UNIVERSIDADE ESTADUAL SANTA CRUZ PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E

BIOLOGIA MOLECULAR

ESTUDO DA COMUNIDADE MICROBIANA DO PRÉ-ESTÔMAGO DE

CAITITU (Pecari tajacu L.)

EDUARDO GOMES DE OLIVEIRA

ILHÉUS-BAHIA-BRASIL MAIO DE 2008

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EDUARDO GOMES DE OLIVEIRA

ESTUDO DA COMUNIDADE MICROBIANA DO PRÉ-ESTÔMAGO DE

CAITITU (Pecari tajacu L.)

Dissertação de mestrado apresentada a Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para obtenção do título de mestre em genética e biologia molecular.

Área de concentração: Biologia Molecular

ILHÉUS-BAHIA-BRASIL MAIO DE 2008

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EDUARDO GOMES DE OLIVEIRA ESTUDO DA COMUNIDADE MICROBIANA DO PRÉ-ESTÔMAGO DE

CAITITU (Pecari tajacu L.)

Dissertação de mestrado apresentada a Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para obtenção do título de mestre em genética e biologia molecular.

Área de concentração: Biologia Molecular

Aprovada em:

Profª. Drª Mara Lucia Albuquerque Profª. Drª Rachael Passos Rezende (UESB) (UESC)

Prof. Dr. Amauri Arias Wenceslau Prof. Dr Eduardo Gross (UESC) (Orientador)

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DEDICATÓRIA

Aos meus irmãos e sobrinhos, por serem a razão do meu viver, aos amigos por terem me ajudado a derrubar os muros que encontrei pela frente e a Deus por ter colocado os muros, pois sem esses o meu chegar aqui não teria tanto sabor de

vitória, dedico.

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AGRADECIMENTOS

A Deus pelo dom da vida, pela força nos momentos de fraqueza, por ter

colocado paz nos momentos de turbulência e pela minha saúde, da minha família e

dos meus amigos;

As minhas três mães do Salobrinho: Maria de Lurdes, Leoni e Hiolanda pois,

sem elas a minha vida acadêmica teria sido muito mais árdua.

Aos meus amigos de laboratório: Ana Cácia, Braz da Hora, Jaime Henrique,

Cristiano, Sizenando e Lana por terem sido o auxilio certo de todas as horas;

A minha segunda família: Valquiria, Rubens, Gardênia, Jorge Rosa, Tiago

Magalhães, Rodrigo, Alda e Elisson, por serem à base da minha sobrevivência

emocional nos momento de felicidade e de dificuldade.

A equipe de orientação, professor Dr. Eduardo Gross, Dr. Sergio Nogueira e

Dr. João Dias, por ter contribuído tanto na minha formação profissional,

principalmente ao professor Gross, que além de orientador, foi pai, amigo, irmão.

A professora Rachael Passos Rezende por ter me acolhido com tanto

carinho e compromisso e amizade no seu laboratório de Monitoramento Ambiental;

Aos professores de graduação: Kátia Moema, Roberta Costa, Roberto

Paixão; George Rego; Amauri Wenceslau, Maria Amélia e Alexandre Munhoz pela

brilhante atuação no processo de construção do meu conhecimento como médico

veterinário;

A UESC e especialmente ao Programa de Pós Graduação em Genética e

Biologia Molecular por ter me acolhido.

A FAPESB pela concessão da bolsa de mestrado;

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EXTRATO

O caititu (Pecari tajacu - Tayassuidae) é uma espécie que sofre pressão de caça em função de sua carne e couro de excelente qualidade. Tal prática tem reduzido drasticamente sua população no ambiente natural, sendo a criação em cativeiro uma das alternativas para amenizar essa pressão sobre a espécie. Entretanto, para seu manejo e criação em cativeiro é importante o conhecimento acerca da sua biologia. O caititu apresenta um estomago complexo formado por quatro diferentes compartimentos e a morfo-fisiologia desse órgão, juntamente com o comportamento alimentar do animal, permitem classificá-lo como pseudo-ruminante. O presente trabalho foi conduzido com intuito de avaliar o perfil da diversidade microbiana do estomago de caititus submetidos à dieta suplementada ou não com uréia. Também foram avaliados as concentrações de acetato, lactato e propionato do pré-estômago desses animais. Para isso, quatro machos adultos foram submetidos à dieta suplementada com uréia e no grupo controle, para outros quatro machos adultos, a uréia foi suprimida. Para avaliar a diversidade microbiana a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de análise em gel de eletroforese com gradiente desnaturante (DGGE) foi utilizada, enquanto que a avaliação dos ácidos provenientes da fermentação foi realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A obtenção das amostras do conteúdo estomacal, apesar da tentativa de uso de sondas gástricas, só foi possível com o sacrifício do animal. Essas amostras foram submetidas a dois diferentes protocolos para extração do DNA total e visualização dos amplicons, sendo a extração mais eficiente com o uso de esferas de vidros (“glass beads”) e a e a melhor visualização e definição de bandas no gel através da revelação com nitrato de prata e padronização da quantidade de DNA aplicado. A avaliação do perfil da comunidade de Archaea e Bacteria revelou comportamentos distintos para esses dois grupos microbianos. O padrão das bandas dos amplicons de Archaea nos géis de DGGE ficou inalterado para os diferentes compartimentos do estomago, nas amostras retiradas dos diferentes animais, mesmo para os suplementados com uréia. Já os perfis de bandas nos géis com amplicons de bactérias mostraram-se diversos tanto para os diferentes compartimentos do estômago como para as diferentes amostras (conteúdo estomacais dos animais). A suplementação com uréia também modificou o perfil dessas bandas e, portanto, a estrutura da comunidade bacteriana. Foi possível demonstrar que houve uma grande similaridade entre as principais espécies que compõe a comunidade bacteriana do estômago de caititu provindas do mesmo compartimento. A suplementação de uréia na dieta dos caititus diminui a concentração do acetato e propionato e aumentou a de acetato em alguns compartimentos do estômago. Palavras - chave : Microbiologia, nutrição animal, biologia molecular, diversidade microbiana.

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ABSTRACT

Collared peccary (Pecari tajacu - Tayassuidae) is a species that is commonly hunted because its meat and high quality leather. This practice has reduced its natural population, and farming and breeding activities are alternatives to diminish the pressure under this species. However, for management and farming of collared peccary it is important knowledge about its biology. This species present a complex stomach formed by four different compartments and organ morphology and physiology jointed with animal feed behavior, permit to classify as pseudoruminat. Present work was conduced with aim to analysed microbial diversity profile of collared peccaries submitted a diet supplemented or not with urea. Also were evaluated acetate, lactate and propionate concentrations in peccaries forestomach. To this four adult males were submitted to urea supplemented dietary and in control group, to the other four adult males, urea was suppressed. To evaluate microbial diversity polymerase chain reaction (PCR) followed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) techniques were employ, and to analyse fermentation products high-performance liquid chromatography (HPLC) was used. Despite of use of gastric probes, samples of stomach content were obtained only with animal euthanasia. These samples were submitted to two different protocols to total DNA extraction and amplicons visualizing, has been more efficient extraction using glass beads, and better bands definition and visualization with silver nitrate staining and standardization of DNA quantity. The evaluation of archaeal and bacterial community profile revealed distinct behavior to the two microbial groups. Bands pattern of archaeal amplicons in DGGE gels was not altered to the different compartments in samples obtained from different animals, even to those urea supplemented. Gels bands profiles of bacterial amplicons were diverse in different stomach compartments and to different samples (animals stomach content). Urea supplementation also modifies bands profiles and consequently the structure of bacterial community. It was possible demonstrate high similarity between major species of bacteria of collared peccary stomach coming from same compartment. Urea supplementation on peccaries diet diminished lactate and propionate concentration and augmented acetate in some stomach compartments. Keywords : Microbiology, animal nutrition, molecular biology, microbial diversity.

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ÍNDICE

EXTRATO.....................................................................................................................vi ABSTRACT...................................................................................................................vii 1. INTRODUÇÃO..........................................................................................................01 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................................02

2.1. A importância da criação de caititus (Tayassu tajacu) em cativeiro ................02

2.2. A importância da fermentação microbiana.......................................................03

2.3. Limitações na identificação de microrganismos de amostras complexas .......05

2.4. Téc. molec. para ident. e estudo de microrg. de comunidade complexas........05

2.4.1. Extração de DNA......................................................................................05 2.4.2. PCR - Reação em Cadeia da Polimerase................................................06 2.4.3. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)..............................….08

2.4.4. Uso de PCR - DGGE em estudos da microbiota gastrintestinal..............09

3. CAPÍTULO 1. Abordagem molecular da microbiota estomacal do caititu.................10 4. CAPITULO 2. Urea supplementation influenced bacteria but not archaea...............22 5. CONCLUSÕES.........................................................................................................45 6. REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES....................................................................46 APÊNDICES.................................................................................................................53

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1. INTRODUÇÃO

O caititu (Pecari tajacu) também conhecido como porco-do-mato ou pecari é

encontrado em todo o Brasil. Existe atualmente uma grande demanda no mercado

internacional pelo seu couro e carne que são de excelente qualidade. Essa

demanda, entretanto, está sendo suprida pela caça ilegal que levou em 1994 e

1997 à classificação dessa espécie como ameaçada de extinção e à sua inserção

no Anexo II da CITES.

