seguida, os materiais foram seccionados em micrótomo Biocut 1130 (Reichert-
Jung, Slee Orgentec Company, Munique, Alemanha) em cortes com 5µm de espessura, que
foram corados em Hematoxilina-Eosina e fotografados em fotomicroscópio Nikon Eclipse Ni-
U (Nikon, Tóquio, Japão) equipado com câmera Nikon DS-RI-1 (Nikon, Tóquio, Japão). As
lesões uroteliais foram classificadas conforme o estadiamento proposto pelo consenso da
Organização Mundial da Saúde / Sociedade Internacional de Patologia Urológica (135).
38
4.11 Imunohistoquímica
Cortes com 5µm de espessura feitos em micrótomo rotativo Biocut 1130 (Reichert-
Jung, Slee Orgentec Company, Munique, Alemanha), coletados em lâminas silanizadas foram
utilizados para análise imunohistoquímica. Os cortes foram desparafinizados em estufa a 60°C
por 16-18 horas. Após a retirada da parafina, os cortes foram reidratados e a recuperação
antigênica foi realizada com a incubação do material em tampão citrato por 3 ciclos de 5
minutos no micro-ondas (Panasonic Piccolo style, Panasonic corporation, JP) em potência
máxima. Após o resfriamento das amostras em temperatura ambiente, os cortes foram lavados
3 vezes com TBS-T (Tris-Buffered Saline - Tween) por 5 minutos cada vez. A peroxidase
endógena foi bloqueada com H2O2 1% em metanol por 15 minutos. Os cortes foram novamente
lavados com TBS-T por 3 vezes de 5 minutos. Para o bloqueio de proteínas inespecíficas, os
cortes foram incubados com BSA (Bovine Serum Albumine) 3% diluído em TBS-T por 1 hora.
Após o bloqueio, os cortes foram incubados com anticorpos primários (Tabela 3) diluídos em
TBS-T com BSA 1% durante a noite a 4°C. O material foi então novamente lavado com TBS-
T por 3 vezes de 5 minutos e incubado com anticorpo secundário conjugado com HRP
(Horseradish Peroxidase), diluído em TBS-T com BSA 1% por 2 horas. O material foi lavado
novamente com TBS-T, 3 vezes por 5 minutos. Os antígenos foram revelados com solução
DAB (Tetra-Hidrocloreto de Diaminobenzidina 0,04% e Peróxido de hidrogênio 0,08% em
tampão PBS) em aproximadamente 20 segundos cada lâmina. As lâminas foram contra-coradas
com hematoxilina de Harris (Dinâmica química contemporânea®, SP, Brasil) por 25 segundos
e lavadas em água corrente por 5 minutos. O material foi então desidratado por imersão em
soluções de etanol em uma série crescente de concentração de álcool, como descrito
anteriormente. Os cortes foram então selados com lamínula e Entellan® New (Merck, USA),
analisados e fotografados em fotomicroscópio Nikon Eclipse Ni-U (Nikon, Tóquio, Japão)
equipado com câmera Nikon DS-RI-1 (Nikon, Tóquio, Japão). Todo o procedimento foi
realizado com suporte de lâminas e aspirador Aspiramax e nos passos de bloqueio de
peroxidases, incubação com anticorpos e revelação com DAB foi usado o Kit Super Sensitive
Polymer-HRP IHC Detection System (BioGenex, USA). Para avaliar a intensidade das
imunorreatividades dos antígenos, a porcentagem de células uroteliais positivas da bexiga
urinária foi examinada em dez campos para cada anticorpo com aumento de 400x usando o
programa ImageJ com o plugin ImmunoRatio (136). A intensidade da marcação foi graduada
em uma escala de 0-3, e expressa como 0 (ausência de imunorreatividade), 0% de células
39
uroteliais positivas; 1 (fraca imunorreatividade), 1-25% de células uroteliais positivas; 2
(moderada imunorreatividade), 26-50% de células uroteliais positivas; 3 (intensa
imunorreatividade), acima de 50% de células uroteliais positivas.
Tabela 2: Anticorpos primários usados nas análises de Imunohistoquímica
Anticorpos Código/Procedência Diluição Nome
TLR2 BS1019R, Bioss, USA 1:100 Toll-like Receptor 2
TLR4 SC293072, Santa Cruz Biotech, USA 1:75 Toll-like Receptor 4
TNF-α SC1350, Santa Cruz Biotech, USA 1:75 Tumor Necrosis Factor α
NF-κB Ab7970, Abcam, USA 1:300 Nuclear Factor Kappa B
IL-6 SC1265, Santa Cruz Biotech, USA 1:75 Interleukin 6
IKK-α SC7218, Santa Cruz Biotech, USA 1:100 IκB Kinase complex subunit α
MyD88 SC11356, Santa Cruz Biotech, USA 1:50 Myeloid Differentiation Primary Response 88
4.12 Western Blotting
Amostras da bexiga urinária de alguns grupos experimentais: (Grupo câncer, grupo
câncer + violaceína, grupo câncer + Salmonella e grupo câncer + Salmonella + violaceína)
foram homogeneizadas em tampão de extração (Triton-x 1%, NaCl 150mM, Tris 10mM pH
7,4, EDTA 1mM, Hepes 1mM pH 7,6, PMSF 0,2 mM e 10 µL/ml de coquetel inibidor de
proteases (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Os extratos de proteína da bexiga urinária
foram obtidos por centrifugação durante 20 minutos a 12000 rpm a 4oC (Eppendorf 5804R
Rotor F-45-24-11). A determinação da concentração de proteínas foi realizada pelo método de
Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories Inc., USA) e as leituras foram feitas
em espectrofotômetro (Multiskan FC Photometer, Standard; Thermo Fisher Scientific, EUA).
O correspondente a 30 microgramas de proteínas foi aplicado no gel de SDS-poliacrilamida,
preparado conforme descrito por Laemmli (137). Após a eletroforese, o material foi transferido
eletricamente para membranas de nitrocelulose. As membranas foram então bloqueadas com
BSA 3% diluído em TBS-T por uma hora e incubadas com os anticorpos primários para
detecção de Bcl-2 (ab7973, 1:100, Abcam, USA), IFNγ (SC7802, 1:500, Santa Cruz Biotech,
USA) e TLR4 (SC30002, 1:1000, Santa Cruz Biotech, USA) diluídos em solução de BSA 1%.
Após lavagem com tampão TBS-T, as membranas foram incubadas por 2 horas com os
anticorpos secundários HRP conjugados diluídos em BSA 1% (Anti-mouse IgG conjugado com
peroxidase, A2304, 1:10000, Sigma-Aldrich, EUA e Anti-rabbit IgG conjugado com
40
peroxidase, AP132P, 1:5000, Sigma-Aldrich, EUA). Após nova série de lavagens com TBS-T,
a atividade peroxidásica foi revelada com solução DAB. O anticorpo para detecção de β-actina
(SC47778, 1:1000, Santa Cruz Biotech, USA) foi usado como controle endógeno. A membrana
foi digitalizada e a intensidade da marcação obtida nas diferentes situações foi quantificada
através do programa ImageJ (136).
4.13 Ensaio de citotoxicidade da violaceína em células uroteliais
Foi utilizada a linhagem 5637 (ATCC®HTB-9™) de carcinoma tipo II de urotélio de
bexiga humana, gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Wagner José Fávaro (Depto. Biologia Celular
e Estrutural, Instituto de Biologia, Unicamp). Após a incubação das células uroteliais com
diferentes concentrações de violaceína (20μM, 10μM, 5μM, 2,5μM, 1,25μM, 0,625μM,
0,3125μM and 0,15625μM), a viabilidade foi avaliada pelo teste de sal de tetrazólio (MTT)
como descrito anteriormente (138). Este teste quantifica as células viáveis, já que suas enzimas
mitocondriais são capazes de reduzir o sal de tetrazolium em formazan, que é insolúvel em água
e tem uma cor roxa. A absorbância da solução de formazan, a 570nm, indica indiretamente a
viabilidade celular. Este teste foi realizado em placa de 96 cavidades usando uma concentração
de células inicial de 7,5.103 células por cavidade.
4.14 Invasão e sobrevivência em células uroteliais
A capacidade de invasão e sobrevivência intracelular das linhagens S. enterica
Typhimurium 14028 selvagem e S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA∆ihfB:cat foi avaliada
com o ensaio de gentamicina para eliminar bactérias extracelulares. Foi utilizada a linhagem
ATCC 5637. Aproximadamente 3x105 células uroteliais foram distribuídas por cavidade (1ml
por cavidade) em 2 microplacas de 24 cavidades (COSTAR®, Corning Incorporated, USA) que
foram incubadas a 37°C, com 5% de CO2, por 24 horas. As colônias bacterianas, crescidas em
LBA no dia anterior, foram diluídas em meio RPMI e aplicados sobre as monocamadas de
células uroteliais, resultando em um MOI (Multiplicidade de infecção) de aproximadamente 10
células bacterianas para cada célula urotelial. Em seguida, as placas foram incubadas a 37°C,
com 5% de CO2 por 1 hora (Tempo de infecção). Após este tempo, as cavidades foram lavadas
duas vezes com PBS. Para isso, 1ml de PBS foi aplicado em cada cavidade, a microplaca foi
41
levemente agitada e o PBS foi retirado com pipeta. Após a lavagem, foi aplicado 1ml de RPMI
(Cultilab, SP, Brasil) com gentamicina (100μg/ml) em cada cavidade e a microplaca foi
incubada novamente a 37°C, com 5% de CO2 por mais 1 hora. Após esse tempo, as cavidades
foram novamente lavadas 2 vezes com PBS e em uma das microplacas, foram aplicados 1ml de
RPMI com gentamicina (20μg/ml) por cavidade, esta placa foi incubada novamente a 37°C,
com 5% de CO2 por mais 5 horas (Teste de sobrevivência). Na outra placa (Teste de invasão),
após última lavagem com PBS, 100μl de PBS em cavidades aleatórias de cada tratamento,
foram plaqueados para controle. Este controle serve para verificar se a gentamicina foi eficiente
em eliminar as bactérias que não invadiram as células. Então, foram aplicados 200μl de solução
de Triton X100 (0,1%) em PBS em cada cavidade, para que as células uroteliais fossem
rompidas e liberassem as bactérias que as invadiram. Esta última suspensão em Triton X100
foi diluída em PBS e plaqueada em LBA para determinação da concentração de UFC/ml. Após
o tempo de incubação da outra placa, foi realizado o mesmo procedimento para lavagem da
monocamada, controle de eficiência de gentamicina, lise celular e plaqueamento para
contagem.
4.15 Análises estatísticas
As análises foram realizadas no software GraphPad Prism versão 7.0 para Windows
(GraphPad Software, USA). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da
média. Quando comparados dois grupos, foi utilizado o teste exato de Fisher. Quando
necessário, a análise de variância (ANOVA) foi realizada, seguida de pós-teste de Tuckey para
comparação entre grupos. Os resultados que apresentaram um nível de significância menor que
0,05 foram considerados significantes.
42
5. RESULTADOS
5.1 Construção do duplo mutante
Foram construídos os mutantes S. enterica ATCC 14028∆ihfA; 14028∆ihfA
pACYC184:ihfA e 14028∆ihfA∆ihfB:cat por recombinação usando o sistema Red seguido de
transdução com fago P22Hint. A confirmação da ausência de fagos após cada transdução foi
realizada em meio Mint Green. No duplo mutante, o gene ihfA foi deletado e o gene ihfB foi
substituído pelo gene de resistência ao cloranfenicol presente no plasmídeo pKD3 como pode
ser observado no gel (Figura 1).
5.2 Confirmação de atenuação e imunogenicidade
A inoculação da linhagem selvagem em quantidades relativamente baixas (103, 104 e 105
UFC) foi letal para os camundongos e, após inoculação de 108 UFC de S. enterica Typhimurium
14028 ∆ihfA∆ihfB:cat, nenhuma mortalidade foi observada. Estes resultados confirmam uma
alta atenuação desta linhagem em modelo murino (Tabela 3).
