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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE
SANTANA
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS
VEGETAIS
ALINE SILVA COSTA
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E
ANTIOXIDANTE DE VARIEDADES COMERCIAIS DE Ananas
comosus E AVALIAÇÃO DO EFEITO DE TRATAMENTO TÉRMICO
E DO USO DE ADITIVOS QUÍMICOS
FEIRA DE SANTANA-BA
2011
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ALINE SILVA COSTA
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E
ANTIOXIDANTE DE VARIEDADES COMERCIAIS DE
Ananas comosus E AVALIAÇÃO DO EFEITO DE
TRATAMENTO TÉRMICO E DO USO DE ADITIVOS
QUÍMICOS
FEIRA DE SANTANA-BA
2011
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ALINE SILVA COSTA
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E
ANTIOXIDANTE DE VARIEDADES COMERCIAIS DE
Ananas comosus E AVALIAÇÃO DO EFEITO DE
TRATAMENTO TÉRMICO E DO USO DE ADITIVOS
QUÍMICOS
FEIRA DE SANTANA-BA
2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, da Universidade Estadual de Feira de Santana,
como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em
Recursos Genéticos Vegetais.
Orientador(a): Prof.ª Dr.ª Maria Gabriela Bello Koblitz
Co-orientador: Prof.º Dr.º Hugo Neves Brandão
Co-orientador(a): Prof.ª Dr.ª Sandra Aparecida de Assis
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Ficha Catalográfica – Biblioteca Central Julieta Carteado
Costa, Aline Silva
C87d Determinação da atividade enzimática e antioxidante de variedades comerciais de Ananas comosus e avaliação do efeito de
tratamento térmico e do uso de aditivos químicos/ Aline Silva Costa.
– Feira de Santana, 2011.
85 f : il.
Orientadora: Maria Gabriela Bello Koblitz
Co-Orientadores: Hugo Neves Brandão
Sandra Aparecida de Assis
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Feira de
Santana. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos
Vegetais., 2011.
1.Abacaxi – Característica bioquímica. 2.Poligalacturonases
(PG). 3.Pectinametilesterases (PME). 4.Polifenol-oxidases (PFO)
5.Peroxidases (PER) 6.Compostos fenólicos. I.Koblitz, Maria
Gabriela Bello. II.Brandão, Hugo Neves. III.Assis, Sandra
Aparecida de. IV.Universidade Estadual de Feira de Santana. V.
Título.
CDU: 634.774
v
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr.
__________________________________________
Prof. Dr.
__________________________________________
Prof.ª Dr.ª Maria Gabriela Bello Koblitz
Orientador(a) e Presidente da Banca
Feira de Santana – BA
2011
vi
AGRADECIMENTOS
Á Deus, pela oportunidade cedida a mim, conduzindo todos os meus passos e permitindo
vivenciar experiências inesquecíveis para meu crescimento.
Aos meus pais, Elias e Lene, que sempre me apoiaram e acreditaram na minha
capacidade... Meu eterno muito obrigada, por tudo que vocês são e pelo que eu sou.
À Prof.ª Dr.ª Maria Gabriela Bello Koblitz, pela orientação, compreensão e incentivo e
mesmo distante se fez tão presente.
Ao Prof. Dr. Hugo Neves Brandão, pela ajuda, paciência e colaboração.
À professora Dr.ª Sandra Aparecida de Assis, pelas contribuições neste trabalho.
À Prof.ª Marília Lordêlo Cardoso Silva, pela participação neste trabalho com prestimosas
sugestões, por ter disponibilizado o laboratório de analise físico-química de alimentos e
pela amizade.
À Prof.ª Taís Oliveira Brandão, pela ajuda no teste de compostos fenólicos.
Aos professores do ALI por ter disponibilizado os laboratórios e equipamentos.
À Cintia Reis, pela disponibilidade em ajudar e pela amizade.
À Danielle Figuerêdo, pela ajuda no teste DPPH.
Às minhas IC‟s, Isabela e minha querida irmã Larissa, pelo trabalho prestado,
companheirismo e amizade.
Aos amigos de sempre, Verônica Santos e Andson Rocha pelos bons momentos de
convivência, que serão lembrados com muito carinho, e pelo apoio para seguir sempre com
coerência.
Aos meus tios Maria e Dore, e a toda minha família, irmãos, cunhada, tios e primos pelo
incentivo e torcida.
A André Luiz, por ter sido tão paciente e compreensivo nesta etapa final.
À FAPESB pela concessão da bolsa e suporte financeiro.
À EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, a quem direciono meus agradecimentos à
Fernanda Vidigal e Eliseth Viana.
Enfim, a todas as pessoas não mencionadas, que direta ou indiretamente contribuíram para
a realização desse trabalho.
Muito Obrigada!
vii
RESUMO
O abacaxizeiro constitui uma das fruteiras tropicais mais cultivadas no país e o seu fruto é
consumido ao natural, ou na forma de diversos produtos industrializados. Porém, poucas
variedades de abacaxi são destinadas à industrialização por falta de conhecimento das suas
características bioquímicas, dentre elas a atividade das enzimas pectinolíticas e oxidativas
que estão entre aquelas que reduzem a vida de prateleira de produtos a base de frutas.
Além disso, apesar do crescente interesse a respeito da atividade antioxidante em produtos
de frutas, pouco se sabe sobre o efeito do processamento sobre essa atividade,
especialmente em derivados de abacaxi. Este trabalho teve como intuito estudar a atividade
das enzimas poligalacturonases (PG), pectinametilesterases (PME), polifenol-oxidases
(PFO) e peroxidases (PER), e formas de inativá-las pela adição de inibidores químicos
(ácido ascórbico, metabissulfito de sódio e cloreto de cálcio), e físicos (tempo e
temperatura de tratamento) de variedades comerciais de Ananas comosus. Estudou-se
também o teor de fenóis totais e atividade antioxidante no abacaxi e a possível alteração
desta atividade depois dos tratamentos para inativação enzimática aplicados. Para obtenção
da máxima atividade enzimática foi feito um planejamento experimental analisando as
variáveis pH e concentração de NaCl no método da extração enzimática. Os resultados
mostraram que as maiores atividades obtidas nesse experimento foram: 4752,9 U/g para
PER; 81,6 U/g para PFO; 7961,3 U/g para PME e 0,000036 U/g h-1
para PG. Foram ainda
determinadas as condições mais indicadas para extração das enzimas a saber: pH=6,0 e
concentração de NaCl de 1,0 M para PER; pH inferior a 4,6 para PFO; concentração de
NaCl de 1,0 M para PME e concentração de NaCl de 2,0 M para PG. Utilizando estes
parâmetros foi determinada a atividade enzimática nas variedades Imperial, Vitória, e
Pérola adquiridas em dois locais distintos. Observaram-se maiores atividades das enzimas
pectinolíticas nas variedades Imperial e Vitória, no entanto estas variedades apresentaram
menor atividades das enzimas oxidativas, característica mais vantajosa para a indústria de
alimentos, pois a PER é a enzima mais termorresistente (difícil inativação). Utilizou-se o
delineamento composto central e a metodologia de superfície de resposta para estudar o
efeito do tempo (1 a 9 min), da temperatura (27 a 86 °C) e da concentração do inibidor
químico (0 a 200 mg/L de metabissulfito de sódio, ácido ascórbico e cloreto de cálcio) na
inativação das enzimas PER e PFO. O metabissulfito de sódio mostrou-se o melhor
inibidor para PER, sendo capaz de garantir 100% de inativação com uma concentração de
viii
130 mg/L, a temperatura de 78 °C, por 3 min, evitando danos de altas dosagens do
inibidor e altas temperaturas no fruto. Para inativação de PFO o tratamento indicado foi
com ácido ascórbico a 190 mg/L por 3 min a 75° C, porém este tratamento não foi eficiente
para inativar 100% a enzima PER. Estes tratamentos tiveram efeito positivo na quantidade
de compostos fenólicos totais e na atividade antioxidante, possivelmente pelo fato destes
tratamentos inativarem as enzimas que degradam os compostos fenólicos (PFO e PER), e
foi observada uma correlação de moderada a alta entre o teor de fenóis totais e atividade
antioxidante.
Palavras-chave: abacaxi, poligalacturonases (PG), pectinametilesterases (PME),
polifenol-oxidases (PFO), peroxidases (PER), compostos fenólicos.
ix
ABSTRACT
The pineapple is a tropical fruit orchard in the country most cultivated and its fruit is eaten
raw, or in the form of ice cream, candy, popsicles, juices processed, fruit in syrup and so
on. However, few varieties are used in industry for lack of knowledge of their biochemical
characteristics, among them the pectinolytic enzymes activity and oxidative that are
among those that decrease the shelf life of products made from fruits. Moreover, despite
the growing concern regarding the antioxidant activity in fruit products, little is known
about the effect of processing on this activity, especially in derivatives of pineapple.
Therefore, the objective of the study to determine the activity of enzymes
polygalacturonase (PG), pectin methylesterase (PME), polyphenol oxidase (PPO) and
peroxidase (PER), and ways to inactivate them by the addition of chemical inhibitors
(ascorbic acid, metabisulfite sodium and calcium chloride) and physical (temperature and
time of treatment) of commercial varieties of Ananas comosus. Furthermore, studied the
total phenolic content and antioxidant activity in the pineapple and possible amendment of
this activity after the treatments applied to enzymatic inactivation. To obtain maximum
enzyme activity was made an experimental design by analyzing the pH and NaCl
concentration on enzymatic extraction method. The results showed that the highest
activities obtained in this experiment were: 1.0 M NaCl, pH 6.0 for PER (4752.9 U / g), pH
< 4.6 for PPO (81.6 U / g)1.0 M NaCl for PME (5.8 U / g) and 2.0 M NaCl for PG
(0,000034 U/g.h-1
) . Using these parameters was determined the enzymatic activity of
varieties Imperial, Vitoria, and Perola acquired from two different places. Observed higher
activities of pectic enzymes in Variety Imperial and Victoria, but these varieties showed
lower activity of oxidative enzymes characteristic most advantageous to the food industry,
because the PER is the most thermoresistant enzyme (inactivation difficult). We used the
central composite design and response surface methodology to study the effect of time (1-9
min), temperature (27 to 86 ° C) and concentration of the chemical inhibitor (0 to 200 mg /
L of sodium metabisulphite, ascorbic acid and calcium chloride) in the inactivation of the
PER and PPO. Sodium metabisulphite was found to be the best inhibitor for PER, 100%
could inactivate this enzyme at a concentration of 130 mg / L at a temperature of 78 ° C for
3 min damage from high doses of the inhibitor and high temperatures on fruit . For PPO
treatment with ascorbic acid was given at 190 mg / L for 3 min at 75 ° C, although this
treatment was not effective to inactivate the enzyme 100% PER. These treatments had a
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positive effect on the amount of total phenolics and antioxidant activity, possibly because
these treatments inactivate enzymes that degrade the phenolic compounds (PPO and PER),
and observed a moderate to high correlation between the total phenols and antioxidant
activity.
Key-words: pineapple, polygalacturonase (PG), pectin methylesterase (PME), polyphenol
oxidase (PPO), peroxidase (PER), phenolic compounds.
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SUMÁRIO
1.0 Introdução ....................................................................................................................1
2.0 Revisão da Literatura ...................................................................................................3 2.1 Abacaxi ........................................................................................................................3
2.1.1 Características gerais .............................................................................................3 2.1.2 Melhoramento Genético do abacaxi .......................................................................5
2.2 Enzimas vegetais de importância na indústria de alimentos ..........................................7 2.2.1 Enzimas Oxidativas ...............................................................................................8
2.2.2 Enzimas pectinolíticas ........................................................................................ 12 2.3 Inativação enzimática ................................................................................................. 15
2.4 Atividade antioxidante e Compostos Fenólicos........................................................... 17 2.5 Otimização de processos e delineamento experimental ............................................... 19
3.0 Material e Métodos .................................................................................................... 20 3.1 Experimento 1. Planejamento experimental e otimização do processo de extração
enzimática. ....................................................................................................................... 20 3.1.1 Material vegetal ................................................................................................... 20
3.1.2 Planejamento experimental .................................................................................. 20 3.1.3 Determinação da atividade enzimática ................................................................. 21
3.1.4 Análise Estatística ............................................................................................... 22 3.2 Experimento 2. Determinação da atividade enzimática em diferentes variedades de
abacaxi. ............................................................................................................................ 23 3.2.1 Material Vegetal .................................................................................................. 23
3.2.2 Determinação da atividade enzimática ................................................................. 23 3.2.3 Análise estatística ................................................................................................ 23
3.3 Experimento 3. Otimização da inativação das enzimas PER e PFO ............................ 24 3.3.1 Material Vegetal .................................................................................................. 24
3.3.2 Planejamento experimental .................................................................................. 24 3.3.3 Determinação da inativação de PER e PFO .......................................................... 25
3.3.4 Análise estatística ............................................................................................... 25 3.3.5 Confirmação dos resultados ................................................................................. 25
3.4 Experimento 4. Determinação da atividade antioxidante e compostos fenólicos totais 25 3.4.1 Material Vegetal .................................................................................................. 25
3.4.2 Extração dos compostos antioxidantes e fenólicos ............................................... 26 3.4.3 Atividade antioxidante ......................................................................................... 26
3.4.4 Determinação do teor de fenóis totais .................................................................. 27 3.4.5 Análise Estatística ............................................................................................... 27
4.0 Resultados e Discussão .............................................................................................. 27 4.1 Experimento 01. Planejamento experimental e otimização do processo de extração
enzimática ........................................................................................................................ 27 4.1.1 Peroxidase (PER) ................................................................................................ 29
4.1.2 Polifenol-oxidase (PFO) ...................................................................................... 31 4.1.3 Pectinametilesterase (PME) ................................................................................. 32
4.1.4 Poligalacturonase (PG) ........................................................................................ 33 4.2 Experimento 2. Determinação da atividade enzimática nas variedades de abacaxis .... 35
4.2.1 Peroxidase (PER) ................................................................................................ 35 4.2.2 Polifenol-oxidase (PFO) ...................................................................................... 36
4.2.3 Pectinametilesterase (PME) ................................................................................. 38
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4.2.4 Poligalacturonase (PG) ........................................................................................ 39
4.3 Experimento 3. Otimização da inativação enzimática de PFO e PER .......................... 41 4.3.1 Peroxidase (PER) ............................................................................................... 44
4.3.2 Polifenol-oxidase (PFO) ...................................................................................... 47 4.3.3 Confirmação dos resultados ................................................................................. 51
4.4 Experimento 4. Compostos fenólicos e atividade antioxidante .................................... 52 4.4.1 Compostos fenólicos totais .................................................................................. 52
4.4.2 Atividade Antioxidante ........................................................................................ 53 5.0 Conclusão .................................................................................................................. 55
6.0 Referências ................................................................................................................ 57 7.0 Anexos ....................................................................................................................... 75
1
1.0 Introdução
O abacaxi ou ananás, nomes utilizados tanto para a fruta como para a planta,
pertence à família Bromeliaceae e gênero Ananas Mill. Esse gênero é vastamente
distribuído nas regiões tropicais por intermédio da espécie Ananas comosus (L.) Merril,
que abrange todas as cultivares plantadas de abacaxi (GIACOMELLI, 1981). O abacaxi é
largamente consumido in natura e utilizado na indústria para obtenção de geléias, doces
em calda, produtos minimamente processados e sucos, entre outros e seus nutrientes
exercem funções importantes no organismo humano (GRANADA et al., 2004).
Com relação ao abacaxi como produto processado, é importante ressaltar que o
interesse pelos produtos “prontos para o consumo” a base de frutas vem crescendo
(VIDAL & GASPARETO, 2000). Mas apenas algumas variedades de abacaxi apresentam
atualmente aproveitamento industrial, principalmente pela falta de conhecimentos das suas
características bioquímicas. A conservação de polpas e sucos de frutas depende
basicamente de se evitar eficientemente a contaminação microbiana e de se contornar os
efeitos deletérios causados pela ação das enzimas endógenas dos frutos. Os grupos de
enzimas mais danosos em polpas e sucos de frutas são as enzimas pectinolíticas e as
enzimas oxidativas (TOIVONEN & BRUMMELL, 2007; MARTINEZ & WHITAKER,
1995).
