UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS · diversidade de fungos endofíticos associados a Goniorrhachis marginata e Cavanillesia arborea e sua produção de ácido abscísico (ABA)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – CCBS

Departamento de Biologia Geral

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – PPGCB

Laboratório de Microbiologia Ambiental

PATRÍCIA MENDONÇA MOREIRA PENNA

DIVERSIDADE E PRODUÇÃO DE ÁCIDO ABSCÍSICO POR FUNGOS

ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS A Goniorrhachis marginata Taub. E Cavanillesia

arborea K. Shum

MONTES CLAROS

2012








arborea K. Shum

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação Stricto Sensu em Ciências

Biológicas da Universidade Estadual de

Montes Claros como requisito para obtenção

do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Biologia e

Conservação

Orientador: Prof. Dr. Henrique Maia

Valério

MONTES CLAROS

2012








arborea K. Shum

Banca Examinadora:

Dr. Henrique Maia Valério

Dra. Betânia Paiva Drumond

Dr. Marcílio Fagundes





Aos meus familiares e amigos,

DEDICO





AGRADECIMENTOS

A Deus, a Nossa Senhora Aparecida e ao menino Jesus de Praga, pela luz, amparo e

pela graça de concluir este trabalho;

À minha família, em especial à minha mãe Sílvia, pela dedicação incondicional, aos

meus irmãos Renata, Gustavo e à minha cunhada Karen pelo apoio de todas as horas;

Ao André Quintino, pela grande contribuição, carinho e incentivo;

Aos meus colegas e amigos do Laboratório de Microbiologia Ambiental da Unimontes,

por esses anos de convivência amigável, pela ajuda e pelas horas de descontração no

laboratório e nas coletas em campo: Beatriz, Bianca, Claudia, Eloá, Fabiana, Fernanda,

France Anne, Henrique Mineiro, Mariana, Pollyana e Vinícius;

Ao meu orientador Henrique Maria Valério pela orientação, paciência e por partilhar

conosco sua valiosa experiência na Microbiologia;

A todos os colegas e amigos do Laboratório de Bioprospecção e Recursos Genéticos,

pelo auxílio técnico e amizade;

Ao Magnel, André, Lucket e Serapas pelas contribuições nas análises estatísticas;

Ao Zé Luis do IEF, pela participação nas coletas no PEMS;

À Malu da Biomm por ter cedido materiais e bibliografia sobre HPLC;

À Marcela pela participação nas análises em HPLC;

Ao professor Geraldo Aclécio por dividir seus conhecimentos sobre HPLC;

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de

Montes Claros, pela oportunidade;





À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela bolsa

de estudos concedida;

Aos membros da banca avaliadora: Betânia Paiva Drumond e Marcílio Fagundes, pelas

contribuições;

A todos os meus colegas, professores e amigos das Ciências Biológicas que não tiveram

seus nomes citados, mas que foram presentes nessa longa caminhada e contribuíram,

cada um à sua maneira, para a conclusão deste trabalho.





"De tudo ficam três coisas:

A certeza de que estamos sempre começando

A certeza de que é preciso continuar

E a certeza de que podemos ser interrompidos antes de terminar.

(Portanto, devemos:)

Fazer da interrupção um caminho novo,

Fazer da queda um passo de dança...

do medo, uma escada

do sonho, uma ponte

da procura, um encontro.”

(Fernando Sabino)





RESUMO

Fungos endofíticos são microrganismos que colonizam o interior de tecidos vegetais em

pelo menos uma fase do desenvolvimento e estabelecem uma relação que

aparentemente não oferece danos ao hospedeiro. A interação com fungos endofíticos

está presente na maioria das espécies de plantas e tem influência em seus mecanismos

biológicos como produção de metabólitos secundários e defesa contra herbívoros e

patógenos. Há perspectivas de que os fungos endofíticos possam ocorrer amplamente

em florestas tropicais devido à ampla diversidade de espécies vegetais e aos vários tipos

de vegetações presentes destes locais. Este trabalho teve como objetivo avaliar a

diversidade de fungos endofíticos associados a Goniorrhachis

marginata e Cavanillesia arborea e sua produção de ácido abscísico (ABA) ao longo

do ciclo de enfolhamento das duas espécies arbóreas. Os fungos endofíticos foram

isolados de folhas de 10 indivíduos das duas espécies e agrupados em morfoespécies. A

produção de ABA pelos fungos foi detectada por meio de cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC). A partir do material foliar coletado de C. arborea e G. marginata foi

obtido um total de 179 isolados de fungos endofíticos, agrupados em 31

morfoespécies. A abundância de fungos endofíticos isolados foi significativamente

maior em folhas maduras em relação a folhas jovens para ambas as espécies arbóreas,

corroborando com outros trabalhos. A comunidade de fungos de C. arborea diferiu da

comunidade de fungos isolados de G. marginata. O mesmo foi observado em relação à

comunidade de fungos isolados de folhas jovens e maduras das duas espécies arbóreas,

demonstrando que houve uma influência da variação temporal nessas comunidades. Em

relação à produção de ABA, das 33 morfoespécies caracterizadas neste trabalho, 15

foram produtoras deste fitormônio. A produção de ABA por fungos endofíticos pode

estar relacionada a uma estratégia de colonização utilizada pelos fungos analisados,

pois, como já foi demonstrado em outros estudos, com o aumento das concentrações de

ABA, as folhas se tornam mais susceptíveis à infecção e a colonização perene.

Palavras-chave: Fungos endofíticos; produção de biomoléculas; ácido

absísico; Goniorrhachis marginata; Cavanillesia arborea





ABSTRACT

The endophytic fungi are microorganisms that settle the inner part of the plant tissues in

at least one phase of their development and establish a relationship that apparently is not

harmful to the hosts. The interaction with endophytic fungi is present in most of the

plant species and has influence in their biological mechanisms as the production of

secondary metabolites and the defense against herbivores and pathogens. There are

some perspectives that the endophytic fungi can occur widely in rain forests due to the

high diversity of plant species and to the several kinds of vegetation present in these

places. This paper aimed to evaluate the endophytic fungi diversity associated

with Goniorrhachis marginata and Cavanillesia arborea and their abscisic acid

production (ABA) throughout the foliage cycle of the two species of

trees. The endophytic fungi were isolated from leaves of 10 individuals of both species

and grouped into morphospecies. The ABA production by the fungi was detected by

liquid chromatography (HPLC). From the leaf material collected

from C arborea and G. marginata it was obtained the total of 179 isolated endophytic

fungi grouped into 31 morphospecies. The abundance of endophytic fungi

isolated was significantly higherin mature leaves over young leaves for both tree

species, corroborating with other studies. The fungi community of C.arborea differed

from the fungi community isolated from G. marginata. The same was observed

in relation to the fungi community isolated from young and mature

leaves of the two tree species, demonstrating that there was an influence of temporal

variation in these communities. Regarding the ABA production, from the 33

morphospecies characterized in this study, 15 produced this phytohormone. The

production of ABA by the endophytic fungi may be related to a colonization strategy

used by the analyzed fungi, as it has already been demonstrated in other studies, with

the ABA increasing concentrations, the leaves become more susceptible to infection and

perennial colonization.