Tabela 3: Ensaio de sobrevivência in vivo em que suspensões bacterianas foram
inoculadas por via oral em camundongos BALB/cAnUnib fêmeas (5 por grupo)
Grupos Linhagens / UFC Sobreviventes / Inoculados
1 ATCC14028 (7,5 x 102) 4 / 5
2 ATCC14028 (7,5 x 103) 0 / 5
3 ATCC14028 (7,5 x 104) 0 / 5
4 ATCC14028 (7,5 x 105) 0 / 5
5 ATCC14028ΔihfAB (1,16 x 108) 5 / 5
Controle PBS 5 / 5
43
Figura 1: A. Esquema descritivo dos eventos da mutação pela metolodogia λRed. B. Gel de Agarose 1% para
confirmação da construção do duplo mutante 14028∆ihfA∆ihfB:cat
A integridade da camada de LPS de S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA∆ihfB:cat foi
confirmada após corrida em gel de poliacrilamida onde os perfis eletroforéticos foram
comparados entre amostras selvagens, mutantes e um controle negativo (Figura 2). Apesar da
construção dos mutantes envolver uma etapa de transdução por fago P22, que utiliza LPS como
receptor para a infecção bacteriana, é usual que seja feito um controle quanto a integridade da
camada de LPS bacteriano uma vez que procedimentos como a eletroporação podem favorecer
a seleção de mutantes com camada de LPS incompleta.
44
Figura 2: Gel de poliacrilamida para a confirmação da integridade da camada de LPS bacteriana,
mostrando os perfis eletroforéticos esperados para amostras com camada de LPS íntegro (2-5) e camada de
LPS incompleta (6).
5.3 Colonização do trato urinário por S. enterica ATCC 14028ΔihfAΔihfB:cat
Após o cultivo em meio MacConkey e SS da urina coletada dos camundongos 7 dias
após o tratamento, verificou-se o crescimento de colônias características de S. enterica (Gram
negativas, não fermentadoras de lactose e produtoras de ácido sulfídrico - H2S), demonstrando
que esta bactéria foi capaz de colonizar o ambiente vesical dos camundongos (Tabela 4). Como
S. enterica não faz parte do microbioma natural da bexiga de camundongos e a infecção urinária
por este tipo de bactéria é rara, ainda mais em animais isolados, o isolamento de S. enterica da
urina dos camundongos tratados e a sua ausência em camundongos não tratados suporta a
persistência bacteriana ao menos 1 semana após a inoculação. Os dados ainda indicam que a
administração concomitante da violaceína não inibiu a colonização por parte de S. enterica,
embora na análise em questão, a dose de violaceína utilizada foi menor do que a utilizada nos
experimentos posteriores (Tabela 4).
45
Tabela 4: Fenótipos observados de bactérias isoladas da urina de camundongos tratados
e não tratados
Grupos
Meios
Ágar
LB
Ágar LB +
Cloranfenicol
Ágar MacConkey
(Lac-)
Ágar SS
(H2S+)
Controle não tratado + - - -
Tratamento com S. enterica ATCC
14028ΔihfAΔihfB:cat (105 UFC) + + + +
Tratamento com S. enterica ATCC
14028ΔihfAΔihfB:cat (105 UFC) +
Violaceína (0,375mg/kg)
+ + + +
5.4 Análise Histopatológica
Foi observado que o tratamento combinado de violaceína e S. enterica Typhimurium
14028 ∆ihfA∆ihfB:cat promoveu a redução e/ou a inibição da progressão do tumor quando
comparados com os controles não tratados. A efetividade deste tratamento foi observada em
80% dos casos usando violaceína 1.5 mg/kg e 105 UFC de S. enterica ATCC14028
ΔihfAΔihfB:cat (Tabela 5). No entanto, os tratamentos apenas com violaceína ou com a bactéria
mostraram ser pouco eficientes na redução/inibição tumoral. Os diagnósticos histopatológicos,
em ordem do menor para maior agressividade foram: Sem evidência de tumor primário;
Hiperplasia plana (aumento no número de células sem apresentar atipia); Neoplasia
intraurotelial de baixo grau (aumento no número de células, com pouca atipia); Carcinoma in
situ (aumento no número de células, muita atipia e desorganização celular); Carcinoma urotelial
papilar (aumento no número de células com atipia e crescimento em forma de pólipo que pode
ser em direção à luz vesical ou à lâmina própria) e Câncer urotelial de alto grau invadindo
lâmina própria (aumento no número de células com muita atipia e desorganização, inclusive da
lâmina basal, permitindo a invasão de células uroteliais na camada de tecido conjuntivo). Um
exemplo de cada um destes diagnósticos pode ser visualizado na figura 3.
46
Tabela 5: Diagnósticos histopatológicos por tratamento
Histopatologia
Grupos
Controle
(n = 5)
Câncer
(n = 5)
Câncer +
BCG
(n = 5)
Câncer +
violaceína
(n = 5)
Câncer + S.
enterica
(n = 5)
Câncer + violaceína
+ S. enterica
(n = 5)
Sem evidência de
tumor primário 100% (5) - - - - -
*Hiperplasia plana - - 40% (2) - 20% (1) -
**Neoplasia
intraurotelial de baixo
grau
- - - 40% (2) - 80% (4)
***Carcinoma in situ - 100% (5) - 60% (3) 60% (3) -
***Carcinoma
urotelial papilar - - 20% (1) - 20% (1) 20% (1)
***Câncer urotelial
de alto grau invadindo
lâmina propria
- - 40% (2) - - -
*Lesões benignas: Hiperplasia plana; **Lesões pré-malígnas: Neoplasia intraurotelial de baixo grau;
***Lesões malígnas: Carcinoma in situ, Carcinoma urotelial papilar e Câncer urotelial de alto grau
invadindo lâmina propria.
5.5 Imunohistoquímica
Com a análise da imunoreatividade das lesões uroteliais em cada tratamento, foi
possível registrar o aumento na expressão de proteínas relacionadas à via canônica do sistema
imune inato, especialmente nas amostras dos animais que receberam o tratamento combinado
de violaceína e S. enterica Typhimurium 14028 ∆ihfA∆ihfB:cat. (Figura 4 e tabela 6).
47
Figura 3: Fotomicrografias representativas de tecido de bexiga de camundongo C57BL/6J com 5µm de
espessura corados com hematoxilina-eosina. A: Controle sem câncer induzido, urotélio normal; B:
Hiperplasia plana observada em animal tratado com BCG; C: Neoplasia intraurotelial de baixo grau
observada em animal tratado com S. enterica mutante e violaceína; D: Carcinoma urotelial papilar
invertido, observado em um dos animais tratados com S. enterica mutante e violaceína; E: Carcinoma in
situ, observado em controle câncer não tratado; F: Câncer urotelial de alto grau invadindo lâmina própria,
observado em um dos animais tratados com BCG. A seta indica células de câncer urotelial invadindo a
lâmina própria. O comprimento da barra de referência é 50µm.
48
Figura 4: Fotomicrografias representativas com diferentes intensidades de imunorreatividade dos antígenos
TLR2 (1-5), Myd88 (6-10), Ikkα (11-15), NFκB (16-20), TNFα (21-25), TLR4 (26-30) e IL6 (31-35) em tecido
de bexiga de camundongo após os diferentes tratamentos. O comprimento da barra de referência é 50µm.
5.6 Western Blotting
A expressão de IFNγ, TLR4 e Bcl-2 foi alterada nos diferentes tratamentos testados. O
tratamento com a violaceína reduziu a expressão de Bcl-2. Nos camundongos tratados apenas
com S. enterica ATCC 14028ΔihfAΔihfB:cat a expressão de TLR4 foi aumentada. E nos
camundongos em que foi testado o tratamento combinado, houve aumento na expressão de
TLR4 e IFNγ. Alguns dos tratamentos combinados e apenas com S. enterica
ATCC1402814028ΔihfAΔihfB:cat levaram à redução da expressão de Bcl-2 (Figuras 5 e 6).
49
Tabela 6: Valores de imunomarcação das lesões uroteliais
Proteínas/Grupo
experimental Câncer
Câncer +
BCG
Câncer +
violaceína
Câncer + S.
enterica
Câncer + S. enterica +
violaceína
TLR2 2 (39,2%) 2 (42,4%)* 2 (42,5%) 2 (39,3%) 3 (57,4%)*
MYD88 2 (35,2%) 2 (49,7%) 2 (46,3%) 2 (43,8%) 3 (55,6%)*
IKKα 2 (44,5%) 2 (43%)* 2 (45,6%)* 2 (49,5%)* 3 (54,6%)*
NFκB 2 (36,9%) 2 (43,8%) 2 (46,5%) 2 (49,6%)* 3 (51,7%)*
TNFα 2 (28,5%) 2 (43,7%) 2 (41,8) 2 (44,6%) 3 (51,3%)*
TLR4 2 (41,1%) 2 (48,2%) 3 (54,1%) 2 (41,4%) 3 (54,5%)
IL6 2 (44,4%) 3 (50,9%) 2 (38,9%) 3 (53%)* 2 (46,1%)
Não marcado = 0; Marcação fraca (1-24%) = 1; Marcação moderada (25-49%) = 2; Marcação forte (>50%) = 3;
*Estatisticamente significativo (p<0,05) em comparação ao grupo controle câncer (Teste exato de Fisher)
Figura 5: Western Blotting utilizando anticorpos específicos para detecção e quantificação de marcadores
imunológicos. As proteínas foram extraídas da bexiga de camundongos submetidos a diferentes
tratamentos, separadas por SDS-PAGE (12%), transferidas para membranas de nitrocelulose e incubadas
com anticorpos específicos. As bandas detectadas evidenciam a detecção das proteínas β-actina (controle),
Bcl-2, TLR4 e IFNγ nas amostras avaliadas frente aos diferentes tratamentos.
50
Figura 6: Expressão diferencial das proteínas TLR4, Bcl-2 e IFNγ comparadas ao controle endógeno e
normalizadas com o controle DMSO em GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, USA).
*Estatisticamente significativo (p<0,05) em comparação ao grupo controle DMSO (One-way ANOVA
seguido de teste de Tuckey).
5.7 Ensaio de citotoxicidade da violaceína em células uroteliais
Os resultados obtidos a partir do ensaio de citotoxicidade da violaceína em células
ATCC 5637 foram plotados em um gráfico (Figura 7) onde o eixo horizontal representa o
logaritmo da concentração de violaceína (Log[violaceína]) que variou de 0,15 a 20µM. A partir
destes dados, foi possível definir a concentração inibitória 50% (IC50) da violaceína usando o
51
programa GraphPad Prism 7.0. A violaceína apresentou um IC50 de 3,7μM em 24 horas de
incubação com células de carcinoma de bexiga.
Figura 7: Ensaio de citotoxicidade da violaceína em células de carcinoma de bexiga ATCC 5637. As células
foram tratadas com concentrações crescentes (0,15 a 20µM) de violaceína por 24 horas e a viabilidade
celular foi avaliada por ensaio de MTT. Os valores representam média e desvio padrão de três experimentos
independentes.
5.8 Ensaio de invasão, sobrevivência e multiplicação de S. enterica
ATCC14028ΔihfAΔihfB:cat em células ATCC 5637
Foi observado que a deleção dos genes ihfA e ihfB não interferiu na capacidade de
invasão da S. enterica ATCC14028ΔihfAΔihfB:cat em células de bexiga humana ATCC 5637,
porém, reduziu a capacidade de sobrevivência e multiplicação no ambiente intracelular. A
adição de violaceína 1μM não alterou a capacidade de invasão ou sobrevivência da linhagem
mutante (Figura 8).