Uma das alternativas que surgiu para solucionar esse problema foi à criação em

cativeiro, pois esse animal vive em diferentes habitats, possui comportamento

gregário, fato este que facilita o processo de adaptação às condições de

confinamento. O que o torna uma alternativa para a produção econômica,

principalmente, em áreas onde as condições locais de clima e relevo, limitam o

potencial zooténico das espécies domésticas criadas convencionalmente. No

entanto, para o estabelecimento de técnicas adequadas para o manejo dessa

espécie, tanto em condições naturais quanto em cativeiro, são necessários

conhecimentos básicos sobre sua biologia.

Esse animal possuir hábito alimentar bastante diversificado. E uma de suas

características bastante vantajosa é a presença de um pré-estomago que permite o

aproveitamento de alimentos fibrosos através da fermentação microbiana, e isso

possibilita o barateamento no custo de produção em cativeiro. No entanto, até o

momento não se haviam estudado o perfil dos microrganismos que realizam a

digestão da celulose ou de outros que possibilitam o aproveitamento destes

alimentos. Esse fato está associado à dificuldade de cultivo desses microrganismos

em condições artificiais, pois segundo Amann et al. (1995) e Rappe (2003), cerca

de 50 a 95% dos microrganismos de amostras complexas são incultiváveis em

laboratório, em função das limitações das técnicas tradicionais de cultivo e

microscopia. E como alternativa para solucionar esse problema técnicas da

biologia molecular podem ser utilizadas para análise dessas comunidades.

O presente estudo teve como objetivos: estabelecer um protocolo eficaz para

extração do DNA total desse conteúdo; Aperfeiçoar a técnicas de PCR e DGGE;

avaliar através dessas técnicas a diversidade microbiana do pré-estomago do

caititu submetida à dieta com e sem uréia; e avaliar os níveis de ácidos acético,

lático e propiônico através da cromatografia liquida de alta eficiência-CLAE.

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Importância da criação de caititus ( Pecari tajacu) em cativeiro

No Brasil, a fauna silvestre ainda é uma importante fonte de proteína

animal utilizada por populações mais afastadas dos grandes centros urbanos. O

aproveitamento desses animais, porém, está sendo feito através da caça de

subsistência que, associada à destruição de habitats, está causando a redução de

suas populações naturais (REDFORD & ROBINSON, 1991; BODMER e SOWLS,

1993; ALVARD et al., 1997; NÉO, 1992; ROCHA, 2001)

Na América Latina uma das espécies mais caçadas é caititu (Pecari

tajacu) porque além da carne, cotada entre as mais apreciadas, também existe

interesse em seu couro, para o qual há uma grande demanda no mercado

internacional (SOWLS, 1997). O couro de caititu é utilizado para confecção de

artigos de luxo que tem grande procura na Europa, Estados Unidos da América e

Japão (SOWLS, 1984). Atualmente, essa demanda é atendida pela caça que é

realizada de forma ilegal e indiscriminada em vários países sul-americanos,

especialmente no Brasil (BODMER e SOWLS, 1993).

A caça e a perda de habitats levaram à sua inserção no Anexo II da

CITES (FONSECA, RYLANDS, COSTA, MACHADO, e LEITE, 1994; SOWLS,

1997). Uma das formas propostas para o aproveitamento racional desses animais

seria o manejo em condições naturais (BODMER et al., 1997) ou a criação em

cativeiro (NOGUEIRA-FILHO, 1999).

A criação comercial, além de contribuir com a conservação da espécie,

poderia gerar uma fonte alternativa de renda para produtores rurais, vindo a suprir

a procura pela carne e demais produtos desse animal, além de evitar a caça de

forma indiscriminada. Como esse animal se adapta facilmente às condições de

cativeiro poderia se tornar uma alternativa de produção econômica, principalmente,

em áreas onde as condições locais de clima e relevo, limitam o potencial

zootécnico das espécies domésticas criadas convencionalmente. No entanto, para

o estabelecimento de técnicas adequadas para o manejo dessa espécie, tanto em

condições naturais quanto em cativeiro, são necessários conhecimentos básicos

sobre sua biologia (FRAGOSO, 1998).

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O caititu é encontrado em todo o Brasil, vivendo em diferentes tipos de

habitats, possui comportamento gregário, fato este que facilita o processo de

criação em cativeiro (DEUTSCH e PUGLIA, 1990). É um animal onívoro, mas

predominantemente frugívoro em floresta tropical úmida (KILTIE 1981). Uma de

suas características marcantes do ponto de vista anatômico-fisiológico é a

presença de um pré-estômago, constituído por um compartimento fermentativo e

dois sacos cegos, que são continuidades de tal compartimento (LANGER 1978). A

presença desse pré-estômago permite o aproveitamento de alimentos volumosos

através da fermentação microbiana dos constituintes da parede celular

(NOGUEIRA-FILHO 2005). Esse dado sugere que , podem ser utilizados alimentos

volumosos na sua alimentação como uma possibilidade de reduzir

significativamente os custos de produção em cativeiro.. O que é relevante

considerando que a alimentação pode representar até 60% dos custos de

produção (NOGUEIRA-FILHO 1999). Como esta espécie se adapta facilmente a

diferentes tipos de alimentos é necessário buscar alternativas mais baratas e que

atendam suas exigências nutricionais (OLIVEIRA, 2007).

2.2. Importância da fermentação microbiana

Devido aos elevados custos com a alimentação animal os animais que

conseguem utilizar forrageiras e outros alimentos volumosos apresentam

vantagens econômicas porque nestas plantas, bem como na natureza, a celulose é

a biomolécula mais abundante. Esta utilização é possível em função desses

animais apresentarem uma relação simbiótica com microrganismos (bactérias,

fungos e protozoários) que têm habilidade em obter energia dos carboidratos

complexos, como celulose e hemicelulose, da parede celular das plantas

(NEWBOLD, 1997; D’AGOSTO et al., 2001). Bovinos, cabras, ovelhas, cavalos,

coelhos entre os animais de produção e caititus e capivaras entre os animais

silvestres são exemplos de animais que apresentam regiões peculiares no seu

trato digestório que possibilitam essa atividade. Além de realizar a fermentação de

forragens esses micróbios produzem vitaminas K e do complexo B entre outros

compostos de grande relevância para o animal (FRANZOLIN, 2003).

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Como conseqüência da fermentação microbiana ocorre formação de

ácidos graxos voláteis (AGV) tais como ácidos acético, butírico e propiônico que

são absorvidos pela parede da mucosa gástrica ou intestinal e seguirão vias

metabólicas distintas para a produção de energia,síntese de proteínas e lipídeos.

Porém, as proporções de produção desses ácidos variam de acordo com o

substrato e tipo de microrganismo que realiza a fermentação, (HORITY, 1987;

BARCELOS et al., 2001).

Vários estudos relacionaram o ganho de peso animal com a atividade

microbiana do trato gastrintestinal, principalmente com bovinos, espécie de grande

interesse econômico para muitos países, inclusive o Brasil (NICODEMO, 2001;

COPPOLA e TURNES, 2004; KABIR et al., 2004; ARENAS et al.., 2005; JORGE et

al., 2006; VIDAL, 2007).Tais trabalhos se dão através do direcionamento de dietas

específicas para os microrganismos ruminais e uma das etapas primordiais para o

fornecimento dessa dieta é a identificação e estudo das sucessões da microbiota

indígena simbionte desses organismos (MARTIN & NISBET, 1992; WALLACE,

1994).

Um exemplo é o fornecimento de uréia na alimentação dos bovinos, a

qual favorece o crescimento dos microrganismos do rúmen, aumentando a

digestão da celulose e outros produtos fibrosos (BARRETO, 2003). A uréia também

eleva o número de microrganismos que chegam ao abomaso (estômago

verdadeiro) junto com a ingesta, e que serão degradados pelo acido clorídrico e

pepsina, transformando-se assim em fonte de proteína para o anima Em síntese, o

nitrogênio não protéico da uréia é incorporado pela microbiota, passando assim a

nitrogênio de origem protéica que será aproveitado pelo animal quando tais

microrganismos forem digeridos no estômago verdadeiro (BARRETO, 2003;

GONÇALVES, 2003; MATOS, 2003).

A complexidade de interações entre fatores relacionados ao tipo de

alimentação, aspectos fisiológicos do animal, e as interações entre os diversos

tipos de microrganismos existentes, torna o sistema digestório um local de intensa

complexidade microbiana (KAMRA, 2005; OLIVEIRA, 2007). Com isso, a perda do

equilíbrio nesse ambiente pode causar a morte ou a sucessão dos microrganismos

ali existentes, interferindo desta forma na atividade celulolítica e diminuindo o

aproveitamento da celulose e de outros produtos(KOZLOSKI, 2002).

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2.3. Limitações na Identificação de microrganismos de amostras

complexas.

