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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
SIDNEI CERQUEIRA DOS SANTOS
PROSPECÇÃO DE LINHAGENS BACTERIANAS PRODUTORAS DE BIOSSURFACTANTES COM POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO NO SEMI-ÁRIDO BAIANO
Feira de Santana, BA 2008
SIDNEI CERQUEIRA DOS SANTOS
PROSPECÇÃO DE LINHAGENS BACTERIANAS PRODUTORAS DE BIOSSURFACTANTES COM POTENCIAL
BIOTECNOLÓGICO NO SEMI-ÁRIDO BAIANO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Milton Ricardo de Abreu Roque Co-Orientador: Prof. Dr. Juan Carlos Rossi Alva
Feira de Santana, BA 2008
SIDNEI CERQUEIRA DOS SANTOS
Prospecção de linhagens bacterianas produtoras de biossurfactantes com potencial biotecnológico no semi-árido baiano
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana, como requisito parcial para obtenção do
título de mestre em Biotecnologia.
NÃO IMPRIMIR ESTÁ PÁGINA
BANCA EXAMINADORA:
___________________________________________________________________ Prof. Dra. Cristina Maria Assis Lopes Tavares da Mata Hermida Quintella Professora de Química (UFBA) e coordenadora do Laboratório de Cinética e Dinâmica Molecular (LABLASER/UFBA).
___________________________________________________________________ Profa. Dra. Sandra Aparecida de Assis Professora de Bromatologia Aplicada e Enzimologia e Tecnologia das Fermentações (UEFS).
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Milton Ricardo de Abreu Roque Professor de Microbiologia (UEFS) e coordenador do Laboratório de Microbiologia Aplicada e Saúde Pública (LAMASP/UEFS).
Feira de Santana, 22 de fevereiro de 2008.
AGRADECIMENTOS
Especiais agradecimentos a Deus, aos meus pais, irmãos e meu cunhado, a
minha namorada e a sua família, que me apoiaram e incentivaram na minha
trajetória como mestrando.
Meu reconhecimento é dedicado aos meus orientadores: Prof. Dr. Milton
Ricardo de Abreu Roque, por ter confiado no meu trabalho e por proporcionar a
conquista de mais um objetivo; e ao Prof. Dr. Juan Carlos Rossi Alva, por mais uma
vez ter colaborado na minha trajetória acadêmica.
Também demonstro a minha gratidão ao Prof. Dr. Milton Ricardo de Abreu
Roque, coordenador do Laboratório de Microbiologia Aplicada e Saúde Pública
(LAMASP) e ao Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto, coordenador do Laboratório de
Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da Universidade Estadual de Feira de Santana
(UEFS); a Profa. Dra. Luzimar Gonzaga Fernandez, por promover o desenvolvimento
de algumas atividades práticas no Laboratório de Estudos em Meio Ambiente
(LEMA) da Universidade Católica do Salvador (UCSal); e a Prof. Dra. Cristina Maria
Assis Lopes Tavares da Mata Hermida Quintella, coordenadora do Laboratório de
Cinética e Dinâmica Molecular (LABLASER) da Universidade Federal da Bahia
(UFBA), por ter me dado à oportunidade de realizar um treinamento na área de
tensiometria e desenvolver os testes de tensão superficial.
E por fim, os meus cordiais agradecimentos a graduanda em Ciências
Biológicas Narah Cabral, ao Farmacêutico Fábio Santos Ferreira, ao M.Sc. Henrique
Fortes Bahia e aos Biólogos Wilson Nascimento de Matos, Lidiane Karla Xisto
Oliveira e Suikinai Nobre Santos, por ter colaborado na realização dos experimentos;
ao secretário do PPGBiotec (UEFS/FIOCRUZ-BA) Helton Ricardo, pela paciência,
competência e clareza na orientação administrativa do corpo discente e docente; aos
colegas do Curso de PGBiotec, pela importante troca de conhecimento; aos
Lemianos; ao grupo MicroAmb e ao grupo Lablaser, que me ajudaram direta ou
indiretamente para a conquista do meu objetivo.
RESUMO
O semi-árido brasileiro apresenta um dos mais diversificados ecossistemas de cerrado, a Chapada Diamantina, que está localizada no centro do Estado da Bahia. A biodiversidade da região representa um grande potencial para bioprospecção de produtos, pelo fato de apresentar uma originalidade fisiológica, ecológica e genética de sua biota. O objetivo do trabalho foi selecionar linhagens bacterianas, provenientes do solo rizosférico e adjacente de plantas do semi-árido baiano, visando avaliar a produção de biossurfactantes com potencial biotecnológico, utilizando substratos alternativos como fonte de carbono. O estudo foi feito a partir de linhagens bacterianas isoladas de amostras de solo rizosférico e adjacente de plantas endêmicas coletadas no Parque Municipal de Mucugê, Município de Mucugê, Bahia. As linhagens bacterianas foram selecionadas pelo método drop-collapse e a otimização da concentração de substrato, pH e temperatura no tempo realizada através do ensaio de emulsificação. A medida da tensão superficial, dos caldos livres de células cultivados nas melhores condições de cultivo, foi analisada pelo método da gota pendente. As duas linhagens bacterianas competentes foram selecionadas do solo rizosférico de Actinocephalus spp. e pertencem ao gênero Pseudomonas. As melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante (>55%) foram à concentração de 0.5% de substrato, pH 7.0, temperatura na escala de 30-40ºC e o período de 24 a 48h de incubação. As duas linhagens de Pseudomonas spp. possuem a capacidade de reduzir as tensões superficial e interfacial dos meios e do óleo cru, respectivamente, tornando uma interessante alternativa para aplicações biotecnológicas.
Palavras-Chave: Semi-árido. Mucugê. Solo. Pseudomonas. Biossurfactante. Substrato alternativo.
ABSTRACT
The semi-arid Brazilian has one of the most diverse ecossystems the Chapada Diamantina, which is located in the center of the state of Bahia. The biodiversity of the region represents a great potential for bioprospecting of products, by the fact present a unique physiological, ecological and genetic of its biota. The work objective was selected bacterial strains, from the rhizosphere soil and adjacent of plants in the semi-arid Bahia, to aiming at assesses the production of biosurfactants with biotechnology potential, using substrates alternative as a source of carbon. The study was done from sampling of rhizosphere soil and adjacent of plants endemic collected in the National Park of Municipal de Mucugê, Município de Mucugê, Bahia. The bacterial strains were selected by the method drop-collapse and optimization of the concentration of substrate, pH and temperature in the time held through the test of emulsification. The measurement of the surface tension of the free broths cells grown in the best conditions of cultivation was examined by the method of drop pending. The two bacterial strains competent were selected soil rhizosphere of Actinocephalus spp. and belong to the genus Pseudomonas. The best conditions for cultivation for the production of biossurfactante (>55%) were 0.5% of the concentration of substrate, pH 7.0, temperature in the range of 30-40°C and the period of 24 to 48h of incubation. The two strains of Pseudomonas spp. have the ability to reduce the surface tension and interfacial from culture media and crude oil, respectively, making an interesting alternative for biotechnological applications.
Keywords: Semi-árido. Mucugê. Soil. Pseudomonas. Biosurfactant. Alternative substratum.
LISTA DE TABELAS
INTRODUÇÃO GERAL
Figura 1:
Forças intermoleculares no interior e na superfície de um líquido (PIRÔLLO,
2006)............................................................................................................................14
Figura 2: Diagrama esquemático da variação da tensão superficial, interfacial e
solubilização em função da concentração de biossurfactante (MULLIGAN,
2005)............................................................................................................................15
Figura 3: Estruturas químicas de alguns biossurfactantes (CAMEOTRA; MAKKAR,
1998)............................................................................................................................16
CAPÍTULO 1
Figura 1: Comparação da produção de emulsificado em diferentes concentrações de
carboidratos no tempo: Isolados Slim03 (A1) e Slim15 (A2) nas concentrações de
0,25% ( ), 0.5% (¦ ), 1% ( ), 2% (X) e 3% (+) de glicose..........................................36
Figura 2: Comparação da produção de emulsificado dos isolados Slim03 ( ) e
Slim15 (¦) na concentração de 0.5% de glicose no período de 24 a 120h.................37
Figura 3: Comparação da produção de emulsificado em diferentes pHs e
temperaturas no tempo: A1 - pH 5.0, B1 - pH 6.0, C1 - pH 7.0 e D1 - pH 8.0 nas
temperaturas de 25°C ( ), 30°C (¦ ), 35°C ( ) e 40ºC (X) para a linhagem Slim03; A2
- pH 5.0, B2 - pH 6.0, C2 - pH 7.0 e D2 - pH 8.0 nas temperaturas de 25°C ( ), 30°C
(¦ ), 35°C ( ) e 40ºC (X) para a linhagem Slim15......................................................39
Figura 4: Variação da concentração da biomassa (mg/mL) (¦ ) e do índice de
emulsificação (%)( ) dos isolados Slim03 (A1) e Slim15 (A2) no tempo..................40
Figura 5: Tensão superficial (mN/m) versus concentração do caldo livre de células
(%) dos isolados Slim03 ( ) e Slim15(¦ )...................................................................41
CAPÍTULO 2
Figura 1: Comparação da produção de emulsificado com diferentes fontes de
carbono no tempo: A1 - óleo de milho, B1 - óleo de girassol e C1 - glicerol para a
linhagem de Pseudomonas sp. pDL01; A2 - óleo de milho, B2 - óleo de girassol e C2
- glicerol a linhagem de P. fluorescens 3B, nas concentrações de 0.5% ( ), 1% (¦ ),
2% ( ) e 3% (X) dos respectivos substratos..............................................................54
Figura 2: Variação da concentração da biomassa bacteriana (mg/mL) (¦ ) e do índice
de emulsificação (%) ( ) com os substratos alternativos: A1 - óleo de milho a 0.5%,
B1 - óleo de girassol a 0.5% e C1 - glicerol a 5% para a linhagem de Pseudomonas
sp. pDL01; e A2 - óleo de milho a 0.5%, B2 - óleo de girassol a 0.5% e C2 - glicerol a
5% para a linhagem de P. fluorescens 3B..................................................................57
Figura 3: Tensão superficial (mN/m) versus concentração do caldo livre de células
(%) de Pseudomonas sp. pDL01 ( ) e P. fluorescens 3B (¦ ): A - óleo de milho; B -
óleo de girassol; e C - glicerol.....................................................................................59
APÊNCICE A
Figura1: Curva do peso seco versus absorbância dos isolados Slim03 ( ) e Slim15
(¦)................................................................................................................................66
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
ABIP – Agar Base para Isolamento de Pseudomonas
APF – Agar Pseudomonas para Fluorescente
APP – Agar Pseudomonas para Piocianina
BA – Bahia
BLST – Local Alignment Search Tool
BSA – Albumina de Soro Bovino
CMC – Concentração Micelar Crítica
Dez. – Dezembro
DMSO – Dimetilsulfóxido
E24 – Índice de Emulsificação
Ed. – Editor
ESALQ – Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"
FIOCRUZ – Fundação Osvaldo Cruz
HUEFS – Herbário da UEFS
LABLASER – Laboratório de Cinética e Dinâmica Molecular
LEMA – Laboratório de Estudos em Meio Ambiente
LAMASP – Laboratório de Microbiologia Aplicada e Saúde Pública
LAPEM – Laboratório de Pesquisa em Microbiologia
MEOR – Recuperação Melhorada de Petróleo
MMJE – Meio Mineral Jones e Edington
MSM – Meio Salino Mineral
NCBI – National Center for Biotechnology Information
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
PMM – Parque Municipal de Mucugê
PGBiotec – Pós-graduação em Biotecnologia
PPGBiotec – Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
SDS – Sodium Dodecyl Sulfate
Set. – Setembro
TIF – Tensão Interfacial
TBE – Tris-Borate-EDTA
TS – Tensão Superficial
TSA – Tryptic Soy Agar
TSB – Tryptic Soy Broth
UCSal – Universidade Católica do Salvador
UEFS – Universidade Estadual de Feira de Santana
UFBA – Universidade Federal da Bahia
USP – Universidade de São Paulo
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL .........................................................................................................12
OBJETIVOS ............................................................................................................................20
GERAL ................................................................................................................................. 20
ESPECÍFICOS.................................................................................................................... 20
ORGANIZAÇÃO DA PESQUISA.........................................................................................21
REFERÊNCAIS ......................................................................................................................22
CAPÍTULO 1: RESPOSTA DA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO
PARA A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE DE LINHAGENS BACTERIANAS
ISOLADAS NO SEMI-ÁRIDO BAIANO ..............................................................................26
RESUMO ............................................................................................................................. 26
Palavras-chave ............................................................................................................... 26
ABSTRACT ......................................................................................................................... 26
Keywords ......................................................................................................................... 26
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 27
2 MATERIAIS E METÓDOS ............................................................................................ 28
2.1 Coleta da Amostra................................................................................................... 28
2.2 Isolamento e Preservação de Linhagens Bacterianas ...................................... 29
2.3 Seleção de Linhagens Bacterianas Produtoras de Biossurfactante ............... 30
2.4 Identificação de Linhagens Bacterianas competentes ...................................... 31
2.5 Inóculo ....................................................................................................................... 31
2.6 Efeito da Concentração de Glicose na Produção de Biossurfactante ............ 32
2.7 Efeito do pH e Temperatura na Produção de Biossurfactante ........................ 32
2.8 Atividade Emulsificante .......................................................................................... 32
2.9 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular .................. 33
2.10 Concentração da Biomassa Bacteriana ............................................................ 33
2.11 Medida da Tensão Superficial............................................................................. 34
2.12 Análise Estatística ................................................................................................. 35
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 35
3.1 Isolamento e seleção de linhagens bacterianas produtoras de
biossurfactante ............................................................................................................... 35
3.2 Identificação de linhagens bacterianas competentes........................................ 36
3.3 Efeito da Concentração de Glicose ...................................................................... 36
3.4 Efeito do pH e Temperatura .................................................................................. 38
3.5 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular .................. 41
3.6 Medida da Tensão Superficial ............................................................................... 42
REFERÊNCAIS ......................................................................................................................43
CAPÍTULO 2: PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR LINHAGENS DE
Pseudomonas spp. USANDO SUBSTRATOS ALTERNATIVOS ..................................47
RESUMO ............................................................................................................................. 47
Palavras-chave ............................................................................................................... 47
ABSTRACT ......................................................................................................................... 47
Keywords ......................................................................................................................... 47
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 48
2 MATERIAIS E METÓDOS ............................................................................................ 50
2.1 Microrganismo.......................................................................................................... 50
2.2 Inóculo ....................................................................................................................... 50
2.3 Efeito de Substratos Alternativos na Produção de Biossurfactante................ 51
2.4 Índice de Emulsificação (E24) ................................................................................ 51
2.5 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular .................. 52
2.6 Concentração da Biomassa Bacteriana .............................................................. 52
2.7 Medida da Tensão Superficial ............................................................................... 52
2.8 Análise Estatística ................................................................................................... 53
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 53
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................61
CONCLUSÃO GERAL ..........................................................................................................65
APÊNDICE A ..........................................................................................................................66
ANEXO A.................................................................................................................................68
ANEXO B.................................................................................................................................69
12
INTRODUÇÃO GERAL
O semi-árido brasileiro abrange uma área de 1.150.662Km2, que corresponde
a 74,30% da Região Nordeste e a 13,52% da superfície do Brasil (PAES et al.,
2003). A caatinga representa o principal tipo vegetacional característico da região
semi-árida; enquanto as manchas de mata úmida, mata estacional, cerrado e
cerradão, que ocorrem espalhadas pelo semi-árido, representam vegetações
residuais de períodos climáticos mais úmidos (FERNANDES, 1996).