Keywords: Endophytic fungi; biomolecules production; abscisic acid;

Goniorrhachis marginata; Cavanillesia arborea





SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................14

1.1 Fungos endofíticos .......................................................................................................... 14

1.2 Diversidade de fungos endofíticos ................................................................................... 16

1.3 Produção de biomoléculas por fungos endofíticos ........................................................... 19

1.4 Produção de ácido abscísico por fungos ............................................................................. 21

2 OBJETIVOS .................................................................................................................... 23

2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 23

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 23

3 METODOLOGIA ............................................................................................................ 24

3.1 Descrição das espécies estudadas .................................................................................... 24

3.2 Área de estudo ................................................................................................................ 25

3.3 Procedimento de coleta de folhas..................................................................................... 26

3.3 Isolamento de fungos endofíticos. ................................................................................... 26

3.5 Identificação de fungos endofíticos ................................................................................. 28

3.6 Detecção da produção de aba por meio de cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(HPLC) ................................................................................................................................. 29

3.7 Análise estatística ............................................................................................................ 31

4 RESULTADOS ................................................................................................................ 33

5 DISCUSSÃO.........................................................................................................................42

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS..............................................................................................50

7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 51

8 APÊNDICES.........................................................................................................................59

8.1 APÊNDICE 1. Espécie arbórea Goniorrhachis marginata Taub .......................................59

8.2 APÊNDICE 2. Espécie arbórea Cavanillesia arborea K. Shum.........................................60

8.3 APÊNDICE 3. Exemplos de morfoespécies isoladas de Goniorrhachis marginata e

Cavanillesia arbórea..................................................................................................................61





LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Corte das folhas ........................................................................................................28

Figura 2 – Fungos endofíticos crescendo a partir do tecido foliar .............................................28

Figura 3 – Curva de calibração para o padrão do Ácido Abscísico (ABA) ...............................31

Figura 4 – Número de isolados de Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata na

1ª e 2ª coleta ................................................................................................................................33

Figura 5 – Curva de acumulação de espécies mostrando a riqueza de endofíticos em função do

número de indivíduos amostrados de Goniorrhachis marginata................................................34

Figura 6 – Curva de acumulação de espécies mostrando a riqueza de endofíticos em função do

número de indivíduos amostrados em Cavanillesia arborea......................................................35

Figura 7 – Riqueza de fungos endofíticos isolados em Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata

em folhas jovens e maduras.........................................................................................................37

Figura 8 – Gráfico de estrutura das comunidades de folhas jovens e maduras de Cavanillesia

arborea e Goniorrhachis marginata ..........................................................................................38

Figura 9 – Gráfico de estrutura das comunidades de folhas jovens e maduras de Cavanillesia arborea e

Goniorrhachis marginata............................................................................................................39

Figura 10 – Concentração de ácido abscísico (mg/mL) produzido por fungos endofíticos

isolados de Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata em folhas jovens e folhas

maduras.......................................................................................................................................41





LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Ocorrência e abundância de morfoespécies/espécies isoladas de folhas de

Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata......................................................................36

Tabela 2 – Valores de Wald stat e p para riqueza em função da idade foliar e espécie

arbórea.............................................................................................................................. ...........38

Tabela 3 – Valores de Wald stat e p para abundância em função da idade foliar e espécie

arbórea.........................................................................................................................................39

Tabela 4 – Fungos produtores de ABA, isolados de folhas jovens e maduras de Cavanillesia

arborea e Goniorrhachis marginata...........................................................................................40

Tabela 5 – Valores de Wald stat e p para ácido abscísico (ABA) em função da idade foliar e

espécie arbórea............................................................................................................................41





LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ABA Ácido Abscísico

ABD Agar Batata Dextrose

ANOSIM Analysis of Similarities

ATCC American Type Culture Collection

CBMAI Coleção Brasileira de Microrganismos de Ambiente e Indústria

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

IEF-MG Instituto Estadual de Florestas de Minas Gerais

NMDS Escalonamento Multidimensional Não Métrico

PEMS Parque Estadual Mata Seca

UFPE Universidade Federal de Pernambuco

Unimontes Universidade Estadual de Montes Claros

URM University of Recife Mycology

UV Ultravioleta

http://www.atcc.com/





14

1. INTRODUÇÃO

1.1. Fungos endofíticos

Microrganismos endofíticos são definidos como fungos e bactérias que

colonizam o interior de tecidos vegetais em pelo menos uma fase de seu

desenvolvimento sem causar nenhum dano aparente ao hospedeiro (SAIKKONEN et

al., 1988; ESPINOSA-GARCIA; PETRINI, 1991; HERRE et al., 2007). A colonização

de fungos endofíticos ocorre em diversas estruturas das plantas como folhas

(CARROLL, 1988; SPYREAS et al., 2001; PIMENTEL et al., 2006), caules

(CARROLL, 1988; JOHNSON et al., 1992; SILVA et al., 2006), raízes

(KERNAGHAN et al., 2003; DESHMUNKH et al., 2006), sementes e frutos

(CIPOLLIN e STILES, 1993; RODRIGUES e MENEZES, 2002).

A transmissão de fungos endofíticos aos tecidos vegetais pode ocorrer

verticalmente por meio de sementes (SCHULZ e BOYLE, 2005) ou horizontalmente

por meio da penetração de esporos no tecido (CARROLL, 1988). Os esporos fúngicos

se movem no ambiente em grande parte por meio de correntes de ar. Depois de

germinados os esporos, os fungos podem infectar o tecido vegetal por meio de

haustórios e apressórios, penetrando diretamente através da parede celular (STONE et

al., 1987) ou por meio dos estômatos e da câmara subestomática (CABRAL et al.,

1993). A colonização endofítica pode ser limitada a células únicas, ser localizada ou

sistêmica e tanto inter quanto intracelular (STONE et al., 2000).





15

Estudos levam a crer que grande parte ou mesmo a totalidade das plantas

superiores sejam colonizadas por fungos endofíticos e que seus tecidos sadios possam

estar acometidos por infecções assintomáticas (ABREU, 2005; FAETH e FAGAN,

2002; FAETH, 2002). A presença de fungos endofíticos é comprovada em todas as

gimnospermas e angiospermas examinadas, contudo a maioria dos estudos está

concentrada nas gramíneas (AZEVEDO et al., 2000).

Cada espécie de planta apresenta geralmente cerca de quatro espécies de

endofíticos, mas a densidade de fungos pode variar grandemente entre indivíduos e

dentro de um mesmo indivíduo (WILSON e FAETH, 2001). Mesmo que um

determinado endofítico seja capaz de infectar múltiplas espécies hospedeiras, suas

interações podem demonstrar especificidade funcional ou ecológica. Um endofítico de

uma espécie hospedeira quando é capaz de colonizar uma segunda, pode não interagir

com ambos os hospedeiros de maneira similar (AGRIOS, 2005).

As interações entre fungos endofíticos e plantas podem variar de comensalismo

(DECKERT et al., 2001) a mutualismo (REDMAN et al., 2002) e até mesmo um

fitopatógeno latente pode estabelecer colonização como fungo endofítico em alguma

etapa de seu desenvolvimento (PHOTITA et al., 2004). Apesar da ampla ocorrência,

pouco se sabe sobre a influência destas interações, principalmente para as plantas

(FAETH, 2002; HERRE et al., 2007). Do ponto de vista dos fungos, os principais

benefícios da associação são nutricionais e também incluem proteção contra estresses

abióticos e benefícios quanto à reprodução e dispersão (RUDGERS et al., 2004). Por





16

outro lado as plantas, sua estrutura e as funções biológicas são influenciadas de

maneiras complexas e ainda pouco conhecidas (PETRINI, 1991).

