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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
PROCESSO INFECCIOSO E ATIVIDADE DE ENZIMAS EM
FRUTOS DE CACAUEIRO DE GENÓTIPO RESISTENTE E
SUSCETÍVEL À VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO
CAUSADA POR Moniliophthora perniciosa
IVANNA MICHELLE MERAZ PÉREZ
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Agosto de 2016
IVANNA MICHELLE MERAZ PÉREZ
PROCESSO INFECCIOSO E ATIVIDADE DE ENZIMAS EM FRUTOS
DE CACAUEIRO DE GENÓTIPO RESISTENTE E SUSCETÍVEL À
VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO CAUSADA POR
Moniliophthora perniciosa
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz, como
parte das exigências para obtenção do título
de Mestre em Genética e Biologia
Molecular.
Área de Concentração: Genética e
Biologia Molecular
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Agosto de 2016
PROCESSO INFECCIOSO E ATIVIDADE DE ENZIMAS EM FRUTOS
DE CACAUEIRO DE GENÓTIPO RESISTENTE E SUSCETÍVEL À
VASSOURA-DE-BRUXA DO CACAUEIRO CAUSADA POR
Moniliophthora perniciosa
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz, como
parte das exigências para obtenção do título
de Mestre em Genética e Biologia
Molecular.
Área de Concentração: Genética e
Biologia Molecular
APROVADA:
_______________________________
Prof.ª Dr.a Suely Xavier De Bruto Souza
(ADAB/COREG)
_______________________________
Prof. Dr. Eduardo Gross
(UESC)
______________________________
Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani
(UESC)
______________________________
Prof.ª Dr.a Karina Peres Gramacho
(CEPLAC/UESC)
iv
“Conte-me e eu esqueço. Mostre-me e eu apenas
me lembro. Envolva-me e eu compreendo. ”
(Confúcio)
v
Ao anjinho no céu me cuidando e procurando
sempre por mim, o melhor irmão do mundo. “De
vez em quando eu penso em ti. De vez em quando
eu te sinto. De vez em quando eu te choro. Tão
perto que nem posso te alcançar tão longe que não
consigo te esquecer. ” (Fernando Barbosa Filho)
DEDICO
Aos meus pais e irmã por acreditar em mim mesmo
quando eu não era capaz e sempre estar ao meu
lado, mesmo só em pensamento, todas as vezes
que precisei. Muito obrigada mãe pelos sacrifícios
que você sempre fez para que os meus sonhos se
realizassem.
Com muito amor
OFEREÇO
vi
AGRADECIMENTOS
Deus e ao São Miguel Arcanjo, aqueles dois seres tão importantes na minha vida que
nunca me deixaram sozinha, que sempre me deram força, vontade e serenidade, que me
ajudaram a persistir diante das dificuldades desta aventura.
À Dr.a Karina Gramacho, orientadora, amiga, confidente, conselheira e minha mãe
científica. Muito obrigada por fazer crescer em mim a paixão pela pesquisa e pelo ensinamento.
Obrigada, por compartilhar seus conhecimentos. Obrigada, pela contribuição ao meu
desenvolvimento e crescimento profissional pessoal ao longo desta viagem. Eu levo você no
meu coração.
À Dra Kaleandra Sena e Dra Virginia L. F. Soares, pela co-orientação e contribuição na
realização deste trabalho.
Ao mestrado em Genética e Biologia Molecular da Universidade Estadual de Santa
Cruz, por me receber e passar para mim tantos conhecimentos através dos maravilhosos
professores que me deram aula.
Ao professor Ronan Xavier Correa, assessor de relações internacionais da UESC; muito
obrigada, pela ajuda e apoio incondicional.
Ao Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia dos Estados Unidos Mexicanos
(CONACYT), pela oportunidade e apoio financeiro indispensável para a realização da pós-
graduação.
Ao Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC) da Comissão Executiva da Lavoura
Cacaueira (CEPLAC), pela permissão da execução do trabalho em suas dependências.
Aos doutores Uilson Vanderlei Lopes e Carlos Priminho Pirovani, pelas excelentes
sugestões e colaboração neste trabalho.
À doutora Mariana Barreto Araújo e muito em especial a doutora Yaska Janaina Bastos
Soares, pela colaboração, conselhos e infinita disponibilidade de ajudar sempre que precisei.
vii
Aos colegas, amigos e família do laboratório de Fitopatologia Molecular da
CEPLAC/CEPEC; Keila, Rafaela do Mar, Rafaela Andrade, Analine, Nara, Marcos, Joselito,
seu Zé, pela ajuda, convívio, amizade e momentos compartilhados. Minha querida Mariana
Carvalho, um agradecimento especial para você, pelos conselhos, ajuda e boas “vibes” que
sempre me deu.
Aos alunos de Iniciação Científica; meu querido Renato, Leandro, Israel, Alex, Julia,
Michelle, Ailton, e outros, pelo apoio, companheirismo e risadas compartilhadas.
Às secretárias do PPGGBM Fabrícia, Mara e Kátia, pelas risadas e apoio nos meus
dramas, bem como pela capacidade de atenção e ajuda sempre que necessitamos.
Aos amados meus pais, Luis e Ibet e minha querida irmã Antonieta, quem mesmo na
distância me deram aquela energia, apoio e amor que eu precisava nas horas mais difíceis desta
aventura. De maneira resumida.... Sem vocês eu sou NADA!
Ao meu irmão, R.N. Meraz Pérez, quem me observa desde o céu. Você é meu grande
anjo, graças a você eu consigo tudo!
À minha querida vovó de ferro, Ana Luz e aos meus queridos tios Sebastian, Jenny e
Aura, sem suas palavras de carinho eu provavelmente teria desistido desta incrível viagem, por
isso não tenho mais que dizer que MUITO OBRIGADA! Os amo!
Ao meu namorado Jonatan quem veio com o mesmo sonho que eu e que cada dia que
passou me mostrou seu apoio e amor incondicional.
Aos meus colegas mexicanos, Alberto e Yuliana, que compartilharam comigo parte
desta viagem cheia de aventuras, mesmo quando em algum ponto não deu certo, agradeço muito
seu apoio, as risadas e sobre tudo a força que me deram para continuar através das adversidades
da vida, desejo muito sucesso para vocês.
A todos que, direta ou indiretamente colaboraram na condução deste trabalho.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Papel na prevenção da infecção patogênica de diversas estruturas associadas à superfície das
plantas. FONTE: Autora, adaptado de Lázniewska et al., 2012. ........................................................... 16
Figura 2. Caracterização macroscópica dos sintomas da vassoura-de-bruxa do cacaueiro. A) meristema
apical com 2 dias após inoculação; B) leve inchamento do meristema; C) hipertrofia apical e inchação
da haste; D) vassouras verdes terminais com perdida de dominância apical; E) vassouras verdes
terminais axiais e F) vassoura necrotrófica ou seca. Sena et al., 2014. ................................................. 19
Figura 3. Sintomas da vassoura-de-bruxa do cacaueiro em frutos de cacaueiro. A) frutos com
conformação “cenoura”; B) frutos com conformação “morango”; C) lesões necróticas; D) halos
amarelados; E) pontuações pretas e duras e F) hidrólise de polpa e sementes. Silva et al., 2002. ........ 20
Figura 4. Caracterização da evolução sintomatológica da vassoura-de-bruxa do cacaueiro em frutos de
cacau de genótipos contrastantes para resistência a doença. ................................................................. 27
Figura 5. Eletromicrografia da superfície de frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes a vassoura-
de-bruxa do cacaueiro mostrando as características da sua superfície e os tipos de tricomas. A) genótipo
suscetível (Catongo); relevo plano com presença de tricomas glandulares, B) tricoma estrelar composto
por célula basal (Cb) e ramificações (R), C) genótipo resistente (TSH1188); relevo amorfo com presença
de tricomas glandulares compostos por célula basal (Cb), pedículo (P) e célula secretora (Cs), e D)
camada amorfa de cera epicuticular (seta branca) no genótipo resistente. ............................................ 28
Figura 6. Eletromicrografia da superfície de frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes a vassoura-
de-bruxa do cacaueiro mostrando a densidade de tricomas por genótipo no: A) Catongo genótipo
suscetível, B) TSH1188 genótipo resistente e, C) número médio de tricomas na superfície de ambos os
genótipos. Médias com letras diferentes apresentam diferença significativa (p<0,05) pelo teste de
Duncan a 5%. ........................................................................................................................................ 29
Figura 7. Eletromicrografia de varredura da superfície de frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes
a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. A, B, C) Catongo, genótipo suscetível, estômatos amonocíticos
localizados em criptas estomáticas. Cg= células guarda; *ostíolo. D, E, F) TSH1188 genótipo resistente,
estômatos amonocíticos com ausência de células subsidiarias. ............................................................ 30
ix
Figura 8. Eletromicrografia da caracterização do processo de pré-penetração de Moniliophthora
perniciosa em frutos de cacaueiro: A) basidiósporo (Es) com formação de hilo (*) aderido à superfície
do hospedeiro observado às 3HAI, B) basidiósporo rodeado de matriz mucilaginosa (seta vermelha)
com emissão e alongamento do tubo germinativo (Tg), C) basidiósporo rodeado de matriz mucilaginosa
(seta vermelha) e aparente dissolução da cera epicuticular do hospedeiro no local de contato com a
estrutura fúngica (seta branca), D-E) hifa rodeada de matriz mucilaginosa (seta vermelha),e D) hifa com
ponta “club-shaped” (Cs) sobre estômato (seta branca). ....................................................................... 32
Figura 9. Número médio de penetrações de Moniliophthora perniciosa por mm2 em frutos de cacaueiro
de genótipo suscetível e resistente a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Médias com letras diferentes
apresentam diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan a 5%. ............................................. 35
Figura 10. Determinação da atividade da peroxidase do guaiacol (GPx) em frutos de cacaueiro de
genótipos contrastantes à vassoura-de-bruxa do cacaueiro, inoculados e não inoculados com
Moniliophthora perniciosa. Médias com letras diferentes apresentam diferença significativa (p<0,05)
pelo teste de Duncan a 5%. ................................................................................................................... 37
Figura 11. Determinação da atividade da peroxidase do guaiacol (GPx) em frutos de cacaueiro de
genótipos contrastantes à vassoura-de-bruxa do cacaueiro, inoculados e não inoculados com
Moniliophthora perniciosa. Médias com letras diferentes apresentam diferença significativa (p<0,05)
pelo teste de Duncan a 5%. ................................................................................................................... 38
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Caracterização da evolução sintomática da vassoura-de-bruxa em frutos de cacaueiro de
genótipos contrastantes a doença. ......................................................................................................... 26
Tabela 2. Avaliação dos eventos de pré-penetração de Moniliophthora perniciosa em frutos de
cacaueiro de genótipos contrastantes a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. ............................................. 31
xi
SUMÁRIO EXTRATO .............................................................................................................................................. iv
ABSTRACT ............................................................................................................................................ vi
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 8
REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................................. 12
2.1. A interação planta – patógeno e o estabelecimento da infecção .............................................. 12
2.2. Mecanismos de resistência e defesa das plantas contra fitopatógenos ..................................... 14
2.3. O patossistema Theobroma cacao – Moniliophthora perniciosa ............................................. 18
MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................. 22
3.1 Obtenção do material vegetal, inoculação e avaliação fenotípica .............................................. 22
3.2 Processo infeccioso de Moniliophthora perniciosa em frutos de cacaueiro ............................ 23
3.3 Ensaios enzimáticos, determinação da atividade da peroxidase do guaiacol (GPx) e da
peroxidase do ascorbato (APx) ................................................................................................. 23
RESULTADOS ..................................................................................................................................... 25
4.1 Evolução dos sintomas de vassoura-de-bruxa em frutos de cacaueiro de genótipos
contrastantes ............................................................................................................................. 25
4.2 Caracterização dos mecanismos de resistência e do processo infeccioso de Moniliophthora
perniciosa em frutos de cacaueiro. ........................................................................................... 28
4.2 Analise enzimática das peroxidases de guaiacol (GPx) e do ascorbato (APx) ......................... 36
DISCUSSÃO ......................................................................................................................................... 39
CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................................ 44
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................... 45
iv
EXTRATO
MERAZ PÉREZ, Ivanna Michelle. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, maio de
2016. Processo infeccioso e atividade de enzimas em frutos de cacaueiro de genótipos resistente
e suscetível à vassoura-de-bruxa do cacaueiro causada por Moniliophthora perniciosa.