A região apresenta um dos mais diversificados ecossistemas de cerrado da
biosfera, a Chapada Diamantina, que está localizada no centro do Estado da Bahia,
entre as coordenadas 10°00S e 40°30 a 43°00W. Compreende uma área de 41.994
Km, constituindo-se na porção da cadeia do Espinhaço, um dos principais conjuntos
montanhosos do Brasil, que se estende da Bahia até Minas Gerais (JESUS et al.,
1985). Toda a região possui relevo muito acidentado, solos pobres em nutrientes e
extremamente ácidos, com clima mesotérmico, caracterizado por invernos secos e
verões brandos e chuvosos (TORRES; CORDEIRO; GIULIETTI, 2003).
A biodiversidade do semi-árido representa um grande potencial de matéria-
prima para o desenvolvimento de produtos diversos, além de possuir valor
econômico, social, recreativo, cultural e estético (BORÉM, 2005). Com uma flora
única e rica, a Chapada Diamantina exibe mais de 3.000 espécies de Angiospermas
e as mais variadas fisionomias, sendo esta diversidade comparada apenas à
encontrada em regiões de Mata Atlântica, Floresta Amazônica Ocidental, Península
do Cabo e Austrália (HARLEY, 1995). É também composta de uma variedade de
espécies animais e de microrganismos, que apresentam potencial pouco conhecido
cientificamente.
É certamente pela sua biodiversidade que a Chapada Diamantina tem atraído
à atenção de pesquisadores no mundo inteiro (OLIVEIRA; LONGHI-WAGNER;
GIULIETTE, 2003). Isso se justifica pelo fato do semi-árido apresentar uma das
biotas mais particulares do mundo, em composição e adaptações às condições do
meio (INSEAR, 2005), também pelo baixo conhecimento dessa diversidade, em
particular dos microrganismos, pois representa a fração biológica mais numerosa do
solo e da rizosfera; participando dos ciclos biogeoquímicos (EMBRAPA, 2001),
13
realizando atividades metabólicas relevantes para o crescimento das plantas
(COTANZA et al., 1997) e contribuindo com os processos ligados à cadeia trófica.
Os microrganismos provenientes de ambientes, como do semi-árido, podem
apresentar benefícios importantes no âmbito científico devido às condições extremas
do seu habitat, como o espectro de pH, salinidade, temperatura e de nutrientes.
Neste contexto, o estudo dos microrganismos fornecerá informações valiosas acerca
de moléculas de interesse industrial e um excelente recurso para o desenvolvimento
de novas aplicações biotecnológicas (CARDOSO et al., 2003).
Bactérias, fungos e leveduras têm sido apontados como agentes
transformadores eficazes, face a sua habilidade em degradar ampla gama de
substâncias orgânicas (URURAHY; PEREIRA JR; MARTINS, 1998), tais como
amido, celulose, quitina e hidrocarbonetos em compostos mais simples, utilizando
essas substâncias como única fonte de carbono e de energia. Essas características
dos microrganismos é resultado da produção de metabólitos secundários
conhecidos como biossurfactantes. Algumas funções fisiológicas têm sido atribuídas
aos biossurfactantes, são elas: emulsificação e solubilização de hidrocarbonetos ou
compostos insolúveis em água, facilitando o crescimento de microrganismos nestes
substratos (FRANCY et al., 1991), através do transporte e translocação de substrato
insolúvel pela membrana celular (BOGNOLO, 1999). Porém, cepas de Bacillus
subtilis produzem biossurfactantes apenas em substratos hidrossolúveis (COOPER
et al., 1981); transporte de hidrocarbonetos, função atribuída aos biossurfactantes
ligados à parede celular de Candida tropicalis (KAPPELI; FIECHTER, 1977), onde
um aumento significativo da porção lipídica do polissacarídeo de membrana foi
detectado quando o microrganismo crescia em alcanos, indicando que o complexo
polissacarídeo-ácido-graxo presente na superfície celular estaria envolvido no
transporte de hidrocarbonetos; aderência-liberação da célula a superfícies, uma das
mais importantes estratégias de sobrevivência dos microrganismos é sua habilidade
em colonizar um nicho ecológico onde possa se multiplicar. O elemento chave nesta
estratégia são estruturas da superfície celular responsáveis pela aderência das
células às superfícies. Os microrganismos podem utilizar surfactantes ligados à
parede para regular as propriedades da superfície celular, visando aderir ou se
desligar de um determinado local de acordo com sua necessidade para encontrar
novos habitats com maior disponibilidade de nutrientes ou se livrar de ambientes
desfavoráveis (ROSENBERG; RON, 1999); e atividade antibiótica, demonstrada por
14
vários biossurfactantes, principalmente da classe dos lipopeptídios e glicopeptídios.
Os ramnolipídios de P. aeruginosa e a surfactina de B. subtilis funcionam como
antibióticos, solubilizando os principais componentes das membranas celulares
microbianas. Através da excreção destes biossurfactantes no meio, os
microrganismos adquirem maior chance de sobrevivência e maior competitividade na
busca por nutrientes (LIN, 1996).
O biossurfactante é um grupo heterogêneo de molécula de superfície ativa,
formado biologicamente pelo crescimento aeróbio, a partir de metabólitos
microbianos (DESAI; BANAT, 1997a), utilizando como fonte de carbono
carboidratos, óleos, alcanos e resíduos (LIN, 1996). Estas moléculas reduzem a
tensão superficial (TS), concentração micelar crítica (CMC) e a tensão interfacial
(TIF) de ambas as soluções aquosas e misturas de hidrocarbonetos (BANAT, 1995;
NITSCHKE; PASTORE, 2003), além de apresentar propriedades de formação de
macro e micro emulsões (BANAT, 1995; NITSCHKE; PASTORE, 2003).
O efeito de um surfactante é determinado pela sua habilidade de diminuir a
TS, que é a medida da superfície livre de energia requerida para conduzir a
molécula da fase líquida para superfície (Figura 1). Devido à presença de um
biossurfactante, menos trabalho é requerido para conduzir a molécula para
superfície e a TS é reduzida. Um bom surfactante pode baixar a tensão de água de
72 para 35 mN/m e a TI (tensão entre líquidos polar e apolar) de água em face de n-
hexadecano de 40 para 1mN/m (CHRISTOFI; IVSHINA, 2002; MULLIGAN, 2005).
Figura 1: Forças intermoleculares no interior e na superfície de um líquido (PIRÔLLO, 2006).
15
A tensão superficial correlaciona-se com a concentração dos compostos
tensoativos até o momento em que a concentração micelar crítica (CMC) é
alcançada (Figura 2). A CMC é definida como a solubilidade de um tensoativo na
fase aquosa, ou seja, a concentração mínima do tensoativo necessária para atingir
os valores mais baixos de tensão superficial e interfacial, a partir da qual se inicia a
formação de micelas, que são partículas de uma solução coloidal. Colóide é um
sistema físico-químico que contém duas fases, uma das quais, a fase dispersa
(micelas), está exatamente subdividida e imersa na outra, a fase dispersora.
Surfactantes eficientes apresentam uma baixa concentração micelar crítica, ou seja,
menos surfactante é utilizado para diminuir a tensão superficial. Na prática, a CMC é
também a concentração máxima de biossurfactantes em água e é influenciada pelo
pH, temperatura e força iônica (MULLIGAN, 2005). Outra função dos surfactantes é
produzir emulsão, que são secretados em meio de cultura durante o crescimento
dos microrganismos. O emulsificado ajuda no transporte e translocação de substrato
insolúvel através da membrana celular (BOGNOLO, 1999).
Figura 2: Diagrama esquemático da variação da tensão superficial, interfacial e solubilização em função da concentração de biossurfactante (MULLIGAN, 2005).
Os surfactantes possuem uma estrutura molecular anfipática, constituída de
uma porção hidrofóbica e uma porção hidrofílica. A cadeia apolar é freqüentemente
uma cadeia hidrocarbonada enquanto a porção polar pode ser iônica (aniônica ou
catiônica), não iônica ou anfotérica (Figura 3) (DESAI; BANAT, 1997b; GOUVEIA et
al., 2003). Não existe relato na literatura de estrutura catiônica, entretanto em alguns
16
casos a presença de grupos contendo nitrogênio confere certo grau de caráter
catiônico em partes da molécula, afetando, por exemplo, na adsorção sobre sólidos
dispersados e floculação de partículas. Em comum com todas as espécies de
superfície ativa, biossurfactantes contém uma ou várias partes lipofílicas e
hidrofílicas. A metade lipofílica pode ser uma proteína ou um peptídio com uma alta
proporção de cadeia de face hidrofóbica, mas é usualmente a cadeia de
hidrocarboneto de um ácido graxo com 10-18 átomos de carbono, contudo ácido
graxo de peso molecular maiores tem sido relatado. A metade hidrofílica pode ser
um éster, uma hidroxila, um fosfato, um grupo carboxilado ou um carboidrato
(BOGNOLO, 1999).
Figura 3: Estruturas químicas de alguns biossurfactantes (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998).
17
A presença de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma molécula
possibilita a distribuição dos surfactantes nas interfaces entre faces fluídas com
diferentes graus de polaridade (óleo/água e água/óleo) (NITSCHKE; PASTORE,
2003).
Os surfactantes são classificados de acordo com sua composição química e
sua origem microbiana, sendo o tipo, a quantidade e a qualidade dos
biossurfactantes influenciados pela natureza do substrato, concentrações de íons
como P, N, Mg, O2 e Fe- no meio de cultura, além das condições de cultivo
(GEORGIOU; LIN; SHARMA, 1992). As principais classes de biossurfactantes
incluem glicolipídeos, lipossacarídeos, lipopeptídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos e
lipídios neutros (BOGNOLO, 1999). As classes de biossurfactantes e os
microrganismos produtores estão distribuídos entre uma extensa variedade de tipos
e gêneros, respectivamente, de acordo a tabela 1.
Tabela 1: Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos.
CLASSES E TIPOS DE BIOSSURFACTANTES
MICRORGANISMOS
Glicolipídios
ramnolipídios Pseudomonas aeroginosa
soforolipídios Torulopsis bombicola Rhodococccus erythropolis.
trehalolipídios Mycobacterium sp.
Lipopeptídios e lipoproteínas
peptídio-lipídio Bacillus licheniformis
viscosina Pseudomonas fluorescens
serravetina Serratia marcescens
subtilisina Bacillus subtilis
surfactina Baciluus subtilis
gramicidina Bacillus brevis
polimixina Bacilllus polymyxa Ácidos graxos, lipídios neutros e fosfolipídios
ácidos graxos Corynebacterium lepus
lipídios neutros Nocardia erythoropolis
fosfolipídios Thiobacillus thiooxidans Surfactantes poliméricos
emulsan Acinetobacter calcoaceticus
biodispersan Acinetobacter calcoaceticus
liposan Candida lipolytica
carboidrato-lipídio-proteína Pseudomonas fluorescens
manana-lipídio-proteína Candida tropicalis Surfactantes particulados
vesículas Acinetobacter calcoaceticus
células Várias bactérias Fonte: DESAI; BANAT, 1997b.
18
O maior mercado para os biossurfactantes é a indústria petrolífera, onde são
utilizados na produção de petróleo ou incorporados em formulações de óleos
lubrificantes (BANAT, 1995). Outras aplicações incluem biorremediação e dispersão
no derramamento de óleos, remoção e mobilização de resíduos de óleo em tanques
de estocagem, e a recuperação melhorada de petróleo (MEOR). Porém, atualmente,
as aplicações se distribuem entre os mais diversos setores industriais (NITSCHKE et
al, 2002), entre elas, à indústria farmacêutica, de cosméticos e de alimentos, devido
sua atuação como dispersantes e/ou solubilizantes de compostos orgânicos com
baixa solubilidade em água (GOUVEIA et al., 2003).
Acidentes com derramamento de óleo e seus derivados vem se tornando
constante e têm causado muitos problemas ecológicos e sociais. A introdução
desses poluentes em diferentes ambientes com relativa freqüência pode sobrepor à
capacidade de recuperação do ecossistema e assim resultar na acumulação em
níveis prejudiciais (RAHMAN et al., 2002), podendo levar a eliminação seletiva de
espécies e acarretar modificações estruturais e funcionais da comunidade ecológica
(GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005).
Os surfactantes microbianos têm grande importância na recuperação de
áreas contaminadas por atividade petrolífera, devido a sua capacidade de
decomposição de químicos xenobióticos no ambiente (EMBRAPA, 2001). Os
xenobiontes são moléculas orgânicas produzidas por tecnologias industriais
modernas e ausentes no ambiente natural. Estas moléculas se encontram em vários
tipos de compostos, aplicados à indústria petrolífera, associadas com as atividades
de produção, transporte e refino de petróleo, como por exemplo, as borras oleosas
(RIBEIRO; 1979; TALES, 2004; URURAHY; PEREIRA JR; MARTINS, 1998); e
indústria química, tais como, agrotóxicos, corantes, fármacos, polímeros e plásticos,
podendo ser tóxicos a sistemas biológicos, uma vez que não fazem parte do
conjunto de moléculas produzidas pelo metabolismo evolutivo que propicia a vida na
Terra (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005).
A revolução na base de conhecimento dos sistemas biológicos, a partir da
biotecnologia moderna vem gerando novas oportunidades de inovação (LOPES,
2005), como a técnica de biorremediação. Métodos de biorremediação estão
atualmente recebendo apoio como promissora tecnologia de tratamento ambiental
de remediação de hidrocarbonetos (DESAI; BANAT, 1997b). A biorremediação pode
ser definida como a conversão de compostos químicos por organismos viáveis,
19
especialmente microrganismos, que apresente funções metabólicas específicas,
derivada de seleção ou pela introdução de genes, codificando tais funções em
energia, massa celular e produtos de resíduo biológico inofensivo (WALTER et al.,
1997).