52
Figura 8: Ensaio de invasão e sobrevivência/multiplicação de S. enterica 14028 selvagem e duplo mutante
ΔihfAΔihfB:cat com e sem a adição de violaceína 1μM após 1 hora (invasão) e 6 horas (sobrevivência) de
incubação com células ATCC 5637. *Estatisticamente significativo (p<0,05) em comparação ao grupo S.
enterica Typhimurium 14028 Selvagem no teste de sobrevivência (One-way ANOVA seguido de teste de
Tuckey)
53
6. DISCUSSÃO
Desde o começo do século passado, bactérias atenuadas tem sido usadas como agentes
terapêuticos antitumorais (46). Nas últimas décadas, os subprodutos do metabolismo bacteriano
também têm chamado a atenção dos pesquisadores. A violaceína, dentre os diferentes
compostos produzidos por bactérias, tem demonstrado atividade antitumoral em vários estudos,
sendo que os mecanismos de ação que levam à esta atividade variam nos diferentes modelos
estudados. Pra citar um exemplo, foi demonstrado o aumento na expressão da proteína
associada ao fagossomo LC3 (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) em células
FaDu (Carcinoma de células escamosas da faringe), CAL-27 (Carcinoma de células escamosas
da língua), SCC-15 (Carcinoma de células escamosas da língua) e SALTO (Células de câncer
na glândula salivar) após o tratamento com violaceína, sugerindo a indução da autofagia nestas
células (24). Porém, no mesmo ano, outro estudo mostrou que a violaceína, apesar de aumentar
a expressão de LC3, induz a morte celular, dentre outros mecanismos, pela inibição do processo
de autofagia e acúmulo produtos do estresse metabólico em células de melanoma (139). Além
da influência da violaceína sobre o processo de autofagia, o efeito apoptótico deste composto é
descrito em diferentes estudos in vitro e in vivo (24, 25, 69, 139, 140). Já foi demonstrado, por
exemplo, que a violaceína é capaz de induzir apoptose em diferentes linhagens celulares pela
redução de expressão de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2 protein), que regula negativamente a
apoptose, e o aumento na expressão de proteína x associada à Bcl-2 (Bcl-2-associated X protein
– Bax), um regulador positivo de apoptose (24). A violaceína apresentou o mesmo efeito
regulatório em Bax e Bcl-2 em outro estudo com células MCF-7 (25). A redução da expressão
de Bcl-2 a partir do tratamento com violaceína também foi observada no presente estudo,
indicando que esta pode ser uma via de indução de apoptose em modelo murino de câncer de
bexiga. Além desta via de apoptose, já foi sugerido que a violaceína pode induzir a morte celular
programada em células HL60 pela ativação da via de TNF- α (141). As amostras de bexiga de
camundongos tratados com violaceína apresentaram aumento na imunorreatividade de TNF-α
em comparação aos controles, o que também pode representar a ativação desta via no processo
de apoptose induzido por violaceína neste modelo.
Em estudo com modelo murino de carcinoma sólido de Ehrlich, o tratamento sistêmico
com extratos de violaceína resultou na redução da massa tumoral em mais de 50% em
comparação com o controle. O modelo de câncer Ehrlich consiste no transplante de células de
adenocarcinoma mamário de camundongo mantidas em forma não diferenciada, por diversas
54
passagens in vivo. Neste estudo, o câncer foi estabelecido na pata posterior direita dos
camundongos e o tratamento foi realizado por via intraperitoneal. Devido à eficiente reposta
antitumoral, após inoculação sistêmica, contra um tumor com alta velocidade de crescimento,
os autores sugeriram que a atividade deste composto neste modelo de câncer, ocorreu pela
ativação da resposta imune inata (142). Também com experimentos in vivo, Masuelli et al.
observaram que a violaceína é capaz de inibir o crescimento de tumores em modelo xenográfico
de câncer de cabeça e pescoço em camundongos. Neste estudo, a violaceína foi aplicada por
via intratumoral e foi reportada a redução do crescimento dos tumores e o aumento na
sobrevivência dos camundongos comparado ao grupo controle tratado com DMSO, uma vez
que a violaceína é solubilizada neste composto (24). No presente estudo, foi observada uma
redução e/ou inibição de crescimento tumoral em 40% dos camundongos tratados com
violaceína 1,5mg/kg. Doses menores de violaceína foram menos eficientes (Dados não
mostrados). Além disto, o tratamento com violaceína foi capaz de modular a resposta imune
dos camundongos, aumentando levemente a imunorreatividade das proteínas associadas à via
TLR4-Myd88-NFκB nas células do urotélio dos animais avaliados em comparação ao controle
não tratado. Especula-se aqui, que a ativação desta via pela violaceína acontece de forma
indireta, pela alteração da microbiota vesical, com o aumento da prevalência de bactérias Gram
negativas neste ambiente. Esta hipótese precisa, no entanto, ser confirmada experimentalmente.
Em contraste, estudos in vitro demonstraram que a violaceína é capaz de reduzir expressão de
NF-κB e a translocação deste fator de transcrição para o núcleo celular. NF-κB faz parte de uma
das vias do processo inflamatório e é superexpresso em câncer de cabeça e pescoço, induzindo
angiogênese e aumentando a invasibilidade das células cancerosas (24). Em 2015, foi
demonstrado que a violaceína é capaz de reduzir o processo de inflamação aguda em modelo
murino, induzido por inoculação de LPS bacteriano por via intraperitoneal, além de reduzir a
inflamação crônica em modelo murino de encefalomielite autoimune. Neste caso, foi observado
um aumento significante na expressão de IDO e a redução dos níveis de citocinas inflamatórias
IL-6 e TNF-α (143). No presente estudo também foi observada, através da imunorreatividade
em ensaios imunohistoquímicos, uma leve redução nos níveis de IL-6 nas amostras de bexiga
tratadas com violaceína em comparação ao controle e aos outros tratamentos. Sendo assim, a
violaceína parece ter capacidade regulatória em diferentes vias do sistema imune, podendo
aumentar ou diminuir a expressão de citocinas inflamatórias dependendo do modelo de câncer
estudado.
55
A manipulação genética para a atenuação de S. enterica Typhimurium se mostrou eficaz
na construção de mutantes seguros e com propensão em se alocarem nas regiões tumorais,
funcionando como imunoterápicos em diferentes modelos animais. A linhagem A1-R, por
exemplo, é auxotrófica incapaz de sintetizar os aminoácidos essenciais leucina e arginina. Estes
mutantes apresentam tropismo pelas regiões necróticas do câncer, onde estes nutrientes são
liberados após a morte e o rompimento do tecido tumoral. Foi demonstrado que esta linhagem
é capaz de destruir células primárias e metastáticas de câncer em modelos xenográficos de
câncer em camundongo sem afetar o tecido normal do animal (144). Algumas das construções
genéticas bacterianas, como VNP20009 e χ4550, foram usadas, inclusive, em ensaios clínicos
em fase I. Essas atenuações foram consideradas seguras o suficiente para serem testadas em
humanos e, apesar de colonizarem as regiões afetadas pelo câncer e estimularem o aumento dos
níveis de citocinas inflamatórias circulantes em alguns dos pacientes tratados, estas linhagens
não se mostraram eficazes na redução ou inibição de crescimento tumoral (103-105). Não se
sabe com clareza, o motivo a que se deve a ineficiência clínica destes tratamentos em estudos
em humanos. Geralmente, os estudos relacionados ao desenvolvimento de um mutante para o
uso em tratamento imunoterápico buscam a estabilidade genética, a imunogenicidade, o
tropismo, a manutenção da citotoxicidade intrínseca bacteriana contra células tumorais e a
segurança, ou falta de patogenicidade/toxicidade nos modelos animais utilizados.
Usando um modelo xenográfico, Hirsch-Werle et al. (2016) demonstraram a redução da
massa tumoral originária da injeção de células de melanoma murino (B16-F10) em
camundongos C57BL/6J após inoculação de linhagem atenuada de S. enterica por via
intratumoral. Naquele trabalho, a linhagem mutante de S. enterica Typhimurium utilizada
apresentava deleção do gene ihfA (ΔihfA), que codifica uma das duas subunidades do IHF. O
fator de integração do hospedeiro é uma proteína ligada ao nucleóide bacteriano que
desempenha importante papel na topologia e compactação do DNA genômico, assim como na
regulação de diferentes atividades como transcrição, tradução e transposição (121). Dessa
maneira, mutações nos genes codificadores de IHF apresentam um efeito pleiotrópico, afetando
a virulência bacteriana (121, 126). Entretanto, apesar de apresentarem atividade antitumoral, os
mutantes ΔihfA também apresentaram alta toxicidade (128). Uma alternativa utilizada ainda
naquele estudo foi a construção de mutantes duplos ΔihfAΔasd (128). O gene asd (Aspartate-
semialdehyde dehydrogenase) codifica uma enzima responsável pela síntese ácido
diaminopimélico, componente essencial da parede de peptideoglicano, o que compromete a
integridade da parede celular dos mutantes em que este gene foi deletado (145, 146). No
56
entanto, a linhagem ΔihfAΔasd apresentou um perfil de atenuação acentuado e foi pouco efetiva
quanto a atividade antitumoral (128).
Baseados nestes resultados e para evitar a toxicidade previamente observada, no
presente estudo foi utilizado uma nova linhagem mutante na tentativa de se alcançar padrões
mais balanceados quanto à atenuação e imunogenicidade. Objetivando a construção de um
mutante com atenuação mais pronunciada em relação ao mutante simples ΔihfA, e, ao mesmo
tempo com maior atividade antitumoral em relação à linhagem ΔihfAΔasd, considerando-se a
atenuação de mutantes ihf, foi construído uma linhagem contendo deleção dos genes (ihfA e
ihfB) que codificam ambas subunidades de IHF (α e β). Outro aspecto importante a ser
considerado é que como a reversão da atenuação para um perfil de virulência não pode ser
descartado, o uso de mutantes duplos adiciona maior segurança à linhagem, diminuindo a
possibilidade de reversão para o fenótipo selvagem de virulência.
IHF pode ser encontrada na célula tanto na sua forma heterodimérica (αβ), como na
forma de homodímeros (αα ou ββ), sendo que estudos de transcriptoma demonstraram que cada
uma dessas formas parece regular grupos específicos, mas sobrepostos de genes, embora os
maiores efeitos na expressão gênica sejam observados em mutantes duplos (121). Essas
observações foram feitas utilizando a linhagem de S. enterica Typhimurium SL1344 (121). As
linhagens SL1344 e ATCC 14028 são referências no estudo da biologia de S. enterica e, de
fato, existem diferenças fenotípicas e genotípicas entre elas (147). No entanto, apesar das
diferenças, espera-se que mutantes ΔihfAΔihfB tenham um padrão de atenuação mais
pronunciado do que mutantes simples. De fato, dados prévios de nosso laboratório com S.
enterica Enteritidis indicam que mutantes duplos são mais atenuados que mutantes simples
(dados não publicados), o que nos direcionou a realizar esta construção utilizando o background
genético da linhagem S. enterica ATCC 14028. Nossos dados demonstram o perfil de atenuação
da virulência dessas linhagens quando testados em camundongos BALB/cAnUnib, uma vez
que doses de 103 UFCs da linhagem selvagem estiveram associadas a mortalidade de animais,
enquanto que 108 UFCs da linhagem mutante foram bem toleradas pelos animais quando
inoculadas por via oral.
O tratamento do câncer de bexiga no modelo murino com este novo mutante não se
mostrou eficiente quando administrado isoladamente. Porém, a S. enterica
ATCC14028ΔihfAΔihfB:cat foi capaz de estimular o sistema imune inato do camundongo, com
o aumento dos níveis de proteínas da via canônica associada à ativação de TLR4 e o aumento
na expressão de IFNγ quando comparado ao controle não tratado. Apesar de ainda não estar
57
descrito na literatura todos os genes regulados pela proteína IHF em S. enterica, nós observamos
que o mutante que não produz essa proteína é atenuado em mais de 10000 vezes quando
comparado com a linhagem selvagem em modelo murino. Além disso, foi visto que a proteína
IHF não tem influência sobre a formação da camada de LPS bacteriana, que é reconhecido pela
TLR4, iniciando uma reação em cascata para a liberação de IL-6 e TNF-α, citocinas que parece
ter um papel importante na colonização bacteriana do tumor e no recrutamento de células de
defesa (148). IFNγ também tem um importante papel na imunomodulação do câncer.
Dependendo do câncer tratado, o aumento na expressão desta citocina pode apresentar
vantagens como: recrutamento de células do sistema imune inato, aumento de fatores
antitumorais produzidos por macrófagos, redução do processo de angiogênese, redução da
proliferação celular e indução de apoptose (149). Em estudo clínico, Giannopoulos et al.
observaram que pacientes com câncer de bexiga, tratados com IFNγ após ressecção transuretral,
apresentaram menor taxa de reincidência, comparados aos pacientes tratados com mitomicina
C. Estes autores demonstraram que o tratamento com IFNγ é capaz de aumentar a quantidade
de células de defesa como células T e NK no microambiente tumoral (150).