Orientadora: Karina Peres Gramacho. Co-orientadores: Virginia Lucia Fontes Soares e
Kaleandra Freitas Sena.
Entre os métodos de controle para a vassoura-de-bruxa do cacaueiro (VBC), considerada
uma das principais doenças da cacauicultura brasileira, destaca-se o uso de genótipos
resistentes. Alterações no metabolismo das plantas elicitadas após infecção do patógeno, bem
como as estruturas presentes na sua superfície são consideradas mecanismos de resistência à
doença. Neste contexto, apesar da interação M. perniciosa – cacau em relação ao processo
infeccioso do patógeno e as respostas de resistência do hospedeiro à infecção em outros órgãos
sejam bem descritos na literatura, o conhecimento destes processos na interação M. perniciosa
– cacau (frutos) são poucos esclarecidos. Este trabalho foi conduzido sob hipótese de que frutos
de cacaueiro do genótipo TSH1188 apresenta mecanismos estruturais e bioquímicos que
dificultam ou retardam a ação de M. perniciosa. O experimento foi montado em campo, em
delineamento experimental inteiramente casualizado, com 2 genótipos e 3 repetições de 3 frutos
por tratamento (inoculado x não inoculado). Frutos dos genótipos TSH1188 (R) e Catongo (S),
obtidos de polinização aberta, foram inoculados com uma gota contendo uma suspenção de
basidiósporos na concentração de 2x105 esporos/mL. Os frutos controle foram inoculados com
água destilada estéril. Avaliações semanais de sintomas característicos da doença foram
realizadas por fruto. Amostras provenientes da região inoculada foram coletadas nos tempos,
3, 5, 6, 8, 12 horas após inoculação (HAI) e processadas para microscopia eletrônica de
varredura (FIOCRUZ, BA) e às 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72HAI e 15, 30, 45 e 60 dias após inoculação
(DAI) para realização de ensaios enzimáticos. Análogo ao observado na infecção do patógeno
em meristemas, a infecção foi mais rápida no genótipo suscetível, onde a adesão, a germinação
dos basidiósporos e a penetração fúngica iniciou-se às 3HAI e no TSH1188 às 8HAI com maior
ocorrência no Catongo em relação ao TSH1188 (p<0,05). Múltiplos modos de penetração foram
observados em ambos os genótipos, sendo estes: penetração direta, na base de tricomas
glandulares e através de aberturas naturais, mediante estômatos, sendo esta última a
predominante (67% das penetrações quantificadas). Os primeiros sintomas da infecção foram
observados aos 15DAI no Catongo e aos 60DAI no TSH1188. Tricomas estrelares e
glandulares, com predominância destes últimos foram observados em ambos os genótipos,
sendo superior (p<0,05) no TSH1188 (569/cm2) quando comparado com o Catongo (292/cm2).
v
Estômatos amonocíticos com ausência de células subsidiárias foram observadas na superfície
de ambos os genótipos com diferença na localização no filoplano dos frutos, encontrando-se
em criptas estomáticas no Catongo. Confirmou-se o envolvimento das enzimas da classe PODs
(p<0,05) no processo infeccioso de M. perniciosa em frutos de cacau. O genótipo TSH1188
apresentou resposta mais rápida, aumentando a atividade das enzimas durante os primeiros
estágios da infecção (0-48 HAI) sugerindo rápido reconhecimento do patógeno. Com base
nestes resultados concluiu-se que frutos do genótipo TSH1188 apresentam mecanismos
estruturais e bioquímicos que dificultam o estabelecimento de M. perniciosa nos seus tecidos,
confirmando-o como um genótipo resistente a doença.
Palavras chave: interação planta-patógeno, mecanismos de resistência, resistência genética,
Theobroma cacao, vassoura-de-bruxa.
vi
ABSTRACT
MERAZ PÉREZ, Ivanna Michelle. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, maio de
2016.Infection process and enzyme activity in cocoa fruits resistant and susceptible genotypes
to witches’ broom disease caused by Moniliophthora perniciosa. Orientadora: Karina Peres
Gramacho. Co-orientadores: Virginia Lucia Fontes Soares e Kaleandra Freitas Sena.
Deployment of resistant genotypes is the main control method for Witches’ broom disease
(WBD) of cacao, one of the main diseases of the Brazilian cacauiculture. Structures on the pod
surface as well as changes in its metabolism induced after pathogen infection are considered
mechanisms of disease resistance. In this context, despite the interaction of M. perniciosa –
cacao (meristems) in relation to the infectious process of the pathogen and the resistance
responses of the host to infection in other organs are well described in the literature, the
knowledge of these processes in the interaction with cacao pods, considered the main
commercial product, remain unclear. This dissertation was conducted under the hypothesis that
cacao pods of the TSH1188 genotype presents structural and biochemical mechanisms that
hinder or delay the action of M. perniciosa. To obtain the samples the experiment was designed
in the field, in a completely randomized design with 2 genotypes and three replications with
three pods each, for treatment (inoculated x uninoculated). Pods of the TSH1188 (R) and
Catongo (S) genotypes obtained from open pollination were inoculated with a suspension of
basidiospores in a concentration of de 2 x 105 spores/mL. Control pods were inoculated with
sterile distilled water. Weekly assessment of characteristic disease symptoms was performed
individually. Samples were collected at 3, 5, 6, 8 and 12 hours after inoculation (HAI) and
processed for scanning electron microscopy (FIOCRUZ, BA), as well as at 0, 3, 6, 12, 24, 48,
72, and 15, 30, 45 and 60 days after inoculation (DAI) to perform enzymatic assays. Similar to
what was observed in the pathogen infection in meristems, the infection was faster in the
susceptible genotype, where adhesion, germination of the basidióspores and fungal penetration
began at 3HAI in Catongo and in TSH1188 at 8HAI with higher frequency in Catongo in
relation to TSH1188 (p <0.05). Several penetration modes were observed in both genotypes:
direct penetration, at the base of glandular trichomes and natural openings, mainly by stomata,
this being the predominant one (67% of the total penetrations). The first symptoms of infection
were observed at 15DAI in Catongo and at 60DAI in TSH1188. Star and glandular trichomes
were observed in both genotypes, being superior (p <0.05) in TSH1188 (569/cm2) when
compared to Catongo (292/cm2). Ammonocytic stomata with absence of subsidiary cells were
observed on the surface of both genotypes with difference in the location at the phylloplane of
the pods, being found in stomatal crypts in Catongo. PODs enzyme involvement (p <0.05) was
confirmed in the M. perniciosa infectious process in cacao pods. The TSH1188 genotype
showed a faster response, increasing the activity of the enzymes during the early stages of the
vii
infection (0-48 HAI) suggesting rapid recognition and combat of the pathogen. Based on these
results it was concluded that pods of TSH1188 genotype present structural and biochemical
mechanisms that make difficult the establishment of M. perniciosa in their tissues, confirming
it as a disease resistant genotype.
Key words: defense mechanism, genetic resistance, plant – pathogen interaction, Theobroma
cacao, Witches broom disease.
8
INTRODUÇÃO
A resistência do hospedeiro a um patógeno reflete a capacidade da planta em atrasar ou
evitar a entrada e/ou subsequente atividade do patógeno no tecido hospedeiro (SCHENK et al.,
2000). Isto ocorre mediante uma complexa troca de sinais e mecanismos desenvolvidos ao
longo da co-evolução patógeno-hospedeiro (KAZAN et al., 2001).
Estruturas pré-formadas ou constitutivas localizadas na superfície da planta, por
exemplo, a quantidade, conformação química e forma física das ceras epicuticulares, número,
morfologia e período de abertura dos estômatos, e a presença e tipo de tricomas podem agir
como barreiras que inibem ou retardam a entrada e colonização do patógeno no hospedeiro
(MEDEIROS et al., 2003; AGRIOS, 2005). Além destes mecanismos pré-formados, o
metabolismo da planta sofre alterações que são consideradas mecanismos pós-formados ou
induzidos, estes são ausentes ou têm pouca expressividade em plantas sadias, e tornam-se
evidentes só após a invasão do patógeno ou quando a planta é injuriada. Estes também
contribuem para inibir ou retardar o desenvolvimento do fitopatógeno na planta (ANTONIO et
al., 2010). Alguns exemplos destes mecanismos são a geração e o acúmulo de espécies reativas
de oxigênio (ROS) e o aumento da atividade das enzimas da classe peroxidase (PODs). Em
conjunto, tais eventos e reações podem determinar o sucesso da resistência da planta contra o
ataque de fitopatógenos, evitando assim, o estabelecimento ou desenvolvimento da doença
(STINTZ et al., 1993).
A relação entre ceras epicuticulares e a resistência a doenças foi estudada por Sena et al.