No primeiro grupo encontram-se a pectinametilesterase (PME) e a
poligalacturonase (PG): essas enzimas são capazes de hidrolizar a pectina presente na
polpa reduzindo sua viscosidade e retirando a turbidez. Conhecendo a atividade das
enzimas pectinolíticas, além de algumas de suas características bioquímicas e sabendo da
possibilidade de algum dano à polpa ou suco armazenado, pode-se indicar qual a melhor
estratégia para evitar esse dano (LEA, 1995; URLAUB, 2002). Entre as enzimas
oxidativas, as mais importantes são as polifenol-oxidases (PFO) e as peroxidases (PER). O
controle destas enzimas é de grande importância para a tecnologia de alimentos, uma vez
que estas são responsáveis pelo escurecimento em frutas e vegetais e seus produtos
processados. Além disso, estas enzimas podem participar de um grande número de reações
oxidativas e de biodegradação, tais como mudança de cor, degradação da clorofila ou
auxinas, oxidação de fenóis, oxidação do ácido indol acético, biossíntese da lignina, e
muitos destes fatores também podem ser associados com sabor, aroma cor, textura e
2
qualidade nutricional dos alimentos (BURNETTE, 1977; CLEMENTE, 1995; VÁMOS-
VIGYÁZÓ, 1981).
Os frutos contêm, além dos nutrientes essenciais e de micronutrientes como
minerais, fibras e vitaminas, diversos compostos secundários de natureza fenólica,
denominados polifenóis que possuem ação antioxidante (KIM et al., 2007). Diversos
estudos têm demonstrado que o consumo de substâncias antioxidantes na dieta diária pode
produzir uma ação protetora efetiva contra os processos oxidativos que naturalmente
ocorrem no organismo. Os compostos fenólicos exibem grande quantidade de propriedades
fisiológicas (como antialergênica, antiaterogênica, antiinflamatória, antimicrobiana,
antitrombótica, cardioprotetiva e vasodilatadora), mas o principal efeito dos compostos
fenólicos tem sido atribuído à sua ação antioxidante em alimentos (BALASUNDRAM et
al., 2006).
O consumo cada vez mais frequente de alimentos industrializados desperta o
interesse na qualidade desses produtos que estão sendo consumidos e a influência do
processamento ainda é pouco estudada. Por isso a importância em verificar a influência do
processamento nos compostos benéficos que estão presentes nos alimentos in natura
(VEDANA, 2008).
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivos avaliar a atividade das
enzimas oxidativas e pectinolíticas, importantes para a indústria de alimentos, em
diferentes variedades de abacaxi de modo a subsidiar a escolha das variedades com boas
características industriais e funcionais. Além de determinar os parâmetros ideais de
inativação das enzimas encontradas minimizando custos e danos ao produto e avaliar a
atividade antioxidante nas variedades estudadas, antes e depois do tratamento de inativação
enzimática.
3
2.0 Revisão da Literatura
2.1 Abacaxi
2.1.1 Características gerais
O abacaxizeiro pertence à família Bromeliaceae (subclasse das monocotiledôneas)
gênero Ananas, sendo a espécie Ananas comosus L. Merril a que mais se destaca, por sua
importância econômica e em razão de abranger todas as variedades de interesse da
fruticultura comercial (PIZA et al., 2003). O seu fruto, o abacaxi, é normalmente cilíndrico
constituído por 100 a 200 pequenos frutilhos fundidos entre si sobre o eixo central, em que
cada “olho” ou “escama” da sua casca é um fruto verdadeiro, que cresceu a partir de uma
flor, e estes se fundem em um grande corpo, chamado infrutescência, no topo do qual se
forma a coroa (GIACOMELLI, 1981; SILVA & TASSARA, 2001). A parte comestível do
fruto é a polpa suculenta formada pelas paredes das lojas dos frutilhos e pelo tecido
parenquimatoso que as ligam entre si, bem como pela porção externa do miolo (MEDINA,
1987).
O abacaxi é extensivamente produzido em todos os países tropicais, sendo que o
Brasil encontra excelentes condições para seu desenvolvimento, sendo cultivado em quase
todos os Estados (FAOSTAT, 2010). O Brasil responde por 8,93% da produção mundial e
a área plantada em 2009 foi de 60 mil hectares, nos quais foram colhidos 1,479 milhões de
frutos. Na safra de 2010, foram produzidos 1,48 milhões de frutos em uma área colhida de
57.727 hectares, um acréscimo de 1,07% em relação ao ano anterior. Os Estados da
Paraíba, Minas Gerais, Pará e Bahia são os principais produtores, o que torna o Nordeste a
região de maior produção (Figura 01) (IBGE, 2010). A Bahia responde por 8,23% da
produção brasileira, ocupando o quarto lugar no ranking dos estados produtores, com uma
produção de 121,127 mil frutos no ano de 2009 (IBGE, 2010). No Recôncavo Baiano a
cultura do abacaxi vem se destacando a cada ano, gerando emprego e renda para o meio
rural, contribuindo para o desenvolvimento local.
4
Figura 01. Produção brasileira de abacaxi por região fisiográfica.
Fonte: IBGE, 2010.
O Brasil é considerado um dos principais centros de diversidade genética do
abacaxi porque, além de A. comosus, todas as espécies do gênero Ananas são encontradas
nas formas silvestres ou cultivadas em várias regiões brasileiras (FERREIRA & CABRAL,
1993). Existem centenas de cultivares desenvolvidas no Brasil e no mundo, sendo que a
Singapore Spanish, Queen e Espanhola Roja, juntamente com a Perolera, Smooth Cayenne
e Pérola, caracterizam as mais conhecidas no mundo (CABRAL et al., 1999). As principais
cultivares brasileiras são a Pérola e a Smooth Cayenne, sendo a Pérola a mais cultivada
(80% da produção nacional) que é destinada principalmente para o consumo in natura pela
sua alta qualidade organoléptica (CABRAL et al., 1999; PINHEIRO et al., 2000). A
indústria tem a preferência pela variedade Smooth Cayenne por apresentar fruto com
excelente aspecto, de elevado tamanho e formato cilíndrico (o que facilita o
descascamento), pesando de 1,5 a 2,0 kg, polpa firme e amarela, com elevado teor de
açúcares e elevada acidez (PINHEIRO et al., 2000; NASCENTE et al., 2005). Já o abacaxi
Pérola apresenta forma cônica, polpa branca, sucosa, pouca acidez (o que favorece ao
consumo in natura), pesando de 1,0 kg a 1,5 kg (CABRAL et al., 2000).
A qualidade dos frutos é atribuída ao seu tamanho, forma e cor da casca, cujos
fatores associados à composição físico-química da polpa, oferecem aos frutos e aos
produtos deles obtidos a qualidade sensorial e nutricional, responsáveis pela aceitação
definitiva desses no mercado (SCALON et al., 2004). O abacaxi apresenta ampla variação
em sua composição química. Diferentes estudos apresentam amplas faixas para os valores
de pH, acidez titulável, açúcares totais e sólidos solúveis dependendo da variedade
5
cultivada, do estádio de maturação, do clima e da época do ano em que o fruto foi
produzido, do solo, dos tratos culturais, entre outros fatores (CESAR, 2005). Ele possui em
sua composição: ferro, potássio, cálcio, as vitaminas A1, B1, B2 e C, além das vitaminas
tiamina, riboflavina e niacina, fibras e outros compostos orgânicos (MEDINA et al., 1978;
FRANCO, 1989).
As formas mais frequentes de comercialização do abacaxi são in natura, em
conserva, suco natural e suco concentrado, polpa em calda, além de ser utilizado também
na fabricação de doces, sorvetes, cremes, balas, bolos, licor, vinho, vinagre e aguardente.
No mercado externo tem-se observado um particular interesse com relação aos sucos de
frutas tropicais, despertando as indústrias nacionais de sucos para o imenso potencial a
ser explorado junto aos consumidores da Europa, Ásia e Estados Unidos. Segundo dados
do Instituto Brasileiro de Fruticultura (IBRAF, 2008), o Brasil exportou mais de 2 milhões
de litros de suco de abacaxi no ano de 2007, enquanto que em 2006 essa marca atingiu
apenas 450 mil litros.
2.1.2 Melhoramento Genético do abacaxi
Apesar da existência de diversas cultivares de abacaxi, os plantios comerciais em
todo o mundo são formados predominantemente com a variedade Smooth Cayenne. Esta
estreita base genética é desfavorável à sustentabilidade da cultura, fazendo-se necessário
uma diversificação de cultivares (CABRAL, 1999).
Os programas de melhoramento do abacaxi visam obter cultivares mais produtivas,
adaptadas às condições climáticas locais e resistentes a pragas e moléstias. Entre as
principais características preconizadas no melhoramento do abacaxizeiro, está a busca de
genótipos resistentes à fusariose (Fusarium subglutinans f.sp. ananas,), principal moléstia
da cultura do abacaxi no Brasil. Além disso, são almejados genótipos que evidenciem
crescimento rápido, folhas com ausência ou poucos espinhos nas extremidades dos seus
bordos, rebentão precoce localizado na base da planta, fruto de forma cilíndrica, casca
amarela e pouco fibrosa, elevado teor de sólidos solúveis totais, acidez moderada e alto
teor de ácido ascórbico e adaptação ao sistema de produção integrada (CUNHA, 2007;
CRESTANI et al., 2010).
O Centro Nacional de Pesquisa de Mandioca e Fruticultura da Embrapa possui o
maior Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de abacaxizeiros do mundo, contando com
aproximadamente 700 acessos. A caracterização e avaliação deste BAG permitiu a
6
identificação de acessos resistentes à fusariose, com folhas sem espinhos nos bordos,
produção precoce de rebentões, sólidos solúveis totais acima de 15° brix e acidez
moderada. Esses acessos são usados para o desenvolvimento de novas cultivares, algumas
já lançadas no mercado, como as cultivares Imperial e Vitória (CABRAL et al., 2006;
MACHADO et al., 2009).
A cultivar Imperial (Figura 02) foi lançada pela Embrapa Mandioca e Fruticultura
em 2003. Esta cultivar é resultante do cruzamento das variedades Perolera com Smooth
Cayenne. Além de ser resistente à fusariose, o fruto é pequeno, cilíndrico, a polpa é
amarela, com elevado teor de açúcar, acidez titulável moderada, alto conteúdo em ácido
ascórbico e excelente sabor, de acordo com as análises sensoriais realizadas. Essas
características contribuem para que os frutos obtidos sejam destinados para o mercado de
consumo in natura e para a industrialização (CABRAL & MATOS, 2005).
Figura 02. Fruto Abacaxi Imperial
Fonte: CABRAL & MATOS 2005.
A cultivar Vitória (Figura 03) é resultado dos estudos da Embrapa Mandioca
Fruticultura e do Incarper (Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão
Rural). Foi utilizado como parental feminino a cultivar Primavera (PRI) e parental
masculino a cultivar Smooth Cayenne (SC), dando no ano de 2006 origem à cultivar
Vitória. Os frutos têm polpa branca, elevada acidez, formato cilíndrico, pesando em torno
de 1,5 kg e excelente sabor segundo as análises químicas e sensoriais, sendo indicado tanto
para o consumo in natura quanto para a industrialização (VENTURA et al., 2006).
7
Figura 03. Abacaxi Vitoria.
Fonte: INCARPER, 2010.
2.2 Enzimas vegetais de importância na indústria de alimentos
Enzimas são, em sua maioria, proteínas que catalisam, com grande eficiência, as
reações metabólicas em determinadas condições de pH, temperatura, meio iônico, entre
outros (WHITAKER, 1972).
As reações enzimáticas são muito importantes em alimentos. Elas são responsáveis
pela formação de compostos extremamente desejáveis, mas também podem provocar
consequências desfavoráveis e ocorrem não só no alimento natural, mas também durante o
seu processamento e armazenamento. Os alimentos de origem vegetal merecem atenção
especial, pois os vegetais possuem em sua composição grupos de enzimas que causam
alterações nos alimentos.
A respeito do comportamento fisiológico de frutos e vegetais, já está estabelecido
que grande parte de sua deterioração - mudanças no sabor, na textura, turbidez e no valor
nutricional - são ocasionados por enzimas do grupo das oxidoredutases, sobretudo
peroxidases (PER) e polifenol-oxidases (PFO); e pelo grupo de enzimas pectinolíticas -
pectinametilesterases (PME) e poligalacturonases (PG) (LEE et al., 1984; CHITARRA;
CHITARRA, 2005).
8
2.2.1 Enzimas Oxidativas
Enzimas oxidativas são aquelas que realizam reações de oxirredução. As enzimas
PFO e PER são importantes, pois em frutas e vegetais são responsáveis pela mudança de
cor, degradação da clorofila, oxidação de fenóis, do ácido indol acético, sendo que muitos
desses fatores estão associados com sabor, aroma, cor, textura e qualidades nutricionais
dos alimentos (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
O problema mais grave dessas enzimas nos frutos é o escurecimento dos tecidos,
que ocorre principalmente pela reação de oxidação dos compostos fenólicos (FILHO &
VIEIRA, 2002). O escurecimento enzimático de vegetais inicia-se em resposta às injúrias
físicas e/ou fisiológicas (impactos, abrasões, injúria pelo frio, excesso de CO2) e é
resultado da oxidação de compostos fenólicos por ação, sobretudo, de PFO. De acordo com
Tomás-Barberán & Spín (2001), PER e PFO são relevantes na degradação oxidativa dos
compostos fenólicos por causarem a produção de polímeros de coloração marrom
conhecidos como melaninas.
Whitaker & Lee (1995) acreditam que mais de 50% das perdas em frutas ocorrem
como resultado do escurecimento enzimático. O controle do escurecimento, portanto,
torna-se crítico para a diminuição das perdas comerciais do agricultor e para a indústria de
transformação. Os pigmentos escuros formados pela ação de PER e PFO são geralmente
acompanhados de mudanças indesejáveis na aparência e nas propriedades sensoriais do
produto, resultando na diminuição da sua vida útil e do seu valor de mercado (ARAÚJO,
1999).
Dentre os diversos fatores que constituem entraves na qualidade do abacaxi
destinados à exportação, está um distúrbio fisiológico denominado “escurecimento
interno”, causado pelo transporte e armazenamento dos frutos em temperaturas inferiores à
sua faixa de segurança (temperatura mínima de segurança - TMS), que é considerada entre
7 e 12ºC. Entretanto, tem-se observado que mesmo dentro dessa faixa de temperatura pode
ocorrer a manifestação de sintomas dessa injúria no abacaxi (ABREU, 1995). Esse
distúrbio fisiológico dos frutos também é associado à ação das enzimas PFO e PER e sua
ação sobre os compostos fenólicos (TEISSON, 1979). Com a injúria do tecido pelo frio há
o rompimento das membranas celulares liberando as enzimas, que entram em contato com
seus substratos (fenólicos e O2 ou H2O2), havendo assim uma oxidação excessiva e não-
controlada ocasionando os compostos escuros (ABREU, 1995).
9
2.2.1.1 Peroxidases
PER (EC 1.11.1.7, doador H2O2 óxido-redutase) são enzimas capazes de oxidar
diferentes compostos, na presença de peróxidos, gerando radicais livres. Na ausência de
peróxidos, essas enzimas podem ainda catalisar a oxidação de alguns substratos com o
auxilio de oxigênio molecular e também hidroxilar diferentes compostos aromáticos
(tirosina, fenilalanina e outros fenólicos). Por ser não especifica, ela pode catalisar a
oxidação de um grande número de fenóis e compostos com anéis aromáticos que ocorrem
naturalmente em tecidos de plantas. Normalmente, essas enzimas estão relacionadas a
reações de oxidação que resultam na formação de compostos coloridos, mas também
podem promover várias reações de biodegradação (BURNETTE, 1977; KOBLITZ, 2008).
O estudo da PER é de grande importância, pois ela pode interferir na qualidade dos
produtos, tanto para os industrializados como para os de consumo in natura, podendo até
mesmo influenciar a deterioração de alimentos quando armazenados, desenvolvendo
sabores e odores indesejáveis nos produtos (HAARD, 1977; LEE & HAMMES, 1979). A
PER pode participar da destruição de vitamina C, catalisar o branqueamento dos
carotenóides na ausência de ácidos graxos insaturados e a descoloração de antocianinas.