Muitas espécies de fungos endofíticos produzem (STROBEL, 2003) ou induzem

a planta hospedeira a produzir metabólitos primários e secundários (CLAY et al.,

1985). Dentre estes metabólitos, destacam-se compostos anti-herbívoros, antifúngicos,

antibacterianos (LU et al., 2000; STROBEL et al., 2001; TAECHOWISAN et al., 2003)

e fitormônios que atuam na queda de folhas, na translocação de nutrientes em plantas

lenhosas perenes (WILSON e CARROLL, 1997), e na fotossíntese (SCHULZ, et al

2002). Através da produção e indução da produção destes metabólitos, a presença

desses fungos pode aumentar o “fitness” das plantas hospedeiras, aumentando a sua

resistência a estresses abióticos (REDMAN et al., 2002) e bióticos (ARNOLD et al.,

2003).

Os fungos endofíticos podem afetar a composição da comunidade vegetal,

sucessão e ciclagem de nutrientes (DAVITT et al., 2010), contudo este papel ainda está

longe de ser reconhecido ou completamente compreendido.

1.2. Diversidade de fungos endofíticos

Os fungos endofíticos são amplamente distribuídos dentro dos tecidos das

plantas e possuem alta diversidade (GENNARO et al., 2003). A estimativa da

diversidade de fungos endofíticos é de aproximadamente um milhão de espécies,

correspondendo a uma média de quatro endofíticos para cada uma das 250.000 espécies





17

de plantas descritas (GANLEY et al., 2004). Os fungos endofíticos são ascomicetos,

basidiomicetos, deuteromicetos e oomicetos, apresentando alta especificidade quanto à

planta hospedeira ou podem ser colonizadores mais generalistas (SAIKKONEN, 1998).

As distinções entre fungos endofíticos, epifíticos e fitopatogênicos são

meramente didáticas, uma vez que pode ocorrer sobreposição entre esses grupos

microbianos. Embora os epifíticos ocorram na superfície dos vegetais, muitos destes

microrganismos podem, eventualmente, colonizar o interior da planta por certo período

(AZEVEDO, 1999), assim é comum encontrar em comunidades de fungos endofíticos

uma variedade de espécies descritas como epifíticas incluindo Alternaria alternata,

Cladosporium cladosporioides, Epicoccum purpurascens (PETRINI, 1991). Além disto,

são comumente relatados taxas de fungos endofíticos pertencentes a grupos de fungos

compostos tanto por endofíticos quanto por parasitas morfologicamente semelhantes

(GANLEY et al., 2004), podendo os endofíticos ser, em muitos casos, parasitas em uma

fase latente dentro do hospedeiro (AZEVEDO, 1999).

Alguns fatores podem influenciar a diversidade e a composição das espécies dos

endofíticos em seus hospedeiros, tais como condições do micro-habitat e

microclimáticas, altitude, densidade da copa do hospedeiro e o próprio hospedeiro

(KUMARESAN e SURYANARAYNAN, 2001; ARNOLD e HERRE, 2003).

Existe uma relação positiva entre precipitação e colonização de endofíticos

foliares. Isso foi evidenciado em estudos com folhas de Rhizophora apiculata B1. e

Rhizophora mucronata Lamk, espécies típicas de mangues na Índia. Trezentos

segmentos foliares de cada espécie de planta foram amostrados durante os meses secos





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e chuvosos e os resultados indicaram uma diferença significativamente maior na taxa de

colonização nos meses chuvosos em relação ao período seco (SURYANARAYANAN

et al., 1998).

Outro fator que pode influenciar a riqueza de fungos endofíticos é a idade foliar.

De modo geral há uma tendência crescente de infecção com o envelhecimento do tecido

foliar, que ocorre possivelmente devido a re-infecções em tecidos do hospedeiro ou à

propagação contínua de fungos endofíticos com o crescimento do tecido depois que o

tecido jovem foi infectado (BERTONI e CABRAL, 1988; STONE, 1987; FRÖHLICH

et al., 2000).

Em ambientes tropicais, os trabalhos com fungos endofíticos são escassos

(RODRIGUES e PETRINI, 1997; AZEVEDO et al., 2000). A maioria dos estudos

realizados até recentemente está relacionada a hospedeiros de regiões temperadas.

Porém, nos últimos anos tem se descoberto uma grande diversidade destes

microrganismos provenientes de hospedeiros vegetais de regiões tropicais. Muitos

destes fungos não foram ainda classificados, podendo pertencer a novos gêneros e

espécies (CHAREPRASERT et al., 2006). Há perspectivas de que os fungos endofíticos

possam ocorrer amplamente em florestas tropicais devido à ampla diversidade de

espécies vegetais, aos vários tipos de vegetação e à grande quantidade de fungos

sapróbios presentes destes locais (RODRIGUES e PETRINI, 1997).

Entender a diversidade de fungos endofíticos tem diversas implicações para os

ecólogos de microrganismos que procuram compreender os aspectos básicos das

associações planta-fungos, para os agricultores que procurem aplicar endofíticos em





19

programas de controle biológico, bioprospectores em busca de novos metabólitos

secundários; micologistas interessados na elucidação da estrutura de vida de fungos

associados às árvores e os biólogos evolucionistas que procuram compreender as

origens evolutivas, a estabilidade e o futuro da interação entre as espécies (ARNOLD,

1997).

1.3. Produção de biomoléculas por fungos endofíticos

Um aspecto que tem sido ainda pouco explorado em relação aos microrganismos

endofíticos são as biomoléculas produzidas por eles durante o processo de interação,

questão intimamente correlacionada à vasta biodiversidade fúngica e à especificidade

nas colonizações das plantas hospedeiras por fungos. O estudo dessas interações entre

plantas e microrganismos e a produção de biomoléculas resultante dessas interações,

além de contribuir para o entendimento de muitos processos bioquímicos na natureza e

na ecologia, pode resultar na descoberta e utilização de fontes alternativas de

substâncias de interesse para a humanidade (SANTOS et al., 2008).

Os fungos endofíticos produzem ou induzem a produção de metabólitos

primários e secundários que se destacam por melhorar o desempenho de seu hospedeiro,

protegendo-o de herbívoros, patógenos e situações ambientais adversas (CLAY et al.,

1985).

As vantagens da interação com fungos endofíticos para as plantas são

diversas. Uma vantagem considerável da interação é provavelmente a proteção contra

herbívoros pelos alcalóides tóxicos produzidos na associação. Além disso, o fungo pode





20

mediar uma resistência induzida, ou seja, como uma extensão da hipótese de

mutualismo defensivo, a ativação da defesa do hospedeiro através de resistência

constitutiva e induzida (BULTMAN e MURPHY, 2000). Há ainda estudos que

comprovaram a ação antifúngica, ou seja, a produção de substâncias que evitam a

colonização do hospedeiro por fungos fitopatogênicos (TAECHOWISAN et al., 2003),

assim como a ação antagônica contra bactérias fitopatogênicas (LU et al., 2000),

evitando a formação de cancros (SMITH et al., 1996).