(2014) e Carvalho et al. (2014) no patossistema M. perniciosa – Theobroma cacao, foi
demonstrado que o extrato da cera epicuticular de cacaueiros resistentes possui ação inibitória
“in-vitro” de cerca do 80% na germinação dos basidiósporos de M. perniciosa. Por outro lado,
Souza (2008), estudando a patogênese de Puccinia psidii mediante a caracterização micro
9
morfológica da epiderme de folhas de clones de eucalipto, observou que nos locais de
penetração do patógeno havia menor quantidade de ceras cuticulares, assim facilitando a
infecção do fungo no tecido hospedeiro.
Outros fatores presentes na superfície da planta, tais como número, tipo e distribuição
de tricomas e estômatos, também influenciam o desenvolvimento do patógeno. Tricomas
simples (não glandulares) podem impedir a deposição do filme de água necessário na adesão
dos esporos fungicos à superfície do hospedeiro (JERBA et al., 2005). Estudos no patossistema
M. perniciosa – T. cacao têm demostrado a secreção de proteínas específicas e compostos
solúveis em água pelos tricomas glandulares presentes no meristema do cacaueiro (Almeida et
al., 2017). Além desta função química na defesa vegetal, a densidade deste tipo de tricoma foi
maior em meristemas de genótipos considerados resistentes (CCN51, 176 tricomas/cm3) em
relação aos meristemas dos genótipos suscetíveis (Catongo, 63 tricomas/cm3) à vassoura-de-
bruxa do cacaueiro (VBC) sugerindo a participação destas estruturas na resistência a esta
doença. Paralelamente, Indah et al. (2013) demostraram que folhas de cacaueiro de genótipos
resistentes com menor densidade e abertura estomática na sua superfície são contrastantes ao
observado nos genótipos suscetíveis (maior densidade e abertura estomática), relacionando
positivamente este fato com a resistência do tecido hospedeiro a Oncobasidium theobromae.
Por ouro lado, fungos como Puccinia graminis f. sp. tritici, agente causal da ferrugem do colmo
do trigo, só conseguem penetrar quando os estômatos estão abertos, fazendo do período de
abertura e fechamento dos estômatos uma característica importante na resistência às doenças.
Portanto, algumas variedades de trigo com abertura estomática tardia, apresentam resistência
ao patógeno porque o tubo germinativo dos esporos germinados sofre dessecação durante a
noite antes dos estômatos começarem a abrir (REIS, 1991).
A percepção dos patógenos pelos hospedeiros é central para a ativação bem-sucedida de
uma resposta de defesa da planta, pois, leva a uma redução dos danos causados pelos agentes
fitopatogênicos. As células vegetais são capazes de detectar moléculas microbianas
denominadas PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) ou MAMPs (microbe-
associated molecular patterns) (AUSUBEL, 2005; BITTEL e ROBATZEK, 2007) mediante
os receptores PRRs (PAMP-recognition receptor) localizados na superfície da membrana
celular ou interior da célula. O reconhecimento das PAMPs ativa uma resposta basal imune
conhecida como PTI (PAMP-triggered immunity) (JONES & DANGL, 2006). Este tipo de
sistema de defesa permite que as plantas respondam rápida e eficientemente a uma ampla gama
de patógenos (ROUX et al., 2014). As plantas respondem com a ativação de genes de resistência
10
que detectam estas proteínas efetoras e desencadeiam a imunidade disparada por efetores (ETI-
effector -triggered immunity) (THOMMA et al., 2011). As vias ETI e PTI resultam na ativação
de um conjunto sobreposto de respostas de defesa que incluem a ativação de múltiplas vias de
sinalização (ácido salicílico, etileno e ácido jasmônico), e a transcrição de genes específicos
que limitam a colonização dos patógenos e/ou a expressão dos sintomas da doença. Isto
mediante a produção de compostos antimicrobianos e o acúmulo de espécies reativas de
oxigênio (ROS) (JONES & DANGL, 2006; NICAISE et al., 2009; ZIPFEL, 2009). As ROS
(peróxido de hidrogênio -H2O2, ánion superóxido -O2-, radicais hidroxila livres-OH-) atuam
fortalecendo a parede celular do hospedeiro, apresentando toxidez ou fazendo parte das cascatas
de sinalização que ativam genes que codificam proteínas relacionadas à patogênese (RESENDE
et al., 2003), impedindo ou retardando o avanço do fitopatógeno no tecido do hospedeiro e
restringindo suas fontes de nutrientes, por conseguinte levando à morte do mesmo. Alguns
estudos bioquímicos tem evidenciado o acúmulo de ROS na célula vegetal como resposta a
patogênese e o aumento na atividade de enzimas antioxidantes da classe peroxidase (PODs)
como consequência da superprodução de ROS. Estas enzimas ocorrem frequentemente em
muitas isoformas e estão envolvidas na síntese de substâncias de defesa ou têm uma atividade
antimicrobiana direta (LEBEDA et al., 1999). A contribuição destas enzimas na resistência a
doenças tem sido demostrada por vários autores em diferentes patossistemas (M. perniciosa –
cacau, CAMILO et al., 2013; Leptosphaeria maculans – canola, RODRIGUES-URRA et al.,
2012). Ambos os estudos evidenciaram aumento na atividade das PODs nos genótipos
resistentes durante os primeiros estágios da infecção em ambos os patossistemas, indicando a
ativação do sistema de defesa das plantas.
Moniliophthora perniciosa, agente causador da VBC, é considerado um dos principais
patógenos das regiões produtoras de cacau da América Tropical por causar perdas de 50 até
90% na produção de cacau dos países produtores tais como o Brasil (ALMEIDA et al., 2017).
A VBC afeta principalmente tecidos meristemáticos em desenvolvimento: gemas vegetativas,
almofadas florais e frutos jovens, sendo este último considerado o principal produto comercial
derivado do cacaueiro, por sua utilização como matéria prima na elaboração de produtos
industriais, tais como o chocolate (Boletim Agronegócio da SEBRAE, 2014).
Embora o processo infeccioso de M. perniciosa no ápice apical, bem como a influência
da cera cuticular na resistência a VBC tenha sido descrito por Sena et al. (2014), e a
sintomatologia da doença nos diversos órgãos da planta de cacaueiro sejam bem relatados por
Silva et al., (2002); a interação M. perniciosa – frutos de cacaueiro ainda é pouco esclarecida.
11
Esta dissertação busca, através de estudos histopatológicos e avaliações bioquímicas no
metabolismo do hospedeiro, melhorar a compreensão do comportamento do patógeno em frutos
de cacaueiro no que tange ao processo infeccioso do fungo e aos mecanismos de resistência do
hospedeiro. Considerou-se a hipótese de que frutos de cacaueiro do genótipo TSH1188
apresenta mecanismos estruturais e bioquímicos que dificultam ou retardam a ação de M.
perniciosa. Os objetivos específicos foram: (i) investigar e comparar o processo infeccioso de
M. perniciosa, (ii) aprofundar sobre a evolução fenotípica dos sintomas da doença neste tecido
hospedeiro, (iii) avaliar as estruturas presentes na superfície de frutos de cacaueiro que possam
influenciar o estabelecimento de M. perniciosa, e (iv) estudar a atividade das enzimas
peroxidase do ascorbato (APx) e peroxidase do guaiacol (GPx) na interação M. perniciosa –
frutos de cacaueiro.
Para o agricultor, o entendimento destes eventos oferece o potencial para aumentar a
eficiência das medidas de controle existentes. Por exemplo, o desenvolvimento de alerta
fitossanitário que indique o alvo e o período fenológico mais apropriado para aplicação de
fungicidas em frutos. À comunidade científica, o conhecimento do processo infeccioso de M.
perniciosa em frutos de cacaueiro e o esclarecimento sobre os mecanismos de resistência que
operam neste patossistema, contribuem para estudos futuros na área de biologia molecular, por
exemplo, no screening de genes de resistência para determinação das características de
resistência ativadas durante o ciclo da doença.
12
REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A interação planta – patógeno e o estabelecimento da infecção
Na interação planta – patógeno a maioria dos eventos que levam ao estabelecimento da
infecção estão envolvidos com o estabelecimento das relações parasíticas ou com a resistência
da planta hospedeira que ocorrem a nível celular, bioquímico e molecular (JONES; DANG,
2006). As interações planta – patógeno são classificadas em compatíveis (patógeno virulento –
hospedeiro suscetível) e incompatíveis (patógeno avirulento e hospedeiro resistente)
(RESENDE et al., 2003). Na interação compatível o patógeno é capaz de mascarar ou reprimir
os mecanismos de resistência do hospedeiro podendo seguir seu desenvolvimento nos tecidos
vegetais e colonizar a planta hospedeira.
Nas interações planta-patógeno incompatíveis, o reconhecimento do produto de um gene
de avirulência (AVR) codificado pelo microrganismo é dado através do produto de um gene de
resistência (R) no hospedeiro. Neste tipo de resistência há a interação cultivar x raça
(MARATHE & DINESH-KUMAR, 2003) e o mecanismo de ação desta resistência atua de
acordo com o modelo de interação gene-a-gene (FLOR, 1956) o que desencadeia mecanismos
de defesa que previnem o crescimento do patógeno (FLOR 1971, HAMMOND-KOSACK &
JONES, 1996). Por outro lado, nas interações compatíveis o gene R ou seu correspondente gene
AVR é ausente, desta maneira o patógeno coloniza e causa doença (STASKAWICZ et al., 2002;
GACHOMO et al., 2003).
As interações entre as plantas e fungos patogênicos são de extremo interesse para a
humanidade, uma vez que grande parte da economia mundial tem por base a utilização de
espécies vegetais, as quais podem sofrer sérios danos em virtude do ataque de patógenos
(BARBIERI & CARVALHO, 2001). Em torno de dois terços das espécies conhecidas de
13
fungos estabelecem íntimas relações com outros organismos vivos e exercem uma grande
influência na evolução de seus hospedeiros, adaptando-se por sua vez às mudanças do genótipo
hospedeiro para aumentar as situações de íntima co-evolução (PYROZINSKI
&HAWKSWORTH, 1988). Fungos demonstram uma enorme diversidade no modo pelo qual
interagem com seus hospedeiros, sendo que enquanto alguns podem viver por longos períodos
em tecidos mortos do hospedeiro, outros dependem completamente das células vivas de seu
hospedeiro (BURDON & SILK, 1997). O sucesso no estabelecimento da doença também
depende de fatores ambientais, como disponibilidade de água, temperatura e molhamento da
superfície do hospedeiro. A maioria dos fungos depende do filme de água no estado líquido
para germinar e causar infecção. Portanto, o processo infeccioso, o qual inclui as fases de pré-
penetração, penetração e colonização, é grandemente influenciado pelas condições de infecção
do patógeno e as características tanto do hospedeiro quanto do meio ambiente.