Catalisa ainda a reação de degradação de ácidos graxos insaturados, produzindo voláteis
que alteram o sabor (RICHARDSON & HYSLOP, 1985).
As PER estão entre as enzimas mais termoestáveis relatadas em vegetais
(BURNETTE, 1977). Podem apresentar diferentes valores de pH ótimo de atividade,
dependendo do substrato empregado e, após certas condições de tratamento, podem
regenerar sua atividade durante o armazenamento de alimentos processados (BURNETTE,
1977; CLEMENTE, 1995).
A Figura 04 representa o mecanismo de escurecimento enzimático da PER,
utilizando como doador de hidrogênio o guaiacol, bastante utilizado nos métodos de
detecção da atividade dessa enzima (FILHO & VIEIRA, 2002). Na reação enzimática o
peróxido de hidrogênio ou outro peróxido orgânico, como o peróxido de metila ou o etil
hidrogênio, é reduzido, enquanto que um doador de elétrons (AH2) é oxidado. O doador de
elétrons pode ser ascorbato, fenóis, aminas ou outros compostos orgânicos. Em muitos
casos o produto da oxidação é colorido e serve como base para a determinação
colorimétrica da atividade da peroxidase (BRITO et al., 2005).
10
Figura 04. Mecanismo de escurecimento enzimático a partir da peroxidase (PER).
Fonte: DEBIEN, 2010.
Ferreira (1983) citado por Brito (2001) purificou e caracterizou PER de abacaxi da
cultivar Pérola. O extrato bruto apresentou uma atividade total de 14,6 U/minuto/mL de
suco e uma atividade específica de 8,59 U/minuto/mg de proteína. Beaudreau & Yasunobu
(1996) encontraram, para o extrato bruto de abacaxi, uma atividade de 24.800 U/mL.
Brito et al. (2005), estudaram algumas características de PER de cultivares de
abacaxi desenvolvidos pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC). As PER dos
cultivares IAC Gomo-de-mel e de seu clone IAC-1 apresentaram temperatura ótima para a
atividade nas faixas de 45 °C a 50 °C e de 50 °C a 55 °C, respectivamente, e apresentaram
atividade ótima em pH 4,5 a 50 °C, com menor atividade em valores de pH muito ácidos
(2,6) ou alcalinos (superiores a 7,0). Brito et al. (2008), estudando as mesmas variedades,
verificaram que IAC Gomo-de-mel apresentou menor atividade de PER bruta (3194 U/g)
que os cultivares comerciais Smooth Cayenne (5137 U/g) e Pérola (5624 U/g).
2.2.1.2 Polifenol-oxidases (PFO)
PFO são enzimas capazes de oxidar compostos fenólicos com o auxílio do oxigênio
molecular. O resultado final das reações catalisadas por PFO são quinonas. Essas
substâncias são altamente reativas e combinam-se entre si e com outros componentes do
meio para gerar produtos de condensação de alta massa molecular e cor escura, chamados
de melaninas (KOBLITZ, 2008). São três as reações catalisadas pela PFO na presença do
oxigênio molecular: a hidroxilação de monofenóis a o-difenóis (atividade monoxigenase,
EC 1.14.18.1), a oxidação de o-difenóis a o-quinonas (atividade difenoloxidase, EC
1.10.3.2), e a oxidação de p-difenóis a p-quinonas (atividade lacase, EC 1.10.3.1)
11
(ZAWISTOWSKI et al., 1991). A Figura 05 mostra o mecanismo, resumidamente, da ação
das PFO no escurecimento enzimático.
Em tecidos vivos, esta enzima e o substrato fenólico estão separados dentro das
células. No momento da extração ou de algum outro processo que danifique a célula, a
enzima e o substrato entram em contato, ocorrendo então a reação. Com a formação da o-
quinonas, acontece a reação com outras o-quinonas formando as melaninas, além de
reagirem também com aminoácidos, peptídeos e proteínas causando alterações estruturais e
funcionais, acarretando a diminuição do valor nutritivo do produto (ESCRIBANO et al.,
1997).
Figura 05. Reação de escurecimento enzimático a partir da polifenol-oxidase.
Fonte: DABIEN, 2010.
Nos tecidos vegetais, PFO estão localizadas nos cloroplastos e sua concentração
(atividade) no tecido vegetal depende do local do plantio, período da colheita, espécie e do
estado de amadurecimento, sendo menor em frutos ou vegetais não-amadurecidos (FILHO
& VIEIRA, 2002). Em plantas, as PFO podem estar solúveis ou ionicamente ligadas à
membrana. Estudos histoquímicos revelaram que essas enzimas estão localizadas
predominantemente em membranas tilacóides de cloroplastos e a sua distribuição nas
diferentes partes da planta também é variável (MARTINEZ & WHITAKER, 1995;
VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
Thé et al. (2001) estudaram atividade de PFO em diferentes estádios de maturação e
formas de armazenamento em polpa de abacaxi e encontraram diferença significativa para
a atividade entre todos os fatores estudados, assim como para a interação entre os mesmos.
A atividade encontrada variou entre 25,81 U/g a 47,98 U/g. Nos frutos em estádio de
maturação 3, armazenados sob refrigeração, a atividade foi mais elevada, o que reforça a
12
teoria da ocorrência de injúria pelo frio (escurecimento interno) e que em frutos maduros a
atividade desta enzima é maior.
Zhou et al. (2003) estudaram a relação entre a atividade de PER e PFO com o
escurecimento interno dos frutos de abacaxi submetidos à refrigeração. Verificaram que a
atividade de PFO era muito baixa na colheita dos frutos e manteve-se baixa durante o
armazenamento pós-colheita numa temperatura de 25 °C durante 4 semanas. Entretanto, a
atividade de PFO aumentou consideravelmente nos frutos após armazenagem em
temperatura mais baixa. O aumento da atividade de PFO foi diretamente relacionado à
incidência de sintomas do escurecimento interno.
2.2.2 Enzimas pectinolíticas
As pectinases formam um grupo de enzimas que degradam substâncias pécticas,
hidrolisando ligações glicosídicas ao longo da cadeia carbônica (UENOJO & PASTORE,
2006).
As substâncias pécticas são definidas como um grupo complexo de polissacarídeos
em forma coloidal, contendo uma grande proporção de unidades de ácido anidro
galacturônico em forma de cadeia. Os grupos carboxílicos do ácido poligalacturônico
podem estar parcialmente esterificados por grupos metílicos e parcial ou totalmente
neutralizados pelo sódio, potássio ou íons de amônio. Incluindo as galactanas e arabinanas
(GAVA, 1998; KRATCHANOV et al., 2004).
A degradação de polissacarídeos pécticos é uma das principais causas do processo
de amaciamento dos frutos. Estão envolvidos na modificação da textura de frutas dois
principais processos enzimáticos, cuja ação é devida à atividade das enzimas pectinolíticas
pectinametilesterase - PME e da poligalacturonase - PG (ANTHON et al., 2002). Quando
os grupos carboxílicos livres das substâncias pécticas encontram-se ligados ao cálcio,
formam o pectato de cálcio, que é insolúvel e também designado como protopectina,
predominante em frutos imaturos. Com o amadurecimento, há liberação de cálcio e
solubilização de protopectina das paredes celulares, possivelmente por ação enzimática. Há
então modificação da textura, que se torna gradualmente macia. Essas transformações
ocorrem não só durante o amadurecimento, como também no armazenamento de frutas e
algumas hortaliças (CHITARRA & CHITARRA, 2005). Em decorrência das modificações
das pectinas durante o amadurecimento, a estrutura das paredes celulares torna-se
13
progressivamente mais hidratada. Dessa forma, a textura do fruto é afetada pela facilidade
com que as células rompem ou se separam umas das outras (BRUMMELL et al., 2004).
PME são enzimas desmetoxilantes que hidrolisam a ligação éster removendo a
metoxila de ácidos galacturônicos esterificados com metanol, resultando em pectinas com
baixo teor de metoxilação. PG são enzimas despolimerizantes que hidrolisam as ligações
glicosídicas entre ácidos galacturônicos (em pectinas com baixo teor de metoxilação ou
ácido péctico/poligalacturônico) e sua atividade decresce com o aumento no grau de
metoxilação dos substratos (KOBLITZ, 2008). A ação de PME deve preceder a atividade
de PG, no sentido de facilitar a atividade desta última, pela desmetilação dos
poliuronídeos, uma vez que PG apresentam afinidade pelo substrato linear desmetilado,
após a atuação da PME (ANTHON et al., 2002).
2.2.2.1 Pectinametilesterases (PME)
Durante o crescimento celular, os homogalacturonanos são secretados nas paredes
celulares com um elevado grau de metilesterificação e, progressivamente, são
desmetilesterificados. Concomitantemente, ocorre aumento da atividade de PME (EC
3.1.1.11), enzimas que hidrolisam os grupos metiléster da posição C-6 dos
homogalacturonanos, formando pectinas com menor grau de metilação e metanol. A
atividade de PME é detectada durante todas as fases do desenvolvimento dos frutos, sendo
que picos de atividade são observados quando os frutos são ainda pequenos e imaturos e
logo no início do processo de amadurecimento (BRUMMELL & HARPSTER, 2001).
Em sucos, a diminuição no grau de esterificação e o aumento na densidade de
cargas geradas na cadeia péctica causam uma elevação na afinidade pelos íons de cálcio
(Ca+2
), sendo então geradas ligações cruzadas intermoleculares mediadas por esse íon. Esta
auto-associação das regiões não esterificadas da pectina poderá levar à formação de
agregados e por consequência sua precipitação (ROMBOUTS et al., 1982; BAKER &
CAMERON, 1999; BOAS et al., 2000). O grande problema na indústria de sucos
concentrados é a formação desses géis de pectato de cálcio impedindo a reconstituição
satisfatória do suco (KOBLITZ, 2008). Por isso o suco é inicialmente submetido a um
aquecimento inicial à temperatura de 90 a 95 ºC durante 30 a 40 segundos, visando a
inativação enzimática (MAIA et al., 2007).
Segundo o estudo elaborado por Thé et al. (2001), a atividade de PME variou de
87,50 U/g a 312,50 U/g em diferentes estádios de maturação do abacaxi. Thé et al. (2006)
14
verificou que a atividade de PME nos frutos de abacaxi analisados no dia da colheita
(116,25 U.g-1
/min) foi inferior à observada após o armazenamento (variação de 174,0 a
750,00 U.g-1
/min). Durante o armazenamento eles utilizaram diversos métodos para
prolongar a vida útil do fruto (associação de tratamentos hidrotérmicos, cloreto de cálcio e
atmosfera modificada). Os mais efetivos foram aqueles que utilizaram embalagem,
resultado também encontrado por Abreu (1995), onde os frutos acondicionados em
embalagens de polietileno sem perfuração evidenciaram menor atividade de PME.
2.2.2.2 Poligalacturonases (PG)
PG são as enzimas que catalisam a hidrólise das ligações glicosídicas α(1→4) da
cadeia de ácido poligalacturônico. As endo-PG (EC 3.2.1.15) hidrolisam as ligações
glicosídicas α(1→4) internas de forma randômica, causando a despolimerização da
molécula e liberando oligômeros de ácido galacturônico, enquanto as exo-PG (EC
3.2.1.67) removem as moléculas de ácido D-galacturônico pela hidrólise das ligações
glicosídicas α(1→4) a partir da extremidade redutora, liberando ácidos mono- ou di-
galacturônicos (VANDRESEN, 2007).
Os homogalacturonanos estão presentes na parede celular numa forma altamente
metilesterificada e, para tornarem-se substratos da PG, precisam ser desmetilesterificados
(BRUMMELL & HARPSTER, 2001). A hidrólise das ligações glicosídicas existentes nas
substâncias pécticas está diretamente ligada ao aumento de pectinas solúveis, à diminuição
da rigidez intercelular e à adesividade dos tecidos vegetais (ASSIS et al., 2000; RESENDE
et al., 2004). O aumento de pectinas solúveis causados pelas PG afetam diretamente a
textura e firmeza dos produtos de frutas, problema encontrado principalmente nos abacaxis
minimamente processados.
Thé et al. (2009) estudaram a influência da associação de tratamento hidrotérmico,
cloreto de cálcio e atmosfera modificada sobre fatores relacionados à textura de abacaxi,
cultivar Smooth Cayenne. Os autores relataram que os efeitos do cálcio nos frutos têm
recebido muita atenção, visto que a aplicação desse cátion produz efeitos positivos no
adiamento da maturação e da senescência. São citados Siddiqui & Bangerth (1996), que
afirmam que o acúmulo dos cátions Ca2+
pode facilitar a ligação entre os polímeros de
pectina, particularmente na lamela média, aumentando sua resistência.
Foi encontrada, no trabalho de Thé et al. (2009), atividade de PG em frutos de
abacaxi variando entre 929,38 nmol.g-1
a 526,85 nmol.g-1
. Thé et al. (2001), não observou
15
diferenças significativas entre a atividade de PG dos abacaxis Smooth Cayenne em
diferentes estádios de maturação, porém a atividade desta enzima foi influenciada pelo
armazenamento (com refrigeração: 697,24 U/g e sem refrigeração: 765,53 U/g). Este
resultado também foi encontrado por Prado et al. (2003), que obteve o menor valor de
atividade para abacaxi Smooth Cayenne minimamente processado sob refrigeração e
atmosfera modificada com valores que variaram na faixa de 36,05 a 69,83 U/min/g.
2.3 Inativação enzimática
Na indústria de alimentos, a inativação e a ativação enzimáticas são recursos
utilizados no processamento de vários produtos. A inativação enzimática objetiva
principalmente a conservação do produto, em seu período de elaboração e de
armazenamento (EVANGELISTA, 1998). A inibição ou inativação enzimática pode ser
realizada através de alguns métodos, como por exemplo: a adição de aditivos inibidores
como o sulfito ou dióxido de enxofre, ácido ascórbico; mudanças de pH; exclusão do
oxigênio por embalagem a vácuo ou emprego de atmosfera modificada; adição de sacarose
para alterar a atividade de água; o congelamento e o tratamento pelo calor, sendo o
tratamento térmico e a adição de sulfito ou dióxido de enxofre os mais utilizados. Além da
temperatura, outro parâmetro importante no processamento térmico é o tempo. Assim, ao
se especificar a temperatura do processamento térmico, é indispensável que se especifique
também o tempo de tratamento (CUNHA et al., 2005).
Diversos mecanismos têm sido propostos com o intuito de prevenir o
escurecimento dos tecidos, os quais visam à diminuição da biossíntese de enzimas
envolvidas e cuidados na manutenção da integridade celular do tecido vegetal. O controle
do escurecimento torna-se crítico para a diminuição das perdas comerciais do agricultor e
para a indústria de transformação (SILVA et al., 2009). O uso de inibidores de
escurecimento enzimático em alimentos é restrito pela toxicidade que podem causar
dependendo da concentração empregada, e também pelo potencial efeito negativo na
textura, aroma, gosto e custos.
O ácido ascórbico, ou vitamina C, além de atribuir valor nutricional aos alimentos,
também apresenta ação redutora. Juntamente com seus sais neutros compõe um dos
principais grupos de antioxidantes empregados em produtos vegetais com o intuito de
prevenir o escurecimento e outras reações oxidativas de duas maneiras: (1) agindo
diretamente na enzima, complexando o cobre do grupo prostético da PFO ou oxidando os
16
resíduos de histidina que ligam os íons de cobres do sítio ativo, causando sua inibição; (2)
reduzindo as quinonas à sua forma anterior de fenóis, impedindo a formação dos
pigmentos escuros (SAPERS e MILLER, 1998; KOBLITZ, 2008).
O sulfito é um dos inibidores químicos mais comumente utilizados na prevenção do
escurecimento enzimático (MARTINEZ et al., 1995). Geralmente é aplicado sob forma de
sais (metabissulfito ou bissulfito de sódio ou potássio). São inibidores diretos da PFO
atuando sobre seu sítio ativo, além de reagirem com as quinonas formadas, gerando
compostos incolores estáveis, o que evita que se polimerizem (KOBLITZ, 2008).