O objetivo de usar técnicas de remediação biológica é aumentar as condições
de fertilidade nativa de tais solos e de melhorar a taxa de degradação dos químicos
xenobiontes; eliminando, desta forma, a concentração de fontes contaminantes no
ambiente e melhorando a remoção dos mesmos (RAHMAN et al., 2002). A utilização
dessas substâncias como única fonte de carbono e de energia para os
microrganismos, aponta como poderosa alternativa aos métodos convencionais de
tratamento, sendo cada vez mais empregados na resolução de problemas
ambientais (URURAHY; PEREIRA JR; MARTINS, 1998).
20
OBJETIVOS
GERAL
Selecionar linhagens bacterianas, provenientes do solo rizosférico e adjacente
de plantas do semi-árido baiano, visando avaliar a produção de biossurfactante com
potencial biotecnológico, utilizando substratos alternativos como fonte de carbono.
ESPECÍFICOS
Isolar, selecionar e caracterizar linhagens bacterianas produtoras de
biossurfactantes, a partir de amostras de solo rizosférico e adjacente de plantas
endêmicas coletadas na área do Parque Municipal de Mucugê, Chapada
Diamantina.
Analisar as melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante
usando matérias primas de baixo custo.
Avaliar a produção de biossurfactante dos isolados bacterianos através de
análise qualitativa (prova de emulsificação) e quantitativa (medida da tensão
superficial).
Identificar as linhagens bacterianas competentes para a produção de
biossurfactantes.
21
ORGANIZAÇÃO DA PESQUISA
O trabalho de dissertação está estruturado em dois capítulos, a saber: o
primeiro intitulado “Resposta da otimização das condições de cultivo para a
produção de biossurfactante de linhagens bacterianas isoladas no semi-árido
baiano” aborda a seleção de linhagens bacterianas provenientes do solo rizosférico
e adjacente de plantas, assim como a avaliação das melhores condições de cultivo
para produção de biossurfactante; e o segundo intitulado “Produção de
biossurfactante por linhagens de Pseudomonas spp. usando substratos alternativos”
visa avaliar a produção de biossurfactante de linhagens de Pseudomonas spp.,
através da utilização de diferentes fontes de carbono. Por fim, a conclusão, onde são
pontuadas o tipo de contribuição do trabalho para o avanço científico e tecnológico,
e as possíveis perspectivas do objeto de estudo.
22
REFERÊNCAIS
BANAT, I.M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review. Bioresource Technology, v.51, p.1-12, 1995.
BOGNOLO, G. Biosurfactants as emulsifying for hydrocarbons. Physicochem. Eng. Aspects, v.152, p.41-52, 1999.
BORÉM, L. A história da biotecnologia: a ciência que está surpreendendo até os mais otimistas. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v.34, p.10-12, 2005.
CAMEOTRA, S.S.; MAKKAR, R.S. Synthesis of biosurfactants in extreme conditions. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.50, p.520-529, 1998.
CARDOSO, A.M. et al. Archaea: potencial biotecnológico: utilização e aplicação de arqueas na biotecnologia. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v.30, p.71-77, 2003.
COOPER, D.G. et al. Enhanced Production of Surfactin from Bacillus subtilis by continuous product removal and metal cation additions. Applied and Environmental Microbiology, v.42, n.3, p. 408-412, 1981.
COSTANZA, R. et al. The value of the world’s ecosystem services and natural capital. Nature, v.387, p.253-260, 1997.
CHRISTOFI, N.; IVSHINA, I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation. Journal of Applied Microbiology, v.93, p.915-929, 2002.
DESAI, A.J.; BANAT, I.M. Emulsifier production by Pseudomonas fluorescens during the growth on hydrocarbons. Current Science, v.57, p.500-5001, 1997a.
DESAI, J.D.; BANAT, I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Micriobiol. Mol. Rev., v.61, p.47-64, 1997b.
EMPRESA Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA). Os microrganismos e os metais pesados do solo. Seropédica, RJ, 2001. Disponível em: <http://www.
23
cnpab.embrapa.br/servicos/download/doc132.pdf>. Acesso em: 5 set. 2005.
FERNANDES, A. Fitogeografia do semi-árido. In: SOCIEDADE BRASILEIRA PARA O PROGRESSO DA CIÊNCIA, SBPC. Feira de Santana, Anais da 4ª Reunião Especial da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência. Feira de Santana: SBPC, 1996. p.215-219.
FRANCY, D.S. et al. Emulsification of hydrocarbon by surface bacteria. Journal Industrial Microbiol., v.8, p.237-46, 1991.
GAYLARDE, C.C.; BELLINASO, M.L.; MANFIO, G.P. Biorremediação: aspectos biológicos e técnicos da biorremediação de xenobióticos. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v.34, p.36-43, 2005.
GEORGIOU, G.; LIN, S.C.; SHARMA, M.M. Surface-active compounds from microorganisms. Biotechinology, v.10, p.60-65, 1992.
GOUVEIA, E.R. et al. Bactérias produtoras de biossurfactantes: produção de biossurfactantes por bactérias isoladas de poços de petróleo. Revista Biotecnologia e Desenvolvimento, v. 30, p. 39-45, 2003.
HARLEY, R. M. Introduction. In: STANNARD, B.L. (Ed.) Flora of the Pico das Almas – Chapada Diamantina, Bahia, Brazil. Royal Botanic Gardens, Kew, 1995.
INSTITUTO do Milênio do Semi-Árido (INSEAR). Biodiversidade, bioprospecção e conservação de recursos naturais. Disponível em: <http://www.imsear.org.br/ default.asp ?id=1&mnu=1>. Acesso em: 1 dez. 2005.
JESUS, E.F.R. et al. Caracterização geográfica e aspectos geológicos da Chapada Diamantina - Bahia. Salvador: Centro Editorial e Didático da UFBA, 1985.
KAPPELI, O.; FINNERTY, W.R. Component from the cell surface of the hydrocarbon-utilizing yeast Candida tropicalis with possible relation to hydrocarbon transport. Journal of Bacteriology, v.131, n.3, p. 917-921, 1977.
LIN, S.C. Biosurfactant: recent advances. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v.63, p.109-120, 1996.
24
LOPES, M.A.; NASS, L.L.; MELO, I.S. Bioprospecção: biotecnologia aplicada a prospecção e uso de serviços e funções da biodiversidade. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v.34, p. 29-35, 2005.
MULLIGAN, C.N. Environmental applications for biosurfactants. Environmental Pollution, v.133, p.183-198, 2005.
NITSCHKE, M.; PASTORE, G.M. Biossurfactantes: propriedades e aplicações. Química Nova, v.25, n.5, p.772-776, 2002.
NITSCHKE, M.; PASTORE, G.M. Biossurfactantes a partir de resíduos agroindustriais. Revista Biotecnologia e Desenvolvimento, v.31, p.63-67, 2003.
OLIVEIRA, R.P.; LONGHI-WAGNER, H.M.; GIULIETTI, A.M. O gênero Ichnanthus (Poaceae: Paniceae) na Chapada Diamantina, Bahia, Brasil. Acta Bot. Bras., v.17, n.1, p.49-70, 2003.
PAES, J.B. et al. Resistência natural de nove madeiras do semi-árido brasileiro a cupins subterrâneos, em ensaio de laboratório. Revista Cerne, v.9, n.1, p.36-47, 2003.
PIRÔLLO, M.P.S. Estudo da produção de biossurfactantes utilizando hidrocarbonetos. 2006. 73f. Dissertação (Ciências Biológicas) – Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, São Paulo.
RAHMAN, K.S.M. et al. Bioremediation of gasoline contaminated soil by a bacterial consortium amended with poultry litter, coir pith and ramnolipid biosurfactant. Bioresource Technology, v.81, p.25-33, 2002.
RIBEIRO, R.F. Estudo sobre os metais pesados nos sedimentos recentes da Baía de Aratu (BA). 1979. 92f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Programa de Pesquisa e Pós-graduação em Geofísica, Universidade Federal da Bahia, Salvador.
ROSENBERG, E.; RON, E.Z. High- and low-molecular-mass microbial surfactants. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.52, n.2, p.154-162, 1999.
TELES, L.J.S. Águas de lastro e sustentabilidade: identificação de áreas para deslastre por geoprocessamento: estudo de caso na Baía de Todos os Santos-BA. 2004. 86f. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Sustentável) – Centro de Desenvolvimento Sustentável, Universidade de Brasília, Brasília.
25
TORRES, D.S.C.; CORDEIRO, I.; GIULIETTI, A.M. O gênero phyllanthus L. (Euphorbiaceae) na Chapada Diamantina, Bahia, Brasil. Acta Bot. Bras., v.17, n.2, p.265-278, 2003.
URUM, K.; PEKDEMIR, T. Evaluation of biosurfactants for crude oil contaminated soil washing. Chemosphere, n.57, p.1139-1150, 2004.
URURAHY, A.F.P.; PEREIRA JR, N.; MARTINS, M.D.M. Desempenho de um biorreator do tipo CSTR no processo de degradação de borra oleosa. Boletim Técnico Petrobrás, v.41, p.125-132, 1998.
WALTER, M.V. et al. Surfactant enhances biodegradation of hydrocarbons: microcosm and field study. Journal Soil Contam., v.6, p.61-77, 1997.
26
CAPÍTULO 1: RESPOSTA DA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO PARA A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE DE LINHAGENS BACTERIANAS ISOLADAS NO SEMI-ÁRIDO BAIANO
RESUMO: A biodiversidade do semi-árido representa um grande potencial de matéria-prima devido às particularidades do seu ambiente, o que torna um importante local para o estudo de biomoléculas de interesse biotecnológico. O objetivo do trabalho foi selecionar linhagens bacterianas do solo rizosférico e adjacente de plantas do semi-árido baiano, visando avaliar as melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante. As amostras de solo foram coletadas de plantas endêmicas da família Verbenaceae e Eriocaulaceae no Parque Municipal de Mucugê, Bahia. As linhagens bacterianas foram selecionadas pelo método drop-collapse, sendo a otimização dos tratamentos realizada através do ensaio de emulsificação e a medida da tensão superficial analisada pelo método da gota pendente. As duas linhagens bacterianas competentes foram selecionadas do solo rizosférico de Actinocephalus spp. e pertencem ao gênero Pseudomonas. As melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante (>55%) foram a concentração de 0.5% de glicose, pH 7.0, temperatura na escala de 30-40ºC e o período de 24 a 48h de incubação. As duas linhagens bacterianas apresentaram a capacidade de reduzir as tensões superficial e interfacial do meio e do óleo cru, respectivamente. Os resultados obtidos confirmam a influência ambiental no metabolismo de microrganismos, tornando uma interessante alternativa para aplicações biotecnológicas.
Palavras-chave: Semi-árido. Mucugê. Solo. Linhagem bacteriana. Biossurfactante.
ABSTRACT: Biodiversity of the semi-arid region is a great potential of raw materials due to the particularities of their environment, which makes it an important place for the study of biomoleculs of interest biotechnology. The work objective was selected bacterial strains, from the rhizosphere soil and adjacent of plants in the semi-arid Bahia, to aiming at assesses the best conditions of cultivation for the production of biosurfactant. Soil samples were collected from plants endemic of the family Verbenaceae and Eriocaulaceae at Park Municipal de Mucugê, Bahia. The bacterial strains were selected by the method drop-collapse, and the optimization of processing performed by the test of emulsification and measurement of surface tension analyzed by the method of drop pending. The two bacterial strains competent were selected soil rhizosphere of Actinocephalus spp. and belong to the genus Pseudomonas. The best conditions for cultivation for the production of biosurfactant (>55%) were the concentration of 0.5% glucose, pH 7.0, temperature in the range of 30-40°C and the period of 24 to 48h of incubation. The two bacterial strains showed the ability to reduce the surface tension and interfacial from culture media and crude oil, respectively. The results confirm the environmental influence on the metabolism of microorganisms, making an interesting alternative for biotechnological applications.
Keywords: Semi-árido. Mucugê. Soil. Bacterial strain. Biosurfactant.
27
1 INTRODUÇÃO
O interesse em biossurfactantes tem crescido consideravelmente nos últimos
anos, pois eles são candidatos em potencial para muitas aplicações comerciais,
incluindo as indústrias de petróleo, farmacêutica, biomédica e de processamento de
alimentos (DESAI; BANAT, 1997). Tal fato vem promovendo uma grande busca por
isolamento de microrganismos capazes de produzir biossurfactantes.
Entretanto, é preciso ficar atento às etapas de crescimento celular e ao
acúmulo de produtos metabólicos, que são fortemente influenciados pela
composição do meio, como por exemplo, fonte de carbono, nitrogênio e sais
inorgânicos, pois isso dificulta a pesquisa por ser um fator importante para
otimização de vários processos biotecnológicos, tendo em vista os vários
parâmetros envolvidos (LI et al., 2002). A otimização do meio de cultivo envolve
mudança de uma variável no tempo, ajustado a outros parâmetros fixos. Existem
também experimentos com uma grande possibilidade de combinação fatorial, mas
de difícil avaliação da variável teste, devido à necessidade de um grande número de
experimentos (SEN, 1997). O mais recomendado é avaliar o resultado do cultivo e
estimar o principal efeito de acordo ao modelo linear, selecionando a variável que
tiver a melhor influência sob a produção para novos estudos (RODRIGUES et al.,
2006).
Fatores ambientais e condições de crescimento tais como pH, temperatura,
agitação, viabilidade de oxigênio e salinidade também afetam a produção de
biossurfactantes, alterando o crescimento celular e suas atividades vitais (DESAI;
BANAT, 1997). Porém, pode fornecer informações importantes para a seleção da
área de estudo, devido à relação paralela entre o ambiente e o crescimento celular
associado à produção de biossurfactantes, visto que alguns biossurfactantes
apresentam elevada estabilidade térmica e de pH podendo ser utilizados em
ambientes com condições mais drásticas, apresentando estabilidade a temperaturas
em torno de 75 °C por até 140 h e de pH entre 5 e 12 (HOROWITZ; GILBERT;
GRIFFIN, 1990), além de suportar concentrações de até 10% de NaCl (BOGNOLO,
1999).
O semi-árido é uma das regiões que apresenta uma biodiversidade de grande
relevância devido às particularidades da sua biota (INSEAR, 2005). Os organismos
28
estão extremamente adaptados às condições desfavoráveis do ambiente como solos
com alta salinidade, pobres em nutrientes e extremamente ácidos, além das altas
temperaturas (CARDOSO et al., 2003), que chegam até 60°C na rocha nua. Esta
alta taxa de biodiversidade do semi-árido, principalmente na Chapada Diamantina,
tornou-se alvo de interesse da comunidade científica (OLIVEIRA; LONGHI-
WAGNER; GIULIETTE, 2003), do governo e de empresas, visto que é uma área de
pouco conhecimento quantitativo e qualitativo de suas espécies (INSEAR, 2005).