Fungos e bactérias, além dos vegetais superiores, também podem

sintetizar alguns reguladores de crescimento vegetal como: auxina, giberelina, ácido

abscísico e citocinina, podendo, assim, influenciar nos processos fisiológicos que

ocorrem em suas plantas hospedeiras (ERGÜN et al., 2002). Os metabólitos que têm

sido isolados de fungos endofíticos pertencem a diversos grupos estruturais, incluindo

esteróides, xantonas, fenóis, isocumarinas, derivados de perileno, quinonas, terpenos,

depsipeptídeos e citocalasinas (KÖNIG et al., 1999).

1.4. Produção de Ácido Abscísico por fungos

O ácido abscísico (ABA) é um composto secundário da classe dos terpenóides e

é um hormônio vegetal responsável por regular várias funções fisiológicas na planta

como a indução de respostas adaptativas ao déficit hídrico e às baixas temperaturas, a

regulação da dormência em sementes, da senescência e abscisão foliar (LEUNG e

GIRAUDAT, 1994; ZEEVAART, 1999). A produção de ácido abscísico também é





21

realizada por algas e alguns fungos, principalmente os fitopatogênicos (ORITANI e

KIYOTA, 2003; HARTUNG e GIMMER, 1994).

A capacidade que alguns fungos possuem de produzir hormônios vegetais como

o ABA e Giberelinas está relacionada à interação destes microrganismos e seus

hospedeiros e pode ter sido adquirida por meio da transferência horizontal de genes das

plantas para os fungos (CHAPMAN e REGAN, 1980). A presença de ABA nos tecidos

da planta pode influenciar a susceptibilidade à infecção por fungos porque esse

hormônio ocorre uma diminui a atividade de defesa das plantas. Através de testes em

tomate (Lycopersicon esculentum) foi possível observar que a infecção dessa espécie

por fungos patogênicos causou o aumento significativo nos níveis de ABA da planta.

Provavelmente o fungo começa a produzir ABA ou a planta é estimulada pelo fungo a

produzir ABA para que ocorra o enfraquecimento/bloqueio de suas defesas metabólicas

sistêmicas (KETTNER e DÖRFFLING, 1995).

Diversos estudos têm sido realizados com fungos fitopatogênicos para avaliar a

produção de ABA e sua possível influência na colonização e infecção das plantas. A

espécie mais utilizada nesses estudos é o fungo Botrytis cinerea. O foco principal dessas

investigações é a identificação de genes envolvidos na via biossintética utilizada por

fungos na produção desse composto (SIEWERS et al., 2004). Essas ferramentas são

úteis no estudo da biossíntese de ABA com outras espécies de fungos.

Este trabalho objetivou avaliar a comunidade de fungos endofíticos associados a

duas espécies arbóreas (Apêndice 1) que ocorrem em uma Floresta Tropical Seca, bem

como sua produção de ABA, permitindo uma maior compreensão da ecologia e dos





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mecanismos de interação entre plantas e microrganismos e da biodiversidade em regiões

tropicais, pouco descrita na literatura.





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2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar a diversidade de fungos endofíticos associados a Goniorrhachis marginata e

Cavanillesia arborea e sua produção de ácido abscísico.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar se há diferença na diversidade de fungos endofíticos isolados de

Goniorrhachis marginata e Cavanillesia arborea;

- Avaliar se a idade foliar tem influência sob a riqueza e abundância de fungos

endofíticos de Goniorrhachis marginata e Cavanillesia arborea;

- Avaliar a frequência de colonização por fungos endofíticos nas duas espécies arbóreas.

- Avaliar se há diferença na produção de ácido abscísico de fungos isolados de folhas

jovens e folhas maduras de Goniorrhachis marginata e Cavanillesia arborea;

- Avaliar se há diferença na produção de ácido abscísico entre fungos isolados de

Goniorrhachis marginata e Cavanillesia arborea;





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3. METODOLOGIA

3.1. Descrição das espécies hospedeiras

Um importante critério utilizado para a escolha de plantas alvos para o

isolamento de fungos endofíticos é a seleção de plantas presentes em ecossistemas

únicos e/ou adaptadas a condições limitantes de sobrevivência, quando comparadas à

maioria das plantas terrestres (STROBEL et al., 2004). Além disto, outro critério a ser

considerado é a escolha de plantas cujo desenvolvimento se dá em regiões de grande

biodiversidade, tais como em florestas temperadas e tropicais (ARNOLD et al., 2000;

STROBEL, 2003).

A escolha das espécies se baseou nestes critérios e no fato de possuírem um

número considerável de indivíduos na área de estudo.

Goniorrhachis marginata Taub

A Goniorrhachis marginata Taub (Leguminosae-Caesalpinioideae) (Apêndice

1) é uma espécie arbórea da família das de nome popular Itapicurú. O porte varia de

médio a grande, podendo chegar a 30 metros de altura. Possui folhas compostas,

pinadas, providas de dois pares de folíolos compostos, rígido-membranáceos, venoso-

reticulados, glabros e com margem espessa. O período de florescência da G. marginata

ocorre durante os meses de Janeiro a Março. Essa espécie tem distribuição geográfica

no Sul da Bahia, Norte do Espírito Santo, Vale do rio Doce em Minas Gerais, na Mata





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Pluvial Atlântica e no Vale do São Francisco nos estados de Minas Gerais, Bahia e em

Pernambuco, na caatinga arbórea (LORENZI, 2002).

Cavanillesia arborea K. Schum

A espécie Cavanillesia arborea K. Schum (Apêndice 2), também conhecida

popularmente como barriguda-branca ou barriguda-lisa, é uma planta da família

Malvaceae, encontrada predominantemente no Nordeste Brasileiro, desde o Piauí até o

Oeste da Bahia, Norte de Minas Gerais e Leste de Tocantins e em matas secas (caatinga

arbórea) sobre solos calcários de boa fertilidade, como o vale do Rio São Francisco.

Apresenta freqüência elevada, porém inconstante ao longo de sua área de ocorrência. C.

arborea possui folhagem decídua durante o período seco do ano, que pode variar de 8 a

9 meses; suas folhas são alternas, simples, em número de 6 a 10 por ramo,

subtomentosas na face dorsal e glabras na face ventral. C. arborea floresce durante os

meses de Agosto a Setembro com as plantas sem folhas; já seus frutos amadurecem de

Setembro a Outubro (LORENZI, 2002).

3.2. Área de estudo:

As espécies de plantas selecionadas para o estudo ocorrem no Parque Estadual

Mata Seca (PEMS), localizado no Vale do Médio São Francisco entre as coordenadas

14°97’02”S, 43°97’02”W e 14°53’08”S, 44°00’05”W. O PEMS está sob

responsabilidade do Instituto Estadual de Florestas de Minas Gerais (IEF-MG), abrange





26

área de cerca de 15.000 ha, onde são encontradas formações vegetais como florestas

perenifólias nas várzeas dos rios, florestas semideciduais em terrenos mais altos ao

longo dos rios e florestas deciduais em solos litólicos, podzólicos, latossolos e

cambissolos (IEF, 2000).

3.3. Procedimento de coleta de folhas:

Os indivíduos de G. marginata e C. arborea foram selecionados aleatoriamente,

totalizando 10 indivíduos de cada espécie com altura similar.

A primeira coleta foi realizada no mês de Janeiro (2011), período médio de

enfolhamento, em que foram coletadas 10 folhas jovens e aparentemente saudáveis de

cada indivíduo. A segunda coleta foi realizada no mês de Abril (2011), período que

antecede a queda foliar e foram coletadas 10 folhas maduras e aparentemente saudáveis

de cada indivíduo.