Sabe-se que o calor pode reduzir a atividade de enzimas e o cálcio pode contribuir
para a manutenção da integridade celular; como conseqüência, a interação entre esses dois
fatores também pode contribuir para menor acúmulo de substratos (fenólicos) nos tecidos
da polpa do abacaxi reduzindo a interação destes com as enzimas menos ativas,
responsáveis pelas reações de escurecimento (GONÇALVES et al., 2000). Resultados
obtidos em vários estudos sugerem que a manutenção da integridade celular conferida pela
aplicação de CaCl2 nos frutos se reflete numa menor atividade das enzimas oxidativas
(PER e PFO) resultando em menor índice de escurecimento, o que pode ser, em parte,
atribuído à menor possibilidade de contato das enzimas com substratos e menor
disponibilidade de fenólicos (GONÇALVES et al., 2000).
O cálcio participa de forma importante da estrutura e da resistência mecânica da
parede celular. O acúmulo dos cátions Ca2+
pode facilitar a ligação entre os polímeros de
pectina, particularmente na lamela média, aumentando sua resistência. O cálcio, além de
conferir insolubilidade ao material péctico, pode inibir a atividade da PG. O pectato
formado pela presença do cálcio é resistente à degradação pela PG, que atua
preferencialmente na ligação glicosídica adjacente ao grupo carboxílico não-esterificado
(THÉ et al., 2006).
Diversas alternativas vem sendo estudadas a fim de se fornecer meios para a
inativação das enzimas que influenciam o tempo de armazenamento dos frutos e de seus
produtos. Silva et al. (2007) estudaram o efeito da radiação ionizante com fonte de
Cobalto-60, como um tratamento alternativo para o aumento da vida útil de abacaxi. A
atividade de PFO, no entanto, aumentou com aplicação da radiação, apresentando resultado
de 32,60 U.g -1
/min, enquanto os frutos controle mantiveram atividade de 27,78 U.g –1
/min.
17
2.4 Atividade antioxidante e Compostos Fenólicos
As frutas, reconhecidas fontes de vitaminas, minerais e fibras, são alimentos
nutricionalmente importantes da dieta. No entanto, nos últimos anos, maior atenção tem
sido dada a estes alimentos uma vez que evidências epidemiológicas têm demonstrado que
o consumo regular de vegetais está associado à redução da mortalidade e morbidade por
algumas doenças crônicas não transmissíveis. O efeito protetor exercido por estes
alimentos tem sido atribuído à presença de polifenóis com ação antioxidante (MELO et al.,
2008). Compostos fenólicos, estruturalmente, compreendem compostos que possuem um
anel aromático ligado a um ou mais grupos hidroxila e podem variar de simples moléculas
de fenóis a grandes moléculas de compostos polimerizados. Embora haja esta diversidade
estrutural, esse grupo de compostos é denominado polifenóis (BALASUNDRAM et al.,
2006). Existem cerca de cinco mil fenóis, dentre eles, destacam-se os flavonóides, ácidos
fenólicos, fenóis simples, cumarinas, taninos, ligninas e tocoferóis (NACZAK &
SHAHIDI, 2004). Principais fontes dietéticas de polifenóis, as frutas, em função de fatores
intrínsecos (cultivar, variedade, estádio de maturação) e extrínsecos (condições climáticas
e edáficas) apresentam, em termos quantitativos e qualitativos, composição variada desses
constituintes. Por sua vez, a eficácia da ação antioxidante depende da estrutura química e
da concentração dos polifenóis no alimento (MELO et al., 2008).
O excesso de radicais livres no organismo é combatido por antioxidantes
produzidos pelo corpo ou absorvidos da dieta. Quando há um desbalanço entre a produção
de radicais livres e os mecanismos de defesa antioxidante, ocorre o chamado “estresse
oxidativo”. Os radicais livres em excesso podem ser originados por defeitos na respiração
mitocondrial, metabolismo do ácido araquidônico, ativação-inibição de sistemas
enzimáticos ou por fatores exógenos, como poluição, hábito de fumar ou ingerir álcool, ou
ainda, por uma nutrição inadequada (NÚÑEZ-SELLÉS, 2002). Um ponto interessante da
atividade farmacológica dos polifenóis naturais é sua eficiência contra o estresse oxidativo.
Os polifenóis reduzem o estresse oxidativo, pois neutralizam radicais livres reativos
gerando moléculas de baixa reação (MISHRA et al., 2005).
De forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que, presentes em
concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente ou
inibem a oxidação desse substrato. Os radicais formados a partir de antioxidantes não são
18
reativos para propagar a reação em cadeia, sendo neutralizados por reação com outro
radical, formando produtos estáveis ou podem ser reciclados por outro antioxidante
(OMONI & ALUKO, 2005; BARREIROS et al., 2006). O consumo de substâncias
antioxidantes na dieta diária pode produzir uma ação protetora efetiva contra os processos
oxidativos do organismo. Foi descoberto que uma série de doenças, entre as quais câncer,
aterosclerose, diabetes, artrite, malária, AIDS, doenças do coração, podem estar ligadas aos
danos causados por formas de oxigênio extremamente reativas denominadas de
“substâncias reativas oxigenadas” ou simplesmente ROS. Estas substâncias também estão
ligadas com processos responsáveis pelo envelhecimento do corpo. (BRENNA;
PAGLIARINI, 2001; YILDRIM et al., 2001)
Um grande número de métodos tem sido desenvolvido para avaliar a atividade
antioxidante. Entretanto, a comparação entre esses métodos torna-se muito difícil uma vez
que os métodos e os substratos utilizados são muito diferentes. Adicionalmente, formas de
acelerar a oxidação dos diversos substratos são empregadas a fim de aumentar a velocidade
dos estudos. Desta forma, torna-se impossível expressar a atividade antioxidante como um
valor absoluto, sendo muito recomendável a utilização de padrões comparativos
independente do método escolhido (KOLEVA et al., 2002).
Dentre os métodos mais utilizados para determinação da atividade antioxidante em
frutos e hortaliças estão o DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil), FRAP (poder antioxidante
de redução do ferro), sistema β-caroteno/ácido linoléico e o ABTS (2,2‟ – azino-bis(3-
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) sal diamônio) (WU et al., 2005). Alguns autores
recomendam a utilização do método DPPH por ser fácil e preciso para a avaliação da
atividade antioxidante de produtos vegetais (RIBEIRO et al., 2002; CARDOSO et al.,
2005; JAYAPRAKASHA et al., 2007). O método está baseado na capacidade do DPPH
em reagir com doadores de hidrogênio e, na presença de substâncias antioxidantes, receber
H+, sendo então reduzido. O DPPH é um radical livre que pode ser obtido diretamente por
dissolução do reagente em meio orgânico (RUFINO et al., 2007) e pode ser facilmente
detectado por espectroscopia, devido à sua intensa absorção na região visível (BONDET et
al., 1997; SANCHEZ-MORENO, 2002), com base na captura do radical DPPH por
antioxidantes, produzindo um decréscimo da absorbância a 515 nm (BRAND-WILLIAMS
et al., 1995).
Um parâmetro cinético importante quando se avalia atividade antioxidante é o EC50
introduzido por Sánchez-Moreno et al. (1998). O EC50 refere-se à quantidade de
antioxidante necessária para reduzir em 50% a quantidade inicial do radical.
19
Melo et al. (2008) estudaram a capacidade antioxidante de diversas frutas tropicais
através do método que determina a capacidade de sequestrar o radical DPPH. O abacaxi
obteve um significativo resultado com capacidade antioxidante moderada (50-70% de
sequestro).
2.5 Otimização de processos e delineamento experimental
O planejamento experimental, também denominado delineamento experimental,
representa um conjunto de ensaios estabelecido com critérios científicos e estatísticos, com
o objetivo de determinar a influência de diversas variáveis nos resultados de um dado
sistema ou processo (BUTTON, 2005). A metodologia do planejamento experimental,
associada à análise de superfície de respostas, é uma ferramenta fundamentada na teoria
estatística, que fornece informações seguras sobre o processo, minimizando o empirismo
que envolve técnicas de tentativa e erro (BOX et al., 1978). Com o objetivo da redução do
número de pontos experimentais, foi criada a técnica que utiliza os delineamentos
compostos. Eles foram desenvolvidos, inicialmente, por Box & Wilson (1951) para estudo
de funções polinomiais de resposta na indústria, sendo o erro experimental pequeno, e as
condições do experimento mais facilmente controláveis (RAMOS, 2005).
A metodologia de superfície de resposta é essencialmente um conjunto de técnicas
estatísticas usadas em pesquisas, com a finalidade de determinar as melhores condições e
dar maior conhecimento sobre a natureza de certos fenômenos. Sua aplicação permite
selecionar a combinação de níveis ótimos na obtenção da melhor resposta para uma dada
situação. Então, usando a metodologia, é possível aproximar um modelo empírico a uma
relação (inicialmente desconhecida ou conhecida) entre os fatores e as respostas do
processo (SILVA, 2005). A modelagem normalmente é feita ajustando-se modelos lineares
ou quadráticos a resultados experimentais obtidos a partir de planejamentos experimentais.
O modelamento ocorre em busca do caminho de máxima inclinação de um determinado
modelo, sendo o caminho onde a resposta varia de forma mais pronunciada (BARROS
NETO et al., 2007). A descrição gráfica do modelo chama-se de superfície de resposta, e
como segunda alternativa tem-se o gráfico bidimensional de contorno, onde cada contorno
corresponde a uma particular altura da superfície de resposta e em cada linha a resposta é
constante. A sensibilidade dos parâmetros estudados sobre a resposta de interesse é
examinada através do diagrama de Pareto. A utilização dessa ferramenta permite indicar
20
quais parâmetros e interações têm influências significativas sobre cada variável resposta
considerada (BARBOSA, 2009).
3.0 Material e Métodos
3.1 Experimento 1. Planejamento experimental e otimização do processo de
extração enzimática.
3.1.1 Material vegetal
Foi utilizado abacaxi cultivar Pérola adquirido no comércio da cidade de Feira de
Santana-Bahia. Os exemplares utilizados apresentaram conteúdo de sólidos solúveis na
faixa de 13,11-13,20 °Brix, de modo a padronizar o estádio de maturação dos frutos em
estudo. Os abacaxis foram descascados e sua polpa homogeneizada foi armazenada sob
congelamento (-10 ºC), até a sua utilização nos experimentos
3.1.2 Planejamento experimental
Com o objetivo de verificar a influência das variáveis pH e concentração de NaCl
na extração das enzimas, foi elaborado um planejamento composto central
com 4
repetições no ponto central, totalizando 12 ensaios. Como variáveis de resposta
(dependentes) foram avaliadas a atividade das seguintes enzimas: PER, PFO, PME e PG.
Os parâmetros de otimização utilizados encontram-se na Tabela 01.
Tabela 01. Parâmetros da otimização
Para cada ensaio realizado, 50 g de polpa de abacaxi foram homogeneizados com
50 mL de tampão (0,1 M) -tampão fosfato de sódio para pH 6,0 7,4 e 8,0 e tampão acetato
de sódio para pH 4,0 e 4,6- (0,1 M), segundo a Tabela 02, em um liquidificador doméstico,
por 3 minutos. Depois, o material obtido foi centrifugado por 15 minutos a 4000 x g na
-α -1 0 +1 +α
pH
NaCl (M)
4,0 4,6 6,0 7,4 8,0
0,0 0,3 1,0 1,7 2,0
21
temperatura de 4ºC. O sobrenadante, denominado extrato enzimático, foi aliquotado e
armazenado sob congelamento (-10 ºC) até o momento da análise.
Tabela 2 - Matriz do planejamento composto central, com quatro repetições no ponto central.
Ensaio pH NaCl (M)
1 4,6 0,3
2 4,6 1,7
3 7,4 0,3
4 7,4 1,7
5 4,0 1,0
6 8,0 1,0
7 6,0 0,0
8 6,0 2,0
9 (C) 6,0 1,0
10 (C) 6,0 1,0
11 (C) 6,0 1,0
12 (C) 6,0 1,0
3.1.3 Determinação da atividade enzimática
3.1.3.1 Atividade de PER
A atividade da enzima PER foi determinada em temperatura ambiente, usando-se
cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico. A reação foi lida a 470 nm, em
espectrofotômetro UV/VIS, pela formação de tetraguaicol em 3,5 mL de meio reacional
contendo: 3,3 mL de guaicol 0,1% (2-metoxi fenol) preparado em tampão fosfato de sódio
(0,1 M; pH=6,5) e 0,2 mL de extrato enzimático. A reação foi iniciada pela adição de 0,1
mL de peróxido de hidrogênio 30% e foram realizadas leituras a cada 10 segundos por até
10 minutos. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de
extrato capaz de aumentar a absorbância em 0,001 unidades por minuto de reação e foi
expressa em U/g de polpa (LIU et al., 2008; SHALINI et al., 2008).
3.1.3.2 Atividade de PFO
A atividade de PFO foi avaliada segundo a metodologia modificada de Babu et al.
(2008), Fang et al. (2007) e Kumar et al. (2008). Utilizou-se 1,5 mL de catecol
(pirocatequina) 0,1 M em tampão fosfato pH=6,5 adicionados de 0,7mL de extrato
enzimático que foram mantidos em banho a 30°C. A reação foi paralisada por adição de
22
0,8 mL de ácido perclórico (2 M) e acompanhou-se o aumento da absorbância a 420nm,
em espectrofotômetro UV/VIS, fazendo leituras a cada 1 minuto por até 10 minutos. Uma
unidade de atividade de PFO foi definida como a quantidade de extrato capaz de aumentar
a absorbância em 0,001 unidade por minuto e foi expressa em U/g de polpa.
3.1.3.3 Atividade de PME
A determinação da atividade da PME foi realizada através do método
espectrofotométrico adaptado de Zocca et al. (2007) e Tiwari et al. (2009), utilizando-se 2
mL de solução de pectina cítrica (0,05% , pH=7,5), 0,25 mL de água destilada, 0,15 mL da
solução de azul de bromotimol (0,04%) e 0,1 mL de extrato enzimático com pH ajustado
para 7,5. Incubou-se em banho a 45 ºC por 24 horas. Usando uma cubeta de quartzo, foi
feita a leitura no espectrofotômetro a 620 nm. Uma unidade de atividade enzimática foi
definida como a quantidade de extrato capaz de reduzir 0,001 unidades de absorbância por
minuto de reação e foi expressa em U/g de polpa.
3.1.3.4 Atividade de PG
A atividade de poligalacturonase foi determinada segundo metodologia proposta
por Zhou et al. (2000). A atividade de PG foi medida em um viscosímetro, pela mistura de
30 mL do extrato enzimático com 45 mL de ácido poligalacturônico 0,2% em tampão
acetato de sódio (0,1 M; pH=4,4). Foi medida a viscosidade inicial e depois de 24 h de
incubação a 45 ºC. Uma unidade de atividade de PG foi definida como a quantidade de
extrato capaz de causar redução na viscosidade (em segundos) por g de polpa por hora de
reação, nas condições do ensaio.
3.1.4 Análise Estatística
A influência das condições de extração foi avaliada pela construção de superfície de
resposta, utilizando o módulo Experimental Design e pela análise de variância (ANOVA)
do software STATISTICA versão 7.0.
23
3.2 Experimento 2. Determinação da atividade enzimática em diferentes
variedades de abacaxi.
3.2.1 Material Vegetal
Foram analisadas três variedades de abacaxi:
1. Imperial: frutos inteiros adquiridos da Embrapa Mandioca e Fruticultura,
2. Vitória: polpa congelada adquirida da Embrapa Mandioca e Fruticultura,
3. Pérola: provenientes de duas fontes que serão identificadas como:
3.1 Pérola Embrapa: polpa congelada adquirida da Embrapa Mandioca e
Fruticultura,
3.2 Pérola Mercado: frutos adquiridos no mercado local, Feira de Santana - Ba.
Os frutos foram lavados com água potável e sabão neutro. Em seguida, foram
descascados, homogeneizados em liquidificador e mantidos sob temperatura de
congelamento até o momento das análises. As polpas oriundas da Embrapa Mandioca e
Fruticultura também passaram por esse mesmo processo nos laboratórios da Embrapa.