Entende-se por comunidades microbianas complexas, ao um conjunto de

populações de micróbios que interagem entre si e com o ambiente no qual está

inserido. Mudanças em fatores como pH, temperatura, salinidade, pressão,

presença ou ausência do gás oxigênio, e variações nos subprodutos do

metabolismo dos microrganismos ali presentes, são alguns dos elementos que

podem causar sucessões microbiológicas nesses ambientes, ou matar

completamente a comunidade (KOZLOSKI, 2002).

As relações de interdependência estabelecida entre os elementos

supracitados e os microrganismos, fazem com que estes sejam de difícil

identificação. Pois, os meios de cultivo seletivos tradicionais, na maioria das vezes,

não são capazes de mimetizar as condições que microrganismos particulares

requerem para sua proliferação em seu habitat natural. A grande parte das

bactérias em amostras ambientais não pode ser detectada através da microscopia

convencional, pois elas aderem-se às partículas de solo e sedimentos tornando-se

invisíveis (PACE, 1997). Portanto a compreensão da diversidade microbiana de

comunidades complexas é bastante limitada. Segundo Amann et al. (1995), cerca

de 95 a 99% dos microrganismos presentes em comunidades complexas não são

cultiváveis em laboratório, restringindo assim o conhecimento sobre sua biologia.

Como alternativa para solucionar esse problema, técnicas da biologia

molecular como extração do DNA total da comunidade, PCR, DGGE e

seqüênciamento surgem como mecanismos eficazes na identificação e estudos

desses microrganismos (MACRAE, 2000; KENT E TRIPLETT, 2002).

2.4. Técnicas moleculares de identificação e estudo de microrganismos de

comunidades complexas.

2.4.1- Extração de DNA

Os ácidos nucléicos (DNA e/ou RNA) constituem o material biológico

através do qual são realizadas análises filogenéticas (taxonômicas), tipagens de

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espécies/linhagens e análise da diversidade de organismos em amostras

complexas. No entanto, para que tais análises possam ser realizadas, os ácidos

nucléicos precisam ser isolados dos outros constituintes celulares, e re-

suspendidos em solução aquosa. Muitas vezes, essas suspensões necessitam,

ainda, passar por processo de purificação para que contaminantes como proteínas

e polissacarídeos sejam retirados da solução. Essa descontaminação se faz

necessária quando os contaminantes interferem em reações posteriores, como

amplificações por PCR, hibridizações, digestões com enzimas de restrição e outras

(MADIGAN et al., 1997; HUGENHOLTZ et al., 1998ab),

Vários protocolos de isolamento de ácidos nucléicos estão descritos na

literatura. Esses protocolos são compostos por alguns poucos procedimentos

básicos, necessários à desintegração e homogeneização de tecidos e células, à

solubilização dos ácidos nucléicos, à separação dos ácidos nucléicos dos outros

constituintes celulares e à precipitação dos ácidos nucléicos. São protocolos que

apresentam pequenas variações e podem ser mais ou menos convenientes a

determinados propósitos em função do tempo gasto, da quantidade e pureza dos

ácidos nucléicos obtidos, do nível de degradação dos ácidos nucléicos resultantes

e da eficiência da lise das células alvo (SAGHAI-MAROOF, 1984; SAMBROOK et

al., l989; OLERUP & ZETTERQUIST, 1994; BELSHAW & QUICKE, 1997).

2.4.2. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

O princípio básico da PCR está na capacidade de, a partir de

quantidades mínimas de DNA, multiplicar uma determinada seqüência, de modo

que esta se torne majoritária na amostra. O material inicial para análise através da

técnica de PCR pode ser obtido a partir de diferentes amostras, como o solo, o

suco gastrintestinal, o tecido animal ou vegetal . Numa reação de PCR, o

fragmento de DNA que desejamos multiplicar (ou amplificar) é chamado de

fragmento alvo ou DNA molde (e os oligonucleotídeos que utilizamos são

chamados de primers), ou iniciadores. Na realidade, os primers nada mais são do

que pequenos fragmentos de DNA complementares às extremidades da região que

se pretende amplificar. Estes primers são produzidos rapidamente e vendidos por

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companhias de biotecnologia específicas (SAIKI, 1988; ERLICH, 1989; ERLICH et

al., 1992; NEWTON, 1994; GRIFFITHS, 1996).

O método pelo qual a PCR funciona é descrito da seguinte forma: dois

pequenos fragmentos de DNA, tipicamente de 20-30 pares de bases, são

sintetizados em laboratório. Esses são os “primers” , que são complementares a

cada uma das extremidades da seqüência do DNA de interesse. Num tubo de

reação são adicionados os primers, os nucleotídeos livres (adenina, guanina,

timina e citosina), o DNA que se quer analisar (DNA molde) e uma enzima especial

resistente ao calor chamada Taq DNA polimerase, que promove a síntese de DNA.

A mistura é aquecida a 95°C, causando a separação d as duas fitas de DNA. Em

seguida, a mistura é esfriada até 55-65°C, temperat ura nas quais os primers se

ligam às regiões complementares das fitas de DNA que estão separadas. Neste

momento, dentro do tubo de reação, todo o DNA está na forma de fita simples,

menos as duas pequenas regiões nas quais os primers se ligaram nos dois lados

da seqüência de DNA de interesse. A temperatura é então elevada a 72°C, e a Taq

DNA polimerase começa a sintetizar um novo DNA, começando nas regiões em

dupla fita, local onde cada um dos primers se ligou ao DNA molde. A Taq irá

promover a síntese de DNA somente a partir da região em dupla fita. A síntese

ocorre em uma taxa de aproximadamente 20 nucleotídeos/segundo, e em cerca de

30 segundos a 1 minuto uma nova cópia do fragmento que se quer analisar é

sintetizada. A reação agora é novamente aquecida a 95°C, causando novamente a

separação de todo DNA em fitas simples. Ao final do primeiro ciclo há duas fitas da

molécula original de DNA, mais duas cópias da região de interesse. A temperatura

é novamente reduzida, e agora os primers irão se ligar aos 4 sítios nas novas duas

cópias e também na molécula original de DNA. A temperatura do ciclo é

novamente elevada a 72°C e as 4 fitas individuais s ão copiadas em 8 (SAIKI, 1988;

ERLICH, 1989; ERLICH et al., 1992; NEWTON, 1994; GRIFFITHS, 1996).

Esses ciclos são repetidos geralmente 30 vezes, num aparelho chamado

termociclador. Ao final dos ciclos de amplificação existem, aproximadamente, 1

milhão de cópias do segmento de DNA de interesse para cada molécula molde

originária da amostra inicial. É assim que podemos selecionar um fragmento

específico dentro de um genoma (SAIKI, 1988; ERLICH, 1989; ERLICH et al.,

1992; NEWTON, 1994; GRIFFITHS, 1996).

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Quando são usados primers específicos em uma reação em cadeia da

polimerase (PCR), fragmentos específicos no genoma do organismo são

amplificados. É por este tipo de análise que podemos observar diferenças entre

indivíduos. De acordo com o número de repetições da seqüência que são

observadas, ou seja, das bandas de diferentes tamanhos visualizadas em gel de

agarose (ou poliacrilamida), podemos identificar o grau de parentesco ou até a

origem da amostra em análise (SAIKI, 1988; ERLICH, 1989; ERLICH et al., 1992;

NEWTON, 1994; GRIFFITHS, 1996).

No entanto, a grande sensibilidade desta técnica apresenta também

desvantagens, pois o risco de contaminação por uma molécula de DNA não

presente na amostra de interesse se torna grande, sendo recomendado bastante

cuidado em casos forenses e em todos os estudos moleculares.

2.4.3. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresi s)

A fim de melhorar a caracterização e a análise de comunidades

complexas, independentemente do cultivo das espécies que as compõem, tem sido

focado o interesse no desenvolvimento de técnicas da biologia molecular capazes

de permitir o estudo da comunidade desses habitats. A análise do gene de 16S

rRNA tem sido utilizada no estudo de microrganismos do ambiente (Amann et al.,

1995), porque: está presente em todos os organismos; apresenta regiões

conservadas assim como regiões variadas, o que torna possível o desenho de

primers e sondas com diferentes níveis de especificidade; tem informações de

seqüências suficiente para inferência filogenética; e está presente em grande

número nas células, o que facilita sua detecção. E, entre as metodologias

baseadas no 16S rDNA, destaca-se o gradiente desnaturante em gel de

eletroforese (DGGE). Esta técnica identifica diferenças estabelecidas no

comportamento desnaturante da dupla fita de DNA que, submetida a um gradiente

crescente de concentração de agentes desnaturantes (uréia e formamida), se

separam em fragmentos discretos, chamados de domínios de desnaturação. Ou

seja, amplicons de DNA com mesmo tamanho, mas com composição diferente, em

pelo menos um par de bases, migrarão para posições diferentes no gel, gerando

assim um perfil genotípico da comunidade (DÍEZ, 2001).

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2.4.4. Uso de PCR-DGGE em estudos da microbiota gas trintestinal de animais

O conhecimento sobre a diversidade microbiana dos diferentes

ecossistemas do trato digestivo de algumas espécies é incompleto e fragmentado.