Um dos motivos que podem estar associados à baixa eficácia do tratamento do câncer
de bexiga em modelo murino com o mutante descrito neste estudo é o background genético
bacteriano. Enquanto este estudo estava sendo realizado, Sanapala et al. (2018) demonstraram
que o background genético é um fator importante nas características imunogênicas de linhagens
recombinantes. No estudo em questão, foi demonstrado que mutante ΔaroA da linhagem UK-
1 foi capaz de induzir resposta imunológica em camundongos BALB/c com mais eficiência do
que o mesmo mutante derivado da linhagem ATCC 14028 (151). Além disso, a linhagem ATCC
14028 parece ser menos invasiva do que a linhagem SL1344 (147). Contudo, nossos dados
indicaram que a linhagem mutante foi capaz de invadir células ATCC 5637 em cultura, apesar
de IHF afetar a expressão dos genes da ilha de patogenicidade 1 (IPS-1), responsável pela
invasão celular (121). Por outro lado, nossos dados demonstram que a capacidade de
sobrevivência intracelular da S. enterica ATCC14028ΔihfAΔihfB:cat foi afetada, indicando
que a expressão dos genes da Ilha de Patogenicidade 2 (IPS-2), responsável pela sobrevivência
intracelular, pode ter sido alterada. Este não é um aspecto negativo, uma vez que a atenuação
bacteriana é uma característica desejável para diminuir a toxicidade. Portanto, baseado em
estudos comparativos entre linhagens de S. enterica Typhimurium (147, 151), é possível
especular que a eficácia antitumoral pode ser melhorada se uma linhagem bacteriana com
diferente background for utilizada. Além disto, alterações genéticas para promover maior
58
invasibilidade de S. enterica Typhimurium ATCC 14028 podem contribuir para o aumento da
atividade antitumoral desta linhagem. Que seja do nosso conhecimento, este é o primeiro relato
sobre o uso de S. enterica como agente antitumoral em modelo de câncer de bexiga.
Apesar do tratamento do câncer de bexiga com o novo mutante atenuado não ter sido
eficiente quando administrado isoladamente, quando combinado com a violaceína, apresentou
uma taxa significativa de redução e/ou inibição do desenvolvimento tumoral, o que foi
observado em 80% dos animais. Este tratamento combinado aumentou o nível de proteínas
TLR2 e 4, induzindo a via Myd88 dependente (via canônica) do sistema imune inato. A indução
do sistema imune por esta via estimula a expressão de citocinas inflamatórias como TNFα e IL-
6 como pudemos observar pelo ensaio de imunohistoquímica. Um importante resultado
considerando a maior complexidade do modelo de câncer usado comparado ao modelo
xenográfico. O modelo singênico de câncer de bexiga induzido quimicamente, apesar das
dificuldades na padronização, permite o estudo do tumor em camundongos imunocompetentes
e a avaliação da resposta imune do hospedeiro, representando de forma mais eficiente a
complexidade dessa doença.
Como observado, o mutante de S. enterica construído não perde a capacidade de invasão
celular, embora não consiga sobreviver ou se replicar dentro das células de bexiga com a mesma
eficiência que a bactéria selvagem. Este resultado mostra que há um equilíbrio entre a virulência
e a toxicidade da linhagem usada, já que o mutante ainda é capaz de se aderir e invadir a célula
de bexiga, permanecendo em menor número em ambiente intracelular. Quando adicionada, a
violaceína não altera a capacidade de invasão ou sobrevivência da bactéria atenuada, portanto,
o efeito sinérgico só pôde ser notado in vivo, onde foi observado que a combinação de S.
enterica ATCC14028ΔihfAΔihfB:cat e violaceína foi o tratamento mais eficiente na redução
tumoral em modelo murino de câncer de bexiga. A maior eficiência do tratamento simultâneo
com S. enterica atenuada e outras tratamentos como radioterapia e quimioterapia já foi
reportada em outros estudos (152-158). Embora o mecanismo envolvido na redução tumoral
causada pela ação combinada da terapia bacteriana com a violaceína não tenha sido
completamente elucidada, pode-se especular que a violaceína, que pode ter uma ação
bactericida no ambiente intravesical, facilita a colonização, invasão e, consequentemente, a
ativação do sistema imune por S. enterica atenuada. A hipótese é baseada no fato de que já foi
descrito que o efeito bactericida da violaceína é consideravelmente mais eficiente em bactérias
Gram positivas do que em linhagens Gram negativas (159-162). Embora parte do mecanismo
da ação bactericida da violaceína tenha sido demonstrado por Cauz et al. e Aruldass et al. (62,
59
160), ainda não é claro o porquê deste efeito ser significantemente maior em bactérias Gram
positivas. Além disto, em 2018, foi demonstrado que o ambiente vesical de camundongos
C57BL/6J apresenta um “oncobioma” característico, composto principalmente por Gardnerella
(Gram variável) e Bifidobacterium (Gram positiva) (163). Mudanças na riqueza de algumas
espécies bacterianas presentes na bexiga devido à alterações associadas ao desenvolvimento de
câncer também já foram descritas em camundongos e humanos (163-165). Alguns autores
sugerem que a microbiota da bexiga influencia até mesmo na imunoterapia com BCG, que é
usada atualmente para evitar a recidiva do câncer em estágio inicial após ressecção (166).
Outra hipótese, que pode ser levantada a partir dos resultados obtidos com o tratamento
combinado, é que a violaceína pode modular a resposta inflamatória causada por S. enterica,
evitando que o sistema imune hospedeiro apresente uma resposta exagerada aos componentes
bacterianos, o que poderia estimular o desenvolvimento do câncer ao invés de sua regressão ou
inibição (54, 149). Como já foi descrito anteriormente, a violaceína é capaz de reduzir o
processo inflamatório causado por LPS em modelo murino (143). Visto que a inflamação pode
influenciar tanto na regressão, quanto no estímulo do crescimento tumoral, através da indução
dos processos de angiogênese e mitose, é importante que a expressão das vias dos sistema imune
seja modulada de forma que o efeito do tratamento imunoterápico seja eficaz na redução e evite
a reincidência do tumor (54). Já foi descrito, por exemplo, que o efeito biológico benéfico do
INFγ no tratamento do câncer segue um padrão dose-dependente em forma de curva gaussiana,
apresentando maior eficácia em doses baixas e médias quando comparado à doses mais altas
(167).
Ainda são necessários outros estudos que comprovem algumas das hipóteses levantadas
neste trabalho, elucidando o mecanismo de ação da violaceína, tanto em relação às células de
câncer de bexiga, quanto em relação ao microbioma intravesical.
60
7. CONCLUSÃO
Pela primeira vez, em modelo murino de câncer de bexiga, foi avaliado o tratamento
com violaceína e S. enterica mutante, que apresentaram ação sinérgica na imunomodulação e
redução/inibição de desenvolvimento tumoral. Este tratamento combinado foi mais eficiente no
tratamento dos tumores do que todos os outros avaliados neste estudo, inclusive o BCG, que já
é utilizado clinicamente como parte do tratamento para este tipo de câncer. Além disto, a
linhagem S. enterica Typhimurium ATCC 14028 ΔihfAΔihfB:cat, construída no presente
estudo, se mostrou altamente atenuada no modelo murino de infecção e, no modelo de câncer
estudado, a violaceína apresentou efeito imunomodulatório e considerável eficiência na redução
e/ou inibição do crescimento dos tumores de bexiga, principalmente quando combinada à
terapia bacteriana. Ainda são necessários mais estudos, envolvendo a caracterização da
virulência do mutante construído, levando em consideração a possibilidade do melhoramento
genético desta linhagem, aumentando sua atenuação, tropismo e até mesmo tornando-a vetor
de toxinas e citocinas com potencial ação antitumoral. Também é necessária, uma
caracterização mais detalhada da violaceína neste modelo, considerando, em perspectiva, a
construção de linhagens bacterianas de S. enterica atenuadas que expressem este composto.
61
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. de Groat WC, Yoshimura N. Anatomy and physiology of the lower urinary tract.
Handbook of clinical neurology. 2015;130:61-108.
2. Sobbota J. Atlas de Anatomia Humana. 21th ed2000.
3. Pontén F, Jirström K, Uhlen M. The Human Protein Atlas—a tool for pathology. The
Journal of Pathology. 2008;216(4):387-93.
4. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer
statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in
185 countries. CA: a cancer journal for clinicians. 2018;68(6):394-424.
5. Ministério da Saúde INdCJAGdSI. Estimativa 2018, Incidência de câncer no Brasil.
Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA), 2017.
6. Society AC. Cancer A-Z https://www.cancer.org/cancer.html2016 [updated
23/05/2016; cited 2018 03/08/2018].
7. DeGeorge KC, Holt HR, Hodges SC. Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment.
American family physician. 2017;96(8):507-14.
8. Shephard EA, Stapley S, Neal RD, Rose P, Walter FM, Hamilton WT. Clinical features
of bladder cancer in primary care. The British journal of general practice : the journal of the
Royal College of General Practitioners. 2012;62(602):e598-604.
9. Matulay JT, Narayan VM, Kamat AM. Clinical and Genomic Considerations for
Variant Histology in Bladder Cancer. Current oncology reports. 2019;21(3):23.
10. Humphrey PA, Moch H, Cubilla AL, Ulbright TM, Reuter VE. The 2016 WHO
Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs-Part B: Prostate and
Bladder Tumours. European urology. 2016;70(1):106-19.
11. Wijkstrom H, Cohen SM, Gardiner RA, Kakizoe T, Schoenberg M, Steineck G, et al.
Prevention and treatment of urothelial premalignant and malignant lesions. Scandinavian
journal of urology and nephrology Supplementum. 2000(205):116-35.
12. Goetsch SJ, Cooper K. An approach to papillary urothelial lesions, including a
discussion of newly described papillary lesions of the urinary bladder. Advances in anatomic
pathology. 1998;5(5):329-45.
13. Kassouf W, Traboulsi SL, Kulkarni GS, Breau RH, Zlotta A, Fairey A, et al. CUA
guidelines on the management of non-muscle invasive bladder cancer. Canadian Urological
62
Association journal = Journal de l'Association des urologues du Canada. 2015;9(9-10):E690-
704.
14. Kamat AM, Bagcioglu M, Huri E. What is new in non-muscle-invasive bladder cancer
in 2016? Turkish journal of urology. 2017;43(1):9-13.
15. Cassell A, Yunusa B, Jalloh M, Mbodji MM, Diallo A, Ndoye M, et al. Non-Muscle
Invasive Bladder Cancer: A Review of the Current Trend in Africa. World journal of oncology.
2019;10(3):123-31.
16. Shen PL, Lin ME, Hong YK, He XJ. Bladder preservation approach versus radical
cystectomy for high-grade non-muscle-invasive bladder cancer: a meta-analysis of cohort
studies. World journal of surgical oncology. 2018;16(1):197.
17. Böhle A, Brandau S. Immune Mechanisms in Bacillus Calmette-Guerin Immunotherapy
for Superficial Bladder Cancer. The Journal of Urology. 2003;170(3):964-9.
18. Schamhart DH, de Boer EC, de Reijke TM, Kurth K. Urinary cytokines reflecting the
immunological response in the urinary bladder to biological response modifiers: their practical
use. European urology. 2000;37 Suppl 3:16-23.
19. Bevers RF, Kurth KH, Schamhart DH. Role of urothelial cells in BCG immunotherapy
for superficial bladder cancer. British journal of cancer. 2004;91(4):607-12.
20. Walsh PCR, A. B.; Vaughan, E. D. Campbell´s Urology. 7th ed. Philadelphia,
Pennsylvania: W.B. Saunders Company; 2007.
21. Duran N, Da-Silva-Nunes O. Characterization of an aggregated polymer from
Penicillium sp. (PB-73 strain). Brazilian journal of medical and biological research = Revista
brasileira de pesquisas medicas e biologicas. 1990;23(12):1289-302.
22. Perabo FG, Willert PL, Wirger A, Schmidt DH, Von Ruecker A, Mueller SC.
Superantigen-activated mononuclear cells induce apoptosis in transitional cell carcinoma.
Anticancer research. 2005;25(5):3565-73.
23. Favaro WJ, Nunes OS, Seiva FR, Nunes IS, Woolhiser LK, Duran N, et al. Effects of
P-MAPA Immunomodulator on Toll-Like Receptors and p53: Potential Therapeutic Strategies
for Infectious Diseases and Cancer. Infectious agents and cancer. 2012;7(1):14.