Inicialmente o patógeno é aderido à superfície do hospedeiro mediante a produção de
adesinas e enzimas, consideradas materiais adesivos que possuem a função de promover a
fixação da estrutura fúngica no hospedeiro (PASHOLATI, 1998), bem como o reconhecimento
da superfície do hospedeiro (TUCKER; TALBOLT, 2001; SENA et al., 2008). Em seguida
ocorre a germinação do esporo fúngico. A germinação é uma resposta fisiológica a diversos
estímulos, tanto ambientais quanto das características da superfície do hospedeiro. O esporo
fúngico é considerado germinado quando o comprimento do tubo germinativo desenvolvido
alcança pelo menos o mesmo tamanho do esporo (D’ENFERT et al. 1997). A extensão do tubo
germinativo é geralmente o estágio de desenvolvimento em que a percepção da superfície do
hospedeiro ocorre (DEZWAAN et al. 1999). Se os sinais físicos e químicos apropriados, tais
como dureza da superfície do hospedeiro, hidrofobicidade e topografia da superfície
(WESSELS, 1994) são detectados pelo tubo germinativo, é induzido um complexo
morfogênico resultando no alongamento da estrutura (HOCH & STAPLES et al. 1987,
TALBOT et al. 1996).
Enquanto alguns fungos utilizam aberturas naturais e ferimentos para penetrarem no
tecido da planta, outros empregam estruturas especializadas, denominadas apressórios
localizadas na ponta dos tubos germinativos. Em algumas espécies, a formação do apressório
pode ser obrigatória para infecção, enquanto para outros pode ser opcional ou desnecessária. O
desenvolvimento do apressório passa pelas fases de iniciação, maturação e produção do peg de
infecção ou germinação. O papel dos apressórios é aderir firmemente ao substrato mediante a
aplicação de uma alta pressão de turgor que permite a penetração da hifa na epiderme da planta.
14
Variações morfológicas durante a formação do apressório podem surgir devido a uma série de
fatores físicos, químicos e genéticos. O tempo também é fator importante na formação do
apressório, a sua formação, na maioria das espécies vegetais, dá-se de 6 a 12 horas após a
inoculação sob condições favoráveis (EMMETT; PARBERY, 1975). A penetração que
acontece mediante influência do apressório geralmente ocorre após a formação das estruturas
de infecção, devido ao que, quanto mais tempo o fungo permanecer na superfície do hospedeiro,
mais vulnerável ele ficará a dessecação, a competição com outros habitantes do filoplano da
planta, aos mecanismos de defesa do hospedeiro e a redução dos seus nutrientes de reserva,
resultando na falha do processo de infecção. A penetração pode ser realizada pela secreção de
enzimas com capacidade de degradação da cutícula, por exemplo as cutinases, pectinases,
celulases, hemicelulases e ligninases, que degradam cutina e compostos da parede celular,
enquanto para outras a penetração é alcançada predominantemente baseados na força mecânica,
ou mediante a combinação de ambos os processos, por exemplo, a degradação da cutícula pela
ação de enzimas pectinolíticas, celulases e ligninases nos patossistemas Rhizopus spp –
pêssego, Fusarium spp – trigo e Phellinus spp – pinheiro; respectivamente (Agrios, 2005).
O entendimento da fase de pré-penetração, a qual se inicia com a germinação do esporo
até a penetração da hifa infectiva, permite esclarecer como as plantas são infectadas,
colaborando desta maneira na definição de estratégias que impeçam ou dificultem a penetração
do patógeno nos tecidos do hospedeiro e assim contribuir ao seu controle.
2.2. Mecanismos de resistência e defesa das plantas contra fitopatógenos
A interação patógeno – hospedeiro pode ser encarada como uma luta pela sobrevivência
entre dois organismos. Não só a planta deve ser capaz de reconhecer e defender-se contra um
potencial agente patogênico, mas este deve também ser capaz de manipular e suplantar os
mecanismos de defesa da planta para criar um ambiente adequado para o seu crescimento e
reprodução (BOYD et al., 2013; MONAHAN et al., 2012). Durante milhões de anos
convivendo no mesmo ambiente, plantas e patógenos desenvolveram um complexo sistema de
interação entre eles (TYLER et al., 2006). A diferença fundamental entre plantas resistentes e
suscetíveis consiste no reconhecimento do patógeno e na ativação rápida e eficaz dos
mecanismos de defesa do hospedeiro, que é iniciado pelo reconhecimento de moléculas
elicitoras do patógeno (DANGL & JONES, 2001). As plantas possuem um aparato estrutural
15
e bioquímico que compõe seu mecanismo de defesa contra a ação de agentes bióticos, abióticos
e físicos (RIBEIRO, 2010). As características estruturais agem como barreiras físicas e inibem
a entrada e disseminação do patógeno, e as reações bioquímicas que ocorrem em células e
tecidos da planta produzem substâncias que ou são tóxicas diretamente para o patógeno, ou
criam condições que inibem o desenvolvimento do patógeno na planta (AGRIOS, 2005). Estes
mecanismos se diferem nos diversos patossistemas e variam com a idade da planta e o tipo de
órgão e tecido atacado (STANGARLIN et al., 2011). A topografia da superfície do hospedeiro,
a constituição da cera epicuticular, bem como quantidade e tipo de tricomas e estômatos, assim
como o período de abertura / fechamento destes últimos, são considerados mecanismos de
resistência pré-formados ou constitutivos (DURBIN, 1988). Este tipo de defesa é, portanto, o
principal mecanismo de resistência que restringe a infecção e influência na penetração de vários
fitopatógenos (HEATH, 2000; PASCHOLATI e LEITE, 1995). Por exemplo, mediante
avaliações histológicas e de dureza de casca observou-se que as células mais externas da
epiderme, em conjunto com a cutícula, agem como barreiras defensivas (MARTIN, 1964).
Neste contexto, cultivares de pêssego consideradas significativamente mais resistentes
apresentaram maior espessura da sua epiderme em comparação aos cultivares suscetíveis,
podendo relacionar esta característica com o atraso na penetração do fitopatógeno e maior
período de incubação deste (ADASKAVEG; FELICIANO; OGAWA, 1991).
A relação entre a camada de cera cuticular nas plantas e resistência a doenças tem sido
demostrado em vários patossistemas, inclusive no patossistema M. perniciosa – cacau
(meristema). Sena et al. (2014) determinaram que extratos cuticulares de genótipos
considerados resistentes apresentaram uma ação inibitória de 80% na germinação dos
basidiósporos de M. perniciosa, sugerindo que a cera cuticular, além de estabelecer uma
barreira física na defesa vegetal também possui um envolvimento químico no mecanismo de
defesa de T. cacao a M. perniciosa. Outras estruturas que agem como barreira física na defesa
vegetal são os tricomas de múltiplas formas e tamanhos presentes na superfície da planta,
podendo ser simples (não glandulares) ou glandulares, estes últimos atuam tanto como barreira
física quanto química a ação do patógeno (Figura 1). Maior densidade de tricomas na superfície
da planta aumenta a captura e retenção de partículas transportadas pelo ar, como o pólen e
esporos fúngicos (RODA et al., 2003), dificultando o contato destas moléculas com a superfície
da planta. Por outro lado, por estarem geralmente espalhados na totalidade do filoplano dos
tecidos vegetais, estes influenciam na deposição do filme de água necessária para a adesão dos
esporos fúngicos na superfície do hospedeiro. Por ex. em uva, a resistência contra Plasmopara
16
vitícola, agente causal do míldio da uva, foi relacionada ao elevado número de tricomas na área
abaxial das folhas (KORTEKAMP & ZYPRIAN, 1999). É citado também que os tricomas
glandulares exsudam metabólitos secundários, alguns dos quais possuem propriedades
antifúngicas. Segundo Nonomura et al. (2009), as substâncias secretadas pelos tricomas
glandulares na superfície das folhas de tomateiro flui a partir das glândulas secretoras dos
tricomas, cobrindo o plano da folha e inibindo a germinação dos esporos fúngicos de Oidium
neolycopersici, agente causal do oídio do tomateiro.
Figura 1. Papel na prevenção da infecção patogênica de diversas estruturas associadas à superfície das plantas.
FONTE: Autora, adaptado de Lázniewska et al., 2012.
A densidade e tipo de estômatos como mecanismos de resistência (Figura 1) têm sido
citada em vários patossistemas, inclusive no patossistema Oncobasidioum theobromae – T.
cacao, onde Indah et al. (2013) demostrou que folhas de clones resistentes a O. theobromae
apresentam menor número de estômatos na sua superfície e abertura estomática menor em
ralação às folhas dos clones suscetíveis, dificultando a penetração através de estômatos, e, por
conseguinte, relacionando este fato com os mecanismos de resistência à doenças. O período de
abertura dos estômatos também é muito importante no estabelecimento do processo infeccioso
dos fitopatógenos. Por exemplo, no patossistema Puccinia graminis f. sp. tritici – trigo,
variedades resistentes apresentaram abertura estomática tardia, como consequência disto o tubo
germinativo não consegue penetrar os tecidos do hospedeiro.
17
Além dessas estruturas pré-existentes, encontram-se na matriz celular da planta ou na
membrana plasmática sítios receptores chamados de PRRs (pattern recognition receptors) que
reconhecem padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs). A percepção ocorre
quando moléculas indutoras das respostas de defesa ligam-se às moléculas receptoras situadas
nas membranas das células vegetais, e uma vez ligadas aos receptores presentes em células
vegetais, estas acionam cascatas de sinalização que ativam genes relacionados com a defesa
vegetal (DE WIT et al., 2007). Moléculas sinalizadoras de respostas de defesa têm sido
determinadas em vários patossistemas, por exemplo, nas interações planta - fungos, a chamada
Pep13 (NURNBERGER et al., 2004) e a lecitina que dispara as respostas de defesa em
Arabidopsis e tabaco (GAULIN et al., 2006).
Após este reconhecimento, é desencadeado um fluxo massivo de íons celulares
conhecidos como explosão oxidativa que consiste na geração e acúmulo de espécies reativas de
oxigênio (ROS), tais como peróxido de hidrogênio (H2O2), ânion superóxido (O2-), e radical
livre hidroxila (OH-) (BARBOSA et al., 2014). O acúmulo de ROS nas células da planta
constitui uma resposta rápida de defesa na planta. As ROS por serem tóxicas ao patógeno
influenciam na colonização dos tecidos do hospedeiro, prevenindo a difusão do patógeno,
participando no cruzamento oxidativo (“cross-lining”) de proteínas da parede celular formando,
com a matriz de polissacarídeos, um grande polímero de várias glicoproteínas ricas em
hidroxiprolina, reforçando estruturalmente a parede celular do hospedeiro (ALVAREZ et al.,
1998).