Isso devido as limitação nas técnicas tradicionais de cultivo e microscopia. No

entanto técnicas moleculares com o PCR e DGGE vêm complementando as

informações a cerca da diversidade microbiana de comunidades complexas

(MACRAE, 2000; KENT E TRIPLETT, 2002).

Vários são os trabalhos que validam a importância de tais técnicas

moleculares para analise de diversidade, por exemplo, foi possível avaliação

através do DGGE a comunidade de bacteriana do intestino de suínos

suplementados com antibióticos ou extratos herbais mostrando com êxito as

variações microbianas em função das dietas fornecidas (PEDROSO, 2005). Outros

trabalhos acerca da utilização do DGGE para tal finalidade têm avaliado desde

comunidades complexas do solo a a flora intestinal de diversos animais

domésticos e selvagens com finalidades diversas (AMANN, 1995; MACRAE, 2000;

DIEZ, 2001).

Portanto o presente estudo teve como objetivos: estabelecer um

protocolo eficaz para extração do DNA total do conteúdo dos compartimentos

estomacais do caititu; Aperfeiçoar a técnicas de PCR e DGGE; avaliar através

dessas técnicas a diversidade microbiana do pré-estomago desse animal

submetido à dieta com e sem uréia; e avaliar os níveis de ácidos acético, lático e

propiônico através da cromatografia liquida de alta eficiência-CLAE.

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3. CAPITULO 1

(Artigo a ser submetido à revista “Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia”)

Título: Abordagem Molecular da Microbiota Estomacal do Cai titu ( Pecari

tajacu) Através de PCR e DGGE

Autores: E. G. Oliveira, A. C. F. Santos, J. H. Amorim, F.R.H. Fraga, S.L.G.

Nogueira-Filho, J.C.T. Dias, R. P. Rezende, E. Gross

RESUMO

Técnicas moleculares como PCR e DGGE são poderosas ferramentas para estudo

da diversidade microbiana de amostras complexas. No entanto, a otimização

dessas metodologias é de fundamental relevância para estudo dessas

comunidades. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer protocolo eficaz

para extração do DNA total do material estomacal do caititu (Pecari tajacu), bem

como potencializar a técnica de PCR-DGGE para análise da microbiota desse

órgão. O material estomacal de três caititus foi alíquotado e conservado a – 20 Cº.

Duas estratégias foram utilizadas para extração do DNA. Na primeira foi utilizado

tampão fosfato e esferas de vidro e, na segunda, um sonicador para a lise celular.

No DGGE foram testadas diferentes concentrações de DNA aplicadas no gel, bem

como a coloração com prata e “syber safe”. Como resultado foi possível constatar

uma melhor qualidade na extração DNA com uso de esferas de vidro; boa

visualização das bandas no DGGE quando corado com nitrato de prata; e

diferenças no bandeamento em virtude da padronização na quantidade de DNA

aplicado ao gel. Através dessas melhorias na metodologia foi possível constatar a

presença de amplicons de Archaea, bactérias, fungos e protozoários no pré-

estômago do caititu.

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Abordagem Molecular Da Microbiota Estomacal do Caititu (Pecari tajacu) Através de PCR e DGGE [Molecular Aproach of Collared Peccary (Peccari tajacu) Stomach Microbiota using PCR-

DGGE]

E. G. OLIVEIRA, A. C. F. SANTOS, J. H. AMORIM, F.R.H. FRA GA, S.G. NOGUEIRA-FILHO, J.C.T. DIAS, R. P. REZENDE, E. GROSS

Universidade Estadual de Santa Cruz

Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 16-Campus Soane Nazaré de Andrade 45662000- Ilhéus, BA

edumev@yahoo.com.br – (73) 3680-5183

RESUMO

Técnicas moleculares como PCR e DGGE são poderosas ferramentas para estudo da diversidade microbiana de amostras complexas. No entanto, a otimização dessas metodologias é de fundamental relevância para estudo dessas comunidades. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer protocolo eficaz para extração do DNA total do material estomacal do caititu (Pecari tajacu), bem como potencializar a técnica de PCR-DGGE para análise da microbiota desse órgão. O material estomacal de três caititus foi alíquotado e conservado a – 20 Cº. Duas estratégias foram utilizadas para extração do DNA. Na primeira foi utilizado tampão fosfato e esferas de vidro e, na segunda, um sonicador para a lise celular. No DGGE foram testadas diferentes concentrações de DNA aplicadas no gel, bem como a coloração com prata e syber safe. Como resultado foi possível constatar uma melhor qualidade na extração DNA com uso de esferas de vidro; boa visualização das bandas no DGGE quando corado com nitrato de prata; e diferenças no bandeamento em virtude da padronização na quantidade de DNA aplicado ao gel. Através dessas melhorias na metodologia foi possível constatar a presença de amplicons de Archaea, bactérias, fungos e protozoários no pré-estômago do caititu. Palavras- chave: Pecari; biologia molecular; pré-estômago; bactéria, Archaea.

ABSTRACT

Molecular techniques as PCR and DGGE are powerful tools for microbial diversity studies in complex samples. However, optimization of these methodologies is relevant for studies of these communities. The aim of present work was to establish an efficient protocol for total DNA extraction of forestomach content of collared peccary (Pecari tajacu), as well to improve the PCR-DGGE technique to analyze microbial diversity in these organ. Stomach content obtained from three collared peccaries was aliquoted and conserved at – 20 ºC. Two strategies for DNA extraction were tested, in the first, we used phosphate buffer and glass beads and, in the second, cells were sonicated to cellular lyse. In DGGE different concentrations of DNA were used in gel as well silver stain and syber safe. Our results demonstrated a better quality in DNA extraction with glass beads use, a better visualization

12

of DGGE bands when silver stained and differences on band pattern when quantity of DNA in gel was standardized. Improving the DNA-PCR methodology was possible to note the presence of Archaea, bacteria, fungi and protozoa amplicons in collared peccary stomach. Keywords: Peccary; molecular biology; forestomach, bacteria, Archaea.

INTRODUÇÃO O caititu (Pecari tajacu) apresenta grande demanda no mercado internacional pelo seu couro

e carne de excelente qualidade (Sowls, 1997). Uma de suas características marcantes é a

presença de um pré-estômago que permite o aproveitamento de alimentos fibrosos através

da fermentação microbiana, e isso possibilita a redução no custo de produção em cativeiro

(Langer 1978; Nogueira-Filho 2005). No entanto, até o momento não foram identificados os

microrganismos que realizam a digestão desses compostos presentes na sua alimentação.

Trabalhos de identificação desses microrganismos utilizando técnicas convencionais de

cultivo demonstraram-se insuficientes (Amann,1995; Pace, 1997 ). Sendo assim, técnicas

da biologia molecular surgem como alternativa para avaliar tais comunidades (Macrae,

2000; Kent e Triplett, 2002). Nos últimos anos estudos sobre a diversidade microbiana

ruminal usando espécies domesticadas e não domesticadas foram publicados (Frórez e

Mayo, 2006; Ercolini, 2004). O presente estudo teve como objetivo estabelecer um

protocolo de extração do DNA total dos compartimentos fermentativos do caititu, bem

como, analisar a diversidade desses compartimentos através da amplificação do DNA

usando “primers” para archaea, bactérias e protozoário, além de otimizar a técnica de DGGE

(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) para análise de tal diversidade.

MATERIAL E MÉTODOS

Os animais desse estudo encontravam-se acondicionados nas baias do setor de

necropsia do hospital veterinária da UESC. Três caititus adultos, machos, criados em

cativeiro e alimentados com dieta contendo 70% de concentrado (grão de milho) e 30% de

volumoso (capim elefante- Pennisetum purpureum Schum) foram sacrificados, após um

período de 14 dias de adaptação alimentar. Foram retirados seus estômagos com respectivos

pré-estômagos. De forma asséptica o material gástrico foi aliquotado e conservada a -20ºC

13

até o momento das análises. Duas técnicas de extração foram testadas. Na primeira, após

descongelamento, 4g do material era deixados “over nigth” em 50 mL de tampão fosfato pH

8,0 e com 0,1% de tween 80. O sobrenadante era centrifugado a 5000rpm /5min.

Adicionava-se 1/3 do tamanho do pellet de glass beads e 3mL de PBS 1X pH 7,5 e em

seguida vortexado por 1min, centrifugando a 5000rpm/5min e descartando o sobrenadante

(repetir 3X). Ressuspender o precipitado em 3 mL de TE pH 7,5 e em seguida foi vortexado

por 1min, centrifugado a 5000rpm/5min e descartado o sobrenadante (repetir 3X). O

precipitado foi ressuspendido em 3mL de TE, ao qual foi adicionado 150µL de SDS 10% e

deixado 15 min a temperatura ambiente. Em seguida o material foi submetido ao choque

térmico (1min em N2 liquido e 4 min em água fervente, repetir 3X). Após choque térmico se

adicionou igual volume, ao da amostra, de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1).

Centrifugou-se a 10.000 rpm/10min. O sobrenadante foi coletado, adicionado 10% de

acetato de sódio 5M e 70% isopropanol gelado (equivalente do volume da amostra), deixado

“over night”. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 10.000rpm/10min e lavou-se o

precipitado duas vezes com etanol 70% gelado. O DNA foi ressuspendido em TE clássico.