Foram avaliados 3 lotes (cada lote com 5 frutos) de cada variedade estudada e todas as
análises foram realizadas em triplicata.
3.2.2 Determinação da atividade enzimática
O extrato enzimático foi preparado utilizando uma proporção 1:2 de polpa e
solução extratora otimizada no item 3.1.2. homogeneizados em liquidificador durante 3
minutos. O homogeneizado foi centrifugado a 4.000 x g em centrífuga refrigerada a 4ºC
durante 15 minutos. As atividades de PER, PFO, PME e PG foram calculadas conforme
descrito no item 3.1.3.
3.2.3 Análise estatística
Foi realizada análise de variância (ANOVA) e teste de médias de Tukey utilizando-
se o programa SISVAR. Foram avaliadas as diferenças significativas (p<0,05) para as
enzimas analisadas nas diferentes variedades de abacaxi.
24
3.3 Experimento 3. Otimização da inativação das enzimas PER e PFO
3.3.1 Material Vegetal
O trabalho foi realizado com abacaxi cultivar Pérola adquiridos no comércio da
cidade de Feira de Santana, Bahia. Os abacaxis foram descascados e sua polpa
homogeneizada em liquidificador. O material obtido foi centrifugado por 15 minutos a
4000 x g a 4 ºC e armazenado sob congelamento (-10 ºC) até a sua utilização nos
experimentos.
3.3.2 Planejamento experimental
Foram usados 3 inibidores químicos (metabissulfito de sódio, ácido ascórbico e
cloreto de cálcio). Dessa forma, foi elaborado um planejamento composto central (para
cada inibidor), utilizando 3 variáveis independentes (tempo – 1, 3, 5, 7 e 9 min,
temperatura – 27, 43, 57, 74 e 86 °C, e concentração do inibidor químico – 0, 40, 100, 160
e 200 mg/L) com 4 repetições no ponto central, totalizando 18 ensaios (Tabela 03)
(RODRIGUES & IEMMA, 2005). Como variáveis de resposta (dependente) foram
avaliadas a inativação das enzimas PER e PFO, em termos de porcentagem de inativação.
Tabela 3. Matriz do planejamento composto central, com quatro repetições no ponto central.
Ensaio Concentração(mg/L) Temperatura(°C) Tempo
(min)
1 40 43 3
2 40 43 7
3 40 74 3
4 40 74 7
5 160 43 3
6 160 43 7
7 160 74 3
8 160 74 7
9 0 57 5
10 200 57 5
11 100 27 5
12 100 86 5
13 100 57 1
14 100 57 9
25
15 (C) 100 57 5
16(C) 100 57 5
17(C) 100 57 5
18(C) 100 57 5
3.3.3 Determinação da inativação de PER e PFO
A atividade das enzimas PER e PFO foi determinada segundo o item 3.1.3. O
percentual de inativação enzimática foi calculado baseado na atividade da enzima sem
tratamento aplicado.
3.3.4 Análise estatística
A influência dos parâmetros na inativação das enzimas PER e PFO foram avaliadas
pela construção de superfície de resposta, utilizando o módulo Experimental Design e pela
análise de variância (ANOVA) no software STATISTICA versão 7.0.
3.3.5 Confirmação dos resultados
Após a análise dos resultados e da escolha dos parâmetros para inativar PER e PFO,
foi aplicado o tratamento escolhido como ideal nas variedades Imperial, Vitória e Pérola
oriunda da Embrapa do item 3.2.1. Depois foi realizada a determinação da atividade das
enzimas PER, PFO, PME e PG segundo o item 3.1.3.
3.4 Experimento 4. Determinação da atividade antioxidante e compostos
fenólicos totais
3.4.1 Material Vegetal
Foram utilizadas neste experimento as amostras descritas no item 3.2.1. As mesmas
amostras passaram pelos tratamentos escolhidos como ideais para inativação de PER e
PFO, a fim de avaliar a influencia do tratamento nos compostos fenólicos totais e na
atividade antioxidante.
26
3.4.2 Extração dos compostos antioxidantes e fenólicos
O procedimento de extração de compostos fenólicos totais e antioxidantes foi
baseado em Alothman et al. (2009), com algumas modificações. Foram utilizados 100 g da
polpa dos frutos, que foram submetidos à extração com 300mL de etanol a 95% com
agitação magnética por 3 horas à temperatura ambiente e no escuro. Os extratos foram
centrifugados a 4.000 x g por 15 minutos e os sobrenadantes foram coletados e
concentrados, para remoção do solvente, em rota-evaporador a 50 ºC. Com o extrato
etanólico obtido foi realizada a determinação de compostos fenólicos totais e a atividade
antioxidante.
3.4.3 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi realizada pelo método DPPH (também chamado de
capacidade de sequestrar o radical DPPH), utilizando-se o reativo 1,1-diphenil-2-
picrilhidrazil, usado como radical livre para reagir com os compostos antioxidantes
presentes na polpa de abacaxi, segundo Brand-Williams et al., (1995), com modificações.
Foram preparadas 5 diluições diferentes (20 a 400 mg/mL) do extrato etanólico, em
triplicata. Transferiu-se uma alíquota de 0,05 mL de cada diluição do extrato para tubos de
ensaio com 3,0 mL da solução metanólica do radical DPPH (45 µg/mL). Utilizou-se álcool
metílico, como branco, para calibrar o espectrofotômetro. Após 15 minutos de incubação à
temperatura ambiente, a redução do radical livre DPPH foi mensurada pela leitura da
absorbância em 517 nm. O mesmo procedimento foi adotado com um padrão comercial,
galato de propila, para efeito comparativo. A capacidade de sequestrar radical livre foi
expressa como percentual de inibição de oxidação do radical e calculado conforme a
Equação 01.
Equação 01
% seqüestro = [(absorbância inicial da amostra – absorbância final da amostra) /
(absorbância inicial do padrão – absorbância final do padrão) )]* 100
O valor de EC50 foi calculado através da equação da reta feita com base nas
concentrações dos extratos e suas respectivas porcentagem de sequestro do radical DPPH.
27
3.4.4 Determinação do teor de fenóis totais
O teor de fenóis totais foi determinado usando o reagente de Folin-Ciocalteau
(SINGLETON & ROSSI, 1965; DEGÁSPARI et al., 2004; GEORGÉ et al., 2005), onde
foi preparada a reação contendo uma alíquota de 0,5 ml do extrato fenólico (dissolvidos em
etanol, a fim de se obter uma concentração de 20 mg de sólidos/mL), 2,5 ml de solução
aquosa de Folin-Ciocalteau 10% e 2,0 ml de carbonato de sódio 7,5%. A mistura foi
mantida em banho-maria a 50°C durante 5 minutos e então realizada a leitura por
espectrofotometria a uma absorbância de 760 nm. O branco que foi utilizado como
referência foi preparado substituindo o extrato fenólico por água destilada. Para a
determinação dos fenólicos totais o mesmo procedimento foi realizado utilizando soluções
padrão de ácido gálico, construindo-se uma curva com o composto em um intervalo de
concentração de 1 a 50 mg/L e a quantidade de fenólicos totais foi expressa em em mg de
ácido gálico em 100g de polpa.
3.4.5 Análise Estatística
Foi realizada análise de variância (ANOVA) e teste de médias de Tukey utilizando-
se o programa SISVAR.
4.0 Resultados e Discussão
4.1 Experimento 01. Planejamento experimental e otimização do processo de
extração enzimática
Cada enzima atua sob condições fisiológicas de pH, temperatura e meio iônico. A
extração enzimática é um processo no qual a enzima de interesse é transferida a partir da
fase aquosa celular para outra fase, seja aquosa ou orgânica. Os reagentes mais utilizados
na extração são NaCl e solução tampão (JUNIOR, 2001). Segundo Kamimura (2006), o
NaCl aumenta a força iônica da solução tampão e isso possibilita ou melhora a extração
das enzimas que estão ligadas ionicamente aos tecidos vegetais.
28
Com o intuito de otimizar o processo de extração das enzimas PER, PFO, PME e
PG da polpa de abacaxi utilizou-se a metodologia de superfície de resposta para estudar o
efeito do pH (de 4,0 a 8,0) e da concentração de NaCl (de 0,0 a 2,0 M) da solução tampão
utilizada na extração das enzimas.
A Tabela 04 mostra os resultados experimentais das atividades enzimáticas quando
se fez variar os fatores pH e concentração de NaCl.
Tabela 4: Resultado experimental em termos de atividade enzimática
Ensaios pH NaCl
(M)
PER
(U/g)
PFO
(U/g)
PME
(U/g)
PG
(U/g.h-1
)
1 4,6 0,3 2984,60 49,43 2672,30 0,000009
2 4,6 1,7 3117,80 81,86 4406,00 0,000034
3 7,4 0,3 2811,70 46,86 1416,70 0,000003
4 7,4 1,7 3067,40 66,38 2441,30 0,000032
5 4,0 1,0 3039,70 80,71 4660,00 0,000003
6 8,0 1,0 3128,00 62,24 3347,30 0,000036
7 6,0 0,0 2273,30 33,48 1113,30 0,000002
8 6,0 2,0 2827,40 21,76 2505,30 0,000032
9 (C) 6,0 1,0 4752,90 40,48 7961,30 0,000048
10 (C) 6,0 1,0 2833,90 36,62 3109,30 0,000029
11 (C)
12 (C)
6,0
6,0
1,0
1,0
4511,00
4043,80
29,95
38,29
2333,30
3117,30
0,000023
0,000023
A atividade máxima encontrada de PER foi de 4752,9 U/g. Brito et al. (2008)
encontraram valores superiores de PER tanto para a cultivar Pérola (5624 U/g) quanto para
cultivar Smooth Cayenne (5137 U/g). De acordo com Cardello et al. (1998) a atividade
enzimática na polpa do fruto pode ser influenciada não apenas por fatores genéticos
(variedade comercial de abacaxi), mas também pelo clima e condições meteorológicas,
condições de cultura, entre outros.
Para PFO as atividades encontradas variaram entre 21,76 e 81,86 U/g. Thé et al.
(2001) estudaram atividade de PFO em diferentes estádios de maturação e armazenamento
do cultivar Smooth Cayenne e as atividades encontradas variaram entre 25,81 U/g e 47,98
U/g, sendo os valores mais elevados aqueles em que o estádio de maturação estava
avançado e sob refrigeração. Estes autores também estudaram a atividade de PME
encontrando valores entre 87,50 e 312,50 U/g, valores bem inferiores ao encontrados neste
trabalho que foram entre 1113,3 e 7961,3 U/g.
Para PG foi encontrada uma atividade entre 0,000009 e 0,000048 U/g h-1
. Thé et al.
(2009), obtiveram uma atividade de PG variando entre 929,38 nmol.g-1
a 526,85 nmol.g-1
,
29
quando estudaram a influência da associação de tratamento hidrotérmico, cloreto de cálcio
e atmosfera modificada sobre fatores relacionados à textura de abacaxi, cultivar Smooth
Cayenne. Essas diferenças podem, no entanto, ser creditadas à metodologia de avaliação
aplicada, que no caso de Thé et al. (2009) foi baseada na liberação de uronídeos redutores
(atividade de exo-PG) e no presente caso foi baseada na redução de viscosidade da solução
em 24 h (atividade de endo-PG). A literatura que trata da atividade de PG em abacaxi na
sua maioria apresenta os resultados obtidos pela avaliação da liberação de açúcares
redutores (ácidos galacturônico) de substâncias pécticas (ácido poligalacturônico) (Prado et
al., 2003). Apesar da atividade de endo-PG (hidrólise do polímero de uma forma aleatória
diminuindo a viscosidade, mas quase não aumentando o poder redutor da solução) ser
detectada por este método, quando a atividade for muito alta, a liberação de açúcares
redutores é melhor aplicada para a atvidade de exo-PG (ataca o polímero pelas
extremidades, liberando unidades redutoras, mas mostrando pouco efeito sobre a
viscosidade). Porém, durante este trabalho, não foi capaz de detectar qualquer atividade de
PG, medindo a liberação de açúcares redutores.
Observa-se pelos resultados encontrados que houve variação na atividade
enzimática em todas as enzimas analisadas, comprovando o quanto a força iônica do meio
e o pH influenciam a extração das enzimas. Assim sendo, é fundamental a escolha correta
dessas duas variáveis para que se possa obter a quantidade máxima das enzimas na
amostra.
A influência das condições de extração para cada enzima foi avaliada pela
construção de superfícies de resposta, nas quais foi possível determinar as regiões de
valores em que se obteve uma maior extração de atividade enzimática. Os modelos
propostos foram avaliados por análise de variância (ANOVA).
4.1.1 Peroxidase (PER)
A superfície de resposta gerada para a atividade de PER está apresentada a seguir
na Figura 06. Pela análise de variância (Tabela 05) conclui-se que o modelo está bem
ajustado às observações, a regressão é estatisticamente significativa e serve para fins
preditivos, com 99% de confiança.
30
Tabela 05. Análise de variância (ANOVA) para atividade de peroxidase
SQ GL MQ Fcalc Ftab(1%) R²
Regressão 5566600 5 1113320 15,5464 10,97 0,93
Resíduo 358063 5 71612,6
Falta de
Ajuste 98192 3
Erro puro 259871 2
Total 5924663 10
Figura 06. Superfície de resposta para atividade de PER.
Com a superfície de resposta gerada, foi possível determinar que o processo de
extração de PER foi otimizado. As condições mais indicadas para extração dessa enzima
são: tampão em pH=6,0 contendo 1,0 M de NaCl. Kamimura (2006), estudando o efeito do
pH da solução tampão da extração de PER de yacon, também encontrou como valor ideal
para extração de pH 6.
31
4.1.2 Polifenol-oxidase (PFO)
A análise de variância e o diagrama de Pareto obtidos para atividade de PFO
encontram-se na Tabela 06 e na Figura 07, respectivamente.
Tabela 06. Análise de variância (ANOVA) para atividade de polifenol-oxidase
SQ GL MQ Fcalc Ftab(10%) R²
Regressão 3328,409 5 665,682 4,316 3,11 0,7824
Resíduo 925,370 6 154,228
Falta de
Ajuste 863,518 3
Erro puro 61,852 3
Total 425,779 11
Pareto Chart of Standardized Effects
-,814135
-1,4216
2,754473
-3,4393
11,40277
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
NaCl(Q)
1Lby2L
(2)NaCl(L)
(1)pH(L)
pH(Q)
Figura 07. Diagrama de Pareto para atividade da polifenol-oxidase.
O coeficiente de determinação alcançado, R², foi de 0,7824, que significa que mais
de 78% das variações nos resultados obtidos podem ser explicados pelo modelo ajustado e
se devem às diferenças entre os tratamentos, no nível de 10% de probabilidade. No
Diagrama de Pareto (Figura 07) é possível visualizar a influência dos fatores estudados
sobre a atividade enzimática. No nível de 95% de confiança ficou demonstrado que
32
somente o pH influenciou a extração de PFO. Este resultado é um indicativo de que, na
polpa da abacaxi cultivar Pérola, as isoformas de PFO encontram-se majoritariamente em
solução e não em formas ionicamente ligadas.
A superfície de resposta gerada (Figura 08) mostram que o processo de extração
proposto não foi otimizado, porém, de acordo com os resultados obtidos dentre os valores
estudados, há uma indicação de que maior atividade de PFO será obtida quando forem
utilizados valores de pH inferiores a 4,6.
Figura 08. Superfície de resposta para atividade de PFO.
4.1.3 Pectinametilesterase (PME)
Na Tabela 07 e na Figura 09 encontram-se a análise de variância e o gráfico
bidimensional obtidos para a atividade de PME. O valor do coeficiente de determinação de
0,89 indica que apenas 11% do total da variação das respostas obtidas não é explicado pelo
modelo. O modelo é estatisticamente significativo e preditivo e descreve as respostas em
função das variáveis analisadas com 95% de confiança.
Tabela 07. Análise de variância (ANOVA) para atividade de pectinametilesterase
SQ GL MQ Fcalc Ftab(5%) R²
Regressão 19,7462 5 3,9492 8,2241 5,05 0,89
Resíduo 2,4012 5 0,4802
33
Falta de
Ajuste 1,8039 3
Erro puro 0,5973 2
Total 22,1474 10
Figura 09. Superfície de resposta para extração de PME.