3.4. Isolamento e cultivo de fungos endofíticos

As folhas coletadas foram armazenadas a 10 4oC e transportadas para o

Laboratório de Microbiologia Ambiental da Universidade Estadual de Montes Claros

(Unimontes). Após serem lavadas em água corrente e detergente neutro, as folhas foram

secas com o auxílio de papel absorvente e examinadas na lupa para verificação da

integridade do tecido foliar. O processo de eliminação de fungos epifíticos foi realizado





27

em câmara de fluxo laminar. As folhas foram submersas por 1 minuto em solução de

etanol 70%, posteriormente em solução de hipoclorito de sódio a 3% (por 4 minutos

para as folhas de G. marginata e 7 minutos para as folhas de C. arborea), novamente

em solução de etanol a 70% por 30 segundos e finalmente foram enxaguadas em água

destilada esterilizada para remoção dos agentes desinfestantes. A última água de

enxague foi analisada para contraprova de controle negativo por meio do plaqueamento

de 1mL em placas de Petri contendo o meio Agar Batata Dextrose (ABD) e incubação

durante sete dias em estufa a 28º C (ESPINOSA-GARCIA e LANGENHEIM 1990,

PIMENTEL et al., 2006).

Após o processo de desinfestação de epifíticos, foram cortados com um

perfurador estéril três discos de 8 mm de diâmetro em cada folha (Figura1). Entre um

corte e outro o perfurador foi flambado para evitar contaminações. Os discos passaram

novamente pelo processo de desinfestação das folhas como supracitado (ficando apenas

por dois minutos no hipoclorito a 3%) e posteriormente foram transferidos para placas

de Petri identificadas por espécie da planta, número do indivíduo e número da folha. O

meio de cultivo utilizado foi o ABD, contendo tetraciclina (100 mg/L). Estas placas

foram incubadas em estufa a 28º C por um período de 10 a 30 dias (PIMENTEL et al.,

2006). O crescimento das colônias fúngicas foi acompanhado diariamente (Figura 2) e,

na medida em que surgiram, foram repicadas para novas placas de Petri nas condições

supracitadas com intuito de isolar as colônias em cultura pura. Uma vez isoladas foram

retirados fragmentos destas e transferidos para tubos contendo ABD inclinado,





28

incubadas em estufa a 28º C e depois armazenadas à 4º C em óleo mineral, para coleção

do Laboratório de Microbiologia Ambiental (Unimontes).

Figura 1. Corte das folhas Figura 2. Fungos endofíticos crescendo

a partir do tecido foliar

3.5. Identificação dos fungos endofíticos

Os isolados obtidos foram caracterizados e agrupados em morfoespécies

(ARNOLD et al., 2000), observando-se os aspectos macromorfológicos das culturas,

como a coloração superficial e do verso do micélio, a textura da superfície, as

características da borda e a coloração do meio de cultura.

Para a identificação foi feita a técnica de microcultivo de fungos em Agar

Sabouraud. Esta técnica consiste na inoculação dos isolados, obtidos e mantidos em

culturas estoque, em blocos de Agar Sabouraud dextrosado montados sobre lâmina

estéril, recobertos por lamínula estéril e mantidos em câmara úmida para a formação das

estruturas reprodutivas. Transcorrido o período de desenvolvimento das colônias, foi

procedida a coloração das mesmas com azul de lactofenol e foram observados em





29

microscópio óptico trilocular (1000 x) os aspectos micro-morfológicos das estruturas

vegetativas e reprodutivas. Os resultados foram comparados com base em literatura

específica em relação às chaves taxonômicas para ascomicetos em geral

(ALEXOPOULOS et al., 1996).

3.6. Detecção da produção de ABA por meio de Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (HPLC)

Para o procedimento de identificação de fungos endofíticos produtores de

ABA foram selecionados aleatoriamente 15 isolados foliares obtidos de C. arborea e 15

isolados de G. marginata da 1ª coleta, realizada no início do ciclo de enfolhamento

(folhas jovens) e 15 isolados foliares de cada espécie arbórea na 2ª coleta, que

corresponde ao final do ciclo de enfolhamento (folhas maduras). Além disto, foi

utilizada como controle positivo uma cepa de Botryts cinerea ATCC CBMAI 863,

descrito na literatura como produtor de ABA (SIEWERS et al., 2004). Primeiramente

foram retirados 6 discos de 8 mm de cada amostra previamente repicada em meio ABD.

Os discos foram transferidos para tubos de polipropileno contendo 35 mL de caldo

Sabouraud enriquecido com triptona e incubados em estufa a temperatura de 28 ºC por

14 dias, sendo agitados manualmente 3 vezes ao dia. Este procedimento foi realizado

em triplicata. Após o crescimento das colônias, as amostras foram centrifugadas a 8.000

rpm por 15 minutos a 10° C. Os sobrenadantes de cada tubo foram retirados e filtrados





30

com filtro Syringe-filter 0.22 µm e mantidos em freezer a -20ºC até o momento da

preparação para as análises em HPLC.

Após serem filtradas, as amostras passaram por um processo de purificação;

foram utilizados cadinhos e pistilos para maceração das amostras com nitrogênio

líquido, em seguida foi retido 1g de cada amostra e misturado a 5 mL dos reagentes:

acetona, água destilada e ácido acético nas proporções de 90:19:1, respectivamente. As

amostras foram transferidas para tubos de polipropileno e centrifugadas novamente a

11.000 rpm, a 4°C por 15 minutos. Os sobrenadantes foram retidos e levados para

análise em HPLC.

O sistema de HPLC adotado para as análises das amostras pré-purificadas

constitui-se em uma coluna C18 Luna 10µ (250/4,60 mm). O gradiente de eluição foi

feito com água e ácido acético 0,5% (solvente A) e acetonitrila + 0,5% de ácido acético

(solvente B), fluxo de 0,4 ml/min., detecção no UV 240 nm. Um gradiente linear com as

seguintes proporções de solvente B foi aplicado (tempo em minutos,%B): (0, 2), (5, 2),

(10, 100), (11, 100), (13, 2), (20, 2). O padrão utilizado foi o ácido abscísico 98,5%

(Sigma). Uma curva de calibração foi construída utilizando-se diferentes concentrações

do padrão: 10 µg/mL, 20 µg/mL e 40 µg/mL. A concentração utilizada para análise foi

de 40 µg/mL (Figura 3).





31

Figura 3. Curva de calibração para o padrão do Ácido Abscísico (ABA).

3.7. Análise estatística

A curva de acumulação de espécies e a estimativa de riqueza total foram

estimadas pelo programa estatístico EstimateS 8.0.

A frequência de colonização por endofíticos foliares foi calculada para cada

espécie arbórea. A frequência de colonização é usualmente dada em porcentagem e

corresponde ao número de fragmentos colonizados, sendo calculada utilizando-se a

fórmula: Nd/Nt x 100, onde Nd e Nt correspondem, respectivamente, ao número de

amostras das quais foi possível isolar um ou mais fungos endofíticos e ao número total

de fragmentos amostrados para o vegetal como um todo. A frequência relativa de





32

ocorrência de cada morfoespécie/espécie foi calculada pela fórmula Nr/Ntx100, onde Nr

e Nt correspondem, respectivamente, ao número de isolados da morfoespécie/espécie e

ao número total de isolados (TAYLOR et al., 1999).