A diversidade microbiana apresenta características aplicáveis à biotecnologia
devido às condições extremas do ambiente, que fornecem aos microrganismos
características metabólicas novas e/ou recombinação de genes de interesse, sendo
o produto do seu metabolismo de grande importância para aplicação de processos
biotecnológicos (CARDOSO et al., 2003). Neste contexto, o objetivo do trabalho foi
selecionar linhagens bacterianas, provenientes do solo rizosférico e adjacente de
plantas do semi-árido baiano, visando avaliar as melhores condições de cultivo para
produção de biossurfactante.
2 MATERIAIS E METÓDOS
2.1 Coleta da Amostra
A coleta do solo rizosférico e adjacente foi realizada em duas áreas do
Parque Municipal de Mucugê (PMM), Município de Mucugê, Bahia, em um período
de seca (verão) e em um período de frio (inverno), sendo a área 1 localizada à
S13°00'06'' e W41°20'54'' e a área 2 à S12°59'36'' e W41°20'33'', dentro de um
transecto de 50 X 2 metros. Para a obtenção de amostras da rizosfera, o sistema
radicular de plantas da família Verbenaceae (Stachytarpheta crassifolia) e
Eriocaulaceae (Actinocephalus spp., Syngonanthus giuliettae e S. mucugensis) foi
retirado e acondicionado em sacos plásticos juntamente com o solo adjacente. As
espécies vegetais foram catalogadas através de uma ficha de coleta com a
29
identificação confirmada no Herbário da UEFS (HUEFS) e as amostras de solo
foram analisadas quanto à composição, de acordo a tabela 1.
Tabela 1: Análise química dos solos adjacentes das espécies de plantas coletadas no Parque Municipal de Mucugê (PMM): Stachytarpheta crassifolia (Amostra 1), Actinocephalus spp. (Amostra 2), Syngonanthus mucugensis parte alta do PMM (Amostra 3) e S. mucugensis parte baixa do PMM (Amostra 4).
CTC, capacidade de troca catiônica; V, condutividade; MO, matéria orgânica.
2.2 Isolamento e Preservação de Linhagens Bacterianas
As amostras de solo rizosférico e adjacente foram peneiradas,
homogeneizadas e deixadas por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida,
foram retiradas sub-amostras de 10g de cada ponto de amostragem para serem
adicionadas em Erlenmeyers de 500mL contendo 90mL de solução salina (0,9%). As
amostras foram incubadas em agitador orbital (150rpm) a 30ºC, por 15 minutos
(ROQUE; MELO, 2000). Após o período sob agitação, foram realizadas diluições em
série, sendo retirada alíquotas de 100µL das diluições de 10-2, 10-3 e 10-4, inoculadas
e semeadas, em triplicata, na superfície dos seguintes meios contidos em placas de
Petri: King`s B (g/L de água destilada; protease peptona nº 03, 10,0g; K2HPO4, 1,5g;
MgSO4.7H2O, 1,5g; glicerol, 10mL; ágar, 15,0g; pH 7,0 0,2), meio mineral Jones e
Edington (MMJE) (água destilada, 1000mL; K2HPO4, 2,0g; MgSO4.7H2O, 0,2g;
CaCl2.2H2O, 0,1g; NaCl, 0,1g; FeCl3, 0,01g; NH4NO3, 0,5g; ágar, 15,0g) e meio
salino mineral (MSM) (g/L de água destilada; K2HPO4, 4,0g; Na2HPO4, 1,5; NaNO3,
1,0; MgSO4.7H2O, 0,2g; CaCl2.2H2O, 0,02g; FeCl3.6H2O, 0,02g; ágar, 15,0g; pH
7,0 0,2), descrito por Bodour e Miller-Maier (1998), modificado. Após um período de
24 a 72h de incubação (30°C), foi realizada a contagem de unidades formadoras de
30
colônia por grama de solo (UFC/g-1 de solo). Os isolados bacterianos foram
purificados em tryptic soy agar (TSA) (Himedia) e mantidos no meio preparado de
tryptic soy broth (TSB) com 15% de glicerol a -80°C.
2.3 Seleção de Linhagens Bacterianas Produtoras de Biossurfactante
As colônias puras isoladas foram inoculadas em 10mL de meio salino mineral
(MSM) (água destilada, 1000mL; K2HPO4, 4,0g; Na2HPO4, 1,5; NaNO3, 1,0;
MgSO4.7H2O, 0,2g; CaCl2.2H2O, 0,02g; FeCl3.6H2O, 0,02g; pH 7,0 0,2) (BODOUR;
MILLER-MAIER, 1998, modificado), utilizando 2% glicose (p/v) como única fonte de
carbono e energia. As culturas foram incubadas no agitador orbital a 30°C, sob
agitação de 180 rpm, por 48. O cultivo dos isolados microbianos foi centrifugado
(Hettich, Universal 32R) a 4.000 rpm, por 20 minutos (10ºC) (ILORI; AMOBI;
ODOCHA, 2005), para remover as células bacterianas e sobrenadante obtido
armazenado para o teste drop-collapse. As linhagens bacterianas foram
selecionadas pela técnica drop-collapse (BODOUR; MILLER-MAIER, 1998;
YOUSSEF, et al., 2004), onde 2µL de óleo mineral (Nujol), a base de hidrocarboneto
de petróleo, foi adicionado em poços de uma microplaca de 96 poços. O óleo foi
repousado nos poços por 24 horas a temperatura ambiente e 5 µL do caldo livre de
células foi adicionado na superfície do óleo. O controle positivo foi realizado com 5
µL de sodium dodecyl sulfate (SDS) (J.T.BAKER) a 1% e os controles negativos com
5 µL de água destilada e 5 µL do meio não inoculado. Após 1 minuto, foi realizada a
leitura visual da forma da gota na superfície do óleo, sendo o resultado considerado
positivo quando ocorreu o espalhamento total ou parcial da gota e negativo quando
a gota permaneceu inalterada.
31
2.4 Identificação de Linhagens Bacterianas competentes
As linhagens bacterianas selecionadas foram identificadas baseadas nas
caracterizadas fenotípicas tais como: morfologia das colônias e celular em
esfregaços corados pelo método de Gram; provas bioquímicas; meios seletivos -
agar Pseudomonas para fluorescente (APF) (Himedia), agar Pseudomonas para
piocianina (APP) (Himedia), agar base para isolamento de Pseudomonas (ABIP)
(Himedia) e agar cetrimide (Merck); e análise filogenética. O DNA genômico foi
extraído usando o protocolo Fenol-Clorofórmio-Álcool isoamílico (25:24:1), descrito
por Sambrook, Maniatis e Frisch (2001) (Anexo A). A região do 16S rRNA foi
amplificada no termociclador (GeneAmp, PCR System 9700), utilizando os
iniciadores fD1 (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG – 3’) e rP2 (5’-
ACGGCTACCTTGTTACGACTT – 3’), segundo Weisburg e colaboradores (1991)
(Anexo B). A eletroforese em gel de agarose do produto da PCR foi realizada com
0.8% de agarose (Pronadisa) em tampão Tris-borate-EDTA (TBE) (SAMBROOK;
FRITSH; MANIATIS, 2001), a 100 V, por 50 minutos, a temperatura ambiente. O
produto amplificado foi purificado com o kit GFXTM PCR DNA, seguindo as
especificações do manual da Amersham Biosciences. O fragmento de 16S rRNA
obtido foi seqüenciado e analisado quanto a sua similaridade para pesquisa de
nucleotídeos no Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) do National Center for
Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov), visando a identificação da
espécie.
2.5 Inóculo
As linhagens bacterianas foram semeadas em TSA e incubadas a 30ºC por
24h. Em seguida, foi feito um novo repique a partir do cultivo anterior e semeado em
TSA por mais 24h. Após essa etapa, foi realizado uma suspensão bacteriana em
solução salina (0,9%), a partir da escala padrão de densidade ótica 1.0 (108 UFC
mL-1) no filtro de 600 nm (ROBERT et al., 1989, modificado).
32
2.6 Efeito da Concentração de Glicose na Produção de Biossurfactante
Foi realizado um inóculo de 3 mL da suspensão bacteriana analisada em um
erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de MSM (pH 7.0 ± 0.2) com as seguintes
concentrações de glicose: 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4% (p/v), como única fonte de carbono e
energia, correspondendo as taxas de 2.5, 5, 10, 20, 30 e 40 g/L, respectivamente.
Um erlenmeyer controle de 500 mL contendo 100 mL de MSM (pH 7.0 ± 0.2) não
inoculado foi preparado para cada concentração de glicose. A amostra foi incubada
no agitador orbital a 30°C, na rotação de 180 rpm, por 5 dias, sendo retirado alíquota
de 2,5 mL do cultivo bacteriano a cada 24h e centrifugado (4000 rpm, 20 min, 10°C)
para determinação do índice de emulsificação (E24).
2.7 Efeito do pH e Temperatura na Produção de Biossurfactante
Foi realizado um inóculo de 3 mL da suspensão bacteriana em um
erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de MSM, utilizando a melhor concentração
de glicose (p/v) como única fonte de carbono e energia, com as temperaturas de 25,
30, 35 e 40°C (± 0,2°C) e pHs de 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0 (± 0,2). Um erlenmeyer controle
de 500 mL contendo 100 mL de MSM (0.5% de glicose) não inoculado foi preparado
para cada temperatura e pH analisado. A amostra foi incubada no agitador orbital na
rotação de 180 rpm, por 5 dias, sendo retirado alíquota de 2,5 mL do cultivo
bacteriano a cada 24h e centrifugado (4000 rpm, 20 min, 10°C) para determinação
do índice de emulsificação (E24).
2.8 Atividade Emulsificante
O ensaio de emulsificação foi realizado usando 2 mL do caldo livre de células
e 2 mL de óleo mineral puro (Nujol), a base de hidrocarboneto de petróleo, foram
33
transferidos para tubos (100mm x 15mm). Em seguida, a mistura foi agitada no
vórtex (Ika®, MS1 Minishaker) durante 2 minutos e deixado em repouso por 24
horas. A produção de biossurfactante foi medida através do índice de emulsificação
(E24), dividindo a altura da camada emulsificada (mm) pela altura total da coluna
líquida (mm) e multiplicado por 100. O controle negativo foi realizado com 2 mL de
MSM não cultivado e o controle positivo com 2 mL de SDS (J.T.BAKER) a 1%. Os
resultados foram expressos em porcentagem (%) (IQBAL et al., 1995; DAS et al.,
1998).
2.9 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular
Foi determinada a relação entre crescimento celular e a produção de
emulsificado com as melhores condições de cultivo no tempo. Foi retirado alíquotas
de 3 mL do cultivo a cada 24h e transferido 2,5 mL para uma cubeta de quartzo
(Plastibrand) para leitura da densidade ótica (600 nm), no programa “simple reads”
do espectrofotómetro (Cary, 50 Probe), visando obter a concentração da biomassa
bacteriana, de acordo a curva de calibração do peso seco versus absorbância. A
produção de biossurfactante foi observada através da formação de emulsificado,
retirando alíquotas de 2,5 mL a cada 24h de incubação e centrifugado a 4000 rpm,
por 20 min, a 10°C, para a obtenção do caldo livre de células.
2.10 Concentração da Biomassa Bacteriana
As linhagens bacterianas foram semeadas em TSA e incubadas na estufa de
crescimento a 30°C, por 24h. Posteriormente, as colônias bacterianas foram
transferidas para erlenmeyers de 500 mL, contendo 100mL de TSB, sob a agitação
de 180 rpm, a 30°C, por 48h. O cultivo bacteriano foi centrifugado a 4.000 rpm, por
20 minutos, e a biomassa bacteriana ressuspendida em 5 mL de água destilada para
34
realização da curva do peso seco versus absorbância (600 nm) (SANTA ANNA et
al., 2002) (Apêndice A).
2.11 Medida da Tensão Superficial
A tensão superficial (TS), do caldo livre de células das linhagens bacterianas
testadas nas melhores condições de E24, foi realizada no tensiômetro (DataPhysics,
Oca15 plus), através do método da gota pendente à temperatura ambiente. Um
volume pré-determinado de água destilada foi adicionado em uma cuba de quartzo
(20 mL) e colocado na superfície da plataforma do tensiômetro. Uma seringa com
agulha invertida foi submersa na água e num volume de ar aspirado para formar
uma gota submergida. A tensão superficial da superfície da gota foi medida usando
um sistema de imagem de vídeo automática e o programa Oca 10/Oca 20. O
instrumento foi calibrado com ar e água destilada para uma leitura de 71,62 ± 1.0
mN/m (FOX; BALA, 2000; CHEN; BAKER; DARTON, 2007). A concentração de
biossurfactante do caldo livre de células foi expressa como concentração micelar
crítica (CMC), sendo realizada diluição seriada do caldo livre de células com água
destilada, nas concentrações de 20, 40, 60, 80 e 100%. A CMC foi estimada
graficamente pela comparação da TS versus concentração (FOX; BALA, 2000).
Também foi realizada a tensão interfacial (TIF) entre o caldo livre de células e óleo
cru (JOSHI; BHARUCHA; DESAI, 2007). O controle negativo foi realizado com MSM
não cultivado e água destilada, e o controle positivo com SDS a 1%. Entre cada
medida, a seringa, a agulha e a cuba foram lavadas por três vezes com água, três
vezes com acetona e seca (WEI; CHOU; CHANG, 2005; CHEN; BAKER; DARTON,
2007).
35
2.12 Análise Estatística
Todos os testes de produção de biossurfactante foram realizados em
triplicata, visando comparar as tendências centrais de produção de biossurfactantes
entre as linhagens bacterianas (CALLEGARI-JACQUES, 2003). Os resultados foram
avaliados através do teste de Kruskal-Wallis, usando o programa estatístico
GraphPad InsTat (versão 3), sendo considerado significativo quando o valor de p foi
menor que 0,05.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Isolamento e seleção de linhagens bacterianas produtoras de biossurfactante
Foram isolados um total de sessenta colônias microbianas morfologicamente
distintas, incluindo 55 bactérias, 4 fungos filamentosos e 1 levedura. Destes, 31%
foram isolados do solo rizosférico e adjacente de Syngonanthus mucugensis, 21%
de Stachytarpheta spp., 11% de Actinocephalus spp. e 10% de Syngonanthus
giuliettae, sendo 24% dos isolados cultivados no meio King`s B, 21% no MSM e 15%
no meio mineral J.E. As 55 linhagens bacterianas foram identificadas com a sigla
SLIM e seguida de um número. Das 55 linhagens bacterianas 49% foram
caracterizadas como Gram-negativa, confirmando o relato de que muitas bactérias
gram-negativas são isoladas de locais com histórico de contaminação por óleo. Isto
pode ser uma característica que contribui para muitas destas populações em tais
ambientes (BICCA et al., 1999).