A análise da superfície de resposta, (Figura 09) mostra que o processo de extração
não se encontra otimizado. No entanto, dentro dos valores estudados observa-se que maior
extração pode ser alcançada com concentração de NaCl de 1,0M. O valor de pH não foi
considerado significativo para a extração de PME de acordo com o diagrama de pareto que
se encontra no anexo 1 (Figura 1.e).
4.1.4 Poligalacturonase (PG)
A validade do modelo obtido para a atividade de poligalacturonase foi verificada
pela analise de variância (ANOVA) apresentada na Tabela 08. O coeficiente de
determinação obtido foi de 0,77 e o modelo foi estatisticamente considerado significativo
com confiança de 90%, assim foi possível utilizar o modelo gerado (Figura 10) para
predizer as melhores condições de extração de PG. De acordo com o Diagrama de Pareto
34
para esse experimento (anexo 1, Figura 1.g), apenas o componente linear da variável
concentração de NaCl foi considerado significativo. Assim, o modelo que mais se ajusta
aos dados experimentais é o modelo não-quadrático (Figura 10).
Tabela 08. Análise de variância (ANOVA) para atividade de poligalacturonase
SQ GL MQ Fcalc Ftab(10%) R²
Regressão 2,7505 5 0,5501 3,4 3,4 0,77
Resíduo 0,8186 5 0,1637
Falta de
Ajuste 0,7586 3
Erro puro 0,0600 2
Total 3,5691 10
Figura 10. Superfície de resposta para extração de PG.
Como pode ser observado pelo modelo (Figura 10), o valor de pH apresenta pouca
influência na extração de PG, no entanto, a atividade obtida aumenta com o aumento da
concentração de NaCl, indicando que boa parte das isoformas dessa enzima se encontra
ionicamente ligada ao tecido vegetal.
35
As condições escolhidas para a extração das enzimas para determinação enzimática
em polpa de abacaxi foram:
PER - pH=6,0 e concentração de NaCl de 1,0 M ;
PFO - pH=4,5 ;
PME - Concentração de NaCl de 1,0 M e pH=60 (como é usual a escolha
de uma solução tampão para extração de enzimas e o pH não demonstrou
influencia na extração de PME, entre os valores analisados, escolheu-se o
pH=6,0, pois dessa forma seria feito uma só solução de extração para PME
e PER);
PG - Concentração de NaCl de 2,0 M e pH=4,6 (por também não sofrer
influencia do pH na extração, entre os valores analisados, foi escolhido o
pH=4,6 que é o utilizado na solução onde ocorre a reação enzimática na
determinação de sua atividade).
4.2 Experimento 2. Determinação da atividade enzimática nas variedades de
abacaxis
4.2.1 Peroxidase (PER)
Os resultados apresentados na Tabela 09 são referentes à atividade da enzima
peroxidase nos três lotes das diferentes amostras de abacaxi analisadas.
Tabela 09. Atividade da enzima peroxidase em diferentes variedades de abacaxis.
PEROXIDASE (U/g)
Lotes Imperial Pérola
EMBRAPA
Pérola
Mercado
Vitória
1 2066,67 3165,55 2930 2318,43
2 1956,67 3006,67 3100 2287,35
3 2013,33 3277,78 2913,3 2299,61
Média*
DP**
2012,22 a
55,01
3150 c
136,22
2981,81 c
103,31
2301,80 b
15,65 *Valores assinalados com a mesma letra na linha entre as médias finais, não diferem significativamente
(p<0,05), segundo o teste de Tukey. **Estimativa de desvio padrão.
Com relação à enzima peroxidase, o abacaxi Pérola se destacou por apresentar
maior atividade desta enzima, não havendo diferença significativa entre as duas amostras
de Pérola analisadas seguindo da Vitoria e Imperial, (Figura 11).
36
Figura 11. Atividade de peroxidase em diferentes cultivares de abacaxi.
Brito et al. 2001, estudaram a peroxidase no híbrido de abacaxi denominado IAC
gomo de mel e seus clones IAC-1, IAC-2 e IAC-3, e encontrou atividades de 3194, 4065,
2751 e 3099 U/g, respectivamente. Antoniolli et al. (2003) determinaram a atividade de
peroxidase em abacaxi Pérola minimamente processado, encontrando atividade inicial de
6480 U/g. Todos estes valores são maiores aos da atividade dos cultivares Vitória e
Imperial aqui analisado.
4.2.2 Polifenol-oxidase (PFO)
Os resultados apresentados na Tabela 10 são referente à atividade da enzima
polifenol-oxidase nos três lotes das diferentes amostras de abacaxi analisadas.
Tabela 10. Atividade da enzima polifenol-oxidase em diferentes variedades de abacaxis.
POLIFENOL-OXIDASE (U/g)
Lotes Imperial Pérola
EMBRAPA
Pérola
Mercado
Vitória
1 17,14 29,04 30,00 18,98
2 15,71 32,38 27,14 19,25
3 14,29 30,95 28,57 20,00
Média*
DP**
15,71 a
1,43
30,79 c
1,67
28,57 c
1,43
19,41 b
0,53
a
b
c c
37
*Valores assinalados com a mesma letra na linha entre as médias finais, não diferem significativamente
(p<0,05), segundo o teste de Tukey. **Estimativa de desvio padrão.
Os valores mais altos de atividade da enzima polifenol-oxidase foram encontrados
nas polpas do abacaxi Pérola Embrapa, diferindo significativamente das cultivares Imperial
e Vitória (Figura 12), mas não foi significativamente diferente da outra variedade Pérola
analisada oriunda do mercado de Feira de Santana.
Figura 12. Atividade de polifenol-oxidase em diferentes cultivares de abacaxi.
Thé et al., (2001) estudaram PFO do abacaxi Smooth Cayenne em diferentes
estádio de maturação e encontraram valores que variaram de 25,81 a 28,43 U/g, valores
superiores ao das variedades Imperial e Vitória, mas, inferiores ao da variedade Pérola,
encontrados neste presente trabalho.
Comparando os valores obtidos nesse estudo para a atividade das enzimas
polifenol-oxidase e peroxidase nas diferentes cultivares estudadas e os dados descritos na
literatura para abacaxi, é possível verificar a existência de diferenças na atividade destas
enzimas. Considerando que não houve diferença significativa entre a variedade Pérola
oriunda de dois lugares distintos, supõe então que estas diferenças não se devem a outros
possíveis fatores de variação da atividade enzimática (condições climáticas, trato cultural,
etc.), mas essas diferenças podem ser de origem genética, por se tratarem de cultivares
diferentes.
a
b
c c
38
Para a indústria de alimentos e até mesmo para o consumo in natura, encontrar
variedades que possuam uma menor atividade das enzimas oxidativas é de fundamental
importância. Os pigmentos escuros formados pela ação das polifenol-oxidases e
peroxidases são geralmente acompanhados de mudanças indesejáveis na aparência e nas
propriedades sensoriais do produto, resultando na diminuição da sua vida útil e do seu
valor de mercado. Além disso, o problema do escurecimento enzimático sob o aspecto
nutricional deve-se à possibilidade das o-quinonas interagirem com grupos amina e tiol,
reduzindo a disponibilidade da lisina, metionina, tiamina e outros nutrientes essenciais
(ARAÚJO, 1999).
Dessa forma as variedades Imperial e Vitória se colocam como uma boa alternativa
para a diversificação das variedades utilizadas na indústria de alimentos, onde predomina a
Smooth Cayenne. Além da indústria, a exportação brasileira também ganha com essa
menor atividade das enzimas oxidativas nessas duas novas variedades, pois diversos
estudos (Zhou et al. (2003); Thé et al. (2001); Weerahewa & Adikaram (2005)) vem
demonstrando que o principal problema do abacaxi na exportação (injúria pelo frio –
escurecimento interno) está ligado diretamente às enzimas oxidativas aqui estudadas.
4.2.3 Pectinametilesterase (PME)
A tabela 11 mostra a atividade da enzima pectinolítica PME nas diferentes
variedades estudadas.
Tabela 11. Atividade da enzima pectinametilesterase em diferentes variedades de abacaxis.
PECTINAMETILESTERASE (U/g)
Lotes Imperial Pérola
EMBRAPA
Pérola
Mercado
Vitória
1 8660 3753,42 3073,33 9700
2 9300 3888,89 2973,33 9853,33
3 8860 2884,89 2720 9986,66
Média*
DP**
8940 a
327,41
3509,07 b
544,78
2922,22 c
182,12
9866,6 a
143,44 *Valores assinalados com a mesma letra na linha entre as médias finais, não diferem significativamente
(p<0,05), segundo o teste de Tukey. **Estimativa de desvio padrão.
As variedades Imperial e Vitoria não apresentaram diferenças significativas para
PME e foram superiores aos da variedade Pérola que apresentaram diferenças
39
significativas entre a variedade oriunda da Embrapa e a do mercado (Figura 13). Valores
inferiores foram encontrados por Thé et al. (2006) estudando diferentes formas de
armazenamento do abacaxi Smooty Cayenne, as atividades variaram entre 170 a 750 U/g.
Figura 13. Atividade de pectinametilesterase em diferentes cultivares de abacaxi.
4.2.4 Poligalacturonase (PG)
A tabela 12 apresenta a atividade de PG encontrada nas diferentes variedades de
abacaxis estudadas.
Tabela 12. Atividade da enzima poligalacturonase em diferentes variedades de abacaxis.
POLIGALACTURONASE (U/g.h-1
)
Lotes Imperial Pérola
EMBRAPA
Pérola
Mercado
Vitória
1 0,00001898 0,00000494 0,00000297 0,00003657
2 0,00001898 0,00000440 0,00000304 0,00003472
3 0,00001574 0,00000417 0,00000289 0,00003287
Média*
DP**
0,00001790 a
0,00000187
0,00000450b
0,00000039
0,00000297c
0,00000008
0,00003472 a
0,00000185 *Valores assinalados com a mesma letra na linha entre as médias finais, não diferem significativamente
(p<0,05), segundo o teste de Tukey. **Estimativa de desvio padrão.
Não houve diferença significativas entre as novas variedades estudadas, sendo que
essas variedades (Imperial e Vitória) apresentaram maior atividade que a variedade Pérola.
b
a a
c
40
A metodologia viscosimétrica (utilizada neste experimento) não foi encontrada na
literatura para uso em atividade de PG em abacaxi, o que dificulta a comparação da nossa
atividade com os outros métodos, pois cada método possui sua unidade específica para a
atividade enzimática. Santana (2009) utilizou este método para pêssego Douradão e
encontrou valores que variaram de 0,001 a 0,005 U/g. h-1
, valores superiores aos
encontrados nesse estudo (Figura 14).
Figura 14. Atividade de poligalacturonase em diferentes cultivares de abacaxi.
Conforme as Tabelas 11 e 12, houve diferença significativa (p<0,05) dentro da
variedade Pérola (Embrapa e Mercado) tanto para PG como PME, possivelmente devido
ao fato dessas frutas apresentarem origens distintas considerando, portanto vários fatores,
como condições climáticas, condições de cultivo, condições de armazenamento, entre
outros. É conhecido que esses fatores influenciam a constituição química das frutas, e por
isso devem ser considerados neste tipo de estudo (CARDELLO & CARDELLO, 1998).
Não podendo descartar a influencia significativa do estádio de maturação dos frutos que
possui relevância nas atividades das enzimas.
A ação da pectinametilesterase libera ácido poligalacturônico, substrato para a ação
da poligalacturonase, enzima despolimerizante, associada à perda de textura em frutas e
vegetais estocados (NIELSEN & CHRISTENSEN, 2002).
A interação do ácido pectínico resultante da ação da PME com íons cálcio, com
formação de pectato de cálcio insolúvel, causa perda da estabilidade da turbidez, com
a
a
b c
41
consequente clarificação do suco (ASSIS et al, 2000), no caso do suco de abacaxi, a
turbidez é característica do suco, e esta clarificação causa perda comercial do produto.
Assim, a alta atividade de PME nas variedades Imperial e Vitória sugere que estas
variedades, ao serem usadas na indústria de alimentos, principalmente de suco
concentrado, tenham o processo de inativação destas enzimas bem definidos, de modo a
evitar a perda do valor comercial do produto.
Apesar das variedades Imperial e Vitória apresentarem uma alta atividade das
enzimas PME e PG, elas ainda devem ser recomendadas para a industrialização de abacaxi,
pois é mais vantajoso para a indústria ter uma variedade com menor atividade da enzima
PER (mais termorresistente e de difícil inativação), do que PME e PG que são enzimas que
podem ser mais facilmente inativas través do uso de tratamento térmico.
4.3 Experimento 3. Otimização da inativação enzimática de PFO e PER
Na Tabela 13 encontram-se os resultados do planejamento experimental para a
inativação enzimática de PER e PFO em polpa de abacaxi Pérola.
Tabela 13. Resultados experimentais em termos de porcentagem de inativação enzimática ao
adicionar ácido ascórbico, metabissulfito de sódio e cloreto de cálcio.
PER PFO
Ensaio
%
Inativação
(ácido
ascórbico)
%
Inativação
(Metabissulfio
de sódio)
%
Inativação
(cloreto de
cálcio)
%
inativação
(ácido
ascórbico)
%
Inativação
(Metabissulfito
de sódio)
%
Inativação
(cloreto de
cálcio)
1 21,38 18,25 22,24 47,54 32,78 36,89
2 21,59 40,46 31,61 56,55 54,91 47,54
3 65,93 70,58 47,39 81,14 77,86 77,05
4 72,72 90,23 54,89 92,62 90,98 86,07
5 31,88 36,02 28,20 63,11 63,93 49,18
6 30,78 31,98 34,19 67,21 80,32 54,92
7 67,35 80,33 59,87 93,44 84,42 82,79
42
8 83,04 85,14 62,42 96,72 95,08 90,16
9 0,00 0,00 32,53 43,44 50,82 52,46
10 39,56 16,16 5,54 69,67 77,04 67,21
11 12,28 36,32 18,47 50 58,19 55,74
12 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
13 18,36 24,27 29,65 59,01 58,19 59,84
14 33,33 37,47 29,47 68,85 65,57 68,85
15(C) 23,25 31,51 25,14 60,65 62,29 72,95
16(C) 25,30 31,91 27,37 62,29 61,47 72,13
17(C) 23,19 31,54 25,97 61,47 61,47 71,31
18(C) 24,32 32,16 27,46 62,29 60,65 70,49
Observa-se na Tabela 13 que a taxa de porcentagem para a inativação de PFO foi
maior do que a de PER, em todos os inibidores utilizados. A grande estabilidade térmica é
uma característica comum às peroxidases de várias frutas. Alguns autores atribuem esta
grande estabilidade térmica à presença de açúcares na molécula da enzima (POMAR et al,
1997). Também foi relatado que a presença de um grande número de resíduos de cisteína
na cadeia polipeptídica contribui para a termoestabilidade das peroxidases (DEEPA, 2002)
Em todos os delineamentos só se obteve 100% de inativação quando foi aplicada a
temperatura de 86 °C (ensaio 12). Brito et al. (2005) conseguiram inativar peroxidases de
abacaxi 'IAC Gomo-de-mel' e „IAC-1‟ com tratamentos a 60 e 120 segundos a 90 ºC.
Lourenço & Neves (1997) observaram que a peroxidase de pêssego apresentou rápida
inativação em temperaturas acima de 70º C, com perda praticamente total após tratamento
a 80º C durante 30 segundos.
A influência dos parâmetros de inativação para PER e PFO foi avaliadas pela
construção de superfícies de resposta, nas quais foi possível determinar as regiões de
valores em que se obteve uma maior inativação enzimática destas enzimas. Os modelos
propostos foram avaliados por análise de variância (ANOVA) que se encontram na Tabela
14 e 15.
43
Tabela 14. Análise de variância para porcentagem de inativação de PER.