Paralelamente à produção e acúmulo de ROS nos tecidos da planta é produzido um
aumento na atividade das enzimas oxidativas da classe das peroxidases (PODs). Estas enzimas
chaves no metabolismo da planta são conhecidas por participar em vários processos fisiológicos
de grande importância (HOAGLAND, 1990). O papel destas enzimas no processo de defesa
das plantas é reforçar a parede celular a partir da formação de lignina, suberina, polissacarídeos
ferulicolados e glicoproteínas ricas em hidroxiprolina (BOWLES, 1990). Diversos autores
verificaram que o aumento da enzima POD confere proteção em fumo contra o TMV e aos
fungos Cercospora nicotianae, Phytophthora tabacina, Phytophthora parasitica (FRIEDRICH
et al., 1996); em Arabidopsis thaliana contra o fungo P. parasítica (LAWTON et al., 1996); e
no cacaueiro contra M. perniciosa (RESENDE; MACHADO, 2000). Ambos os tipos de
mecanismos de defesa, tanto os pré- quanto os pós-formados são geneticamente determinados,
e sua efetividade mostra-se dependente da expressão dos mesmos no momento certo, na
magnitude adequada, e em uma determinada sequência lógica, após o contato do patógeno com
18
o hospedeiro (STADNIK, 2000; CAMARGO & BERGAMIN FILHO, 1995;
VANDERPLANK, 1968).
Muitos estudos têm sido desenvolvidos na identificação dos possíveis mecanismos de
resistência e defesa desenvolvidos pela planta sob infecção do patógeno, pois, o controle de
doenças torna-se mais efetivo, econômico e ecológico quando se utilizam diversas táticas de
forma integrada. Dentre as quais, a utilização da resistência genética representa um dos métodos
de controle mais eficientes, de fácil acesso aos produtores e econômico, reduzindo de forma
expressiva, os prejuízos com a doença e custo de produção (REZENDE et al., 2005) graças ao
desenvolvimento de ações moleculares e biológicas duráveis para proteção e melhoramento das
culturas (CAMARGO & BERGAMIN FILHO, 1995).
2.3. O patossistema Theobroma cacao – Moniliophthora perniciosa
A VBC causada pelo basidiomiceto M. perniciosa, é considerada um dos maiores
problemas fitopatológicos das regiões produtoras de cacau do Brasil. Causando uma queda de
até um 70% na produção desta cultura, trazendo grandes prejuízos sociais e econômicos à região
(RESENDE et al., 2007). Por muitos anos, o Brasil foi um dos principais exportadores de grãos
de cacau, no entanto, com a introdução da VBC na Bahia, em 1989, o Brasil deixou de ser o
segundo maior produtor de cacau do mundo, e hoje alcança a posição número seis no ranking
de maiores produtores de cacau do mundo (MONDEGO et al., 2016).
O fungo produz pequenos (2-3 cm de largura) basidiomas, e nestes, em estruturas
chamadas de basídios, os basidiósporos são formados. Os basidiósporos de M. perniciosa
infectam tecidos meristemáticos (meristema apical, almofadas florais e frutos em
desenvolvimento) produzindo uma série de sintomas que dependem do órgão infectado e do
seu estágio de desenvolvimento (PURDY & SMITH, 1996). A germinação dos basidiósporos
e o alongamento (extensão) do tubo germinativo ocorre entre as 6 e 12 horas após os
basidiósporos entrarem em contato com a planta (SILVA et al., 2002; SREENIVASAN &
DABYDEEN 1989; KILARU & HASENSTEIN, 2005). Depois desse período, os tubos
germinativos penetram diretamente as aberturas naturais, e os estômatos nos tecidos do
cacaueiro (SENA et al., 2014).
19
Durante a fase biotrófica de M. perniciosa, os basidiósporos germinam como um micélio
monocariótico colonizando intercelularmente os tecidos corticais, seguido pelo esclerênquima,
tecidos vasculares, e a medula (CEITA et al., 2007; SENA et al., 2014). Depois de algumas
semanas, os tecidos colonizados sofrem necrose que é desencadeada por um mecanismo
desconhecido, quando as hifas fúngicas formam grampos de conexão e se tornam dicarióticas,
crescendo tanto inter quanto intracelularmente. (DELGADO & COOK, 1976; SENA et al.,
2014).
Os primeiros sintomas visíveis da infecção é um intumescimento do meristema apical das
plantas devido à hipertrofia dos brotos que perdem a dominância apical, e clorose das folhas
novas. Caracterizando a “vassoura verde” (fase biotrófica) (Figura 2A-E). Depois de um
período de aproximadamente 90 dias é observada a necrose dos tecidos infectados onde a
vassoura verde torna-se “vassoura seca” (fase necrotrófica) (Figura 2F) (EVANS, 1980;
MEINHARDT et al., 2008; TEIXEIRA et al., 2014; MONDEGO et al., 2016).
Figura 2. Caracterização macroscópica dos sintomas da vassoura-de-bruxa do cacaueiro. A) meristema
apical com 2 dias após inoculação; B) leve inchamento do meristema; C) hipertrofia apical e inchação da
haste; D) vassouras verdes terminais com perdida de dominância apical; E) vassouras verdes terminais
axiais e F) vassoura necrotrófica ou seca. Sena et al., 2014.
20
Além desses sintomas próprios da planta de cacaueiro que dão o nome à doença, muitos
são os danos ocasionados por M. perniciosa em frutos de cacaueiro, principal produto
comercial, considerados a matéria prima para elaboração de produtos industriais tais como o
chocolate. Frutos infectados, dependendo da sua idade exibem uma grande variedade de
sintomas (Figura 3). As infecções de flores resultam em vassouras de almofada e
desenvolvimento de fruto “morango” ou “cenoura” (Figura 3A-B). As infecções em frutos
jovens apresentam na casca uma lesão preta, dura e irregular (Figura 3C) enquanto que a
infecção tardia causa pontuações pretas e lesões necróticas e irregulares (Figura 3E).
Internamente, o endocarpo apresenta pontos necróticos de diferentes tamanhos com liquefação
da mucilagem (Figura 3F) (GRAMACHO et al., 1992; SILVA et al., 2002). Após a necrose
tecidual ocorre uma degradação da polpa e sementes pelo micélio saprofítico, provavelmente
com o envolvimento de enzimas hidrolíticas que criam um ambiente adequado para sua
sobrevivência (GRIFFITH et al., 1994; PURDY & SCHIMIDT, 1996), e posteriormente a
formação de basidiomas, estruturas reprodutivas do fungo onde se formam os basidiósporos
que darão continuidade ao ciclo de vida do patógeno (FRIAS et al., 1991; SILVA, 1997).
Figura 3. Sintomas da vassoura-de-bruxa do cacaueiro em frutos de cacaueiro. A) frutos com
conformação “cenoura”; B) frutos com conformação “morango”; C) lesões necróticas; D) halos
amarelados; E) pontuações pretas e duras e F) hidrólise de polpa e sementes. Silva et al., 2002.
21
Historicamente, pesquisadores têm tentado uma grande variedade de métodos para o
controle da VBC incluindo poda fitossanitária, aplicação de fungicidas e o controle biológico,
bem como a utilização de variedades resistentes (BROWN, 2015; MEINHARDT et al., 2008;
MEDEIROS et al., 2010), considerada a medida mais atrativa devido ao baixo requerimento de
fungicidas reduzindo assim o impacto tanto ambiental quanto o impacto na saúde humana
(NYADANU et al., 2009).
Os cultivares resistentes as doenças tipicamente são gerados incorporando genes de
resistência em genótipos específicos através da reprodução ou cruzamento, no entanto, para
alcançar resistência durável a um determinado patógeno, o conhecimento abrangente da
interação patógeno-hospedeiro é necessário (SHAW & VANDENBON, 2007; MARELLI et
al., 2009; SILVA et al., 2014). Neste contexto, o entendimento do processo infeccioso e do
desenvolvimento da doença nos tecidos infectados com diferentes níveis de resistência à VBC
são necessários para conhecer e avaliar os níveis de resistência a doença mediante a resposta
do hospedeiro ao patógeno.
As comparações, através da observação mediante microscopia eletrônica e avaliações das
mudanças bioquímicas no metabolismo do hospedeiro nas interações suscetíveis (compatíveis)
e resistentes (incompatíveis) da planta–patógeno, permitiram a análise no que tange à
microestrutura do fungo e do hospedeiro. Além da função e cinética enzimática do hospedeiro
desde a fase inicial da interação que inclui a deposição, aderência e germinação dos
basidiósporos possibilitando a caracterização do processo infeccioso e de possíveis barreiras
físicas e /ou químicas à sua penetração. Assim como, permitirá acompanhar a evolução da
doença a nível celular em frutos resistentes e suscetíveis a doença devido ao que, apesar de já
descritos por alguns autores em outros tecidos de T. cacao, os mecanismos estruturais de
resistência e bioquímicos de defesa precisam ser bem definidos no patossistema frutos de
cacaueiro–M. perniciosa. Contudo, o citado acima poderá facilitar a compreensão dos
mecanismos de ação do patógeno, contribuindo com estudo futuros na área molecular e melhor
manejo da doença.
22
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção do material vegetal, inoculação e avaliação fenotípica
Frutos de cacaueiro provenientes de polinização aberta dos genótipos TSH1188 e
Catongo; respectivamente padrões de resistência e suscetibilidade à VBC, foram utilizados
neste trabalho. O experimento foi montado em campo, em delineamento experimental
inteiramente casualizado, com dois genótipos, com e sem inoculação, e 15 tempos de coleta.
Foram feitas três repetições de três frutos cada, e utilizadas 20 testemunhas por genótipo (10
frutos inoculados e 10 não inoculados) perfazendo um total de 580 frutos.
Os frutos foram inoculados com uma suspensão de 2x105 basidiósporos/mL segundo
metodologia descrita por Frias et al. (1991) adaptada as condições de campo no intuito de
atender este trabalho: (i) seleção de frutos com cerca de 45 dias de formação (+/- 6cm de
tamanho) e marcação no fruto da área a ser inoculada; (ii) inoculação do local previamente
marcado com inóculo em papel filtro; e (iii) envolvimento dos frutos inoculados em sacos
plásticos transparentes umedecidos com água destilada esterilizada como medida para obtenção
de uma câmara úmida artificial. Para os frutos controle foram seguidos todos os passos
anteriores, mas a inoculação foi feita com água destilada estéril.