O teste drop-collapse é uma medida indireta da atividade superficial de uma
amostra analisada contra óleo, sendo que o maior diâmetro representa uma melhor
atividade superficial da amostra testada (RODRIGUES et al., 2006) Seis linhagens
bacterianas foram selecionadas por apresentarem atividade superficial, são elas:
36
SLIM03, SLIM04, SLIM15, SLIM17, SLIM26 e SLIM41. O controle positivo (SDS 1%)
apresentou espalhamento da gota e os controles negativos, água destilada e o meio
não inoculado, permaneceram inalterados. As linhagens bacterianas SLIM03 e
SLIM15 foram selecionadas para as posteriores análises, pois apresentaram
resultados promissores no ensaio de emulsificação (CHEN; BAKER; DARTON,
2007).
3.2 Identificação de linhagens bacterianas competentes
As linhagens bacterianas Slim03 e Slim15, isoladas do solo rizosférico de
Actinocephalus spp., se apresentaram como bacilos Gram-positivos. Os resultados
das provas bioquímicas caracterizam os isolados bacterianos como aeróbio estrito,
oxidase positivo, motilidade positivo, glicose positivo e lisina positiva. Esses
resultados representam algumas das características-chave que agrupam as
linhagens bacterianas em estudo na família Pseudomonadaceae (KONEMAM et al.,
2001), além de apresentar resultado positivo em todos os meios seletivos para
Pseudomonas. A análise parcial do gene 16S rRNA seqüenciado indica que ambos
isolados pertencem ao gênero Pseudomonas, tendo em vista o nível de similaridade
apresentado pelo isolado Slim03 de 99% para Pseudomonas sp. (GenBank, nº de
acesso AF125317) e do isolado Slim15 de 96% para Pseudomonas fluorescens
(GenBank, nº de acesso DQ417330).
3.3 Efeito da Concentração de Glicose
As duas linhagens bacterianas testadas foram capazes de produzir
biossurfactante em MSM nas concentrações de glicose testadas. Nenhum
crescimento bacteriano e índices de emulsificação foram obtidos nos frascos
controles não inoculados, com as respectivas concentrações de glicose analisada. O
caldo livre de células das linhagens bacterianas apresentou bons índices de
37
emulsificação (E24) contra óleo mineral, que variaram entre 27 a 58%, de acordo
com o período de cultivo (Figura 1). Os maiores valores do E24 (>55%) foram
formados pelos caldos livres de células, de ambas as linhagens bacterianas,
cultivadas em MSM nas concentrações de 0.5 e 1% (Figura1), no período de 24 a
120h, sendo 48h o melhor tempo de cultivo para produção de biossurfactante. Não
houve diferença significativa (p>0,05) entre as duas concentrações (0.5 e 1%) e nem
entre as duas linhagens testadas no período de 48 a 120h. Porém, existiu diferença
significativa de formação de emulsificado nas primeiras 24h de cultivo do isolado
Slim15, permanecendo estável após esse período. As linhagens bacterianas
formaram emulsificados eficientes e estabilizaram emulsões com vários tipos de
óleos de diferentes viscosidades, tais como óleo mineral (ACDelco, 5W-30), óleo
mineral (SAE, 40), óleo mineral (Helix, 25W-60) (resultado não mostrado) e óleo
mineral puro (Nujol).
0
20
40
60
80
24h 48h 72h 96h 120h
Horas
E24
(%
)
0
20
40
60
80
24h 48h 72h 96h 120h
Horas
E2
4 (%
)
Figura 1: Comparação da produção de emulsificado em diferentes concentrações de carboidratos no tempo: Isolados Slim03 (A1) e Slim15 (A2) nas concentrações de 0,25% ( ), 0.5% (¦ ), 1% ( ), 2% (X) e 3% (+) de glicose.
As linhagens bacterianas apresentaram o melhor comportamento metabólico
de produção de emulsificado nas concentrações de 0.5 e 1% de glicose (Figura 2),
mas à medida que diminuía ou aumentava essas concentrações ocorria uma
considerável redução da formação de emulsificado. Foi otimizada a concentração de
0.5% de glicose para produção de emulsificante extracelular, levando-se em conta o
(A1) (A2)
38
menor custo para composição do meio, visando o isolamento de bactérias com esse
potencial de ambientes como do semi-árido. O solo rizosférico e adjacente das
espécies vegetais analisadas apresentaram baixo potencial orgânico. Essa
informação é essencial para iniciar o entendimento sobre o comportamento dos
microrganismos e a síntese do seu produto, tendo em vista o preparo do meio de
cultivo, pois altas concentrações de fonte de carbono podem provocar uma
significativa supressão da taxa de geração de muitas espécies, devido à inibição da
reação de catálise enzimática provocada pelo excesso de substrato (HUGO;
MENDIE; NASIPURI, 1998). Tal fato ocorreu neste trabalho quando foi utilizada uma
concentração de 4% de glicose em MSM, para ambas as linhagens bacterianas
analisadas (dados não mostrados).
0
20
40
60
80
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
Figura 2: Comparação da produção de emulsificado dos isolados Slim03 ( ) e Slim15 (¦ ) na concentração de 0.5% de glicose no período de 24 a 120h.
3.4 Efeito do pH e Temperatura
A influência do pH no meio de cultura e da temperatura no tempo tem efeito
direto na síntese de biossurfactante, na escala de valores testadas (Figura 3). A
39
atividade do biossurfactante de ambas as linhagens bacterianas foi melhor (>58%)
no pH 7.0, na temperatura de 35ºC (Figura 3). Resultados semelhantes de pH (7-8)
e temperatura (30-40ºC) foram observados por Ilori, Amobi e Odocha (2005)
cultivando, em MSM, Aeromonas spp. isolada de um ambiente tropical. Essas
condições de cultivo podem possibilitar uma maior atividade enzimática e com isso
acelerar o metabolismo celular, resultando numa maior produção de biossurfactante.
O controle positivo, SDS a 1%, apresentou valor médio de índice de emulsificação
de 65,13%, sendo que este resultado não apresenta diferença significativa quando
comparado com os caldos livres de células analisados nas melhores condições de
cultivo. O melhor tempo de cultivo foi de 24h, mesmo sendo encontrados valores
superiores de E24 em outros períodos de cultivo. Porém, sem apresentar diferença
significativa de formação de emulsificado. Esta mostrou os maiores E24 a partir de
48h de incubação, atingindo o valor máximo em 72h, e permanecendo atestável por
mais de 30 dias (resultados não mostrados), sem mostrar diferença significativa de
formação de emulsificado. No geral, a estabilidade do biossurfactante produzido
pelos isolados bacterianos indica o grande potencial econômico dessa biomolécula,
pois pode promover um maior tempo de prateleira para os produtos. Essa
característica pode proporcionar seu emprego em várias indústrias, tais como
alimentos, farmacêutica e de cosméticos, assim como para aplicação na área de
biorremediação de ambientes marinhos (ILORI; AMOBI; ODOCHA, 2005), além de
ser um interessante aditivo de detergente (GUPTA et al., 2002). O E24 de 24h
reduziu significativamente à medida que diminuía ou aumentava a temperatura dos
isolados analisados, permanecendo constante a partir de 48h de cultivo (Figura 3).
Wei, Chou e Chang (2005) mostraram que a produção de biossurfactante por
Pseudomonas aeruginosa aumentava com a temperatura de 25 a 30ºC, tornando
constante entre 30-37ºC e decrescendo em temperaturas acima de 42ºC,
corroborando com os resultados deste trabalho (Figura 3).
40
(A1)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
(A2)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
(B1)
0,00
10,00
20,00
30,00
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70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
(B2)
0,00
10,00
20,00
30,00
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50,00
60,00
70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
(C1)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
(C2)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
(D1)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
(D2)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
24 48 72 96 120
Horas
E24
(%
)
Figura 3: Comparação da produção de emulsificado em diferentes pHs e temperaturas no tempo: A1 - pH 5.0, B1 - pH 6.0, C1 - pH 7.0 e D1 - pH 8.0 nas temperaturas de 25°C ( ), 30°C (¦ ), 35°C ( ) e 40ºC (X) para a linhagem Slim03; A2 - pH 5.0, B2 - pH 6.0, C2 - pH 7.0 e D2 - pH 8.0 nas temperaturas de 25°C ( ), 30°C (¦ ), 35°C ( ) e 40ºC (X) para a linhagem Slim15.
41
3.5 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular
A relação entre crescimento celular e produção de emulsificado no tempo foi
determinada para ambas as linhagens bacterianas, após o processo de otimização
das condições de cultivo (0.5% de glicose, pH 7.0, 35ºC, 24h), onde a medida do
crescimento celular foi expressa pela concentração de biomassa e a atividade do
biossurfactante pelo índice de emulsificação (E24). Para ambas as linhagens
bacterianas a produção de biossurfactante esteve associada ao crescimento celular
(Figura 4), confirmando a relação direta que existe entre a utilização do substrato,
crescimento celular e produção de biossurfactante no tempo (DESAI; DESAI, 1993).
O valor máximo de E24 e de crescimento celular de ambas as linhagens bacterianas
foi observado nas primeiras 24h de cultivo (Figuras 4), fase de crescimento
exponencial, sendo a maior concentração de biomassa bacteriana observada para
linhagem Slim03, que alcançou o valor de 0,0014 mg/mL. Após o período de 24h de
incubação, foi verificado um decréscimo gradativo da biomassa bacteriana das
linhagens testadas, identificada como a fase de morte celular, sem afetar
estatisticamente os níveis de formação de emulsificado. Estes resultados indicam
que a produção de biossurfactantes pelos microrganismos ocorre,
predominantemente, durante a fase de crescimento exponencial, sugerindo que o
biossurfactante é produzido como um metabólito primário, acompanhando a
formação da biomassa celular (ABU-RUWAIDA et al., 1991; AMIRIYAN et al., 2004).
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
24 48 72 96 120Horas
Bio
mas
sa b
acte
riana
(m
g/m
L)
10,00
30,00
50,00
70,00
E24
(%
)
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
24 48 72 96 120
Horas
Bio
mas
sa b
acte
riana
(m
g/m
L)
10,00
30,00
50,00
70,00
E24
(%
)
Figura 4: Variação da concentração da biomassa (mg/mL) (¦ ) e do índice de emulsificação (%)( ) dos isolados Slim03 (A1) e Slim15 (A2) no tempo.
(A1) (A2)
42
3.6 Medida da Tensão Superficial
O caldo livre de células dos isolados Slim03 e Slim15 apresentaram excelente
redução da tensão superficial (TS) da gota do meio testado de 73,52 mN/m para
31,14 e 32,73 mN/m, respectivamente. Esses valores médios são inferiores a TS do
controle positivo, SDS a 1%, que foi de 40,04 mN/m. A concentração micelar crítica
(CMC) do biossurfactante produzido pelos isolados Slim03 e Slim15 ficou entre 30 e
40% (Figura 5). De acordo com o teste de Kruskal-Wallis, não houve diferença
significativa (p<0,05) da TS da gota nas diferentes concentrações das amostras
analisadas. Na figura 5 pode-se observar que o aumento da concentração reduz a
TS da gota, indicando que as moléculas de biossurfactante começam a se agregar
(CASSIDY; HUDAK, 1998).
0
20
40
60
80
0 20 40 60 80 100
Concentração (%)
TS
(m
N/m
)
Figura 5: Tensão superficial (mN/m) versus concentração do caldo livre de células (%) dos isolados Slim03 ( ) e Slim15(¦ ).
O resultado da TS do caldo livre de células das linhagens bacterianas
analisadas é promissor, pois segundo Batista e colaboradores (2006), a
concentração de biossurfactante do caldo livre de células equivale de cinco a dez
vezes acima do valor da CMC de um biossurfactante isolado. Os caldos livres de
células dos isolados Slim03 e Slim15 reduziram a tensão interfacial (TIF) do óleo cru
de 17,16 mN/m para 1,88 e 2,41 mN/m, respectivamente, sendo valor médio do
43
controle positivo, SDS a 1% (4,82 mN/m), inferior a TS das amostras analisadas. A
redução da TIF indica a habilidade do surfactante de remover o óleo, nesse
contexto, a TIF entre água e óleo (A/O) é diminuída, refletindo na força capilar.
Portanto, a redução da TIF pode aumentar o ângulo de contato e provocar uma
diminuição da força capilar, que mantém o óleo cru adsorvido ao solo, o que pode
ser exemplificado em casos de acidentes com petróleo ou seus derivados (URUM;
PEKDEMIR, 2004).
As duas linhagens bacterianas foram selecionadas do solo rizosférico e
adjacente de Actinocephalus spp. e pertencem ao gênero Pseudomonas. As
linhagens de Pseudomonas spp. possuem a capacidade de produzir biossurfactante,
reduzindo a TS e ITF de água e óleo cru, respectivamente. Estes resultados indicam
que as condições ótimas de cultivo para produção de biossurfactante por isolados
bacterianos de ambientes semi-áridos sejam: MSM com 0.5% de glicose, pH 7.0,
temperatura na escala de 30-40ºC, no período de 24 a 48h. Os resultados obtidos
neste trabalho são promissores, tendo em vista a crescente busca por biomoléculas
com tal potencial para aplicação nas indústrias de alimento, farmacêutica,
cosmético, detergente e de biorremediação. Essas informações a respeito do efeito
do pH e da temperatura para a produção de biossurfactante por linhagens de
Pseudomonas spp. são importantes, tendo em vista o pouco conhecimento do seu
processo fisiológico de produção de biossurfactante em habitats como o semi-árido.
REFERÊNCAIS
AMIRIYAN, A. et al. Bioemulsan production by Iranian oil reservoirs microorganisms. Iranian Journal Env. Health Sci. Eng., v.1, n.2, p.28-35, 2004.
ABU-RUWAIDA, A.S. et al. Isolation of biosurfactant-producing bacteria product characterization, and evaluation. Acta Biotechnologica, v.4, p.315-24, 1991.
BATISTA, S.B. Isolation and characterization of biosurfactant/bioemulsifier-producing bacteria from petroleum contaminated sites. Bioresource Technology, v.97, p.868-875, 2006.
44
BICCA, C.F.; FLECK, L.C.; AYUB, M.A.Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus rubber and Rhodococcus erythropolis. Braz. J. Microbiol., v. 30, p.231-236, 1999.
BODOUR, A.A.; MILLER-MAIER, R.M. Application of a modified drop-collapse technique for surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microorganisms. Journal of Microbiological Methods, v.32, p.273-280, 1998.
BOGNOLO, G. Biosurfactants as emulsifying for hydrocarbons. Physicochem. Eng. Aspects, v.152, p.41-52, 1999.
CALLEGARI-JACQUES, S.M. Bioestatística: princípios e aplicações. Porto Alegre: Artmed, 2003. 184p.
CARDOSO, A.M. et al. Archaea: potencial biotecnológico: utilização e aplicação de arqueas na biotecnologia. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v.30, p.71-77, 2003.