Na segunda técnica, após descongelamento, era adicionado 3 ml de PBS 1X (pH 7,5)

a 4g da amostra e vortexado por 1min, centrifugado a 5000rpm/5min e descartado o

sobrenadante (repetir 3X). O precipitado foi ressuspendido em 3 mL de TE pH 7,5 e em

seguida vortexado por 1 min, centrifugado a 5000rpm/5min e descartado o sobrenadante

(repetir 3X). O precipitado foi ressuspendido em 500 µL de TESC pH 8,3, e adicionado

12µL de SDS 20% com 12µL de proteinase K deixado em banho-maria por 30 min a 37ºC.

Sonicado a 130w com 20 khz por 50seg. Em seguida dado choque térmico (1min em N2

liquido e 4 min em água fervente, repetir 3X). Após choque térmico foi adicionado, igual

volume ao da amostra, de fenol-clorofórmio-álcool isoamilico (25:24:1). Centrifugado a

10.000 rpm/10min, coletado o sobrenadante e adicionado 10% de acetato de sódio 5M e

70%, e isopropanol gelado, deixado over nigth. Foi centrifugado a 10.000rpm/10min e

lavado o precipitado duas vezes com etanol 70% gelado. O DNA foi ressuspendido em TE

clássico.

Para amplificação de fragmentos específicos da região V3 do rDNA 16S de microrganismos

de domínio Bacteria, utilizou-se o seguinte conjunto de iniciadores: BA338fCG (5´ CGC

CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA GCA CGG GGG GAC TCC TAC

GGG 3´) e UN518r (5´ ATT ACC GCG GCT GCT GG 3´) (Ovreas et al., 1997), em

solução contendo 0,1 mM/µL de cada dNTP, 6 mM/µL MgCl2, 0,2 mM/µL de cada

iniciador, 1,5U de Taq DNA Polimerase /25µLda reação, 5µL do tampão da reação 10X

14

(reagentes-Taq Gen da biosystems) e 10ng/µL de DNA. A amplificação foi realizada em um

termociclador (Mastercycler Gradient, Eppendorf), nas seguintes condições: desnaturação

inicial durante 5 min a 95°C, anelamento durante 1 min a 55ºC e extensão a 72ºC por 1 min;

30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 min, anelamento a 55°C por 1 min e extensão a 72°C

durante 1 min; extensão final a 72°C durante 10 min. Uma alíquota dos produtos de PCR

(amplicons) foi analisada por meio de eletroforese em gel de agarose a 1,0% - 1X TBE

Para amplificação do domínio archaea foram usados primers específicos para a região do

rDNA 16S entre as posições 1100 e 1400 conjunto de iniciadores: 1100fCG (5´ CGC CCG

CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG CAC GGG GGG AAC CGT CGA CAG

TCA GGY AAC GAG CGA G3´) e 1400r (5´ CGG CGA ATT CGT CGT GCA AGG AGC

AGG GAC 3´)(Kudo et al. 1997). Em solução contendo 0,1 mM/µL de cada dNTP, 6

mM/µL MgCl2, 0,2 mM/µL de cada iniciador, 1,5U de Taq DNA Polimerase /25µLda

reação, 5µL do tampão da reação 10X (reagentes-Taq Gen da biosystems) e 10ng/µL de

DNA. A amplificação foi realizada em um termociclador (Mastercycler Gradient,

Eppendorf), nas seguintes condições: desnaturação inicial durante 90 segundos a 94°C; 35

ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos e

extensão a 72°C durante por 90 segundos. O ultimo ciclo é seguido por 72º C por 180

segundos.

Para amplificação de fragmento do 18S ribossomal (protozoários ciliados) foram utilizados

o seguinte conjunto de iniciadores: 18SF/GC 5’- CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC

GGC CCG CCG CCC CCG CCC GGG GCG GGT GGT GCA TGG CCG-3’ 18S/R 5’-

AAT TGC AAA GAT CAT TCC C-3’. Em solução contendo 0,1 mM/µL de cada dNTP, 6

mM/µL MgCl2, 0,2 mM/µL de cada iniciador, 1,5U de Taq DNA Polimerase /25µLda

reação, 5µL do tampão da reação 10X (reagentes-Taq Gen da biosystems) e 10ng/µL de

DNA. A amplificação foi realizada em um termociclador (Mastercycler Gradient,

Eppendorf) nas seguintes condições: desnaturação inicial durante 4mim a 94°C, anelamento

a 60ºC por 30 seg. e extensão 1 min a 72ºC; 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 1min,

anelamento a 60°C por 1min e extensão a 72°C durante por 1 min . O ultimo ciclo

desnaturação a 94ºC por 1 min, anelamento 60º por 1min e extensão a 72º C por 10 min.

Os amplicons foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% com gradiente

desnaturante variando de 30 a 70%. O gradiente foi preparado utilizando-se duas soluções

(solução 100% de desnaturação contendo 40% (vol/vol) formamida e 7 M uréia e solução

0% de desnaturação sem uréia ou formamida) (Ovreas et al., 1997). A DGGE foi realizada

com auxílio do equipamento DCode (BioRad) em géis de 16 x 16 x 0,1 cm e tampão TAE

15

1X (20 mM Tris acetato e 0,5 mM EDTA). Foram aplicados de 650 a 3250 ng de produto de

PCR por canaleta. A eletroforese foi realizada a 200V e 60°C, durante quatro horas. Na

coloração com prata os géis foram fixados com solução de etanol e ácido acético a 10 e 1%

respectivamente por 10 min, lavados com água deionizada duas vezes por 1 min, pré-

tratamento com acido nítrico 1,5% por 3 min, duas lavagens com água deionizada por 1 min,

impregnados com solução de prata (AgNO3) a 0,2% por 20 min, revelação com solução

gelada de carbonato de sódio (Na2CO3) a 3% com 0,54 mL de formaldeido, até aparecer as

bandas (4-7 min), bloquei da revelação é feito com acido acético 5% por 5 min, lavar com

água deionizada por 1 min. A coloração com saber syfe foi realizada de acordo com as

instruções do fabricante.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Uma das etapas principais nos estudos da biologia molecular é extração do DNA

com qualidade compatível com as técnicas subseqüentes para a realização do trabalho

(Mesquita et al., 2001; Solléro et al., 2004). Existem diversas técnicas que visam extrair o

DNA total de diferentes tipos de amostras, porém, nenhum método é universalmente

aplicável, pois cada tipo de amostra, devido a sua própria natureza, requer otimização

(ZHOU et al., 1996). Diversos métodos de extração de DNA de amostras complexas

encontram-se disponíveis na literatura. Basicamente, eles envolvem a ruptura das células

presentes na amostra, liberando o material genético (DNA) tornando-o apto para uso em

técnicas da biologia molecular, como a restrição enzimática, a amplificação de seqüências

específicas por PCR e a hibridização. Nas duas técnicas aqui utilizadas foi possível a

extração do DNA total do conteúdo estomacal estudado. O protocolo I (ver Material e

Métodos) apresentou uma maior quantidade de DNA extraído (Fig. 1) que o protocolo II.

Isso pode ser de grande relevância, pois microrganismos com baixa representabilidade na

comunidade ou de difícil lise celular podem não ter amplicons visíveis no gel ou

simplesmente não ter seu DNA extraído (Pedroso et al, 2005).

O DNA obtido com os dois protocolos foi amplificado com primers para Archaea,

bactérias e protozoários ciliados (Fig. 2 a 4). Essa comunidade microbiana presente no

estômago do caititu é comum a outros tratos gastrintestinais de animais poligástricos

(Ezequiel, 2002; Kamra, 2005). A qualidade das extrações e amplificações foi verificada

16

através da quantidade de bandas dos amplicons obtidas no DGGE, que foi maior com a

utilização do protocolo I e que permitiu inferir sobre uma maior eficiência desse protocolo

na representação da diversidade microbiana no estômago do caititu (Fig. 5), o que é de

fundamental importância para real avaliação da microbiota existente (Leser et al., 2003;

Abbott, 2004; Pedroso, 2005).

Técnicas moleculares de “fingerprint”, como o DGGE, vêm sendo utilizadas nos

mais diversos estudos para demonstrar o perfil da diversidade de comunidades microbianas

de ambientes específicos e complexos, e é talvez a técnica mais comumente utilizada entre

os métodos independentes de cultivo. Esta técnica foi utilizada pela primeira vez para

análise da diversidade de amostras complexas por Muyzer et al. (1993).

Alguns trabalhos têm demonstrado que a técnica de PCR-DGGE muitas vezes

subestima a comunidade existente (Leser et al., 2003; Abbott, 2004; Pedroso, 2005).

Segundo Marriel (2005), isso ocorre devido à existência de certa probabilidade de

fragmentos pertencentes a microrganismos diferentes assumirem um mesmo posicionamento

no gel em função de possuírem a mesma quantidade de GC ou se caso a divergência em GC

seja de poucos pares de bases e o uso do gradiente desnaturante inadequado. Essa

subestimação pode ser devido também ao fato que algumas bactérias representam pequena

parte da população e, conseqüentemente, na amostra de DNA das mesmas, podem

representar menos de 1% do total que é o limite de resolução do DGGE (Muyzer; Smalla,

1998). No entanto, o presente trabalho mostra que parte desse problema está também

relacionada à quantidade de DNA aplicado no gel bem como à técnica de coloração utilizada

(Fig. 6 a 10).