Variações na riqueza e na abundância de fungos endofíticos entre folhas jovens e

folhas maduras e entre cada uma das espécies arbóreas, foram testadas utilizando-se um

teste de variância (ANOVA).

Para avaliar a composição das comunidades de fungos endofíticos de C. arborea

e G. marginata em folhas jovens e maduras foi realizada uma análise de Escalonamento

Multidimensional Não Métrico (NMDS) e uma análise de similaridade (ANOSIM),

utilizando o programa PAST.





33

4. RESULTADOS

A partir do material foliar coletado de C. arborea e G. marginata foi obtido um

total de 179 isolados de fungos endofíticos, sendo todos fungos filamentosos.

Um total de 23 fungos endofíticos foi isolado da espécie C. arborea na 1ª coleta,

que corresponde à estação úmida, em que foram coletadas folhas jovens, e na 2ª coleta,

que corresponde à estação seca, foram coletadas folhas maduras, e destas, foram

isolados 46 fungos endofíticos. Da espécie G. marginata foram isolados 45 fungos

endofíticos na 1ª coleta e 65 na 2ª coleta (Figura 4).

Figura 4. Número de isolados de Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata na 1ª e 2ª

coleta





34

Efetuando-se o cálculo da frequência de colonização em folhas das duas espécies

obteve-se para G. marginata 15% na 1ª coleta e 21,6% na 2ª coleta e para C. arborea

7,3% na 1ª coleta e 15,3% na 2ª coleta.

As curvas de acumulação de espécies isoladas para G. marginata e C. arborea,

demonstraram que a riqueza encontrada foi subestimada em relação à riqueza esperada

(Figuras 5 e 6).

Figura 5. Curva de acumulação de espécies de fungos endofíticos em função do número

de indivíduos amostrados em Goniorrhachis marginata.





35

Figura 6. Curva de acumulação de espécies de fungos endofíticos em função do número

de indivíduos amostrados em Cavanillesia arborea.

Os 179 isolados de fungos endofíticos foram agrupados em 31 morfoespécies e

alguns destes foram identificados em nível de espécie pela Micoteca URM (University

of Recife Mycology) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). A partir das

folhas da espécie G. marginata foram isoladas, nas duas coletas, um total de 20

morfoespécies e em C. arborea foram isoladas 23 morfoespécies (Apêndice 3). Destas

morfoespécies, 4 foram identificadas em nível de espécie e uma em nível de gênero

(Tabela 1).





36

Tabela 1: Ocorrência e abundância de morfoespécies/espécies isoladas de folhas de

Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata

Morfoespécie/espécie Cavanillesia

arborea

Goniorrhachis

marginata

Cladosporium cladosporioides (Fresen) G.A. de Vries 1 10

Colletotrichum gloeosporioides (Penzing) 7 14

Curvularia pallescens (Boedijn) 1 1

Guignardia bidwellii (Ellis) Viala e Ravaz 11 -

Morfo 1 2 -

Morfo 2 1 1

Morfo 3 1 -

Morfo 4 4 -

Morfo 5 6 37

Morfo 6 - 1

Morfo 7 9 2

Morfo 8 1 1

Morfo 9 - 4

Morfo 10 2 -

Phomopsis sp1 8 2

Morfo 12 2 -

Morfo 13 1 -

Morfo 14 2 3

Morfo 15 2 -

Morfo 16 - 3

Morfo 17 - 1

Morfo 18 - 2

Morfo 19 - 2

Morfo 20 1 5

Morfo 21 2 -

Morfo 22 2 -

Morfo 23 1 1

Morfo 24 - 4

Morfo 25 1 1

Morfo 26 1 -

Morfo 27 - 15

Morfo= morfoespécie





37

Em relação à frequência relativa de fungos isolados em G. marginata, a

morfoespécie 5 foi a mais frequente correspondendo a 35% dos isolados, seguida pela

morfoespécie 27 (14,2%), Colletotrichum gloeosporioides (Penzing) (13%) e

Cladosporium cladosporioides (Fresen) G.A. de Vries (9%). Em C. arborea a espécie

mais frequente dentre as isoladas foi Guignardia bidwellii (Ellis) Viala e Ravaz,

correspondendo a 15,94% dos isolados, seguida pela morfoespécie 7 (13,04%) e

Phomopsis sp1 (11,5%).

De acordo com o teste de variância (ANOVA), não houve diferença

estatisticamente significativa na riqueza de fungos endofíticos caracterizados de ambas

as espécies arbóreas em relação à idade foliar e entre si (Figura 7 e Tabela 2).

Figura 7. Riqueza de fungos endofíticos isolados de Cavanillesia arborea e Goniorrhachis

marginata em folhas jovens e maduras





38

Tabela 2: Valores de Wald stat e p para riqueza em função da idade foliar e espécie

arbórea.

Wald stat. p

Riqueza

Espécie 0,96017 0,327144

Idade foliar 0,62569 0,428941

Espécie x Idade foliar 0,62569 0,428941

Quanto à abundância de fungos endofíticos em relação à idade foliar, foi

demonstrado que houve diferença estatisticamente significativa para C. arborea e G.

marginata, aumentando em folhas maduras (Figura 8 e Tabela 3).

Figura 8. Abundância de fungos endofíticos isolados de Cavanillesia arborea e Goniorrhachis

marginata em folhas jovens e maduras





39

Tabela 3: Valores de Wald stat e p para abundância em função da idade foliar e espécie

arbórea.

De acordo com a análise de similaridade (ANOSIM), a comunidade de fungos

isolados de folhas jovens de C. arborea diferiu estatisticamente da comunidade de

fungos isolados de folhas maduras da mesma espécie. O mesmo foi observado em

relação à comunidade de fungos isolados de G. marginata. A comunidade de fungos

isolados nas duas espécies também foi estatisticamente diferente (p<0,05) (Figura 9).

Figura 9. Gráfico de estrutura das comunidades de folhas jovens e maduras de Cavanillesia

arborea e Goniorrhachis marginata

Wald stat. p

Abundância

Espécie 7,1637 0,007439

Idade foliar 7,1637 0,007439






40

Do total de 60 isolados de fungos analisados quanto à produção de ABA, 34

produziram ABA em meio de cultura, correspondendo a 8 isolados de C. arborea na 1ª

coleta e 7 isolados na 2ª coleta e para G. marginata foram 9 isolados na 1ª coleta e 7 na

2ª coleta. A média de produção de ABA pelos fungos produtores foi de 0,04mg/mL,

variando de 0,001mg/mL a 0,038mg/mL. Das 33 morfoespécies caracterizadas, 15

foram produtoras de ABA (Tabela 4).

Tabela 4: Fungos produtores de ABA, isolados de folhas jovens e maduras de

Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata.