CASSIDY, D.P.; HUDAK, A.J. Microorganism selection and biosurfactant production in a continuously and periodically operated bioslurry reactor. Journal Hazard. Mater., v.84, p.253-264, 2001.
CHEN, C-Y.; BAKER, S.C.; DARTON, R.C. The application of a high throughput analysis method for the screening of potential biosurfactants from natural sources. Journal of Microbiological Methods, v.70, p.503-510, 2007.
DAS, M.; DAS, S.K.; MUKHERJEE, R.K. Surface active properties of the culture filtrates of a Micrococcus species grown on n-aalkenes and sugars. Biores. Technol, v.63, p.231-235, 1998.
DESAI, J.; DESAI, A. Production of biosurfactants. In: KOSARIC, N. (Ed) Biosurfactants: production, properties and applications. New York: Marcel Dekker, 1993. p.65-97.
DESAI, J.D.; BANAT, I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Micriobiol. Mol. Rev., v.61, p.47-64, 1997.
FOX, S.L.; BALA, G.A. Production of surfactant from Bacillus subtilis ATCC 21332 using potato substrates. Bioresource Technology, v.75, p.235-240, 2000.
45
GUPTA, R. et al. An overview on fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline proteases. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.60, p.381-95, 2002.
HOROWITZ, S.; GILBERT, J.N.; GRIFFIN, W.M. Isolation and characterization of a surfactant produced by Bacillus licheniformis 86. Journal of Industrial Microbiology, v.6, p.243-248, 1990.
HUGO, P.G.; MENDIE, V.E.; NASIPURI, R.N. Kinetics of growth caracteristics of micro-organisms in dextrose infusion solutions. International Journal or Phannaceutics, v.167, p.1-6, 1998.
ILORI, M.; AMOBI, C.J.; ODOCHA, A.C. Factors affecting biosurfactant production by oil degrading Aeromonas spp. Isolated from a tropical environment. Chemosphere, v.61, p.985-992, 2005.
INSTITUTO do Milênio do Semi-Árido (INSEAR). Biodiversidade, bioprospecção e conservação de recursos naturais. Disponível em: < http://www.imsear.org.br/ default.asp ?id=1&mnu=1>. Acesso em: 1 dez. 2005.
IQBAL, S.; KHALID, Z.M.; MALIK, K.A. Enhanced biodegradation and emulsification of crude oil and hyperproduction of biosurfactants by a gamma rayinduced mutant of Pseudomonas aeruginosa. Lett. Appl. Microbiol., v.21, p.176-179, 1995.
JOSHI, S.; BHARUCHA, C.; DESAI, A.J. Production of biosurfactant and antifungal compound by fermented food isolate Bacillus subtilis 20B. Bioresource Technology, 2007, doi:10.1016/j.biortech.2007.07.030.
KONEMAM, E.W. et al. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas colorido. Rio de Janeiro: Editora Médica e Científica Ltda, 2001. 578p.
LI, C.; BAI, J.; CAI, Z.; OUYANG, F. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis using a response surface methodology. Journal Biotechnology, v.93, p.27-34, 2002.
OLIVEIRA, R.P.; LONGHI-WAGNER, H.M.; GIULIETTI, A.M. O gênero Ichnanthus (Poaceae: Paniceae) na Chapada Diamantina, Bahia, Brasil. Acta Bot. Bras., v.17, n.1, p.49-70, 2003.
46
ROBERT M. et al. Effect of carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 4T1. Biotechnol. Lett., v.11, p.871-874, 1989.
RODRIGUES, L. et al. Response surface optimization of the medium components for the production of biosurfactants by probiotic bacteria. Process Biochemistry, v.41, 1-10, 2006.
ROQUE, M.R.A.; MELO, I.S. Isolamento e caracterização de bactérias degradadoras do herbicida diuron. Scientia Agricola, v.57, n.4, p.723-728, 2000.
SAMBROOK, J.; MANIATIS, T.; FRISCH, E.F. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory press, 2001.
SANTA ANNA, L.M. et al. Production of biosurfactants from Pseudomonas aeruginosa PA1 isolated in oil environments. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 19, n. 2, p. 159-166, 2002.
SEN, R. Response surface optimization of the critical media components for the production of surfactin. Journal Chem. Technol. Biotechnol., v.68, p.263-270, 1997.
URUM, K.; PEKDEMIR, T. Evaluation of biosurfactants for crude oil contaminated soil washing. Chemosphere, v.57, p.1139-1150, 2004.
WEI, Y-H.; CHOU, C-L.; CHANG, J-S. Rhamnolipid production by indigenous Pseudomonas aeruginosa J4 originating from petrochemical wastewater. Biochemical Engineering Journal, v.27, p.146-154, 2005.
WEISBURG, W.G. et al. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. Journal of Bacteriology, v. 173, n. 2, p.697-703, 1991.
YOUSSEF, N.H. et al. Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms. Journal of Microbiological Methods, v.56, p.339-347, 2004.
47
CAPÍTULO 2: PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR LINHAGENS DE Pseudomonas spp. USANDO SUBSTRATOS ALTERNATIVOS
RESUMO: O gênero Pseudomonas tem recebido atenção devido ao seu potencial de utilizar diferentes fontes de carbono para a produção de biossurfactante, tal fato pode possibilitar a redução dos custos de produção, tornando muito mais viável para o mercado industrial. Neste sentido, o trabalho teve como objetivo avaliar a produção de biossurfactante de duas linhagens de Pseudomonas ssp., utilizando substratos alternativos como fonte de carbono e energia. As linhagens bacterianas foram isoladas no Parque Municipal de Mucugê, Município de Mucugê, Bahia. Foram utilizados diferentes concentrações de dois óleos vegetais e glicerol como única fonte de carbono e energia para a produção de biossurfactante, sendo avaliado através do ensaio de emulsificação e da medida da tensão superficial. A melhor concentração dos substratos alternativos foi de 0.5%, com formação de índices de emulsificação que variaram de 50 a 60% para ambas as linhagens bacterianas analisadas. O caldo livre de células das linhagens de Pseudomonas spp. apresentaram a capacidade de reduzir a tensão superficial de todos os meios testados, sendo mais efetivo com glicerol. Os resultados obtidos confirmam o potencial desses substratos alternativos, o que pode viabilizar o aumento da produção de biossurfactante, tendo em vista a disponibilidade e o baixo custo da matéria prima.
Palavras-chave: Pseudomonas. Biossurfactante. Substrato alternativo.
ABSTRACT: The genus Pseudomonas has received attention because of their potential to use different sources of carbon for the production of biosurfactant, this fact may allow the reduction of production costs, making it more feasible for the industrial market. In this sense, the work was to evaluate the production of biosurfactant of two strains of Pseudomonas spp. Using substrates alternative as a source of carbon and energy. The bacterial strains were isolated in the Park Municipal de Mucugê, Município de Mucugê, Bahia. We used different concentrations of two vegetable oils and glycerol as the sole source of carbon and energy for the production of biosurfactant, as measured by the test of emulsification and the measurement of surface tension. The best concentration of substrates alternative was 0.5%, with rates of formation of emulsification which ranged from 50 to 60% for both bacterial strains analyzed. The broth of free cell of Pseudomonas spp. strain had the ability to reduce the surface tension of all culture media tested, and more effective with glycerol. The results confirm the potential of these alternative substrates, which may enable the increased production of biosurfactant in view of the availability and low cost of raw material.
Keywords: Pseudomonas. Biosurfactant. Alternative substratum.
48
1 INTRODUÇÃO
Os surfactantes constituem uma classe de compostos químicos amplamente
utilizados em diversos setores industriais. A demanda industrial de surfactante tem
crescido acima de 300% na indústria química nas últimas décadas, sendo estimado
que a produção mundial de surfactantes exceda 3 milhões de tonelada por ano
(GREEK, 1990; BANAT, 2000). Entretanto, existe uma tendência dos países
industrializados pela substituição dos surfactantes sintéticos pelos naturais,
biossurfactantes. Esta tendência é motivada pelas seguintes vantagens dos
biossurfactantes: necessidade de produtos mais baratos, a partir de substratos
renováveis e possuírem grande diversidade química, possibilitando aplicações
específicas para cada caso particular (DESAI; BANAT, 1997); pela crescente
preocupação ambiental dos consumidores combinada com novas legislações de
controle do meio ambiente; pelo fato de serem compostos que não são derivados de
petróleo, fator importante à medida que os preços do petróleo aumentam
consideravelmente; e pela possibilidade de modificação da estrutura química e das
propriedades físicas dos biossurfactantes através de manipulações genéticas,
biológicas ou químicas, o que permite o desenvolvimento de produtos para
necessidades específicas (NITSCHKE; PASTORE, 2002, 2003).
Os biossurfactantes são moléculas de superfície ativa produzidas por
microrganismos, que possuem uma série de propriedades de importância comercial
de representativas vantagens sobre os surfactantes convencionais (BOGNOLO,
1999), tais como atividade superficial e interfacial. Os biossurfactantes são mais
eficientes e mais efetivos do que os surfactantes convencionais (detergentes
aniônicos sulfatados), pois produzem menor tensão superficial em menores
concentrações de biossurfactante (COOPER; PADDOCK, 1984). A concentração
micelar crítica (CMC) dos biossurfactantes varia entre 1-200014mg/L, enquanto que
a tensão interfacial (óleo/água) e superficial fica em torno de 1 e 30 mN/m,
respectivamente (BOGNOLO, 1999); tolerância à temperatura, pH e força iônica.
Alguns biossurfactantes apresentam elevada estabilidade térmica e de pH podendo
ser utilizados em ambientes com condições mais drásticas, como por exemplo, o
lipopeptídio de B. licheniformis JF-2, que é estável a temperaturas em torno de 75 °C
por até 140 h e pH entre 5 e 12 (HOROWITZ; GILBERT; GRIFFIN, 1990). Os
49
biossurfactantes suportam concentrações de até 10% de NaCl enquanto que uma
concentração salina de 2-3% é suficiente para inativar surfactantes convencionais
(BOGNOLO, 1999); biodegradabilidade, diferentes dos surfactantes químicos os
biossurfactantes são facilmente degradáveis na água e no solo, o que os torna
adequados para aplicações como biorremediação e tratamento de resíduos
(MULLIGAN; EFTEKHARI, 2003); baixa toxicidade. Os biossurfactantes têm
recebido maior atenção devido à crescente preocupação da população com os
efeitos alérgicos dos produtos artificiais (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998); além disto,
sua baixa toxicidade permite o uso em alimentos, cosméticos e produtos
farmacêuticos (GOUVEIA et al., 2003). Assim, os biossurfactantes vêm se tornando
uma grande opção para substituir os surfactantes sintéticos em um grande número
de operações industriais e processos ambientais (DESAI; BANAT, 1997;
MULLIGAN, 2005).
Entretanto, os biossurfactantes ainda não são amplamente utilizados na
indústria, devido ao seu alto custo de produção associado a métodos ineficientes de
recuperação do produto e ao uso de substratos caros (NITSCHKE; PASTORE,
2003). Um alto custo de produção de biossurfactante pode ser tolerado para uso em
pequenas quantidades como produtos cosméticos, medicinais, etc. Mas, aplicações
como recuperação de óleos, biorremediação de hidrocarbonetos e locais
contaminados por metais pesados requer altos volumes de surfactantes de baixo
preço, o que torna incompatível o uso de biossurfactantes (MAKKAR; CAMEOTRA,
2002). Porém, o sucesso da produção de biossurfactantes pode ser
significativamente conquistado pelo aperfeiçoamento de cepas, otimização da
composição do meio de cultivo através de métodos estatísticos e, principalmente,
pelo uso de matérias-primas facilmente disponíveis e de baixo custo, que é
considerado 10-30% do custo total da produção (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998;
MAKKAR; CAMEOTRA, 2002).
O gênero Pseudomonas tem recebido destaque por sua capacidade de
utilizar as mais variadas fontes de carbono para a produção de biossurfactantes,
entre elas estão o glicerol, manitol, frutose, n-parafina e óleos vegetais (BOULTON;
RATLEDGE,1987; RAZA et al., 2006), reduzindo, em média, a tensão superficial
(TS) e tensão interfacial (TIF) entre 30 e 1 mN/m, respectivamente, com um índice
de emulsificação (E24) acima de 70% (RAZA et al., 2006). Neste sentido, este
trabalho teve como objetivo avaliar a produção de biossurfactante de linhagens de
50
Pseudomonas spp. utilizando substratos alternativos como única fonte de carbono e
energia.
2 MATERIAIS E METÓDOS
2.1 Microrganismo
Foi utilizada a linhagem de Pseudomonas sp. Slim03 (nº de acesso
AF125317) e Pseudomonas fluorescens Slim15 (nº de acesso DQ417330) isoladas
no Parque Municipal de Mucugê, Município de Mucugê, Bahia. Ambas as linhagens
de bacterianas foram conservadas em triptic soyer agar (TSA) (Himedia) a 4ºC, no
Laboratório de Microbiologia Aplicada e Saúde Pública da Universidade Estadual de
Feira de Santana.
2.2 Inóculo
As linhagens bacterianas foram semeadas em TSA e incubadas a 30ºC por
24h. Em seguida, foi feito um novo repique a partir do cultivo anterior e semeado em
TSA por mais 24h. Após essa etapa, foi realizado uma suspensão bacteriana em
solução salina (0,9%), a partir da escala padrão de densidade ótica 1.0 (108 UFC
mL-1) no filtro de 600 nm (ROBERT et al., 1989, modificado).
51
2.3 Efeito de Substratos Alternativos na Produção de Biossurfactante
Foi realizado um inóculo de 3 mL da suspensão bacteriana em um erlenmeyer
de 500 mL contendo 100 mL de MSM (pH 7.0 ± 0.2) com as seguintes
concentrações de glicerol e dos óleos de milho e girassol: 0.5, 1, 2, 3% (p/v), como
única fonte de carbono e energia, correspondendo as taxas de 5, 10, 20 e 30 g/L,
respectivamente. Um erlenmeyer controle de 500 mL contendo 100 mL de MSM (pH
7.0 ± 0.2) não inoculado foi preparado para cada concentração de glicerol e dos
óleos vegetais. A amostra foi incubada no agitador orbital a 30°C (± 0.2°C), na
rotação de 180 rpm, por 5 dias. Alíquota de 2,5 mL do cultivo bacteriano foi retirado
a cada 24h de incubação e centrifugado (4000 rpm, 20 min, 10°C) para
determinação do índice de emulsificação (E24).