O perfil de bandas no gel de DGGE pode ser visualizado através de coloração com

brometo de etídio, “syber safe”, prata, dentre outros. No presente trabalho, os géis corados

com prata apresentaram um maior número de bandas visualizadas, quando comparados com

a coloração com “syber safe” e brometo de etídio. Observação semelhante foi feita por

Felske (1996), mostrando assim uma maior sensibilidade na técnica que utiliza o nitrato de

prata para coloração (Fig.6).

No rúmen e trato digestivo de animais a maioria das bactérias presentes não são

cultiváveis, somente alguns protozoários podem ser cultivados e os fungos exibem ciclo de

vida complexo. Assi, varias técnicas moleculares tem sido utilizadas e continuamente

evoluem para aumentar o conhecido sobre essas comunidades microbianas complexas e sua

composição e estrutura. De um ponto de vista ecológico uma maior diversidade é

17

geralmente considerada um atributo positivo para maior estabilidade e resiliência dessas

comunidades (Zoetendal et. al, 2004).

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18

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19

LISTA DE FIGURAS COM LEGENDAS

.

DGGE

SC SC CF CF E E C- C+ P1 P1 P2 P2

Figura 1 – Gel de agarose a 1% mostrando DNA extraído com Protocolo I- P1 e Protocolo II –P2

Figura 3 - DNA amplificado com primer região V3 do 16S ribossomal (SC=DNA do seco cego; CF=DNA da câmara fermentativa; E=DNA do estomago; C- controle negativo; P1 e

C- P1 P2 E CF SC SC SC CF CF E E C- C+

Figura 4 - DNA amplificado com primer para 18S ribossomal (para protozoários ciliados) SC=DNA do seco cego; CF=DNA da câmara fermentativa; E=DNA do estomago; C- e C+ controle negativo e positivo respectivamente.

Figura 2 - DNA amplificado com primers para Archaea (SC=DNA do seco cego; CF=DNA da câmara fermentativa; E=DNA do estomago; C-e C+ controle negativo e positivo

20

Figura 5 - DGGE c/ gradiente de 40 a 70% corado com prata mostrando diversidade de fragmentos 18S.

Figura 7- DGGE com DNA de Archaea presente nos compartimentos estomacais de caititu (Pecari tajacu). Gel corado com solução de prata.

Figura 6- DGGE com DNA de Archaea presente nos compartimentos estoma- cais de caititu (Pecari tajacu). Gel corado com SYBER-SAFE.

Figura 8 - DGGE corado com prata com DNA do saco cego 100ng/µL.Região V3 do 16S ribossomal- teste piloto

21

1µL 2µL 3µL 4µL 5µL 10µL 15µL 25µL 35µL 45µL1µL 2µL 3µL 4µL 5µL 10µL 15µL 25µL 35µL 45µL

Figura 10 - DGGE c/ gradiente de 45 a 65% corado com prata mostrando em fragmentos de archaea.

Figura 9 - DGGE c/ gradiente de 40 a 70% corado com prata mostrando em fragmentos de archaea do saco sego; 1µL=650ng de DNA .

22

4. CAPITULO 2

(Artigo a ser submetido à revista “Journal of Applied Microbiology”)

Título: Urea supplementation influenced bacteria but not ar chaea communities

in compartmented stomach of collared peccary ( Pecari tajacu L.)

Autores: E.G. Oliveira1, A.C.F, Santos2, J.C.T. Dias2, R.P. Rezende2, S.L.G.

Nogueira-Filho1, E. Gross1

ABSTRACT

Aims: This study was carried out to verify if bacterial and archaeal populations, and

products of fermentation in each compartment of collared peccary stomach vary

significantly with urea supplementation to this animal. Also we compare bacterial

and archaeal populations variation among the four compartments of stomach.

Methods and Results: Archaeal and bacterial communities in the stomach of four

individuals per treatment were analysed at the molecular level using PCR followed

by denaturing gradient gel electrophoresis. Volatile fatty acids (VFA) and lactate

composition in the three different compartments of forestomach were also analysed.

The bacterial community varied considerably among each compartment and with

urea supplementation, but no variation was observed on archaeal populations.

Differences on bacterial community between treatments (with and without urea)

were noticeably greater than among stomach compartments. Acetate propionate

ratio also was modified due urea supplementation.

Conclusions: Use of urea on peccaries diet can substantially modify bacterial

populations but not influenced archaeal community. There are some differences on

bacterial but not on archaeal populations in each compartment of collared peccary

stomach.

Significance and Impact of the Study: Urea factor have an important effect on

determining bacterial composition, and modify the composition of volatile fatty acids

in the collared peccary stomach. Archaeal populations present on collared peccary

stomach are not affect by urea supplementation.

23

Urea supplementation influenced bacteria but not ar chaea communities in

compartmented stomach of collared peccary ( Pecari tajacu L.)

E.G. Oliveira1, A.C.F, Santos2, J.C.T. Dias2, R.P. Rezende2, S.L.G. Nogueira-Filho1,

E. Gross1

1 Department of Environmental and Agricultural Sciences, State University of Santa

Cruz, Ilheus, Brazil

2 Department of Biology, State University of Santa Cruz, Ilheus, Brazil

Running title: Urea on microbiota of peccary stomach

Correspondence: Eduardo Gomes Oliveira, Departament of Environmental and

Agricultural Sciences, State University of Santa Cruz, km 16 Rodovia Ilheus –

Itabuna, 45662-000, Ilheus, Brazil. E-mail: edumev@yahoo.com.br.

Telephone: +55 73 36805112; Fax: +55 73 36805254

24

ABSTRACT

Aims: This study was carried out to verify if bacterial and archaeal populations, and

products of fermentation in each compartment of collared peccary stomach vary

significantly with urea supplementation to this animal. Also we compare bacterial

and archaeal populations variation among the four compartments of stomach.

Methods and Results: Archaeal and bacterial communities in the stomach of four

individuals per treatment were analysed at the molecular level using PCR followed

by denaturing gradient gel electrophoresis. Volatile fatty acids (VFA) and lactate

composition in the three different compartments of forestomach were also

analysed. The bacterial community varied considerably among each compartment

and with urea supplementation, but no variation was observed on archaeal

populations. Differences on bacterial community between treatments (with and

without urea) were noticeably greater than among stomach compartments. Acetate

propionate ratio also was modified due urea supplementation.

Conclusions: Use of urea on peccaries diet can substantially modify bacterial

populations but not influenced archaeal community. There are some differences on

bacterial but not on archaeal populations in each compartment of collared peccary

stomach.

Significance and Impact of the Study: Urea factor have an important effect on

determining bacterial composition, and modify the composition of volatile fatty

acids in the collared peccary stomach. Archaeal populations present on collared

peccary stomach are not affect by urea supplementation.

KEYWORDS

Microbial community, Digestive tract, Tayassuidae, PCR-DGGE, Volatile fatty acids.

25

INTRODUCTION

Collared peccary have a unique digestive system (Shively et al. 1985), where its

stomach can be distinguished on four compartments that Langer (1979) named: a

gastric pouch, a glandular stomach, and two blind sacs. Some microbial

fermentation probably occurs in forestomach (gastric pouch plus blind sacs)

evidenced by high volatile fatty acids concentration in this compartment (Swols

1987; Lochmiller et al., 1989). In one of few studies about microbial community on

forestomach, Carl and Brown (1983) found high concentrations of protozoa (0.3 –

2.5 .106 individuals per ml) in this compartment. Swols (1987) suggested that

bacteria digest the cellulose in the chambered stomach, however bacterial and

archaeal populations were not observed or isolated from forestomach.

Collared peccary have a wide distribution in Americas, from southwestern of United

States to northern Argentina, and is one of the most frequently hunted species in

Latin-America (Robinson and Redford 1991) representing an important source of

meat (Bodmer et al. 1997). Maintenance in captivity of collared peccaries is a

suitable strategy for conservation and breeding programs (Sowls 1987; Nogueira-

Filho and Nogueira 2004), and some farm experiences were done in Brazil

(Nogueira-Filho et al. 2004). Some Brazilian rural producers have tamed this

species for meat and leather production and its status as a pseudo-ruminant animal

(Langer, 1979) could enable cheap diets to be formulated (Nogueira-Filho, 2005).

Supplementation of urea as inorganic N source is widely applied on ruminant diet

(Huntington and Archibeque 1999). This N source is an attractive protein

replacement because of its low cost compared with most natural proteins (crude

protein) and can synchronize the fermentation of fiber digestion (Huntington and

26

Archibeque 1999). Despite of the ability of peccaries to digest low quality roughage,

many collared peccary farms use commercial pig diets, which increase production

costs (Nogueira-Filho 2005). Use of low quantities of urea (to avoid toxicity) on

collared peccary diet could help on forestomach fermentation diminished costs of

collared peccary farming.