Morfoespécie/espécie

Produção de ABA mg/mL

Idade Foliar Cavanillesia

arborea

Goniorrhachis

marginata

Cladosporium cladosporioides

(Fresen) G.A. de Vries

0,02 - M

- 0,005 J

Colletotrichum gloeosporioides

(Penzing) 0,012 0,001 M

Curvularia pallescens (Boedijn) 0,038 - J

Guignardia bidwellii (Ellis) Viala e

Ravaz

0,02 - J

0,003 - M

Morfo 4 0,008 - J

Morfo 5 0,003 0,012 M

0,002 0,002 J

Morfo 7 - 0,002 J

0,008 - M

Morfo 10 - 0,001 M

Phomopsis sp. 0,002 - J

Morfo 12 0,003 - J

Morfo 18 - 0,001 M

Morfo 21 - 0,005 J

Morfo 24 - 0,01 J

Morfo 25 - 0,002 J

Morfo 26 0,001 - J

*J= jovem; M= madura





41

A concentração de ABA produzido pelos fungos isolados das duas espécies

arbóreas foi maior em folhas jovens em relação a folhas maduras e também foi maior

em C. arborea em relação a G. marginata (Figura 10). No entanto, a análise de

variância (ANOVA) realizada para avaliar esta diferença demonstrou que estes valores

não foram estatisticamente significativos (Tabela 5).

Figura 10. Concentração de ácido abscísico (mg/mL) produzido por fungos endofíticos

isolados de Cavanillesia arborea e Goniorrhachis marginata em folhas jovens e folhas

maduras.

Tabela 5: Valores de Wald stat e p para ácido abscísico (ABA) em função da idade

foliar e espécie arbórea.

Wald stat. p

[ABA]

Espécie 0,061112 0,804747

Idade foliar 0,120354 0,72865






42

5. DISCUSSÃO

O processo de desinfestação superficial dos fragmentos das folhas coletadas de

C. arborea e G. marginata mostrou-se eficaz, eliminando possíveis microrganismos

epifíticos e garantindo assim o crescimento seletivo dos fungos endofíticos. A eficiência

desse procedimento foi confirmada neste trabalho, pois nenhuma das alíquotas da água

destilada estéril utilizadas ao final do processo de desinfestação, as quais foram

plaqueadas em meio de cultura ABD, apresentou crescimento microbiano após

incubação.

As curvas de acumulação de espécies demonstram que a diversidade de fungos

endofíticos foi sub-estimada, tanto em folhas de C. arborea, quanto em folhas de G.

marginata. A estimativa da proporção de fungos endofíticos que pode ser efetivamente

isolada e cultivada com as técnicas atuais é inferior a 17% do total de microrganismos

associados a determinado hospedeiro vegetal (ARNOLD, 2007). Um fator que pode ter

influenciado para que a riqueza de endofíticos presentes em ambas as espécies arbóreas

tenha sido sub-estimada é o tamanho dos fragmentos das folhas amostrado neste

trabalho, que foi de 8mm. Segundo Gamboa et al. (2002), existe uma relação linear

entre o tamanho do fragmento e o número de espécies obtidas. Ao analisar a quantidade

de fungos endofíticos isolados de fragmentos de diferentes tamanhos de folhas de

diferentes espécies vegetais, esses autores verificaram que quando são utilizados

fragmentos foliares de tamanhos menores e em maior número por folha analisada, o

número de espécies de fungos isolados aumenta de forma significativa.





43

Os valores de frequência encontrados tanto para C. arborea quanto para G.

marginata foram relativamente baixos se comparados a estudos anteriores com outras

espécies arbóreas tropicais. Em um estudo realizado em Porto Rico com folhas de

Guarea guidonia, a frequência de colonização de endofíticos encontrada em folhas foi

de 95% (GAMBOA e BAYMAN, 2001). Em outro estudo que objetivou avaliar a

colonização por endofíticos de Pueraria phaseoloides e Theobroma grandiflorum,

espécies vegetais também de ecossistemas tropicais, Galvão (1998) relatou frequências

elevadas de colonização: 72,5% e 58,7%, respectivamente. Em contrapartida, um

percentual inferior foi encontrado por Rodrigues (1994), que relatou o valor máximo de

30% de colonização em um estudo com a planta Euterpe oleracea, oriunda da

Amazônia.

A frequência de colonização de endofíticos pode variar com a altitude, umidade,

densidade da copa das árvores, precipitação e presença do hospedeiro que o fungo se

adapta (SURYANARAYANAN et al., 1998). A baixa frequência de colonização

encontrada em G. marginata e C. arborea pode ser explicada pelo fato de que espécies

arbóreas de florestas tropicais secas não comportam uma alta diversidade de fungos

endofíticos. A baixa incidência destes microrganismos em florestas tropicais secas em

comparação à alta incidência em florestas tropicais úmidas é uma resposta à influência

de fatores abióticos como chuva anual (baixos índices de precipitação) e queimadas; e

bióticos tais como diversidade de herbívoros e abertura das copas das árvores (a alta

intensidade de raios UV diminui o sucesso de colonização dos fungos) (MURALI et al.,

2007).





44

Dentre os isolados de G. marginata e C. arborea foram observadas algumas

morfoespécies/espécies dominantes. Em G. marginata, as morfoespécies/espécies com

maior frequência relativa foram a 5 (35%), a 27 (14,2%) e Colletotrichum

gloeosporioides (Penzing) (13%). Em C. arborea as espécies mais frequentes dentre as

isoladas foram G. bidwellii (15,94%) e a morfoespécie 7 (13,04%) e Phomopsis sp1

(11,5%). Esses dados corroboram com a afirmação de alguns autores de que para

determinado hospedeiro, a comunidade de endofíticos compõe uma variedade de

gêneros e espécies de fungos, onde há um pequeno número de espécies dominantes e

um número maior com baixa representação, denominadas espécies transitórias

(VERMA et al., 2007). Arnold (2007) também observou a dominância de poucos táxons

ao avaliar comunidades endofíticas associadas à Pinus ponderosa. A colonização de

uma mesma espécie de fungo endofítico foi observada em 58,6% do total de isolados

obtido.

A técnica de microcultivo permite a identificação dos fungos endofíticos por

meio da observação dos aspectos micro-morfológicos das suas estruturas vegetativas e

reprodutivas, como conidióforos, conídios e macroconídios. A maioria dos fungos

isolados submetidos à técnica de microcultivo neste trabalho não apresentaram

estruturas reprodutivas para identificação. Este fato tem sido comumente mencionado

em outros trabalhos com endofíticos isolados de plantas tropicais

(SURYANARAYANAN et al.,1998; PHOTITA et al., 2001) e ocorre em decorrência

de algumas espécies de fungos não se adaptarem aos meios de cultivo e desenvolverem

estruturas reprodutivas apenas em ambiente natural ou em associação com o tecido





45

hospedeiro. A caracterização e o agrupamento dos fungos em morfoespécies têm sido

realizados em diversos trabalhos por meio da observação dos aspectos

macromorfológicos das culturas, como a coloração superficial e do verso do micélio, a

borda, o relevo e a coloração do meio de cultura (ARNOLD et al., 2000; HILARINO et

al., 2011).

No presente trabalho foi observado que a abundância de fungos endofíticos

aumentou proporcionalmente à idade do tecido hospedeiro, corroborando com outros

estudos. Chareprasert e colaboradores (2006), avaliaram a diversidade de fungos

endofíticos associados à Tectona grandis e Samanea saman Merr., duas espécies de

plantas da Tailândia, levando em consideração a idade das folhas coletadas e como

resultado a frequência de colonização de folhas maduras foi maior do que de folhas

jovens, recém-emergidas. Este padrão pode ocorrer devido ao fato de que folhas

maduras apresentam uma área maior, aumentando a probabilidade do inóculo se

depositar em sua superfície. Além disto, folhas mais velhas encontram-se expostas a

colonização fúngica durante um período mais longo do que folhas jovens (OKI et al.,

2009). Outro fator considerável para que haja uma maior colonização em tecidos mais

velhos é a alteração física do tecido da planta ou a degradação da cutícula da folha com

o aumento da idade do tecido, o que torna as plantas hospedeiras mais susceptíveis à

invasão (STONE, 1987; KUMARESAN; SURYANARAYANAN, 2001). Existem

outras características do tecido vegetal, como espessura da cutícula, biomassa e

substâncias secundárias, relacionadas à idade foliar, que podem explicar a baixa

colonização de folhas jovens (OKI et al., 2009).