Para acompanhar a evolução dos sintomas da VBC em frutos de genótipos contrastantes,
cada fruto foi inspecionado semanalmente até os 120 dias após inoculação (DAI). Os frutos
foram avaliados quanto ao: (i) período de incubação, (i) amadurecimento aparente, (ii)
pontuações negras e duras, (iii) lesões necróticas duras e (iv) colonização e hidrólise das
amêndoas. A sintomatologia da doença foi avaliada conforme descrito por Silva et al. (2007).
23
3.2 Processo infeccioso de Moniliophthora perniciosa em frutos de cacaueiro
Segmentos de frutos inoculados e não inoculados com aproximadamente 1cm3 de
tamanho foram coletados às 3, 5, 6, 8 e 12 horas após inoculação (hai), fixados em solução de
Glutaraldeído 2% e tampão de sódio e processados para MEV de acordo com metodologia
descrita por Sena et al. (2014). Em seguida, as amostras foram montadas em suportes especiais
de alumínio (Stub’s) com auxílio de fita dupla face, metalizadas mediante banho de ouro e
observadas em microscópio eletrônico JEAOL JSM6390LV na Fundação Oswaldo Cruz,
FIOCRUZ em Salvador, BA Brasil. Os esporos e as estruturas tanto do fungo quanto do fruto
foram fotografados com uma câmera digital CCD de 8 megapixels acoplada ao microscópio.
Em cada amostra foram avaliadas as seguintes variáveis: (i) micromorfologia/topografia da
superfície do fruto, (ii) número e tipo de tricomas, (iii) número e tipo de estômatos, (iv) número
de esporos aderidos, considerada uma variável qualitativa (+/ -), (v) germinação de
basidiósporos; um esporo foi considerado germinado quando o comprimento do tubo
germinativo fosse igual ou maior ao diâmetro do esporo, e (vi) tipo de penetração.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, para cada tempo de coleta
dois stubs foram montados, cada um contendo 3 repetições biológicas. Em cada repetição
biológica foram observados 5 campos visuais de 400µm (250x). Cada uma das variáveis
descritas acima foi analisada através do software SAS (Statistical Analysis System) mediante
ANOVA com agrupamento de médias por significância (p<0,05) pelo teste de Duncan. Foram
feitas análises de múltiplos efeitos (multiple effects -SLICE) comparando genótipo x tratamento
x tempo de coleta para determinar interação entre as variáveis.
3.3 Ensaios enzimáticos, determinação da atividade da peroxidase do guaiacol (GPx) e da
peroxidase do ascorbato (APx)
Amostras de segmentos de frutos inoculados e não inoculados de ambos os genótipos,
nos tempos 0, 3, 6, 12, 24 HAI e 2, 3, 15, 45 e 116 DAI; com um tamanho aproximado de 1cm3
foram coletadas e imediatamente submersas em nitrogênio líquido e estocadas em -80°C
durante 24 horas, após esse tempo foram liofilizadas para uso posterior.
Para determinação das atividades das enzimas GPx e APx usou-se 0,04g de extrato seco
de cada tempo de coleta, isto foi misturado com 0,028g de antioxidante polivinilpirrolidona
24
(PVPP) mais 800µl de tampão fosfato de sódio 50mM pH 6,0 para obtenção do extrato bruto
de frutos de cacaueiro para determinação da GPx e 800µl de tampão fosfato de potássio 50mM
pH 7,0 para obtenção do extrato bruto de frutos de cacaueiro para determinação da APx. Em
seguida, os extratos brutos de cada enzima foram sonicados sob amplitude de 70% em sonicador
SONICS, Vibra cell com 5 pulsos de 5” (ON) e intervalos de 10” (OFF). Posteriormente foram
centrifugados durante 15 minutos com velocidade de 13,400rpm. Os sobrenadantes foram
aliquotados em microplaca de Elisa 96 poços (GREINER BIO ONE INTERNATIONAL, NC,
EUA). Para 30µl do sobrenadante adicionou-se a cada repetição experimental 140µl de MIX
de reação (guaiacol 40mM, H2O2 0,06% e fosfato de sódio 20mM pH 6,0) e 110µl de tampão
fosfato de sódio 50mM pH 6,0 para determinação da GPx e 150µl de MIX de reação (EDTA
500mM, ácido ascórbico 5mM e tampão fosfato de potássio 50mM pH 7,0) mais 20µl de H2O2
para determinação da APx. As placas foram submetidas a leitura em espectrofotômetro
Espectramax Paradigm (Molecular Devices, CA EUA) a 470nm para GPx e 240nm para APx.
A atividade da GPx foi determinada pelo aumento do consumo de guaiacol e expressa em
nmol.g-1ML.h-1, para APx pela diminuição da absorbância e expressa em nmol de ascorbato.g-
1MS.h-1, sendo ML, massa liofilizada e MS, massa seca. Segundo metodologias descritas por
Rehem et al. (2011) e Nakano & Asada (1981) respectivamente.
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado com 3 repetições
biológicas, cada repetição contendo um pool de 3 segmentos de fruto de aproximadamente 1cm3
e com 4 repetições experimentais para cada tempo de coleta em ambos os genótipos e
tratamentos. Os resultados das leituras foram analisados através do software SAS (Statistical
Analysis System) mediante avaliações de medidas repetidas no tempo, com agrupamento de
médias por significância (p<0,05) pelo teste de Duncan 5% e avaliações de covariâncias para
determinação de correlação presente nas variáveis genótipo x tratamento x tempo de coleta.
25
RESULTADOS
4.1 Evolução dos sintomas de vassoura-de-bruxa em frutos de cacaueiro de genótipos
contrastantes
A sintomatologia da doença em frutos variou entre os genótipos de cacau com diferentes
níveis de resistência a VBC os quais; respectivamente, apresentaram 64% e 24% de incidência
da doença. A evolução dos sintomas da doença em genótipos contrastantes está apresentada na
Tabela 1.
No Catongo, genótipo suscetível (Figura 4A), os primeiros sintomas da doença foram
observados aos 15 DAI (Figura 4B) no ponto onde foi depositado o inóculo na concentração
de 20.000 basidiósporos/ml. Estes frutos apresentaram uma zona de amarelecimento e pequenos
pontos necróticos que evoluíram a uma lesão necrótica dura e irregular aos 30 DAI (Figura
4C). Internamente as amêndoas apresentaram-se assintomáticas aos 15 DAI, com pontuações
necróticas na área do pedúnculo. Aos 30 DAI, no interior do fruto no local da lesão externa, em
corte transversal, também se observou lesão necrótica na casca e amêndoas necrosadas. Aos 45
DAI (Figura 4D) observou-se a presença de uma lesão maior, irregular, preta e dura que se
estendeu até o pedúnculo do fruto. Estes quando abertos apresentavam colonização da placenta
e dos cotilédones, com cerca de 60% das amêndoas inviáveis ao plantio. Aos 60 DAI (Figura
4E) todo o fruto apresentou mancha dura e necrótica. Internamente o fruto apresentou-se
necrosado e parcialmente seco, com aproximadamente 95% das amêndoas necrosadas, sem
indício de hidrólise.
Contrário do genótipo suscetível, os frutos de TSH1188, genótipo resistente,
apresentaram longo período latente do fruto. Ao longo das avaliações fenotípicas desenvolvidas
desde as 0 HAI até os 60 DAI (Figura 4F-J) os frutos apresentaram-se totalmente
assintomáticos, conservando sua cor característica (roxo – avermelhado), tamanho consistente
26
a seu desenvolvimento cronológico (5 – 30cm), apresentando tanto polpa como sementes
viáveis para consumo/plantio.
Tabela 1. Caracterização da evolução sintomática da vassoura-de-bruxa em frutos de cacaueiro de genótipos
contrastantes a doença.
Tempo
avaliado
CATONGO TSH1188
0 – 120 HAI Assintomático Assintomático
15DAI Zona de amarelecimento e pequenos
pontos necróticos na área donde foi
depositado o inóculo com pontuações
necróticas na área do pedúnculo.
Amêndoas assintomáticas.
Assintomático
30 DAI Lesão necrótica e dura rodeada de um
halo amarelado desde a região média
do fruto até seu ápice, tanto externa
quanto internamente. Amêndoas
sintomáticas com 50% de
inviabilidade.
Assintomático
45 DAI Lesão necrótica, irregular e dura, da
região média do fruto até o pedúnculo
com lesões necróticas circundadas
por halos amarelados espalhados pela
totalidade do fruto. Amêndoas
sintomáticas com cerca de 60% de
inviabilidade.
Assintomático
60 DAI Necrose preta e dura geral da
totalidade do fruto. Necrose interna.
Aproximadamente 95% das
amêndoas inviáveis.
Assintomático
27
Figura 4. Caracterização da evolução sintomatológica da vassoura-de-bruxa do cacaueiro em
frutos de cacau de genótipos contrastantes para resistência a doença.
28
4.2 Caracterização dos mecanismos de resistência e do processo infeccioso de
Moniliophthora perniciosa em frutos de cacaueiro.
A camada de cera em ambos os genótipos não apresentou diferença morfológica
significativa. No entanto, a topografia da superfície de ambos os genótipos apresentou-se
levemente diferenciada. No genótipo resistente observou-se um padrão de superfície amorfo
(Figura 5C-D), sendo seu relevo constituído por depressões e ondulações da epiderme ao longo
da sua superfície. O genótipo suscetível, pelo contrário, apresentou superfície majoritariamente
plana e uniforme.
Figura 5. Eletromicrografia da superfície de frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes a
vassoura-de-bruxa do cacaueiro mostrando as características da sua superfície e os tipos de tricomas.
A) genótipo suscetível (Catongo); relevo plano com presença de tricomas glandulares, B) tricoma
estrelar composto por célula basal (Cb) e ramificações (R), C) genótipo resistente (TSH1188); relevo
amorfo com presença de tricomas glandulares compostos por célula basal (Cb), pedículo (P) e célula
secretora (Cs), e D) camada amorfa de cera epicuticular (seta branca) no genótipo resistente.
Ambos os genótipos apresentaram tanto tricomas glandulares como estrelares. As
características morfológicas foram condizentes com o descrito na literatura, em que os tricomas
glandulares apresentaram-se compostos de uma célula basal aderida à epiderme do fruto, um
pedículo que constitui o corpo do tricoma e uma cabeça unicelular secretora (Figura 5C). Os
tricomas estrelados caracterizaram-se por serem pluricelulares, compostos de uma célula basal
29
e geralmente multisseriados com 3 ramificações alongadas (Figura 5B). A densidade total de
tricomas por cm2 (Figura 5C) foi significativamente maior no TSH1188 (569,8 tricomas/cm2)
em relação ao Catongo (292,0 tricomas/cm2) (Figura 6A-B), com predominância significativa
(p<0.05) (Figura 6C) de tricomas glandulares em ambos os genótipos.