24. Masuelli L, Pantanella F, La Regina G, Benvenuto M, Fantini M, Mattera R, et al.
Violacein, an indole-derived purple-colored natural pigment produced by Janthinobacterium
lividum, inhibits the growth of head and neck carcinoma cell lines both in vitro and in vivo.
Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and
Medicine. 2016;37(3):3705-17.
63
25. Alshatwi AA, Subash-Babu P, Antonisamy P. Violacein induces apoptosis in human
breast cancer cells through up regulation of BAX, p53 and down regulation of MDM2.
Experimental and Toxicologic Pathology. 2016;68(1):89-97.
26. Dias QC, Nunes ID, Garcia PV, Favaro WJ. Potential therapeutic strategies for non -
muscle invasive bladder cancer based on association of intravesical immunotherapy with p -
mapa and systemic administration of cisplatin and doxorubicin. International braz j urol :
official journal of the Brazilian Society of Urology. 2016;42(5):942-54.
27. Yee NS, Ignatenko N, Finnberg N, Lee N, Stairs D. Animal Models of Cancer Biology.
Cancer growth and metastasis. 2015;8(Suppl 1):115-8.
28. Olson B, Li Y, Lin Y, Liu ET, Patnaik A. Mouse Models for Cancer Immunotherapy
Research. Cancer discovery. 2018;8(11):1358-65.
29. Druckrey H, Preussmann R, Ivankovic S, Schmidt CH, Mennel HD, Stahl KW.
[Selective Induction of Bladder Cancer in Rats by Dibutyl- and N-Butyl-N-Butanol(4)-
Nitrosamine]. Zeitschrift fur Krebsforschung. 1964;66:280-90.
30. Kobayashi T, Owczarek TB, McKiernan JM, Abate-Shen C. Modelling bladder cancer
in mice: opportunities and challenges. Nature reviews Cancer. 2015;15(1):42-54.
31. Vasconcelos-Nobrega C, Colaco A, Lopes C, Oliveira PA. Review: BBN as an
urothelial carcinogen. In vivo. 2012;26(4):727-39.
32. John BA, Said N. Insights from animal models of bladder cancer: recent advances,
challenges, and opportunities. Oncotarget. 2017;8(34):57766-81.
33. Hicks RM, Wakefield JS. Rapid induction of bladder cancer in rats with N-methyl-N-
nitrosourea. I. Histology. Chemico-biological interactions. 1972;5(2):139-52.
34. Reis LO, Favaro WJ, Ferreira U, Billis A, Fazuoli MG, Cagnon VH. Evolution on
experimental animal model for upper urothelium carcinogenesis. World journal of urology.
2010;28(4):499-505.
35. Noveroske JK, Weber JS, Justice MJ. The mutagenic action of N-ethyl-N-nitrosourea
in the mouse. Mammalian genome : official journal of the International Mammalian Genome
Society. 2000;11(7):478-83.
36. Shibuya T, Morimoto K. A review of the genotoxicity of 1-ethyl-1-nitrosourea.
Mutation research. 1993;297(1):3-38.
37. Leroy P, Slos P, Homann H, Erbs P, Poitevin Y, Regulier E, et al. Cancer
immunotherapy by direct in vivo transfer of immunomodulatory genes. Research in
immunology. 1998;149(7-8):681-4.
64
38. Abbas AKL, A. H.; Pillai, S. Basic Immunology. 4th ed: Saunders, Elsevier Inc.; 2014.
336 p.
39. Zindl CL, Chaplin DD. Immunology. Tumor immune evasion. Science.
2010;328(5979):697-8.
40. Vinay DS, Ryan EP, Pawelec G, Talib WH, Stagg J, Elkord E, et al. Immune evasion in
cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in cancer biology. 2015;35
Suppl:S185-S98.
41. Khalil DN, Smith EL, Brentjens RJ, Wolchok JD. The future of cancer treatment:
immunomodulation, CARs and combination immunotherapy. Nature reviews Clinical
oncology. 2016;13(5):273-90.
42. Trapani JA, Darcy PK. Immunotherapy of cancer. Australian family physician.
2017;46(4):194-9.
43. Corrales L, Matson V, Flood B, Spranger S, Gajewski TF. Innate immune signaling and
regulation in cancer immunotherapy. Cell research. 2017;27(1):96-108.
44. Nouri Rouzbahani F, Shirkhoda M, Memari F, Dana H, Mahmoodi Chalbatani G,
Mahmoodzadeh H, et al. Immunotherapy a New Hope for Cancer Treatment: A Review.
Pakistan journal of biological sciences : PJBS. 2018;21(3):135-50.
45. Li K, Qu S, Chen X, Wu Q, Shi M. Promising Targets for Cancer Immunotherapy:
TLRs, RLRs, and STING-Mediated Innate Immune Pathways. International journal of
molecular sciences. 2017;18(2).
46. Coley WB. The treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas.
With a report of ten original cases. 1893. Clinical orthopaedics and related research.
1991(262):3-11.
47. Morales A, Eidinger D, Bruce AW. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the
treatment of superficial bladder tumors. J Urol. 1976;116(2):180-3.
48. Caisova V, Vieru A, Kumzakova Z, Glaserova S, Husnikova H, Vacova N, et al. Innate
immunity based cancer immunotherapy: B16-F10 murine melanoma model. BMC cancer.
2016;16(1):940.
49. Galluzzi L, Vacchelli E, Eggermont A, Fridman WH, Galon J, Sautes-Fridman C, et al.
Trial Watch: Experimental Toll-like receptor agonists for cancer therapy. Oncoimmunology.
2012;1(5):699-716.
50. Goldberg JL, Sondel PM. Enhancing Cancer Immunotherapy Via Activation of Innate
Immunity. Seminars in oncology. 2015;42(4):562-72.
65
51. Matzner P, Sorski L, Shaashua L, Elbaz E, Lavon H, Melamed R, et al. Perioperative
treatment with the new synthetic TLR-4 agonist GLA-SE reduces cancer metastasis without
adverse effects. International journal of cancer. 2016;138(7):1754-64.
52. Kaczanowska S, Joseph AM, Davila E. TLR agonists: our best frenemy in cancer
immunotherapy. Journal of leukocyte biology. 2013;93(6):847-63.
53. Lu H. TLR Agonists for Cancer Immunotherapy: Tipping the Balance between the
Immune Stimulatory and Inhibitory Effects. Frontiers in immunology. 2014;5:83.
54. Guadagni F, Ferroni P, Palmirotta R, Portarena I, Formica V, Roselli M. Review.
TNF/VEGF cross-talk in chronic inflammation-related cancer initiation and progression: an
early target in anticancer therapeutic strategy. In vivo. 2007;21(2):147-61.
55. Bazett M, Costa AM, Bosiljcic M, Anderson RM, Alexander MP, Wong SWY, et al.
Harnessing innate lung anti-cancer effector functions with a novel bacterial-derived
immunotherapy. Oncoimmunology. 2018;7(3):e1398875.
56. Mai CW, Kang YB, Pichika MR. Should a Toll-like receptor 4 (TLR-4) agonist or
antagonist be designed to treat cancer? TLR-4: its expression and effects in the ten most
common cancers. OncoTargets and therapy. 2013;6:1573-87.
57. Duran N, Justo GZ, Duran M, Brocchi M, Cordi L, Tasic L, et al. Advances in
Chromobacterium violaceum and properties of violacein-Its main secondary metabolite: A
review. Biotechnology advances. 2016;34(5):1030-45.
58. McClean KH, Winson MK, Fish L, Taylor A, Chhabra SR, Camara M, et al. Quorum
sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition
for the detection of N-acylhomoserine lactones. Microbiology. 1997;143 ( Pt 12):3703-11.
59. Hoshino T. Violacein and related tryptophan metabolites produced by
Chromobacterium violaceum: biosynthetic mechanism and pathway for construction of
violacein core. Applied microbiology and biotechnology. 2011;91(6):1463-75.
60. Dantas C, Tauler R, Ferreira MM. Exploring in vivo violacein biosynthesis by
application of multivariate curve resolution on fused UV-VIS absorption, fluorescence, and
liquid chromatography-mass spectrometry data. Analytical and bioanalytical chemistry.
2013;405(4):1293-302.
61. Duran N, Justo GZ, Ferreira CV, Melo PS, Cordi L, Martins D. Violacein: properties
and biological activities. Biotechnology and applied biochemistry. 2007;48(Pt 3):127-33.
62. Cauz ACG, Carretero GPB, Saraiva GKV, Park P, Mortara L, Cuccovia IM, et al.
Violacein Targets the Cytoplasmic Membrane of Bacteria. ACS infectious diseases. 2019.
66
63. Antonisamy P, Kannan P, Ignacimuthu S. Anti-diarrhoeal and ulcer-protective effects
of violacein isolated from Chromobacterium violaceum in Wistar rats. Fundamental & clinical
pharmacology. 2009;23(4):483-90.
64. Antonisamy P, Ignacimuthu S. Immunomodulatory, analgesic and antipyretic effects of
violacein isolated from Chromobacterium violaceum. Phytomedicine : international journal of
phytotherapy and phytopharmacology. 2010;17(3-4):300-4.
65. Platt D, Amara S, Mehta T, Vercuyssee K, Myles EL, Johnson T, et al. Violacein inhibits
matrix metalloproteinase mediated CXCR4 expression: potential anti-tumor effect in cancer
invasion and metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 2014;455(1-
2):107-12.
66. Domanska UM, Kruizinga RC, Nagengast WB, Timmer-Bosscha H, Huls G, de Vries
EG, et al. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: no place to hide. European journal
of cancer. 2013;49(1):219-30.
67. Queiroz KC, Milani R, Ruela-de-Sousa RR, Fuhler GM, Justo GZ, Zambuzzi WF, et al.
Violacein induces death of resistant leukaemia cells via kinome reprogramming, endoplasmic
reticulum stress and Golgi apparatus collapse. PloS one. 2012;7(10):e45362.
68. Leal AM, de Queiroz JD, de Medeiros SR, Lima TK, Agnez-Lima LF. Violacein
induces cell death by triggering mitochondrial membrane hyperpolarization in vitro. BMC
microbiology. 2015;15:115.
69. Kodach LL, Bos CL, Duran N, Peppelenbosch MP, Ferreira CV, Hardwick JC.
Violacein synergistically increases 5-fluorouracil cytotoxicity, induces apoptosis and inhibits
Akt-mediated signal transduction in human colorectal cancer cells. Carcinogenesis.
2006;27(3):508-16.
70. Hashimi SM, Xu T, Wei MQ. Violacein anticancer activity is enhanced under hypoxia.
Oncology reports. 2015;33(4):1731-6.
71. Hernandez-Luna MA, Luria-Perez R. Cancer Immunotherapy: Priming the Host
Immune Response with Live Attenuated Salmonella enterica. Journal of immunology research.
2018;2018:2984247.
72. Coley WB. II. Contribution to the Knowledge of Sarcoma. Annals of surgery.
1891;14(3):199-220.
73. Morrissey D, O'Sullivan GC, Tangney M. Tumour targeting with systemically
administered bacteria. Current gene therapy. 2010;10(1):3-14.
67
74. Forbes NS. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nature reviews Cancer.
2010;10(11):785-94.
75. Baban CK, Cronin M, O'Hanlon D, O'Sullivan GC, Tangney M. Bacteria as vectors for
gene therapy of cancer. Bioengineered bugs. 2010;1(6):385-94.
76. Cummins J, Tangney M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic
inhabitants? Infectious agents and cancer. 2013;8(1):11.
77. Zhang Q, Ni W, Zhao X, Wang F, Gao Z, Tai G. Synergistic antitumor effects of
Escherichia coli maltose binding protein and Bacillus Calmette-Guerin in a mouse lung
carcinoma model. Immunology letters. 2011;136(1):108-13.
78. Rodrigues AL, Trachtmann N, Becker J, Lohanatha AF, Blotenberg J, Bolten CJ, et al.
Systems metabolic engineering of Escherichia coli for production of the antitumor drugs
violacein and deoxyviolacein. Metabolic engineering. 2013;20:29-41.