SQ GL MQ F calc F tab
(1%) R²
Ácido
Ascórbico
Regressão 11672,19 7 1667,45 17,05 5,20 0,92
Resíduo 977,47 10 97,747
Falta de ajuste 974,46 7
Erro Puro 3,01 3
Total 12649,66 17
Metabissulfito
De
Sódio
Regressão 12136,28 9 1348,475 7,010 5,91 0,88
Resíduo 1538,82 8 192,3525
Falta de ajuste 1538,53 5
Erro Puro 0,29 3
Total 13675,10 17
Cloreto
de
Cálcio
Regressão 6813,526 7 973,36 9,7986 5,20 0,87
Resíduo 993,36 10 99,336
Falta de ajuste 989,576 7
Erro Puro 3,784 3
Total 7806,886 17
Tabela 15. Análise de variância para porcentagem de inativação de PFO.
SQ GL MQ F calc F tab
(1%) R²
Ácido
Ascórbico
Regressão 4700,223 7 671,460 21,366 5,20 0,937
Resíduo 314,26 10 31,426
Falta de ajuste 312,411 7
Erro Puro 1,849 3
Total 5014,483 17
Regressão 4802,126 9 533,56 25,24 5,91 0,965
44
Metabissulfito
De
Sódio
Resíduo 169,059 8 21,1323
Falta de ajuste 167,715 5
Erro Puro 1,344 3
Total 4971,185 17
Cloreto
de
Cálcio
Regressão 4450,718 7 635,816 53,82 5,20 0,987
Resíduo 118,133 10 11,813
Falta de ajuste 114,774 7
Erro Puro 3,359 3
Total 4568,85 17
Observou-se que os modelos empíricos estabelecidos nos planejamentos executados
para PER e PFO mostraram boa concordância com os dados experimentais obtidos. Todos
obtiveram uma regressão significativa, pois o F calculado foi superior ao F tabelado (1%).
A partir das equações de regressão obtiveram-se as superfícies de resposta.
4.3.1 Peroxidase (PER)
Todas as superfícies de respostas e os gráficos bidimensionais de contorno para a
inativação de PER encontram-se no anexo 2.
Na Figura 15, encontra-se a superfície de resposta para o planejamento utilizando
ácido ascórbico como inibidor químico de PER. Analisando este gráfico, observa-se que a
temperatura mínima para se obter 100% de inativação de PER é 78,41°C, e a concentração
de ácido ascórbico dependerá do tempo de tratamento empregado, sendo que quanto menor
o tempo maior a concentração requerida para 100% de inativação. Utilizando o modelo
proposto chega-se a várias possibilidades para alcançar 100% de inativação, entre elas
encontram-se as combinações: 78,41°C, 1 min e 200 mg/L de ácido ascórbico; 78,41°C, 3
min e 174 mg/L de ácido ascórbico; e 78,41 °C, 5 min e 145 mg/L de ácido ascórbico.
45
Figura 15. Superfície de resposta para o efeito temperatura e concentração de ácido ascórbico na
inativação enzimática de PER.
Na Figura 16, encontra-se o gráfico bidimensional de contorno quando se aplicou
metabissulfito de sódio como inibidor químico para PER. Observa-se que a temperatura
para se alcançar 100% de inativação dependerá do tempo e da concentração de
metabissulfito de sódio empregado. Entre o limite testado, conseguimos 100% de
inativação a partir de uma temperatura de 77,52 °C com uma concentração de
metabissulfito de 130 mg/L.
Figura 16. Gráfico bidimensional de contorno para os efeitos temperatura e concentração de
metabissulfito de sódio na inativação enzimática de PER.
46
Na Figura 17, encontra-se a superfície de resposta para a aplicação do cloreto de
cálcio na inativação de PER. Analisando o gráfico obtido, observa-se que 100% de
inativação é alcançado com uma temperatura de 84°C independente da concentração e do
tempo aplicado no tratamento. GONÇALVES et al. (2000) verificaram a influência do
tratamento hidrotérmico com a aplicação de cloreto de cálcio em abacaxis Smooth
Cayenne. Eles alcançaram a inativação da enzima peroxidase fazendo a imersão dos frutos
de abacaxi em uma solução a 1% de cloreto de cálcio em água aquecida (38 ºC ou 40 °C)
por 10 ou 20 minutos. Os autores atribuíram a inativação da peroxidase à ação do cálcio na
manutenção da integridade celular, reduzindo o contato da enzima com seu substrato. Essa
justificativa, entretanto, não deve ser atribuída ao experimento aqui feito, pois utilizou-se
polpa homogeneizada, desta forma a enzima já estava em contato com o substrato.
Figura 17. Superfície de resposta para os efeitos temperatura e concentração de cloreto de cálcio
para inativação enzimática de PER.
CLEMENTE (1995) em seu trabalho com isoenzimas de laranja, não conseguiu
inativar peroxidase com tratamento de 70ºC e elevando a temperatura para 80 ºC não
houve alteração no comportamento da atividade enzimática, mostrando estas temperaturas
serem ineficientes para a inativação da peroxidase.
Neste trabalho, segundo os modelos propostos, 100% de inativação de peroxidase é
alcançada com uma temperatura de 77,52 ºC, isso pode ser atribuído ao efeito benéfico dos
47
agentes químicos empregados nos tratamentos. Quanto menor for o binômio
tempo/temperatura a ser aplicado para inativação enzimática, melhor para a indústria de
alimentos. Temperaturas e tempos longos podem levar à destruição de vitaminas e à
formação de sabor de cozido, com rejeição do consumidor (KOBLITZ, 2008).
O metabissulfito de sódio apresentou a melhor resposta de inativação para PER,
pois a uma concentração mais baixa e tratamento térmico mais brando, do que quando
comparados com os outros inibidores, atingiu-se 100% de inativação enzimática, sem
necessitar longo tempo de exposição. Isso representa as vantagens de reduzido emprego de
aditivo (diminuindo o uso de altas dosagens que podem provocar gosto e cheiro
desagradáveis, além de causarem crises alérgicas em pessoas asmáticas tendo o seu uso
controlado pela legislação, no caso do metabissulfito de sódio) e diminuição dos danos
causados por tratamento térmicos severo (perdas de vitaminas e sabor de cozido).
4.3.2 Polifenol-oxidase (PFO)
Todas as superfícies de respostas e os gráficos bidimensionais de contorno para a
inativação de PFO encontram-se no anexo 3.
Na Figura 18 encontra-se o gráfico de superfície de resposta para porcentagem de
inativação de PFO utilizando ácido ascórbico.
Figura 18. Superfície de resposta para porcentagem de inativação de PFO utilizando ácido
ascórbico.
48
Observa-se pelo gráfico que à medida que vai aumentado a concentração de ácido
ascórbico dimínui-se a temperatura para alcançar 100% de inativação de PFO. Com uma
temperatura de 75 °C e concentração de ácido de 200 mg/L é alcançado 100% de
inativação.
Na Figura 19 encontra-se a superfície de resposta para a inativação de PFO com
metabissulfito de sódio.
Figura 19. Gráfico Bidimensional de contorno para porcentagem de inativação de PFO
utilizando metabissulfito de sódio.
O comportamento da inativação de PFO com o metabissulfito de sódio, mostra que
são necessárias temperaturas mais altas para se conseguir 100 % de inativação. Todas as
variáveis estudadas foram significativas, e a interação entre elas também. Como o principal
interesse é conseguir temperaturas mais brandas para a inativação enzimática, com o
metabissulfito o modelo indica que isso ocorre com 79 °C, porém com o máximo de
metabissulfito de sódio aplicados nos tratamentos (200 mg/L) e tempo de 5 min.
Na figura 20, encontra-se a superfície de resposta para a inativação de PFO
aplicando cloreto de cálcio.
49
Figura 20. Superfície de resposta para porcentagem de inativação de PFO utilizando
cloreto de cálcio.
As interações entre as variáveis estudadas aplicando cloreto de cálcio não foram
significativas, sendo excluídas do modelo. Observa-se pela superfície de resposta (Figura
20) que a medida que vai aumentado a concentração de cloreto de cálcio diminui a
temperatura necessária para se obter 100% de inativação de PFO, porém chega-se um
ponto, que aumentando a concentração, aumenta também a temperatura necessária para
inativar PFO, demonstrado um efeito negativo de se usar altos valores de cloreto de cálcio
para inativar PFO. Alcança-se 100 % de inativação de PFO com aplicação de 100 mg/L de
cloreto de cálcio a uma temperatura de 82 °C por 5 min.
O cloreto de cálcio não é um inibidor direto da enzima PFO. Mas seu uso é
estudado pois sabe-se que é a perda da integridade da parede celular que representa o
início das reações de escurecimento enzimático. É o corte, a queda, a ação de pectinases,
hemicelulases e celulase que levam à perda da integridade da parede celular dos vegetais, e
por consequência, geralmente ao início das reações de escurecimento enzimático. Soluções
de sais de cálcio ajudam a manter a parede celular em bom estado: os íons de cálcio ligam-
se às cadeias de pectina, formando pontes entre elas, aumentando sua força e formando
pectato de cálcio, impedindo que o substrato se encontre com a enzima (POOVAIAH,
1986; RENSBURG & ENGELBRECHT, 1986). No presente estudo, foi utilizada polpa
50
homogeneizada, isso faz com que a justificativa da integridade da parede celular conferida
pelo cálcio seja descartada. Mas, apesar da inativação com cloreto de cálcio ter
apresentado os piores resultados (entre os inibidores testados), a presença do inibidor não
pode ser descartada, pois houve um efeito benéfico na inativação. Koblitz (2008) relata a
inativação da enzima PFO pela ação de halogenetos, principalmente os sais de cloro, sendo
o CaCl2 comercializado, em conjunto com ácido ascórbico, em um preparado comercial
inibidor de PFO de excelente eficácia.
Fujita et al., 1988, estudou a inativação de PFO em berinjela, a enzima ficou
completamente inativada após 30 minutos a 75°C ou 5 minutos a 80°C. Neste presente
trabalho, a temperatura mais branda para a inativação de PFO também foi de 75 °C, porém
o tempo empregado é de apenas 3 min, confirmando o efeito benéfico de empregar
inibidores químicos na inativação de enzimas associado ao binômio temperatura/tempo.
O melhor resultado para inativar PFO foi usando ácido ascórbico, pois foi
necessária menor temperatura para 100 % de inativação.
Na Tabela 16, encontra-se o melhor resultado para cada inibidor químico para as
enzimas PER e PFO.
Tabela 16. Resumos dos melhores resultados obtidos para inativação das enzimas PER e PFO.
Inibidores
Ac. ascórbico Metabissulfito de sódio Cloreto de Cálcio
T
(°C)
Concen-
tração
(mg/L)
Tempo
(min)
T
(°C)
Concen-
tração
(mg/L)
Tempo
(min)
T
(°C)
Concen-
tração
(mg/L)
Tempo
(min)
PER 79 174 3 78 130 3 84 0 1
PFO 75 190 3 79 200 5 82 100 5
Escolheram-se os 2 melhores tratamentos para inativar PER e PFO, avaliando
principalmente o binômio tempo/temperatura, pois é a principal causa de danos ao produto
final (sabor de cozido, perdas de nutrientes). Para PER tratamento com 130 mg/L de
metabissulfito de sódio a 78º C por 3 min e para PFO tratamento com 190 mg/L de ácido
ascórbico a 75° C por 3 min.
51
4.3.3 Confirmação dos resultados
O tratamento ideal para PER (130 mg/L de metabissulfito de sódio a 78º C por 3
min ) e para PFO (190 mg/L de ácido ascórbico a 75° C por 3 min) foram aplicados nas
variedades citadas no item 3.2.1 e depois foi determinada as atividades das enzimas PG,
PME, PFO e PER. Os resultados encontram-se nas tabelas 17 e 18.
Tabela 17. Atividade enzimática após aplicação do tratamento para inativação enzimática
com 130 mg/L de metabissulfito de sódio a 78 °C por 3 min.
PFO
(U/g)
PG
(U/g.h-1
)
PME
(U/g)
PER
(U/g)
Imperial 0 0 0 0
Vitoria 0 0 0 0
Pérola
Embrapa
0 0 0 0
Pérola
Mercado 0 0 0 0
Tabela 18. Atividade enzimática após aplicação do tratamento para inativação enzimática com 190
mg/L de ácido ascórbico a 75 °C por 3 min.
PFO
(U/g)
PG
(U/g.h-1
)
PME
(U/g)
PER
(U/g)
Imperial 0 0 0 312,12
Vitória 0 0 0 445,35
Pérola
Embrapa
0 0 0 789,56
Pérola
Mercado 0 0 0 659,12
Observa-se que os resultados encontrados pelos modelos propostos foram
confirmados, o tratamento do metabissulfito conseguiu inativar peroxidase e também as
outras enzimas, e o tratamento com ácido ascórbico conseguiu inativar a PFO e outras
enzimas, com exceção da PER.
52
A peroxidase é umas das enzimas mais termoestáveis em vegetais. Considera-se
que a inativação da peroxidase é acompanhada pela desnaturação de todas as outras
enzimas (BUENETTE, 1977; KHAN & ROBINSON, 1993), fato comprovado neste
experimento: o tratamento recomendado de inativação aplicado para PER inativou todas as
outras enzimas, já o melhor tratamento pra PFO não foi suficiente para inativar
completamente PER. Mello & Clemente (1996), conseguiram inativar PER de abacaxi
com uma temperatura de 75ºC, (a mesma utilizada pelo melhor tratamento de PFO),
porém eles usaram um tempo de 10 min, bem superior ao utilizado neste experimento, 3
min. A PER parcialmente purificada de tomate mostrou-se menos termorresistente que a de
abacaxi, sendo completamente inativada após 10 segundos a 72ºC (ANTHON et al, 2002).
4.4 Experimento 4. Compostos fenólicos e atividade antioxidante
4.4.1 Compostos fenólicos totais
Houve diferença significativa do conteúdo de compostos fenólicos totais entre as
variedades estudadas e dentro da mesma variedade Pérola (Tabela 19). A variedade Pérola
foi a que apresentou maior teor de fenólicos totais, com 5,66 e 5,16 mg de ácido
gálico/100g, respectivamente para o Pérola Mercado e Pérola Embrapa.
Conteúdos semelhantes de fenólicos totais foram encontrados por Silva (2010), que
estudou híbridos de abacaxi sob diferentes tratamentos do solo. Os valores médios dos
fenólicos variaram entre 4,34 a 5,80 mg de ácido gálico 100g-1
. Porém, Kuskoski et al.
(2006) e Melo et al (2008), encontraram valores bem superiores em polpa de abacaxi
congelada (21,7 mg/100g) e em abacaxi Pérola (66,3 mg/100g). Essa variação no teor de
fenólicos totais é explicada pois o conteúdo de compostos fenólicos é influenciado pelos
fatores de pré-colheita, como cultivar, ocorrência de estresses, localização geográfica e
outros (ZADERNOWSKI et al., 2005).
53
Tabela 19. Teor de fenóis totais em diferentes variedades de abacaxi.
Fenólicos Totais (mg de ácido galico/100 g de polpa)
Imperial Vitória Pérola
Embrapa
Pérola
mercado
Amostra pura 4,90 A a 4,87 A b 5,16 A c 5,66 A d
Amostra c/
metabissulfito
de sódio
Amostra c/ Ac.
Ascórbico
5,4 B
6,19 C
5,37 B
6,73 C
5,98 B
7,18 C
7,01 B
8,97 C
Valores assinalados com a mesma letra maiúscula na mesma coluna, não diferem significativamente
(p<0,05), segundo o teste de Tukey. Valores assinalados com a mesma letra na primeira linha, não diferem
significativamente (p<0,05), segundo o teste de Tukey.
Analisando o teor de fenólicos totais depois dos tratamentos aplicados para
inativação enzimática, observa-se que houve aumento na quantidade de fenólicos totais
havendo diferença significativa nos valores encontrados antes e depois dos tratamentos na
mesma variedade.