2.4 Índice de Emulsificação (E24)
O ensaio de emulsificação foi realizado usando 2 mL do caldo livre de células
e 2 mL de óleo mineral puro (Nujol), a base de hidrocarboneto de petróleo, foram
transferidos para tubos (100mm x 15mm). Em seguida, a mistura foi agitada no
vórtex (Ika®, MS1 Minishaker) durante 2 minutos e deixado em repouso por 24
horas. A produção de biossurfactante foi medida através do índice de emulsificação
(E24), dividindo a altura da camada emulsificada (mm) pela altura total da coluna
líquida (mm) e multiplicado por 100. O controle negativo foi realizado com 2 mL de
MSM não cultivado e o controle positivo com 2 mL de SDS (J.T.BAKER) a 1%. Os
resultados foram expressos em porcentagem (%) (IQBAL et al., 1995; DAS et al.,
1998).
52
2.5 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular
Foi determinada a relação entre crescimento celular e a produção de
emulsificado com a melhor concentração de substrato no tempo. Foi retirado
alíquotas de 3 mL do cultivo a cada 24h e transferido 2,5 mL para uma cubeta de
quartzo (Plastibrand) para leitura da densidade ótica (600 nm), no programa “simple
reads” do espectrofotómetro (Cary, 50 Probe), visando obter a concentração da
biomassa bacteriana, de acordo a curva de calibração do peso seco versus
absorbância. A produção de biossurfactante foi observada através da formação de
emulsificado, retirando alíquotas de 2,5 mL a cada 24h de incubação e centrifugado
a 4000 rpm, por 20 min, a 10°C, para a obtenção do caldo livre de células.
2.6 Concentração da Biomassa Bacteriana
As linhagens de bacterianas foram semeadas em TSA e incubadas na estufa
de crescimento a 30°C, por 24h. Posteriormente, as colônias bacterianas foram
transferidas para erlenmeyers de 500 mL, contendo 100mL do preparo de triptic
soyer broth (TSB), sob a agitação de 180 rpm, a 30°C, por 48h. O cultivo bacteriano
foi centrifugado a 4.000 rpm, por 20 minutos, e a biomassa bacteriana suspendida
em 5 mL de água destilada para realização da curva do peso seco versus
absorbância (600 nm) (SANTA ANNA et al., 2002) (Apêndice A).
2.7 Medida da Tensão Superficial
A tensão superficial (TS) do caldo livre de células das linhagens de
Pseudomonas spp., cultivadas por 48h em MSM com 0.5% dos respectivos
substratos, foi realizada no tensiômetro (DataPhysics, Oca15 plus), através do
método da gota pendente à temperatura ambiente. Um volume pré-determinado de
53
água destilada foi adicionado em uma cuba de quartzo (20 mL) e colocado na
superfície da plataforma do tensiômetro. Uma seringa com agulha invertida foi
submersa na água e um volume de ar aspirado para formar uma gota submergida. A
tensão superficial da superfície da gota foi medida usando um sistema de imagem
de vídeo automática e o programa Oca 10/Oca 20. O instrumento foi calibrado com
ar e água destilada para uma leitura de 71,62 ± 1.0 mN/m (FOX; BALA, 2000;
CHEN; BAKER; DARTON, 2007). A concentração de biossurfactante do caldo livre
de células foi expressa como concentração micelar crítica (CMC), sendo realizado
diluição seriada do caldo livre de células com água destilada, nas concentrações de
20, 40, 60, 80 e 100%. A CMC foi estimada graficamente pela comparação da TS
versus concentração (FOX; BALA, 2000). O controle negativo foi realizado com MSM
não cultivado, com as respectivas fontes de carbono analisadas, e água destilada, e
o controle positivo com SDS a 1%. Entre cada medida, a seringa, a agulha e a cuba
foram lavadas por três vezes com água, três vezes com acetona e seca (WEI;
CHOU; CHANG, 2005; CHEN; BAKER; DARTON, 2007).
2.8 Análise Estatística
Todos os testes de produção de biossurfactante foram realizados em
triplicata, visando comparar as tendências centrais de produção de biossurfactante
entre as linhagens de Pseudomonas spp. (CALLEGARI-JACQUES, 2003). Os
resultados foram avaliados através do teste de Kruskal-Wallis, usando o programa
estatístico GraphPad InsTat (versão 3), sendo considerado significativo quando o
valor de p foi menor que 0,05.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As duas linhagens de Pseudomonas spp. apresentaram produção de
biossurfactante usando todos os substratos alternativos testados como única fonte
54
de carbono e energia (Figura 1). Os óleos de milho e de girassol mostraram-se como
substratos promissores para produção de biossurfactante, apresentando índice de
emulsificação (E24) que variaram de 33 a 59%. O cultivo com os óleos vegetais
apresentou comportamento de produção de emulsificado diferenciado, com o óleo
de milho apresentando as melhores formações de emulsificado nas concentrações
de 0.5 e 1%, sendo que nas concentrações 2 e 3% houve uma produção inferior de
emulsificado, que só atingiram níveis similares de E24 entre 96 a 120h de incubação
para ambas as linhagens bacterianas, com exceção da concentração de 2% de óleo
de milho que apresentou formação de emulsificado similar a partir de 72h de cultivo
da linhagem de Pseudomonas sp. Slim03 (Figura 1). Tal fato pode estar relacionado
com o excesso de substrato no meio, pois dificulta o metabolismo de uma grande
parte de espécies bacterianas devido à inibição de reação de catálise enzimática
(HUGO; MENDIE; NASIPURI, 1998), o que reduz, consideravelmente, a produção
de biossurfactante. Porém, foi observado que à medida que a população bacteriana
crescia, ocorria uma mudança na tonalidade do meio de cultura com o respectivo
aumento da produção de biossurfactante (resultado não mostrado). Já o óleo de
girassol apresentou um comportamento similar de índice de emulsificação em todas
as concentrações testadas para a linhagem de P. fluorescens Slim15 e a linhagem
de Pseudomonas sp. Slim03 apresentou formação de emulsificado semelhante nas
concentrações de 0.5, 1 e 3% de óleo de girassol, apesar de que a concentração de
1% formou um pico maior de emulsificado quando comparado com as outras
concentrações testadas nas primeiras 24h de cultivo (Figura 1). Entretanto, o cultivo
da linhagem de Pseudomonas sp. Slim03 na concentração de 2% de óleo de
girassol apresentou uma lenta produção de emulsificado nas primeiras 72h,
atingindo taxas similares (0.5, 1 e 3%) de E24 entre 96 a 120h de incubação. Os
resultados mostram a capacidade das linhagens de Pseudomonas spp. de crescer e
produzir, eficientemente, biossurfactantes em diferentes concentrações de óleo de
girassol, emulsificando e estabilizando emulsões com vários tipos de óleos de
diferentes viscosidades, tais como óleo mineral (ACDelco, 5W-30), óleo mineral
(SAE, 40), óleo mineral (Helix, 25W-60) (resultado não mostrado) e óleo mineral
puro (Nujol). A habilidade de formar emulsões estáveis com óleos vegetais indica o
potencial uso destes biossurfactantes como agente emulsificante na indústria de
alimentos (RUJIRAVANIT et al., 2008).
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Horas
Figura 1: Comparação da produção de emulsificado com diferentes fontes de carbono no tempo: A1 - óleo de milho, B1 - óleo de girassol e C1 - glicerol para a linhagem de Pseudomonas sp. pDL01; A2 - óleo de milho, B2 - óleo de girassol e C2 - glicerol a linhagem de P. fluorescens 3B, nas concentrações de 0.5% ( ), 1% (¦), 2% ( ) e 3% (X) dos respectivos substratos.
56
Não houve diferença significativa do E24 nas quatro concentrações testadas
para o óleo de girassol e nem para as concentrações de 0.5 e 1% de óleo de milho
em 48h de cultivo. Porém, quando comparado com as concentrações de 2 e 3% de
óleo de milho, foi observada uma diferença significativa de formação de emulsificado
tanto em relação à concentração quanto ao tempo de cultivo. O cultivo com glicerol
apresentou excelente formação de emulsificado, sendo os maiores E24 (>54%)
atingidos em 48h de cultivo (Figura 1). O cultivo com glicerol apresentou
comportamento muito semelhante de formação de emulsificado em todas as
concentrações testadas para ambas as linhagens bacterianas, demonstrando que a
taxa do substrato não interfere no crescimento celular e na produção de
biossurfactante das espécies em estudo, o que pode estar relacionado com a
solubilidade do glicerol. Os valores encontrados não apresentaram diferença
significativa quando comparado com as concentrações testadas no tempo. Nenhum
crescimento bacteriano e índices de emulsificação foram obtidos nos frascos
controles não inoculados, com as respectivas fontes de carbono analisadas, e o
controle positivo, SDS a 1%, apresentou valor médio de índice de emulsificação de
65,13%. Os resultados confirmaram a habilidade das linhagens de Pseudomonas
spp. de utilizar substratos solúveis e insolúveis em água para a produção de
biossurfactante, corroborando com os resultados obtidos por Cooper e
colaboradores (1981). A concentração de 0.5% dos substratos alternativos e o
tempo de cultivo de 48h mostraram o grande potencial dos óleos vegetais e do
glicerol para a produção de biossurfactante, sendo os resultados superiores ou
semelhantes às outras concentrações (1-3%) no período de incubação de 72 a
120h. O resultado torna ainda mais viável e econômico a composição do meio,
visando o isolamento de linhagens de Peseudomonas spp. com esse potencial de
ambientes como do semi-árido. O uso de óleos vegetais e glicerol como fonte de
carbono para produção de biossurfactante parece ser uma alternativa interessante e
de baixo custo (BOULTON; RATLEDGE, 1987), sendo o glicerol indicado como uma
fonte de carbono mais apropriada para a produção de biossurfactante, do tipo
raminolipídeo, por linhagens de Pseudomonas aeruginosa do que a glicose
(GOUVEIA et al., 2003).
A utilização de diferentes substratos pelas linhagens de Pseudomonas spp.
mostrou uma estreita relação entre crescimento celular e a produção de emulsificado
no tempo, sendo a medida do crescimento celular expressa pela concentração de
57
biomassa e a atividade do biossurfactante pelo índice de emulsificação (E24). Para
ambas as linhagens bacterianas a produção de biossurfactante esteve associada ao
crescimento celular (Figura 2), confirmando a relação direta que existe entre a
utilização do substrato, crescimento celular e produção de biossurfactante (DESAI;
DESAI, 1993). O cultivo com óleo de milho (0,5%) apresentou a melhor biomassa
bacteriana nas primeiras 48h de cultivo para a Linhagem de Pseudomonas sp.
Slim03 (Figura 2) e a linhagem de P. fluorescens Slim15 teve o maior crescimento
celular em 24h de incubação (Figura 2), sendo que após a fase de crescimento
exponencial foi verificado um decréscimo gradativo da biomassa bacteriana das
linhagens testadas sem afetar estatisticamente os níveis de formação de
emulsificado. Os resultados demonstram a diferença de comportamento fisiológico
de ambas as linhagens bacterianas frente ao óleo de milho, o que não foi observado
no cultivo com óleo de girassol (0.5%), pois ambas as linhagens analisadas
formaram as melhores biomassa bacteriana em 24n de incubação (Figura 2).
Entretanto, o cultivo com glicerol apresentou o melhor crescimento celular entre 24 e
48h de incubação, sendo também verificado um decréscimo gradativo da biomassa
das linhagens bacterianas após a fase exponencial, mas sem afetar estatisticamente
os níveis de formação de emulsificado (Figura 2). O valor máximo do E24 foi atingido
com 48h de crescimento para ambas as linhagens bacterianas cultivadas com óleos
vegetais e glicerol (Figura 2), sendo que não houve diferença significativa de
formação de emulsificado após esse período de incubação. As linhagens de
Pseudomonas spp. apresentaram crescimento máximo entre 24 e 48h de cultivo,
sendo a maior concentração de biomassa observada para linhagem de
Pseudomonas sp. Slim03 cultivada no óleo de milho, que alcançou o valor de 0,0066
mg/mL. Estes resultados indicam que a produção de biossurfactantes pelos
microrganismos ocorre, predominantemente, durante a fase de crescimento
exponencial, sugerindo que o biossurfactante é produzido como um metabólito
primário, acompanhando a formação da biomassa celular (ABU-RUWAIDA et al.,
1991; AMIRIYAN et al., 2004).
Os resultados obtidos nos ensaios de produção de biossurfactante com
diferentes substratos alternativos mostram a capacidade de reduzir a tensão
superficial (TS) dos meios testados. O caldo livre de células das linhagens de
Pseudomonas sp. Slim03 e P. fluorescens Slim15 apresentou excelente redução da
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(A1)
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Figura 2: Variação da concentração da biomassa bacteriana (mg/mL) (¦ ) e do índice de emulsificação (%) ( ) com os substratos alternativos: A1 - óleo de milho a 0.5%, B1 - óleo de girassol a 0.5% e C1 - glicerol a 5% para a linhagem de Pseudomonas sp. pDL01; e A2 - óleo de milho a 0.5%, B2 - óleo de girassol a 0.5% e C2 - glicerol a 5% para a linhagem de P. fluorescens 3B.
59
TS da gota do meio com óleo de milho de 76,35 mN/m para 35,26 e 49,15 mN/m;
meio com óleo de girassol de 78,06 mN/m para 38,12 e 44,65 mN/m; e meio com
glicerol de 78,24 mN/m para 31,75 e 30,85 mN/m, respectivamente. Os óleos
vegetais analisados apresentaram grande potencial como substrato para a produção
de biossurfactantes por linhagens de Pseudomonas ssp., confirmando os relatos de
Wei, Chou e Chang (2005), quando analisaram a produção de biossurfactante de P.
aeruginosa usando diferentes óleos vegetais como substrato, entre eles girassol e
milho. Os óleos vegetais podem ser hidrolisados pela lipase de espécies de
Pseudomonas (MAIER; SOBERON-CHAVEZ, 2000) para formar ácidos graxos de
cadeia longa (AGCLs), composta de 12 a 18 carbonos (WEI; CHOU; CHANG, 2005).
Os AGCLs podem ser degradados via ß-oxidação para manter o crescimento celular
ou pode ser transformado em um precursor lipídico para promover a biossíntese de
biossurfactante (LANG; WULLBRANDT, 1999; MAIER; SOBERON-CHAVEZ, 2000).