Figura 6. Eletromicrografia da superfície de frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes a vassoura-
de-bruxa do cacaueiro mostrando a densidade de tricomas por genótipo no: A) Catongo genótipo
suscetível, B) TSH1188 genótipo resistente e, C) número médio de tricomas na superfície de ambos os
genótipos. Médias com letras diferentes apresentam diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan
a 5%.
Com relação aos estômatos, ambos os genótipos apresentaram estômatos amonocíticos,
constituídos por uma abertura chamada “ostíolo” e duas células guarda responsáveis pela
fechadura/abertura do mesmo (Figura 7C). Estes estômatos caracterizaram-se pela ausência de
células subsidiárias. Contudo, houve variação na localização destes na superfície dos frutos, em
que no TSH1188, os estômatos comumente apresentaram-se no filoplano do fruto (Figura 7A-
C), enquanto que no Catongo, os estômatos foram observados em invaginações na epiderme do
fruto, as chamadas “criptas estomáticas” (Figura 7D-E). Entretanto, de maneira geral e
independente do tipo de estômato, não houve diferença significativa com respeito à densidade
de estômatos/cm2 contabilizados entre os genótipos estudados.
30
Figura 7. Eletromicrografia de varredura da superfície de frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes
a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. A, B, C) Catongo, genótipo suscetível, estômatos amonocíticos
localizados em criptas estomáticas. Cg= células guarda; *ostíolo. D, E, F) TSH1188 genótipo resistente,
estômatos amonocíticos com ausência de células subsidiarias.
31
O processo infeccioso de M. perniciosa em frutos de cacaueiro foi registrado mediante
capturas fotográficas de microscopia eletrônica de varredura (Figura 8). Observou-se os
eventos de pré-penetração caracterizado pela a adesão dos basidiósporos de M. perniciosa à
superfície do fruto e formação do hilo (Figura 8A), emissão e alongamento do tubo germinativo
(Figura 8B-C), e esporos rodeados de matriz amorfa mucilaginosa com aparente dissolução da
cera epicuticular do fruto no local de contato da estrutura fúngica com a superfície do fruto
(Figura 8D-E). Observou-se a ausência de apressório e a formação de hifas com ponta “club-
shaped” (Figura 8F).
De maneira geral, diferença significativa também foi observada entre os genótipos
avaliados (p<0.05) para todas as variáveis testadas durante os eventos de pré-penetração do
processo infeccioso de M. perniciosa em frutos de cacaueiro (Tabela 2). Pela análise de
variância a interação genótipo/tempo foi significativa (p<0.05) mostrando uma tendência de
incremento nos valores observados tanto para a adesão como para germinação dos
basidiósporos; indicando variações de acordo com o genótipo. A adesão de basidiósporos no
Catongo iniciou-se às 3 HAI com pico às 6 HAI e no TSH1188 às 5 HAI com pico às 8 HAI.
No geral, independentemente do tempo de coleta, o alongamento do tubo germinativo no
Catongo foi sempre maior (p<0.05) que no TSH1188; com uma média de 9,6µm e 1,45µm
respectivamente. A germinação dos basidiósporos iniciou mais rapidamente no Catongo, às 3
HAI, não obstante, todos os tempos avaliados apresentaram a mesma percentagem de
germinação. Por outro lado, no TSH1188 a germinação dos basidiósporos foi tardia, ocorrendo
a partir das 8 HAI com 50% dos basidiósporos contabilizados germinados.
Tabela 2. Avaliação dos eventos de pré-penetração de Moniliophthora perniciosa em frutos de cacaueiro de genótipos
contrastantes a vassoura-de-bruxa do cacaueiro.
Tempo de
coleta (HAI)
Índice de adesão
Alongamento do tubo
germinativo (µm)
Germinação
(%)
CATONGO TSH1188 CATONGO TSH1188 CATONGO TSH118
3 1,17 d 0,00 a 6,08 d 0,00 a 50 0
5 0,90 c 0,03 b 7,82 d 0,00 a 50 0
6 0,93 c 0,13 c 9,55 c 0,00 a 50 0
8 0,70 a 0,23 c 11,02 b 2,24 c 50 50
12 0,83 b 0,17 c 13,55 a 5,02 b 50 50
Média geral 0,90b 0,12 9,60b 1,45a 50 20
Médias com a mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan (p < 0,05)
32
Figura 8. Eletromicrografia da caracterização do processo de pré-penetração de Moniliophthora
perniciosa em frutos de cacaueiro: A) basidiósporo (Es) com formação de hilo (*) aderido à superfície
do hospedeiro observado às 3HAI, B) basidiósporo rodeado de matriz mucilaginosa (seta vermelha)
com emissão e alongamento do tubo germinativo (Tg), C) basidiósporo rodeado de matriz mucilaginosa
(seta vermelha) e aparente dissolução da cera epicuticular do hospedeiro no local de contato com a
estrutura fúngica (seta branca), D-E) hifa rodeada de matriz mucilaginosa (seta vermelha),e D) hifa
com ponta “club-shaped” (Cs) sobre estômato (seta branca).
33
De modo geral, o Catongo apresentou mais penetrações fúngicas (p<0.05) (Figura 9) em
relação ao genótipo resistente.
Moniliophthora perniciosa em frutos de cacaueiro apresentou vários tipos de penetrações,
na base de tricomas glandulares (Figura 10A), direta através da cutícula do fruto (Figura 10B-
E, seta branca) e através de aberturas naturais, sendo estas predominantemente via estômatos
(Figura 10C-F).
Figura 9. Número médio de penetrações de Moniliophthora perniciosa por µm2 em frutos de cacaueiro de
genótipo suscetível e resistente a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Médias com letras diferentes apresentam
diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan a 5%.
No Catongo as penetrações fúngicas começaram às 3HAI aumentando ao longo do tempo
e alcançando seu pico máximo às 8HAI (Figura 11A). Por outro lado, a ocorrência de
penetrações fúngicas no TSH1188 teve início às 8HAI apresentando diferença significativa
(p<0.05) em relação às penetrações observadas às 12HAI (Figura 11B). Em ambos os
genótipos as penetrações através da base de tricomas glandulares foram às menos recorrentes.
34
Figura 10. Eletromicrografia dos múltiplos modos de penetração apresentados por Moniliophthora
perniciosa em frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes a vassoura-de-bruxa do cacaueiro: A)
através de base de tricoma glandular, B) penetração direta com evidente força de turgor sobre a
cutícula do fruto (seta branca), C e D) através de estômatos subepidermais, E) penetração através de
estômato subepidermal e penetração direta (seta branca) com evidente dissolução da cera epicuticular
do fruto e F) penetração através de estômato.
35
Figura 9. Número médio de penetrações de Moniliophthora perniciosa por mm2 em frutos de cacaueiro de
genótipo suscetível e resistente a vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Médias com letras diferentes apresentam
diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan a 5%.
36
4.2 Análise enzimática das peroxidases de guaiacol (GPx) e do ascorbato (APx)
De maneira geral foi observado que a atividade de ambas as enzimas foram ligeiramente
maiores no TSH1188, o qual exibiu uma atividade aproximadamente 5% maior nos tratamentos
inoculados com o fungo.
A atividade da peroxidase do guaiacol (GPx) em frutos de TSH1188 infectados com M.
perniciosa mostraram aumento linear nos tempos iniciais da infecção, das 3 HAI às 48 HAI,
alcançando sua máxima atividade às 48 HAI, diminuindo a partir desse ponto até sua mínima
atividade às 2784 HAI. Ao contrário, no Catongo a atividade desta enzima foi menor, com
exceção dos picos de atividade máxima observada as 360 e 1080 HAI. É importante ressaltar
que mesmo apresentando picos na sua atividade, estes foram menores que os observados no
TSH1188 (Figura 12).
Com relação a atividade da enzima peroxidase do ascorbato (APx), observou-se que o
TSH1188 inoculado com M. perniciosa apresentou atividade da enzima maior e constante em
todos os pontos avaliados, existindo um pico significativo na atividade da enzima às 0 HAI, e
de forma análoga no Catongo, com exceção do pico observado às 0 HAI (Figura 13).
37
Figura 10. Determinação da atividade da peroxidase do guaiacol (GPx) em frutos de cacaueiro de genótipos
contrastantes à vassoura-de-bruxa do cacaueiro, inoculados e não inoculados com Moniliophthora
perniciosa. Médias com letras diferentes apresentam diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan
a 5%.
38
Figura 11. Determinação da atividade da peroxidase do guaiacol (GPx) em frutos de cacaueiro de genótipos
contrastantes à vassoura-de-bruxa do cacaueiro, inoculados e não inoculados com Moniliophthora
perniciosa. Médias com letras diferentes apresentam diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan
a 5%.
39
DISCUSSÃO
Este estudo descreve pela primeira vez os fatores envolvidos no processo infeccioso de
M. perniciosa em frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes para resistência a VBC.
Verificou-se que a expressão da resistência de frutos de cacaueiro foi, provavelmente,
diferenciada pelos fatores pré-formados na superfície dos frutos dentre os quais encontram-se
a camada de cera epicuticular, a topografia da sua superfície, tipo e densidade de tricomas e
tipo de estômatos. A camada de cera epicuticular, primeira barreira encontrada pelos fungos
fitopatogênicos nos processos iniciais da infecção (STOCKWELL & HANCHEY, 1985), foi
morfologicamente similar entre os genótipos de cacau estudados. Entretanto, a similaridade
morfológica da camada epicuticular observada sugere que a contribuição desta na resistência
de frutos de cacaueiro a M. perniciosa não é de natureza física e sim química, a qual deve ter
contribuído retardando o crescimento do patógeno. A interação entre as ceras epicuticulares e
a resistência a doenças tem sido demostrada em alguns patossistemas (Blumeria graminis –
ballica, PATTO e NIKS, 2001; Puccinia psidii – goiabeira, ROCABADO, 2003, SENA et al.,
2008; M. perniciosa – meristema de cacau, SENA et al., 2014; Dothistroma pini – pinho,
FRASER et al., 2015). É citado que as ceras epicuticulares estão positivamente relacionadas à
deficiência/dificuldade da germinação dos esporos fúngicos na superfície do hospedeiro
(LICHSTON e PIRES DE GODOY, 2006), provavelmente devido à presença na sua
composição química de metabólitos secundários com propriedades fúngicas. De forma análoga,
é suposto neste trabalho que a baixa porcentagem de basidiósporos germinados na superfície
do fruto de cacaueiro do genótipo TSH1188 tenha sido influenciada tanto pela presença de
moléculas antifúngicas na sua camada de cera epicuticular (SENA et al., 2014; CARVALHO
et al., 2014), quanto pela maior densidade de tricomas glandulares na sua superfície (570/cm2
no TSH1188, 292/cm2 no Catongo). Os tricomas glandulares são considerados mecanismos
40
físico-químico de defesa nos patossistemas Glomerella cingulata – feijoeiro (JERBA et al.,
2005) e M. perniciosa – cacaueiro (ALMEIDA et al., 2017). Nestes estudos, os tricomas
glandulares foram observados em maior quantidade nos genótipos resistentes quando
comparados com os suscetíveis. Ademais desta característica física, os tricomas glandulares
exsudam compostos solúveis em água tais como a α-1,3-glucanase em Caupi (RODRIGUES et
al., 2007) e a filoplanina em cacaueiro (AMARAL et al., 2015; ALMEIDA et al., 2017).