46

Apesar da riqueza de fungos isolados entre as espécies arbóreas não ter sido

significativamente diferente neste trabalho, a análise da estrutura das comunidades

(NMDS e ANOSIM) demonstrou que a estrutura da comunidade de fungos endofíticos

isolados de G. marginata diferiu da comunidade de fungos isolados de C. arborea. Foi

observado que algumas espécies/morfoespécies foram exclusivas de seus hospedeiros.

As morfoespécies 1, 3, 4, 10, 12, 13, 15, 21, 22, 26 e a espécie G. bidwellii ocorreu

somente em C. arborea, enquanto que as morfoespécies 9, 16, 17, 18, 19, 24 e 27 foram

exclusivas de G. marginata (Tabela 1). Isto indica que há uma relação de especificidade

entre os fungos endofíticos e as espécies hospedeiras desde estudo. A especificidade

entre fungo e espécie hospedeira foi relatada em outros estudos

(SURYANARAYANAN et al., 1998; SURYANARAYANAN e KUMARESAN,

2000). Neste trabalho, a diferença na composição das comunidades de fungos

endofíticos presentes nas duas espécies arbóreas provavelmente deveu-se às

particularidades fisiológicas e anatômicas dos hospedeiros, já que todos se encontravam

nas mesmas condições ambientais.

A composição de espécies da comunidade de fungos endofíticos isolados foi

significativamente diferente entre folhas jovens e maduras e a riqueza entre as diferentes

idades foliares não variou em ambas as espécies arbóreas. Isto implica que com o

aumento da idade foliar houve uma substituição de espécies na comunidade de fungos

endofíticos de ambas as espécies arbóreas, indicando uma variação temporal na

composição de espécies destas comunidades. Algumas morfoespécies/espécies

ocorreram exclusivamente em folhas jovens ou folhas maduras. Considerando fungos





47

isolados das duas espécies arbóreas, as morfoespécies 1, 2, 4, 11, 12 e a espécie C.

pallescens foram isoladas apenas de folhas jovens e as morfoespécies 3, 9, 10, 14, 15,

16, 18, 19, 20 foram isoladas apenas de folhas maduras. Um padrão semelhante de

variação temporal na composição de espécies e a presença de fungos exclusivos de

folhas jovens e maduras ocorreu em um estudo avaliando riqueza e distribuição de

fungos endofíticos em folhas de Bauhinia brevipes Vog. (Fabaceae) (HILARINO et al.,

2011). Suryanarayanan e Thennarasan (2004), avaliando o padrão temporal de

colonização por endofíticos em folhas de Plumeria rubra, uma espécie decídua tropical,

observaram que folhas jovens foram colonizadas, em sua maioria, por Hyphomycetes,

enquanto que folhas maduras foram colonizadas por Coelomycetes.

A especificidade pelos tecidos do hospedeiro pode estar relacionada à

capacidade do fungo para utilizar nutrientes existentes neste tecido. Com a maturação

do tecido, há uma mudança em fatores como cutícula, textura, fisiologia e química, o

que pode influenciar na comunidade de fungos associados e na especificidade

(PHOTITA et al., 2001).

Com o intuito de avaliar a possível influência da colonização por endofíticos na

dinâmica foliar das plantas hospedeiras por meio da produção de ABA, foi analisada a

produção desse fitormônio por alguns dos fungos isolados das duas espécies arbóreas.

Também foi avaliado se houve uma diferença na produção por fungos isolados em

folhas jovens e maduras. Dos 60 isolados testados, mais da metade (34) foram

produtores de ABA.





48

Em relação à produção de ABA por endofíticos isolados de folhas jovens e

maduras das duas espécies arbóreas, não foi observada diferença estatisticamente

significativa. Esse resultado pode ter sido influenciado pelo fato de a análise da

produção de ABA ter sido feita em condições de cultivo, o que pode ter influenciado

para que os fungos, fora da planta hospedeira, tenham se comportado de uma maneira

diferente do que se comportariam em seu ambiente natural.

Os 34 fungos isolados, produtores de ABA, correspondem a 15 das 33

morfoespécies caracterizadas neste trabalho. Nestas estão incluídas as espécies

identificadas C. cladosporioides (Fresen) G.A. de Vries, C. gloeosporioides (Penzing),

C. pallescens (Boedijn), G. bidwellii (Ellis) Viala e Ravaz e o gênero Phomopsis que

nunca haviam sido caracterizados em literatura como produtores deste fitormônio.

A produção de ABA por fungos endofíticos e outros metabólitos originalmente

característicos de seu hospedeiro vegetal provavelmente está relacionada a uma troca

gênica ocorrida entre o endofítico e a planta ao longo de anos de coevolução (TAN e

ZOU, 2001) e é considerada uma estratégia que estes fungos desenvolveram para

colonizar a planta hospedeira. Neste trabalho, foi observada uma maior produção, em

termos de concentração de ABA, de fungos de folhas jovens, e isso pode estar

relacionado a uma estratégia de colonização utilizada pelos fungos analisados. Como já

foi demonstrado em outros estudos, com o aumento das concentrações de ABA, as

folhas se tornam mais susceptíveis à infecção (KETTNER; DÖRFFLING, 1995).

Observa-se que a concentração de ABA produzido pelos fungos diminuiu em folhas

maduras, isso pode estar relacionado ao aumento da concentração de ABA nas folhas,





49

produzido pela própria planta, que ocorre no período em que antecede a queda foliar.

No entanto, são necessários outros estudos para melhor elucidar a influência da

produção de ABA pelos fungos em suas plantas hospedeiras.





50

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

- As espécies arbóreas selecionadas para este estudo abrigam uma diversidade

considerável de fungos endofíticos;

- A variação temporal tem influência na mudança da composição da comunidade de

fungos endofíticos das duas espécies arbóreas avaliadas;

- Um número considerável de morfoespécies de fungos endofíticos caracterizadas neste

trabalho produz ABA;

- Novos estudos acerca da diversidade de fungos endofíticos e sua produção de

biomoléculas se fazem necessários, a fim de se elucidar os aspectos da interação com

suas plantas hospedeiras e a influência que esses fungos exercem nos mecanismos

fisiológicos das plantas, na composição da comunidade vegetal, na sucessão e ciclagem

de nutrientes.





51

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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58

8. APÊNDICES

8.1. APÊNDICE 1

Espécie arbórea Goniorrhachis marginata Taub

Foto: Lívia Martins Botelho





59

8.2. APÊNDICE 2

Espécie arbórea Cavanillesia arborea K. Schum

Foto: Pollyana Queiroz





60

8.3. APÊNCICE 3

Exemplos de morfoespécies de fungos enfofíticos isoladas de Cavanillesia arborea

e Goniorrhachis marginata





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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS · diversidade de fungos endofíticos associados a Goniorrhachis marginata e Cavanillesia arborea e sua produção de ácido abscísico (ABA)