The hypotheses tested in the present study were (i) that the addition of urea on

collared peccary diet could modify bacterial and archaeal community in

compartmented stomach, and (ii) that supplementation with urea would increase

carbohydrates fermentation in forestomach, measured by volatile fatty acids

content.

MATERIALS AND METHODS

Protocols and animal handling through this experiment were approved by the

Comissão de Ética para Uso de Animais nas Atividades de Ensino e de Pesquisa of

the State University of Santa Cruz.

Food was withheld for 6 h before euthanasia that was performed agree with the

Brazilian resolution number 714 of Conselho Federal de Medicina Veterinária.

Stomach content (digesta) were collected in sterilized plastic bags immediately after

slaughter and stored at -20 ºC until DNA extraction, and volatile fatty acids and

lactate evaluation.

27

Experimental design

Eight adult male collared peccaries were distributed between two homogeneous

groups and allocated into environmental conditions barns for a 4-days

acclimatization period and a 35-days experimental dietary period. All the peccaries

were weighed before and after experiment, and were fed on a diet with elephant

grass (Pennisetum purpureum Schum.) as the roughage source, and soybean and

corn meals as crude protein concentrate, on proportion of 30 : 70 (forage :

concentrate), with free access to fresh water. For urea supplemented animals (urea

treatment), part of crude protein concentrate was gradually substituted for this

nonprotein N at proportion of 0.5% per week, reaching 2% at fourth week,

proportion that was maintaining at last week of experiment. All the ingredients were

well mixed and dietary were offered to peccaries once a day with amount of food

based on 2,6% of them body weight (mean).

DNA extraction and PCR amplification

Total DNA of forestomach content (digesta) was extracted by means of a modified

freezing / heating protocol (Oliveira et al in submission). All PCR mixtures contained

200 ng of genomic DNA as a template. The following primers were used for PCR

amplification across the 16S rDNA V3 region (Ovreas et al., 1997): BA338fCG (5´

CGC CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA GCA CGG GGG GAC

TCC TAC GGG 3´) and UN518r (5´ ATT ACC GCG GCT GCT GG 3´).

Approximately 180 bp of the bacterial 16S rDNA gene was amplified. PCR for these

bacterial analyses was performed using the following steps: one cycle (95 ºC for 5

min), 30 cycles (95 ºC for 1 min, 55 ºC for 1 min, 72 ºC for 1 min) and one cycle (72

ºC for 10 min).

28

PCR using archaeal primers 1100fCG (5´ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC

GGG GCG GGG CAC GGG GGG AAC CGT CGA CAG TCA GGY AAC GAG CGA

G3´ and 1400r (5´ CGG CGA ATT CGT CGT GCA AGG AGC AGG GAC 3´) was

performed using one cycle (94 ºC for 90 s), 35 cycles (94 ºC for 30 s, 55 ºC for 30 s,

72 ºC for 90 s) and one cycle (72 ºC for 3 min). PCR amplification was performed

using a Mastercycler Gradient (Eppendorf, Germany).

DGGE conditions

DGGE was performed on the DCode Universal Mutation Detection system (Bio-

Rad, Hemel Hempstead, UK) on an 8% (w/v) polyacrylamide gel in 0.5 mM TAE

with a denaturant gradient of 15–70% run at 200 V for 4 h at 60 ºC. DNA bands

were visualized by staining with silver and images were acquired using Image

Master 3D Platinum software (GE Healthcare, USA) at a spatial resolution of 300

d.p.i., and each band was considered an operational taxonomical unit (OTU). The

similarity matrix for the DGGE profiles was evaluated by Dice index using Past

software (Hammer et al. 2001), with results presented as dendrograms.

VFA and acetate analysis

Forestomach digesta samples were analysed for VFA content by high performance

liquid chromatography (HPLC) as previously described by Keates et al. (2000) with

some modifications. About 10 mg of lyophilized and macerated stomach content for

each animal was suspended in 1mL of extraction buffer composed by 4 mmol L-1 of

H2SO4, 5 mmol L-1 of DTT (dithiothreitol) and 0,01 % de PVPP

(polyvinylpolypyrrolidone) at 10 mg.mL-1. Solution was vortexed and centrifuged at

14.000 rpm for 20 min in TA buffer. Supernatant was filtered (0,45 µm) and about

29

100 µL was applied on HPLC (ÄKTAbasic™ GE Health Care, USA) for analysis and

detection of lactic, acetic and propionic acids using Bio-Rad Aminex HPX-87H ionic

column (300 x 7.8 mm, flux 0,7 mL min-1, 25ºC). Data obtained were integrated and

analysed with UNICORN™ v. 5.0. software.

RESULTS

Samples collected simultaneously from all four compartments of collared peccary

stomachs demonstrated that there was considerable variation on composition of the

major bacterial species (OTU) present in each compartment of stomach (Fig. 1).

Samples collected from two groups of peccaries (with and without urea

supplementation) demonstrated that also there was considerable variation on

bacterial community between treatments in different compartments (Fig. 2 and 3).

These observations imply that (i) there is some important differences on bacterial

composition among the compartments of collared peccary stomach and (ii) urea

supplementation could be important factor to determine the major groups of

bacterial populations.

In the clustering analysis applied on bacterial DGGE profiles of different

compartments of collared peccaries stomach (Fig. 4), dendrogram topology

revealed that dorsal blind sac (DS), ventral blind sac (VS) and gastric pouch (GP)

were distinctly grouped from glandular stomach (GS). This clustering analysis also

showed that bacterial community in DS of the four-sampled animal (replicates) was

very similar, and that VS and GP bacterial community clustering separately from

30

those of DS. This also demonstrates that although there is variation in the pattern

observed between samples collected from different peccaries, the change in major

groups of bacterial population is result of local (stomach compartment) where

digesta was collected.

Collared peccaries submitted to urea supplementation (+U) clustering separately

from those no urea supplemented, as can be seen, for example, on VS and GP

dendogram topology of bacterial DGGE profiles (Fig. 5). Same behavior can be

observed on dendogram of DS and GS bacterial DGGE profiles (Fig. 6) suggesting

that a substantial change in the bacterial population occur when urea is

supplemented on collared peccary dietary. However some specificity of resident

bacteria for collared peccary stomach can be observed.

For DGGE gels of archaeal amplicons no differences were observed when we

compare bands distribution. A same pattern to these bands was visualized in

different compartments of different samples (replicates) of peccary stomach and

even urea supplementation did not alter this pattern (Fig. 7).

VFA and lactate concentration, and acetate : propionate ratio in different

forestomach compartments of collared peccaries are presented in Table 1. Urea

supplementation increased acetate concentration on gastric pouch and ventral blind

sac. Propionate concentration in ventral blind sacs and lactate concentration on

dorsal blind sac of urea supplemented peccaries was diminished. Change in the

acetate : propionate ratio was observed on ventral sac. Despite no statistically

significant differences were verified in some compartments (due high values on

standard deviation), in general, there was a tendency of urea supplementation to

diminished lactate and propionate concentrations and to augmented acetate

concentration in collared peccaries forestomach.

31

In attempted to results of collared peccary growth rate, non-urea supplemented

animals weighed less than those urea supplemented at end of experiment, but the

difference was not statistically significant. In the beginning of experiment, urea-

supplemented peccaries mean weight was 22.7 kg, and for non-urea supplemented

peccaries was 22.0 kg. At the end of experiment, urea-supplemented animals gain

some weight (23, 25 kg) and non-urea supplemented peccaries keep them weight

(22, 08 kg).

DISCUSSION

The peccary is a foregut fermenter, with a complex (in compartments) stomach

containing large concentrations of protozoa (Langer 1978) capable of producing

volatile fatty acids from structural carbohydrates of plants (Langer 1978, 1979; Carl

and Brown 1983). The peccary forestomach has a large storage capacity and many

folds that slow the passage of food (Langer 1979), which can allow more time for

microbial fermentation to occur. However, at moment, to the best of our knowledge,

there is no report on literature about bacteria and archaeal presence in the collared

peccary forestomach. Our study, despite of no cultivation nor isolation of archaeal

and bacterial organisms, reports the use of denaturing gradient gel electrophoresis

(DGGE) to assess the diversity of the major species of Archaea and Bacteria

present in the collared peccary stomach.

The DGGE profiles were useful for detecting differences in archaeal and bacterial

diversity attributable to exogenous (urea supplementation) and endogenous

(stomach compartments) parameters.

Probably some of Archae and Bacteria amplicons that we obtained are from

microbial community adherent to plant biomass (elephant grass or, and soybean

32

and corn meals), since forestomach fluid was scarce and digesta was mainly

composed by solid material partially digested. Larue et al. (2005), for example,

observed on clone libraries of grass and starch fed animals many novel lineages of

Clostridium, Selenomonas and Ruminococcus adhered (forming biofilms) on plant

material. If this occurred on our study, the nature of the feed could be influenced the

archaeal and bacterial communities from the solid forestomach phase of collared

peccary.

Eventually, some of archaeal and bacteria amplicons observed on DGGE profiles of

peccaries could be from microbiota attached to the forestomach epithelium. This

microbiota, named epimural community, can differ from that associated with the

rumen digestive contents how observed on lambs by Sadet et al. (2007).