Compostos citados por influenciar à germinação de Fusarium oxysporum e de M. perniciosa na
superfície do hospedeiro.
Conjuntamente à observação dos tricomas verificou-se na superfície de ambos os
genótipos estudados a existência de estômatos amonocíticos com ausência de células
subsidiárias, mas, em densidade similar. A influência dos estômatos e suas características na
resistência a doenças têm sido expostas por vários autores em diferentes patossistemas, dentre
os quais podem ser citados Oidiopsis haplophylli – pimentão (LIMA et al., 2010) e Puccinia
graminis f. sp. tritici – trigo (BALARDIN, 2002). Neste último patossistema observou-se que
algumas variedades de trigo resistentes à ferrugem apresentaram abertura estomática tardia,
acarretando dessecação do tubo germinativo devido à evaporação do orvalho combinada com a
demora na abertura dos estômatos. Além disto, as próprias estruturas do estômato (abertura
estreita, células guarda elevadas) também são consideradas fatores de resistência (BALARDIN,
2002). Apesar de no presente estudo não ter sido observada diferença significativa na densidade
nem no tamanho da abertura estomática entre os genótipos estudados, observou-se, no genótipo
suscetível-Catongo, a predominância de estômatos dentro de estruturas chamadas de “criptas
estomáticas”. As criptas estomáticas são invaginações na superfície do fruto produzidas quando
a cera epicuticular da superfície do fruto reveste as células epidérmicas e não a cavidade externa
do estômato, desenvolvendo assim uma estrutura semelhante a uma caverna (RAVEN et al.,
2001). Na literatura são escassas as informações que associem este tipo de estômatos como
mecanismos de defesa às doenças, mas, é citado que este tipo de estômatos favorece a
resistência a seca, por impedir a perda de água suscitada pela abertura e fechamento dos
estômatos, mantendo assim a umidade dentro da cripta (HASSIOTOU et al., 2009). Com base
nos resultados deste trabalho e, considerando que M. perniciosa precisa de condições de alta
umidade para desencadear seu processo infeccioso, é suposto que a predominância de estômatos
amonocíticos em criptas estomáticas esteja relacionada com a retenção ou aumento da umidade
da superfície do fruto, por conseguinte favorecendo a deposição, adesão e posterior germinação
dos basidiósporos de M. perniciosa.
41
Durante o evento de penetração de M. perniciosa em frutos de cacaueiro observou-se que
o desenvolvimento de estruturas de infecção foi similar em ambos os genótipos. No entanto, a
resistência do TSH1188 foi associada a um processo infeccioso mais lento, relacionado à
restrição do alongamento do tubo germinativo, o qual foi provavelmente influenciado pelas
características da superfície dos frutos discutidas acima. O início da germinação dos
basidiósporos de M. perniciosa em frutos de cacaueiro ocorreu 5 horas mais cedo no genótipo
suscetível (3 HAI) em relação ao genótipo resistente (8 HAI) corroborando os resultados
encontrados por Sena et al. (2014) em um estudo do ápice caulinar de cacaueiro infectado por
M. perniciosa, onde o padrão temporal da emissão e do alongamento (µm) dos tubos
germinativos foi semelhante ao observado na interação M. perniciosa – frutos de cacaueiro, em
que a emissão do tubo germinativo e seu alongamento foi mais tardia no genótipo resistente,
quando comparado ao genótipo suscetível.
No estudo da interação M. perniciosa – frutos de cacaueiro, também foi observada a
existência de múltiplos modos de penetração, através da base de tricomas glandulares,
diretamente através da cutícula do fruto (BAKER & HOLLIDAY, 1957) e através de estômatos
(FRIAS et al., 1991; SILVA & MATSUOKA, 1999). Este último modo de penetração parece
ser independente do nível de resistência do hospedeiro e no geral é o modo preferencial de
penetração do patógeno nos tecidos do hospedeiro. Este resultado contrasta com o observado
na interação M. perniciosa – meristema apical de cacaueiro por Sena et al., (2014) onde
penetrações através de estômatos não foram predominantes. Determinou-se também o pico de
penetração de M. perniciosa nos tecidos do hospedeiro, às 3 HAI e às 8 HAI nos frutos de
cacaueiro de genótipo suscetível e resistente respectivamente. O significado deste resultado está
diretamente relacionado com o sucesso da infecção, já que a adesão dos basidiósporos assegura
que o patógeno permaneça em contato com o hospedeiro por tempo necessário para seu correto
desenvolvimento e consequente penetração.
Embora as estruturas na superfície do hospedeiro sejam componentes importantes da
defesa do hospedeiro contra doenças, outro mecanismo que merece atenção são os eventos de
sinalização que são desencadeados já nos primeiros minutos de contato entre o patógeno e o
hospedeiro. Este processo é inicializado com a percepção de um sinal extracelular transmitido
através da membrana plasmática, o qual resulta no acúmulo de moléculas intracelulares
sinalizadoras e indução de uma cascata de fosforilação que permite a expressão de genes
específicos, ocorrendo assim, vários processos fisiológicos que determinam também a
resistência pós-formada a doenças (TUCKER; TALBOT, 2001). Um exemplo de moléculas
42
sinalizadoras que permitem o acúmulo de compostos que servem como mecanismos de
resistência a doenças são as enzimas do tipo peroxidase (PODs). Por ex., nos patossistemas
Bremia lactucae Regel – alface e Pseudoperonospora cubensis – melão, alta atividade de
peroxidases e isoenzimas têm sido relacionada à resistência, podendo até serem utilizadas como
marcadores bioquímicos de resistência pelo fato de, na maioria das vezes, serem as primeiras
enzimas a terem sua atividade alterada, quando a planta é submetida a qualquer condição de
estresse (físico, químico e biológico) (REUVENI et al., 1991; REUVENI et al., 1992; SIEGEL,
1993; LEE et al., 2001; HSU & KAO, 2003).
Neste trabalho, observou-se maior atividade da peroxidase de guaiacol no TSH1188,
genótipo resistente, durante os primeiros estágios da infecção, ocorrendo de maneira contraria
no Catongo, genótipo suscetível, em que a atividade da enzima aumentou nos estágios tardios
da doença. Com respeito à atividade da peroxidase do ascorbato, observou-se uma atividade
constante ao longo dos tempos avaliados, porém, sempre maior no TSH1188 em comparação
com o Catongo. Um padrão temporal semelhante à atividade da peroxidase do guaiacol foi
observado também na peroxidase do ascorbato, apresentando um pico significativo (p>0,05) na
sua atividade às 0 HAI. Van Loon et al. (2006) sugere que estas enzimas (PODs) possuem ação
imediata na defesa das plantas, com ação direta sobre as estruturas invasoras. Sendo assim, o
padrão temporal da atividade da enzima peroxidase do guaiacol e ascorbato no TSH1188,
genótipo resistente, sugere um rápido reconhecimento do patógeno e posterior indução da
cascata de defesa, por conseguinte, restringindo a colonização dos seus tecidos. No Catongo,
pelo contrário, sugere um reconhecimento tardio da planta a ação do patógeno, o que possibilita
seu estabelecimento e posterior colonização dos tecidos do hospedeiro. Condição
correlacionada com a transição morfológica do fungo, de biotrófica à fase necrotrófica. Nos
estágios tardios da interação M. perniciosa – frutos de cacaueiro existe o crescimento do micélio
dicariótico intracelular nos tecidos do hospedeiro concomitante com necrose e morte dos
tecidos infectados produzida pelo estresse oxidativo causado pela superprodução e acúmulo de
ROS produzidas em resposta à infecção (CEITA et al., 2007).
Diante das evidências obtidas neste trabalho confirmou-se a hipótese de que frutos de
cacaueiro do genótipo TSH1188 apresenta mecanismos estruturais e bioquímicos que
dificultam ou retardam a ação de M. perniciosa. A resistência genética do genótipo TSH1188
foi caracterizada por um período de latência maior (60 DAI), processo infeccioso reduzido e,
consequentemente, menor incidência e severidade sintomatológica; confirmando que o
genótipo TSH1188 é, de fato, um genótipo resistente a VBC. Por outro lado, o genótipo
43
Catongo apresentou reconhecimento tardio do patógeno e ausência de diversas características
consideradas mecanismos de resistência, permitindo o estabelecimento do patógeno e a
colonização dos tecidos do hospedeiro resultando em um menor período de incubação (15 DAI)
e elevada severidade da doença. O presente trabalho colabora com a descrição da evolução
temporal dos sintomas e das reações de defesa de frutos de cacaueiro de genótipos contrastantes
a VBC submetidos a infecção fúngica, servindo como referencial para o aprimoramento de
medidas de controle da doença e ponto de partida para direcionar futuros experimentos na área
genômica.
.
44
CONSIDERAÇÕES FINAIS
• O processo infeccioso (adesão, germinação e penetração) de M. perniciosa mostrou-se
significativamente mais tardio no genótipo TSH1188, portanto, M. perniciosa
apresentou maior período de incubação (60 DAI) no genótipo TSH1188 e
consequentemente menor incidência da doença e menor severidade sintomatológica;
• Frutos do genótipo TSH1188 apresentaram aumento da atividade das enzimas da classe
PODs nos estágios iniciais da infecção (0-48 HAI) o que sugere a rápido
reconhecimento de M. perniciosa nos seus tecidos;
• Frutos do genótipo TSH1188 apresentaram diferentes mecanismos de resistência, sendo
estes pré-formados (características na sua superfície) e pós-formado (elevada atividade
enzimática), e estes influenciaram na restrição do desenvolvimento e colonização de M.
perniciosa;
• Genótipos de cacaueiro com mecanismos de resistência pré- e pós-formados,
provavelmente, possuem resistência mais duradoura do que aqueles que apresentam só
um mecanismo de defesa.
45
REFERÊNCIAS
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