79. Wallecha A, Singh R, Malinina I. Listeria monocytogenes (Lm)-LLO immunotherapies
reduce the immunosuppressive activity of myeloid-derived suppressor cells and regulatory T
cells in the tumor microenvironment. Journal of immunotherapy. 2013;36(9):468-76.
80. Chang WW, Lee CH. Salmonella as an innovative therapeutic antitumor agent.
International journal of molecular sciences. 2014;15(8):14546-54.
81. Wan X, Cheng C, Lin Z, Jiang R, Zhao W, Yan X, et al. The attenuated hepatocellular
carcinoma-specific Listeria vaccine Lmdd-MPFG prevents tumor occurrence through immune
regulation of dendritic cells. Oncotarget. 2015;6(11):8822-38.
82. Rodrigues AL, Becker J, de Souza Lima AO, Porto LM, Wittmann C. Systems
metabolic engineering of Escherichia coli for gram scale production of the antitumor drug
deoxyviolacein from glycerol. Biotechnology and bioengineering. 2014;111(11):2280-9.
83. Lim JY, Brockstedt DG, Lord EM, Gerber SA. Radiation therapy combined with
Listeria monocytogenes-based cancer vaccine synergize to enhance tumor control in the B16
melanoma model. Oncoimmunology. 2014;3:e29028.
84. Loeffler M, Le'Negrate G, Krajewska M, Reed JC. Inhibition of tumor growth using
salmonella expressing Fas ligand. Journal of the National Cancer Institute. 2008;100(15):1113-
6.
85. Figueroa Ochoa IM, Verdugo Rodriguez A. [Molecular mechanism for pathogenicity of
Salmonella sp]. Revista latinoamericana de microbiologia. 2005;47(1-2):25-42.
86. Woc-Colburn L, Bobak DA. The expanding spectrum of disease due to salmonella: an
international perspective. Current infectious disease reports. 2009;11(2):120-4.
68
87. Darwin KH, Miller VL. Molecular basis of the interaction of Salmonella with the
intestinal mucosa. Clinical microbiology reviews. 1999;12(3):405-28.
88. Hurley D, McCusker MP, Fanning S, Martins M. Salmonella-host interactions -
modulation of the host innate immune system. Frontiers in immunology. 2014;5:481.
89. Liang K, Liu Q, Li P, Luo H, Wang H, Kong Q. Genetically engineered Salmonella
Typhimurium: Recent advances in cancer therapy. Cancer letters. 2019;448:168-81.
90. Kimura H, Zhang L, Zhao M, Hayashi K, Tsuchiya H, Tomita K, et al. Targeted therapy
of spinal cord glioma with a genetically modified Salmonella typhimurium. Cell proliferation.
2010;43(1):41-8.
91. Eisenstark A, Kazmierczak RA, Dino A, Khreis R, Newman D, Schatten H.
Development of Salmonella strains as cancer therapy agents and testing in tumor cell lines.
Methods in molecular biology. 2007;394:323-54.
92. Spector MP, Garcia del Portillo F, Bearson SM, Mahmud A, Magut M, Finlay BB, et
al. The rpoS-dependent starvation-stress response locus stiA encodes a nitrate reductase
(narZYWV) required for carbon-starvation-inducible thermotolerance and acid tolerance in
Salmonella typhimurium. Microbiology. 1999;145 ( Pt 11):3035-45.
93. Tu DG, Chang WW, Lin ST, Kuo CY, Tsao YT, Lee CH. Salmonella inhibits tumor
angiogenesis by downregulation of vascular endothelial growth factor. Oncotarget.
2016;7(25):37513-23.
94. Lee CH, Lin ST, Liu JJ, Chang WW, Hsieh JL, Wang WK. Salmonella induce
autophagy in melanoma by the downregulation of AKT/mTOR pathway. Gene therapy.
2014;21(3):309-16.
95. Kurashige S, Mitsuhashi S. Enhancing effects of mini-cells prepared from Salmonella
typhimurium on anti-tumor immunity in sarcoma 180-bearing mice. Cancer immunology,
immunotherapy : CII. 1982;14(1):1-3.
96. Zheng JH, Nguyen VH, Jiang SN, Park SH, Tan W, Hong SH, et al. Two-step enhanced
cancer immunotherapy with engineered Salmonella typhimurium secreting heterologous
flagellin. Science translational medicine. 2017;9(376).
97. Kocijancic D, Leschner S, Felgner S, Komoll RM, Frahm M, Pawar V, et al. Therapeutic
benefit of Salmonella attributed to LPS and TNF-alpha is exhaustible and dictated by tumor
susceptibility. Oncotarget. 2017;8(22):36492-508.
69
98. Chirullo B, Ammendola S, Leonardi L, Falcini R, Petrucci P, Pistoia C, et al. Attenuated
mutant strain of Salmonella Typhimurium lacking the ZnuABC transporter contrasts tumor
growth promoting anti-cancer immune response. Oncotarget. 2015;6(19):17648-60.
99. Clairmont C, Lee KC, Pike J, Ittensohn M, Low KB, Pawelek J, et al. Biodistribution
and genetic stability of the novel antitumor agent VNP20009, a genetically modified strain of
Salmonella typhimurium. J Infect Dis. 2000;181(6):1996-2002.
100. Kasinskas RW, Forbes NS. Salmonella typhimurium lacking ribose chemoreceptors
localize in tumor quiescence and induce apoptosis. Cancer research. 2007;67(7):3201-9.
101. Forbes NS, Munn LL, Fukumura D, Jain RK. Sparse initial entrapment of systemically
injected Salmonella typhimurium leads to heterogeneous accumulation within tumors. Cancer
research. 2003;63(17):5188-93.
102. Sznol M, Lin SL, Bermudes D, Zheng LM, King I. Use of preferentially replicating
bacteria for the treatment of cancer. The Journal of clinical investigation. 2000;105(8):1027-
30.
103. Toso JF, Gill VJ, Hwu P, Marincola FM, Restifo NP, Schwartzentruber DJ, et al. Phase
I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with
metastatic melanoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of
Clinical Oncology. 2002;20(1):142-52.
104. Heimann DM, Rosenberg SA. Continuous intravenous administration of live genetically
modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. Journal of
immunotherapy. 2003;26(2):179-80.
105. Nemunaitis J, Cunningham C, Senzer N, Kuhn J, Cramm J, Litz C, et al. Pilot trial of
genetically modified, attenuated Salmonella expressing the E. coli cytosine deaminase gene in
refractory cancer patients. Cancer gene therapy. 2003;10(10):737-44.
106. Nallar SC, Xu DQ, Kalvakolanu DV. Bacteria and genetically modified bacteria as
cancer therapeutics: Current advances and challenges. Cytokine. 2017;89:160-72.
107. Luijsterburg MS, Noom MC, Wuite GJ, Dame RT. The architectural role of nucleoid-
associated proteins in the organization of bacterial chromatin: a molecular perspective. Journal
of structural biology. 2006;156(2):262-72.
108. Thanbichler M, Wang SC, Shapiro L. The bacterial nucleoid: a highly organized and
dynamic structure. Journal of cellular biochemistry. 2005;96(3):506-21.
109. Fang FC, Rimsky S. New insights into transcriptional regulation by H-NS. Current
opinion in microbiology. 2008;11(2):113-20.
70
110. McLeod SM, Johnson RC. Control of transcription by nucleoid proteins. Current
opinion in microbiology. 2001;4(2):152-9.
111. Wang G, Maier RJ. Bacterial histone-like proteins: roles in stress resistance. Current
genetics. 2015;61(4):489-92.
112. Azam TA, Ishihama A. Twelve species of the nucleoid-associated protein from
Escherichia coli. Sequence recognition specificity and DNA binding affinity. The Journal of
biological chemistry. 1999;274(46):33105-13.
113. Drlica K, Rouviere-Yaniv J. Histonelike proteins of bacteria. Microbiological reviews.
1987;51(3):301-19.
114. T OC, Dorman CJ. Expression of the Fis protein is sustained in late-exponential- and
stationary-phase cultures of Salmonella enterica serovar Typhimurium grown in the absence of
aeration. Molecular microbiology. 2007;66(1):237-51.
115. Dillon SC, Dorman CJ. Bacterial nucleoid-associated proteins, nucleoid structure and
gene expression. Nature reviews Microbiology. 2010;8(3):185-95.
116. Dorman CJ. Nucleoid-associated proteins and bacterial physiology. Advances in applied
microbiology. 2009;67:47-64.
117. Dorman CJ, Kane KA. DNA bridging and antibridging: a role for bacterial nucleoid-
associated proteins in regulating the expression of laterally acquired genes. FEMS
microbiology reviews. 2009;33(3):587-92.
118. Miller HI, Kikuchi A, Nash HA, Weisberg RA, Friedman DI. Site-specific
recombination of bacteriophage lambda: the role of host gene products. Cold Spring Harbor
symposia on quantitative biology. 1979;43 Pt 2:1121-6.
119. Miller HI, Friedman DI. An E. coli gene product required for lambda site-specific
recombination. Cell. 1980;20(3):711-9.
120. Werner MH, Clore GM, Gronenborn AM, Nash HA. Symmetry and asymmetry in the
function of Escherichia coli integration host factor: implications for target identification by
DNA-binding proteins. Current biology : CB. 1994;4(6):477-87.
121. Mangan MW, Lucchini S, Danino V, Croinin TO, Hinton JC, Dorman CJ. The
integration host factor (IHF) integrates stationary-phase and virulence gene expression in
Salmonella enterica serovar Typhimurium. Molecular microbiology. 2006;59(6):1831-47.
122. Anuchin AM, Goncharenko AV, Demidenok OI, Kaprel'iants AS. [Histone-like
proteins of bacteria (review)]. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia. 2011;47(6):635-41.
71
123. Lee DJ, Minchin SD, Busby SJ. Activating transcription in bacteria. Annual review of
microbiology. 2012;66:125-52.
124. Goshima N, Kano Y, Tanaka H, Kohno K, Iwaki T, Imamoto F. IHF supresses the
inhibitory effect of H-NS on HU function in the hin inversion system. Gene. 1994;141(1):17-
23.
125. Beach MB, Osuna R. Identification and characterization of the fis operon in enteric
bacteria. Journal of bacteriology. 1998;180(22):5932-46.
126. Ali BM, Amit R, Braslavsky I, Oppenheim AB, Gileadi O, Stavans J. Compaction of
single DNA molecules induced by binding of integration host factor (IHF). Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 2001;98(19):10658-63.
127. Milanez GP, Werle CH, Amorim MR, Ribeiro RA, Tibo LHS, Roque-Barreira MC, et
al. HU-Lacking Mutants of Salmonella enterica Enteritidis Are Highly Attenuated and Can
Induce Protection in Murine Model of Infection. Frontiers in microbiology. 2018;9:1780.
128. Hirsch Werle C, Damiani I, Paier Milanez G, Farias AS, Cintra Gomes Marcondes MC,
Fabricio Culler H, et al. Antimelanoma effect of Salmonella Typhimurium integration host
factor mutant in murine model. Future oncology. 2016;12(20):2367-78.
129. Sambrook JaR, R.W. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring
Harbor, N.Y.: Cold spring harbor laboratory press; 2001.
130. Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia
coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America. 2000;97(12):6640-5.
131. Maloy SRS, V.J.; Taylor, R.K. . Genetic Analysis of Pathogenic Bacteria: A Laboratory
Manual: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1996.
132. Leite B, Werle CH, Carmo CPD, Nobrega DB, Milanez GP, Culler HF, et al. Integration
host factor is important for biofilm formation by Salmonella enterica Enteritidis. Pathogens and
disease. 2017;75(6).
133. Hitchcock PJ, Brown TM. Morphological heterogeneity among Salmonella
lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels. Journal of bacteriology.
1983;154(1):269-77.
134. Tsai CM, Frasch CE. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in
polyacrylamide gels. Analytical biochemistry. 1982;119(1):115-9.
135. Epstein JI, Amin MB, Reuter VR, Mostofi FK. The World Health
Organization/International Society of Urological Pathology consensus classification of
72
urothelial (transitional cell) neoplasms of the urinary bladder. Bladder Consensus Conference
Committee. The American journal of surgical pathology. 1998;22(12):1435-48.
136. Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image
analysis. Nature methods. 2012;9(7):671-5.
137. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5.
138. Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of Cell Viability by the MTT Assay. Cold
Spring Harbor protocols. 2018;2018(6):pdb prot095505.