Major groups of Archaea in collared peccary stomach were constant among the four

compartments and the stomach content samples (replicates), and urea

supplementation surprisingly did not alter bands patterns of Archaea amplicons. A

hypothesis that could explain these results is that subtle variations in the community

might be undetected using PCR-DGGE technique. DGGE has an abundance limit

of 1% (Fromin et al. 2002), and thus the contribution to diversity of less-abundant

taxons is underestimated. In our study about 11 archaeal amplicons were

differentiated on DGGE bands. In a study using specific primers to archaeal groups

Nicholson et al. (2007) estimated a total of 66 methanogenic archaeal sequences

belonging to Methanobacteriales, and Methanosarcinales were present on rumen of

sheep and cows. These authors evaluated the metanogenic archaea population in

rumen content between 105 - 1010 g -1.

Within the rumen, fermentative bacteria hydrolyse and ferment carbohydrates,

proteins and lipids to produce acetate, propionate, butyrate and other longer-chain

33

fatty acids (FA) along with H2 and CO2. Hydrogen gas is produced as a result of

acetate and butyrate formation and is utilized in the production of propionate. Since

early work of Langer (1978) VFA were reported in collared peccary forestomach.

Our study demonstrated high concentrations of propionate, which were measured

by HPLC and these results could be attributed to the high grain (mainly to the corn

meals) diet offered to collared peccary. In this type of diet, high in non-structural

carbohydrate and low in structural carbohydrate, the growth/development of

propionate producing bacteria is favoured and the proportion of propionate

produced is increased at the expense of acetate (Bannink et al. 2006). This could

also explain the very low acetate:propionate ratio observed in collared peccary

forestomach.

Of the three main VFA, acetic and butyric acids are substrates for oxidation and as

precursors of lipids. Propionic acid is the only glucogenic VFA, accounting for 65–

80% of the net glucose supply (Reynolds et al. 2003). However, no statistically

significant results were observed on collared peccary growth rate, altought discrete

gain of weight on urea supplemented animals were obtained. This can be explained

due the experiment has been performed with adults animals.

The ratio of VFA produced is a function of the microbial populations present, which

are largely dictated by diet and type of carbohydrate being fermented (Czerkawski

1986). Recent molecular surveys based on amplified 16S rRNA sequences have

revealed the extent of bacterial diversity in farm animals (Tajima et al. 1999; Daly et

al. 2001, Abecia et al. 2007). The dependence of the rumen bacterial community

structure on an animal’s diet is a well-documented fact (Dehority and Orpin 1997),

and could explain some of the similarities of major bacterial amplicons observed on

DGGE gels of collared peccary stomach, since a basic diet was offered to all

34

animals in our experiment. Ruminal microbial communities are composed of various

distinct groups mostly specialized in polysaccharide hydrolysis and fermentations of

resultant sugars, so populations of microbes among animals fed similar diets would

be expected to be similar (Larue et al. 2005).

In our study an important result was demonstrated when soy meal (as crude

protein) was in part substituted by urea, what conducted to modifications in bacterial

structure, as could be observed in DGGE profiles of bacterial amplicons from

peccaries stomach samples. This modification were stronger that the local (stomach

compartment) where digesta were collected. However, it is interesting to note that

similarities on bacterial community were higher in compartments than in same

sampled animal. These results suggest that each compartment of collared peccary

stomach could provide microhabitats and different niches to some species of

microorganisms, and part of microbiota could be specific or characteristic for each

compartment.

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38

TABLE AND FIGURES

Table 1. Influence of urea supplementation on forestomach fermentation products

of collared peccary after 5 week of dietary experiment.

Control Urea supplemented Fermented product (mM / g)

Gastric Pouch

Ventral Sac

Dorsal Sac

Gastric Pouch

Ventral Sac

Dorsal Sac

Lactate 65.8 41,1 103.0* 21.6 36.4 38.1*

Acetate 100.0* 88,4* 104.2 134.4* 122.5* 104.8

Propionate 2623.7 2395.0* 3077.2 1546.2 1370.1* 1498.3

Acetate : Propionate

0.064 0,043* 0,034 0.077 0,080* 0.083

* Statistically significant (p < 0.05) for fermented product at the same forestomach compartment.

39

Figure 1. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profile generated from

PCR amplified V3-16S rDNA of the bacterial community in the compartments

(gastric pouch, ventral and dorsal blind sacs, and glandular stomach, GP, VS, DS

and GS, respectively) of collared peccary stomach. Samples taken for this gel are

from the four non-urea supplemented animals.

Figure 2. Analysis of urea-supplementation alterations in gastric pouch (GP) and

ventral blind sac (VS) bacterial profiles. Denaturing gradient gel electrophoresis

(DGGE) profile generated from PCR amplified V3-16S rDNA from four stomach

content samples of non-urea supplemented and tree stomach samples of urea

supplemented (*) collared peccaries.

40

Figure 3. Analysis of urea-supplementation alterations in dorsal blind sac (DS) and

glandular stomach (GS) bacterial profiles. DGGE profile generated from PCR

amplified V3-16S rDNA from stomach content samples of non-urea and urea

supplemented (*) collared peccaries.

41

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0,72

0,76

0,8

0,84

0,88

0,92

0,96

1

Sim

ilarit

y

GS

2

GS

3

GS

4

GS

1

VS

4

DS

4

DS

1

DS

2

DS

3

GP

4

VS

3

VS

2

VS

1

GP

1

GP

3

GP

2

Figure 4. Dice dendrogram generated from bacterial denaturing gradient gel

electrophoresis (DGGE) profiles (Fig. 1) of four non-urea supplemented peccaries.

Samples are from gastric pouch, ventral and dorsal sacs, and glandular stomach,

GP, VS, DS and GS, respectively)

42

0 1,6 3,2 4,8 6,4 8 9,6 11,2 12,8 14,4

0,54

0,6

0,66

0,72

0,78

0,84

0,9

0,96

1,02

Sim

ilarit

y

GP

1+U

GP

3+U

GP

2+U

VS

1+U

VS

2+U

VS

3+U

VS

3

VS

4

GP

3

VS

1

VS

2

GP

2

GP

1

GP

4

Figure 5. Dice dendrogram generated from bacterial DGGE profiles (Fig. 2) of

gastric pouch (GP) and ventral blind sac (VS) samples collected from four non-urea

supplemented and three urea supplemented (+U) collared peccaries.

43

0 1,2 2,4 3,6 4,8 6 7,2 8,4 9,6 10,8

0,68

0,72

0,76

0,8

0,84

0,88

0,92

0,96

1

Sim

ilarit

y

DS

3+U

DS

4+U

GS

3+U

GS

4+U

GS

1

DS

3

DS

2

DS

1

DS

4

DS

2+U

Figure 6. Dice dendrogram generated from bacterial DGGE profiles (Fig. 3) of

dorsal blind sac (DS) and glandular stomach (GS) samples collected from non-urea

supplemented and urea supplemented (+U) collared peccaries.

44

Figure 7. Analysis of urea supplementation on archaeal amplicons profiles of gastric

pouch (GP) and blind sac (VS). DGGE profile generated from PCR amplified

archaeal 16S rDNA from stomach content samples of four non-urea and three urea

supplemented (*) collared peccaries. Analysis of urea-supplementation alterations

in dorsal blind sac (DS) and glandular stomach (GS) bacterial profiles. DGGE

profile generated from PCR amplified V3-16S rDNA from stomach content samples

of non-urea and urea supplemented (*) collared peccaries.

45

5. CONCLUSÕES

• A coleta do material estomacal do caititu somente foi possível com o sacrifício

do animal em função da ineficácia do uso da sonda gástrica.

• O DNA total do conteúdo estomacal de caititu pode ser extraído utilizando

dois protocolos a base de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, entretanto a

metodologia que emprega as esferas de vidro é mais eficaz na extração.

• Para a melhor visualização e definição das bandas de amplicons, a

padronização da quantidade de DNA aplicada no gel do DGGE bem como sua

revelação com nitrato de prata devem ser empregados

• O perfil da comunidade de Archaea e Bacteria revelou comportamentos

distintos para esses dois grupos microbianos.

• O perfil das bandas no DGGE dos principais grupos de Archaea não foi

alterado nos diferentes compartimentos do estomago e nem nas amostras

retiradas dos diferentes animais, mesmo para aqueles suplementados com

uréia.

• Os perfis de bandas nos géis com amplicons de bactérias foram diversificados

tanto para os diferentes compartimentos do estômago como para as diferentes

amostras (conteúdo estomacais dos animais).

• A suplementação com uréia modificou o perfil das bandas nos géis de DGGE

dos amplicons de bactérias alterando, portanto a estrutura da comunidade

bacteriana nos compartimentos do estômago do caititu.

• Ocorreu grande similaridade entre as comunidades bacterianas provindas do

mesmo compartimento nas diferentes amostras do conteúdo estomacal de

caititus.

• A suplementação de uréia na dieta dos caititus diminui a concentração do

acetato e propionato e aumentou a de acetato em alguns compartimentos do

estômago.

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