Entretanto, a melhor taxa de produção de biossurfactante associado com a melhor
característica de superfície ativa foi observada com o glicerol como única fonte de
carbono. O uso de glicerol foi apontado como o substrato mais eficaz para redução
da tensão superficial dos meios testados, que pode ser facilmente observado
quando comparado com os óleos vegetais, corroborando com os resultados de
Santa Anna e colaboradores (2002), como a principal fonte de carbono para
produção de biossurfactantes por linhagens de Pseudomonas spp. O glicerol tem
recebido maior atenção devido ao crescimento da produção de biodiesel, pois esse
gera um excedente de glicerol, subproduto da fabricação do biocombustível, que
possui uma capacidade limitada de absorção de grandes quantidades do subproduto
pelos mercados tradicionais, tornando necessária a criação de novos produtos à
base de glicerol. O controle positivo, SDS a 1%, apresentou valor médio da TS da
gota de 40,04 mN/m. De acordo com o teste de Kruskal-Wallis, houve diferença
significativa (p<0,05) da TS da gota entre óleo de girassol e glicerol cultivados pela
linhagem de Pseudomonas sp. Slim03, e entre óleo de milho e glicerol cultivados
pela linhagem de P. fluorescens Slim15. A concentração micelar crítica (CMC) do
biossurfactante produzido pelas linhagens de Pseudomonas sp. Slim03 e P.
fluorescens Slim15 ficaram entre 90 a 100% para óleo de milho; entre 90 a 100% e
50 a 60% para óleo de girassol; e entre 10 a 20% para glicerol; respectivamente
(Figura 3). Como esperado, foi observado a redução da TS da gota com o aumento
da concentração do caldo livre de células. O resultado da TS apresentou grande
60
(A)
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
0 20 40 60 80 100
Concentração (%)
TS
(m
N/m
)
(B)
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
0 20 40 60 80 100Concentração (%)
TS
(m
N/m
)
(C)
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
0 20 40 60 80 100Concentração (%)
TS
(m
N/m
)
Figura 3: Tensão superficial (mN/m) versus concentração do caldo livre de células (%) de Pseudomonas sp. pDL01 ( ) e P. fluorescens 3B (¦): A - óleo de milho; B - óleo de girassol; e C - glicerol.
61
potencial, tendo em vista que a concentração de biossurfactante do caldo livre de
células equivale de cinco a dez vezes acima do valor da CMC de um biossurfactante
isolado (BATISTA et al., 2006).
As linhagens de Pseudomonas spp. analisadas são capazes de produzir
biossurfactante com eficiência a partir de fontes de carbono alternativas, sendo a
concentração de 0.5% dos substratos essencial para formar os maiores níveis de
emulsificado e uma ótima redução da tensão superficial. O glicerol apresentou a
melhor tensão superficial para ambas as linhagens bacterianas, aparecendo como
substrato promissor para a produção em massa de biossurfactante e abrindo mais
um mercado para absorver o glicerol formado na produção do biodiesel. O potencial
desses substratos alternativos pode viabilizar o aumento da produção de
biossurfactante, tendo em vista a disponibilidade e o baixo custo da matéria prima, o
que reduz sensivelmente os custos do produto final.
REFERÊNCIAS
AMIRIYAN, A. et al. Bioemulsan production by Iranian oil reservoirs microorganisms. Iranian Journal Env. Health Sci. Eng., v.1, n.2, p.28-35, 2004.
ABU-RUWAIDA, A.S. et al. Isolation of biosurfactant-producing bacteria product characterization, and evaluation. Acta Biotechnologica, v.4, p.315-24, 1991.
BANAT, I.M. Les biosurfactants, plus que jamais solicites. Biofutur, v.198, p.44-47, 2000.
BATISTA, S.B. Isolation and characterization of biosurfactant/bioemulsifier-producing bacteria from petroleum contaminated sites. Bioresource Technology, v.97, p.868-875, 2006.
BOGNOLO, G. Biosurfactants as emulsifying for hydrocarbons. Physicochem. Eng. Aspects, v.152, p.41-52, 1999.
62
BOULTON, C.; RATLEDGE, C. Biosynthesis of lipid precursors to surfactant production. In: KOSARIC, N.; CAIRNS, W.L.; GRAY, N.C.C. (Ed.) Biosurfactants and biotechnology. New York: Marcel Dekker Inc., 1987. p.47-87.
CALLEGARI-JACQUES, S.M. Bioestatística: princípios e aplicações. Porto Alegre: Artmed, 2003. 184p.
CAMEOTRA, S.S.; MAKKAR, R.S. Synthesis of biosurfactants in extreme conditions. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.50, p.520-529, 1998.
CHEN, C-Y.; BAKER, S.C.; DARTON, R.C. The application of a high throughput analysis method for the screening of potential biosurfactants from natural sources. Journal of Microbiological Methods, v.70, p.503-510, 2007.
COOPER, D.G. et al. Enhanced production of surfactin from B. subtilis by continuous product removal and metal cation additions. Appl. Environ. Microbiol., v.42, p.408-412, 1981.
COOPER, D.G.; PADDOCK, D. A. Production of a biosurfactant from Torulopsis bombicola. Applied and Environmental Microbiology, v.47, p.173-176, 1984.
DAS, M.; DAS, S.K.; MUKHERJEE, R.K. Surface active properties of the culture filtrates of a Micrococcus species grown on n-aalkenes and sugars. Biores. Technol., v.63, p.231-235, 1998.
DESAI, J.; DESAI, A. Production of biosurfactants. In: KOSARIC, N. (Ed.) Biosurfactants: production, properties and applications. New York: Marcel Dekker, 1993. p.65-97.
DESAI, J.D.; BANAT, I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Micriobiol. Mol. Rev., v.61, p.47-64, 1997.
FOX, S.L.; BALA, G.A. Production of surfactant from Bacillus subtilis ATCC 21332 using potato substrates. Bioresource Technology, v.75, p.235-240, 2000.
GOUVEIA, E.R. et al. Bactérias produtoras de biossurfactantes: produção de biossurfactantes por bactérias isoladas de poços de petróleo. Revista Biotecnologia e Desenvolvimento, v. 30, p. 39-45, jun. 2003.
63
GREEK, B.F. Detergent industry ponders product for new decade. Chem. Eng. News, v.68, p.37-38, 1990.
HOROWITZ, S.; GILBERT, J.N.; GRIFFIN, W.M. Isolation and characterization of a surfactant produced by Bacillus licheniformis 86. Journal of Industrial Microbiology, v.6, p.243-248, 1990.
HUGO, P.G.; MENDIE, V.E.; NASIPURI, R.N. Kinetics of growth caracteristics of micro-organisms in dextrose infusion solutions. International Journal or Phannaceutics, v.167, p.1-6, 1998.
IQBAL, S.; KHALID, Z.M.; MALIK, K.A. Enhanced biodegradation and emulsification of crude oil and hyperproduction of biosurfactants by a gamma rayinduced mutant of Pseudomonas aeruginosa. Lett. Appl. Microbiol., v.21, p.176-179, 1995.
LANG, S.; WULLBRANDT, D. Rhamnose lipid: biosynthesis, microbial production and application potential. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.51, p. 22-32, 1999.
MAIER, R.M.; SOBERON-CHAVEZ, G. Pseudomonas aerugionsa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.54, p.625-633, 2000.
MAKKAR, R.S.; CAMEOTRA, S.S. An update on the use of unconventional substrates for biosurfactant production and their new applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.58, p.428-434, 2002.
MULLIGAN, C.N.; EFTEKHARI, F. Remediation with surfactant foam of PCP-contaminated soil. Engineering Geology, v.70, p.269-279, 2003.
MULLIGAN, C.N. Environmental applications for biosurfactants. Environmental Pollution, v.133, p.183-198, 2005.
NITSCHKE, M.; PASTORE, G.M. Biossurfactantes a partir de resíduos agroindustriais. Revista Biotecnologia e Desenvolvimento, v.31, p.63-67, 2003.
RAZA, Z.A. et al. Improved production of biosurfactant by a Pseudomonas aeruginosa mutant using vegetable oil refinery wastes. Biodergard. 2006, doi:10.1007/s10532-006-9047-9.
64
ROBERT, M. et al. Effect of carbon source on biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa 4T1. Biotechnol Lett, v.11, p.871-874, 1989.
RUJIRAVANIT, R. et al. Structural and physicochemical characterization of crude biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa SP4 isolated from petroleum-contaminated soil. Bioresource Technology, v.99, p.1589-1595, 2008.
SANTA ANNA L.M. et al. Production of biosurfactants from Pseudomonas aeruginosa PA1 isolated in oil environments. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 19, n. 2, p. 159-166, 2002.
WEI, Y-H.; CHOU, C-L.; CHANG, J-S. Rhamnolipid production by indigenous Pseudomonas aeruginosa J4 originating from petrochemical wastewater. Biochemical Engineering Journal, n.27, p.146-154, 2005.
65
CONCLUSÃO GERAL
As duas linhagens bacterianas isoladas do solo rizosférico e adjacente de
Actinocephalus spp. pertencem ao gênero Pseudomonas. As linhagens
bacterianas possuem a capacidade de produzir biossurfactante, reduzindo a
tensão superficial e a tensão interfacial do meio e do óleo cru.
As condições ótimas de cultivo para produção de biossurfactante pelos
isolados bacterianos testados são MSM com 0.5% de glicose, pH 7.0,
temperatura na escala de 30-40ºC, no período de 24 a 48h.
O meio de cultura suplementado com glicerol, apresentou para ambas as
linhagens de Pseudomonas spp. os melhores resultados para a tensão
superficial.
O efeito do pH, da temperatura e do tipo de substratos são fatores
importantes para a produção de biossurfactante por linhagens de
Pseudomonas spp.
66
APÊNDICE A – Curva de crescimento bacteriano
1. Repicar a amostra bacteriana em TSA e incubar na estufa a 30ºC por 24h.
2. Realizar um novo repique a partir do cultivo crescido em 24h, seguindo o 1º
passo.
3. Retirar uma alçada do cultivo em TSA e inocular em um erlenmeyer (500 mL)
contendo 100 mL de TSB (2% glicose).
4. Incubar no shaker a 30°C, 180 rpm, por 48h (observe a turvação do meio).
5. Transferir o cultivo para tubos falcons de 50 mL e centrifugar (10°C, 4000
rpm, 20 min.).
6. Desprezar o sobrenadante, lavar a biomassa bacteriana com água destilada
(10 mL) e centrifugar (10°C, 4000 rpm, 20 min.).
7. Desprezar o sobrenadante, resuspender a biomassa bacteriana com água
destilada (5-10 mL) e realizar as seguintes diluições a partir da solução
bacteriana mãe:
7.1. Absorbância:
7.1.1. Realizar uma diluição de 1:10 (ou 1:20 vai depender da biomassa
bacteriana), sendo 1 mL da solução de biomassa bacteriana mãe e 9 mL de água
destilada.
7.1.2. A partir dessa diluição realizar novas diluições (duplicata), como a
seguir: 1:5 (1 mL da diluição bacteriana/4 mL de água destilada), 1:10 (500 µL/4,5
mL), 1:15 (500 µL/7 mL), 1:20 (500 µL/9,5 mL).
7.1.3. Transferir 2,5 mL das diluições para cubetas (Plastibrand) e realizar a
leitura da densidade ótica (600 nm), utilizando água destilada como branco.
7.2. Peso seco:
7.2.1. Pesar o papel de filtro (0,45 µm) na balança analítica (5 cascas
decimais) e colocar na placa de Petri com a identificação da diluição e da amostra
bacteriana.
7.2.2. Colocar a placa na estufa a 105°C, por 24h.
7.2.3. Realizar uma diluição a partir da solução de biomassa bacteriana mãe
(duplicata), como a seguir: 1:5 (1 mL da solução de biomassa bacteriana mãe /4 mL
de água destilada), 1:10 (500 µL/4,5 mL), 1:15 (500 µL/7 mL), 1:20 (500 µL/9,5 mL).
67
7.2.4. Filtrar as diluições (3-5 mL) nos respectivos papéis de filtro (aquecido
por 24h na estufa), através do sistema de vácuo.
7.2.5. Transferir os papéis de filtro para as suas respectivas placas e colocar
na estufa a 105°C, por 24h.
7.2.6. Pesar os papéis de filtro na balança analítica (5 cascas decimais).
8. Fazer um gráfico de dispersão com linha de tendência (interseção, equação e
valor de R-quadrado) entre o valor da massa seca (eixo Y) e o valor da
densidade ótica (eixo X), sendo que o valor de confiança foi de R2 = 0,8
(Figura 1).
y = 0,0012x
R2 = 0,9714
0,00000
0,00100
0,00200
0,00300
0,00400
0,00500
0,00000 1,00000 2,00000 3,00000 4,00000
DO (600 nm)
Bio
ma
ssa
Ba
cte
ria
na
(g)
y = 0,001x
R2 = 0,9598
0,00000
0,00100
0,00200
0,00300
0,00400
0,00500
0,00600
0,00000 1,00000 2,00000 3,00000 4,00000 5,00000
DO (600 nm)
Bio
mas
sa B
acte
riana
(g)
Figura 1: Curva do peso seco versus absorbância dos isolados Slim03 ( ) e Slim15 (¦).
68
ANEXO A – Extração de DNA bacteriano
1. Obter uma massa de células de uma cultura crescida em caldo LB por 16-
24h;
2. Acrescentar 400uL de tampão de extração (Tris-Hcl 200mM pH7,5; NaCl
250mM; EDTA 25mM, pH8,0; e SDS 0,5%), vortexar e deixar a temperatura
ambiente por 15 min.;
3. Acrescentar 200uL de acetato de potássio (3M);
4. Homogeneizar vertendo os tubos 40 vezes;
5. Centrifugar a 13.000 rpm por 10 min.;
6. Transferir 400uL para outro tubo e acrescentar 400uL de Clorofórmio-álcool
isoamílico (24:1);
7. Homogeneizar vertendo os tubos 40 vezes;
8. Centrifugar a 13.000 rpm por 10 min., recuperar o sobrenadante e transferir
para outro tubo do tipo eppendorf de 2,0mL;
9. Acrescentar 75% do volume de Isopropanol, conservado a -20°C, e 25% de
acetato de amônia 10M;
10. Homogeneizar vertendo os tubos 5 vezes;
11. Deixar a -80ºC por 15 min.;
12. Centrifugar por 30min. e descartar o sobrendante;
13. Lavar o pellet com etanol a 70%, conservado a -20°C, por 3 vezes,
centrifugando por 5 min. a cada lavagem cada;
14. Deixar o pellet secar e ressuspender em 50uL de TE (Tris 10mM, pH: 8,0 /
EDTA1mM, pH: 8,0) ou água MiliQ estéril;
15. Armazenar a -20ºC.
69
ANEXO B – Reação em cadeia da polimerase (PCR)
1. As reações individuais foram compostas de:
Tampão de reação (100 mM Tris-HCl) 2,5 L
MgCl2 (50mM) 1,25 L
DNTPs (10mM) 0,5 L
Iniciador fD1 (10 pmol) 0,25 L
Iniciador rP2 (10 pmol) 0,25 L
Taq polimerase (5 U/ L) 0,125 L
DMSO 0,5 L
Betaina (5M) 5 L
BSA 0,25 L
Água destilada 12,4 L
DNA extraído 2,475 L
2. A reação foi realizada em 35 ciclos, nas seguintes condições:
Pré-desnaturação 3 minutos 95°C
Desnaturação 45 segundos 95°C
Anelamento 45 segundos 59°C
Extensão 1 minuto 72°C
Extensão 5 minutos 72°C
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