139. Goncalves PR, Rocha-Brito KJ, Fernandes MR, Abrantes JL, Duran N, Ferreira-Halder
CV. Violacein induces death of RAS-mutated metastatic melanoma by impairing autophagy
process. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental
Biology and Medicine. 2016;37(10):14049-58.
140. Melo PS, Justo GZ, de Azevedo MB, Duran N, Haun M. Violacein and its beta-
cyclodextrin complexes induce apoptosis and differentiation in HL60 cells. Toxicology.
2003;186(3):217-25.
141. Ferreira CV, Bos CL, Versteeg HH, Justo GZ, Duran N, Peppelenbosch MP. Molecular
mechanism of violacein-mediated human leukemia cell death. Blood. 2004;104(5):1459-64.
142. Menezes CB, Silva BP, Sousa IM, Ruiz AL, Spindola HM, Cabral E, et al. In vitro and
in vivo antitumor activity of crude extracts obtained from Brazilian Chromobacterium sp
isolates. Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas
medicas e biologicas. 2013;46(1):65-70.
143. Verinaud L, Lopes SC, Prado IC, Zanucoli F, Alves da Costa T, Di Gangi R, et al.
Violacein Treatment Modulates Acute and Chronic Inflammation through the Suppression of
Cytokine Production and Induction of Regulatory T Cells. PloS one. 2015;10(5):e0125409.
144. Hoffman RM. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Current opinion in
biotechnology. 2011;22(6):917-23.
145. Schleifer KH, Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their
taxonomic implications. Bacteriological reviews. 1972;36(4):407-77.
146. Nakayama K, Aehle S, Curtiss R. Construction of an ASD+ Expression-Cloning Vector:
Stable Maintenance and High Level Expression of Cloned Genes in a Salmonella Vaccine
Strain. Nature Biotechnology. 1988;6:693-7.
73
147. Clark L, Perrett CA, Malt L, Harward C, Humphrey S, Jepson KA, et al. Differences in
Salmonella enterica serovar Typhimurium strain invasiveness are associated with heterogeneity
in SPI-1 gene expression. Microbiology. 2011;157(Pt 7):2072-83.
148. Leschner S, Westphal K, Dietrich N, Viegas N, Jablonska J, Lyszkiewicz M, et al.
Tumor invasion of Salmonella enterica serovar Typhimurium is accompanied by strong
hemorrhage promoted by TNF-alpha. PloS one. 2009;4(8):e6692.
149. Zaidi MR. The Interferon-Gamma Paradox in Cancer. Journal of interferon & cytokine
research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research.
2019;39(1):30-8.
150. Giannopoulos A, Constantinides C, Fokaeas E, Stravodimos C, Giannopoulou M,
Kyroudi A, et al. The immunomodulating effect of interferon-gamma intravesical instillations
in preventing bladder cancer recurrence. Clinical cancer research : an official journal of the
American Association for Cancer Research. 2003;9(15):5550-8.
151. Sanapala S, Mosca L, Wang S, Curtiss R. Comparative evaluation of Salmonella
Typhimurium vaccines derived from UK-1 and 14028S: Importance of inherent virulence. PloS
one. 2018;13(9):e0203526.
152. Chen J, Qiao Y, Tang B, Chen G, Liu X, Yang B, et al. Modulation of Salmonella
Tumor-Colonization and Intratumoral Anti-angiogenesis by Triptolide and Its Mechanism.
Theranostics. 2017;7(8):2250-60.
153. Igarashi K, Kawaguchi K, Kiyuna T, Miyake K, Miyake M, Li S, et al. Tumor-targeting
Salmonella typhimurium A1-R combined with recombinant methioninase and cisplatinum
eradicates an osteosarcoma cisplatinum-resistant lung metastasis in a patient-derived orthotopic
xenograft (PDOX) mouse model: decoy, trap and kill chemotherapy moves toward the clinic.
Cell cycle. 2018;17(6):801-9.
154. Jia LJ, Wei DP, Sun QM, Jin GH, Li SF, Huang Y, et al. Tumor-targeting Salmonella
typhimurium improves cyclophosphamide chemotherapy at maximum tolerated dose and low-
dose metronomic regimens in a murine melanoma model. International journal of cancer.
2007;121(3):666-74.
155. Liu X, Jiang S, Piao L, Yuan F. Radiotherapy combined with an engineered Salmonella
typhimurium inhibits tumor growth in a mouse model of colon cancer. Experimental animals.
2016;65(4):413-8.
74
156. Platt J, Sodi S, Kelley M, Rockwell S, Bermudes D, Low KB, et al. Antitumour effects
of genetically engineered Salmonella in combination with radiation. European journal of
cancer. 2000;36(18):2397-402.
157. Zhang X, Cheng X, Lai Y, Zhou Y, Cao W, Hua ZC. Salmonella VNP20009-mediated
RNA interference of ABCB5 moderated chemoresistance of melanoma stem cell and
suppressed tumor growth more potently. Oncotarget. 2016;7(12):14940-50.
158. Zhao C, He J, Cheng H, Zhu Z, Xu H. Enhanced therapeutic effect of an
antiangiogenesis peptide on lung cancer in vivo combined with salmonella VNP20009 carrying
a Sox2 shRNA construct. Journal of experimental & clinical cancer research : CR.
2016;35(1):107.
159. Wang HS, Wang FZ, Zhu XF, Yan YC, Yu XH, Jiang PX, et al. Biosynthesis and
characterization of violacein, deoxyviolaceiri and oxyviolacein in heterologous host, and their
antimicrobial activities. Biochem Eng J. 2012;67:148-55.
160. Aruldass CA, Rubiyatno, Venil CK, Ahmad WA. Violet pigment production from liquid
pineapple waste by Chromobacterium violaceum UTM5 and evaluation of its bioactivity. Rsc
Adv. 2015;5(64):51524-36.
161. Lichstein HC, Vandesand VF. Violacein, an Antibiotic Pigment Produced by
Chromobacterium-Violaceum. J Infect Dis. 1945;76(1):47-51.
162. Duran M, Ponezi AN, Faljoni-Alario A, Teixeira MFS, Justo GZ, Duran N. Potential
applications of violacein: a microbial pigment. Med Chem Res. 2012;21(7):1524-32.
163. Forster C, Cody J, Banskota N, Stroud C, Hsieh Y, Farah D, et al. Profiling of urine
bacterial DNA to identify an oncobiome in a mouse model of bladder cancer2018.
164. Wu P, Zhang G, Zhao J, Chen J, Chen Y, Huang W, et al. Profiling the Urinary
Microbiota in Male Patients With Bladder Cancer in China. Frontiers in cellular and infection
microbiology. 2018;8:167.
165. Matson V, Fessler J, Bao R, Chongsuwat T, Zha YY, Alegre ML, et al. The commensal
microbiome is associated with anti-PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients. Science.
2018;359(6371):104-+.
166. Bajic P, Wolfe AJ, Gupta GN. The Urinary Microbiome: Implications in Bladder Cancer
Pathogenesis and Therapeutics. Urology. 2019.
167. Balachandran S, Adams GP. Interferon-gamma-induced necrosis: an antitumor
biotherapeutic perspective. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of
the International Society for Interferon and Cytokine Research. 2013;33(4):171-80.
75
168. Aaron L, Franco OE, Hayward SW. Review of Prostate Anatomy and Embryology and
the Etiology of Benign Prostatic Hyperplasia. The Urologic clinics of North America.
2016;43(3):279-88.
169. Oh M, Alkhushaym N, Fallatah S, Althagafi A, Aljadeed R, Alsowaida Y, et al. The
association of BRCA1 and BRCA2 mutations with prostate cancer risk, frequency, and
mortality: A meta-analysis. The Prostate. 2019;79(8):880-95.
170. Dickerman B, Mucci L. Metabolic Factors and Prostate Cancer Risk. Clinical chemistry.
2019;65(1):42-4.
171. Chan JM, Stampfer MJ, Giovannucci EL. What causes prostate cancer? A brief
summary of the epidemiology. Seminars in cancer biology. 1998;8(4):263-73.
172. Crawford ED, Petrylak D, Sartor O. Navigating the evolving therapeutic landscape in
advanced prostate cancer. Urologic oncology. 2017;35S:S1-S13.
173. Wade CA, Kyprianou N. Profiling Prostate Cancer Therapeutic Resistance.
International journal of molecular sciences. 2018;19(3).
174. Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, Berger ER, Small EJ, Penson DF, et al. Sipuleucel-
T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. The New England journal of
medicine. 2010;363(5):411-22.
175. Mehta T, Vercruysse K, Johnson T, Ejiofor AO, Myles E, Quick QA. Violacein induces
p44/42 mitogen-activated protein kinase-mediated solid tumor cell death and inhibits tumor cell
migration. Molecular medicine reports. 2015;12(1):1443-8.
176. Liekens S, Schols D, Hatse S. CXCL12-CXCR4 axis in angiogenesis, metastasis and
stem cell mobilization. Current pharmaceutical design. 2010;16(35):3903-20.
177. Singh S, Singh UP, Grizzle WE, Lillard JW, Jr. CXCL12-CXCR4 interactions modulate
prostate cancer cell migration, metalloproteinase expression and invasion. Laboratory
investigation; a journal of technical methods and pathology. 2004;84(12):1666-76.
178. Park JY, Zheng W, Kim D, Cheng JQ, Kumar N, Ahmad N, et al. Candidate tumor
suppressor gene SLC5A8 is frequently down-regulated by promoter hypermethylation in
prostate tumor. Cancer detection and prevention. 2007;31(5):359-65.
179. Ma S, Chan YP, Kwan PS, Lee TK, Yan M, Tang KH, et al. MicroRNA-616 induces
androgen-independent growth of prostate cancer cells by suppressing expression of tissue factor
pathway inhibitor TFPI-2. Cancer research. 2011;71(2):583-92.
76
9. ANEXO I - AÇÃO DA VIOLACEÍNA EM CÉLULAS DE CÂNCER DE
PRÓSTATA
9.1 INTRODUÇÃO
9.1.1 Próstata humana
A próstata é uma glândula masculina do tamanho de uma noz que fica localizada em
frente ao reto, abaixo da bexiga urinária, envolvendo parcialmente a parte distal da uretra. Essa
glândula é composta por três partes histológica e anatomicamente distintas: uma camada
fibromuscular que envolve o órgão, uma região glandular periférica e uma região glandular
central (168). A função da próstata é produzir, armazenar e secretar um líquido protetivo e
nutritivo para os espermatozoides. Este líquido, essencial para a função reprodutiva normal do
homem, é composto de lipídeos, enzimas proteolíticas, fosfatase ácida, fibrinolisina e ácido
cítrico (2, 3).
9.1.2 Câncer de próstata
De acordo com estimativas recentes reportadas pela agência internacional de pesquisa
em câncer (IARC), o câncer de próstata é o segundo diagnóstico mais frequente na população
de homens do mundo, apresentado uma alta taxa de mortalidade. A pesquisa relatou mais de
1.270.000 casos por ano, com quase 360.000 mortes (4). Os fatores de risco para o
desenvolvimento deste tipo de câncer são: idade, etnia, histórico familiar e mutações genéticas
específicas. O câncer de próstata é raro antes dos 40 anos, porém, a chance do desenvolvimento
deste tipo de câncer cresce a partir dos 50 anos, sendo que 60% dos casos são diagnosticados
em homens acima de 65 anos. Tanto a incidência quanto a mortalidade deste câncer é maior em
afrodescendentes. A chance de se desenvolver o câncer de próstata também aumenta
dependendo do número e da proximidade genealógica de parentes que já desenvolveram essa
doença (6). Algumas mutações genéticas, como por exemplo alterações nos genes associados à
susceptibilidade ao câncer de mama BRCA1 e BRCA2 (Breast cancer type 1 e 2 susceptibility
protein) aumentam a chance do desenvolvimento do câncer de próstata (169). Além disto,
77
fatores metabólicos como altos níveis de colesterol, obesidade e diabetes podem estar
associados ao desenvolvimento desta doença. Também existem evidências de que o hormônio
sexual testosterona pode ser um iniciador ou promotor do câncer de próstata (170, 171).
O simples inchaço da próstata, mesmo no caso de hiperplasia benigna, gera
desconforto ao paciente pela obstrução da uretra ou aumento na frequência da micção (168).