Em todas as variedades, o tratamento com ácido ascórbico foi o que obteve maior
conteúdo de fenólicos totais. Vale ressaltar que os tratamentos aplicados obtiveram no
experimento de inativação enzimática 100% de inativação de PFO, enzima que tem os
compostos fenólicos como substrato o que pode justificar o aumento significativo dos
compostos fenólicos dentro da mesma amostra depois que estas passaram pelo processo de
inativação enzimática. Essa hipótese é confirmada pelo fato de que, na presença de
metabissulfito, o teor de fenólicos foi maior do que na amostra sem tratamento porém
inferior ao encontrado na amostra tratada com ácido ascórbico. Verifica-se portanto, que
pode haver uma importante influência da presença de enzimas nativas do fruto na extração
de compostos fenólicos da polpa. É possível que seja aconselhável o uso de inibidores
químicos, prévios à extração, para garantir a manutenção do conteúdo de fenólicos
original.
4.4.2 Atividade Antioxidante
Os resultados obtidos dos testes frente ao método do radical livre DPPH estão
apresentados na Tabela 20 e permitem fazer uma comparação do potencial antioxidante
entre as variedades de abacaxi estudadas.
54
Tabela 20. Valores do EC50 dos extratos etanólico de abacaxi.
EC50 (mg/mL)
Imperial Vitória Pérola
embrapa
Pérola
mercado
Amostra pura 326,51 a A 315,44 b A 263,11 d A 288,98 c A
Amostra c/
metabissulfito
de sódio
Amostra c/ Ac.
Ascórbico
301,02 B
257,28 C
289,22 B
191,24 C
249,21 B
160,89 C
187,22 B
138,63 C
Valores assinalados com a mesma letra maiúscula na mesma coluna, não diferem significativamente
(p<0,05), segundo o teste de Tukey. Valores assinalados com a mesma letra na primeira linha, não diferem
significativamente (p<0,05), segundo o teste de Tukey. EC50 é definida como a quantidade de amostra
suficiente para reduzir a concentração inicial de DPPH para 50%.
As substâncias antioxidantes presentes nos extratos reagem com o DPPH, que é um
radical estável, e convertem-no em 2,2-difenil-1-picril hidrazina provocando descoloração
da solução. O grau de descoloração indica o potencial antioxidante do extrato. Um extrato
que apresenta alto potencial em sequestrar radicais livres possui baixo valor de EC50. Desta
forma, uma pequena quantidade de extrato é capaz de decrescer a concentração inicial do
radical DPPH em 50%, ou seja, inibir a oxidação do radical em 50%.
A variedade que apresentou a maior capacidade de sequestrar o radical DPPH foi a
Pérola Mercado (EC50=288,98 mg/L) seguida da Pérola Embrapa (EC50=263,11 mg/mL)
havendo diferença significativa entre elas.
Avaliando o efeito do tratamento de inativação enzimática nas amostras, observa-se
que houve aumento na capacidade antioxidante dessas amostras. Este resultado já era
esperado para os tratamentos aplicados, diante de que esses aditivos são antioxidantes
conhecidos. Porém, o aumento da capacidade antioxidante nessas amostras pode estar
relacionada também à inibição enzimática e preservação dos fenólicos quando aplicou-se
estes tratamentos, sugerindo a relação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante.
Desta forma, os estudos realizados indicam a relação entre concentração de fenóis
totais e a capacidade de sequestrar radicais livres das variedades de abacaxi, visto que as
amostras com maior concentração de fenóis totais são justamente as amostras com maior
atividade antioxidante. A correlação entre compostos fenólicos totais e atividade
antioxidante entre as diferentes variedades de abacaxi foi de 0,544, valores que corroboram
55
com Vedana (2008) que encontrou uma correlação de 0,540 para fenólicos totais e
atividade antioxidante em uvas. A correlação entre fenólicos totais e atividade antioxidante
na mesma variedade comparando os tratamentos aplicados foi superior em todas as
variedades estudadas, variando de 0,95 a 0,99. Benvenuti et al. (2004) encontrou
coeficiente de correlação para DPPH e fenóis totais de 0,992, Roesler (2007) também
encontrou relação entre concentração de fenóis totais e a capacidade de sequestrar radicais
livres dos extratos de frações das frutas do cerrado.
O potencial antioxidante de frutas está intimamente relacionado com a composição
específica dos diferentes tipos de compostos fenólicos, uma vez que a atividade
antioxidante ótima depende da sua configuração especial e do número e da posição dos
grupos hidroxilas presentes na sua estrutura (KUSKOSKI et al., 2006).
5.0 Conclusão
O delineamento experimental e a metodologia de superfície de respostas se
mostraram métodos eficazes para otimizar o processo de extração
enzimática. Observou-se que a concentração de NaCl e o pH da solução
tampão de extração influenciam na extração das enzimas. Os resultados
mostraram que o pH foi significativo na extração das enzimas PER e PFO, e
o NaCl foi significativo na extração de PME e PG.
As variedades Imperial e Vitoria são boas alternativas para a
industrialização de abacaxi. Apesar de apresentarem alta atividade das
enzimas pectiniloticas ( que afetam a textura e turbidez dos alimentos), elas
possuem uma menor atividade das enzimas oxidativas (responsáveis pelo
escurecimento interno e reações de degradação). Sendo a PER a enzima
mais termoresistente, é mais vantajoso ter uma menor atividade desta
enzima do que as enzimas pectinolítcas que são mais termolábeis. Estes
resultados também servirão de incentivo aos programas de melhoramento
genético do abacaxi, que se prendiam em obter cultivares mais produtivas,
adaptadas às condições climáticas locais e resistentes a pragas e moléstias,
mas não se preocupavam com outros fatores, como características
bioquímicas que darão ao fruto possibilidade de uso industrial.
56
Os inibidores químicos utilizados se mostraram eficazes na inativação das
enzimas oxidativas, pois reduziram a temperatura necessária para a
inativação térmica, comparada com a literatura. O melhor tratamento para
inativar PER foi com metabissulfito de sódio, que apresentou a melhor
resposta de inativação, pois a uma concentração mais baixa e com
tratamento térmico mais brando, do que quando comparados com os outros
inibidores, atingiu-se 100% de inativação enzimática, sem necessitar longo
tempo de exposição. Isso representa vantagens de reduzido emprego de
aditivo e diminuição dos danos causados por tratamentos térmicos severos.
Para PFO o tratamento com ácido ascórbico foi o mais indicado para
alcançar 100% de inativação. Ao se aplicar estes tratamentos em todas as
variedades e estudando todas as enzimas (PER, PFO, PG e PME), observa-
se que o melhor tratamento para PFO não foi eficaz para inativar totalmente
a PER, confirmando a termoestabilidade desta enzima.
Os tratamentos utilizados para inativação enzimática tiveram
influencia positiva no teor dos fenóis totais em todas as variedades de
abacaxis estudadas, possivelmente pelo fato da inativação das enzimas
oxidativas e permanência dos compostos fenólicos no abacaxi. Houve uma
correlação moderada entre os compostos fenólicos e a capacidade de
sequestrar o radical DPPH entre as variedades estudadas e uma correlação
alta (0,95-0,99) dentro da mesma variedade comparando os tratamentos
aplicados.
57
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75
7.0 Anexos
Anexo 01. Gráficos obtidos no experimento de otimização da extração
enzimática.
Figura 01(a). Gráfico de Pareto para extração de PER.
Figura 01(b). Gráfico Bidimensional de contorno para extração de PER.
76
Figura 01(c). Gráfico bidimensional de contorno para extração de PFO.
Figura 01(d). Gráfico bidimensional de contorno para extração de PME.
Figura 01(e). Gráfico de Pareto para extração de PME.
77
Figura 01(f). Gráfico bidimensional de contorno para extração de PG.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: PG
2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=13,50904
DV: PG
,6088086
-1,63694
-2,29795
3,756507
9,27627
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1Lby2L
pH(Q)
NaCl(Q)
(1)pH(L)
(2)NaCl(L)
Figura 01(g). Gráfico de Pareto para extração de PG.
78
Anexos 02. Gráficos obtidos no experimento de inativação da enzima PER.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: % INATIVAÇÃO
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=1,003367
DV: % INATIVAÇÃO
2,678964
-2,80603
6,070128
8,248669
12,63366
13,68367
26,46374
51,71374
89,40051
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1Lby3L
1Lby2L
CONCENTRAÇÃO(Q)
2Lby3L
(3)TEMPO(L)
TEMPO(Q)
(1)CONCENTRAÇÃO(L)
TEMPERATURA(Q)
(2)TEMPERATURA(L)
Figura 02(a). Gráfico de Pareto para a inativação de PER com ácido ascórbico.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: % inativação
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=,0972667
DV: % inativação
-5,24873
7,13056
35,68435
-44,4868
-46,581
47,39895
56,24921
197,7465
266,0781
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1Lby2L
2Lby3L
(1)Concentração(L)
Concentração(Q)
1Lby3L
tempo(Q)
(3)tempo(L)
temperatura(Q)
(2)temperatura(L)
Figura 02(b). Gráfico de Pareto para a inativação de PER com mestabissulfito de sódio.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: % inativação
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=1,261391
DV: % inativação
-1,67107
-2,62331
3,61288
-4,05439
-4,17148
6,051306
7,615482
40,83479
59,13516
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
2Lby3L
1Lby3L
1Lby2L
(1)Concentração(L)
Concentração(Q)
(3)Tempo(L)
Tempo(Q)
Temperatura(Q)
(2)Temperatura(L)
Figura 02(c). Gráfico de Pareto para a inativação de PER com cloreto de cálcio.
79
% inativação = 23,298352419362 + 7,1730811931683*x + 1,7096088260765*x2
+ 24,232291056662*y + 14,564810108048*y2 + 2,92125*0*y
120 100 80 60 40 20
% inativação = 23,298352419362 + 7,1730811931683*x +
1,7096088260765*x2
+ 24,232291056662*y + 14,564810108048*y2 + 2,92125*0*y
120 100 80 60 40 20
-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
CONCENTRAÇÃO Ac. Ascorb. mg/L
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
TE
MP
ER
AT
UR
A °
C
% inativação = 23,298352419362+24,232291056662*x
+14,564810108048*x2
+3,424393188822*y+3,8539101400247*y2+2,92125*x*y+0
120 100 80 60 40 20
-1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
TEMPERATURA °C
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
TE
MP
O m
in
Figura 02(d). Superfície de resposta para o efeito temperatura e concentração de acido
ascórbico (i), gráfico bidimensional de contorno para os efeitos temperatura e concentração
de acido ascórbico (ii) e temperatura e tempo (iii) na inativação enzimática.
i
ii iii
80
% inativação=30,779266245175+22,455139510485*x+17,340429544132*x²+4,7470423406699*y+4,1564236089085*y²-0;57875*1*x-5,13625*1*y+0,78625*x*y-0,88954677
120 100 80 60 40
Fitted Surface; Variable: % inativação
DV: % inativação
120 100 80 60 40
-1,6-1,4
-1,2-1,0
-0,8-0,6
-0,4-0,2
0,00,2
0,40,6
0,81,0
1,21,4
1,6
temperatura: 2
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
tem
po
: 3
120
100
80
60
40
20 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Concentração: 1
-1,50
-1,25
-1,00
-0,75
-0,50
-0,25
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
tem
pe
ratu
ra: 2
Figura 02(e). Superfície de resposta para o efeito tempo e temperatura (i); gráfico
bidimensional de contorno para os efeitos tempo e temperatura (ii) e temperatura e
concentração de metabissulfito de sódio (iii) na inativação enzimática.
ii
i ii
i
ii ii
i
81
Fitted Surface; Variable: % inativação
DV: % inativação
100
80
60
40
20 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Temperatura: 2
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Tem
po
: 3
z=26;195891851905-1;2321829136412*x-1;3172979030932*x^2
+17;971953293654*y+12;895087059813*y^2+1;4346085409253*x*y
+4;24394015
80
60
40
20
Figura 02(f). Gráfico bidimensional de contorno quando se aplicou cloreto de cálcio
em termos de porcentagem de inativação enzimática para o efeito tempo e temperatura (i) e
superfície de resposta para os efeitos temperatura e concentração de cloreto de cálcio (ii).
i
ii
82
Anexos 03. Gráficos obtidos no experimento de inativação da enzima PFO.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: % inativação
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=,6163667
DV: % inativação
,7430523
1,037441
-4,42679
-5,90389
12,84958
15,3099
29,89797
30,57979
73,62166
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
2Lby3L
Conc. Ac. Ascorbico(Q)
1Lby2L
1Lby3L
Tempo(Q)
(3)Tempo(L)
(1)Conc. Ac. Ascorbico(L)
Temperatura(Q)
(2)Temperatura(L)
Figura 03(a). Gráfico de Pareto para a inativação de PER com ácido ascórbico.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: % de inativação
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=,4479083
DV: % de inativação
-4,33013
5,166133
-7,79423
9,016229
-24,2487
30,20375
37,50694
45,01172
75,48655
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
1Lby3L
Tempo(Q)
2Lby3L
conc. MS(Q)
1Lby2L
(3)Tempo(L)
Temperatura(Q)
(1)conc. MS(L)
(2)Temperatura(L)
Figura 03(b). Gráfico de Pareto para a inativação de PER com metabissulfito de sódio.
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: % de inativaçao
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=1,119771
DV: % de inativaçao
0,
-2,19089
-3,28634
6,205623
-9,86547
12,2618
13,89096
-15,2225
56,76438
p=,05
Standardized Effect Estimate (Absolute Value)
2Lby3L
1Lby3L
1Lby2L
Temperatura(Q)
Tempo(Q)
(3)Tempo(L)
(1)Concentraçao CC(L)
Concentraçao CC(Q)
(2)Temperatura(L)
Figura 03(c). Gráfico de Pareto para a inativação de PER com cloreto de cálcio.
83
80 70 60 50 z=61;465828615814+6;3516403089265*x+3;2524943622243*y
+2;7885044115204*y^2-1;22875*0;*x-1;63875*x*y+0;
z=61;465828615814+15;640471635941*x+6;702340445388*x^2+3;2524943622243*y+2;7885044115204*y^2-1;22875*0;*x-1;63875*0;*y+0;
110 100 90 80 70 60 -1,50 -1,25 -1,00 -0,75 -0,50 -0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50
Temperatura: 2
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Te
mp
o: 3
z=61;465828615814+6;3516403089265*x+3;2524943622243*y+2;7885044115204*y^2-1;22875*0;*x-1;63875*x*y+0;
80
70
60 50 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Conc. Ac. Ascorbico: 1
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Tem
po: 3
Figura 03(d). Superfície de resposta para o efeito tempo e concentração de ácido ascórbico (i),
gráfico bidimensional de contorno para os efeitos tempo e temperatura (ii) e tempo e concentração
de ácido ascórbico (iii) na inativação enzimática.
i
ii
iii
84
z=61;290546100252+13;670637000461*x+7;0578958903423*x^2+5;4699090306075*y+;97214080635975*y^2-5;7377049180328*0;*x-1;0245901639344*0;*y-1;844262295082*x*y+0;
110 100 90 80 70 60 50
Figura 03(e). Superfície de resposta para o efeito, tempo e temperatura quando se aplicou
metabissulfito de sódio na inativação de PFO.
Fitted Surface; Variable: % de inativação
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=,4479083
DV: % de inativação
90
80 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
conc. MS: 1
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Tem
po: 3
Figura 03(f). Gráfico bidimensional de contorno para os efeitos tempo e concentração de
metabissulfito de sódio na inativação enzimática de PFO.
85
z=71;794411396116+3;977602204174*x-4;5291819016944*x^2
+16;254181972065*y+1;8463710434302*y^2-1;2295081967213*x*y+0;
100
90
80
70
60
50
40
30 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Concentraçao CC: 1
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Tem
pera
tura
: 2
Fitted Surface; Variable: % de inativaçao
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=1,119771
DV: % de inativaçao
90
80
70
60 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
Concentraçao CC: 1
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
Tem
po:
3
Fitted Surface; Variable: % de inativaçao
3 factors, 1 Blocks, 18 Runs; MS Pure Error=1,119771
DV: % de inativaçao
100
90
80 70
60
50
40 z=71;794411396116+16;254181972065*x+1;8463710434302*x^2
+3;5111007424365*y-2;9352936654133*y^2-1;2295081967213*0;*x+0;
Figura 03(g). Gráfico bidimensional de contorno para o efeito temperatura e concentração
de cloreto de cálcio (i), tempo e concentração de cloreto de cálcio (ii), e superfície de
resposta para os efeitos tempo e temperatura (iii).
iii
ii
i