Quadros mais avançados deste câncer podem causar outros sintomas como a presença de sangue
na urina e no sêmen, disfunção erétil e a perda de controle da bexiga e intestino (6). O pré-
diagnóstico deste câncer pode ser realizado através de exame de sangue para medição dos níveis
de antígeno próstata-específico (Prostate-specific antigen – PSA) e pelo exame digital retal.
Com a suspeita do câncer, exames mais detalhados, como o ultrassom transretal e a biópsia da
próstata devem ser realizados (6).
As terapias atuais para o tratamento de câncer de próstata incluem a deprivação
androgênica por inibição de testosterona associada à radioterapia seguida de quimioterapia com
docetaxel e cabazitaxel (172, 173). Docetaxel é um agente antimitótico usado como
quimioterapia primária por mais de 10 anos. Cabazitaxel, o quimioterápico secundário,
apresenta atividade citotóxica contra linhagens de células tumorais que apresentam resistência
ao docetaxel (172). Outra alternativa de tratamento é a imunoterapia com Sipuleucel-T (174).
Estes tratamentos resultam em sintomas adversos variados e precisam ser ajustados para
aumentar a eficiência do efeito terapêutico e dar melhores condições aos pacientes. Assim, é
necessário o desenvolvimento de tratamentos alternativos mais eficientes e com menos efeitos
colaterais para os pacientes com câncer de próstata. A violaceína, já descrita anteriomente,
também pode representar uma potencial e ainda não explorada opção no tratamento de câncer
de próstata (24, 25, 61, 70, 142).
9.2 OBJETIVO
Investigar o efeito citotóxico da violaceína em diferentes células de próstata humana.
78
9.3 METODOLOGIA
Este estudo foi realizado durante estágio de 6 meses no Laboratório do Prof. Dr. Luiz
Fernando Celidônio Zerbini, Cancer Genomics Group, International Centre for Genetic
Engineering and Biotechnology (ICGEB), Cidade do Cabo, África do Sul, sob a supervisão do
Prof. Zerbini, em colaboração com nosso grupo na Unicamp. Para este estudo, foi utilizada a
violaceína comercial (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).
9.3.1 Ensaio de citotoxicidade
A citotoxicidade da violaceína em diferentes linhagens de células de próstata foi
avaliada por ensaio com sal de tetrazólio (MTT) como descrito anteriormente (138). A
concentração inibitória 50% (IC50) foi definida após incubação da violaceína em diferentes
concentrações por 24 horas com células DU145 (Carcinoma de próstata humana derivado do
cérebro), 22RV1 (Carcinoma epitelial de próstata humana), C4-2 (Câncer de próstata humana)
e PNT1A (Próstata humana normal imortalizada). A IC50 foi calculada em programa GraphPad
Prism 7.0 por análise de regressão não linear usando os dados gerados pela leitura da
absorbância da solução de formazan em 595nm.
9.3.2 Visualização do efeito em células
O efeito citotóxico da violaceína foi visualizado e registrado em aumento de 400x após
1, 2 e 3 horas de incubação com células DU145 e 22RV1. As células foram cultivadas em placas
de 24 cavidades e tratadas com violaceína em concentração IC50. Células tratadas com DMSO
0,01% foram usadas como controle. As cavidades foram marcadas por baixo para que um grupo
de células específico pudesse ser acompanhado em diferentes tempos.
79
9.3.3 Migração celular
A migração de células DU145, 22RV1 e C4-2 foi analisada em ensaio de Wound
Healing. Para este ensaio, as células foram cultivadas em placas de 24 cavidades. Após a
confluência, foi feito um risco vertical sobre a monocamada celular usando uma ponteira de
200µl. As células que se desprenderam com o risco foram removidas após lavagem com PBS.
As cavidades receberam tratamento com violaceína em doses não letais de 0,05 a 0,3µM e
DMSO 0,01% como controle. As células foram fotografadas nos tempos 0, 24, 48 e 72 horas
após o tratamento. A área do espaço formado entre as células foi calculada pela análise das
fotos em imageJ.
9.3.4 Extração de RNA e qPCR
O RNA foi extraído de células 22RV1, tratadas com violaceína em concentração IC50
por 6 horas, com o RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha) seguindo as instruções do
fabricante. O RNA de células tratadas com DMSO 0,01% foi usado como controle. A
transcrição reversa do RNA foi realizada com o kit SuperScriptTM IV VILOTM Master Mix
(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, United States). Após a síntese do cDNA, o PCR em
tempo real foi realizado com o kit RT2 profiler PCR array (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Com
este kit foi possível analisar a expressão de 84 genes relacionados ao câncer de próstata ao
mesmo tempo. A reação foi realizada em termociclador LightCycler 480 Instrument II (Roche
Life Sciences, Penzberg, Alemanha). Os dados gerados foram analisados em software online
GeneGlobe Data Analysis Center (QIAGEN, Hilden, Alemanha).
80
9.4 RESULTADOS
9.4.1 Citotoxidade da violaceína em células de próstata
A dose IC50 da violaceína foi definida para quatro tipos de células de próstata humana
(Figura 9). Quando incubada com as células normais de próstata (PNT1A), a violaceína
apresentou a maior IC50 (1,28µM), significando que é necessária uma dose maior da violaceína
para danificar células não cancerosas da próstata.
Figura 9: Gráficos gerados pelo programa GraphPad Prism 7.0 das quatro células testadas com violaceína
indicando o valor da IC50 calculado. A: Gráfico de viabilidade de células DU145; B: Gráfico de viabilidade
de células 22RV1; C: Gráfico de viabilidade de células C4-2; D: Gráfico de viabilidade de células PNT1A.
Todas as células foram incubadas com violaceína por 24 horas.
81
9.4.2 Visualização do efeito da violaceína em células de próstata
Após uma hora de incubação com a violaceína em dose IC50, foi possível observar o
aparecimento de estruturas semelhantes à vacúolos no citoplasma das células. Após duas e três
horas, ocorreu um aumento na “vacuolização” nestas células. (Figura 10).
Figura 10: Fotos das células de próstata humana DU145 e 22RV1 após incubação com violaceína (IC50) nos
tempos 0, 1 hora, 2 horas e 3 horas. A: Efeito da violaceína em células DU145 nos tempos 0, 1, 2 e 3 horas;
B: Efeito da violaceína em células 22RV1 nos tempos 0, 1, 2 e 3 horas. As setas indicam o registro da mesma
célula em todos os tempos.
9.4.3 Migração celular (Wound Healing)
Após análise das fotos em imageJ, foi possível plotar gráficos da porcentagem de
migração celular pelo tempo (Figura 11). O tratamento das células com dose não letal de
violaceína, definida de acordo com o tipo celular testado, reduziu a capacidade de migração
celular de todas as linhagens analisadas, com maior evidência de inibição em células 22RV1.
82
Figura 11: Migração células C4-2, DU145 e 22RV1 após tratamento com dose não letal de violaceína A:
Porcentagem de migração de células C4-2 em 72 horas de incubação com violaceína em dose não letal; B:
Porcentagem de migração de células DU145 em 72 horas de incubação com violaceína em dose não letal; C:
Porcentagem de migração de células 22RV1 em 72 horas de incubação com violaceína em dose não letal.
83
9.4.4 PCR em tempo real
Com o uso do software online GeneGlobe Data Analysis Center (QIAGEN, Hilden,
Alemanha), foi possível observar a expressão diferencial dos 84 genes analisados (Figura 12).
Houve alteração na expressão dos genes SLC5A8 (Solute carrier Family 5 member 8) e TFPI2
(Tissue fator pathway inhibitor 2), que foram regulados positivamente em 2,42 e 2,13 vezes
(Fold regulation) respectivamente após o tratamento com violaceína.
Figura 12: Heat map gerado pelo programa GeneGlobe Data Analysis (QIAGEN, Hilden, Alemanha)
indicando a expressão diferencial de 84 genes relacionados ao câncer de próstata após tratamento de células
22Rv1 com violaceína
84
9.5 DISCUSSÃO
A partir dos ensaios de viabilidade celular foi possível observar que violaceína apresenta
uma potente atividade citotóxica nas diferentes linhagens avaliadas. A dose IC50 deste composto
foi de aproximadamente 0,4µM em células 22RV1, 0,65µM em células DU145 e 0,9µM em
células C4-2. Em 2015, Hashimi et al. calcularam a dose IC50 da violaceína em células PC-3
(Adenocarcinoma de próstata derivado de tecido ósseo) e chegaram ao valor de 0,318µM (70).
A variação nos valores de IC50 da violaceína para as diferentes linhagens celulares indicam a
heterogeneidade da resposta dessas células a este composto. O valor de IC50 calculado em
células normais de próstata PNT1A se aproximou de 1,3µM. Sendo assim, a citotoxicidade da
violaceína em células normais de próstata é quase 50% menor do que nas células de câncer de
próstata mais resistentes avaliadas após exposição a este composto.
Em estudo com células U87 (Glioblastoma), Mehta et al. observaram a redução da
migração celular em 40% comparado com o controle (175). No presente estudo, o tratamento
com violaceína reduziu a capacidade de migração de algumas das células de câncer de próstata
testadas em até 50% quando comparado ao controle. Estudos complementares são necessários
para a caracterização do mecanismo ativado por violaceína na redução da migração celular nos
modelos estudados. Sugerimos aqui, que estes estudos objetivem elucidar a influência deste
composto sobre a expressão de proteínas relacionadas à quimiocina CXCL12 e seu receptor
CXCR4 em células de próstata, sendo que, em 2014, Platt et al. observaram que a violaceína
inibe a interação entre CXCL12 e CXCR4 mediada por MMP2 e MMP9 em células MCF-7
(65). Esta interação estimula o processo de angiogênese e induz a multiplicação, invasão e
migração de células tumorais (176). A influência destas metaloproteinases de matriz e
quimiocinas sobre a migração celular foi descrita em células de câncer de próstata por Singh et
al. em 2004, sendo assim, o mesmo mecanismo pode ter sido ativado pela violaceína nas células
avaliadas no presente estudo (177).
A partir de contagem de células viáveis em diferentes tempos de incubação com a
violaceína em dose IC50, foi determinado que a viabilidade das células 22RV1 é reduzida a
partir de 6 horas de tratamento (dados não mostrados). Após este tempo de tratamento, o RNA
das células tratadas foi extraído, purificado e usado como molde para transcrição reversa do
cDNA para análise de PCR em tempo real. Com o ensaio em qPCR, pudemos destacar a
regulação positiva dos genes SLC5A8 e TFPI2. Em 2007, Park et al. sugerem que SLC5A8
seja um supressor tumoral em câncer de próstata, como já havia sido descrito em outros tipos
85
de câncer. Por ensaios de RT-PCR, estes autores relataram que este gene não foi expresso em
células PC-3 e DU145 e apresentaram expressão reduzida em 70% dos tecidos de câncer de
próstata analisados, sendo significantemente mais expressos nos tecidos adjacentes que estavam
livre de tumores (178). Em outro estudo, Ma et al. descrevem que TFPI2 é suprimido por mR-
616, um micro RNA altamente expresso em células de câncer de próstata. Estes autores
correlacionaram a supressão de TFPI2 e o aumento no nível de mR-616 com o aumento no grau
de agressividade do câncer estudado, além de observarem que TFPI2 era mais expresso e menos
suprimido em células e tecidos normais de próstata. A partir destes resultados, sugere-se que
TFPI2, também apresente função de supressor tumoral em câncer de próstata (179).
9.6 CONCLUSÃO
Em experimentos in vitro, a violaceína apresentou maior citotoxicidade em células de
câncer do que em células normais de próstata, foi capaz de inibir a migração celular e, em pouco
tempo de incubação com as células tumorais, regulou positivamente a expressão de genes
envolvidos na supressão tumoral. A partir dos resultados obtidos, é possível que este composto
tenha potencial terapêutico no tratamento do câncer de próstata, porém, estudos
complementares in vitro e in vivo são necessários para a caracterização detalhada dos
mecanismos genéticos e moleculares envolvidos nos efeitos da violaceína em células de câncer
de próstata.
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10. ANEXO II – CERTIFICADOS DO COMITÊ DE ÉTICA EM
EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL
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88
89
11. ANEXO III – DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS
